ES2854673T3 - VSR recombinante con mutaciones silenciosas, vacunas y métodos relacionados con ello - Google Patents

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Abstract

Un ácido nucleico recombinante aislado que codifica NS1 de un virus respiratorio sincitial (VSR) de tipo salvaje que comprende la SEQ ID NO: 6.

Description

DESCRIPCIÓN
VSR recombinante con mutaciones silenciosas, vacunas y métodos relacionados con ello
ANTECEDENTES
El virus respiratorio sincitial (VSR) conduce a infecciones del tracto respiratorio inferior. Los pacientes inmunodeprimidos, los bebés prematuros y los niños tienen un riesgo particular de contraer una enfermedad grave. El VSR es la principal causa de muerte viral en bebés. Los tratamientos del VSR se centran en la prevención de infecciones y en la mejora de la respiraciónB. Palivizumab es un anticuerpo monoclonal humanizado que se puede administrar de forma profiláctica. Palivizumab no es eficaz después de la infección por VSR y la protección finaliza poco después de que finaliza el tratamiento. Actualmente no hay vacunas disponibles para el VSR. Los candidatos a vacunas contra el VSR atenuado han fracasado debido a la inmunogenicidad subóptima en los lactantes y la estabilidad subóptima que conduce a la reversión genética hacia secuencias de tipo salvaje indeseables. VerTeng, Trastornos infecciosos - Objetivos de drogas, 2012, 12 (2): 129-3. Por tanto, existe la necesidad de encontrar una vacuna de VSR atenuada que sea adecuadamente inmunogénica, suficientemente estable y segura para su uso en bebés.
Debido a la redundancia del código genético, los aminoácidos individuales están codificados por múltiples secuencias de codones, a veces denominados codones sinónimos. En diferentes especies, los codones sinónimos se utilizan con mayor o menor frecuencia, a veces denominados codones sesgados. Se ha demostrado que la ingeniería genética de codones sinónimos infrarrepresentados en la secuencia codificante de un gen da como resultado tasas reducidas de traducción de proteínas sin un cambio en la secuencia de aminoácidos de la proteína. Mueller y col. informan de la atenuación del virus por cambios en el sesgo de codones. Véase,Science, 2008, 320: 1784. Véase tambiénWO/2008121992,WO/2006042156,Burns et al., J Virology, 2006, 80 (7): 3259yMueller et al., J Virology, 2006, 80 (19): 9687.
Luongo et al. informan del aumento de la estabilidad genética y fenotípica de un candidato a vacuna de virus sincitial respiratorio vivo atenuado por genética inversa. VéaseJ. Virol. 2012, 86 (19): 10792.
Dochow et al. informan dominios estructurales independientes en la proteína polimerasa de paramixovirus.J Biol Chem, 2012, 287: 6878- 91 .
US2008118530describe composiciones inmunogénicas que comprenden un patógeno atenuado, en las que el patógeno atenuado comprende al menos un codón desoptimizado en una secuencia codificante y métodos para provocar una respuesta inmune contra un patógeno en un sujeto, que comprende introducir en el sujeto una cantidad inmunológicamente eficaz de la composición inmunogénica.
U.S. Patent 8.580.270 reports VSR F polypeptide sequences. U.S. Patent 7.951.384 reports that it contemplates a VLP VSR vaccine.
RESUMEN
La divulgación se refiere a las secuencias de polinucleótidos del virus respiratorio sincitial (VSR). La divulgación se refiere a ácidos nucleicos y polipéptidos aislados o recombinantes que comprenden mutaciones y secuencias de ácidos nucleicos deseables descritas en el presente documento. También se describen VSR aislado o recombinante que comprende los ácidos nucleicos y polipéptidos descritos en este documento (por ejemplo, VSR recombinante atenuado), así como composiciones inmunogénicas que incluyen tales ácidos nucleicos, polipéptidos y genomas de VSR que son adecuados para su uso como vacunas. También se contemplan los VSR atenuados o muertos que contienen estos ácidos nucleicos y la mutación en forma de ácidos nucleicos copiados (por ejemplo, cDNA).
La divulgación se refiere a ácidos nucleicos aislados, virus sincitial respiratorio recombinante (VSR) con desoptimización de codones, vacunas producidas a partir de los mismos y métodos de vacunación relacionados con los mismos. El VSR recombinante puede comprender los genes NS1, Ns 2, N, P, M, SH, G, F, M2 y L de la cepa A2, línea 19, o la cepa Long o variantes de la misma. La desoptimización del codón puede estar en los genes no estructurales NS1 y NS2 y opcionalmente en un gen G y opcionalmente en un gen L. El gen SH puede delecionarse. El gen F puede mutar, por ejemplo, una mutación I a V correspondiente al residuo 557 de la proteína F de la línea 19 de la cepa del VSR.
La divulgación se refiere a ácidos nucleicos aislados que codifican genes desoptimizados NS1 y/o NS2 y opcionalmente el gen G y opcionalmente el gen L de puede ser un VSR humano de tipo salvaje o variante en la que los nucleótidos pueden sustituirse de manera que un codón para producir Gly es GGT, un codón para producir Asp es GAT, un codón para producir Glu es GAA, un codón para producir His es CAT, un codón para producir Ile es ATA, un el codón para producir Lys es AAA, un codón para producir Leu es CTA, un codón para producir Asn es AAT, un codón para producir Gln es CAA, un codón para producir Val es GTA, o un codón para producir Tyr es TAT, o combinaciones del mismo. Un gen en el ácido nucleico aislado comprende además una combinación de al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o todos los codones individuales. Un gen en el ácido nucleico aislado comprende al menos 20, 30, 40 o 50 o más codones.
Esta divulgación se refiere a un ácido nucleico aislado como se describe en el presente documento en el que los nucleótidos se pueden sustituir de modo que un codón para producir Ala sea GCG, un codón para producir Cys sea TGT, un el codón para producir Phe es TTT, un codón para producir Pro es CCG, un codón para producir Arg es CGT, un codón para producir Ser es TCG, o un codón para producir Thr es ACG, o combinaciones de los mismos. Un gen que contiene el ácido nucleico comprende una combinación de al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis o todos los codones individuales. Un gen en el ácido nucleico aislado comprende además al menos 20, 30, 40 o 50 o más codones.
La divulgación se refiere a ácidos nucleicos divulgados en este documento que codifican una NS1 que tiene la SEC ID NO: 5 MGX1NX2LSX3IKX4RLQNLX5X6NDEVALLKITCYX7DKLIX8LTNALAKAX9IHTIKL NGIVFXr HVITSSX11X12CPX13NX14IWKSNFTTMPX15LX16NGGYIX17EX18X19ELTH CSQX2°NGX21X22X23DNCEIKFSX24X25LX26DSX27MTX28YX29X3°QX31SX32LLGX33DL X34X35, en donde X1-X35son cualquier aminoácido o
X1es S o C; X2es S o T; X3es M o V; X4es V o I; X5es F o L; X6es D o N; X7es T o A; X8es H, L, o Q; X9es V o T; X1°es V o I; X11es D o E; X12es I, A o V; X13es N o D; X14es N o S; X15es V, I o A; X16es Q o R; X17es W o cualquier aminoácido; X18es M o L; X19es M o I; X2°es P o L; X21es L o V; X22es L, M o I; X23es D o V; X24es K o R; X25es K o R; X26es S o cualquier aminoácido; X27es T o V; X28es N o D; X29es M o I; X3°es N o S; X31es L o I; X32es E o D; X33es F o L; X34es N o H; y X35es P o S o se elimina.
La divulgación se refiere a ácidos nucleicos descritos en este documento que codifican una NS1 de VSR como se proporciona en el número de acceso NCBI NP_044589.1, NP_056856.1, P04544.1, AEQ63513.1, AFM55237.1, AFV32554. 1, Q86306.1, AFV32528.1, AFM55248.1, AFM95358.1, AFV32568.1, ACY68428.1, CBW45413.1, AC083290.1, AFM55347.1, CBW45433.1, AEQ63459.1, AFM55204.1, AFV32572.1, AFV32558.1, CBW45429.1, CBW45445.1, AFV32596.1, CBW45481.1, CBW47561.1, P24568.1, AAR14259.1, CBW45451.1, CBW45447.1, CBW45471.1, BAE96914. 1, CBW45463.1, CBW45473.1 o CBW45467.1 o variantes que comprenden una, dos o tres inserciones, deleciones, sustituciones o sustituciones conservadas de aminoácidos.
En determinadas realizaciones, la invención se refiere a un ácido nucleico recombinante aislado que codifica NS1 de un virus sincitial respiratorio humano (VSR) de tipo salvaje que comprende la SEQ ID NO: 6.
La divulgación se refiere a los ácidos nucleicos divulgados en este documento que codifican una NS2 que tiene la SEC ID NO: 8, MX1TX2X3X4X5X6TX7QX8LX9ITDMRPX1°SX11X12X13X14IX15SLTX16X17IITHX18FIYLI NX19ECIVX2°KLDEX21QATX22X23FLVNYEMX24LLHX25VGSX26X27YKKX28TEYNTK YGTFPMPIFIX29HX3°GFX31ECIGX32KPTKHTPIIX33KYDLNP,
en donde X1-X33son cualquier aminoácido o
X1es D o S; X2es T, A o K; X3es H, S, o N; X4es N o P; X5es D, G, o E; X6es T o N; X7es P, M, Q, S, o A; X8es R o G; X9es M o I; X1°es L o M; X11es L, M o I; X12es I, D o E; X13es T o S; X14es I o V; X15es I o T; X16es R o K; R17es D o E; R18es R o K;R19es H o N; X2°es R o K; X21es R o K; X22es F o L; X23es T o A; X24es K o N; X25es K o R; X26es T o A; X27es K o I; X28es T o S; X29es N o cualquier aminoácido; X3°es D o G; X31es L o I; X32es I o V; y X33es Y o H.
La divulgación se refiere a los ácidos nucleicos descritos en el presente documento que codifican una NS1 que tiene una NS2 de VSR como se indica en el número de acceso de NCBI NP_044590.1, NP_056857.1, CBW45420.1, AFM95337.1, CBW45416.1, CBW45430.1, AFV32529.1, Q86305.1, AEQ63383.1, CBW45424.1, AFM55546.1, CBW45444.1, P04543.2, AFM55326.1, AFM55425.1, AFM55381.1, AFM55458.1, AFM55216.1, AAB59851.1, AEQ63372.1, AFM55337.1, CBW45426.1, AFV32515.1, AFV32519.1, AAR14260.1, CBW47562.1, AFV32643.1, P24569.1, AFV32657.1 AFI25256.1, CBW45480.1, AFV32605.1, AEQ63580.1, AFV32627.1, AFV32665.1, CBW45482.1, CBW45478.1, CBW45462.1, AEQ63635.1, CBW45448.1, CBW45464.1, CBW45484.1 o CBW45474.1 o variantes que comprenden una, dos o tres inserciones, deleciones, sustituciones o sustituciones conservadas de aminoácidos.
La divulgación se refiere a un ácido nucleico aislado que comprende SEQ ID NO: 9 o SEQ ID NO: 10 o una secuencia con 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % o mayor secuencia identidad al mismo.
En determinadas realizaciones, la invención se refiere a vectores recombinantes que comprenden un ácido nucleico como se define en las reivindicaciones.
En determinadas realizaciones, la invención se refiere a un VSR recombinante atenuado que comprende un ácido nucleico como se define en las reivindicaciones.
En ciertas realizaciones, la invención se refiere a un sistema de expresión que comprende un vector o un VSR recombinante atenuado como se define en las reivindicaciones.
En determinadas realizaciones, la invención se refiere a vacunas que comprenden un VSR recombinante atenuado que comprende un ácido nucleico como se define en las reivindicaciones.
En determinadas realizaciones, la invención se refiere a una vacuna para su uso en métodos de vacunación que comprenden administrar una cantidad eficaz de una vacuna como se define en las reivindicaciones a un sujeto con riesgo de infección por VSR.
En ciertas realizaciones, el sujeto es menor de 2 meses o 6 meses de edad, menor de 1 año de edad, nacido prematuramente, tiene enfermedad cardíaca o pulmonar congénita, está recibiendo quimioterapia o trasplante, o está diagnosticado con asma, insuficiencia cardíaca congestiva o enfermedad pulmonar obstructiva crónica, leucemia o VIH/SIDA.
En determinadas realizaciones, la vacuna en uso se administra en combinación con motavizumab, palivizumab u otro anticuerpo monoclonal humanizado dirigido contra un epítopo en el sitio antigénico II de la proteína F del VSR. En determinadas realizaciones, la invención se refiere a vectores como se definen en las reivindicaciones que comprenden un cromosoma artificial bacteriano (BAC) y una secuencia de ácido nucleico que comprende virus respiratorio sincitial (VSR), y el BAC contiene todos los genes que son esenciales para la generación de una partícula viral infecciosa en una célula huésped. La secuencia de ácido nucleico puede ser un genoma o antigenoma viral en combinación operativa con un elemento regulador. Normalmente, el cromosoma artificial bacteriano comprende uno o más genes seleccionados del grupo que consiste en genes oriS, repE, parA y parB del factor F en combinación operable con un marcador seleccionable, por ejemplo, un gen que proporciona resistencia a un antibiótico.
La secuencia de ácido nucleico puede ser la secuencia genómica o antigenómica del virus que está opcionalmente mutado como se define en las reivindicaciones. En determinadas realizaciones, el vector de expresión es un plásmido que comprende sitios de escisión de endonucleasas de restricción MluI, ClaI, BstB1, SacI y, opcionalmente, un sitio de escisión de endonucleasas de restricción AvrII fuera de la región de la secuencia viral de tipo salvaje o fuera de las secuencias que codifican genes virales o fuera de el genoma o antigenoma viral. En determinadas realizaciones, la secuencia de ácido nucleico comprende además un gen marcador o indicador seleccionable en combinación operativa con él, por ejemplo, un gen que codifica una proteína fluorescente.
La divulgación se refiere a bacterias aisladas que comprenden uno o más vectores descritos en este documento, y otras realizaciones, la divulgación se refiere a una célula aislada que comprende uno o más vectores descritos en este documento. En determinadas realizaciones, el vector comprende un antigenoma de VSR y uno o más vectores seleccionados del grupo que consiste en: un vector que codifica una proteína N de VSR, un vector que codifica una proteína P de VSR, un vector que codifica una proteína L de VSR, y un vector que codifica una proteína M2-1 de VSR. Típicamente, el vector comprende un elemento regulador, por ejemplo, un promotor, y la célula eucariota aislada expresa un ácido nucleico o polipéptido que activa el elemento regulador, por ejemplo, codifica un polipéptido que activa la transcripción cadena abajo del promotor. En determinadas realizaciones, el promotor es T7, y el polipéptido que activa la transcripción cadena abajo del promotor es la ARN polimerasa de T7.
La divulgación se refiere a métodos para generar partículas de virus respiratorio sincitial (VSR) que comprenden insertar un vector con un gen BAC y un antigenoma de VSR en una célula eucariota aislada e insertar una o más vectores seleccionados del grupo que consiste en: un vector que codifica una proteína N de VSR, un vector que codifica una proteína P de VSR, un vector que codifica una proteína L de VSR y un vector que codifica una proteína M2-1 de VSR en la célula en condiciones tales que se forme el virión de VSR. La inserción de un vector en una celda puede ocurrir inyectando físicamente, electroporando o mezclando la celda y el vector en condiciones tales que el vector entre en la celda.
La divulgación se refiere a la estabilidad del virus mutante de la línea 19 F557 en comparación con otras cepas, y val en 557, lo que hace que el VSR que expresa la línea 19 F sea aún más termoestable. Es probable que Val en la posición 557 en otras cepas también se estabilice; por tanto, la posición 557 es importante para la estabilidad térmica. La divulgación contempla otras mutaciones en la línea 19 F u otras cepas de VSR en la posición 557 (cualquier aminoácido, por ejemplo, alanina, valina, isoleucina, leucina) en cualquier contexto de cepa F, que mejora la termoestabilidad del virus VSR.
