ES2851389T3 - Método para preparar un aditivo alimentario - Google Patents

Abstract

Un método para preparar una composición de aditivo alimentario que comprende: a. pretratar física y/o química y/o biológicamente una biomasa lignocelulósica; y b. tratar la biomasa lignocelulósica pretratada física y/o química y/o biológicamente con al menos una enzima predigestiva; y c. mezclar dicha biomasa lignocelulósica pretratada y tratada adicionalmente con al menos una enzima predigestiva de la etapa b. con al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento; d. y opcionalmente envasarla; en donde la al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento: i) es funcional, o principalmente funcional, en el tracto gastrointestinal del animal de tal modo que, antes de entrar en el tracto gastrointestinal, el nivel de actividad enzimática definido como la cantidad de solubilización de material de biomasa con respecto a oligosacáridos y monosacáridos es menor que un 20% del nivel de actividad enzimática después de entrar en el tracto gastrointestinal; y/o ii) se mezcla con la biomasa lignocelulósica pretratada de la etapa b. cuando la biomasa lignocelulósica pretratada de la etapa b., la enzima en alimento o ambas están en un estado seco o sustancialmente seco, de tal modo que la biomasa lignocelulósica pretratada de la etapa b., la enzima en alimento o ambas comprenden menos de un 15% en peso de contenido de agua; y/o iii) se encapsula antes de mezclarla con la biomasa lignocelulósica pretratada de la etapa b.; y/o iv) se mezcla con la biomasa lignocelulósica pretratada de la etapa b. inmediatamente antes de alimentar a un animal con la composición de aditivo alimentario.

Description

DESCRIPCIÓN

Método para preparar un aditivo alimentario

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos y composiciones para mejorar el valor nutricional de la biomasa lignocelulósica en un alimento para animales (en particular un alimento para animales no rumiantes). La presente invención se refiere a métodos y composiciones que dan lugar a que la biomasa lignocelulósica sea un sucedáneo adecuado del almidón de granos usado convencionalmente en la alimentación animal.

Antecedentes de la invención

Algunos animales, por ejemplo los animales no rumiantes, como por ejemplo los cerdos y las aves de corral, no pueden digerir y absorber glucosa de la lignocelulosa de ingredientes fibrosos, como los desechos agrícolas, por ejemplo, hasta un punto que permita la sustitución de los granos de cereal en la dieta del animal. Algunos animales, en particular los animales no rumiantes, no tienen las enzimas necesarias para digerir la celulosa, e incluso si las tuvieran, el tiempo de retención en el intestino es una limitación para la conversión de celulosa en glucosa.

La absorción directa de glucosa de la celulosa en el intestino delgado de animales, en particular de animales no rumiantes, es una forma eficiente de utilizar esa energía en sustitución de la energía del grano.

La sustitución del maíz y los granos tradicionalmente utilizados en la alimentación animal, dado que permite que los animales utilicen los carbohidratos de materiales celulósicos más baratos como fuente de energía, es importante para reducir el coste de la alimentación animal y liberar tierras valiosas para el crecimiento de otros cultivos no alimentarios, por ejemplo.

El documento WO 2008/109111 describe métodos para tratar una fuente de fibra comestible con el fin de producir una alimentación animal con mayor energía digestible, por ejemplo un método que incluye hidrolizar la fuente de fibra comestible con un agente de hidrólisis de fibra inorgánica, en el que el material hidrolizado de forma inorgánica también se trata (antes o después) con una enzima degradante de fibra.

El documento WO 2010/011957 describe métodos y una composición destinados a reducir la inhibición de celulasa mediante xilooligómeros a través de la adición de una o más enzimas de hemicelulosa, tales como xilanasa y pxilosidasa, para formar una biomasa lignocelulósica.

Declaraciones de la invención

Según un primer aspecto, la presente invención proporciona un método para preparar una composición de aditivo alimentario que comprende:

a. pretratar física y/o química y/o biológicamente una biomasa lignocelulósica; y

b. tratar la biomasa lignocelulósica pretratada física y/o química y/o biológicamente con al menos una enzima predigestiva; y

c. mezclar dicha biomasa lignocelulósica pretratada y tratada adicionalmente con al menos una enzima predigestiva de la etapa b. con al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento;

d. y opcionalmente envasarla;

en donde la al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento:

i) es funcional, o principalmente funcional, en el tracto gastrointestinal del animal de tal modo que, antes de entrar en el tracto gastrointestinal, el nivel de actividad enzimática definido como la cantidad de solubilización de material de biomasa con respecto a oligosacáridos y monosacáridos es menor que un 20% del nivel de actividad enzimática después de entrar en el tracto gastrointestinal; y/o

ii) se mezcla con la biomasa lignocelulósica pretratada de la etapa b. cuando la biomasa lignocelulósica pretratada de la etapa b., la enzima en alimento o ambas están en un estado seco o sustancialmente seco, de tal modo que la biomasa lignocelulósica pretratada de la etapa b., la enzima en alimento o ambas comprenden menos de un 15% en peso de contenido de agua; y/o

iii) se encapsula antes de mezclarla con la biomasa lignocelulósica pretratada de la etapa b.; y/o

iv) se mezcla con la biomasa lignocelulósica pretratada de la etapa b. inmediatamente antes de alimentar a un animal con la composición de aditivo alimentario.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición de aditivo alimentario o un ingrediente alimentario que comprende una biomasa lignocelulósica pretratada física y/o química y/o biológicamente, pretratada con al menos una enzima predigestiva en combinación con al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento, en donde la biomasa lignocelulósica pretratada física y/o química y/o biológicamente se trata además con dicha al menos una enzima predigestiva antes de mezclar la biomasa lignocelulósica pretratada física y/o química y/o biológicamente con dicha al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento, en donde además la al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento:

i) es funcional, o principalmente funcional, en el tracto gastrointestinal del animal de tal modo que, antes de entrar en el tracto gastrointestinal, el nivel de actividad enzimática definido como la cantidad de solubilización de material de biomasa con respecto a oligosacáridos y monosacáridos es menor que un 20% del nivel de actividad enzimática después de entrar en el tracto gastrointestinal; y/o

ii) se mezcla con dicha biomasa lignocelulósica pretratada cuando dicha biomasa lignocelulósica pretratada, la enzima en alimento o ambas están en un estado seco o sustancialmente seco, de tal modo que dicha biomasa lignocelulósica pretratada, la enzima en alimento o ambas comprenden menos de un 15% en peso de contenido de agua; y/o

iii) se encapsula antes de mezclarla con dicha biomasa lignocelulósica pretratada; y/o

iv) se mezcla con dicha biomasa lignocelulósica pretratada inmediatamente antes de alimentar a un animal con la composición de aditivo alimentario.

La presente invención proporciona además un kit de aditivo alimentario que comprende un primer recipiente que incluye una biomasa lignocelulósica pretratada física y/o química y/o biológicamente, pretratada con al menos una enzima predigestiva, y un segundo recipiente que incluye al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento, e instrucciones para coadministrar las mismas, en donde la al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento se mezcla con dicha biomasa lignocelulósica pretratada inmediatamente antes de alimentar a un animal con la composición de aditivo alimentario.

La presente invención proporciona además un alimento o pienso que comprende una composición de aditivo alimentario o ingrediente alimentario según la presente invención o una composición de aditivo alimentario obtenible (preferiblemente obtenida) mediante el método de la presente invención.

La presente invención proporciona además una premezcla que comprende una composición de aditivo alimentario o ingrediente alimentario según la presente invención o una composición de aditivo alimentario obtenible (preferiblemente obtenida) mediante el método de la presente invención, y al menos un mineral y/o al menos una vitamina.

En otro aspecto más, la presente invención proporciona una biomasa lignocelulósica pretratada física y/o química y/o biológicamente, pretratada con al menos una enzima predigestiva en combinación con una enzima glicosil hidrolasa en alimento, para utilizarla en la mejora de una característica biofísica de un animal, en donde la biomasa lignocelulósica pretratada física y/o química y/o biológicamente se trata adicionalmente con dicha al menos una enzima predigestiva antes de mezclar la biomasa lignocelulósica pretratada física y/o química y/o biológicamente con dicha al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento, y en donde además la al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento:

i) es funcional, o principalmente funcional, en el tracto gastrointestinal del animal de tal modo que, antes de entrar en el tracto gastrointestinal, el nivel de actividad enzimática definido como la cantidad de solubilización de material de biomasa con respecto a oligosacáridos y monosacáridos es menor que un 20% del nivel de actividad enzimática después de entrar en el tracto gastrointestinal; y/o

ii) se mezcla con dicha biomasa lignocelulósica pretratada cuando dicha biomasa lignocelulósica pretratada, la enzima en alimento o ambas están en un estado seco o sustancialmente seco, de tal modo que dicha biomasa lignocelulósica pretratada, la enzima en alimento o ambas comprenden menos de un 15% en peso de contenido de agua; y/o

iii) se encapsula antes de mezclarla con dicha biomasa lignocelulósica pretratada; y/o

iv) se mezcla con dicha biomasa lignocelulósica pretratada inmediatamente antes de alimentar a un animal con la composición de aditivo alimentario;

en donde además la característica biofísica se selecciona entre el grupo consistente en una o más de las siguientes: rendimiento del animal, comportamiento de crecimiento de un animal, índice de transformación de alimentos (FCR, por sus siglas en inglés), capacidad para digerir una materia prima (por ejemplo digestibilidad de nutrientes, incluyendo digestibilidad de almidón, grasa, proteínas, fibra), retención de nitrógeno, rendimiento de canal, tasa de crecimiento, aumento de peso, peso corporal, masa, eficiencia alimenticia, porcentaje de grasa corporal, distribución de grasa corporal, crecimiento, tamaño de los huevos, peso de los huevos, masa de los huevos, tasa de puesta de huevos, e impacto medioambiental, por ejemplo producción de estiércol y/o excreción de nitrógeno.

En un aspecto, la presente invención proporciona una composición de aditivo alimentario obtenible (por ejemplo obtenida) mediante el método de la presente invención, o una composición de aditivo alimentario según la presente invención, o un alimento según la presente invención, o una premezcla según la presente invención, para utilizarlos en la mejora de una característica biofísica de un animal, en donde la característica biofísica se selecciona entre el grupo consistente en una o más de las siguientes: rendimiento del animal, comportamiento de crecimiento de un animal, índice de transformación de alimentos (FCR), capacidad para digerir una materia prima (por ejemplo digestibilidad de nutrientes, incluyendo digestibilidad de almidón, grasa, proteínas, fibra), retención de nitrógeno, rendimiento de canal, tasa de crecimiento, aumento de peso, peso corporal, masa, eficiencia alimenticia, porcentaje de grasa corporal, distribución de grasa corporal, crecimiento, tamaño de los huevos, peso de los huevos, masa de los huevos, tasa de puesta de huevos, e impacto medioambiental, por ejemplo producción de estiércol y/o excreción de nitrógeno.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para preparar un pienso, que comprende poner en contacto un componente alimentario con una composición de aditivo alimentario o ingrediente alimentario según la presente invención, o una composición de aditivo alimentario obtenible (preferiblemente obtenida) mediante los métodos de la presente invención.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 representa el procedimiento para digestiones in vitro del tracto gastrointestinal (GIT, por sus siglas en inglés) proximal de pollo.

La Figura 2 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID N° 1) que codifica una endoxilanasa (FoxXyn6). La secuencia señal se muestra en negrita (mayúsculas).

La Figura 3 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID N° 2) que codifica una endoxilanasa (FoxXyn6).

La Figura 4 muestra una secuencia de polipéptidos (SEQ ID N° 3) de una endoxilanasa (FoxXyn6). Ésta es la forma activa de la enzima (por ejemplo, la forma madura de la enzima).

La Figura 5 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID N° 4) que codifica una endoxilanasa (FoxXyn4). La secuencia señal se muestra en negrita (mayúsculas).

La Figura 6 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID N° 5) que codifica una endoxilanasa (FoxXyn4).

La Figura 7 muestra una secuencia de polipéptidos (SEQ ID N° 6) de una endoxilanasa (FoxXyn4). Ésta es la forma activa de la enzima (por ejemplo, la forma madura de la enzima).

La Figura 8 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID N° 7) que codifica una endoglucanasa (EG1) de Aspergillus niger (CBS513.88).

La Figura 9 muestra una secuencia de polipéptidos (SEQ ID N° 8) de una endoglucanasa (EG1) de Aspergillus niger (CBS513.88).

La Figura 10 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID N° 9) que codifica una endoglucanasa (EG2) de Aspergillus niger CBS513.88.

La Figura 11 muestra una secuencia de polipéptidos (SEQ ID N° 10) de una endoglucanasa (EG2) de Aspergillus niger CBS513.88.

La Figura 12 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID N° 11) que codifica una endoxilanasa.

La Figura 13 muestra una secuencia de polipéptidos (SEQ ID N° 12) de una endoxilanasa.

La Figura 14 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID N° 13) que codifica una p-glucosidasa de Aspergillus niger CBS513.88.

La Figura 15 muestra una secuencia de polipéptidos (SEQ ID N° 14) de una p-glucosidasa de Aspergillus niger CBS513.88.

La Figura 16 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID N° 15) que codifica una polisacárido monooxigenasa lítica de Aspergillus niger CBS513.88.

La Figura 17 muestra una secuencia de polipéptidos (SEQ ID N° 16) de una polisacárido monooxigenasa lítica de Aspergillus niger CBS513.88.

La Figura 18 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID N° 17) que codifica un CHB1A de Aspergillus niger (CBS513.88).

La Figura 19 muestra una secuencia de polipéptidos (SEQ ID N° 18) de un CHB1A de Aspergillus n iger(CBS513.88).

La Figura 20 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID N° 19) que codifica un CHB1B de Aspergillus niger (CBS513.88).

La Figura 21 muestra una secuencia de polipéptidos (SEQ ID N° 20) de un CHB1B de Aspergillus n iger(CBS513.88). La Figura 22 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID N° 21) que codifica un CHB1 de Trichoderma reesei. La Figura 23 muestra una secuencia de polipéptidos (SEQ ID N° 22) de un CHB1 de Trichoderma reesei.

La Figura 24 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID N° 23) que codifica un CHB2 de Trichoderma reesei. La Figura 25 muestra una secuencia de polipéptidos (SEQ ID N° 24) de un CHB2 de Trichoderma reesei.

La Figura 26 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID N° 25) que codifica una endoglucanasa (EG1) de Trichoderma reesei.

La Figura 27 muestra una secuencia de polipéptidos (SEQ ID N° 26) de una endoglucanasa (EG1) de Trichoderma reesei.

La Figura 28 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID N° 27) que codifica una endoglucanasa (EG2) de Trichoderma reesei.

La Figura 29 muestra una secuencia de polipéptidos (SEQ ID N° 28) de una endoglucanasa (EG2) de Trichoderma reesei.

La Figura 30 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID N° 29) que codifica una endoglucanasa (EG3) de Trichoderma reesei.

La Figura 31 muestra una secuencia de polipéptidos (SEQ ID N° 30) de una endoglucanasa (EG3) de Trichoderma reesei.

La Figura 32 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID N° 31) que codifica una polisacárido monooxigenasa lítica de Trichoderma reesei.

La Figura 33 muestra una secuencia de polipéptidos (SEQ ID N° 32) de una polisacárido monooxigenasa lítica de Trichoderma reesei.

La Figura 34 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID N° 33) que codifica una endoxilanasa de Trichoderma reesei.

La Figura 35 muestra una secuencia de polipéptidos (SEQ ID N° 34) de una endoxilanasa de Trichoderma reesei. La Figura 36 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID N° 35) que codifica una p-glucosidasa de Trichoderma reesei.

La Figura 37 muestra una secuencia de polipéptidos (SEQ ID N° 36) de una p-glucosidasa de Trichoderma reesei.

Descripción detallada

Un hallazgo fundamental de la presente invención consiste en que los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que pretratar físicamente, pretratar químicamente, pretratar fisicoquímicamente, pretratar biológicamente (o combinaciones de los mismos) biomasa lignocelulósica en combinación con un tratamiento con al menos una enzima en alimento puede mejorar de forma inesperada y significativa el valor nutricional de la biomasa lignocelulósica para animales (en particular animales no rumiantes).

La presente invención significa que se puede utilizar biomasa lignocelulósica como un sucedáneo del almidón usado convencionalmente (por ejemplo, de granos) en la alimentación animal. Esto tiene ventajas significativas. Por ejemplo, el uso de la presente invención significa que una proporción significativa de los granos de cereal usados convencionalmente para la nutrición animal ya no necesitaría usarse en aplicaciones de alimentos para animales. La presente invención permite reducir el coste de preparación del alimento para animales. Adicional o alternativamente, la presente invención alivia las presiones de recursos en las cadenas de suministro provocadas por el crecimiento de la población humana y las limitaciones en el suministro de combustibles fósiles.

Para la nutrición animal se utilizan aproximadamente 750 millones de toneladas de granos de cereal al año. La sustitución de una proporción de estos granos de cereal por biomasa lignocelulósica tal como se describe en la presente memoria proporciona un beneficio significativo para la población en su conjunto.

La sustitución de granos (por ejemplo maíz) por materiales celulósicos más baratos (por ejemplo biomasa lignocelulósica) revolucionará los mercados de alimentos para animales y/o aumentará la estabilidad de los mercados de alimentos para humanos y de energía durante algún tiempo.

La invención actualmente reivindicada es relevante tanto para animales no rumiantes como para rumiantes. Por ejemplo, en los rumiantes, los complementos alimentarios según la presente invención o producidos mediante la presente invención se pueden usar para sustituir los granos de cereales utilizados para la producción intensiva de carne y leche en rumiantes y/o para aumentar la eficiencia del sistema.

Por consiguiente, una ventaja de la presente invención consiste en que mejora el valor nutricional de la biomasa lignocelulósica.

En la presente memoria se describe un método para preparar una composición de aditivo alimentario que comprende:

a. pretratar física y/o química y/o biológicamente una biomasa lignocelulósica; y

b. mezclar la biomasa lignocelulósica pretratada de la etapa a. con al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento;

c. y opcionalmente envasarla.

El método de la presente invención puede comprender además alimentar a un animal con la composición de aditivo alimentario.

En algunas realizaciones se alimenta a un animal con la biomasa lignocelulósica pretratada física y/o química y/o biológicamente en combinación con la al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento inmediatamente después de mezclar la biomasa lignocelulósica pretratada física y/o química y/o biológicamente con la al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento.

En otras realizaciones, la enzima glicosil hidrolasa en alimento se mantiene en una forma inactiva en la biomasa lignocelulósica pretratada física y/o química y/o biológicamente, hasta el momento en que la enzima entra en el tracto gastrointestinal (GIT) de un animal.

En estos casos, cuando la enzima entra en el GIT del animal, la enzima se activa (por ejemplo, se vuelve activa).

La expresión "en alimento", tal como se usa en la presente memoria, significa que la enzima es funcional, de forma preferible principalmente funcional, más preferiblemente únicamente funcional, en el GIT del animal. En otras palabras, la expresión "en alimento", tal como se usa en la presente memoria, significa que la enzima es sustancialmente inactiva (o está inactiva) en la composición de aditivo alimentario y/o en la biomasa lignocelulósica antes de alimentar a un animal con la composición de aditivo alimentario.

La expresión "principalmente funcional" significa que la enzima funciona principalmente sobre su sustrato una vez que entra en el GIT. En otras palabras, antes de entrar en el GIT, el nivel de actividad enzimática definido como la cantidad de solubilización del material de biomasa con respecto a oligosacáridos y monosacáridos es menor que un 20%, adecuadamente menor que un 10%, preferiblemente menor que un 5%, del nivel de actividad enzimática después de entrar en el GIT (en particular, después de entrar en el intestino delgado del GIT).

La expresión "únicamente funcional", tal como se usa en la presente memoria, significa que la enzima está inactiva antes de entrar en el GIT y se activa al entrar en el GIT.

El término "inactiva", tal como se usa en la presente memoria, significa que la enzima no está activa. Esto puede significar que la actividad de la enzima está inhibida de alguna manera o que la enzima se encuentra en un entorno en el que está inactiva, o que la enzima se presenta a su sustrato inmediatamente antes de alimentar al animal, de modo que no hay suficiente tiempo para que esté activa. En cualquier caso, la "inactividad" de la enzima es reversible una vez que entra en el GIT de un animal.

La expresión "sustancialmente inactiva", tal como se usa en la presente memoria, significa que la enzima tiene baja actividad en comparación con su actividad una vez que ha entrado en el GIT (por ejemplo, en el intestino delgado del animal). Por ejemplo, sustancialmente inactiva puede significar que la enzima en la composición de aditivo alimentario y/o en la biomasa lignocelulósica tiene menos de un 10% de su actividad en comparación con su actividad en el GIT (en particular, en el intestino delgado del GIT).

El mantenimiento de la enzima "en alimento" en un estado inactivo o sustancialmente inactivo en la composición de aditivo alimentario y/o en la biomasa lignocelulósica se puede lograr de varias formas conocidas por los expertos en la técnica.

Únicamente a modo de ejemplo, mantener el contenido de agua (% en peso) de la biomasa lignocelulósica y/o de la enzima en alimento y/o de la composición de aditivo alimentario en menos de un 15%, preferiblemente menos de un 10%, es suficiente para asegurar que la enzima en alimento está inactiva o sustancialmente inactiva en la composición de aditivo alimentario y/o en la biomasa lignocelulósica.

Por lo tanto, en una realización, la enzima en alimento se puede mezclar con la biomasa lignocelulósica pretratada física y/o química y/o biológicamente cuando la biomasa lignocelulósica pretratada física y/o química y/o biológicamente, la enzima en alimento o ambos están en un estado seco o en un estado sustancialmente seco.

En una realización, la biomasa lignocelulósica y/o la enzima en alimento y/o la composición de aditivo alimentario, después de mezclar la biomasa lignocelulósica y la enzima en alimento, se (mantienen y/o almacenan) en un estado seco o en un estado sustancialmente seco.

La expresión "estado seco", tal como se usa en la presente memoria, significa que la biomasa lignocelulósica y/o la enzima en alimento y/o la composición de aditivo alimentario no contienen agua o solo contienen una cantidad muy pequeña de agua. En otras palabras, la expresión "estado seco", tal como se usa en la presente memoria, puede significar que la biomasa lignocelulósica y/o la enzima en alimento y/o la composición de aditivo alimentario comprenden menos de un 5%, preferiblemente menos de un 1%, de contenido de agua (% en peso).

La expresión "estado sustancialmente seco", tal como se usa en la presente memoria, significa que la biomasa lignocelulósica y/o la enzima en alimento y/o la composición de aditivo alimentario solo contienen una cantidad muy pequeña de agua. En otras palabras, la expresión "estado sustancialmente seco", tal como se usa en la presente memoria, puede significar que la biomasa lignocelulósica y/o la enzima en alimento y/o la composición de aditivo alimentario comprenden menos de un 15%, preferiblemente menos de un 10%, de contenido de agua (% en peso).

En una realización, el método según la presente invención puede comprender secar la biomasa lignocelulósica pretratada física y/o química y/o biológicamente antes, durante o después (preferiblemente antes) de mezclar la biomasa con al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento.

En otra realización, la biomasa lignocelulósica pretratada física y/o química y/o biológicamente comprende menos de un 15% en peso de contenido de humedad antes o después de añadir la al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento.

En otra realización, la biomasa lignocelulósica pretratada física y/o química y/o biológicamente comprende menos de un 10% en peso de contenido de humedad antes o después de añadir la al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento.

En otra realización, la biomasa lignocelulósica pretratada física y/o química y/o biológicamente comprende menos de un 5% en peso de contenido de humedad antes o después de añadir la al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento.

En otra realización, la biomasa lignocelulósica pretratada física y/o química y/o biológicamente comprende menos de un 1% en peso de contenido de humedad antes o después de añadir la al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento.

