ES2853355T3 - Formulación inmunogénica que contiene BCG vivas recombinantes que expresan antígenos de Metapneumovirus (hMPV), en una suspensión que se prepara a partir de un liofilizado sin la necesidad de adyuvante, apta para su uso farmacéutico - Google Patents

Abstract

La presente invención describe una formulación inmunogénica para ser utilizada en mamíferos contra Metapneumovirus humano (hMPV) consistente en un liofilizado de 1x109 ufc/ml de BCG recombinantes que expresa la proteína viral P de hMPV (de los genogrupos A1, A2, B1 y B2). La vacuna esta derivada del producto completo o parcial del gen P de hMPV pudiendo ser utilizadas, estabilizadas y administradas en solución sin la necesidad de adyuvantes. La preparación puede contener además combinaciones de formulaciones descritas anteriormente. La formulación está estabilizada por liofilización (rango de conservación entre 4°C y 8°C), para ser posteriormente reconstituida en una solución salina sin adyuvante previo a su uso.

Description

DESCRIPCIÓN

Formulación inmunogénica que contiene BCG vivas recombinantes que expresan antígenos de Metapneumovirus (hMPV), en una suspensión que se prepara a partir de un liofilizado sin la necesidad de adyuvante, apta para su uso farmacéutico

Campo de la invención

La presente invención se relaciona con los campos de inmunología y biotecnología, y está específicamente dirigida a una formulación inmunogénica basada en una bacteria atenuada recombinante para ser utilizada en la preparación de una vacuna contra Metapneumovirus humano (hMPV). Esta formulación contiene el Bacilo de Calmette-Guerin (BCG) recombinante, que expresa el péptido antigénico proteína P del virus hMPV.

Antecedentes de la invención

El Metapneumovirus humano (de ahora en adelante hMPV), es el agente etiológico de un alto porcentaje de las hospitalizaciones y la morbilidad asociadas a enfermedades respiratorias agudas de los tractos respiratorio superior e inferior, especialmente en infantes, personas de la tercera edad e individuos inmunocomprometidos. La infección por este virus se asocia con un amplio rango de condiciones, dentro de las cuales la bronquiolitis y neumonía corresponden a los cuadros con mayor impacto socio-económico. Adicionalmente, han sido asociadas con gastroenteritis, y queratoconjuntivitis. Calvo et al (2008) demostraron en un período de estudio de 3 años que la incidencia acumulada de infecciones respiratorias agudas causada por los virus respiratorios VRS, ADV y hMPV, son responsables del 64,5% de las hospitalizaciones de niños menores de 2 años, siendo la incidencia para cada uno de los virus de 35,4%, 19,3% y 9,8% respectivamente. Una característica interesante que hMPV comparte con los otros virus respiratorios de alta incidencia es la producción de infecciones repetidas a lo largo de la infancia, fenómeno posiblemente asociado a una falla en el establecimiento de una respuesta inmune protectora frente a la primera infección durante los primeros meses de vida. Este último fenómeno motiva la urgente necesidad en los sistemas públicos de salud por nuevos prototipos de vacunas capaces de controlar brotes anuales de infecciones respiratorias, de tal modo que permita disminuir la congestión de los centros asistenciales y en último término, el impacto socio-económico asociado a estas infecciones. No hay estudios hasta el momento del impacto económico específico que ocasiona la infección por hMPV, sin embargo, la incidencia de hospitalización por hMPV se ha estimado en 1/3 respecto de la incidencia de hospitalización por virus respiratorio sincicial humano (hRSV). Estudios realizados en países desarrollados, estiman que el coste individual de la infección por hRSV es de sobre 3,000 euros ($1.86 millones de pesos chilenos) con un límite superior de hasta 8,400 euros ($5.2 millobes de pesos chilenos). Los costes por concepto de hospitalización individual se sugieren aproximados, considerando que el proceso patológico que amerita la hospitalización es de similares características.

El virus hMPV se clasifica en la familia Paramyxoviridae subfamilia Pneumovirinae, la misma en que se clasifica hRSV, si bien cada uno está agrupado dentro de los géneros Metapneumovirus y Pneumovirus, respectivamente. El genoma de hMPV está compuesto por ácido ribonucleico de hebra simple (ssRNA) no segmentada de sentido negativo, por lo que las proteínas virales se organizan en sentido 3'a 5' (con respecto a su secuencia) de la siguiente forma: N, P, M, F, M2 (ORF1 y 2), SH, G y L. Cinco de estas proteínas son responsables del empaquetamiento del material genético y de definir la estructura propia de la partícula viral, correspondiendo a la proteína de nucleocápside N y la proteína de matriz M, junto a las glicoproteínas de transmembrana F, G y SH, respectivamente. Las otras cuatro proteínas, M2-1, M2-2, P y L, están involucradas en la replicación y transcripción viral. Existen 2 subtipos de hMPV, clasificados como A y B respecto de dos grupos antigénicos basados en diferencias de secuencia principalmente en las proteínas F y G. Si bien estas proteínas presentan cierto grado de diferencia, existe una alta identidad respecto de las otras proteínas codificadas por el genoma viral.

El desarrollo de vacunas contra virus respiratorios se inició en la década de 1960 con el primer prototipo de vacuna contra hRSV, basado en virus inactivado por formalina (hRSV-FI), que presentó importantes efectos adversos que impidieron utilización en programas de inmunización. La formulación intramuscular acompañada del adyuvante hidróxido de aluminio produjo en los infantes vacunados un cuadro más severo que en aquellos individuos que se infectaron que no fueron vacunados. Este efecto fue asociado con una híper-reactividad de la respuesta inmune frente a la infección, caracterizándose por una elevada infiltración parenquimatosa de polimorfonucleares, eosinófilos y neutrófilos además de un elevado título de anticuerpos fijadores de complemento.

Contra Metapneumovirus humano (hMPV) se han desarrollado pocas vacunas y hasta el momento ninguna ha tenido un resultado satisfactorio. Un prototipo que utilizó el mismo diseño anterior de virus inactivado por formalina (hMPV-FI), también demostró producir cuadros de híper-reactividad inflamatoria de similares características al producido por la vacuna contra hRSV en el modelo Sigmodon hispidus de infección (Yim et al., 2007). A diferencia de los procesos de híper-reactividad observados para hVRS, se demostró eliminación parcial del virus desde el sistema respiratorio. La enfermedad observada en ratones y Sigmodon hispidus expuestos a hVRS-FI se asoció a una respuesta inmune patológica basada en anticuerpos de tipo Th2 y una activación exagerada de NF-kB. El incremento en la actividad transcripcional NF-kB se relaciona adicionalmente con la secreción de citoquinas pro-inflamatorias como IL-8. Por otro lado, la híper-reactividad del tejido pulmonar luego de la infección por hMPV ha sido asociada a respuestas inmunes caracterizadas por la presencia de IFN-y e IL-4 en lavado bronco-alveolar y la detección de anticuerpos neutralizantes de los isotipos IgG1 e IgG2a en suero de ratones enfermos, sugiriendo fuertemente que la inflamación crónica observada se debe a respuestas patológicas de los tipos Th1 y Th2, o bien, a una insuficiente respuesta basada en células de tipo Th1 que se ve acompañada de una respuesta patológica Th2. En cuanto a este último postulado, algunos autores han propuesto que una respuesta incrementada del tipo Th1, también podría exacerbar la enfermedad.