La divulgación contempla el polipéptido VSR F que comprende una alanina, valina o leucina en la posición 557, por ejemplo, alanina o leucina en la posición 557 de SEQ ID NO: 17.
La divulgación se refiere a cierta secuencia deseable de polipéptidos VSR F, por ejemplo, secuencias de la línea 19 que comprenden una valina en la posición 557, por ejemplo, SEQ ID NO: 17, y ácidos nucleicos recombinantes. codificando lo mismo. La divulgación contempla vectores recombinantes que comprenden ácidos nucleicos que codifican estos polipéptidos y células que comprenden dichos vectores.
La invención se refiere a composiciones inmunogénicas que comprenden una cantidad inmunológicamente eficaz de un virus sincitial respiratorio recombinante (VSR), polipéptido VSR, partícula VSR, partícula similar al virus VSR y/o ácido nucleico como se define en las reclamaciones.
En ciertas realizaciones, la invención se refiere a una vacuna que comprende un VSR recombinante que comprende un ácido nucleico de la reivindicación 1 para su uso en métodos para estimular el sistema inmunológico de un individuo para producir una respuesta inmune protectora contra el VSR. En determinadas realizaciones, en uso, se administra al individuo una cantidad inmunológicamente eficaz de un VSR, polipéptido y/o ácido nucleico como se define en las reivindicaciones en un vehículo fisiológicamente aceptable.
En determinadas realizaciones, la invención se refiere a medicamentos y productos de vacuna que comprenden ácidos nucleicos como se define en las reivindicaciones para usos como se definen en las reivindicaciones. La divulgación se refiere a usos de ácidos nucleicos o vectores descritos en este documento para la fabricación de un medicamento para usos descritos en este documento.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La Figura 1 muestra una tabla con los codones menos usados en genes humanos y en cepas específicas de VSR. La Figura 2 muestra los datos de crecimiento para kVSR-dNS1h en las líneas celulares BEAS-2B (arriba) y Vero (abajo). Growth curves of kVSR-A2 (open circle) and kVSR-dNSh (closed circle) in HEp-2 (A), Vero (B) and BEAS-2B (C) at 37 °C infected at MOI of 0.01, as well as in differentiated NHBE/ALI cells infected at MOI of 0,2 (D) or 2,0 (E).
La Figura 3 muestra datos sobre experimentos de carga viral usando ciertos virus descritos en este documento. Time course images for NHBE cells infection at MOI of 0.2, showing mKate2 fluorescence produced by the recombinant viruses. *P < 0,05
La Figura 4 muestra un gel después de la inserción del operón galK en BAC-VSR por recombinación. MluI digerir. Carril 1, marcador de escalera. Ad N de BAC Mini-prep (carriles 2 a 7). Carril 8, clon parental BAC-VSR "C2". Carril 9, plásmido que contiene galK. El operón galK tiene un sitio de restricción Mlu I que sirve como marcador para la introducción de galK por recombinación homóloga.
La Figura 5 muestra un gel después de la deleción del operón galK de BAC-VSR por recombinación. Digerido MluI de plásmido que contiene galK (carril 2), ADN de minipreparación de BAC (carriles 3-7) y clon C2 de BAC-VSR parental (carril 8).
Las Figuras 6A-E ilustran esquemáticamente los pasos para crear un BAC-VSR. Se generan tres plásmidos con segmentos de VSR (ver experimental); A) pKBS3 se corta en los sitios BstB1 y Mlul para linealizar y se liga a un adaptador de oligonucleótidos que proporciona pKBS5; B) pSynVSR # 2 con Sacl y Clal se corta y se liga a pKBS5 proporcionando pKBS5-2; C) pSynVSR # 3 con Avrll y Mlul se corta y se liga a pKBS5_2 proporcionando pKBS5_2_3; D) pSynVSR # 1 con BstB1 y Sacl se corta y se liga a pKBS5_2_3 proporcionando pKBS5_1_2_3. MI). La recombinación se usa para eliminar nucleótidos entre dos sitios Clal que generan pSynVSR-línea 19F.
La Figura 7 muestra datos que indican la inmunogenicidad de una cepa de VSR con una mutación del gen F 1557 a V. Los ratones se infectaron con las dosis indicadas de A2-K-line19F, A2-line19F-I557 V o A2-K-A2GF y 29 días después se desafiaron con la cepa VSR 12-35. La carga viral pulmonar se midió el día 4 después de la exposición. La línea de puntos indica el límite de detección.
La Figura 8 muestra datos que indican la termoestabilidad superior de las cepas de VSR con una mutación del gen 1557 a V de la línea 19 F de la línea A2 (SEQ ID NO: 17). Los virus se incubaron a las temperaturas indicadas y se midieron los títulos virales todos los días durante 6 días. The results at 4°C are statistically significant between viruses (P < 0,01). Los resultados a 37 ° C demuestran el mismo fenotipo.
La Figura 9 ilustra una comparación de secuencia de VSR de la cepa 19, mutación I557 V (SEQ ID NO: 17) (Consulta) y la secuencia típica de la cepa 19 de VSR (Sbjct).
Figure 10 illustrates an v Sr sequence comparison of strain 19, I557 V mutation (SEQ ID NO:17) (Query) and sequence 61 from patent US 7.951.384 (Sbjct).
Figure 10 illustrates an VSR sequence comparison of strain 19, I557 V mutation (SEQ ID NO: 17) (Query) sequence 12 from patent US 8.580.270 (Sbjct).
La Figura 12 muestra datos sobre atenuación, eficacia e inmunogenicidad de los virus descritos en este documento. (A) 6-8 week old BALB/c mice (n = 5 per group) were infected i.n. with 1,6 x 105 FFU of kVSR-A2 (open circle) or kVSR-dNSh (closed circle) and lung viral titer was assayed on days 1, 2, 4, 6, and 8 p.i.. Los datos representan uno de los dos experimentos repetidos con resultados similares. * P <0,05. (B) BALB/c mice were vaccinated i.n. with varying doses (105 FFU, 104 FFU, and 103 FFU) of kVSR-A2 (open circle) or kVSR-dNSh (closed circle), or mockinfected, and 100 days after vaccination, mice were challenged with 1,6 x 106 PFU VSR 12-35 strain. Las cargas virales máximas pulmonares se midieron el día 4 después de la exposición. Cada simbolo representa un raton. Las líneas discontinuas (A y B) indican el límite de detección para el ensayo de placa. A los títulos por debajo del límite de detección se les asignó la mitad del valor del límite de detección. (C) Los ratones BALB/c (n = 5 por grupo) se infectaron de forma simulada o se infectaron con 105 FFU de kVSR-A2 o kVSR-dNSh y se midieron los títulos de nAb en suero los días indicados después de la infección. * P <0,05.
La Figura 13 muestra datos sobre la eficacia de la vacuna para ciertas vacunas descritas en este documento. Ratones BALB/c de 6-8 semanas de edad (n = 5 por grupo) se infectaron de forma simulada o se vacunaron con dosis variables indicadas de kVSR-A2 (círculo abierto) o kVSR-dNSh (círculo cerrado). Los ratones fueron desafiados 28 días después con (A) 2X106PFU VSR A2-line19 cepa o (B) 5X105PFU VSR 12-35. Las cargas virales pulmonares se midieron el día 4 después de la exposición. Cada símbolo representa un ratón. Las líneas discontinuas indican el límite de detección para el ensayo de placa. A los títulos por debajo del límite de detección se les asignó la mitad del valor del límite de detección.
La Figura 14 muestra datos sobre la expresión de proteínas NS1 y NS2 durante la infección por VSR en líneas celulares. Las células HEp-2 (A), BEAS-2B (B) y Vero (C) se infectaron de forma simulada o se infectaron con kVSR-A2, kVSR-dNSh o kVSR-dNSv en MOI 5. Veinte horas pi, NS1 y NS2 Los niveles de proteína se analizaron mediante Western blot y densitometría. Las manchas representativas se muestran a la izquierda. La densitometría de 2-3 experimentos independientes se muestra a la derecha. Después de normalizar a los niveles de proteína N de VSR, los niveles de proteína NS1 y NS2 expresados por cada virus se normalizaron a los de la infección por kVSR-A2 y se expresaron como porcentaje ± SEM. Las barras sin relleno representan kVSR-A2, las barras grises representan kVSR-dNSv y las barras negras representan kVSR-dNSh.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Antes de describir la presente invención en más detalle, se deberá entender que esta invención no está limitada a las modalidades particulares descritas, ya que estas pueden evidentemente variar.
También debe comprenderse que la terminología utilizada en la presente tiene el fin de describir solamente modalidades particulares y no pretende ser taxativa, dado que el alcance de la presente invención estará limitado solamente por las reivindicaciones adjuntas.
A menos que se indique de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado que entiende normalmente un experto en la técnica a la que pertenece la presente descripción. Si bien se pueden utilizar métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente en la práctica o la evaluación de la presente descripción, a continuación se describen métodos y materiales preferidos.
Cualquier método enumerado se puede llevar a cabo en el orden de los eventos enumerados o en cualquier otro orden que sea lógicamente posible.
Las realizaciones de la presente invención emplearán, a menos que se indique lo contrario, técnicas de inmunología, medicina, química orgánica, bioquímica, biología molecular, farmacología, fisiología y similares, que se encuentran dentro de la habilidad del Arte. Estas técnicas se explican completamente en la literatura.
También se debe tener en cuenta que, como se usan en la memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares “un”, “una” y “el/la” incluyen las referencias plurales a menos que el contexto dicte claramente otra cosa.
En esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones que la siguen se hará referencia a varios términos cuyos significados se deben definir:
Antes de describir las diversas modalidades, se brindan las siguientes definiciones y estas se deben utilizar salvo que se indique lo contrario.
Los términos "proteína" y "polipéptido" se refieren a compuestos que comprenden aminoácidos unidos mediante enlaces peptídicos y se usan indistintamente.
El término "porción" cuando se usa en referencia a una proteína (como en "una porción de una proteína dada") se refiere a fragmentos de esa proteína. Los fragmentos pueden variar en tamaño desde cuatro residuos de aminoácidos hasta la secuencia de aminoácidos completa menos un aminoácido.
El término "quimera" cuando se usa en referencia a un polipéptido se refiere al producto de expresión de dos o más secuencias codificantes obtenidas de diferentes genes, que han sido clonadas juntas y que, después de la traducción, actúa como una única secuencia polipeptídica. Los polipéptidos quiméricos también se denominan polipéptidos "híbridos". Las secuencias codificantes incluyen las obtenidas de la misma o de diferentes especies de organismos.
El término "homólogo" u "homólogo" cuando se usa en referencia a un polipéptido se refiere a un alto grado de identidad de secuencia entre dos polipéptidos, o a un alto grado de similitud entre la estructura tridimensional o en un alto grado de similitud entre el sitio activo y el mecanismo de acción. En una realización preferida, un homólogo tiene una identidad de secuencia superior al 60 %, y más preferiblemente una identidad de secuencia superior al 75 %, y aún más preferiblemente una identidad de secuencia superior al 90 %, con una secuencia de referencia. Tal como se utiliza con respecto a polipéptidos, el término «identidad sustancial” significa que dos secuencias de péptidos que, cuando se alinean en forma óptima, tal como mediante los programas GAP o BESTFIT con pesos de huecos por defecto, comparten al menos 80 % de identidad de secuencia, preferiblemente al menos un 90 % de identidad de secuencia, más preferiblemente al menos un 95 % de identidad de secuencia o más (por ejemplo, 99 % de identidad de secuencia). Preferentemente, las posiciones de residuos que no son idénticas difieren en las sustituciones de aminoácidos conservadoras.
Los términos "variante" y "mutante" cuando se usan en referencia a un polipéptido se refieren a una secuencia de aminoácidos que difiere en uno o más aminoácidos de otra, generalmente relacionada polipéptido. La variante puede tener cambios "conservadores", en los que un aminoácido sustituido tiene propiedades químicas o estructurales similares. Un tipo de sustituciones de aminoácidos conservativas se refiere a la intercambiabilidad de residuos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas es glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales de hidroxilo alifático es serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amida es asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina y triptófano; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas es lisina, arginina e histidina; y un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre es la cisteína y la metionina. Los grupos de sustitución conservadora de aminoácidos que se prefieren son: valina-leucina-isoleucina, fenilalaninatirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato y asparagina-glutamina. Más raramente, una variante puede tener cambios "no conservadores" (p. Ej., Reemplazo de una glicina por un triptófano). Variaciones menores similares también pueden incluir deleciones o inserciones de aminoácidos (en otras palabras, adiciones), o ambas. Puede encontrarse orientación para determinar cuáles y cuántos residuos de aminoácidos pueden sustituirse, insertarse o eliminarse sin abolir la actividad biológica utilizando programas informáticos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, el software DNAStar. Las variantes se pueden probar en ensayos funcionales. Las variantes preferidas tienen menos del 5 %, y aún más preferiblemente menos del 2 % de cambios (ya sean sustituciones, deleciones, etc.).
El término “gen” se refiere a una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, ADN o ARN) que comprende secuencias de codificación de longitud completa o de longitud parcial necesarias para la producción de un polipéptido o un polipéptido precursor. Un polipéptido funcional puede ser codificado por una secuencia codificante de longitud completa o por cualquier porción de la secuencia codificante siempre que se retengan la actividad o propiedades funcionales deseadas (por ejemplo, actividad enzimática, unión de ligando, transducción de señales, etc.) del polipéptido. El término "porción" cuando se usa en referencia a un gen se refiere a fragmentos de ese gen. Los fragmentos pueden variar en tamaño desde unos pocos nucleótidos hasta la secuencia completa del gen menos un nucleótido. Por tanto, "un nucleótido que comprende al menos una parte de un gen" puede comprender fragmentos del gen o el gen completo.
El término "gen" también abarca las regiones codificantes de un gen estructural e incluye secuencias ubicadas adyacentes a la región codificante en los extremos 5 'y 3' durante una distancia de aproximadamente 1 kb en cada extremo de modo que el gen corresponda a la longitud del ARNm de longitud completa. Las secuencias que están ubicadas en 5 'de la región codificante y que están presentes en el ARNm se denominan secuencias 5' no traducidas. Las secuencias que se encuentran 3 'o cadena abajo de la región codificante y que están presentes en el ARNm se denominan secuencias 3' no traducidas. El término "gen" abarca tanto el cDNA como las formas genómicas de un gen. Una forma genómica o clon de un gen contiene la región codificante interrumpida con secuencias no codificantes denominadas "intrones" o "regiones intermedias" o "secuencias intermedias". Los intrones son segmentos de un gen que se transcriben en ARN nuclear (ARNm); los intrones pueden contener elementos reguladores como potenciadores. Los intrones se eliminan o "empalman" de la transcripción nuclear o primaria; por tanto, los intrones están ausentes en la transcripción del ARN mensajero (ARNm). El ARNm funciona durante la traducción para especificar la secuencia o el orden de los aminoácidos en un polipéptido naciente.
Además de contener intrones, las formas genómicas de un gen pueden incluir también secuencias localizadas tanto en el extremo 5' y 3' de las secuencias que están presentes en el transcrito de ARN. Estas secuencias se denominan secuencias o regiones "flanqueantes" (estas secuencias flanqueantes están ubicadas en 5 'o 3' con respecto a las secuencias no traducidas presentes en la transcripción de ARNm). La región flanqueante 5 'puede contener secuencias reguladoras tales como promotores y potenciadores que controlan o influyen en la transcripción del gen. La región flanqueante 3 'puede contener secuencias que dirigen la terminación de la transcripción, escisión postranscripcional y poliadenilación.
El término "gen heterólogo" se refiere a un gen que codifica un factor que no se encuentra en su entorno natural (es decir, ha sido alterado por la mano del hombre). Por ejemplo, un gen heterólogo incluye un gen de una especie introducido en otra especie. Un gen heterólogo también incluye un gen nativo de un organismo que ha sido alterado de alguna manera (por ejemplo, mutado, agregado en múltiples copias, ligado a una secuencia promotora o potenciadora no nativa, etc.). Los genes heterólogos se distinguen de los genes vegetales endógenos en que las secuencias génicas heterólogas típicamente se unen a secuencias de nucleótidos que comprenden elementos reguladores tales como promotores que no se encuentran asociados naturalmente con el gen de la proteína codificada por el gen heterólogo o con secuencias de genes vegetales en el cromosoma, o están asociados con porciones del cromosoma que no se encuentran en la naturaleza (por ejemplo, genes expresados en loci donde el gen no se expresa normalmente).