La enzima "en alimento" se puede mantener en un estado inactivo o sustancialmente inactivo en la composición de aditivo alimentario y/o en la biomasa lignocelulósica evitando físicamente que la enzima interactúe con su sustrato. Por ejemplo, la enzima en alimento se puede encapsular antes de mezclarla con la biomasa lignocelulósica.

Cuando se impide físicamente que la enzima en alimento interactúe con su sustrato en la biomasa lignocelulósica, la barrera física se elimina una vez que está dentro del GIT, permitiendo así la interacción de la enzima en alimento con su sustrato.

Únicamente a modo de ejemplo, la encapsulación se puede eliminar mediante el paso de la enzima encapsulada a través del estómago de un animal. El estómago de un animal tiene un pH muy bajo (ácido) (por ejemplo pH 2-4). Esta acidez se puede utilizar para activar enzimas encapsuladas.

En una realización, la enzima puede estar encapsulada por un polímero, tal como quitina o quitosanos, gelatina, goma arábiga o cera, por ejemplo. Únicamente a modo de ejemplo, el polímero puede ser una gelatina o goma arábiga tal como se describe en Xue et al Food Funct. 2013, 25 de abril; 6 de febrero (epub); 4 (4) 610-7. Alternativamente, el polímero puede ser un hidrogel basado en quitosán tal como se describe en Zhang et al Biomacromolecules 2011, 12, 2894-2901.

En una realización, la al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento se puede activar alimentando a un animal con la al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento.

El término "inactiva", tal como se usa en la presente memoria, puede significar que la enzima se presenta a su sustrato inmediatamente antes de alimentar al animal, de modo que no hay suficiente tiempo para que esté activa antes de que entre en el GIT del animal.

En una realización, la al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento se puede mezclar con la biomasa lignocelulósica pretratada física y/o química y/o biológicamente inmediatamente antes de alimentar a un animal con la composición de aditivo alimentario.

En una realización preferida, la enzima en alimento se mantiene en un estado inactivo o sustancialmente inactivo manteniendo la composición de aditivo alimentario en un estado seco o sustancialmente seco. Esto tiene ventajas adicionales, ya que la manipulación, por ejemplo el procesamiento, envasado, almacenamiento y transporte de una composición seca es más fácil que en el caso de las formulaciones no secas (por ejemplo, líquidos).

Sin embargo, también se puede prever que un kit en el que la biomasa pretratada física y/o química y/o biológicamente esté separada físicamente de la enzima en alimento (por ejemplo, manteniéndolas en contenedores separados) permitiría al usuario final (por ejemplo, un granjero) mezclar la biomasa pretratada física y/o química y/o biológicamente con la enzima en alimento inmediatamente antes de alimentar al animal con la mezcla. En esta situación, la biomasa pretratada física y/o química y/o biológicamente y/o la enzima en alimento pueden estar en cualquier formulación, por ejemplo sólida, semisólida o líquida.

Los presentes inventores fueron los primeros en reconocer que la biomasa lignocelulósica pretratada química y/o física y/o biológicamente puede tener suficiente valor nutricional para su uso como alimento si esta biomasa se combina con enzimas en alimento. Resultó sorprendente que el período de tiempo relativamente corto que la biomasa está en el GIT de un animal proporcionara tiempo suficiente para que la(s) enzima(s) en alimento mejore(n) significativamente el valor nutricional de este tipo de biomasa.

Preferiblemente, la biomasa lignocelulósica pretratada física y/o química y/o biológicamente comprende al menos un 70%, preferiblemente al menos un 80%, más preferiblemente al menos un 90%, de los monosacáridos presentes en el material como oligómeros o polímeros.

En la presente invención, la enzima en alimento preferiblemente genera y/o libera monosacáridos (preferiblemente monosacáridos C-6) de la biomasa lignocelulósica tratada (por ejemplo, pretratada) física y/o química y/o biológicamente, en el GIT del animal.

De manera adecuada, los monosacáridos producidos por la enzima en alimento son monosacáridos solubles, tales como azúcares C6, tales como uno o más del grupo que consiste en glucosa, galactosa, fructosa o manosa.

Por lo tanto, es preferible que la al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento comprenda una o más actividades de formación de monómero de carbohidrato (preferiblemente monómero C-6).

Las enzimas glicosil hidrolasa son un grupo muy extendido de enzimas que hidrolizan el enlace glicosídico entre dos o más carbohidratos o entre un resto carbohidrato y un resto no carbohidrato. Muchas de ellas son enzimas producidas por microorganismos para la degradación de los polisacáridos en las paredes celulares de plantas.

Preferiblemente, la al menos una enzima en alimento es una enzima glicosil hidrolasa. Una enzima glicosil hidrolasa se clasifica según la clasificación E.C. 3.2.1.4 (según las Recomendaciones del Comité de Nomenclatura (NC, por sus siglas en inglés) de la Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular (IUBMB, por sus siglas en inglés) sobre la Nomenclatura y Clasificación de Enzimas por las Reacciones que Catalizan, tal como se han publicado en Enzime Nomenclature 1992 [Academic Press, San Diego; 0-12-227165-3] con Suplemento 1 (1993), Suplemento 2 (1994), Suplemento 3 (1995), Suplemento 4 (1997) y Suplemento 5 (en Eur. J. Biochem. 1994, 223, 1-5; Eur. J. Biochem.

1995, 232, 1-6; Eur. J. Biochem. 1996, 237, 1-5; Eur. J. Biochem. 1997, 250; 1-6, y Eur. J. Biochem. 1999, 264, 610­ 650; respectivamente).

De manera adecuada, la al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento puede ser una enzima degradante de glicanos.

Preferiblemente, la al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento hidroliza un enlace beta-1,4-glicosídico.

En una realización, la al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento puede comprender (o consistir esencialmente en, o consistir en) una de las siguientes actividades enzimáticas, o ambas: actividad de celulasa y/o actividad de hemicelulasa.

En una realización preferida, la al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento puede comprender (o consistir esencialmente en, o consistir en) al menos actividad de celulasa y de hemicelulasa.

En una realización preferida, la actividad de celulasa puede comprender (o consistir esencialmente en, o consistir en) al menos las siguientes actividades enzimáticas: actividad de endoglucanasa y actividad p-glucosidasa.

En una realización preferida, la actividad de hemicelulasa puede comprender (o consistir en, o consistir esencialmente en) al menos actividad enzimática de endoxilanasa.

De manera adecuada, la al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento que comprende al menos actividad de celulasa y/o actividad de hemicelulasa, o ambas, puede comprender además una de las siguientes actividades, o ambas: actividad de exoglucosidasa y/o actividad de polisacárido monooxigenasa lítica.

En una realización, la al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento comprende (o consiste esencialmente en, o consiste en) una o más de las siguientes actividades enzimáticas: actividad de endoglucanasa, actividad de endoxilanasa o actividad de p-glucosidasa.

De forma adecuada, la al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento que comprende al menos una de las siguientes actividades enzimáticas: actividad de endoglucanasa, actividad de endoxilanasa o actividad de p glucosidasa puede comprender además una de las siguientes actividades, o ambas: actividad de exoglucosidasa y/o actividad de polisacárido monooxigenasa lítica.

En una realización, la al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento comprende (o consiste esencialmente en, o consiste en) dos o más (por ejemplo, adecuadamente tres) de las siguientes actividades enzimáticas: actividad de endoglucanasa, actividad de endoxilanasa o actividad de p-glucosidasa.

De manera adecuada, la al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento que comprende dos o más (por ejemplo, adecuadamente tres) de las siguientes actividades enzimáticas: actividad de endoglucanasa, actividad de endoxilanasa o actividad de p-glucosidasa puede comprender además una de las siguientes actividades, o ambas: actividad de exoglucosidasa y/o actividad de polisacárido monooxigenasa lítica.

En una realización, la al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento es una composición enzimática que comprende más de una enzima. La composición enzimática que comprende más de una enzima tiene preferiblemente al menos una enzima celulasa y al menos una enzima hemicelulasa.

En otra realización, la composición enzimática que comprende más de una enzima tiene preferiblemente al menos una de las siguientes: una endoglucanasa, una endoxilanasa o una p-glucosidasa.

En una realización, la composición enzimática comprende al menos dos (adecuadamente al menos tres) enzimas. La composición enzimática que comprende las al menos dos (adecuadamente al menos tres) enzimas tiene preferiblemente al menos dos (adecuadamente al menos tres) de las siguientes: una endoglucanasa, una endoxilanasa o una p-glucosidasa.

De forma adecuada, la composición enzimática puede comprender además una de las siguientes actividades, o ambas: actividad de exoglucosidasa y/o actividad de polisacárido monooxigenasa lítica.

En una realización preferible, la composición enzimática puede comprender (o consistir esencialmente en, o consistir en) al menos las siguientes actividades: actividad de endoglucanasa, actividad de endoxilanasa y actividad de pglucosidasa.

En una realización, la al menos una enzima glicosil hidrolasa (o composición enzimática) en alimento se puede caracterizar por su actividad enzimática.

En una realización, la al menos una enzima glicosil hidrolasa (o composición enzimática) en alimento para su uso en la presente invención comprende (o consiste esencialmente en, o consiste en) al menos las siguientes actividades: actividad de endoglucanasa tal como se determina mediante el "Ensayo de Actividad de Endoglucanasa", actividad de endoxilanasa tal como se determina usando el "Ensayo de Actividad de Endoxilanasa", y actividad de p-glucosidasa tal como se determina usando el "Ensayo de Actividad de Beta-glucosidasa". Los intervalos en los que estas actividades están presentes en dicha composición enzimática se exponen en las tablas mostradas más abajo y en los párrafos siguientes:

1 Una unidad CMC de actividad libera 1 pmol de azúcares reductores (expresados como equivalentes de glucosa) en un minuto a 50 °C y pH 4,8.

2 Una unidad ABX se define como la cantidad de enzima necesaria para generar 1 gmol de equivalentes de azúcar reductor de xilosa por minuto a 50 °C y pH 5,3.

3 Una unidad pNPG indica 1 gmol de nitrofenol liberado a partir de para-nitrofenil-B-D-glucopiranósido por minuto a 50 °C y pH 4,8.

En una realización, la al menos una enzima glicosil hidrolasa (o composición enzimática) en alimento para su uso en la presente invención puede comprender aproximadamente 2.000-2.600 CMC u/g de actividad de endoglucanasa, más de aproximadamente 3.000 ABX u/g de actividad de endoxilanasa y más de 2.000 pNPG u/g de actividad de pglucosidasa.

De manera adecuada, la al menos una enzima glicosil hidrolasa (o composición enzimática) en alimento para su uso en la presente invención puede comprender (o consistir esencialmente en o consistir en) al menos 1.000 CMC u/g de actividad de endoglucanasa (adecuadamente al menos 1.500 CMC u/g de actividad, adecuadamente al menos 2.000 CMC u/g de actividad) tal como se determina usando el "Ensayo de Actividad de Endoglucanasa".

Adecuadamente, la al menos una enzima glicosil hidrolasa (o composición enzimática) en alimento para su uso en la presente invención puede comprender (o consistir esencialmente en o consistir en) al menos 2.000 ABX u/g de actividad de endoxilanasa (adecuadamente al menos 2.500 ABX u/g de actividad, adecuadamente al menos 3.000 ABX u/g de actividad) tal como se determina usando el "Ensayo de Actividad de Endoxilanasa".

De manera adecuada, la al menos una enzima glicosil hidrolasa (o composición enzimática) en alimento para su uso en la presente invención puede comprender (o consistir esencialmente en o consistir en) al menos 300 pNPG u/g de actividad de p-glucosidasa (adecuadamente al menos 500 pNPG u/g de actividad, adecuadamente al menos 1.000 pNPG u/g de actividad o adecuadamente al menos 2.000 pNPG u/g de actividad) tal como se determina usando el "Ensayo de Actividad de Beta-glucosidasa".

De manera adecuada, la al menos una enzima glicosil hidrolasa (o composición enzimática) en alimento para su uso en la presente invención puede comprender (o consistir esencialmente en o consistir en) al menos 1.000 CMC u/g de actividad de endoglucanasa (adecuadamente al menos 1.500 CMC u/g de actividad, adecuadamente al menos 2.000 CMC u/g de actividad) tal como se determina usando el "Ensayo de Actividad de Endoglucanasa"; y al menos 2.000 ABX u/g de actividad de endoxilanasa (adecuadamente al menos 2.500 ABX u/g de actividad, adecuadamente al menos 3.000 ABX u/g de actividad) tal como se determina usando el "Ensayo de Actividad de Endoxilanasa"; y al menos 300 pNPG u/g de actividad de p-glucosidasa (adecuadamente al menos 500 pNPG u/g de actividad, adecuadamente al menos 1.000 pNPG u/g de actividad o adecuadamente al menos 2.000 pNPG u/g de actividad) tal como se determina usando el "Ensayo de Actividad de Beta-glucosidasa".

De manera adecuada, la al menos una enzima glicosil hidrolasa (o composición enzimática) en alimento para su uso en la presente invención puede comprender (o consistir esencialmente en, o consistir en) de aproximadamente 600 a aproximadamente 4.000 CMC u/g de actividad de endoglucanasa (adecuadamente, de al menos aproximadamente 1.000 a aproximadamente 3.000 CMC u/g de actividad, adecuadamente de al menos aproximadamente 1.500 a aproximadamente 2.600 CMC u/g de actividad) tal como se determina usando el "Ensayo de Actividad de Endoglucanasa".

De manera adecuada, la al menos una enzima glicosil hidrolasa (o composición enzimática) en alimento para su uso en la presente invención puede comprender (o consistir esencialmente en, o consistir en) de aproximadamente 2.000 a aproximadamente 5.000 ABX u/g de actividad de endoxilanasa (adecuadamente, de al menos aproximadamente 2.500 a aproximadamente 4.000 ABX u/g de actividad, adecuadamente de al menos aproximadamente 3.000 a aproximadamente 4.000 ABX u/g de actividad) tal como se determina usando el "Ensayo de Actividad de Endoxilanasa".

De manera adecuada, la al menos una enzima glicosil hidrolasa (o composición enzimática) en alimento para su uso en la presente invención puede comprender (o consistir esencialmente en, o consistir en) de aproximadamente 200 a aproximadamente 4.000 pNPG u/g de actividad de p-glucosidasa (adecuadamente de al menos aproximadamente 300 a aproximadamente 3.000 pNPG u/g de actividad, adecuadamente de al menos aproximadamente 1.000 a aproximadamente 3.000 pNPG u/g de actividad o adecuadamente de al menos aproximadamente 2.000 a aproximadamente 3.000 pNPG u/g de actividad) tal como se determina usando el "Ensayo de Actividad de Betaglucosidasa".

De manera adecuada, la al menos una enzima glicosil hidrolasa (o composición enzimática) en alimento para su uso en la presente invención puede comprender (o consistir esencialmente en, o consistir en) de aproximadamente 600 a aproximadamente 4.000 CMC u/g de actividad de endoglucanasa (adecuadamente, de al menos aproximadamente 1.000 a aproximadamente 3.000 CMC u/g de actividad, adecuadamente de al menos aproximadamente 1.500 a aproximadamente 2.600 CMC u/g de actividad) tal como se determina usando el "Ensayo de Actividad de Endoglucanasa"; y de aproximadamente 2.000 a aproximadamente 5.000 ABX u/g de actividad de endoxilanasa (adecuadamente de al menos aproximadamente 2.500 a aproximadamente 4.000 ABX u/g de actividad, adecuadamente de al menos aproximadamente 3.000 a aproximadamente 4.000 ABX u/g de actividad) tal como se determina usando el "Ensayo de Actividad de Endoxilanasa"; y de aproximadamente 200 a aproximadamente 4.000 pNPG u/g de actividad de p-glucosidasa (adecuadamente de al menos aproximadamente 300 a aproximadamente 3.000 pNPG u/g de actividad, adecuadamente de al menos aproximadamente 1.000 a aproximadamente 3.000 pNPG u/g de actividad o adecuadamente de al menos aproximadamente 2.000 a aproximadamente 3.000 pNPG u/g de actividad, tal como se determina usando el "Ensayo de Actividad de Beta-glucosidasa".

En una realización, cada una de las actividades enzimáticas reivindicadas debe comprender al menos un 4%, preferiblemente al menos un 5%, preferiblemente al menos un 10%, de la actividad enzimática total de la al menos una glicosil hidrolasa (o composición enzimática) en alimento de la presente invención.

La endoglucanasa puede ser endo-1,4-p-D-glucanasa. Una endoglucanasa es aquella que cataliza la endohidrólisis de enlaces (1^-4)-p-D-glucosídicos en celulosa, liquenina y p-D glucanos de cereales. En otras palabras, la actividad de endoglucanasa tal como se define en la presente memoria significa una enzima que endohidroliza enlaces (1^4)-p-D-glucosídicos en celulosa, liquenina y p-D glucanos de cereales. La actividad de endoglucanasa se puede clasificar en la clasificación E.C. como E.C. 3.2.1.4. Otro nombre para la endoglucanasa es p-gluanasa.

Una endoglucanasa para utilizarla en al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento para su uso en la presente invención puede consistir en una o más endoglucanasas codificadas por un ácido nucleico que comprende (o consiste en, o consiste esencialmente en) una o más secuencias de nucleótidos seleccionadas entre el grupo que consiste en: SEQ ID N2 SEQ ID N229, SEQ ID N227, SEQ ID N225, SEQ ID N29, y SEQ ID N27.

Una endoglucanasa para utilizarla en al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento para su uso en la presente invención puede consistir en una o más endoglucanasas que comprenden (o consisten en, o consisten esencialmente en) una o más de las secuencias de polipéptidos seleccionadas entre el grupo que consiste en: SEQ ID N° 30, SEQ ID N228, SEQ ID N226, SEQ ID N210 y SEQ ID N28.

"Ensayo de actividad de endoglucanasa" (CMC U/g)

Pipetear 1 ml de solución de sal sódica de carboxilmetilcelulosa (CMC) al 1% (preparada con tampón de acetato de sodio 0,05 M) en tubos de muestra y en blanco. Incubar los tubos en un baño de agua a 50 °C durante 10 minutos. Pipetear 1 ml de dilución de enzima a intervalos de 15 segundos en los tubos de muestra. Mezclar los tubos después de cada adición. Diez minutos después, agregar 3 ml de sal sódica de ácido 3,5 dinitrosalicílico (DNS) al 1% en el mismo orden y ritmo que la adición de la enzima a los tubos de muestra. Añadir 3 ml de DNS a los tubos de muestra en blanco. Después de añadir el DNS, retirar los tubos de ensayo a otra gradilla que no esté en el baño de agua a 50 °C. Añadir 1 ml de enzima diluida a la muestra en blanco correspondiente. Tapar los tubos y hervir durante exactamente 5 minutos. Retirar del baño de agua a 100 °C y colocar en un baño de hielo durante 10 minutos. Dejar a temperatura ambiente durante 10-15 minutos. Transferir a cubetas de 3 ml. Usando el reactivo en blanco para poner a cero el espectrofotómetro, cada muestra se lee a 540 nm frente a agua desionizada. La actividad en este procedimiento se mide en relación con un patrón de enzima con unidades CMC asignadas.

Una unidad CMC de actividad libera 1 pmol de azúcares reductores (expresados como equivalentes de glucosa) en un minuto a 50 °C y pH 4,8.

La actividad de endoxilanasa puede ser actividad endo-1,4-p-xilanasa. Preferiblemente, la endoxilanasa endohidroliza el enlace (1^4)-p-D-xilosídico en xilanos. Preferiblemente, la endoxilanasa se clasifica como E.C. 3.2.1.8.

Una endoxilanasa para utilizarla en la al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento para su uso en la presente invención puede consistir en una o más endoxilanasas codificadas por un ácido nucleico que comprende (o consiste en, o consiste esencialmente en) una o más secuencias de nucleótidos seleccionadas entre del grupo que consiste en: SEQ ID N2 SEQ ID N233, SEQ ID N211, SEQ ID N25, SEQ ID N24, SEQ ID N22 y SEQ ID N21.

Una endoxilanasa para utilizarla en la al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento para su uso en la presente invención puede consistir en una o más endoxilanasas que comprenden (o consisten en, o consisten esencialmente en) una o más de las secuencias de polipéptidos seleccionadas entre el grupo que consiste en: SEQ ID N° 34, SEQ ID N212, SEQ ID N26 y SEQ ID N23.

"Ensayo de actividad de endoxilanasa" (ABX U/g)

Pipetear 1,8 ml de solución de sustrato de 4-O metil glucuronoxilano de madera de abedul al 1% en cada tubo de ensayo. Incubar durante 10-15 minutos, dejando que se equilibre a 50 °C. Pipetear 0,2 ml de dilución enzimática utilizando pipetas de desplazamiento positivo o equivalentes. Agitar por vórtice para mezclar. Incubar cada muestra a 50 °C durante exactamente 5 minutos. Añadir 3 ml de solución de sal sódica de ácido 3,5 nitrosalicílico al 1 % (DNS) y mezclar. Cubrir la parte superior de los tubos de ensayo con tapas para evitar la evaporación. Colocar los tubos de ensayo en un baño en ebullición durante exactamente 5 minutos. Enfriar los tubos de ensayo durante 10 minutos en un baño de hielo/agua. Incubar el tubo de ensayo durante 10 minutos a temperatura ambiente. Transferir el contenido de los tubos de ensayo a cubetas y medir a 540 nm contra agua desionizada. Corregir la absorbancia del color de fondo restando el banco de enzimas correspondiente. Este ensayo mide la liberación de azúcares reductores por acción de la endoxilanasa sobre un sustrato de xilano de Madera de Abedul. La tasa de liberación de azúcar reductor medida con DNS es proporcional a la actividad enzimática.

Una unidad ABX se define como la cantidad de enzima necesaria para generar 1 gmol de equivalentes de azúcar reductor de xilosa por minuto a 50 °C y pH 5,3.

La actividad de la p-glucosidasa, tal como se define en la presente memoria, es la hidrólisis de residuos de p-D-glucosilo terminales no reductores con la liberación de p-D-glucosa. La actividad de la p-glucosidasa puede clasificarse en la clasificación E.C. como E.C. 3.2.1.21.

Una p-glucosidasa para utilizarla en al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento para su uso en la presente invención puede consistir en una o más p-glucosidasas codificadas por un ácido nucleico que comprende (o consiste en, o consiste en esencialmente en) una o más secuencias de nucleótidos seleccionadas entre el grupo que consiste en: SEQ ID N° 35 y SEQ ID N° 13.

Una p-glucosidasa para utilizarla en al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento para su uso en la presente invención puede consistir en una o más p-glucosidasas que comprenden (o consisten en, o consisten esencialmente en) una o más de las secuencias de polipéptidos seleccionadas entre el grupo que consiste en: SEQ ID N° 36 y SEQ ID N° 14.

"Ensayo de actividad de beta-glucosidasa" (pNPG U/g)

Pipetear 1 ml de solución de nitrofenil-beta-D-glucopiranósido (pNPG) al 3% (preparada con tampón acetato de sodio 0,05 M) en tubos de ensayo duplicados para cada muestra y control. Disponer en un baño de agua a 50 °C durante 5 minutos. Añadir 200 gl de control o muestra a sus respectivos tubos duplicados a intervalos de 15-30 segundos. Añadir 200 gl de tampón de acetato de sodio al tubo de reactivo en blanco. Agitar por vórtice cada tubo después de la adición de la muestra. Dejar incubar los tubos durante exactamente 10 minutos. Después de 10 minutos de incubación, añadir 500 gl de solución de carbonato de sodio 1 M para detener la reacción. Agitar por vórtice cada tubo después de la adición y colocar el tubo en una gradilla fuera del baño de agua. Añadir 10 ml de agua milli-Q a cada tubo y agitar por vórtice para mezclar. Usando el reactivo en blanco para poner a cero el espectrofotómetro, la concentración del 4-nitrofenol se mide leyendo cada muestra a 400 nm.

