ES2855182T3 - Método de cromatografía - Google Patents

Abstract

Método de purificación de moléculas diana de una o más impurezas en una muestra clarificada, mediante lo cual la molécula diana es una proteína o una mezcla de dos o más proteínas, comprendiendo el método las etapas de a) proporcionar al menos tres unidades de separación que tienen la misma matriz de cromatografía que están conectadas de modo que puede fluir líquido al menos desde una unidad de separación hasta la siguiente y desde la última hasta la primera unidad de separación b) alimentar la muestra en una primera unidad de separación de modo que, mientras la muestra se carga en esta unidad de separación en la que la muestra está a un primer pH y conductividad que permiten que las moléculas diana se unan a esta unidad de separación, dicha unidad de separación está al menos parte del tiempo de carga en comunicación de fluido con la siguiente unidad de separación, de modo que las moléculas diana no unidas a dicha primera unidad de separación pueden unirse a la siguiente unidad de separación, al mismo tiempo al menos lavar, eluir y reequilibrar una unidad de separación diferente de la unidad de separación que está cargándose y de la que está en comunicación de fluido con la unidad de separación que está cargándose c) cambiar la alimentación a la siguiente unidad de separación d) alimentar la muestra en la siguiente unidad de separación de modo que, mientras la muestra está cargándose en dicha siguiente unidad de separación en la que la muestra está a un primer pH y conductividad que permiten que las moléculas diana se unan a dicha siguiente unidad de separación, dicha siguiente unidad de separación está al menos parte del tiempo de carga en comunicación de fluido con la unidad de separación después de la siguiente, de modo que las moléculas diana no unidas a dicha siguiente unidad de separación pueden unirse a la unidad de separación después de la siguiente, al mismo tiempo al menos lavar, eluir y/o reequilibrar una unidad de separación diferente de la unidad de separación que está cargándose y de la que está en comunicación de fluido con la unidad de separación que está cargándose- e) repetir las etapas c) y d) una o más veces, caracterizado porque la alimentación nunca se detiene y tiene una velocidad por encima de 800 cm/h y porque la matriz de cromatografía de las unidades de separación comprende partículas con un diámetro de tamaño de partícula promedio de entre 30 y 200 μm y con diámetros de poro promedio en el intervalo entre 50 nm y 200 nm y porta ligandos de afinidad o ligandos de intercambio iónico.

Description

DESCRIPCIÓN

Método de cromatografía

Descripción

La presente invención se refiere a un método de cromatografía continua y a un aparato que va a usarse en tal método. El método permite el uso de una alta velocidad operativa al tiempo que se mantienen altas capacidades de unión.

Antecedentes de la invención

La purificación de moléculas biofarmacéuticas implica el uso de métodos de separación cromatográfica como una de las tecnologías ampliamente establecidas. La aplicación habitual implica la captura y el pulido de la molécula diana. Pueden aplicarse diversos métodos cromatográficos y resinas para cumplir con estas tareas (por ejemplo modos de cromatografía de fase normal, fase inversa, exclusión molecular e intercambio iónico). En áreas especiales, esto se ha desarrollado en métodos de separación más específicos y eficaces tales como cromatografía de afinidad. El estado actual de la técnica de la purificación de anticuerpos es el uso de materiales de soporte de cromatografía de afinidad modificados con ProtA para unir y separar la molécula diana de la mayor parte de las impurezas más abundantes (proteínas de la célula huésped, ADN de la célula huésped, azúcares, aminoácidos, factores de crecimiento y etc.). Más de 30 resinas cromatográficas con diversas propiedades están disponibles actualmente en el mercado, proporcionando al cliente la oportunidad de encontrar la más adecuada para su aplicación. Las principales diferencias en esos productos son propiedades físicas (material de soporte, tamaño de partícula, forma de partícula y tamaño de poro) así como químicas (ligando de ProtA, densidad de ligando, tipo de matriz de soporte) que influyen en la capacidad de unión, propiedades de transferencia de masa, compresibilidad y robustez.

La capacidad de unión depende en gran medida del ligando de afinidad, su densidad en la superficie y su accesibilidad. Debido a las mejoras en las tecnologías de modificación, pueden alcanzarse altas capacidades de unión > 30 g/l en tiempos de residencia de > 3 min independientemente de la química de la matriz de soporte.

Por otro lado, las propiedades de transferencia de masa son bastante variables, lo que provoca diferencias radicales en la aplicación. La transferencia de masa de la película y la difusión de poros son dos parámetros principales que influyen en la difusividad de la molécula diana hacia los sitios de adsorción. La transferencia de masa de la película se ve influida principalmente por el tamaño y la forma de las partículas. Cuanto menor sea la partícula y el volumen entre partículas, mayor será la transferencia de masa y la resistencia al flujo. Por tanto, para las aplicaciones a escala analítica, se usa un tamaño de partícula más pequeño para garantizar una transferencia de masa rápida y una alta eficiencia. Pero debido a los problemas de resistencia a la presión, las operaciones a escala industrial se realizan a presiones de funcionamiento < 3 bares. Generalmente, se eligen partículas más grandes (60 |im - 120 |im).

Debido a los problemas mencionados anteriormente, la difusión de los poros es una de las propiedades más influyentes que definen la transferencia de masa. Se demostró que algunos materiales presentan poros anchos (50 - 500 nm) para permitir una transferencia de masa rápida. Pero estos materiales muestran bajas capacidades de unión (~20 g/l), debido a la baja área de superficie. Para potenciar la capacidad de unión, se requiere una mayor área de superficie, generalmente lograda a través de un tamaño de poro más pequeño. Materiales que presentan tamaños de poro de -100 nm han mostrado capacidades de unión de 40 g/l (Prosep-vA High Capacity (Millipore Bioprocessing, Consett, Reino Unido), incluso más materiales que presentan un tamaño de poro de -70 nm han mostrado capacidades de unión de 56 g/l (Prosep-vA Ultra (Millipore Bioprocessing, Consett, Reino Unido). Los materiales de soporte con una distribución de tamaño de poro amplia en el intervalo comparable también han mostrado capacidades de unión similares (MabSelect Sure® (GE Healthcare, Uppsala, Suecia)). Debido al tamaño de poro más pequeño, la difusión de la molécula diana es más lenta, requiriendo un cierto tiempo de residencia de la molécula diana para lograr capacidades de unión por encima de 40 g/l. El intervalo habitual de tiempos de residencia usados está en el intervalo de 3-6 minutos para garantizar que la molécula diana difunde hacia los sitios de unión. Esto es importante en la fase de carga del proceso cromatográfico, donde el material de soporte se trata con una disolución que contiene la molécula diana. El resto de las etapas necesarias del método de cromatografía de afinidad (tales como lavado, elución, separación, limpieza en el lugar, reequilibrado, etc.) pueden realizarse más rápidamente para garantizar un tiempo de procesamiento más corto. La velocidad operativa en este caso se ve influida por la rigidez del material de soporte. No obstante, después de la aplicación de este método específico y muy selectivo durante aproximadamente 20 años, existe la necesidad creciente de una optimización adicional del método en busca de una mayor eficiencia económica y productividad (g (molécula diana)/ml (fase estacionaria)/h (tiempo de funcionamiento)). El estado actual es usar columnas grandes para un mayor rendimiento a expensas de una mayor inversión para las cantidades de resina más altas. A veces, se usan columnas de 1,2 metros de diámetro y 10-20 cm de altura de lecho para la purificación de AcM. Se reconoció que hay una tecnología alternativa que podría permitir un procesamiento económico, concretamente, la cromatografía continua. Lo esencial de este método es una mayor utilización de resina al tiempo que se carga hasta el 80% de la capacidad de unión de la resina en lugar del 60% como en el lote convencional sin pérdida de producto, tiempos de funcionamiento más cortos al dividir el proceso discontinuo secuencial en un funcionamiento en paralelo en numerosas columnas y, por tanto, permitiendo el uso de columnas más pequeñas.

En la cromatografía continua, varias columnas idénticas se conectan en una disposición que permite que las columnas funcionen en serie y/o en paralelo, dependiendo de los requisitos del método. Por tanto, todas las columnas pueden ejecutarse en principio simultáneamente, pero ligeramente desplazadas en las etapas del método. El procedimiento puede repetirse, de modo que cada columna se carga, se eluye y se regenera varias veces en el proceso. En comparación con la cromatografía “convencional”, en la que un solo ciclo de cromatografía se basa en varias etapas consecutivas, tales como carga, lavado, elución y regeneración, en la cromatografía continua basada en múltiples columnas idénticas, todas estas etapas se producen simultáneamente pero en columnas diferentes cada una. El funcionamiento de la cromatografía continua da como resultado una mejor utilización de la resina de cromatografía, un tiempo de procesamiento reducido y requisitos de tampón reducidos, todo lo cual beneficia la economía del proceso. Un ejemplo de cromatografía continua es la cromatografía de lecho móvil simulado (SMB). En la actualidad, esta tecnología de lecho móvil simulado (SMB) se introdujo también en el mercado biofarmacéutico, especialmente para la purificación de anticuerpos. Si anteriormente, en la cromatografía discontinua normal, la carga de la columna cromatográfica se detenía en un porcentaje específico de avance de la molécula diana, ahora la carga puede continuar con el fin de aumentar la capacidad de unión sin pérdidas de molécula diana, ya que se carga una fracción de avance en la columna que sigue a la primera. El documento CN101948399 da a conocer la separación y recuperación de valina usando un proceso de SMB de cinco zonas. Gottschlich N. et al.: “Purification of monoclonal antibodies by simulated moving-bed chromatography”, Journal of Chromatography A, vol. 765, páginas 201-206, núm. 2, marzo de 1997, dan a conocer un método para la purificación de anticuerpos monoclonales mediante cromatografía de SMB.

No obstante, para una mejor eficiencia económica, el tiempo de procesamiento es de gran importancia ya que influye directamente en la productividad. El aumento en la capacidad de unión ya está aumentando la productividad en el nivel de cuánto más material puede unirse a la superficie (~20- 40%), pero la disminución del tiempo de residencia requerido para que la molécula diana se una a la superficie modificada potenciaría aún más la eficiencia económica. Presumiblemente, la disminución del tiempo de residencia hasta 0,3 min conducirá a un aumento de la productividad de 10 veces en comparación con el tiempo de residencia de 3 min. Desafortunadamente, la disminución del tiempo de residencia durante la fase de adsorción de la molécula diana conduce a la disminución de la capacidad de unión dinámica, ya que disminuye la tasa de transferencia de masa. En consecuencia, la carga de la columna se realiza normalmente con velocidades que van hasta aproximadamente 600 cm/h tal como se da a conocer en el documento US 20090209736. Pero como también se afirma en realidad en E. Mahajan et al., Journal of Chromatography A, 1227 (2012) 154-162, a velocidades de flujo más altas, la capacidad de unión de la columna se reduce de modo que no son viables velocidades de flujo altas para la carga de la columna.

Sorprendentemente, se encontró que una selección apropiada de las propiedades físicas del material de soporte (tamaño de partícula, tamaño de poro) junto con un cierto método de cromatografía continua permite velocidades de carga por encima de 800 cm/h y más.

Breve descripción de la invención

Pueden lograrse capacidades de unión totales de más del 60% de las resinas de afinidad sin o con bajas pérdidas de moléculas diana < 5% durante la carga usando velocidades de más de 800 e incluso más de 1000 cm/h transfiriendo eficazmente la molécula diana lixiviada de una primera columna de afinidad de captura a una segunda columna de afinidad de captura durante la carga. Simultáneamente, se usa al menos una tercera columna para las otras etapas del proceso cromatográfico para permitir un funcionamiento unitario en paralelo. Esto da como resultado un aumento de la capacidad de unión >20% si se compara directamente (las mismas condiciones de funcionamiento unitario) con un funcionamiento unitario discontinuo y una disminución > 3 veces en el tiempo de funcionamiento (el funcionamiento unitario discontinuo habitual se realiza a 300 cm/h). Esto no solo funciona para aplicaciones de cromatografía de afinidad, sino también para aplicaciones de cromatografía de intercambio iónico.

La presente invención se refiere en consecuencia a un método de purificación de moléculas diana de una o más impurezas en una muestra, comprendiendo el método las etapas de

a) proporcionar al menos tres unidades de separación que tienen la misma matriz de cromatografía que están al menos conectadas de modo que puede fluir líquido desde una unidad de separación hasta la siguiente y desde la última hasta la primera unidad de separación

b) alimentar la muestra en una primera unidad de separación de modo que, mientras la muestra se carga en esta unidad de separación en la que la muestra está a un primer pH y conductividad que permiten que las moléculas diana se unan a esta unidad de separación, dicha unidad de separación está al menos parte del tiempo de carga en comunicación de fluido con la siguiente unidad de separación, de modo que las moléculas diana no unidas a dicha primera unidad de separación pueden unirse a la siguiente unidad de separación, al mismo tiempo al menos lavar, eluir y/o reequilibrar una unidad de separación diferente de la unidad de separación que está cargándose y de la que está en comunicación de fluido con la unidad de separación que está cargándose

c) cambiar la alimentación a la siguiente unidad de separación

d) alimentar la muestra en dicha siguiente unidad de separación de modo que, mientras la muestra está cargándose en dicha siguiente unidad de separación en la que la muestra está a un primer pH y conductividad que permiten que las moléculas diana se unan a dicha siguiente unidad de separación, dicha siguiente unidad de separación está al menos parte del tiempo de carga en comunicación de fluido con la unidad de separación después de la siguiente, de modo que las moléculas diana no unidas a dicha siguiente unidad de separación pueden unirse a la unidad de separación después de la siguiente, al mismo tiempo al menos lavar, eluir y/o reequilibrar una unidad de separación diferente de la unidad de separación que está cargándose y de la que está en comunicación de fluido con la unidad de separación que está cargándose

e) repetir las etapas c) y d) una o más veces,

caracterizado porque el flujo de alimentación nunca se detiene y tiene una velocidad por encima de 800 cm/h y porque la matriz de cromatografía de las unidades de separación comprende partículas con un diámetro promedio de entre 30 y 200 |jm y con diámetros de poro promedio en el intervalo entre 50 nm y 200 nm y porta ligandos de afinidad o ligandos de intercambio iónico.

En una realización preferida, la alimentación tiene una velocidad por encima de 1000 cm/h.

En una realización preferida, se proporcionan tres, cuatro o cinco unidades de separación que tienen la misma matriz de cromatografía en la etapa a). En una realización muy preferida, solo se proporcionan tres unidades de separación que tienen la misma matriz de cromatografía en la etapa a).

En una realización preferida, la matriz de cromatografía es una matriz de cromatografía de afinidad.

En otra realización preferida, la matriz de cromatografía de las unidades de separación comprende partículas con un diámetro de tamaño de partícula promedio (d50) entre 40 y 120 jm. Más preferiblemente entre 55 y 100 jm.

En otra realización preferida, la matriz de cromatografía de las unidades de separación comprende partículas con diámetros de poro promedio en el intervalo entre 40 nm y 300 nm. Más preferiblemente, los poros de las partículas que están presentes en las unidades de separación tienen poros con diámetros de poro promedio en el intervalo entre 50 y 150 nm. Más preferido, los poros de las partículas tienen diámetros de poro promedio en el intervalo entre 60 nm y 100 nm.

En una realización preferida, en las etapas b), c) y d), la unidad de separación que está cargándose está no solo parte del tiempo de carga, sino a lo largo de todo el tiempo de carga en comunicación de fluido con la siguiente unidad de separación en el círculo.

En otra realización preferida en las etapas b), c) y d), la comunicación de fluido entre la unidad de separación que está cargándose y la siguiente unidad de separación en el círculo comienza en la segunda mitad del tiempo de carga.

En otra realización, cuando se lava la unidad de separación cargada, el líquido de lavado que eluye de dicha unidad de separación cargada se dirige a la entrada de otra unidad de separación.

En otra realización, cuando se lava la unidad de separación cargada, el líquido de lavado que eluye de dicha unidad de separación cargada se dirige a la materia prima.

En una realización preferida, la muestra es una muestra clarificada. Una muestra clarificada es una muestra que se ha sometido a clarificación anteriormente.

En otra realización preferida, las moléculas diana purificadas que se eluyen de las unidades de separación y por tanto resultan del método según la presente invención, se someten además a al menos una etapa de purificación de flujo continuo.

La invención se refiere también a un aparato que comprende

- al menos tres unidades de separación que tienen la misma matriz de cromatografía que están conectadas con líneas de conexión de modo que puede fluir líquido desde una unidad de separación hasta la siguiente y desde la última hasta la primera unidad de separación y en el que cada línea de conexión entre dos unidades de separación comprende al menos una válvula de encendido/apagado

- un sistema de suministro de disolvente que está en conexión de fluido con la entrada de cada unidad de separación por medio de una ramificación en la línea de conexión entre las unidades de separación cerca de la entrada de cada unidad de separación

- una línea de salida de fluido que se ramifica de cada línea de conexión entre las unidades de separación cerca de la salida de una unidad de separación que comprende una línea con al menos dos ramificaciones, teniendo cada ramificación una válvula de encendido/apagado.

La presente invención también se refiere a un procedimiento para purificar moléculas diana, normalmente un procedimiento de producción biofarmacéutico, que comprende el método según la presente invención. Un procedimiento de producción biofarmacéutico es un procedimiento en el que una molécula diana producida en cultivo celular en un biorreactor se purifica de manera que puede usarse en aplicaciones biofarmacéuticas.

En una realización preferida, el procedimiento comprende adicionalmente una o más de las siguientes etapas:

- clarificación (como centrifugación y/o filtración y/o sedimentación)

- inactivación de virus

- al menos una etapa de purificación de flujo continuo, también denominada pulido de flujo continuo

- filtración estéril

En una realización preferida, al menos dos etapas del procedimiento se solapan en al menos una porción de su duración.

Figuras

La figura 1 muestra una vista esquemática de una realización preferida del aparato según la presente invención. Muestra las tres unidades de separación de captura (ProtA o IEX), las conexiones a los depósitos de disolvente A, B, C, D, E, F así como las líneas de conexión, válvulas y bombas.

Las figuras 2a-e muestran esquemáticamente una parte del proceso continuo de tres columnas, en donde las unidades de separación primera y segunda están en comunicación de fluido durante la fase de carga (alimentación) y la tercera unidad de separación, diferente de la unidad de separación que se carga y de la que está en comunicación de fluido con la unidad de separación que se carga, está sometiéndose a diversas subetapas del procedimiento: a) lavar con disolución A, b) lavar con disolución B, c) eluir la molécula diana unida, d) limpiar en el lugar y e) regenerar la unidad de separación.

Las figuras 3a-c muestran esquemáticamente una parte seleccionada del proceso continuo de tres columnas para la comunicación de fluido resaltada durante la fase de carga, en donde en a) la unidad de separación 1 está en comunicación de fluido con la unidad de separación 2 durante la carga y la unidad de separación 3 está en fase de lavado, b) la unidad de separación 2 está en comunicación de fluido con la unidad de separación 3 y la unidad de separación 1 está en fase de lavado, c) la unidad de separación 3 está en comunicación de fluido con la unidad de separación 1 y la unidad de separación 2 está en fase de lavado.

La figura 4 muestra una configuración que está restringida principalmente a las características esenciales de tres unidades de separación y dos sistemas de suministro de disolvente.

Las figuras 5a-d muestran esquemáticamente una parte seleccionada del procedimiento continuo de cuatro columnas para la comunicación de fluido resaltada durante la fase de carga, en donde en a) la unidad de separación 1 está en comunicación de fluido con la unidad de separación 2 durante la carga y la unidad de separación 4 está en comunicación de fluido con la unidad de separación 3 para la fase de lavado, b) la unidad de separación 2 está en comunicación de fluido con la unidad de separación 3 y la unidad de separación 1 está en comunicación de fluido con la unidad de separación 4 para la fase de lavado, c) la unidad de separación 3 está en comunicación de fluido con la unidad de separación 4 y la unidad de separación 2 está en comunicación de fluido con la unidad de separación 1 para la fase de lavado, d) la unidad de separación 4 está en comunicación de fluido con la unidad de separación 1 y la unidad de separación 3 está en comunicación de fluido con la unidad de separación 2 para la fase de lavado.

Las figuras 6a-e muestran esquemáticamente una parte del procedimiento continuo de cuatro columnas, en donde las unidades de separación primera y segunda están en comunicación de fluido durante la fase de carga (alimentación) y la cuarta unidad de separación, diferente de la unidad de separación que se carga y de la que está en comunicación de fluido con la unidad de separación que se carga, está sometiéndose a diversas subetapas del procedimiento: a) lavar con disolución A y transferir dicha disolución de lavado de esta unidad de separación a la previa que está en comunicación de fluido con una unidad de separación que está lavándose, b) lavar con disolución B, c) eluir la molécula diana unida, d) limpiar en el lugar y e) regenerar la unidad de separación.

