ES2851209T3

ES2851209T3 - Mutantes GRF3, métodos y plantas

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Publication number: ES2851209T3
Application number: ES13700010T
Authority: ES
Inventors: Javier Palatnik; Ramiro Rodriguez; Martin Mecchia; Juan Manuel Debernandi
Original assignee: Consejo Nacional de Investigaciones Cientificas y Tecnicas CONICET; Universidad Nacional de Rosario UNR
Current assignee: Consejo Nacional de Investigaciones Cientificas y Tecnicas CONICET; Universidad Nacional de Rosario UNR
Priority date: 2012-01-04
Filing date: 2013-01-04
Publication date: 2021-09-03
Anticipated expiration: 2033-01-04
Also published as: BR112014016523B1; AU2013207126B2; BR112014016523A2; GB201200075D0; WO2013102762A1; AR089661A1; CN104093844A; EP2800817B1; US9890388B2; CN104093844B; AU2013207126A1; IN2014CN04992A; CA2860112A1; EP2800817A1; US20150033413A1; CA2860112C

Abstract

Un método para producir una planta, que comprende transformar la planta con un ácido nucleico que codifica el factor de regulación del crecimiento 3 (GRF3) de Arabidopsis thaliana, en donde dicho GRF comprende un motivo FFD, en donde dicho ácido nucleico comprende un sitio blanco de miR396 mutado que desacopla dicho ácido nucleico del control por miR396 que comprende la secuencia: CGTTCtAGAAAaCCaGTaGAg (SEQ ID NO: 38), en donde las minúsculas indican las bases modificadas.

Description

DESCRIPCIÓN

Mutantes GRF3, métodos y plantas

Campo de la invención

Las plantas que exhiben fenotipos mejorados de productividad y/o rendimiento y/o una mayor tolerancia a la sequía por introducción en dichas plantas de mutaciones en el factor de crecimiento GRF3, o en un ortólogo de GRF3, donde dichos mutantes desregulan al GRF3 o al ortólogo de GRF3 del control de miR396 (opcionalmente en combinación con sobreexpresión de al menos un gen GIF).

Antecedentes de la invención

A diferencia de los animales, las plantas continúan produciendo órganos nuevos durante todo su ciclo de vida. Los órganos aéreos derivan del meristema apical de brotes (SAM), que incluye una agrupación de células madre que reside en la punta en crecimiento de la planta. Las células SAM en proliferación producen un exceso de células hijas que se incorporan en los primordios de hojas en desarrollo en la periferia del SAM o bien, se vuelven parte del brote. La maquinaria central que controla el progreso del ciclo celular en plantas, así como en otros eucariotas, se basa en la actividad de quinasas dependientes de ciclina (Inze y De Veylder, 2006). Muchos aspectos de la regulación del ciclo celular están altamente conservados entre los eucariotas. Sin embargo, es la integración de los mecanismos básicos del ciclo celular con el programa de desarrollo que genera la enorme variación fenotípica entre los organismos multicelulares, un proceso que es muy poco comprendido (Inze y De Veylder, 2006).

A diferencia del SAM indeterminado en Arabidopsis thaliana, las hojas son órganos determinados que tienen una morfología definida. El desarrollo de las hojas comprende la acción concertada de diversas vías de señalización de hormonas y redes de factores de transcripción. Algunos de los principales reguladores de la transcripción relacionados con el control de la proliferación celular en hojas incluyen AINTEGUMENTA (Mizukami y Fischer, 2000), PEAPOD (White, 2006), JAGGED (Dinneny et al., 2004; Ohno et al., 2004), BLADE ON PETIOLE (Ha et al., 2003), TCPs (Nath et al., 2003) y FACTORES REGULADORES DEL CRECIMIENTO [GROWTH-REGULATING FACTORs](GRFs) (Kim et al., 2003).

Para obtener su tamaño y forma característicos finales, el crecimiento de la hoja en desarrollo debe ser cuidadosamente coordinado primero por proliferación celular y luego por expansión celular (Piazza et al., 2005; Tsukaya, 2006). Inicialmente, se observa proliferación celular por toda la hoja en desarrollo (Donnelly et al., 1999). A continuación, el ciclo celular se detiene en la punta de la hoja y hay un frente de arresto mitótico hacia la base del órgano (Donnelly et al., 1999). Una vez que las células dejan de dividirse, comienzan a agrandarse y el crecimiento celular se vuelve la fuerza impulsora que regula el tamaño del órgano (Piazza et al., 2005; Tsukaya, 2006).

Actualmente, se sabe poco acerca de los mecanismos moleculares que coordinan la proliferación celular por toda la hoja en desarrollo. Un regulador conocido es el gen TCP CINCINNATA (CIN), que controla el progreso del frente de arresto mitótico en boca de dragón (Nath et al., 2003). Las mutaciones tal como cin (Nath et al., 2003) y los noqueos triples de sus homólogos tcp2/4/10 de Arabidopsis (Schommer et al., 2008) causan cambios en la morfogénesis de la hoja y una curvatura desigual del órgano debido a un exceso de proliferación celular en los márgenes de la hoja. Notablemente, cinco TCPs de Arabidopsis (TCP2, 3, 4, 10y 24), así como CIN, tienen un sitio blanco para el microARN (miARN) miR319 (Palatnik et al., 2003). La sobreexpresión de miR319 causa la degradación de estos genes TCPs y la generación de hojas rugosas similares a las observadas en los mutantes de pérdida-de-función tcp (Palatnik et al., 2003). Las mutaciones en el sitio blanco de los TCPs que disminuyen la interacción con el miARN afectan la morfología de la hoja en Arabidopsis (Palatnik et al., 2003; Palatnik et al., 2007) y la complejidad de la hoja en tomate (Ori et al., 2007), y en casos extremos son letales (Palatnik et al., 2003).

La familia de factores de transcripción GRF comprende nueve miembros en Arabidopsis (Kim et al., 2003). Siete de ellos tienen un sitio blanco para el miR396 (Jones-Rhoades y Bartel, 2004). Se ha demostrados que las mutaciones de pérdida-de-función en los diferentes GRFs o la sobreexpresión de miR396, que disminuye los niveles de GRF, reducen la cantidad de células en hojas de Arabidopsis (Horiguchi et al., 2005; Kim et al., 2003; Kim y Kende, 2004; Liu et al., 2009). Los GRFs funcionan juntos con los FACTORES QUE INTERACTÚAN CON GRF-INTERACTING FACTOR [Gr F-INTERACTING FAc To Rs) (GIFs), una pequeña familia de genes que codifica proteínas con homología para el co-activador de transcripción SYT humano (Horiguchi et al., 2005; Kim y Kende, 2004). La inactivación de GIF1 (Kim y Kende, 2004), también conocido como ANGUSTIFOLIA 3 (AN3) (Horiguchi et al., 2005), produce hojas más estrechas como resultado de una reducción en la proliferación celular.

Rodríguez et al., Development 137, 103-112 (2010) han divulgado que un microARN, miR396, cumple un rol en la coordinación de la proliferación celular en hojas de Arabidopsis. Mostraron que en primordios de hoja, el miR396 se expresa a niveles bajos, pero su expresión aumenta de manera constante durante el desarrollo de los órganos. Asimismo mostraron que el miR396 antagoniza el patrón de expresión de sus blancos, los factores de transcripción GROWTH-REGULATING FACTOR (GRF). Se demostró que miR396 se acumula preferencialmente en la parte distal de hojas jóvenes en desarrollo, restringiendo la expresión de GRF2 a la parte proximal del órgano. Se demostró que esto, as su vez, coincide con la actividad del marcador de la proliferación celular CICLINAB1;1. Se mostró que miR396 atenuaba la proliferación celular en hojas en desarrollo por medio de la represión de la actividad GRF y una disminución en la expresión de los genes del ciclo celular. Aún más, informaron que la sobreexpresión de miR396 en un mutante que no contiene GRF-INTERACTING FACTOR 1 (GIF1) comprometía severamente el meristema de brotes. Se encontró que miR396 se expresaba a niveles bajos por todo el meristema, superponiéndose con la expresión de su blanco, g RF2. Además, se mostró que la sobreexpresión de miR396 puede reducir la proliferación celular y el tamaño del meristema. Se encontró que las plantas de Arabidopsis con una mayor actividad del factor de transcripción TCP4, que reduce la proliferación celular en las hojas, tienen mayores niveles de miR396 y menores niveles de GRF. El Gr F2 modificado, que fue mutado para interferir con la interacción con miR396, demostró ser independiente de la regulación de miR396 del cual era objeto el GRF2 de tipo salvaje. Se informó que estas plantas tienen hojas ligeramente más grandes que las de tipo salvaje, sin embargo estas hojas se curvaban hacia abajo lo cual podría ser perjudicial para la captura de luz y la fotosíntesis. Estos resultados indicaban que los niveles de miR396 pueden restringir significativamente la proliferación celular en plantas.

En la presente descripción, se muestra que un mutante GRF3 (a menudo denominado rGRF3 en la presente) y ortólogos del mutante GRF3 (a menudo denominados ortólogos de rGRF3 en la presente) están deprivados de la regulación por miR396, y que las plantas que comprenden al mutante GRF3 u ortólogos del mutante g RF3 tienen una productividad y/o rendimiento mejorados (incluyendo un mayor área foliar, mayores cantidades de células, mayor biomasa, mayor resistencia al estrés, senescencia demorada de las hojas, mayor producción de semillas, mayor rendimiento de semillas, mayor crecimiento radicular, mayor velocidad de elongación radicular y mayor tolerancia a la sequía), ya sea si se comparan con plantas de tipo salvaje o con plantas que comprenden un mutante GRF2 sin la regulación miR396. Aún más, las hojas de las plantas mutantes GRF3 o de plantas ortólogas de mutantes de GRF3 no se curvaban hacia abajo como las del mutante GRF2. El ligero incremento en el área foliar observado en las plantas mutantes GRF2 era causado por un aumento de su nivel de al menos veinte veces en comparación con el nivel de GRF2 en plantas de tipo salvaje; sin embargo, se ha observado tan solo tres a cinco veces más mutantes GRF3 en comparación con el nivel de GRF3 en plantas de tipo salvaje causa un impacto mucho mayor sobre el tamaño de las hojas y la biomasa de las plantas.

Cuando la modificación GRF3 o la modificación de un ortólogo de GRF3 se combinan en una planta que sobreexpresa GIF1, estos efectos presentan una gran mejora.

Kim et al (The Plant Journal, vol. 36 no.1, 2012, páginas 94-104) tienen por objeto dilucidar el papel de los miembros de la familia de AtGRF en Arabidopsis.

Descripción breve de las figuras

En la Figura 1 se muestran construcciones y secuencias de ácidos nucleicos de relevancia para esta invención; en el panel superior se muestra la secuencia de la secuencia GRF3 de tipo salvaje en la región que es sustancialmente complementaria de miR396b, indicándose la afinidad de unión (AG = -33,9 kcal/mol); en el panel del medio se muestra la secuencia GRF3 modificada (rGRF3), que incluye cinco cambios de bases con respecto a la secuencia de tipo salvaje (una modificación A->U, G->A, U->A , G-> A y A->G), todos los cuales retienen la secuencia de aminoácidos nativa, pero que desestabiliza sustancialmente la interacción con el microARN miR396b, (reduciendo el AG a -14,4 kcal/mol); y en el panel inferior se muestra un gráfico de un constructo de expresión 35S:GIF1.

En la Figura 2 se muestran los niveles de expresión relativos de GRF3 y GIF1 en plantas de Arabidopsis transgénicas estimados por RT-qPCR, así como en cruzamientos entre dichas plantas transgénicas, donde los niveles de GRF3 en plantas de tipo salvaje representan un valor relativo de 1, se puede observar que la sobreexpresión de miR396 (bajo el control del promotor 35S), reduce la expresión de GRF3, en tanto el nivel de expresión de GRF3 en transgénicos rGRF3 es aproximadamente cinco veces el nivel de expresión de GRF3 en plantas de tipo salvaje. Este aumento de GRF3 en las plantas transgénicas que expresan la versión mutante es causado por la ausencia de la represión por el miARN.

En el cruzamiento entre plantas rGRF3 y 35S:GIF1, la expresión de rGRF3 es ligeramente (pero no significativamente) menor que el nivel de expresión cinco veces mayor observado en las plantas rGRF3. En comparación, los niveles de expresión de GIF1, que nuevamente representan a los niveles en las plantas de tipo salvaje como 1, no están significativamente alterados en las plantas que expresan 35S:miR396, pero es casi cuarenta veces el nivel del tipo salvaje en plantas rGRF3 y en cruzamientos entre plantas rGRF3xGIF1. Las mediciones son triplicados ± DEM.

En la Figura 3 se muestra la modificación en el desarrollo de las hojas observadas en plantas rGRF3, en plantas 35S:GIF1 y en plantas rGRF3x35S:GIF1. En el panel izquierdo, se determinaron el área foliar, el peso fresco y el peso seco de primeras hojas completamente expandidas, que muestran los cambios más fácilmente observados; en el panel derecho se muestran fenotipos de hoja de plantas en desarrollo en días cortos, en tanto en el panel inferior derecho se muestran plantas que crecen en macetas grandes bajo condiciones de días cortos.

En la Figura 4 se muestra, en el panel superior, la senescencia demorada de las hojas de plantas cruzadas rGRF3x35S:GIF1; en el panel inferior, se muestra la senescencia demorada de las hojas de una hoja individual para la hoja 5 completamente expandida, que se desprendió y se incubó en la oscuridad (senescencia inducida por oscuridad). El progreso de senescencia se monitoreó por medición de la fluorescencia de clorofila (Fv/Fm).

En la Figura 5 se muestra el área foliar de plantas transformadas con la versión de tipo salvaje de GRF3 (GRF3) y/o con la versión resistente miR396 de GRF3 (rGRF3).

En la Figura 6 se muestra el peso fresco (Figura 6A) y el peso seco (Figura 6B) de plantas rGRF3, GRF2 y 35S:miR396, todos bajo condiciones de días largos, donde el eje vertical son unidades de gramos.

En la Figura 7 se muestra un análisis de la unión al vecino más próximo para los GRFs de Arabidopsis thaliana (AtGRF#), Oryza sativa (OsGRF#), Zea mays (ZmORF#), Glycine max (GmGRF), Populus trichocarpa (PtGRF), Prunus persica (PpGRF), Medicago truncatula (MtGRF) y Carica papaya (CpCRF) indicado como un cladograma sin raíces. Subrayado: GRFs con un sitio de unión a miR396: Marcado con un asterisco: GRFs con un motivo conservado FFD.

En la Figura 8 se muestra la distribución de los motivos de las proteínas QLQ, WRC y FDD en los GRFs de Arabidopsis thaliana (AtGRF#), Oryza sativa (OsGRF#), Zea mays (ZmORF#), Glycine max (GmGRF), Populus trichocarpa (PtGRF), Prunus persica (PpGRF), Medicago truncatula (MtGRF) y Carica papaya (CpGRF).

En la Figura 9 se muestra un análisis de la unión al vecino más próximo de GIF para Arabidopsis thaliana y Oryza sativa indicado como un cladograma sin raíces: Las secuencias se obtuvieron de PlantTFDB 2.0 (http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn).

En la Figura 10 se muestran los cambios perjudiciales en la forma de la hoja (“enrollamiento” descendente) que se encontraron con rGRF2, pero no en rGRF3.

En la Figura 11 se muestra que un incremento leve en GRF3 (3x) causa un mayor aumento de la productividad, por ejemplo de la biomasa en comparación con una gran acumulación de GRF2 (25x).

En la Figura 12 se muestra que las plantas rGRF3 expresan mayores índices de crecimiento del tallo y de acumulación de biomasa en tallos. Izquierda: elongación de un segmento de tallo de 4,5 cm de longitud en plantas de tipo salvaje (wt) y rGRF3 de 10 días.

En la Figura 13 se muestran los fenotipos de rosetas de plantas cultivadas en días cortos. Nótese el mayor tamaño de la hoja y la acumulación de biomasa en las plantas de acuerdo con la presente invención.

En la Figura 14 se muestran los efectos de la sequía en las diferentes plantas transgénicas.

En la Figura 15 se muestra que los GRFs Arabidopsis se expresan en tejidos proliferativos.

Panel izquierdo: patrón de expresión de GRF3 durante el desarrollo de la hoja (DAS = días después de la siembra). Panel derecho: GRF3 se coexpresa con genes específicos de la mitosis durante el desarrollo de Arabidopsis.

En la Figura 16 se muestra que los GRFs de maíz se co-expresan con genes específicos de la mitosis.

En la Figura 17 se muestra un aumento en el tamaño de las plantas causado por el GRF3 resistente a miR396 de Arabidopsis.

A) plantas de 30 días correspondientes a líneas de plantas transgénicas independientes: vector vacío (WT, izquierda), GRF3 resistente a miR396 (rGRF3, centro) y GRF3 de tipo salvaje (GRF3, derecha). Nótese el mayor tamaño de las rosetas transformadas con rGRF3.

B) área de la primera hoja completamente expandida de las diferentes plantas transgénicas representadas en (A). Se calificaron al menos 50 plantas independientes por cada vector. Las barras marcadas con diferentes letras son significativamente diferentes determinado mediante ANOVA y la prueba de rangos múltiples de Duncan (P<0,05).

En la Figura 18 se muestra que la expresión específica de tejidos mejora el rendimiento de rGRF3 en la productividad de las plantas. Área de la primera hoja completamente expandida de plantas transgénicas que expresan rGRF3 a partir de diferentes promotores: GRF3, ASYMMETRIC LEAVES 1 (AS1) o AINTEGUMENTA (ANT). Se calificaron al menos 50 plantas por cada vector. Para AS1:rGRF3 y ANT:rGRF3 los datos representan transgénicos primarios independientes, en tanto para GRF3:rGRF3 se usó una línea representativa. Las barras marcadas con diferentes letras son significativamente diferentes determinado mediante la prueba de Kruskal-Wallis y la prueba de rangos múltiples de Duncan (P<0,05).

En la Figura 19 se muestra un aumento en el diámetro de tallos debido a rGRF3. Diámetro de tallos de plantas transgénicas que expresan rGRF3 a partir de diferentes promotores: GRF3, ASYMMETRIC LEAVES 1 (AS1) y AINTEGUMENTA (ANT). Las barras marcadas con diferentes letras son significativamente diferentes determinado mediante la prueba de Kruskal-Wallis y la prueba de rangos múltiples de Duncan (P<0,05).

En la Figura 20 se muestran los efectos del desacoplamiento sobre el tamaño de la hoja con respecto a los efectos sobre la sincronización de la senescencia de las hojas usando promotores específicos de tejidos. Según se muestra en la presente, GRF3:rGRF3 aumenta el tamaño de la hoja y demora la senescencia de las hojas. Este último efecto se puede desacoplar del aumento en tamaño de la hoja, si se deseara. La expresión de rGRF3 a partir de los promotores ANT y AS1 aumentó significativamente el tamaño de la hoja con un efecto menor sobre la senescencia de las hojas. Senescencia inducida por oscuridad de la hoja N° 5 completamente expandida. Las imágenes se tomaron inmediatamente después de recortar las hojas completamente expandidas de la roseta (Día 1) y después se incubaron por 6 días en oscuridad (Día 6). Se usó una línea representativa para GRF3:rGRF3, y para el vector AS1:rGRF3 y ANT:rGRF3 se seleccionaron las 4 plantas transgénicas primarias con la mayor área foliar.

En la Figura 21 se muestran las secuencias de nucleótidos de los GRFs de Arabidopsis thaliana, que son 9, a saber, AtGRF1 (SEQ ID NO: 40), AtGRF2 (SEQ ID NO: 87), AtGRF3 (SEQ ID NO: 2), AtGRF4 (SEQ ID NO: 19), AtGRF5 (SEQ ID NO: 41), AtGRF6 (SEQ ID NO: 42), AtGRF7 (SEQ ID NO: 43), AtGRF8 (SEQ ID NO: 44) y AtGRF9 (SEQ ID NO: 45). La sección subrayada de las secuencias representan la porción de la secuencia de nucleótidos que codifica al dominio WRC (Trp, Arg, Cys); y la sección subrayada y resaltada con negritas de las secuencias representan el sitio blanco de miR396, si hubiera alguno.

En la Figura 22 se muestran las secuencias de aminoácidos de los GRFs de A. thaliana, que son 9 (AtGRF1 (SEQ ID NO: 46), AtGRF2 (SEQ ID NO: 47), AtGRF3 (SEQ ID NO: 20), AtGRF4 (SEQ ID NO: 21), AtGRF5 (SEQ ID NO: 48), AtGRF6 (SEQ ID NO: 49), AtGRF7 (SEQ ID NO: 50), AtGRF8 (SEQ ID NO: 51) y AtGRF9 (SEQ ID NO: 52); la sección subrayada de las secuencias representa la porción de la secuencia de aminoácidos conocida como dominio WRC (Trp, Arg, Cys); y la sección subrayada y resaltada con negrita de las secuencias representa el motivo FFD.

En la Figura 23 se muestran las secuencias de nucleótidos de los GRFs de Oryza sativa (arroz); que son 12, (OsGRF1 (SEQ ID NO: 3), OsGRF2 (SEQ ID NO: 4), OsGRF3 (SEQ ID NO: 5), OsGRF4 (SEQ ID NO: 6), OsGRF5 (SEQ ID NO: 53), OsGRF6 (SEQ ID NO: 54), OsGRF7 (SEQ ID NO: 55), OsGRF8 (SEQ ID NO: 56), OsGRF9 (SEQ ID NO: 57), OsGRF10 (SEQ ID NO: 58), OsGRF11 (SEQ ID NO: 59) y OsGRF12 (SEQ ID NO: 60)). La sección subrayada y resaltada con negrita de las secuencias representa el sitio blanco de miR396, si hubiera alguno.

En la Figura 24 se muestran las secuencias de aminoácidos de los GRFs de Oryza sativa (arroz), que son 12, (OsGRF1 (SEQ ID NO: 22), OsGRF2 (SEQ ID NO: 23), OsGRF3 (SEQ ID NO: 24), OsGRF4 (SEQ ID NO: 25), OsGRF5 (SEQ ID NO: 61), OsGRF6 (SEQ ID NO: 62), OsGRF7 (SEQ ID NO: 63), OsGRF8 (SEQ ID NO: 64), OsGRF9 (SEQ ID NO: 65), OsGRF10 (SEQ ID NO: 66), OsGRF11 (SEQ ID NO: 67) y OsGRF12 (SEQ ID NO: 68)).

En la Figura 25 se muestran las secuencias de nucleótidos de los GRFs de Zea mays (maíz), que son 14) (ZmORF1 (SEQ ID NO: 7), ZmORF2 (SEQ ID NO: 69), ZmORF3 (SEQ ID NO: 8), ZmORF4 (SEQ ID NO: 70), ZmORF5 (SEQ ID NO: 9), ZmORF6 (SEQ ID NO: 10), ZmORF7 (SEQ ID NO: 11), ZmORF8 (SEQ ID NO: 71), ZmORF9 (SEQ ID NO: 12), ZmORF10 (SEQ ID NO: 72), ZmORF11 (SEQ ID NO: 13), ZmORF12 (SEQ ID NO: 73), ZmORF13 (SEQ ID NO: 74) y ZmORF14 (SEQ ID NO: 14)). La sección subrayada y resaltada con negrita de las secuencias representa el sitio blanco de miR396, si hubiera alguno.

En la Figura 26 se muestran las secuencias de aminoácidos de los GRFs de Zea mays (maíz).que son 12, (ZmORF1 (SEQ ID NO: 26), ZmORF2 (SEQ ID NO: 75), ZmORF3 (SEQ ID NO: 27), ZmORF4 (SEQ ID NO: 76), ZmORF5 (SEQ ID NO: 28), ZmORF6 (SEQ ID NO: 29), ZmORF7 (SEQ ID NO: 30), ZmORF8 (SEQ ID NO: 77), ZmORF9 (SEQ ID NO: 31), ZmORF10 (SEQ ID NO: 78), ZmORF11 (SEQ ID NO: 32), ZmORF12 (SEQ ID NO: 79), ZmORF13 (SEQ ID NO: 80) y ZmORF14 (SEQ ID NO: 33)).