Una unidad de pNPG indica 1 gmol de nitrofenol liberado de para-nitrofenil-B-D-glucopiranósido por minuto a 50 °C y pH 4,8.

En una realización, la al menos una enzima en alimento puede comprender adicionalmente una o más de las siguientes actividades enzimáticas: actividad de exoglucosidasa o actividad de polisacárido monooxigenasa lítica.

En una realización, la al menos una enzima en alimento puede comprender adicionalmente otra enzima que comprende (o tiene) una o más de las siguientes actividades enzimáticas: actividad de exoglucosidasa o actividad de polisacárido monooxigenasa lítica.

En una realización, una polisacárido monooxigenasa lítica para utilizarla en al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento para su uso en la presente invención puede consistir en una descrita en Levasseur et al Biotechnology for Biofuels 2013, 6: 41 y Kittle et al Biotechnology for Biofuels 2012, 5: 79.

Una polisacárido monooxigenasa lítica para utilizarla en la al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento para su uso en la presente invención puede consistir en una o más polisacárido monooxigenasas líticas codificadas por un ácido nucleico que comprende (o consiste en, o consiste en esencialmente en) una o más secuencias de nucleótidos seleccionadas entre el grupo que consiste en: SEQ ID N° 31 y SEQ ID N° 15.

Una polisacárido monooxigenasa lítica para utilizar la al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento para su uso en la presente invención puede consistir en una o más polisacárido monooxigenasas líticas que comprenden (o consisten en, o consisten esencialmente en) una o más de las secuencias polipeptídicas seleccionadas entre el grupo que consiste en: SEC ID N° 32 y SEC ID N° 16.

La actividad de exoglucosidasa se puede clasificar como E.C. 3.2.1.74. La exoglucosidasa hidroliza los enlaces (1 ->4) en (1 ->4)-beta-D-glucanos, para eliminar unidades de glucosa sucesivas.

En algunas realizaciones, la al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento para utilizarla en la presente invención puede comprender (o consistir esencialmente en, o consistir en) actividad de celobiohidrolasa.

La actividad de celobiohidrolasa (CBH) puede ser actividad de CBH clase I (CBH I) o CBH clase II (CBH II) o una combinación de ambas, CBH I y CBH II. De manera adecuada, la celobiohidrolasa puede hidrolizar enlaces (1 —^ 4)-p-D-glucosídicos en celulosa y celotetraosa, liberando celobiosa de los extremos no reductores de las cadenas. Otro término para la actividad de celobiohidrolasa puede ser actividad de exocelobiohidrolasa o actividad de celulosa 1,4 p-celobiosidasa. La actividad de celobiohidrolasa II se puede clasificar en la clasificación E.C. como E.C. 3.2.1.91. La actividad de celobiohidrolasa I se puede clasificar en la clasificación E.C. como E.C. 3.2.1.176.

Una celobiohidrolasa (CBH) para utilizarla en la al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento para su uso en la presente invención puede consistir en una o más celobiohidrolasas codificadas por un ácido nucleico que comprende (o consiste en, o consiste esencialmente en) una o más secuencias de nucleótidos seleccionadas entre el grupo que consiste en: SEQ ID N° 23, SEQ ID N° 21, SEQ ID N° 19 y SEQ ID N° 17.

Una celobiohidrolasa (CBH) para utilizarla en la al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento para su uso en la presente invención puede consistir en una o más celobiohidrolasas que comprenden (o consisten en, o consisten esencialmente en) una o más de las secuencias de polipéptidos seleccionadas entre el grupo que consiste en: SEQ ID N° 24, SEQ ID N° 22, SEQ ID N° 20 y SEQ ID N° 18.

En una realización, la al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento para utilizarla en la presente invención es capaz de hidrolizar biomasa lignocelulósica en un estado cristalino.

De manera adecuada, la al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento para utilizarla en la presente invención es capaz de hidrolizar celulosa en un estado cristalino.

Únicamente a modo de ejemplo, las siguientes enzimas pueden utilizarse adecuadamente de acuerdo con la presente invención:

En una realización, la al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento puede consistir en una sola enzima o una combinación de enzimas (por ejemplo, una mezcla de enzimas).

En una realización preferida, la al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento consiste en una mezcla de enzimas.

Preferiblemente, la enzima en alimento según la presente invención es estable y activa en el tracto gastrointestinal (GIT) de un animal. En una realización, la enzima en alimento es resistente a la pepsina. En una realización, la enzima en alimento es tolerante a las sales biliares. En una realización, la enzima en alimento es resistente a pH bajo. En una realización, la enzima en alimento puede soportar temperaturas de aglomeración (70-95 °C). En una realización, la enzima en alimento es activa en el intervalo de 37-40 °C. En una realización, la enzima en alimento es activa en el intervalo de 37-40 °C.

La expresión "consisten esencialmente en" o "consiste esencialmente en", tal como se usa en el contexto de la actividad de la al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento, significa que la(s) enzima(s) glicosil hidrolasa en alimento tiene(n) la actividad o la actividades caracterizadas, pero ninguna otra actividad de enzima glicosil hidrolasa y/o ninguna otra actividad enzimática que pueda digerir biomasa lignocelulósica.

En una realización, cada una de las diferentes actividades enzimáticas definidas en la presente memoria se proporciona preferiblemente mediante una proteína individual. En otras palabras, cada actividad enzimática es una proteína enzimática diferente. Preferiblemente, la actividad enzimática definida es la actividad primaria (o única) de la proteína. En otras palabras, preferiblemente la actividad definida no es una actividad secundaria de una proteína.

Biomasa

El término "lignocelulósico" se refiere a una composición que comprende tanto lignina como celulosa. El material lignocelulósico también puede comprender hemicelulosa.

El término "celulósico" se refiere a una composición que comprende celulosa y componentes adicionales, incluyendo hemicelulosa.

En una realización, la biomasa lignocelulósica es cualquier material celulósico o lignocelulósico. La expresión "biomasa lignocelulósica" se refiere a cualquier material lignocelulósico e incluye materiales que comprenden celulosa. Opcionalmente, la biomasa lignocelulósica puede comprender además hemicelulosa, lignina, almidón, oligosacáridos y/o monosacáridos.

La biomasa también puede comprender componentes adicionales, como proteínas, lípidos, cenizas y/o extractos. La biomasa se puede derivar de una sola fuente o la biomasa puede comprender una mezcla derivada de más de una fuente; por ejemplo, la biomasa podría comprender una mezcla de mazorcas de maíz y rastrojo de maíz, o una mezcla de hierba y hojas.

Preferiblemente, la biomasa lignocelulósica comprende al menos un 15% de celulosa.

En una realización, la biomasa lignocelulósica comprende al menos un 20% de celulosa.

La biomasa lignocelulósica puede consistir en cualquier material celulósico o lignocelulósico tal como residuos agrícolas, cultivos bioenergéticos, residuos sólidos industriales, residuos sólidos urbanos, lodos de la fabricación de papel, residuos de jardinería, residuos de madera, residuos forestales y combinaciones de los mismos.

En una realización, la biomasa lignocelulósica se puede seleccionar entre el grupo que consiste en mazorcas de maíz, residuos de cultivos tales como hojas de maíz, rastrojo de maíz, hierbas, pulpa de remolacha, paja de trigo, cascabillo de trigo, paja de avena, harinilla de trigo, subproductos de molienda de trigo, salvado de arroz, cascarilla de arroz, salvado de trigo, cascarilla de avena, nuez de palma, pulpa de cítricos, algodón, lignina, paja de cebada, heno, paja de arroz, cascarilla de arroz, pasto varilla, miscanthus, cordgrass, alpiste arundináceo, papel de desecho, bagazo de caña de azúcar, bagazo de sorgo, sorgo forrajero, rastrojo de sorgo, rastrojo de soja, soja, componentes obtenidos de la molienda de árboles, ramas, raíces, hojas, astillas de madera, serrín, arbustos y matorrales, hortalizas, frutos, flores.

En una realización, la biomasa lignocelulósica se puede seleccionar entre el grupo que consiste en torta húmeda, fibra de maíz, harina de germen de maíz, salvado de maíz, alimento de maíz molido, alimento de gluten de maíz, harina de gluten, subproductos de molienda de trigo, harinilla de trigo, residuos desecados de destilería (DDG, por sus siglas en inglés) y solubles de residuos desecados de destilería (DDGS, por sus siglas en inglés) basados, por ejemplo, en maíz, trigo, sorgo o combinaciones de los mismos.

En otra realización, la biomasa lignocelulósica se puede seleccionar entre el grupo que consiste en rastrojo de maíz, paja de trigo, mazorcas de maíz, bagazo de caña de azúcar, pasto varilla, sorgo forrajero y paja de arroz.

En una realización, la biomasa que es útil para la invención incluye biomasa que tiene un valor de carbohidratos relativamente alto, es relativamente densa y/o es relativamente fácil de recolectar, transportar, almacenar y/o manipular.

En una realización, la biomasa lignocelulósica puede comprender menos de un 50% de almidón, preferiblemente menos de un 40% de almidón.

En una realización, la biomasa lignocelulósica puede comprender menos de un 30% de almidón, preferiblemente menos de un 10% de almidón.

En una realización, la biomasa lignocelulósica puede comprender menos de un 3% de almidón.

En una realización, la biomasa lignocelulósica puede comprender menos de un 1% de almidón.

De forma adecuada, la biomasa lignocelulósica no comprende almidón.

En una realización, la biomasa lignocelulósica no comprende grano de cereales.

Pretratamiento

En una realización, la biomasa lignocelulósica se pretrata mediante cualquier proceso de pretratamiento conocido en la técnica que sea capaz de romper la estructura compacta de la biomasa lignocelulósica para exponer fibras de celulosa y/o que dé como resultado una disminución de la cristalinidad de la biomasa (por ejemplo, cristalinidad de celulosa) y/o que aumente la superficie accesible para la actividad enzimática.

Durante las últimas décadas se han desarrollado varios procesos de pretratamiento. Generalmente, estos pretratamientos se pueden dividir en pretratamientos mecánicos/físicos, fisicoquímicos, químicos y biológicos, o combinaciones de los mismos. Por ejemplo, en X Zhao, L Zhang, D Liu Review: Fundamentals of different pretreatments to increase the enzymatic digestibility of lignocelluloses, Biofuels, Bioprod. Bioref. 6:561-579 (2012) se puede encontrar una descripción general de los diversos pretratamientos.

El pretratamiento puede ser cualquier tratamiento conocido en la técnica que dé como resultado una baja cristalinidad de celulosa medida mediante el Método de Segal (Segal et al. "An Emprical Method for Estimating the Degree of Crystallinity of Native Celulose Using the X-Ray Diffractometer", Textile Research Journal, octubre de 1959, Vol. 29, N° 10, 786-794), o que aumente el área superficial accesible para la actividad enzimática, o una combinación de ambos.

En una realización, el pretratamiento es un pretratamiento que reduce la cristalinidad de la celulosa en la biomasa lignocelulósica.

En una realización, el pretratamiento es un pretratamiento que reduce la cristalinidad de la celulosa en la biomasa lignocelulósica en al menos aproximadamente un 20%, medida utilizando el Método de Segal (supra).

En una realización, el pretratamiento es un pretratamiento que aumenta el área superficial accesible para la actividad enzimática en la biomasa lignocelulósica.

En una realización, el pretratamiento es un pretratamiento que aumenta el área superficial accesible en al menos aproximadamente un 20%, adecuadamente al menos aproximadamente un 30%, adecuadamente al menos aproximadamente un 40% en la biomasa lignocelulósica. El área superficial accesible se puede determinar mediante el BET (Brunauer, Emmett y Teller), tal como se describe en Guo et al Bioresource Technology 99 (2008) 6046-6053.

El área superficial disponible de la biomasa lignocelulósica se puede medir usando análisis de Brunauer, Emmett y Teller (BET), comprendiendo dicho método (i) pesar 0,5 g de muestra seca; (ii) desgasificar con nitrógeno de alta pureza (99,999%) a temperatura ambiente (por ejemplo, 25 °C) a lo largo de la noche; y (iii) realizar análisis BET utilizando un analizador de superficie (Quantachrome NOVA2000).

En una realización, la biomasa lignocelulósica puede ser sometida (o es sometida) a un tratamiento físico y/o químico y/o biológico. Esto se puede designar en la presente memoria como un pretratamiento físico y/o químico y/o biológico.

En una realización, el pretratamiento físico y/o químico según la presente invención puede ser un tratamiento físico o un tratamiento químico o un tratamiento fisicoquímico.

El concepto tratamiento físico y químico se usa en la presente memoria de manera intercambiable con tratamiento fisicoquímico.

En una realización, la biomasa lignocelulósica puede ser sometida (o es sometida) a un pretratamiento físico y/o químico.

En una realización, la biomasa lignocelulósica puede ser sometida (o es sometida) a un pretratamiento físico.

En una realización, la biomasa lignocelulósica puede ser sometida (o es sometida) a un pretratamiento químico. En una realización, la biomasa lignocelulósica puede ser sometida (o es sometida) a un pretratamiento fisicoquímico. El tratamiento físico y/o químico y/o biológico puede ser cualquier tratamiento (por ejemplo, pretratamiento) físico y/o químico y/o biológico conocido en la técnica.

Pretratamiento mecánico/físico

El pretratamiento mecánico/físico se refiere al proceso de trituración mecánica mediante una combinación de astillado, molturación, molienda en seco, molienda en húmedo, molienda por bolas vibratorias, molienda por bolas rotativas. El tamaño de la materia prima es normalmente de 10-30 mm después del astillado y de 0,2-2 mm después de la molienda

o trituración, y la cristalinidad de la celulosa disminuye y/o el área superficial accesible aumenta. El pretratamiento

previo del sólido de biomasa con agua caliente, ácidos o bisulfato de sodio para ablandar la materia prima puede hacer que la molienda consuma menos energía. En una forma de realización de la invención, la biomasa se pretrata con un proceso de descristalización mecánica.

El concepto pretratamiento físico se utiliza en la presente memoria de manera intercambiable con pretratamiento mecánico.

Pretratamientos fisicoquímicos

Los pretratamientos fisicoquímicos combinan la modificación química de las composiciones de biomasa y la fractura

física de la estructura de la pared celular. Un pretratamiento fisicoquímico útil es la explosión por vapor. En este pretratamiento, la biomasa se trata con vapor saturado a alta presión (alta presión y alta temperatura), opcionalmente incluyendo la adición de ácidos, bases u otros productos químicos, y luego la presión se reduce rápidamente, haciendo

que los materiales experimenten una descompresión explosiva.

En una realización, el tratamiento (por ejemplo, pretratamiento) físico y/o químico puede consistir en hidrotermólisis u oxidación en húmedo y comprende: alta presión y/o alta temperatura con agua líquida y/o vapor, incluyendo opcionalmente la adición de ácidos, bases u otros productos químicos.

En una realización, la presión está en el intervalo de 300 a 600, preferiblemente de 350 a 550, preferiblemente de 400

a 500 psi.

En una realización, alta temperatura significa temperaturas en el intervalo de aproximadamente 100 a 300 °C, preferiblemente de aproximadamente 140 a 240 °C, tal como de aproximadamente 170 a 200 °C.

Únicamente a modo de ejemplo, el pretratamiento puede ser un tratamiento físico que comprende explosión por vapor.

En términos de cristalinidad de celulosa, después de la explosión por vapor se incrementa el índice de cristalinidad

(CrI, por sus siglas en inglés) del sustrato. El índice de cristalinidad (CrI) se describe en Segal (supra).

Otro ejemplo de un pretratamiento fisicoquímico consiste en la explosión de fibra de amoníaco (AFEX, por sus siglas

en inglés), donde el material lignocelulósico se impregna con amoníaco líquido seguido de un aumento de la temperatura hasta aproximadamente 90 °C. Sin desear ceñirse a la teoría, el amoníaco gaseoso formado interactúa

con la biomasa bajo presión (por ejemplo, 17-20 bar durante 5-10 minutos) y la presión se libera rápidamente, lo que

puede provocar la descristalización de la celulosa, la prehidrólisis de la hemicelulosa, y la alteración de la estructura

de la lignina y/o un aumento del área superficial accesible.

El índice de cristalinidad (CrI) puede verse influenciado por las condiciones del pretratamiento AFEX, ya que ligeras diferencias en las condiciones del pretratamiento pueden resultar en la formación de diferentes estructuras cristalinas

de celulosa.

Otro proceso de pretratamiento fisicoquímico útil es el pretratamiento con agua caliente líquida que utiliza agua como

medio para pretratar la biomasa a presión con el fin de mantener el agua en estado líquido a temperaturas elevadas.

El pretratamiento también suele designarse como hidrotermólisis o pretratamiento hidrotérmico. Puede solubilizar aproximadamente un 40-60% de la biomasa total con un 4-22% de la celulosa y prácticamente todas las hemicelulosas

para formar oligosacáridos solubles líquidos. Como resultado de ello se puede observar un aumento de la superficie accesible. Adicional o alternativamente se puede observar una disminución de la cristalinidad de la celulosa, una

menor asociación de la celulosa con lignina y despolimerización de la celulosa, lo que contribuye a mejorar la accesibilidad de la celulosa.

En una realización, el pretratamiento puede ser un pretratamiento fisicoquímico que comprende hidrotermólisis o un tratamiento hidrotérmico.

En una realización, la biomasa lignocelulósica consiste en paja de trigo y el pretratamiento comprende el uso de un tratamiento hidrotérmico. El pretratamiento según la presente invención puede incluir adecuadamente un tratamiento hidrotérmico tal como se describe en el documento WO2011/125056 (IBICON).

Los pretratamientos por radiación implican procesos para pretratar biomasa lignocelulósica con irradiación y, ultrasonido, haz de electrones o microondas. Los pretratamientos de radiación también se pueden combinar con otros pretratamientos para aumentar aún más la accesibilidad de la celulosa. Sin desear ceñirse a la teoría, con una dosis de irradiación elevada, los sustratos se vuelven frágiles debido a la degradación por radiación de la celulosa, la hemicelulosa y la lignina. La cristalinidad de la celulosa se puede destruir hasta cierto punto por radiación y. El pretratamiento con microondas se realiza normalmente en presencia de agua, un disolvente orgánico, álcali o una solución ácida diluida.

Pretratamientos químicos

Los pretratamientos químicos implican los procesos que utilizan varios productos químicos para pretratar la biomasa en diversas condiciones. Los mecanismos de estos pretratamientos varían según los productos químicos utilizados y las condiciones del pretratamiento. Los ejemplos de procesos de pretratamiento químico adecuados incluyen, pero de ninguna manera se limitan a: pretratamiento con ácido diluido, pretratamiento con álcali, pretratamiento con sulfito, pretratamiento oxidativo, como por ejemplo oxidación en húmedo, pretratamiento con disolvente de celulosa, percolación de amoníaco (APR, por sus siglas en inglés) y pretratamiento organosolv.

En una realización, el pretratamiento puede ser un tratamiento químico que comprende el uso de un tratamiento ácido o alcalino.

A modo de ejemplo, el tratamiento físico y/o químico puede consistir en la adición de un catalizador de base u otros métodos conocidos en la técnica.

En una realización, la biomasa lignocelulósica consiste en rastrojo de maíz y el tratamiento físico y/o químico comprende el uso de un tratamiento ácido.

En una realización, el pretratamiento es un pretratamiento con ácido diluido. Por ejemplo, el material de biomasa lignocelulósica se puede mezclar con ácido diluido, por regla general H²SO⁴ , y agua para formar una suspensión, se calienta por medio de vapor a la temperatura deseada (normalmente entre 160 y 220 °C), y después de un tiempo de permanencia se pasa rápidamente a presión atmosférica.

En una realización específica, el pretratamiento puede comprender las etapas consistentes en: a) impregnar la biomasa lignocelulósica (por ejemplo, paja de trigo) con H²SO⁴ al 0,2%, por ejemplo por remojo; b) prensar el material hasta obtener una materia seca entre un 40-50%; y c) pretratar con vapor durante 10 minutos a 190 °C. Opcionalmente, prensar la suspensión resultante para filtrar el líquido y opcionalmente lavar el residuo sólido 2-3 veces y prensar hasta un contenido final de sólidos de aproximadamente un 40-50%.

En otra realización específica, el pretratamiento puede comprender las etapas consistentes en a) impregnar la biomasa lignocelulósica (por ejemplo, paja de trigo) con ácido acético al 1% por remojo; b) prensar el material hasta obtener una materia seca entre un 40-50%; y c) pretratar con vapor durante 10 minutos a 200 °C. Opcionalmente, prensar la suspensión subsiguiente para filtrar el líquido y opcionalmente lavar el residuo sólido 2-3 veces y prensar hasta un contenido final de sólidos de aproximadamente un 40-50%.

El pretratamiento alcalino puede implicar el tratamiento de biomasa lignocelulósica con varios álcalis o bases tales como NaOH, KOH, CaOH² , amoníaco acuoso, peróxido y cal (usando CaOH²) para pretratar la biomasa lignocelulósica. Sin desear ceñirse a la teoría, se cree que durante el pretratamiento alcalino se saponifican los enlaces de éster intermoleculares que reticulan la xilano hemicelulosa y la lignina, lo que resulta en la deslignificación de la biomasa. Se ha descrito que los álcalis son agentes adecuados para hinchar la celulosa y alterar los polimorfos cristalinos de la celulosa, lo que indica una alteración de la red de enlaces de hidrógeno cristalinos, influyendo así en la digestibilidad de la celulosa.

En una realización, el tratamiento físico y/o químico puede consistir en un tratamiento químico que comprende el uso de un tratamiento alcalino (por ejemplo, amonio).

En una realización, el pretratamiento es un pretratamiento con amoníaco anhidro.

En una realización específica, el pretratamiento puede ser un pretratamiento de amoníaco anhidro que comprende las etapas consistentes en 1) disponer material de biomasa lignocelulósica (por ejemplo, rastrojo de maíz) en un recipiente que se evacúa a presión para permitir una mejor penetración del amoníaco anhidro; b) el contacto del material de biomasa con una solución acuosa que comprende un 12% de amoníaco se lleva a cabo a 140 °C; c) el pretratamiento con amoníaco puede durar hasta 25 h, pero puede observarse una liberación óptima de glucosa y xilosa después de un período de tiempo más corto (por ejemplo, 15 minutos); d) retirar la solución de amoníaco adicional aplicando un vacío para alcanzar un contenido final de sólidos de un 50-60% de materia seca.

Alternativamente, el tratamiento fisicoquímico puede ser el método de pretratamiento que utiliza amoníaco (por ejemplo, amoníaco diluido) descrito en los documentos WO 2006/110891, WO 2006/11899, WO 2006/11900 y WO2006/110901 (DuPont).

En una realización, la biomasa pretratada consiste en rastrojo de maíz pretratado con amonio diluido (DaCS).

En una realización, el pretratamiento consiste en una deslignificación cáustica.

En una realización, el pretratamiento puede ser un pretratamiento de deslignificación cáustica que comprende las etapas consistentes en 1) tratar la biomasa con entre un 0,5 y un 3% de base nucleófila (por ejemplo, hidróxido de sodio (NaOH), hidróxido de litio, hidróxido de potasio, hidróxido de cesio, hidróxido de magnesio o combinaciones de los mismos) durante entre 0,25 y 20 h, a una temperatura entre 25-200 °C y con un pH en el intervalo de 9-11; 2) recuperar la filtración de biomasa pretratada y lavar con agua desionizada para eliminar cualquier exceso de álcali y subproductos disueltos.

En una realización específica, el pretratamiento puede ser un pretratamiento de deslignificación cáustica que comprende las etapas consistentes en 1) tratar la biomasa con entre un 0,5 y un 3% de hidróxido de sodio (NaOH) durante entre 0,25 y 1,5 h, a aproximadamente 121 °C y con un pH en el intervalo de 9-11; 2) recuperar la filtración de biomasa pretratada y lavar con agua desionizada para eliminar cualquier exceso de álcali y subproductos disueltos.