Estos antecedentes destacan la importancia de establecer una respuesta inmune equilibrada y eficaz, capaz de limitar el progreso del proceso inflamatorio y a la vez, inducir una adecuada eliminación de estos virus desde los tejidos infectados.

Debido a que la enfermedad respiratoria causada por hMPV es similar a lo visto anteriormente con hVRS, que se ha asociado con una falla en la inducción de inmunidad celular, es necesario generar un prototipo de vacuna cumpla con ser un buen inductor de células T CD8+ citotóxicas y células T CD4+ helper, ambos productores de IFN-y. Las aproximaciones experimentales recientes han enfocado sus esfuerzos en el desarrollo de vacunas contra sólo una especie viral, mediante el uso de distintas técnicas de genética molecular e inmunología. Es importante mencionar que estos estudios han utilizado una cantidad limitada de proteínas o subunidades proteicas como antígenos para cada virus de interés. Para hVRS, algunas de ellas se han basado en el uso de proteínas virales individuales, como subunidades completas o fragmentos, de las proteínas F o G, o una mezcla de ellas en modelos de infección murino y primates no humanos. Se han utilizado en ensayos clínicos de fase I y II algunos prototipos de vacuna contra hVRS, pero los resultados no han demostrado una capacidad protectora a largo plazo, y las vacunas distan de ser adecuadas para su uso masivo en la profilaxis de la infección (Denis et al., 2005; Karron et al., 2005).

Mediante la eliminación de genes que se ha sugerido se relacionan con la patogenicidad viral se han desarrollado cepas de hMPV atenuadas. Cepas de hMPV carentes de los genes que codifican para las proteínas SH, G, M2-1 y m 2-2 se han planteado como candidatos para vacunas (Biacchesi et al., 2005). Estos candidatos han presentado buenos resultados en modelos animales pero aún no se han realizado estudios en seres humanos. Si bien, esta alternativa es viable, resulta ser costosa ya que requiere de la producción de virus en cultivos celulares que estén aprobados para uso en seres humanos. Otra fuente de vacuna es la sobreexpresión de proteínas virales por sistemas heterólgos, como la proteína F de hMPV, acoplada a adyuvantes genera anticuerpos neutralizantes, pero la desventaja de esta opción es que proporcionan inmunidad por un periodo muy corto de tiempo (Herfst et al., 2008a).

No existen estudios clínicos para candidatos de vacunas contra hMPV, pues no se ha podido desarrollar prototipos capaces de generar inmunidad protectora. Los prototipos hasta ahora evaluados en modelos animales generan una inmunidad basada en anticuerpos de tipo Th2, que no son de largo plazo ni eficientes previniendo la infección. Animales vacunados con estos prototipos, si bien generan anticuerpos neutralizantes in vitro, no son protegidos contra la infección ni tampoco disminuyen los síntomas clínicos de la enfermedad inducida por la infección de hMPV en ratones (Cseke et al., 2007) o en macacos (Herfst et al., 2008b). La inmunidad basada en anticuerpos tampoco es eficiente neutralizando el virus in vivo. Anticuerpos capaces de neutralizar el hMPV in vitro, no son capaces de prevenir la infección ni la enfermedad ocasionada por hMPV, cuando se utilizan como terapias mediante inmunización pasiva (Hamelin et al., 2008). Por otra parte, se ha observado que la resolución del cuadro viral requiere de la participación de una repuesta inmune basada en células, de tipo Th1. Se demostró que la resolución del cuadro viral y la remoción de partículas virales es dependiente de la activación de linfocitos c D4+ y CD8+, si bien la actividad de estos es responsable también de la inmunopatologia de la enfermedad (Kolli et al., 2008). Más recientemente se ha visto que los principales efectores en la resolución del cuadro viral son células citotóxicas de tipo CD8+, si bien los linfocitos T helper CD4+ tienen una participación regulatoria. Por esto, es necesaria una respuesta inmune equilibrada de tipo celular Th1 para producir la resolución del cuadro viral sin generar hiper-reactividad inflamatoria. El documento WO2005/027825 se refiere a vacunas que comprenden sistemas de expresión del virus de la parainfluenza recombinante (PIV) que codifican antígenos heterólogos derivados de metaneumovirus. El documento US 2011/200634 describe una cepa de Mycobacterium atenuada (BCG) que es recombinante para una o más proteínas inmunogénicas del RSV de neumovirus (paramixovirus). En resumen, no existe en la actualidad una vacuna contra el Metapneumovirus humano (hMPV) que otorgue una protección efectiva y que no tenga efectos secundarios importantes, de hecho no existen vacunas comerciales disponibles contra este virus.

Sorprendentemente los inventores han encontrado que el uso de una cepa de Mycobacterium recombinante que expresa la proteína P del Metapneumovirus humano permite generar una inmunidad protectora contra la infección por el virus respiratorio Metapneumovirus, sin provocar efectos secundarios no aceptables, tales como hiper-reactividad inflamatoria en las vías aéreas. Esta invención viene a solucionar un problema técnico que permanecía sin solución en el arte previo, que consiste en una formulación inmunogénica que otorgue protección contra infecciones por hMPV y no genere hiper-reactividad inflamatoria.

La invención está definida por las reivindicaciones y cualquier otro aspecto o realización aquí establecido que no esté dentro del alcance de las reivindicaciones es solo para información.

Descripción de las figuras

Figura 1: Generación de la construcción pMV361-P-hMPV. A partir de RNA de metapneumovirus se realizó la transcripción reversa con partidores universales y posteriormente se amplificó con los partidores P-hMPV-Fw y PhMPV-Rv del marco abierto de lectura del gen P. Al producto de amplificación se le incorporó lo sitios EcoRI en ambos extremos y se insertó en el sitio EcoRI del vector micobacteriano pMV361 para generar la construcción del vector pMV361-P-hMPV. La Figura 1A muestra el genoma de hMPV, y el gen que codifica para la proteína P, y la Figura 1B muestra el vector pMV361-P-hMPV que incorpora dicho gen que codifica para la proteína P.