El término "polinudeótido" se refiere a una molécula compuesta por dos o más desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, preferiblemente más de tres, y normalmente más de diez. El tamaño exacto dependerá de muchos factores, que a su vez dependen de la función o uso final del oligonucleótido. El polinucleótido se puede generar de cualquier manera, incluida la síntesis química, la replicación del ADN, la transcripción inversa o una combinación de los mismos. El término "oligonucleótido" generalmente se refiere a una longitud corta de cadena polinucleotídica monocatenaria, normalmente de menos de 30 nucleótidos de longitud, aunque también se puede usar de manera intercambiable con el término "polinucleótido".
El término "ácido nucleico" se refiere a un polímero de nucleótidos, o un polinucleótido, como se describió anteriormente. El término se usa para designar una sola molécula o una colección de moléculas. Los ácidos nucleicos pueden ser monocatenarios o bicatenarios y pueden incluir regiones codificantes y regiones de varios elementos de control, como se describe a continuación.
El término "un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica un gen" o "un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica un gen" o "una secuencia de ácido nucleico que codifica" un polipéptido se refiere a una secuencia de ácido nucleico que comprende la región codificante de un gen o, en otras palabras, la secuencia de ácido nucleico que codifica un producto génico. La región codificante puede estar presente en forma de ADNc, ADN genómico o ARN. Cuando está presente en forma de ADN, el oligonucleótido, polinucleótido o ácido nucleico puede ser monocatenario (es decir, la cadena con sentido) o bicatenario. Los elementos de control adecuados tales como potenciadores/promotores, uniones de empalme, señales de poliadenilación, etc. pueden colocarse muy cerca de la región codificante del gen si es necesario para permitir el inicio adecuado de la transcripción y/o el procesamiento correcto del transcrito de ARN primario. Alternativamente, la región codificante utilizada en los vectores de expresión de la presente divulgación puede contener potenciadores/promotores endógenos, uniones de empalme, secuencias intermedias, señales de poliadenilación, etc. o una combinación de elementos de control tanto endógenos como exógenos.
El término "recombinante" cuando se hace referencia a una molécula de ácido nucleico se refiere a una molécula de ácido nucleico que se compone de segmentos de ácido nucleico unidos por medio de biología molecular Técnicas El término "recombinante" cuando se hace referencia a una proteína o un polipéptido se refiere a una molécula de proteína que se expresa usando una molécula de ácido nucleico recombinante.
Los términos "complementario" y "complementariedad" se refieren a polinucleótidos (es decir, una secuencia de nucleótidos) relacionados por las reglas de apareamiento de bases. Por ejemplo, para la secuencia "AGT", es complementaria a la secuencia "TCA". La complementariedad puede ser "parcial", en la que sólo algunas de las bases de los ácidos nucleicos se emparejan de acuerdo con las reglas de emparejamiento de bases. O puede haber complementariedad "completa" o "total" entre los ácidos nucleicos. El grado de complementariedad entre las cadenas de ácidos nucleicos tiene efectos significativos sobre la eficacia y la fuerza de la hibridación entre las cadenas de ácidos nucleicos. Esto es de particular importancia en las reacciones de amplificación, así como en los métodos de detección que dependen de la unión entre ácidos nucleicos.
El término "homología" cuando se usa en relación con ácidos nucleicos se refiere a un grado de complementariedad. Puede haber homología parcial u homología completa. "Identidad de secuencia" se refiere a una medida de relación entre dos o más ácidos nucleicos o proteínas, y se da como un porcentaje con referencia a la longitud total de comparación. El cálculo de la identidad tiene en cuenta aquellos residuos de nucleótidos o aminoácidos que son idénticos y están en las mismas posiciones relativas en sus respectivas secuencias más grandes. Los cálculos de identidad se pueden realizar mediante algoritmos contenidos en programas informáticos tales como "GAP" (Genetics Computer Group, Madison, Wis.) Y "ALIGN" (DNAStar, Madison, Wis.). Una secuencia parcialmente complementaria es aquella que inhibe al menos parcialmente (o compite con) una secuencia completamente complementaria de hibridar con un ácido nucleico diana. Se hace referencia al término funcional "sustancialmente homólogo". La inhibición de la hibridación de la secuencia completamente complementaria a la secuencia diana puede examinarse usando un ensayo de hibridación (transferencia Southern o Northern, hibridación en solución y similares) en condiciones de baja rigurosidad. Una secuencia o sonda sustancialmente homóloga competirá e inhibirá la unión (es decir, la hibridación) de una secuencia que es completamente homóloga a una diana en condiciones de baja rigurosidad. Esto no quiere decir que las condiciones de baja rigurosidad sean tales que se permita la unión no específica; Las condiciones de baja rigurosidad requieren que la unión de dos secuencias entre sí sea una interacción específica (es decir, selectiva). La ausencia de unión no específica puede probarse mediante el uso de una segunda diana que carece incluso de un grado parcial de complementariedad (por ejemplo, menos de aproximadamente 30 % de identidad); en ausencia de unión no específica, la sonda no hibridará con la segunda diana no complementaria.
Los siguientes términos se utilizan para describir las relaciones de secuencia entre dos o más polinucleótidos: "secuencia de referencia", "identidad de secuencia", "porcentaje de identidad de secuencia", y "identidad sustancial". Una "secuencia de referencia" es una secuencia definida que se utiliza como base para una comparación de secuencias; una secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia más grande, por ejemplo, como un segmento de una secuencia de ADNc de longitud completa dada en una lista de secuencias o puede comprender una secuencia génica completa. Generalmente, una secuencia de referencia tiene al menos 20 nucleótidos de longitud, frecuentemente al menos 25 nucleótidos de longitud y, a menudo, al menos 50 nucleótidos de longitud. Dado que dos polinucleótidos pueden cada uno (1) comprender una secuencia (es decir, una parte de la secuencia polinucleotídica completa) que es similar entre los dos polinucleótidos, y (2) pueden comprender además una secuencia que es divergente entre los dos polinucleótidos, las comparaciones de secuencia entre dos (o más) polinucleótidos se realizan típicamente comparando secuencias de los dos polinucleótidos en una "ventana de comparación" para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia. Una "ventana de comparación", como se usa en este documento, se refiere a un segmento conceptual de al menos 20 posiciones de nucleótidos contiguos en el que una secuencia de polinucleótidos se puede comparar con una secuencia de referencia de al menos 20 nucleótidos contiguos y en el que la porción de la secuencia de polinucleótidos en la comparación la ventana puede comprender adiciones o eliminaciones (es decir, espacios) del 20 por ciento o menos en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o eliminaciones) para el alineamiento óptimo de las dos secuencias. La alineación óptima de secuencias para su comparación se puede llevar a cabo mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1981) Add. Appl. Matemáticas. 2: 482 (1981)) mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch (Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970)), mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman (Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. (Estados Unidos) 85: 2444 (1988)), mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), O por inspección, y la mejor alineación (es decir, que da como resultado el mayor porcentaje de homología sobre la ventana de comparación) generada por los diversos se selecciona métodos. El término "identidad de secuencia" significa que dos secuencias de polinucleótidos son idénticas (es decir, nucleótido a nucleótido) en la ventana de comparación.
El porcentaje de identidad de secuencia se calcula mediante la determinación de la cantidad de posiciones en las que la base de ácido nucleico o el residuo de aminoácidos idéntico aparece en ambas secuencias para proporcionar la cantidad de posiciones emparejadas, dividiendo la cantidad de posiciones emparejadas entre la cantidad total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para proporcionar el porcentaje de identidad de secuencia.
En ciertas realizaciones, la "identidad" de secuencia se refiere al número de aminoácidos que coinciden exactamente (expresado como un porcentaje) en un alineamiento de secuencia entre dos secuencias del alineamiento calculado usando el número de posiciones idénticas dividido por la mayor de la secuencia más corta o el número de posiciones equivalentes excluyendo los voladizos en los que los espacios internos se cuentan como una posición equivalente. Por ejemplo, los polipéptidos GGGGGG y GGGGT tienen una identidad de secuencia de 4 de 5 u 80 %. Por ejemplo, los polipéptidos GGGPPP y GGGAPPP tienen una identidad de secuencia de 6 de 7 u 85 %. En determinadas realizaciones, cualquier mención de la identidad de secuencia expresada en el presente documento puede sustituir la similitud de secuencia. El porcentaje de "similitud" se utiliza para cuantificar la similitud entre dos secuencias del alineamiento. Este método es idéntico para determinar la identidad, excepto que ciertos aminoácidos no tienen que ser idénticos para tener una coincidencia. Los aminoácidos se clasifican como coincidencias si se encuentran entre un grupo con propiedades similares de acuerdo con los siguientes grupos de aminoácidos: Aromáticos - FYW; hidrofóbico-A VIL; Cargado positivo: RKH; Cargado negativo - DE; Polar: STN Q.
Los términos "identidad sustancial" como se usan en este documento denotan una característica de una secuencia de polinucleótidos, donde el polinucleótido comprende una secuencia que tiene al menos 85 por ciento de identidad de secuencia, preferiblemente al menos 90 a 95 por ciento de identidad de secuencia, más usualmente al menos 99 por ciento de identidad de secuencia en comparación con una secuencia de referencia en una ventana de comparación de al menos 20 posiciones de nucleótidos, frecuentemente en una ventana de al menos 25-50 nucleótidos, donde el porcentaje de identidad de secuencia se calcula comparando la secuencia de referencia con la secuencia de polinucleótidos que puede incluir deleciones o adiciones que suman el 20 por ciento o menos de la secuencia de referencia en la ventana de comparación. La secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia más grande, por ejemplo, como un segmento de las secuencias completas de las composiciones reivindicadas en la presente divulgación.
Cuando se utiliza en referencia a una secuencia de ácido nucleico bicatenario, como un ADNc o un clon genómico, el término "sustancialmente homólogo" se refiere a cualquier sonda que pueda hibridar con una o ambas cadenas del doble -secuencia de ácido nucleico en cadena en condiciones de rigurosidad baja a alta como se describe anteriormente.
Cuando se usa en referencia a una secuencia de ácido nucleico monocatenario, el término "sustancialmente homólogo" se refiere a cualquier sonda que pueda hibridar (es decir, es el complemento de) el ácido nucleico monocatenario secuencia en condiciones de rigurosidad baja a alta como se describe anteriormente.
El término “enlazado de forma operativa”, como se utiliza en la presente, se refiere al enlace de dos o más secuencias de ácido nucleico de forma tal que se produzca una molécula de ácido nucleico que pueda dirigir la transcripción de un gen dado y/o la síntesis de una molécula de proteína deseada. El término también se refiere al enlace de secuencias de aminoácidos de tal manera que se produce una proteína funcional.
El término "elemento regulador" se refiere a un elemento genético que controla algún aspecto de la expresión de secuencias de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor es un elemento regulador que facilita el inicio de la transcripción de una región codificante unida operativamente. Otros elementos reguladores son señales de empalme, señales de poliadenilación, señales de terminación, etc.
Las señales de control transcripcional en eucariotas comprenden elementos "promotores" y "potenciadores". Los promotores y potenciadores consisten en series cortas de secuencias de ADN que interactúan específicamente con proteínas celulares implicadas en la transcripción (Maniatis, et al., Science 236: 1237, 1987). Se han aislado elementos promotores y potenciadores de una variedad de fuentes eucariotas que incluyen genes en células de levadura, insectos, mamíferos y plantas. Los elementos promotores y potenciadores también se han aislado de virus y se encuentran en procariotas. La selección de un promotor y potenciador particular depende del tipo de célula utilizado para expresar la proteína de interés. Algunos promotores y potenciadores eucariotas tienen una amplia gama de huéspedes, mientras que otros son funcionales en un subconjunto limitado de tipos de células (para una revisión, véaseVoss, et al., Trends Biochem. Sci., 11: 287, 1986; y Maniatis y col., supra 1987).
Los términos "elemento promotor", "promotor" o "secuencia promotora" como se usan en este documento, se refieren a una secuencia de ADN que se encuentra en el extremo 5 '(es decir precede) a la región codificante de proteínas de un polímero de ADN. La ubicación de la mayoría de los promotores conocidos en la naturaleza precede a la región transcrita. El promotor funciona como un interruptor, activando la expresión de un gen. Si el gen está activado, se dice que se transcribe o participa en la transcripción. La transcripción implica la síntesis de ARNm del gen. El promotor, por tanto, sirve como elemento regulador de la transcripción y también proporciona un sitio para el inicio de la transcripción del gen en ARNm.
promotores pueden ser específicos de tejido o específicos de célula. El término "específico de tejido", tal como se aplica a un promotor, se refiere a un promotor que es capaz de dirigir la expresión selectiva de una secuencia de nucleótidos de interés a un tipo específico de tejido (por ejemplo, semillas) en ausencia relativa de expresión del mismo nucleótido. secuencia de interés en un tipo diferente de tejido (por ejemplo, hojas). La especificidad tisular de un promotor puede evaluarse, por ejemplo, enlazando operativamente un gen informador a la secuencia promotora para generar una construcción informadora, introduciendo la construcción informadora en el genoma de una planta de modo que la construcción informadora se integre en cada tejido de la planta. planta transgénica resultante y detectar la expresión del gen informador (por ejemplo, detectar ARNm, proteína o la actividad de una proteína codificada por el gen informador) en diferentes tejidos de la planta transgénica. La detección de un mayor nivel de expresión del gen informador en uno o más tejidos en relación con el nivel de expresión del gen informador en otros tejidos muestra que el promotor es específico para los tejidos en los que se detectan mayores niveles de expresión. El término "específico del tipo de célula" aplicado a un promotor se refiere a un promotor que es capaz de dirigir la expresión selectiva de una secuencia de nucleótidos de interés en un tipo específico de célula en ausencia relativa de expresión de la misma secuencia de nucleótidos de interés en un diferente tipo de célula dentro del mismo tejido. El término "específico de tipo celular" cuando se aplica a un promotor también significa un promotor capaz de promover la expresión selectiva de una secuencia de nucleótidos de interés en una región dentro de un solo tejido. La especificidad del tipo de célula de un promotor se puede evaluar usando métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, tinción inmunohistoquímica. Brevemente, las secciones de tejido se incrustan en parafina y las secciones de parafina se hacen reaccionar con un anticuerpo primario que es específico para el producto polipeptídico codificado por la secuencia de nucleótidos de interés cuya expresión está controlada por el promotor. Se deja que un anticuerpo secundario marcado (por ejemplo, conjugado con peroxidasa) que es específico para el anticuerpo primario se una al tejido seccionado y se detecta la unión específica (por ejemplo, con avidina/biotina) por microscopía.
promotores pueden ser constitutivos o regulables. El término "constitutivo" cuando se hace referencia a un promotor significa que el promotor es capaz de dirigir la transcripción de una secuencia de ácido nucleico unida operativamente en ausencia de un estímulo (por ejemplo, choque térmico, productos químicos, luz, etc.). Normalmente, los promotores constitutivos son capaces de dirigir la expresión de un transgén sustancialmente en cualquier célula y tejido.
En contraste, un promotor "regulable" o "inducible" es aquel que es capaz de dirigir un nivel de transcripción de una secuencia de ácido nucleico operativamente enlazada en presencia de un estímulo (por ejemplo, choque térmico, productos químicos, luz, etc.) que es diferente del nivel de transcripción de la secuencia de ácido nucleico operativamente enlazada en ausencia del estímulo.