En Xu et al (2011) Bioresources 6(1) 707-720 se describe una forma de llevar a cabo la deslignificación cáustica. En una realización, la biomasa pretratada puede ser una biomasa tratada mediante el proceso de deslignificación cáustica descrito en Xu et al (2011) supra.

En una realización, la biomasa pretratada consiste en rastrojo de maíz deslignificado (DLcs, por sus siglas en inglés) de forma cáustica y/o pasto varilla deslignificado (DLswg, por sus siglas en inglés) de forma cáustica.

En una realización, el pretratamiento con sulfito o el proceso de reducción a pasta con sulfito comprende el tratamiento con sulfito del material de biomasa en condiciones ácidas seguido de reducción mecánica del tamaño usando refinado con disco. El pretratamiento con sulfito da como resultado la eliminación de una cantidad considerable de hemicelulosa, una disminución del DP de celulosa y la sulfonación de la lignina con un mayor carácter hidrófilo de la lignina.

Otro pretratamiento químico puede ser un pretratamiento oxidativo que se refiere a procesos con oxidantes usados para eliminar la lignina y la sustancia reductora. Los oxidantes empleados habitualmente para la deslignificación oxidativa comprenden ozono, peróxido de hidrógeno, oxígeno y ácidos peracéticos. Este tratamiento se puede combinar opcionalmente con otros tratamientos químicos o hidrotérmicos. Los mecanismos de degradación oxidativa de lignina varían en función de los oxidantes utilizados y las condiciones de reacción, como el pH. Para la ozonólisis, la oxidación en húmedo y deslignificación por perácidos, la degradación de las estructuras aromáticas y olefínicas implica un ataque electrófilo inicial mediante oxidantes, mientras que durante un pretratamiento alcalino-H²O² estas estructuras son destruidas por ataque nucleófilo de aniones de hidroperóxido.

En una realización, el tratamiento físico y/o químico es una oxidación en húmedo.

En una realización útil, la oxidación en húmedo es una que implica alta presión y/o alta temperatura con agua líquida y/o vapor, incluyendo opcionalmente la adición de ácidos, bases u otros productos químicos.

Una alta presión puede significar una presión en el intervalo de 300 a 600, preferiblemente de 400 a 500, tal como alrededor de 450 psi.

Una alta temperatura puede significar temperaturas en el intervalo de aproximadamente 100 a 300 °C, preferiblemente de aproximadamente 180 a 200 °C durante 5 a 15 minutos (Schmidt y Thomsen, 1998, Bioresource Technol. 64: 139­ 151). En una realización, la alta temperatura puede ser de aproximadamente 140 a 235 °C.

De manera adecuada, la explosión en húmedo es una modificación del método de pretratamiento de oxidación en húmedo, en donde se combinan la oxidación en húmedo y la explosión por vapor, tal como se describe más arriba. En explosión en húmedo, el agente oxidante se introduce durante el pretratamiento después de un cierto tiempo de permanencia. A continuación se finaliza el tratamiento rápidamente a presión atmosférica (WO 2006/032282).

Únicamente a modo de ejemplo, en una realización, el pretratamiento físico y/o químico puede implicar alta presión y/o alta temperatura con agua líquida, estando presente el agua como una mezcla de líquido y vapor, incluyendo opcionalmente la adición de ácidos, bases u otros productos químicos. La alta presión en esta realización puede estar en el intervalo de 50 a 300, adecuadamente de 100 a 200, por ejemplo alrededor de 150 psi. La alta temperatura en esta realización puede estar en el intervalo de aproximadamente 100 a 300 °C, adecuadamente de aproximadamente 170 a 220 °C, tal como de aproximadamente 170 a 200 °C.

Otro pretratamiento químico útil es el pretratamiento con organosolv, que deslignifica el material de biomasa celulósica mediante extracción usando etanol acuoso (por ejemplo, etanol al 40-60%) a 160-200 °C durante 30-60 minutos. Puede añadirse ácido sulfúrico como catalizador. En el pretratamiento con organosolv se puede eliminar la mayor parte de la hemicelulosa.

El pretratamiento a base de disolventes de celulosa es también un pretratamiento químico para el tratamiento de biomasa lignocelulósica a base de disolventes de celulosa, como ácido fosfórico (CPA) y los líquidos iónicos (IL).

Pretratamiento biológico

En una realización, la biomasa lignocelulósica puede ser sometida a un tratamiento biológico (por ejemplo, un pretratamiento biológico). Dicho tratamiento biológico puede ser cualquier tratamiento biológico conocido en la técnica.

En los pretratamientos biológicos se pueden utilizar microorganismos para el pretratamiento de la biomasa con el fin de aumentar la digestibilidad enzimática de los sólidos restantes. Los microorganismos empleados normalmente son capaces de degradar la lignina y polímeros de carbohidratos. Por ejemplo, algunos tipos de hongos pueden producir enzimas lignocelulolíticas, que trabajan de forma sinérgica para degradar la pared celular de las plantas, y otros tipos pueden producir peróxido de hidrógeno.

Después del pretratamiento biológico se puede aumentar el área superficial accesible, dando como resultado la mejora de la digestibilidad de la celulosa.

El pretratamiento biológico, únicamente a modo de ejemplo, puede incluir el tratamiento con un hongo de pudrición blanca. Se sabe que algunos hongos de pudrición blanca, como Phanerochaete chrysosporium, Ceriporiopsis subvermispora, Phlebia subserialis y Pleurotous ostreatus metabolizan eficientemente la lignina en una variedad de materiales lignocelulósicos (véase, por ejemplo, Singh D y Chen S. 2008. The white-rot fungus Phanerochaete chrysosporium: conditions for the production of lignin-degrading enzymes. Applied Microbiology Biotechnology 81,399­ 417).

El material celulósico también puede someterse a reducción del tamaño de partícula, remojo previo, humectación, lavado o acondicionamiento antes del pretratamiento (por ejemplo, antes del pretratamiento físico y/o químico y/o biológico) utilizando métodos conocidos en la técnica.

Enzima(s) predigestiva(s)

La biomasa lignocelulósica tratada (por ejemplo pretratada) física y/o química y/o biológicamente se trata (por ejemplo, se pretrata) adicionalmente con al menos una enzima glicosil hidrolasa predigestiva (designada en la presente memoria como enzima predigestiva) mezclada con la biomasa lignocelulósica tratada (por ejemplo pretratada) física y/o química y/o biológicamente antes de mezclar la biomasa lignocelulósica con al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento, utilizando dicha enzima predigestiva celulosa como un sustrato (por ejemplo, para hidrólisis).

Preferiblemente, la enzima predigestiva se incuba con la biomasa lignocelulósica.

Preferiblemente, la enzima predigestiva se incuba con la biomasa lignocelulósica durante un mínimo de 3 horas, preferiblemente al menos 4 horas, preferiblemente al menos 6 horas.

Preferiblemente, la enzima predigestiva se incuba con la biomasa lignocelulósica durante entre aproximadamente 3 horas y aproximadamente 120 horas, preferiblemente entre aproximadamente 4 horas y aproximadamente 90 horas, preferiblemente entre aproximadamente 6 horas y aproximadamente 48 horas.

Como apreciará un experto en la técnica, el tiempo de incubación depende de factores tales como la actividad enzimática, la concentración enzimática, la temperatura y similares. El objetivo del período de incubación consiste en permitir que las enzimas degraden la biomasa. La determinación de la cantidad de degradación de la biomasa puede ser realizada por un experto en la técnica, por ejemplo midiendo la cantidad de azúcares solubilizados (por ejemplo, unidades de azúcar monoméricas, por ejemplo, unidades de glucosa) producidos por hidrólisis.

En la presente invención, la(s) enzima(s) predigestiva(s) genera(n) preferiblemente oligómeros en la biomasa.

Preferiblemente, la biomasa lignocelulósica se incuba con la enzima predigestiva durante un período de tiempo adecuado para asegurar que la biomasa posterior a la incubación con la enzima predigestiva contenga al menos un 70%, adecuadamente al menos un 60%, adecuadamente al menos un 50%, de las unidades de azúcar de la biomasa tratada (por ejemplo, unidades de glucosa) presentes como oligómeros o polímeros (preferiblemente oligómeros) que pueden ser liberados en el tracto gastrointestinal de un animal por la enzima en alimento.

En una realización, preferiblemente la enzima predigestiva se añade a la biomasa lignocelulósica antes de secarla. Preferiblemente, la biomasa lignocelulósica tratada con la enzima predigestiva se seca antes de mezclarla con al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento.

En una realización, preferiblemente la enzima predigestiva se añade a la biomasa lignocelulósica antes de formar una barrera física (por ejemplo, encapsular) la biomasa. En una realización, la biomasa lignocelulósica tratada con la enzima predigestiva se separa físicamente de la al menos una enzima en alimento.

Preferiblemente, la enzima predigestiva según la presente invención no es activa en el tracto gastrointestinal del animal y/o se inactiva inmediatamente al entrar en el tracto gastrointestinal del animal (por ejemplo, por el pH del estómago).

De manera adecuada, la enzima al menos predigestiva puede consistir en una mezcla de más de una enzima, preferiblemente más de dos enzimas.

En otra realización, la enzima digestiva puede comprender o consistir esencialmente en (o consistir en) una enzima formadora de oligómeros de carbohidratos.

Una enzima predigestiva según la presente invención puede comprender (o consistir esencialmente en, o consistir en) cualquier actividad de despolimerización de lignocelulosa.

En una realización, la enzima predigestiva puede comprender (o consistir esencialmente en, o consistir en) al menos una de las siguientes actividades enzimáticas: actividad de celulasa y actividad de hemicelulasa. En una realización preferida, la enzima predigestiva puede comprender (o consistir esencialmente en, o consistir en) al menos las siguientes actividades enzimáticas: actividad de celulasa y actividad de hemicelulasa.

En otra realización, la enzima predigestiva puede comprender (o consistir esencialmente en, o consistir en) al menos una de las siguientes actividades enzimáticas: actividad de endoglucanasa, actividad de endoxilanasa o actividad de p-glucosidasa. En una realización preferida, la enzima predigestiva puede comprender (o consistir esencialmente en, o consistir en) al menos las siguientes actividades enzimáticas: actividad de endoglucanasa, actividad de endoxilanasa o actividad de p-glucosidasa.

En algunas realizaciones, la enzima predigestiva puede comprender además (o consistir esencialmente en, o consistir en) una de las siguientes actividades enzimáticas, o ambas: actividad de exoglucosidasa y actividad de polisacárido monooxigenasa lítica.

En una realización está previsto que el método de la presente invención comprenda además una etapa de mezcla de un componente alimentario con la composición de aditivo alimentario, por ejemplo, para proporcionar así un alimento o pienso.

La presente invención se refiere a usos para mejorar las características biofísicas de un animal mediante la administración a un animal de una cantidad eficaz de una composición de aditivo alimentario según la presente invención, o de una composición de aditivo alimentario producida mediante un método de la presente invención, o de un pienso que comprende dicha composición de aditivo alimentario.

La expresión "características biofísicas", tal como se usa en la presente memoria, significa una o más del grupo seleccionado entre lo siguiente: rendimiento de un animal, comportamiento de crecimiento de un animal, índice de transformación de alimentos (FCR), capacidad para digerir una materia prima (por ejemplo digestibilidad de nutrientes, incluyendo digestibilidad de almidón, grasa, proteínas, fibra), retención de nitrógeno, rendimiento de canal, tasa de crecimiento, aumento de peso, peso corporal, masa, eficiencia alimenticia, porcentaje de grasa corporal, distribución de grasa corporal, crecimiento, tamaño de los huevos, peso de los huevos, masa de los huevos, tasa de puesta de huevos, e impacto medioambiental, por ejemplo producción de estiércol y/o excreción de nitrógeno.

El término "mejorar", tal como se usa en la presente memoria, significa mejorado en comparación con la alimentación del animal con la biomasa lignocelulósica que no ha sido tratada de acuerdo con la presente invención.

En la presente memoria se describe un método para mejorar las características biofísicas de un animal administrando a un animal una cantidad eficaz de una composición de aditivo alimentario según la presente invención o una composición de aditivo alimentario producida mediante un método de la presente invención o un pienso que comprende dicha composición de aditivo alimentario, en el que las características biofísicas de un animal se mejoran en comparación con el uso equivalente de biomasa lignocelulósica que no ha sido tratada de acuerdo con la presente invención.

En algunas realizaciones, la(s) enzima(s) en alimento se puede(n) dosificar en el intervalo de aproximadamente 2,5 g - 5 kg de proteína activa por tonelada de biomasa pretratada, de forma adecuada aproximadamente 5 g - 1 kg de proteína activa por tonelada de biomasa tratada.

Únicamente a modo de ejemplo, asumiendo una inclusión de un 5-60% de biomasa por tonelada métrica (TM) de alimento, la proteína activa por TM de alimento sería 0,125 g - 3 kg por TM de alimento.

En una realización, la cantidad de enzima(s) en alimento en el alimento puede estar entre aproximadamente 0,125 g y aproximadamente 3 kg (de forma adecuada de aproximadamente 100 g a aproximadamente 2,5 kg, de forma adecuada de aproximadamente 500 g a aproximadamente 2 kg) por TM de alimento.

Está previsto que la cantidad de biomasa tratada en el pienso se pueda variar. En una realización, la cantidad de biomasa tratada en el alimento es inferior a un 90% p/p del alimento total, preferiblemente inferior a un 80%, adecuadamente inferior a un 70%, adecuadamente inferior a un 60%, adecuadamente inferior a un 50%, adecuadamente inferior a un 40%. Preferiblemente, la cantidad de biomasa tratada en el pienso es inferior a un 60%.

En una realización, la cantidad de biomasa tratada en la alimentación es superior a un 30% p/p del pienso total. En una realización, la cantidad de biomasa tratada en la alimentación es preferiblemente superior a un 5%, preferiblemente superior a un 10%, preferiblemente superior a un 20%, preferiblemente superior a un 30%, preferiblemente superior a un 40%, adecuadamente superior a un 50%, adecuadamente superior a un 60% p/p. En una realización, la cantidad de biomasa tratada en el pienso es superior a un 5% o un 10%. En una realización, la biomasa tratada puede ser de al menos un 60% p/p del pienso total.

En otra realización, la cantidad de biomasa tratada en la alimentación está en el intervalo de aproximadamente un 5-70%, adecuadamente en el intervalo de aproximadamente un 5-60%, adecuadamente un 5-50%, adecuadamente un 10-40% p/p del pienso total.

En otra realización, la cantidad de biomasa tratada en la alimentación está en el intervalo de un 10-70%.

En otra realización, la cantidad de biomasa tratada en la alimentación está en el intervalo de un 10-40%.

En una realización, el término "mezclar", tal como se usa en la presente memoria, incluye cualquier método para realizar una mezcla, como mezclar, combinar, pulverizar, etc.).

En una realización, la al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento puede estar en una formulación de enzima seca (por ejemplo, en forma de gránulos o en un vehículo (tal como un vehículo de trigo)) antes de mezclarla con la sustancia biomasa pretratada física y/o química y/o biológicamente. En otra realización, la al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento puede estar en una formulación líquida antes de mezclarla con la biomasa pretratada física y/o química y/o biológicamente.

Cuando la enzima está en una formulación líquida antes de mezclarla con la biomasa pretratada física y/o química y/o biológicamente, la enzima se puede mezclar pulverizando la formulación enzimática o sumergiendo la biomasa en la formulación enzimática, por ejemplo.

Preferiblemente, en el momento en que la al menos una enzima en alimento se mezcla con la biomasa pretratada física y/o química y/o biológicamente, la biomasa es seca y/o es sólida.

La biomasa pretratada física y/o química y/o biológicamente (antes o después del tratamiento enzimático) se puede moler y/o pulverizar y/o se puede formar una harina a partir de la misma.

Animal

El término "animal", tal como se usa en la presente memoria, significa un animal al que se le ha de administrar o al que se le ha administrado una composición de aditivo alimentario según la presente invención o un pienso que comprende dicha composición de aditivo alimentario según la presente invención.

Preferiblemente, el animal es un mamífero, un animal rumiante, un animal no rumiante, un pez o un crustáceo, incluyendo, por ejemplo, ganado o un animal domesticado (por ejemplo, una mascota).

En una realización, el "animal" es ganado.

El término "ganado", tal como se usa en la presente memoria, se refiere a cualquier animal de granja. Preferiblemente, el ganado consiste en uno o más de los siguientes: vacas o toros (incluyendo terneros), cerdos (incluyendo lechones, puercos), aves de corral (incluyendo pollos de engorde, pollos, ponedoras y pavos), aves, peces (incluyendo peces de agua dulce, como salmón, bacalao, truchas y carpas, por ejemplo, carpas comunes, y peces marinos, como la lubina), crustáceos (como camarones, mejillones y vieiras), caballos (incluyendo caballos de carreras), ovejas (incluyendo corderos).

En otra realización, el "animal" es un animal doméstico o una mascota o un animal mantenido en un entorno zoológico.

La expresión "animal domesticado o mascota o animal mantenido en un entorno zoológico", tal como se usa en la presente memoria, se refiere a cualquier animal relevante, incluyendo cánidos (por ejemplo, perros), felinos (por ejemplo, gatos), roedores (por ejemplo, cobayas, ratas, ratones), aves, peces (incluyendo peces de agua dulce y peces marinos) y caballos.

En una realización, el animal es un animal no rumiante. En una realización preferida, los animales no rumiantes pueden ser aves de corral o cerdos (o una combinación de los mismos).

En otra realización, el animal es un animal rumiante.

Envase

En una realización, la composición de aditivo alimentario y/o la premezcla y/o el alimento o pienso según la presente invención se envasan.

En una realización preferida, la composición de aditivo alimentario y/o la premezcla y/o el alimento o pienso se envasan en una bolsa, tal como una bolsa de papel.

En una realización alternativa, la composición de aditivo alimentario y/o la premezcla y/o el alimento o pienso se pueden cerrar herméticamente en un recipiente. Se puede utilizar cualquier recipiente adecuado.

Alimento

La composición de aditivo alimentario de la presente invención se puede utilizar como un alimento o en la preparación del mismo.

El término "alimento" se utiliza en la presente memoria como sinónimo de "pienso".

El alimento puede estar en forma de una solución o un sólido, según el uso y/o el modo de aplicación y/o el modo de administración.

Cuando se utiliza como un alimento (tal como un alimento funcional) o en la preparación del mismo, la composición de la presente invención se puede usar junto con uno o más de: un vehículo nutricionalmente aceptable, un diluyente nutricionalmente aceptable, un excipiente nutricionalmente aceptable, un adyuvante nutricionalmente aceptable, un ingrediente nutricionalmente activo.

En una realización preferida, la composición de aditivo alimentario de la presente invención se mezcla con un componente alimentario para formar un pienso.

La expresión "componente alimentario", tal como se usa en la presente memoria, significa todo o parte del pienso. Parte del pienso puede significar un constituyente del pienso o más de un constituyente del pienso, por ejemplo, 2 o 3 o 4. En una realización, la expresión "componente alimentario" abarca una premezcla o constituyentes de premezcla. Preferiblemente, el alimento puede ser un forraje o una premezcla del mismo, un alimento compuesto o una premezcla del mismo. En una realización, la composición de aditivo alimentario según la presente invención se puede mezclar con un alimento compuesto, un componente de alimento compuesto o para formar una premezcla de un alimento compuesto o para formar un forraje, un componente de forraje o una premezcla de un forraje.

El término forraje, tal como se usa en la presente memoria, significa cualquier alimento que se le proporcione a un animal (en lugar de que el animal tenga que buscarlo por sí mismo). El forraje incluye plantas que se han cortado. El término forraje incluye heno, paja, ensilado, piensos comprimidos y aglomerados, aceites y raciones mixtas, así como granos y legumbres germinados.

El forraje se puede obtener de una o más de las plantas seleccionadas entre: alfalfa (mielga), cebada, loto de los prados, Brassicas, Chau moellier, col rizada, colza (canola), colinabo (nabo sueco), nabo, trébol, trébol híbrido, trébol rojo, trébol subterráneo, trébol blanco, hierba, hierba de avena falsa, festuca, césped Bermuda, bromo, hierba de brezo, poa de los prados (césped de pastizal mezclado naturalmente, hierba de huerto, ballico, hierba Timothy, maíz, mijo, avena, sorgo, soja, árboles (brotes de árboles desmochados para heno de árbol), trigo y legumbres.

La expresión "alimento compuesto" significa un alimento comercial en forma de una harina, un aglomerado, nueces, torta o migajas. Los alimentos compuestos se pueden mezclar a partir de diversas materias primas y aditivos. Estas mezclas se formulan de acuerdo con los requisitos específicos del animal de destino.

Los alimentos compuestos pueden ser alimentos completos que aporten todos los nutrientes necesarios a diario, concentrados que aporten una parte de la ración (proteína, energía) o suplementos que solo aporten micronutrientes adicionales, como minerales y vitaminas.

Los principales ingredientes utilizados en los alimentos compuestos son los cereales forrajeros, que incluyen maíz, trigo, centeno, soja, sorgo, avena y cebada.

De forma adecuada, una premezcla, tal como se menciona en la presente memoria, puede ser una composición compuesta por microingredientes tales como vitaminas, minerales, conservantes químicos, antibióticos, productos de fermentación y otros ingredientes esenciales. Las premezclas son habitualmente composiciones adecuadas para mezclar en raciones comerciales.

Cualquier pienso de la presente invención puede comprender uno o más materiales alimentarios seleccionados entre el grupo que comprende a) cereales, tales como granos pequeños (por ejemplo trigo, cebada, centeno, avena y combinaciones de los mismos) y/o granos grandes, como maíz o sorgo; b) subproductos de plantas, como Solubles de Residuos Desecados de Destilería (DDGS), salvado de trigo, harinilla de trigo, subproductos de molienda de trigo, salvado de arroz, cascarilla de arroz, cascarilla de avena, nuez de palma, pulpa de cítricos, fibra de maíz, harina de germen de maíz, salvado de maíz, alimento de maíz molido, alimento de gluten de maíz, harina de gluten, subproductos de molienda de trigo, harinilla de trigo, o combinaciones de los mismos; c) proteína obtenida de fuentes tales como soja, girasol, cacahuete, altramuz, guisantes, habas, algodón, canola, harina de pescado, proteína de plasma seca, harina de carne y huesos, proteína de patata, suero de leche, copra, sésamo; d) aceites y grasas obtenidos de fuentes vegetales y animales; e) minerales y vitaminas.

Un pienso de la presente invención puede contener al menos un 30%, al menos un 40%, al menos un 50% o al menos un 60% en peso de harina de maíz y soja, o maíz y soja entera, o harina de trigo o harina de girasol.

Adicional o alternativamente, un pienso de la presente invención puede comprender al menos un material alimentario con alto contenido de fibra y/o al menos un subproducto del al menos un material alimentario con alto contenido de fibra para proporcionar un pienso con alto contenido de fibra. Algunos ejemplos de materiales alimentarios con alto contenido de fibra incluyen: trigo, cebada, centeno, avena, subproductos de plantas (por ejemplo cereales), tales como Solubles de Residuos Desecados de Destilería (DDGS), salvado de trigo, harinilla de trigo, subproductos de molienda de trigo, salvado de arroz, cascarillas de arroz, cascarillas de avena, nuez de palma, pulpa de cítricos, fibra de maíz, harina de germen de maíz, salvado de maíz, alimento de maíz molido, alimento de gluten de maíz, harina de gluten, subproductos de molienda de trigo, harinilla de trigo o combinaciones de los mismos. Algunas fuentes de proteínas también pueden considerarse ricas en fibra: proteína obtenida de fuentes como el girasol, el altramuz, las habas y el algodón.