Figura 2. Expresión de la proteína P o proteína M2.1 de hMPV por cepas recombiantes de Mycobacterium BCG.

Se electrotransformó la cepa Danish de Mycobacterium BCG con el plásmido pMV361-P-hMPV y se seleccionó en medio agar Middlebrook 7H10 suplementado con ácido oleico, albumina, dextrosa y catalasa que contiene kanamicina 20 |ig/ml. Se realizó una electroforesis SDS-PAGE (CB) y un Western Blot (WB), utilizando anticuerpos monoclonales anti proteína P de hMPV (WB). Figura 2A: western blot, utilizando anticuerpos monoclonales anti la proteína P de hMPV y Figura 2B: western blot, utilizando anticuerpos monoclonales anti la proteína M2.1 de hMPV. En el SDS-PAGE se cargó 25 |ig de proteína total preparada de cuatro clones de rBCG-P-hMPV (Figura 2A) o cinco clones de rBCG-M2.1-hMPV (Figura 2B). Como control positivo se cargaron 5 ng de proteína recombinante P-hMPV o 25 |ig de hMPV inactivado según corresponda. Como control negativo se cargó proteína total de la cepa tipo silvestre de BCG y en el caso de rBCG-P-MPV además una BCG recombinante para el gen N de VRS (cepa N-5). Se puede apreciar que todos los clones analizados expresan la proteína del plásmido clonado, ya sea la proteína P, Figura 2A, o la proteína M2.1, Figura 2B.

Figura 3. Inmunización con rBCG-P-hMPV recombinante protege contra la infección con hMPV. Grupos de ratones BALB/c de 4-8 semanas de vida recibieron una dosis subdérmica de 1 x 108 unidades formadoras de colonia (UFC) de rBCG-M2.1-hMPV, rBCG-P-hMPV o BCG-WT (silvestre) también se vacunaron con 1x106 unidades formadoras de placas (UFP) de virus vivo (Live-hMPV) o virus inactivado por UV (UV-hMPV). Posteriormente todos los grupos fueron infectados vía intranasal con 1 x 106 ufp de hMPV. Como grupos control se incluyó animales sin vacunar y otro grupo de animales sin infectar. Durante los seis días posteriores a la infección se registró el peso de los animales y se sacrificaron al término del experimento y de cada uno se obtuvo el lavado bronco alveolar (BAL) y pulmón. Los símbolos representan a cada animal individual y la barra horizontal es la media. (Figura 3 A) Gráfico de la pérdida peso por grupo de animales posterior a la infección. (Figura 3 B) Total de células que infiltran las vías aéreas. (Figura 3 C) Porcentaje de células que dan reacción positiva a la doble tinción para CD11 b y Gr1 en el BAL.

(Figura 3 D) Determinación de RNA de hMPV en el pulmón de ratones infectados, mediante PCR cuantitativa. Se obtuvo RNA total del pulmón de cada animal sacrificado y se utilizó para producir cDNA mediante transcripción reversa. Posteriormente el cDNA generado se utilizó en una reacción de PCR cuantitativa para determinar el número de copias de RNA viral presente en la muestra respecto del número de copias del RNA de p-actina. En la Figura 3A se puede apreciar que las vacunas recombinantes BCG para proteínas P (•) y M2 (♦ ) fueron protectoras en la pérdida de peso del animal posterior a la infección, obteniéndose un peso similar al animal sin infectar (▼). Por otra parte los animales sin inmunizar (A ) o inmunizados con BCG silvestre (BCG-WT) (■ ), Live-hMPV (■ ) o UV-hMPV (•) sufrieron pérdida de peso corporal del animal posterior a la infección. En la Figura 3B y 3C se observa que la vacuna recombinante BCG para la proteína P previno la infiltración de células inmunes en las vías aéreas del animal posterior a la infección, obteniéndose una infiltración similar al animal sin infectar. Por otra parte los animales sin inmunizar o inmunizados con BCG silvestre, BCG-WT, Live-hMPV o UV-hMPV sufrieron la infiltración de células inmunes en sus vías aéreas posterior a la infección. La vacunación con rBCG-M2 confirió una protección incompleta. En la Figura 3D se aprecia que el número de virus de hMPV expresados en copias del gen N-hMPV por 5000 copias de D-actina, presentes en los pulmones de animales infectados no inmunizados es similar al de animales infectados inmunizados con BCG-WT, Live-hMPV o UV-hMPV, es decir, no otorgarían protección, mientras que los animales infectados inmunizados con rBCG-P-MPV prácticamente no se encuentra el virus, al igual que en animales no infectados. La inmunización con rBCG-M2 otorgó una protección no completa.

Figura 4 La inmunización con rBCG-P-hMPV protege contra la inflamación después del desafío con hMPV. Los pulmones de animales removidos 6 días después del desafío con 1 x 106 UFP de hMPV, fueron fijados en paraformaldehido y e incluidos en parafina y cortes de 7 |im fueron teñidos con hematoxilina y eosina. Se observa una significativa infiltración de células polimorfas nucleares en animales no inmunizados o inmunizados con rBCG-M2.1-hMPV o BCG-WT. Sin embargo, no se observan signos de inflamación en pulmones obtenidos de animales inmunizados con rBCG-P-hMPV. Las imágenes son representativas de seis experimentos independientes. HSP representa la cuantificación de una puntuación de inflamación por grupo de animales (Histopathology Score). Se puede apreciar que la inflamación en animales inmunizados con rBCG-P-MPV e infectados fue muy baja o inexistentes, similar a lo apreciado en animales no infectados.

Figura 5. La inmunización con rBCG-P-hMPV produce un perfil de citoquinas tipo Th1. Para determinar cuál es el tipo de respuesta inmune responsable de la inmunidad por rBCG-P-hMPV, se analizó el perfil de citoquinas de células de bazo de BALB/cj inmunizados con la cepa BCG recombinante para proteína P de hMPV (rBCG-P-hMPV, en los gráficos: rBCG-P). Se recuperó el bazo de cuatro ratones BALB/cj inmunizados con rBCG-P-hMPV y las células de bazo se estimularon durante 7 días por incubación con 10 |jg de proteína P-hMPV o PBS (en los gráficos U/S). Como control, las células de bazo de BALB/cj inmunizados con BCG- Wt se cultivaron en las mismas condiciones. El sobrenadante de las células de bazo de rBCG-P-hMPV y BCG-WT estimuladas y no estimuladas se les determinó por ELISA los niveles de (A) IFN-y, (B) IL-2, (C) IL-5 y (D) IL-4 a los días 4 y 7 de cultivo. Las células de bazo derivadas de rBCG-P-hMPV estimuladas con proteína P-hMPV (rBCG-P) secretan cantidades significativamente mayores de IFN-y en comparación con células provenientes de animales inmunizados con BCG-WT o células no estimuladas (rBCG-P U/S) (*** p <0,001, prueba t de Student), Figura 5 A . Además, las cantidades de IFN-y aumentaron entre el día 4 a 7 (* p <0,05, prueba t de Student), Figura 5 A . Las células de bazo estimuladas, de ratones inmunizados con rBCG-P-hMPV (rBCG-P) producen cantidades significativamente mayores de IL-2 al 4 día respecto de células no estimuladas (rBCG-P U/S) y disminuyó al nivel basal en el día 7 (**, p <0,001; ns = no significativo prueba t de Student), Figura 5 B. Las células de bazo secretaron cantidades bajas de IL-5 e IL-4 sin mostrar incremento respecto de células de bazo provenientes de BCG-WT o no estimuladas (ns = prueba no significativa t de Student), Figura 5 C.