En la Figura 27 se muestra la secuencia de nucleótidos para un GRF de gran similitud con AtGRF3, es decir el GRF de Glycine max (soja) (GmGRF) (SEQ ID NO: 16). La sección subrayada y resaltada con negrita de las secuencias representa el sitio blanco de miR396, si hubiera alguno.

En la Figura 28 se muestra la secuencia de nucleótidos para un GRF de gran similitud con AtGRF3, es decir, el GRF de Medicago truncatula (MtGRF) (SEQ ID NO: 17).

En la Figura 29 se muestra la secuencia de nucleótidos para un GRF de gran similitud con AtGRF3, es decir, GRF de Populus trichocarpa (PtGRF) (SEQ ID NO: 18).

En la Figura 30 se muestra la secuencia de nucleótidos para un GRF de gran similitud con AtGRF3, es decir, el GRF de Prunus pérsica (PpGRF) (SEQ ID NO: 15).

En la Figura 31 se muestra la secuencia de aminoácidos de un GRF de Medicago truncatula (MtGRF) (SEQ ID NO: 36) ; la sección subrayada de las secuencias representa la porción de la secuencia de aminoácidos conocida como el dominio WRC (Trp, Arg, Cys); y la sección subrayada y resaltada con negrita de las secuencias representa el motivo FFD.

En la Figura 32 se muestra la secuencia de aminoácidos para un GRF de Glycine max (soja) (GmGRF) (SEQ ID NO: 35); la sección subrayada de las secuencias representa la porción de la secuencia de aminoácidos conocida como el dominio WRC (Trp, Arg, Cys); y la sección subrayada y resaltada con negrita de las secuencias representa el motivo FFD.

En la Figura 33 se muestra la secuencia de aminoácidos de un GRF de Populus trichocarpa (PtGRF) (SEQ ID NO: 37) ; la sección subrayada de las secuencias representa la porción de la secuencia de aminoácidos conocida como el dominio WRC (Trp, Arg, Cys); y la sección subrayada y resaltada con negrita de las secuencias representa el motivo FFD.

En la Figura 34 se muestra la secuencia de aminoácidos de un GRF de Prunus persica (PpGRF) (SEQ ID NO: 34); la sección subrayada de las secuencias representa la porción de la secuencia de aminoácidos conocida como el dominio WRC (Trp, Arg, Cys); y la sección subrayada y resaltada con negrita de las secuencias representa el motivo FFD.

En la Figura 35 se muestra la secuencia de nucleótidos del GRF3 de Arabidopsis con un sitio blanco de miR396 mutado (A t-rGRF3) (SEQ ID NO: 81); la porción sombreada y subrayada de la secuencia es el sitio blanco del miR396 mutado. Las minúsculas se refieren a sustituciones de bases que vuelven al GRF resistente a miR396. Para evitar toda duda, cuando se hace referencia al AtGRF3 mutante en la presente, a menos que se defina de otra manera, es a esta secuencia a la cual se hace referencia. Esta secuencia también se denomina At-rGRF3 y rGRF3 en la presente. Este At-rGRF3 mutado se usó en la presente para generar, entre otros, plantas de Arabidopsis transgénicas.

En la Figura 36 se muestra la secuencia de nucleótidos del GRF de Glycine max con un sitio blanco de miR396 mutado (Gm-rGRF) (SEQ ID NO: 82); la porción sombreada y subrayada de la secuencia es el sitio blanco del miR396 mutado. Las minúsculas se refieren a sustituciones de bases que vuelven al GRF resistente a miR396. Este Gm-rGRF mutado se usó en la presente para generar plantas de Arabidopsis transgénicas.

En la Figura 37 se muestra la secuencia de nucleótidos del GRF4 de Oryza sativa con un sitio blanco de miR396 mutado (O s-rGRF4.1) (SEQ ID NO: 83); la porción sombreada y subrayada de la secuencia es el sitio blanco del miR396 mutado. Las minúsculas se refieren a sustituciones de bases que vuelven al GRF resistente a miR396. Este Os-rGRF4 mutado se usó en la presente para generar plantas de Arabidopsis transgénicas. Esta secuencia también se denomina Os-rGRF4.1 y rOsGRF4.1 en la presente.

En la Figura 38 se muestran tablas de similitud entre At-GRF3 y GRFs de otras especies de plantas basada en las secuencias de aminoácidos primarias. La similitud global entre GRF3 y cada GRF de At, Os y Zm (más otros GRFs muy similares de especies seleccionadas) se calificó usando Needle (EMBOSS:http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/). La identidad se relaciona con la presencia de un aminoácido idéntico en la posición correspondiente; en tanto la similitud se relaciona con la presencia de una sustitución conservadora de un aminoácido en una posición correspondiente.

En la Figura 39 se muestra la secuencia de nucleótidos que codifica JD16_GIF1 (incluyendo el promotor 35S (nt 427 1295) - sección subrayada; secuencia de codificación GIF1 (nt 1310-1942) - sección en cursiva y resaltada en negrita; y el terminador (nt 2106-2755) - sección en negrita y subrayada.

En la Figura 40 se muestra la secuencia de nucleótidos que codifica RER32 GRF3 (SEQ ID NO: 85) (incluyendo el Promotor GRF3 (427-1707) - sección subrayada; 5'UTR (1708-1913) - minúscula y cursiva; secuencia de codificación de g Rf 3 + intrones [en minúscula] (1914-4231) - cursiva y negritas; 3'UTR (4232-4454) - minúsculas y cursiva; y terminador (4455-5105) - sección en negrita y subrayada.

En la Figura 41 se muestra una mapa del vector 35S.GIF1 (JD16) (SEQ ID NO: 84) - Tamaño del vector: 11332 pb digerido con bamHI y SalI. Productos: 10682 y 650 pb.

En la Figura 42 se muestran un mapa del vector GRF3:GRF3r (RER32) - Tamaño del vector: 13642 pb digestión con XbaI y SalI. Productos: 11962 y 1680 pb.

En la Figura 43 se muestra que la sobreexpresión de GIF1, GIF2 y GIF3 promueve la proliferación celular y el tamaño de la hoja y que las proteínas GIF2 y GIF3 son equivalentes funcionales de GIF1 (véase la Figura 43 en combinación con la Figura 9).

En la Figura 44 se muestran los mapas de los dos plásmidos que comprenden rGRF3:GIF1 en el pBRACT114. El pBRACT114 se encuentra disponible en www.bract.org. Los pBRACTs se basan en el sistema de vector pGreen/pSoup y la referencia original para el pGreen es: Hellens et al 2000.

En la Figura 45 se muestra la senescencia demorada de las hojas de plantas primarias de Arabidopsis transgénicas por un GRF mutado de Arabidopsis (At-rGRF3) y por un GRF mutado de soja (Gm-rGRF).

En la Figura 46 se muestra que la expresión en Arabidopsis de ortólogos de GRF3 de soja y de arroz, cuando se desacopla de la regulación miR396 también aumenta la biomasa vegetal. Se midió el área de la primera hoja completamente expandida de plantas transgénicas que expresan al GRF de Arabidopsis, soja o arroz.

En la Figura 47 se muestra la secuencia de nucleótidos para un GRF de gran similitud con AtGRF3, es decir, el GRF de Carica papaya (CpGRF) (SEQ ID NO: 88).

En la Figura 48 se muestra la secuencia de aminoácidos de un GRF de Carica papaya (CpGRF) (SEQ ID NO: 89); la sección subrayada de las secuencias representa la porción de la secuencia de aminoácidos conocida como el dominio WRC (Trp, Arg, Cys); y la sección subrayada y resaltada con negrita de las secuencias representa el motivo FFD.

En la Figura 49 se muestran datos que comparan el ancho de tallos 10 cm por encima del nivel del suelo en la floración y ancho máximo de tallos en la floración en plantas transformadas de Brassica oleracea con el rGRF3 de Arabidopsis y plantas control (sin el At rGRF3).

En la Figura 50 se muestra la expresión del rGRF3 a partir de promotores específicos de tejidos.

Parte superior: representación esquemática de un constructo que expresa GRF3 como una fusión de traducción con GFP. Parte inferior: patrón de expresión de la proteína de fusión GRF3-GFP en hojas de diferente edades recolectadas de plantas GRF3:GRF3-GFP y GRF3:rGRF3-GFP. B) Nivel de expresión del ARNm de GRF3 en ápice y hojas de diferentes edades. C) Tinción con GUS de plantas transformadas con los informantes ANT:GUS y AS1:GUS. Parte superior, representación esquemática de los informantes.

En la Figura 51 se muestran los niveles de expresión de rGRF3 bajo promotores específicos de tejidos y el área foliar de los transformantes.

A) Niveles de expresión de GRF3 en plántulas transgénicas que expresan GRF3 a partir de diferentes promotores. Las determinaciones se efectuaron por RT-qPCR y se normalizaron para plantas de tipo salvaje. B) Área de la primera y la segunda hoja completamente expandida. C) Primera (izquierda) y tercera (derecha) hoja completamente expandida.

En la Figura 52 se muestran imágenes de plantas de 40 días que expresan rGRF3 a partir de sus promotores endógenos y a partir de los promotores ANT y AS1.

En la Figura 53 se muestra la senescencia demorada cuando rGRF3 se expresa bajo el control de su propio promotor. La senescencia es evidente en el tipo salvaje y cuando rGRF3 se expresa bajo el control de AS1 y/o ANT.

A) Imágenes de rosetas de 50 días. Nótese la senescencia demorada de plantas GRF3:rGRF3 y el desarrollo normal de AS1.GRF3 y ANT:GRF3. B) Se muestra la senescencia de una hoja individual para la hoja 5 completamente expandida, que se desprendió y se incubó en oscuridad (senescencia inducida por oscuridad). El progreso de la senescencia se cuantificó por determinación de Fv/Fm.

En la Figura 54 se muestra el área foliar graficada para plantas transgénicas primarias independientes. CHF3 es un vector vacío control; rGRF3 con el motivo FFD es el ADNc rGRF3 expresado a partir de su propio promotor; rGRF3 AAD es el ADNc de rGRF3 con tres mutaciones en el motivo FFD (FFDDW) que reemplazan a los dos aminoácidos fenilalanina y al triptofano por tres aminoácidos alanina (AADDA).

En la Figura 55 se muestra una comparación entre plantas que expresan rGRF2 y rGRF3. Según se muestra en la presente, la expresión de rGRF3 conduce a la producción de plantas más grandes que el tipo salvaje o con expresión de rGRF2. El rGRF2 también genera rosetas distorsionadas.

La Figura 56 es una tabla que muestra en mayor ancho de tallo en la floración y el peso de 10 cm de tallo para transformantes de Brassica oleracea que expresan rGRF3 y plantas control (TC).

La Figura 57, izquierda, es un gráfico que muestra la longitud de raíces en distintos días después de la siembra para Brassica oleracea de tipo salvaje y dos plantas transgénicas de Brassica oleracea que expresan rGRF3.

A la derecha, es un gráfico que muestra la velocidad de elongación radicular para el tipo salvaje o dos plantas transgénicas que expresan rGRF3.

Resumen

La invención se define por las reivindicaciones.

La presente invención se basa en el hallazgo sorprendente que un nuevo gen GRF3 modificado, rGRF3, que se desacopla del control por el miR396, en particular en la presencia de sobreexpresión de GIF1, puede ser de utilidad para mejorar significativamente la biomasa, mejorar la resistencia al estrés, mejorar la tolerancia a la sequía, demorar la senescencia de hojas en plantas. La mejora en la acumulación de biomasa es sorprendentemente elevada e inesperadamente mayor que el único otro GRF desacoplado de miARN informado, es decir, rGRF2, en tanto la tolerancia a la sequía es inesperada a partir de los datos previamente informados.

Los inventores de la presente también han encontrado sorprendentemente ortólogos de GRF3 que también están modificados para estar desacoplados del control por miR396 y que también proveen efectos sorprendentes e inesperados.

En un primer aspecto se provee un ácido nucleico aislado que codifica un factor regulador del crecimiento modificado (GRF)-3 o un ortólogo del mismo, donde el ácido nucleico está desacoplado del control por el miR396.

En otro aspecto se provee un constructo que comprende al ácido nucleico de acuerdo con la presente invención ligado operativamente con un promotor y un terminador.

La presente descripción provee además un vector que comprende al ácido nucleico anterior o el constructo anterior.

La presente descripción provee una planta, una célula vegetal o un tejido vegetal que comprende al ácido nucleico de acuerdo con la presente descripción, el constructo de acuerdo con la presente descripción o el vector de acuerdo con la presente descripción.

En aún otro aspecto se provee un método de uso del ácido nucleico de acuerdo con la presente descripción que comprende introducir dicho ácido nucleico de acuerdo con la presente descripción o un constructo de acuerdo con la presente descripción o un vector de acuerdo con la presente descripción en una planta.

El ácido nucleico de acuerdo con la presente descripción o el constructo de acuerdo con la presente descripción o el vector de acuerdo con la presente descripción se puede usar en la elaboración de una planta con mayor productividad y/o rendimiento (incluyendo, por ejemplo, mayor biomasa, mayor resistencia al estrés, mayor tolerancia a la sequía, mayor producción de semillas, mayor rendimiento de semillas, mayor crecimiento radicular, mayor velocidad de elongación radicular, senescencia demorada de las hojas y combinaciones de los mismos).

En otro aspecto de la presente invención, se provee un método para producir una planta con mayor productividad y/o rendimiento (incluyendo, por ejemplo, uno o más entre mayor biomasa, mayor resistencia al estrés, mayor tolerancia a la sequía, senescencia demorada de las hojas, mayor producción de semillas, mayor rendimiento de semillas, mayor crecimiento radicular, mayor velocidad de elongación radicular y combinaciones de los mismos) que comprende transformar la planta con un ácido nucleico de acuerdo con la presente descripción o un constructo de acuerdo con la presente descripción o un vector de acuerdo con la presente descripción.

La descripción también provee el uso de un ácido nucleico o un constructo o un vector mencionados con anterioridad en la elaboración de una planta para incrementar la productividad y/o el rendimiento (por ejemplo, uno o más entre aumentar la biomasa, aumentar la resistencia al estrés, aumentar la tolerancia a la sequía, demorar la senescencia de las hojas, aumentar la producción de semillas, aumentar el rendimiento de semillas, aumentar el crecimiento radicular, aumentar la velocidad de elongación radicular o combinaciones de los mismos).

En otro aspecto, la presente descripción provee un nuevo gen modificado, rGRF3, que está desacoplado del control por miR396, en particular en la presencia de sobreexpresión de GIF1.

Por lo tanto, un objeto de esta invención comprende proveer un nuevo gen GRF3 modificado o un nuevo ortólogo modificado del gen GRF3.

Un objeto adicional de esta invención comprende proveer nuevas plantas que comprenden un gen GRF3 modificado.

Un objeto adicional de esta invención comprende proveer nuevas plantas que comprenden un gen GRF3 modificado en la presencia de sobreexpresión de GIF1.

Otro objeto adicional de esta invención comprende proveer un método de uso del gen GRF3 modificado o un ortólogo modificado de GRF3 divulgado en la presente.

Un objeto adicional de esta invención comprende proveer un método para producir plantas con un fenotipo de mayor productividad y/o rendimiento (por ejemplo, un fenotipo de senescencia demorada de las hojas, mayor biomasa, mayor respuesta al estrés, mayor tolerancia a la sequía, mayor producción de semillas, mayor rendimiento de semillas, mayor crecimiento radicular, mayor velocidad de elongación radicular o combinaciones de los mismos), en comparación ya sea con plantas de tipo salvaje o plantas que comprenden un gen GRF2 modificado (rGRF2).

Un objeto adicional de la presente invención comprende proveer plantas con un fenotipo de mayor productividad y/o rendimiento (por ejemplo, un fenotipo de senescencia demorada de las hojas, mayor biomasa, mayor respuesta al estrés, mayor tolerancia a la sequía, mayor producción de semillas, mayor rendimiento de semillas, mayor crecimiento radicular, mayor velocidad de elongación radicular o combinaciones de los mismos) sin efectos secundarios adversos en las plantas que expresan un GRF2 modificado (rGRF2), tal como cambios perjudiciales en la forma de las hojas, por ejemplo, hojas curvas u hojas enrolladas hacia abajo.

Otros objetos y ventajas de esta invención serán evidentes con referencia a la descripción completa provista en la presente, y las reivindicaciones adjuntas.

Descripción detallada

Rodríguez et al., (2010) empleó el patrón de expresión de miR396 usando directamente transferidos de ARN pequeños e hibridación in situ en ápices, e indirectamente por la expresión diferencial de informantes de tipo salvaje y GRF2-GUS resistentes a miARN. El miR396 se expresó a niveles bajos en el meristema y primordios de hoja, y luego se acumulaba de manera constante con el desarrollo de la hoja. Por el contrario, el GRFs, de gran expresión en el SAM y hojas jóvenes, disminuyó durante el desarrollo de las hojas, en concordancia con el retroceso de la proliferación celular.

Se han observado patrones de expresión antagonistas temporales para miR156 y miR172 y sus blancos, los factores de transcripción SPL y tipo AP2, respectivamente (Chuck et al., 2007; Wu y Poethig, 2006). Las redes heterocrónicas miR156 y miR172 regulan de manera correspondiente las transiciones de juvenil a adulto, y de fase vegetativa a reproductora, que requieren de decisiones que implican a la planta completa (Aukerman y Sakai, 2003; Chen, 2004; Chuck et al., 2007; Schmid et al., 2005; Wu y Poethig, 2006). Las observaciones acerca de miR396 indicó que este miARN también está relacionado con la coordinación de los eventos del desarrollo en plantas; sin embargo, su rol estaría restringido a órganos individuales.

El programa del desarrollo de Arabidopsis dirige un patrón basiplástico, según el cual la maduración de la hoja comienza por la punta y luego avanza hacia la base del órgano (Donnelly et al., 1999). La división celular se produce primero por todos los primordios y luego hay un frente de arresto mitótico que se mueve desde la punta hasta la base de la hoja, de modo que las células en la parte distal de la hoja detiene su avance por el ciclo y comienza a expandirse, donde las células en la base continúan proliferándose (Donnelly et al., 1999). Los resultados de Rodríguez et al. mostraron que en la parte distal de la hoja se acumula más miR396 y hay un gradiente de actividad miARN que avanza hacia la base del órgano. Dicho resultado estaba fundamentado por transferidos de ARN pequeños y el retroceso observado del informante de tipo salvaje GRF2-GUS, que luego coincidía con el patrón de un informante CYCB1;1. Dichas observaciones llevaron a los autores a implicar la represión de la expresión del GRF por miR396 como un componente del frente de arresto mitótico.

Se han observado patrones de expresión espaciales similares para el ARNm GRF2 y para miR396 en el meristema y primordios de hojas, lo cual indica que hay co-expresión del miARN y su blanco en esta etapa temprana. Sin embargo, la situación era diferente en las etapas posteriores del desarrollo de la hoja. El informante de tipo salvaje GRF2-GUS solamente era activo en la parte proximal de hojas en desarrollo jóvenes, en tanto el informante proximal se expresó por toda la hoja. Este cambio cualitativo en la expresión del GRF2-GUS de tipo salvaje se observaba en paralelo con un gran incremento en el miR396, cuyos niveles cambiaron hasta 10-30 veces en las hojas con las diferentes edades del desarrollo. Notablemente, la disminución en la expresión de GRF se produjo antes que el miR396 alcanzara su nivel máximo, lo cual indica que un aumento parcial en el miARN es suficiente para reprimir a los GRFs in vivo; sin embargo, no se puede descartar la participación de factores adicionales que actúan conjuntamente con el miR396 en este proceso.

Se ha propuesto que los miARNs podrían tener efectos cualitativos, que conducen a la eliminación completa de sus blancos, y efectos cuantitativos más sutiles (Bartel y Chen, 2004). En las plantas, estas interacciones cuantitativas fueron propuestas para tener miR169 (Cartolano et al., 2007) y miR156 (Wang et al., 2008), miR319 (Ori et al., 2007) y miR164 (Baker et al., 2005; Nikovics et al., 2006), y sus blancos. Desde un punto de vista mecanístico, se especula que miR396 tiene funciones dobles durante el desarrollo de la hoja: podría regular cuantitativamente la expresión de GRF en el SAM y en primordios de hojas, causando al mismo tiempo un gran efecto cualitativo que contribuye con la depuración de la actividad GRF de los órganos más viejos. Este rol funcional posterior en la depuración de transcriptos de GRF podría explicar el aumento continuo en los niveles de miR396, aún después que ha cesado la proliferación celular. Por otro lado, la regulación cuantitativa potencial de la actividad de GRF durante el desarrollo de las hojas podría cumplir un rol relevante en el ajuste fino de la proliferación celular, ya que se ha mostrado que las modificaciones del equilibrio entre los niveles de miR396 y de GRF2 tienen consecuencias importantes para la cantidad final de células en el órgano.

El miR396 fue el primero en ser identificado debido a la conservación entre A. thaliana y arroz (Jones-Rhoades y Bartel, 2004). miR396 y los GRFs con un sitio blanco de miR396 están presentes en muchas especies de plantas (Axtell y Bartel, 2005; Jones-Rhoades y Bartel, 2004), lo cual es indicativo de un origen antiguo de la red reguladora de miR396-GRF. La función de los GRFs como reguladores de la cantidad de células en las hojas está bien establecida en base a los fenotipos de grf (Horiguchi et al., 2005; Kim et al., 2003; Kim y Lee, 2006) y gif (Horiguchi et al., 2005; Kim y Kende, 2004) mutantes y plantas con niveles elevados de miR396 (Liu et al., 2009).

Rodríguez et al., (2010) extendieron estas observaciones y encontraron que los GRFs regulan la proliferación celular en el SAM, lo cual explica al menos parcialmente la falta de un meristema funcional en los mutantes an3-1 que sobreexpresan miR396 (este estudio) y en múltiples noqueos de grf (Kim et al., 2003; Kim y Lee, 2006). El análisis del transcriptoma de los miR396 de sobreexpresión moderada ha mostrado que la subregulación de los genes específicos de la mitosis es uno de los principales efectos moleculares de los niveles elevados de miR396. Sin embargo, los propios GRFs no cambian su expresión durante el ciclo celular (Menges et al., 2005) y será necesario continuar con las investigaciones para identificar los mecanismos subyacentes de la actividad de los GRFs.

Las mediciones de los GRFs por RT-qPCR indican que los blancos y no blancos de miR396 se desactivaban en etapas similares del desarrollo de las hojas, y que actúan de manera redundante. Estudios previos en los cuales se fusionaron promotores directamente a un informante GUS han mostrado que la transcripción de los genes GRF puede producirse en diferentes regiones de la hoja (Horiguchi et al., 2005). Rodríguez et al., observaron que el control de post-transcripción de GRF2 por el miR396 contribuye significativamente en su patrón de expresión final, y concluyeron que es posible que el miARN también cumpla un rol clave en el ajuste de la expresión de otros GRFs.

Se ha demostrado que el gen CIN de TCP de boca de dragón se expresa según un patrón dinámico durante el desarrollo de la hoja y que regula la expresión de ciclina (Nath et al., 2003). Los genes tipo CIN de Arabidopsis, que están regulados por el miR319, también se han relacionado con la coordinación de la proliferación celular y su diferenciación en hojas (Efroni et al., 2008; Koyama et al., 2007; Masuda et al., 2008; Palatnik et al., 2003; Schommer et al., 2008). Un aumento de los niveles de TCP4 debido a mutaciones que deterioran la interacción con el miR319 produce hojas más pequeñas (Efroni et al., 2008; Palatnik et al., 2003; Schommer et al., 2008).