En la presente invención, el alimento puede ser uno o más de los siguientes: un alimento compuesto y una premezcla, incluyendo aglomerados, nueces o tortas (de ganado); un cultivo o residuo de cultivo: maíz, soja, sorgo, avena, cebada, rastrojo de maíz, copra, paja, cascabillo, desechos de remolacha azucarera; harina de pescado; pasto recién cortado y otras plantas forrajeras; harina de carne y huesos; melaza; torta de aceite y torta prensada; oligosacáridos; plantas forrajeras conservadas: heno y ensilado; algas marinas; semillas y granos, enteros o preparados por trituración, molienda, etc.; granos y legumbres germinados; extracto de levadura.

El término "alimento" en la presente invención también abarca en algunas realizaciones comidas para mascotas. Un alimento para mascotas consiste en material vegetal o animal destinado al consumo de mascotas, como comida para perros o comida para gatos. La comida para mascotas, como la comida para perros y gatos, puede estar en forma seca, como croquetas para perros, o en forma húmeda enlatada. La comida para gatos puede contener el aminoácido taurina.

El término "alimento" en la presente invención también abarca en algunas realizaciones comida para peces. Una comida para peces normalmente contiene macronutrientes, oligoelementos y vitaminas necesarios para mantener una buena salud de los peces cautivos. La comida para peces puede presentarse en forma de escamas, aglomerados o tabletas. Las formas aglomeradas, algunas de las cuales se hunden rápidamente, se utilizan a menudo para peces más grandes o especies que se alimentan en el fondo. Algunas comidas para peces también contienen aditivos, como betacaroteno u hormonas sexuales, para realzar artificialmente el color de los peces ornamentales.

El término "alimento" en la presente invención también abarca en alguna realización comida para pájaros. La comida para pájaros incluye comida que se utiliza tanto en comederos para pájaros como para alimentar a aves de compañía. Normalmente, la comida para pájaros comprende una variedad de semillas, pero también puede incluir sebo (grasa de vaca o de oveja).

Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "poner en contacto" se refiere a la aplicación indirecta o directa de la composición de la presente invención al producto (por ejemplo, el alimento). Los ejemplos de los métodos de aplicación que se pueden usar incluyen, pero no se limitan a, tratar el producto en un material que comprende la composición de aditivo alimentario, la aplicación directa mezclando la composición de aditivo alimentario con el producto, pulverizar la composición de aditivo alimentario sobre la superficie del producto o sumergir el producto en una preparación de la composición de aditivo alimentario.

En una realización, la composición de aditivo alimentario de la presente invención se mezcla preferiblemente con el producto (por ejemplo, pienso). Alternativamente, la composición de aditivo alimentario se puede incluir en la emulsión o en los ingredientes sin elaborar de un pienso.

Para algunas aplicaciones es importante que la composición esté disponible sobre o en la superficie de un producto en el que se ha de influir/que ha de ser tratado. Esto permite que la composición imparta una o más de las siguientes características favorables: características biofísicas, por ejemplo seleccionándose la característica biofísica entre el grupo que consiste en una o más de las siguientes: rendimiento de un animal, comportamiento de crecimiento de un animal, índice de transformación de alimentos (FCR), capacidad para digerir una materia prima (por ejemplo digestibilidad de nutrientes, incluyendo digestibilidad de almidón, grasa, proteínas, fibra), retención de nitrógeno, rendimiento de canal, tasa de crecimiento, aumento de peso, peso corporal, masa, eficiencia alimenticia, porcentaje de grasa corporal, distribución de grasa corporal, crecimiento, tamaño de los huevos, peso de los huevos, masa de los huevos, tasa de puesta de huevos, e impacto medioambiental, por ejemplo producción de estiércol y/o excreción de nitrógeno.

Las composiciones de aditivos para piensos de la presente invención se pueden aplicar para intercalar, revestir y/o impregnar un producto (por ejemplo, pienso o ingredientes sin elaborar de un pienso) con una cantidad controlada de enzima(s).

Preferiblemente, la biomasa lignocelulósica tratada física y/o química y/o biológicamente y al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento se usan simultáneamente (por ejemplo, cuando están mezcladas entre sí o cuando se administran por diferentes vías). En una realización se aplican simultáneamente biomasa lignocelulósica tratada física y/o química y/o biológicamente y al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento. Preferiblemente, la biomasa lignocelulósica tratada física y/o química y/o biológicamente y al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento se mezclan antes de ser suministradas a un pienso o a un ingrediente sin elaborar de un pienso.

Preferiblemente, la composición de aditivo alimentario de la presente invención será térmicamente estable al tratamiento térmico hasta aproximadamente 70 °C; hasta aproximadamente 85 °C; o hasta aproximadamente 95 °C. El tratamiento térmico se puede realizar durante aproximadamente 1 minuto; hasta aproximadamente 5 minutos; hasta aproximadamente 10 minutos; hasta aproximadamente 30 minutos; hasta aproximadamente 60 minutos. La expresión "térmicamente estable" significa que al menos aproximadamente un 75% de los componentes enzimáticos que estaban presentes/activos en el aditivo antes de calentarlo a la temperatura especificada todavía están presentes/activos después de que el mismo se enfríe a temperatura ambiente. Preferiblemente, al menos aproximadamente un 80% de los componentes enzimáticos que estaban presentes y activos en el aditivo antes de calentarlo a la temperatura especificada todavía están presentes y activos después de que el mismo se enfríe a temperatura ambiente.

En una realización particularmente preferida, la composición de aditivo alimentario se homogeneiza para producir un polvo.

En una realización preferida alternativa, la composición de aditivo alimentario se formula en gránulos tal como se describe en el documento WO2007/044968 (designados como gránulos de TPT).

En otra realización preferida, cuando la composición de aditivo alimentario se formula en gránulos, los gránulos comprenden una sal de barrera hidratada que reviste el núcleo de proteína. La ventaja de dicho revestimiento de sal consiste en una mejor tolerancia térmica, una estabilidad de almacenamiento mejorada y una protección contra otros aditivos alimentarios que de otro modo tendrían un efecto negativo sobre la enzima.

Preferiblemente, la sal utilizada para el revestimiento de sal tiene una actividad de agua superior a 0,25 o una humedad constante superior a un 60% a 20 °C.

Preferiblemente, el revestimiento de sal comprende un Na2SO4.

El método de preparación de una composición de aditivo alimentario también puede comprender la etapa adicional de aglomerar el polvo. El polvo se puede mezclar con otros componentes conocidos en la técnica. El polvo, o la mezcla que comprende el polvo, puede pasar de forma forzada a través de una matriz y las hebras resultantes se cortan en aglomerados adecuados de longitud variable.

Opcionalmente, la etapa de aglomeración puede incluir un tratamiento con vapor, o una etapa de acondicionamiento, antes de la formación de los aglomerados. La mezcla que comprende el polvo se puede disponer en un acondicionador, por ejemplo una mezcladora con inyección de vapor. La mezcla se calienta en el acondicionador hasta una temperatura especificada, por ejemplo de 60-100 °C, las temperaturas típicas serían de 70 °C, 80 °C, 85 °C, 90 °C o 95 °C. El tiempo de permanencia puede variar de segundos a minutos e incluso horas. Por ejemplo, 5 segundos, 10 segundos, 15 segundos, 30 segundos, 1 minuto, 2 minutos, 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 30 minutos y 1 hora.

Se entenderá que la composición de aditivo alimentario de la presente invención es adecuada para la adición a cualquier material de alimentación apropiado.

Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "material de alimentación" se refiere al material de alimentación básico que debe consumir un animal. Se entenderá además que esto puede comprender, por ejemplo, al menos uno o más granos sin procesar, y/o material vegetal y/o animal procesado, como harina de soja o harina de huesos.

Tal como se usa en la presente memoria, el término "pienso" se refiere a un material alimentario al que se le han añadido una o más composiciones de aditivo alimentario.

El experto en la materia entenderá que diferentes animales requieren diferentes piensos, e incluso el mismo animal puede requerir diferentes piensos, dependiendo del propósito para el que se críe el animal.

Preferiblemente, el pienso puede comprender materiales alimentarios que comprenden maíz, trigo, cebada, triticale, centeno, arroz, tapioca, sorgo y/o cualquiera de los subproductos, así como componentes ricos en proteínas como harina de soja, harina de colza, harina de canola, harina de semillas de algodón, harina de semillas de girasol, harinas de subproductos animales y mezclas de las mismas. Más preferiblemente, el pienso puede comprender grasas animales y/o aceites vegetales.

Opcionalmente, el pienso también puede contener minerales adicionales tales como, por ejemplo, calcio y/o vitaminas adicionales.

Preferiblemente, el pienso consiste en una mezcla de harina de maíz y soja.

En otro aspecto se proporciona un método para producir un pienso. El pienso se produce normalmente en fábricas de piensos en las que las materias primas se muelen primero hasta un tamaño de partícula adecuado y luego se mezclan con aditivos adecuados. A continuación, el pienso se puede producir como una pasta o aglomerados; los últimos normalmente implican un método mediante el cual la temperatura se eleva a un nivel objetivo y luego el alimento se pasa a través de una matriz para producir aglomerados de un tamaño particular. Después se deja que los aglomerados se enfríen. Posteriormente se pueden añadir aditivos líquidos como grasas y enzimas. La producción de pienso también puede implicar una etapa adicional que incluye extrusión o expansión antes de la aglomeración, en particular mediante técnicas adecuadas que pueden incluir al menos el uso de vapor.

El pienso puede ser un pienso para un animal no rumiante, como aves de corral (por ejemplo, pollos de engorde, ponedoras, reproductoras de pollos de engorde, pavos, patos, gansos, aves acuáticas), cerdos (todas las categorías de edad), una mascota (por ejemplo, perros, gatos) o peces, preferiblemente el pienso es para aves de corral.

Únicamente a modo de ejemplo, un pienso para pollos, por ejemplo, pollos de engorde, puede estar compuesto por uno o más de los ingredientes enumerados en la siguiente tabla, por ejemplo en los porcentajes indicados en la siguiente tabla:

Únicamente a modo de ejemplo, la especificación de la dieta para pollos, tales como pollos de engorde, puede ser la que se establece en la siguiente tabla:

Únicamente a modo de ejemplo, un pienso para gallinas ponedoras puede estar compuesto por uno o más de los ingredientes enumerados en la siguiente tabla, por ejemplo en los porcentajes indicados en la siguiente tabla:

Únicamente a modo de ejemplo, la especificación de la dieta para las gallinas ponedoras puede ser la que se establece en la siguiente tabla:

Únicamente a modo de ejemplo, un pienso para pavos puede estar compuesto por uno o más de los ingredientes enumerados en la siguiente tabla, por ejemplo en los porcentajes indicados en la siguiente tabla:

Únicamente a modo de ejemplo, la especificación de la dieta para pavos puede ser la que se establece en la siguiente tabla:

Únicamente a modo de ejemplo, un pienso para lechones puede estar compuesto por uno o más de los ingredientes enumerados en la siguiente tabla, por ejemplo en los porcentajes indicados en la siguiente tabla:

Únicamente a modo de ejemplo, la especificación de la dieta para lechones puede ser la que se establece en la siguiente tabla:

Únicamente a modo de ejemplo, un pienso para cerdos de engorde/de cebo puede estar compuesto por uno o más de los ingredientes enumerados en la siguiente tabla, por ejemplo en los porcentajes indicados en la siguiente tabla:

Únicamente a modo de ejemplo, la especificación de la dieta para cerdos de engorde/de cebo puede ser la que se establece en la siguiente tabla:

Formas

La composición de aditivo alimentario de la presente invención y otros componentes y/o el pienso que los comprende se pueden usar en cualquier forma adecuada.

La composición de aditivo alimentario de la presente invención se puede utilizar en forma de preparaciones sólidas o líquidas, o formas alternativas de las mismas. Los ejemplos de preparaciones sólidas incluyen polvos, pastas, bolos, cápsulas, aglomerados, tabletas, polvos y gránulos que pueden humedecerse, secarse por pulverización o liofilizarse. Los ejemplos de preparaciones líquidas incluyen, pero no se limitan a, soluciones, suspensiones y emulsiones acuosas, orgánicas o acuoso-orgánicas.

En algunas aplicaciones, la composición de aditivo alimentario de la presente invención se puede mezclar con alimento o administrar en el agua potable.

Algunos ejemplos adecuados de formas incluyen una o más de: polvos, pastas, bolos, aglomerados, tabletas, píldoras, cápsulas, óvulos, soluciones o suspensiones, que pueden contener agentes aromatizantes o colorantes, para administraciones de liberación inmediata, retardada, modificada, sostenida, pulsada o controlada.

A modo de ejemplo, si la composición de la presente invención se usa en forma sólida, por ejemplo aglomerada, también puede contener uno o más de: excipientes tales como celulosa microcristalina, lactosa, citrato de sodio, carbonato de calcio, fosfato de calcio dibásico y glicina; desintegrantes tales como almidón (preferiblemente almidón de maíz, patata o tapioca), almidón glicolato de sodio, croscarmelosa de sodio y ciertos silicatos complejos; aglutinantes de granulación tales como polivinilpirrolidona, hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC), hidroxipropilcelulosa (HPC), sacarosa, gelatina y goma arábiga; se pueden incluir agentes lubricantes tales como estearato de magnesio, ácido esteárico, behenato de glicerilo y talco.

Los ejemplos de vehículos nutricionalmente aceptables para su uso en la preparación de las formas incluyen, por ejemplo, agua, soluciones salinas, alcohol, silicona, ceras, vaselina, aceites vegetales, polietilenglicoles, propilenglicol, liposomas, azúcares, gelatina, lactosa, amilosa, estearato de magnesio, talco, tensioactivos, ácido silícico, parafina viscosa, aceite de perfume, monoglicéridos y diglicéridos de ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos petroetrales, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona y similares.

Los excipientes preferidos para las formas incluyen lactosa, almidón, una celulosa, azúcar de leche o polietilenglicoles de alto peso molecular.

Para suspensiones acuosas y/o elixires, la composición de la presente invención se puede combinar con diversos agentes edulcorantes o aromatizantes, colorantes o tintes, con agentes emulsionantes y/o de suspensión y con diluyentes como agua, propilenglicol y glicerina, y combinaciones de los mismos.

Combinación con otros componentes

La composición de aditivo alimentario, o ingrediente alimentario, o alimento o pienso o premezcla de la presente invención se puede usar en combinación con otros componentes.

La combinación de la composición de aditivo alimentario de la presente invención, o ingrediente alimentario, o alimento o pienso o premezcla de la presente invención y otro componente que es adecuado para el consumo animal y es capaz de proporcionar un beneficio médico o fisiológico al consumidor.

En una realización, el "otro componente" puede consistir en una o más enzimas.

Las enzimas adicionales adecuadas para su uso en la presente invención pueden ser una o más de las enzimas seleccionadas entre el grupo que consiste en: endoglucanasas (E.C. 3.2.1.4); celiobiohidrolasas (E.C. 3.2.1.91), p -glucosidasas (E.C. 3.2.1.21), celulasas (E.C. 3.2.1.74), liquenasas (E.C. 3.1.1.73), lipasas (E.C. 3.1.1.3), lípido aciltransferasas (generalmente clasificadas como E.C. 2.3.1.x), fosfolipasas (E.C. 3.1.1.4, E.C. 3.1.1.32 o E.C. 3.1.1.5), fitasas (por ejemplo, 6-fitasa (E.C. 3.1.3.26) o una 3-fitasa (E.C. 3.1.3.8), alfa-amilasas (E.C. 3.2.1.1), xilanasas (E.C.

3.2.1.8, E.C. 3.2.1.32, E.C. 3.2.1.37, E.C. 3.1.1.72, E.C. 3.1.1.73), glucoamilasas (E.C. 3.2.1.3), proteasas (por ejemplo, subtilisina (E.C. 3.4.21.62) o una bacilolisina (E.C. 3.4.24.28) o una serina proteasa alcalina (E.C. 3.4.21.x) o una queratinasa (E.C. 3.4.x.x)) y/o mananasas (por ejemplo, p -mananasa (E.C. 3.2.1.78)).

En una realización (en particular para aplicaciones alimentarias), el otro componente puede consistir en una o más de las enzimas seleccionadas del grupo que consiste en xilanasas (E.C. 3.2.1.8, E.C. 3.2.1.32, E.C. 3.2.1.37, E.C.

3.1.1.72, E.C.3.1.1.73), una amilasa (incluyendo a -amilasas (E.C. 3.2.1.1), amilasas formadoras de G4 (E.C. 3.2.1.60), p -amilasas (E.C. 3.2.1.2) e Y-amilasas (E.C. 3.2.1.3); y/o una proteasa (por ejemplo, subtilisina (E.C. 3.4.21.62) o una bacilolisina (E.C. 3.4.24.28) o una serina proteasa alcalina (E.C. 3.4.21.x) o una queratinasa (EC 3.4.x.x)).

En una realización (en particular para aplicaciones alimentarias) el otro componente puede consistir en una combinación de una amilasa (por ejemplo, a -amilasas (E.C. 3.2.1.1)) y una proteasa (por ejemplo, subtilisina (E.C.

3.4.21.62)).

En una realización (en particular para aplicaciones alimentarias) el otro componente puede consistir en una pglucanasa, por ejemplo, una endo-1,3(4)-p-glucanasa (E.C. 3.2.1.6).

En una realización (en particular para aplicaciones alimentarias) el otro componente puede consistir en una mananasa (por ejemplo, una p-mananasa (E.C. 3.2.1.78)).

En una realización (en particular para aplicaciones alimentarias) el otro componente puede consistir en una lipasa lipasa (E.C. 3.1.1.3), una lípido aciltransferasa (generalmente clasificada como E.C. 2.3.1.x) o una fosfolipasa (E.C.

3.1.1.4, E.C. 3.1.1.32 o E.C. 3.1.1.5), adecuadamente una lipasa (E.C. 3.1.1.3).

En una realización (en particular para aplicaciones alimentarias) el otro componente puede consistir en una proteasa (por ejemplo, subtilisina (E.C. 3.4.21.62) o una bacilolisina (E.C. 3.4.24.28) o una serina proteasa alcalina (E.C.

3.4.21.x) o una queratinasa (E.C. 3.4.x.x)).

En una realización, el componente adicional puede consistir en un estabilizador o un emulsionante o un aglutinante o vehículo o un excipiente o un diluyente o un desintegrante.

El término "estabilizador", tal como se usa en la presente memoria, se define como un ingrediente o combinación de ingredientes que evita que un producto (por ejemplo, un producto alimentario) cambie con el paso del tiempo.

El término "emulsionante", tal como se usa en la presente memoria, se refiere a un ingrediente (por ejemplo, un ingrediente alimentario) que evita la separación de emulsiones. Las emulsiones son dos sustancias inmiscibles, una presente en forma de gotículas, contenida dentro de la otra. Las emulsiones pueden consistir en emulsiones de aceite en agua, en las que las gotículas o fase dispersa son aceite y la fase continua es agua; o en emulsiones de agua en aceite, en las que el agua se convierte en la fase dispersa y la fase continua es aceite. Las espumas, que son gas en líquido, y las suspensiones, que son sólido en líquido, también se pueden estabilizar mediante el uso de emulsionantes.

Tal como se usa en la presente memoria, el término "aglutinante" se refiere a un ingrediente (por ejemplo, un ingrediente alimentario) que aglutina el producto a través de una reacción física o química. Durante la "gelificación", por ejemplo, se absorbe agua, lo que proporciona un efecto aglutinante. Sin embargo, los aglutinantes pueden absorber otros líquidos, como aceites, manteniéndolos dentro del producto. En el contexto de la presente invención, los aglutinantes se utilizarían normalmente en productos sólidos o con poca humedad, por ejemplo, productos de panadería: pasteles, rosquillas, pan y otros. Los ejemplos de aglutinantes de granulación incluyen uno o más de: polivinilpirrolidona, hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC), hidroxipropilcelulosa (HPC), sacarosa, maltosa, gelatina y goma arábiga.

"Vehículos" significa materiales adecuados para la administración de la enzima e incluyen cualquier material conocido en la técnica tal como, por ejemplo, cualquier líquido, gel, disolvente, diluyente líquido, solubilizante o similares, que no sea tóxico y que no interactúe con ningún componente de la composición de una manera perjudicial.

En la presente memoria se describe un método para preparar una composición (por ejemplo, una composición de aditivo alimentario) que comprende mezclar el aditivo alimentario de la presente invención (y preferiblemente maíz o un subproducto de maíz) con al menos un vehículo fisiológicamente aceptable seleccionado entre al menos uno de maltodextrina, caliza (carbonato de calcio), ciclodextrina, trigo o un componente de trigo, sacarosa, almidón, Na²SO⁴ , talco, PVA, sorbitol, benzoato, sorbiato, glicerol, sacarosa, propilenglicol, 1,3-propanodiol, glucosa, parabenos, cloruro de sodio, citrato, acetato, fosfato, calcio, metabisulfito, formiato y mezclas de los mismos.

Los ejemplos de "excipientes" incluyen uno o más de: celulosa microcristalina y otras celulosas, lactosa, citrato de sodio, carbonato de calcio, fosfato de calcio dibásico, glicina, almidón, azúcar de leche y polietilenglicoles de alto peso molecular.

Los ejemplos de "desintegrantes" incluyen uno o más de: almidón (preferiblemente almidón de maíz, patata o tapioca), almidón glicolato de sodio, croscarmelosa de sodio y ciertos silicatos complejos.

Los ejemplos de "diluyentes" incluyen uno o más de: agua, etanol, propilenglicol y glicerina, y combinaciones de los mismos.

Los otros componentes pueden usarse simultáneamente (por ejemplo, cuando están mezclados entre sí o incluso cuando se administran por diferentes vías) o secuencialmente (por ejemplo, pueden administrarse por diferentes vías) con respecto al aditivo alimentario de la presente invención.

Preferiblemente, en una realización, la composición de aditivo alimentario, o ingrediente alimentario, o alimento o pienso o premezcla según la presente invención no comprende cromo ni cromo orgánico.

Preferiblemente, en una realización, la composición de aditivo alimentario, o ingrediente alimentario, o alimento o pienso o premezcla de acuerdo con la presente invención no contiene ácido sórbico.

Características biofísicas

Tal como se usa en la presente memoria, "característica biofísica" significa cualquier propiedad biofísica de un animal que mejora su salud y/o rendimiento y/o potencia. A modo de ejemplo, la característica biofísica de interés puede ser una o más del grupo seleccionado entre: rendimiento del animal, comportamiento de crecimiento de un animal, índice de transformación de alimentos (FCR), capacidad para digerir una materia prima (por ejemplo digestibilidad de nutrientes, incluyendo digestibilidad de almidón, grasa, proteínas, fibra), retención de nitrógeno, rendimiento de canal, tasa de crecimiento, aumento de peso, peso corporal, masa, eficiencia alimenticia, porcentaje de grasa corporal, distribución de grasa corporal, crecimiento, tamaño de los huevos, peso de los huevos, masa de los huevos, tasa de puesta de huevos, e impacto medioambiental, por ejemplo producción de estiércol y/o excreción de nitrógeno.

En una realización, la característica biofísica del animal significa el rendimiento del animal.

Rendimiento

Tal como se usa en la presente memoria, el "rendimiento del animal" puede estar determinado por la eficiencia alimenticia y/o el aumento de peso del animal y/o por el índice de transformación de alimentos y/o por la digestibilidad de un nutriente en un alimento (por ejemplo, digestibilidad de aminoácidos) y/o energía digestible o energía metabolizable en un alimento y/o por la retención de nitrógeno.

Preferiblemente, el "rendimiento del animal" se determina por la eficiencia alimenticia y/o el aumento de peso del animal y/o por el índice de transformación de alimentos.

