ES2850048T3

ES2850048T3 - Detección y tratamiento de tumores malignos en el SNC

Info

Publication number: ES2850048T3
Application number: ES16752735T
Authority: ES
Inventors: Åkerlund Evy Lundgren; Ramiro Gisler; Jan Talts
Original assignee: Xintela AB
Current assignee: Xintela AB
Priority date: 2015-02-16
Filing date: 2016-02-16
Publication date: 2021-08-25
Anticipated expiration: 2036-02-16
Also published as: JP7139569B2; US20180236094A1; IL253582B; AU2016220535B2; PT3258964T; EP3258964A4; KR102571075B1; IL253582A0; PL3258964T3; ZA201704839B; CA2976203A1; US20210316005A1; EP3258964B1; WO2016133449A9; EP3258964A1; JP2018511569A; LT3258964T; CN107427575A; WO2016133449A1; JP7059478B2

Abstract

Una composición para su uso en el tratamiento de una neoplasia maligna del sistema nervioso central, comprendiendo dicha composición un anticuerpo que se une específicamente a una subunidad de integrina alfa 10.

Description

DESCRIPCIÓN

Detección y tratamiento de tumores malignos en el SNC

Campo técnico

La presente divulgación se refiere a métodos para la detección y el tratamiento de tumores malignos en el sistema nervioso central basados en la expresión de la subunidad de integrina alfa 10.

Antecedentes

Los tumores cerebrales primarios se originan dentro del tejido cerebral. Hay varios tipos de tumores cerebrales primarios. El tipo más común de tumores cerebrales primarios malignos diagnosticados pertenece al grupo de gliomas. Los gliomas pueden desarrollarse a partir de varios tipos de células gliales, por ejemplo, astrocitos, oligodendrocitos y células ependimarias. Los gliomas se clasifican de grado bajo (I) a grado alto (IV), lo que refleja el potencial de crecimiento y la agresividad del tumor.

El glioblastoma (también conocido como glioblastoma multiforme, GBM) pertenece al grupo de gliomas y se clasifica como un glioma de grado alto. Es el tipo de tumor cerebral primario más común y más agresivo. Como se describe en la clasificación de la Organización Mundial de la Salud, los tumores de glioblastoma se caracterizan por la presencia de pequeñas áreas de tejido necrotizante que está rodeado por células anaplásicas. Esta característica, así como la presencia de vasos sanguíneos hiperplásicos, diferencia el tumor de los astrocitomas de grado III, que no tienen estas características. Es probable que los esquemas de clasificación emergentes que no se basan únicamente en la morfología incorporen diferencias moleculares que distinguen aún más estos tumores. Por lo tanto, los glioblastomas se pueden caracterizar adicionalmente en cuatro subtipos distintos según sus patrones de expresión molecular (Verhaak et al, 2010; Dunn et al, 2012). Los subtipos clásico, mesenquimatoso, proneural y neural se definen por sus aberraciones y expresión génica del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), neurofibromatosis (NF1), receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas A (PDGFRA) e isocitrato deshidrogenasa (IDH1).

El glioblastoma es un tumor muy heterogéneo que contiene diferentes tipos de células y existe una gran variación en el contenido celular entre pacientes. Los tipos de células que se producen son, por ejemplo, astrocitos, oligodendrocitos y fibroblastos. Las células tumorales se diseminan e infiltran en el tejido adyacente muy rápidamente y exhiben una alta resistencia tanto a la radiación como a la quimioterapia. Cada año se diagnostican alrededor de 28000 casos nuevos de esta enfermedad en los EE. UU. y la UE (fuente: Registro Nacional de Cáncer de EE. UU.). El glioblastoma es el tumor cerebral más letal. Sin tratamiento, el tiempo medio de supervivencia es de 4 meses y con tratamiento disponible de unos 15 meses. Muchos pacientes no sobreviven más de 6 meses desde el diagnóstico y la mayoría muere en 2 años. Solo unos pocos sobreviven hasta 5 años.

Hasta el día de hoy, ningún estudio de laboratorio prequirúrgico específico es útil para diagnosticar GBM. Los estudios de imágenes del cerebro son esenciales para hacer el diagnóstico, incluida la tomografía computarizada, la resonancia magnética con y sin contraste, la tomografía por emisión de positrones y la espectroscopia de resonancia magnética. Para asegurarse del diagnóstico, se debe realizar un examen patológico del tejido cerebral. La genética del tumor es útil para predecir la respuesta a la terapia adyuvante. Sin embargo, hoy en día no existen diferencias en los regímenes de tratamiento entre los diferentes tipos de glioblastomas.

Se ha propuesto que la integrina alfa 10 tiene un papel en el melanoma. Wenke et al. (2007, Cellular Oncology) se refiere a la expresión inducida de la integrina alfa 10 en el melanoma maligno. El documento WO 2007/107774 describe opciones de tratamiento para el melanoma que se dirigen a la integrina alfa 10.

Los glioblastomas son la neoplasia maligna más común y más agresiva del SNC. La incidencia es de 2-3 casos / 100000 individuos. El tratamiento actual incluye cirugía, quimioterapia y radiación. El tratamiento estándar consiste en una resección quirúrgica máxima para disminuir la presión sobre el cerebro, radioterapia y quimioterapia concomitante y adyuvante con temozolomida. Sin tratamiento, el tiempo medio de supervivencia es de 4,5 meses y con los tratamientos actuales disponibles este se puede prolongar hasta 15 meses. Debido a la gravedad de la enfermedad, se ha intentado encontrar nuevos medicamentos para tratar los glioblastomas y otras neoplasias malignas del cerebro. Sin embargo, ni estas ni las terapias tradicionales han dado como resultado una mejora significativa para los pacientes con glioblastoma o un aumento en la tasa de supervivencia.

Por tanto, existe una necesidad urgente de encontrar métodos más eficaces para la detección, el diagnóstico y el tratamiento de neoplasias malignas del SNC, incluidos los gliomas.

Compendio

Los autores de la presente invención han descubierto que la proteína integrina alfa 10 beta 1 se expresa en tejido obtenido de neoplasias malignas del SNC. Basándose en este hallazgo, los autores de la presente invención han desarrollado métodos y herramientas para detectar una subunidad de integrina alfa 10 con el objetivo de diagnosticar y tratar neoplasias malignas del SNC.

Por tanto, un objeto de la presente divulgación es proporcionar un método para determinar la presencia de neoplasias malignas en el SNC de un paciente y tratarlas.

En un aspecto, la presente divulgación se refiere a una composición para su uso en el tratamiento de una neoplasia maligna en el sistema nervioso central, comprendiendo dicha composición un anticuerpo que se une específicamente a una subunidad de integrina alfa 10.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a un método de tratamiento de una neoplasia maligna en el sistema nervioso central de un sujeto que lo necesita, comprendiendo dicho método administrar a dicho sujeto un anticuerpo que se une específicamente a una subunidad de integrina alfa 10.

En otro aspecto más, la presente divulgación se refiere a un método para tratar a un sujeto que padece una neoplasia maligna en el sistema nervioso central, comprendiendo dicho método:

a) determinar si un sujeto padece una neoplasia maligna del sistema nervioso central según los métodos descritos en la presente memoria; y

b) administrar a un sujeto al que se ha diagnosticado una neoplasia maligna del sistema nervioso central, una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo que se une específicamente a una subunidad de integrina alfa 10 a dicho sujeto como se define en cualquiera de las realizaciones anteriores de la presente divulgación. En otro aspecto, la presente divulgación se refiere al uso de una composición que comprende un anticuerpo que se une específicamente a una subunidad de integrina alfa 10 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una neoplasia maligna en el sistema nervioso central.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a un método para inhibir la vascularización asociada a un tumor en un mamífero, comprendiendo el método administrar a dicho mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-subunidad de integrina alfa 10 según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a un producto conjugado de anticuerpo-fármaco que comprende un anticuerpo específico de integrina-alfa 10 unido covalentemente a un trazador radiactivo o un radical citotóxico.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a una nanopartícula que comprende un anticuerpo específico de integrina alfa-10 y un trazador radiactivo.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a un kit para detectar una neoplasia maligna del sistema nervioso central, tal como un glioma, in vitro, in situ o in vivo, comprendiendo el kit un anticuerpo específico para una subunidad de la integrina alfa 10, un péptido capaz de unirse específicamente a un antígeno de la subunidad de integrina alfa 10, o una sonda polinucleotídica capaz de hibridar específicamente con un transcrito de la subunidad de integrina alfa 10 o su complemento y, opcionalmente, instrucciones de uso.

Un objeto adicional de la presente divulgación es proporcionar productos que se pueden usar en la detección, diagnóstico y tratamiento dirigido y exitoso de neoplasias malignas del SNC tales como gliomas.

En un primer aspecto la presente divulgación se refiere a un método para detectar una neoplasia maligna en el sistema nervioso central de un mamífero, comprendiendo dicho método analizar en una muestra aislada, la presencia o ausencia de:

i) un antígeno que comprende un polipéptido de la subunidad de integrina alfa 10, o

ii) un transcrito polinucleotídico que codifica un polipéptido de la subunidad de integrina alfa 10 o un fragmento o variante del mismo,

en donde la presencia del antígeno de a) o el transcrito polinucleotídico de b) es indicativa de una neoplasia maligna en el sistema nervioso central de dicho mamífero.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a un método para detectar una neoplasia maligna en el sistema nervioso central de un mamífero, comprendiendo dicho método las etapas de:

a) administrar a un sujeto una sonda molecular capaz de unirse específicamente a un polipéptido de la subunidad de integrina alfa 10, o a un transcrito polinucleotídico de la subunidad de integrina alfa 10, estando dicha sonda unida covalentemente a un radical capaz de emitir fotones,

b) detectar los fotones emitidos por dicho radical y formar una imagen del sistema nervioso central o parte del mismo,

en donde la emisión localizada de fotones de dicho radical es indicativa de una neoplasia maligna en el sistema nervioso central de dicho mamífero.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a un método de diagnóstico in vitro para diagnosticar una neoplasia maligna en el sistema nervioso central de un mamífero, comprendiendo dicho método las etapas de:

a) poner en contacto una muestra in vitro con una sonda molecular capaz de unirse específicamente a un polipéptido de la subunidad de integrina alfa 10, o al transcrito de un polinucleótido de la subunidad de integrina alfa 10, estando dicha sonda unida covalentemente a un radical capaz de emitir fotones,

b) detectar los fotones emitidos desde dicho radical y formar una imagen de la muestra, en donde la emisión localizada de fotones de dicho radical es indicativa de una neoplasia maligna en el sistema nervioso central de dicho mamífero.

En otro aspecto la presente divulgación se refiere a un método in vitro para la detección de una subunidad de integrina alfa 10 en una muestra aislada, comprendiendo dicho método analizar en dicha muestra aislada, la presencia o ausencia de:

a) un antígeno que comprende un polipéptido de la subunidad de integrina alfa 10, o

b) un transcrito polinucleotídico que codifica un polipéptido de la subunidad de integrina alfa 10 o un fragmento o variante del mismo,

en donde la presencia del antígeno de a), o el transcrito polinucleotídico de b) es indicativa de una neoplasia maligna en dicha muestra aislada.

En otro aspecto, la presente divulgación tiene que ver con el uso de un anticuerpo específico anti-subunidad de integrina alfa 10 que se une específicamente a la subunidad de integrina alfa 10 para detectar una neoplasia maligna del sistema nervioso central en una muestra biológica in vitro, in situ o in vivo.

En otro aspecto, la presente divulgación tiene que ver con el uso de una sonda de ácido nucleico para la subunidad de integrina alfa 10 que se une a un ARNm o ADNc de la subunidad de integrina alfa 10 en una reacción de hibridación para detectar una neoplasia maligna del sistema nervioso central en una muestra biológica in vitro, in situ o in vivo.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere al uso de un compuesto sonda de ácido nucleico de la subunidad de integrina alfa 10 en la preparación de un kit para diagnosticar una neoplasia maligna del sistema nervioso central.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere al uso de un anticuerpo específico anti-subunidad de integrina alfa 10 que se une a una subunidad de integrina alfa 10, en la preparación de un kit para diagnosticar una neoplasia maligna del sistema nervioso central.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere al uso de un compuesto de sonda de ácido nucleico de subunidad de integrina alfa 10 , para la fabricación de un agente de diagnóstico para diagnosticar, controlar o determinar si un sujeto tiene una neoplasia maligna del sistema nervioso central, donde dicho agente de diagnóstico se fabrica para medir la presencia de un polinucleótido de la subunidad de integrina alfa 10 en una muestra biológica, en donde la presencia de dicho polinucleótido de la subunidad de integrina alfa 10 en dicha muestra es indicativa de una neoplasia maligna del sistema nervioso central de dicho sujeto.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere al uso de un anticuerpo específico anti-subunidad de integrina alfa 10 que se une a una subunidad de integrina alfa 10, para la fabricación de un agente de diagnóstico para diagnosticar, controlar o determinar si un mamífero tiene una neoplasia maligna del sistema nervioso central, en donde dicho agente de diagnóstico se fabrica para medir la presencia de un polipéptido de la subunidad de integrina alfa 10 en una muestra, en donde la presencia de dicho polipéptido de la subunidad de integrina alfa 10 en dicha muestra es indicativa de una neoplasia maligna del sistema nervioso central de dicho mamífero.

Descripción de los dibujos

Figura 1: Descripción general de las neoplasias malignas del cerebro y su progresión. Las neoplasias malignas se clasifican fenotípicamente según su morfología aparente y se clasifican según su gravedad basándose en las características histológicas del tumor. En esta figura se muestran las principales clasificaciones de glioma y supuestas vías de progresión tumorales desde células normales hasta glioblastoma.

Figura 2: La integrina a10 es expresada por células aisladas de tejido tumoral de glioblastoma. Mediante el uso de un anticuerpo dirigido contra la integrina a10 se demostró que la integrina a10 se expresa específica y fuertemente en células de glioblastoma en una línea celular de glioblastoma visualizada mediante tinción por inmunofluorescencia.

Figura 3: La integrina a10 es expresada por células en tejido de glioblastoma. Mediante el uso de un anticuerpo dirigido contra la integrina a10, se demostró que la integrina a10 se expresa específica y fuertemente en células de glioblastoma en material de paciente que consiste en muestras de tejido de glioblastoma visualizadas mediante tinción de inmunofluorescencia.

Figura 4: La integrina a10 se detecta en tejido de glioblastoma, pero no en tejido cerebral no afectado. La figura 4A muestra una parte de la muestra del paciente con una morfología cerebral típica, mientras que la figura 4B muestra otra parte de la misma muestra con tejido cerebral maligno (glioblastoma multiforme). Utilizando un anticuerpo policlonal dirigido contra una subunidad de integrina alfa 10 (Camper et al (1998) J Biol Chem.

273(32):20383-9) se demostró que la subunidad de integrina alfa 10 se expresa específica y fuertemente en células de glioblastoma, mientras que se observó una expresión insignificante de la subunidad de integrina alfa 10 en tejido cerebral morfológicamente no afectado.

Figura 5: La expresión de integrina a10 se detecta de forma diferencial en diferentes grados de glioma. Mediante el uso de un anticuerpo dirigido contra la integrina a10 se demostró que la integrina a10 se expresa específicamente en células de muestras de tejido tumoral cerebral de pacientes que consisten en astrocitoma grado II (pocas células; véanse las flechas) (A), astrocitoma de grado III (B), glioblastoma multiforme también conocido como astrocitoma de grado IV (C), visualizado por tinción inmunohistoquímica. La expresión de la integrina a10 aumenta con los grados y se expresa fuertemente en los astrocitomas de grado III y IV. Se puede encontrar tinción positiva de células en vasos sanguíneos en todos los grados de gliomas (D).

Figura 6: Expresión de integrina a10 en neuroblastoma y meduloblastoma. Mediante el uso de un anticuerpo dirigido contra la integrina a10 se demostró que la integrina a10 se expresa específica y fuertemente en células en tejido tumoral de neuroblastoma (A) y tejido tumoral de meduloblastoma (B) de pacientes según se visualiza mediante inmunohistoquímica.

Figura 7: La integrina a10 se detecta en varios tejidos de tumores cerebrales. Se utilizaron matrices de ADNc de cáncer de cerebro para el análisis diferencial de la expresión génica y la validación de la expresión génica en material de tejido de tumor cerebral del paciente. Los ADNc de cada matriz se sintetizaron a partir de ARN totales de alta calidad de tejidos verificados por patólogos, se normalizaron y validaron con beta-actina en dos análisis secuenciales de qPCR y se analizaron junto con la información clínica. La figura muestra los valores medios de cuantificación relativa (RQ) para dos rondas. Como se puede ver en la figura, el ARNm de la subunidad de integrina alfa 10 se puede detectar en astrocitomas, astrocitomas anaplásicos, astrocitomas fibrilares, glioblastoma multiforme, hemangiopericitomas del cerebro, meningiomas, hemangiomas angiomatosos, meningiomas atípicos, meningiomas fibroblásticos, meningiomas menigioteliales, meningiomas microquísticos, meningiomas secretores, oligoastrocitomas, oligoastrocitomas anaplásicos, oligodendrogliomas y oligodendrogliomas anaplásicos.

Figura 8: Co-localización de la integrina a10 con CD163 y CD206 en células en tejido de glioblastoma. La Figura 8A muestra la formación de imágenes de microscopía confocal de tejido de glioblastoma de tumor cerebral marcado para ADN con DAPI. La Figura 8B muestra la formación de imágenes de microscopía de tejido visualizado mediante microscopía de contraste de fase. La Figura 8C muestra la formación de imágenes de microscopía confocal de la expresión de CD 163 en el tejido tumoral utilizando anticuerpo anti-CD 163. La Figura 8D muestra la formación de imágenes de microscopía confocal de la expresión de la subunidad de integrina alfa 10 en el tejido tumoral utilizando un anticuerpo anti-subunidad de integrina alfa 10. La Figura 8E muestra la formación de imágenes por microscopía confocal de la expresión de CD 206 en el tejido tumoral utilizando un anticuerpo anti-CD 206 en el tejido. La Figura 8F muestra una composición de las Figuras 8 A-E y demuestra la co-localización de CD163, subunidad de integrina alfa 10 y CD206.

Figura 9: Co-localización de la integrina a10 con EGFRvIII en células en tejido de glioblastoma. La Figura 9A muestra la formación de imágenes de microscopía confocal de tejido de glioblastoma de tumor cerebral marcado para ADN con DAPI. La Figura 9B muestra la formación de imágenes de microscopía de tejido visualizado mediante microscopía de contraste de fase. La Figura 9C muestra imágenes de microscopía confocal de la expresión de EGFRvIII en el tejido tumoral utilizando un anticuerpo anti-EGFRvIII. La Figura 9D muestra la formación de imágenes de microscopía confocal de la expresión de la subunidad de integrina alfa 10 en el tejido tumoral utilizando un anticuerpo anti-subunidad de integrina alfa 10. La Figura 9E muestra una combinación de las Figuras 9 A-D y demuestra la co-localización de EGFRvIII y la subunidad de integrina alfa 10.

Figura 10: Los anticuerpos contra la subunidad de integrina alfa 10 inhiben la formación de esferas de las células de glioblastoma. La figura muestra que la unión de un anticuerpo monoclonal a la subunidad de integrina alfa 10 en las células de glioblastoma pudo reducir la capacidad de formación de esferas en comparación con las células no tratadas. Este efecto no se observó en células tratadas con anticuerpo de control IgG.

Figura 11: Los anticuerpos contra la subunidad de integrina alfa 10 disminuyen la viabilidad y/o el crecimiento de las células de glioblastoma. La figura muestra que las células de glioma (GBM) son sensibles al tratamiento con un anticuerpo monoclonal no conjugado contra la subunidad de la integrina alfa 10 utilizando el ensayo WST-1. El tratamiento con anticuerpo anti-integrina alfa 10 disminuyó la viabilidad celular y/o el crecimiento de células de glioblastoma en comparación con las células no tratadas.

Figura 12: Los anticuerpos contra la subunidad de integrina alfa 10 disminuyen la supervivencia celular y/o la proliferación de células de glioblastoma. La figura muestra que el tratamiento de células de glioblastoma con anticuerpos monoclonales contra alfa10, seguido de la adición de un anticuerpo secundario (que se une al anticuerpo contra alfa10) conjugado con saporina, redujo la supervivencia y/o la proliferación de las células de glioblastoma en comparación con el tratamiento con un anticuerpo de control.

Definiciones

"Anticuerpo anti-integrina alfa 10" o "anticuerpo anti-subunidad de integrina alfa 10" como se emplea en la presente memoria se refiere a un anticuerpo capaz de reconocer y unirse al menos a la subunidad alfa 10 de la proteína heterodimérica integrina alfa 10 beta 1. Estos anticuerpos pueden ser anticuerpos que reconocen un epítopo de la proteína heterodimérica integrina alfa 10 beta 1, en donde el epítopo comprende restos de aminoácidos tanto de la subunidad alfa 10 como de la subunidad beta 1.