Rodríguez et al., observaron que las plantas que expresan formas resistentes a miR319 de TCP4 indujo al miR396. Dado que el balance cuantitativo entre miR396 y los GRFs regula la cantidad de células en las hojas, el aumento en el miR396 causado por TCP4 podría ser responsable de al menos parte de la reducción en la cantidad de células en los mutantes soj8. Sin embargo, observaron que el aumento en los niveles de TCP4 también causó una reducción en los GRFs que no era regulada por miR396 y GIF1, indicativo de un efecto a nivel de la transcripción. Los circuitos reguladores en los cuales un factor de transcripción causa tanto la represión de la transcripción de los genes blanco como la inducción de un miARN que a su vez inhibe post-transcripcionalmente al mismo grupo de genes, están bien descritos en animales, donde se conocen como bucles de alimentación directa coherentes (Hornstein y Shomron, 2006).

Los que sobreexpresan miR319 (Efroni et al., 2008; Ori et al., 2007; Palatnik et al., 2003) y noqueos de tcp (Nath et al., 2003; Schommer et al., 2008) tienen grandes cambios en la morfología de la hoja, así como otros defectos fenotípicos, tal como una demora en el tiempo de floración (Palatnik et al., 2003). Esto indica que los TCPs tienen funciones que van más allá del desarrollo de las hojas. Sin embargo, es posible que los TCPs regulados por miR319 recluten a la red miR396 como parte de su función biológica. Rodríguez et al., propusieron que la red miR396 podría constituir un enlace entre diferentes entradas o estímulos ambientales durante el desarrollo y los componentes de la maquinaria del ciclo celular.

En esta descripción, se muestran los efectos en las plantas de GRF3 mutantes (y ortólogos de los mismos) para producir una nueva molécula, rGRF3 (u ortólogos de los mismos), de manera análoga a lo observado para GRF2 informado por Rodríguez et al.. Sorprendentemente, sin embargo, se informa aquí que el resultado es una planta con un aumento pronunciado en la productividad y/o el rendimiento (por ejemplo, con un aumento pronunciado en la biomasa, una mayor respuesta al estrés, una senescencia demorada de las hojas, una mayor producción de semillas, un mayor rendimiento de semillas, un mayor crecimiento radicular, una mayor velocidad de elongación radicular y/o una mayor tolerancia a la sequía), ya sea si se compara a plantas con GRF3 de tipo salvaje (por ejemplo, no mutado), GRF2 de tipo salvaje o el GRF2 mutado (rGRF2) descritos en Rodríguez et al. Además, se muestra que estos efectos aumentan cuando al menos un GIF (por ejemplo GIF1) es sobreexpresado en la presencia del GRF3 mutado (rGRF3) o un ortólogo del mismo.

Aún más, las hojas de las plantas imitantes GRF3 y/o de plantas ortólogas de imitantes de GRF3 no se curvaban hacia abajo como las del mutante GRF2 (rGRF2) informados en Rodríguez et al.

Un aumento ligero en el área foliar se observa en las plantas rGRF2 si su nivel es aumentado al menos veinte veces el nivel de GRF2; sin embargo, se puede observar un impacto mucho mayor sobre la productividad (por ejemplo, el tamaño de las hojas y la biomasa de las plantas) en plantas rGRF3 y plantas con ortólogos rGRF3 con solamente tres a cinco veces más GRF3 u ortólogo de GRF3.

Por consiguiente, según esta descripción, como se muestra con detalle en los ejemplos y métodos experimentales provistos más adelante, se producen rGRF3 u ortólogos de los mismos que comprenden varias mutaciones sinónimos en la secuencia de ácido nucleico - es decir no hay cambios en la secuencia de aminoácidos de GRF3.

El resultado es una planta en la cual la represión lograda de otra manera por miR396 está desacoplada del rGRF3, y así se pueden producir plantas con mayor productividad y/o rendimiento (incluyendo una mayor biomasa, una mayor resistencia al estrés, una senescencia demorada de las hojas y una mayor tolerancia a la sequía o una combinaciones de los mismos).

En un primer aspecto se provee un ácido nucleico aislado que codifica un factor regulador del crecimiento modificado (GRF)-3, donde el ácido nucleico está desacoplado del control por el miR396.

El ácido nucleico puede desacoplarse del control por miR396 mediante mutación del sitio blanco de miR396.

Preferiblemente, el ácido nucleico mutado o modificado solamente es modificado en el sitio blanco de miR396, por ejemplo el resto del gen permanece no modificado o no mutado.

En un aspecto preferido, el ácido nucleico modificado es modificado de manera tal que comprenda cambios de ácidos nucleicos conservados. En otras palabras, el ácido nucleico es modificado de manera tal que no hay cambios en la secuencia de aminoácidos del GRF3 o de ortólogo de GRF3 expresado por el ácido nucleico.

La modificación del ácido nucleico esencialmente desacopla al ácido nucleico (por ejemplo, al gen) del control por el miR396.

El ácido nucleico está desacoplada del control por miR396 mediante una mutación del ácido nucleico en el sitio blanco de miR396.

El ácido nucleico de acuerdo con la presente invención codifica una proteína que contiene al motivo FFD.

En algunos aspectos, preferiblemente el ácido nucleico codifica una proteína que contiene al motivo FFD(D/E)WP. Para evitar toda duda, “(D/E)” significa que en dicha posición hay un residuo D o E. En otras palabras, FFD(D/E)WP significa FFDDWP o FFDEWP.

Con el fin de determinar si un GRF es un ortólogo GRF3 de acuerdo con la presente invención, se puede buscar a los GRFs que codifican una proteína que contiene al motivo FFD, (por ejemplo FFD(D/E)WP). Los ortólogos GRF3 serán los GRFs que comprenden al menos un sitio blanco de miR396. Convenientemente, el sitio blanco de miR396 (por ejemplo, en el ácido nucleico de acuerdo con la presente descripción, tal como en el gen GRF3) puede tener, comprender o consistir de la siguiente secuencia de nucleótidos CGTTCAAGAAAGCCTGTGGAA (SEQ ID NO: 1). En algunas formas de realización, esta secuencia de nucleótidos puede considerarse como la secuencia del sitio blanco de tipo salvaje de miR396.

Un ortólogo GRF3 son uno o más de los siguientes GRFs seleccionados del grupo que consiste de: GRF4 de Arabidopsis thaliana; GRF 1, 2, 3, 4 o 5 de Oryza sativa; GRF 1, 3, 5, 6, 7, 9, 11 o 14 de Zea mays; GRF de Glycine max; g Rf de Medicago truncatula; GRF de Populus trichocarpa, GRF de Carica papaya y GRF de Prunus persica que fueron desacoplados del control por miR396.

Los ortólogos de GRF3 son aquellos que se agrupan con AtGRF3 en el cladograma representado en la Figura 7. Se ha encontrado que estos ortólogos de GRF3 funcionan de manera similar a AtGRF3.

Para evitar toda duda, los GRFs que se agrupan con ya sea AtGRF2 o AtGRF9 no son de interés en la presente solicitud ya que se ha encontrado que estos GRFs no funcionan como AtGRF3.

Un ortólogo de GRF3 es aquel que tiene la misma funcionalidad que AtGRF3.

El término “ortólogo” según se usa en la presente significa genes de función similar o igual pero que aparecen en especies diferentes.

Según se muestra en la Figura 7, el ortólogo de GRF3 puede ser aquel que comprende un sitio blanco de miR396 y que codifica una proteína que contiene al motivo FFD (por ejemplo FFD(D/E)WP).

Los ortólogos GRF3 de acuerdo con la presente invención serán los GRFs que comprenden al menos un sitio blanco de miR396.

El ácido nucleico usado en el contexto de la presente invención codifica el factor de regulación del crecimiento 3 (GRF3) de Arabidopsis thaliana.

La presente descripción se relaciona con un ácido nucleico aislado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende i) una secuencia de nucleótidos que se muestra como la SEQ ID NO: 2 (AtGRF3); ii) o una secuencia de nucleótidos que es al menos un 45%, preferiblemente al menos un 50%, preferiblemente al menos un 60%, preferiblemente al menos un 65%, idéntica a la SEQ ID NO: 2; o iii) una secuencia de nucleótidos que se hibrida bajo condiciones severas con una secuencia de nucleótidos de ya sea i) o ii) en donde la secuencia de nucleótidos comprende una modificación en el sitio blanco de miR396 para desacoplar el ácido nucleico del control por miR396.

El ácido nucleico aislado de acuerdo con la presente invención puede comprender i) una secuencia de nucleótidos que se muestra como la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 5, la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 9, la SEQ ID NO: 10, la SEQ ID NO: 11, la SEQ ID NO: 11, la SEQ ID NO: 12, la SEQ ID NO: 13, la SEQ ID NO: 14, la SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 16, la SEQ ID NO: 17, la SEQ ID NO: 18 o la SEQ ID NO: 19; ii) o una secuencia de nucleótidos que es al menos un 45%, preferiblemente al menos un 50%, preferiblemente al menos un 60%, preferiblemente al menos un 65%, idéntica a la SEQ ID NO: 3, la SEQ ID NO: 4, la SEQ ID NO: 5, la SEQ ID NO: 6, la SEQ ID NO: 7, la SEQ ID NO: 8, la SEQ ID NO: 9, la SEQ ID NO: 10, la SEQ ID NO: 11, la SEQ ID NO: 11, la SEQ ID NO: 12, la SEQ ID NO: 13, la SEQ ID NO: 14, la SEQ ID NO: 15, la SEQ ID NO: 16, la SEQ ID NO: 17, la SEQ ID NO: 18 o la SEQ ID NO: 19; o iii) una secuencia de nucleótidos que se hibrida bajo condiciones severas con una secuencia de nucleótidos ya sea de i) o ii), en donde la secuencia de nucleótidos de i), ii) o iii) comprende una modificación en el sitio blanco de miR396 para desacoplar el ácido nucleico del control por miR396.

El ácido nucleico aislado de acuerdo con la presente invención puede comprender i) una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que en la presente se muestra como la SEQ ID NO: 20, la SEQ ID NO: 21, la SEQ ID NO: 22, la SEQ ID NO: 23, la SEQ ID NO: 24, la SEQ ID NO: 25, la SEQ ID NO: 26, la SEQ ID NO: 27, la SEQ ID NO: 28, la SEQ ID NO: 29, la SEQ ID NO: 30, la SEQ ID NO: 31, la SEQ ID NO: 32, la SEQ ID NO: 33, la SEQ ID NO: 34, la SEQ ID NO: 35, la SEQ ID NO: 36 o la SEQ ID NO: 37; ii) o una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 45%, preferiblemente al menos un 50%, preferiblemente al menos un 60%, preferiblemente al menos un 65%, de identidad con la secuencia de nucleótidos de i); o iii) una secuencia de nucleótidos que se hibrida bajo condiciones severas con una secuencia de nucleótidos de ya sea i) o ii), en donde la secuencia de nucleótidos de i), ii) o iii) comprende una modificación en el sitio blanco de miR396 para desacoplar el ácido nucleico del control por el miR396.

Preferiblemente el ácido nucleico desacoplado del control de miR396 de acuerdo con la presente invención presenta una mejora adicional en la presencia de sobreexpresión de al menos un gen GIF (por ejemplo, GIF1).

La sobreexpresión de al menos un GIF (por ejemplo, GIF1) se puede lograr transformando una planta, o una célula vegetal, o un tejido vegetal, con un constructo que comprende al menos un GIF (por ejemplo G lF l) que codifica una secuencia ligada operativamente a un promotor.

En un aspecto, la planta, la célula vegetal o el tejido vegetal comprende al menos dos, por ejemplo 2 o 3, genes GIF sobreexpresados.

El gen GIF de acuerdo con la presente invención puede ser cualquier gen GIF adecuado, incluyendo AtGIF1 (a menudo denominado GIF1 en la presente), AtGIF 2, AtGlF 3, Os11g40100, Os12g31350, Os03g52320 o combinaciones de los mismos.

La secuencia de codificación de GIF (por ejemplo GIF1) puede estar bajo el control de un promotor constitutivo, tal como el promotor CaMV 35S, o puede ser un promotor específico de tejidos.

Según se muestra con detalle en los ejemplos y en los métodos experimentales provistos más adelante, se pueden producir rGRF3 u ortólogos del mismo, que comprendan varios cambios de ácido nucleico sinónimos - es decir, no hay cambios en la secuencia de aminoácidos de GRF3. El GRF3 modificado o un ortólogo del mismo puede comprender al menos uno o todos los siguientes cambios de bases en el sitio blanco de miR396, por ejemplo una modificación A->U, G->A, U->G, U->A, G-> C, A->T, G->A, T->A, G->A, A->G. Estos cambios pueden retener la secuencia de aminoácidos nativa, pero desestabilizan sustancialmente la interacción de miR396 con dicho rGRF3. El GRF3 modificado o un ortólogo del mismo puede comprender al menos uno o todos los siguientes cambios de base en el sitio blanco miR396 una modificacion A->U, G->A, U->A, G->A, G->A y A->G. Estos cambios pueden retener una secuencia de aminoácidos nativa, pero desestabilizan sustancialmente la interaccion de miR396 con dicho rGRF3. El GRF3 modificado o un ortólogo del mismo comprende un sitio blanco de miR396 modificado que presenta la siguiente secuencia: CGTTCxAGAAAxCCxGTxGAx (SEQ ID NO: 86), en donde x indica las bases que fueron modificadas (por ejemplo, mutadas) (por ejemplo, en comparación con la secuencia de tipo salvaje).

De acuerdo con la presente descripción, el GRF3 modificado o un ortólogo del mismo comprende un sitio blanco de miR396 modificado que presenta la siguiente secuencia: CGTTCtAGAAAaCCaGTaGAg (SEQ ID NO: 38), en donde las minúsculas indican las bases que fueron modificadas (por ejemplo en comparación con la secuencia de tipo salvaje).

Las secuencias mutantes se pueden producir mediante cualquier método conocido y hay diversos métodos fácilmente disponibles para el especialista en el arte. Como podrá apreciar un especialista en el arte, es posible producir numerosas mutaciones dirigidas al sitio o aleatorias en una secuencia de nucleótidos y subsiguientemente examinar la funcionalidad mejorada del polipéptido codificado utilizando distintos medios.

Las mutaciones se pueden introducir usando oligonucleótidos sintéticos. Estos oligonucleótidos contienen secuencias de nucleótidos que rodean los sitios de mutación deseados. Se describe un método apropiado en Morinaga et al (Biotechnology (1984) 2, páginas 646-649). Otro método para introducir mutaciones en secuencias de nucleótidos se describe en Nelson y Long (Analytical Biochemistry (1989), 180, págs. 147-151).

Un método para introducir mutaciones en una secuencia de nucleótidos sería usar el conjunto de elementos para mutagénesis dirigida al sitio QuikChange® de Stratagene.

En algunos aspectos, se puede usar la tecnología de lesiones locales inducidas dirigidas en genomas (TILLING) descrita por Colbert et al 2001 (Plant Physiology, junio 2001, Vol. 126, págs. 480-484) para examinar las mutaciones inducidas, por ejemplo mutaciones puntuales inducidas.

En otro aspecto se provee un constructo que comprende al ácido nucleico de acuerdo con la presente invención ligado operativamente a un promotor y/o un terminador.

El promotor puede ser un promotor constitutivo, tal como el promotor CaMV 35S, el promotor AtGRF3 nativo o el promotor nativo del ortólogo de GRF3, o puede ser un promotor específico de tejidos.

En una forma de realización, el promotor puede ser un promotor específico de tejidos.

Cuando se desea desacoplar las diferentes funciones de GRF3 (tal como para desacoplar la mayor biomasa de la senescencia demorada de las hojas), preferiblemente el ácido nucleico de acuerdo con la presente invención está ligado operativamente a un promotor específico de tejidos.

Además, el uso de un promotor específico de tejidos puede mejorar el rendimiento de la producción de plantas y mejorar además la productividad.

En algunos aspectos, el promotor específico de tejidos puede comprender (o puede ser) un promotor expresado transitoriamente durante el desarrollo temprano de las hojas.

En una forma de realización, el promotor específico de tejidos puede comprender (o puede ser) un promotor ASYMMETRIC LEAVES 1 (AS-1) o un promotor AINTEGUMENTA (ANT). Un especialista en el arte conocerá otros promotores específicos de tejidos adecuados para dirigir la expresión del ácido nucleico de acuerdo con la presente invención en la ubicación apropiada de la planta. Sin considerar la teoría, un GRF3 o mutante un ortólogo mutante de GRF3 desacoplado del control de miR396 con o sin la co-sobreexpresión de GIF, puede modificar la cantidad de células en hojas u otros órganos cuando los ácidos nucleicos se expresan específicamente en dichos tejidos. Por ello, el rGRF3 solamente afectará aquella parte de la planta donde tiene lugar la expresión.

Un especialista en el arte también sabe que el patrón y nivel de expresión temporales también pueden ser modificados. Por ejemplo, el promotor AS-1 es activo por un mayor período de tiempo que el promotor ANT, y por consiguiente genera hojas más grandes cuando expresa secuencias del GRF3 mutado (rGRF3) o del ortólogo mutado de GRF3. Por ello, el promotor específico de tejidos puede ser aquel que regula la expresión de manera espacial y/o temporal. La presente descripción provee además un vector que comprende al ácido nucleico de la presente invención o el constructo de acuerdo con la presente invención.

En un aspecto adicional, la presente descripción provee una planta, una célula vegetal o un tejido vegetal que comprende al ácido nucleico de acuerdo con la presente invención, el constructo de acuerdo con la presente descripción o el vector de acuerdo con la presente descripción.

En un aspecto, la planta, la célula vegetal o el tejido vegetal de acuerdo con la presente invención puede comprender además un GRF2 modificado (rGRF2), donde dicho GRF2 modificado también está desacoplado del control por miR396. En otras palabras, el GRF2 también se puede mutar en sitio blanco de miR396 de acuerdo con la presente descripción. Para evitar toda duda, esta forma de realización solamente relaciona la combinación del rGRF3 o del ortólogo de rGRF3 de acuerdo con la presente invención en combinación con rGRF2.

AtGRF2 y AtGRF9 no son ortólogos de GRF3 de acuerdo con la presente descripción.

Por ende, el término “ortólogo de GRF3" según se usa en la presente no incluye AtGRF2 o AtGRF9.

Por ende, la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la presente invención no comprende una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra en la presente como la SEQ ID NO: 87 o la SEQ ID NO: 45.

Asimismo, el término “ortólogo modificado de GRF3" u “ortólogo de rGRF3” según se usa en la presente no incluye al AtGRF2 modificado o al AtGRF9 modificado.

En una forma de realización de la presente invención, la planta, la célula vegetal o el tejido vegetal además puede sobreexpresar al menos un GIF (por ejemplo GIF1).

La sobreexpresión de al menos un GIF (por ejemplo, GIF1) se puede lograr transformando dicha planta, o una célula vegetal, o un tejido vegetal, con un constructo que comprende al menos un GIF (por ejemplo GIF1) que codifica una secuencia ligada operativamente a un promotor.

En algunos aspectos, la planta, la célula vegetal o el tejido vegetal de acuerdo con la presente descripción, puede comprender más de uno (por ejemplo dos, por ejemplo tres) ácidos nucleicos mencionados con anterioridad.

A modo de ejemplo solamente, la planta, la célula vegetal o el tejido vegetal de acuerdo con la presente invención puede comprender más de uno (por ejemplo dos, por ejemplo tres) genes rGRF3. Por ejemplo, la planta, la célula vegetal o el tejido vegetal de acuerdo con la presente descripción, puede comprender rGRF3 en combinación con uno o más ortólogos de rGRF3.

El término “GRF3" según se usa en la presente se refiere al GROWTH-REGULATING FACTOR 3 que se puede obtener (preferiblemente, que se obtiene) de Arabidopsis thaliana.

El término “rGRF3" según se usa en la presente se refiere al GROWTH-REGULATING FACTOR 3 mutado o modificado que se puede obtener (preferiblemente, que se obtiene) de Arabidopsis thaliana. Preferiblemente, el GROWTH-REGULATING FACTOR 3 mutado o modificado fue mutado o modificado para desacoplarlo del control por el miR396.

El término “ortólogo de GRF3" según se usa en la presente puede abarcar uno o más de los siguientes GRFs seleccionados del grupo que consiste de: GRF4 de Arabidopsis thaliana; GRF 1, 2, 3, 4 o 5 de Oryza sativa; GRF 1, 3, 5, 6, 7, 9, 11 o 14 de Zea mays; GRF de Glycine max; GRF de Medicago truncatula; GRF de Populus trichocarpa, GRF de Carica papaya y GRF de Prunus persica.

El término “ortólogo de rGRF3” según se usa en la presente puede abarcar uno o más de los siguientes GRFs seleccionados del grupo que consiste de GRF4 de Arabidopsis thaliana; GRF 1,2, 3, 4 o 5 de Oryza sativa; GRF 1, 3, 5, 6, 7, 9, 11 o 14 de Zea mays; GRF de Glycine max; GRF de Medicago truncatula; GRF de Populus trichocarpa, GRF de Carica papaya y GRF de Prunus persica que fueron desacoplados del control por miR396.

El ácido nucleico que codifica un GRF-3 modificado, o un ortólogo del mismo, puede comprender intrones o puede excluir intrones.

En un aspecto, el ácido nucleico que codifica un GRF-3 modificado o un ortólogo del mismo comprende intrones. Sin considerar la teoría, los intrones pueden mejorar la expresión de los transgenes.

El ácido nucleico de acuerdo con la presente descripción o el constructo de acuerdo con la presente descripción o el vector de acuerdo con la presente descripción se puede usar en la elaboración de una planta con mayor biomasa, mayor resistencia al estrés, mayor tolerancia a la sequía, senescencia demorada de las hojas y combinaciones de los mismos.

En otro aspecto, se provee un método para producir una planta con mayor biomasa, mayor resistencia al estrés, mayor tolerancia a la sequía, senescencia demorada de las hojas y combinaciones de los mismos que comprende transformar la planta con un ácido nucleico de acuerdo con la presente descripción o un constructo de acuerdo con la presente descripción o un vector de acuerdo con la presente descripción.

Un aspecto adicional provee el uso de un ácido nucleico o un constructo o un vector de acuerdo con la presente descripción en la elaboración de una planta para incrementar la biomasa, aumentar la resistencia al estrés, aumentar la tolerancia a la sequía, demorar la senescencia de las hojas o combinaciones de los mismos.

Preferiblemente, las plantas tienen una mayor biomasa, una mayor resistencia al estrés, una mayor tolerancia a la sequía, una senescencia demorada de las hojas o combinaciones de los mismos.

El término “mayor biomasa” puede comprender uno o más de los siguientes seleccionados del grupo que consiste de: mayor biomasa vegetal global, mayor peso fresco, mayor área o tamaño foliar, mayor longitud de raíces, mayor peso seco, mayor crecimiento del tallo, mayor biomasa del tallo, mayor diámetro de tallos y mayor ancho de tallo en la floración.

Una ventaja técnica sorprendente del uso de rGRF3 o de ortólogos de rGRF3 (que difieren del uso de rAtGRF2) es que la mayor biomasa, la mayor tolerancia a la sequía, la senescencia demorada de las hojas o combinaciones de los mismos tienen lugar sin cambios perjudiciales en la forma de la hoja, por ejemplo un enrollamiento descendente. En algunos aspectos, puede ser preferible desacoplar la mayor biomasa de la senescencia demorada de las hojas. Los inventores han encontrado sorprendentemente que esto se puede lograr usando promotores específicos de tejidos.

El término “mayor resistencia al estrés” según se usa en la presente se refiere a la capacida d de una planta para permanecer productiva (por ejemplo, mantener o aumentar la biomasa, etc.) aún bajo condiciones que ubican a la planta bajo estrés, por ejemplo de sequía etc.