La figura 7a muestra esquemáticamente una trayectoria de flujo alternativa para un lavado de moléculas diana débilmente unidas o no unidas que dilucida la transferencia de dichas moléculas a la otra unidad de separación. Mientras, la figura 7b muestra una trayectoria de flujo para un lavado de impurezas.

La figura 8 muestra una ventaja convincente de la cromatografía continua con respecto a los métodos discontinuos convencionales, expresada en capacidad de unión con respecto a tiempo de residencia para la resina ProSep vA Ultra Plus.

La figura 9 muestra una superposición de los perfiles de señal UV para una ejecución de 103 ciclos en un sistema de cromatografía continua de tres unidades de separación en un experimento de purificación de AcMA aplicando columnas ProSep vA Ultra Plus.

La figura 10 muestra las concentraciones de entrada de AcMA y las concentraciones de elución de AcM para una ejecución de 103 ciclos en un sistema de cromatografía continua de tres unidades de separación aplicando columnas ProSep vA Ultra Plus.

La figura 11 muestra la concentración de HCP en los conjuntos de elución para una ejecución de 103 ciclos en un sistema de cromatografía continua de tres unidades de separación aplicando columnas ProSep vA Ultra Plus para la purificación de AcMA.

La figura 12 muestra la capacidad de unión dinámica para diversas resinas de Prot A y diversas concentraciones de AcM en modos de funcionamiento discontinuo y continuo. Obsérvese que la leyenda en donde no se proporciona material se refiere al material PUP. Todas las columnas tenían las mismas dimensiones de 0,8 * 10 cm.

La figura 13 muestra una ventaja convincente de la cromatografía continua con respecto a los métodos discontinuos convencionales, expresada en capacidad de unión con respecto a tiempo de residencia para la resina Eshmuno S. La figura 14 muestra una superposición de los perfiles de señal UV para una ejecución en un sistema de cromatografía continua de tres unidades de separación en un experimento de purificación de AcMA aplicando columnas Eshmuno S. La figura 15 muestra un procedimiento para la purificación de moléculas diana usando el método de la presente invención para la etapa de cromatografía de unión y elución (captura). El procedimiento de purificación mostrado usa un biorreactor para cultivo celular seguido por las siguientes etapas de procedimiento: clarificación; cromatografía de unión y elución de proteína A (captura); inactivación de virus; purificación de flujo continuo; y formulación. Tal como se muestra, cada una de las etapas del procedimiento emplea uno o más dispositivos usados para lograr el resultado previsto de la etapa del procedimiento. Tal como se muestra, la clarificación emplea precipitación y filtración en profundidad; la cromatografía de unión y elución de proteína A se realiza usando el procedimiento de la presente invención; la inactivación de virus emplea dos mezcladoras estáticas en línea; la purificación de flujo continuo emplea carbono activado (AC) seguido por cromatografía de intercambio aniónico (AEX) seguido por un cambio de pH usando una mezcladora en línea y un tanque de compensación seguido por cromatografía de intercambio catiónico (CEX) de flujo continuo y filtración de virus; y la formulación emplea un dispositivo de filtración de flujo tangencial de concentración/diafiltración seguido por filtración estéril. Se emplean también uno o más filtros estériles a lo largo de todo el procedimiento.

Definiciones

Antes de describir la presente invención en detalle, ha de entenderse que esta invención no se limita a composiciones o etapas de procedimiento específicas, ya que estas pueden variar. Debe observarse que, tal como se usa en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, la forma singular “un”, “una” y “el/la” incluyen referentes en plural a menos que el contexto indique claramente otra cosa. Por tanto, por ejemplo, la referencia a “un ligando” incluye una pluralidad de ligandos y la referencia a “un anticuerpo” incluye una pluralidad de anticuerpos y similares.

A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto habitual en la técnica al que se refiere esta invención. Los siguientes términos se definen para los fines de la invención tal como se describe en el presente documento.

Tal como se usa en el presente documento, el término “molécula diana” o “compuesto diana” se refiere a cualquier molécula, sustancia o compuesto o mezclas de los mismos que debe aislarse, separarse o purificarse de una o más impurezas en una muestra. En una realización preferida, la molécula diana es una proteína o una mezcla de dos o más proteínas. En una realización muy preferida, la molécula diana es un anticuerpo. Alternativamente, una “molécula diana” o “compuesto diana” podría ser un compuesto no deseado que debe eliminarse de uno o más compuestos deseados. El término “anticuerpo” se refiere a una proteína que tiene la capacidad de unirse específicamente a un antígeno. Normalmente, los anticuerpos tienen una estructura básica de cuatro cadenas polipeptídicas que consisten en dos cadenas pesadas y dos ligeras, estabilizándose dichas cadenas, por ejemplo, mediante enlaces disulfuro entre cadenas. Los anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales y pueden existir en forma monomérica o polimérica, por ejemplo, anticuerpos IgM que existen en forma pentamérica y/o anticuerpos IgA que existen en forma monomérica, dimérica o multimérica. Los anticuerpos también pueden incluir anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpos siempre que conserven, o se modifiquen para comprender, un dominio de unión específico de ligando. El término “fragmento” se refiere a una parte o porción de un anticuerpo o cadena de anticuerpo que comprende menos residuos de aminoácido que un anticuerpo o cadena de anticuerpo intacto o completo. Pueden obtenerse fragmentos por medio de tratamiento químico o enzimático de un anticuerpo o cadena de anticuerpo intacto o completo. Pueden obtenerse también fragmentos mediante medios recombinantes. Cuando se producen de manera recombinante, los fragmentos pueden expresarse solos o como parte de una proteína más grande denominada proteína de fusión. Los fragmentos a modo de ejemplo incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, Fc y/o Fv. Las proteínas de fusión a modo de ejemplo incluyen proteínas de fusión de Fc. Según la presente invención, las proteínas de fusión están englobadas también por el término “anticuerpo”.

Tal como se comentó anteriormente, en algunas realizaciones, un anticuerpo es una proteína que contiene una región Fc, por ejemplo, una inmunoglobulina. En algunas realizaciones, una proteína que contiene una región Fc es una proteína recombinante que incluye la región Fc de una inmunoglobulina fusionada a otro polipéptido o a un fragmento del mismo. Los polipéptidos a modo de ejemplo incluyen, por ejemplo, renina; una hormona de crecimiento, incluyendo hormona de crecimiento humana y hormona de crecimiento bovina; factor de liberación de hormona de crecimiento; hormona paratiroidea; hormona estimulante del tiroides; lipoproteínas; a-1-antitripsina; cadena a de insulina; cadena p de insulina; proinsulina; hormona estimulante del folículo; calcitonina; hormona luteinizante; glucagón; factores de coagulación tales como factor VIIIC, factor IX, factor tisular y factor de von Willebrand; factores anticoagulantes tales como proteína C; factor natriurético auricular; tensioactivo pulmonar; un activador de plasminógeno, tal como urocinasa o activador de plasminógeno humano de tipo tisular o urinario (t-PA); bombesina; trombina; factor de crecimiento hematopoyético; factor de necrosis tumoral a y P; encefalinasa; RANTES (quimiocina regulada por activación, expresada y secretada normalmente por células T); proteína inflamatoria de macrófagos humana (MIP-1-a); una albúmina sérica tal como albúmina sérica humana; sustancia inhibidora mulleriana; cadena a de relaxina; cadena p de relaxina; pro-relaxina; péptido asociado a gonadotropina de ratón; una proteína microbiana, tal como p-lactamasa; ADNasa; IgE; un antígeno asociado a linfocito T citotóxico (CTLA) (por ejemplo, CTLA-4); inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); receptores para hormonas o factores de crecimiento; proteína A o D; factores reumatoides; un factor neurotrófico tal como factor neurotrófico derivado de huesos (BDNF), neurotrofina-3, -4, -5 o -6 (NT-3, NT-4, NT-5 o NT-6), o un factor de crecimiento nervioso tal como NGF-P; factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF); factor de crecimiento de fibroblastos tal como aFGF y PFGF; factor de crecimiento epidérmico (EGF); factor de crecimiento transformante (TGF) tal como TGF-alfa y TGF-p, incluyendo TGF-P1, TGF-P2, TGF-P3, TGF-P4 o TGF-P5; factor de crecimiento similar a la insulina I y II (IGF-I e IGF-II); des(I-3)-IGF-I (IGF-I de cerebro), proteínas de unión a factor de crecimiento similar a la insulina (IGFBP); proteínas CD tales como CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD34 y CD40; eritropoyetina; factores osteoinductores; inmunotoxinas; una proteína morfogenética ósea (BMP); un interferón tal como interferón-a, p y y; factor estimulante de colonias (CSF), por ejemplo, M-CSF, GM-CSF y G-CSF; interleucinas (IL), por ejemplo, IL-I a IL-IO; superóxido dismutasa; receptores de células T; proteínas de superficie de membrana; factor acelerador de la degradación; antígeno viral tal como, por ejemplo, una porción de la envuelta del virus del sida; proteínas transportadoras; receptores de migración; adresinas; proteínas reguladoras; integrinas tales como CDI Ia, CDI Ib, CDI Ic, CD 18, una ICAM, VLA-4 y VCAM; un antígeno asociado a tumor tal como el receptor HER2, HER3 o HER4; y fragmentos y/o variantes de cualquiera de los polipéptidos enumerados anteriormente. Además, un anticuerpo según la presente invención es cualquier proteína o polipéptido, fragmento o variante del mismo, que se une específicamente a cualquiera de los polipéptidos enumerados anteriormente.

Tal como se usa en el presente documento, y a menos que se indique otra cosa, el término “muestra” se refiere a cualquier composición o mezcla que contiene una molécula diana. Las muestras pueden derivarse de fuentes biológicas o de otras. Las fuentes biológicas incluyen fuentes eucariotas y procariotas, tales como células, tejidos y órganos de plantas y animales. La muestra también puede incluir diluyentes, tampones, detergentes y especies contaminantes, desechos y similares que se encuentran mezclados con la molécula diana. La muestra puede estar “parcialmente purificada” (es decir, haberse sometido a una o más etapas de purificación, tales como etapas de filtración) o puede obtenerse directamente de una célula u organismo huésped que produce la molécula diana (por ejemplo, la muestra puede comprender fluido de cultivo celular recogido).

El término “impureza” o “contaminante”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier molécula extraña u objetable, incluyendo una macromolécula biológica tal como ADN, ARN, una o más proteínas de células huésped, endotoxinas, lípidos y uno o más aditivos que pueden estar presentes en una muestra que contiene la molécula diana que está separándose de una o más de las moléculas extrañas u objetables usando un procedimiento de la presente invención.

Adicionalmente, tal impureza puede incluir cualquier reactivo que se use en una etapa que puede producirse antes del método de la invención.

Los términos “purificar”, “separar” o “aislar”, tal como se usan de manera intercambiable en el presente documento, se refieren a aumentar el grado de pureza de una molécula diana de una composición o muestra que comprende la molécula diana y una o más impurezas. Normalmente, el grado de pureza de la molécula diana aumenta eliminando (completa o parcialmente) al menos una impureza de la composición.

Los términos “modo de unión y elución” y “procedimiento de unión y elución”, tal como se usan de manera intercambiable en el presente documento, se refieren a una técnica de separación de productos en la que al menos un producto contenido en una muestra (por ejemplo, una proteína que contiene una región Fc) se une a una resina o medio cromatográfico y posteriormente se eluye.

Tal como se usa en el presente documento, el término “depósito”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier recipiente, tanque o bolsa, que puede usarse para almacenar cualquier tampón que va a usarse cuando se realiza el método de la invención o la muestra o cualquier otro líquido que se use en el método de la invención. Adicionalmente un “depósito” es cualquier recipiente, tanque o bolsa que se usa para recoger la salida de una etapa de procedimiento (por ejemplo, un eluato de una columna).

El término “cromatografía” se refiere a cualquier tipo de técnica que separa un analito de interés (por ejemplo, una molécula diana) de otras moléculas presentes en una mezcla. Habitualmente, la molécula diana se separa de otras moléculas como resultado de diferencias en las velocidades a las que migran las moléculas individuales de la mezcla a través de un medio estacionario bajo la influencia de una fase móvil, o en procedimientos de unión y elución.

Los términos “matriz” o “matriz de cromatografía” se usan de manera intercambiable en el presente documento y se refieren a cualquier tipo de fase sólida, resina o sorbente particulado que en un procedimiento de separación separa una molécula diana (por ejemplo, una proteína que contiene una región Fc tal como una inmunoglobulina) de otras moléculas presentes en una mezcla. Habitualmente, la molécula diana se separa de otras moléculas como resultado de diferencias en las velocidades a las que migran las moléculas individuales de la mezcla a través de la matriz bajo la influencia de una fase móvil, o en procedimientos de unión y elución. La matriz que consiste en partículas de resina puede ponerse en columnas o cartuchos. Los ejemplos no limitativos incluyen resinas particuladas, monolíticas o fibrosas así como membranas que pueden colocarse en columnas o cartuchos. Los ejemplos de materiales para formar la matriz incluyen polisacáridos (tales como agarosa y celulosa); y otras matrices mecánicamente estables tales como sílice (por ejemplo, vidrio de poro controlado), poli(estirendivinil)benceno, poliacrilamida, partículas de cerámica y derivados de cualquiera de los anteriores. Normalmente la matriz porta uno o más tipos de ligandos.

Un “ligando” es un grupo funcional que se une a la matriz de cromatografía y que determina las propiedades de unión de la matriz. Los ejemplos de “ligandos” incluyen, pero no se limitan a, grupos de intercambio iónico, grupos de interacción hidrófoba, grupos de interacción hidrófila, grupos de interacciones tiófilas, grupos de afinidad con metal, grupos de afinidad, grupos de bioafinidad y grupos en modo mixto (combinaciones de los mencionados anteriormente). Algunos ligandos preferidos que pueden usarse en el presente documento incluyen, pero no se limitan a, grupos de intercambio catiónico fuerte, tales como sulfopropilo, ácido sulfónico; grupos de intercambio aniónico fuerte, tales como cloruro de trimetilamonio; grupos de intercambio catiónico débil, tales como ácido carboxílico; grupos de intercambio aniónico débil, tales como N5N dietilamino o DEAE; grupos de interacción hidrófoba, tales como fenilo, butilo, propilo, hexilo; y grupos de afinidad, tales como proteína A, proteína G y proteína L.

El término “cromatografía de afinidad” se refiere a una técnica de separación de proteínas en la que una proteína diana (por ejemplo, una proteína que contiene una región Fc de interés o anticuerpo) se une específicamente a un ligando que es específico para la proteína diana. Un ligando de este tipo generalmente se denomina un ligando bioespecífico. En algunas realizaciones, el ligando bioespecífico (por ejemplo, proteína A o una variante funcional de la misma) se une covalentemente a un material de matriz de cromatografía y es accesible para la proteína diana en disolución cuando la disolución entra en contacto con la matriz de cromatografía. La proteína diana generalmente conserva su afinidad de unión específica para el ligando bioespecífico durante las etapas cromatográficas, mientras que otros solutos y/o proteínas en la mezcla no se unen de manera apreciable o específica al ligando. La unión de la proteína diana al ligando inmovilizado permite que las proteínas contaminantes o impurezas proteicas pasen a través de la matriz de cromatografía mientras que la proteína diana permanece unida específicamente al ligando inmovilizado en el material de fase sólida. Entonces, se retira la proteína diana unida específicamente en forma activa del ligando inmovilizado en condiciones adecuadas (por ejemplo, pH bajo, pH alto, alta concentración de sal, ligando de competición, etc.), y se hace pasar a través de la columna cromatográfica con el tampón de elución, libre de las proteínas contaminantes o impurezas proteicas que se había permitido que pasaran anteriormente a través de la columna. Puede usarse cualquier componente como ligando para purificar su proteína de unión específica respectiva, por ejemplo, un anticuerpo. Sin embargo, en diversos métodos según la presente invención, se usa proteína A como ligando para una proteína diana que contiene una región Fc. Las condiciones para la elución del ligando bioespecífico (por ejemplo, proteína A) de la proteína diana (por ejemplo, una proteína que contiene una región Fc) puede determinarlas fácilmente un experto habitual en la técnica. En algunas realizaciones, puede usarse proteína G o proteína L o una variante funcional de la misma como ligando bioespecífico. En algunas realizaciones, se usa un ligando bioespecífico tal como proteína A un intervalo de pH de 5-9 para unirse a una proteína que contiene una región Fc, lavar o reequilibrar el conjugado de ligando bioespecífico/proteína diana, seguido por elución con un tampón que tiene un pH de aproximadamente o por debajo de 4 que contiene al menos una sal.

El término “intercambio iónico” y “cromatografía de intercambio iónico” se refiere al procedimiento cromatográfico en el que un soluto o analito de interés (por ejemplo, una proteína diana que contiene una región Fc) en una mezcla interacciona con un compuesto cargado unido (tal como mediante unión covalente) a un material de intercambio iónico de fase sólida de manera que el soluto o analito de interés interacciona de manera no específica con el compuesto cargado más o menos que las impurezas o contaminantes del soluto en la mezcla. Los solutos contaminantes en la mezcla eluyen de una columna del material de intercambio iónico más rápido o más lento que el soluto de interés o se unen a o se excluyen de la resina en relación con el soluto de interés. “Cromatografía de intercambio iónico” incluye específicamente cromatografía de intercambio catiónico, de intercambio aniónico y de intercambio iónico en modo mixto. Por ejemplo, la cromatografía de intercambio catiónico puede unir la molécula diana (por ejemplo, una proteína diana que contiene una región Fc) seguido por elución (cromatografía de intercambio catiónico de unión y elución o “CIEX”) o puede unir predominantemente las impurezas mientras que la molécula diana “fluye de manera continua a través de” la columna (cromatografía de intercambio catiónico de flujo continuo FT-CIEX). La cromatografía de intercambio aniónico puede unir la molécula diana (por ejemplo, una proteína diana que contiene una región Fc) seguido por elución o puede unir predominantemente las impurezas mientras que la molécula diana “fluye de manera continua a través de” la columna. En algunas realizaciones y tal como se demuestra en los ejemplos expuestos en el presente documento, la etapa de cromatografía de intercambio aniónico se realiza en un modo de flujo continuo.

La expresión “matriz de intercambio iónico” se refiere a una matriz de cromatografía que está cargada negativamente (es decir, una resina de intercambio catiónico) o cargada positivamente (es decir, una resina de intercambio aniónico). La carga puede proporcionarse uniendo uno o más ligandos cargados a la matriz, por ejemplo, mediante unión covalente. Alternativamente, o además, la carga puede ser una propiedad inherente de la matriz (por ejemplo, como es el caso para la sílice, que tiene una carga negativa global).

Una “matriz de intercambio catiónico” se refiere a una matriz de cromatografía que está cargada negativamente y que, por tanto, tiene cationes libres para el intercambio con cationes en una disolución acuosa que se hace pasar sobre o a través de la fase sólida. Un ligando cargado negativamente unido a la fase sólida para formar la resina de intercambio catiónico puede ser, por ejemplo, un carboxilato o sulfonato. Las resinas de intercambio catiónico disponibles comercialmente incluyen carboximetilcelulosa, sulfopropilo (SP) inmovilizado sobre agarosa (por ejemplo, SP-SEPHAROSE FAST FLOW™ o SP-SEPHAROSE HIGH PERFORMANCE™ de Pharmacia) y sulfonilo inmovilizado sobre agarosa (por ejemplo, S-SEPHAROSE FAST FLOW™ de Pharmacia). Se prefiere Fractogel® EMD SO³, Fractogel® EMD SE Highcap, Eshmuno ® S y Fractogel ® EMD COO (Merck).

Una “matriz de intercambio iónico en modo mixto” se refiere a una matriz de cromatografía que está modificada covalentemente con restos catiónicos y/o aniónicos e hidrófobos. Una resina de intercambio iónico en modo mixto disponible comercialmente es BAKERBOND ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.) que contiene grupos de intercambio catiónico débil, una baja concentración de grupos de intercambio aniónico y ligandos hidrófobos unidos a una matriz de soporte de fase sólida de gel de sílice. Las matrices de intercambio catiónico en modo mixto normalmente tienen grupos de intercambio catiónico y matrices hidrófobas. Matrices de intercambio catiónico en modo mixto adecuadas son Capto® MMC (GE Healthcare) y Eshmuno® HCX (Merck). Matrices de intercambio aniónico en modo mixto adecuadas normalmente tienen grupos de intercambio aniónico y restos hidrófobos. Matrices de intercambio aniónico en modo mixto adecuadas son Capto ® Adhere (GE Healthcare).

