ES2855973T3

ES2855973T3 - Nuevo anticuerpo útil en trastornos neurológicos o neurodegenerativos

Info

Publication number: ES2855973T3
Application number: ES14731163T
Authority: ES
Inventors: Fabian Docagne; Richard Macrez; Denis Vivien; Karl-Uwe Petersen
Original assignee: Paion Deutschland GmbH; Universite de Caen Normandie; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Paion Deutschland GmbH; Universite de Caen Normandie; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 2013-05-21
Filing date: 2014-05-21
Publication date: 2021-09-27
Anticipated expiration: 2034-05-21
Also published as: WO2014187879A2; EP2805972A1; EP2999715A2; US10072077B2; US20180371082A1; JP2016531085A; DK2999715T3; JP6865581B2; JP2019201655A; WO2014187879A3; US20160115230A1; PT2999715T; EP2999715B1

Abstract

Un anticuerpo monoclonal contra el receptor NMDA o un fragmento del mismo, en donde dicho anticuerpo o fragmento del mismo inhibe la interacción entre el receptor NMDA y t-PA, y en donde dicho anticuerpo o fragmento del mismo es capaz de unirse a un epítopo que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 y los fragmentos peptídicos: - LVSDDHEGRAAQKRL, - DDHEGRAAQKRLETL, - EGRAAQKRLETLLEE, y - AAQKRLETLLEERES.

Description

DESCRIPCIÓN

Nuevo anticuerpo útil en trastornos neurológicos o neurodegenerativos

Sector de la técnica

La presente invención se refiere al campo de los anticuerpos. En particular, proporciona un anticuerpo anti-NMDA o un fragmento del mismo que es eficaz en la inhibición de los efectos nocivos del activador de plasminógeno de tipo tisular (t-PA) mediado por receptores de N-metil-D-aspartato (NMDA) que son tóxicos para las neuronas y ocasionan daño a la unidad neurovascular/barrera hematoencefálica (BHE) o la regulan de una manera que conduce a consecuencias patológicas. También se proporcionan usos médicos, en particular para el tratamiento de trastornos neurológicos o neurodegenerativos, p.ej., esclerosis múltiple.

Estado de la técnica

La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad tanto inflamatoria como degenerativa del sistema nervioso central (SNC). Está caracterizada por la infiltración de células inmunitarias, pérdida de mielina debido a la muerte de las células oligodendrocíticas y daños axonales.

La causa o las causas de la EM no se han probado de manera definitiva. Se cree que la EM es una enfermedad inmunomediada en la que el propio sistema inmunitario del organismo daña las estructuras del sistema nervioso. Aunque su fisiopatología no se conoce bien, los resultados de modelos animales sugieren que los procesos excitotóxicos están implicados en la patología de la EM (Pitt et al., 2000; Correa et al., 2007). De hecho, la homeostasis de glutamato desequilibrada contribuye a la patología axonal y oligodendroglial en la EM humana, sugiriendo que este desequilibrio podría manipularse con un objetivo terapéutico (Werner et al., 2001). Por ejemplo, se ha demostrado que los bloqueadores de los receptores NMDA, tales como memantina, atenúan el daño de la sustancia blanca (Manning et al., 2008). Una fuerte liberación de glutamato por los leucocitos y las células gliales, un metabolismo alterado de glutamato o una captación alterada de glutamato pueden constituir los principales mecanismos que conducen a un aumento de los niveles extracelulares de glutamato. Aparte de la EM, la excitotoxicidad del glutamato también parece estar implicada en otros trastornos desmielinizantes, tal como la enfermedad de Devic o la mielitis transversa idiopática.