Los términos “mayor biomasa”, “mayor resistencia al estrés”, “mayor tolerancia a la sequía”, “senescencia demorada de las hojas” “mayor crecimiento radicular”, “mayor velocidad de elongación radicular” significa que está aumentado o demorado en comparación ya sea con plantas de tipo salvaje (por ejemplo, plantas que comprenden un GRF3 u ortólogo GRF3 no modificado) o plantas que comprenden un GRF2 modificado (rGRF2).

Los términos “mayor biomasa vegetal global”, “mayor peso fresco”, “mayor área o tamaño foliar”, “mayor peso seco”, “mayor crecimiento del tallo”, “mayor biomasa del tallo”, “mayor diámetro de tallos” y “mayor ancho de tallo en la floración” significa que está aumentado o demorado en comparación ya sea con plantas de tipo salvaje (por ejemplo, plantas que comprenden un GRF3 u ortólogo GRF3 no modificado) o plantas que comprenden un GRF2 modificado (rGRF2).

El término “modificado” según se usa en la presente puede significar mutado. El término “modificado” según se usa en la presente significa que es diferente del tipo salvaje.

El término “tipo salvaje” según se usa en la presente significa un ácido nucleico natural. Es decir un ácido nucleico presente en un código genético endógeno y aislado de su organismo huésped endógeno que no ha sido mutado (es decir, que no contiene supresiones, adiciones o sustituciones de bases) cuando se compara con el código genético del organismo huésped.

El vector de acuerdo con la presente invención puede ser un vector de expresión. El término "vector de expresión" se refiere a un constructo capaz de una expresión in vivo o in vitro.

Preferiblemente, el vector de expresión se incorpora en el genoma de un organismo adecuado, por ejemplo una planta. El término “incorporado” preferiblemente abarca la incorporación estable en el genoma.

La secuencia de nucleótidos de la presente invención puede estar presente en un vector en el que la secuencia de nucleótidos esta unida operativamente una secuencias reguladoras que son capaces de proveer la expresión de la secuencia de nucleótidos por parte de un organismo huésped apropiado, por ejemplo, planta.

Los vectores para su uso en la presente invención se pueden transformar en una célula huésped adecuada, por ejemplo una célula vegetal, descrita más adelante.

Los vectores para usar en la presente invención pueden contener uno o más genes marcadores seleccionables - tal como un gen que confiera resistencia a antibióticos por ejemplo resistencia a ampicilina, kanamicina, cloranfenicol o tetraciclina.

Los vectores se pueden usar in vitro, por ejemplo para la producción de ARN o se pueden usar para transfectar, transformar, transducir o infectar una célula huésped.

Por lo tanto, en una forma de realización adicional, la invención provee un método para hacer secuencias de nucleótidos de la presente invención mediante introducción de una secuencia de nucleótidos de la presente invención en un vector replicable, introduciendo el vector en una célula huésped compatible (por ejemplo, vegetal), y creciendo la célula huésped (por ejemplo, vegetal) bajo condiciones que producen la replicación del vector.

El término “unión operativa” como se usa en la presente hace referencia a una yuxtaposición donde los componentes descriptos se hallan en una relación que les permite operar de la manera deseada. Una secuencia reguladora "ligada operativamente" a una secuencia de codificación está unida de tal manera que la expresión de dicha secuencia de codificación tiene lugar bajo condiciones compatibles con las secuencias control.

El término “secuencias reguladoras” incluye promotores y potenciadores y otras señales de regulación de la expresión. El término "promotor" se usa en el sentido normal de la técnica, por ejemplo un sitio de unión a la ARN polimerasa.

El término “constructo” - que es sinónimo de términos tales como “conjugado”, “casete” e “híbrido” - incluye una secuencia de nucleótidos que puede usarse de acuerdo con la presente invención, unida de manera directa o indirecta a un promotor.

Un ejemplo de una unión indirecta es la provisión de un grupo espaciador apropiado, tal como una secuencia de un intrón, tal como el intrón Sh1 o el intrón ADH, entre el promotor y la secuencia de nucleótidos de la presente invención. Lo mismo se cumple para el término “fusionado” con relación a la presente invención, que incluye una unión directa o indirecta. En algunos casos, los términos no abarcan la combinación natural de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína asociada comúnmente con el promotor del gen de tipo salvaje y cuando ambos se encuentran en su ambiente natural.

El constructo aún puede contener o expresar un marcador que permita seleccionar el constructo genético.

Para algunas aplicaciones, preferiblemente el constructo usado en la presente invención comprende al menos la secuencia de nucleótidos de la presente invención unida operativamente a un promotor.

Un organismo huésped adecuado para la transformación con el ácido nucleico usado en la presente invención puede ser una planta. Con respecto a esto, el principio básico del constructo de plantas genéticamente modificadas es insertar información genética en el genoma de la planta de modo de obtener un mantenimiento estable del material genético que se insertó. Se puede consultar una revisión de las técnicas generales en los artículos de Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205-225) y Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech marzo/abril de 199417-27).

La infección directa de tejido vegetales mediante Agrobacterium es una técnica simple que se ha empleado ampliamente y que se describe en Butcher D.N. et al., (1980), Tejido Culture Métodos for Plant Pathologists, editores D.S. Ingrams y J.P. Helgeson, 203-208.

Otras técnicas para transformar plantas incluyen a transformación balística, la técnica de carburo sensor de silicio (véase Frame BR, Drayton PR, Bagnaall SV, Lewnau CJ, Bullock WP, Wilson HM, Dunwell JM, Thompson JA & Wang K (1994) Production of fertile transgenic maize plants by silicon carbide whisker-mediated transformation, The Plant Journal 6941-948) y técnicas de transformación viral (por ejemplo véase Meyer P, Heidmann I & Niedenhof I (1992) The use of cassava mosaic virus as a vector system for plants, Gene 110: 213-217).

Se pueden consultar otras descripciones de la transformación de plantas en el documento EP-A-0449375.

Las células vegetales se pueden crecer y mantener de acuerdo con métodos de cultivo tisular bien conocidos tal como mediante cultivo de las células en un medio de cultivo apropiado provisto con los factores de crecimiento necesarios tal como aminoácidos, hormonas vegetales, vitaminas, etc.

En otro aspecto, la presente invención se relaciona con un sistema de vector que porta una secuencia de nucleótidos o construcción de acuerdo a la presente invención y que es capaz de introducir la secuencia de nucleótidos o construcción en el genoma de un organismo, tal como una planta. El sistema de vector puede comprender un vector, pero el mismo puede comprender dos vectores. En el caso de dos vectores, el sistema de vector se denomina normalmente como un sistema de vector binario. Los sistemas de vectores binarios se describen en más detalle en Gynheung An et al., (1980), Binary Vectors, Plant Molecular Biology Manual A3, 1-19.

Un sistema que se emplea extensamente para la transformación de células vegetales usa el plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens o un plásmido Ri de Agrobacterium rhizogenes An et al., (1986), Plant Physiol. 81, 301 305 y Butcher D.N. et al., (1980), Tissue Culture Methods for Plant Pathologists, eds.: D.S. Ingrams y J.P. Helgeson, 203-208. Después de cada método de introducción del deseado promotor o construcción o secuencia de nucleótidos de acuerdo a la presente invención en las plantas, puede ser necesaria la presencia y/o inserción de otras secuencias de ADN. Si, por ejemplo, se usa para la transformación de las células vegetales el plásmido Ti o Ri, se pueden conectar al menos el extremo derecho y con frecuencia los extremos izquierdo y derecho del ADN-T del plásmido Ti y Ri, como áreas flanqueantes de los genes que se introdujeron. El uso de ADN-T para la transformación de células vegetales se ha estudiado intensamente y se describe en Ep - A - 120516; Hoekema, en: The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerij Kanters B.B., Alblasserdam, 1985, Capítulo V; Fraley, et al., Crit. Rev. Plant Sci., 4:1-46; y An et al., EMBO J. (1985) 4:277-284.

El término GIF según se usa en la presente significa FACTORES QUE INTERACTÚAN CON GRF-INTERACTING FACTOR [GRF-INTERACTING FACTORs) (GIFs), una pequeña familia de genes que codifica proteínas con homología para el co-activador de transcripción SYT humano (Horiguchi et al., 2005; Kim y Kende, 2004).

GIF1 (Kim y Kende, 2004) también se conoce como ANGUSTIFOLIA 3 (AN3).

En una forma de realización, preferiblemente el GIF usado de acuerdo con la presente invención es GIF1. GIF1 también se puede denominar en la presente como MGIF1.

En una forma de realización, el GIF usado de acuerdo con la presente invención puede ser GIF1, en donde GIF1 i) comprende el aminoácido que se muestra en la presente como MQQHLMQMQPMMAGYYPSNVTSDHIQQYLDENKSLILKIVESQNSGKLSECAENQ ARLQRNLMYLAAIADSQPQPPSVHSQYGSAGGGMIQGEGGSHYLQQQQATQQQ QMTQQSLMAARSSMLYAQQQQQQQPYATLQHQQLHHSQLGMSSSSGGGGSSG LH ILQGEAGGFHDFGRGKPEMGSGGGGEGRGGSSGDGGETLYLKSSDDGN (SEQ ID NO: 95) o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80% de identidad con la misma; o ii) está codificada por la secuencia de nucleótidos:

ATGCAACAGCACCTGATGCAGATGCAGCCCATGATGGCTGGTTACTACCCCAG

CAATGTTACCTCTGATCATATCCAACAGTACTTGGACGAAAACAAATCGTTGATT

CTGAAGATTGTTGAGTCTCAAAACTCTGGAAAGCTTAGCGAATGCGCCGAGAAT

CAAGCAAGGCTTCAACGCAACCTAATGTACCTAGCTGCAATAGCAGATTCTCAG

CCTCAGCCACCAAGTGTGCATAGCCAGTATGGATCTGCTGGTGGTGGGATGAT

TCAGGGAGAAGGAGGGTCACACTATTTGCAGCAGCAACAAGCGACTCAACAGC

AACAGATGACTCAGCAGTCTCTAATGGCGGCTCGATCTTCAATGTTGTATGCTC

AGCAACAGCAGCAGCAGCAGCCTTACGCGACGCTTCAGCATCAGCAATTGCAC

CATAGCCAGCTTGGAATGAGCTCGAGCAGCGGAGGAGGAGGAAGCAGTGGTC

TCCATATCCTTCAGGGAGAGGCTGGTGGGTTTCATGATTTTGGCCGTGGGAAG

CCGGAAATGGGAAGTGGTGGTGGCGGTGAAGGCAGAGGAGGAAGTTCAGGGG

ATGGTGGAGAAACCCTTTACTTGAAATCATCAGATGATGGGAATTGA (SEQ ID

NO: 39); o

iii) está codificado por una secuencia de nucleótidos que es al menos un 70%, preferiblemente un 80%, más preferiblemente un 90%, aún más preferiblemente un 95% idéntico a la SEQ ID NO: 39; o iv) está codificado por una secuencia de nucleótidos que se hibrida bajo condiciones severas con la SEQ ID NO: 39.

Según se observa en la Figura 9, una cantidad de secuencias GIF de Arabidopsis thaliana y Oryza sativa se agrupan entre sí. Se prevé que cualquiera de estos GIFs puede usarse de acuerdo con la presente invención. Por ello, el GIF para su uso de acuerdo con la presente invención puede ser uno o más de los GIFs denominados Os11g40100, Os12g31350, Os03g52320 que se pueden obtener (preferiblemente que se obtienen) de Oryza sativa o puede ser uno o más de los GIFs denominados AtGIF1, AtGIF2 o AtGIF3 que se puede obtener (preferiblemente, que se obtiene) de Arabidopsis thaliana.

En una forma de realización, el GIF usado de acuerdo con la presente invención puede ser AtGIF2, en donde AtGIF2 i) comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la presente como MQQQQSPQMFPMVPSIPPANNITTEQIQKYLDENKKLIMAIMENQNLGKLAECAQY QALLQKNLMYLAAIADAQPPPPTPGPSPSTAVAAQMATPHSGMQPPSYFMQHPQA SPAGIFAPRGPLQFGSPLQFQDPQQQQQIHQQAMQGHMGIRPMGMTNNGMQHA MQQPETGLGGNVGLRGG-KQDGADGQGKDDGK (SEQ ID NO: 96) o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80% de identidad con la misma; o

ii) está codificada por la secuencia de nucleótidos:

ATGCAGCAGCAGCAGTCTCCGCAAATGTTTCCGATGGTTCCGTCGATTCCCCCT

GCTAACAACAT CACTACCGAACAGATCCAAAAGT ACCTT GATGAGAACAAGAAG

CT GATT ATGGCCAT CAT GGAAAACCAGAAT CTCGGT AAACTT GCT GAGT GC GCC

CAGT ACCAAGCTCTT CTCCAGAAGAACTT GAT GTATCTT GCTGCAATT GCT GAT

GCTCAACCCCCACCACCT ACGCCAGGACCTT CACCAT CT ACAGCTGTCGCTGC

CCAGATGGCAACACCGCATTCTGGGATGCAACCACCTAGCTACTTCATGCAACA

CCCACAAGCATCCCCTGCAGGGATTTTCGCTCCAAGGGGTCCTTTACAGTTTG

GTAGCCCACTCCAGTTTCAGGATCCGCAACAGCAGCAGCAGATACATCAGCAA

GCTATGCAAGGACACATGGGGATTAGACCAATGGGTATGACCAACAACGGGAT

GCAGCATGCGATGCAACAACCAGAAACCGGTCTTGGAGGAAACGTGGGGCTTA

GAGGAGGAAAGCAAGATGGAGCAGATGGACAAGGAAAAGATGATGGCAAGTG

A (SEQ ID NO: 90), o

iii) está codificado por una secuencia de nucleótidos que es al menos un 70%, preferiblemente un 80%, más preferiblemente un 90%, aún más preferiblemente un 95% idéntica a la SEQ ID NO: 90; o iv) está codificado por una secuencia de nucleótidos que se hibrida bajo condiciones severas con la SEQ ID NO: 90.

En una forma de realización el GIF usado de acuerdo con la presente invención puede ser AtGIF3, en donde AtGIF3 i) comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la presente como MQQSPQMIPMVLPSFPPTNNITTEQIQKYLDENKKLIMAILENQNLGKLAECAQYQA LLQKNLMYLAAIADAQPQPPAATLTSGAMTPQAMAPNPSSMQPPPSYFMQQHQAV GMAQQIPPGIFPPRGPLQFGSPHQFLDPQQQLHQQAMQGHMGIRPMGLNNNNGL QHQMHHHETALAANNAGPNDASGGGKPDGTNMSQSGADGQGGSAARHGGGDAKTEGK (SEQ ID NO: 97) o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80% de identidad con la misma; o

ii) está codificada por la secuencia de nucleótidos:

ATGCAGCAATCTCCACAGATGATTCCGATGGTTCTTCCTTCATTTCCGCCCACC

AATAATATCACCACCGAACAGATCCAAAAGTATCTTGATGAGAACAAGAAGCTG

ATAATGGCGATCTTGGAAAATCAGAACCTCGGTAAACTTGCAGAATGTGCTCAG

TATCAAGCTCTTCTCCAGAAGAATTTGATGTATCTCGCTGCAATTGCGGATGCT

CAACCTCAGCCACCAGCAGCTACACTAACATCAGGAGCCATGACTCCCCAAGC

AATGGCTCCTAATCCGTCATCAATGCAGCCACCACCAAGCTACTTCATGCAGCA

ACATCAAGCTGTGGGAATGGCTCAACAAATACCTCCTGGGATTTTCCCTCCTAG

AGGTCCATTGCAATTTGGTAGCCCGCATCAGTTTCTGGATCCGCAGCAACAGTT

ACATCAACAAGCTATGCAAGGGCACATGGGGATTAGACCAATGGGTTTGAATAA

TAACAACGGACTGCAACATCAAATGCACCACCATGAAACTGCTCTTGCCGCAAA

CAATGCGGGTCCTAACGATGCTAGTGGAGGAGGTAAACCGGATGGGACCAATA

TGAGCCAGAGTGGAGCTGATGGGCAAGGTGGCTCAGCCGCTAGACATGGCGG

TGGTGATGCAAAAACTGAAGGAAAATGA (SEQ ID NO: 91), o

iii) está codificada por una secuencia de nucleótidos que es al menos un 70%, preferiblemente un 80%, más preferiblemente un 90%, aún más preferiblemente un 95% idéntico a la SEQ ID NO: 91; o

iv) está codificada por una secuencia de nucleótidos que se hibrida bajo condiciones severas con la SEQ ID NO: 91.

En un aspecto, el GIF usado de acuerdo con la presente invención puede ser el GIF denominado Os11g40100, en donde Os11g40100 i) comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la presente como:

MQQQMAMPAGAAAAAVPPAAGITTEQIQKYLDENKQLILAILENQNLGKLAECAQY

QAQLQKNLLYLAAIADAQPPQNPGSRPQMMQPGATPGAGHYMSQVPMFPPRTPL

TPQQMQEQQQQQLQQQQAQALAFPGQMLMRPGTVNGMQSIPVADPARAADLQT

AAPGSVDGRGNKQDATSEPSGTESHKSAGADNDAGGDIAEKS (SEQ ID NO: 98)

o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80% de identidad con la misma; o

ii) está codificada por la secuencia de nucleótidos:

ATGCAGCAGCAGATGGCCATGCCGGCGGGGGCCGCCGCCGCCGCGGTGCCG

CCGGCGGCCGGCATCACCACCGAGCAGATCCAAAAGTATTTGGATGAAAATAA

ACAGCT AATTTT GGCCAT C CTGGAAAAT CAAAACCT AGGGAAGTT GGCTGAAT G

TGCTCAGTACCAAGCTCAGCTTCAAAAGAATCTCTTGTATCTGGCTGCCATTGC

AGATGCCCAACCACCT CAGAATCCAGGAAGTCGCCCT CAGATGATGCAGCCTG

GTGCTACCCCAGGTGCTGGGCATTACATGTCCCAAGTACCGATGTTCCCTCCA

AGAACTCCCTTAACCCCACAACAGATGCAAGAGCAGCAGCAGCAGCAACTCCA

GCAACAGCAAGCTCAGGCTCTAGCCTTCCCCGGCCAGATGCTAATGAGACCAG

GTACTGTCAATGGCATGCAATCTATCCCAGTTGCTGACCCTGCTCGCGCAGCC

GATCTTCAGACGGCAGCACCGGGCTCGGTAGATGGCCGAGGAAACAAGCAGG

ATGCAACCTCGGAGCCTTCCGGGACCGAGAGCCACAAGAGTGCGGGAGCAGA

TAACGACGCAGGCGGTGACATAGCGGAGAAGTCCTGA (SEQ ID NO: 92), ), o

iii) está codificada por una secuencia de nucleótidos que es al menos un 70%, preferiblemente un 80%, más preferiblemente un 90%, aún más preferiblemente un 95% idéntico a la SEQ ID NO: 92; o

iv) está codificada por una secuencia de nucleótidos que se hibrida bajo condiciones severas con la SEQ ID NO: 92.

En un aspecto, el GIF usado de acuerdo con la presente invención puede ser el GIF denominado Os12g31350, en donde Os12g31350 i) comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la presente como:

MQQQPMPMPAQAPPTAGITTEQIQKYLDENKQLILAILENQNLGKLAECAQYQAQLQKNLLYLAAIADTQPQTTISRPQ MVPHGASPGLGGQYMSQVPMFPPRTPLTPQQMQEQQLQQQQAQLLSFGGQMVMRPGVVNGIPQLLQGEMHRGA DHQNAGGATSEPSESHRSTGTENDGGSDFGDQS (SEQ ID NO: 99) o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80% de identidad con la misma; o

ii) está codificada por la secuencia de nucleótidos:

ATGCAGCAGCAGCCGATGCCGATGCCCGCGCAGGCGCCGCCGACGGCCGGA

ATCACCACCGAGCAGATCCAAAAGTATCTGGATGAAAACAAGCAGCTTATTTTG

GCTATTTTGGAAAATCAGAATCTGGGAAAGTTGGCAGAATGTGCTCAGTATCAA

GCGCAGCTTCAGAAGAATCTCTTGTACTTGGCTGCAATTGCTGATACTCAACCG

CAGACCACTATAAGCCGTCCCCAGATGGTGCCGCATGGTGCATCGCCGGGGTT

AGGGGGGCAATACATGTCGCAGGTGCCAATGTTCCCCCCCAGGACCCCTCTAA

CGCCCCAGCAGATGCAGGAGCAGCAGCTGCAGCAACAGCAAGCCCAGCTGCT

CTCGTTCGGCGGTCAGATGGTTATGAGGCCTGGCGTTGTGAATGGCATTCCTC

AGCTTCTGCAAGGCGAAATGCACCGCGGAGCAGATCACCAGAACGCTGGCGG

GGCCACCTCGGAGCCTTCCGAGAGCCACAGGAGCACCGGCACCGAAAATGAC

GGTGGAAGCGACTTCGGCGATCAATCCTAA (SEQ ID NO: 93), o

iii) está codificada por una secuencia de nucleótidos que es al menos un 70%, preferiblemente un 80%, más preferiblemente un 90%, aún más preferiblemente un 95% idéntico a la SEQ ID NO: 93; o

iv) está codificada por una secuencia de nucleótidos que se hibrida bajo condiciones severas con la SEQ ID NO: 93.

En un aspecto, el GIF usado de acuerdo con la presente invención puede ser el GIF denominado Os03g52320, en donde Os03g52320 i) comprende la secuencia de aminoácidos que se muestra en la presente como:

MQQQHLMQMNQGMMGGYASPTTVTTDLIQQYLDENKQLILAILDNQNNGKVEECA RNQAKLQHNLMYLAAIADSQPPQTAAMSQYPSNLMMQSGARYMPQQSAQMMAP QSLMAARSSMMYAQPALSPLQQQQQQQAAAAHGQLGMGSGGTTSGFSILHGEA SMGGGGGGGGAGNSMMNAGVFSDFGRGGGGGGKEGSTSLSVDVRGANSGAQSGDGEYLKGTEEEGS (SEQ ID NO: 100) o una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 80% de identidad con la misma; o

ii) está codificada por la secuencia de nucleótidos:

ATGCAGCAGCAACACCTGATGCAGATGAACCAGGGCATGATGGGGGGATATGC

TTCCCCTACCACCGTCACCACTGATCTCATTCAGCAGTATCTGGATGAGAACAA

GCAGCTGATCCTGGCCATCCTTGACAACCAGAACAATGGGAAGGTGGAAGAGT

GCGCTCGGAACCAAGCTAAGCTCCAGCACAATCTCATGTACCTCGCCGCCATC

GCCGACAGCCAGCCGCCGCAGACGGCCGCCATGTCCCAGTATCCGTCGAACC

TGATGATGCAGTCCGGGGCGAGGTACATGCCGCAGCAGTCGGCGCAGATGAT

GGCGCCGCAGTCGCTGATGGCGGCGAGGTCTTCGATGATGTACGCGCAGCCG

GCGCTGTCGCCGCTCCAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGGCGGCGGCGGCGCAC

GGGCAGCTGGGCATGGGCTCGGGGGGCACCACCAGCGGGTTCAGCATCCTCC

ACGGCGAGGCCAGCATGGGCGGCGGCGGCGGCGGCGGTGGCGCCGGTAACA

GCATGATGAACGCCGGCGTGTTCTCCGACTTCGGACGCGGCGGCGGCGGCGG

CGGCAAGGAGGGGTCCACCTCGCTGTCCGTCGACGTCCGGGGCGCCAACTCC

GGCGCCCAGAGCGGCGACGGGGAGTACCTCAAGGGCACCGAGGAGGAAGGC

AGCTAG (SEQ ID NO: 94), o

iii) está codificada por una secuencia de nucleótidos que es al menos un 70%, preferiblemente un 80%, más preferiblemente un 90%, aún más preferiblemente un 95% idéntico a la SEQ ID NO: 94; o

iv) está codificada por una secuencia de nucleótidos que se hibrida bajo condiciones severas con la SEQ ID NO: 94.