Por "rendimiento mejorado del animal" se entiende que existe una mayor eficiencia alimenticia y/o un mayor aumento de peso y/o un índice de transformación de alimentos reducido y/o una digestibilidad mejorada de los nutrientes o la energía en un alimento y/o una mejor retención de nitrógeno en el individuo resultante del uso de la composición de aditivo alimentario de la presente invención en comparación con la alimentación del animal con biomasa lignocelulósica que no ha sido tratada de acuerdo con la presente invención.

Preferiblemente, por "rendimiento mejorado del animal" se entiende que existe una mayor eficiencia alimenticia y/o un mayor aumento de peso y/o un índice de transformación de alimentos reducido.

Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "eficiencia alimenticia" se refiere a la magnitud del aumento de peso de un animal que se produce cuando el animal es alimentado ad libitum o con una cantidad específica de alimento durante un período de tiempo.

Por "mayor eficiencia alimenticia" se entiende que el uso de una composición de aditivo alimentario según la presente invención en alimento da como resultado un mayor aumento de peso por unidad de consumo de alimento en comparación con un animal alimentado con la biomasa lignocelulósica que no ha sido tratada según la presente invención.

Índice de transformación de alimentos (FCR)

Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "índice de transformación de alimentos" se refiere a la cantidad de alimento que se le da a un animal para aumentar el peso del animal en una magnitud específica.

Un índice de transformación de alimentos mejorado significa un índice de transformación de alimentos más bajo.

Por "índice de transformación de alimentos más bajo" o "índice de transformación de alimentos mejorado" se entiende que el uso de una composición de aditivo alimentario en alimento da como resultado que se requiera una menor cantidad de alimento para alimentar a un animal con el fin de aumentar el peso del animal en una magnitud específica en comparación con la cantidad de alimento requerida para aumentar el peso del animal en la misma magnitud cuando la biomasa lignocelulósica que no ha sido tratada según la presente invención se usa en el alimento o como alimento.

Digestibilidad de nutrientes

La digestibilidad de nutrientes, tal como se usa en la presente memoria, significa la fracción de un nutriente que desaparece del tracto gastrointestinal o de un segmento específico del tracto gastrointestinal, por ejemplo el intestino delgado. La digestibilidad de nutrientes se puede medir como la diferencia entre lo que se administra al individuo y lo que sale en las heces del individuo, o entre lo que se administra al individuo y lo que queda en la digesta en un segmento específico del tracto gastrointestinal, por ejemplo el íleon.

La digestibilidad de nutrientes, tal como se usa en la presente memoria, se puede medir mediante la diferencia entre la ingesta de un nutriente y el nutriente excretado por medio de la recolección total de las excreciones durante un período de tiempo; o con el uso de un marcador inerte que no es absorbido por el animal, y permite al investigador calcular la cantidad de nutriente que ha desaparecido en todo el tracto gastrointestinal o en un segmento del tracto gastrointestinal. Dicho marcador inerte puede ser dióxido de titanio, óxido crómico o ceniza insoluble en ácido. La digestibilidad se puede expresar como un porcentaje del nutriente en el alimento, o como unidades de masa de nutriente digestible por unidades de masa de nutriente en el alimento.

La digestibilidad de nutrientes, tal como se usa en la presente memoria, abarca la digestibilidad de almidón, la digestibilidad de grasas, la digestibilidad de proteínas y la digestibilidad de aminoácidos.

La digestibilidad energética, tal como se usa en la presente memoria, significa la energía bruta del alimento consumido menos la energía bruta de las heces o la energía bruta del alimento consumido menos la energía bruta de la digesta restante en un segmento específico del tracto gastrointestinal del animal, por ejemplo el íleon. La energía metabolizable, tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a energía metabolizable aparente y significa la energía bruta del alimento consumido menos la energía bruta contenida en las heces, orina y productos gaseosos de la digestión. La digestibilidad energética y la energía metabolizable se pueden medir como la diferencia entre la ingesta de energía bruta y la energía bruta excretada en las heces o la digesta presente en un segmento específico del tracto gastrointestinal utilizando los mismos métodos para medir la digestibilidad de nutrientes, con correcciones apropiadas para la excreción de nitrógeno con el fin de calcular la energía metabolizable del alimento.

Retención de nitrógeno

La retención de nitrógeno, tal como se usa en la presente memoria, significa la capacidad del individuo para retener nitrógeno de la dieta como masa corporal. Un balance de nitrógeno negativo ocurre cuando la excreción de nitrógeno es superior a la ingesta diaria, y a menudo se observa cuando se pierde el músculo. Un balance positivo de nitrógeno se asocia a menudo con el crecimiento muscular, particularmente en animales en crecimiento.

La retención de nitrógeno se puede medir como la diferencia entre la ingesta de nitrógeno y el nitrógeno excretado por medio de la recolección total de las excreciones y la orina durante un período de tiempo. Se entiende que el nitrógeno excretado incluye proteína no digerida del alimento, secreciones proteínicas endógenas, proteína microbiana y nitrógeno urinario.

Rendimiento de canal y rendimiento cárnico

El término rendimiento de canal, tal como se usa en la presente memoria, significa la cantidad de canal como una proporción del peso corporal vivo, después de un proceso de sacrificio comercial o experimental. El término "canal" significa el cuerpo de un animal que ha sido sacrificado como alimento, sin la cabeza, las entrañas, parte de las extremidades y las plumas o la piel. El término rendimiento cárnico, tal como se usa en la presente memoria, significa la cantidad de carne comestible como una proporción del peso corporal vivo, o la cantidad de un corte de carne específico como una proporción del peso corporal vivo.

Aumento de peso

La presente invención proporciona además un método para incrementar el aumento de peso en un individuo, por ejemplo, un ave de corral o un cerdo, que comprende alimentar a dicho individuo con un pienso que comprende una composición de aditivo alimentario según la presente invención.

Un "mayor aumento de peso" se refiere a un animal que tiene un mayor peso corporal al ser alimentado con alimento que comprende una composición de aditivo alimentario en comparación con un animal alimentado con un alimento que comprende o consiste en biomasa lignocelulósica que no ha sido tratada según la presente invención.

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta descripción. Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 20 ED., John Wiley and Sons, Nueva York (1994), y Hale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991) proporcionan a los expertos un diccionario general de muchos de los términos utilizados en esta divulgación.

Esta divulgación no está limitada por los métodos y materiales ejemplares descritos en la presente memoria, y cualquier método o material similar o equivalente a los descritos en la presente memoria se puede usar en la práctica o las pruebas de las realizaciones de esta divulgación. Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo. A menos que se indique lo contrario, cualquier secuencia de ácidos nucleicos se escribe de izquierda a derecha en orientación 5' a 3'; las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en orientación amino a carboxi, respectivamente.

Los títulos proporcionados en la presente memoria no son limitaciones de los diversos aspectos o realizaciones de esta divulgación, que se pueden obtener por referencia a la memoria descriptiva en su conjunto. Por consiguiente, los términos definidos inmediatamente a continuación se definen más completamente por referencia a la memoria descriptiva en su conjunto.

Los aminoácidos se designan en la presente memoria usando el nombre del aminoácido, la abreviatura de tres letras o la abreviatura de una sola letra.

El término "proteína", tal como se usa en la presente memoria, incluye proteínas, polipéptidos y péptidos.

Tal como se usa en la presente memoria, la expresión "secuencia de aminoácidos" es sinónimo del término "polipéptido" y/o el término "proteína". En algunos casos, la expresión "secuencia de aminoácidos" es sinónimo del término "péptido". En algunos casos, la expresión "secuencia de aminoácidos" es sinónimo del término "enzima".

Los términos "proteína" y "polipéptido" se usan indistintamente en la presente memoria. En la presente divulgación y las reivindicaciones se pueden usar los códigos convencionales de una y tres letras para residuos de aminoácidos. El código de 3 letras para los aminoácidos tal como se define de conformidad con la IUPACIUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN) (Comisión Mixta de Nomenclatura Bioquímica de lUPACIUB). También se entiende que un polipéptido puede estar codificado por más de una secuencia de nucleótidos debido a la degeneración del código genético.

Se ha de señalar que, tal como se usa en la presente memoria y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una", "el" y "la" incluyen referentes en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "una enzima" incluye una pluralidad de dichos agentes candidatos y la referencia a "el alimento" incluye una referencia a uno o más alimentos y equivalentes de los mismos conocidos por los expertos en la técnica, etc.

Las publicaciones analizadas en la presente memoria se proporcionan únicamente por su divulgación antes de la fecha de presentación de la presente solicitud. Nada de lo aquí mencionado debe interpretarse como una admisión de que dichas publicaciones constituyen la técnica anterior a las reivindicaciones adjuntas.

La invención se describirá ahora, solo a modo de ejemplo, con referencia a las siguientes Figuras y Ejemplos.

Ejemplos

Ejemplo 1: Efectos de Accellerase®BG y Accellerase®Trio™ en la digestibilidad de la fibra que se encuentra en rastrojo de maíz pretratado con amoníaco diluido usando un modelo in vitro que simula la digestión en el tracto superior en pollos

Materiales y métodos

Digestiones in vitro del alimento simulado que contiene material de biomasa de rastrojo de maíz

En la Tabla 1 se muestra la composición de los tratamientos de digestión in vitro. Para imitar la alimentación de los pollos, el 70% del material de biomasa se mezcló con un 30% de harina de soja (SBM, por sus siglas en inglés). Para las muestras de biomasa se realizaron dos tipos de digestiones gastrointestinales superiores (GIT, por sus siglas en inglés). En primer lugar se prepararon las muestras, que no fueron tratadas con Accellerase®Trio™ ni con Accellerase®BG (muestras designadas como 'Ninguna'). En segundo lugar se prepararon muestras que se trataron con Accellerase®Trio™ y Accellerase®BG durante las digestiones GIT superior in vitro (muestras designadas como 'muestras en alimento'). Además se prepararon dos muestras de control de maíz puro y alimento basado en SBM sin material de biomasa: bien digeridas con Accellerase®Trio™ y Accellerase®BG, designadas como 'Control en Alimento', bien digeridas sin Accellerase®Trio™ ni Accellerase®BG, designadas como 'Control'.

Accellerase®Trio™ es una enzima comercial disponible en Danisco (ahora parte de DuPont) y tiene ciertas actividades de celulasa, tales como la actividad de endoglucanasa y la actividad de beta-glucosidasa, y cierta actividad de hemicelulasas, tal como la actividad de endoxilanasa.

Accellerase®BG es una enzima comercial disponible en Danisco (ahora parte de DuPont) y tiene actividad de pglucosidasa.

Tabla 1. Composición de los tratamientos de digestión in vitro.

La digestión in vitro en el GIT superior del pollo se llevó a cabo utilizando el procedimiento representado en la Figura 1. Se pesó un total de uno, dos o tres gramos de materia seca (DM, por su siglas en inglés) por unidad de simulación, dependiendo del contenido de materia seca objetivo (% de DM Final) durante la etapa de digestión en el intestino delgado. Después de mezclar el alimento con agua y ajustar el pH con HCl, se dosificaron enzimas alimentarias Accellerase®Trio™ y Accellerase®BG a 0,2 ml/1 g de Dm y 0,05 ml/1 g de DM, respectivamente. Al final de la digestión in vitro, la fase líquida se separó por centrifugación a 30.000 g durante 30 minutos (10 °C) y se almacenó a -20 °C hasta que se analizó en cuanto a la composición de carbohidratos solubles.

Los residuos sólidos se secaron en horno a 75 °C durante 24 a 48 horas dependiendo de la cantidad de DM en la unidad de simulación. Los aglomerados secos pesados (materia seca no digestible) se homogeneizaron mediante trituración para el análisis de azúcares polisacáridos no almidón (NSP, por sus siglas en inglés) insolubles, fibra en detergente neutro (NDF, por sus siglas en inglés) y fibra en detergente ácido (ADF, por sus siglas en inglés).

Evaluación de la digestión de fibra y la liberación de azúcares solubles

Determinación de azúcares solubles tras digestión in vitro

Las muestras de sobrenadante centrifugadas se purificaron en una columna de extracción en fase sólida C18 y los monosacáridos libres se analizaron con HPLC tal como se describe más abajo. Los azúcares solubles totales se determinaron después de la hidrólisis ácida del sobrenadante en H²SO⁴1 M en un horno a 100 °C durante tres horas. Después de la dilución con agua y la filtración, los monosacáridos se analizaron mediante HPLC tal como se describe más abajo. La cantidad de azúcares poliméricos solubles (oligo y polisacáridos) en la solución de muestra se calculó de la siguiente manera: oligo y polisacáridos = azúcares solubles totales - monosacáridos solubles libres.

Determinación de azúcares NSP (polisacárido no almidón) insolubles después de la digestión in vitro

Una parte alícuota del aglomerado seco se dispersó en una solución tampón de fosfato 0,05 M (pH 6) y el almidón se degradó con alfa-amilasa termoestable (Sigma-Aldrich) incubando la muestra en un baño de agua a 95-100 °C durante 30 minutos. A continuación, el pH se ajustó a 4,5, se añadió amiloglucosidasa y la muestra se incubó en un baño de agua a 60 °C durante 60 minutos. Después se añadió etanol y la muestra se centrifugó. El sobrenadante se descartó y el aglomerado se secó en un horno a 50 °C.

Para hidrolizar los azúcares poliméricos, el residuo seco se dispersó en H²SO⁴12 M y se incubó en un baño de agua a 35 °C durante 60 minutos. Después se añadió agua para diluir el H²SO⁴ de 12 M a una concentración de 1 M y la muestra se incubó en un horno a 100 °C durante dos horas. La muestra se diluyó con agua y se filtró, y los monosacáridos se determinaron por HPLC como se describe más abajo.

Determinación de monosacáridos por HPLC

Los monosacáridos (ramnosa, arabinosa, galactosa, glucosa, xilosa, manosa) se separaron y detectaron usando cromatografía de intercambio aniónico de pH alto con detección electroquímica pulsada. La precolumna fue CarboPac PA1 (4 x 40 mm) y la columna analítica CarboPac PA1 (4 x 250 mm). El caudal fue de 1 ml/min y la fase móvil consistió en A: agua y B: NaOH 0,2 M como el siguiente gradiente:

Tiempo (min) A (%) B (%)

0 90 10

1,1 90 10

5 100 0

29 100 0

30 0 100

40 0 100

41 90 107

58 90 10

Análisis de fibra en detergente neutro (NDF) y en detergente ácido (ADF) después de la digestión in vitro

Para el alimento y los residuos de la digestión in vitro se determinaron los valores de materia seca mediante secado al horno a 105 °C durante 18 horas. Los métodos gravimétricos de NDF y ADF aplicados fueron realizados por MTT Agrifood Research Finland, utilizando un sistema de extracción Fibertec TM System M (FOSS Analytical, Dinamarca). Para determinar la cantidad de NDF se aplicó la extracción con la solución neutra de lauril sulfato de sodio y EDTA (Van Soest et al., 1991). La fibra en detergente ácido (celulosa, lignina) se recuperó mediante extracción con ácido sulfúrico 1 N que contenía CTAB (bromuro de cetiltrimetilamonio) (AOAC 973.18, 1990). Después de un secado a lo largo de la noche a 100 °C, se pesó el resto de la muestra y se calculó la cantidad de fibra como porcentaje del contenido de materia seca.

Análisis estadísticos

Los análisis estadísticos se llevaron a cabo utilizando ANOVA de una vía (Graphpad Prism versión 6.01) con la prueba post hoc de Tukey. El valor de P < 0,05 se consideró estadísticamente significativo. Se muestra la media SD para todas las cifras.

Resultados

Digestión de fibra y liberación de azúcares solubles de materiales de biomasa

Para estudiar el efecto de un pretratamiento fisicoquímico solo (ninguna) o en combinación con enzimas en alimento (Accellerase®Trio™ y Accellerase®BG en alimento) en la hidrólisis de hidratos de carbono durante la digestión en el GIT superior simulada, se llevaron a cabo varios análisis. Se muestran los resultados para el residuo de materia seca no digestible, los azúcares solubles liberados, la composición de azúcar NSP insoluble y la cantidad de NDF y ADF para el alimento de control y el tratamiento con rastrojo de maíz. Los datos para la dieta de control (70%-30% SBM) se muestran en las Tablas 2-4 y para los tratamientos que contienen rastrojo de maíz pretratado con amoníaco diluido (CS 70% - SBM 30%) en las Tablas 5-7.

Dieta de control (maíz 70% - SBM 30%)

No hubo ninguna diferencia en la cantidad de residuo indigerible (%) entre Control y Control Accellerase®Trio™ y Accellerase®BG en alimento después digestiones in vitro (Tabla 2).

Tabla 2. Residuos de materia seca no digestible de la dieta de Control (maíz 70% - SBM 30%) después de digestiones in vitro (n = 4) con 3 g (DM) de material de prueba.

Tratamiento Residuo indigerible SD

(%)

Control 77 1,3

Control Accellerase®Trio™ y Accellerase®BG en alimento 76 2,1 Accellerase®Trio™: Combinación de actividades de celulasa, incluyendo actividad de endoglucanasa y actividad de beta-glucosidasa, y actividades de hemicelulasa, incluyendo actividad de endoxilanasa.

2 Accellerase®BG: p-glucosidasa.

La cantidad de azúcares solubles totales, monosacáridos libres, azúcares oligo y poliméricos solubles y azúcares NSP insolubles después de las digestiones in vitro de los tratamientos de Control, así como la composición aproximada del azúcar NSP total antes de las digestiones, se presentan en la Tabla 3.

Tabla 4. Cantidad fibra en detergente neutro y en detergente ácido (% de materia seca) después de digestiones in vitro con dieta de Control.

NDF ADF

Tratamiento % DM SD % DM SD Control 22,46 3,60 5,81 0,70 Control Accellerase®Trio™ 1 y 22,50 3,23 6,04 0,62 Accellerase®BG2 en alimento

1 Accellerase®Trio™: Combinación de actividades de celulasa, incluyendo actividad de endoglucanasa y actividad de beta-glucosidasa, y actividades de hemicelulasa, incluyendo actividad de endoxilanasa.

2 Accellerase®BG: p-glucosidasa.

Tabla 5. Residuos de materia seca indigerible de rastrojo de maíz - SBM (70%-30%) después de digestiones in vitro (n = 4) con 3 g (DM) de material de prueba y diferentes tratamientos

Tratamiento Residuo indigerible

(%) SD

CS Ninguna 87b 0,8

CS Accellerase®Trio™ 1 y Accellerase®BG2 en alimento 72a 1,6

1 Accellerase®Trio™: Combinación de actividades de celulasa, incluyendo actividad de endoglucanasa y actividad de beta-glucosidasa, y actividades de hemicelulasa, incluyendo actividad de endoxilanasa.

2 Accellerase®BG: p-glucosidasa.

a- b Los valores medios dentro de una columna con distintas letras en superíndice fueron significativamente diferentes (P < 0,05; ANOVA seguido de la prueba post hoc de Tukey).

Tabla 6. Rastrojo de maíz - SBM (70%-30%): Análisis de azúcar después de digestiones in vitro con 3 g (DM) de material de prueba y diferentes tratamientos. Composición aproximada del azúcar NSP antes de las digestiones.

Tabla 7. Cantidad de fibra en detergente neutro y en detergente ácido (% de materia seca) después de digestiones in vitro con tratamientos que contienen rastrojo de maíz.

NDF ADF

Tratamiento % DM SD % DM SD

CS Ninguna 49,78a 1,18 39,88a 1,08

CS Accellerase®Trio™ 1 y 40,55b 1,66 38,90a 1,31 Accellerase®BG2 en alimento

1 Accellerase®Trio™: Combinación de actividades de celulasa, incluyendo actividad de endoglucanasa y actividad de beta-glucosidasa, y actividades de hemicelulasa, incluyendo actividad de endoxilanasa.

2 Accellerase®BG: p-glucosidasa.

a- b Los valores medios dentro de una columna con distintas letras en superíndice fueron significativamente diferentes (P < 0,05).

Exposición

Evaluación de la digestibilidad de fibra

Debido a la adición de enzimas en alimento (Accellerase®T rio™ y Accellerase®BG en alimento) en la dieta de Control que contenía un 70% de maíz, no hubo ninguna diferencia significativa en los parámetros de digestión de fibra de residuo de DM indigerible, NDF o ADF. Por el contrario, la cantidad de glucosa NSP insoluble fue significativamente menor (-19%), siendo coherente con la mayor liberación de glucosa libre detectada con 'Accellerase®Trio™ y Accellerase®BG en alimento'. Con estructuras de CHO que contienen xilosa, arabinosa y manosa se observó principalmente la solubilización de azúcares oligo y poliméricos durante la digestión in vitro.

La adición de enzimas en alimento (Accellerase®Trio™ y Accellerase®BG en alimento) a rastrojo de maíz pretratado con amoníaco diluido resultó en un aumento significativo (P < 0,05) en la solubilización de glucosa, xilosa, arabinosa y manosa en comparación con rastrojo de maíz pretratado con amoníaco diluido solo (CS Ninguna). Además, la mayor parte de la liberación de azúcar soluble como resultado de las enzimas en alimento (Accellerase®Trio™ y Accellerase®BG en alimento) se detectó como monosacáridos con la excepción de manosa, donde la liberación de manosa polimérica explicaba el aumento en la solubilización de manosa. La cantidad residual de fibra en detergente neutro también fue menor con 'Accellerase®Trio™ y Accellerase®BG en alimento' en comparación con 'CS Ninguna', sin embargo, no hubo ningún cambio en la fibra en detergente ácido entre tratamientos. De forma coherente con los resultados de NDF, la cantidad de residuo de DM indigerible y azúcares NSP insolubles se redujo por la adición de enzimas en alimento (Accellerase®Trio™ y Accellerase®BG en alimento).

Conclusión

La digestión in vitro de rastrojo de maíz pretratado con amoníaco diluido resultó en una conversión de un 10 y un 11% de la fracción total de azúcares NSP en glucosa soluble y xilosa, respectivamente. Sin embargo, la adición de Accellerase®Trio™ y Accellerase®BG para rastrojo de maíz pretratado durante la digestión in vitro aumentó aún más la conversión de glucosa y xilosa a un 38 y un 54% de la fracción total de azúcar NSP. Una disminución correspondiente en la fracción de NDF mientras que la fracción de ADF permanecía igual indica que la adición de enzima en alimento para diluir el rastrojo de maíz pretratado con amoníaco solubilizó la fracción de hemicelulosa de los NSP totales.

Ejemplo 2: Efectos de la endoxilanasa y Accellerase®Trio™ en la digestibilidad en el tracto total de nutrientes en cerdos alimentados con dietas que contienen un 30% de rastrojo de maíz pretratado con amoníaco diluido como sustitución parcial del maíz

Materiales y métodos

El uso de animales y el protocolo experimental está aprobado por el Comité de Experimentación Animal. La dieta basal, tal como se administra, está formulada de modo que esté equilibrada en cuanto a energía y proteínas, y para superar en un 15% las necesidades de nutrientes de los cerdos en crecimiento de esta edad (Tabla 1). Se incluye un marcador de digestibilidad común (óxido crómico) a 6 g/kg para permitir la determinación de la digestibilidad de los componentes de la dieta. Se incluyen niveles bajos de un antimicrobiano sintético (Virginamicina) en la dieta para equilibrar cualquier rastro de antimicrobianos que pueda estar presente en el rastrojo de maíz pretratado con amoníaco y la dieta se suministra en forma de una pasta. Para los tratamientos 2 y 3, un 30% de la dieta basal se sustituye con rastrojos de maíz molidos o rastrojos de maíz pretratados con amoníaco diluido (sobre una base de materia seca) de acuerdo con los tratamientos detallados en la Tabla 2.

La dieta basal se divide en porciones, que luego se tratan con las enzimas identificadas en la Tabla 2. Durante la mezcla del alimento, la mezcladora se enjuaga para evitar la contaminación cruzada de la dieta. Se recolectan muestras de cada dieta de tratamiento al principio, a la mitad y al final de cada lote y se mezclan entre sí para confirmar las actividades enzimáticas en el alimento. Las muestras de cada dieta de tratamiento se conservan durante la mezcla y se almacenan a -20 °C hasta que se necesiten.