El potenciador y/o promotor puede ser "endógeno" o "exógeno" o "heterólogo". Un potenciador o promotor "endógeno" es uno que está naturalmente ligado a un gen dado en el genoma. Un potenciador o promotor "exógeno" o "heterólogo" es uno que se coloca en yuxtaposición con un gen por medio de manipulación genética (es decir, técnicas de biología molecular) de manera que la transcripción del gen está dirigida por el potenciador o promotor ligado. Por ejemplo, un promotor endógeno en combinación operativa con un primer gen puede aislarse, eliminarse y colocarse en combinación operativa con un segundo gen, convirtiéndolo así en un "promotor heterólogo" en combinación operativa con el segundo gen. Se contempla una variedad de tales combinaciones (por ejemplo, el primer y segundo genes pueden ser de la misma especie o de diferentes especies).
La expresión eficaz de secuencias de ADN recombinante en células eucariotas normalmente requiere la expresión
de señales que dirigen la terminación eficaz y la poliadenilación del transcrito resultante. Las señales de terminación
de la transcripción se encuentran generalmente aguas abajo de la señal de poliadenilación y tienen unos pocos
cientos de nucleótidos de longitud. El término "sitio poli (A)" o "secuencia poli (A)" como se usa en este documento
denota una secuencia de ADN que dirige tanto la terminación como la poliadenilación del transcrito de ARN
naciente. Es deseable una poliadenilación eficaz del transcrito recombinante, ya que los transcritos que carecen de
una cola poli (A) son inestables y se degradan rápidamente. La señal de poli (A) utilizada en un vector de expresión
puede ser "heteróloga" o "endógena". Una señal poli (A) endógena se encuentra naturalmente en el extremo 3 'de la
región codificante de un gen dado en el genoma. Una señal poli (A) heteróloga es una que se ha aislado de un gen y
se ha posicionado 3 'con respecto a otro gen. Una señal poli (A) heteróloga comúnmente utilizada es la señal poli (A)
de SV40. La señal de poli (A) de SV40 está contenida en un fragmento de restricción BamHI/BclI de 237 pb y dirige
tanto la terminación como la poliadenilación.
El término "vector" se refiere a moléculas de ácido nucleico que transfieren segmento (s) de ADN de una célula a
otra. El término "vehículo" a veces se usa indistintamente con "vector".
"Vector de expresión" o "construcción de expresión" tal como se usa en la presente se refiere a una molécula de
ADN recombinante que contiene una secuencia de codificación deseada y secuencias de control de ácido nucleico
apropiadas necesarias para la expresión de la secuencia de codificación unida de manera operativa en una célula
hospedadora particular.
Las secuencias de ácido nucleico utilizadas para la expresión en procariotas incluyen típicamente un promotor, un
operador (opcional) y un sitio de unión a ribosoma, a menudo junto con otras secuencias. Se sabe que las células
eucariotas utilizan promotores, potenciadores y señales de terminación y poliadenilación.
El término "célula huésped" se refiere a cualquier célula capaz de replicar y/o transcribir y/o traducir un gen
heterólogo. Como se usa en el presente documento, el término "célula" se refiere a cualquier célula eucariota,
incluidas las células de mamíferos, células aviares, células de anfibios, células vegetales, células de peces y células
de insectos, ya sea que se encuentren in vitro o in vivo. Por ejemplo, las células hospedadoras pueden estar
ubicadas en un animal transgénico.
El término "marcador seleccionable" se refiere a un gen que codifica una enzima que tiene una actividad que
confiere resistencia a antibióticos o fármacos a la célula en la que se expresa el marcador seleccionable, o que
confiere expresión de un rasgo que puede detectarse (por ejemplo, luminiscencia o fluorescencia). Los marcadores
seleccionables pueden ser "positivos" o "negativos". Ejemplos de marcadores seleccionables positivos incluyen el
gen de la neomicina fosfotrasferasa (NPTII) que confiere resistencia a G418 y a la kanamicina, y el gen de
higromicina fosfotransferasa bacteriana (hyg), que confiere resistencia al antibiótico higromicina. Los marcadores
seleccionables negativos codifican una actividad enzimática cuya expresión es citotóxica para la célula cuando se
cultiva en un medio selectivo apropiado. Por ejemplo, el gen HSV-tk se usa comúnmente como marcador
seleccionable negativo. La expresión del gen HSV-tk en células cultivadas en presencia de ganciclovir o aciclovir es
citotóxica; por tanto, el crecimiento de células en medio selectivo que contiene ganciclovir o aciclovir selecciona
contra células capaces de expresar una enzima TK de HSV funcional.
El término "gen indicador" se refiere a un gen que codifica una proteína que se puede ensayar. Los ejemplos de
genes indicadores incluyen, pero no se limitan a, katushka, mkate y mkate2 modificados (véase, por
ejemplo,Merzlyak et al., Nat. Methods, 2007, 4, 555-557yShcherbo et al., Biochem. J., 2008, 418, 567-574), luciferasa (Véase, por ejemplo,deWet et al., Mol. Cell. Biol. 7:725 (1987) and U.S. Pat Nos., 6.074.859; 5.976.796;
5.674.713; and 5.618.682; all of which are incorporated herein by reference), green fluorescent protein (e.g.,
GenBank Accession Number U43284; a number of GFP variants are commercially available from ClonTech
Laboratories, Palo Alto, Calif.), chloramphenicol acetyltransferase, beta-galactosidase, alkaline phosphatase, and
horse radish peroxidase.
El término "tipo salvaje" cuando se hace en referencia a un gen se refiere a un gen que tiene las características de
un gen aislado de una fuente de origen natural. Según se utiliza en la presente, el término “tipo salvaje” se refiere a
un gen o un producto génico que tiene las características de ese gen o producto génico cuando se aísla de una
fuente de origen natural. El término "de origen natural", como se usa en este documento, aplicado a un objeto, se
refiere al hecho de que un objeto se puede encontrar en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polipéptidos o
polinucleótidos que está presente en un organismo (incluidos los virus) que puede aislarse de una fuente en la
naturaleza y que no ha sido modificada intencionalmente por el hombre en el laboratorio es de origen natural. Un
gen natural es aquel que se observa con mayor frecuencia en una población y, por lo tanto, se designa
arbitrariamente como la forma "normal" o "natural" del gen. Por el contrario, el término "modificado" o "mutante"
cuando se hace referencia a un gen o un producto génico se refiere, respectivamente, a un gen o a un producto
génico que muestra modificaciones en la secuencia y/o propiedades funcionales (es decir, alterado características)
en comparación con el gen o el producto génico de tipo salvaje. Se observa que pueden aislarse mutantes de origen
natural; estos se identifican por el hecho de que tienen características alteradas en comparación con el gen o producto génico de tipo salvaje.
El término "antisentido" o "antigenoma" se refiere a una secuencia de nucleótidos cuya secuencia de residuos de nucleótidos está en orientación inversa 5 'a 3' en relación con la secuencia de nucleótidos residuos en una cadena de sentido. Una "hebra con sentido" de un dúplex de ADN se refiere a una hebra en un dúplex de ADN que es transcrita por una célula en su estado natural en un "ARNm con sentido". Por tanto, una secuencia "antisentido" es una secuencia que tiene la misma secuencia que la hebra no codificante en un dúplex de ADN.
El término "aislado" se refiere a un material biológico, como un virus, un ácido nucleico o una proteína, que está sustancialmente libre de componentes que normalmente acompañan o interactúan con en su entorno natural. El material aislado comprende opcionalmente material que no se encuentra con el material en su entorno natural, por ejemplo, una celda. Por ejemplo, si el material está en su entorno natural, como una célula, el material se ha colocado en un lugar de la célula (por ejemplo, genoma o elemento genético) que no es nativo de un material que se encuentra en ese entorno. Por ejemplo, un ácido nucleico de origen natural (p. Ej., Una secuencia codificante, un promotor, un potenciador, etc.) se aísla si se introduce por medios no naturales en un locus del genoma (p. Ej., Un vector, como un plásmido o vector de virus, o amplicón) no nativo de ese ácido nucleico. Dichos ácidos nucleicos también se denominan ácidos nucleicos "heterólogos". Un virus aislado, por ejemplo, se encuentra en un entorno (p. Ej., Un sistema de cultivo celular o purificado a partir de un cultivo celular) distinto al entorno nativo del virus de tipo salvaje (p. Ej., La nasofaringe de un individuo infectado).
Una "cantidad inmunológicamente eficaz" de VSR es una cantidad suficiente para mejorar la propia respuesta inmunitaria de un individuo (por ejemplo, un ser humano) contra una exposición posterior al VSR. Los niveles de inmunidad inducida pueden controlarse, por ejemplo, midiendo cantidades de anticuerpos neutralizantes secretores y/o séricos, por ejemplo, mediante neutralización en placa, fijación del complemento, inmunoabsorbente ligado a enzima o ensayo de microneutralización.
Una "respuesta inmune protectora" contra el VSR se refiere a una respuesta inmune exhibida por un individuo (por ejemplo, un ser humano) que protege contra una enfermedad grave del tracto respiratorio inferior (por ejemplo, neumonía y/o bronquiolitis) cuando el individuo es posteriormente expuesto ay/o infectado con VSR de tipo salvaje.
Virus sincitial respiratorio recombinante (VSR) con mutaciones silenciosas de uso de codones en genes no estructurales
candidatos a vacuna de VSR vivos atenuados tienen dos obstáculos principales, inmunogenicidad subóptima en bebés y estabilidad subóptima que conduce a la reversión genética hacia el tipo salvaje y la eliminación de revertientes por parte de los vacunados. Las proteínas virales no estructurales (NS), NS1 y NS2, son únicas e inhiben las respuestas del interferón tipo I y de las células T. La mutación de NS1/NS2 para la vacuna mejora la inmunogenicidad. Sin embargo, las cepas de VSR recombinante mutante nulo/deleción NS1 y NS1/NS2 desarrolladas previamente están sobreatenuadas, y el mutante nulo NS2 está sub-atenuado in vivo.
mutantes descritos en el presente documento superan las limitaciones de la sobreatenuación y la inestabilidad. Se generaron mutantes con función parcial NS1 y NS2 para cerrar la brecha de atenuación-inmunogenicidad para una vacuna pediátrica. La síntesis de genes y el sistema de rescate VSR BAC se utilizaron para generar mutantes NS1/NS2 alterando el uso de codones en los genes NS1 y NS2. La desoptimización de codones reduce la eficiencia de traducción mediante múltiples mecanismos (por ejemplo, concentración de ARNt y estructura de ARNm). Un mutante descrito en el presente documento ("dNSh") tiene 84/420 nt de NS1 mutado y 82/375 nt de NS2 mutado, lo que reduce la preferencia de codones humanos sin alterar las secuencias de aminoácidos. Este virus produce aproximadamente el 25 % de los niveles de NS1 en peso, el 25 % de los niveles de NS2 en peso, el 100 % de los niveles de nucleoproteína en peso y se replica como el virus de peso en las células Vero, la línea celular comúnmente utilizada para producir VSR vivo atenuado en condiciones de GMP (Fig. 2). Además de reducir la expresión de NS, este enfoque probablemente resuelve el problema de la estabilidad genética porque hay demasiadas mutaciones para la reversión.
La divulgación se refiere a una vacuna, genoma de VSR recombinante o un ácido nucleico recombinante aislado que codifica VSR NS1, NS2, N, P, M, G, F, M2- 1, M2-2 y genes L que comprenden la desoptimización del codón de los genes NS1 y NS2, en donde la desoptimización del codón se configura de tal manera que al menos un codón para producir Gly es GGT, un codón para producir Asp es GAT, al menos un codón para producir Glu es GAA, al menos un codón para producir His es CAT, al menos un codón para producir Ile es ATA, al menos un codón para producir Lys es AAA, al menos un codón para producir Leu es CTA, al menos un codón para producir Asn es AAT, al menos un codón para producir Gln es CAA, al menos un codón para producir Val es GTA, o al menos un codón para producir Tyr es TAT, donde en más del 25 % de Asp, Glu, His Los aminoácidos, Ile, Lys, Leu, Asn, Gln, Val y Tyr están desoptimizados por codones. Más del 75 % de los aminoácidos pueden ser desoptimizados por codones en comparación con las secuencias de tipo salvaje, por ejemplo, VSR A2 línea 19.
En ciertas realizaciones, el gen NS1 comprende (SEQ ID NO: 6) o una variante de la misma con más del 95, 97, 98 o 99 % o más de identidad de secuencia.
El gen NS2 puede comprender (SEQ ID NO: 9) o una variante del mismo con más del 70, 80, 90, 95, 97, 98 o 99 % o más de identidad de secuencia con el mismo.
El gen de la glicoproteína hidrofóbica pequeña (SH) del VSR se puede eliminar.
El ácido nucleico puede tener una desoptimización adicional del codón del gen G, en el que la desoptimización del codón se configura de modo que al menos un codón para producir Gly sea GGT, un codón para producir Asp sea GAT, en al menos un codón para producir Glu es GAA, al menos un codón para producir His es CAT, al menos un codón para producir Ile es ATA, al menos un codón para producir Lys es AAA, al menos un codón para producir Leu es CTA, en al menos un codón para producir Asn es AAT, al menos un codón para producir Gln es cAa , al menos un codón para producir Val es GTA, o al menos un codón para producir Tyr es TAT, donde en más del 25 % de Asp, Los aminoácidos Glu, His, Ile, Lys, Leu, Asn, Gln, Val y Tyr tienen codones desoptimizados.
El gen G puede comprender SEQ ID NO: 18 ATGTCGAAAAACAAAGACCAACGTACCGCGAAGACGTTAGAACGTACCTGGGA TACTCTAAATCATTTACTATTCATATCGTCGTGCCTATATAAGCTAAATCTTAAA TCGGTAGCACAAATAACACTATCCATACTGGCGATAATAATCTCGACTTCGCTT ATAATAGCAGCGATCATATTTATAGCCTCGGCGAACCATAAAGTCACGCCAACG ACTGCGATCATACAAGATGCGACATCGCAGATAAAGAATACAACGCCAACGTA CCTAACCCAAAATCCTCAACTTGGTATCTCGCCCTCGAATCCGTCTGAAATAAC ATCGCAAATCACGACCATACTAGCGTCAACGACACCGGGAGTAAAGTCGACCC TACAATCCACGACAGTAAAGACGAAAAACACGACAACGACTCAAACGCAACCC TCGAAGCCGACCACGAAACAACGCCAAAATAAACCACCGAGCAAACCGAATAA TGATTTTCACTTTGAAGTATTCAATTTTGTACCCTGTAGCATATGTAGCAATAAT CCAACGTGCTGGGCGATCTGTAAAAGAATACCGAACAAAAAACCGGGAAAAAA AACCACGACCAAACCCACGAAAAAACCAACGCTCAAAACAACGAAAAAAGAT CCCAAAC CGCAAACCACGAAATCAAAAGAAGTACCCACGACCAAAC CCACGGA AGAGCCGACCATAAACACGACCAAAACGAACATAATAACTACGCTACTCACGT CCAATACCACGGGAAATCCGGAACTCACGAGTCAAATGGAAACGTTTCACTCG ACTTCGTCCGAAGGTAATCCATCGCCTTCGCAAGTCTCGACAACGTCCGAATAC CCGTCACAACCGTCATCGCCACCGAACACGCCACGTCAGTAG o variante del mismo con una mayor de 70, 80, 90, 95, 97, 98 o 99 % o más de identidad de secuencia con los mismos.