Aún más, los inventores han demostrado que la sobreexpresión de GIF1, GIF2 y GIF3 promueve la proliferación celular y el tamaño de la hoja y que las proteínas GIF2 y GIF3 son equivalentes funcionales de GIF1 (véase la Figura 43 junto con la Figura 9).

Previamente, Horiguchi et al., (2005) mostraron que la sobreexpresión del gen GIF1/AN3 también estimula la proliferación celular, lo cual conduce a hojas agrandadas en aproximadamente un 20%.

Estos resultados sugieren que todos los genes GIF funcionan de manera redundante como reguladores positivos de la proliferación celular, determinando el tamaño del órgano de la planta.

Por ello, se contempla el uso de cualquier gen GIF de acuerdo con la invención en la presente.

Además, en la presente también se contemplan combinaciones de genes GIF.

En un aspecto, la secuencia preferiblemente se encuentra en una forma aislada. El término “aislada” denota que la secuencia se hallan al menos sustancialmente libres de al menos otro componente con el que la secuencia se halla asociada normalmente en la naturaleza.

En un aspecto, la secuencia preferiblemente se encuentra en una forma purificada. El término “purificada” significa que la secuencia se encuentra en un estado relativamente puro - por ejemplo, al menos un 90% puro aproximadamente, o al menos un 95% puro aproximadamente o al menos un 98% puro aproximadamente.

Los términos “secuencia de nucleótidos” o “ácido nucleico”, como se los usa en la presente, hacen referencia a una secuencia oligonucleotídica o a una secuencia polinucleotídica y a variantes, homólogos, fragmentos y derivados de ésta (tales como porciones de ésta). La secuencia de nucleótidos puede ser de origen genómico, sintético o recombinante, puede ser de cadena doble o de cadena simple y puede representar la cadena orientada en el sentido del marco de lectura o antisentido.

Los términos “secuencia de nucleótidos” o “ácido nucleico”, con relación a la presente invención, incluye ADN genómico, ADNc, ADN sintético y ARN. Preferiblemente el mismo significa ADN, más preferiblemente secuencia codificante de ADNc para la presente invención.

En un aspecto preferido, la secuencia de nucleótidos cuando es en relación a, y cuando esta abarcada por el alcance per se de la presente invención, no incluye a la secuencia de nucleótidos nativa de acuerdo a la presente invención cuando la misma está en su entorno natural y cuando la misma está asociada a su(s) secuencia(s) naturalmente asociada(s) que está/están también en su entorno natural. Para facilitar la denominación, esta forma de realización preferida se denominará “secuencia de nucleótidos no nativa” o “ácido nucleico no nativo”

Típicamente, la secuencia de nucleótidos o el ácido nucleico abarcada por el alcance de la presente invención se prepara usando técnicas de ADN recombinante (es decir ADN recombinante). Sin embargo, en una forma de realización alternativa de la invención, la secuencia de nucleótidos o el ácido nucleico podría sintetizarse, por completo o en parte, usando métodos químicos bien conocidos en la técnica (véanse Caruthers MH et al (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23 y Horn T et al (1980) Nuc Ácidos Res Symp Ser 225-232).

Debido a la degeneración del código genético, las secuencias de nucleótidos pueden producirse fácilmente, para lo cual se puede cambiar la utilización de tripletes o codones, para algunos o todos los aminoácidos codificados por la secuencia de nucleótidos original, produciendo así una secuencia de nucleótidos con una baja homología con la secuencia de nucleótidos original pero que codifica la misma secuencia de aminoácidos, o una variante de la misma, que la codificada por la secuencia de nucleótidos original. Por ejemplo, para la mayoría de los aminoácidos, la degeneración del código genético es en la tercera posición en el codon de triplete (posición de bamboleo) (por mayor referencia véase Stryer, Lubert, Biochemistry, Tercera Edición, Freeman Press, ISBN 0-7167-1920-7); por ello, una secuencia de nucleótidos en la todos los tripletes o codones han sido “bamboleados” en la tercera posición sería aproximadamente un 66% idéntica a la secuencia de nucleótidos original. Sin embargo, la secuencia de nucleótidos modificada codificaría la misma secuencia de aminoácidos primaria, o una variante, que la secuencia de nucleótidos original.

Por ello, la presente descripción se relaciona además, en algunas formas de realización, con cualquier secuencia de nucleótidos que tiene una utilización de tripletes o codones alternativos para al menos un aminoácido que codifica un triplete o codón, pero que codifica la misma secuencia de polipéptido, o una variante de la misma, codificada por la secuencia de nucleótidos original.

Aún más, los organismos específicos típicamente tienen una tendencia hacia los tripletes o codones que utilizarán para codificar los aminoácidos. Las tablas de la utilización de codones preferida se encuentran ampliamente disponibles, y se pueden usar para preparar genes de codones optimizados. Dichas técnicas de optimización de codones se utilizan rutinariamente para optimizar la expresión de los transgenes en un huésped heterólogo.

La presente descripción también abarca el uso de secuencias que tienen identidad o similitud con las secuencias de acuerdo con la presente descripción.

Aquí, el término “identidad” hace referencia a una entidad que presenta una identidad determinada con las secuencias de aminoácidos y con las secuencias de nucleótidos. La identidad se refiere al porcentaje de aminoácidos o bases que son iguales en una secuencia cuando se compara con otra secuencia.

Aquí, el término “similitud” significa una entidad que tiene propiedades/funciones químicas similares. Por ende, el término similitud tiene en cuenta los cambios conservadores.

En el presente contexto, se considera que una secuencia que tiene un determinado porcentaje de identidad o similitud incluye una secuencia que puede ser al menos un 90% idéntica, preferiblemente al menos un 95, 96, 97, 98 o 99% idéntica a una secuencia de la presente invención (la secuencia de la invención). Típicamente, las secuencias comprenderán las mismas secuencias que codifican los sitios activos, etcétera, que la secuencia de la invención.

Las comparaciones de identidad o similitud pueden llevarse a cabo visualmente, o más comúnmente, con la ayuda de programas de comparación de secuencias fácilmente disponibles. Los programas informáticos disponibles pueden calcular el % de identidad y el % de similitud entre dos o más secuencias.

El % de identidad puede calcularse sobre secuencias contiguas, es decir, se alinea una secuencia con otra y cada aminoácido en una secuencia se compara directamente con el aminoácido correspondiente en la otra, de a un residuo por vez. Esto se denomina alineamiento “sin huecos o faltas de coincidencia”. Típicamente, dichos alineamientos sin faltas de coincidencia solamente se efectúan sobre una extensión relativamente corta de residuos.

Aunque este es un método muy simple y consistente, no tiene en consideración, por ejemplo, que en un par de secuencias por lo demás idénticas, una inserción o una supresión provocarán que los siguientes residuos de aminoácidos queden fuera del alineamiento, lo cual potencialmente resultaría en una gran reducción en el % de homología cuando se efectuara un alineamiento global. En consecuencia, la mayoría de los métodos de comparación de secuencia están diseñados para producir alineamientos óptimos, donde se tienen en cuenta las inserciones y las supresiones posibles sin penalizar indebidamente la calificación general de homología. Esto se efectúa mediante la inserción de “huecos” en el alineamiento de las secuencias, con el fin de maximizar la homología local.

Sin embargo, en estos métodos más complejos se le asignan “penalidades por falta de coincidencia” a cada falta de coincidencia que aparece en el alineamiento, de modo que, para la misma cantidad de aminoácidos idénticos, un alineamiento de secuencia con tan pocas faltas de coincidencia como sea posible - que refleje la mayor relación entre las dos secuencias comparadas - permita obtener una calificación más alta que uno con muchas faltas de coincidencia. Típicamente se usa una “afinación de los costos por falta de coincidencia”, donde se asigna un costo relativamente alto por la existencia de una falta de coincidencia y una penalidad más pequeña por cada residuo subsiguiente en la falta de coincidencia.

Este es el sistema de calificación de las faltas de coincidencia usado más comúnmente. Por supuesto, las penalidades altas por las faltas de coincidencia producirán alineamientos optimizados con menos faltas de coincidencia. La mayoría de los programas de alineamiento permiten modificar las penalidades por falta de coincidencia. Sin embargo, se prefiere emplear los valores predeterminados cuando se usa dicho software para comparar secuencias. Por ejemplo cuando se usa el paquete GCG Wisconsin Bestfit la penalidad por falta de coincidencia para secuencias de aminoácidos es de -12 para una falta de coincidencia y -4 para cada extensión.

Por consiguiente, para el cálculo del % de identidad máximo, primero es necesario producir un alineamiento óptimo, donde se tengan en cuenta las penalidades por falta de coincidencia. Un programa para computadoras apropiado para llevar a cabo dicho alineamiento es el paquete GCG Wisconsin Bestfit (Devereux et al 1984 Nuc Ácidos Research 12 p387).Los ejemplos de otros programas que pueden llevar a cabo comparaciones de secuencia incluyen a, pero no como limitación, el paquete BLAST (véase Ausubel et al., 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4° Ed - Capítulo 18), FASTA (Altschul et al., 1990 J. Mol. Biol. 403-410) y la aplicación GENEWORKS de herramientas de comparación. Tanto BLAST como FASTA están disponibles para búsquedas fuera de línea y en línea (véase Ausubel et al., 1999, Short Protocols in Molecular Biology, páginas 7-58 a 7-60).

Sin embargo, para algunas aplicaciones, se prefiere usar el programa GCG Bestfit. Una nueva herramienta, llamada BLAST 2 Secuencias también está disponible para comparación de secuencias proteínas y de nucleótidos (véanse FEMS Microbiol Lett 1999174(2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177(1): 187-8 y tatiana@ncbi.nlm.nih.gov).

Aunque el % de identidad final puede medirse en términos de identidad, típicamente el propio proceso de alineamiento no se basa en una comparación de pares de todo o nada. En su lugar, generalmente se usa una matriz de calificación de similitud llevada a escala, donde se le asignan puntos a cada comparación apareada sobre la base de la similitud química o de la distancia evolutiva. Un ejemplo de una matriz de esta índole de uso común es la matriz BLOSUM62 -la matriz predeterminada para el conjunto de programas BLAST. En los programas GCG Wisconsin generalmente se emplean los valores predeterminados públicos o una tabla de comparación de símbolos personalizada, de proveérsela (véase el manual del usuario para hallar detalles adicionales). Para algunas aplicaciones, se prefiere usar los valores por defecto públicos para el paquete GCG, o en el caso de otro programa, la matriz por defecto, tal como BLOSUM62.

Como alternativa, el porcentaje de identidades se puede calcular usando la característica de alineación múltiple en DNASIS™ (Hitachi Software), basado en un algoritmo, análogo a CLUSTAL (Higgins DG & Sharp PM (1988), Gene 73(1), 237-244).

En general, el porcentaje de identidad se calcula para al menos 50, preferiblemente al menos 100, preferiblemente al menos 200 bases o residuos contiguos. Preferiblemente, el porcentaje de identidad se calcula usando la secuencia de longitud completa.

Una vez que el software ha producido un alineamiento óptimo, es posible calcular el % de identidad de secuencia. Típicamente, el software realiza esto como parte de la comparación de secuencias y genera un resultado numérico.

Las secuencias también pueden contener supresiones, inserciones o sustituciones de residuos de aminoácidos que producen un cambio silencioso y que dan como resultado una sustancia funcionalmente equivalente. Se pueden efectuar sustituciones de aminoácidos deliberadas basado en las propiedades de los aminoácidos (tales como polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o la naturaleza anfipática de los residuos) y por ello son de utilidad para agrupar los aminoácidos en grupos funcionales. Los aminoácidos se pueden agrupar sobre la base de las propiedades de su cadena lateral solamente. Sin embargo, es más útil incluir también los datos de mutación. Los conjuntos de aminoácidos así derivados probablemente están conservados por razones estructurales. Estos conjuntos se pueden describir en la forma de un diagrama de Venn (Livingstone C.D. y Barton G.J. (1993) "Protein sequence alignments: a strategy for the hierarchical analysis of residue conservation" Comput. Appl Biosci., 9: 745-756)(Taylor W.R. (1986) "The classification of amino acid conservation" J. Theor. Biol. 119; 205-218). Las sustituciones conservadoras se pueden efectuar, por ejemplo, de acuerdo con la siguiente tabla en la cual se describe una agrupación de aminoácidos según un diagrama de Venn generalmente aceptado.

Las secuencias de nucleótidos para usar en la presente invención pueden incluir dentro de las mismas nucleótidos sintéticos o modificados. Hay varios tipos de modificaciones diferentes para los oligonucleótidos que son conocidas en la técnica. Incluyen esqueletos de metilfosfonato y de fosforotioato y/o la adición de cadenas de acridina o de polilisina en los extremos 3' y/o 5' de la molécula. A los efectos de la presente invención, ha de comprenderse que las secuencias de nucleótidos que se describen en la presente pueden ser modificadas mediante cualquier método disponible en la técnica. Dichas modificaciones pueden efectuarse con el fin de mejorar la actividad in vivo o la expectativa de vida de las secuencias de nucleótidos de la presente invención.

La presente descripción también abarca el uso de secuencias de nucleótidos que son complementarias de las secuencias que se describen en la presente, o cualquier derivado, fragmento o derivado de éstas. Si la secuencia es complementaria de un fragmento, luego la secuencia puede usarse como una sonda para identificar secuencias codificantes similares en otros organismos, etcétera.

Los polinucleótidos que no son 100% idénticos a las secuencias de la presente invención, pero que se encuentran dentro del alcance de la invención, pueden obtenerse de numerosas maneras. Es posible obtener otras variantes de las secuencias que se describen en la presente, por ejemplo, mediante análisis con sondas en bibliotecas de ADN obtenidas de un rango de individuos, por ejemplo, individuos de distintas poblaciones. Además, se pueden obtener otros homólogos y dichos homólogos fragmentos de los mismos en general serán capaces de hibridar selectivamente con las secuencias que se muestran en el listado de secuencias de la presente. Dichas secuencias pueden obtenerse por medio de análisis con sondas de bibliotecas de ADNc o de bibliotecas de ADN genómico de otras especies de animales, para luego realizar un análisis en dichas bibliotecas con sondas que comprendan la totalidad o una parte de cualquiera de las secuencias del listado de secuencias adjunto, bajo condiciones de severidad media a alta. Se aplican consideraciones similares para obtener especies homólogas y variantes alélicas de las secuencias de polipéptidos o de nucleótidos de la descripción.

Las variantes y las cepas/especies ortólogas también pueden obtenerse usando una PCR degenerada, donde se emplearán cebadores diseñados para buscar secuencias dentro de variantes y homólogos que codifiquen secuencias de aminoácidos conservadas dentro de las secuencias de la presente invención. Las secuencias conservadas pueden predecirse, por ejemplo, alineando las secuencias de aminoácidos a partir de diversas variantes/homólogos. Los alineamientos de secuencia pueden efectuarse usando un software informático conocido en la técnica. Por ejemplo, generalmente se usa el programa GCG Wisconsin PileUp.

Los cebadores usados en la PCR degenerada contendrán una o más posiciones degeneradas y se usarán bajo condiciones de menor severidad que las empleadas para la clonación de secuencias con cebadores de secuencias únicas contra secuencias conocidas.

Como alternativa, dichos polinucleótidos pueden obtenerse mediante la mutagénesis dirigida a sitios específicos de secuencias caracterizadas. Esto puede ser de utilidad cuando se necesitan, por ejemplo, cambios de secuencia de codones silenciosos, para optimizar las preferencias de codones para una célula huésped particular en la cual se estén expresando las secuencias de polinucleótidos. Puede ser deseable efectuar otros cambios de secuencia con el fin de introducir sitios de reconocimiento de enzimas de restricción, o para alterar la propiedad o la función de los polipéptidos codificados por los polinucleótidos. Los polinucleótidos (las secuencias de nucleótidos) de la invención pueden usarse para producir un cebador, por ejemplo, un cebador de PCR, un cebador para una reacción de amplificación alternativa, una sonda marcada, por ejemplo, con una marca que pueda ser revelada por medios convencionales, usando marcas radiactivas o no radiactivas, o los polinucleótidos pueden clonarse en vectores. Dichos cebadores, sondas y otros fragmentos tendrán al menos 15, preferiblemente al menos 20, por ejemplo, al menos 25, 30 o 40 nucleótidos de longitud, y también están comprendidos por el término polinucleótidos de la invención, como se lo usa en la presente.

Los polinucleótidos, tales como polinucleótidos y las sondas de ADN de acuerdo con la invención, pueden producirse de manera recombinante, sintética o empleando cualquier medio disponible para aquellos versados en la técnica. También pueden clonarse mediante técnicas convencionales.

En general, los cebadores se producirán con medios sintéticos que comprendan una elaboración por pasos de la secuencia de ácido nucleico deseada, de a un nucleótido por vez. Las técnicas para lograr esto usando procedimientos automáticos se encuentran fácilmente disponibles en el arte.

Los polinucleótidos más largos generalmente se producirán usando medios recombinantes, por ejemplo, usando técnicas de clonación por PCR (reacción en cadena de la polimerasa). Los cebadores pueden diseñarse para que contengan sitios de reconocimiento para enzimas de restricción apropiadas, de modo que el ADN amplificado pueda clonarse en un vector de clonación apropiado.

La presente descripción también abarca secuencias que son complementarias de las secuencias de ácidos nucleicos de la presente invención o secuencias que pueden hibridar con las secuencias de la presente invención o con secuencias que son complementarias de éstas.

El término “hibridación”, como se lo usa en la presente documentación, ha de incluir “el proceso en el cual una cadena de ácido nucleico se une con una cadena complementaria a través de apareamiento de bases”, así como el proceso de amplificación que se efectúa con la tecnología de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Preferiblemente, la hibridación se determina bajo condiciones severas (por ejemplo 50 oC y SSC 0,2x {SSC 1x = NaCl 0,15 M, citrato-Na30,015 M a pH 7,0}).

Convenientemente, la hibridación se puede determinar bajo condiciones de gran severidad (por ejemplo 65 oC y SSC 0,1x {SSC 1x = NaCl 0,15 M, citrato-Na30,015 M pH 7,0}).

La presente descripción también se relaciona con el uso de secuencias de nucleótidos que pueden hibridar con las secuencias de nucleótidos de la presente invención (incluyendo secuencias complementarias de las que se describen en la presente).

Un especialista comprenderá que el ortólogo modificado de GRF3 se puede obtener de cualquier planta. En una forma de realización preferida, el ortólogo de GRF3 se puede obtener, preferiblemente se obtiene, de una o más de las plantas seleccionadas del grupo que consiste de: Arabidopsis thaliana, Oryza sativa, Zea mays, Glycine max, Medicago truncatula, Populus trichocarpa, Prunus persica, Carica papaya, Triticum aestivum, Sorghum bicolor, Gossypium hirstutum, caña de azúcar (Saccharum spp.), Panicum virgatum, Helianthis annus, Beta vulgaris y especies de Brassica.

En una forma de realización aún más preferida, el ortólogo de GRF3 se puede obtener, preferiblemente se obtiene, de una o más de las plantas seleccionadas del grupo que consiste de: Arabidopsis thaliana, Oryza sativa, Zea mays, Glycine max, Medicago truncatula, Populus trichocarpa, Prunus persica, Carica papaya.

El ácido nucleico, vector o construcción de acuerdo con la presente invención se puede transformar en cualquier planta (huésped).

La planta, la célula vegetal o el tejido vegetal de acuerdo con la presente invención puede ser una planta monocotiledónea (monocot) o una planta dicotiledónea (dicot).

En una forma de realización, la planta, la célula vegetal o el tejido vegetal de acuerdo con la presente invención puede ser una dicot.

La planta monocot se puede seleccionar, por ejemplo, de las familias Arecaceae, Amaryllidaceae o Poaceae. Por ejemplo, la planta puede ser un cultivo de cereales, tales como trigo, arroz, cebada, maíz, avena, sorgo, centeno, cebolla, puerro, mijo, trigo sarraceno, césped, ryegrás italiano, pasto varilla, Miscanthus, pasto-caña de azúcar, hierba triguera, festuca, pasto Bermuda, bromo, brezal común, gramas cebolleras (por ejemplo, pastizales naturalmente mixtos, dáctilo, pasto centeno, pasto Timothy o altramuz) o especies de Festuca. Una planta dicot se puede seleccionar de las familias que incluyen, pero en un sentido no limitativo, Asteraceae, Brassicaceae (por ejemplo Brassica napus), Chenopodiaceae, Cucurbitaceae, Leguminosae (Caesalpiniaceae, Aesalpiniaceae Mimosaceae, Papilionaceae o Fabaceae), Malvaceae, Rosaceae o Solanaceae. Por ejemplo, la planta se puede seleccionar entre lechuga, girasol, Arabidopsis, espinaca, sandía, zapallito, colza oleaginosa (incluyendo canola), col, brócoli, col rizada, nabo, colinabo (sueco), tomate, papa, pimiento, tabaco, algodón, legumbres, remolacha, quimbombó, manzana, rosa, frutilla, alfalfa (lucerna), loto de los prados, haba, soja, guisantes, arveja, lenteja, maní, garbanzo, café, cacao, damascos, manzanas, peras, durazno, uvas o especies de cítricos.

También se incluyen cultivos para biocombustible y bioenergía, tales como caña de azúcar, colza/colza oleaginosa, linaza, jatrofa, palmera oleaginosa, copra y sauce, eucalipto, álamo, híbridos de álamo. También de Miscanthus o gimnospermas, tal como pino ponderosa. También se incluyen cultivos para ensilaje (por ejemplo, especies de pastos forrajeros o maíz forrajero), para pastoreo o forrajeros (pasturas, trébol, trébol híbrido, trébol rojo, trébol subterráneo, trébol blanco, pasto santo, alfalfa), fibras (por ejemplo, algodón, lino), materiales de construcción (por ejemplo, pino, roble), pulpas (por ejemplo, álamo), materia prima para la industria química (por ejemplo, colza oleaginosa rica en ácido erúcico, linaza), plantas gomeras y cultivos para fines recreativos (por ejemplo, céspedes para superficies deportivas y recreativas), ornamentales para jardines públicos y privados (por ejemplo, especies de Angelonia, Begonia, Catharanthus, Euforbia, Gazania, Impatiens, Nicotiana, Pelargonium, Petunia, Rosa, Verbena y Viola) y flores de cualquier planta para el Mercado de flores cortadas (tal como tulipanes, rosas, narcisos, lirios, estallion, gerbera, claveles, crisantemos, lirios azules, gladiolos, alstroemeria, tagetes, guisantes de olor, fresia, anemones, amapola).

Preferiblemente, la planta, la célula vegetal o el tejido vegetal, o planta huésped es una planta de cultivo. Una planta de cultivo se refiere a cualquier planta que se cultiva a escala comercial para consumo o uso de humanos o animales en usos distintos de alimenticias/forrajeras. Las plantas preferidas son maíz, mijo, trigo, trigo duro, arroz, colza oleaginosa (o canola), sorgo, caña de azúcar, soja, girasol, papa, tomate, cebada, centeno, avenas, arveja, haba, haba panosa, remolacha, palmera oleaginosa, cacahuete, maní, mandioca, alfalfa, trébol, copra, pasas de uva, café, algodón, lechuga, banana, brócoli u otras brassicas de verduras.

En una forma de realización, la planta, célula vegetal o tejido vegetal, o planta huésped, es Brassica, convenientemente Brassica olerácea (por ejemplo, brócoli u otras Brassicas de verduras).

La planta puede ser un árbol, tal como eucalipto, álamo o una conífera tales como especies de Picea (por ejemplo, abeto) o especies de Pinus (pinos), especies de árboles de madera dura, tal como teca, árboles de plantaciones tal como gomeras (Hevea), palmera (palmera datilera u oleaginosa) o jatrofa o huertos de árboles frutales (tales como ciruelos, duraznero, manzana y perales).