Figura 6. Transferencia de Linfocitos T de ratones inmunizados con rBCG-P-hMPV confieren resistencia a la infección por hMPV en ratones naive. Se purificaron linfocitos T CD4+ y linfocitos T CD8+ desde esplenocitos estimulados y no estimulados con proteínas recombinantes virales. Se transfirió independientemente a través de la vena caudal de ratones naive, dos millones de linfocitos T CD4+ o CD8+, estimulados o sin estimular provenientes de animales inmunizados con rBCG-P-MPV o BCG-WT. Veinticuatro horas después de la transferencia, los ratones fueron infectados vía intranasal con 1x106 ufp de hMPV. En la Figura 6A los ratones transferidos con linfocitos T CD4+ y/o CD8+ de ratones inmunizados con rBCG-P-hMPV no muestran ninguna diferencia en el peso corporal en comparación con los ratones no infectados. Por el contrario se observa que los ratones transferidos con linfocitos T CD4+ y/o CD8+ de ratones inmunizados con BCG-WT, perdieron significativamente más peso tras la infección, en comparación con los animales no infectados (p <0,0001) (Figura 6B). La figura 6C muestra que en el lavado bronco alveolar, BAL, de ratones naive previamente transferidos con linfocitos T CD4+ y/o CD8+ de ratones inmunizado con rBCG-P-hMPV (P-CD8, P-CD4, P-CD8/4), presentan una infiltración significativamente menor de granulocitos en comparación a ratones transferidos con linfocitos T de BCG-WT (Wt-CD8, Wt-CD4, Wt-CD8/4) (*** p <0,0001, prueba t de Student). La infiltración de granulocitos en BAL de ratones transferidos con linfocitos T de BCG-WT o no inmunizados no muestran diferencias significativas con infiltración de ratones que no recibieron linfocitos T (NS = no significativo, prueba t de Student). La Figura 7D muestra que la carga viral en los pulmones de ratones transferidos con linfocitos T (P-CD8, P-CD4, P-CD8/4) provenientes de ratones inmunizados con rBCG-P-hMPV, fue baja en comparación con la carga viral de ratones transferidos con linfocitos T (Wt-CD8, Wt-CD4, Wt-CD8/4) de animales inmunizados con la cepa BCG-WT y sin inmunizar (***, p <0,0001, prueba t de Student). En los pulmones de ratones transferidos con linfocitos T de BCG-WT (Wt-CD8, Wt-CD4, Wt-CD8/4), la carga viral no muestra diferencias significativas con los ratones sin inmunizar (ns = no significativo, prueba t de Student). La carga viral se cuantificó como copias génicas de N-hMPV por RT-qPCR, como se describió anteriormente.

Descripción detallada de la invención

La presente invención consiste en una formulación inmunogénica contra hMPV que comprende una cepa BCG recombinante que expresa la proteína P del Metapneumovirus humano. Esta formulación otorga protección efectiva contra infecciones por hMPV y no genera una respuesta de hiper-reactividad inflamatoria.

La formulación de la invención se puede suministrar sola o mezclada con otras vacunas, como por ejemplo con una formulación inmunogénica contra VRS, en una dosis mixta que entregaría protección contra la infección y/o las complicaciones asociadas a hMPV y VRS.

La formulación inmunogénica detallada en esta invención puede ser utilizada para preparar vacunas que contengan bacterias recombinantes vivas atenuadas, provenientes de cultivos axénicos en dosis de entre 1x104 ufc a 1x1010 ufc por dosis, especialmente se prefieren dosis de 1x108 ufc por dosis. La formulación se presentará liofilizada con una solución reconstituyente que no necesita adyuvante, pues la composición de la envoltura celular de la bacteria recombinante es el adyuvante. La formulación inmunogénica liofilizada de la invención se debe conservar entre 4 y 8° C, protegida de luz solar directa e indirecta, en presentación de dos frascos separados, uno con la bacteria recombinante liofilizada, y otro con la solución salina reconstituyente, a mezclar previa a su administración.

Desde su introducción en 1921, la vacuna basada en Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin (BCG) se ha utilizado en más de mil millones de personas y se utiliza actualmente alrededor del mundo contra la tuberculosis.

Los inventores han encontrado que una manera de desplazar el equilibrio de la respuesta inmune desde una respuesta de tipo Th2 pro inflamatoria cuya protección no es duradera en el tiempo hacia una respuesta de tipo Th1 basada en células, específicamente células T CD8+ citotóxicas y células T CD4+ helper es utilizar adyuvantes como los componentes de la pared celular de Mycobacterium. Específicamente, expresar la proteína inmunogénica de hMPV en Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin (BCG).

Las proteínas F y G de hPMV se encuentran en la superficie de la partícula viral y por lo tanto son accesibles a anticuerpos circulantes. Por esta razón dichas proteínas serían la elección más obvia para realizar una vacuna basada en la producción de anticuerpos para prevenir una infección por hMPV.