"Integrina alfa 10" o "Subunidad de integrina alfa 10" como se emplea en la presente memoria se refiere a la subunidad alfa 10 de la proteína heterodimérica integrina alfa 10 beta 1. Esta denotación no excluye la presencia de la subunidad beta 1 unida a la subunidad alfa 10 formando así la estructura cuaternaria del heterodímero de integrina alfa 10 beta 1.

"Anticuerpo biespecífico" como se emplea en la presente memoria se refiere a un anticuerpo con dos sitios de unión de dominio variable (Fv) diferentes, cada uno de los cuales se une a un antígeno diferente.

"Sujeto", como se emplea en la presente memoria, denota un mamífero, tal como un roedor, un félido, un cánido y un primate. Preferiblemente, un sujeto según la divulgación es un ser humano.

Como se emplea en la presente memoria, las formas singulares "un", "una/uno", y "el/la" incluyen los referentes plurales a menos que el contexto dicte claramente otra cosa. Así, por ejemplo, la referencia a "un anticuerpo" incluye una pluralidad de tales anticuerpos.

Una "muestra biológica" como se emplea en la presente memoria abarca cualquier sujeto y una variedad de tipos de muestras obtenidas de cualquier sujeto. Los ejemplos de muestras biológicas útiles en los métodos descritos incluyen, pero no se limitan a un sujeto, una muestra de tejido líquido tal como sangre, o una muestra de tejido sólido tal como material de biopsia o cultivos de tejido o células derivadas del mismo y su progenie. Por ejemplo, las muestras biológicas incluyen células obtenidas de una muestra de tejido recogida de un sujeto. Por lo tanto, las muestras biológicas abarcan muestras clínicas, células en cultivo, sobrenadantes celulares, productos lisados celulares y muestras de tejido, p. ej., muestras de tejido de un cerebro tal como un cerebro adulto, muestras de tejido del SNC, incluidas muestras de tumores del cerebro, etc.

"Detección", "detectar", "detectando" como se emplean en la presente memoria incluyen la detección cualitativa y/o cuantitativa (niveles de medición) con o sin referencia a un control, y adicionalmente se refieren a la identificación de la presencia, ausencia o cantidad de una diana dada, específicamente la diana de una subunidad de integrina alfa 10.

"Analizar", como se emplea en la presente memoria, incluye la detección cualitativa y/o cuantitativa (niveles de medición) con o sin referencia a un control, y adicionalmente se refiere a la identificación de la presencia, ausencia o cantidad de una diana dada, específicamente la diana de una subunidad de integrina alfa 10.

Un "trazador radiactivo", o "marcador radiactivo", es un compuesto químico en el que uno o más átomos han sido reemplazados por un radioisótopo, por lo que en virtud de su desintegración radiactiva se puede utilizar para explorar el mecanismo de las reacciones químicas trazando el camino que sigue el radioisótopo desde los reactivos hasta los productos.

Los radioisótopos de hidrógeno, carbono, fósforo, azufre y yodo se han utilizado ampliamente para rastrear la ruta de las reacciones bioquímicas. También se puede usar un marcador radiactivo para rastrear la distribución de una sustancia dentro de un sistema natural, tal como una célula o tejido. Los trazadores radiactivos forman la base de una variedad de sistemas de formación de imágenes, tales como las exploraciones PET, las exploraciones SPECT y las exploraciones con tecnecio. El término "trazador radiactivo" incluye isótopos radiactivos que emiten dosificaciones terapéuticas de radiación, tales como yodo 131

Descripción detallada

La invención se define mediante las reivindicaciones adjuntas. Cualquier realización que no se encuentre dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas no forma parte de la invención.

Los autores de la presente invención han descubierto sorprendentemente que la subunidad de integrina alfa 10 (Uniprot: O75578) codificada por el gen ITGA10 se expresa en tejido obtenido a partir de biopsias de tejido del SNC en particular de neoplasias malignas del cerebro. Basándose en este hallazgo, los autores de la presente invención han desarrollado métodos y herramientas para detectar una subunidad de integrina alfa 10 y han demostrado que es posible diagnosticar y/o tratar neoplasias malignas del SNC y subtipos tales como el glioma.

I. Tratamiento de las neoplasias malignas del sistema nervioso central

En un aspecto, la presente divulgación se refiere al tratamiento de una o más neoplasias malignas del SNC. En una realización preferida de la presente divulgación, el tratamiento se lleva a cabo utilizando un anticuerpo anti-subunidad de integrina alfa 10 específico como se describe en la presente memoria. El anticuerpo se prepara preferiblemente para que esté incluido en una composición farmacéutica como se describe a continuación.

Composiciones farmacéuticas y administración de las mismas

En una realización, la presente divulgación se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos y equivalentes funcionales de los mismos según la divulgación. La divulgación se refiere además a medicamentos para el tratamiento de una afección clínica que comprende el anticuerpo, métodos de tratamiento de neoplasias malignas del SNC que comprenden la administración de dicho anticuerpo o el uso de dicho anticuerpo para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una afección clínica.

La afección clínica puede ser cualquiera de las afecciones mencionadas en la presente memoria. El individuo que necesita la administración de anticuerpos anti-subunidad de integrina alfa 10 puede ser cualquier individuo que padezca dicha afección o que esté en riesgo de adquirir dicha afección clínica. El individuo es preferiblemente un ser humano.

El tratamiento puede ser curativo, paliativo, de mejora y/o profiláctico.

Las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación comprenden preferiblemente una cantidad farmacéuticamente eficaz de al menos un anticuerpo o equivalente funcional del mismo que reconoce específicamente un epítopo dentro del dominio extracelular de una subunidad de integrina alfa 10 (en la presente memoria, más arriba y más abajo, denominado "anticuerpo anti-integrina alfa 10" o "anticuerpo anti-subunidad de integrina alfa 10"). Para fines in vitro, p. ej., para detectar la integrina alfa 10 beta 1 en muestras de sangre o tejido, también se pueden usar anticuerpos capaces de reconocer el dominio citoplásmico de la integrina alfa 10 beta 1.

Una cantidad farmacéuticamente eficaz como se menciona en la presente memoria es típicamente una cantidad de anticuerpo anti-subunidad de integrina alfa 10, que induce la respuesta deseada en un individuo que recibe dicha composición farmacéutica.

La cantidad farmacéuticamente eficaz del anticuerpo anti-subunidad de integrina alfa 10 depende del individuo al que se debe administrar, en particular del tamaño de dicho individuo, así como la afección clínica y el modo específico de administración. Sin embargo, en general, se debe administrar a un ser humano adulto por dosis una dosis en el intervalo de 1 mg a 5000 mg, preferiblemente en el intervalo de 10 mg a 3000 mg, más preferiblemente en el intervalo de 50 mg a 1000 mg, por ejemplo en el intervalo de 100 mg a 750 mg, tal como en el intervalo de 150 mg a 500 mg, por ejemplo en el intervalo de 200 mg a 400 mg, tal como en el intervalo de 250 mg a 350 mg, por ejemplo alrededor de 300 mg de anticuerpo contra la subunidad de integrina alfa 10.

La composición de la presente divulgación puede ser una composición farmacéutica adecuada para administración parenteral. Las composiciones adecuadas para la administración parenteral incluyen soluciones inyectables estériles acuosas y no acuosas que pueden contener reactivos humectantes o emulsionantes, agentes antioxidantes, tamponadores del pH, compuestos bacteriostáticos y solutos que vuelven isotónica la formulación con los fluidos corporales, preferiblemente la sangre, del individuo; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión o agentes espesantes. Las composiciones se pueden presentar en recipientes de dosis unitaria o de dosis múltiple, por ejemplo, ampollas selladas y recipientes, y se pueden almacenar en condiciones de liofilización que únicamente requieren la adición del portador líquido estéril inmediatamente antes de su uso.

Preferiblemente, la composición de la presente divulgación comprende uno o más excipientes farmacéuticos adecuados, que podrían ser estériles o no estériles, para su uso con células, tejidos u organismos, tales como excipientes farmacéuticos adecuados para la administración a un individuo. Tales excipientes pueden incluir, pero no se limitan a, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones de estos excipientes en diversas cantidades. La formulación debe adecuarse al modo de administración. La divulgación se refiere adicionalmente a un kit farmacéutico de partes que comprende uno o más recipientes cargados con uno o más de los ingredientes de las composiciones de la divulgación anteriormente mencionados. Los ejemplos de excipientes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como el aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo.

Preferiblemente, las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación se preparan en una forma que es inyectable, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas; además, las formas sólidas adecuadas para disolución o suspensión en líquido antes de la inyección también están dentro del alcance de la presente divulgación. La preparación también se puede emulsionar, o encapsular en liposomas.

El anticuerpo anti-subunidad de integrina alfa 10 se puede administrar solo o combinado con otros compuestos, ya sea de forma simultánea o secuencial en cualquier orden.

La administración podría ser, por ejemplo, parenteral mediante inyección o infusión. La inyección parenteral podría ser, por ejemplo, una inyección intraventricular, intratumoral, intravenosa, intramuscular, intradérmica o subcutánea. Preferiblemente, dicha administración es por vía parenteral mediante inyección o infusión.

El anticuerpo anti-subunidad de integrina alfa 10 debe administrarse con la frecuencia necesaria, por lo tanto, el anticuerpo anti-subunidad de integrina alfa 10 puede administrarse más de una vez, tal como al menos dos veces, por ejemplo, al menos 3 veces, tal como al menos 4 veces, por ejemplo, al menos 5 veces, tal como en el intervalo de 1 a 100 veces, por ejemplo, en el intervalo de 1 a 50 veces, tal como en el intervalo de 1 a 25 veces, por ejemplo, en el intervalo de 1 a 10 veces.

Preferiblemente, transcurre al menos 1 día entre 2 administraciones, tal como al menos 2 días, por ejemplo, al menos 3 días, tal como al menos 5 días, por ejemplo, al menos una semana, tal como al menos 2 semanas, por ejemplo, al menos un mes, tal como al menos 6 meses, por ejemplo, al menos 1 año, tal como al menos 2 años, por ejemplo, al menos 3 años, tal como al menos 5 años, por ejemplo, al menos 10 años.

Los agentes quimioterapéuticos pueden dirigirse a neoplasias malignas del SNC, tales como el glioma, utilizando proteínas de unión a integrina alfa-10, tales como anticuerpos anti-integrina alfa-10. En otras realizaciones de la presente divulgación, las neoplasias malignas del SNC tales como el glioma pueden tratarse con anticuerpos anti-subunidad de integrina alfa 10 con una función efectora apropiada, tal como la capacidad de activar el complemento.

En un aspecto, la presente divulgación se refiere a una composición para su uso en el tratamiento de una neoplasia maligna en el sistema nervioso central, comprendiendo dicha composición un anticuerpo que se une específicamente a la subunidad de integrina alfa 10.

En una realización de la presente divulgación, el anticuerpo se une específicamente a un polipéptido que comprende o consiste en SEQ ID NO: 2 (el dominio extracelular de la integrina alfa10), y en otra realización de la presente divulgación el anticuerpo se une específicamente a un polipéptido que comprende o consiste en SEQ ID NO: 3 (el dominio I extracelular de la integrina alfa10).

En una realización de la presente divulgación, el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal y un fragmento de anticuerpo, tal como un fragmento de anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab')2 y un fragmento Fv, tal como un fragmento variable de cadena sencilla (scFv) y un anticuerpo de dominio único.

Los anticuerpos utilizados para aplicaciones terapéuticas son preferiblemente anticuerpos quiméricos, humanizados o completamente humanos, preferiblemente con una región constante humana.

En una realización de la presente divulgación, el anticuerpo es un anticuerpo no humano, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano o un anticuerpo heteroespecífico tal como un anticuerpo biespecífico.

El anticuerpo puede tener un isotipo seleccionado del grupo que consiste en IgA, IgD, IgG e IgM. Los isotipos de IgG pueden, por ejemplo, seleccionarse del grupo que consiste en IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4.

En una realización específica de la presente divulgación, el anticuerpo es:

a. un anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma depositado en Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH con el número de acceso DSM ACC2583 o un fragmento de unión a antígeno del mismo, en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno se une específicamente al dominio I extracelular de la cadena de integrina alfa10; o

b. un anticuerpo que compite por unirse al mismo epítopo que el epítopo al que se una el anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma depositado en Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH con el número de acceso DSM ACC2583; o

c. un fragmento de a) o b), en donde dicho fragmento es capaz de unirse específicamente al dominio I extracelular de la cadena de la subunidad de integrina alfa 10.

En una realización, el anticuerpo anti-alfa10 de la presente divulgación es un anticuerpo capaz de bloquear la función celular a través de la integrina alfa 10 beta 1.

El anticuerpo puede unirse covalentemente a un radical citotóxico, tal como un radical citotóxico seleccionado entre una toxina, un agente quimioterapéutico y un agente radiactivo.

En una realización de la presente divulgación, la toxina es una proteína inactivadora de ribosomas, tal como una proteína inactivadora de ribosomas seleccionada del grupo que consiste en tricosantina y lufina; proteínas inactivadoras de ribosomass de tipo II, tales como ricina, aglutinina y abrina; y saporina.

En una realización de la presente divulgación, la toxina es saporina. La saporina es una enzima vegetal, una proteína de 30 kDa, con actividad N-glicosidasa que despurina un nucleótido específico en el ARN ribosómico 28S, bloqueando irreversiblemente la síntesis de proteínas. Pertenece a la bien caracterizada familia de proteínas inactivadoras de ribosomas (RIP). Los productos conjugados de SAP dirigidos son agentes lesionadores potentes y específicos que se utilizan en la técnica conocida como Cirugía Molecular. La saporina (de las semillas de la planta, Saponaria officinalis) puede unirse a un agente de direccionamiento, en este caso un anticuerpo anti-integrina alfa y administrarse a las células (in vitro o in vivo). El agente de direccionamiento busca y se une a su diana en la superficie celular. El producto conjugado se internaliza, la saporina se separa del agente de direccionamiento, e inactiva los ribosomas, lo que provoca la inhibición de las proteínas y, en última instancia, la muerte celular. Las células que no tienen el marcador de superficie celular no se ven afectadas.

En una realización de la presente divulgación, un agente quimioterapéutico se une covalentemente al anticuerpo. En otras realizaciones de la presente divulgación, un agente quimioterapéutico se encapsula en una nanopartícula tal como un liposoma y la partícula se dirige al glioma al tener anticuerpos anti-subunidad alfa 10 anti-integrina unidos a su superficie.

Los productos conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC) tales como un anticuerpo anti-subunidad alfa 10 de integrina conjugado con saporina pueden ser preparados por los expertos en la técnica, por ejemplo, como ilustran Bidard y Trédan (2014) en Targ Oncol 9: 1-8 o Agarwal y Bertozzi (2015) en Bioconjugate Chem. 26: 176-192.

En una realización de la presente divulgación, la composición para su uso en el tratamiento de una neoplasia maligna del SNC comprende un anticuerpo que está unido covalentemente a un modificador de la respuesta biológica, tal como una citocina, p. ej. una citoquina seleccionada entre una linfocina y un interferón.

La composición para su uso en el tratamiento puede comprender adicionalmente ingredientes activos tales como uno o más agentes quimioterapéuticos y opcionalmente un diluyente, portador o excipiente farmacéuticamente aceptables.

El anticuerpo de la presente divulgación está en una realización de la presente divulgación diseñado para ser específico para la subunidad de integrina alfa 10 y en otra realización de la presente divulgación diseñado para ser específico de una variante natural de subunidad de integrina alfa 10, por ejemplo, una isoforma de la subunidad de integrina alfa 10 o una variante de empalme de una subunidad de integrina alfa 10.

En una realización, la presente divulgación se refiere a un anticuerpo que se une a las subunidades alfa 10 y beta 1 del heterodímero de integrina alfa 10 beta 1.

En otra realización, la presente divulgación se refiere a un anticuerpo que se une a la subunidad alfa 10 pero no a la beta 1 del heterodímero de integrina alfa 10 beta 1.

En una realización de la presente divulgación, el anticuerpo es capaz de inducir la muerte celular y/o inhibir el crecimiento y/o la proliferación de las células que expresan la subunidad de integrina alfa 10.

En una realización de la presente divulgación, el anticuerpo es capaz de inducir la muerte celular de las células que expresan la subunidad de integrina alfa 10. En una realización de la presente divulgación, el anticuerpo es capaz de inhibir el crecimiento de las células que expresan la subunidad de integrina alfa 10. En una realización de la presente divulgación, el anticuerpo es capaz de inhibir la proliferación de las células que expresan la integrina alfa 10. En una realización de la presente divulgación, el anticuerpo es capaz de inhibir la migración de las células que expresan la integrina alfa 10.

En una realización de la presente divulgación, las células expresan adicionalmente una o más de EGFRvlll, Nestina, PSA-NCAM, GFAP, PDGFRb (CD140b), PECAM-1 (CD31), CD45, CD68, CD163 y/o CD206.

En una realización de la presente divulgación las células expresan adicionalmente EGFRvIII. En una realización de la presente divulgación, las células expresan adicionalmente Nestina. En una realización de la presente divulgación, las células expresan adicionalmente PSA-NCAM.

En una realización de la presente divulgación, las células expresan adicionalmente GFAP. En una realización de la presente divulgación, las células expresan adicionalmente PDGFRb (CD140b). En una realización de la presente divulgación, las células expresan adicionalmente PECAM-1 (CD31). En una realización de la presente divulgación, las células expresan adicionalmente CD45. En una realización de la presente divulgación, las células expresan adicionalmente CD68. En una realización de la presente divulgación, las células expresan adicionalmente CD163. En una realización de la presente divulgación, las células expresan adicionalmente CD206.

Por tanto, en una realización, la presente divulgación se refiere a un método para inducir la muerte celular y/o inhibir el crecimiento y/o proliferación de células asociadas con una neoplasia maligna en el sistema nervioso central, en donde la célula expresa una subunidad de integrina alfa 10 y, opcionalmente, uno o más de EGFRvlll, Nestina, PSA-NCAM, GFAP, PDGFRb (CD140b), PECAM-1 (CD31), CD45, CD68, CD163 y/o CD206.

En una realización de la presente divulgación, las células asociadas con la neoplasia maligna en el sistema nervioso central son células malignas o células asociadas a tumores.

Los ejemplos de células malignas o células asociadas a tumores incluyen células gliales; astrocitos; pericitos; células endoteliales; células hematopoyéticas; y microglía.

En una realización de la presente divulgación, las células son células gliales.

Las células hematopoyéticas pueden seleccionarse, por ejemplo, del grupo que consiste en células madre hematopoyéticas, células T, células B, células plasmáticas, células NK, células dendríticas, macrófagos y monocitos.

En una realización de la presente divulgación, el macrófago es un macrófago asociado a tumor (TAM).

Condiciones clínicas

Las condiciones clínicas según la presente divulgación pueden consistir en el tratamiento de cualquiera de las neoplasias malignas del SNC como se define en la presente memoria, incluido el tratamiento curativo, mejorador o profiláctico mediante la administración de los anticuerpos anti-subunidad de integrina alfa 10 de la divulgación.