EJEMPLOS

Transgenes

Véase la Tabla 1 por un listado de los plásmidos binarios utilizados.

Tabla 1

Vector Constructo Cromosoma de Arabidopsis: comienzo-fina Objeto

^35S:miR39 Sobreexpresión del tallo-bucle de pJP123 9319 ₆ 5:13628907 - 1362 _bmiR396b

pRER31 GRF3 2:15274101 - 15270081 GRF3 genómico

CGC AAC CGT TCA AGA AAG CCT GTG GAA ACT CCA

pRER32 rGRF3 2:15274101 - 15270081 GRF3 genómico mutante

CGC AAC CGT TCT AGA AAA CCA GTA GAG ACT CCA

pRER35 rGRF2 4:17729683 - 17725302 GRF2 genómico mutante

CGT CAT CGT TCT AGA AAA CCG GTC GAA GTC CAA

pJD16 35S:GIF1 5:10647830 - 10649620 Sobreexpresión de AtGIF1

a Resaltado en negritas (amarillo), nucleótidos que se aparean con miR396. Subrayado, residuos mutagenizados. Resaltado en cursiva (rojo), codones corriente arriba y corriente abajo.

Análisis de la expresión

Primero, se trataron 0,5-1,0 pg de ARN total DNasa libre de RQ1 RNasa (Promega). A continuación, se realizó la síntesis de la primera cadena de ADNc usando la transcriptasa inversa SuperScript III (Invitrogen). Las reacciones de PCR se condujeron en un ciclador térmico Mastercycler ep realplex (Eppendorf) usando SYBR Green I (Roche) para monitorear la síntesis de ADN(cd) de cadena doble. La (q)PCR cuantitativa de cada gen se llevó a cabo para al menos tres réplicas biológicas, con duplicados técnicos para cada réplica biológica. El nivel relativo de transcriptos se determinó para cada muestra, normalizado para el nivel de ADNc de la PROTEÍNA FOSFATASA 2A (Czechowski et al., 2005). Las secuencias de los cebadores se muestran en la Tabla 2:

Tabla 2: IDs de los Locus relevantes y cebadores de oligonucleótidos usados en la RT-qPCR_______________ Gen ID del locus Cebador directo Cebador inverso

AtGRF3 AT2G36400 GTCTTCGCTGGCCACAAGTATT TGTTGCTGTTGTAGTGGTGGCT

AtGRF2 AT4G37740 CACAT CAACAGAGGCCGT CAT cg AACCGGAGATTCCTTGGGTTGTAAG AtGIF1 AT5G28640 TT GGACG AAAACAAAT CGTT GA CTGTTGCTGTTGAGTCGCTTGT

Análisis de ARN pequeño

Se extrajo ARN usando el reactivo TRIzol (Invitrogen). El ARN total se resolvió sobre geles de poliacrilamida bajo condiciones desnaturalizantes 17% (urea 7 M). Los transferidos se hibridaron usando sondas de oligonucleótidos de ácido nucleico cerrado (LNA) ya sea marcadas radioactivemente o marcadas en los extremos con digoxigenina diseñadas contra el miR396 (Exiqon, Dinamarca).

Como alternativa, los niveles de miR396 se determinaron por RT-qPCR de tallo-bucle, como se describió con anterioridad (Chen et al., 2005). Las secuencias de los oligonucleótidos utilizados fueron: oligo de retrotranscripción de tallo-bucle, 5GTCTCCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGGAGACMAGTTC3'; cebador directo de la PCR, 5GGCGGTTCCACAGCTTTCTT3'; y cebador inverso de la PCR, 5TGGTGCAGGGTCCGAGGTATT3'. Análisis de microordenamientos

Se extrajo ARN total de la parte aérea de plántulas cultivadas sobre placas por 10 días usando el mini conjunto de elementos para plantas RNeasy (QIAGEN). Se condujeron análisis de microordenamientos usando la plataforma Affymetrix ATH1 con dos réplicas biológicas como se describió con anterioridad (Schmid et al., 2005). Los genes diferencialmente expresados se identificaron usando la varianza por gen, calculada usando logit-T (Lemon et al., 2003). El cambio correspondiente de los transcriptos se obtuvo mediante estimados de expresión usando gcRMA (www.bioconductor.org), una modificación del algoritmo del análisis de múltiples ordenamientos robustos (RMA) (Irizarry et al., 2003). La expresión de los grupos de genes se evaluó mediante análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes GSEA-P 2.0 (Subramanian et al., 2007; Subramanian et al., 2005).

Observaciones bajo microscopio

El tejido se fijó en FAA y se embebió en parafina. Se tiñeron secciones de 10 pm de espesor con azul de toluidina.

Para obtener vistas paradérmicas de las células en empalizada, se fijaron hojas con FAA y se aclararon con solución de hidrato de cloral como se describió con anterioridad (Horiguchi et al., 2005). Las células en empalizada de las hojas se observaron usando microscopía de contraste de interferencia diferencial (DIC).

Hibridación in situ

Las sondas orientadas en el sentido del marco de lectura y antisentido marcadas con DIG se sintetizaron por transcripción con T7 o SP6 ARN polimerasa utilizando el conjunto de elementos para marcar ARN DIG (SP6/T7) (Roche) con los ADNc clonados de GRF2 e HISTONEH4 como templados. Para la sonda miR396, los oligonucleótidos LNA (Exiqon) se marcaron por sus extremos con el conjunto de elementos para marcar extremos 3' de oligonucleótidos DIG (Roche). Se disecaron ápices de brotes de plantas de 15 días cultivadas bajo fotoperíodos cortos y se fijaron en FAA. El material embebido en parafina se cortó hasta un espesor de 8 pm. La hibridación y detección se condujeron como se describió con anterioridad (Palatnik et al., 2003).

Ensayos GUS

Para visualizar la actividad de los informantes, se sometieron plantas transgénicas a tinción con GUS, de acuerdo con Donnelly et al. (Donnelly et al., 1999). El tejido teñido se embebió en parafina, se cortó en secciones y se montó en bálsamo de Canadá.

Números de acceso

En la Tabla 2 se provee un listado de los identificadores de los locus AGI relevantes. El número de acceso para los experimentos de microordenamientos es GSE11250.

Tabla 3: Expresión de GRF en plantas 35S:miR396b comparada con el tipo salvaje, estimada por el microordenamiento Affymetrix________________________________________________________________ Descripción Expresión relativa*

GRF1 0,81

GRF2 0,58

GRF3 0,73

GRF4 WA

GRF5 0,89

GRF6 A

GRF7 0,57

GRF8 A

GRF9 NP

*Cambio con relación al tipo salvaje, normalizado con gcRMA. Se muestra el promedio de dos réplicas biológicas para cada genotipo.

A, gen denominado 'ausente' por el software MAS 5.0 (Affymetrix); NP, ausente en los ordenamientos ATH1; WA, erróneamente anotado en los ordenamientos ATH1.

EJEMPLO N° 1

Una versión de miR396 resistente de GRF3 aumenta el tamaño y la acumulación de biomasa de las plantas

La familia de factores de transcripción GRF comprende nueve miembros en Arabidopsis (Kim et al., 2003). Siete de ellos, incluyendo GRF3, tienen un sitio blanco para miR396 (Jones-Rhoades y Bartel, 2004). Se ha demostrados que la pérdida-de-función de GRF o la sobreexpresión de miR396 reducen la cantidad de células en hojas de Arabidopsis (Horiguchi et al., 2005; Kim et al., 2003; Kim y Kende, 2004; Liu et al., 2009).

Para estudiar la importancia del miR396 en la restricción de la expresión de GRF3, se introdujeron dos fragmentos genómicos de GRF3 en plantas de Arabidopsis thaliana. Uno de ellos contenía el gen GRF3 de tipo salvaje (Figura 1, panel superior), en tanto el segundo comprendía una secuencia GRF3 modificada en la cual se había alterado el motivo dirigido al miARN por medio de mutaciones sinónimas que impiden el direccionamiento a miR396 (denominado rGRF3, Figura 1, panel del medio).

La secuencia del GRF3 de tipo salvaje contiene una región complementaria del miR396 con una gran energía de interacción (AG = -33,9 kcal/mol). Por el contrario, la secuencia de GRF3 modificada (rGRF3), que incluye cinco cambios con respecto a la secuencia de tipo salvaje (modificaciones A->U, G->A, U->A G->A y A->G) no tiene un sitio claro de interacción con miR396, ya que la energía de interacción se reduce de -33,9 kcal/mol a -14,4 kcal/mol. La secuencia completa de GRF3 se muestra con detalle en las Figuras 21 y 22. La secuencia completa de rGRF3 se muestra con detalle en la Figura 35. La secuencia completa y un mapa del vector binario usado (denominado RER32, véase la Tabla 1) se muestra en las Figuras 40 y 42, respectivamente.

Las plantas transgénicas de Arabidopsis que expresan rGRF3 tenían hojas y rosetas más grandes que el tipo salvaje o las plantas transgénicas que expresan la secuencia de GRF3 regulada por miR396 (Figuras 3, 5, 13 y 17). También acumulan más biomasa, a juzgar por los pesos fresco y seco de las hojas y las rosetas (Figura 6). En general, se observó que rGRF3 casi duplicaba el tamaño y el peso de la primera hoja con respecto a las plantas de tipo salvaje (Figura 3). El dominio FFD de rGRF3 aumentó la actividad de la proteína (Figura 54).

Las plantas que expresan rGRF3 también tenían un tallo más grueso con un mayor peso seco y velocidad de crecimiento que las plantas de tipo salvaje (Figura 12). Se observó que el diámetro de tallos aumentaba un 20% en las plantas rGRF3 con respecto al tipo salvaje (Figura 12).

Materiales y métodos

Se usó el acceso de Arabidopsis thaliana Columbia (Col-0) como tipo salvaje. Todos los transgénicos se encuentran en el antecedente Col-0. Las plantas se cultivaron con fotoperíodos largos (16 hs de luz/8 hs de oscuridad) o con fotoperíodos cortos (8 hs de luz/16 hs de oscuridad) a 23 °C. Véase la Tabla 1 por un listado de los plásmidos binarios generados y los detalles sobre la preparación de las plantas transgénicas. El motivo blanco del miARN en AtGRF3 se alteró introduciendo mutaciones sinónimas en un fragmento genómico clonado del AtGRF3 de tipo salvaje usando el conjunto de elementos para mutagénesis dirigida al sitio QuikChange® (Stratagene).

Todos los constructos se clonaron en el vector binario pCHF3 (Jarvis et al., 1998). Los constructos de ADN-T se introdujeron en la cepa ASE de Agrobacterium tumefaciens y se obtuvieron plantas transgénicas de Arabidopsis por inmersión floral.

El área foliar se midió tomando primero una fotografía de las hojas completamente expandidas desprendidas, y midiendo luego el área foliar con el software ImageJ de NIH.

Para determinar la acumulación de biomasa, se pesaron las rosetas completas u hojas individuales para medir el peso fresco. A continuación, el tejido se secó a 60°C durante 2 días y se midió el peso seco. Para determinar el crecimiento del tallo, se midió la elongación comenzando con tallos de 5 cm de longitud durante 10 días hasta alcanzar la extensión completa. La velocidad de elongación máxima se calculó a partir del gráfico de elongación. La acumulación de biomasa en los tallos se estimó por medición del peso seco de segmento de tallo de 10 cm de longitud completamente elongados. Finalmente se midió el diámetro de los tallos en la parte inferior del tallo, 0,5 cm por encima de la roseta.

El motivo FFD en AtGRF3 se alteró introduciendo mutaciones en un fragmento genómico clonado del AtGRF3 de tipo salvaje usando el conjunto de elementos para mutagénesis dirigida al sitio QuikChange® (Stratagene). La secuencia de ADNc nativa del rGRF3 “TTC TTT GAC GAT TGG” (SEQ ID NO: 113) que codifica FFDDW (SEQ ID NO: 114) se mutagenizó en “GCT GCT GAC GAT GCT” (SEQ ID NO: 115) que codifica AADDA (SEQ ID NO: 116), reemplazando todos los aminoácidos aromáticos por alaninas en el motivo FFD. Los genes wt (rGRF3 (FFD)) y mutagenizados (rGRF3(AAD)) se ubicaron bajo el promotor de AtGRF3.

Conclusiones

-Las plantas transgénicas de Arabidopsis transformadas con la versión resistente a miR396 de GRF3 (denominado rGRF3) muestra un aumento notable en el tamaño de la hoja y de acumulación de biomasa en comparación con las plantas de tipo salvaje o las plantas transgénicas que expresan una secuencia GRF3 con un sitio de unión a miR396. -E l rGRF3 también promueve el crecimiento de otros tejidos, tal como los tallos.

-E l dominio FFD aumenta la actividad de rGRF3.

EJEMPLO N° 2

La sobreexpresión de GIF1 mejora el efecto de rGRF3

La familia de factores de transcripción GRF comprende nueve miembros en Arabidopsis (Kim et al., 2003). Siete de ellos tienen un sitio blanco para el miR396 (Jones-Rhoades y Bartel, 2004). Se ha demostrado que las mutaciones en diferentes GRF o la sobreexpresión de miR396 reducen la cantidad de células en hojas de Arabidopsis (Horiguchi et al., 2005; Kim y Kende, 2004; Rodríguez et al., 2010). Los GRFs interactúan con los factores GRF-INTERACTING FACTORs (GlFs), una familia de genes pequeños compuestos por tres miembros (GIF1, GIF2 y GIF3) que codifica proteínas con homología con el co-activador de la transcripción SYT humana (Kim y Kende, 2004). La inactivación de GIF1, también conocida como ANGUSTIFOLIA 3 (AN3), produce hojas más estrechas como resultado de una reducción en la proliferación celular de manera similar a las plantas deficientes en GRF (Horiguchi et al., 2005).

Se prepararon plantas transgénicas que sobreexpresan GIF1 (Figuras 1 y 2) del promotor viral 35S (denominado 35S:GIF1). La secuencia completa y el mapa del vector binario utilizado (denominado JD16, véase la Tabla 1) se pueden encontrar en las Figuras 39 y 41, respectivamente. Estas plantas eran similares a las plantas de tipo salvaje. Posteriormente, se cruzó 35S.GIF1 con plantas que expresan rGRF3 (GRF3 insensible al miR396, descrito en el ejemplo N° 1). Las plantas resultantes que co-sobreexpresan rGRF3 y GIF1 (denominadas rGRF3 x 35S:GIF1) se analizaron con mayor detalle (Figuras 1 y 2).

Al analizar la productividad de biomasa de estas plantas se encontró que rGRF3 en combinación con sobreexpresión de GIF1 produce plantas con hojas más grandes y que acumulan más del doble de los pesos fresco y seco que las plantas de tipo salvaje (Figuras 3 y 13). El rendimiento de rGRF3 x GIF era mejor que el rGRF3 solo.

Materiales y métodos

Se usó el acceso de Arabidopsis thaliana Columbia (Col-0) como tipo salvaje. Todos los transgénicos se encuentran en el antecedente Col-0. Las plantas se cultivaron con fotoperíodos largos (16 hs de luz/8 hs de oscuridad) o con fotoperíodos cortos (8 hs de luz/16 hs de oscuridad) a 23 °C. Véase la Tabla 1 por un listado de los plásmidos binarios generados y por los detalles sobre la preparación de las plantas transgénicas. El motivo blanco del miARN en AtGRF3 se alteró introduciendo mutaciones sinónimas en un fragmento genómico clonado del AtGRF3 de tipo salvaje usando el conjunto de elementos para mutagénesis dirigida al sitio QuikChange® (Stratagene). Todos los constructos se clonaron en el vector binario pCHF3 (Jarvis et al., 1998). Los constructos de ADN-T se introdujeron en la cepa ASE de Agrobacterium tumefaciens y se obtuvieron plantas transgénicas de Arabidopsis por inmersión floral.

Para analizar la expresión por RT-PCR, se preparó ARN a partir de los ápices de plantas de 20 días cultivadas con fotoperíodos cortos, incluyendo un desarrollo de hojas menor que 3 mm. Se trataron 0,5 a 1,0 pg de ARN total con Dnasa libre de RQ1 RNasa (Promega). A continuación, se realizó la síntesis de la primera cadena de ADNc usando la transcriptasa inversa SuperScript III (Invitrogen). Las reacciones de PCR se condujeron en un ciclador térmico Mastercycler® ep realplex (Eppendorf) usando SYBRGreen I (Roche) para monitorear la síntesis de ADN(cd). La qPCR para cada gen se condujo en al menos 3 réplicas biológicas con duplicados técnicos para cada réplica biológica. El nivel relativo de transcriptos se determinó para cada muestra, normalizado para el nivel de ADNc de la PROTEÍNA FOSFATASA 2A (Czechowski et al., 2005).

Las mediciones del área foliar y de los pesos fresco y seco se efectuaron como en el Ejemplo N° 1.

Conclusiones

-Se puede mejorar el rendimiento en la productividad de plantas rGRF3 por co-sobreexpresión de GIF1.

EJEMPLO N° 3

Senescencia demorada de las hojas y mayor resistencia a la sequía de plantas rGRF3.

Según se muestra en el Ejemplo N° 1, las plantas rGRF3 producen hojas más grandes que las plantas de tipo salvaje, acumulando así más biomasa. Este efecto mejora con la co-sobreexpresión de rGRF3 y GIF1 (rGRF3 x 35S: GIF1) (véase el ejemplo N° 2 por detalles adicionales). Además, los inventores observaron que rGRF3 y rGRF3/35S:GIF1 permanecen verdes por un período de tiempo más prolongado que las plantas de tipo salvaje (Figura 4).

Para evaluar si hay una demora en la senescencia de las hojas en plantas transgénicas rGRF3 y rGRF3 x 35S:GIF1, se condujo un experimento de senescencia inducida por oscuridad. La incubación de hojas desprendidas en la oscuridad induce senescencia y este proceso pueden monitorearse por medición de una disminución en la eficiencia máxima de la fotoquímica del fotosistema II (PSII) (Fv/Fm) como se describió son anterioridad (Baker, 2008; Schommer et al., 2008). Para tal fin, se recolectó la quinta hoja del tipo salvaje, rGRF3, 35S.GIF1 y rGRF3 x 35S.GIF1 y se mantuvo en oscuridad, y se midió el valor de Fv/Fm todos los días. Según se detalla en la Figura 4, no hay diferencia entre las plantas de tipo salvaje y las plantas 35S.GIF1. Sin embargo, la senescencia en las hojas rGRF3 comienza 2 días después de las hojas de tipo salvaje. Notablemente, las hojas que co-sobreexpresan niveles elevados de ambos rGRF3 y GIF1 mostraron una demora aún mayor en el decaimiento de Fv/Fm, lo cual indica que la sobreexpresión de GIF1 mejora aún más la demora de la senescencia de las plantas rGRF3.

Además, se evaluó el rendimiento del transgénico bajo deprivación de agua (Figura 14). Plantas 35S:miR396, de tipo salvaje, rGRF3, 35S.GIF1 y rGRF3 x 35S:GIF1 de 25 días fueron deprivadas de agua durante 2 semanas. A continuación, las plantas fueron irrigadas una vez por semana. Los sobreexpresores de MiR396, el tipo salvaje y 35S:GIF1 fueron severamente afectados en su crecimiento hacia el final de la deprivación de agua y después de la misma (Figura 14). Por el contrario, ambas líneas rGRF3 y rGRF3 x 35S:GIF1 se recuperaron y se desarrollaron bien después de la deprivación de agua (Figura 14).

Materiales y métodos

Para estudiar la senescencia de las hojas, se desprendieron las quintas hojas completamente expandidas y se guardaron en la oscuridad. La senescencia inducida por oscuridad fuero seguida por medición de la Eficiencia fotoqúimica máxima (Fv/Fm) del Fotosistema II, como se describió con anterioridad (Baker, 2008). En los ensayos de deprivación de agua, las plantas se cultivaron por fotoperíodos prolongados (16 horas de luz/8 horas de oscuridad) a 23°C. Cuando las plantas tenían 25 días, fueron deprivadas de agua durante dos semanas. Después de ello, las plantas fueron irrigadas una vez por semana. Las imágenes se tomaron cuando las plantas tenían 50 días.

Conclusiones

-Las plantas rGRF3 tienen una demora en la senescencia de las hojas. Este efecto mejora con la co-sobreexpresión de GIF1.

-Las plantas rGRF3 son más tolerantes a la deprivación de agua.

EJEMPLO N° 4

La expresión a partir de promotores específicos de tejidos mejora el rendimiento de rGRF3 en la productividad de las plantas

La familia de factores de transcripción GRF comprende nueve miembros en Arabidopsis (Kim et al., 2003). Siete de ellos, incluyendo GRF3, tienen un sitio blanco para miR396 (Jones-Rhoades y Bartel, 2004). MiR396 se expresa a niveles bajos en el meristema y en primordios de hojas, y luego se acumula de manera constante con el desarrollo de la hoja, conjuntamente con el retroceso de la proliferación celular (Rodríguez et al., 2010). Se muestra en los Ejemplos N° 1 y N° 2 que la anulación de la represión por miR396 de GRF3 en Arabidopsis genera plantas con un aumento significativo en la acumulación de la biomasa y una demora en la senescencia.

Para estudiar si es posible mejorar el rendimiento adicional de rGRF3, se expresó esta versión resistente a miR396 de GRF3 a partir de promotores específicos de tejidos. Se seleccionaron los promotores de AS1 (ASYMMETRIC LEAVES 1) y A N T (AINTEGUMENTA), que son conocidos por su expresión específica en las etapas proliferativas del desarrollo de las hojas (Figura 50).

Las plantas transgénicas de Arabidopsis transformadas con los vectores AS1:rGRF3 y ANT:rGRF3 tenían hojas más grandes que las plantas de tipo salvaje y aún que las plantas que expresan al rGRF3 a partir del promotor GRF3 nativo (Figuras 18 y 51). Estas plantas también tenían tallos más gruesos (Figura 19).

Notablemente, la expresión de los promotores rGRF3 de ANT y AS1 solamente tenía un efecto menor sobre la senescencia de las hojas, y menos que el observado en las plantas rGRF3 que se expresan a partir del promotor endógeno (Figuras 20 y 54).

La expresión de rGRF3 a partir de los promotores ANT y AS1 muestra una dominancia apical similar (Figura 52) a la de las plantas de tipo salvaje.

Materiales y métodos

Se usó el acceso de Arabidopsis thaliana Columbia (Col-0) como tipo salvaje. Todos los transgénicos se encuentran en el antecedente Col-0. Las plantas se cultivaron con fotoperíodos largos (16 hs de luz/8 hs de oscuridad) o con fotoperíodos cortos (8 hs de luz/16 hs de oscuridad) a 23 °C. Véase la Tabla 1 por un listado de los plásmidos binarios generados y por los detalles sobre la preparación de las plantas transgénicas. El motivo blanco del miARN en AtGRF3 se alteró introduciendo mutaciones sinónimas en un fragmento genómico clonado del AtGRF3 de tipo salvaje usando el conjunto de elementos para mutagénesis dirigida al sitio QuikChange® (Stratagene).

El área foliar se midió tomando primero una fotografía de las hojas completamente expandidas desprendidas, y midiendo luego el área foliar con el software ImageJ de NIH. Finalmente se midió el diámetro de los tallos en la parte inferior del tallo, 0,5 cm por encima de la roseta.

El fenotipo de senescencia se analizó con experimentos de senescencia inducida por oscuridad en hojas N° 5 completamente expandidas. Las imágenes se tomaron justo después que las hojas completamente expandidas se desprendieron de la roseta (Día 1) y después de incubarlas durante 6 días en la oscuridad (Día 6). La degradación de la clorofila es un indicador de senescencia (Schommer et al., 2008).