No obstante lo anterior, en la presente invención se ha escogido utilizar como inmunógeno proteínas de la cápside no expuestas, específicamente la proteína P, acompañada de un adyuvante que promueve una respuesta basada en células de tipo Th1, como es la bacteria atenuada Mycobacterium bovis BCG. Se ha visto que proteínas de la cápside como M2.1 de hMPV promueven la activación de linfocitos citotóxicos (LTC). Sorprendentemente, en la presente invención se describe que el uso de la proteína P, una proteína no expuesta del virus hMPV al ser utilizada como proteína inmunógena, expresada por Mycobacterium permite formular una composición inmunogénica que, al ser utilizada como vacuna o composición inmunogénica, otorga una protección efectiva sin efectos secundarios indeseados tales como hiper-reactividad inflamatoria

Las proteínas recombinantes expresadas por la bacteria vector utilizada en esta invención se obtiene mediante la clonación de los genes que las codifican provenientes del virus hMPV del grupo A en vectores de expresión procariontes, todos disponibles comercialmente. El genoma de Metapneumovirus (hMPV) ha sido descrito con anterioridad y se encuentra disponible en las bases de datos de GeneBank, número de acceso: AB503857.1, DQ843659.1, DQ843658.1, EF535506.1, GQ153651.1, AY297749.1, AY297748.1, AF371337.2, FJ168779.1, FJ168778.1, NC_004148.2 y AY525843.1. La obtención de la cepa bacteriana recombinante descrita en esta invención, considera la expresión heteróloga de las proteínas virales durante la replicación bacteriana en el hospedero. Las secuencias de DNA heterólogo se integran al DNA cromosómico bacteriano mediante el vector de expresión pMV361. Estas proteínas de hMPV pueden ser modificadas genéticamente, como por ejemplo, mediante la incorporación de secuencias peptídicas o dominios de glicosilación y/o posterior destinación a receptores endocíticos o fagocíticos de células presentadoras de antígeno, mediante su acoplamiento a ligandos naturales mediante el uso del sistema biotina-estreptavidina (utilizando para ello kits comerciales de biotinilación y modificación genética de las proteínas virales mediante acoplamiento a la proteína bacteriana estreptavidina, o bien, mediante la introducción de la secuencia genética codificante de secuencias aminoácidicas descritas como señales de biotinilación en las proteínas o fragmentos proteicos recombinantes, utilizando técnicas previamente descritas para sistemas de expresión heteróloga procarionte y/o eucarionte) .

La formulación inmunogénica de la invención comprende la expresión de la proteína P de hMPV, en una cepa atenuada de la cepa Danish Mycobacterium Bacillus Calmette-Guerin (BCG). La proteína P de hMPV es la proteína P de Metapneumovirus del subtipo A.

La cepa atenuada de Mycobacterium recombinante de la invención puede contener las secuencias de ácidos nucleicos que codifican para la proteína P de hMPV insertado en el genoma de la bacteria o en un plásmido extracromosomal, en una o más copias. La expresión de la proteína puede estar bajo el control de promotores constitutivos o inducibles, endógenos o exógenos de Mycobacterium BCG.

La proteína P de hMPV puede expresarse en forma soluble, soluble-citoplasmática, como proteína extracelular secretada, o unida a membrana.

La formulación inmunogénica de la invención puede comprender dos o más cepas atenuadas recombinantes de Mycobacterium, en donde la proteína P de hMPV de las cepas se expresan para generar un número diferente de copias, se expresan constitutivamente o inducibles, y/o están ubicados en diferentes localizaciones celulares.

La formulación inmunogénica que se divulga en la presente invención puede ser utilizada en conjunto con formulaciones inmunogénicas que contienen otras formulaciones antigénicas contra virus diferentes de hVRS y hMPV, con cepas atenuadas de BCG y vacunas estacionales contra influenza A y B.

La formulación inmunogénica anteriormente descrita puede ser aplicada al individuo de forma subcutánea/subdérmica en conjunto con una solución salina tampón (PBS, tampón fosfato de sodio) o solución salina.

Para desarrollar la bacteria recombinante Mycobacterium que expresa la proteína P de hMPV, en primer lugar debe generarse un vector que exprese dicha proteína. Puede utilizarse cualquier vector de expresión micobacteriano conocido, y debe insertarse el gen que codifica para la proteína P del virus hMPV en fase con su región promotora. En una realización preferida se realiza una transcripción reversa con partidores universales desde el RNA de metapneumovirus humano aislado. Posteriormente el gen de la proteína P se amplifica con partidores específicos (Figura 1A). El producto de amplificación se inserta en el vector de expresión. En la presente invención se ha utilizado el vector de expresión micobacteriano pMV361, generando el vector pMV361-P-hMPV (Figura 1B).

Una vez obtenido el vector se utiliza para transformar la cepa Mycobacterium, tal como Mycobacterium BCG. Para efectos de la invención puede utilizarse cualquier cepa Danish BCG conocida,. El método de transformación puede ser cualquier método disponible, especialmente se prefiere electrotransformación. Posteriormente se deben seleccionar las células transformadas que expresan proteína P de hMPV.

Estas células recombinantes constituyen la formulación inmunogénica de la invención, la que se provee en cantidades de entre 104 a 109 UFC/dosis en un tampón salino farmacológicamente aceptable.

Adicionalmente la formulación de la invención puede formularse en combinación con cepas BCG recombinantes que expresen proteínas inmunogénicas de virus sincicial respiratorio (VRS). En un ejemplo, la bacteria recombinante b Cg que expresa la proteína P de hMPV se provee en conjunto con bacterias recombinantes BCG que expresan proteínas N, P, M, F, M2 (ORF1 y 2), SH, G o L de VRS. En un ejemplo, la formulación inmunogénica de la invención se utiliza en combinación con una cepa BCG recombinante para el gen N de VRS. Particularmente, se prefiere la combinación de BCG recombinante para el gen P de hMPV subtipo A y BCG recombinante para el gen N de VRS subtipo A.

En otr ejemplo, se transforma una cepa de BCG con un vector que expresa la proteína P de hMPV y luego la célula transformada se vuelve a transformar con un vector que exprese una proteína de virus sincicial respirtatorio (VRS). La proteína de VRS se escoge entre N, P, M, F, M2 (ORF1 y 2), SH, G o L. Particularmente, se prefiere transformar en primer lugar con un vector que expresa la proteína P de hMPV subtipo A, y en segundo lugar someter estas cepas transformadas a una segunda transformación con un vector que exprese el gen N de VRS subtipo A, obteniendo una cepa BCG que expresa simultáneamente las proteínas P de hMPV subtipo A y N de VRS subtipo A.

La formulación inmunogénica de la invención se puede proveer liofilizada en una presentación multidosis lista para reconstituirse en 1 ml de una solución salina adjunta, para obtener una solución 1x109 ufc/ml de solución reconstituida. Cada 0,1 ml de solución resuspendida contendrá la dosis apropiada de 1x108 ufc para la administración.

Para preparar la solución liofilizada las cepas transformadas de la invención pueden suspenderse en cualquier solución de liofilización apropiada, por ejemplo se puede emplear el tampón LYO C, compuesto por manitol al 4% (p/v), Tyloxapol al 0,05% (p/v), sacarosa al 0,25% e histidina 5 mM. para luego ser liofilizada y conservada a 25°C.