Además de la excitotoxicidad del glutamato, se ha sugerido la participación de serina proteasas (tal como t-PA) en la EM. Realmente, t-PA puede promover la desmielinización, porque la plasmina (que se genera por la acción de t-PA sobre el plasminógeno) puede degradar directamente la proteína básica de mielina (MBP, por sus siglas en inglés) (Cammer et al., 1978). Además, la plasmina es el iniciador clave de la cascada de activación de las metaloproteinasas de la matriz (MMP, por sus siglas en inglés). Se ha documentado que la actividad de las MMP tiene un papel importante en la degradación de las membranas de mielina (Cuzner y Opdenakker, 1999). Curiosamente, también se informó que t-PA promueve la muerte neuronal excitotóxica (Nicole et al., 2001) y contribuye al daño de oligodendrocitos inducido por glutamato (Pitt et al., 2000). Por otra parte, la alteración de la fibrinólisis impulsada por t-PA puede contribuir al daño axonal en la EM (East et al., 2005). Varios grupos sugieren una relación entre t-PA y la transmisión glutamatérgica (Nicole et al, 2001, Fernandez-Monreal et al., 2004; Samson et al., 2008, para revisión: Yepes et al., 2009). Cabe destacar que, las diversas funciones de t-PA en el organismo prohíben un enfoque mediante el cual t-PA se neutralizaría totalmente. Esto se indica por el hallazgo de que ratones t-PA'/_, después de un inicio tardío de una enfermedad sintomática, muestran una mayor gravedad y una recuperación tardía en el modelo de encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE) de EM (Lu et al., 2002). t-PA es una serina proteasa con dos caras, que muestra roles clave en el espacio intravascular, en la interfaz entre la sangre y el cerebro y en el parénquima cerebral (para revisión: Yepes et al., 2008). En el compartimento intravascular, el sustrato principal de t-PA es el plasminógeno zimógeno inactivo y su función principal es promover la fibrinólisis. El t-PA obtenido de la sangre puede cruzar tanto la barrera hematoencefálica intacta como la dañada (Benchenane et al. 2005a, Benchenane et al., 2005b) y por lo tanto puede, junto con t-PA producido de manera endógena, interactuar en el parénquima cerebral con una variedad de sustratos, ampliando sus funciones, de este modo, por encima de la degradación de la matriz extracelular impulsada por t-PA/plasminógeno.

Existe un creciente conjunto de datos que indica que la interacción entre t-PA y el receptor de N-metil-D-aspartato (NMDAR), la proteína relacionada con el receptor de lipoproteínas de baja densidad (LRP, por sus siglas en inglés), la anexina II en células gliales y/o neuronas activas los procesos de señalización celular, que pueden, cuando son excesivos, dar lugar a resultados nocivos que incluyen edema cerebral, transformación hemorrágica y muerte celular. En función de estos múltiples efectos fisiopatológicos de t-PA, la participación de t-PA endógeno (respaldado por los efectos secundarios del rt-PA aplicado de manera exógena) se analiza más allá del papel establecido en los trastornos isquémicos para varios trastornos neurológicos o neurodegenerativos tales como epilepsia, enfermedad de Alzheimer, esclerosis múltiple o meningitis.

Los receptores NMDA sinápticos se pueden distinguir de los receptores NMDA extrasinápticos en la forma en que la hipoactividad de los receptores NMDa sinápticos es perjudicial para las neuronas. La potenciación de su actividad desencadena múltiples vías neuroprotectoras. Los niveles bajos de activación de NMDAR extrasinápticos no tienen efectos sobre la supervivencia neuronal, pero se ha informado que el aumento de su actividad activa las vías de muerte celular y agrava determinados procesos neurodegenerativos (Hardingham y Bading, 2010). Por tanto, los medios para efectuar una reducción específica de la actividad de los receptores NMDA extrasinápticos, evitando al de los sinápticos, sería un objetivo terapéutico prometedor en enfermedades neurológicas.

La formación de infiltrados inflamatorios cerebrales contribuye significativamente al desarrollo de déficits neuronales en una serie de trastornos cerebrales como la EM (Zipp et al., 2006). En condiciones fisiológicas, el endotelio microvascular cerebral, junto con las células gliales adjuntas y sus extensiones, actúa como una barrera hematoencefálica (BHE) a través de sus complejos de unión estrecha, limitando así, la entrada de leucocitos.

La invasión cerebral de las células inmunitarias necesita la apertura de las uniones estrechas endoteliales y el daño a la BHE es un sello distintivo de muchos trastornos neurológicos. El conocimiento de los procesos moleculares y celulares de la BHE subyacentes a la inflamación cerebral puede ayudar en la formulación de nuevos enfoques terapéuticos dirigidos a preservar la BHE y modular la entrada celular. Curiosamente, también se describió que t-PA altera las reacciones inflamatorias en el SNC aumentando la permeabilidad de la barrera hematoencefálica (Paterson et al., 1987). Los resultados recientes indican que t-PA facilita la apertura de la BHE inducida por monocitos y el posterior recorrido de los monocitos a través de la BHE humana y de rata. in vitro (Reijerkerk et al., 2008).

La prevalencia de EM está entre 2 y 150 por 100.000. No se conoce cura para la esclerosis múltiple. Los objetivos de la terapia para la EM son principalmente restaurar la función, para prevenir los ataques de EM y detener la progresión de la discapacidad.