La composición definida anteriormente en la presente memoria es para uso en el tratamiento de una neoplasia maligna seleccionada de los grupos que consisten en:

a) Tumores de tejido neuroepitelial seleccionados entre

i) Tumores astrocíticos seleccionados entre astrocitoma pilocítico (ICD-O 9421/1, grado I de la OMS), astrocitoma pilomixoide (ICD-O 9425/3, grado II de la OMS), astrocitoma subependimario de células gigantes (ICD-O 9384/1, grado I de la OMS), xantoastrocitoma pleomórfico (ICD-O 9424/3, grado II de la OMS), astrocitoma difuso (ICD-O 9400/3, grado II de la OMS), astrocitoma anaplásico (ICD-O 9401/3, grado III de la OMS), glioblastoma ( ICD-O 9440/3, grado IV de la Om S), glioblastoma de células gigantes (ICD-O 9441/3, grado IV de la OMS), gliosarcoma (ICD-O 9442/3, grado IV de la OMS), gliomatosis cerebri (ICD-O 9381/3, grado III de la OMS), y

ii) Tumores oligodendrogliales seleccionados entre oligodendroglioma (ICD-O 9450/3, grado II de la OMS) y oligodendroglioma anaplásico (ICD-O 9451/3, grado III de la OMS), y

iii) Tumores oligoastrocíticos seleccionados entre oligoastrocitoma (ICD-O 9382/3, grado II de la OMS) y oligoastrocitoma anaplásico (ICD-O 9382/3, grado III de la OMS), y

iv) Tumores ependimarios seleccionados entre subependimoma (ICD-O 9383/1, grado I de la OMS), ependimoma mixopapilar (ICD-O 9394/1, grado I de la o Ms ), ependimoma (ICD-O 9391/3, grado II de la OMS), ependimoma anaplásico (ICD-O 9392/3, grado III de la OMS), y

v) Tumores del plexo coroideo seleccionados entre papiloma del plexo coroideo (ICD-O 9390/0, grado I de la OMS), papiloma del plexo coroideo atípico (ICD-O 9390/1, grado II de la OMS) y carcinoma del plexo coroideo (ICD-O 9390/3, grado III de la OMS), y

vi) Otros tumores neuroepiteliales seleccionados entre astroblastoma (ICD-O 9430/3, grado I de la OMS), glioma cordoide del tercer ventrículo (ICD-O 9444/1, grado II de la OMS) y glioma angiocéntrico (ICD-O 9431/1, grado I de la OMS) y,

vii) Tumores neuronales y neuronal-gliales mixtos seleccionados entre gangliocitoma displásico de cerebelo (Lhermitte-Duclos) (ICD-O 9493/0), astrocitoma/ganglioglioma infantil desmoplásico (ICD-O 9412/1, grado I de la OMS), tumor neuroepitelial disembrioplásico (ICD-O 9413/0, grado I de la OMS), gangliocitoma (ICD-O 9492/0, grado I de la OMS), ganglioglioma (ICD-O 9505/1, grado I de la OMS), ganglioglioma anaplásico (ICD-O 9505/3 , grado III de la OMS), neurocitoma central (ICD-O 9506/1, grado II de la OMS), neurocitoma extraventricular (ICD-O 9506/1, grado II de la OMS), liponeurocitoma cerebeloso (ICD-O 9506/1, grado II de la OMS) , tumor papilar glioneuronal (ICD-O 9509/1, grado I de la OMS), tumor glioneuronal formador de rosetas del cuarto ventrículo (ICD-O 9509/1, grado I de la OMS) y paraganglioma (ICD-O 8680/1, grado I de la OMS),

viii) Tumores de la región pineal seleccionados entre pineocitoma (ICD-O 9361/1, grado I de la OMS), tumor del parénquima pineal de diferenciación intermedia (ICD-O 9362/3, grado II, III de la OMS), pineoblastoma (ICD-O 9362 / 3, grado IV de la OMS) y tumores papilares de la región pineal (ICD-O 9395/3, grado II, III de la OMS), y

ix) Tumores embrionarios seleccionados entre meduloblastoma (ICD-O 9470/3, grado IV de la OMS), meduloblastoma con nodularidad extensa (ICD-O 9471/3, grado IV de la OMS), meduloblastoma anaplásico (ICD-O 9474/3, grado IV de la OMS), tumor neuroectodérmico primitivo del SNC (ICD-O 9473/3, grado IV de la OMS), neuroblastoma del SNC (Ic D-O 9500/3, grado IV de la OMS) y tumor teratoideo/rabdoide atípico (ICD-O 9508/3, grado de la OMS IV), y

b) Tumores de nervios craneales y paraespinales seleccionados entre

i) Schwannoma (ICD-O 9560/0, grado I de la OMS)

ii) Neurofibroma (ICD-O 9540/0, grado I de la OMS),

iii) Perineurioma (ICD-O 9571/0, 9571/3, grado I, II, III de la OMS) y

iv) Tumor maligno de la vaina del nervio periférico (MPNST) (ICD-O 9540/3, grado II, III, IV de la OMS), y

c) Tumores de las meninges seleccionados entre

i) Tumores de células meningoteliales, seleccionados entre meningioma (ICD-O 9530/0, grado I de la OMS), meningioma atípico (ICD-O 9539/1, grado II de la OMS), meningioma anaplásico (ICD-O 9530/3, grado de la OMS III), y

ii) Tumores mesenquimales seleccionados entre lipoma (ICD-O 8850/0), angiolipoma (ICD-O 8861/0), hibernoma (ICD-O 8880/0), liposarcoma (ICD-O 8850/3), tumor fibroso solitario (ICD-O 8815/0), fibrosarcoma (ICD-O 8810/3), histiocitoma fibroso maligno (ICD-O 8830/3), leiomioma (ICD-O 8890/0), leiomiosarcoma (ICD-O 8890/3), rabdomioma (ICD-O 8900/0), rabdomiosarcoma (ICD-O 8900/3), condroma (ICD-O 9220/0), condrosarcoma (ICD-O 9220/3), osteoma (ICD-O 9180/0), osteosarcoma (ICD-O 9180/3), osteocondroma (ICD-O 9210/0), hemangioma (ICD-O 9120/0), hemangioendotelioma epitelioide (ICD-O 9133/1), hemangiopericitoma (ICD-O 9150/1, grado II de la OMS), hemangiopericitoma anaplásico (ICD-O 9150/3, grado III de la OMS) y angiosarcoma (ICD-O 9120/3) 3.2.22 sarcoma de Kaposi (ICD-O 9140/3), sarcoma de Ewing -PNET (ICD-O 9364/3) y

iii) Lesiones melanocíticas primarias seleccionadas entre melanocitosis difusa (ICD-O 8728/0), melanocitoma (iCd -O 8728/1), melanoma maligno (ICD-O 8720/3), melanomatosis meníngea (ICD-O 8728/3) y

iv) Otras neoplasias relacionadas con las meninges tales como el hemangioblastoma (ICD-O 9161/1, grado I de la OMS), y

d) Tumores del sistema hematopoyético seleccionados entre

i) Linfomas malignos (ICD-O 9590/3)4,2 plasmocitoma (ICD-O 9731/3), y

ii) Sarcoma granulocítico (ICD-O 9930/3), y

e) Tumores de la región selar seleccionados entre

i) Craneofaringioma (ICD-O 9350/1, grado I de la OMS)

ii) Tumor de células granulares (ICD-O 9582/0, grado I de la OMS)

iii) Pituicitoma (ICD-O 9432/1, grado I de la OMS) y

iv) Oncocitoma de células fusiformes de la adenohipófisis (ICD-O 8991/0, grado I de la OMS)

En una realización de la presente divulgación, la neoplasia maligna que se va a tratar con el anticuerpo anti-integrina alfa 10 o la composición que comprende un anticuerpo anti-integrina alfa 10 de la presente divulgación es un glioma.

En una realización de la presente divulgación, la neoplasia maligna que se va a tratar con el anticuerpo anti-integrina alfa 10 o la composición que comprende un anticuerpo anti-integrina alfa 10 de la presente divulgación es un glioma de grado II, III o IV.

En una realización de la presente divulgación, la neoplasia maligna que se va a tratar con el anticuerpo anti-integrina alfa 10 o la composición que comprende un anticuerpo anti-integrina alfa 10 de la presente divulgación es un astrocitoma, tal como astrocitoma de grado II, astrocitoma de grado III o astrocitoma de grado IV.

En una realización de la presente divulgación, el glioma que se va a tratar con el anticuerpo anti-integrina alfa 10 o la composición que comprende un anticuerpo anti-integrina alfa 10 de la presente divulgación es un glioblastoma.

En una realización de la presente divulgación, el glioma es glioblastoma primario.

En una realización de la presente divulgación, el glioma es un glioblastoma secundario.

En una realización de la presente divulgación, la neoplasia maligna que se va a tratar con el anticuerpo anti-integrina alfa 10 o la composición que comprende un anticuerpo anti-integrina alfa 10 de la presente divulgación es meduloblastoma. En una realización de la presente divulgación, la neoplasia maligna que se va a tratar con el anticuerpo anti-integrina alfa 10 o la composición que comprende un anticuerpo anti-integrina alfa 10 de la presente divulgación es neuroblastoma.

En una realización de la presente divulgación, la neoplasia maligna que se va a tratar mediante la composición de la presente divulgación se selecciona del grupo que consiste en astrocitomas, astrocitomas anaplásicos, hemangiopericitomas del cerebro, meningiomas, hemangiomas angiomatosos , meningiomas atípicos, meningiomas fibroblásticos, meningiomas meningioteliales, meningiomas secretores, oligoastrocitomas, oligoastrocitomas anaplásicos, oligodendrogliomas y oligodendrogliomas anaplásicos.

En una realización, la neoplasia maligna que se va a tratar mediante la composición de la presente divulgación se selecciona del grupo que consiste en tumores astrocíticos, tumores oligodendrogliales, tumores de células ependimarias, gliomas mixtos, tumores neuroepiteliales de origen incierto, tumores del plexo coroideo, tumores neuronales y neuronalgliales mixtos, tumores del parénquima pineal y tumores con elementos neuroblásticos o glioblásticos (tumores embrionarios), ependimomas, astrocitomas, oligodendrogliomas, oligoastrocitomas, tumores neuroepiteliales y tumores neuronales y neuronales-mixtos.

En un aspecto, la presente divulgación se refiere a un método de tratamiento de un neoplasma maligno en el sistema nervioso central de un sujeto que lo necesita, comprendiendo dicho método administrar a dicho sujeto un anticuerpo que se une específicamente a una subunidad de integrina alfa 10. Dicho tratamiento puede ser profiláctico, paliativo o curativo.

El tratamiento definido anteriormente en la presente memoria puede iniciarse tras la detección de una subunidad de integrina alfa 10 en dicho sujeto.

En un aspecto, la presente divulgación se refiere a un método para tratar a un sujeto que padece un neoplasma maligno en el sistema nervioso central, comprendiendo dicho método:

a) determinar si un sujeto padece un neoplasma maligno del sistema nervioso central mediante un método de detección definido en la presente memoria; y

b) administrar a un sujeto diagnosticado de una neoplasia maligna del sistema nervioso central, una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo que se une específicamente a una subunidad de integrina alfa 10 a dicho sujeto.

En un aspecto, la presente divulgación se refiere al uso de una composición que comprende un anticuerpo que se une específicamente a una subunidad de integrina alfa 10 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una neoplasia maligna en el sistema nervioso central.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a un método para inhibir la vascularización asociada a un tumor en un mamífero, comprendiendo el método administrar a dicho mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo anti-subunidad de anti-integrina alfa 10.

En una realización, la presente divulgación se refiere a un método para inhibir el crecimiento y/o la proliferación de una célula que expresa la subunidad de integrina alfa 10 que comprende administrar una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-subunidad de integrina alfa 10 a dicha célula. La célula puede expresar uno o más marcadores adicionales como se define en la presente memoria. En una realización particularmente preferida de la presente divulgación, dicha célula es una célula de glioma. El método se puede realizar in vitro o in vivo.

En una realización, la presente divulgación se refiere a un método para disminuir el potencial tumorigénico o metastásico de una célula que expresa la subunidad de integrina alfa 10 que comprende administrar una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-subunidad de integrina alfa 10 a dicha célula. La célula puede expresar uno o más marcadores adicionales como se define en la presente memoria. En una realización particularmente preferida de la presente divulgación, dicha célula es una célula de glioma. El método se puede realizar in vitro o in vivo. Los datos presentados en la presente memoria muestran que el tratamiento de las células de glioma (GBM) que expresan la subunidad de integrina alfa 10 con un anticuerpo anti-subunidad de integrina alfa 10 disminuye significativamente la capacidad de formación de esferas, lo que indica que el tratamiento con un anticuerpo anti-subunidad de integrina alfa 10 inhibe o al menos disminuye la capacidad de las células que expresan la subunidad de integrina alfa 10 para formar tumores.

En realizaciones adicionales de la presente divulgación, los métodos de terapia implican adquirir una imagen del sistema nervioso central para detectar la ubicación del glioma utilizando los métodos descritos en la presente memoria, preferiblemente en donde la ubicación se detecta en el espacio 3D y utilizar la información sobre la ubicación para guiar la radioterapia posterior para tratar el glioma.

En otras realizaciones más de la presente divulgación, un cirujano puede usar una sonda molecular específica de la subunidad de integrina alfa 10 para detectar la presencia de glioma durante la cirugía.

II. Detección y diagnóstico de neoplasias malignas del sistema nervioso central

La presente divulgación también se refiere a un método para detectar una neoplasia maligna en el sistema nervioso central de un mamífero, comprendiendo dicho método analizar en una muestra aislada, la presencia o ausencia de:

b) detectar los fotones emitidos por dicho radical y formar una imagen de la muestra,

En otro aspecto la presente divulgación se refiere a un método in vitro para la detección de la subunidad de integrina alfa 10 en una muestra aislada, comprendiendo dicho método analizar en dicha muestra aislada, la presencia o ausencia de:

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a un agente que comprende o consiste en un anticuerpo con especificidad por la subunidad de integrina alfa 10 para su uso en la detección de células asociadas con una neoplasia maligna del sistema nervioso central de un mamífero, en donde las células expresan la subunidad de integrina alfa 10. En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a un método de diagnóstico in vitro para diagnosticar una neoplasia maligna en el sistema nervioso central de un mamífero, comprendiendo dicho método las etapas de:

a) poner en contacto una muestra in vitro obtenida de dicho mamífero con una sonda molecular capaz de unirse específicamente a un polipéptido de la subunidad de integrina alfa 10, o a un transcrito polinucleotídico de la subunidad de integrina alfa 10, estando dicha sonda unida covalentemente a una fracción capaz de emitir fotones,

En otro aspecto la presente divulgación se refiere a un método in vitro para la detección de la subunidad de integrina alfa 10 en una muestra aislada obtenida de un mamífero, comprendiendo dicho método analizar en dicha muestra aislada, la presencia o ausencia de:

a) un antígeno que comprende un polipéptido de la subunidad de integrina alfa 10; y/o

en donde la presencia del antígeno de a) y/o la transcripción de polinucleótidos de b) es indicativa de una neoplasia maligna en el sistema nervioso central de dicho mamífero.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere al uso de un anticuerpo específico anti-subunidad de integrina alfa 10 que se une específicamente a la subunidad de integrina alfa 10 para detectar una neoplasia maligna del sistema nervioso central en una muestra biológica. in vitro, in situ o in vivo.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere al uso de una sonda de ácido nucleico de la subunidad de integrina alfa 10 que se une a un ARNm o ADNc de la subunidad de integrina alfa 10 en una reacción de hibridación para detectar una neoplasia maligna del sistema nervioso central en una muestra biológica in vitro, in situ o in vivo.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere al uso de un anticuerpo específico anti-subunidad de integrina alfa 10 que se une a la subunidad de integrina alfa 10, en la preparación de un kit para diagnosticar una neoplasia maligna del sistema nervioso central.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere al uso de un compuesto sonda de ácido nucleico de la subunidad de integrina alfa 10, para la fabricación de un agente de diagnóstico para diagnosticar, controlar o determinar si un sujeto tiene una neoplasia maligna de la sistema nervioso central, en donde dicho agente de diagnóstico se fabrica para medir la presencia de un polinucleótido de la subunidad de integrina alfa 10 en una muestra biológica, en donde la presencia de dicho polinucleótido de la subunidad de integrina alfa 10 en dicha muestra es indicativa de una neoplasia maligna del sistema nervioso central de dicho sujeto.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere al uso de un anticuerpo específico anti-subunidad de integrina alfa 10 que se une a la subunidad de integrina alfa 10, para la fabricación de un agente de diagnóstico para diagnosticar, controlar o determinar si un mamífero tiene una neoplasia maligna del sistema nervioso central, en donde dicho agente de diagnóstico se fabrica para medir la presencia de un polipéptido de la subunidad de integrina alfa 10 en una muestra, en donde la presencia de dicho polipéptido de la subunidad de integrina alfa 10 en dicha muestra es indicativa de una neoplasia maligna del sistema nervioso central de dicho mamífero.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a un método para detectar una célula de mamífero maligna o asociada a un tumor, comprendiendo dicho método analizar en una muestra aislada, la presencia o ausencia de:

a) un primer antígeno que comprende un polipéptido de la subunidad de integrina alfa 10; y/o

b) un primer transcrito polinucleotídico que codifica un polipéptido de la subunidad de integrina alfa 10 o un fragmento o variante del mismo;

y

c) un segundo antígeno que comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en EGFRvIII, Nestina, PSA-NCAM, GFAP, PDGFRb (CD140b), PECAM-1 (CD31), CD45, CD68, CD163 y CD206; y/o

d) un segundo transcrito polinucleotídico que codifica un polipéptido o un fragmento o variante del mismo, en donde dicho polipéptido se selecciona del grupo que consiste en EGFRvlll, Nestina, PSA-NCAM, GFAP, PDGFRb (CD140b), PECAM-1 (CD31), CD45, CD68, CD163 y CD206.

La presencia del primer antígeno de a) y/o el primer transcrito polinucleotídico de b); junto con el segundo antígeno de c) y/o el segundo transcrito de d), indica que dicha célula de mamífero es una célula maligna o una célula asociada a un tumor.

En otro aspecto, la presente divulgación se refiere a un método para detectar una célula maligna o asociada a un tumor de un mamífero, comprendiendo dicho método las etapas de:

a) administrar a un mamífero una primera sonda molecular capaz de unirse específicamente a un polipéptido de la subunidad de integrina alfa 10; y/o a un transcrito polinucleotídico de la subunidad de integrina alfa 10, estando dicha primera sonda unida covalentemente a un primer radical capaz de emitir fotones; y

b) administrar a un mamífero una segunda sonda molecular capaz de unirse específicamente a un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en EGFRvlll, Nestina, PSA-NCAM, GFAP, PDGFRb (CD140b), PEc Am -1 (CD31), CD45, Cd 68, CD163 y CD206; y/o a un transcrito polinucleotídico que codifica un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en EGFRvlll, Nestina, PSA-NCAM, GFAP, PDGFRb (CD140b), PECAM-1 (CD31), CD45, CD68, CD163 y CD206, estando dicha segunda sonda unida covalentemente a un segundo radical capaz de emitir fotones;

c) detectar los fotones emitidos desde dicho primer y segundo radicales, formando así una imagen del sistema nervioso central o parte del mismo.

La emisión localizada de fotones de dicho primer y segundo radicales es indicativa de una célula maligna o asociada a un tumor de dicho mamífero.

Neoplasias malignas del SNC

Las neoplasias malignas se clasifican de dos formas. Se clasifican fenotípicamente según su morfología aparente y se catalogan según su gravedad. Esta catalogación también se basa en las características histológicas del tumor.

En los gliomas, por ejemplo, las neoplasias malignas se denominan astrocitomas cuando morfológicamente parecen ser similares a astrocitos y oligodendrogliomas cuando las células malignas parecen morfológicamente similares a oligodendrocitos. También existen formas mixtas de glioma, en este caso llamados oligoastrocitomas.

El grado del tumor es un indicador de la rapidez con la que es probable que un tumor crezca y se disemine. Si las células del tumor y la organización del tejido del tumor son similares a las de las células y el tejido normales, el tumor se denomina bien diferenciado (grado bajo). Estos tumores tienden a crecer y diseminarse a un ritmo más lento que los tumores poco diferenciados o indiferenciados, que tienen células de aspecto anormal y crecen más rápido (grado alto). Véase la figura 1 para ver un ejemplo de clasificación de gliomas.

La clasificación de la OMS de los tumores del SNC establece una escala de malignidad basada en las características histológicas del tumor. Los grados histológicos son los siguientes: el grado I de la OMS incluye lesiones con bajo potencial proliferativo, una naturaleza frecuentemente discreta y la posibilidad de curación después de la resección quirúrgica sola. El grado II de la OMS incluye lesiones que generalmente son infiltrantes y de baja actividad mitótica, pero que recurren con más frecuencia que los tumores malignos de grado I después de la terapia local. Algunos tipos de tumores tienden a progresar a grados más altos de malignidad. El grado III de la OMS incluye lesiones con evidencia histológica de malignidad, incluyendo atipia nuclear y aumento de la actividad mitótica. Estas lesiones tienen histología anaplásica y capacidad infiltrativa. Suelen tratarse con terapia adyuvante agresiva. El grado IV de la OMS incluye lesiones mitóticamente activas, propensas a necrosis y generalmente asociadas con una rápida progresión preoperatoria y postoperatoria y desenlaces fatales. Las lesiones suelen tratarse con terapia adyuvante agresiva.

Para obtener una clasificación completa y actualizada, consulte la nueva clasificación de tumores del sistema nervioso de la Organización Mundial de la Salud (OMS), publicada en 2000, surgida de una conferencia de consenso internacional de neuropatólogos de 1999 (Kleihues y Cavanee, Eds., 2000: Patología y genética de los tumores del sistema nervioso. Lyon, Francia: International Agency for Research on Cancer.; Kleihues et al. (2002) The WHO Classification of Tumours of the Nervous System. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology 61: 215-225). La clasificación real va acompañada de descripciones e ilustraciones extensas de las características clínico-patológicas de cada tipo de tumor, incluidas las características genéticas moleculares, los factores predictivos y capítulos separados sobre síndromes tumorales hereditarios.