El gen puede comprender SEQ ID NO: 19 ATGTCGAAAAATAAAGACCAACGTACGGCGAAGACGCTAGAACGTACCTGGGA TACGCTAAATCATTTACTATTTATATCGTCGTGCCTATATAAACTAAATCTTAAA TCGGTAGCGCAAATAACACTATCGATACTGGCGATAATAATATCGACTTCGCTA ATAATAGCAGCGATAATATTTATAGCCTCGGCGAATCATAAAGTCACGCCGACG ACTGCGATAATACAAGATGCGACATCGCAAATAAAGAATACGACGCCAACGTA TCTAACCCAAAATCCGCAACTTGGTATATCGCCCTCGAATCCGTCGGAAATAAC ATCGCAAATAACGACCATACTAGCGTCGACGACACCGGGTGTAAAGTCGACGC TACAATCCACGACGGTAAAGACGAAAAATACGACAACGACGCAAACGCAACCG TCGAAACCGACCACGAAACAACGTCAAAATAAACCACCGTCGAAACCGAATAA TGATTTTCACTTTGAAGTATTTAATTTTGTACCCTGTTCGATATGTAGCAATAAT CCGACGTGCTGGGCGATATGTAAAAGAATACCGAATAAAAAACCGGGAAAAAA AACGACGACCAAACCGACGAAAAAACCAACGCTAAAAACAACGAAAAAAGAT CCGAAACCGCAAACCACGAAATCGAAAGAAGTACCCACGACGAAACCCACGG AAGAACCGACCATAAATACGACCAAAACGAATATAATAACTACGCTACTAACG TCCAATACGACGGGAAATCCGGAACTAACGAGTCAAATGGAAACGTTTCATTC GACTTCGTCGGAAGGTAATCCATCGCCGTCGCAAGTCTCGACGACTTCCGAATA TCCGTCACAACCGTCGTCGCCACCGAATACGCCACGTCAATAG o variante del mismo con una mayor ° un 70, 80, 90, 95, 97, 98 o 99 % o más de identidad de secuencia con el mismo.
El gen G puede comprender SEQ ID NO: 20 ATGTCGAAAAATAAAGATCAACGTACGGCGAAAACGCTAGAACGTACGTGGGA TACGCTAAATCATCTACTATTTATATCGTCGTGTCTATATAAACTAAATCTAAAA TCGGTAGCGCAAATAACGCTATCGATACTAGCGATAATAATATCGACTTCGCTA ATAATAGCGGCGATAATATTTATAGCGTCGGCGAATCATAAAGTAACGCCGAC GACGGCGATAATACAAGATGCGACTTCGCAAATAAAAAATACGACGCCGACGT ATCTAACGCAAAATCCGCAACTAGGTATATCGCCGTCGAATCCGTCGGAAATAA CGTCGCAAATAACGACGATACTAGCGTCGACGACGCCGGGTGTAAAATCGACG CTACAATCGACGACGGTAAAAACGAAAAATACGACGACGACGCAAACGCAACC GTCGAAACCGACGACGAAACAACGTCAAAATAAACCGCCGTCGAAACCGAATA ATGATTTTCATTTTGAAGTATTTAATTTTGTACCGTGTTCGATATGTTCGAATAA TCCGACGTGTTGGGCGATATGTAAACGTATACCGAATAAAAAACCGGGTAAAA
AAACGACGACGAAACCGACGAAAAAACCGACGCTAAAAACGACGAAAAAAGA TCCGAAACCGCAAACGACGAAATCGAAAGAAGTACCGACGACGAAACCGACG GAAGAACCGACGATAAATACGACGAAAACGAATATAATAACGACGCTACTAAC GTCGAATACGACGGGTAATCCGGAACTAACGTCGCAAATGGAAACGTTTCATTC GACtTCGTCGGAAGGTAATCCGTCGCCGTCGCAAGTATCGACGACtTCGGAATAT CCGTCGCAACCGTCGTCGCCGCCGAATACGCCGCGTCAATAG o variante del mismo con una mayor de 70, 80, 90, 95, 97, 98 o 99 % o más de identidad de secuencia con los mismos.
El gen F puede codificar una valina en la posición 557 y una lisina en la posición 66. El gen F puede codificar una valina en la posición 557 y el gen F puede comprender una secuencia que codifica una o más de las siguientes secuencias de aminoácidos El gen F comprende dos, tres, cuatro, cinco o todas las siguientes secuencias de aminoácidos TTNIMITTIIMMLLSUAVGLLLYCK (SEQ ID NO: 11), ARSTPVPILKANAITTILAAVTFCFA (SEQ ID NO: 12), AVTFCFASSQNITEEFYQST (SEQ ID NO: 13), QSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKK (SEQ ID NO: 14), IKK NKCNGTDAKVKLMKQELDKYKNAV (SEQ ID NO: 15), y FPQAEKCKVQSNRVFC DTMYSLTLPSEVNLCNV (SEQ ID NO : 16).
El gen F puede comprender dos, tres, cuatro, cinco o todas las siguientes secuencias de aminoácidos (SEQ ID NO: 11), (SEQ ID NO: 12), (SEQ ID NO: 13), (SEQ ID NO: 14), (SEQ ID NO: 15) y (SEQ ID NO: 16).
El gen F puede codificar una valina en la posición 557 y el gen F puede codificar uno o más de los siguientes aminoácidos: asparagina en la posición 8, fenilalanina en la posición 20, serina en la posición 35, lisina en la posición 66, metionina en la posición 79, lisina en la posición 124, arginina en la posición 191, arginina en la posición 213, ácido glutámico en la posición 354, lisina en la posición 357, tirosina en la posición 371, valina en la posición 384, asparagina en la posición 115 y treonina en la posición 523.
El gen F puede codificar una valina en la posición 557 y lisina en la posición 66 y metionina en la posición 79.
El gen F puede codificar una valina en la posición 557 y lisina en la posición 66 y arginina en la posición 191.
El gen F puede codificar una valina en la posición 557, lisina en la posición 66, arginina en la posición 191 y lisina en la posición 357.
El gen F puede codificar una valina en la posición 557, lisina en la posición 66, metionina en la posición 79 y asparagina en la posición 115.
El gen F puede codificar SEQ ID NO: 17
MELPILKANAITTILAAVTFCFASSQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITI
ELSNIKKNKCNGTDAKVKLMKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPAANNRARRELPRF
MNYTLNNTKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAV SKVLHLEGEVNKIKSA
LLSTNKAVVSLSNGVSVLTSRVLDLKNYIDKQLLPIYNKQSCRISNIETVIEFQQKNN
RLLEITREFSYNAGVTTPYSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNYQIYRQQS
YSIMSIIKEEVLAYWQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWY
CDNAGSVSFFPQAEKCKVQSNRVFCDTMYSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTS
KTDV S SSVITSLGAIV SCY GKTKCTASNKNRGIIKTF SNGCDYV SNKGVDTV SV GNT
LYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELL
HNVNAGKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN
o variantes que contienen uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez amino sustituciones ácidas siempre que el gen F codifique una valina en la posición 557. En algunas modalidades, todas las sustituciones de aminoácidos son sustituciones conservadoras.
La divulgación se refiere a un ácido nucleico recombinante aislado que comprende un gen F que codifica (SEQ ID NO: 17) o variantes que contienen una o dos sustituciones de aminoácidos siempre que el gen F codifique una valina en la posición 557 y lisina en la posición 66.
El gen F puede codificar una valina en la posición 557 y el gen F codifica uno o más de los siguientes aminoácidos: asparagina en la posición 8, fenilalanina en la posición 20, serina en la posición 35, lisina en posición 66, metionina en la posición 79, lisina en la posición 124, arginina en la posición 191, arginina en la posición 213, ácido glutámico en la posición 354, lisina en la posición 357, tirosina en la posición 371, valina en la posición 384, asparagina en la posición 115, y treonina en la posición 523.
El gen F puede codificar una valina en la posición 557 y una lisina en la posición 66.
El gen F puede codificar una valina en la posición 557 y lisina en la posición 66 y metionina en la posición 79. El gen F puede codificar una valina en la posición 557, lisina en la posición 66, arginina en la posición 191 y lisina en la posición 357.
El gen F puede codificar una valina en la posición 557, lisina en la posición 66, metionina en la posición 79 y asparagina en la posición 115.
En determinadas realizaciones, la invención se refiere a un vector recombinante que comprende un ácido nucleico como se define en las reivindicaciones. En determinadas realizaciones, la invención se refiere a una célula que comprende el vector recombinante, VSR recombinante o VSR recombinante atenuado como se define en las reivindicaciones.
La divulgación se refiere a un gen F que codifica (SEQ ID NO: 17) o variantes que contienen sustituciones de un aminoácido siempre que el gen F codifique una valina en la posición 557.
La descripción se refiere a un gen que codifica F MELPILKANAITTILAAVTFCFASSQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITI ELSNIKENKCNGTDAKVKLMKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPAANNRARRELPRF MNYTLNNTKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKSA LLSTNKAVVSLSNGVSVLTSRVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCRISNIETVIEFQQKNN RLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQS YSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWY CDNAGSVSFFPQAEKCKVQSNRVFCDTMYSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTS KTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNT LYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELL HNVNAGKSTTNIMITTINVIIVILLSUAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN (SEQ ID NO: 21). El gen F puede codificar una valina en la posición 557 y ácido glutámico en la posición 66 y arginina en la posición 191.
La divulgación se refiere a polipéptidos recombinantes que comprenden una secuencia de proteína VSR F descrita en el presente documento. La divulgación se refiere a partículas de virus o partículas similares a virus producidas mediante métodos recombinantes que comprenden una secuencia de proteína VSR F descrita en el presente documento.
En ciertas realizaciones, la invención se refiere a un ácido nucleico recombinante aislado que comprende un genoma OE1 de VSR de SEQ ID NO: 1 o variante con más de 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, en el que el genoma comprende un ácido nucleico como se define en las reclamaciones. 96, 97, 98 o 99 % o más de identidad de secuencia con los mismos.
En determinadas realizaciones, la invención se refiere a un ácido nucleico recombinante aislado que comprende un genoma OE2 de VSR de SEQ ID NO: 2 o variante con más de 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, en el que el genoma comprende un ácido nucleico como se define en las reclamaciones. 96, 97, 98 o 99 % o más de identidad de secuencia con los mismos.
En ciertas realizaciones, la invención se refiere a un ácido nucleico recombinante aislado que comprende un genoma OE3 de VSR de SEQ ID NO: 3 o variante con más de 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, en el que el genoma comprende un ácido nucleico como se define en las reclamaciones. 96, 97, 98 o 99 % o más de identidad de secuencia con los mismos.
En determinadas realizaciones, la invención se refiere a un ácido nucleico recombinante aislado que comprende un genoma OE4 de VSR de SEQ ID NO: 4 o una variante con más de 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, en el que el genoma comprende un ácido nucleico como se define en las reclamaciones. 96, 97, 98 o 99 % o más de identidad de secuencia con los mismos.
La divulgación contempla ácidos nucleicos recombinantes aislados que comprenden genomas OE1, OE2, OE3 y OE4 del VSR, en los que uno o ambos genes NS1 y NS2 están delecionados.
Cultivando VSR en un cromosoma artificial bacteriano
cultivo del VSR en bacterias E. coli se puede lograr utilizando un cromosoma artificial bacteriano (BAC). Se describe un BAC que contiene la secuencia antigenómica completa de la cepa A2 del virus respiratorio sincitial (VSR), excepto el gen F, que es la secuencia antigenómica de la línea 19 de la cepa del VSR. Junto con los plásmidos auxiliares, se puede utilizar en el sistema de genética inversa para la recuperación de virus infecciosos. La secuencia del antigenoma en el plásmido se puede mutar antes de la recuperación del virus para generar virus con las mutaciones deseadas.
El plásmido es una mejora de los plásmidos antigenómicos actuales del VSR por varias razones. Cada gen de VSR está flanqueado por sitios de escisión de endonucleasas de restricción para permitir una fácil manipulación de cualquier gen. Como base para la mutagénesis viral, este plásmido puede usarse para diseñar virus atenuados para uso en vacunas. Un gen extra que codifica la proteína monomérica katushka 2, mKate2, se ha incluido en el antigenoma antes del primer gen del VSR. La proteína mKate2 es una proteína fluorescente de color rojo lejano que se expresaría en concierto con los otros genes del VSR y serviría como evidencia visual de la replicación del virus. También se han realizado cambios en las secuencias de ribozimas que flanquean el antigenoma del VSR y juegan un papel en la producción de virus infecciosos a través de la genética inversa.
Los vectores descritos permiten una mutagénesis eficaz a través de la recombinación. Este método de mutagénesis requiere poca o ninguna clonación por ligadura, pero se basa en la maquinaria de recombinación presente en las bacterias que albergan ciertos genes de un bacteriófago. Debido a que los ADNc de VSR a menudo son inestables en vectores de clonación de número de copias medio a alto dentro de bacterias que se usan predominantemente para clonación, como Eschericha coli (E. coli), la naturaleza de copia de un solo dígito del cromosoma artificial bacteriano reduce la inestabilidad y la reducción Se cree que la inestabilidad se produce porque la naturaleza de copia única limita la capacidad de E. coli para reconocer los promotores crípicos en el ADNc del VSR y producir proteínas tóxicas.
Virus sincitial respiratorio (VSR)
Normalmente, la partícula de VSR contiene un genoma viral dentro de una nucleocápside helicoidal que está rodeada por proteínas de la matriz y una envoltura que contiene glicoproteínas virales. El genoma del VSR de tipo salvaje codifica las proteínas, NS1, NS2, N, P, M, SH, G, F, M2-1, M2-2 y L. G, F y SH son glicoproteínas. El gen F se ha incorporado a varias vacunas virales. La actividad de la polimerasa del VSR consiste en la proteína grande (L) y la fosfoproteína (P). La proteína viral M2-1 se usa durante la transcripción y es probable que sea un componente del complejo de transcriptasa. La proteína N viral se usa para encapsular el a Rn naciente.
El genoma se transcribe y se replica en el citoplasma de una célula huésped. La transcripción de la célula huésped típicamente da como resultado la síntesis de diez ARNm metilados y poliadenilados. El antigenoma es un complemento de ARN de sentido positivo del genoma producido durante la replicación, que a su vez actúa como molde para la síntesis del genoma. Los genes virales están flanqueados por secuencias conservadas de inicio de gen (GS) y de final de gen (GE). En los extremos 3 'y 5' del genoma se encuentran los nucleótidos líder y de cola. La secuencia líder de tipo salvaje contiene un promotor en el extremo 3 '. Cuando la polimerasa viral alcanza una señal de GE, la polimerasa poliadenila y libera el ARNm y reinicia la síntesis de ARN en la siguiente señal de GS. Se cree que el complejo LP es responsable del reconocimiento del promotor, la síntesis de ARN, el taponamiento y la metilación de los extremos 5 'de los ARNm y la poliadenilación de sus extremos 3'. Se cree que la polimerasa a veces se disocia del gen en las uniones. Debido a que la polimerasa inicia la transcripción en el extremo 3 'del genoma, esto da como resultado un gradiente de expresión, con los genes en el extremo 3' del genoma que se transcriben con mayor frecuencia que los del extremo 5 '.
Para replicar el genoma, la polimerasa no responde a lasseñales de GE y GS que actúan en cisy genera un complemento de ARN de sentido positivo del genoma, el antigenoma. En el extremo 3 'del antigenoma está el complemento del tráiler, que contiene un promotor. La polimerasa usa este promotor para generar ARN con sentido del genoma. A diferencia del ARNm, que se libera como ARN desnudo, los ARN del antigenoma y del genoma se encapsulan con la nucleoproteína (N) del virus a medida que se sintetizan.
En determinadas realizaciones, la invención se refiere a vectores y ácidos nucleicos como se definen en las reivindicaciones y que contienen gen (s) del VSR como el genoma o antigenoma de tipo salvaje. An example of an VSR antigenome is provided in U.S. Patent No. 6.790.449. Se contempla que la referencia a los genes del VSR y al genoma incluya ciertas mutaciones, deleciones o combinaciones variantes, como los derivados de VSR sometidos a pases en frío (cp) y sensibles a la temperatura (ts), como rA2cp248/404/1030ASH. rA2cp248/404ASH contiene 4 elementos genéticos atenuantes independientes: cp que se basa en 5 mutaciones sin sentido en las proteínas N y L y la glicoproteína F que en conjunto confieren el fenotipo de atenuación no ts de cpVSR; ts248, una mutación sin sentido en la proteína L; ts404, una sustitución de nucleótidos en la señal de transcripción de inicio del gen del gen M2; y ASH, deleción completa del gen SH. rA2cp248/404/1030ASH contiene 5 elementos genéticos atenuantes independientes: los presentes en rA2cp248/404ASH y ts1030, otra mutación sin sentido en la proteína L. VéaseKarron et al., J Infect Dis., 2005, 191 (7): 1093-1104. Se contempla que el anitgenoma del VSR puede contener deleciones o mutaciones en genes no esenciales (p. Ej., SH, NS1, NS2 y genes M2-2) o combinaciones de los mismos.