Para el tratamiento sintomático de las crisis graves de EM, se utilizan corticosteroides de forma habitual. Sin embargo, no parecen tener efectos significativos a largo plazo. Para el tratamiento modificador de la esclerosis múltiple, actualmente se utilizan fumarato de dimetilo, fingolimod, acetato de glatirámero, interferón-beta 1 mitoxantrona, natalizumab y teriflunomida. La mayoría de estos fármacos solamente están aprobados para el subtipo de EM remitente-recurrente, en la que son algo eficaces para disminuir el número de crisis. Adicionalmente, se ha informado que MK-801 (dizocilpina) es neuroprotector y eficaz en un modelo de esclerosis múltiple. Sin embargo, MK-801 es un antagonista del receptor NMDA no selectivo, que tiene efectos adversos inaceptables.

Los problemas de los medicamentos que se utilizan actualmente en la EM incluyen efectos adversos y escasa tolerabilidad. El anticuerpo que se utiliza actualmente en la esclerosis múltiple, natalizumab, es un anticuerpo monoclonal humanizado que reconoce la molécula de adhesión celular integrina a4. Después de estar relacionado con la afección neurológica leucoencefalopatía multifocal progresiva (LMP), se había retirado transitoriamente del mercado estadounidense. Otros efectos adversos notificados de natalizumab incluyen hepatotoxicidad.

Los anticuerpos contra el receptor NMDA se conocen como tales (véase, por ejemplo, el documento EP 2289 542 A1), pero no se han divulgado epítopos o regiones determinantes de la complementariedad (CDR) específicos. Los anticuerpos contra el receptor NMDA se encuentran en una determinada enfermedad autoinmunitaria, encefalitis contra receptores NMDA. Estos anticuerpos se unen a la subunidad NR1 (también denominada GlunN1) del receptor NMDA, y se ha definido su epítopo de unión (Gleichman et al., 2012). Al unirse, estos anticuerpos desencadenan efectos similares a los de mK-⁸⁰¹, pero los efectos son más graves. Los anticuerpos desencadenan una rápida estimulación de los receptores NMDA y su posterior internalización. Por lo tanto, los receptores NMDA ya no pueden estimularse, en particular aquellos cuya activación tiene un efecto neuroprotector. Los pacientes que padecen encefalitis contra receptores NMDA presentan ansiedad aguda, cambios de comportamiento o psicosis y aparecen convulsiones o déficits neuropsicológicos. En días o semanas, aparecen conciencia reducida, trastornos del movimiento, hipoventilación y desequilibrio autonómico, lo que a con frecuencia hace necesario el ingreso en unidades de cuidados intensivos.

Objeto de la invención

Por tanto, existe una necesidad continua de medios novedosos, y preferentemente mejorados, para el tratamiento de la EM. Por lo tanto, el objetivo de la presente invención es proporcionar un medio novedoso para el tratamiento de un trastorno neurológico o neurodegenerativo tal como la EM.

De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, este objetivo se resuelve mediante un anticuerpo contra receptores NMDA o un fragmento del mismo, en donde dicho anticuerpo o fragmento

(a) es capaz de unirse a un epítopo que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 y los fragmentos peptídicos LVSDDHEGRAAQKRL DDHEGRAAQKRLETL EGRAAQKRLETLLEE y

AAQKRLETLLEERES.

(b) comprende una o más regiones determinantes de la complementariedad que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 29, 30, 31, 32, 33 y 34 o

(c) comprende una o más regiones determinantes de la complementariedad que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 29, 30, 31, 32, 33 y 34 que está alterada en una o dos posiciones de aminoácidos o que contiene una inserción de uno o más aminoácidos, y que son equivalentes funcionales de las correspondientes regiones determinantes de la complementariedad inalteradas. El epítopo mencionado anteriormente está en una región de la subunidad NR1 (también denominada GluN1) del receptor NMDA que interactúa con t-PA y está conservada entre especies. Los presentes inventores han descubierto que un anticuerpo que se une a este epítopo o que tiene las regiones determinantes de la complementariedad mencionadas anteriormente es capaz de inhibir los efectos nocivos del activador de plasminógeno de tipo tisular (t-PA) mediados por el receptor de N-metil-D-aspartato (NMDA). Tal como se describe a continuación, dicho anticuerpo bloquea la potenciación de las lesiones inducidas por t-PA, y también tiene un efecto en ausencia de t-PA administrado de manera exógena, lo que significa que tiene un efecto sobre t-PA endógeno. Sin embargo, en ausencia total de t-PA, el anticuerpo no tiene ningún efecto. Se puede concluir que el anticuerpo inhibe la interacción entre el receptor NMDA y t-PA. De este modo, se mitigan o evitan las consecuencias dañinas asociadas con esta interacción. Mediante esta acción específica en una diana circunscrita, otras funciones de t-PA que son beneficiosas, tal como su papel en la restauración del flujo sanguíneo vascular y la reorganización de la matriz celular, permanecen intactas.