Conclusiones

-La expresión de rGRF3 a partir de promotores específicos de tejidos puede mejorar su rendimiento en cuanto a la productividad de las plantas.

-La expresión de rGRF3 a partir de promotores específicos de tejidos puede desacoplar las diferentes funciones de GRF3, tal como el control del tamaño de la hoja y la senescencia.

EJEMPLO N° 5

rGRF3 supera a rGRF2 en aumentar el tamaño de la planta y la acumulación de biomasa

Como se mostró con anterioridad, los niveles elevados de miR396 reducen las hojas considerablemente (Rodríguez et al., 2010). Por otro lado, las plantas que expresan una versión resistente a miR396 de GRF2 (rGRF2) acumula niveles elevados de GRF2 que causan una ligera disminución en el tamaño de la hoja (Rodríguez et al., 2010). Se ha demostrado en los Ejemplos N° 1 y N° 2 que las plantas rGRF3 también acumulan más biomasa que las plantas de tipo salvaje. En este ejemplo se muestra que rGRF3 supera significativamente a rGRF2 en aumentar el tamaño de la planta y la acumulación de biomasa.

Para comparar la acumulación de biomasa en las líneas rGRF2 y rGRF3, los autores midieron los pesos fresco y seco de rosetas de 40 días de plantas 35S:miR396, de tipo salvaje, rGRF2 y rGRF3 (Figura 6). Las plantas con niveles elevados de miR396 presentaban una reducción en la biomasa de las plantas del 25%. Las plantas rGRF2 solamente tienen un aumento menor en la acumulación de la biomasa que no era estadísticamente significativo (Figura 6). Las rosetas rGRF3 acumularon un 40% más de biomasa en comparación con las plantas de tipo salvaje, que es estadísticamente significativo (Figura 6).

Se observó otra diferencia notable entre las plantas rGRF2 y rGRF3 cuando que comparaban en cuanto a la morfología de las hojas. Las hojas de las plantas rGRF2 tienen una forma de “enrollamiento” descendente, en tanto las hojas de las plantas rGRF3 son más grandes que las hojas de tipo salvaje sin cambios importantes en la morfología de las hojas (Figura 10). De esta manera, rGRF3 produjo plantas con hojas más grandes sin afectar la morfología de las hojas.

Para analizar la correlación entre la acumulación de biomasa y los niveles de GRF en plantas rGRF2 y plantas rGRF3, se seleccionó una línea independiente de cada línea transgénica rGRF. A continuación, se midieron los niveles de ARNm de GRF2 y GRF3 por RT-PCR y también el peso seco de rosetas de rGRF2 y plantas rGRF3 de 1 mes. Se observó que un incremento de 25 veces en los niveles de ARNm de GRF2 en las plantas rGRF2 produjo un incremento de biomasa de tan solo un 30% (Figura 11). Por el contrario, un incremento de tan solo 2,5 veces en los niveles de ARNm de GRF3 en plantas rGRF3 dio como resultado casi el doble de acumulación de biomasa en comparación con el tipo salvaje Col-0 (Figura 11).

Como una comparación adicional, se comparó el efecto de la expresión de rGRF2 o rGRF3 con el tipo salvaje (Figura 55). El área foliar en las plantas que expresan rGRF3 era casi el doble que el área del tipo salvaje y estaba aumentado en comparación con rGRF2 (Figura 55). Cuando rGRF2 se ubicaba bajo el control del promotor GRF3 el aumento en el área foliar no era tan significativo como en las plantas que expresan rGRF3, demostrando que la actividad diferencial de rGRF3 y rGRF2 es causada por sus diferentes secuencias primarias y no por la fuerza del promotor y/o los niveles de expresión (Figura 55).

Materiales y métodos

Se usó el acceso de Arabidopsis thaliana Columbia (Col-0) como tipo salvaje. Todos los transgénicos se encuentran en el antecedente Col-0. Las plantas se cultivaron con fotoperíodos largos (16 hs de luz/8 hs de oscuridad) o con fotoperíodos cortos (8 hs de luz/16 hs de oscuridad) a 23 °C. Véase la Tabla 1 por un listado de los plásmidos binarios generados y por los detalles sobre la preparación de las plantas transgénicas. El motivo blanco del miARN en AtGRF3 o AtGRF2 se alteró introduciendo mutaciones sinónimas en un fragmento genómico clonado del AtGRF3 de tipo salvaje usando el conjunto de elementos para mutagénesis dirigida al sitio QuikChange® (Stratagene).

Para determinar la acumulación de biomasa, se pesaron las rosetas completas para medir el peso fresco. A continuación, el tejido se secó a 60°C durante 2 días y se midió el peso seco.

Para analizar la expresión por RT-PCR, se preparó ARN a partir de los ápices de plantas de 20 días cultivadas con fotoperíodos cortos, incluyendo un desarrollo de hojas menor que 3 mm. Se trataron 0,5 a 1,0 pg de ARN total con Dnasa libre de RQ1 RNasa (Promega).

A continuación, se realizó la síntesis de la primera cadena de ADNc usando la transcriptasa inversa SuperScript III (Invitrogen). Las reacciones de PCR se condujeron en un ciclador térmico Mastercycler® ep realplex (Eppendorf) usando SYBRGreen I (Roche) para monitorear la síntesis de ADN(cd). La qPCR para cada gen se condujo en al menos 3 réplicas biológicas con duplicados técnicos para cada réplica biológica. El nivel relativo de transcriptos se determinó para cada muestra, normalizado para el nivel de ADNc de la PROTEÍNA FOSFATASA 2A (Czechowski et al., 2005).

Conclusiones

- Se requieren niveles elevados de rGRF2 para aumentar ligeramente la biomasa de las plantas (por ejemplo, 25 veces más GRF2 causó un aumento del 30% de la biomasa).

- Los aumentos moderados de la expresión de GRF3 en plantas rGRF3 causaron un gran aumento en la acumulación de la biomasa (por ejemplo, 2,5 veces más GRF3 causó un aumento del 85% de la biomasa).

- Los niveles elevados de rGRF2 afectan el desarrollo de las hojas.

- La expresión de rGRF3 en plantas conduce a un aumento de 2 veces aproximadamente en el área foliar en comparación con el tipo salvaje

- El mayor área foliar de rGRF3 en comparación con rGRF2 depende de la secuencia primaria de los genes y no es el resultado de la fuerza del promotor.

EJEMPLO N° 6

Se encontraron homólogos de GRF3 y GIF1 de Arabidopsis en plantas de cultivo: la familia GRF en Arabidopsis thaliana y en otras especies de plantas

La familia de factores de la transcripción GROWTH-REGULATING FACTOR (GRF) es una familia de proteínas específica de plantas definida por la presencia de dos motivos de proteínas altamente conservadas, QLQ y WRC (Kim et al., 2003). El dominio QLQ está involucrado en las interacciones proteína-proteína con las proteínas GRF-INTERACTING FACTORS, y el dominio WRC contiene una señal de localización nuclear funcional y un motivo de unión a ADN que consiste de tres cisteínas y una histidina conservadas (Kim y Kende, 2004). La familia GRF de factores de transcripción comprende nueve miembros en Arabidopsis (Kim et al., 2003) (Figuras 21 y 22), 12 en Oryza sativa (Choi et al., 2004) (Figuras 23 y 24) y 14 en Zea mays (Zhang et al., 2008) (Figuras 25 y 26). Además, los g Rfs se encuentran en muchas otras especies vegetales (Zhang et al., 2011) (Véase los ejemplos seleccionados de Glycine max, Medicago truncatula, Prunus persica, Carica papaya y Populus trichocarpa en las Figuras 27 a 34).

Hay al menos dos regiones conservadas adicionales en las secuencias de codificación de GRF. Primero, a nivel de nucleótidos, solamente un subgrupo de los GRFs de cada especie contiene un sitio blanco de miR396. Por ejemplo, solamente 7 de los nueve GRFs hallados en Arabidopsis son blancos de miR396 (Figuras 7 y 8) (Jones-Rhoades y Bartel, 2004).

Segundo, solamente un subgrupo de los GRFs de cada especie contiene al motivo conservado FFD (Figura 8). Por ejemplo, en Arabidopsis solamente GRF3 y GRF4 tienen al motivo FFD. Aún más, los GRFs que contienen al motivo de direccionamiento a miR396 y el motivo FFD, y con gran homología para el GRF3 de Arabidopsis se puede encontrar en arroz, maíz y muchas otras especies vegetales (Figuras 7, 8, 22, 24, 2631-34, 38).

Patrones de expresión de GRFs en Arabidopsis thaliana y Zea mays

El patrón de expresión de GRF3 se analizó por RT-qPCR en hojas en desarrollo (Figura 15, izquierda). Se recolectó las quintas hojas de roseta a intervalos de tres días, comenzando el día que se volvieron visibles (~1 mm) a simple vista, que era 16 días después de la siembra (DAS). A continuación, se determinó el nivel de GRF3 por RT-qPCR. Se observó que este factor de transcripción se expresaba durante las etapas tempranas del desarrollo de las hojas (Figura 15, izquierda). Un atlas de expresión del desarrollo de Arabidopsis (Schmid et al., 2005) indica que genes específicos de la mitosis se expresan en tejidos en proliferación (Figura 15, derecha). Consistente con el rol de los GRFs como reguladores positivos de la proliferación celular durante el crecimiento de órganos, su perfil de expresión es muy similar al de los genes específicos de la mitosis (indicado para GRF3 en la Figura 15, derecha).

Para confirmar la equivalencia funcional entre los GRFs de Arabidopsis y Zea mays se analizaron sus patrones de expresión durante el desarrollo de las hojas de maíz usando el buscador Maize eFP (Li et al., 2010; Winter et al., 2007). Como se observa en la Figura 16, los GRFs de maíz, de la misma manera que los GRFs de Arabidopsis, se coexpresan con genes específicos de la mitosis.

Factores de interacción con grf [grf-interacting factors] en plantas de Arabidopsis y de cultivo

Según se describió en el ejemplo N° 2, es posible mejorar mucho el rendimiento de rGRF3 en la productividad de las planta por co-sobreexpresión del GRF-INTERACTING FACTOR 1. Este gen pertenece a una familia de genes pequeños compuesta por tres miembros (GIF1, GIF2 y GIF3) en Arabidopsis. Además, se pueden encontrar fácilmente homólogos de GIF1 en otras especies vegetales, tal como arroz (Figura 9). Los tres GIFs en Arabidopsis son altamente redundantes, ya que los mutantes en GIF1 pueden ser complementados por la sobreexpresión de GIF2 o GIF3 (Figura 43) (Lee et al., 2009). Estos resultados sugieren que la mejora del fenotipo de rGRF3 por sobreexpresión de GIF1 también se logra por co-sobreexpresión de GIF2 y GIF3.

Materiales y métodos

Se preparó ARN a partir de los ápices de plantas de 20 días cultivadas con fotoperíodos cortos, incluyendo un desarrollo de hojas menor que 3 mm. Se trataron 0,5 a 1,0 pg de ARN total con Dnasa libre de RQ1 RNasa (Promega). A continuación, se realizó la síntesis de la primera cadena de ADNc usando la transcriptasa inversa SuperScript III (Invitrogen). Las reacciones de PCR se condujeron en un ciclador térmico Mastercycler® ep realplex (Eppendorf) usando SYBRGreen I (Roche) para monitorear la síntesis de ADN(cd). La qPCR para cada gen se condujo en al menos 3 réplicas biológicas con duplicados técnicos para cada réplica biológica. El nivel relativo de transcriptos se determinó para cada muestra, normalizado para el nivel de ADNc de la PROTEÍNA FOSFATASA 2A. Las secuencias de los cebadores se muestran en la Tabla 2.

Las secuencias de los GRFs de Arabidopsis thaliana, Oryza sativa y Zea maize se obtuvieron de Genebank usando los números de acceso provistos en la literatura (Choi et al., 2004; Kim et al., 2003; Zhang et al., 2008). Se condujeron alineamientos de secuencias apareadas y se efectuaron los cálculos de porcentaje de identidad y de similitud con NEEDLE usando el algoritmo de alineamiento de Needleman-Wunche (Rice et al., 2000). Se efectuaron múltiples alineamientos de secuencia de las secuencias proteicas usando MCOFFE (Moretti et al., 2007). Se empleó el paquete FYLIP, versión 3.67 (Felsenstein, 1989), para obtener 100 réplicas Bootstrap de un árbol de unión de vecinos (NJ) basado en una matriz de distancia JTT. Los árboles se visualizaron usando TreeView 1.6.6. (Page, 1996).

Conclusiones

- Los GRFs en general y los homólogos (ortólogos) de GRF3 en particular existen en muchas especies vegetales.

- Los GIFs también existen en muchas especies vegetales.

- De acuerdo con su función como un regulador positivo de la proliferación celular, el GRF3 se co-expresa con genes de la mitosis durante el desarrollo de las hojas en Arabidopsis. Según lo esperado para genes equivalentes funcionales, la expresión de los GRFs de Zea mays también se co-expresan con genes de la mitosis durante el desarrollo de las hojas.

- La mejora del fenotipo rGRF3 por sobreexpresión de GIF1 también podría lograrse con los homólogos (ortólogos) de plantas de Arabidopsis y de cultivo.

EJEMPLO N° 7

Introducción de rGRF3 y rGRF3+GIF en Brassica oleracea

Materiales y métodos

Material vegetal

En este estudio, se usó un genotipo doble haploide genéticamente uniforme de Brassica oleracea, DH 1012 (Sparrow et al., 2004). Este genotipo deriva de una cruza entre B. oleracea alboglabra (A12) de ciclado rápido y B. oleracea italica Green Duke (GD33).

Cepas bacterianas

Se condujeron transformaciones usando la cepa AGL1 de Agrobacterium tumefaciens que contiene a los plásmidos apropiados pBRACT114 rGRF3 y pBRACT114 rGRF3:GIF1 y (véase la Figura 44) que contienen al gen del marcador seleccionable de la neomicina fosfotransferasa (nptII) dirigido por el promotor 35S y uno o más genes de interés (es decir, rGRF3 dirigido por su propio promotor; o el constructo combinada que contenía un rGRF3 dirigido por su propio promotor, y además un GIF dirigido por el promotor 35S, respectivamente).

A continuación se describirá el procedimiento de clonación usado para obtener el vector de transformación pBRACT114-rGRF3 GIF1. El pBRACT114-rGRF3 GIF1 contiene al gen rGRF3 dirigido por su promotor nativo y la región de codificación de GIF1 sobreexpresado por el promotor CaMV 35S.

Se condujo una digestión de ~1,7 pg de ADN de pGRF3:GRF3r DNA en un volumen de reacción total de 20 pl con PvulI (Invitrogen) en la solución amortiguadora apropiada a 37 °C durante 1 hora en un baño de agua. Se aisló un fragmento de 4950 bp que contiene al promotor nativo, la región de codificación, la 3'UTR y el terminador de de rGRF3 por extracción en gel.

El vector de transformación pBRACT114 de Brassica (www.bract.org) se basa en pGreen (Hellens et al., 2000) y es compatible con Gateway™ (Invitrogen). Se digirió aproximadamente 1 pg de pBract114 con la enzima de restricción StuI (Roche) en la solución amortiguadora apropiada durante 1 hora a 37 °C. El vector linealizado se desfosforiló por incubación a 37 °C durante una hora adicional con fosfatasa alcalina de camarón (SAP). La SAP se desnaturalizó por calentamiento a 65°C durante 15 minutos.

Se condujo una reacción de ligación durante la noche a 14 °C y que contenía al fragmento rGRF3 y el pBRACT114 lineal a una relación de 3:1, respectivamente. Se usaron cinco unidades de T4 ligasa (Invitrogen) en los 10 pl de la reacción de ligación de extremos romos. A 50 pl de células competentes ccdB de E. coli (Invitrogen) se agregaron 2 pl de la reacción de ligación y se transformaron por shock de calor. Las células se cultivaron en 250 pl de medio SOC durante 1 hora a 37 °C y se agitaron a 200 rpm. Se dispersaron 20 pl y 100 pl del cultivo sobre placas de medio LB sólido (Sambrook y Russel, 2001) que contienen a la selección apropiada y se incubaron durante la noche a 37 °C.

Las colonias de E. coli se examinaron por PCR directa de colonias para asegurar que contenían al pBRACT114 con el inserto en la orientación deseada. Se transfirieron doce colonias individuales positivas de la PCR a 10 ml de medio LB líquido que contienen a la selección apropiada y se incubaron a 37oC con agitación a 220 rpm durante la noche. El ADN plasmídico se aisló usando un conjunto de elementos mini-prep (Qiagen). La integridad del constructo conocida como pBRACT114-rGRF3 se confirmó por digestión con enzimas y secuenciación de los sitios de inserción.

En la fase dos del proceso de clonación para crear el pBRACT-rGRF3 GIF1 se usó el sistema Gateway™ (Invitrogen) para recombinar la región de codificación de GIF1 3' con respecto al promotor CaMV 35S. La región de codificación de GIF1 se amplificó por PCR usando la polimerasa Platinum™ de gran fidelidad (Invitrogen) y se clonó Topo T/A en el vector de entrada Gateway™, pCR8/GW/Topo® TA (Invitrogen). A 50 pl de células DH5-a químicamente competentes de E. coli (Invitrogen) se agregaron 2 pl de la reacción de Topo y se transformaron por shock de calor. Las células se cultivaron en 250 pl de medio SOC durante 1 hora a 37 °C y se agitaron a 200 rpm. Se dispersaron 20 pl y 100 pl del cultivo sobre placas de medio LB sólido (Sambrook y Russel, 2001) que contienen a la selección apropiada y se incubaron durante la noche a 37 °C.

Las colonias de E. coli se examinaron por PCR directa de colonias para asegurar que contenían al pCR8 con el amplicón GIF1 en la orientación deseada. Se transfirieron seis colonias individuales positivas de la PCR a 10 ml de medio LB líquido que contienen a la selección apropiada y se incubaron a 37oC con agitación a 220 rpm durante la noche. El a Dn plasmídico se aisló usando un conjunto de elementos para plásmidos mini-prep (Qiagen). El vector de entrada pCR8-GIF1 se comprobó mediante digestión enzimática. Se secuenció la región de codificación de GIF1 completa para asegurar su integridad.

Se condujo una reacción de recombinación Gateway™ LR para insertar la región de codificación GIF1 en el pBRACT114-rGRF3 entre los sitios gateway 3' del promotor CaMV 35S. La reacción de 10 pl de LR contenía ~ 100 ng del pBRACT114-rGRF3 35 ng del pCR8-GIF1 con 2 pl de mezcla de enzimas™ Gateway® LR Clonase™ II (Invitrogen) en solución amortiguadora TE. La reacción LR se incubó a temperatura ambiente durante la noche. Se aplicó un tratamiento con proteinasa K a 37 °C durante 10 minutos. A 50 pl de células DH5-a químicamente competentes de E. coli (Invitrogen) se agregó 1 pl de la reacción LR y se transformaron por shock de calor. Las células se cultivaron en 250 pl de medio SOC durante 1 hora a 37 °C y se agitaron a 200 rpm. Se dispersaron 20 pl y 100 pl del cultivo sobre placas de medio LB sólido (Sambrook y Russel, 2001) que contienen a la selección apropiada y se incubaron durante la noche a 37 °C.

Se transfirieron doce colonias individuales de la PCR a 10 ml de medio LB líquido que contienen a la selección apropiada y se incubaron a 37oC con agitación a 220 rpm durante la noche. El ADN plasmídico se aisló usando un conjunto de elementos mini-prep (Qiagen). La integridad del constructo conocida como pBRACT114-rGRF3 GIF1 se confirmó por digestión con enzimas y secuenciación de los sitios de inserción GIF1.

El plásmido pBRACT-rGRF3 GIF1 junto con su plásmido auxiliar pSoup (Hellens et al., 2000) se transformó en la cepa AGL1 de Agrobacterium tumefaciens por electroporación. El plásmido pGRF3:rGRF3 también se transformó por electroporación en A. tumefaciens. Brevemente, se agregaron 100 ng de ADN plasmídico a 40 pl de células electrocompetentes de A. tumefaciens en una cubeta para electroporación preenfriada con una separación de electrodos de 2 mm. La electroporación con las células se condujo en un equipo GenePulser (Biorad) con los siguientes ajustes 2,50 kV, 25 uFD y 400 Ohms. Inmediatamente se agregaron 300 pl de medio LB líquido para recuperar las células, que se cultivaron a temperatura ambiente, se agitaron at180 rpm durante 6 horas. Los cultivos de A. tumefaciens se dispersaron sobre medio LB sólido (Sambrook y Russel, 2001) que contiene la selección apropiada y se incubaron a 28oC durante 48 horas. Se seleccionaron colonias individuales y se usaron para inocular 10 ml de medio LB líquido que contiene a los antibióticos apropiados y se incubaron a 28oC, se agitaron a 200 rpm durante 48 horas. Se prepararon soluciones madre de glicerol e inóculos estándar y se guardaron a -80 oC. Los plásmidos se volvieron a comprobar, por digestión enzimática, antes de comenzar con los experimentos de transformación con Brassica.

Las células de A. tumefaciens se dispersaron sobre medio LB sólido (Sambrook y Russel, 2001) que contiene la selección apropiada y se incubaron a 28oC durante 48 horas. Se transfirió una sola colonia a 10 ml de medio LB líquido que contiene a la selección apropiada y luego se transfirió a un agitador a 28oC durante 48 horas. Se transfirió una alícuota de 50 pl de la suspensión bacteriana resultante a 10 ml de medio líquido MGL con la selección y se cultivó durante la noche en un agitador a 28oC. Los cultivos de la noche se centrifugaron a 3.000 rpm durante 5 minutos a R.T. antes de resuspenderlos en medio MS líquido. Se usaron las suspensiones de D.O.650 = 0,3 para las inoculaciones (las diluciones se efectuaron usando medio Ms líquido).

Transformación de plantas

Se esterilizó la superficie de las semillas en 100% de etanol durante 2 minutos, 15% de hipoclorito de sodio más 0,1% de Tween-20 durante 15 minutos y se lavaron tres veces durante 10 minutos en agua destilada estéril. Las semillas se hicieron germinar sobre MS de fuerza completa (Murashige y Skoog, 1962) base de sales para plantas, que contiene 3% de sacarosa y 0,8% de Phytagar (Difco) a pH 5,6. Antes de verterlo, se agregaron vitaminas esterilizados por filtración al medio; mio-inositol (100 mg/l), tiamina-HCl (10 mg/l), piridoxina (1 mg/l) y ácido nicotínico (1 mg/l). Las semillas se sembraron a una densidad de 15 semillas por 90 mm de caja de Petri y se transfirieron a un cuarto frío a 10oC durante la noche antes de transferirlas a un cuarto de cultivo a 23oC bajo un día de 16 horas de luz con iluminación de 70 pmol m-2 seg-1.

Sobre la base del protocolo de transformación desarrollado para Brassica napus (Moloney et al., 1989), y desarrollado luego por BRACT (www.bract.org), los pecíolos de cotiledones recortados de plántulas de 4 días se sumergieron en una suspensión de toda la noche de Agrobacterium. Los explantes se mantuvieron, a razón de 10 explantes por placa, sobre medio de co-cultivo (medio de germinación suplementado con 6-bencilaminopurina 2 mg/l); con los pecíolos embebidos y asegurando que las lamelas de los cotiledones estuvieran libres de medio. Los cultivos se mantuvieron en los cuartos de crecimiento a 23oC con 16 horas de extensión del día, bajo luz dispersa de 40 pmol m-2 seg-1 durante 72 horas. Después de 72 horas, los explantes fueron transferidos a medio de selección (medio de co-cultivo suplementado con timentina 160 mg/l (o un antibiótico apropiado para eliminar Agrobacterium) y kanamicina 15 mg/l como agente de selección. Los controles se establecieron sobre medio libre de kanamicina, como explantes que habían, y no habían, sido inoculados con Agrobacterium.