La presente divulgación se refiere a la detección y/o el tratamiento de neoplasias malignas en el SNC caracterizadas por la expresión de la subunidad de integrina alfa 10. Por tanto, en una realización de la presente divulgación, la neoplasia maligna del SNC se selecciona entre los grupos que consisten en:

a) Tumores de tejido neuroepitelial seleccionados entre

i) Tumores astrocíticos seleccionados entre astrocitoma pilocítico (ICD-O 9421/1, grado I de la OMS), astrocitoma pilomixoide (ICD-O 9425/3, grado II de la OMS), astrocitoma subependimario de células gigantes (ICD-O 9384/1, grado I de la OMS), xantoastrocitoma pleomórfico (ICD-O 9424/3, grado II de la OMS), astrocitoma difuso (ICD-O 9400/3, grado II de la OMS), astrocitoma anaplásico (ICD-O 9401/3, grado III de la OMS), glioblastoma (ICD-O 9440/3, grado IV de la OMS), glioblastoma de células gigantes (ICD-O 9441/3, grado IV de la OMS), gliosarcoma (ICD-O 9442/3, grado IV de la OMS), gliomatosis cerebri (ICD-O 9381/3, grado III de la OMS), y

vii) Tumores neuronales y neuronal-gliales mixtos seleccionados entre gangliocitoma displásico de cerebelo (Lhermitte-Duclos) (ICD-O 9493/0), astrocitoma/ganglioglioma infantil desmoplásico (ICD-O 9412/1, grado I de la OMS), tumor neuroepitelial disembrioplásico (ICD-O 9413/0, grado I de la OMS), gangliocitoma (ICD-O 9492/0, grado I de la OMS), ganglioglioma (ICD-O 9505/1, grado I de la OMS), ganglioglioma anaplásico (ICD-O 9505/3 , Grado III de la OMS), neurocitoma central (ICD-O 9506/1, grado II de la OMS), neurocitoma extraventricular (ICD-O 9506/1, grado II de la OMS), liponeurocitoma cerebeloso (ICD-O 9506/1, grado II de la OMS) , tumor papilar glioneuronal (ICD-O 9509/1, grado I de la OMS), tumor glioneuronal formador de rosetas del cuarto ventrículo (ICD-O 9509/1, grado I de la OMS) y paraganglioma (ICD-O 8680/1, grado I de la OMS), y

viii) Tumores de la región pineal seleccionados entre pineocitoma (ICD-O 9361/1, grado I de la OMS), tumor del parénquima pineal de diferenciación intermedia (ICD-O 9362/3, grado II, III de la OMS), pineoblastoma (ICD-O 9362/3, grado IV de la OMS) y tumores papilares de la región pineal (ICD-O 9395/3, grado II, III de la OMS), y

b) Tumores de nervios craneales y paraespinales seleccionados entre

i) Schwannoma (ICD-O 9560/0, grado I de la OMS)

ii) Neurofibroma (ICD-O 9540/0, grado I de la OMS),

iii) Perineurioma (ICD-O 9571/0, 9571/3, grado I, II, III de la OMS) y

iv) Tumor maligno de la vaina del nervio periférico (MPNST) (ICD-O 9540/3, grado II, III, IV de la OMS), y c) Tumores de las meninges seleccionados entre

ii) Tumores mesenquimales seleccionados entre lipoma (ICD-O 8850/0), angiolipoma (ICD-O 8861/0), hibernoma (ICD-O 8880/0), liposarcoma (ICD-O 8850/3), tumor fibroso solitario (ICD-O 8815/0), fibrosarcoma (ICD-O 8810/3), histiocitoma fibroso maligno (ICD-O 8830/3), leiomioma (ICD-O 8890/0), leiomiosarcoma (ICD-O 8890/3), rabdomioma (ICD-O 8900/0), rabdomiosarcoma (ICD-O 8900/3), condroma (ICD-O 9220/0), condrosarcoma (ICD-O 9220/3), osteoma (ICD-O 9180/0), osteosarcoma (ICD-O 9180/3), osteocondroma (ICD-O 9210/0), hemangioma (ICD-O 9120/0), hemangioendotelioma epitelioide (ICD-O 9133/1), hemangiopericitoma (ICD-O 9150/1, grado II de la OMS), hemangiopericitoma anaplásico (ICD-O 9150/3, grado III de la OMS) y angiosarcoma (ICD-O 9120/3) 3.2.22 Sarcoma de Kaposi (ICD-O 9140/3), sarcoma de Ewing - PNET (ICD-O 9364/3) y

iii) Lesiones melanocíticas primarias seleccionadas entre melanocitosis difusa (ICD-O 8728/0), melanocitoma (iCd -O 8728/1), melanoma maligno (ICD-O 8720/3), melanomatosis meníngea (ICD-O 8728/3) y iv) Otras neoplasias relacionadas con las meninges tales como el hemangioblastoma (ICD-O 9161/1, grado I de la OMS), y

d) Tumores del sistema hematopoyético seleccionados entre

i) Linfomas malignos (ICD-O 9590/3)4.2 Plasmocitoma (ICD-O 9731/3), y

ii) Sarcoma granulocítico (ICD-O 9930/3), y

e) Tumores de la región selar seleccionados entre

i) Craneofaringioma (ICD-O 9350/1, grado I de la OMS)

ii) Tumor de células granulares (ICD-O 9582/0, grado I de la OMS)

iii) Pituicitoma (ICD-O 9432/1, grado I de la OMS) y

iv) Oncocitoma de células fusiformes de la adenohipófisis (ICD-O 8991/0, grado I de la OMS).

En una realización de la presente divulgación, la neoplasia maligna detectado y/o tratado por el método de la presente divulgación es un glioma, como un grado II, III o IV glioma. En otra realización de la presente divulgación, la neoplasia maligna detectada y/o tratada mediante el método de la divulgación es un astrocitoma.

En ciertas realizaciones de la presente divulgación, la neoplasia maligna es un glioma tal como un glioblastoma. Los tumores de glioblastoma detectados por la presente divulgación también pueden seleccionarse del grupo que consiste en tumores astrocíticos, tumores oligodendrogliales, tumores de células ependimarias, gliomas mixtos, tumores neuroepiteliales de origen incierto, tumores del plexo coroideo, tumores neuronales y neuronal-gliales mixtos, tumores de parénquima pineal y tumores con elementos neuroblásticos o glioblásticos (tumores embrionarios), ependimomas, astrocitomas, oligodendrogliomas, oligoastrocitomas, tumores neuroepiteliales y tumores neuronales y neuronal-gliales mixtos.

III. Subunidad de integrina alfa 10

Las integrinas son heterodímeros que consisten en una subunidad alfa y una beta. El heterodímero de integrina alfa 10 beta 1 puede detectarse mediante anticuerpos anti-subunidad de integrina alfa 10 específicos y péptidos y proteínas de unión a la subunidad de integrina alfa 10. La integrina alfa 10 beta 1 es la integrina de unión a colágeno más abundante en los tejidos cartilaginosos y su patrón de expresión es distinto del de otras integrinas de unión a colágeno. Los estudios in vitro e in vivo han identificado la integrina alfa 10 beta 1 como un marcador fenotípico único para la diferenciación de condrocitos y un mediador crucial de las interacciones célula-matriz necesarias para el correcto desarrollo del cartílago (Lundgren Ákerlund y Aszódi (2014) Adv Exp Med Biol. 819:61-71).

La integrina alfa 10 beta 1 se identificó como un receptor de unión a colágeno de tipo II en los condrocitos en 1998 (Camper et al., 1998). El análisis inmunohistoquímico durante el desarrollo y en tejidos adultos ha demostrado una localización restringida del marcador en los tejidos que contienen cartílago (Camper et al. 1998, Camper et al., 2001). Los ratones con una modificación genética para inactivar la expresión de un gen que carecen del marcador tienen placas de crecimiento desorganizadas, disminución del colágeno en la matriz y huesos largos más cortos, lo que respalda adicionalmente su importancia estructural celular (Bengtsson et al., 2005). La secuencia de aminoácidos, variantes, isoformas y anotaciones de secuencia se pueden encontrar en el número de acceso de Uniprot O75578-ITA10_HUMAN.

Además, la integrina alfa10 beta 1 está presente en las células madre mesenquimales (MSC) y aumenta durante la condrogénesis in vitro en cultivos agregados. El cultivo extenso de MSC regula negativamente la integrina alfa 10 beta 1 mientras que el tratamiento de las células madre mesenquimales cultivadas con factor de crecimiento de fibroblastos-2 aumenta la expresión de la integrina alfa 10 beta 1 junto con moléculas específicas del cartílago, tales como colágeno tipo II y agrecano. Esto demuestra que alfa 10 beta 1 es un biomarcador de superficie celular de MSC con potencial condrogénico (Varas et al., 2007).

Varias estructuras diferentes del cerebro de ratón, incluido el cerebro completo, se han analizado anteriormente para determinar la expresión de la subunidad de integrina alfa 10 y se ha demostrado que no hay expresión de la subunidad de integrina alfa 10 en ninguna de las estructuras analizadas de cerebros sanos. (documento WO 99/51639).

Por tanto, la subunidad de la integrina alfa 10 es un excelente biomarcador de enfermedad. Por consiguiente, la presente divulgación se refiere a la detección del polipéptido de la subunidad de integrina alfa 10 antigénico, por ejemplo, con anticuerpos dirigidos específicamente a SEQ ID NO: 1 (subunidad de integrina alfa 10), SEQ ID NO: 2 (el dominio extracelular de la integrina alfa10) o SEQ ID NO: 3 (el dominio I extracelular de la integrina alfa 10). Otros antígenos son antígenos que son isoformas, variantes de corte y empalme o variantes naturales de la subunidad de integrina alfa 10.

En una realización de la presente divulgación, la neoplasia maligna del SNC se detecta o diagnostica detectando la presencia o ausencia de un antígeno que es una variante de la subunidad de integrina alfa 10, en donde dicha variante es idéntica en al menos 70% a SEQ ID NO: 1, 2 o 3, p. ej. una variante que es idéntica en al menos 75% a SEQ ID NO: 1,2 o 3, tal como una variante que es idéntica en al menos 80% a SEQ ID NO: 1,2 o 3, p. ej. una variante que es idéntica en al menos 85% a SEQ ID NO: 1, 2 o 3, tal como una variante que es idéntica en al menos 90% a SEQ ID NO: 1, 2 o 3, p. ej. una variante que es idéntica en al menos 95% a SEQ ID NO: 1, 2 o 3, tal como una variante que es idéntica en al menos 96% a SEQ ID NO: 1, 2 o 3, p. ej. una variante que es idéntica en al menos 97% a SEQ ID NO: 1, 2 o 3, p. ej. una variante que es idéntica en al menos 98% a SEQ ID NO: 1, 2 o 3, p. ej. una variante que es idéntica en al menos 99% a SEQ ID NO: 1, 2 o 3, tal como una variante que es idéntica en al menos 99,5% a SEQ ID NO: 1, 2 o 3.

En una realización de la presente divulgación, la neoplasia maligna del SNC se detecta o diagnostica detectando la presencia o ausencia de un antígeno que es un fragmento de la subunidad de integrina alfa 10 en donde dicho fragmento comprende al menos 100 aminoácidos de SEQ ID NO: 1, preferiblemente al menos 200 aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 1, preferiblemente al menos 300 aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 1, preferiblemente al menos 400 aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 1 , preferiblemente al menos 500 aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 1, preferiblemente al menos 600 aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 1, preferiblemente al menos 700 aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 1, preferiblemente al menos 800 aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 1, preferiblemente al menos 900 aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 1, preferiblemente al menos 1000 aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 1.

La subunidad de integrina alfa 10 también puede detectarse a nivel de nucleótidos analizando una muestra para determinar la presencia de, por ejemplo, transcritos de ARNm que tras la traducción generan un antígeno de subunidad de integrina alfa 10 como se define en la presente memoria anteriormente.

Anticuerpos dirigidos contra la subunidad de integrina alfa 10

En una realización de la presente divulgación, se detecta la presencia de una subunidad de integrina alfa 10, normalmente como parte de una proteína heterodimérica de integrina alfa 10 beta 1, en una muestra biológica mediante el uso de un anticuerpo específico anti-integrina alfa10 que se une a la subunidad de la integrina alfa 10 en una reacción inmunológica. Preferiblemente, el anticuerpo se une al dominio extracelular de la subunidad de integrina alfa 10, pero en ciertas realizaciones de la presente divulgación, el anticuerpo anti-subunidad de integrina alfa 10 tiene una especificidad solapante para todo el complejo heterodimérico de la integrina alfa 10 beta 1. Esto puede significar, por ejemplo, que el anticuerpo de la presente divulgación se une a un epítopo que cubre tanto las subunidades alfa 10 como beta 1.

Los anticuerpos y equivalentes funcionales de los mismos pueden producirse mediante cualquier método adecuado conocido por el experto en la técnica. En una realización de la presente divulgación, el anticuerpo de la divulgación se produce en una línea celular de hibridoma (p. ej., la línea celular de hibridoma mAb 365 depositada en Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH con el número de acceso DSM ACC2583), produciendo así una unión de anticuerpo al dominio extracelular alfa10beta1. Para la producción de dicho hibridoma, se puede utilizar un ratón con el gen de la integrina alfa10beta1 inactivado. El ratón con la modificación genética para inactivar el gen se describe en el documento WO 03/101497.

Un método para producir un anticuerpo que reconoce y se une específicamente a un epítopo dentro del dominio extracelular o dominio I de la subunidad de integrina alfa 10 comprende la etapa de administrar a un mamífero el dominio extracelular o dominio I de la subunidad de integrina alfa 10 o un fragmento del mismo o un homólogo funcional del mismo. Dicho dominio extracelular o dominio I de la subunidad de integrina alfa 10 o un fragmento del mismo o un homólogo funcional del mismo puede ser cualquiera de los fragmentos y péptidos de la subunidad de integrina alfa 10 descritos en la presente memoria. El dominio extracelular o dominio I de la subunidad de integrina alfa 10 o fragmento del mismo u homólogo funcional del mismo administrado a dicho mamífero también se denomina "antígeno de la subunidad de integrina alfa 10" o "antígeno de integrina alfa 10" en la presente memoria.

En una realización de la presente divulgación, la presente divulgación se refiere a métodos para producir un anticuerpo capaz de inhibir la actividad de una subunidad de integrina alfa 10, en donde dicho anticuerpo reconoce específicamente un epítopo dentro del dominio extracelular o dominio I de la subunidad de integrina alfa 10.

El antígeno de la subunidad de integrina alfa 10 puede administrarse a dicho mamífero más de una vez, tal como dos veces, por ejemplo 3 veces, tal como de 3 a 5 veces, por ejemplo, de 5 a 10 veces, tal como de 10 a 20 veces, por ejemplo, de 20 a 50 veces, tal como más de 50 veces. También es posible que se administren diferentes antígenos de la subunidad de integrina alfa 10 al mismo mamífero, ya sea de forma simultánea o secuencial en cualquier orden.

En general, el antígeno de la subunidad de integrina alfa 10 estará en una solución o suspensión acuosa antes de su administración. Además, el antígeno de la subunidad de integrina alfa 10 se puede mezclar con uno o más de otros compuestos. Por ejemplo, el antígeno de la subunidad de integrina alfa 10 se puede mezclar con uno o más adyuvantes adecuados y/o con uno o más portadores.

Los adyuvantes son cualquier sustancia cuya mezcla con un antígeno administrado aumenta o modifica de otro modo la respuesta inmunitaria a dicho antígeno. Los adyuvantes adecuados son bien conocidos por los expertos en la técnica.

Los portadores son estructuras de armazón, p. ej., un polipéptido o un polisacárido, al que un antígeno puede asociarse. Puede estar presente un portador independientemente de un adyuvante. Los portadores adecuados son conocidos por los expertos en la técnica.

Los métodos para preparar anticuerpos monoclonales, mezclas de anticuerpos monoclonales o anticuerpos policlonales son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Antibodies: A Laboratory Manual, por Ed Harlow y David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988.

En una realización de la presente divulgación, el anticuerpo anti-subunidad de integrina alfa 10 de la presente divulgación es un anticuerpo capaz de inhibir la actividad biológica de una subunidad de integrina alfa 10.

En una realización de la presente divulgación, el anticuerpo de la presente divulgación tiene un isotipo seleccionado del grupo que consiste en IgA, IgD, IgG e IgM. En una realización adicional de la presente divulgación, el anticuerpo es un isotipo IgG, tal como un isotipo IgG seleccionado del grupo que consiste en IgG1, IgG2 (p. ej., IgG2a), IgG3 e IgG4.

La divulgación contempla anticuerpos monoclonales y policlonales y fragmentos de los mismos, fragmentos de unión a antígeno y proteínas recombinantes de los mismos que son capaces de unirse a la subunidad de integrina alfa 10.

En una realización de la presente divulgación, el anticuerpo específico de la subunidad anti-integrina alfa 10 utilizado para detectar la presencia de la subunidad de integrina alfa 10 en una muestra biológica es un anticuerpo policlonal.

En una realización de la presente divulgación, el anticuerpo utilizado para detectar el antígeno de la subunidad de integrina alfa 10 es un fragmento de anticuerpo. Los fragmentos de unión al antígeno de un anticuerpo son fragmentos que conservan la capacidad para unirse específicamente a un antígeno. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos de la presente divulgación incluyen fragmentos de anticuerpos seleccionados del grupo que consiste en un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab')2 y un fragmento Fv, tal como un fragmento variable monocatenario (scFv) y un anticuerpo de dominio único.

El anticuerpo según la divulgación también puede ser un anticuerpo quimérico, es decir, un anticuerpo que comprende regiones derivadas de diferentes especies. El anticuerpo quimérico puede comprender, por ejemplo, regiones variables de una especie de animal y regiones constantes de otra especie de animal. Por ejemplo, un anticuerpo quimérico puede ser un anticuerpo que tiene regiones variables que derivan de un anticuerpo monoclonal de ratón y regiones constantes que son humanas. Dichos anticuerpos también pueden denominarse anticuerpos humanizados.

En una realización de la presente divulgación, el anticuerpo es un anticuerpo heteroespecífico tal como un anticuerpo biespecífico, que es una proteína o polipéptido, que comprende dos sitios de unión de antígeno diferentes con diferentes especificidades. Por ejemplo, el anticuerpo biespecífico puede reconocer y unirse a (a) un epítopo en la subunidad de integrina alfa 10 y (b) a otro epítopo en la subunidad de integrina alfa 10. Por tanto, puede reconocer y unirse a dos epítopos diferentes dentro del mismo antígeno. Se pretende que el término "anticuerpo heteroespecífico" cualquier proteína o polipéptido que tenga más de dos sitios de unión a antígeno diferentes con diferentes especificidades. Por consiguiente, la divulgación incluye, pero no se limita a, anticuerpos biespecíficos, interespecíficos, tetraespecíficos y otros anticuerpos multiespecíficos que se dirigen a la subunidad de integrina alfa 10.

En una realización de la presente divulgación, el anticuerpo específico para la subunidad de integrina alfa 10 es:

a) un anticuerpo monoclonal, producido por la línea celular de hibridoma depositada en Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH con el número de acceso DSM ACC2583; o

b) un anticuerpo que compite por unirse al mismo epítopo que el epítopo unido por el anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma depositado en Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH con el número de acceso DSM ACC2583; o

c) un fragmento de a) o b), en el que dicho fragmento es capaz de unirse específicamente al dominio I extracelular de la cadena de la subunidad de integrina alfa 10.

Para obtener una buena razón señal/ruido cuando se detecta el anticuerpo anti-subunidad de integrina alfa 10, puede ser necesario conjugar un radical al anticuerpo para facilitar la detección.

En una realización de la presente divulgación, el anticuerpo se une covalentemente a un radical detectable, tal como un radical detectable seleccionado del grupo que consiste en un fluoróforo, una enzima o un trazador radiactivo. El antígeno de la subunidad de integrina alfa 10 también puede detectarse detectando un péptido, proteína o polipéptido distinto de la subunidad de integrina alfa 10, en donde dicho otro péptido, proteína o polipéptido es capaz de unirse específicamente a un antígeno de la subunidad de integrina alfa 10. En una realización de la presente divulgación, dicho péptido, proteína o polipéptido está unido a una enzima, un fluoróforo o un trazador radiactivo. El trazador radiactivo puede, p. ej., seleccionarse entre un emisor de positrones o un emisor gamma.

El experto en la técnica es capaz de seleccionar el equipo de laboratorio convencional para la detección de anticuerpos anti-subunidad de integrina alfa 10, dependiendo de la situación y el estado físico de la muestra.

En una realización de la presente divulgación, el experto en la técnica llevaría a cabo la etapa de detección utilizando citometría de flujo tal como Clasificación de Células Activadas por Fluorescencia (FACS).

Los métodos inmunológicos típicos bien conocidos en la técnica incluyen, pero no se limitan a, transferencia Western, ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), inmunohistoquímica (IHC), ensayo inmunofluorescente.