Por consiguiente, el anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con la invención es útil como medio para el tratamiento de un trastorno neurológico o neurodegenerativo tal como la EM.

Los anticuerpos autorreactivos en la encefalitis contra receptores NMDA se unen a una región en el dominio aminoterminal de la subunidad NR1 que implica la región de los restos 368 y 369 y una región de la posición de aminoácidos 144 a 156, regiones que están muy próximas en el dominio plegado (Gleichman et al., 2012).

Estos anticuerpos autoinmunitarios ilustran los peligros de una estrategia que tenga como objetivo bloquear la interacción de t-PA con el receptor NMDA, que comparten con t-PA la subunidad NR1 como diana. Un anticuerpo puede ser propenso a causar encefalitis si interactúa con, bloquea o afecta de otro modo a los epítopos de unión de dichos anticuerpos autoinmunitarios perjudiciales. No obstante, los inventores actuales han logrado formular un anticuerpo que evita este riesgo.

Los presentes inventores han generado un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la invención después de la inmunización con un fragmento correspondiente a los aminoácidos 19 a 371 de la subunidad NR1. Aunque este fragmento incluía las regiones inmunogénicas reconocidas por los anticuerpos de la encefalitis contra receptores NMDA, los inventores han descubierto que el anticuerpo creado no provocó el efecto nocivo de los anticuerpos de la encefalitis contra receptores NMDA. Por otra parte, el anticuerpo de acuerdo con la invención bloqueó selectivamente solamente determinadas funciones del receptor NMDA. Los epítopos de unión de los anticuerpos de encefalitis contra receptores NMDA y el anticuerpo de acuerdo con la invención no se solapan. Los inventores también han encontrado anticuerpos generados después de la inmunización con el fragmento 19-371 que se unió fuera del epítopo descrito en la alternativa (a) anterior y no mostraron los efectos positivos del anticuerpo de acuerdo con la invención.

Un anticuerpo preferido de acuerdo con la invención tiene un perfil de eficacia favorable. Un anticuerpo particularmente preferido de acuerdo con la invención tiene una o más de las siguientes características: tiene una mayor eficacia (por ejemplo, en lo que respecta a la prevención de las crisis de la EM, una mejora o restauración de la función, un efecto neuroprotector o una parada en la progresión de la discapacidad), es más conveniente de usar, necesita administrarse con menos frecuencia o con menos regularidad o tiene menos efectos adversos o una mayor tolerabilidad en comparación con un medicamento anterior para la EM, es un anticuerpo de alta afinidad, tiene una baja reactividad cruzada, es seguro, económico o utilizable en subtipos de EM para los que actualmente no existe un tratamiento adecuado.

El término "anticuerpo" se refiere preferentemente a una proteína que comprende al menos dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras conectadas por enlaces disulfuro. El término "anticuerpo" incluye anticuerpos de origen natural, así como todas las formas recombinantes de anticuerpos, p. ej., anticuerpos expresados en procariotas, anticuerpos no glucosilados, anticuerpos humanizados y anticuerpos quiméricos. Cada cadena pesada consiste en una región variable de cadena pesada (VH) y una región constante de cadena pesada (CH). Cada cadena ligera consiste en una región variable de cadena ligera (VL) y una región constante de cadena ligera (CL). La región constante de cadena pesada comprende tres o, en el caso de anticuerpos de tipo IgM o IgE, cuatro dominios constantes de cadena pesada (CH1, CH2, CH3 y CH4) en donde el primer dominio constante CH1 es adyacente a la región variable y puede estar conectado al segundo dominio constante CH2 por una región de bisagra. La región constante de cadena ligera consiste solamente en un dominio constante. Las regiones variables pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR), en donde cada región variable comprende tres CDR y cuatro FR. Las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar en la unión de la inmunoglobulina a tejidos o factores del hospedador, incluyendo varias células del sistema inmunitario (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (C1q) del sistema del complemento clásico. El término "anticuerpo" de acuerdo con la invención, sin embargo, también incluye anticuerpos inusuales tal como los anticuerpos de cadena pesada, es decir, anticuerpos compuestos solamente por una o más, en particular dos cadenas pesadas y nanocuerpos, es decir, anticuerpos compuestos únicamente por un único dominio variable monomérico.