Cromosomas artificiales bacterianos (BAC)
En determinadas realizaciones, la invención se refiere a vectores y ácidos nucleicos como se definen en las reivindicaciones y que contienen cromosomas artificiales bacterianos. Un sistema de clonación bacteriana para el mapeo y análisis de genomas complejos se ha descrito enShizuya et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1992, 89: 8794­ 8797. El sistema BAC (para cromosomas artificiales bacterianos) se basa en Escherichia coli y su factor de plásmido F de copia única que se describió como útil para clonar grandes fragmentos de ADN humano. El factor F codifica genes que regulan su propia replicación, incluidos oriS, repE, parA y parB. Los genes oriS y repE median la replicación unidireccional del factor F, mientras que parA y parB típicamente mantienen el número de copias a un nivel de una o dos por genoma de E. coli. Se contempla que los genes y el cromosoma pueden contener mutaciones, deleciones o variantes con atributos funcionales deseados. El vector BAC (pBAC) normalmente contiene estos genes, así como un marcador de resistencia y un segmento de clonación que contiene promotores para incorporar segmentos de ácido nucleico de interés ligándolos en sitios de enzimas de restricción. Los sistemas de BAC ejemplares incluyen los descritos enShizuya & Kouros-Hehr, Keio J Med, 2001, 50 (1): 26-30.
Se puede reconstituir el virus VSR infeccioso a partir de los plásmidos VSR BAC descritos en este documento. Los vectores BAC se pueden transfectar a bacterias como E. coli mediante electroporación. Los VSR-BAC descritos en el presente documento pueden mantenerse de manera estable en bacterias, volver a aislarse de las bacterias e insertarse en una célula eucariota junto con uno o más vectores que expresan las proteínas N, P, L y M2-1. Estas células producen partículas de VSR infecciosas. La producción de VSR infeccioso resulta de la cotransfección de plásmidos que codifican proteínas N, P, L y M2-1 y el antigenoma bajo el control del promotor T7 en células BHK-21 que expresan ARN polimerasa T7 (células BSR). VéaseBuchholz y col., J Virol., 2000, 74 (3): 1187-1199.
Vacuna
Se han desarrollado varias cepas atenuadas de VSR como vacunas candidatas para administración intranasal utilizando múltiples rondas de mutagénesis química para introducir múltiples mutaciones en un virus. La evaluación en roedores, chimpancés, adultos y lactantes indica que algunas de estas cepas de vacuna candidatas son inmunogénicas y pueden estar atenuadas. El análisis de la secuencia de nucleótidos de algunos de estos virus atenuados indica que cada nivel de atenuación aumentada se asocia típicamente con dos o más sustituciones de nucleótidos y aminoácidos nuevas.
La divulgación proporciona la capacidad de distinguir entre mutaciones incidentales silenciosas frente a las responsables de las diferencias fenotípicas al introducir las mutaciones, por separado y en varias combinaciones, en el genoma o antigenoma de infecciones VSR. Este proceso identifica mutaciones responsables de fenotipos como atenuación, sensibilidad a la temperatura, adaptación al frío, tamaño de placa pequeño, restricción del rango de hospedadores, etc. Las mutaciones de este menú se pueden introducir en varias combinaciones para calibrar un virus de vacuna a un nivel apropiado de atenuación., etc., como desee. Además, la presente divulgación proporciona la capacidad de combinar mutaciones de diferentes cepas de virus en una sola cepa.
La presente divulgación también proporciona métodos de atenuación. Por ejemplo, los genes internos individuales de VSR pueden reemplazarse con su homólogo de VSR bovino, murino u otro. Esto puede incluir parte o la totalidad de uno o más de los genes NS1, NS2, N, P, M, SH, M2-1, M2-2 y L, o partes de los genes G y F. Recíprocamente, se proporcionan medios para generar un VSR bovino atenuado vivo insertando genes atenuantes humanos en un genoma o antigenoma de VSR bovino. VSR humano que lleva glicoproteínas de VSR bovino proporciona una restricción de rango de hospedadores favorable para preparaciones de vacunas humanas. Las secuencias de VSR bovino que pueden usarse en la presente divulgación se describen en, por ejemplo,Pastey et al., J. Gen. Viol. 76: 193-197 (1993);Pastey y col., Virus Res. 29: 195 - 202 (1993);Zamora y col., J. Gen. Virol. 73: 737 - 741 (1992);Mallipeddi y col., J. Gen. Virol. 74: 2001-2004 (1993);Mallipeddi y col., J. Gen. Virol. 73: 2441-2444 (1992); yZamora y col., Virus Res. 24: 115-121 (1992),
La divulgación también proporciona la capacidad de analizar otros tipos de mutaciones atenuantes e incorporarlas en el VSR infeccioso para vacunas u otros usos. Por ejemplo, una cepa no patógena del virus de la neumonía adaptada al cultivo de tejidos de ratones (la contraparte murina del VSR) carece de una cola citoplasmática de la proteína G (Randhawa et al., Virology 207: 240-245 (1995)). Por analogía, los dominios citoplásmico y transmembrana de cada una de las glicoproteínas de VSR, F, G y SH, pueden eliminarse o modificarse para lograr la atenuación.
Otras mutaciones para uso en VSR infeccioso de la presente divulgación incluyen mutaciones en señales que actúan en cis identificadas durante el análisis mutacional de minigenomas de VSR. Por ejemplo, el análisis de inserción y deleción del líder y el remolque y las secuencias flanqueantes identificaron los promotores virales y las señales de transcripción y proporcionaron una serie de mutaciones asociadas con diversos grados de reducción de la replicación o transcripción del ARN. La mutagénesis de saturación (mediante la cual cada posición a su vez se modifica para cada una de las alternativas de nucleótidos) de estas señales que actúan en cis también ha identificado muchas mutaciones que redujeron (o en un caso aumentaron) la replicación o transcripción del ARN. Cualquiera de estas mutaciones puede insertarse en el antigenoma o genoma completo como se describe en el presente documento. Otras mutaciones implican el reemplazo del extremo 3 'del genoma con su contraparte del antigenoma, que está asociado con cambios en la replicación y transcripción del ARN. Además, las regiones intergénicas (Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 4594-4598 (1986),) se pueden acortar o alargar o cambiar en el contenido de secuencia, y el contenido de secuencia natural- el solapamiento de genes que se produce (Collins y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 5134-5138 (1987),) puede eliminarse o cambiarse a una región intergénica diferente mediante los métodos descritos en el presente documento.
En otra realización, el VSR útil en una formulación de vacuna puede modificarse convenientemente para adaptarse a la variación antigénica en el virus circulante, incluidas las cepas antigénicas del subgrupo A y B y las variaciones dentro de esos subgrupos. Normalmente, la modificación estará en las proteínas G y/o F. El gen G o F completo, o el segmento o segmentos que codifican regiones inmunogénicas particulares del mismo, se incorpora al ADNc del antigenoma o genoma del VSR mediante la sustitución de la región correspondiente en el clon infeccioso o añadiendo una o más copias del gen de manera que se representan varias formas antigénicas. Los virus de la progenie producidos a partir del ADNc de VSR modificado se utilizan luego en protocolos de vacunación contra las cepas emergentes. Además, la inclusión del gen de la proteína G del subgrupo B del VSR ampliaría la respuesta para cubrir un espectro más amplio de las cepas relativamente diversas del subgrupo A y B que infectan poblaciones humanas.
Un clon de VSR infeccioso de la divulgación también se puede diseñar para mejorar su inmunogenicidad e inducir un nivel de protección mayor que el proporcionado por la infección natural, o viceversa, para identificar y extirpar epítopos asociados con reacciones inmunopatológicas indeseables. La inmunogenicidad mejorada de las vacunas producidas por la presente divulgación aborda uno de los mayores obstáculos para controlar el VSR, a saber, la naturaleza incompleta de la inmunidad inducida por una infección natural. Puede insertarse un gen adicional en el genoma o antigenoma del VSR o próximo al mismo que está bajo el control de un conjunto independiente de señales de transcripción. Los genes de interés incluyen los que codifican citocinas (por ejemplo, IL-2 a IL-15, especialmente IL-3, IL-6 e IL-7, etc.), interferón gamma y proteínas ricas en epítopos de células T auxiliares. La proteína adicional se puede expresar como una proteína separada o como una quimera diseñada a partir de una segunda copia de una de las proteínas VSR, como SH. Esto proporciona la capacidad de modificar y mejorar la respuesta inmune contra el VSR tanto cuantitativa como cualitativamente.
Para uso de vacuna, el virus producido según la presente invención puede usarse directamente en formulaciones de vacuna, o liofilizarse, según se desee, usando protocolos de liofilización bien conocidos por el experto. El virus liofilizado se mantendrá típicamente a aproximadamente 4 grados C. Cuando está listo para su uso, el virus liofilizado se reconstituye en una solución estabilizante, por ejemplo, solución salina o que comprende SPG, Mg y HEPES, con o sin adyuvante, como se describe más adelante.
Por tanto, las vacunas de VSR de la invención contienen como ingrediente activo una cantidad inmunogenéticamente eficaz de VSR producido como se describe en el presente documento. El virus modificado puede introducirse en un huésped con un portador y/o adyuvante fisiológicamente aceptable. Useful carriers are well known in the art, and include, e.g., water, buffered water, 0,4 % saline, 0,3 % glycine, hyaluronic acid and the like. Las soluciones acuosas resultantes pueden envasarse para su uso en la forma en que se encuentran o liofilizarse, donde la preparación liofilizada se combina con una solución estéril antes de la administración. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables que sean necesarias para acercarse a las condiciones fisiológicas, tales como el ajuste de pH y agentes amortiguadores, agentes de ajuste de tonicidad, agentes humectantes y similares, por ejemplo, acetato de sodio, lactato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, monolaurato de sorbitán, oleato de trietanolamina, etc. Los adyuvantes aceptables incluyen adyuvante incompleto de Freund, fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio o alumbre, que son materiales bien conocidos en la técnica.
Tras la inmunización con una composición de VSR como se describe en este documento, vía aerosol, gotita, oral, tópica u otra ruta, el sistema inmunológico del huésped responde a la vacuna produciendo anticuerpos. específico para las proteínas del virus VSR, por ejemplo, glicoproteínas F y G. Como resultado de la vacunación, el huésped se vuelve al menos parcial o completamente inmune a la infección por VSR, o resistente al desarrollo de una infección moderada o grave por VSR, particularmente del tracto respiratorio inferior.
El huésped al que se administran las vacunas puede ser cualquier mamífero que sea susceptible a la infección por VSR o un virus estrechamente relacionado y cuyo huésped sea capaz de generar una respuesta inmunitaria protectora a los antígenos de la cepa vacunante. Por tanto, los huéspedes adecuados incluyen seres humanos, primates no humanos, bovinos, equinos, porcinos, ovinos, caprinos, lagamorfos, roedores, etc. Por consiguiente, la divulgación proporciona métodos para crear vacunas para una variedad de usos humanos y veterinarios.
Las composiciones de vacuna que contienen el VSR de la invención se administran a un huésped susceptible o en riesgo de infección por VSR para mejorar las propias capacidades de respuesta inmunitaria del huésped. Tal cantidad se define como una "dosis inmunogénicamente eficaz". En este uso, las cantidades precisas dependen nuevamente del estado de salud y peso del huésped, el modo de administración y la naturaleza de la formulación. Las formulaciones de vacuna deben proporcionar una cantidad de VSR modificado de la divulgación suficiente para proteger eficazmente al paciente huésped contra una infección por VSR grave o potencialmente mortal.
El VSR producido de acuerdo con la presente divulgación se puede combinar con virus del otro subgrupo o cepas para lograr protección contra múltiples subgrupos o cepas de VSR, o epítopos protectores de estos las cepas se pueden manipular en un virus como se describe en el presente documento. Normalmente, los diferentes virus estarán mezclados y se administrarán simultáneamente, pero también se pueden administrar por separado. Por ejemplo, como las glicoproteínas F de los dos subgrupos de VSR difieren solo en aproximadamente un 11 % en la secuencia de aminoácidos, esta similitud es la base de una respuesta inmune protectora cruzada observada en animales inmunizados con antígeno VSR o F y desafiados con un presion. Por tanto, la inmunización con una cepa puede proteger contra diferentes cepas del mismo o diferente subgrupo.
En algunos casos, puede ser deseable combinar las vacunas contra el VSR de la invención con vacunas que inducen respuestas protectoras a otros agentes, particularmente a otros virus infantiles. Por ejemplo, la vacuna del VSR de la presente invención se puede administrar simultáneamente con la vacuna del virus de la parainfluenza, tal como se describe enClements et al., J. Clin. Microbiol. 29: 1175 - 1182 (1991). En otro aspecto de la invención, el VSR se puede emplear como vector para antígenos protectores de otros patógenos del tracto respiratorio, como la parainfluenza, incorporando las secuencias que codifican esos antígenos protectores en el genoma o antigenoma del VSR que se utiliza para producir VSR infeccioso como se define. en las reclamaciones.
Se pueden llevar a cabo administraciones únicas o múltiples de las composiciones de vacuna de la invención. En recién nacidos y lactantes, pueden ser necesarias administraciones múltiples y secuenciales para provocar niveles suficientes de inmunidad. La administración puede comenzar dentro del primer mes de vida, o antes, alrededor de los dos meses de edad, típicamente no después de los seis meses de edad, y a intervalos durante la infancia, como a los dos meses, seis meses, un año y dos años, según necesario para mantener niveles suficientes de protección contra la infección por VSR nativo (tipo salvaje). Del mismo modo, los adultos que son particularmente susceptibles a la infección por VRS repetida o grave, como, por ejemplo, trabajadores de la salud, trabajadores de guarderías, familiares de niños pequeños, ancianos (mayores de 55, 60 o 65 años), personas con problemas función cardiopulmonar, puede requerir múltiples inmunizaciones para establecer y/o mantener respuestas inmunes protectoras. Los niveles de inmunidad inducida pueden controlarse midiendo cantidades de anticuerpos neutralizantes secretores y séricos, y las dosis ajustadas o las vacunaciones repetidas según sea necesario para mantener los niveles deseados de protección. Además, diferentes virus de vacuna pueden ser ventajosos para diferentes grupos de receptores. Por ejemplo, una cepa de VSR modificada genéticamente que exprese una proteína adicional rica en epítopos de células T puede ser particularmente ventajosa para adultos más que para bebés.
En otro aspecto más de la divulgación, el VSR se emplea como vector para la terapia génica transitoria del tracto respiratorio. Según esta realización, el genoma o antigenoma de VSR recombinante incorpora una secuencia que es capaz de codificar un producto génico de interés. El producto génico de interés está bajo el control del mismo o de un promotor diferente del que controla la expresión del VSR. El VSR infeccioso producido coexpresando el genoma o antigenoma del VSR recombinante con las proteínas N, P, L y M2 -1 y que contiene una secuencia que codifica el producto génico de interés se administra a un paciente. La administración es típicamente mediante aerosol, nebulizador u otra aplicación tópica en el tracto respiratorio del paciente que está siendo tratado. El VSR recombinante se administra en una cantidad suficiente para dar como resultado la expresión de niveles terapéuticos o profilácticos del producto génico deseado. Ejemplos de productos génicos representativos que se administran en este método incluyen aquellos que codifican, por ejemplo, aquellos particularmente adecuados para la expresión transitoria, por ejemplo, interleucina-2, interleucina-4, gamma-interferón, GM-CSF, G-CSF, eritropoyetina, y otras citocinas, glucocerebrosidasa, fenilalanina hidroxilasa, regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR), hipoxantina-guanina fosforribosil transferasa, citotoxinas, genes supresores de tumores, ARN antisentido y antígenos de vacuna.