La solución reconstituyente puede ser cualquier solución disponible en la técnica, en una realización se prefiere una solución diluida Sauton SSI (125 |jg MgSO4, 125 |jg K²HPO⁴, 1 mg L-asparragina, 12,5 |jg citrato de amonio férrico, 18,4 mg 85% glicerol, 0,5 mg ácido cítrico en 1 ml de H2O) a -80°C. En otra realización la formulación de la invención puede suspenderse en una solución de PBS (137 mM NaCl; 2,7 mM KCl; 4,3 mM Na2HPO4; 1,47 mM KH2PO4, pH 7,4), suplementado con Glicerol 20% y Tween 80 0,02% a una concentración final de 108 bacterias por 100 |jl y conservadas a -80°C. Ambos en presencia de un detergente no iónico como Tween®-80 al 0,1% o Tyloxapol al 0,05%. La formulación de la invención debe mantenerse entre 4 a 8°C, antes y después de reconstituir, en todo momento alejada de la luz solar directa e indirecta y una vez reconstituida deberá eliminarse al final del día.

Los siguientes ejemplos de la generación y uso de la formulación inmunogénica contra hMPV a base de la bacteria recombinante Mycobacterium que expresa proteínas virales son solamente ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de producción o aplicación de la invención.

Ejemplos

Ejemplo I: Generación de un vector recombinante permite la expresión de la proteína P del hMPV en la bacteria Mycobacterium BCG.

A partir de RNA de metapneumovirus se amplificó la región codificante del gen P utilizando los siguientes partidores: P-hMPV_Fw: GAATT CAT GT CATTCCCT GAAGGAAA (SEQ ID No 1) y P-hMPV_Rv: GAATTCCTACATAATTAACTGGTAAA (SEQ ID No 2), donde las secuencias subrayadas incorporan el sitio EcoRI en ambos extremos del producto de amplificación, Figura 1A. El vector micobacteriano pMV361 se linearizó en el sitio EcoRI, lo que permitió insertar la siguiente secuencia correspondiente al gen P de hMPV:

GAATT CAT GT C ATT CC CT G AAG G AAAAG AT ATT CTTTT CAT G G GT AAT G AAG C G GC AAAA TT G GC AG AAGCTTTCC AAAAAT CATTAAG AAAACCTAGT CAT AAAAG AT CT CAAT CT ATT A T AGG AG AAAAAGT GAAC ACT GTATCT GAAACATTGG AATTACCT ACT AT C AGT AGACCT A CCAAACCGACCATATTGTCAGAGCCGAAGTTAGCATGGACAGACAAAGGTGGGGCAAT CAAAACT GAAGCAAAGCAAACAAT CAAAGTT ATGGATCCTATT GAAGAAGAAGAGTTTAC T G AG AAAAG GGTGCT GCCCT CCAGT GATGGGAAAACT CCTG CAG AAAAG AAGTT GAAA CC AT C AACCAAT ACT AAAAAG AAG GT CT C ATTT ACAC C AAAT G AACC AG GAAAAT ACACA AAGTT GGAG AAAGAT GCT CT AG ACTT GCTTT CAGACAAT G AAGAAGAAGAT GCAG AAT C CT CAAT CTTAACCTT CG AAGAAAGAGAT ACTT CAT CATT AAGCATT GAAGCCAGACT AGA ATCGATT GAGGAG AAATT AAGCAT GAT ATT AGGGCT ATT AAGAACACT CAACATT GCTAC AGCAGGACCCACAGCAGCAAGAGAT GGGAT CAGAG AT GCAAT GATT GGCAT AAGGGAG G AACT AAT AGCAG AC AT AAT AAAAG AAG CCAAGG GAAAAGCAG CAG AAAT GAT G GA AG A AGAAAT GAACCAGCGG ACAAAAAT AGGAAACGGT AGT GTAAAATT AACT GAAAAGGC AA AGGAGCT CAACAAAATT GTT GAAGACGAGAGCACAAGT GGT GAAT CCGAAGAAGAAGAA G AACT AAAAG AC ACAC AGG AAAAT AAT C AAG AAG AT GAC ATTT ACCAGTT AATT ATGT AG GAATTC (SEQ ID No 3)

La inserción del marco de lectura abierto del gen P de hMPV en el sitio EcoRI del vector pMV361 lo posiciona bajo el control del promotor hsp60 y dio origen a la construcción pMV361-P-hMPV (Figura 1B).

Ejemplo II: Formulación inmunogénica compuesta por 10 dosis de 1x10a UFC cada una de la cepa BCG Danish recombinante para el gen P de hMPV subtipo A.

El gen P de hMPV subtipo A se encuentra inserto en una copia en el genoma de la bacteria bajo la regulación del promotor endógeno constitutivo hsp60 de Mycobacterium BCG para la expresión de la proteína.

La cepa Mycobacterium BCG Danish (ATCC 35733) fue transformada mediante electrotransformación con el plásmido pMV361-P-hMPV, derivado del plásmido pMV361 (Stover et al., 1991), que se inserta una sola vez en el genoma de la bacteria. Este plásmido contiene el gen que codifica para la proteína P de hMPV subtipo A, el cual se expresa bajo el promotor endógeno y constitutivo del gen hsp60 de BCG. Las colonias recombinantes resultantes se crecieron (a 37°C en medio de cultivo Middlebrock 7H9 (4,9 g/L), suplementado) hasta OD600nm=1, fueron centrifugadas a 4.000 rpm por 20 min (rotor eppendorf modelo 5702/R A-4-38) y se resuspendieron en solución PBS (137 mM NaCl; 2,7 mM KCl; 4,3 mM Na2HPO4; 1,47 mM KH²PO⁴, pH 7,4), suplementado con Glicerol 20% y Tween 80 0,02% a una concentración final de 108 bacterias por 100 |j¡ y se conservaron a -80°C.

Del mismo modo, las cepas pueden resuspenderse en una solución volumen:volumen de lactosa 25% y Medio Proskauer y Beck suplementado con glucosa y Tween 80 (PBGT: 0,5 g asparragina; 5,0 g fosfato monopotasio; 1,5 g citrato de magnesio; 0,5 g sulfato de potasio; 0,5 ml Tween 80 y 10,0 g glucosa por litro de agua destilada) para luego ser liofilizada y conservada a 25°C.

Usando transferencia Western y anticuerpos para la proteína P de hMPV, puede observarse que esta cepa de BCG expresa de manera constitutiva la proteína P de hMPV subtipo A en el citoplasma (Figura 2A).