El término “matriz de intercambio aniónico” se usa en el presente documento para referirse a una matriz de cromatografía que está cargada positivamente, por ejemplo, que tiene uno o más ligandos cargados positivamente, tales como grupos amino cuaternarios, unidos a la misma. Las resinas de intercambio aniónico disponibles comercialmente incluyen DEAE celulosa, QAE SEPHADEX™ y FAST Q SEPHAROSE™ (Pharmacia). Materiales preferidos son Fractogel® EMD TMAE, Fractogel® EMD TMAE highcap, Eshmuno ® Q y Fractogel® EMD DEAE.

Los términos “proteína A” y “Prot A” se usan de manera intercambiable en el presente documento y engloban proteína A recubierta de una fuente nativa de la misma, proteína A producida de manera sintética (por ejemplo, mediante síntesis de péptidos o mediante técnicas recombinantes) y variantes de la misma que conservan la capacidad para unirse a proteínas que tienen una región CH²/CH³, tal como una región Fc. La proteína A puede adquirirse comercialmente de Repligen, Pharmacia y Fermatech. La proteína A se inmoviliza generalmente en una matriz de cromatografía. El término “ProA” también se refiere a una matriz o columna de cromatografía de afinidad que contiene una matriz de soporte sólida cromatográfica a la que se une covalentemente la proteína A.

Un derivado, fragmento o variante funcional de la proteína A usado en los métodos según la presente invención puede caracterizarse por una constante de unión de al menos K=10-8 M, y preferiblemente K=10-9 M, para la región Fc de IgG2a de ratón o IgG1 humana. Una interacción que se amolda a tal valor para la constante de unión se denomina “unión de alta afinidad” en el presente contexto. Preferiblemente, un derivado o variante funcional de proteína A de este tipo comprende al menos parte de un dominio de unión a IgG funcional de proteína A de tipo natural, seleccionado de los dominios naturales E, D, A, B, C o mutantes obtenidos por ingeniería genética de los mismos que tienen funcionalidad de unión a IgG conservada.

Además, también pueden usarse derivados o variantes de proteína A obtenidos por ingeniería genética que permiten una unión en un único punto en la etapa de cromatografía de afinidad en los métodos reivindicados.

Unión en un único punto generalmente significa que el resto de proteína se une a través de un único enlace covalente a un material de soporte cromatográfico de la cromatografía de afinidad con proteína A. Una unión en un único punto de este tipo también puede producirse mediante el uso de residuos reactivos adecuados que están colocados en una posición de aminoácido expuesto, concretamente en un bucle, cerca del extremo N o C-terminal o en otro sitio en la circunferencia externa del plegamiento de proteína. Tales grupos reactivos son por ejemplo funciones sulfhidrilo o amino.

El término “matriz de cromatografía de afinidad” se usa en el presente documento para referirse a una matriz de cromatografía que porta ligandos adecuados para cromatografía de afinidad. Normalmente, los ligandos (por ejemplo, proteína A o una variante funcional de la misma) se unen covalentemente a un material de matriz de cromatografía y son accesibles a la molécula diana en disolución cuando la disolución entra en contacto con la matriz de cromatografía. Un ejemplo de una matriz de cromatografía de afinidad es una matriz de proteína A. Una matriz de cromatografía de afinidad se une normalmente a las moléculas diana con alta especificidad basándose en un mecanismo de “llave/cerradura” tal como unión de antígeno/anticuerpo o enzima/receptor.

Ejemplos de matrices de afinidad son matrices que portan ligandos de proteína A como Protein A SEPHAROSE™ o PROSEP®-A.

El término “unión” tal como se usa en el presente documento para describir interacciones entre una molécula diana (por ejemplo, una proteína que contiene una región Fc) y un ligando unido a una matriz (por ejemplo, proteína A unida a una resina o matriz de fase sólida), se refiere a la unión generalmente reversible de la molécula diana a un ligando a través de los efectos combinados de complementariedad espacial de, por ejemplo, las estructuras de la proteína y el ligando en un sitio de unión acoplado con fuerzas electrostáticas, enlaces de hidrógeno, fuerzas hidrófobas y/o fuerzas de van der Waals en el sitio de unión. Generalmente, cuanto mayor es la complementariedad espacial y cuanto más fuerte sean las otras fuerzas en el sitio de unión, mayor será la especificidad de unión de una proteína para su ligando respectivo. Los ejemplos no limitativos de unión específica incluyen unión de anticuerpo-antígeno, unión de enzima-sustrato, unión de enzima-cofactor, quelación de iones metálicos, unión de proteína de unión a ADN-ADN, interacciones reguladoras proteína-proteína, y similares. De manera ideal, en la cromatografía de afinidad se produce unión específica con una afinidad de aproximadamente 10'4 a 10'8 M en disolución libre.

El término “detergente” se refiere a tensioactivos iónicos y no iónicos tales como polisorbatos (por ejemplo, polisorbatos 20 u 80); poloxámeros (por ejemplo, poloxámero 188); Triton; dodecilsulfato de sodio (SDS); laurilsulfato de sodio; octilglicósido de sodio; lauril-, miristil-, linoleil- o estearil-sulfobetaína; lauril-, miristil-, linoleil- o estearil-sarcosina; linoleil-, miristil- o cetil-betaína; lauroamidopropil-, cocamidopropil-, linoleamidopropil-, miristamidopropil-, palmidopropil- o isoestearamidopropil-betaína (por ejemplo, lauroamidopropilo); miristamidopropil-, palmidopropil- o isoestearamidopropildimetilamina; metilcocoil-taurato de sodio o metiloleil- taurato de disodio; y la serie MONa Qu AT™ (Mona Industries, Inc., Paterson, N. J.). Detergentes útiles son un polisorbato, tal como polisorbato 20 (TWEEN 20®.) o polisorbato 80 (TWEEN 80®.) o diversos ácidos, tales como ácido octanoico.

Un “tampón” es una disolución que resiste cambios en el pH mediante la acción de sus componentes de conjugado ácido-base. Diversos tampones que pueden emplearse dependiendo, por ejemplo, del pH deseado del tampón se describen en Buffers. A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems, Gueffroy, D., ed. Calbiochem Corporation (1975). Los ejemplos no limitativos de tampones incluyen tampones MES, MOPS, MOPSO, Tris, HEPES, fosfato, acetato, citrato, succinato y amonio, así como combinaciones de estos.

Según la presente invención, el término “tampón” o “disolvente” se usa para cualquier composición líquida que se use para cargar, lavar, eluir y reequilibrar las unidades de separación.

Cuando “se carga” una columna de separación, se usa un tampón para cargar la muestra o composición que comprende la molécula diana (por ejemplo, una proteína diana que contiene una región Fc) y una o más impurezas sobre una columna de cromatografía (por ejemplo, una columna de afinidad o una columna de intercambio iónico). El tampón tiene una conductividad y/o pH de manera que la molécula diana se une a la matriz de cromatografía mientras que de manera ideal todas las impurezas no se unen y fluyen de manera continua a través de la columna.

Cuando “se carga” una columna de separación para “hacer fluir de manera continua” una molécula diana, se usa un tampón para cargar la muestra o composición que comprende la molécula diana (por ejemplo, una proteína diana que contiene una región Fc) y una o más impurezas sobre una columna de cromatografía (por ejemplo, una columna de afinidad o una columna de intercambio iónico). El tampón tiene una conductividad y/o pH de manera que la molécula diana no se une a la matriz de cromatografía y fluye de manera continua a través de la columna mientras que de manera ideal todas las impurezas se unen a la columna.

El término “reequilibrar” se refiere al uso de un tampón para reequilibrar la matriz de cromatografía antes de cargar la molécula diana. Normalmente, para reequilibrar se usa el tampón de carga.

Mediante “lavado” o “lavar” una matriz de cromatografía quiere decirse hacer pasar un líquido apropiado, por ejemplo un tampón, a través o sobre la matriz. Normalmente, se usa lavado para eliminar contaminantes débilmente unidos de la matriz antes de eluir la molécula diana y/o para eliminar la molécula diana no unida o débilmente unida después de cargar.

En este caso, normalmente, el tampón de lavado y el tampón de carga son el mismo. En caso de que se use un tampón de inactivación de virus, se usa para inactivar determinados virus presentes antes de eluir la molécula diana. En este caso, normalmente, el tampón de inactivación de virus difiere del tampón de carga puesto que puede contener detergente/detergentes o tener propiedades diferentes (pH/conductividad/sales y sus cantidades).

“Eluir” una molécula (por ejemplo, un polipéptido de interés o una impureza) de una matriz de cromatografía quiere decir retirar la molécula de la misma alterando las condiciones de la disolución de manera que el tampón compite con la molécula de interés por los sitios de ligando en la resina de cromatografía. Un ejemplo no limitativo es eluir una molécula de una resina de intercambio iónico alterando la fuerza iónica del tampón que rodea el material de intercambio iónico de manera que el tampón compite con la molécula por los sitios cargados en el material de intercambio iónico. Según la presente invención, una “unidad de separación” es un equipo sobre el que puede realizarse una etapa de separación cromatográfica. Una unidad de separación normalmente es una columna de cromatografía o cartucho de cromatografía que se llena con una matriz sorbente. Un experto en la técnica conoce columnas de cromatografía. Normalmente comprenden un tubo de columna con accesorios de extremo para la entrada de fluido y la salida de fluido. El tubo de columna se llena con una matriz de cromatografía adecuada.

Según la presente invención, un procedimiento “continuo” es un procedimiento que no se ejecuta en modo discontinuo.

En un procedimiento continuo según la invención, se carga una nueva muestra sobre una o más unidades de separación de manera continua sin ninguna pausa entremedias. En un procedimiento continuo según la presente invención, la alimentación nunca se detiene.

Según la presente invención, un “procedimiento semicontinuo” es un procedimiento en el que la alimentación se interrumpe al menos una vez, normalmente varias veces de una manera secuencial.

Según la invención, “secuencial” es dos veces o más de dos veces.

Según la presente invención, una “línea de conexión” es cualquier tubo, manguito, tubería o canal que es adecuado para que fluyan fluidos a su través. Una línea de conexión puede estar interrumpida por una o más válvulas. Una línea de conexión puede ser recta o ramificada.

Según la presente invención, si dos partes de un aparato están “en conexión de fluido”, significa que hay una línea de conexión entre las dos partes del aparato de modo que puede fluir líquido desde una parte hasta la otra. Esta línea de conexión puede ser directa o puede estar interrumpida por una o más válvulas, por una unidad de separación u otras partes del aparato. El término “en conexión de fluido” engloba una conexión de fluido que es permanente pero también engloba una conexión de fluido que no es permanente y está compuesta por una línea de conexión que está interrumpida por ejemplo por una o más válvulas de modo que el flujo de líquido a través de la línea de conexión puede iniciarse y detenerse siempre que sea necesario. Normalmente, la mayoría de las partes del aparato que están en conexión de fluido tienen una conexión de fluido que no es permanente. Por ejemplo, si un depósito de tampón está en conexión de fluido con una unidad de separación, esto significa que puede realizarse un flujo del tampón a la columna si es necesario pero normalmente hay al menos una válvula ubicada en la línea de conexión entre el depósito y la unidad de separación de modo que el flujo de líquido puede detenerse cuando sea necesario e iniciarse cuando sea necesario.

Si se realiza realmente un flujo de líquido entre dos partes del aparato que están en conexión de líquido y por tanto está fluyendo líquido a través de la línea de conexión entre las dos partes, estas dos partes están en “comunicación de fluido”. En consecuencia, “comunicación de fluido” según la presente invención describe el estado en el que una “conexión de fluido” se usa realmente por el líquido que fluye a través de la línea de conexión. Si dos partes del sistema están parcialmente en comunicación de fluido, significa que la comunicación de fluido no es permanente y el líquido no está fluyendo permanentemente desde una parte hasta la otra sino solo parte del tiempo. Normalmente, el flujo del líquido entre dos partes del sistema se inicia y/o se detiene con la ayuda de válvulas que dirigen el flujo de líquido.

Una “entrada de fluido” o “entrada” es cualquier medio que permite la introducción de líquido. Una entrada de la unidad de separación es, por ejemplo, el accesorio de extremo de una columna de cromatografía al que puede conectarse una línea de conexión. Una entrada también puede ser una válvula que proporciona la introducción de líquido en una línea de conexión. Una entrada también puede ser el extremo de una línea de conexión.

Una “salida” o “salida de fluido” es cualquier medio que permite la retirada de un líquido. Una salida de la unidad de separación es, por ejemplo, el accesorio de extremo de una columna de cromatografía al que puede conectarse una línea de conexión. Una salida también puede ser una válvula que proporciona la introducción de líquido en una línea de conexión. Una salida también puede ser el extremo de una línea de conexión.

Una “válvula de selección de fluido” es cualquier medio que permite una comunicación de fluido selectivamente entre cualquier fluido conectado y la parte del sistema. Una válvula de selección de fluido es, por ejemplo, la válvula antes de la entrada de la unidad de separación, a la que pueden conectarse las líneas de conexión y elegirse selectivamente, lo que puede permitir la comunicación de fluido entre la línea seleccionada y la entrada de la unidad de separación. Una válvula de selección de fluido es, por ejemplo, la válvula después de la salida de la unidad de separación a la que pueden conectarse las líneas de conexión y elegirse selectivamente, lo que puede permitir la comunicación de fluido entre la línea seleccionada y la salida de la unidad de separación. Una válvula de selección de fluido también puede ser una válvula que proporciona la introducción de líquido en una línea de conexión. Una válvula de selección de fluido también puede ser el extremo de una línea de conexión.

Una “válvula de selección de disolvente” es una válvula de selección de fluido que permite una comunicación de fluido selectivamente entre cualquier depósito de disolvente conectado y la parte del sistema. Una válvula de selección de disolvente es, por ejemplo, la válvula antes de la bomba de disolvente a la que pueden conectarse las líneas de conexión desde los depósitos de disolvente y elegirse selectivamente, lo que puede permitir la comunicación de fluido entre el disolvente seleccionado y la bomba.

Una “válvula de selección de fluido” y una “válvula de selección de disolvente” pueden ser de tipo idéntico o de tipo diferente.

Un sistema de suministro de disolvente es un sistema que permite el suministro de líquido. Normalmente, el sistema de suministro de disolvente de un aparato comprende al menos un depósito y al menos una bomba para transportar el líquido desde el depósito hasta otra parte del aparato que está en conexión de líquido con el depósito. Un experto en la técnica conoce que cada vez que se transfiere líquido desde un depósito hasta una unidad de separación, esto se realiza con la ayuda de una bomba. Las bombas también pueden usarse para mezclar dos o más corrientes de líquido que proceden de dos o más depósitos.

El término “alimentación” se refiere a un líquido que contiene dos o más compuestos que van a separarse. En este contexto, el término “compuesto” se usa en un sentido amplio para cualquier entidad tal como una molécula, compuesto químico, célula etc. Normalmente, la alimentación es la muestra que contiene la molécula diana.

El término “avance” significa el punto de tiempo durante la adición de la alimentación a una matriz de cromatografía o unidad de separación tal como una columna de cromatografía empaquetada cuando el compuesto que está adsorbido sobre la matriz aparece por primera vez en el flujo de salida. En otras palabras, el “avance” es el punto de tiempo cuando comienza la pérdida de compuesto diana.

El término “regeneración” significa en el presente documento un procedimiento de tratamiento de una matriz de cromatografía para hacerla útil de nuevo en cromatografía. Por tanto, “regeneración” incluirá la liberación de compuestos unidos, también conocida como elución de compuestos, así como reequilibrado con el tampón de adsorción apropiado. Tal como se comentará a continuación, la “regeneración” también puede incluir limpieza en el lugar (CIP). El término “programación de flujo” significa un cambio deliberado en la velocidad de flujo de alimentación durante la aplicación de la alimentación a una columna de cromatografía.

El término “captura” significa, en el contexto de un método de cromatografía, la primera etapa de la cromatografía, en la que se captura una gran cantidad de compuesto diana.

“Unión completa” significa el momento cuando una matriz de cromatografía, por ejemplo en una columna de cromatografía empaquetada, ha adsorbido tanto de un compuesto diana que ya no puede adsorber más en las condiciones dadas. Normalmente, la unión completa se alcanza cuando una matriz ha adsorbido más del 60% de su capacidad original estimada durante mediciones correspondientes de capacidad de unión estática.

Tiempo de carga significa el tiempo requerido para saturar un adsorbente tal como una columna de cromatografía empaquetada hasta su estado de “unión completa”.

El término “diámetro de tamaño de partícula promedio” o d50 significa el valor de distribución de tamaño de partícula promedio al 50% de la distribución de tamaño de partícula acumulada.

El término “tamaño de poro promedio” significa el valor de distribución de tamaño de poro promedio al 50% de la distribución de tamaño de poro acumulada.

Los términos “clarificar”, “clarificación” y “etapa de clarificación”, tal como se usan en el presente documento, se refieren a una etapa del procedimiento para eliminar coloides y/o partículas suspendidas, reduciendo de ese modo la turbidez, de una disolución que contiene molécula diana, tal como se mide en NTU (unidades de turbidez nefelométrica). La clarificación puede lograrse mediante una variedad de medios, incluyendo centrifugación, sedimentación o filtración. La centrifugación podría realizarse de un modo discontinuo o continuo, mientras que la filtración podría realizarse de un modo en flujo normal (por ejemplo filtración en profundidad) o flujo tangencial. En procedimientos usados en la industria hoy en día, la centrifugación va seguida normalmente por filtros de profundidad destinados a eliminar impurezas insolubles, que pueden no haberse eliminado mediante centrifugación. Además, pueden usarse métodos para potenciar la eficiencia de clarificación, por ejemplo precipitación. La precipitación de impurezas puede realizarse por diversos medios tales como mediante floculación, ajuste del pH (precipitación con ácido), cambios de temperatura, cambio de fase debido a moléculas pequeñas o polímeros sensibles a estímulos, o cualquier combinación de estos métodos. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, la clarificación implica cualquier combinación de dos o más de centrifugación, filtración, filtración en profundidad y precipitación. En algunas realizaciones, los procedimientos y sistemas descritos en el presente documento obvian la necesidad de centrifugación.

El término “precipitar”, “que precipita” o “precipitación” tal como se usa en el presente documento, se refiere a un procedimiento usado en la clarificación, en el que las propiedades de las impurezas no deseadas se modifican de manera que pueden separarse más fácilmente de la molécula diana soluble, por ejemplo provocando la precipitación de un compuesto desde un estado soluble hasta un estado no soluble o aglutinando y/o agregando partículas finas a partir de una disolución de modo que su sedimentación y/o filtración y/o centrifugación se mejoran y por tanto se alcanza una reducción de la turbidez. Esto se logra normalmente formando complejos insolubles y/o partículas agregadas grandes que contienen las impurezas no deseadas. Estas partículas tienen propiedades (por ejemplo densidad o tamaño) tales que pueden separarse más fácilmente de la fase líquida que contiene la molécula diana soluble, tal como mediante filtración o centrifugación. En algunos casos, se efectúa un cambio de fase, de manera que las impurezas no deseadas pueden separarse más fácilmente de la molécula diana soluble. La precipitación mediante cambio de fase puede efectuarse mediante la adición de un agente de precipitación, tal como un polímero o una molécula pequeña. En una realización particular, el precipitante es un polímero sensible a estímulos, también denominado polímero inteligente. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, el precipitante o agente de precipitación es un floculante. La floculación, tal como se usa en el presente documento, es un modo de realizar la precipitación en donde el rendimiento depende normalmente de la concentración de floculante usada (“dependiente de la dosis”). Agentes de floculación típicos son polielectrolitos, tales como policationes, que se complejan con impurezas de carga opuesta.

En algunas realizaciones descritas en el presente documento, la clarificación emplea la adición de un precipitante a una muestra que contiene una molécula diana y una o más impurezas. En algunos casos, puede usarse un cambio en las condiciones de la disolución (tales como temperatura, pH, salinidad) para iniciar la precipitación, tal como en el caso de polímeros sensibles a estímulos. El material precipitado, que contiene la una o más impurezas así como el agente de precipitación, se eliminan de ese modo recuperando la molécula diana en la fase líquida, donde el líquido se somete entonces a etapas adicionales del procedimiento con el fin de purificar adicionalmente la molécula diana.

La precipitación puede realizarse directamente en un biorreactor que contiene un cultivo celular que expresa una molécula diana que va a purificarse, donde se añade un precipitante directamente al biorreactor. Alternativamente, el precipitante puede añadirse al cultivo celular, que normalmente contiene la molécula diana, en un recipiente diferenciado.

Existen muchos modos conocidos por los expertos en la técnica de eliminar el material precipitado, tal como centrifugación, filtración o sedimentación o cualquier combinación de los mismos.

El término “sedimentación”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un procedimiento de sedimentación en el que el material precipitado migra a la parte inferior de un recipiente bajo la influencia de fuerzas gravitacionales. La sedimentación puede ir seguida de decantación y/o filtración de la fase líquida o sobrenadante.