La detección de la subunidad de integrina alfa 10 se puede lograr utilizando métodos bien conocidos en la técnica de la detección y la formación de imágenes, tal como la formación de imágenes clínicas, tal como los microscopios de fluorescencia convencionales, microscopio confocal, microscopios de 2 fotones, agotamiento de la emisión estimulada (STED), etc.

Sondas moleculares para la detección de la subunidad de integrina alfa 10

El análisis de la muestra biológica para detectar la presencia de un antígeno de la subunidad de integrina alfa 10 o un polinucleótido que codifica la subunidad de integrina alfa 10 también se puede llevar a cabo utilizando una sonda molecular (proteína o polinucleótido) capaz de unirse o hibridar con ARNm, ADNc o proteína de la subunidad de integrina alfa 10 para detectar su expresión en la muestra biológica o mediante PCR, preferiblemente Q-PCR.

En una realización de la presente divulgación, las sondas polinucleotídicas específicas de la subunidad de integrina alfa 10 están unidas a un radical detectable opcionalmente capaz de emitir fotones. Al usar esta realización de la presente divulgación, el sujeto que se va a diagnosticar o investigar puede iluminarse utilizando una fuente de luz capaz de excitar dicha fracción detectable, por ejemplo, un fluoróforo. Los métodos para detectar fotones incluyen, entre otros, PET-scan y SPECT-scan.

En ciertas realizaciones de la presente divulgación, el radical detectable se selecciona del grupo que consiste en un fluoróforo, una enzima o un trazador radiactivo.

Un transcrito polinucleotídico también puede detectarse utilizando PCR, preferiblemente Q-PCR.

En una realización adicional de la presente divulgación, la presencia de la subunidad de integrina alfa 10 en una muestra biológica se detecta utilizando una sonda de ácido nucleico de la subunidad de integrina alfa 10 que se une al ARN o ADNc de la subunidad de integrina alfa 10 en una reacción de hibridación.

Los componentes de direccionamiento específicos de la integrina alfa 10 de ácido nucleico ilustrativos incluyen sondas de ADN, ARN antisentido o ARNi, tales como microARN, ARN de interferencia cortos (ARNip) y ARN de horquilla corta (ARNhc).

Los métodos típicos para la detección de ácidos nucleicos bien conocidos en la técnica incluyen, entre otros, transferencia Northern, transferencia Southern, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), micromatrices, hibridación in situ, etc.

En una realización adicional de la presente divulgación, la presencia de la subunidad de integrina alfa 10 en una muestra biológica se detecta utilizando un péptido o proteína de unión a la subunidad de integrina alfa 10. Tales péptidos o proteínas se pueden hacer recombinantes, sintetizar químicamente o purificar a partir de una fuente natural.

En una realización adicional de la presente divulgación, la presencia de la subunidad de integrina alfa 10 en una muestra biológica se detecta in vivo mediante el uso de un anticuerpo específico de la subunidad de integrina alfa 10 o un péptido o proteína que se une a la subunidad de integrina alfa 10, o una sonda de ácido nucleico de la subunidad de integrina alfa 10 que se une a ARN o ADNc de la subunidad de integrina alfa 10 en una reacción de hibridación.

Los métodos típicos para la detección de antígenos de superficie celular y polinucleótidos in vivo son bien conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, tomografía por emisión de positrones, tomografía computarizada de rayos X (CT), resonancia magnética (MRI) y resonancia magnética funcional (fMRI), ultrasonido y tomografía computarizada por emisión de fotón único (SPECT). En particular, se pueden obtener imágenes de los antígenos de la superficie celular in vivo utilizando inmunomarcaje con un trazador radiactivo unido a un anticuerpo u otra proteína de unión específica.

Preferiblemente, los anticuerpos utilizados para la formación de imágenes in vivo son fragmentos de anticuerpos tales como fragmentos Fab y anticuerpos de cadena sencilla debido a su tamaño más pequeño y ausencia de función efectora.

Las etapas adicionales de los métodos pueden abarcar comparar la cantidad de subunidad de integrina alfa 10 detectada con un control positivo y/o negativo, detectando así la neoplasia maligna del SNC. Esto se puede realizar estableciendo niveles de fondo de una tinción en una configuración experimental particular para poder distinguir una tinción positiva de una negativa, para evaluar que el método ha funcionado como se esperaba y que una tinción positiva es una verdadera detección de dicha neoplasia.

Adicionalmente, el control positivo puede comprender una línea celular o tejido que se sabe que expresa la subunidad de integrina alfa 10. Los ejemplos de muestras de control incluyen, pero no se limitan a, líneas celulares de glioblastoma.

Adicionalmente, el control negativo puede comprender una línea celular o tejido que se sabe que no expresa la subunidad de integrina alfa 10. Los ejemplos de muestras de control incluyen, pero no se limitan a, células, tejidos o líneas celulares normales del cerebro, tales como el cerebro humano.

IV. Marcadores que se expresan conjuntamente con la subunidad de integrina alfa 10

Las células tumorales malignas, también denominadas células cancerosas, son la base del cáncer como enfermedad. Estas células inician tumores e impulsan la progresión tumoral, portando las mutaciones oncogénicas y supresoras de tumores que definen el cáncer como una enfermedad genética (Hanahan y Weinberg (2011) Cell 144(5)646-74)).

Las características específicas de las células tumorales malignas son que invaden los tejidos vecinos, entran en los vasos sanguíneos y producen metástasis en sitios distantes. Además de las células malignas, el microentorno tumoral también incluye células no malignas (p. ej., fibroblastos, miofibroblastos, células endoteliales, pericitos y células inflamatorias) y proteínas secretadas que rodean y apoyan el crecimiento del tumor. La interferencia entre las células tumorales y el microentorno cambia la composición del microentorno en una dirección y, a la inversa, el microentorno afecta la forma en que las células tumorales crecen y se propagan (Ansell y Vonderheide (2013) Ansell SM, Vonderheide RH (2013) Cellular composition of the tumour microenvironment. Am Soc Clin Oncol Educ Book).

La composición del microentorno tumoral varía dependiendo del sitio del tumor. El cerebro, en particular, consiste en numerosos tipos de células especializadas, tales como microglía, astrocitos y células endoteliales del cerebro. Además de las células que residen en el cerebro, también se ha demostrado que los tumores cerebrales están infiltrados por diferentes poblaciones de células hematopoyéticas (Lorger (2012) Cancer 4:218-243).

Muchos tipos de células diferentes son posibles dianas para el tratamiento del cáncer. Por ejemplo, se ha demostrado que los vasos sanguíneos del cerebro son importantes para la expansión y el mantenimiento de las poblaciones de células madre cancerosas en el glioma, se ha demostrado que los pericitos y su interacción con la vasculatura del tumor son cruciales para el crecimiento de tumores intracraneales en modelos animales y la inhibición del reclutamiento de células progenitoras endoteliales en tumores también puede tener valor terapéutico.

Está bien aceptado que los vasos sanguíneos promueven el crecimiento tumoral al suministrar la nutrición y el oxígeno a las células cancerosas. Además, las células tumorales usan los vasos sanguíneos para diseminarse a través del parénquima cerebral al migrar a lo largo del sitio del vaso abluminal entre las células endoteliales y los procesos de los pies terminales de los astrocitos. El mantenimiento de la población de células madre cancerosas (CSC) en los tumores cerebrales primarios también depende de la presencia del llamado nicho perivascular.

Las células del linaje de los monocitos se clasifican en función de su estado de maduración y su progenie incluye macrófagos y células dendríticas. La diferenciación de estas células se define por una variedad de marcadores de superficie celular tales como CD11c, CD14 y CD68.

Las células monocíticas son esenciales para la respuesta inmunitaria innata, actuando como una primera línea de resistencia contra patógenos mientras que también activan las respuestas inmunitarias adaptativas. Dependiendo del tipo de estimulación, los macrófagos pueden sufrir una activación clásica de M1 (estimulada por lipopolisacárido e IFN-y) o, alternativamente, activación de M2 (estimulada por IL-4 e IL-13). Los macrófagos M1 y M2 resultantes producen citocinas distintas y tienen diferentes roles funcionales en la respuesta inmunitaria innata. Por ejemplo, los macrófagos M1 secretan IL-12 y promueven el desarrollo de células TH1, mientras que los macrófagos M2 producen IL-10 y facilitan el desarrollo de células TH2 (Schmieder et al. (2012) Semin Cancer Biol. 22:289-297). Los macrófagos M1 se reclutan en tumores en estadio temprano, infiltrando el microentorno tumoral en respuesta a señales inflamatorias. Posteriormente, los macrófagos M1 liberan citocinas y quimiocinas proinflamatorias para promover el desarrollo y la diferenciación de las células T y NK. En estadios posteriores, los macrófagos se diferencian hacia una subpoblación llamada macrófagos asociados a tumores (TAM). Los TAM pueden polarizarse a células M2, liberando citocinas para estimular la diferenciación y el reclutamiento de TH2. Además, los TAM inhiben la inmunidad antitumoral al secretar citocinas supresoras, tales como TGF-, lo que conduce a un aumento de la angiogénesis y la expresión de factores de crecimiento implicados en el apoyo del crecimiento tumoral. Las observaciones clínicas sugieren que un aumento en el número o la densidad de macrófagos intratumorales se correlaciona tanto con la progresión como con el pronóstico en la mayoría de las neoplasias malignas (Bingle et al. (2002) Bingle L, Brown NJ, Lewis CE. (2002). El papel de los macrófagos asociados a tumores en la progresión tumoral es descrito por Bingle et al (2002) en J Pathol. 196: 254-265.

Como se demuestra en el ejemplo 7 y las figuras 8-9, los autores de la presente invención han descubierto que varios marcadores se expresan conjuntamente en diversos grados con la subunidad de integrina alfa 10. Estos marcadores incluyen EGFRvlll, Nestina, PSA-NCAM, GFAP, PDGFRb (CD140b), PECAM-1 (CD31), CD45, CD68, CD163 y CD206. Basándose en estos hallazgos, los autores de la presente invención han proporcionado un método multidimensional para detectar y tratar células que incluyen neoplasias malignas del sistema nervioso central de un mamífero.

Así, en un aspecto, la presente divulgación se refiere a un método para detectar una célula de mamífero maligna o asociada a un tumor, comprendiendo dicho método analizar en una muestra aislada, la presencia o ausencia de:

b) un primer transcrito polinucleotídico que codifica un polipéptido de la subunidad de integrina alfa 10 o un fragmento o variante del mismo; y

d) un segundo transcrito polinucleotídico que codifica un polipéptido o un fragmento o variante del mismo, en donde dicho polipéptido se selecciona del grupo que consiste en EGFRvlll, Nestina, PSA-NCAM, GFAP, PDGFRb (CD140b), PECAM-1 (CD31), CD45, CD68, CD163 y CD206;

en donde la presencia del primer antígeno de a) y/o el primer transcrito polinucleotídico de b); junto con el segundo antígeno de c) y/o el segundo transcrito de d), es indicativa de que dicha célula de mamífero es una célula maligna o asociada a un tumor.

En un aspecto, la presente divulgación se refiere a un método para detectar una célula maligna o asociada a un tumor de un mamífero, comprendiendo dicho método las etapas de:

a) administrar a un sujeto una primera sonda molecular capaz de unirse específicamente a un polipéptido de la subunidad de integrina alfa 10; y/o a un transcrito polinucleotídico de la subunidad de integrina alfa 10, estando dicha primera sonda unida covalentemente a un primer radical capaz de emitir fotones; y

b) administrar a un sujeto una segunda sonda molecular capaz de unirse específicamente a un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en donde dicho polipéptido se selecciona del grupo que consiste en EGFRvlll, Nestina, PSA-NCAM, GFAP, PDGFRb (CD140b), PECAM- 1 (CD31), CD45, CD68, CD163 y CD206; y/o a un transcrito polinucleotídico que codifica un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en EGFRvlll, Nestina, PSA-NCAM, GFAP, PDGFRb (CD140b), PECAM-1 (Cd 31), CD45, CD68, CD163 y CD206, estando dicha segunda sonda unida covalentemente a un segundo radical capaz de emitir fotones;

c) detectar los fotones emitidos desde dicho primer y segundo radicales, formando así una imagen del sistema nervioso central o parte del mismo,

en donde la emisión localizada de fotones de dicho primer y segundo radicales es indicativa de una célula maligna o asociada a un tumor de dicho mamífero.

EGFRvIII

El receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) se expresa en exceso en una variedad de tumores epiteliales humanos, a menudo como consecuencia de la amplificación de genes. Los tumores con amplificación del gen EGFR contienen frecuentemente reordenamientos del gen EGFR, siendo la mutación del dominio extracelular más común EGFRvIII. Se ha demostrado que la señalización aberrante de EGFRvIII es importante para impulsar la progresión del tumor y, a menudo, se correlaciona con un mal pronóstico. Está claro que EGFRvIII se expresa en una proporción considerable de pacientes con glioblastoma multiforme (GBM). Sin embargo, la presencia de EGFRvIII en otros tipos de tumores sigue siendo controvertida. (Gan et al (2013) FEBS J 280(21):5350-5370). Los autores de la presente invención han descubierto que EGFRvIII se co-expresa en un grado muy alto con la subunidad de la integrina alfa 10 en células malignas. Por tanto, en una realización de la presente divulgación de la presente divulgación, la detección de una célula que co-expresa un antígeno de la subunidad de integrina alfa 10 y un antígeno EGFRvIII, es indicativa de que dicha célula es una célula maligna, tal como una célula de una neoplasia maligna del SNC, p. ej., una célula de un glioma en el mamífero del que se obtiene dicha muestra. En otra realización de la presente divulgación, la detección de una célula que comprende un transcrito polinucleotídico que codifica un polipéptido de la subunidad de integrina alfa 10; y un transcrito polinucleotídico que codifica un polipéptido EGFRvIII, es indicativa de que dicha célula es una célula maligna, tal como una célula de una neoplasia maligna del SNC, p. ej., una célula de un glioma en un mamífero del que se obtiene dicha muestra.

Nestina

La Nestina es una proteína de filamentos intermedios (IF) de tipo VI. Estas proteínas de filamentos intermedios se expresan principalmente en neuronas en las que están implicadas en el crecimiento radial del axón. La nestina ha sido el marcador más utilizado para identificar células madre del SNC en diversas áreas del sistema nervioso en desarrollo y en células cultivadas in vitro. Los autores de la presente invención han descubierto que la nestina se co-expresa con la subunidad de integrina alfa 10 en algunas células del SNC. Por tanto, en una realización de la presente divulgación, la detección de una célula que co-expresa un antígeno de la subunidad de integrina alfa 10 y un antígeno de nestina, es indicativa de que dicha célula es una célula maligna o asociada a un tumor, tal como una célula de una neoplasia maligna del SNC, p. ej., una célula de un glioma, en el mamífero del que se obtiene dicha muestra. En otra realización de la presente divulgación, la detección de una célula que comprende un transcrito polinucleotídico que codifica un polipéptido de la subunidad de integrina alfa 10; y un transcrito polinucleotídico que codifica un polipéptido de nestina, es indicativa de que dicha célula es una célula maligna o asociada a un tumor, tal como una célula de una neoplasia maligna del SNC, p. ej., una célula de un glioma en un mamífero del que dicha se obtiene muestra.

PSA-NCAM

La Molécula de Adhesión de Células Neuronales Polisialiladas (PSA-NCAM) es un marcador de neuronas en desarrollo y migratorias y de sinaptogénesis en el sistema nervioso de vertebrados inmaduros. Los autores de la presente invención han descubierto que PSA-NCAM se co-expresa con la subunidad de integrina alfa 10 en células malignas o asociadas a tumores. Por tanto, en una realización de la presente divulgación, la detección de una célula que co-expresa un antígeno de la subunidad de integrina alfa 10 y un antígeno PSA-NCAM, es indicativa de que dicha célula es una célula maligna o asociada a un tumor, tal como una célula de una neoplasia maligna del SNC, p. ej., una célula de un glioma, en el mamífero del que se obtiene dicha muestra.

En otra realización de la presente divulgación, la detección de una célula que comprende un transcrito polinucleotídico que codifica un polipéptido de la subunidad de integrina alfa 10; y un transcrito polinucleotídico que codifica un polipéptido PSA-NCAM, es indicativa de que dicha célula es una célula maligna o asociada a un tumor, tal como una célula de una neoplasia maligna del SNC, p. ej., una célula de un glioma en un mamífero del que se obtiene dicha muestra.

GFAP

La Proteína Ácida Fibrilar Glial (GFAP) es una proteína de filamentos intermedios (IF) que se expresa en numerosos tipos de células del sistema nervioso central (SNC), incluidos los astrocitos y las células ependimarias. Se cree que GFAP ayuda a mantener la fuerza mecánica de los astrocitos, así como la forma de las células, pero su función exacta sigue siendo poco conocida, a pesar de la cantidad de estudios que la utilizan como marcador celular. Los autores de la presente invención han descubierto que GFAP se co-expresa con la subunidad de integrina alfa 10 en células malignas. Por tanto, en una realización de la presente divulgación, la detección de una célula que co-expresa un antígeno de la subunidad de integrina alfa 10 y un antígeno de GFAP, es indicativa de que dicha célula es una célula maligna o asociada a un tumor, tal como una célula de una neoplasia maligna del SNC, p. ej., una célula de un glioma, en el mamífero del que se obtiene dicha muestra. En otra realización de la presente divulgación, la detección de una célula que comprende un transcrito polinucleotídico que codifica un polipéptido de la subunidad de integrina alfa 10; y un transcrito polinucleotídico que codifica un polipéptido GFAP, es indicativa de que dicha célula es una célula maligna o asociada a un tumor, tal como una célula de una neoplasia maligna del SNC, p. ej., una célula de un glioma en un mamífero del que se obtiene dicha muestra.

PDGFRb (CD140b)

El receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas de tipo beta es una proteína que en seres humanos está codificada por el gen PDGFRB. Este gen codifica un receptor de tirosina quinasa de superficie celular para miembros de la familia de factores de crecimiento derivados de plaquetas. Estos factores de crecimiento son mitógenos para células de origen mesenquimatoso. Los autores de la presente invención han descubierto que PDGFRb/CD140b se co-expresa con la subunidad de integrina alfa 10 en células malignas. Por tanto, en una realización de la presente divulgación, la detección de una célula que co-expresa un antígeno de la subunidad de integrina alfa 10 y un antígeno de PDGFRb/CD140b, es indicativa de que dicha célula es una célula maligna o asociada a un tumor, tal como una célula de una neoplasia maligna del SNC, p. ej., una célula de un glioma, en el mamífero del que se obtiene dicha muestra. En otra realización de la presente divulgación, la detección de una célula que comprende un transcrito polinucleotídico que codifica un polipéptido de la subunidad de integrina alfa 10; y un transcrito polinucleotídico que codifica un polipéptido PDGFRb/CD140b, es indicativa de que dicha célula es una célula maligna o asociada a un tumor, tal como una célula de una neoplasia maligna del SNC, p. ej., una célula de un glioma en el mamífero del que se obtiene dicha muestra.

PECAM-1 (CD31)

La molécula de adhesión de células endoteliales plaquetarias (PECAM-1) también conocida como Cúmulo de Diferenciación 31 (CD31) juega un papel clave en la eliminación de neutrófilos envejecidos del cuerpo humano. PECAM-1 se encuentra normalmente en células endoteliales, plaquetas, macrófagos y células de Kupffer, granulocitos, células T/NK, linfocitos, megacariocitos, osteoclastos, neutrófilos. CD31 también se expresa en ciertos tumores, incluido el hemangioendotelioma epitelioide, el hemangioendotelioma similar al sarcoma epitelioide, otros tumores vasculares, neoplasias histiocíticas y plasmocitomas. Rara vez se encuentra en algunos sarcomas, tales como el sarcoma de Kaposi y los carcinomas. Los autores de la presente invención han descubierto que PECAM-1 (CD31) se co-expresa con la subunidad de integrina alfa 10 en células malignas. Por tanto, en una realización de la presente divulgación, la detección de una célula que co-expresa un antígeno de la subunidad de integrina alfa 10 y un antígeno PECAM-1 (CD31), es indicativa de que dicha célula es una célula maligna o asociada a un tumor, tal como una célula de una neoplasia maligna del SNC, por ejemplo, una célula de un glioma, en el mamífero del que se obtiene dicha muestra. En otra realización de la presente divulgación, la detección de una célula que comprende un transcrito polinucleotídico que codifica un polipéptido de la subunidad de integrina alfa 10; y un transcrito polinucleotídico que codifica un polipéptido PECAM-1 (CD31), es indicativa de que dicha célula es una célula maligna o asociada a un tumor, tal como una célula de una neoplasia maligna del SNC, p. ej., una célula de un glioma en un mamífero. del cual se obtiene dicha muestra.