La inmunización de ratones BALB/c con una dosis subdérmica de 1 x 108 unidades formadoras de colonia (UFC) de rBCG-P-hMPV, a modo de vacuna, confiere protección de estos animales contra una infección intranasal con 106 unidades formadoras de placa de hMPV subtipo A (Figura 3).Se comparó el efecto de la vacuna de la invención, rBCG-P-hMPV, con una vacuna rBCG que expresa otra proteína de hMPV, la proteína M2, y con BCG sin transformar, como control se utilizó un grupo sin inmunizar, todos estos grupos se infectaron con hMPV por vía intranasal, también se incluyó un control sin inmunizar y sin infectar. Se analizó la variación de peso de los animales después de lainfección, los resultados se muestran en la Figura 3A. Ambas vacunas recombinantes BCG para proteínas P (•) y M2 (♦ ) de hMPV fueron protectoras en la pérdida de peso del animal posterior a la infección, obteniéndose un peso similar al animal sin infectar (▼). Por otra parte los animales sin inmunizar (A ) o inmunizados con BCG silvestre (BCG-WT) (■ ), Live-hMPV (■ ) o UV-hMPV (•) sufrieron pérdida de peso corporal del animal posterior a la infección.

Se analizó además la infiltración de células inmunes en las vías aéreas del animal posterior a la infección, parámetro indicativo del desarrollo de la enfermedad. Esto se analizó por el número de células infiltradas en la vía aérea (Figura 3B) y por las células infiltradas que al ser positivas para CD11 b y Gr1 corresponden a granulocitos (Figura 3C). En la Figura 3 B, se aprecia que sólo la vacuna de la invención rBCG-P-hMPV previno la infiltración de linfocitos en la vía aérea, obteniéndose una infiltración similar al animal sin infectar. Por otra parte los animales sin inmunizar o inmunizados con otras vacunas BCG tipo silvestre (BCG-WT) o rBCG-M2-hMPV, sufrieron la infiltración de células inmunes en sus vías aéreas posterior a la infección. La vacunación con rBCG-M2 confirió una protección incompleta para la infiltración de células inmunes en las vías aéreas del animal.

Adicionalmente se analizó el número de copias de RNA del gen N-hMPV en las células de pulmón de los distintos grupos estudiados. Un mayor número de copias de RNA del virus hMPV es indicativo de una mayor infección, los resultados se normalizan por copias de p-actina. Los resultados se muestran en la Figura 3D. Se aprecia que el número de virus de hMPV, presentes en los pulmones de animales infectados no inmunizados es similar al de animales infectados inmunizados con BCG-WT, Live-hMPV o UV-hMPV, es decir, estas inmunizaciones no otorgarían protección. Se observa que la inmunización con rBCG-M2 otorgó una protección no completa. Por otra parte, en los animales infectados inmunizados con la vacuna de la invención rBCG-P prácticamente no se encuentra el virus, tienen resultados similares al grupo de animales no infectados. Esto comprueba que la formulación de la invención protege efectivamente contra la infección de hMPV.

Ejemplo III: Formulación inmunogénica que comprende 5x107 bacterias de la cepa Mycobacterium BCG Danish recombinante para el gen P de hMPV subtipo A y 5x107 bacterias de la cepa Mycobacterium BCG Danish recombinante para el gen N de VRS subtipo A.

En cada una de las bacterias que componen la formulación inmunogénica, los genes de hMPV y de VRS se encuentran insertos en una copia en el genoma de la bacteria bajo la regulación del promotor endógeno constitutivo hsp60 de BCG y la expresión de la proteína es citoplasmática. La formulación inmunogénica se encuentra preservada en PBS (137 mM NaCl; 2,7 mM KCl; 4,3 mM Na2HPO4; 1,47 mM KH²PO⁴, pH 7,4), suplementado con Glicerol 20% y Tween 80 0,02% a una concentración final de 108 bacterias por 100 j l y se conservaron a -20°C.

Cepas BCG Danish (ATCC 35733) fueron transformadas mediante electrotransformación con el plásmido pMV361-P de hMPV para dar la cepa de la invención rBCG-P-MPV, y adicionalmente un segundo grupo fue transformado con pMV361-N de VRS para obtener la cepa transformada rBCG-N VRS, estos plásmidos son derivados del plásmido pMV361 (Stover et al., 1991), los cuales se insertan una sola vez en el genoma de la bacteria. Las colonias recombinantes resultantes se crecieron a 37°C en medio de cultivo Middlebrock 7H9 suplementado hasta OD⁶⁰⁰ nm =1, fueron centrifugadas a 4.000 rpm por 20 min (rotor eppendorf modelo 5702/R A-4-38) y se resuspendieron en una solución PBS (137 mM NaCl; 2,7 mM KCl; 4,3 mM Na2HPO4; 1,47 mM KH²PO⁴, pH 7,4), suplementado con Glicerol 20% y Tween 800,02% a una concentración final de 107 bacterias por 100 |jl y se conservaron a -20°C. Las cepas se resuspendieron en tampón LYO C, compuesto por manitol al 4% (p/v), Tyloxapol al 0,05% (p/v), sacarosa al 0,25% e histidina 5 mM, luego fueron liofilizadas y conservadas a 4°C. Mediante el uso de transferencia Western, y anticuerpos específicos para la proteína P de hMPV o la proteína y N de VRS, se observó que estas cepas de BCG Danish expresan de manera recombinate, la proteínas P de hMPV o N de VRS, subtipo A respectivamente (Figura 2). Una formulación inmunogénica que comprende ambas cepas transformadas conferirá inmunidad simultánea contra los virus hMPV y VRS.

Ejemplo IV: Formulación inmunogénica de 104 bacterias de la cepa BCG Danish recombinante para el gen P de hMPV subtipo A.

Se transformó una cepa de BCG Danish con el gen P de hMPV subtipo A, de modo que el gen se insertó en una copia en el genoma de la bacteria bajo la regulación del promotor endógeno inducible acr de BCG, el cual es activo en respuesta a óxido nítrico, baja concentraciones de oxígeno, y fases estacionarias de crecimiento. La expresión de la proteína es citoplasmática. La formulación inmunogénica se liofilizó en tampón LYO C, compuesto por manitol al 4% (p/v), Tyloxapol al 0,05% (p/v), sacarosa al 0,25% e histidina 5 mM y fue conservarse reconstutuida 25°C en solución diluida Sauton SSI (125 |jg MgSO4, 125 |jg K²HPO⁴, 1 mg L-asparragina, 12,5 |jg citrato de amonio férrico, 18,4 mg 85% glicerol, 0,5 mg ácido cítrico en 1 ml de H²O). Alternativamente las cepas transformadas pueden preservarse en una solución PBS (137 mM NaCl; 2,7 mM KCl; 4,3 mM Na2HPO4; 1,47 mM KH²PO⁴, pH 7,4) suplementado con Tween 80 0,02% y Glicerol 20% a una concentración final de 104 bacterias por 100 jl.