El término “estímulo” o “estímulos”, tal como se usan de manera intercambiable en el presente documento, pretende referirse a un cambio físico o químico en el entorno que da como resultado una respuesta por un polímero sensible a estímulos. Por consiguiente, tales polímeros son sensibles a un estímulo, estímulo que da como resultado un cambio en la solubilidad del polímero. Los ejemplos de estímulos a los que uno o más polímeros usados en el presente documento son sensibles incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, cambios en la temperatura, cambios en la conductividad y/o cambios en el pH. En algunas realizaciones, un estímulo comprende la adición de un agente complejante o una sal formadora de complejo a una muestra. En diversas realizaciones, se añade generalmente un estímulo después de la adición de un polímero a una muestra. Sin embargo, el estímulo también puede añadirse durante o antes de la adición de un polímero a una muestra.

El término “polímero sensible a estímulos”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un polímero o copolímero que presenta un cambio en una propiedad física y/o química después de la adición de un estímulo. Una respuesta típica a un estímulo es un cambio en la solubilidad del polímero. Por ejemplo, el polímero poli(N-isopropilacrilamida) es soluble en agua a temperaturas por debajo de aproximadamente 35°C, pero se vuelve insoluble en agua a temperaturas de aproximadamente 35°C. En una realización particular, un polímero sensible a estímulos es un polímero de polialilamina o de polivinilamina que es sensible a un estímulo de ion monovalente (por ejemplo, estímulo de fosfato).

En algunas realizaciones, se somete un cultivo celular a un filtro de profundidad para eliminar una o más impurezas. Los términos “filtro de profundidad” o “filtración en profundidad” tal como se usan en el presente documento se refieren a un filtro que es capaz de retener materia particulada en todo el medio de filtro, en vez de justo sobre la superficie del filtro. En algunas realizaciones descritas en el presente documento, se usan uno o más filtros de profundidad en la etapa del procedimiento de clarificación.

En algunas realizaciones, la clarificación da como resultado la eliminación de impurezas solubles y/o insolubles en una muestra, que posteriormente pueden dar como resultado el ensuciamiento de un filtro o dispositivo usado en una etapa de procedimiento en un procedimiento de purificación, haciendo de ese modo que el procedimiento de purificación global sea más económico.

Los términos “procedimiento de flujo continuo”, “modo de flujo continuo” y “funcionamiento de flujo continuo”, tal como se usan de manera intercambiable en el presente documento, se refieren a una técnica de separación en la que al menos una molécula diana (por ejemplo, un anticuerpo o una proteína que contiene una región Fc) contenida en una preparación biofarmacéutica junto con una o más impurezas se pretende que fluya a través de un material, que habitualmente se une a la una o más impurezas, en donde la molécula diana habitualmente no se une (es decir, fluye a su través).

Los términos “modo de unión y elución” y “procedimiento de unión y elución”, tal como se usan en el presente documento, se refieren a una técnica de separación en la que al menos una molécula diana contenida en una muestra (por ejemplo, una proteína que contiene una región Fc) se une a un medio o resina adecuado (por ejemplo, un medio de cromatografía de afinidad o un medio de cromatografía de intercambio catiónico) y posteriormente se eluye.

Descripción detallada de la invención

La presente invención, por primera vez, proporciona un método para un procedimiento de cromatografía continua que permite mantener una alta capacidad de unión con un tiempo de residencia bajo.

Por tanto, no solo es una tecnología de purificación (captura) rápida, sino también económica, aumentando habitualmente la productividad de la etapa mencionada en un factor de > 2. En esta nueva metodología innovadora, la productividad (g de (molécula diana) / ml de (lecho empaquetado) / h (tiempo de producción) está habitualmente en el intervalo de 6-10 mayor que en el procedimiento discontinuo.

Método

El método según la presente invención se basa en la combinación de un cierto tipo de matriz de cromatografía con un cierto tipo de procedimiento de cromatografía continua.

La matriz de cromatografía que va a usarse en el método según la presente invención es un sorbente particulado. El tamaño de partícula promedio (d50) del sorbente es de entre 30 y 200 |jm. Los poros tienen un tamaño de poro promedio de entre 40 nm y 300 nm.

En una realización preferida, el tamaño promedio de las partículas es de entre 40 y 120 jm, más preferiblemente entre 55 y 100 jm. En otra realización preferida, las partículas tienen poros de tamaño de poro promedio en el intervalo de entre 50 y 150 nm, lo más preferido entre 60 y 100 nm.

Los valores de tamaño de poro promedio y valores de tamaño de partícula promedio se definen como el valor donde la mitad de la población se encuentra por encima de este punto, y la mitad se encuentra por debajo de este punto. Para distribuciones de tamaño de partícula, el tamaño de poro promedio se denomina el d50.

El d50 es el tamaño en micrómetros que divide la distribución con la mitad por encima y la mitad por debajo de este diámetro. D50 corresponde al 50% de la distribución de tamaño acumulada.

Los métodos convencionales para la estimación del tamaño de partícula pueden ser obtención de imágenes y análisis de imágenes, tecnologías de dispersión de luz, tecnologías de tamizado, técnicas de sedimentación, tecnologías de espectroscopía acústica y otras. (K.K. Unger et al. “Particled packed columns and monolithic columns in highperformance liquid chromatography - comparison and critical appraisal” J. Chrom. A. 1184 (2008) 393 - 415). El método de caracterización usado para la estimación del valor de diámetro de partícula promedio fue dispersión de luz. Según la presente invención, se usa difracción láser para partículas con diámetros de hasta 30 nm y se usa detección óptica de una sola partícula (SPOS) para partículas con diámetros de entre 0,5 nm - 400 nm.

El tamaño de poro puede medirse mediante las tecnologías de cromatografía de exclusión molecular inversa, intrusión de mercurio, adsorción de gas, etc. (M. Thommes et al., “Textural characterization of native and n-alky-bonded silica monoliths by mercury intrusion/extrusion, inverse size exclusion chromatography and nitrogen sorption”, J. Chrom. A, 2008).

El volumen de poro puede estimarse mediante los mismos métodos usados para la estimación del tamaño de poro. Según la presente invención, para la estimación del tamaño de poro promedio y la estimación del volumen de poro promedio, se usa cromatografía de exclusión molecular inversa para matrices que no pueden medirse en el estado seco ya que sus propiedades físicas cambian cuando las matrices se secan. Para matrices que pueden medirse en el estado seco, se usan métodos de adsorción de nitrógeno.

Las partículas pueden tener una forma regular o irregular. Pueden estar hechas de cualquier material adecuado como sorbente cromatográfico, como polisacáridos (tales como agarosa y celulosa); y otras matrices mecánicamente estables tales como sílice (por ejemplo vidrio de poro controlado), poli(estirendivinil)benceno, poliacrilamida, polimetacrilatos, partículas cerámicas o copolímeros de alquil vinil éteres sustituidos hidrofílicamente como monovinil éter de 1,2-etanodiol, monovinil éter de 1,3-propanodiol, monovinil éter de 1,4-butanodiol, monovinil éter de 1,5-pentanodiol, monovinil éter de 1,6-hexanodiol, monovinil éter de dietilenglicol o monovinil éter de ciclohexanodimetanol y agentes de reticulación como diviniletilenurea (1,3-divinilimidazolin-2-ona) o divinilpropilenurea (1,3-diviniltetrahidropirimidin-2-ona) y derivados de cualquiera de los anteriores. Ejemplos de copolímeros de alquil vinil éteres sustituidos hidrofílicamente se dan a conocer en el documento EP 1910433. Se prefieren materiales que muestran una alta rigidez de modo que puedan aplicarse velocidades por encima de 1000 cm/h.

Puesto que el método según la presente invención se basa preferiblemente en cromatografía de afinidad o de intercambio iónico, las partículas que van a usarse como matriz de cromatografía normalmente portan ligandos de afinidad como proteína A o una variante funcional de la misma o ligandos de intercambio iónico.

El método según la presente invención se basa en el uso de al menos tres unidades de separación que tienen la misma matriz de cromatografía que están conectadas de modo que puede fluir líquido al menos desde una unidad de separación hasta la posterior y desde la última hasta la primera unidad de separación. Eso significa que todas las unidades de separación del sistema están conectadas en un círculo (figura 1).

El método comprende las etapas de:

a) proporcionar al menos tres unidades de separación que tienen la misma matriz, preferiblemente una matriz de cromatografía de afinidad o de intercambio iónico, que están conectadas de modo que puede fluir líquido desde una unidad de separación hasta la siguiente y desde la última hasta la primera unidad de separación;

b) alimentar la muestra en una primera unidad de separación de modo que, mientras la muestra se carga en esta unidad de separación en la que la muestra está a un pH y conductividad que permiten que las moléculas diana se unan a esta unidad de separación, dicha unidad de separación está al menos parte del tiempo de carga en comunicación de fluido con la siguiente unidad de separación, de modo que las moléculas diana no unidas a dicha primera unidad de separación pueden unirse a la siguiente unidad de separación (figura 2a), al mismo tiempo al menos eluir (figura 2c) y reequilibrar (figura 2e) una unidad de separación diferente de la unidad de separación que se carga y de la que está en comunicación de fluido con la unidad de separación que se carga. Eso significa que las otras etapas del procedimiento como lavar, eluir y reequilibrar que son necesarias en un procedimiento de separación cromatográfica se realizan en una o más de esas unidades de separación que no están en comunicación de fluido con la unidad o unidades de separación que están cargándose.

c) Cambiar la alimentación a la siguiente unidad de separación. Esto significa que, cuando la unidad de separación que se acaba de cargar está completamente cargada, la alimentación de la muestra a esta unidad de separación se detiene y, manipulando simultáneamente las válvulas del sistema, se dirige sin interrupción a la unidad de separación que está a continuación en el círculo (figura 3b). La unidad de separación que está a continuación en el círculo es la que estaba antes al menos parte del tiempo de carga conectada a la salida de la unidad de separación que se ha cargado. En consecuencia, esta unidad de separación ya está parcialmente cargada con las moléculas diana que no se han unido a la primera unidad de separación.

d) Alimentar la muestra en la siguiente unidad de separación de modo que, mientras la muestra se carga en dicha siguiente unidad de separación en la que la muestra está a un pH y conductividad que permiten que las moléculas diana se unan a dicha siguiente unidad de separación, dicha siguiente unidad de separación está al menos parte del tiempo de carga en comunicación de fluido con la unidad de separación después de la siguiente, de modo que las moléculas diana no unidas a dicha siguiente unidad de separación pueden unirse a la unidad de separación después de la siguiente, al mismo tiempo al menos eluir y reequilibrar una unidad de separación diferente de la unidad de separación que se carga y de la que está en comunicación de fluido con la unidad de separación que se carga

e) repetir las etapas c) y d) una o más veces.

Durante el tiempo en que se realiza el método continuo según la presente invención, la alimentación nunca se detiene y tiene una velocidad por encima de 800 cm/h. Preferiblemente, tiene una velocidad por encima de 1000 cm/h.

Y la matriz de cromatografía de las unidades de separación comprende partículas con un diámetro de partícula promedio de entre 30 y 200 |jm con diámetros de poro promedio en el intervalo entre 40 nm y 300 nm.

En una realización preferida, puede realizarse una etapa de lavado adicional (figura 2b) para lavar los contaminantes de la unidad de separación.

En una realización preferida, el lavado se realiza en dos o más etapas con dos o más tampones de lavado diferentes. Por ejemplo, puede usarse una primera etapa de lavado con un primer tampón de lavado para lavar una molécula diana no unida o débilmente unida de la unidad de separación (figura 2a) y puede usarse una segunda etapa de lavado usando un segundo tampón de lavado para lavar los contaminantes de la unidad de separación (figura 2b).

En una realización preferida, la disolución que contiene molécula diana no unida o débilmente unida, habitualmente durante la fase de lavado, puede redirigirse a la disolución de materia prima o a una salida específica.

En una realización preferida, la disolución que contiene molécula diana no unida o débilmente unida, habitualmente durante la fase de lavado, puede redirigirse a otra unidad de separación.

En otra realización preferida, la limpieza en el lugar se realiza (figura 2d) después de la elución de la molécula diana unida y antes de las etapas de reequilibrado.

En otra realización preferida, un único sistema de suministro de disolvente puede ser específico para el suministro de la alimentación (figura 4).

En una realización preferida, la unidad de separación que se carga con la molécula diana se carga hasta el máximo en las condiciones dadas, lo que significa que se carga hasta la unión completa.

En una realización de la presente invención, la unidad de separación que se carga con la molécula diana está a lo largo de todo el tiempo de carga en comunicación de fluido con otra unidad de separación.

En otra realización, la unidad de separación que se carga está solo parte del tiempo de carga en comunicación de fluido con otra unidad de separación. En una realización preferida, dichas dos unidades de separación están solo en comunicación de fluido durante la totalidad o partes de la segunda mitad del tiempo de carga. Esto se debe al hecho de que, cuando comienza la carga, normalmente todas las moléculas diana se unen a la unidad de separación que se carga. Solo cuando esta unidad de separación está ya parcialmente cargada, podría suceder que las moléculas diana no se unan y pasen a través de la unidad de separación. En la cromatografía discontinua, normalmente, la carga se detiene cuando demasiadas moléculas diana comienzan a pasar a través de la unidad de separación. En el método según la presente invención, al menos durante esta última fase de carga cuando las moléculas diana comienzan a pasar a través de la unidad de separación sin unirse, la salida de dicha unidad de separación se conecta con la entrada de otra unidad de separación de modo que la molécula diana que no se ha unido a la primera unidad de separación se une a la segunda. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente cuándo, durante la carga, la cantidad de molécula diana que no se une a la unidad de separación que se carga es tan alta que es necesario conectar la salida de dicha unidad de separación con la entrada de otra unidad de separación.

En una realización, la salida de la unidad de separación o las unidades de separación que se lavan están en comunicación de líquido con la entrada de otra unidad de separación de modo que las moléculas diana eliminadas por dicho lavado no se pierden sino que se cargan en la otra unidad de separación. Este enfoque es especialmente adecuado cuando el sistema comprende 4 o más unidades de separación.

En una realización, la salida de la unidad de separación o las unidades de separación que se lavan está en una comunicación de líquido con la unidad de separación previa de modo que las moléculas diana eliminadas por dicho lavado no se pierden sino que se cargan en la unidad de separación previa.

En una realización, tal método comprende

a) proporcionar al menos cuatro unidades de separación que tienen la misma matriz de cromatografía afinidad o de intercambio iónico que están conectadas de modo que puede fluir líquido desde una unidad de separación hasta la siguiente y desde la última hasta la primera unidad de separación;

b) alimentar la muestra en una primera unidad de separación de modo que, mientras la muestra se carga en esta unidad de separación en la que la muestra está a un pH y conductividad que permiten que las moléculas diana se unan a esta unidad de separación, dicha unidad de separación está al menos parte del tiempo de carga en comunicación de fluido con la siguiente unidad de separación, de modo que las moléculas diana no unidas a dicha primera unidad de separación pueden unirse a la siguiente unidad de separación (figura 5a), al mismo tiempo al menos lavar una unidad de separación que está en una comunicación de líquido con la unidad de separación previa de modo que las moléculas diana eliminadas por dicho lavado no se pierden sino que se cargan en la unidad de separación previa (figura 6a). Entonces, eluir secuencialmente (figura 6c) y reequilibrar (figura 6e) una unidad de separación diferente de la unidad de separación que se carga y de la que está en comunicación de fluido con la unidad de separación que se carga. Eso significa que las otras etapas del procedimiento como lavar, eluir y reequilibrar que son necesarias en un procedimiento de separación cromatográfica se realizan en una o más de esas unidades de separación que no están en comunicación de fluido con la unidad o unidades de separación que están cargándose.

c) Cambiar la alimentación a la siguiente unidad de separación. Eso significa que, cuando la unidad de separación que se acaba de cargar está completamente cargada, la alimentación de la muestra a esta unidad de separación se detiene y, manipulando simultáneamente las válvulas del sistema, se dirige sin interrupción a la unidad de separación que está a continuación en el círculo (figura 5b). La unidad de separación que está a continuación en el círculo es la que estaba antes al menos parte del tiempo de carga conectada a la salida de la unidad de separación que se ha cargado. En consecuencia, esta unidad de separación ya está parcialmente cargada con las moléculas diana que no se han unido a la primera unidad de separación.

d) Alimentar la muestra en la siguiente unidad de separación de modo que, mientras la muestra se carga en dicha siguiente unidad de separación en la que la muestra está a un pH y conductividad que permiten que las moléculas diana se unan a dicha siguiente unidad de separación, dicha siguiente unidad de separación está al menos parte del tiempo de carga en comunicación de fluido con la unidad de separación después de la siguiente, de modo que las moléculas diana no unidas a dicha primera unidad de separación pueden unirse a la unidad de separación después de la siguiente (figura 6b), al mismo tiempo al menos lavar una unidad de separación que está en una comunicación de líquido con la unidad de separación previa de modo que las moléculas diana eliminadas por dicho lavado no se pierden sino que se cargan en la unidad de separación previa. Entonces, secuencialmente eluir y reequilibrar una unidad de separación diferente de la unidad de separación que se carga y de la que está en comunicación de fluido con la unidad de separación que se carga. Eso significa que las otras etapas del procedimiento como lavar, eluir y reequilibrar que son necesarias en un procedimiento de separación cromatográfica se realizan en una o más de esas unidades de separación que no están en comunicación de fluido con la unidad o unidades de separación que están cargándose.

e) Repetir las etapas c) y d) una o más veces,

El procedimiento descrito anteriormente en las etapas b) a e) e ilustrado en la figura 6 puede realizarse también conectando tres unidades de separación para la carga. Esto significa que, si por ejemplo se carga la unidad de separación 1, está en comunicación de fluido con la unidad de separación 2 y la unidad de separación 3 está en comunicación de fluido con la unidad de separación 2 pero las unidades de separación 1, 2 y 3 no están durante este tiempo en comunicación de fluido con la unidad de separación 4. Cuando las unidades de separación 1, 2 y 3 están en comunicación de fluido y se cargan, la unidad de separación 4 está normalmente en un modo de espera. Un experto en la técnica puede decidir, basándose en los parámetros específicos del procedimiento, parámetros como tipo de matriz, tipo de muestra, velocidad de flujo, etc., si es favorable conectar tres unidades de separación para la carga o solo dos.

La figura 1 muestra esquemáticamente los tres sistemas de unidad de separación, adecuados para el método de cromatografía continua descrito a continuación. El sistema tiene sistemas de suministro de disolvente (al menos dos tal como se indica en la figura 4), tres unidades de separación, canales de comunicación de fluido entre los sistemas de suministro de disolvente y las unidades de separación, entradas y salidas de las unidades de separación, válvulas de conmutación para redirigir el flujo de disolvente hasta la unidad de separación y desde la unidad de separación.

Opcionalmente, la figura 1 muestra válvulas de selección de disolvente antes de los sistemas de suministro de disolvente para seleccionar el disolvente necesario para la etapa o subetapa del procedimiento requerida. Un experto en la técnica puede decidir, basándose en los parámetros específicos del procedimiento, como el tipo de los sistemas de suministro de disolvente, las unidades de separación y los medios para controlar el flujo de disolvente, etc. basándose en la aplicación seleccionada y los requisitos de la misma.

Las figuras 2a-e muestran esquemáticamente las etapas del método según la presente invención con un sistema de tres columnas. En la figura 2a, la alimentación se ha cambiado a la entrada de la unidad de separación 1, fluye a través de la unidad de separación 1, mediante lo cual al menos parte de las moléculas diana se unen a la unidad de separación 1.

La salida de la unidad de separación 1 está en comunicación de líquido con la entrada de la unidad de separación 2 de modo que todas las partes de la alimentación que no se han unido a la unidad de separación 1 pasan adicionalmente a través de la unidad de separación 2. Esto permite que las moléculas diana que no se han unido a la unidad de separación 1 se unan a la unidad de separación 2. La salida de la unidad de separación 2 está conectada a los desechos. Mientras se cargan las unidades de separación 1 y 2, la unidad de separación 3 que se ha cargado antes, por ejemplo, se lava (figura 2a y figura 2b), se eluye (figura 2c), se somete a limpieza en el lugar (figura 2d) y reequilibrado (figura 2e) y todas las demás etapas del procedimiento que podrían ser necesarias y son diferentes de la carga. La salida de la unidad de separación 3 puede estar conectada a un tanque de recogida o a otra unidad donde la molécula diana débilmente unida o no unida eliminada por dicho lavado se procesa adicionalmente (figura 2a). Siempre que la molécula diana se eluya de la unidad de separación 3, la salida de la unidad de separación 3 está conectada a un tanque de recogida de molécula diana (indicado con “producto” en la figura 2c) o a otra unidad donde la molécula diana se procesa adicionalmente (no mostrado en la figura 2c). Para otras etapas del procedimiento, la salida de la unidad de separación 3 está conectada a una de las salidas tal como se muestra en la figura 2b, figura 2d y figura 2e.