CD45

CD45 también conocido como proteína tirosina fosfatasa, tipo receptor, C (PTPRC) es una enzima que, en seres humanos, está codificada por el gen PTPRC. CD45 es una proteína transmembrana de tipo I que en diversas formas está presente en todas las células hematopoyéticas diferenciadas, excepto en los eritrocitos y las células plasmáticas, que ayuda en la activación de esas células. CD45 se expresa en linfomas, leucemia linfocítica crónica de células B, leucemia de células pilosas y leucemia no linfocítica aguda. Los autores de la presente invención han descubierto que CD45 se co-expresa en un alto grado con la subunidad de la integrina alfa 10 en células malignas. Por tanto, en una realización de la presente divulgación, la detección de una célula que co-expresa un antígeno de la subunidad de integrina alfa 10 y un antígeno CD45, es indicativa de que dicha célula es una célula maligna o asociada a un tumor, tal como una célula de una neoplasia maligna. del SNC, p. ej., una célula de un glioma, en el mamífero del que se obtiene dicha muestra.

En otra realización de la presente divulgación, la detección de una célula que comprende un transcrito polinucleotídico que codifica un polipéptido de la subunidad de integrina alfa 10; y un transcrito polinucleotídico que codifica un polipéptido CD45, es indicativa de que dicha célula es una célula maligna o asociada a un tumor, tal como una célula de una neoplasia maligna del SNC, p. ej., una célula de un glioma en un mamífero del que se obtiene dicha muestra.

CD68

CD68 (Cúmulo de Diferenciación 68) es una glicoproteína que se une a lipoproteínas de baja densidad. CD68 se encuentra en los gránulos citoplasmáticos de una variedad de diferentes células sanguíneas y miocitos. Se considera particularmente útil como marcador para las diversas células del linaje de macrófagos, incluidos monocitos, histiocitos, células gigantes, células de Kupffer y osteoclastos. Su presencia en macrófagos también la hace útil en el diagnóstico de afecciones relacionadas con la proliferación o anomalías de estas células, tales como histiocitosis maligna, linfoma histiocítico y enfermedad de Gaucher. Los autores de la presente invención han descubierto que CD68 se co-expresa en un grado muy alto con la subunidad de integrina alfa 10 en células malignas. Por tanto, en una realización de la presente divulgación, la detección de una célula que co-expresa un antígeno de la subunidad de integrina alfa 10 y un antígeno CD68, es indicativa de que dicha célula es una célula maligna o asociada a un tumor, tal como una célula de una neoplasia maligna. del SNC, p. ej., una célula de un glioma, en el mamífero del que se obtiene dicha muestra. En otra realización de la presente divulgación, la detección de una célula que comprende un transcrito polinucleotídico que codifica un polipéptido de la subunidad de integrina alfa 10; y un transcrito polinucleotídico que codifica un polipéptido CD68, es indicativa de que dicha célula es una célula maligna o asociada a un tumor, tal como una célula de una neoplasia maligna del SNC, p. ej., una célula de un glioma en un mamífero del que se obtiene dicha muestra.

CD163

CD163 (Cúmulo de Diferenciación 163) es un receptor captador del complejo hemoglobina-haptoglobina. También se ha demostrado que marca células de linaje de monocitos/macrófagos. Los autores de la presente invención han descubierto que CD163 se co-expresa con la subunidad de integrina alfa 10 en células malignas. Por tanto, en una realización de la presente divulgación, la detección de una célula que co-expresa un antígeno de la subunidad de integrina alfa 10 y un antígeno CD163, es indicativa de que dicha célula es una célula maligna o asociada a un tumor, tal como una célula de una neoplasia maligna. del SNC, p. ej., una célula de un glioma, en el mamífero del que se obtiene dicha muestra. En otra realización de la presente divulgación, la detección de una célula que comprende un transcrito polinucleotídico que codifica un polipéptido de la subunidad de integrina alfa 10; y un transcrito polinucleotídico que codifica un polipéptido CD163, es indicativa de que dicha célula es una célula maligna o asociada a un tumor, tal como una célula de una neoplasia maligna del SNC, p. ej., una célula de un glioma en un mamífero del que se obtiene dicha muestra.

CD206

CD206 (Cúmulo de Diferenciación 206), también conocido como receptor de manosa, está presente principalmente en la superficie de los macrófagos y las células dendríticas inmaduras, pero también se expresa en la superficie de células de la piel tales como queratinocitos y fibroblastos dérmicos humanos. Los autores de la presente invención han descubierto que CD206 se co-expresa con la subunidad de integrina alfa 10 en células malignas. Por tanto, en una realización de la presente divulgación, la detección de una célula que co-expresa un antígeno de la subunidad de integrina alfa 10 y un antígeno CD206, es indicativa de que dicha célula es una célula maligna o asociada a un tumor, tal como una célula de una neoplasia maligna del SNC, p. ej., una célula de un glioma, en el mamífero del que se obtiene dicha muestra. En otra realización de la presente divulgación, la detección de una célula que comprende un transcrito polinucleotídico que codifica un polipéptido de la subunidad de integrina alfa 10; y un transcrito polinucleotídico que codifica un polipéptido CD206, es indicativa de que dicha célula es una célula maligna o asociada a un tumor, tal como una célula de una neoplasia maligna del SNC, p. ej., una célula de un glioma en un mamífero del que se obtiene dicha muestra.

Basándose en los datos de la presente divulgación y la evidencia de la bibliografía, los autores de la presente invención han proporcionado un método para identificar células que expresan un polipéptido de la subunidad de integrina alfa 10 y un polipéptido adicional seleccionado del grupo que consiste en EGFRvlll, Nestina, PSA-NCAM, GFAP, PDGFRb (CD140b), PECAM-1 (CD31), CD45, CD68 , CD163 y CD206. Dependiendo del patrón de expresión, las células se pueden identificar como se indica en la tabla 1.

Las muestras analizadas según la presente divulgación contienen células malignas o células asociadas a tumores. En una realización de la presente divulgación, las células que expresan la subunidad de integrina alfa 10 son células malignas. En una realización de la presente divulgación, las células que expresan la subunidad de integrina alfa 10 son células asociadas a tumores. En una realización de la presente divulgación, las células malignas o las células asociadas a tumores comprenden células seleccionadas del grupo que consiste en células gliales; células madre; células progenitoras; astrocitos; pericitos; células endoteliales; células hematopoyéticas; y microglía.

Las células hematopoyéticas pueden, por ejemplo, seleccionarse del grupo que consiste en células madre hematopoyéticas, células T, células B, células plasmáticas, células NK, células dendríticas, macrófagos, y monocitos. En una realización particular de la presente divulgación, el macrófago es un macrófago asociado a tumor (tA m ).

En una realización de la presente descripción la célula se selecciona del grupo que consiste de las células EGFRvIII+, células nestina+, células PSA-NCAM+, células GFAP+, células PDGFRb+ (células CD140b+), células PECAM-1+ (células CD31+), células CD45+, células CD68+, células CD163+ y células CD206+, o cualquier combinación de las mismas.

V. Muestras

La muestra puede ser cualquier muestra del SNC u obtenida del mismo. Los métodos para obtener muestras de tejido o sangre son rutinarios para el experto en la técnica. En ciertas realizaciones de la presente divulgación, la muestra biológica es una muestra de tejido cerebral o una muestra de tejido de la médula espinal. En realizaciones adicionales de la presente divulgación, la muestra biológica es una muestra de tejido de tumor cerebral o una muestra de tejido de tumor de médula espinal. En realizaciones adicionales de la presente divulgación, la muestra biológica es una muestra de sangre.

Como se demuestra en el ejemplo 4 y la figura 5, también es posible detectar la subunidad de integrina alfa 10 en células presentes en la sangre, tales como sangre completa o plasma sanguíneo. Por tanto, en una realización de la presente divulgación, la detección o el diagnóstico de una neoplasia maligna del SNC se realiza tomando una muestra de sangre y analizando la presencia o ausencia de la subunidad de integrina alfa 10 o un fragmento de la misma (p. ej., un fragmento que comprende SEQ ID NO: 2 o 3) sobre o dentro de las células presentes en dicha muestra de sangre.

En realizaciones adicionales de la presente divulgación, la muestra biológica es un sujeto, es decir, la prueba para la expresión de la subunidad de integrina alfa 10 se realiza in vivo o in situ. Después de la extirpación de una neoplasia maligna del SNC de un sujeto mediante cirugía, se puede usar un anticuerpo específico de la subunidad de integrina alfa 10, o un péptido o proteína de unión a subunidad de integrina alfa 10, o una sonda de ácido nucleico de subunidad de integrina alfa 10 para detectar restos células del tumor. Esto se puede realizar poniendo en contacto el espacio donde se ha extirpado el tumor cerebral, aplicando el anticuerpo específico de la subunidad de integrina alfa 10, o el péptido o proteína de unión a la subunidad de integrina alfa 10, o la sonda de ácido nucleico de la subunidad de integrina alfa 10 a la cavidad que aparece después de la extirpación del tumor. Por tanto, el anticuerpo específico de la subunidad de integrina alfa 10, o el péptido o proteína de unión a la subunidad de integrina alfa 10, o la sonda de ácido nucleico de la subunidad de integrina alfa 10 aplicados detectarán cualquier célula residual del tumor de glioma que quede en la cavidad después de la extirpación del tumor.

En realizaciones adicionales de la presente divulgación, el anticuerpo específico de la subunidad de integrina alfa 10, o el péptido o proteína de unión a la subunidad de integrina alfa 10, o la sonda de ácido nucleico de la subunidad de integrina alfa 10 se pueden aplicar a la cavidad que aparece después de la extirpación del tumor mediante cepillado o rociado.

Los expertos en la técnica conocen varios métodos de detección para la detección de tejidos o células in vivo. Tales métodos de formación de imágenes incluyen tomografía por emisión de positrones (PET), tomografía computarizada por emisión de fotón único (SPECT), tomografía computarizada de rayos X (CT), formación de imágenes por resonancia magnética (MRI), formación de imágenes por resonancia magnética funcional (fMRI) y ultrasonido.

Un aspecto adicional de la presente divulgación es el uso de un anticuerpo específico de la subunidad de integrina alfa 10, o un péptido o proteína de unión a la subunidad de integrina alfa 10, o una sonda de ácido nucleico de la subunidad de integrina alfa 10 para detectar un glioma en una muestra biológica in vitro, in situ o in vivo.

VI. Kits

Aspectos adicionales de la presente divulgación proporcionan un kit para detectar una neoplasia maligna del SNC, tal como un glioma, en una muestra biológica, comprendiendo el kit

a) un anticuerpo específico para la subunidad de integrina alfa 10, un péptido que se une a un antígeno de la subunidad de integrina alfa 10, una sonda polinucleotídica capaz de hibridar con un transcrito de la subunidad de integrina alfa 10; o

b) un par de cebadores para la amplificación de un transcrito de la subunidad de integrina alfa 10; y

c) opcionalmente, instrucciones de uso.

Adicionalmente, dicho kit puede incluir muestras de control positivas y/o negativas, tales como una línea celular o tejido que se sabe que expresan o no la subunidad de integrina alfa 10. Los ejemplos de muestras de control incluyen, pero no se limitan a, líneas celulares de glioblastoma, células normales, tejidos o líneas celulares de cerebro, tal como cerebro humano. En realizaciones adicionales de la presente divulgación, las células o líneas celulares cerebrales proceden de un adulto.

En algunas realizaciones de la presente divulgación, el kit incluye materiales instructivos que describen, por ejemplo, los medios de uso del anticuerpo específico anti-subunidad de integrina alfa 10, o el péptido que se une a un antígeno de la subunidad de integrina alfa 10, o la sonda de ácido nucleico que codifica la subunidad de integrina alfa 10 o su complemento. Las instrucciones pueden estar escritas, en formato electrónico o pueden ser visuales.

En algunas realizaciones de la presente divulgación, el kit también puede incluir componentes adicionales para facilitar la aplicación particular para la que está diseñado el kit. Por tanto, por ejemplo, el kit puede incluir tampones y otros reactivos utilizados habitualmente para la práctica del método descrito. Tales kits y contenidos apropiados son bien conocidos por los expertos en la técnica.

En ciertas realizaciones de la presente divulgación, el kit comprende reactivos adicionales, tales como anticuerpos, para la detección de uno o más marcadores adicionales que se sabe que se co-expresan o co-localizan con la subunidad de integrina alfa 10 como se describe en otra parte de la presente memoria.

VII. Radicales detectables

Los anticuerpos anti-subunidad de integrina alfa 10 de la presente divulgación pueden comprender un radical detectable, p. ej., el anticuerpo puede estar unido covalentemente al radical detectable.

En una realización de la presente divulgación, el anticuerpo se une covalentemente a un radical detectable seleccionado del grupo que consiste en un fluoróforo, una enzima o un trazador radiactivo o radioisótopo. En una realización de la presente divulgación, el radical detectable es un trazador radiactivo seleccionado entre un emisor de positrones y un emisor gamma. En una realización de la presente divulgación, el radioisótopo se selecciona del grupo que consiste en 99mTc, 111In, 67Ga, 68Ga, 72As, 89Zr, 123I y 201Tl.

En una realización de la presente divulgación, el anticuerpo comprende un par de radionúclidos detectables y citotóxicos, tales como 86Y/90Y o 124I/211At.

En una realización de la presente divulgación, el radioisótopo es capaz de actuar simultáneamente de una manera multimodal como un radical detectable y también como un radical citotóxico.

En una realización de la presente divulgación, el radical detectable comprende o consiste en un isótopo paramagnético, tal como uno seleccionado del grupo que consiste en 157Gd, 55Mn, 162Dy, 52Cr y 56Fe. En una realización, el radical detectable es detectable mediante una técnica de formación de imágenes tal como SPECT, PET, MRI, formación de imágenes óptica o por ultrasonidos.

En una realización de la presente divulgación, el radical citotóxico y/o el radical detectable se unen al anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo indirectamente, mediante un radical conector. El radical conector puede ser, por ejemplo, un quelante, tal como un quelante seleccionado del grupo que consiste en derivados de ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetraacético (DOTA), deferoxamina (DFO), derivados de ácido dietilentriaminopentaacético ávido (DTPA), derivados del ácido S-2-(4-isotiocianatobencil)-1,4,7-triazaciclononan-1,4,7-triacético (NOTA) y derivados de ácido 1,4,8,11-tetraazaciclodocedan-1,4,8,11-tetraacético (TETA).

Ejemplos

Ejemplo 1: Expresión de la subunidad de integrina alfa 10 en células aisladas de un tumor cerebral de glioblastoma

Se cultivó una línea celular que derivaba del material del paciente, obtenida de muestras de tejido tumoral cerebral recolectadas como biopsias quirúrgicas en el Hospital Universitario de Lund a 37°C con 5% de CO2 en medio DMEM con un suplemento de FBS al 10% y Pen Strep al 1%. Las células se cultivaron hasta una confluencia de 70-90%. Las células se lavaron en PBS (0,1 M, pH 7,4) y después del tratamiento con tripsina se movieron a la parte inferior de portaobjetos de microscopio especializados (Ibidi, Alemania). Las células se cultivaron hasta una confluencia de 50-100% antes de la fijación, seguido de marcaje por inmunofluorescencia.

El marcaje de células por inmunofluorescencia se realizó siguiendo el protocolo:

1. Se extrajo/aspiró el medio celular. Las células se fijaron en PFA al 4% frío (<10°C) durante 10-20 min.

2. Las células se enjuagaron en PBS (0,1 M, pH 7,4) durante 2 x 5 min.

3. Las células se incubaron en una solución de bloqueo, PBS que contenía Triton-X 100 al 0,02% durante 20 min.

4. Las células se incubaron en PBS (0,1 M, pH 7,4) que contenía Triton-X 100 al 0,001% (0,1-0,001%*) y albúmina de suero bovino (BSA) al 1% durante 20 min.

5. Las células se incubaron en anticuerpos primarios, 1 pg/ml de MAb contra alfa 10 (1-2 pg) diluidos en PBS (0,1 M, pH 7,4) que contenía Triton-X 100 al 0,001% (0,1-0,001%*) y albúmina de suero bovino (BSA) al 1% durante 90 min.

6. Las células se enjuagaron en PBS (pH 7,4) durante 2 x 10 min y a continuación se incubaron en anticuerpos secundarios, 1:150 (AlexaFluor 488 a-ratón y AlexaFluor 568 a-conejo preparados en cabra, Invitrogen, USA), diluidos en PBS (0,1 M, pH 7,4) que contenía Triton-X 100 al 0,001% (0,1-0,001 %) y albúmina de suero bovino (BSA) al 1% durante 30 min.

7. Las células se enjuagaron en PBS (0,1 M, pH 7,4) durante 1 2x7 min.

8. Las células se incubaron en DAPI (0,1 pM, en PBS) durante >10 min.

No se requiere montaje para análisis mediante microscopios invertidos, como se emplea en la presente memoria.

Para la obtención de imágenes y análisis se utilizó microscopía confocal.

En conclusión, mediante el uso de un anticuerpo dirigido contra la integrina a10 (mAb 365, (WO 99/51639)) se demostró sorprendentemente que la integrina a 10 se expresa de manera específica y fuerte en células de glioblastoma derivadas del glioblastoma (glioma grado IV, glioblastoma multiforme), la forma más agresiva de glioma (figura 2).

Ejemplo 2: Expresión de la subunidad de integrina alfa 10 en tejido tumoral cerebral de pacientes con glioblastoma visualizada por inmunofluorescencia

Se recogieron muestras de tejido de tumor cerebral como biopsias quirúrgicas de pacientes en e1Hospital Universitario de Lund.

Los tejidos se seccionaron, 5 pm (micrótomo MICROM HM 360) y se recogieron en portaobjetos SuperFrost Plus (Menzel-Glaser, GmbH). Las secciones se utilizaron para el inmunomarcaje, directamente o después de la post-fijación con acetona (100% a -20 ° C, durante 10 min, véase más abajo).

Se incluyeron tejidos congelados de nueva aportación en TissueTek (Sakura, Jpn). Se recogieron secciones de 10 pm (preparadas en un criostato MICROM HM 500 OM) en portaobjetos SuperFrost Plus. Las secciones se utilizaron para el inmunomarcaje, después de la post-fijación con acetona (100% a -20°C, durante 10 min, véase más abajo).

Después de la recuperación del antígeno, se siguió el siguiente protocolo:

1. Enjuagar/tamponar en PBS 5 min, a TA.

2. Bloquear con PBS que contiene BSA al 1%, durante 20 min, a TA.

3. Enjuagar con PBS (PBS-Triton X100) 5 min, a TA.

4. Incubar secciones con H2O2 al 0,03% (en PBS), durante 10 min, a TA (extinguir la actividad peroxidasa endógena)

5. Enjuagar en PBS, 5 min x 2, a TA.

6. Incubar secciones con anticuerpos primarios, con PAb contra alfa 10 de 1 pg/ml (0,6-1,2 pg/ml), diluidos en PBS que contiene BSA al 1%, Triton X100 al 0,05%).

- durante la noche (aprox. 16-18 h) a 4°C.

7. Enjuagar en PBS 5 min x 2 (misma temperatura que los portaobjetos/secciones).

8. Aplicar anticuerpos secundarios conjugados durante 30 min (a-conejo), a TA. (diluidos en PBS que contiene BSA al 1%, Triton X100 al 0,05%).

9. Enjuagar en PBS, 5 min x 2, a TA.

10. Incubar/hacer reaccionar en solución de DAB/H2O2 al 0,03%, 1-10 min, a TA.

11. Enjuagar en PBS, 5 min x 2, a TA.

Contratinción de secciones inmunomarcadas:

1. Incubar con hematoxilina (Mayers), 2 min, a TA.

2. Enjuagar en PBS 3 min, a TA.

3. Lavar con PBS 2 min, a TA.

Montaje:

Deshidratar secciones mediante inmersión en

1. En etanol del 70%, 96%, 100% x 2, durante 2 min en cada concentración.

2. Xileno >3 min x2.

3. Montar los portaobjetos en Pertex® (Histolab, Suecia) y el cubreobjetos con portaobjetos de vidrio (22x 30-50 mm).

Análisis y documentación: La microscopía de campo claro proporciona una buena detección de la distribución general del marcaje con relación celular, especialmente en secciones delgadas de parafina (5 pm).

Aparatos: microscopio Leica DMRE, que utiliza objetivos Plan Apochromate 10x/0,3 y 20x/0,5. Las imágenes digitales (1360 x 1024 px) se adquirieron con una cámara c Cd Leica DCF500 y el soporte lógico de adquisición de imágenes LAS (Leica Application Suite) v4.4.