Como se usa en el presente documento, el término "proteína" se refiere a una cadena molecular de aminoácidos o un complejo de más de una cadena de aminoácidos. Una proteína puede contener cualquiera de los aminoácidos de origen natural, así como aminoácidos artificiales y puede ser de origen biológico o sintético. Una proteína puede modificarse, de manera natural (modificaciones postraduccionales) o sintética, por ejemplo, por glucosilación, amidación, carboxilación y/o fosforilación. Una proteína comprende al menos dos aminoácidos, pero no tiene que tener una longitud específica; este término no incluye restricciones de tamaño. En la presente solicitud, los términos "proteína", "polipéptido" y "péptido" se usan indistintamente. Preferentemente, una proteína comprende al menos 10 aminoácidos, preferentemente al menos 50 aminoácidos, al menos 100 aminoácidos y lo más preferido al menos 100 aminoácidos.

Un "fragmento o derivado" de un anticuerpo es preferentemente una proteína o glucoproteína que procede de dicho anticuerpo y es capaz de unirse al mismo antígeno, en particular al mismo epítopo que el anticuerpo. Por tanto, un fragmento o derivado de un anticuerpo en el presente documento generalmente se refiere a un fragmento o derivado funcional. En realizaciones particularmente preferidas, el fragmento o derivado de un anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada. Se ha demostrado que la función de unión a antígeno de un anticuerpo puede realizarse mediante fragmentos de un anticuerpo de longitud completa o derivados del mismo. Ejemplos de fragmentos o derivados de un anticuerpo incluyen (i) fragmentos Fab, fragmentos monovalentes que consisten en la región variable y el primer dominio constante de cada cadena pesada y ligera; (ii) fragmentos F(ab)2, fragmentos bivalentes que comprenden dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) fragmentos Fd que consisten en la región variable y el primer dominio constante CH1 de la cadena pesada; (iv) fragmentos Fv que consisten en la región variable de cadena pesada y cadena ligera de un único brazo de un anticuerpo; (v) fragmentos scFv, fragmentos Fv que consisten en una única cadena polipeptídica; (vi) fragmentos (Fv)2 que consisten en dos fragmentos Fv unidos covalentemente entre sí; (vii) un dominio variable de cadena pesada; y (viii) multicuerpos que consisten en una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera unidas covalentemente entre sí de tal manera que la asociación de las regiones variables de cadena pesada y de cadena ligera solamente se puede producir intermolecular pero no intramolecular. Estos fragmentos y derivados de anticuerpos se obtienen utilizando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia.

Una secuencia de aminoácidos diana "procede" de una secuencia de aminoácidos de referencia, por ejemplo, si la secuencia de aminoácidos diana comparte una homología o identidad en toda su longitud con una parte correspondiente de la secuencia de aminoácidos de referencia del 60 % o más, preferentemente 70 % o más, 75 % o más, más preferentemente del 80 % o más, 85 % o más, 90 % o más, 93 % o más, 95 % o más, 97 % o más, del 98 % o más, o del 99 % o más. Por ejemplo, si una región marco de un anticuerpo humanizado procede de una región variable de un anticuerpo humano particular, después, el aminoácido de la región marco del anticuerpo humanizado comparte una homología o identidad en toda su longitud con la región marco correspondiente del anticuerpo humano del 60 % o más, preferentemente 70 % o más, 75 % o más, más preferentemente del 80 % o más, 85 % o más, 90 % o más, 93 % o más, 95 % o más, 97 % o más, del 98 % o más, o del 99 % o más. La "parte correspondiente" o la "región marco correspondiente" significa que, por ejemplo, la región marco 1 de una región variable de cadena pesada (FRH1) de un anticuerpo diana corresponde a la región marco 1 de la región variable de cadena pesada del anticuerpo de referencia. Lo mismo ocurre, por ejemplo, para FRH2, FRH3, FRH4, FRL1, FRL2, FRL3 y FRL4. En realizaciones particulares, una secuencia de aminoácidos diana que "procede" de una secuencia de aminoácidos de referencia es 100 % homóloga, o en particular 100 % idéntica, en toda su longitud a una parte correspondiente de la secuencia de aminoácidos de referencia.

Preferentemente, un anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con la invención tiene dos regiones variables de cadena pesada que son idénticas entre sí y/o dos regiones variables de cadena ligera que son idénticas entre sí.