Opcionalmente, las etapas de limpieza en el lugar y reequilibrado en la unidad de separación 3 pueden realizarse en un modo de flujo inverso tal como se muestra en la figura 2d y la figura 2e.

En una etapa posterior que se muestra en

figura 3b, la alimentación se cambia a la entrada de la unidad de separación 2 y fluye a través de la unidad de separación 2, mediante lo cual al menos parte de las moléculas diana se unen a la unidad de separación 2. La salida de la unidad de separación 2 está en comunicación de líquido con la entrada de la unidad de separación 3 de modo que todas las partes de la alimentación que no se han unido a la unidad de separación 2 pasan adicionalmente a través de la unidad de separación 3. Esto permite que las moléculas diana que no se han unido a la unidad de separación 2 se unan a la unidad de separación 3. La salida de la unidad de separación 3 está conectada a los desechos. Mientras se cargan las unidades de separación 2 y 3, la unidad de separación 1 que se ha cargado antes, por ejemplo, se lava, se eluye, se somete a limpieza en el lugar y reequlibrado y todas las demás etapas del procedimiento que podrían ser necesarias y son diferentes de la carga. La salida de la unidad de separación 1 puede estar conectada a un tanque de recogida o a otra unidad donde la molécula diana débilmente unida o no unida eliminada por dicho lavado se procesa adicionalmente. Siempre que la molécula diana se eluya de la unidad de separación 1, la salida de la unidad de separación 1 está conectada a un tanque de recogida de molécula diana o a otra unidad donde la molécula diana se procesa adicionalmente. Para otras etapas del procedimiento, la salida de la unidad de separación 1 está conectada a una de las salidas. Opcionalmente, las etapas de limpieza en el lugar y reequilibrado en la unidad de separación 1 pueden realizarse de un modo de flujo inverso.

En una etapa posterior que se muestra en

figura 3c, la alimentación se cambia a la entrada de la unidad de separación 3 y fluye a través de la unidad de separación 3, mediante lo cual al menos parte de las moléculas diana se unen a la unidad de separación 3. La salida de la unidad de separación 3 está en comunicación de líquido con la entrada de la unidad de separación 1 de modo que todas las partes de la alimentación que no se han unido a la unidad de separación 3 pasan adicionalmente a través de la unidad de separación 1. Esto permite que las moléculas diana que no se han unido a la unidad de separación 3 se unan a la unidad de separación 1. La salida de la unidad de separación 1 está conectada a los desechos. Mientras se cargan las unidades de separación 3 y 1, la unidad de separación 2 que se ha cargado antes, por ejemplo, se lava, se eluye, se somete a limpieza en el lugar y reequilibrado y todas las demás etapas del procedimiento que podrían ser necesarias y son diferentes de la carga. La salida de la unidad de separación 2 puede estar conectada a un tanque de recogida o a otra unidad donde la molécula diana débilmente unida o no unida eliminada por dicho lavado se procesa adicionalmente. Siempre que la molécula diana se eluya de la unidad de separación 2, la salida de la unidad de separación 2 está conectada a un tanque de recogida de molécula diana o a otra unidad donde la molécula diana se procesa adicionalmente. Para otras etapas del procedimiento, la salida de la unidad de separación 2 está conectada a una de las salidas. Opcionalmente, las etapas de limpieza en el lugar y reequilibrado en la unidad de separación 2 pueden realizarse en un modo de flujo inverso.

En la siguiente etapa, la alimentación se cambia de nuevo a la unidad de separación 1 (figura 3a) y se realiza de nuevo la etapa del procedimiento tal como se describe en las figuras 2a-e. Normalmente, las etapas del procedimiento se realizan más de dos veces.

Tal como puede observarse a partir de la descripción del procedimiento mostrado en las figuras 2a-e y las figuras 3 a-c, la alimentación nunca se detiene y en cada etapa del procedimiento (se muestra una etapa del procedimiento en la figura 2a-e), se eluye la molécula diana de al menos una unidad de separación.

En otra realización de la presente invención, el líquido de lavado que se usa para lavar la unidad de separación cargada para eliminar moléculas diana no unidas o débilmente unidas, cuando se eluye de la unidad de separación cargada, no se dirige a la salida seleccionada del sistema sino a la entrada de otra unidad de separación. Esto garantiza que las moléculas diana que podrían eluirse de la unidad de separación cargada durante el lavado no vayan a la salida sino que se unen en otra unidad de separación.

Las figuras 6a-e muestran esquemáticamente las etapas del método según la presente invención con un sistema de cuatro columnas. En la figura 6a, la alimentación se ha cambiado a la entrada de la unidad de separación 1, fluye a través de la unidad de separación 1, mediante lo cual al menos parte de las moléculas diana se unen a la unidad de separación 1. La salida de la unidad de separación 1 está en comunicación de líquido con la entrada de la unidad de separación 2 de modo que todas las partes de la alimentación que no se han unido a la unidad de separación 1 pasan adicionalmente a través de la unidad de separación 2. Esto permite que las moléculas diana que no se han unido a la unidad de separación 1 se unan a la unidad de separación 2. La salida de la unidad de separación 2 está conectada a los desechos. Mientras se cargan las unidades de separación 1 y 2, la unidad de separación 4 que se ha cargado antes, por ejemplo, se lava (figura 6a y figura 6b), se eluye (figura 6c), se somete a limpieza en el lugar (figura 6d) y reequilibrado (figura 6e) y todas las demás etapas del procedimiento que podrían ser necesarias y son diferentes de la carga. Durante la fase de lavado o una parte de la fase de lavado de la unidad de separación 4, la salida de la unidad de separación 4 está en comunicación de fluido con la unidad de separación 3 donde la molécula diana débilmente unida o no unida eliminada por dicho lavado, y no unida a la unidad de separación 4, pasa adicionalmente a través de la unidad de separación 3. Esto permite que las moléculas diana que no se han unido a la unidad de separación 4 se unan a la unidad de separación 3 (figura 6a). Adicionalmente, la salida de la unidad de separación 4 puede estar en comunicación de fluido con la entrada de la unidad de separación 3 (no mostrado en la figura 6a) o con la salida de la unidad de separación 3 (figura 6a). Además, la unidad de separación 3 puede estar en comunicación de fluido con la unidad de separación 2 (figura 6b-e). Siempre que la molécula diana se eluya de la unidad de separación 4, la salida de la unidad de separación 4 está conectada a un tanque de recogida de molécula diana (indicado con “producto” en la figura 6c) u otra unidad donde la molécula diana se procesa adicionalmente (no mostrado en la figura 6c). Para otras etapas del procedimiento, la salida de la unidad de separación 4 está conectada a una de las salidas tal como se muestra en la figura 6b, figura 6d y figura 6e. Opcionalmente, las etapas de limpieza en el lugar y reequilibrado en la unidad de separación 4 pueden realizarse en un modo de flujo inverso tal como se muestra en la figura 4d y la figura 4e.

En una etapa posterior que se muestra en la figura 5b, la alimentación se ha cambiado a la entrada de la unidad de separación 2, fluye a través de la unidad de separación 2, mediante lo cual al menos parte de las moléculas diana se unen a la unidad de separación 2. La salida de la unidad de separación 2 está en comunicación de líquido con la entrada de la unidad de separación 3 de modo que todas las partes de la alimentación que no se han unido a la unidad de separación 2 pasan adicionalmente a través de la unidad de separación 3. Esto permite que las moléculas diana que no se han unido a la unidad de separación 2 se unan a la unidad de separación 3. La salida de la unidad de separación 3 está conectada a los desechos. Mientras se cargan las unidades de separación 2 y 3, la unidad de separación 1 que se ha cargado antes, por ejemplo, se lava, se eluye, se somete a limpieza en el sitio y reequilibrado y todas las demás etapas del procedimiento que podrían ser necesarias y son diferentes de la carga. Durante la fase de lavado o una parte de la fase de lavado de la unidad de separación 1, la salida de la unidad de separación 1 está en comunicación de fluido con la unidad de separación 4 donde la molécula diana débilmente unida o no unida eliminada por dicho lavado, y no unida a la unidad de separación 1, pasa adicionalmente a través de la unidad de separación 4. Esto permite que las moléculas diana que no se han unido a la unidad de separación 1 se unan a la unidad de separación 4. Adicionalmente, la salida de la unidad de separación 1 puede estar en comunicación de fluido con la entrada de la unidad de separación 4 o con la salida de la unidad de separación 4. Además, la unidad de separación 4 puede estar en comunicación de fluido con la unidad de separación 3. Siempre que la molécula diana se eluya de la unidad de separación 1, la salida de la unidad de separación 1 está conectada a un tanque de recogida de molécula diana o a otra unidad donde la molécula diana se procesa adicionalmente. Para otras etapas del procedimiento, la salida de la unidad de separación 1 está conectada a una de las salidas. Opcionalmente, las etapas de limpieza en el lugar y reequilibrado en la unidad de separación 1 pueden realizarse como un modo de flujo inverso.

En una etapa posterior que se muestra en la figura 5c, la alimentación se ha cambiado a la entrada de la unidad de separación 3, fluye a través de la unidad de separación 3, mediante lo cual al menos parte de las moléculas diana se unen a la unidad de separación 3. La salida de la unidad de separación 3 está en comunicación de líquido con la entrada de la unidad de separación 4 de modo que todas las partes de la alimentación que no se han unido a la unidad de separación 3 pasan adicionalmente a través de la unidad de separación 4. Esto permite que las moléculas diana que no se han unido a la unidad de separación 3 se unan a la unidad de separación 4. La salida de la unidad de separación 4 está conectada a los desechos. Mientras se cargan las unidades de separación 3 y 4, la unidad de separación 2 que se ha cargado antes, por ejemplo, se lava, se eluye, se somete a limpieza en el lugar y reequilibrado y todas las demás etapas del procedimiento que podrían ser necesarias y son diferentes de la carga. Durante la fase de lavado o una parte de la fase de lavado de la unidad de separación 2, la salida de la unidad de separación 2 está en comunicación de fluido con la unidad de separación 1 donde la molécula diana débilmente unida o no unida eliminada por dicho lavado, y no unida a la unidad de separación 2, pasa adicionalmente a través de la unidad de separación 1. Esto permite que las moléculas diana que no se han unido a la unidad de separación 2 se unan a la unidad de separación 1. Adicionalmente, la salida de la unidad de separación 2 puede estar en comunicación de fluido con la entrada de la unidad de separación 1 o con la salida de la unidad de separación 1. Además, la unidad de separación 1 puede estar en comunicación de fluido con la unidad de separación 4. Siempre que la molécula diana se eluya de la unidad de separación 2, la salida de la unidad de separación 2 está conectada a un tanque de recogida de molécula diana o a otra unidad donde la molécula diana se procesa adicionalmente. Para otras etapas del procedimiento, la salida de la unidad de separación 2 está conectada a una de las salidas. Opcionalmente, las etapas de limpieza en el lugar y reequilibrado en la unidad de separación 2 pueden realizarse en a modo de flujo inverso.

En una etapa posterior que se muestra en la figura 5d, la alimentación se ha cambiado a la entrada de la unidad de separación 4, fluye a través de la unidad de separación 4, mediante lo cual al menos parte de las moléculas diana se unen a la unidad de separación 4. La salida de la unidad de separación 4 está en comunicación de líquido con la entrada de la unidad de separación 1 de modo que todas las partes de la alimentación que no se han unido a la unidad de separación 4 pasan adicionalmente a través de la unidad de separación 1. Esto permite que las moléculas diana que no se han unido a la unidad de separación 4 se unan a la unidad de separación 1. La salida de la unidad de separación 1 está conectada a los desechos. Mientras se cargan las unidades de separación 4 y 1, la unidad de separación 3 que se ha cargado antes, por ejemplo, se lava, se eluye, se somete a limpieza en el lugar y reequilibrado y todas las demás etapas del procedimiento que podrían ser necesarias y son diferentes de la carga. Durante la fase de lavado o una parte de la fase de lavado de la unidad de separación 3, la salida de la unidad de separación 3 está en comunicación de fluido con la unidad de separación 2 donde la molécula diana débilmente unida o no unida eliminada por dicho lavado, y no unida a la unidad de separación 3, pasa adicionalmente a través de la unidad de separación 2. Esto permite que las moléculas diana que no se han unido a la unidad de separación 3 se unan a la unidad de separación 2. Adicionalmente, la salida de la unidad de separación 3 puede estar en comunicación de fluido con la entrada de la unidad de separación 2 o con la salida de la unidad de separación 2. Además, la unidad de separación 2 puede estar en comunicación de fluido con la unidad de separación 1. Siempre que la molécula diana se eluya de la unidad de separación 3, la salida de la unidad de separación 3 está conectada a un tanque de recogida de molécula diana o a otra unidad donde la molécula diana se procesa adicionalmente. Para otras etapas del procedimiento, la salida de la unidad de separación 3 está conectada a una de las salidas. Opcionalmente, las etapas de limpieza en el lugar y reequilibrado en la unidad de separación 3 pueden realizarse en un modo de flujo inverso.

En la siguiente etapa, la alimentación se cambia de nuevo a la unidad de separación 1 (figura 5a) y se realiza de nuevo la etapa del procedimiento tal como se describe en las figuras 6a-e. Normalmente, las etapas del procedimiento se realizan más de dos veces.

En un sistema con tres unidades de separación, normalmente, en un determinado momento del procedimiento, una unidad de separación 1 está completamente cargada y es necesario lavarla, una unidad de separación 2 está conectada a la alimentación para cargarse completamente y una unidad de separación 3 se ha eluido y reequilibrado. Según la presente invención, al menos parte del tiempo de carga de la unidad de separación 2, la salida de la unidad de separación 2 estará en comunicación de fluido con la entrada de la unidad de separación 3 de modo que la molécula diana no unida puede unirse a la unidad de separación 3. Puesto que esta conexión de fluido normalmente solo es necesaria durante la parte de la carga, al comienzo de la carga es posible adicionalmente conectar la salida de la unidad de separación 1 con la entrada de la unidad de separación 2 (figura 7a). En tal caso, serían posibles dos comunicaciones de fluido para la unidad de separación 2, una que contiene la corriente de alimentación, otra que contiene moléculas diana débilmente unidas o no unidas eliminadas de la unidad de separación 1 durante dicha fase de lavado (figura 7a). Esta comunicación de fluido debe mantenerse durante el lavado de la unidad de separación 1 cargada de modo que las moléculas diana que podrían eluirse de la unidad de separación 1 durante el lavado puedan capturarse en la unidad de separación 2. Tras completarse el lavado, la comunicación de fluido entre las unidades de separación 1 y 2 se detiene. Mientras la unidad de separación 1 se somete a otras etapas como lavado adicional (por ejemplo la eliminación de moléculas distintas de las moléculas diana) (figura 7b), CIP, elución, reequilibrado, la entrada en la unidad de separación 3 está conectada a la salida de la unidad de separación 2 de modo que, al menos en parte del tiempo de carga, debido a la comunicación de fluido entre las unidades de separación 2 y 3, la molécula diana no unida que se eluye de la unidad de separación 2 puede unirse a la unidad de separación 3.

Puede entenderse fácilmente que las mismas etapas se realizan también cuando la alimentación se cambia a la siguiente unidad de separación (con las unidades de separación respectivas).

En una realización preferida, la muestra que se somete al método de la presente invención es una muestra clarificada. Eso significa que la muestra se somete a una etapa de clarificación antes de cargarla en las unidades de separación para el procedimiento de cromatografía de unión y elución según la presente invención.

La etapa de clarificación está destinada a separar una o más impurezas solubles y/o insolubles de la molécula diana. Por ejemplo, se eliminan impurezas insolubles como células y residuos celulares de la muestra dando como resultado un fluido clarificado que contiene la molécula diana en disolución así como otras impurezas solubles. Una etapa de clarificación puede implicar uno o más de los siguientes, o bien solos o bien en cualquier combinación, centrifugación, sedimentación y/o filtración, preferiblemente filtración de flujo tangencial o filtración en profundidad. Preferiblemente, la etapa de clarificación no implica centrifugación sino solo filtración y/o sedimentación. En una realización preferida, la filtración es filtración en profundidad.

En algunas realizaciones, se usan filtros de profundidad para eliminar una o más impurezas insolubles. Los filtros de profundidad son filtros que usan un medio de filtración poroso para retener partículas en todo el medio, en vez de solo en la superficie del medio. Una clase común de tales filtros de profundidad son aquellos que comprenden una mezcla al azar de fibras unidas (o fijadas de otra forma), para formar un laberinto completo y tortuoso de canales de flujo. La separación de partículas en estos filtros resulta generalmente del atrapamiento por o adsorción a la matriz de fibras. El medio de filtro de profundidad más frecuentemente usado para el bioprocesamiento de caldos de cultivo celular y otras materias primas consiste habitualmente en fibras de celulosa, un adyuvante de filtro tal como DE (tierra de diatomeas) y un aglutinante de resina cargada positivamente.

Se ha encontrado que pueden lograrse especialmente buenos resultados en la eliminación primaria de impurezas particuladas si el filtro de profundidad poroso es anisotrópico. En algunas realizaciones, los poros tienen un tamaño de poro nominal que se clasifica > aproximadamente 25 |jm. En algunas realizaciones, el filtro de profundidad comprende al menos 2 capas graduadas de fibras no tejidas, en las que las capas graduadas tienen un grosor total de aproximadamente 0,3 cm a aproximadamente 3 cm.

En algunas realizaciones, los filtros de profundidad comprenden un material compuesto de capas graduadas de fibras no tejidas, celulosa y tierra de diatomeas. Las fibras no tejidas comprenden polipropileno, polietileno, poliéster, nailon o mezclas de los mismos.

Pueden encontrarse filtros de profundidad a modo de ejemplo en la solicitud de patente provisional estadounidense n.° 61/571994.

En algunas realizaciones, puede realizarse una etapa de centrifugación y/o filtración de flujo tangencial antes de una etapa de filtración en profundidad. Alternativamente, puede realizarse una etapa de filtración en profundidad sin la necesidad de una etapa de centrifugación y/o filtración de flujo tangencial.

En una realización, antes de la clarificación mediante centrifugación y/o filtración y/o sedimentación, la muestra se pretrata con una composición de precipitación para precipitar y eliminar contaminantes no deseados de la muestra. La composición de precipitación comprende al menos un precipitante que es capaz de precipitar contaminantes como HCP, ADN, hormonas, etc. de la muestra. Los precipitantes provocan la precipitación de un compuesto desde un estado acuoso y/o soluble hasta un estado no acuoso y/o insoluble o agregan y aglutinan partículas finas de una disolución, dando como resultado su sedimentación de la fase líquida y una reducción en la turbidez de la disolución.

Ejemplos de precipitantes adecuados son ácidos orgánicos (por ejemplo ácido octanoico), ácidos inorgánicos (por ejemplo HCl), otros agentes ácidos que disminuyen sustancialmente el pH hacia el intervalo ácido, sales (por ejemplo, benzoato de sodio, colato de sodio, desoxicolato de sodio, etc.), otras sales monovalentes o ácidos orgánicos que precipitan en el medio ácido). Otro ejemplo de un precipitante es un ácido graso de cadena corta tal como ácido caprílico. En condiciones levemente ácidas, la adición de ácidos grasos de cadena corta tales como ácido caprílico normalmente precipita proteínas distintas de IgG mientras que IgG no precipita.

Otros precipitantes adecuados son polímeros de polielectrolitos (véase, por ejemplo, la solicitud de patente PCT internacional n.° WO2008/091740).

En una realización preferida, se usan polímeros sensibles a estímulos para precipitar una o más impurezas. Pueden encontrarse ejemplos de tales polímeros sensibles a estímulos, por ejemplo, en las publicaciones estadounidenses n.os 20080255027, 20090036651, 20090232737 y 20111 0020327.

Los polímeros sensibles a estímulos son generalmente solubles en un disolvente de base acuosa en un cierto conjunto de condiciones del procedimiento tales como pH, temperatura y/o concentración de sal y se vuelven insolubles tras un cambio en una o más de tales condiciones y posteriormente precipitan. Los polímeros sensibles a estímulos a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, polialilamina, polialilamina modificada con un grupo bencilo o polivinilamina y polivinilamina modificada con un grupo bencilo, donde el estímulo es fosfato o citrato.

La composición de precipitación puede comprender además un detergente (Triton X-100, Triton X-114, NP-40, Tween-20, OTD, SDS, CHAPS y/o polietilenglicol (PEG) (PEG-1000, PEG 10000) y/o poli(alcohol vinílico) y/o polielectrolitos. Los contaminantes precipitados se eliminan entonces de la muestra mediante clarificación antes de cargar la muestra en las unidades de separación.

En una realización preferida, la precipitación va seguida por filtración en profundidad, sin una etapa de centrifugación para proporcionar la muestra clarificada.