En determinadas realizaciones, la invención se refiere a composiciones inmunogénicas (p. Ej., Vacunas) que comprenden una cantidad inmunológicamente eficaz de un VSR recombinante de la invención (p. Ej., Un VSR recombinante vivo atenuado o un VSR inactivado, no replicante). VSR), una cantidad inmunológicamente eficaz de un polipéptido como se define en las reivindicaciones, y/o una cantidad inmunológicamente eficaz de un ácido nucleico como se define en las reivindicaciones.
En determinadas realizaciones, la invención se refiere a una vacuna como se define en las reivindicaciones para su uso en métodos para estimular el sistema inmunológico de un individuo para producir una respuesta inmunitaria protectora contra el VSR. En los métodos, se administra al individuo una cantidad inmunológicamente eficaz de un VSR recombinante como se define en las reivindicaciones una cantidad inmunológicamente eficaz de un polipéptido como se define en las reivindicaciones y/o una cantidad inmunológicamente eficaz de un ácido nucleico como se define en las reivindicaciones. en un portador fisiológicamente aceptable.
Normalmente, el vehículo o excipiente es un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable, como agua estéril, solución salina acuosa, soluciones salinas tamponadas acuosas, soluciones acuosas de dextrosa, soluciones acuosas de glicerol, etanol o combinaciones de los mismos. La preparación de tales soluciones que garantizan la esterilidad, el pH, la isotonicidad y la estabilidad se efectúa de acuerdo con los protocolos establecidos en la técnica. Generalmente, se selecciona un vehículo o excipiente para minimizar los efectos alérgicos y otros efectos indeseables, y para adaptarse a la vía de administración particular, por ejemplo, subcutánea, intramuscular, intranasal, oral, tópica, etc. Las soluciones acuosas resultantes pueden, por ejemplo, envasarse para su uso. tal cual o liofilizado, la preparación liofilizada se combina con una solución estéril antes de la administración
En ciertas realizaciones, en uso, el VSR (o componentes del VSR) se administra en una cantidad suficiente para estimular una respuesta inmune específica para una o más cepas de VSR (por ejemplo, una cantidad inmunológicamente eficaz de Se administra VSR o un componente VSR). Preferiblemente, la administración de VSR provoca una respuesta inmune protectora. Dosages and methods for eliciting a protective anti-viral immune response, adaptable to producing a protective immune response against VSR, are known to those of skill in the art. See, e.g., U.S. Pat. No. 5.922.326; Wright et al. (1982) Infect. Immun. 37: 397-400;Kim y col. (1973) Pediatrics 52: 56-63; yWright et al. (1976) J. Pediatr. 88: 931-936. Por ejemplo, el virus se puede proporcionar en el intervalo de aproximadamente 103-106ufp (unidades formadoras de placa) por dosis administrada (por ejemplo, 104-105ufp por dosis administrada). Normalmente, la dosis se ajustará basándose, por ejemplo, en la edad, la condición física, el peso corporal, el sexo, la dieta, el modo y el momento de administración y otros factores clínicos. La formulación de vacuna profiláctica se puede administrar sistémicamente, por ejemplo, mediante inyección subcutánea o intramuscular usando una aguja y jeringa o un dispositivo de inyección sin aguja. Preferiblemente, la formulación de vacuna se administra por vía intranasal, p. Ej., Mediante gotas, aerosol (p. Ej., Aerosol de partículas grandes (más de aproximadamente 10 micrómetros)) o pulverización en el tracto respiratorio superior. Si bien cualquiera de las rutas de administración anteriores da como resultado una respuesta inmune sistémica protectora, la administración intranasal confiere el beneficio adicional de provocar inmunidad mucosa en el sitio de entrada del virus. Para la administración intranasal, a menudo se prefieren las vacunas de virus vivos atenuados, por ejemplo, un VSR recombinante atenuado, adaptado al frío y/o sensible a la temperatura, por ejemplo, un VSR recombinante quimérico. Como alternativa o además de las vacunas de virus vivos atenuados, se pueden utilizar vacunas de virus muertos, vacunas de ácido nucleico y/o vacunas de subunidades polipeptídicas, por ejemplo, como sugierenWalsh et al. (1987) J. Infect. Dis. 155: 1198-1204yMurphy et al. (1990) Vaccine 8: 497-502.
En ciertas realizaciones, el VSR recombinante atenuado es como se usa en una vacuna y está lo suficientemente atenuado como para que no se presenten síntomas de infección, o al menos síntomas de infección grave en la mayoría de los individuos inmunizados (o infectados de otro modo) con el VSR atenuado, en realizaciones en las que los componentes virales (por ejemplo, los ácidos nucleicos o polipéptidos de la presente) se utilizan como vacuna o componentes inmunogénicos. Sin embargo, la virulencia es típicamente abrogada lo suficiente como para que las infecciones del tracto respiratorio inferior leves o graves no se produzcan típicamente en el huésped vacunado o incidental.
Si bien se prefiere la estimulación de una respuesta inmune protectora con una sola dosis, se pueden administrar dosis adicionales, por la misma vía o por una ruta diferente, para lograr el efecto profiláctico deseado. En recién nacidos y bebés, por ejemplo, se pueden requerir múltiples administraciones para provocar niveles suficientes de inmunidad. La administración puede continuar a intervalos durante la niñez, según sea necesario para mantener niveles suficientes de protección contra la infección por VSR de tipo salvaje. De manera similar, los adultos que son particularmente susceptibles a infecciones repetidas o graves por VSR, como, por ejemplo, trabajadores de la salud, trabajadores de guarderías, familiares de niños pequeños, ancianos y personas con función cardiopulmonar comprometida pueden requerir múltiples vacunas para establecer y/o mantener una respuesta inmunitaria protectora. Los niveles de inmunidad inducida pueden controlarse, por ejemplo, midiendo cantidades de anticuerpos secretores y séricos neutralizantes de virus, y las dosis ajustadas o las vacunaciones repetidas según sea necesario para provocar y mantener los niveles de protección deseados.
Alternativamente, se puede estimular una respuesta inmune mediante el direccionamiento ex vivo o in vivo de células dendríticas con virus. Por ejemplo, las células dendríticas en proliferación se exponen a virus en una cantidad suficiente y durante un período de tiempo suficiente para permitir la captura de los antígenos de VSR por las células dendríticas. Luego, las células se transfieren a un sujeto para ser vacunado mediante métodos estándar de trasplante intravenoso.
Opcionalmente, la formulación para la administración profiláctica del VSR también contiene uno o más adyuvantes para potenciar la respuesta inmune a los antígenos del VSR. Los adyuvantes adecuados incluyen, por ejemplo: adyuvante completo de Freund, adyuvante incompleto de Freund, saponina, geles minerales como hidróxido de aluminio, sustancias tensioactivas como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite o hidrocarburos, bacilo de Calmette-Guerin (BCG)., Corynebacterium parvum y el adyuvante sintético QS-21.
Si se desea, la administración de la vacuna profiláctica del VSR puede realizarse junto con la administración de una o más moléculas inmunoestimuladoras. Las moléculas inmunoestimuladoras incluyen varias citocinas, linfocinas y quimiocinas con actividades inmunoestimuladoras, inmunopotenciadoras y proinflamatorias, como las interleucinas (p. Ej., IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-12, IL-13); factores de crecimiento (por ejemplo, factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM) (CSF)); y otras moléculas inmunoestimuladoras, tales como factor inflamatorio de macrófagos, ligando Flt3, B7.1; B7.2, etc. Las moléculas inmunoestimuladoras pueden administrarse en la misma formulación que el VSR, o pueden administrarse por separado. Se puede administrar la proteína o un vector de expresión que codifica la proteína para producir un efecto inmunoestimulador.
Aunque la vacunación de un individuo con un VSR atenuado de una cepa particular de un subgrupo particular puede inducir protección cruzada contra el VSR de diferentes cepas y/o subgrupos, protección cruzada se puede potenciar, si se desea, vacunando al individuo con VSR atenuado de al menos dos cepas, por ejemplo, cada una de las cuales representa un subgrupo diferente. De manera similar, las vacunas de VSR atenuado se pueden combinar opcionalmente con vacunas que inducen respuestas inmunes protectoras contra otros agentes infecciosos.
EXPERIMENTACIÓN
El virus A2-line19F-I557V es inmunogénico en ratones BALB/c
Esto se demuestra en la Fig. 7, que muestra que este virus induce niveles más altos de anticuerpos séricos neutralizantes de VSR que VSR A2 y VSR A2-línea 19F. La Figura 7B demuestra que, incluso con dosis de entrada bajas, este virus proporciona una protección completa para el desafío con una cepa heteróloga de VSR, cuando se desafía 29 días después de la infección primaria. Esta protección completa con inmunización a dosis bajas no se observa en otras dos cepas de VSR, A2-K-line19F y A2-K-A2GF, que permiten una reinfección revolucionaria. Esos dos virus son similares a la línea A219F-I557V excepto por la proteína F, lo que indica que la proteína I557V F codificada por este virus es importante para el fenotipo.
Además de ser inmunogénico (Fig. 7A), el virus A2-line19F-I557V es termoestable. La termoestabilidad del virus se midió como la capacidad del virus para retener el título durante varios días cuando se incubó a 4 ° C o 37 ° C. Los resultados indicados indican que este virus es más termoestable que el virus A2-K-A2GF a ambas temperaturas ensayadas y más estable que la línea A2-19F a 4 ° C. Como se indicó anteriormente, el gen F es la única diferencia entre estos dos virus, lo que indica que esta proteína F única es responsable del fenotipo.
La cepa VSR 19 F de la línea A2 es más estable que la cepa A2, y Val en 557 en el contexto de la proteína F de la línea 19 hace que el virus sea aún más estable. Es probable que Val en la posición 557 en otras cepas también se esté estabilizando: posición y estabilidad 557. La divulgación contempla otras mutaciones en la posición 557 (cualquier aminoácido, por ejemplo, alanina, valina, isoleucina, leucina), en cualquier contexto de cepa F, que afectan la termoestabilidad del virus.
Generación de VSR recombinante con mutaciones silenciosas de codones NS1 y NS2 y atenuación del crecimiento
usaron codones que son poco comunes en humanos para preparar VSR recombinante con los genes NS1 y NS2 designados como dNS1h y dNS2h a continuación. Los codones que son poco comunes en VSR se utilizaron para preparar VSR recombinante con los genes NS1 y NS2 denominados dNS1v y dNS2v a continuación. La figura 1 proporciona una tabla que se utiliza para determinar las secuencias óptimas. Se preparó VSR recombinante con las siguientes secuencias de nucleótidos para el gen NS1 y NS2. Es importante señalar que antes de probar los codones, era impredecible si los codones humanos poco comunes o los codones del VSR poco comunes producirían un candidato de vacuna del VSR deseable. Los experimentos que utilizaron codones poco comunes para las secuencias de VSR tuvieron el efecto inesperado e indeseable de un aumento de la expresión. El uso de codones poco comunes para secuencias humanas tuvo el efecto deseable de disminución de la expresión. Los experimentos que comparan codones NS poco comunes para secuencias humanas y codones NS poco comunes para secuencias VSR indicaron que los codones poco comunes para secuencias humanas eran preferenciales para el desarrollo de vacunas.
La secuencia de nucleótidos dNS1h (SEQ ID NO: 6) tiene 84 de 420 nucleótidos (20 %) diferentes y 68 de 140 codones (48 %) que NS1 en A2 de tipo salvaje
SEQ ID NO: 6
AT GGGTT CGAATT CGCT ATCGAT GAT AAAAGTACGT CT ACAAAAT CT ATTT GAT
AATGATGAAGTAGCGCTACTAAAAATAACGTGTTATACGGATAAACTAATACA
TCT AACGAAT GCGCT AGCGAAAGCGGT AAT ACAT ACGAT AAAACT AAAT GGT A
TAGTAAAATCGAATTTTACGACGATGCCGGTACTACAAAATGGTGGTTATATAT
GGGAAATGAT GGAACTAACGCATT GTTCGCAACCGAAT GGT CTACTAGAT GAT
AATT GT GAAATAAAATTTT CG AAAAAACT AT CGGATTCGACGAT GACGAATT AT
AT GAAT CAACTAT CGGAACTACTAGGTTTT GAT CT AAAT CCGT AA
La secuencia de nucleótidos dNS1v (SEQ ID NO: 7) tiene 145 de 420 nucleótidos (34 %) diferentes y 122 de 140 codones (87 %) que NS1 en A2 de tipo salvaje
SEQ ID NO: 7
AT GGGGT CGAACTCGCT CT CGAT GAT C AAGGT CCGCCTCC AGA AT CTCTT CGAC
AACGACGAGGTCGCGCTCCTCAAGATCACGTGTTACACGGACAAGCTCATCCAC
CTCACGAACGCGCTCGCGAAGGCGGTCATCCACACGATCAAGCTCAACGGGAT
CGT CAAGT CGAACTT CACGACGAT GCCGGTCCTCCAGAACGGGGGGTACAT CT G
GGAGATGATGGAGCTCACGCACTGTTCGCAGCCGAACGGGCTCCTCGACGACA
ACT GT GAGAT CAAGTT CT CGAAGAAGCT CTCGGACT CGACGATGACGAACTAC
ATGAACCAGCTCTCGGAGCTCCTCGGGTTCGACCTCAACCCGTAA
La secuencia de nucleótidos dNS2h (SEQ ID NO: 9) tiene 82 de 420 nucleótidos (21 %) diferentes y 73 de 140 codones (58 %) que NS1 en A2 de tipo salvaje
SEQ ID NO: 9
AT GGAT ACGACGCAT AAT GAT AAT ACGCCGCAACGT CT AAT GAT AACGGAT AT
GCGT CCGCT AT CGCT AGAAACGAT AAT AACGT CGCT AACGCGT GAT AT AATAAC
GCAT AAATTT AT ATAT CTAAT AAAT CAT G AAT GT ATAGTACGT AAACT AGAT GA
ACGTCAAGCGACGTTTACGTTTCTAGTAAATTATGAAATGAAACTACTACATAA
AGTAGGTT CGACGAAAT AT AAA AA ATAT ACGGAAT AT AAT ACGAAAT AT GGTA
CGTTTCCGAT GCCG ATATTT AT AAAT CAT GATGGTTTT CT AGAAT GT ATAGGT AT
AAAACCGACGAAACATACGCCGATAATATATAAATATGATCTAAATCCGTAA
La secuencia de nucleótidos dNS2v (SEQ ID NO: 10) tiene 103 de 420 nucleótidos (27 %) diferentes y 92 de 140 codones (73 %) que NS1 en A2 de tipo salvaje
SEQ ID NO: 10
ATGGACACGACGCACAACGACAACACGCCGCAGCGCCTCATGATCACGGACAT
GCGCCCGCTCTCGCTCGAGACGATCATCACGTCGCTCACGCGCGACATCATCAC
GCACAAGTT CAT CTACCTCATCAACCACGAGT GTAT CGT CCGCAAGCT CGACGA
GCGCCAGGCGACGTTCACGTTCCTCGTCAACTACGAGATGAAGCTCCTCCACAA
GGTCGGGTCGACGAAGTACAAGAAGTACACGGAGTACAACACGAAGTACGGG
ACGTT CCCGATGCCGATCTT CAT CAACCACGACGGGTT CCTCGAGT GTAT CGGG
ATCAAGCCGACGAAGCACACGCCGATCATCTACAAGTACGACCTCAACCCGTA
A BEAS-2B cell lines at 60-70 % confluence are infected with the recombinant virus indicated as above at MOI (multiplicity of infection) of 0,01 (i.e., for each 100 cells, there is one infectious virus particle). Esto se hace contando primero las células antes de la infección, calculando el número total de células en cada pocillo y luego calculando la cantidad de cada virus para la infección. La infección se realiza a temperatura ambiente durante 1 hora y luego se lava. Las células infectadas se dejan en incubadora a 37°C con 5 % deco2durante hasta 96 horas. Las muestras se toman a las 12, 24, 48, 72 y 96 horas después de la infección y se congelan. Después de recolectar todas las muestras puntuales, la cantidad de virus en cada muestra se determina titulando las líneas celulares Vero de acuerdo con el protocolo estándar y se calcula el título (FFU/mL, lo que significa Unidad de formación de foco fluorescente por mL) para cada muestra. Dado que los virus utilizados tienen un gen rojo fluorescente en el genoma, las células infectadas se cuentan bajo el microscopio fluorescente proporcionando unidades formadoras de focos fluorescentes. Cada punto de datos representa muestras duplicadas de dos experimentos independientes.