La expresión "comprenden", como se usa en el presente documento, además de su significado literal también incluye y preferentemente se refiere a las expresiones "consisten esencialmente en" y "consisten en", a menos que el contexto indique lo contrario. Por tanto, la expresión "comprende" se refiere a realizaciones en donde la materia objeto que "comprende" elementos de manera específica enumerados no comprende elementos adicionales, así como realizaciones en donde esto puede abarcar y/o de hecho abarca elementos adicionales. Análogamente, la expresión "tiene" debe entenderse de la misma manera que la expresión "comprende".

Tal como se menciona anteriormente, de acuerdo con determinadas realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con la invención comprende una o más regiones determinantes de la complementariedad que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 29, 30, 31, 32, 33 y 34, o equivalentes funcionales de las mismas, que en cada caso puede estar alterada en una o dos posiciones de aminoácidos o que puede contener en cada caso una inserción de uno o más aminoácidos (en particular una inserción de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 aminoácidos, presentando, preferentemente, dichos aminoácidos determinados por alineación con secuencias CDR humanas una alta homología con las CDR de las SEQ ID NO: 29, 30, 31, 32, 33 y 34, en donde las inserciones preferidas están entre los aminoácidos 4 y 5 de la SEQ ID NO: 29, entre los aminoácidos 4 y 5 de la SEQ ID NO: 30, entre los aminoácidos 4 y 5 de la SEQ ID NO: 31, entre los aminoácidos 6 y 7 de la SEQ ID NO: 32, entre los aminoácidos 2 y 3 de la SEQ ID NO: 33 y/o entre los aminoácidos 5 y 6 de la SeQ ID NO: 34).

La presente invención abarca realizaciones en las que el anticuerpo o fragmento comprende 1, 2, 3, 4, 5 o preferentemente 6 de las regiones determinantes de la complementariedad que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 29, 30, 31, 32, 33 y 34, o equivalentes funcionales de las mismas. En este contexto, las SEQ ID NO: 29, 30 y 31 corresponden preferentemente a la CDR1, CDR2 y CDR3 de una cadena pesada, respectivamente, y las SEQ ID NO: 32, 33 y 34 corresponden preferentemente a la CDR1, CDR2 y CDR3 de una cadena ligera, respectivamente.

La presente invención también proporciona un anticuerpo o un fragmento del mismo como se define en las reivindicaciones, que es capaz de unirse al menos a una porción de una región (preferentemente a la región completa) de un receptor NMDA que interactúa con t-PA y en donde dicha unión inhibe (parcial o totalmente, en particular con respecto a las consecuencias fisiológicas) la interacción entre el receptor NMDA y t-PA, por lo que al menos una función del receptor NMDA se inhibe de manera selectiva. Esta función es preferentemente una función nociva del receptor NMDA, más preferentemente una que está mediada o agravada por t-PA. Debido a que la unión t-PA- receptor NMDA en determinados contextos conduce a consecuencias indeseables, en particular en la esclerosis múltiple, la inhibición de dicha unión t-PA-receptor NMDA tiene un efecto terapéutico beneficioso. La selectividad de la inhibición del receptor NMDA es el resultado preferentemente de la inhibición de manera selectiva de determinadas funciones del receptor NMDA (por ejemplo, una entrada de calcio neurotóxica), o de la inhibición de manera selectiva de un determinado subconjunto de receptores NMDA (tal como un subconjunto que media efectos nocivos, por ejemplo, un subconjunto seleccionado del grupo que consiste en receptores NMDA sinápticos y extrasinápticos), preferentemente receptores NMDA extrasinápticos. Preferentemente, la unión del anticuerpo o fragmento no conduce a la estimulación del receptor NMDA, no conduce a una internalización del receptor NMDA y/o no altera la función normal del receptor NMDA. Preferentemente, la unión del anticuerpo o fragmento no provoca ninguna encefalopatía, ningún efecto conductual o,, en términos generales, ningún efecto nocivo en sí misma.

Preferentemente, el receptor NMDA es el receptor NMDA de rata o el humano. Preferentemente, t-PA es t-PA de rata o humano. Preferentemente, la región del receptor NMDA que interactúa con t-PA está en el dominio aminoterminal de la subunidad GluN1-1a (en particular en los aminoácidos 19 a 371 del mismo) del receptor NMDA. Dicho anticuerpo o fragmento se une solamente a una pequeña parte de una de las subunidades de NMDA. Esto permite una intervención específica en el receptor NMD^a, que no interfiere con la función fisiológica del receptor NMDA, sino que inhibe solamente la potenciación inducida por t-PA de la actividad del receptor NMDA.