En conclusión, mediante el uso de un anticuerpo policlonal dirigido contra la subunidad de integrina alfa 10 se demostró sorprendentemente que la subunidad de integrina alfa 10 se expresa de forma específica y fuerte en células de glioblastoma en muestras de tejido tumoral recogidas como biopsias quirúrgicas de pacientes de1Hospital Universitario de Lund (figura 3).

Ejemplo 3: Expresión de la subunidad de integrina alfa 10 en tejido tumoral cerebral de pacientes con glioblastoma en comparación con la expresión en tejido cerebral no afectado visualizada por inmunohistoquímica Se recogieron muestras de tejido cerebral de pacientes de regiones aparentemente no afectadas y de regiones con tejido cerebral maligno (según lo diagnosticaron dos patólogos independientes) como biopsias quirúrgicas de pacientes en el Hospital Universitario de Lund.

Las secciones de parafina se desparafinaron y rehidrataron mediante la inmersión de portaobjetos en xileno seguido de una serie de etanol y agua de acuerdo con protocolos convencionales.

Las secciones de parafina se post-fijaron en acetona seguido de enjuagado en PBS, 5 min x 2. Las secciones de parafina se trataron para la recuperación del antígeno sumergiendo los portaobjetos en solución tamponada ácida - tampón de citrato (Citrato de sodio 10mM, Tween 20 al 0,05%, pH 6,0) y tratamiento con calor. Después de la recuperación del antígeno, se siguió el siguiente protocolo:

1. Enjuagar/tamponar en PBS 5 min, a TA.

2. Bloquear con PBS que contiene BSA al 1%, durante 20 min, a TA.

3. Enjuagar con PBS (PBS-Triton X100) 5 min, a TA.

4. Incubar las secciones con H2O2 al 0,03% (en PBS), durante 10 min, a TA (extinguir la actividad peroxidasa endógena)

5. Enjuagar en PBS, 5 min x 2, a TA.

6. Incubar las secciones con anticuerpos primarios, con 1 pg/ml de PAb contra alfa 10 (0,6-1,2 pg/ml), diluidos en PBS que contiene BSA al 1%, Triton x 100 al 0,05%).

- durante la noche (aprox. 16-18 h) a 4°C.

7. Enjuagar en PBS 5 min x 2 (la misma temperatura que los portaobjetos/secciones).

8. Aplicar anticuerpos secundarios conjugados durante 30 min (anti-conejo), a TA. (diluidos en PBS que contiene BSA al 1%, Triton X100 al 0,05%).

9. Enjuagar en PBS, 5 min x 2, a TA.

10. Incubar/hacer reaccionar en solución de DAB/H2O2 al 0,03%, 1-10 min, a TA.

11. Enjuagar en PBS, 5 min x 2, a TA.

Contratinción de secciones inmunomarcadas:

1. Incubar con hematoxilina (Mayers), 2 min, a TA.

2. Enjuagar en PBS 3 min, a TA.

3. Lavar con PBS 2 min, a TA.

Montaje:

Deshidratar las secciones mediante inmersión en

1. En etanol del 70%, 96%, 100% x 2, durante 2 min en cada concentración.

2. Xileno >3 min x2.

Análisis y documentación: La microscopía de campo claro proporciona una buena detección de la distribución de marcaje general con relación celular, especialmente en secciones delgadas de parafina (5 pm).

La Figura 4A muestra una parte de la muestra del paciente con una morfología cerebral aparentemente no afectada mientras que la Figura 4B muestra otra parte de la misma muestra con tejido cerebral maligno (glioblastoma multiforme). En conclusión, mediante el uso de un anticuerpo policlonal dirigido contra la subunidad de integrina alfa 10 (Camper et al (1998) J Biol Chem. 273(32):20383-9) se demostró que la subunidad de integrina alfa 10 es específica y fuertemente expresada en células de glioblastoma, mientras que se observó una expresión insignificante de la subunidad de integrina alfa 10 en tejido cerebral morfológicamente no afectado.

Ejemplo 4: Expresión de la subunidad de integrina alfa 10 en muestras de tejidos de tumores cerebrales de pacientes con gliomas de diferentes grados.

Se utilizó material de paciente que consistía en muestras de tejido de tumor cerebral recogidas como biopsias quirúrgicas o post-mortem del Hospital de la Universidad de Lund.

Los tejidos se seccionaron, 5 pm (micrótomo MICROM HM 360) y se recogieron en portaobjetos SuperFrost Plus (Menzel-Gláser, GmbH). Las secciones se utilizaron para el inmunomarcaje, directamente o después de la post-fijación con acetona (100% a -20°C, durante 10 min, véase más abajo).

Se incluyeron tejidos congelados de nueva aportación en TissueTek (Sakura, Jpn). Se recogieron secciones de 10 pm (preparadas en un criostato MICROM HM 500 OM) en portaobjetos SuperFrost Plus Las secciones se utilizaron para el inmunomarcaje, después de la post-fijación con acetona (100% a -20°C, durante 10 min, véase más abajo).

1. Secciones criogénicas (recién cortadas o congeladas): Secar las secciones al aire a 37°C durante aprox. 20 min y dejar que las secciones alcancen la temperatura ambiente.

2. Enjuagar en PBS, > 5 min x2

3. Fijar con posterioridad las secciones en acetona, seguido de enjuagado en PBS, 5 min x 2

4. Aplicar una barrera de silicona ("bolígrafo PAP") alrededor de la sección.

5. Incubar/bloquear en PBS que contiene TritonX-100 al 0,05% (0,1-0,001) y BSA al 1%, durante 30 min, a TA.

6. Enjuagar en PBS 1 x 2 min.

7. Incubar con anticuerpos primarios mixtos (como un "cóctel") con anticuerpos preparados contra otros antígenos (evaluados en primer lugar individualmente para determinar la especificidad y la dilución de trabajo óptima) 16-18 horas a 4-8°C, con 1,2 pg/ml de Pab contra a10 (0,6-1,2 pg/ml) (diluidos en PBS que contiene TritonX-100 al 0,05% y BSA al 1%).

8. Para la visualización de fluorescencia simultánea, se aplican dos epítopos, los anticuerpos primario y secundario, respectivamente, como una mezcla, un "cóctel".

9. Enjuagar en PBS, 1 min seguido de 2 x 5 min.

10. Incubar las secciones con Ab/Ab secundarios conjugados con fluoróforos (véase más abajo), en una mezcla (contra los diferentes animales hospedadores de los anticuerpos primarios) diluidos 1:150, durante 30-45 min, a TA.

Se prepararon anticuerpos secundarios para el marcaje múltiple (altamente purificados por afinidad, principalmente fragmentos Fab2) en burro o cabra contra IgG de conejo, ratón o cabra o contra IgY de pollo (Jackson, EE.u U. o Invitrogen, EE.UU.). Se diluyeron en PBS que contenía BSA al 1%. Para la visualización de fluorescencia simultánea, se aplican dos epítopos, el primario y el secundario, como una mezcla, un "cóctel".

11. Enjuagar en PBS-TritonX-100 durante 2 min.

12. Enjuagar en PBS 1 x 5 min.

13. Incubar en tinción DAPI para orgánulos (nuclear), 0,1 pM, diluida en PBS, durante 15 min.

14. Enjuagar en PBS, 2 x 5 min.

15. Montar y colocar cubreobjetos en "solución anti-decoloración": ProLong Gold (Invitrogen, EE. UU.).

Análisis - Inmunofluorescencia - Microscopía de barrido láser confocal:

La microscopía confocal proporcionó alta resolución, razón señal/ruido del marcaje y detección de señal de longitud de onda específica. Solo el análisis de imágenes microscópicas confocales puede resolver la localización estructural, la localización extra/intracelular y la co-localización del marcaje (a través del seccionamiento óptico de pila Z y reconstrucciones 3-D).

Equipo:

Las muestras se examinaron en un microscopio confocal Zeiss LSM 510 META, utilizando láseres para excitación entre 305-633 nm y detección de emisión entre 420-650 nm. Las imágenes se adquirieron con un objetivo Plan Apochromate 20x/0,8 y un objetivo Plan Apochromate 40x/1,3 de inmersión en aceite, con tres canales de inmunofluorescencia, un canal DAPI y un canal DIC de campo claro.

Las pilas z (sin DIC) de los planos confocales consecutivos se obtuvieron con el objetivo 40x/1,3, con tamaño de fotograma 1024x1024 px (anchura de pixel 0,22 pm), o con "zoom" (barriendo un área más pequeña) y una frecuencia de muestreo óptima Nyquist (anchura de pixel 0,115 pm) para una resolución máxima. El incremento del paso entre los planos confocales consecutivos estuvo de acuerdo con la frecuencia de muestreo óptima Nyquist (0,48 pm).

En conclusión, al usar un anticuerpo dirigido contra la integrina a10 (Camper et al (1998) J Biol Chem. 273(32):20383-9) se demostró sorprendentemente que la integrina a10 se expresa específicamente en células en material de paciente que consiste en astrocitoma grado II (en pocas células), astrocitoma grado III, glioblastoma multiforme también conocido como astrocitoma grado IV, muestras de tejido tumoral cerebral (figura 5A-C). Curiosamente, la expresión de la integrina a10 aumenta con los grados y se expresa fuertemente en los astrocitomas de grado III y IV. Obsérvese la tinción positiva de células en vasos sanguíneos o áreas llenas de sangre en todos los grados de astrocitoma (figura 5D).

Ejemplo 5: Expresión de la subunidad de integrina alfa 10 en muestras de tejido tumoral de pacientes de neuroblastoma y meduloblastoma según se visualiza mediante inmunohistoquímica

Se utilizó material de paciente que consistía en muestras de tejido de neuroblastoma y meduloblastoma recogidas como muestras quirúrgicas de la Universidad de Lund y del Hospital Universitario de Uppsala. Las secciones de parafina se desparafinaron y rehidrataron mediante inmersión de portaobjetos en xileno seguido de una serie de etanol y agua de acuerdo con protocolos convencionales. Las secciones de parafina se post-fijaron en acetona seguido de enjuagado en PBS, 5 min x 2. Las secciones de parafina se trataron para la recuperación del antígeno sumergiendo los portaobjetos en solución tamponada ácida - tampón de citrato (Citrato de sodio 10mM, Tween 20 al 0,05%, pH 6,0) y tratamiento con calor. Después de la recuperación del antígeno, se siguió el siguiente protocolo:

1. Enjuagar/tamponar en PBS 5 min, a TA.

2. Bloquear con PBS que contiene BSA al 1%, durante 20 min, a TA.

3. Enjuagar con PBS (PBS-Triton X100) 5 min, a TA.

4. Incubar las secciones con H2O2 al0,03% (en PBS), durante 10 min, a TA (extinguir la actividad peroxidasa endógena)

5. Enjuagar en PBS, 5 min x 2, a TA.

6. Incubar las secciones con anticuerpos primarios, con 1 pg/ml de PAb contra alfa 10 (0,6-1,2 pg/ml), diluidos en PBS que contiene BSA al 1% y Triton X100 al 0,05%), durante la noche (aprox. 16-18 h) a 4°C.

8. Aplicar los anticuerpos secundarios conjugados 30 min (anti-conejo), a TA (diluidos en PBS que contiene BSA al 1% y Triton X100 al 0,05%).

9. Enjuagar en PBS, 5 min x 2, a TA.

10. Incubar/hacer reaccionar en solución de DAB/H2O2 al 0,03%, 1-10 min, a TA.

11. Enjuagar en PBS, 5 min x 2, a TA.

Contratinción de secciones inmunomarcadas:

1. Incubar con hematoxilina (Mayers), 2 min, a TA.

2. Enjuagar en PBS 3 min, a TA.

3. Lavar con PBS 2 min, a TA.

Montaje:

Deshidratar las secciones mediante inmersión en

1. En etanol del 70%, 96%, 100% x 2, durante 2 min en cada concentración.

2. Xileno >3 min x2.

En conclusión, los autores de la presente invención encontraron que la subunidad de la integrina alfa 10 se expresa específica y fuertemente en células en muestras de tejido tumoral de pacientes de neuroblastoma maligno y meduloblastoma (figura 6).

Ejemplo 6: Análisis de la expresión de ARN de alfa 10 en tumores cerebrales de pacientes mediante PCR cuantitativa.

Se realizó una PCR cuantitativa de muestras de tejido de tumor cerebral recogidas como biopsias quirúrgicas de pacientes en el Hospital Universitario de Lund utilizando cebadores para la detección de la subunidad de integrina alfa 10. Se utilizaron matrices de ADNc de cáncer de cerebro (OriGene Technologies Inc.) para el análisis diferencial de la expresión génica y la validación de la expresión génica en material de tejido de pacientes de diferentes tumores cerebrales. Los ADNc de cada matriz se sintetizaron a partir de ARN totales de alta calidad de tejidos verificados por patólogos, se normalizaron y validaron con beta-actina en dos análisis secuenciales de qPCR y se analizaron junto con la información clínica. La detección por PCR en tiempo real de la subunidad de la integrina alfa 10 se llevó a cabo utilizando un cebador específico de gen y una sonda TaqMan (ensayo de expresión génica HS00174623_m1, Life Technology) y se realizaron según las recomendaciones de los fabricantes. El sistema de detección utilizado fue ICycler (Bio-Rad). La expresión de la subunidad de integrina alfa 10 de tejido de cáncer de cerebro se normalizó frente a tejido cerebral sano y se calcularon los valores de cuantificación relativa (RQ) de la subunidad de integrina alfa 10. La Figura 7 muestra los valores medios de cuantificación relativa para dos rondas. RQ se define como 2'AACt donde AACt = ACtmuestra de tumor - ACttejido cerebral normal y ACt se obtiene a partir de CtITGA10 - Ctbeta-actina.

Como se puede observar en la figura 7, la subunidad de integrina alfa 10 se detectó sorprendentemente en varios tumores cerebrales, incluidos astrocitomas, astrocitomas anaplásicos, astrocitomas fibrilares, glioblastoma multiforme, hemangiopericitomas del cerebro, meningiomas, hemangiomas angiomatosos, meningiomas atípicos, meningiomas fibroblásticos, meningiomas meningioteliales, meningiomas microquísticos, meningiomas secretores, oligoastrocitomas, oligoastrocitomas anaplásicos, oligodendrogliomas y oligodendrogliomas anaplásicos.

Ejemplo 7: Análisis de la co-expresión de la subunidad de integrina alfa 10 y otros marcadores

Un tumor es heterogéneo y consta de muchos tipos de células diferentes. Para mostrar diferentes tipos de células positivas para la expresión de la subunidad de integrina alfa 10 en los gliomas (GBM), se utilizaron varios marcadores que típicamente y específicamente inmunomarcan diferentes tipos de células en muestras de tejido de glioblastoma de tumores cerebrales recolectadas como biopsias quirúrgicas o post-mortem del Hospital de la Universidad de Lund.

Preparación de muestras:

Se incluyeron tejidos congelados de nueva aportación en TissueTek (Sakura, Jpn). Se recogieron secciones de 10 pm (preparadas en un criostato MICROM HM 500 OM) en portaobjetos SuperFrost Plus Las secciones se utilizaron para el inmunomarcaje, después de la post-fijación con acetona (100% a -20°C, durante 10 min).

Las crio-secciones (recién cortadas o congeladas) se secaron al aire a 37°C, durante aproximadamente 20 min. Cuando las secciones alcanzaron la temperatura ambiente, se enjuagaron dos veces en PBS durante 5 min. Las secciones se fijaron posteriormente en acetona seguido de dos rondas de enjuagado en PBS (5 min x 2). Se aplicó una barrera de silicona ("bolígrafo PAP") alrededor de las secciones. Las secciones se incubaron en PBS que contenía Triton X-100 al 0,05% (0,1-0,001) y BSA al 1%, durante 30 min, a TA y a continuación, se enjuagaron en p Bs 1 x 2 min. Las secciones se incubaron con anticuerpos primarios mezclados con anticuerpos preparados contra otros antígenos (primero se evaluaron individualmente para determinar la especificidad y la dilución de trabajo óptima) durante 16-18 horas a 4-8°C, con 1,2 pg/ml (0,6-1,2 pg/ml) de PAb contra a10 (diluido en PBS que contenía Triton X-100 al 0,05% y BSA al 1%). Para la visualización de fluorescencia simultánea, se aplicaron dos epítopos, los anticuerpos primario y secundario respectivamente, como una mezcla ("cóctel"). Las secciones se enjuagaron en PBS, 1 min seguido de 2 x 5 min y se incubaron con Ab/Ab secundarios conjugados con fluoróforos en una mezcla, diluidos 1:150, durante 30-45 min, a t A.

Se prepararon anticuerpos secundarios para el marcaje múltiple (altamente purificados por afinidad, principalmente fragmentos Fab2) en burro o en cabra contra IgG de conejo, ratón o cabra o contra IgY de pollo (Jackson, Ee .UU. o Invitrogen, EE.UU.). Se diluyeron en PBS que contenía BSA al 1%. Para la visualización de fluorescencia simultánea de dos epítopos, el primario y el secundario se aplicaron como una mezcla, un "cóctel". Las secciones se enjuagaron en PBS-Triton X100 durante 2 min, y se enjuagaron en PBS 1 x 5 min. Las secciones se incubaron en tinción DAPI para orgánulos (nuclear) 0,1 pM, diluida en p Bs , durante 15 min y se enjuagaron PBS, 2 x 5 min. Las secciones se montaron y se colocaron los cubreobjetos en "solución anti-decoloración": ProLong Gold (Invitrogen, EE.UU.).

Anticuerpos utilizados en el presente estudio:

Análisis:

El análisis se realizó mediante microscopía de barrido láser confocal. La microscopía confocal proporcionó alta resolución, razón señal/ruido del marcaje, y detección de señal de longitud de onda específica. Solo el análisis de imágenes microscópicas confocales puede resolver la localización estructural, la localización extra/intracelular y la co-localización del marcaje (a través del seccionamiento óptico de pila Z y reconstrucciones 3-D).

Las muestras se examinaron en un microscopio confocal Zeiss LSM 510 META, utilizando láseres para excitación entre 305-633 nm y detección de emisión entre 420-650 nm. Las imágenes se adquirieron con un objetivo Plan Apochromate 20x/0,8 y un objetivo Plan Apochromate 40x/1,3 de inmersión en aceite, con tres canales de inmunofluorescencia, un canal dA p I y un canal DIC de campo claro.

Se obtuvieron pilas Z (sin DIC) de planos confocales consecutivos con el objetivo 40x/1,3, ya sea con un tamaño de fotograma de 1024x1024 px (ancho de píxel 0,22 pm), o con "zoom" (barriendo un área más pequeña) y la frecuencia de muestreo óptima de Nyquist (ancho de píxel 0,115 pm) para una resolución máxima. El tamaño del paso entre planos confocales consecutivos se basó en la frecuencia de muestreo óptima de Nyquist (0,48 pm).

El análisis cuantitativo de la coexistencia de la integrina alfa 10 con los diferentes marcadores se realizó utilizando datos de imagen digitalizados. Los datos se analizaron a partir de canales únicos, que representan diferentes marcajes. Las regiones de interés (ROI) se identificaron por primera vez mediante la identificación de núcleos celulares. Se utilizó un área de 1 micrómetro alrededor de los núcleos para el análisis de la co-expresión de marcadores. Los valores umbral para la tinción positiva fueron determinados mediante inspección visual por un operario de microscopía experimentado y se fijaron en 5%.

Resultados: la Tabla 1 siguiente muestra el patrón de expresión de los marcadores que se co-expresan con la subunidad de integrina alfa 10. Los anticuerpos utilizados dirigidos contra los antígenos se indican en la columna de la izquierda. Los diferentes tipos de células que se espera que expresen los antígenos (inmunofenotipos) se indican en la columna central. El grado de co-expresión de cada marcador con la integrina a10 se indica en la columna de la derecha.

Tabla 1: Matriz de marcadores

La co-expresión y co-localización CD163, CD206 y la subunidad de integrina alfa 10 se muestran en la figura 8 y la co expresión y co-localización de EGFRvIII y la subunidad de integrina alfa 10 se muestran en la figura 9.

Ejemplo 8: Ensayo de migración

Las células malignas dependen de la migración para propagarse y producir metástasis. Para dilucidar si la integrina alfa10 es importante para este proceso celular, se realizan ensayos de migración.

El ensayo de migración se realiza utilizando el kit CytoSelect Cell Migration Assay (Cell Biolabs', EE. UU.). Este es un sistema de dos cámaras donde se permite que las células migren desde la cámara superior al compartimento inferior, que se llena con medio quimioatrayente. Las cámaras están separadas por una membrana que solo permite el paso de las células que migran activamente. Las células de glioma (GBM) obtenidas, por ejemplo, de cultivos primarios o líneas celulares establecidas, se recolectan utilizando acutasa, se resuspenden en medio sin suero de ternera fetal (FCS) y se transfieren al compartimento superior del inserto CytoSelect. Los ensayos de migración se realizan utilizando anticuerpos monoclonales no conjugados y/o productos conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC) contra la subunidad de integrina alfa 10, o anticuerpos de control IgG. Después de la incubación a 37°C durante 24-48 h, los insertos se recogen y las células adheridas a la superficie inferior se fijan, tiñen y cuantifican.