En una realización preferida, la clarificación de la muestra se realiza simultáneamente con la purificación cromatográfica según el método de la presente invención durante al menos una parte de su duración. En otras palabras, la muestra líquida que contiene la molécula diana no se almacena en un tanque de reserva después de la clarificación para esperar a que el volumen completo de la muestra se clasifique, sino que tan pronto como la muestra clarificada resulta del procedimiento de clarificación, se usa de manera continua como disolución de la muestra para el método de la presente invención y se carga en las unidades de separación.

En consecuencia, el método de la presente invención, también cuando usa una disolución de muestra clarificada, no requiere el uso de tanques de reserva que sean capaces de almacenar el volumen completo de la disolución de la muestra. Preferiblemente, no se usan tanques de reserva o solo tanques de reserva que pueden almacenar menos del 25%, preferiblemente menos del 10% del volumen total de la disolución de la muestra.

En otra realización, la molécula diana que se ha purificado con el método según la presente invención se somete a etapas adicionales del procedimiento como inactivación de virus y/o purificación de flujo continuo.

La inactivación de virus hace que los virus sean inactivos, o incapaces de infectar, lo que es importante, especialmente en caso de que la molécula diana esté destinada a uso terapéutico.

Muchos virus contienen recubrimientos proteicos o lipídicos que pueden inactivarse por alteración química. Más bien que simplemente hacer que el virus sea inactivo, algunos procedimientos de inactivación de virus son capaces de desnaturalizar el virus completamente. Un experto en la técnica conoce bien métodos para inactivar virus. Algunos de los procedimientos de inactivación de virus más ampliamente usados incluyen, por ejemplo, el uso de uno o más de los siguientes: inactivación con disolvente/detergente (por ejemplo con Triton X 100); pasteurización (calentamiento); inactivación por pH ácido; e inactivación por ultravioleta (UV). Es posible combinar dos o más de estos procedimientos; por ejemplo, realizar inactivación por pH ácido a elevada temperatura.

Con el fin de garantizar una inactivación de virus completa y eficaz, la inactivación de virus se realiza a menudo a lo largo de un periodo de tiempo prolongado con agitación constante para garantizar un mezclado apropiado de un agente de inactivación de virus con la muestra. Por ejemplo, en muchos procedimientos usados en la industria hoy en día, se recoge una salida o eluato de una etapa de captura en un tanque de reserva y se somete a inactivación de virus a lo largo de un periodo de tiempo prolongado (por ejemplo, >1 a 2 horas, a menudo seguido por almacenamiento durante la noche).

El tiempo requerido para la inactivación de virus se reduce significativamente realizando inactivación de virus en línea o empleando un tanque de compensación en lugar de un tanque de reserva para esta etapa.

En una realización preferida, la inactivación de virus emplea el uso de pH ácido, donde la salida de la etapa de cromatografía de unión y elución según el método de la presente invención se somete a exposición a pH ácido para la inactivación de virus, o bien usando un tanque de compensación o bien en línea. El pH usado para la inactivación de virus es normalmente menor de 5,0, o preferiblemente de entre 3,0 y 4,0. En algunas realizaciones, el pH es de aproximadamente 3,6 o inferior. La duración de tiempo usada para la inactivación de virus usando un método en línea puede ser cualquiera entre 10 minutos o menos, 5 minutos o menos, 3 minutos o menos, 2 minutos o menos, o aproximadamente 1 minuto o menos. En el caso de un tanque de compensación, el tiempo requerido para la inactivación es normalmente menor de 1 hora, o preferiblemente menor de 30 minutos.

La salida del método de cromatografía de unión y elución de la presente invención que se ha sometido opcionalmente a inactivación de virus puede someterse entonces a purificación de flujo continuo.

En una realización preferida, la etapa del procedimiento de purificación de flujo continuo emplea dos o más etapas o dispositivos o métodos para lograr la purificación de flujo continuo, que está destinada a eliminar una o más impurezas. En una realización preferida, el procedimiento de purificación de flujo continuo, tal como se describe en el presente documento, incluye una o más de las siguientes etapas realizadas en un modo de flujo continuo: carbono activado; cromatografía de intercambio aniónico; cromatografía de intercambio catiónico, cromatografía en modo mixto, cromatografía de interacción hidrófoba, exclusión molecular, filtración de virus o combinaciones de las mismas. En algunas realizaciones, pueden usarse una o más válvulas, mezcladoras estáticas en línea y/o tanques de compensación entre estas etapas, con el fin de cambiar las condiciones de la disolución.

En una realización preferida, la purificación de flujo continuo emplea al menos una etapa de cromatografía de intercambio aniónico (AEX) de flujo continuo, donde una o más impurezas que todavía permanecen en la muestra que contiene la molécula diana se unen a la matriz de cromatografía de intercambio aniónico, mientras que la molécula diana fluye a su través.

Las matrices de intercambio aniónico a modo de ejemplo que pueden emplearse incluyen, pero no se limitan a, las basadas en iones de amonio cuaternario, así como intercambiadores aniónicos débiles, tales como los basados en amina primaria, secundaria y terciaria.

Las matrices que van a usarse en la etapa de purificación de flujo continuo pueden estar en forma de partículas, membranas, materiales porosos fibrosos o materiales monolíticos. En el caso del carbono activado, puede impregnarse en un material poroso, por ejemplo, un material fibroso poroso. Un experto en la técnica conoce unidades de separación adecuadas para que contengan estas matrices, por ejemplo columnas o cartuchos. También es posible combinar dos o más matrices diferentes, por ejemplo una matriz de intercambio catiónico y una matriz de intercambio aniónico, en una unidad de separación. Las unidades de separación pueden ser también desechables, por ejemplo, Millistak® Pod.

En una realización preferida, las matrices usadas en la etapa de purificación de flujo continuo son matrices basadas en membranas, también denominadas adsorbentes de membrana. El adsorbente de membrana es preferiblemente una lámina de membrana porosa producida mediante métodos de separación de fases bien conocidos en la técnica.

En una realización preferida, la etapa de purificación de flujo continuo incluye al menos una etapa de intercambio aniónico y una etapa de carbono activado. La etapa de carbono activado podría realizarse antes de la cromatografía de intercambio aniónico, en combinación con la cromatografía de intercambio aniónico o después de la cromatografía de intercambio aniónico, preferiblemente se realiza antes de la etapa de intercambio aniónico. En algunas realizaciones, se empaqueta carbono activado con un medio de celulosa. Alternativamente, puede combinarse carbono activado con una matriz de intercambio aniónico (por ejemplo, en una columna o un cartucho), para eliminar de ese modo además una o más impurezas de una muestra que contiene una molécula diana.

En una realización preferida, la purificación de flujo continuo incluye además una o más etapas de flujo continuo adicionales para la eliminación de agregados y/o filtración de virus basándose en exclusión molecular. En algunas realizaciones, la muestra se hace pasar a través de un filtro de profundidad de adsorción, o una capa o capas microporosas cargadas o modificadas en un modo de funcionamiento de filtración en flujo normal, para la eliminación de agregados. En algunas realizaciones, una etapa de flujo continuo adicional emplea una matriz de cromatografía de intercambio catiónico (CEX).

El uso de una etapa de intercambio catiónico (CEX) de flujo continuo puede necesitar una reducción del pH de la disolución para aumentar la afinidad y capacidad para impurezas, tales como agregados de anticuerpos. Tal reducción del pH puede realizarse mediante una adición en línea simple de una disolución adecuada que contiene ácido, por medio de una válvula de tres vías, un conector de tipo T, una mezcladora estática u otros dispositivos adecuados bien conocidos en la técnica. Además, puede emplearse un recipiente de compensación pequeño para proporcionar mezclado adicional y acceso para la toma de muestras. El volumen del recipiente de compensación, que puede estar en forma de una bolsa, un depósito o un tanque, es de manera habitual considerablemente más pequeño que el volumen del fluido procesado con la configuración de flujo continuo, por ejemplo no más del 10% del volumen del fluido.

Toda la operación de purificación de flujo continuo (incluyendo la etapa de cromatografía de intercambio aniónico y una o más etapas adicionales, tal como se describen en el presente documento), se realizan preferiblemente de manera continua sin el uso de un tanque de reserva entre las etapas del procedimiento de flujo continuo.

En una realización preferida, la etapa de flujo continuo comprende poner en contacto la muestra con una matriz de carbono activado, una matriz de intercambio aniónico, una matriz de intercambio catiónico y una matriz de exclusión molecular. Preferiblemente, se realiza un intercambio de tampón antes de hacerla pasar a través de la matriz de intercambio catiónico.

Si se realiza una etapa de clarificación antes del método según la presente invención y/o se realiza una etapa de purificación de flujo continuo después de realizar el método según la presente invención, en una realización preferida, al menos la etapa de clarificación y la etapa de cromatografía de unión y elución se solapan en al menos una porción de su duración. Muy preferido, la etapa de clarificación y la etapa de cromatografía de unión y elución se solapan en al menos una porción de su duración y la etapa de cromatografía de unión y elución y la etapa de purificación de flujo continuo se solapan en al menos una porción de su duración.

En una realización preferida, el método de cromatografía de unión y elución según la presente invención así como todas las etapas del procedimiento opcionales adicionales se realizan sin el uso de tanques para almacenar la disolución de la muestra durante las etapas del procedimiento que tienen más del 25%, preferiblemente no más del 10 % del volumen de la muestra que se sometió al procedimiento al comienzo.

Sistema

La presente invención se refiere también a un sistema de cromatografía líquida (figura 1) para separar al menos una molécula diana de la alimentación, sistema que se compone de al menos tres unidades de separación conectadas en un círculo, comprendiendo cada unidad de separación una matriz de cromatografía empaquetada en una columna. Cada unidad de separación está dotada de medios para la entrada y salida de líquido. Dichos medios para la entrada están al menos conectados al sistema de suministro de disolvente y a la salida de la unidad de separación previa en el círculo. Dichos medios de salida están al menos conectados a un depósito o desechos y a la entrada de la siguiente unidad de separación en el círculo. En una realización preferida, la salida de cada unidad de separación en el círculo está conectada con la entrada de cada unidad de separación en el círculo de modo que es posible la comunicación de fluido entre la salida de cualquier unidad de separación seleccionada con la entrada de cualquier otra unidad de separación seleccionada.

En el sistema según la presente invención, las líneas de conexión están preferiblemente ramificadas cerca de cada entrada de fluido y cerca de cada salida de fluido.

Todas las líneas de conexión ubicadas entre la salida de una unidad de separación y la entrada de la siguiente unidad de separación del círculo están dotadas de válvulas de “encendido-apagado” para seleccionar la corriente de entrada, en donde la corriente de entrada puede conectarse directamente con un sistema de suministro de disolvente o se conecta directamente con la salida de la columna previa. Adicionalmente, todas las salidas están dotadas de válvulas de “encendido-apagado” para seleccionar entre las direcciones de la corriente de disolvente, en donde dicho disolvente puede dirigirse hacia un depósito de disolvente o desechos o hacia la entrada de otra unidad de separación. Esta configuración permite una captura del producto lixiviado desde la primera unidad de separación de captura (al final de la carga) en la segunda unidad de separación (recién reequilibrada y lista para la captura). Esto permite usar mayores rendimientos y capacidades de unión sin la pérdida de molécula diana.

Adicionalmente, la selección del disolvente antes del sistema de suministro de disolvente se realiza con una válvula de selección de disolvente con al menos dos entradas pero más probablemente con cuatro y más.

En una realización, preferiblemente, las válvulas de encendido/apagado están ubicadas en las líneas de conexión con el fin de detener el flujo del disolvente a través de esta línea. Adicionalmente, el sistema puede contener solo el sistema de suministro de dos disolventes pero todavía ser capaz de funcionar con los métodos de tres columnas facilitados anteriormente (figura 4).

En otra realización, el sistema según la presente invención podría contener cuatro unidades de separación (figura 5a; figura 6a).

En otra realización preferida, el aparato comprende además uno o más detectores. Los detectores pueden usarse para el control de la transferencia de la muestra entre las columnas, para el análisis de calidad de la muestra, monitorización, etc. Los detectores pueden estar ubicados en cualquier lugar adecuado, normalmente están ubicados antes de la entrada de fluido y/o después de la salida de fluido de las columnas de separación. Ejemplos de detectores adecuados son detectores de pH, detectores de UV, detectores de infrarrojo o detectores que miden la conductividad.

En otra realización preferida, el aparato comprende además un sistema informático. Los detectores, así como las bombas y las válvulas, están conectados al sistema informático. Este sistema informático permite el control de las bombas y las válvulas y los detectores. Preferiblemente, el sistema informático comprende un software y algoritmos que permiten que el aparato se use en un modo parcial o completamente automatizado.

En otra realización preferida, el aparato comprende un sistema informático en el que los eventos (por ejemplo, señales del detector) pueden usarse como desencadenantes para el control.

El sistema puede comprender adicionalmente unidades de filtro, unidades de detección u otro equipo que puede ser necesario o adecuado en un procedimiento de separación cromatográfica.

El aparato según la presente invención comprende columnas, válvulas, depósitos y otro equipo que se usa normalmente en sistemas de cromatografía. Las unidades de separación podrían ser por ejemplo columnas de acero inoxidable, columnas de plástico o columnas de vidrio que se llenan con las respectivas matrices de cromatografía y tienen accesorios de extremo adecuados para la entrada y salida de disolvente.

El aparato según la presente invención comprende 3 o más, preferiblemente 3, 4 o 5, lo más preferido 3 unidades de separación que tienen la misma matriz de cromatografía.

El aparato también comprende al menos dos depósitos de tampón y al menos dos bombas, también denominado el sistema de suministro de disolvente, que proporcionan el almacenamiento y la provisión de los tampones necesarios por ejemplo para la carga, el lavado y la elución de las moléculas diana. Normalmente, todas las unidades de separación tienen al menos una entrada de fluido que está conectada a al menos un depósito de tampón.

En una realización muy preferida, el aparato según la presente invención tiene tres unidades de separación y dos sistemas de suministro de disolvente.

A continuación, la descripción del aparato y el método se centran en un aparato con tres unidades de separación de captura que tienen la misma matriz de cromatografía. Esto no significa que sea restrictivo sino que hace que la descripción sea más exhaustiva. Un experto en la técnica puede transferir la descripción también a sistemas con más de tres unidades tal como se describió anteriormente.

En otras realizaciones, el aparato puede comprender depósitos adicionales para otros tampones, limpieza en el lugar, reequilibrado, etc.

Normalmente, los depósitos y las unidades de separación están conectados por medio de líneas de conexión, válvulas y bombas. Las válvulas de selección de disolvente preferidas para la elección del disolvente antes de la bomba son válvulas que tienen numerosas entradas de disolvente y 1 salida de disolvente que puede estar conectada directamente a la bomba. La cantidad de las entradas requeridas correspondería a la cantidad de los diferentes tampones usados específicamente para una aplicación individual. Cualquier bomba que garantice un flujo de disolvente podría usarse, incluyendo bombas peristálticas, bombas isocráticas, bombas de gradiente, bombas de alta presión y similares, bombas de baja presión y similares. Las válvulas de selección de fluido preferidas para la elección de la introducción de fluido antes de una entrada de fluido de la parte del sistema son válvulas que tienen numerosas entradas de fluido y 1 salida que puede estar conectada a la entrada de fluido de la parte del sistema. Las válvulas de selección de fluido preferidas para la elección de la extracción de fluido después de la salida de fluido de la parte del sistema son válvulas que tienen numerosas salidas de fluido y 1 entrada que puede estar conectada a la salida de fluido de la parte del sistema.

En una realización preferida, al menos un sistema de suministro de disolvente está conectado al depósito de materia prima, garantizando una corriente de materia prima constante al aparato. Esto permite un funcionamiento continuo con respecto a la corriente de alimentación continua. El intervalo de la corriente de alimentación podría controlarse con el fin de garantizar la unión a la columna requerida en el intervalo de tiempo dado. Habitualmente, para las aplicaciones de afinidad, la cantidad de molécula diana en la corriente de alimentación es un criterio decisivo para la corriente de alimentación.

En otra realización preferida, la velocidad de flujo de la alimentación se controla para mejorar la productividad de cada columna y más preferiblemente se mantiene en el intervalo dependiendo de la cantidad de molécula diana en la corriente de alimentación.

En otra realización preferida, la velocidad de flujo de una o más corrientes de líquidos adicionales se controla.

Otras cuestiones

En otra realización preferida, el aparato comprende además un depósito adicional para la limpieza en el lugar. La limpieza en el lugar (CIP) es una tecnología conocida por el experto en la técnica. La limpieza en el lugar es la eliminación de sustancias muy fuertemente unidas, precipitadas o desnaturalizadas de la matriz de cromatografía. Si tales contaminantes no se eliminan de la matriz de cromatografía, podrían afectar a las propiedades cromatográficas de la columna, disminuir la capacidad de unión y desprenderse en ejecuciones posteriores, lo que da como resultado el arrastre de contaminantes o producto entre ciclos. Los protocolos de CIP convencionales incluyen normalmente de uno a cinco lavados con de uno a tres volúmenes de columna de tampones acuosos que comprenden componentes como - clorhidrato de guanidina 6 M

- NaOH de 10 mM a 500 mM

- NaOH de 10 mM a 500 mM y NaCl 1 M,

- NaOH 50 mM y Na2SO41 M,

- disolución de ácido fosfórico 150 mM,

- urea 6 M,

- etanol al 20%,

- etanol al 20% y ácido acético 0,5 M,

- etanol al 20% y ácido acético 2 M,

- Tween al 1 % o tensioactivo T riton® X-100 o similar.

La concentración de los componentes como NaOH, el tiempo de contacto del tampón de CIP en la columna así como la frecuencia de realización de la CIP pueden ajustarse y determinarse por el experto en la técnica.

El aparato según la presente invención tiene preferiblemente al menos un depósito que contiene un tampón de CIP. El tampón de CIP puede usarse para la CIP de todas las unidades de separación si es adecuado. Entonces, el depósito de tampón está en conexión de líquido con todas las unidades de separación de un modo que el flujo del tampón de CIP puede dirigirse a cada una de las columnas independientemente. Los lavados de la limpieza en el lugar pueden realizarse después de cada ciclo de separación. Normalmente, se realiza la CIP después de cada segundo, tercero, cuarto, quinto, sexto, séptimo, octavo, noveno o décimo ciclo de separación dependiendo de la muestra y por tanto la cantidad y el tipo de contaminantes que podrían contaminar la unidad de separación.

En otra realización preferida, el aparato comprende un depósito adicional para la eliminación parcial o total de impurezas unidas del adsorbente (lavado). La purificación de impurezas, especialmente la eliminación de HCP y ADN, desempeña un papel importante en la producción de compuestos biofarmacéuticos ya que los niveles de ADN de la célula huésped en compuestos biofarmacéuticos están regulados por la FDA. Es posible reducir el número de los niveles de HCP y ADN unidos en el adsorbente a través de la exposición adicional del adsorbente cargados a diversas disoluciones. Esta tecnología la conoce el experto en la técnica. Los protocolos de lavado convencionales incluyen normalmente de uno a diez lavados con de uno a veinte volúmenes de columna de tampones acuosos que comprenden componentes como

- NaCl de 0,02 M a 2 M,

- NaCl de 0,02 M a 2 M y Na2SO4

- Na2SO4 de 0,02 M a 2 M

- CaCl² de 0,02 M a 2 M

- MgCl² de 0,02 M a 2 M

- MgSO4 de 0,02 M a 2 M

- disolventes orgánicos al 10-20%,

- polipropilenglicol y polietilenglicol al 10-20%,

- aminoácidos 0,5 M tales como arginina y glicina,

- tensioactivo Tween o Triton® X-100 al 0,1-1% o similar.

La concentración de los componentes como NaCl, el tiempo de contacto del tampón de lavado en la columna, el valor de pH del tampón así como la frecuencia de realización del lavado pueden ajustarse y determinarse por el experto en la técnica.

En otra realización preferida, las etapas de lavado se llevan a cabo con diferentes tampones.

En otra realización preferida, cada adsorbente se lava mediante múltiples etapas de lavado.

En una realización, el sistema comprende tres o más unidades de separación con una matriz de cromatografía de afinidad. Matrices de afinidad adecuadas son matrices que tienen grupos funcionales de proteína A, proteína G, proteína L o proteína r (por ejemplo Prosep® Highcap (Merck Millipore), Prosep® Ultra Plus (Merck Millipore), Poros® Prot A(Life Technologies), A650f (Tosoh), MabSelect® Sure (GE).

La matriz de cromatografía de afinidad que va a usarse en el aparato según la presente invención comprende partículas con diámetros promedio entre 40 y 200 |jm, anteriormente se han facilitado tamaños de poro y diámetros preferidos al describir el método según la presente invención.