Como se ilustra en la Figura 2, el crecimiento de kVSR-dNS1h (virus NS1 NS2 desoptimizado humano) se atenúa en la línea celular BEAS-2B a las 72 y 96 horas después de la infección. Se cree que esto se debe a que las proteínas NS1 y NS2 son más bajas que las del virus de tipo salvaje.
Expresión de VSR en plásmido diseñado para bajo número de copias
VSR recombinante infeccioso (rVSR) se puede recuperar a partir de plásmidos transfectados. La coexpresión de las proteínas VSR N, P, L y M21, así como el ARN antigenómico de longitud completa, es suficiente para la replicación del VSR. El VSR infeccioso se puede producir a partir de la cotransfección de plásmidos que codifican proteínas N, P, L y M2-1 y el ADNc antigenómico bajo el control del promotor T7 en células BHK-21 que expresan de manera estable la a Rn polimerasa de T7 (células BSR). Actualmente, los laboratorios de investigación suelen utilizar un ADNc antigenómico de VSR clonado en el plásmido pBR322 (número de copias de rango medio, 15-20 copias por E. coli). Para mantener el ADNc antigenómico en este plásmido, las bacterias se cultivan a 30 ° C y con baja aireación. No obstante, con frecuencia se experimentan reordenamientos de plásmidos y pérdida de clones.
Se descubrió que una fracción de ADNc de VSR que contiene los genes de glicoproteína de unión (G) y de fusión (F) del virus no era clonable en plásmidos basados en pUC (500-700 copias de plásmido en E. coli). Este fragmento se clonó en un plásmido de bajo número de copias (aproximadamente 5 copias por E. coli) llamado pLG338-30.5. El plásmido pLG338-30 se desarrolló para aumentar la estabilidad de las glicoproteínas de lentivirus clonadas.Cunningham y col., Gene, 1993, 124, 93-98. Se plantea la hipótesis de que la inestabilidad del cDNA en E. coli resulta de la presencia de promotores de transcripción crípticos de E. coli dentro de las secuencias de glicoproteínas virales. Por tanto, la inestabilidad del cDNA en plásmidos "sin promotor" en bacterias puede surgir porque las proteínas aberrantes se expresan a partir de promotores crípticos, lo que conduce a una toxicidad agravada por el número de copias del plásmido.
Se generó un plásmido antigenómico que contenía el genoma de la cepa A2 del VSR con el gen F de la línea de cepa 19 en lugar del gen A2 F. It had been derived from the antigenome plasmid first disclosed in Collins et al., Proc Natl Acad Sci U S A., 1995, 92(25):11563-11567 and U.S. Patent No. 6.790.449. El antigenoma se extrajo del vector plasmídico por digestión y se ligó en el pKBS3 BAC.
Los reactivos de recombinación de GalK se obtuvieron del NCI y establecieron con éxito un protocolo de genética inversa BAC-VSR (Figuras 4 y 5). Consulte http://web.ncifcrf.gov/research/brb/ recombineeringInformation.aspx. La mutación del ADNc del VSR mediante recombinación de BAC ha mejorado la capacidad de manipular el VSR para la generación de mutantes. Un beneficio adicional del sistema es la estabilidad mejorada del ADNc antigenómico de longitud completa en el vector BAC.
El vector antigenoma de VSR basado en BAC se propagó a 32 ° C y 250 RPM sin observar ningún reordenamiento del vector o pérdida de clones en E. coli. Por tanto, BAC-VSR no solo permite manipulaciones mediante recombinación sino que también facilita la genética inversa del VSR en general debido a la eliminación de la inestabilidad del cDNA.
Antigenoma de VSR en el vector BAC (construcción pSynkVSRJine 19 F)
El VSR-BAC pSynkVSRJine 19 F contiene el gen katushka modificado (mKate2, proteína fluorescente) y sitios de restricción para métodos de clonación estándar convenientes. Para construir pSynkVSR, Gene Art, una empresa que sintetiza ADN, sintetizó tres piezas de ácido nucleico. Luego, estas tres piezas deben unirse en el cromosoma artificial bacteriano (BAC). Las tres piezas se denominan pSynkVSR-BstBI_SacI (# 1), pSynkVSR-SacI_ClaI (# 2) y pSynkVSR-ClaI_MluI (# 3). Uno usa el plásmido pKBS3 como columna vertebral para construir pSynkVSR. Vea las Figuras 6A-E. pSynkVSR contiene las secuencias cromosómicas artificiales bacterianas necesarias para regular el número de copias y la partición en las bacterias.
Para insertar los tres segmentos sintetizados, se colocan adaptadores de oligonucleótidos en pKBS3 entre dos sitios de corte de enzimas de restricción existentes, BstBI y MluI.
Los salientes se diseñaron de manera que el adaptador se ligara en pKBS3 en los sitios BstBI y MluI. Las secuencias subrayadas indican sitios de restricción: SacI, Clal y AvrII de derecha a izquierda, respectivamente. Esto produce un sitio de clonación múltiple que contiene los sitios de restricción BstBI, SacI, Clal, AvrII y MluI, en ese orden, y un plásmido denominado pKBS5. Vea la Figura 6A. Uno corta y liga el segmento SacI_ClaI (# 2) de Gene Art en pKBS5. Vea la Figura 6B. El siguiente corta y liga el segmento # 3 usando las enzimas AvrII y MluI (no se puede usar ClaI nuevamente debido a un sitio de restricción ClaI inactivo en pSynkVSR-ClaI_MluI). Vea la Figura 6C. En este punto, el plásmido pKBS5 contiene las secuencias de Gene Art de SacI a Clal, algunos nucleótidos intermedios (menos de 10) y las secuencias de Gene Art de AvrII a MluI. Uno corta y liga el segmento # 1 usando BstBI y SacI. Vea la Figura 6D. Este VSR BAC contiene aproximadamente 10 nucleótidos no deseados entre dos sitios ClaI (el del segmento # 2 y el del segmento # 3). La recombinación se usa para eliminar esos nucleótidos, generando así pSynkVSRJine 19 F. Ver la Figura 6E. Los tres segmentos deben ligarse en este orden para evitar posibles interferencias de múltiples sitios de restricción.
Virus sincitial respiratorio recombinante (VSR) como vacuna viva atenuada (LAV)
Se generaron cuatro plásmidos de expresión, uno que expresa la nucleoproteína (N) del VSR, uno que expresa la fosfoproteína (P) del VSR, uno que expresa la proteína ORF 1 de la matriz 2 del VSR (M2 -1), y uno que expresa VSR polimerasa grande (L) - pA2-Nopt, pA2-Popt, pA2-M2-lopt y pA2-Lopt. La nomenclatura refleja el hecho de que estos genes son de la cepa A2 de VSR y que estos ADNc están optimizados para el sesgo de codones humanos con el fin de aumentar los niveles de expresión en células de mamíferos. La recuperación de VSR recombinante a partir de ADNc incluye cinco componentes: ARN de longitud completa (por ejemplo, proporcionado por pSynkVSR119F) y proteínas VSR N, P, M2-1 y L. Los cuatro plásmidos auxiliares pA2-Nopt, pA2-Popt, pA2-M2-lopt y pA2-Lopt son útiles para impulsar el rescate del VSR.
Se generó una cepa de virus sincitial respiratorio recombinante A2-linel9F con una mutación puntual en el residuo F557, en el cual la isoleucina se cambió a una valina (nombre del virus: A2-linel9F -I557V). También se generó un plásmido de expresión de proteínas que codifica la proteína de la línea 19 F con la misma mutación de isoleucina a valina en la posición 557 (nombre de la proteína, línea 19F-I557V). A2-line19F-I557V tiene mayor termoestabilidad, a 4 ° C y 37 ° C, que el virus parental A2-line 19F. Esta mayor estabilidad probablemente contribuye a una mayor inducción de anticuerpos neutralizantes y protección por parte de la línea a 219F-I557V en relación con la línea A2 19F.
desarrollo de una vacuna contra el VSR vivo atenuado se ha visto obstaculizado por la baja inmunogenicidad del VSR en los bebés pequeños, que constituyen la población objetivo, y la estabilidad genómica limitada. Una vacuna deseable es inmunogénica y genética y térmicamente estable y segura para la vacunación en bebés pequeños. proteínas no estructurales (NS) 1 y 2 del VSR (NS1 y NS2) están asociadas con la inhibición de las rutas del interferón de la célula huésped y, por lo tanto, limitan potencialmente la inmunogenicidad del virus. La pequeña glucoproteína hidrófoba (SH) forma poros catiónicos en las membranas, modula las vías apoptóticas del hospedador e inhibe la señalización del factor de necrosis tumoral a (TNF-a). SH, NS1 y NS2 son prescindibles para la replicación del virus. Sin embargo, la deleción de NS1 y NS2 juntas da como resultado una atenuación excesiva. La deleción de la proteína SH tiene poco efecto aparente sobre la atenuación en candidatos a vacunas experimentales que se están evaluando actualmente. Sin embargo, la deleción de SH mejora la replicación del VSR in vitro y presumiblemente mejora la expresión de genes posteriores, como los genes antigénicos G y F.
candidatos a vacuna del VSR descritos en este documento combinan múltiples tecnologías para superar los desafíos de una inmunogenicidad deficiente y una estabilidad genética y térmica limitada en un candidato a vacuna viral seguro. VSR LAV OE1 combina la expresión limitada de las proteínas inhibidoras inmunitarias NS1 y NS2 a través de la desoptimización de codones y la proteína SH a través de la deleción sin el potencial de una rápida reversión en un fondo viral estable e inmunogénico.
Los candidatos a vacuna se generaron utilizando la desoptimización del codón de genética inversa VSR basada en BAC de genes no estructurales (NS) NS1 y NS2 se combinaron con el gen 19F de la línea A2 que contenía una mutación en el residuo 557, así como deleción de la glicoproteína hidrófoba pequeña (SH) del VSR.
Genoma del virus OE1 (SEQ ID NO: 1)
Genotipo candidato a vacuna contra el VSR:
A2-mKate2-dNSh-deltaSH-A2G-line19F-I557V (etiquetado)
y A2-dNSh-deltaSH-A2G-line19F-I557V (sin etiquetar)
La glicoproteína de unión al VSR (G) es una proteína muy glicosilada, que existe en dos formas variantes: unida a la membrana y secretada. Los estudios que evalúan el papel funcional del VSR G han demostrado que desempeña un papel en la inhibición de la activación del receptor tipo peaje y su forma secretada probablemente actúa como un señuelo de antígeno inmunológico. Además de VSR F, la proteína G también es inmunogénica; sin embargo, debido en parte a su extensa glicosilación, es un antígeno pobre para la generación de anticuerpos neutralizantes. VSR G es indispensable para la replicación del virus, pero la deleción da como resultado una atenuación excesiva. Por tanto, G puede considerarse un gen de virulencia no esencial.
Se sustituyó una secuencia de proteína VSR A2 G que contiene una mutación M48I y tiene el 50 % de los codones desoptimizados [dGm (50 %)] en el fondo del VSR LAV Genoma del virus OE1. El fondo del virus OE2 incluye la desoptimización de codones de los genes NS1 y NS2 no estructurales con el gen 19F de la línea A2 que contiene una mutación en el residuo de aminoácido 557, así como la deleción de la glicoproteína hidrófoba pequeña (SH) del VSR.
Genoma del virus OE2 (SEQ ID NO: 2)
Genotipo candidato a vacuna contra el VSR:
A2-mKate2-dNSh-deltaSH-dGm (50 %) - línea19F-I557V (etiquetado)
y A2-dNSh-deltaSH-dGm (50 %) - línea 19F-I557V (sin etiquetar)
VSR LAV OE2 combina la expresión reducida de la glucoproteína G inmuno-inhibidora a través de la desoptimización de codones del 50 % de los codones, la codondeoptimización del 100 % de las proteínas inmunomoduladoras NS1 y NS2, y la deleción de la proteína SH sin potencial de reversión rápida en un fondo viral estable e inmunogénico.
En una tercera vacuna candidata, una secuencia de proteína G VSR A2 sustituida por una que contiene una mutación M48I y tiene el 75 % de los codones desoptimizados [dGm (75 %)] en el fondo del genoma del virus VSR LAV OE1. El fondo del virus OE3 incluye la desoptimización de codones de los genes NS1 y NS2 no estructurales con el gen 19F de la línea A2 que contiene una mutación en el residuo 557, así como la deleción de la glicoproteína hidrófoba pequeña (SH) del VSR.
Genoma del virus OE3 (SEQ ID NO: 3)
Genotipo candidato a vacuna contra el VSR:
A2-mKate2-dNSh-deltaSH-dGm (75 %) - línea19F-I557V (etiquetado)
y A2-dNSh-deltaSH-dGm (75 %) - línea 19F-I557V (sin etiquetar)
VSR LAV OE3 combina la expresión reducida de la glucoproteína G inhibidora inmunitaria mediante la desoptimización de codones del 75 % de los codones, la desoptimización de codones al 100 % de las proteínas inmunomoduladoras NS1 y NS2 y la deleción de la proteína Sh sin potencial de reversión rápida en un fondo viral estable e inmunogénico.
Una secuencia de proteína G VSR A2 que contiene una mutación M48I y tiene el 100 % de los codones desoptimizados [dGm (100 %)] en el fondo del virus VSR LAV OE1 se generó el genoma. El fondo del virus OE4 incluye la desoptimización de codones de los genes NS1 y NS2 no estructurales con el gen 19F de la línea A2 que contiene una mutación en el residuo 557, así como la deleción de la glicoproteína hidrófoba pequeña (SH) del VSR. Genoma del virus OE4 (SEQ ID NO: 4)
Genotipo candidato a vacuna contra el VSR:
A2-mKate2-dNSh-deltaSH-dGm (100 %) - línea19F-I557V (etiquetado)
y A2-dNSh-deltaSH-dGm (100 %) - línea 19F-I557V (sin etiquetar)

Claims (7)

REIVINDICACIONES
1. Un ácido nucleico recombinante aislado que codifica NS1 de un virus respiratorio sincitial (VSR) de tipo salvaje que comprende la SEQ ID NO: 6.
2. Un vector de expresión recombinante que comprende un ácido nucleico de la reivindicación 1.
3. Un VSR recombinante que comprende un ácido nucleico de la reivindicación 1 y que además comprende la SEQ ID NO 9.
4. Un sistema de expresión que comprende el vector de la reivindicación 2 o el VSR recombinante atenuado de la reivindicación 3.
5. Una vacuna que comprende un VSR recombinante de la reivindicación 3.
6. La vacuna de la reivindicación 5 para su uso en un método de vacunación contra la infección por virus respiratorio sincitial que comprende administrar una cantidad eficaz de la vacuna de la reivindicación 5 a un sujeto; opcionalmente en el que el sujeto es menor de 6 meses de edad, menor de 1 año de edad, nacido prematuramente, tiene enfermedad cardíaca o pulmonar congénita, está recibiendo quimioterapia o un trasplante, o diagnosticado con asma, insuficiencia cardíaca congestiva o enfermedad pulmonar obstructiva crónica, leucemia ancianos o VIH/SIDA; u, opcionalmente, en el que la vacuna se administra en combinación con motavizumab, palivizumab u otro anticuerpo monoclonal humanizado dirigido contra un epítopo en el sitio antigénico A de la proteína F del VSR.
7. Un ácido nucleico recombinante aislado que comprende un genoma de VSR; en el que el genoma comprende el ácido nucleico que codifica NS1 de la reivindicación 1, el ácido nucleico que codifica NS2 de SEQ ID NO 9, y un gen G desoptimizado con codón representado por SEQ ID NO. 20, en el que el gen de la glicoproteína hidrófoba pequeña del VSR no está presente.
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