Preferentemente, la unión del anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con la invención evita la escisión del dominio extracelular de la subunidad NR1 del receptor NMDA.

Preferentemente, el anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con la invención es capaz de unirse de forma específica (por ejemplo, al epítopo o a la región mencionados anteriormente). Por ejemplo, esto puede disminuir los efectos adversos o aumentar la tolerabilidad del anticuerpo, fragmento o derivado.

"Unión específica" significa preferentemente que un agente tal como un anticuerpo se une de manera más fuerte a una diana tal como un epítopo para el que es específico en comparación con la unión a otra diana. Un agente se une de manera más fuerte a una primera diana en comparación con una segunda diana si se une a la primera diana con una constante de disociación (Kd) que es menor que la constante de disociación para la segunda diana. Preferentemente, la constante de disociación para la diana a la que el agente se une de manera específica es más de 2 veces, preferentemente más de 5 veces, más preferentemente más de 10 veces, incluso más preferentemente más de 20 veces, 50 veces, 100 veces, 200 veces, 500 veces o 1000 veces menor que la constante de disociación para la diana a la que el agente no se une de manera específica. Lo más preferentemente, el agente no se une en absoluto a la segunda diana en un grado relevante.

Un anticuerpo preferido de acuerdo con la invención bloquea parcial o completamente la difusión en la superficie celular del receptor NMDA extrasináptico neuronal, en particular, la difusión en la superficie celular del receptor NMDA extrasináptico neuronal promovida por t-PA.

Preferentemente, el anticuerpo de acuerdo con la invención (i) suprime la migración de monocitos y/o linfocitos T a través de la barrera hematoencefálica y/o (ii) detiene el daño de la mielina de la médula espinal y la infiltración de células inmunitarias.

Una realización preferida de la presente invención es un anticuerpo como se describe anteriormente, que es un anticuerpo monoclonal, o un fragmento del mismo.

Preferentemente, el anticuerpo o fragmento como se describe anteriormente tiene una o más de las siguientes características:

(a) comprende una región marco de cadena pesada que comparte una homología o identidad del 80 % o más con una región marco que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 35, 36, 37 y 38 y/o una región marco de cadena ligera que comparte una homología o identidad del 80 % o más con una región marco que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 39, 40, 41 y 42, o

(b) muestra reactividad cruzada con un anticuerpo producido por un hibridoma depositado seleccionado del grupo que consiste en 15A4B2E5, 15A4B2F3, 15A4B2, 6C9A3, 6C9A3F4 y 6C9A3F6.

En el presente documento, las denominaciones de hibridomas tienen letras mayúsculas (tal como 15A4B2E5) y las denominaciones de anticuerpos monoclonales producidos por los hibridomas tienen letras minúsculas (tal como 15a4b2e5).

Preferentemente, como se describe anteriormente para las secuencias de aminoácidos procedentes de una secuencia de aminoácidos de referencia, la homología o identidad de secuencia es del 85 % o más, 90 % o más, 93 % o más, 95 % o más, 97 % o más, 98 % o más, 99 % o más, o 100 %.

En una realización preferida, un valor porcentual de homología o identidad de secuencia mencionado anteriormente se aplica a la región marco de cadena pesada y/o cadena ligera completa. Esto significa que, para la cadena pesada, la región variable de cadena pesada completa del anticuerpo, excluyendo las CDR, se compara con las SEQ ID Nos: 35, 36, 37 y 38 unidas, y para la cadena ligera, la región variable de cadena ligera completa del anticuerpo, excluyendo las CDR, se compara con las SEQ ID NO: 39, 40, 41 y 42 unidas.

En otra realización preferida, el anticuerpo como se describe anteriormente comprende una o dos regiones variables de cadena pesada que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 43 y/o comprende una o dos regiones variables de cadena ligera que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 44. Un fragmento preferido del mismo muestra reactividad cruzada con dicho anticuerpo. Preferentemente, un anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con la invención tiene dos de dichas regiones variables de cadena pesada y/o dos de dichas regiones variables de cadena ligera.

Otro derivado preferido tiene dos regiones variables de cadena pesada que son idénticas entre sí y comparten una homología o identidad de, por ejemplo, el 80 % o más en toda su longitud con una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 43 y/o tiene dos regiones variables de cadena ligera que son idénticas entre sí y comparten una homología o identidad de por ejemplo, 80 % o más en toda su longitud con una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 44.