Las células de glioma incubadas con un anticuerpo contra la subunidad de integrina alfa 10 muestran una capacidad de migración reducida.

Ejemplo 9: Análisis de apoptosis: morfología celular y citometría de flujo

Las células dependen de la adherencia de la integrina a la matriz extracelular para sobrevivir. Si estos enlaces matrizintegrina se rompen, las células pueden entrar en apoptosis. Para dilucidar si la inducción de apoptosis ocurre en células de glioma (GBM) cuando se rompen los enlaces de integrina a10, se realizan ensayos de apoptosis.

Se cultivan células de glioma (GBM) en placas de 6 pocillos y se incuban durante la noche para determinar la apoptosis. Al día siguiente se añaden anticuerpos monoclonales no conjugados o ADC contra la subunidad de integrina alfa 10, o anticuerpos de control IgG. Los cambios morfológicos se observan utilizando un microscopio invertido y las células se recolectan para el análisis de citometría de flujo después de tratamientos de 72 h para observar la apoptosis temprana y tardía. El grado de apoptosis inducido por el anticuerpo contra la subunidad de integrina alfa 10 se determina mediante un kit de detección de apoptosis disponible comercialmente como kit de detección de Apoptosis con anexina V-FITC con 7-AAD (Biolegend) y los datos se analizan mediante citometría de flujo. En el análisis de citometría de flujo, las células positivas individuales para Anexina V-FITC representan células apoptóticas tempranas. Las células de tinción doble positiva con Anexina V-FITC y 7-AAD (7-amino-actinomicina D) representan células apoptóticas tardías. La tinción positiva para 7-AAD solo representa la población necrótica de células.

Las células de glioma incubadas con un anticuerpo contra la subunidad de integrina alfa 10 muestran una apoptosis mejorada.

Ejemplo 10: Capacidad de formación de esferas de células de glioma (GBM) tratadas con anticuerpo monoclonal contra la subunidad de integrina alfa 10

Un ensayo in vitro común para determinar la capacidad de autorrenovación de una población celular y, por tanto, su capacidad para inducir tumores in vivo tras el trasplante de xenoinjerto, es el ensayo de formación de esferas.

En este ensayo se utilizaron líneas de células de glioma (GBM) del biobanco de cultivo de células de glioma humano (HGCC) de la Universidad de Uppsala y estas células se obtienen del material del paciente obtenido de muestras de tejido tumoral cerebral recogidas como biopsias descritas por Xie et al. 2015 (EBioMedicine. 15; 2(10):1351-63). Las células se cultivaron en DMEM/F12 con Glutamax y medio Neurobasal (1:1) con un suplemento de 50X b27, 100X N2, Pen Strep al 1%, bFGF (10 ng/ml) y EGF (10 ng/ml) a 37°C con 5% de CO2. Para evaluar la capacidad de formación de esferas, las células se trataron con acutasa, se recolectaron y centrifugaron durante 4 min a 300xg y, a continuación, se resuspendieron en medio. El ensayo se realizó en placas de 96 pocillos y se sembraron 5000 células por pocillo. Las células se trataron con concentraciones variables del anticuerpo monoclonal contra la subunidad de la integrina alfa 10 o un anticuerpo de control IgG. Todos los tratamientos se realizaron por triplicado. Después de 7 días de incubación a 37°C con 5% de CO2, se tomaron imágenes microscópicas de cada pocillo y se contaron las esferas que habían alcanzado un diámetro de 100 pm.

En conclusión, mediante el uso de un anticuerpo monoclonal contra la subunidad de integrina alfa 10, las células de glioma muestran una capacidad de formación de esferas reducida en comparación con las células no tratadas. Este efecto no se observó en células tratadas con anticuerpo de control IgG (figura 10).

Ejemplo 11: Viabilidad y crecimiento de células de glioma (GBM) tratadas con anticuerpo contra la subunidad de integrina alfa 10

Una de las características del cáncer son las señales proliferativas sostenidas en las células malignas. Para dilucidar si los anticuerpos anti-subunidad de integrina alfa 10 son capaces de inhibir la viabilidad y proliferación de células de glioma, se realizaron ensayos de viabilidad celular colorimétrica como WST-1 (Roche, DE) y XTT. Los ensayos de viabilidad celular colorimétrica comprenden sal de tetrazolio, que se reduce a un compuesto de formazán coloreado en células metabólicamente activas. Por tanto, la cantidad de colorante de formazán se correlaciona con el número de células viables.

Para los ensayos de viabilidad celular, las células de glioma obtenidas de cultivos primarios se trataron con acutasa, se recolectaron y centrifugaron durante 4 min a 300xg y, a continuación, se resuspendieron en medio. Se utilizaron varias líneas celulares de glioma (GBM). La de la Universidad de Lund se cultivó en medio DMEM con un suplemento de FBS al 10% y Pen Strep al 1%, mientras que las líneas celulares HGCC se cultivaron en DMEM/F12 con Glutamax y medio Neurobasal (1:1) con un suplemento de 50X B27, 100X N2, Pen Strep al 1%, bFGF (10 ng/ml) y EGF (10 ng/ml) a 37°C con 5% de CO2. Se usó una densidad de 5000 células por pocillo y las placas de 96 pocillos se recubrieron con laminina (Cultrex® Mouse Laminin I, R&D Systems) para una buena adherencia al plástico de las células HGCC. Al día siguiente, se añadieron concentraciones variables del anticuerpo monoclonal no conjugado contra la subunidad de integrina alfa 10. Las células también se trataron con una combinación del anticuerpo monoclonal no conjugado contra la subunidad de integrina alfa 10 y un anticuerpo secundario conjugado con saporina (ATSbio, EE.UU.), que es un buen sistema modelo in vitro. Como control, se usaron células no tratadas, así como un anticuerpo de control. Todos los tratamientos se realizaron por triplicado. Las células se cultivaron adicionalmente a 37°C con 5% de CO2 durante 72 h. La viabilidad celular se evaluó añadiendo 10-50 pl de reactivo de sal de tetrazolio a cada pocillo seguido de incubación a 37°C durante 1-4 h. Las placas se agitaron suavemente y se midió la absorbancia de las muestras utilizando un espectrofotómetro (SpectraMax i3) a una longitud de onda de 450-500 nanómetros.

Como se puede observar en la figura 11, el tratamiento con el anticuerpo monoclonal no conjugado contra la subunidad de integrina alfa 10 solo disminuyó significativamente la viabilidad y/o proliferación celular en comparación con las células de glioma no tratadas (GBM). La Figura 12 muestra la supervivencia y/o el crecimiento reducidos de células de glioma (GBM) tratadas con un anticuerpo monoclonal contra la subunidad de integrina alfa 10 combinado con un anticuerpo secundario conjugado con saporina, en comparación con un anticuerpo de control.

E je m p lo 12: Modelo murino in vivo p ara la ev a lu a c ió n fu n c io n a l d e la in te g rin a a lfa10b e ta 1 c o m o d ia n a c a n d id a ta p ara el tra ta m ie n to d e n eo p las ia s m a lig n a s en el s is te m a n erv io s o ce n tra l (S N C ).

Con el fin de demostrar el efecto antitumoral del anticuerpo contra integrina alfa10 no conjugado o del anticuerpo contra integrina alfa10 conjugado (Producto Conjugado de Anticuerpo-Fármaco, ADC) que comprende un anticuerpo antiintegrina alfa10 como agente anticanceroso, se utiliza un modelo de xenoinjerto de tumor cerebral ortotópico estereotáctico de ratones inmunodeprimidos. Las células tumorales humanas se trasplantan al cerebro de ratones inmunodeprimidos. El método para inyectar las células cancerosas ortotópicamente se realiza esencialmente como lo describen Joo KM et al. 2013 (Cell Rep. 3, 260-73).

Se administran diferentes dosis del anticuerpo monoclonal no conjugado/ADC contra la integrina alfa10 o el anticuerpo de control a animales modelo tras el trasplante de células malignas y en diferentes puntos de tiempo después de la inducción de las neoplasias. El anticuerpo se introduce mediante inyecciones intravenosas, intratumorales o intraventriculares. El efecto terapéutico del anticuerpo específico de integrina alfa10 se evalúa comparando animales tratados con anti-integrina alfa10 con animales tratados con anticuerpo de control.

La evaluación del valor terapéutico del reactivo se realiza mediante múltiples comparaciones patológicas basadas en análisis de órganos, celulares y moleculares, así como en la supervivencia. Los ejemplos de rasgos y marcadores patológicos son:

- Tamaño del tumor

- Tasa de crecimiento tumoral

- Características morfológicas, moleculares e histopatológicas

- Invasividad

- Expresión genética de marcadores malignos

- Estado del ciclo celular

- Apoptosis

Un objetivo del presente experimento es determinar la dosis más eficaz de reactivo sin causar o provocar una reacción tóxica. A continuación, se presentan las etapas principales y generales de la configuración estratégica in vivo, que contienen un plan experimental más detallado:

Plan experimental detallado

En general, el desarrollo de glioma desde el día de inicio (día 0), es decir, desde la inyección de células neoplásicas en el hospedador del injerto normal, hasta un tumor totalmente desarrollado en el animal hospedador es de aproximadamente 2 a 20 semanas, dependiendo del modelo de xenoinjerto elegido. El estudio se divide en tres fases diferentes:

1. Iniciación

2. Progresión

3. Terminación

Fase 1, Iniciación:

Antes de la inyección de células malignas, se realizan las siguientes etapas el día 0.

Preparación de células para trasplante:

a) Líneas de células tumorales, o

b) Disociación tumoral para obtener suspensiones de células malignas primarias

Para el trasplante ortotópico en cerebro de ratón, el aparato estereotáctico se prepara de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Procedimiento quirúrgico:

Se utilizan al menos cinco animales para cada una de las condiciones de inyección y cada punto de tiempo.

a) Preparación preoperatoria del animal (anestesia, limpieza, fijación del animal)

b) Preparación preoperatoria de la célula (lavado y recuento celular)

c) Cuidado procedimental (mantenimiento de la anestesia y procedimiento quirúrgico)

d) Inyección de células

e) Cuidado y seguimiento de animales

Fase 2, Progresión:

Los animales experimentales se dividen en cuatro grupos según los regímenes de tratamiento. Los grupos son:

1. Grupo 1: grupo no tratado. Sin tratamiento con anticuerpos.

2. Grupo 2: grupo de control. Tratamiento con anticuerpo control.

3. Grupo 3: grupo ITGA10. Tratamiento con anticuerpo no conjugado/ADC contra la subunidad de la integrina alfa 10.

Fase 3, Terminación:

Los animales se sacrifican según protocolos establecidos y los tumores cerebrales se aíslan con el fin de adquirir toda la información necesaria en cuanto a características morfológicas, moleculares e histopatológicas, invasividad, datos de expresión génica de marcadores malignos, estado del ciclo celular y apoptosis.

Ejemplo 13: Descripción general de secuencias

SEQ ID NO 1: Subunidad de integrina alfa 10 humana

SEQ ID NO 2: Dominio extracelular de la subunidad de integrina alfa 10 humana

SEQ ID NO 3: Dominio I de la subunidad de integrina alfa 10 humana

SEQ ID NO: 4 Precursor de la subunidad de integrina alfa 10 de Homo sapiens, ARNm, cds completas

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición para su uso en el tratamiento de una neoplasia maligna del sistema nervioso central, comprendiendo dicha composición un anticuerpo que se une específicamente a una subunidad de integrina alfa 10.

2. La composición para su uso según la reivindicación 1, en donde el anticuerpo está unido covalentemente a un radical citotóxico.

3. La composición para su uso según la reivindicación 2, en donde el radical citotóxico se selecciona del grupo que consiste en una toxina, un agente quimioterapéutico y un agente radiactivo.

4. La composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la toxina es una proteína inactivadora de ribosomas.

5. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 4, en donde la proteína inactivadora de ribosomas se selecciona del grupo que consiste en

a) toxinas shiga y similares a shiga;

b) proteínas inactivadoras de ribosomas de tipo I, tales como tricosantina y lufina;

c) proteínas inactivadoras de ribosomas de tipo II, tales como ricina, aglutinina y abrina; y

d) saporina.

6. La composición para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el anticuerpo es capaz de inducir la muerte celular y/o inhibir el crecimiento y/o la proliferación y/o migración de células que expresan una subunidad de integrina alfa 10.

7. La composición para su uso, según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la neoplasia maligna del sistema nervioso central se selecciona del grupo que consiste en:

a) Tumores de tejido neuroepitelial seleccionados entre

i) Tumores

astrocíticos seleccionados entre Astrocitoma pilocítico (ICD-O 9421/1, grado I de la OMS), Astrocitoma pilomixoide (ICD-O 9425/3, grado II de la OMS), Astrocitoma subependimario de células gigantes (ICD-O 9384/1, OMS grado I), Xantoastrocitoma pleomórfico (ICD-O 9424/3, OMS grado II), Astrocitoma difuso (ICD-O 9400/3, OMS grado II), Astrocitoma anaplásico (ICD-O 9401/3, OMS grado III), Glioblastoma (ICD-O 9440/3, grado IV de la OMS), Glioblastoma de células gigantes (ICD-O 9441/3, grado IV de la OMS), Gliosarcoma (ICD-O 9442/3, grado IV de la OMS), Gliomatosis cerebri (ICD-O 9381/3, grado III de la OMS) y

ii) Tumores oligodendrogliales seleccionados entre

Oligodendroglioma (ICD-O 9450/3, grado II de la OMS) y Oligodendroglioma anaplásico (ICD-O 9451/3, grado III de la OMS), y

iii) Tumores oligoastrocíticos seleccionados entre

Oligoastrocitoma (ICD-O 9382/3, grado II de la OMS) y Oligoastrocitoma anaplásico (ICD-O 9382/3, grado III de la OMS), y

iv) Tumores ependimarios seleccionados entre

Subependimoma (ICD-O 9383/1, grado I de la OMS), Ependimoma mixopapilar (ICD-O 9394/1, grado I de la OMS), Ependimoma (ICD-O 9391/3, grado II de la o Ms ), Ependimoma anaplásico (ICD-O 9392/3, grado III de la OMS), y

v) Tumores del plexo coroideo seleccionados entre

Papiloma del plexo coroideo (ICD-O 9390/0, grado I de la OMS),

Papiloma del plexo coroideo atípico (ICD-O 9390/1, grado II de la OMS) y Carcinoma del plexo coroideo (ICD -O 9390/3, grado III de la OMS), y

vi) Otros tumores neuroepiteliales seleccionados de

Astroblastoma (ICD-O 9430/3, grado I de la OMS), Glioma cordoide del tercer ventrículo (ICD-O 9444/1, grado II de la OMS) y Glioma angiocéntrico (ICD-O 9431/1, grado I de la OMS) y,

vii) Tumores neuronales y neuronal-gliales mixtos seleccionados entre Gangliocitoma displásico de cerebelo (Lhermitte-Duclos) (ICD-O 9493/0), Astrocitoma/ganglioglioma infantil desmoplásico (ICD-O 9412/1, grado I de la OMS), Tumor neuroepitelial disembrioplásico (ICD-O 9413/0, grado I de la Om S), Gangliocitoma (ICD-O 9492/0, grado I de la OMS), Ganglioglioma (ICD-O 9505/1, grado I de la OMS), Ganglioglioma anaplásico (ICD-O 9505/3 , grado III de la OMS), Neurocitoma central (ICD-O 9506/1, grado II de la OMS), Neurocitoma extraventricular (ICD-O 9506/1, grado II de la OMS), Liponeurocitoma cerebeloso (ICD-O 9506/1, grado II de la OMS) , Tumor glioneuronal papilar (ICD-O 9509/1, grado I de la OMS), Tumor glioneuronal formador de rosetas del cuarto ventrículo (ICD-O 9509/1, grado I de la OMS) y Paraganglioma (ICD-O 8680/1, grado I de la OMS), y

ix) Tumores embrionarios seleccionados entre

Meduloblastoma (ICD-O 9470/3, grado IV de la OMS), Meduloblastoma con nodularidad extensa (ICD-O 9471/3, grado iV de la OMS), Meduloblastoma anaplásico (ICD-O 9474/3, OMS grado IV), Tumor neuroectodérmico primitivo del SNC (ICD-O 9473/3, grado IV de la OMS), Neuroblastoma del Sn C (ICD-O 9500/3, grado IV de la OMS) y Tumor teratoide/rabdoide atípico (ICD-O 9508/3, Grado IV de la OMS), y b) Tumores de nervios craneales y paraespinales seleccionados entre

i) Schwannoma (ICD-O 9560/0, grado I de la OMS)

ii) Neurofibroma (ICD-O 9540/0, grado I de la OMS),

iii) Perineurioma (ICD-O 9571/0, 9571/3, grado I, II, III de la OMS) y

ii) Tumores mesenquimales seleccionados entre Lipoma (ICD-O 8850/0), Angiolipoma (ICD-O 8861/0), Hibernoma (ICD-O 8880/0), Liposarcoma (ICD-O 8850/3), Tumor fibroso solitario (ICD-O 8815/0), Fibrosarcoma (ICD-O 8810/3), Histiocitoma fibroso maligno (ICD-O 8830/3), Leiomioma (ICD-O 8890/0), Leiomiosarcoma (ICD-O 8890/3), Rabdomioma (ICD-O 8900/0), Rabdomiosarcoma (ICD-O 8900/3), Condroma (ICD-O 9220/0), Condrosarcoma (ICD-O 9220/3), Osteoma (ICD-O 9180/0), Osteosarcoma (ICD-O 9180/3), Osteocondroma (ICD-O 9210/0), Hemangioma (ICD-O 9120/0), Hemangioendotelioma epitelioide (ICD-O 9133/1), Hemangiopericitoma (lCD-O 9150/1, grado II de la OMS), Hemangiopericitoma anaplásico (iCD-O 9150/3, grado III de la OMS) y Angiosarcoma (ICD-O 9120/3) 3.2.22 Sarcoma de Kaposi (ICD-O 9140/3), Sarcoma de Ewing - PNET (lCD-O 9364/3) y

iii) Lesiones melanocíticas primarias seleccionadas entre Melanocitosis difusa (ICD-O 8728/0), Melanocitoma (lCD-O 8728/1), Melanoma maligno (ICD-O 8720/3), Melanomatosis meníngea (ICD-O 8728/3) y iv) Otras neoplasias relacionadas con las meninges tales como el Hemangioblastoma (ICD-O 9161/1, grado I de la OMS), y

d) Tumores del sistema hematopoyético seleccionados entre

i) Linfomas malignos (ICD-O 9590/3)4,2 Plasmocitoma (ICD-O 9731/3), y

ii) Sarcoma granulocítico (ICD-O 9930/3), y

e) Tumores de la región selar seleccionados entre

i) Craneofaringioma (ICD-O 9350/1, grado I de la OMS)

ii) Tumor de células granulares (ICD-O 9582/0, grado I de la OMS)

iii) Pituicitoma (ICD-O 9432/1, grado I de la OMS) y

8. El uso de un anticuerpo con especificidad por una subunidad de integrina alfa 10 para detectar células asociadas con una neoplasia maligna del sistema nervioso central de un mamífero, en donde las células expresan una subunidad de integrina alfa 10.

9. Un método para detectar una célula de mamífero maligna o asociada a un tumor, comprendiendo dicho método analizar en una muestra aislada, la presencia o ausencia de:

a) un primer antígeno que comprende un polipéptido de la subunidad de integrina alfa 10; y

b) un segundo antígeno que comprende un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en EGFRvIII, Nestina, PSA-NCAM, GFAP, PDGFRb (CD140b), PECAM-1 (CD31), CD45, CD68, CD163 y CD206;

en donde la presencia del primer antígeno de a) junto con el segundo antígeno de b) indica que dicha célula de mamífero es una célula maligna o una célula asociada a un tumor.

10. El método según la reivindicación 9, en donde dicha muestra comprende células malignas o células asociadas a tumores, por ejemplo, en donde las células malignas o células asociadas a tumores comprenden células seleccionadas del grupo que consiste en células gliales; astrocitos; pericitos; células endoteliales; células hematopoyéticas; células madre; y microglía.

11. El método según la reivindicación 10, en donde la célula hematopoyética se selecciona del grupo que consiste en células madre hematopoyéticas, células T, células B, células plasmáticas, células NK, células dendríticas, macrófagos, tales como macrófagos asociados a tumores (TAM) y monocitos.

12. La composición para su uso, el uso o el método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho anticuerpo específico para la subunidad de integrina alfa 10 es un anticuerpo monoclonal, producido por la línea celular de hibridoma depositada en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen. GmbH con el número de acceso DSM ACC2583.