La cepa BCG Danish (American Type Culture Collection, www.atcc.org, ATCC number 35733) fue transformada mediante electrotransformación con el plásmido pMV361Pacr/P-hMPV, derivado del plásmido pMV361 (Stover et al., 1991), que se inserta una sola vez en el genoma de la bacteria. Este plásmido contiene el gen que codifica para la proteína P de hMPV subtipo A, el cual se expresa bajo el promotor endógeno e inducible del gen acr de BCG. Las colonias recombinantes resultantes se crecieron (a 37°C en medio de cultivo Middlebrock 7H9 suplementado) hasta OD⁶⁰⁰ nm =1, fueron centrifugadas a 4.000 rpm por 20 min (rotor eppendorf modelo 5702/R A-4-38) y se resuspendieron en una solución tampón LYO C, compuesto por manitol al 4% (p/v), Tyloxapol al 0,05% (p/v), sacarosa al 0,25% e histidina 5 mM. Finalmente se liofilizaron alícuotas de 1 ml con 104 bacterias y se conservaron a 25°C. Del mismo modo, las cepas pueden preservarse en una solución PBS (137 mM NaCl; 2,7 mM KCl; 4,3 mM Na2HPO4; 1,47 mM KH²PO⁴, pH 7,4) suplementado con Tween 80 0,02% y Glicerol 20% a una concentración final de 104 bacterias por 100 jl. Esta formulación inmunogénica confiere inmunidad contra el virus hMPV.

Ejemplo V: Formulación inmunogénica que consiste en 109 bacterias de la cepa BCG Danish recombinante para el gen P de hMPV subtipo A.

El gen se encuentra inserto en una copia en el genoma de la bacteria bajo la regulación del promotor exógeno del fago T7 de expresión constitutiva en cepas de BCG que co-expresen la polimerasa del fago T7. La expresión de la proteína es citoplasmática. La formulación inmunogénica se encuentra en una solución diluida Sauton SSI (125 jig MgSO4, 125 jig K²HPO⁴, 1 mg L-asparragina, 12,5 jig citrato de amonio férrico, 18,4 mg 85% glicerol, 0,5 mg ácido cítrico en 1 ml de H²O) y fue conservada a-20°C, o puede encontrarse liofilizada y conservada a 4°C. Del mismo modo, las cepas pueden preservarse en una solución Pb S (137 mM NaCl; 2,7 mM KCl; 4,3 mM Na2HPO4; 1,47 mM KH²PO⁴ , pH 7,4) suplementado con Tween 800,02% y Glicerol 20% a una concentración final de 109 bacterias por 100 jl.

La cepa BCG Danish ATCC 35733 fue transformada mediante electrotransformación con el plásmido pMV361PT7/P-hMPV, derivado del plásmido pMV361 (Stover et al., 1991), que se inserta una sola vez en el genoma de la bacteria. Este plásmido contiene el gen que codifica para la proteína P de hMPV subtipo A, el cual se expresa bajo el promotor T7 activado por la expresión de la polimerasa del fago T7.

La cepa BCG resultante fue transformada mediante electrotransformación con el plásmido pMV261Amp/PolT7, derivado del plásmido pMV261 (Stover et al., 1991), el cual reside extracromosomalmente en la bacteria en múltiples copias. En este plásmido la resistencia al antibiótico kanamicina ha sido reemplazada por la resistencia al antibiótico higromicina (Higr). La polimerasa T7 del fago T7 se encuentra bajo control del promotor constitutivo del gen hsp60 de BCG. Las colonias recombinantes resultantes se crecieron a 37°C en medio de cultivo Middlebrock 7H9 suplementado hasta OD⁶⁰⁰ nm =1, se centrifugaron a 4.000 rpm por 20 min (rotor eppendorf modelo 5702/R A-4-38) y se resuspendieron en una solución diluida Sauton SSI (125 jg MgSO4, 125 jg K²HPO⁴, 1 mg L-asparragina, 12,5 jg citrato de amonio férrico, 18,4 mg 85% glicerol, 0,5 mg ácido cítrico en 1 ml de H²O) y fue conservada a -80°C. Esta formulación inmunogénica confiere inmunidad contra el virus hMPV.

Ejemplo VI: La inoculación de 108 bacterias de la cepa BCG Danish recombinante para gen P-hMPV en cualquiera de sus formulaciónes inmunogénicas, protege del daño inmunopatológico.

La inoculación de la cepa recombinante BCG que expresa la proteína P de metapneumovirus en cualquiera de sus presentaciones protege de los signos y síntomas clínicos de la infección con la cepa A y B de hMPV. Disminuye la

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Una formulación inmunogénica que confiere protección frente a la infección por metapneumovirus (hMPV) y/o atenúa la patogenicidad causada por hMPV, caracterizada porque la formulación comprende una cepa Danish de Mycobacterium Bacillus Calmette-Guerin (BCG) recombinante atenuada en una cantidad que varía 104 a 109 bacterias (UFC/dosis), en las que dicha cepa expresa la proteína P del subtipo A de hMPV, en un tampón salino farmacológicamente apropiado.

2. Formulación inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 1, en la que las secuencias de ácido nucleico que codifican la proteína P del hMPV se insertan en el genoma de una cepa Danish de Mycobacterium BCG atenuada o se insertan en un plásmido extracromosómico, en una o más copias, de modo que la proteína viral se expresa a partir de las secuencias de ácidos nucleicos

3. Formulación inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la formulación comprende una cepa Danish de Mycobacterium BCG atenuada recombinante, en la que dicha cepa expresa la proteína P de hMPV como una proteína soluble, citoplásmica soluble, secretada extracelularmente o unida a membrana.

4. La formulación inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la proteína se deriva de la expresión de ácidos nucleicos bajo el control de promotores constitutivos o inducibles, endógenos o exógenos de la cepa Danish de Mycobacterium BCG.

5. La formulación inmunogénica de la reivindicación 1, en la que dicha formulación comprende una cepa Danish de Mycobacterium BCG atenuada recombinante, en la que la proteína P de hMPV de la cepa se expresa constitutivamente o inducible.

6. La formulación inmunogénica de la reivindicación 1, en la que la formulación se estabiliza mediante congelación, secado por congelación o utilizando una solución salina tamponada para su conservación antes de su uso.

7. La formulación inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la proteína se expresa como proteínas citoplasmáticas solubles, secretadas extracelularmente o unidas a la membrana celular.

8. La formulación inmunogénica de acuerdo con la reivindicación 1, para su uso en la prevención de una infección por hMPV.

9. La formulación inmunogénica para uso de acuerdo con la reivindicación 8, en la que dicha formulación se administra por vía subcutánea, percutánea o subdérmica.

10. Una vacuna contra el hMPV, que comprende la formulación inmunogénica de la reivindicación 1.