Tabla 1: Ejemplos de composición de la dieta basal para cerdos de 25 a 60 kg de peso corporal (%, como alimento)

Tabla 2: Identificación de dietas experimentales

El experimento está planificado y realizado para corresponder a la fase de crecimiento (£25 a ~60 kg de peso corporal).

Unos cerdos castrados jóvenes en crecimiento (peso corporal inicial de 30 kg) se alojan en corrales individuales (1,2 x 1,5 m) en un espacio con control ambiental. Cada corral estaba equipado con un comedero y un bebedero de boquilla y tenía pisos de hormigón completamente emparrillados. El experimento está diseñado y realizado para proporcionar un mínimo de 12 repeticiones por tratamiento. Todos los cerdos se alimentan con un nivel correspondiente a 3 veces su energía de mantenimiento necesaria (197 kcal ME por kg MW60; NRC, 2012), que se proporciona en dos porciones iguales a las 0800 y 1700 h. Los animales tienen acceso libre al agua a través de un bebedero de tipo cubeta. Los pesos de los cerdos se registran al principio y al final de cada período y también se registra la cantidad de alimento suministrado cada día. El período experimental dura 14 días. Los primeros 10 días de cada período se consideran un período de adaptación a la dieta. Los días 11 y 12 se recogen muestras de heces frescas utilizando procedimientos operativos estándar. Después de su recogida, las muestras de heces se congelan inmediatamente a -20 ° C para su análisis posterior.

Las muestras de heces se descongelan, se mezclan dentro del animal y la dieta, y se recoge una submuestra para análisis químico. También se recoge y analiza una muestra de dieta basal. Las muestras de heces se secan en un horno y se muelen finamente para su análisis. Todas las muestras se analizan en busca de materia seca, marcador de digestibilidad, energía bruta, proteína bruta, grasa y fibra en detergente neutro de acuerdo con procedimientos estándar (AOAC, 2005).

Los valores de digestibilidad total de energía y nutrientes se calculan tal como se ha descrito anteriormente (Stein et al., 2007. J. Anim. Sci, 85: 172-180). El corral es la unidad experimental. Los datos se someten a los procedimientos MIXTOS de SAS. La significancia se reivindica en P < 0,05.

Resultados

Como se esperaba, la digestibilidad de tracto total aparente (ATTD, por sus siglas en inglés) de materia seca, materia orgánica, proteína bruta, energía bruta y fibra en cerdos alimentados con la dieta de control de maíz y soja es mayor que todos los demás tratamientos, ya que esta dieta no contiene ningún material de biomasa con alto contenido de fibra (Tabla 3: P < 0,01). Los grupos de cerdos tratados alimentados con la combinación completa de endoxilanasa más Accellerase®Trio™ junto con un 30% de rastrojo de maíz pretratado con amoniaco diluido tienen una mayor digestibilidad de tracto total aparente de materia seca, materia orgánica, proteína bruta, energía bruta y fibra en comparación con cerdos alimentados con dietas que contienen 30% de rastrojo de maíz molido que no se ha sometido a ningún proceso de pretratamiento ni a la adición de enzimas en alimento.

Tabla 3. Digestibilidad total aparente (ATTD) de energía y nutrientes en cerdos en crecimiento del Ensayo BMN1204 alimentados con dietas con alto contenido de fibra con o sin enzimas exógenas.

Dietas

Elemento, % Control ^Ras

_z ^tr

_m ^oj

_o ^o

_li ^d

_d ^e DAcs1

_{maí o enzimas2} SEM Valor P

Materia seca 87,53a 72,04c 77,68b 0,65 <0,01

Materia orgánica 89,36a 73,84c 79,47b 0,64 <0,01

Proteína bruta 87,58a 75,79c 78,74b 0,93 <0,01 Energía bruta 86,64a 72,36c 76,47b 0,74 <0,01

Fibra cruda 68,93a 48,04c 57,64b 2,14 <0,01

ADF 61,16a 43,12c 51,60b 2,82 <0,01 NDF 60,08a 1,69c 33,25b 2,31 <0,01

1 DAcs - Rastrojo de maíz pretratado con amoníaco diluido

2 Enzimas - endoxilanasa incluida a 4.400 U/kg y Accellerase®Trio™: una combinación enzimática de celulasa, hemicelulasa desarrollada por DuPont incluida a 12.500 BGU/kg.

abc Dentro de una fila, las medias con distintos superíndices son significativamente diferentes (P < 0,05)

Exposición

En general, las tecnologías de pretratamiento fisicoquímico maximizan la actividad de las enzimas reduciendo la cristalinidad de la celulosa y maximizando la accesibilidad de la celulasa a la celulosa (CAC, por sus siglas en inglés). El pretratamiento con amoníaco diluido abre con éxito la estructura de la celulosa, lo que aumenta el área superficial para que actúen las enzimas. Esto fue muy evidente en este estudio, donde se mejoró la materia seca y la digestibilidad de nutrientes de rastrojo de maíz con la combinación de pretratamiento con amoníaco diluido y enzimas en alimento en comparación con el rastrojo de maíz molido solo al ser evaluado en cerdos.

Ejemplo 3: Efectos de la endoxilanasa y Accellerase®Trio™ en la energía metabolizable real de materiales de biomasa pretratados de manera fisicoquímica, suministrados a gallos convencionales utilizando un modelo de alimentación de precisión

El uso de animales y el protocolo experimental está aprobado por el Comité de Experimentación Animal.

Los tratamientos incluyen materiales de biomasa suministrados con o sin enzimas (resumidos en la Tabla 4). Los gallos se alojan en jaulas individuales de malla de alambre equipadas con bandejas de recolección de excreciones. La alimentación se suspende 24 horas antes de la intubación (30 g) de cada tratamiento y durante 48 horas después de la intubación de cada tratamiento. El experimento está diseñado y realizado para proporcionar un mínimo de 8 repeticiones por tratamiento. Las excreciones totales se recogen durante 48 horas, se pesan, se liofilizan y se muelen con mortero. Las excreciones se analizan en cuando a energía bruta y nitrógeno. Las excreciones de gallos en ayunas se utilizan para calcular las pérdidas de nitrógeno endógeno. El valor de nitrógeno atribuido a pérdidas endógenas se utiliza como un factor de corrección que permite el cálculo de energía metabolizable real corregida en nitrógeno (TMEn, por sus siglas en inglés).

Tabla 4: Identificación de dietas experimentales

Resultados

Los resultados sugieren que los grupos tratados alimentados con materiales de biomasa pretratada fisicoquímicamente en combinación con enzimas (endoxilanasa más Accellerase®Trio™) tienen mayor digestibilidad de energía (TMEn) que gallos alimentados con biomasa pretratada de manera fisicoquímica o biomasa no tratada sin enzimas (rastrojo de maíz molido - tratamiento 1).

Tabla 5. Valores de energía de metabolismo real para materiales de biomasa pretratada con o con enzimas exógenas de un ensayo realizado utilizando un modelo de gallo1.

Material de biomasa TMEn (kcal/kg DM)2

Rastrojo de maíz molido 980

DLcs3 917

DLcs enzimas4 1.056

1 Todos los materiales de prueba se suministraron como una mezcla de un 30% de material de prueba y un 70% de maíz para facilitar la alimentación. El valor GE del maíz se utilizó para factorizar su contribución energética en la mezcla.

2 Las medias TMEn son un promedio de 8 observaciones.

3 DLcs - rastrojo de maíz deslignificado de forma cáustica.

4 Enzimas - Se incluyó endoxilanasa a 2500 U/kg y se incluyó Accellerase®Trio™ a 12.500 BGU/kg.

Ejemplo 4: Efectos de Danisco xylanase™ y Accellerase®Trio™ en la digestibilidad de la fibra que se encuentra en materiales de biomasa pretratada de forma fisicoquímica usando un modelo de digestibilidad de rumiantes in vitro

Materiales y métodos

La fermentación de los ingredientes de prueba solos (Tabla 1) o como parte de una dieta completa para rumiantes (Tabla 2) con o sin adición de enzimas se lleva a cabo utilizando un novedoso sistema inalámbrico automatizado para medir la cinética de producción de gas de fermentación del ingrediente alimentario descrito previamente por Adesogan et al. (2005). Los experimentos están diseñados y realizados para proporcionar 5 repeticiones por tratamiento y la incubación dura 24 horas. Después de la fermentación se cuantifica la cantidad total de gases producidos. Los residuos que quedan después de la fermentación se caracterizan según su composición de fibra en detergente ácido (ADF) y fibra en detergente neutro (NDF).

Tabla 1. Tratamientos para el experimento 1

Tabla 2. Tratamientos para el experimento 2

Resultados

Los resultados del experimento 1, que evalúa los materiales de biomasa por sí solos, indican que la adición de enzimas (Accellerase®T rio™ y Danisco Xylanase™) para diluir rastrojos de maíz pretratados con amoníaco y rastrojos de maíz y pasto varilla deslignificados de forma cáustica da como resultado una mayor digestibilidad de materia seca y orgánica junto con un aumento digestibilidad de fibra medida mediante la digestibilidad de fibra en detergente ácido y neutro (Tabla 3). La producción de gas a partir de los materiales de biomasa pretratados también se mejoró mediante la adición de enzimas en alimento.

Tabla 3. Digestibilidad aparente in vitro de materia seca (DMD, por sus siglas en inglés), materia orgánica (OMD, por sus siglas en inglés), fibra en detergente ácido (ADFD, por sus siglas en inglés) y neutro (NDFD, por sus siglas en inglés) de materiales de biomasa pretratada.

Tratamiento DMD (%) OMD (%) NDFD (%) ADFD (%) Producción de gas (ml)

Rastrojo de maíz (no tratado - CS) 19,8 20,4 0,7 -4,3 262

CS pretratado con amoníaco diluido 35,7 35,8 19,7 14,4 422 (DAcs)

DAcs enzimas 44,9 46,1 30,4 24,7 558 CS deslignificado de forma cáustica 35,7 35,6 43,1 39,6 540

CS deslignificado de forma cáustica 46,2 45,6 49,7 45,9 763 enzimas1

Tratamiento DMD (%) OMD (%) NDFD (%) ADFD (%) Producción de gas (ml) Pasto varilla (SGW, por sus siglas en 25,0 24,2 30,6 26,4 346 inglés) deslignificado de forma

cáustica

SGW deslignificado de forma 33,8 33,4 37,3 33,4 572 cáustica enzimas1

1 Enzimas: Accellerase®Trio™: Combinación de actividades de celulasa, incluyendo actividades de endoglucanasa y de beta-glucosidasa, y actividades de hemicelulasa, incluyendo actividad de endoxilanasa y Danisco xylanase™ que tiene actividad de endoxilanasa.

Los resultados del experimento 2, donde la biomasa pretratada constituye un 60% de una dieta completa para rumiantes, la digestibilidad de la materia seca junto con la digestibilidad de fibra, según lo evaluado mediante la digestibilidad de fibra en detergente neutro y ácido, aumentan cuando se añaden enzimas en alimento. Del mismo modo, la producción de gas es mayor cuando la biomasa pretratada incluida como parte de una dieta completa para rumiantes se combina con enzimas en alimento en comparación con la biomasa pretratada sola.

Tabla 4. Digestibilidad aparente in vitro de materia seca (DMD) y fibra en detergente ácido (ADFD) y neutro (NDFD) y producción de gas de fermentación de las dietas experimentales1.

Tratamiento DMD (%) NDFD (%) ADFD (%) Producción de gas, psi

Dieta basal 59,3 32,7 32,7 549

Basal 70% DAcs 45,9 25,9 19,9 372

Basal 70% DAcs enzimas1 55,6 38,6 39,8 448 Basal 70% DLcs 51,7 48,2 43,5 479 Basal 70% DLcs enzimas 51,9 50,3 43,7 485

Basal 70% DLswg 41,6 39,7 38,5 156

Basal 70% DLswg enzimas 44,1 44,2 41,2 500

1 Enzimas: Accellerase®Trio™: Combinación de actividades de celulasa, incluyendo actividades de endoglucanasa y de beta-glucosidasa, y actividades de hemicelulasa, incluyendo actividad de endoxilanasa y Danisco xylanase™ que tiene actividad de endoxilanasa.

DAcs - rastrojo de maíz pretratado con amoníaco diluido, DLcs - rastrojo de maíz deslignificado de forma cáustica, DLswg - pasto varilla deslignificado de forma cáustica

Exposición

Tal como se observó en el experimento 1, el pretratamiento fisicoquímico por sí solo aumenta la digestibilidad de fibra y la producción de gas a partir de material de biomasa; sin embargo, estas respuestas se mejoran aún más cuando en la digestión se incluyen enzimas en alimento en forma de Accellerase®Trio™ y Danisco xylanase™.

Ejemplo 5: Efectos de Accellerase®1500 y Econase® XT en la digestibilidad de la fibra encontrada en rastrojo de maíz pretratado con amoníaco diluido utilizando un modelo in vitro que simula la digestión en el tracto superior en pollos

Materiales y métodos

Digestiones in vitro del alimento simulado que contiene material de biomasa de rastrojo de maíz

En la Tabla 1 se muestra la composición de los tratamientos de digestión in vitro. Para imitar el alimento para pollos, un 70% del material de biomasa se mezcla con un 30% de harina de soja (SBM). Para las muestras de biomasa se realizan dos tipos de digestiones en el tracto gastrointestinal superior (GIT). En primer lugar se preparan muestras que no están tratadas con Accellerase®1500 ni Econase® XT (muestras designadas como 'Ninguna'). En segundo lugar se preparan muestras que están tratadas con Accellerase®1500 y Econase® XT durante las digestiones in vitro uGIT (muestras designadas como 'Muestras en alimento'). Además se preparan dos muestras de control de alimento basado en maíz puro y SBM sin material de biomasa: bien digerido con Accellerase®1500 y Econase® XT, designado como "Control en alimento", bien digerido sin Accellerase®1500 y Econase® XT, designado como "Control".

Accellerase®1500 es una enzima comercial disponible en Danisco (ahora parte de DuPont) y tiene ciertas actividades de celulasa tales como actividad de endoglucanasa, de beta-glucosidasa y cierta actividad de hemicelulasas, tal como actividad de endoxilanasa.

Econase® XT es una enzima comercial disponible en AB Vista y tiene actividad de endo 1 -4 beta xilanasa.

Tabla 1. Composición de los tratamientos de digestión in vitro.

La digestión in vitro en el GIT superior del pollo se realiza con el procedimiento mostrado en la Figura 1. Se pesa un total de uno, dos o tres gramos de materia seca (DM) por unidad de simulación, según el contenido de materia seca objetivo (% de DM Final) durante la etapa de digestión del intestino delgado. Después de mezclar el alimento con agua y ajustar el pH con HCl, se dosifican enzimas alimentarias, Accellerase®1500 y Econase® XT a 0,3 ml/1 g de DM y 4,6 pl/g de DM, respectivamente. Al final de la digestión in vitro, la fase líquida se separa por centrifugación a 30.000 xg durante 30 minutos (10 °C) y se almacena a -20 °C hasta que se analiza en cuanto a la composición de carbohidratos solubles.

La liberación de azúcares solubles, la determinación de azúcares polisacáridos no almidón insolubles, el análisis de fibra en detergente neutro y ácido, después de la digestión in vitro, se evalúan tal como se describe mediante los métodos en el ejemplo 1.

Resultados

Digestión de fibra y liberación de azúcares solubles de materiales de biomasa

Los resultados preliminares indican que la adición de Accellerase®1500 y Econase® XT para diluir rastrojos de maíz pretratados con amoníaco aumenta la liberación de azúcares solubles y disminuye la cantidad de fibra en detergente neutro residual, residuos de DM indigeribles y azúcares NSP insolubles, en comparación con los rastrojos de maíz pretratados únicamente con amoníaco diluido.

Ejemplo 6: Efectos de Celluclast®, Danisco Xylanase™ y Accellerase®BG™ en la digestibilidad de la fibra que se encuentra en el rastrojo de maíz pretratado con amoniaco diluido utilizando un modelo in vitro que simula la digestión en el tracto superior en pollos

Materiales y métodos

Digestiones in vitro del alimento simulado que contiene material de biomasa de rastrojo de maíz

En la Tabla 1 se muestra la composición de los tratamientos de digestión in vitro. Para imitar el alimento para pollos, un 70% del material de biomasa se mezcla con un 30% de harina de soja (SBM). Para muestras de biomasa se realizan dos tipos de digestiones en el tracto gastrointestinal superior (GIT). En primer lugar se preparan muestras que no se tratan con Celluclast®, Danisco Xylanase™ ni Accellerase®BG™ (muestras designadas como "Ninguna"). En segundo lugar se preparan muestras que se tratan con Celluclast®, Danisco Xylanase™ y Accellerase®BG™ durante las digestiones de uGIT in vitro (muestras denominadas 'Muestras en alimento'). Además se preparan dos muestras de control de alimento a base de maíz puro y SBM sin material de biomasa: bien digerido con Celluclast®, Danisco Xylanase™ y Accellerase®BG™, designado como 'Control en alimento', bien digerido sin Celluclast®, Danisco Xylanase™ ni Accellerase®BG™, designado como 'Control'.

Celluclast® es una enzima comercial disponible en Sigma-Aldrich (C2730) y contiene ciertas actividades de celulasa, incluyendo actividad de endoglucanasa, y de beta-glucosidasa.

Danisco Xylanase™ es una enzima comercial disponible en Danisco (ahora parte de DuPont) y tiene actividad de endoxilanasa.

Accellerase®BG™ es una enzima comercial disponible en Danisco (ahora parte de DuPont) y tiene actividad de pglucosidasa.

Tabla 1. Composición de los tratamientos de digestión in vitro.

La digestión in vitro en el GIT superior del pollo se realiza mediante el procedimiento mostrado en la Figura 1. Se pesa un total de uno, dos o tres gramos de materia seca (DM) por unidad de simulación, según el contenido de materia seca objetivo (% de DM Final) durante la etapa de digestión en el intestino delgado. Después de mezclar el alimento con agua y ajustar el pH con HCl, se dosifican enzimas alimentarias, Celluclast®, Danisco Xylanase™ y Accellerase®BG™ a 0,1 ml/g de DM, 2,3 gl/g de DM (40.000 U/g), y 0,15 ml/g de DM, respectivamente. Al final de la digestión in vitro , la fase líquida se separa por centrifugación a 30.000 xg durante 30 minutos (10 °C) y se almacena a -20 °C antes del análisis de la composición de carbohidratos solubles.

La liberación de azúcares solubles, la determinación de azúcares polisacáridos no almidón insolubles, el análisis de fibra en detergente neutro y ácido, después de la digestión in vitro , se evalúan tal como se describe mediante los métodos en el ejemplo 1.

Resultados

Digestión de fibra y liberación de azúcares solubles de materiales de biomasa

Los resultados preliminares indican que la adición de Celluclast®, Danisco Xylanase™ y Accellerase®BG™ a rastrojos de maíz pretratados con amoníaco diluido aumenta la liberación de azúcares solubles y disminuye la cantidad de fibra en detergente neutro residual, residuos de DM indigerible y azúcares NSP insolubles, en comparación con los rastrojos de maíz pretratados únicamente con amoníaco diluido.

Ejemplo 7: Efectos de la Celulasa de Aspergillus n iger (C1184 - Sigma) y Accellerase®BG™ en la digestibilidad de la fibra encontrada en el rastrojo de maíz pretratado con amoníaco diluido usando un modelo in vitro que simula la digestión en el tracto superior en pollos

Materiales y métodos

Digestiones in vitro del alimento simulado que contiene material de biomasa de rastrojo de maíz

En la Tabla 1 se muestra la composición de los tratamientos de digestión in vitro . Para imitar el alimento para pollos, un 70% del material de biomasa se mezcla con un 30% de harina de soja (SBM). Para las muestras de biomasa se realizan dos tipos de digestiones en el tracto gastrointestinal superior (GIT). En primer lugar se preparan muestras que no se tratan con Celulasa ni con Accellerase®BG™ (muestras designadas como 'Ninguna'). En segundo lugar se preparan muestras que se tratan con Celulasa o con Accellerase®BG™ durante las digestiones en el uGIT in vitro (muestras designadas como 'Muestras en alimento'). Además se preparan dos muestras de control de alimento a base de maíz puro y SBM sin material de biomasa: bien digerido con Celulasa o con Accellerase®BG™, designado como 'Control en alimento', bien digerido sin Celulasa ni Accellerase®BG™, designado como 'Control'.

La celulasa de Aspergillus n iger es una enzima comercial disponible en Sigma-Aldrich (C1184) y contiene ciertas actividades de celulasa, incluyendo actividad de endoglucanasa así como actividad de endoxilanasa.

Accellerase®BG™ es una enzima comercial disponible en Danisco (ahora parte de DuPont) y tiene actividad de pglucosidasa.

Tabla 1. Composición de los tratamientos de digestión in vitro.

La digestión in vitro en el GIT superior del pollo se realiza mediante el procedimiento mostrado en la Figura 1. Se pesa un total de uno, dos o tres gramos de materia seca (DM) por unidad de simulación, según el contenido de materia seca objetivo (% de DM Final) durante la etapa de digestión en el intestino delgado. Después de mezclar el alimento con agua y ajustar el pH con HCl, se dosificaron enzimas alimentarias, Celulasa (C1184) o Accellerase®BG™ a 0,2 ml/g de DM, 0,15 ml/g de DM, respectivamente. Al final de la digestión in vitro, la fase líquida se separa por centrifugación a 30.000 xg durante 30 minutos (10 °C) y se almacena a -20 °C antes del análisis de la composición de carbohidratos solubles. La liberación de azúcares solubles, la determinación de azúcares polisacáridos no almidón insolubles, el análisis de fibra en detergente neutro y ácido, después de la digestión in vitro, se evalúan tal como se describe mediante los métodos en el ejemplo 1.

Resultados

Digestión de fibra y liberación de azúcares solubles de materiales de biomasa

Los resultados preliminares indican que la adición de Celulasa (de Aspergillus niger) y Accellerase®BG™ a rastrojos de maíz pretratados con amoníaco diluido aumenta la liberación de azúcares solubles y disminuye la cantidad de fibra en detergente neutro residual, residuos de DM indigerible y azúcares NSP insolubles, en comparación con los rastrojos de maíz pretratados únicamente con amoníaco diluido.

Ejemplo 8: Efectos de Accellerase®1500 y Econase® XT en la digestibilidad de la fibra que se encuentra en material de biomasa pretratado fisicoquímicamente utilizando un modelo in vitro que simula la digestión en el tracto superior en cerdos

Materiales y métodos

Digestiones in vitro del alimento simulado que contiene material de biomasa pretratado fisicoquímicamente

En la Tabla 1 se muestra la composición de los tratamientos de digestión in vitro. Se digieren tres tipos de biomasa pretratada fisicoquímicamente (DAcs: rastrojo de maíz pretratado con amoníaco diluido, DLcs: rastrojo de maíz deslignificado de forma cáustica, DLswg: pasto varilla deslignificado de forma cáustica) y maíz bajo condiciones simuladas del tracto digestivo superior de un cerdo en presencia o ausencia de enzimas carbohidrasa Accellerase®1500 y Econase® XT.

Accellerase®1500 es una enzima comercial disponible en Danisco (ahora parte de DuPont) y tiene ciertas actividades de celulasa tales como actividad de endoglucanasa, de beta-glucosidasa y cierta actividad de hemicelulasas, tal como actividad de endoxilanasa.

Econase® XT es una enzima comercial disponible en AB Vista y tiene actividad de endo 1 -4 beta xilanasa.

Tabla 1. Composición de los tratamientos de digestión in vitro.