Las partículas pueden tener una forma regular o irregular. Pueden estar hechas de cualquier material adecuado como sorbente cromatográfico, como polisacáridos (tales como agarosa y celulosa); y otras matrices mecánicamente estables tales como sílice (por ejemplo vidrio de poro controlado), poli(estirendivinil)benceno, poliacrilamida, polimetacrilatos, partículas cerámicas o copolímeros de alquil vinil éteres sustituidos hidrofílicamente como monovinil éter de 1,2-etanodiol, monovinil éter de 1,3-propanodiol, monovinil éter de 1,4-butanodiol, monovinil éter de 1,5-pentanodiol, monovinil éter de 1,6-hexanodiol, monovinil éter de dietilenglicol o monovinil éter de ciclohexanodimetanol y agentes de reticulación como diviniletilenurea (1,3-divinilimidazolin-2-ona) o divinilpropilenurea (1,3-diviniltetrahidropirimidin-2-ona) y derivados de cualquiera de los anteriores. Ejemplos de copolímeros de alquil vinil éteres sustituidos hidrofílicamente se dan a conocer en el documento EP 1910433. Se prefieren materiales que muestran una alta rigidez de modo que puedan aplicarse velocidades por encima de 1000 cm/h.

En otra realización preferida, el aparato descrito puede conectarse a un biorreactor, biorreactor de perfusión y/o metodología de purificación aplicada para la eliminación parcial de impurezas (como residuos celulares, etc.), como filtros de profundidad, centrifugación, clarificación, sedimentación, tecnologías de fluctuación que garantizan una corriente de alimentación constante. Esto no solo es esencial para el requisito del método de una necesidad de corriente de alimentación continua, sino que proporcionaría tiempos de procesamiento más cortos y mantendría la calidad del producto (como menores niveles de agregación, etc.) al tiempo que se evitan tiempos de almacenamiento prolongados entre la producción de la molécula diana y/o la purificación de la corriente de alimentación y la captura de la molécula diana.

En otra realización preferida, la corriente de salida de producto puede estar conectada directamente a otras técnicas de purificación, tales como modos de cromatografía de intercambio iónico, cromatografía en modo mixto, cromatografía de fase inversa, cromatografía HIC, cromatografía SEC, filtración en profundidad, sedimentación, tecnologías de fluctuación, etc. o acumularse en el depósito, bolsa de compensación, bolsa de almacenamiento.

En otro experimento preferido, la corriente de salida de producto está conectada a un depósito, donde se ajusta al menos un grupo de elución a partir de un único adsorbente, en donde puede realizarse una extracción continua o semicontinua de la disolución combinada, permitiendo una conexión directa a las siguientes tecnologías de purificación. Esto garantizaría no solo condiciones más constantes (en comparación con el perfil de elución de cromatografía convencional) para las siguientes tecnologías de purificación con respecto a los valores de concentración, pH y conductividad objetivo, sino que garantizaría un procesamiento más rápido puesto que pueden purificarse directamente cantidades más pequeñas de molécula diana procesada con tecnologías adicionales con el fin de permitir un procedimiento de purificación total más corto.

En otra realización preferida, tiene que elegirse un diámetro y una longitud apropiados de la columna para garantizar un funcionamiento óptimo. Más preferiblemente, la altura del lecho adsorbente debe ser menor de 10 cm e incluso más preferiblemente 4-6 cm de altura. Esto influye en la caída de presión en la columna que en la aplicación a escala industrial no debe exceder de 3 bares. La ventaja es el funcionamiento a 1000 cm/h y más sin exceder las limitaciones de presión.

Ejemplos

Ejemplo I

Purificación continua de AcM-x (1 mg/ml) en PUP durante >100 ciclos con datos correspondientes

El anticuerpo monoclonal AcM-x en disolución de cultivo celular (SP 2/0), que tenía anticuerpo monoclonal 1 mg/ml que constituía una fracción del 21% de todos los componentes en la disolución (según SEC analítica), donde la cantidad de HCP era de 600000 ng/mg de anticuerpo (según el ensayo inmunoenzimático SP 2/0), se purificó en la resina de ProtA (PUP) en las siguientes condiciones. Columnas de cromatografía: se empaquetó resina PUP en una columna de 16 x 55 mm; entonces se equilibró la columna con tampón PBS 25 mM pH 7,2 a 33,3 ml/min. En total, se empaquetaron tres columnas. Para preparar la muestra: se filtró una disolución de cultivo celular de anticuerpo monoclonal a través de un filtro de 0,45 |jm. La conductividad de la disolución era de aproximadamente 16 mS/cm y pH 6,4. Las tres columnas se unieron a un sistema cromatográfico continuo, permitiendo una conexión entre la primera columna y la segunda columna, así como una conexión entre la segunda columna y la tercera columna y una conexión entre la tercera columna y la primera columna. Todo el experimento se divide en tres etapas. Cuando se inicia la primera etapa, la primera columna se conecta con la segunda columna. Este grupo de columnas se carga con la muestra preparada a 1500 cm/h, mientras que la tercera columna se lava a 1500 cm/h durante al menos 3 CV con tampón TRIS 25 mM y NaCl 1,5 M pH 7, luego se lava a 1500 cm/h durante al menos 3 CV con tampón TRIS 25 mM pH 7,2, luego se eluye a 1500 cm/h con tampón glicina 50 mM pH 2,7, seguido por limpieza de la columna a 1500 cm/h con ácido fosfórico 150 mM, seguido por reequilibrado a 1500 cm/h con tampón TRIS 25 mM pH 7,2.

Cuando se inicia la segunda etapa, la segunda columna se conecta con la tercera columna. Este grupo de columnas se carga con la muestra preparada a 1500 cm/h, mientras que la primera columna se lava a 1500 cm/h durante al menos 3 CV con tampón TRIS 25 mM y NaCl 1,5 M pH 7, luego se lava a 1500 cm/h durante al menos 3 CV con tampón TRIS 25 mM pH 7,2, luego se eluye a 1500 cm/h con tampón glicina 50 mM pH 2,7, seguido por limpieza de la columna a 1500 cm/h con ácido fosfórico 150 mM, seguido por reequilibrado a 1500 cm/h con tampón TRIS 25 mM pH 7,2.

Cuando se inicia la tercera etapa, la tercera columna se conecta con la primera columna. Este grupo de columnas se carga con la muestra preparada a 1500 cm/h, mientras que la segunda columna se lava a 1500 cm/h durante al menos 3 CV con tampón TRIS 25 mM y NaCl 1,5 M pH 7, luego se lava a 1500 cm/h durante al menos 3 CV con tampón TRIS 25 mM pH 7,2, luego se eluye a 1500 cm/h con tampón glicina 50 mM pH 2,7, seguido por limpieza de la columna a 1500 cm/h con ácido fosfórico 150 mM, seguido por reequilibrado a 1500 cm/h con tampón TRIS 25 mM pH 7,2.

Las etapas nombradas se repitieron al menos 100 veces y se obtuvo el funcionamiento en estado estacionario en el segundo ciclo. Los perfiles de señal de UV se facilitan en la figura 9, que muestra todos los perfiles de UV de las etapas que cada columna atraviesa en cada ciclo individual. Comenzando con un lavado de la primera columna cargada, cargar simultáneamente la siguiente columna en la serie acoplada con la columna después de la siguiente en la serie. Cuando todavía las columnas nombradas están cargándose, la columna cargada previamente se eluye (primer pico), se somete a CIP y se equilibra. En el minuto 18, se realiza la carga de la siguiente columna y se cambia la carga a la columna después de la siguiente en la serie seguido por la primera columna, procediendo en consecuencia con el procedimiento necesario para la siguiente columna incluyendo lavado, elución (segundo pico), CIP y reequilibrado. Al mismo tiempo, están cargándose la columna después de la siguiente y la primera. En el minuto 36, se realiza la carga de la columna después de la siguiente y se cambia la carga la primera columna seguido por la siguiente columna, procediendo en consecuencia con el procedimiento necesario para la columna después de la siguiente incluyendo lavado, elución (tercer pico), CIP y reequilibrado.

Las fracciones eluidas contenían anticuerpo 7-9 mg/ml (véase la figura 10), dando como resultado una capacidad de unión al lecho empaquetado >35 mg/ml y una pérdida de molécula diana <5% y la productividad promedio de 50 g/ml/h (en comparación con el funcionamiento discontinuo la productividad era de 9,6 g/ml/h), que constituían el 99,9% de todos los componentes (según SEC analítica), donde la cantidad de HCP era de 120-250 ppm (según el ensayo inmunoenzimático SP 2/0) (véase la figura 11). La cantidad de la ProtA lixiviada permaneció estable a lo largo de todo el experimento, dando como resultado valores de entre 10-60 ppm.

Ejemplo II

Los siguientes ejemplos se realizaron para explorar las posibles diferencias en el valor de capacidad de unión dependiendo del tiempo de residencia para el método de cromatografía discontinua y para el método de cromatografía continua descrito. Tal como se indica en la figura 8, los valores de capacidad de unión medidos hasta valores de avance del 1% para el funcionamiento discontinuo convencional disminuyeron con valores de residencia decrecientes dando como resultado capacidades de unión <20 mg/ml para un tiempo de residencia <0,45 min. En cambio, los valores de capacidad de unión para métodos de cromatografía continua permanecieron >35 mg/ml en el intervalo medido de tiempo de residencia >0,2 min. El ejemplo actual se realizó en el ejemplo de AcM-x puro y a diferentes títulos iniciales (1 mg/ml y 5 mg/ml).

Basándose en estos resultados, se facilitan a continuación ejemplos de materias primas:

a) Purificación continua de AcM-v (0,5 mg/ml) en PUP

El anticuerpo monoclonal AcM-y en disolución de cultivo celular (CHO), que tenía anticuerpo monoclonal 0,5 mg/ml que constituía una fracción del 9% de todos los componentes en la disolución (según SEC analítica), donde la cantidad de HCP era de 250000 ng/mg de anticuerpo (según el ensayo inmunoenzimático CHO), se purificó en la resina de ProtA (PUP) en las siguientes condiciones. Columnas de cromatografía: se empaquetó resina PUP en una columna de 16 x 55 mm; entonces se equilibró la columna con tampón PBS 25 mM pH 7,2 a 33,3 ml/min. En total se empaquetaron tres columnas. Para preparar la muestra: se filtró una disolución de cultivo celular de anticuerpo monoclonal a través de un filtro de 0,45 |jm. La conductividad de la disolución era de aproximadamente 14 mS/cm y pH 6,8. Las tres columnas se unieron a un sistema cromatográfico continuo, permitiendo una conexión entre la primera columna y la segunda columna, así como una conexión entre la segunda columna y la tercera columna y una conexión entre la tercera columna y la primera columna. Todo el experimento se divide en tres etapas. Cuando se inicia la primera etapa, la primera columna se conecta con la segunda columna. Este grupo de columnas se carga con la muestra preparada a 1500 cm/h, mientras que la tercera columna se lava a 1500 cm/h durante al menos 5 CV con tampón TRIS 25 mM y NaCl 0,05 M pH 7, luego se lava a 1500 cm/h durante al menos 3 CV con tampón TRIS 25 mM pH 7,2, luego se eluye a 1500 cm/h con tampón glicina 50 mM pH 2,8, seguido por limpieza de la columna a 1500 cm/h con ácido fosfórico 150 mM, seguido por reequilibrado a 1500 cm/h con tampón TRIS 25 mM pH 7,0.

Cuando se inicia la segunda etapa, la segunda columna se conecta con la tercera columna. Este grupo de columnas se carga con la muestra preparada a 1500 cm/h, mientras que la primera columna se lava a 1500 cm/h durante al menos 5 CV con tampón TRlS 25 mM y NaCl 0,05 M pH 7, luego se lava a 1500 cm/h durante al menos 3 CV con tampón TRIS 25 mM pH 7,2, luego se eluye a 1500 cm/h con tampón glicina 50 mM pH 2,8, seguido por limpieza de la columna a 1500 cm/h con ácido fosfórico 150 mM, seguido por reequilibrado a 1500 cm/h con tampón TRIS 25 mM pH 7,2.

Cuando se inicia la tercera etapa, la tercera columna se conecta con la primera columna. Este grupo de columnas se carga con la muestra preparada a 1500 cm/h, mientras que la segunda columna se lava a 1500 cm/h durante al menos 5 CV con tampón TRIS 25 mM y NaCl 0,05 M pH 7, luego se lava a 1500 cm/h durante al menos 3 CV con tampón TRIS 25 mM pH 7,2, luego se eluye a 1500 cm/h con tampón glicina 50 mM pH 2,8, seguido por limpieza de la columna a 1500 cm/h con ácido fosfórico 150 mM, seguido por reequilibrado a 1500 cm/h con tampón TRIS 25 mM pH 7,2.

Las etapas nombradas se repitieron al menos dos veces.

Las fracciones eluidas dieron como resultado una capacidad de unión al lecho empaquetado >37 mg/ml y una pérdida de molécula diana <5% y la productividad promedio de 136,12 g/ml/h (en comparación con el funcionamiento discontinuo la productividad era de 7,12 g/ml/h), que constituían el 99,9% de todos los componentes (según SEC analítica), donde la cantidad de HCP promedio era de 1300 ppm (según el ensayo inmunoenzimático CHO).

Las condiciones experimentales se compararon con dos casos discontinuos individuales, donde las condiciones convencionales de purificación discontinua se aplicaron usando un tiempo de residencia de 4 minutos para las condiciones de carga y lavado, elución, CIP y reequilibrado idénticas a las facilitadas anteriormente. Y en el segundo caso donde la carga de un funcionamiento discontinuo convencional se realizó a un tiempo de residencia de 0,22 minutos. La productividad obtenida en este caso fue de 19,4 g/ml/h.

b) Purificación continua de AcM-z (1 mg/ml) en PUP

El anticuerpo monoclonal AcM-z en disolución de cultivo celular (CHO-DG44), que tenía anticuerpo monoclonal 1 mg/ml que constituía una fracción del 14% de todos los componentes en la disolución (según SEC analítica), donde la cantidad de HCP era de 200000 ng/mg de anticuerpo (según el ensayo inmunoenzimático CHO), se purificó en la resina de ProtA (PUP) en las siguientes condiciones. Columnas de cromatografía: se empaquetó resina PUP en una columna de 16 x 55 mm; entonces se equilibró la columna con tampón PBS 25 mM pH 7,2 a 33,3 ml/min. En total se empaquetaron tres columnas. Para preparar la muestra: se filtró una disolución de cultivo celular de anticuerpo monoclonal a través de un filtro de 0,45 jm. La conductividad de la disolución era de aproximadamente 13 mS/cm y pH 6,2. Las tres columnas se unieron a un sistema cromatográfico continuo, permitiendo una conexión entre la primera columna y la segunda columna, así como una conexión entre la segunda columna y la tercera columna y una conexión entre la tercera columna y la primera columna. Todo el experimento se divide en tres etapas. Cuando se inicia la primera etapa, la primera columna se conecta con la segunda columna. Este grupo de columnas se carga con la muestra preparada a 1500 cm/h, mientras que la tercera columna se lava a 1500 cm/h durante al menos 5 CV con tampón TRIS 25 mM y NaCl 0,05 M pH 7, luego se lava a 1500 cm/h durante al menos 3 CV con tampón TRIS 25 mM pH 7,2, luego se eluye a 1500 cm/h con tampón glicina 50 mM pH 2,8, seguido por limpieza de la columna a 1500 cm/h con ácido fosfórico 150 mM, seguido por reequilibrado a 1500 cm/h con tampón TRIS 25 mM pH 7,0.

Cuando se inicia la segunda etapa, la segunda columna se conecta con la tercera columna. Este grupo de columnas se carga con la muestra preparada at 1500 cm/h, mientras que la primera columna se lava a 1500 cm/h durante al menos 5 CV con tampón TRIS 25 mM y NaCl 0,05 M pH 7, luego se lava a 1500 cm/h durante al menos 3 CV con tampón TRIS 25 mM pH 7,2, luego se eluye a 1500 cm/h con tampón glicina 50 mM pH 2,8, seguido por limpieza de la columna a 1500 cm/h con ácido fosfórico 150 mM, seguido por reequilibrado a 1500 cm/h con tampón TRIS 25 mM pH 7,2.

Cuando se inicia la tercera etapa, la tercera columna se conecta con la primera columna. Este grupo de columnas se carga con la muestra preparada a 1500 cm/h, mientras que la segunda columna se lava a 1500 cm/h durante al menos 5 CV con tampón TRIS 25 mM y NaCl 0,05 M pH 7, luego se lava a 1500 cm/h durante al menos 3 CV con tampón TRIS 25 mM pH 7,2, luego se eluye a 1500 cm/h con tampón glicina 50 mM pH 2,8, seguido por limpieza de la columna a 1500 cm/h con ácido fosfórico 150 mM, seguido por reequilibrado a 1500 cm/h con tampón TRIS 25 mM pH 7,2.

Las etapas nombradas se repitieron al menos dos veces.

Las fracciones eluidas dieron como resultado una capacidad de unión al lecho empaquetado >37 mg/ml y una pérdida de molécula diana <5% y la productividad promedio de 271,4 g/ml/h (en comparación con el funcionamiento discontinuo la productividad era de 14,27 g/ml/h), que constituían el 99,9% de todos los componentes (según SEC analítica), donde la cantidad de HCP promedio era de 1551 ppm (según el ensayo inmunoenzimático CHO).

Las condiciones experimentales se compararon con dos casos discontinuos individuales, donde las condiciones convencionales de purificación discontinua se aplicaron usando 4 minutos de tiempo de residencia para las condiciones de carga y lavado, elución, CIP y reequilibrado idénticas a las facilitadas anteriormente. Y en el segundo caso donde la carga de un funcionamiento discontinuo convencional se realizó a un tiempo de residencia de 0,22 minutos. La productividad obtenida en este caso fue de 45,13 g/ml/h.

c) Purificación continua de AcM-w (2,4 mg/ml) en PUP

El anticuerpo monoclonal AcM-z en disolución de cultivo celular (NH0), que tenía anticuerpo monoclonal 2,4 mg/ml que constituía una fracción del 35% de todos los componentes en la disolución (según SEC analítica), donde la cantidad de HCP era de 350000 ng/mg de anticuerpo (según el ensayo inmunoenzimático NH0), se purificó en la resina de ProtA (PUP) en las siguientes condiciones. Columnas de cromatografía: se empaquetó resina PUP en una columna de 16 x 55 mm; entonces se equilibró la columna con tampón PBS 25 mM pH 7,2 a 33,3 ml/min. En total se empaquetaron tres columnas. Para preparar la muestra: se filtró una disolución de cultivo celular de anticuerpo monoclonal a través de un filtro de 0,45 |im. La conductividad de la disolución era de aproximadamente 17 mS/cm y pH 5,8. Las tres columnas se unieron a un sistema cromatográfico continuo, permitiendo una conexión entre la primera columna y la segunda columna, así como una conexión entre la segunda columna y la tercera columna y una conexión entre la tercera columna y la primera columna. Todo el experimento se divide en tres etapas. Cuando se inicia la primera etapa, la primera columna se conecta con la segunda columna. Este grupo de columnas se carga con la muestra preparada a 1032 cm/h, mientras que la tercera columna se lava a 1500 cm/h durante al menos 5 CV con tampón TRIS 25 mM y NaCl 0,05 M pH 7, luego se lava a 1500 cm/h durante al menos 3 CV con tampón TRIS 25 mM pH 7,2, luego se eluye a 1500 cm/h con tampón glicina 50 mM pH 2,8, seguido por limpieza de la columna a 1500 cm/h con ácido fosfórico 150 mM, seguido por reequilibrado a 1500 cm/h con tampón TRIS 25 mM pH 7,0.

Cuando se inicia la segunda etapa, la segunda columna se conecta con la tercera columna. Este grupo de columnas se carga con la muestra preparada a 1032 cm/h, mientras que la primera columna se lava a 1500 cm/h durante al menos 5 CV con tampón TRIS 25 mM y NaCl 0,05 M pH 7, luego se lava 1500 cm/h durante al menos 3 CV con tampón TRIS 25 mM pH 7,2, luego se eluye a 1500 cm/h con tampón glicina 50 mM pH 2,8, seguido por limpieza de la columna a 1500 cm/h con ácido fosfórico 150 mM, seguido por reequilibrado a 1500 cm/h con tampón TRIS 25 mM pH 7,2.

Cuando se inicia la tercera etapa, la tercera columna se conecta con la primera columna. Este grupo de columnas se carga con la muestra preparada a 1032 cm/h, mientras que la segunda columna se lava a 1500 cm/h durante al menos 5 CV con tampón TRIS 25 mM y NaCl 0,05 M pH 7, luego se lava a 1500 cm/h durante al menos 3 CV con tampón TRIS 25 mM pH 7,2, luego se eluye a 1500 cm/h con tampón glicina 50 mM pH 2,8, seguido por limpieza de la columna a 1500 cm/h con ácido fosfórico 150 mM, seguido por reequilibrado a 1500 cm/h con tampón TRIS 25 mM pH 7,2.