Aislamiento de brotes y regeneración de plantas

Se recortaron brotes verdes en regeneración y se transfirieron a medio Gamborg B5 (Gamborg et al., 1968), que contiene sacarosa 1%, Phytagar 0,8%, timentina 160 mg/l y kanamicina 50 mg/l. Cuando se aislaron múltiples brotes densos, se efectuó un subcultivo adicional después de la elongación de brotes para asegurar que se aislara un tallo principal reduciendo así la probabilidad de escapes y la frecuencia de plantas de múltiples tallos cuando eran transferidos a invernadero. Los brotes se mantuvieron sobre medio Gamborg B5 hasta el desarrollo de las raíces. Las plántulas fueron transferidas luego a macetas de turba estériles (Jiffy N° 7) para permitir el desarrollo adicional de raíces, antes de transferirlas al invernadero.

Mantenimiento de las plantas y producción de semillas

Las plantas transgénicas se mantuvieron en un invernadero de luz definida (fotoperíodo de 16 horas 18/12oC día/noche) y se autopolinizaron para generar las semillas T ¹. Las plantas se cubrieron con 'bolsas de pan' claras, perforadas (Cryovac (RU) Ltd) tan pronto como florecían para prevenir la polinización cruzada. El genotipo del antecedente DH1012 es un genotipo autocompatible y la agitación diaria de la 'bolsa de pan' se llevó a cabo para facilitar la polinización. Se dejó que las vainas se desarrollaran sobre la planta hasta que estuvieran completamente hinchadas y se cosecharon cuando las vainas se habían secado y vuelto marrones. Las vainas cosechadas fueron trilladas cuando estaban secas, y las semillas se guardaron en el centro de almacenamiento de semillas John Innes (+ 1,5 oC, 7-10 de humedad relativa).

Análisis molecular

Se usó tejido foliar de brotes transgénicos putativos (in vitro) para las extracciones iniciales de ADN para evaluar por PCR la presencia de los transgenes.

Análisis del número de copias por PCR multiplexado en tiempo real

El número de copias del transgén se midió usando ensayos de PCR multiplexado en tiempo real (TaqMan), realizado según 'iDNA genetics' (www.idnagenetics.com). El gen blanco nptlI se detectó usando una sonda desactivada Tamra, marcada con Fam y simultáneamente se detectó un gen de control positivo interno usando una sonda desactivada Tamra, marcada con Vic. Las reacciones se condujeron usando 5-20 ng de ADN genómico de cada muestra, en un volumen de reacción de 20 pl, evaluándose dos veces cada muestra. Se hallaron los umbrales de ciclo (Cts) para las señales Fam y Vic para cada tubo, y se calculó el promedio DeltaCt (CtFam - CtVIC) para cada muestra. Las muestras fueron calificadas por DeltaCt (donde un mayor valor de delta Ct se relaciona con muestras de una baja cantidad de copias, y un valor bajo de DeltaCt con números elevados de copias). Las muestras de plantas se clasificaron con respecto a las muestras de referencia (de número de copias conocido).

Investigaciones preliminares muestran un crecimiento mejorado y una productividad mejorada de las plantas en plantas de Brassica que comprende AtrGRF3 o AtrGRF3.GIF1. En la Figura 49 se muestran datos que comparan plantas de Brassica olerácea transformadas con el rGRF3 de Arabidopsis y plantas control (sin At rGRF3). La transformación de plantas de Brassica oleracea con At rGRF3 mejoró significativamente el crecimiento y la productividad de las plantas. Por ejemplo, en la floración el ancho del tallo a 10 cm por encima del nivel del suelo y el ancho máximo de los tallos en la floración eran ambos significativamente mayor en las plantas de Brassica oleracea transformadas con At rGRF3 en comparación con las plantas control. Estos resultados eran significativos usando ya sea la prueba t (p<0,01) o análisis de regresión (p = 0,008).

En la Figura 56 se muestran los datos para plantas de Brassica oleracea transformadas con el rGRF3 de Arabidopsis (rGRF3) y un control de regeneración (TC). El mayor ancho de tallo en la floración aumenta en rGRF3 cuando se compara con el control (Figura 56). En la figura también se muestra que el peso de 10 cm de tallo está aumentado en rGRF3 cuando se compara con el control (Figura 56).

Se midió el crecimiento radicular de las plantas de Brassica oleracea transgénicas que expresan el rGRF3 de Arabidopsis. Para ello, se cultivaron plantas de tipo salvaje y transgénicas en placas MS verticales. Se midió la longitud de las raíces en al menos 10 plantas para cada genotipo entre 4 y 7 días después de la siembra (Figura 57, izquierda). El índice de crecimiento radicular se estimó a partir de la pendiente de estas líneas (Figura 57, derecha).

Conclusiones

- Las plantas de Brassica oleracea transgénicas que expresan al rGRF3 y rGRF3:GIF1 de Arabidopsis muestran un mayor crecimiento y productividad de las plantas.

- Las plantas de Brassica oleracea transgénicas transformadas con la versión resistente a miR396 de GRF3 (denominada rGRF3) muestran un aumento notable en el crecimiento radicular.

EJEMPLO N° 8

En el Ejemplo N° 6, se describieron los GRFs de otras especies distintas de Arabidopsis. Para evaluar si estos GRFs se comportan de manera similar al rGRF3 de Arabidopsis, se introdujeron secuencias seleccionadas en Arabidopsis. Se seleccionaron los GRFs con la mayor homología para At-rGRF3 y que contienen un motivo FFD y un sitio blanco de miR396 de arroz (Figura 37) y de soja (Figura 36). El GRF3 de soja y arroz se desacopló del control por miR396 mediante introducción de mutaciones en el sitio de unión del miARN como se describió previamente para el GRF3 de Arabidopsis.

Se preparó un vector que expresa estas secuencias a partir del promotor de GRF3 de Arabidopsis y a continuación se obtuvieron plantas transgénicas de Arabidopsis. De manera similar a las plantas que expresan At-rGRF3, las plantas de Arabidopsis transgénicas que expresan Os-rGRF4 y Gm-rGRF tenían hojas más grandes que las plantas de tipo salvaje (Figura 46). Estas plantas transgénicas que expresan los ortólogos de rGRF3 de soja y arroz también presentaban una demora en la senescencia de las hojas (no se muestra).

Materiales y métodos

Se usó el acceso de Arabidopsis thaliana Columbia (Col-0) como control de tipo salvaje. Todos los transgénicos se encuentran en el antecedente Col-0. Las plantas se cultivaron con fotoperíodos largos (16 hs de luz/8 hs de oscuridad) o con fotoperíodos cortos (8 hs de luz/16 hs de oscuridad) a 23 °C. Véase la Tabla 1 por un listado de los plásmidos binarios generados y por los detalles sobre la preparación de las plantas transgénicas. El motivo de miARN blanco en OsGRF4 y Gm-GRF se alteró introduciendo mutaciones usando el conjunto de elementos para mutagénesis dirigida al sitio QuikChange® (Stratagene) como se describió previamente para el GRF3 de Arabidopsis. El motivo miR396 mutado en Os-GRF4 y Gm-GRF se muestra en las Figuras 37 y Figura 36, respectivamente.

El área foliar se midió tomando primero una fotografía de las hojas completamente expandidas desprendidas, y midiendo luego el área foliar con el software ImageJ de NIH (como se describe en el Ejemplo N° 1 y otros ejemplos precedentes).

Conclusiones

Los ortólogos de rGRF3 de especies distintas de especies Arabidopsis (por ejemplo, al menos de arroz y soja) también aumentan el tamaño de las plantas y la acumulación de biomasa.

Referencias

Aukerman M. J., Sakai H. (2003). Regulation of flowering time and floral organ identity by a microRNA and its APETALA2-like target genes. Plant Cell 15, 2730-2741

Ausubel FM, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA and Struhl K. (1998). Current protocols in molecular biology. John Wiley and Sons. Inc. publication.

Axtell M. J., Bartel D. P. (2005). Antiquity of microRNAs and their targets in land plants. Plant Cell 17, 1658-1673 Baker C. C., Sieber P., Wellmer F., Meyerowitz E. M. (2005). The early extra petals1 mutant uncovers a role for microRNA miR164c in regulating petal number in Arabidopsis. Curr. Biol. 15, 303-315

Baker, N.R. (2008). Chlorophyll fluorescence: a probe of photosynthesis in vivo. Annu Rev Plant Biol 59, 89-113. Bartel D. P., Chen C. Z. (2004). Micromanagers of gene expression: the potentially widespread influence of metazoan microRNAs. Nat. Rev. Genet. 5, 396-400

Cartolano M., Castillo R., Efremova N., Kuckenberg M., Zethof J., Gerats T., Schwarz-Sommer Z., Vandenbussche M. (2007). A conserved microRNA module exerts homeotic control over Petunia hybrida and Antirrhinum majus floral organ identity. Nat. Genet. 39, 901-905

Chen C., Ridzon D. A., Broomer A. J., Zhou Z., Lee D. H., Nguyen J. T., Barbisin M., Xu N. L., Mahuvakar V. R., Andersen M. R., et al. (2005). Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33, e179

Chen X. (2004). A microRNA as a translational repressor of APETALA2 in Arabidopsis flower development. Science 303, 2022-2025

Choi, D., Kim, J.H., and Kende, H. (2004). Whole genome analysis of the OsGRF gene family encoding plant-specific putative transcription activators in rice (Oryza sativa L.). Plant & cell physiology 45, 897-904.

Chuck G., Cigan A. M., Saeteurn K., Hake S. (2007). The heterochronic maize mutant Corngrass1 results from overexpression of a tandem microRNA. Nat. Genet. 39, 544-549

Czechowski T., Stitt M., Altmann T., Udvardi M. K., Scheible W. R. (2005). Genome-wide identification and testing of superior reference genes for transcript normalization in Arabidopsis. Plant Physiol. 139, 5-17

De Veylder L., Beeckman T., Beemster G. T., Krols L., Terras F., Landrieu I., van der Schueren E., Maes S., Naudts M., Inze D. (2001). Functional analysis of cyclin-dependent kinase inhibitors of Arabidopsis. Plant Cell 13, 1653-1668 Dinneny J. R., Yadegari R., Fischer R. L., Yanofsky M. F., Weigel D. (2004). The role of JAGGED in shaping lateral organs. Development 131, 1101-1110

Donnelly P. M., Bonetta D., Tsukaya H., Dengler R. E., Dengler N. G. (1999). Cell cycling and cell enlargement in developing leaves of Arabidopsis. Dev. Biol. 215, 407-419

Efroni I., Blum E., Goldshmidt A., Eshed Y. (2008). A protracted and dynamic maturation schedule underlies Arabidopsis leaf development. Plant Cell 20, 2293-2306

Felsenstein, J. (1989). Mathematics vs. Evolution: Mathematical Evolutionary Theory. Science (New York, NY 246, 941-942.

Ferjani A., Horiguchi G., Yano S., Tsukaya H. (2007). Analysis of leaf development in fugu mutants of Arabidopsis reveals three compensation modes that modulate cell expansion in determinate organs. Plant Physiol. 144, 988-999 Fujikura U., Horiguchi G., Ponce M. R., Micol J. L., Tsukaya H. (2009). Coordination of cell proliferation and cell expansion mediated by ribosome-related processes in the leaves of Arabidopsis thaliana. Plant J. 59, 499-508 Gamborg, OL., R. B. Miller and K. Ojima. 1968. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Experimental Cell Research. 50: 151-158.

Gaudin V., Lunness P. A., Fobert P. R., Towers M., Riou-Khamlichi C., Murray J. A., Coen E., Doonan J. H. (2000). The expression of D-cyclin genes defines distinct developmental zones in snapdragon apical meristems and is locally regulated by the Cycloidea gene. Plant Physiol. 122, 1137-1148

Ha C. M., Kim G. T., Kim B. C., Jun J. H., Soh M. S., Ueno Y., Machida Y., Tsukaya H., Nam H. G. (2003). The BLADE-ON-PETIOLE 1 gene controls leaf pattern formation through the modulation of meristematic activity in Arabidopsis. Development 130, 161-172

Haga N., Kato K., Murase M., Araki S., Kubo M., Demura T., Suzuki K., Muller I., Voss U., Jurgens G., et al. (2007). R1R2R3-Myb proteins positively regulate cytokinesis through activation of KNOLLE transcription in Arabidopsis thaliana. Development 134, 1101-1110

Hellens, R.P, Edwards E.A., Leyland, N.R., Bean, S. and Mullineaux P.M. (2000) "pGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation", Plant Mol. Bio. 42: 819-832.

Horiguchi G., Kim G. T., Tsukaya H. (2005). The transcription factor AtGRF5 and the transcription coactivator AN3 regulate cell proliferation in leaf primordia of Arabidopsis thaliana. Plant J. 43, 68-78

Horiguchi G., Ferjani A., Fujikura U., Tsukaya H. (2006). Coordination of cell proliferation and cell expansion in the control of leaf size in Arabidopsis thaliana. J. Plant Res. 119, 37-42

Hornstein E., Shomron N. (2006). Canalization of development by microRNAs. Nat. Genet. 38Suppl, S20-S24 Inze D., De Veylder L. (2006). Cell cycle regulation in plant development. Annu. Rev. Genet. 40, 77-105

Irizarry R. A., Bolstad B. M., Collin F., Cope L. M., Hobbs B., Speed T. P. (2003). Summaries of Affymetrix GeneChip probe level data. (Nucleic Acids Res. 31, e15

Jarvis, P., Chen, L.J., Li, H., Peto, C.A., Fankhauser, C., and Chory, J. (1998). An Arabidopsis mutant defective in the plastid general protein import apparatus. Science 282, 100-103.

Jones-Rhoades M. W., Bartel D. P. (2004). Computational identification of plant microRNAs and their targets, including a stress-induced miRNA. Mol. Cell 14, 787-799

Kim J. H., Kende H. (2004). A transcriptional coactivator, AtGIF1, is involved in regulating leaf growth and morphology in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 13374-13379

Kim J. H., Lee B. H. (2006). GROWTH-REGULATING FACTOR4 of Arabidopsis thaliana is required for development of leaves, cotyledons, and shoot apical meristem. J. Plant Biol. 49, 463-468

Kim J. H., Choi D., Kende H. (2003). The AtGRF family of putative transcription factors is involved in leaf and cotyledon growth in Arabidopsis. Plant J. 36, 94-104

Koyama T., Furutani M., Tasaka M., Ohme-Takagi M. (2007). TCP transcription factors control the morphology of shoot lateral organs via negative regulation of the expression of boundary-specific genes in Arabidopsis. Plant Cell 19, 473 484

Krizek B. A. (1999). Ectopic expression of AINTEGUMENTA in Arabidopsis plants results in increased growth of floral organs. Dev. Genet. 25, 224-236

Lee, B.H., Ko, J.H., Lee, S., Lee, Y., Pak, J.H., and Kim, J.H. (2009). The Arabidopsis GRF-INTERACTING FACTOR Gene Family Performs an Overlapping Function in Determining Organ Size as well as Multiple Developmental Properties. Plant physiology.

Lemon W. J., Liyanarachchi S., You M. (2003). A high performance test of differential gene expression for oligonucleotide arrays. Genome Biol. 4, R67

Li, P., Ponnala, L., Gandotra, N., Wang, L., Si, Y., Tausta, S.L., Kebrom, T.H., Provart, N., Patel, R., Myers, C.R., et al. (2010). The developmental dynamics of the maize leaf transcriptome. Nature genetics 42, 1060-1067.

Liu D., Song Y., Chen Z., Yu D. (2009). Ectopic expression of miR396 suppresses GRF target gene expression and alters leaf growth in Arabidopsis. Physiol. Plant 136, 223-236

Lukowitz W., Mayer U., Jurgens G. (1996). Cytokinesis in the Arabidopsis embryo involves the syntaxin-related KNOLLE gene product. Cell 84, 61-71

Masuda H. P., Cabral L. M., De Veylder L., Tanurdzic M., de Almeida Engler J., Geelen D., Inze D., Martienssen R. A., Ferreira P. C., Hemerly A. S. (2008). ABAP1 is a novel plant Armadillo BTB protein involved in DNA replication and transcription. EMBO J. 27, 2746-2756

Menges M., de Jager S. M., Gruissem W., Murray J. A. (2005). Global analysis of the core cell cycle regulators of Arabidopsis identifies novel genes, reveals multiple and highly specific profiles of expression and provides a coherent model for plant cell cycle control. Plant. J. 41, 546-566

Moloney, MM., J. M. Walker, and K. K. Sharma. 1989. High-efficiency transformation of Brassica napus using Agrobacterium vectors. Plant Cell Reports 8:238-242.

Moretti, S., Armougom, F., Wallace, I.M., Higgins, D.G., Jongeneel, C.V., and Notredame, C. (2007). The M-Coffee web server: a meta-method for computing multiple sequence alignments by combining alternative alignment methods. Nucleic acids research 35, W645-648.

Mizukami Y., Fischer R. L. (2000). Plant organ size control: AINTEGUMENTA regulates growth and cell numbers during organogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 942-947

Murashige, T., and F. Skoog. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays and tobacco tissue culture. Physiol Plant 15:437-497.

Nath U., Crawford B. C., Carpenter R., Coen E. (2003). Genetic control of surface curvature. Science 299, 1404-1407

Nikovics K., Blein T., Peaucelle A., Ishida T., Morin H., Aida M., Laufs P. (2006). The balance between the MIR164A and CUC2 genes controls leaf margin serration in Arabidopsis. Plant Cell 18, 2929-2945

Ohno C. K., Reddy G. V., Heisler M. G., Meyerowitz E. M. (2004). The Arabidopsis JAGGED gene encodes a zinc finger protein that promotes leaf tissue development. Development 131, 1111-1122

Ori N., Cohen A. R., Etzioni A., Brand A., Yanai O., Shleizer S., Menda N., Amsellem Z., Efroni I., Pekker I., et al. (2007). Regulation of LANCEOLATE by miR319 is required for compound-leaf development in tomato. Nat. Genet. 39, 787-791

Page, R.D. (1996). TreeView: an application to display phylogenetic trees on personal computers. Comput Appl Biosci 12, 357-358.

Palatnik J. F., Allen E., Wu X., Schommer C., Schwab R., Carrington J. C., Weigel D. (2003). Control of leaf morphogenesis by microRNAs. Nature 425, 257-263

Palatnik J. F., Wollmann H., Schommer C., Schwab R., Boisbouvier J., Rodríguez R., Warthmann N., Allen E., Dezulian T., Huson D., et al. (2007). Sequence and expression differences underlie functional specialization of Arabidopsis microRNAs miR159 and miR319. Dev. Cell 13, 115-125

Piazza P., Jasinski S., Tsiantis M. (2005). Evolution of leaf developmental mechanisms. New Phytol. 167, 693-710

Rice, P., Longden, I., and Bleasby, A. (2000). EMBOSS: the European Molecular Biology Open Software Suite. Trends Genet 16, 276-277.

Rodríguez, R., Mecchia, M., Debernardi, J., Schommer, C., Weigel, D., and Palatnik, J. (2010). Control of cell proliferation in Arabidopsis thaliana by microRNA miR396, Development 137, 103-112

Sambrook J and Russell DW (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Third Edition. Cold Spring Harbour Laboratory Press

Schmid M., Davison T. S., Henz S. R., Pape U. J., Demar M., Vingron M., Scholkopf B., Weigel D., Lohmann J. U. (2005). A gene expression map of Arabidopsis thaliana development. Nat. Genet. 37, 501-506

Schommer C., Palatnik J. F., Aggarwal P., Chetelat A., Cubas P., Farmer E. E., Nath U., Weigel D. (2008). Control of jasmonate biosynthesis and senescence by miR319 targets. PLoS Biol. 6, e230

Schwab R., Palatnik J. F., Riester M., Schommer C., Schmid M., Weigel D. (2005). Specific effects of microRNAs on the plant transcriptome. Dev. Cell 8, 517-527

Sparrow PAC, Dale PJ and Irwin JA (2004). The use of phenotypic markers to identify Brassica oleracea genotypes for routine high-throughput Agrobacterium-mediated transformation. Plant Cell Reports. 23:64-70

Subramanian A., Tamayo P., Mootha V. K., Mukherjee S., Ebert B. L., Gillette M. A., Paulovich A., Pomeroy S. L., Golub T. R., Lander E. S., et al. (2005). Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 15545-15550

Subramanian A., Kuehn H., Gould J., Tamayo P., Mesirov J. P. (2007). GSEA-P: a desktop application for Gene Set Enrichment Analysis. Bioinformatics 23, 3251-3253

Tsukaya H. (2005). Leaf shape: genetic controls and environmental factors. Int. J. Dev. Biol. 49, 547-555

Tsukaya H. (2006). Mechanism of leaf-shape determination. Annu. Rev. Plant Biol. 57, 477-496

Wang J. W., Schwab R., Czech B., Mica E., Weigel D. (2008). Dual effects of miR156-tTargeted SPL genes and CYP78A5/KLUH on plastochron length and organ size in Arabidopsis thaliana. Plant Cell. 5, 1231-1243

White D. W. (2006). PEAPOD regulates lamina size and curvature in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103, 13238-13243

Wu G., Poethig R. S. (2006). Temporal regulation of shoot development in Arabidopsis thaliana by miR156 and its target SPL3. Development 133, 3539-3547

Winter, D., Vinegar, B., Nahal, H., Ammar, R., Wilson, G.V., and Provart, N.J. (2007). An "Electronic Fluorescent Pictograph" browser for exploring and analyzing large-scale biological data sets. PloS one 2, e718.

Zhang, D.-F., Li, B., Jia, G.-Q., Zhang, T.-F., Dai, J.-R., Li, J.-S., and Wang, S.-C. (2008). Isolation and characterization of genes encoding GRF transcription factors and GIF transcriptional coactivators in Maize (Zea mays L.). Plant Science 175, 809-817.

Zhang, H., Jin, J., Tang, L., Zhao, Y., Gu, X., Gao, G., and Luo, J. (2011). PlantTFDB 2.0: update and improvement of the comprehensive plant transcription factor database. Nucleic acids research 39, D1114-1117.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para producir una planta, que comprende transformar la planta con un ácido nucleico que codifica el factor de regulación del crecimiento 3 (GRF3) de Arabidopsis thaliana, en donde dicho GRF comprende un motivo FFD, en donde dicho ácido nucleico comprende un sitio blanco de miR396 mutado que desacopla dicho ácido nucleico del control por miR396 que comprende la secuencia: CGTTCtAGAAAaCCaGTaGAg (SEQ ID NO: 38), en donde las minúsculas indican las bases modificadas.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos mostrada como SEQ ID NO. 2 (AtGRF3) y la secuencia de nucleótidos comprende una modificación en el sitio blanco de miR396 para desacoplar el ácido nucleico del control por miR396.

3. El método de acuerdo con las reivindicaciones 1-2, en donde el ácido nucleico comprende una secuencia de ácidos nucleótidos mostrada como SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO.

8, SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 13, SEQ ID NO. 14, SEQ ID NO. 15, SEQ ID NO. 16, SEQ ID NO. 17, SEQ ID NO. 18, SEQ ID NO. 19 o SEQ ID NO. 88; y la secuencia de nucleótidos comprende una modificación en el sitio blanco de miR396 para desacoplar el ácido nucleico del control por miR396.

4. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la planta sobreexpresa al menos un gen GIF.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el al menos un gen GIF se selecciona del grupo que consiste en GIF1, AtGIF 2, AtGIF 3, Os11g40100, Os12g31350, Os03g52320 y sus combinaciones.

6. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el ácido nucleico está ligado operativamente a un promotor y un terminador.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el promotor es un promotor específico de tejidos.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el promotor comprende un promotor ASYMMETRIC LEAVES 1 (AS-1) o un promotor AINTEGUMENTA (ANT).

9. Una planta transgénica, célula de planta o tejido de planta que comprende un ácido nucleico mutado como se define de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8.