Para evaluar el efecto de diferentes enzimas en las características de fermentación de ingredientes alimentarios en la parte superior del sistema digestivo, se simulan las condiciones gástricas y del intestino delgado en pruebas por lotes. A 3 g (DM) de material de prueba y enzimas se les añade jugo gástrico (28 ml) que contiene mucina y pepsina (pH 3,5), y la mezcla se incuba durante 2 horas a 39 °C en una incubadora con agitación ajustada a 90 rpm. Se dosifican Accellerase®1500 y Econase® XT 5P a 0,3 ml/g de DM y 1,4 mg/g de DM, respectivamente. Durante la incubación en el estómago, el pH se mide a intervalos de tiempo regulares y se ajusta a pH 3,5. Después de la incubación en el estómago, se añaden 12 ml de jugo pancreático, que contiene hiel de buey (6 g/l), pancreatina (6 g/l), bicarbonato de sodio (12,5 g/l) y tampón fosfato (pH 6,8) y la digesta se incuba durante 6 horas a 39 °C bajo agitación. Durante la incubación en el intestino delgado, el pH se mide regularmente y se ajusta a pH 6,8 en caso necesario. La liberación de azúcar soluble (Total: glucosa, xilosa, arabinosa, galactosa, manosa) se mide mediante HPAE-PAD (Cromatografía de Intercambio Aniónico de Alto Rendimiento - Detección Amperométrica Pulsada) (Nota Técnica 20 de Dionex). La determinación de polisacáridos no almidón solubles e insolubles se evalúa de acuerdo con la descripción de Englyst et al. (1992).

Resultados

Digestión de NSP y liberación de azúcares solubles de materiales de biomasa pretratados fisicoquímicamente

Los resultados indican que la adición de Accellerase®1500 y Econase® XT a la biomasa pretratada fisicoquímicamente (rastrojos de maíz pretratados con amoníaco diluido, rastrojo de maíz y pasto varilla deslignificados de forma cáustica) aumenta la liberación de arabinosa, galactosa, glucosa, xilosa y manosa solubles totales en comparación con el pretratamiento fisicoquímico solo (Tabla 2).

Después del análisis de azúcares NSP tras la digestión in vitro en condiciones simuladas del tracto digestivo superior de un cerdo, se comprobó que la adición de Accellerase®1500 y Econase® XT en alimento disminuye la liberación de azúcares NSP totales del rastrojo de maíz pretratado con amoníaco diluido y deslignificado de forma cáustica y el pasto varilla deslignificado de forma cáustica en comparación con el pretratamiento fisicoquímico solo (Tabla 3). La mayor parte de esta reducción comprendía la liberación reducida de glucosa, xilosa y arabinosa insolubles.

Tabla 3. Análisis de azúcar polisacárido no almidón (NSP) después de digestiones in vitro en condiciones simuladas del tracto digestivo superior de un cerdo con 3 g (DM) de material de prueba con o

Conclusión

La adición de enzimas en alimento con al menos actividad de endoglucanasa, endoxilanasa y p-glucosidasa a la biomasa pretratada fisicoquímicamente en condiciones digestivas de cerdo simuladas (GIT superior) dio como resultado una mayor liberación de azúcares solubles y una disminución de la liberación de polisacáridos no almidón totales, en particular la fracción insoluble, en comparación con el pretratamiento fisicoquímico solo. La reducción de polisacáridos no almidón (NSP) totales es deseable, ya que los animales no pueden digerir estos polisacáridos in vivo. Por lo tanto, la adición de las enzimas en alimento capaces de romper los NSP (en particular la fracción insoluble) tiene una gran importancia en la liberación de nutrientes para un animal.

Ejemplo 9: Efectos de Celluclast®, Danisco Xylanase™ y Accellerase®BG™ sobre la digestibilidad de la fibra que se encuentra en material de biomasa pretratado fisicoquímicamente utilizando un modelo in vitro que simula la digestión en el tracto superior en cerdos

Materiales y métodos

Digestiones in vitro del alimento simulado que contiene materiales de biomasa pretratados fisicoquímicamente

En la Tabla 1 se muestra la composición de los tratamientos de digestión in vitro. Se digieren tres tipos de biomasa pretratada fisicoquímicamente (DAcs: rastrojo de maíz pretratado con amoníaco diluido, DLcs: rastrojo de maíz deslignificado de forma cáustica, DLswg: pasto varilla deslignificado de forma cáustica) y maíz bajo condiciones simuladas del tracto digestivo superior de un cerdo en presencia o ausencia de enzimas carbohidrasa Celluclast®, Danisco Xylanase™ y Accellerase®BG™.

Celluclast® es una enzima comercial disponible en Sigma-Aldrich (C2730) y contiene ciertas actividades de celulasa, incluyendo actividad de endoglucanasa, y de beta-glucosidasa.

Danisco Xylanase™ es una enzima comercial disponible en Danisco (ahora parte de DuPont) y tiene actividad de endoxilanasa.

Accellerase®BG™ es una enzima comercial disponible en Danisco (ahora parte de DuPont) y tiene actividad de pglucosidasa.

Tabla 1. Composición de los tratamientos de digestión in vitro.

Para evaluar el efecto de diferentes enzimas en las características de fermentación de ingredientes alimentarios en la parte superior del sistema digestivo, se simulan las condiciones gástricas y del intestino delgado en pruebas por lotes tal como se describe en el Ejemplo 8. Se dosifican Celluclast®, Danisco Xylanase™ y Accellerase®BG a 0,1 ml/g de DM, 3,5 ul/g de DM y 0,15 ml/g de DM, respectivamente. La liberación de azúcar soluble (Total: glucosa, xilosa, arabinosa, galactosa, manosa) y los polisacáridos no almidón solubles e insolubles se evalúan tal como se describe en el Ejemplo 8.

Resultados

Digestión de NSP y liberación de azúcares solubles de materiales de biomasa pretratados fisicoquímicamente

Los resultados indican que la adición de Celluclast®, Danisco Xylanase™ y Accellerase®BG a biomasa pretratada fisicoquímicamente (rastrojos de maíz pretratados con amoníaco diluido, rastrojo de maíz y pasto varilla deslignificados de forma cáustica) aumenta la liberación de arabinosa, galactosa, glucosa, xilosa y manosa solubles totales en comparación con el pretratamiento fisicoquímico solo (Tabla 2).

Después del análisis de azúcares NSP tras la digestión in vitro en condiciones simuladas del tracto digestivo superior de un cerdo, se comprobó que la adición de Celluclast®, Danisco Xylanase™ y Accellerase®BG en alimento disminuye la liberación de azúcares NSP totales del rastrojo de maíz pretratado con amoníaco diluido y deslignificado de forma cáustica y el pasto varilla deslignificado de forma cáustica en comparación con el pretratamiento fisicoquímico solo (Tabla 3). La mayor parte de esta reducción comprendía la liberación reducida de glucosa, xilosa y arabinosa insolubles.

Tabla 3. Análisis de azúcar polisacárido no almidón (NSP) después de digestiones in vitro en condiciones simuladas del tracto digestivo superior de un cerdo con 3 g (DM) de material de prueba con o sin enzimas en alimento

Conclusión

La adición de enzimas en alimento con al menos actividad de endoglucanasa, endoxilanasa y p-glucosidasa a la biomasa pretratada fisicoquímicamente en condiciones digestivas de cerdo simuladas (GIT superior) dio como resultado una mayor liberación de azúcares solubles y una disminución de la liberación de polisacáridos no almidón totales, en particular la fracción insoluble, en comparación con el pretratamiento fisicoquímico solo.

Ejemplo 10: Efectos de la Celulasa de Aspergillus niger (C1184 - Sigma) y Accellerase®BG™ en la digestibilidad de la fibra encontrada en material de biomasa pretratado fisicoquímicamente utilizando un modelo in vitro que simula la digestión en el tracto superior en cerdos

Materiales y métodos

Digestiones in vitro del alimento simulado que contiene materiales de biomasa pretratados fisicoquímicamente

En la Tabla 1 se muestra la composición de los tratamientos de digestión in vitro. Se digieren tres tipos de biomasa pretratada fisicoquímicamente (DAcs: rastrojo de maíz pretratado con amoníaco diluido, DLcs: rastrojo de maíz deslignificado de forma cáustica, DLswg: pasto varilla deslignificado de forma cáustica) y maíz bajo condiciones simuladas del tracto digestivo superior de un cerdo en presencia o ausencia de enzimas carbohidrasa Celulasa de Aspergillus niger (C1184 - Sigma) y Accellerase®BG™.

La celulasa de Aspergillus niger es una enzima comercial disponible en Sigma-Aldrich (C1184) y contiene ciertas actividades de celulasa, incluyendo actividad de endoglucanasa así como actividad de endoxilanasa.

Accellerase®BG™ es una enzima comercial disponible en Danisco (ahora parte de DuPont) y tiene actividad de pglucosidasa.

Tabla 1. Composición de los tratamientos de digestión in vitro.

Para evaluar el efecto de diferentes enzimas en las características de fermentación de ingredientes alimentarios en la parte superior del sistema digestivo, se simulan las condiciones gástricas y del intestino delgado en pruebas por lotes como se describe en el Ejemplo 8. Se dosifican Celulasa de Aspergillus n iger(C1184 - Sigma) y Accellerase®BG™ a 0,2 g/g de DM y 0,15 ml/g de DM, respectivamente. La liberación de azúcar soluble (Total: glucosa, xilosa, arabinosa, galactosa, manosa) y los polisacáridos no almidón solubles e insolubles se evalúan tal como se describe en el Ejemplo 8.

Resultados

Digestión de fibra y liberación de azúcares solubles de materiales de biomasa tratados fisicoquímicamente

Los resultados indican que la adición de Celulasa de Aspergillus niger (C1184 - Sigma) y Accellerase®BG™ a la biomasa pretratada fisicoquímicamente (rastrojos de maíz pretratados con amoníaco diluido, rastrojo de maíz y pasto varilla deslignificados de forma cáustica) aumenta la liberación de arabinosa, galactosa, glucosa, xilosa y manosa solubles totales en comparación con el pretratamiento fisicoquímico solo (Tabla 2).

Después del análisis de azúcares NSP tras la digestión in vitro en condiciones simuladas del tracto digestivo superior de un cerdo, se comprobó que la adición de Celulasa en el alimento de Aspergillus niger (C1184 - Sigma) y Accellerase®BG™ disminuye la liberación de azúcares NSP totales de rastrojo de maíz pretratado con amoníaco diluido y deslignificado de forma cáustica y pasto varilla deslignificado de forma cáustica en comparación con el pretratamiento fisicoquímico solo (Tabla 3). La mayor parte de esta reducción comprendía la liberación reducida de glucosa, xilosa y arabinosa insolubles.

Tabla 3. Análisis de azúcar polisacárido no almidón (NSP) después de digestiones in vitro en condiciones simuladas del tracto digestivo superior de un cerdo con 3 g (DM) de material de prueba con o sin enzimas en alimento

Claims (22)

REIVINDICACIONES

1. Un método para preparar una composición de aditivo alimentario que comprende:

a. pretratar física y/o química y/o biológicamente una biomasa lignocelulósica; y

b. tratar la biomasa lignocelulósica pretratada física y/o química y/o biológicamente con al menos una enzima predigestiva; y

c. mezclar dicha biomasa lignocelulósica pretratada y tratada adicionalmente con al menos una enzima predigestiva de la etapa b. con al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento;

d. y opcionalmente envasarla;

en donde la al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento:

i) es funcional, o principalmente funcional, en el tracto gastrointestinal del animal de tal modo que, antes de entrar en el tracto gastrointestinal, el nivel de actividad enzimática definido como la cantidad de solubilización de material de biomasa con respecto a oligosacáridos y monosacáridos es menor que un 20% del nivel de actividad enzimática después de entrar en el tracto gastrointestinal; y/o

ii) se mezcla con la biomasa lignocelulósica pretratada de la etapa b. cuando la biomasa lignocelulósica pretratada de la etapa b., la enzima en alimento o ambas están en un estado seco o sustancialmente seco, de tal modo que la biomasa lignocelulósica pretratada de la etapa b., la enzima en alimento o ambas comprenden menos de un 15% en peso de contenido de agua; y/o

iii) se encapsula antes de mezclarla con la biomasa lignocelulósica pretratada de la etapa b.; y/o

iv) se mezcla con la biomasa lignocelulósica pretratada de la etapa b. inmediatamente antes de alimentar a un animal con la composición de aditivo alimentario.

2. Un método de la reivindicación 1, en donde el método comprende además alimentar a un animal con la composición de aditivo alimentario.

3. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde, cuando la enzima en alimento se añade a la biomasa pretratada de la etapa b., la biomasa pretratada contiene al menos un 70% de las unidades de azúcar de la biomasa tratada (por ejemplo, monosacáridos solubles, por ejemplo, unidades de glucosa) presentes como oligómeros o polímeros que pueden ser liberados en el intestino gastrointestinal de un animal por la enzima en alimento.

4. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde:

i) cuando la enzima en alimento es funcional, o principalmente funcional, en el tracto gastrointestinal del animal, la enzima en alimento está inactiva, o sustancialmente inactiva, en la composición de aditivo alimentario y/o en la biomasa lignocelulósica pretratada de la etapa b. antes de alimentar a un animal con la composición de aditivo alimentario, de tal modo que la enzima en la composición de aditivo alimentario y/o en la biomasa lignocelulósica tiene menos de un 10% de su actividad en comparación con su actividad en el tracto gastrointestinal; y/o

ii) cuando la enzima en alimento se mezcla con la biomasa lignocelulósica pretratada de la etapa b., cuando la biomasa lignocelulósica pretratada de la etapa b., la enzima en alimento o ambas están en un estado seco o sustancialmente seco, el método comprende secar la biomasa lignocelulósica pretratada de la etapa b. antes, durante o después, preferiblemente antes, de mezclar la biomasa con al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento.

5. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento comprende:

i) una de las siguientes actividades enzimáticas, o ambas: actividad de celulasa y/o actividad de hemicelulasa; o

ii) una o más de las siguientes actividades enzimáticas: actividad de endoglucanasa, actividad de endoxilanasa o actividad p-glucosidasa.

6. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento comprende al menos las siguientes actividades enzimáticas: actividad de celulasa y actividad de hemicelulasa, preferiblemente en donde al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento comprende al menos las siguientes actividades enzimáticas: actividad de endoglucanasa, actividad de endoxilanasa y actividad de pglucosidasa.

7. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 5-6, en donde la al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento comprende además una de las siguientes actividades enzimáticas, o ambas: actividad de exoglucosidasa y/o actividad de polisacárido monooxigenasa lítica.

8. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la biomasa lignocelulósica es cualquier material celulósico o lignocelulósico, por ejemplo residuos agrícolas, cultivos bioenergéticos, residuos sólidos industriales, residuos sólidos urbanos, lodos de la fabricación de papel, residuos de jardinería, residuos de madera, residuos forestales y combinaciones de los mismos, preferiblemente en donde la biomasa lignocelulósica se selecciona entre el grupo que consiste en rastrojo de maíz, paja de trigo, mazorcas de maíz, bagazo de caña de azúcar, pasto varilla, sorgo forrajero, paja de arroz, astillas de madera, papel de desecho, componentes obtenidos de la molienda de árboles, ramas, raíces, hojas y serrín.

9. Una composición de aditivo alimentario o un ingrediente alimentario que comprende una biomasa lignocelulósica pretratada física y/o química y/o biológicamente, pretratada con al menos una enzima predigestiva en combinación con al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento, en donde la biomasa lignocelulósica pretratada física y/o química y/o biológicamente se trata además con dicha al menos una enzima predigestiva antes de mezclar la biomasa lignocelulósica pretratada física y/o química y/o biológicamente con dicha al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento, en donde además la al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento:

i) es funcional, o principalmente funcional, en el tracto gastrointestinal del animal de tal modo que, antes de entrar en el tracto gastrointestinal, el nivel de actividad enzimática definido como la cantidad de solubilización de material de biomasa con respecto a oligosacáridos y monosacáridos es menor que un 20% del nivel de actividad enzimática después de entrar en el tracto gastrointestinal; y/o

ii) se mezcla con dicha biomasa lignocelulósica pretratada cuando dicha biomasa lignocelulósica pretratada, la enzima en alimento o ambas están en un estado seco o sustancialmente seco, de tal modo que dicha biomasa lignocelulósica pretratada, la enzima en alimento o ambas comprenden menos de un 15% en peso de contenido de agua; y/o

iii) se encapsula antes de mezclarla con dicha biomasa lignocelulósica pretratada; y/o

iv) se mezcla con dicha biomasa lignocelulósica pretratada inmediatamente antes de alimentar a un animal con la composición de aditivo alimentario.

10. Una composición de aditivo alimentario o un ingrediente alimentario según la reivindicación 9, en donde, cuando la enzima en alimento es funcional, o principalmente funcional, en el tracto gastrointestinal del animal, la enzima en alimento está inactiva, o sustancialmente inactiva, en la composición de aditivo alimentario y/o en dicha biomasa lignocelulósica pretratada antes de alimentar a un animal con la composición de aditivo alimentario, de tal modo que la enzima en la composición de aditivo alimentario y/o en la biomasa lignocelulósica tiene menos de un 10% de su actividad en comparación con su actividad en el tracto gastrointestinal.

11. Un kit de aditivo alimentario que comprende un primer recipiente que incluye una biomasa lignocelulósica pretratada física y/o química y/o biológicamente, pretratada con al menos una enzima predigestiva, y un segundo recipiente que incluye al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento, e instrucciones para coadministrar las mismas, en donde la al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento se mezcla con dicha biomasa lignocelulósica pretratada inmediatamente antes de alimentar a un animal con la composición de aditivo alimentario.

12. Una composición de aditivo alimentario o un kit de aditivo alimentario según una cualquiera de las reivindicaciones 9-11, en donde la al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento comprende:

i) una de las siguientes actividades enzimáticas, o ambas: actividad de celulasa y/o actividad de hemicelulasa; o

ii) una o más de las siguientes actividades enzimáticas: actividad de endoglucanasa, actividad de endoxilanasa o actividad p-glucosidasa.

13. Una composición de aditivo alimentario o un kit de aditivo alimentario según una cualquiera de las reivindicaciones 9-12, en donde la al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento comprende al menos las siguientes actividades enzimáticas: actividad de celulasa y actividad de hemicelulasa, preferiblemente en donde la al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento comprende al menos las siguientes actividades enzimáticas: actividad de endoglucanasa, actividad de endoxilanasa y actividad de p-glucosidasa.

14. Una composición de aditivo alimentario o un kit de aditivo alimentario según una cualquiera de las reivindicaciones 12-13, en donde la al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento comprende además una de las siguientes actividades enzimáticas, o ambas: actividad de exoglucosidasa y/o actividad de polisacárido monooxigenasa lítica.

15. Un alimento o pienso que comprende una composición de aditivo alimentario o ingrediente alimentario según una cualquiera de las reivindicaciones 9, 10 o 12-14 o una composición de aditivo alimentario obtenible (preferiblemente obtenida) mediante el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8.

16. Una premezcla que comprende una composición de aditivo alimentario o ingrediente alimentario según una cualquiera de las reivindicaciones 9, 10 o 12-14 o una composición de aditivo alimentario obtenible (preferiblemente obtenida) mediante el método una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, y al menos un mineral y/o al menos una vitamina.

17. Una biomasa lignocelulósica pretratada física y/o química y/o biológicamente, pretratada con al menos una enzima predigestiva en combinación con una enzima glicosil hidrolasa en alimento, para utilizarla en la mejora de una característica biofísica de un animal, en donde la biomasa lignocelulósica pretratada física y/o química y/o biológicamente se trata adicionalmente con dicha al menos una enzima predigestiva antes de mezclar la biomasa lignocelulósica pretratada física y/o química y/o biológicamente con dicha al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento, y en donde además la al menos una enzima glicosil hidrolasa en alimento:

i) es funcional, o principalmente funcional, en el tracto gastrointestinal del animal de tal modo que, antes de entrar en el tracto gastrointestinal, el nivel de actividad enzimática definido como la cantidad de solubilización de material de biomasa con respecto a oligosacáridos y monosacáridos es menor que un 20% del nivel de actividad enzimática después de entrar en el tracto gastrointestinal; y/o

ii) se mezcla con dicha biomasa lignocelulósica pretratada cuando dicha biomasa lignocelulósica pretratada, la enzima en alimento o ambas están en un estado seco o sustancialmente seco, de tal modo que dicha biomasa lignocelulósica pretratada, la enzima en alimento o ambas comprenden menos de un 15% en peso de contenido de agua; y/o

iii) se encapsula antes de mezclarla con dicha biomasa lignocelulósica pretratada; y/o

iv) se mezcla con dicha biomasa lignocelulósica pretratada inmediatamente antes de alimentar a un animal con la composición de aditivo alimentario;

en donde además la característica biofísica se selecciona entre el grupo consistente en una o más de las siguientes: rendimiento del animal, comportamiento de crecimiento de un animal, índice de transformación de alimentos (FCR, por sus siglas en inglés), capacidad para digerir una materia prima (por ejemplo digestibilidad de nutrientes, incluyendo digestibilidad de almidón, grasa, proteínas, fibra), retención de nitrógeno, rendimiento de canal, tasa de crecimiento, aumento de peso, peso corporal, masa, eficiencia alimenticia, porcentaje de grasa corporal, distribución de grasa corporal, crecimiento, tamaño de los huevos, peso de los huevos, masa de los huevos, tasa de puesta de huevos, e impacto medioambiental, por ejemplo producción de estiércol y/o excreción de nitrógeno.

18. Una biomasa lignocelulósica pretratada física y/o química y/o biológicamente, pretratada con al menos una enzima predigestiva en combinación con una enzima glicosil hidrolasa en alimento, para utilizarla según la reivindicación 17, en donde, cuando la enzima en alimento es funcional, o principalmente funcional, en el tracto gastrointestinal del animal, la enzima en alimento está inactiva, o sustancialmente inactiva, en la composición de aditivo alimentario y/o en dicha biomasa lignocelulósica pretratada antes de alimentar a un animal con la composición de aditivo alimentario, de tal modo que la enzima en la composición de aditivo alimentario y/o en la biomasa lignocelulósica tiene menos de un 10% de su actividad en comparación con su actividad en el tracto gastrointestinal.

19. Una biomasa lignocelulósica pretratada física y/o química y/o biológicamente, pretratada con al menos una enzima predigestiva en combinación con una enzima glicosil hidrolasa en alimento, para utilizarla según la reivindicación 17, que adicionalmente comprende al menos un componente alimentario y/o al menos un mineral y/o al menos una vitamina.

20. Una composición de aditivo alimentario obtenible (preferiblemente obtenida) mediante el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, o una composición de aditivo alimentario según una cualquiera de las reivindicaciones 9, 10 o 12-14, o un alimento según la reivindicación 15 o una premezcla según la reivindicación 16, para utilizarlos en la mejora de una característica biofísica de un animal, en donde la característica biofísica se selecciona entre el grupo consistente en una o más de las siguientes: rendimiento del animal, comportamiento de crecimiento de un animal, índice de transformación de alimentos (FCR), capacidad para digerir una materia prima (por ejemplo digestibilidad de nutrientes, incluyendo digestibilidad de almidón, grasa, proteínas, fibra), retención de nitrógeno, rendimiento de canal, tasa de crecimiento, aumento de peso, peso corporal, masa, eficiencia alimenticia, porcentaje de grasa corporal, distribución de grasa corporal, crecimiento, tamaño de los huevos, peso de los huevos, masa de los huevos, tasa de puesta de huevos, e impacto medioambiental, por ejemplo producción de estiércol y/o excreción de nitrógeno.

21. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -8, en donde el método comprende además poner en contacto un componente alimentario con la composición de aditivo alimentario.

22. Un método para preparar un pienso que comprende poner en contacto un componente alimentario con una composición de aditivo alimentario o ingrediente alimentario según una cualquiera de las reivindicaciones 9, 10 o 12­ 14 o una composición de aditivo alimentario obtenible (preferiblemente obtenida) mediante el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8.