Las etapas nombradas se repitieron al menos dos veces.

Las fracciones eluidas dieron como resultado una capacidad de unión al lecho empaquetado >30 mg/ml y una pérdida de molécula diana <5% y la productividad promedio de 407,24 g/ml/h (en comparación con el funcionamiento discontinuo la productividad era de 34,97 g/ml/h), que constituían el 99,9% de todos los componentes (según SEC analítica), donde la cantidad de HCP promedio era de 900 ppm (según el ensayo inmunoenzimático NH0).

Las condiciones experimentales se compararon con dos casos discontinuos individuales, donde las condiciones convencionales de purificación discontinua se aplicaron usando un tiempo de residencia de 4 minutos para las condiciones de carga y lavado, elución, CIP y reequilibrado idénticas a las facilitadas anteriormente. Y en el segundo caso donde la carga de un funcionamiento discontinuo convencional se realizó a un tiempo de residencia de 0,32 minutos. La productividad obtenida en este caso fue de 101,95 g/ml/h.

d) Purificación continua de AcM-x (3,5 mg/ml) en PUP

El anticuerpo monoclonal AcM-x en disolución de cultivo celular (SP2/0), que tenía anticuerpo monoclonal 3,5 mg/ml que constituía una fracción del 45% de todos los componentes en la disolución (según SEC analítica), donde la cantidad de HCP era de 450000 ng/mg de anticuerpo (según el ensayo inmunoenzimático SP2/0), se purificó en la resina de ProtA (PUP) en las siguientes condiciones. Columnas de cromatografía: se empaquetó resina PUP en una columna de 16 x 55 mm; entonces se equilibró la columna con tampón PBS 25 mM pH 7,2 a 33,3 ml/min. En total se empaquetaron tres columnas. Para preparar la muestra: se filtró una disolución de cultivo celular de anticuerpo monoclonal a través de un filtro de 0,45 |jm. La conductividad de la disolución era de aproximadamente 17 mS/cm y pH 5,8. Las tres columnas se unieron a un sistema cromatográfico continuo, permitiendo una conexión entre la primera columna y la segunda columna, así como una conexión entre la segunda columna y la tercera columna y una conexión entre la tercera columna y la primera columna. Todo el experimento se divide en tres etapas. Cuando se inicia la primera etapa, la primera columna se conecta con la segunda columna. Este grupo de columnas se carga con la muestra preparada a 920 cm/h, mientras que la tercera columna se lava a 1500 cm/h durante al menos 5 CV con tampón TRIS 25 mM y NaCl 0,05 M pH 7, luego se lava a 1500 cm/h durante al menos 3 CV con tampón TRIS 25 mM pH 7,2, luego se eluye a 1500 cm/h con tampón glicina 50 mM pH 2,8, seguido por limpieza de la columna a 1500 cm/h con ácido fosfórico 150 mM, seguido por reequilibrado a 1500 cm/h con tampón TRIS 25 mM pH 7,0.

Cuando se inicia la segunda etapa, la segunda columna se conecta con la tercera columna. Este grupo de columnas se carga con la muestra preparada a 920 cm/h, mientras que la primera columna se lava a 1500 cm/h durante al menos 5 CV con tampón TRIS 25 mM y NaCl 0,05 M pH 7, luego se lava a 1500 cm/h durante al menos 3 CV con tampón TRIS 25 mM pH 7,2, luego se eluye a 1500 cm/h con tampón glicina 50 mM pH 2,8, seguido por limpieza de la columna a 1500 cm/h con ácido fosfórico 150 mM, seguido por reequilibrado a 1500 cm/h con tampón TRIS 25 mM pH 7,2. Cuando se inicia la tercera etapa, la tercera columna se conecta con la primera columna. Este grupo de columnas se carga con la muestra preparada a 920 cm/h, mientras que la segunda columna se lava a 1500 cm/h durante al menos 5 CV con tampón TRIS 25 mM y NaCl 0,05 M pH 7, luego se lava a 1500 cm/h durante al menos 3 CV con tampón TRIS 25 mM pH 7,2, luego se eluye a 1500 cm/h con tampón glicina 50 mM pH 2,8, seguido por limpieza de la columna a 1500 cm/h con ácido fosfórico 150 mM, seguido por reequilibrado a 1500 cm/h con tampón TRIS 25 mM pH 7,2.

Las etapas nombradas se repitieron al menos dos veces.

Las fracciones eluidas dieron como resultado una capacidad de unión al lecho empaquetado >57,1 mg/ml y una pérdida de molécula diana <5% en la carga y una pérdida de molécula diana del -5% en la elución dando como resultado una recuperación de producto del 90% y la productividad promedio de 572 g/ml/h (en comparación con el funcionamiento discontinuo la productividad era de 46,19 g/ml/h), que constituían el 99,9% de todos los componentes (según SEC analítica), donde la cantidad de HCP promedio era de 2100 ppm (según el ensayo inmunoenzimático SP2/0).

Las condiciones experimentales se compararon con dos casos discontinuos individuales, donde las condiciones convencionales de purificación discontinua se aplicaron usando un tiempo de residencia de 4 minutos para las condiciones de carga y lavado, elución, CIP y reequilibrado idénticas a las facilitadas anteriormente. Y en el segundo caso donde la carga de un funcionamiento discontinuo convencional se realizó a un tiempo de residencia de 0,36 minutos. La productividad obtenida en este caso fue de 88,7 g/ml/h.

Ejemplo III

Pueden usarse otros materiales en la aplicación también, tales como MabSelect Sure, aunque debe tenerse en cuenta que las condiciones de funcionamiento no son las mismas que las mostradas anteriormente para el material de PUP. Tan solo como ejemplo, se aplica habitualmente MabSelect Sure a 500 cm/h y MabSelect Xtra a 300 cm/h. Obsérvese la figura a continuación que presenta la diferencia en la capacidad de unión alcanzable para el funcionamiento en el enfoque discontinuo y el presente enfoque continuo para materiales diferentes (PUP, MabSelect Xtra, MabSelect Sure) y dos títulos de AcM diferentes (1 mg y 5 mg/ml).

El anticuerpo monoclonal AcM-x en disolución de cultivo celular (SP2/0), que tenía anticuerpo monoclonal 0,68 mg/ml que constituía una fracción del 10% de todos los componentes en la disolución (según SEC analítica), donde la cantidad de HCP era de 450000 ng/mg de anticuerpo (según el ensayo inmunoenzimático SP2/0), se purificó en la resina de ProtA (MabSelect Sure) en las siguientes condiciones. Columnas de cromatografía: se empaquetó resina MabSelect Sure en una columna de 10 x 60 mm; entonces se equilibró la columna con tampón PBS 25 mM pH 7,2 a 20 ml/min. En total se empaquetaron tres columnas. Para preparar la muestra: se filtró una disolución de cultivo celular de anticuerpo monoclonal a través de un filtro de 0,45 |jm. La conductividad de la disolución era de aproximadamente 16 mS/cm y pH 6,8. Las tres columnas se unieron a un sistema cromatográfico continuo, permitiendo una conexión entre la primera columna y la segunda columna, así como una conexión entre la segunda columna y la tercera columna y una conexión entre la tercera columna y la primera columna. Todo el experimento se divide en tres etapas. Cuando se inicia la primera etapa, la primera columna se conecta con la segunda columna. Este grupo de columnas se carga con la muestra preparada a 917,2 cm/h, mientras que la tercera columna se lava a 1000 cm/h durante al menos 5 CV con tampón acetato 50 mM y NaCl 1,5 M pH 6,8, luego se lava a 1000 cm/h durante al menos 3 CV con tampón acetato 50 mM pH 6,8, luego se eluye con tampón ácido acético 20 mM pH 3,2, seguido por limpieza de la columna con hidróxido de sodio 50 mM, seguido por reequilibrado con tampón acetato 50 mM pH 6,8.

Cuando se inicia la segunda etapa, la segunda columna se conecta con la tercera columna. Este grupo de columnas se carga con la muestra preparada a 917,2 cm/h, mientras que la primera columna se lava a 1000 cm/h durante al menos 5 CV con tampón acetato 50 mM y NaCl 1,5 M pH 6,8, luego se lava a 1000 cm/h durante al menos 3 CV con tampón acetato 50 mM pH 6,8, luego se eluye con tampón ácido acético 20 mM pH 3,2, seguido por limpieza de la columna con hidróxido de sodio 50 mM, seguido por reequilibrado con tampón acetato 50 mM pH 6,8.

Cuando se inicia la tercera etapa, la tercera columna se conecta con la primera columna. Este grupo de columnas se carga con la muestra preparada a 917,2 cm/h, mientras que la segunda columna se lava a 1000 cm/h durante al menos 5 CV con tampón acetato 50 mM y NaCl 1,5 M pH 6,8, luego se lava a 1000 cm/h durante al menos 3 CV con tampón acetato 50 mM pH 6,8, luego se eluye con tampón ácido acético 20 mM pH 3,2, seguido por limpieza de la columna con hidróxido de sodio 50 mM, seguido por reequilibrado con tampón acetato 50 mM pH 6,8.

Las etapas nombradas se repitieron al menos dos veces.

Las fracciones eluidas dieron como resultado una capacidad de unión al lecho empaquetado >38 mg/ml y una pérdida de molécula diana <5% en la carga y una pérdida de molécula diana de ~2% en la elución dando como resultado una recuperación de producto del 93% y la productividad promedio de 102 g/ml/h (en comparación con el funcionamiento discontinuo la productividad era de 12,1 g/ml/h), que constituían el 99,9% de todos los componentes (según SEC analítica), donde la cantidad de HCP estaba entre 120-150 ppm (según el ensayo inmunoenzimático SP2/0).

Ejemplo IV

Tal como se comentó anteriormente, el concepto de cromatografía continua descrito anteriormente puede usarse en diferentes modos de cromatografía (por ejemplo cromatografía de intercambio iónico). Véase la figura 13 para conocer el potencial de este enfoque descrito expresado en la escala de capacidad de unión frente al tiempo de residencia. Para el funcionamiento con una única columna empaquetada con Eshmuno S, la capacidad de unión para AcM x disminuye con el tiempo de residencia decreciente debido a la resistencia a la transferencia de masa. Para un enfoque de cromatografía continua, la capacidad de unión no disminuye hasta ciertos valores de tiempo de residencia, lo que muestra el potencial de una mayor productividad a valores de tiempo de residencia más cortos. Adicionalmente, los valores de capacidad de unión son más altos en la ventana de tiempo de residencia investigada. Los ejemplos para este caso se facilitan a continuación: El anticuerpo monoclonal AcM-y en disolución de reserva de elución post-ProtA, que tenía anticuerpo monoclonal 5,5 mg/ml que constituía una fracción del 98% de todos los componentes en la disolución (según SEC analítica), donde la cantidad de HCP era de 2000 ng/mg de anticuerpo (según el ensayo inmunoenzimático CHO), se purificó en la resina de intercambio iónico (Eshmuno S) en las siguientes condiciones. Columnas de cromatografía: se empaquetó la resina Eshmuno S en una columna de 16 x 63 mm; entonces se equilibró la columna con tampón acetato 50 mM pH 4,5 a 33 ml/min. En total se empaquetaron cuatro columnas. Para preparar la muestra: se filtró la disolución de anticuerpo monoclonal post-ProtA a través de un filtro de 0,45 jm. La conductividad de la disolución era de aproximadamente 2 mS/cm y pH 4,8. Por consiguiente, se unieron tres o cuatro columnas a un sistema cromatográfico continuo, permitiendo una conexión entre la primera columna y la segunda columna, así como una conexión entre la segunda columna y la tercera columna y una conexión entre la tercera columna y la primera columna o permitiendo una conexión entre la primera columna y la segunda columna, así como una conexión entre la segunda columna y la tercera columna y una conexión entre la tercera columna y la cuarta columna y la conexión entre la cuarta columna y la primera columna.

Todo el experimento para el enfoque de tres columnas se divide en tres etapas. Cuando se inicia la primera etapa, la primera columna se conecta con la segunda columna. Este grupo de columnas se carga con la muestra preparada a 810 cm/h, mientras que la tercera columna se lava a 1000 cm/h durante al menos 3 CV con acetato 50 mM pH 4,5, luego se eluye con tampón TRIS 50 mM, NaCl 250 mM, pH 7,5, seguido por limpieza de la columna con hidróxido de sodio 500 mM, seguido por reequilibrado con tampón acetato 50 mM pH 4,5.

Cuando se inicia la segunda etapa, la segunda columna se conecta con la tercera columna. Este grupo de columnas se carga con la muestra preparada a 810 cm/h, mientras que la primera columna se lava a 1000 cm/h durante al menos 3 CV con acetato 50 mM pH 4,5, luego se eluye con tampón TRIS 50 mM, NaCl 250 mM, pH 7,5, seguido por limpieza de la columna con hidróxido de sodio 500 mM, seguido por reequilibrado con tampón acetato 50 mM pH 4,5.

Cuando se inicia la tercera etapa, la tercera columna se conecta con la primera columna. Este grupo de columnas se carga con la muestra preparada a 810 cm/h, mientras que la segunda columna se lava a 1000 cm/h durante al menos 3 CV con acetato 50 mM pH 4,5, luego se eluye con tampón TRIS 50 mM, NaCl 250 mM, pH 7,5, seguido por limpieza de la columna con hidróxido de sodio 500 mM, seguido por reequilibrado con tampón acetato 50 mM pH 4,5. Las etapas nombradas se repitieron al menos dos veces.

Por consiguiente, todo el experimento para el enfoque de cuatro columnas se divide en cuatro etapas. Cuando se inicia la primera etapa, la primera columna se conecta con la segunda columna. Este grupo de columnas se carga con la muestra preparada a 810 cm/h, mientras que la cuarta columna se lava a 810 cm/h durante al menos 3 CV con acetato 50 mM pH 4,5 y se conecta con la tercera columna, entonces la tercera columna se conecta con la segunda columna y la cuarta columna se lava a 1000 cm/h con acetato 50 mM pH 4,5, luego se eluye con tampón TRIS 50 mM, NaCl 250 mM, pH 7,5, seguido por limpieza de la columna con hidróxido de sodio 500 mM, seguido por reequilibrado con tampón acetato 50 mM pH 4,5.

Cuando se inicia la segunda etapa, la segunda columna se conecta con la tercera columna. Este grupo de columnas se carga con la muestra preparada a 810 cm/h, mientras que la primera columna se lava a 810 cm/h durante al menos 3 CV con acetato 50 mM pH 4,5 y se conecta con la cuarta columna, entonces la cuarta columna se conecta con la tercera columna y la primera columna se lava a 1000 cm/h con acetato 50 mM pH 4,5, luego se eluye con tampón TRIS 50 mM, NaCl 250 mM, pH 7,5, seguido por limpieza de la columna con hidróxido de sodio 500 mM, seguido por reequilibrado con tampón acetato 50 mM pH 4,5. Cuando se inicia la tercera etapa, la tercera columna se conecta con la cuarta columna. Este grupo de columnas se carga con la muestra preparada a 810 cm/h, mientras que la segunda columna se lava a 810 cm/h durante al menos 3 CV con acetato 50 mM pH 4,5 y se conecta con la primera columna, entonces la primera columna se conecta con la cuarta columna y la segunda columna se lava a 1000 cm/h con acetato 50 mM pH 4,5, luego se eluye con tampón TRIS 50 mM, NaCl 250 mM, pH 7,5, seguido por limpieza de la columna con hidróxido de sodio 500 mM, seguido por reequilibrado con tampón acetato 50 mM pH 4,5.

Cuando se inicia la cuarta etapa, la cuarta columna se conecta con la primera columna. Este grupo de columnas se carga con la muestra preparada a 810 cm/h, mientras que la tercera columna se lava a 810 cm/h durante al menos 3 CV con acetato 50 mM pH 4,5 y se conecta con la segunda columna, entonces la segunda columna se conecta con la primera columna y la tercera columna se lava a 1000 cm/h con acetato 50 mM pH 4,5, luego se eluye con tampón TRIS 50 mM, NaCl 250 mM, pH 7,5, seguido por limpieza de la columna con hidróxido de sodio 500 mM, seguido por reequilibrado con tampón acetato 50 mM pH 4,5.

Las etapas nombradas se repitieron al menos dos veces.

Las fracciones eluidas dieron como resultado una capacidad de unión al lecho empaquetado >55 mg/ml y una pérdida de molécula diana <5% en la carga y una pérdida de molécula diana de ~4% en la elución para el concepto de tres columnas dando como resultado una recuperación de producto del 91% para el concepto de tres columnas y una recuperación del 96% para el concepto de cuatro columnas. La productividad promedio de 666 g/ml/h para el concepto de tres columnas y de 720 g/ml/h para el concepto de cuatro columnas (en comparación con el funcionamiento discontinuo la productividad era de 76,8 g/ml/h), que constituían el 99,9% de todos los componentes (según SEC analítica), donde la cantidad de HCP estaba entre 400-430 ppm (según el ensayo inmunoenzimático CHO).

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Método de purificación de moléculas diana de una o más impurezas en una muestra clarificada, mediante lo cual la molécula diana es una proteína o una mezcla de dos o más proteínas, comprendiendo el método las etapas de a) proporcionar al menos tres unidades de separación que tienen la misma matriz de cromatografía que están conectadas de modo que puede fluir líquido al menos desde una unidad de separación hasta la siguiente y desde la última hasta la primera unidad de separación

b) alimentar la muestra en una primera unidad de separación de modo que, mientras la muestra se carga en esta unidad de separación en la que la muestra está a un primer pH y conductividad que permiten que las moléculas diana se unan a esta unidad de separación, dicha unidad de separación está al menos parte del tiempo de carga en comunicación de fluido con la siguiente unidad de separación, de modo que las moléculas diana no unidas a dicha primera unidad de separación pueden unirse a la siguiente unidad de separación, al mismo tiempo al menos lavar, eluir y reequilibrar una unidad de separación diferente de la unidad de separación que está cargándose y de la que está en comunicación de fluido con la unidad de separación que está cargándose

c) cambiar la alimentación a la siguiente unidad de separación

d) alimentar la muestra en la siguiente unidad de separación de modo que, mientras la muestra está cargándose en dicha siguiente unidad de separación en la que la muestra está a un primer pH y conductividad que permiten que las moléculas diana se unan a dicha siguiente unidad de separación, dicha siguiente unidad de separación está al menos parte del tiempo de carga en comunicación de fluido con la unidad de separación después de la siguiente, de modo que las moléculas diana no unidas a dicha siguiente unidad de separación pueden unirse a la unidad de separación después de la siguiente, al mismo tiempo al menos lavar, eluir y/o reequilibrar una unidad de separación diferente de la unidad de separación que está cargándose y de la que está en comunicación de fluido con la unidad de separación que está cargándose

e) repetir las etapas c) y d) una o más veces,

caracterizado porque la alimentación nunca se detiene y tiene una velocidad por encima de 800 cm/h y porque la matriz de cromatografía de las unidades de separación comprende partículas con un diámetro de tamaño de partícula promedio de entre 30 y 200 |jm y con diámetros de poro promedio en el intervalo entre 50 nm y 200 nm y porta ligandos de afinidad o ligandos de intercambio iónico.

2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque se proporcionan tres, cuatro o cinco unidades de separación que tienen la misma matriz de cromatografía en la etapa a).

3. Método según las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque la matriz de cromatografía de las unidades de separación comprende partículas con un diámetro de tamaño de partícula promedio de entre 55 y 100 jm.

4. Método según una o más de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la matriz de cromatografía de las unidades de separación comprende partículas con diámetros de poro promedio en el intervalo entre 60 nm y 100 nm.

5. Método según una o más de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque en las etapas b), c) y d), la unidad de separación que está cargándose está no solo parte del tiempo de carga, sino a lo largo de todo el tiempo de carga en comunicación de fluido con la siguiente unidad de separación.

6. Método según una o más de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque en las etapas b), c) y d), la comunicación de fluido entre la unidad de separación que está cargándose y la siguiente unidad de separación comienza en la segunda mitad del tiempo de carga.

7. Método según una o más de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque cuando se lava la unidad de separación cargada, el líquido de lavado que eluye de dicha unidad de separación cargada se dirige a la entrada de otra unidad de separación.

8. Método según una o más de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque las moléculas diana que se eluyen de las unidades de separación se someten además a al menos una etapa de purificación de flujo continuo.

9. Procedimiento para purificar proteínas que comprende el método según la reivindicación 1 caracterizado porque el procedimiento comprende además una o más de las siguientes etapas:

- clarificación

- inactivación de virus

- purificación de flujo continuo

- filtración estéril.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, caracterizado porque al menos dos etapas del procedimiento se solapan en al menos una porción de su duración.