Los anticuerpos específicos se producen inyectando un antígeno a un mamífero, tal como un ratón, rata, conejo, cabra, oveja o caballo. La sangre aislada de estos animales contiene anticuerpos policlonales dirigidos contra dicho antígeno en el suero. Para obtener un anticuerpo que sea específico para un único epítopo de un antígeno, los linfocitos secretores de anticuerpos se aíslan del animal y se inmortalizan fusionándolos con una línea celular cancerosa, dando como resultado células de hibridoma. A continuación, las células de hibridoma individuales se aíslan mediante clonación por dilución para generar clones de células que producen todos el mismo anticuerpo monoclonal.

Asimismo, el anticuerpo de acuerdo con la invención es preferentemente un anticuerpo humano, murino, de cabra, de primate o de camello o procede de los mismos. Puede ser un anticuerpo quimérico o humanizado. Puede ser un anticuerpo de cualquier isotipo o subclase del mismo, en particular del isotipo IgG, IgM, IgA, IgE o IgD o una subclase de los mismos, tal como IgG1. Preferentemente, el fragmento del anticuerpo de acuerdo con la invención se selecciona del grupo que consiste en un fragmento Fab, un fragmento F(ab)2, un fragmento Fd, un fragmento Fv, un fragmento scFv, un fragmento (Fv)2 y un multicuerpo. El anticuerpo o fragmento del mismo puede ser una construcción de cadena sencilla que comprende solamente una molécula de aminoácido, o una construcción de cadena múltiple que comprende más de una molécula de aminoácido que preferentemente están conectadas entre sí de manera covalente, por ejemplo, mediante enlaces disulfuro.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con la invención se modifica por ingeniería de tal manera que su región variable de cadena pesada (VH) contiene al menos una CDR que procede de un anticuerpo diferente en al menos una parte de la VH restante. Por ejemplo, la VH comprende al menos una CDR, preferentemente dos o tres CDR, procedentes de un anticuerpo, por ejemplo, de un anticuerpo de ratón, camello, de cabra o de primate, y al menos una FR, preferentemente dos, tres o cuatro FR, procedentes de otro anticuerpo o grupo de anticuerpos, preferentemente de anticuerpos de otra especie, en particular a partir de anticuerpos humanos. En esta realización, el anticuerpo o fragmento del mismo puede comprender además una región variable de cadena ligera (VL). En particular, la VL puede proceder del anticuerpo del que proceden una o más CDR de la VH, o la VL puede ser una construcción en donde una, dos o tres CDR proceden del mismo anticuerpo que una o más CDR de la VH, mientras que una, dos, tres o preferentemente las cuatro FR proceden de la misma especie, en particular, del mismo anticuerpo o grupo de anticuerpos que una o más FR de la VH. Por otra parte, el anticuerpo o fragmento del mismo puede comprender además una, dos, tres o cuatro regiones constantes de cadena pesada (CH) y/o una región constante de cadena ligera (CL) que proceden preferentemente de la misma especie, en particular, del mismo anticuerpo o grupo de anticuerpos que las FR de las regiones variables. En realizaciones preferidas, las FR de las regiones variables y las regiones constantes no proceden de un anticuerpo específico, sino que tienen una secuencia de aminoácidos que representa una secuencia consenso u otra secuencia preferida procedente de un grupo específico de anticuerpos, por ejemplo, un grupo de anticuerpos humanos.

En otra realización, el anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con la invención es quimérico y comprende una o más regiones variables de cadena pesada y opcionalmente de cadena ligera que proceden de un anticuerpo y una o más regiones constantes de cadena pesada y opcionalmente de cadena ligera que proceden de otro anticuerpo. Preferentemente, los dos anticuerpos diferentes son de especies diferentes, tal como, por ejemplo, las regiones variables proceden de un anticuerpo murino y las regiones constantes proceden de un anticuerpo humano.

El anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con la invención está preferentemente glucosilado. En realizaciones preferidas, tiene un patrón de glucosilación humano que también se encuentra en los anticuerpos de origen natural producidos por el cuerpo humano. Asimismo, el anticuerpo o fragmento o derivado del mismo puede comprender un patrón de glucosilación que modula, en particular potencia una o más actividades de los mismos. Por ejemplo, el patrón de glucosilación puede potenciar la afinidad del anticuerpo o del fragmento hacia su epítopo específico, y/o su afinidad hacia sus receptores aguas abajo, tal como los receptores Fc, en particular los receptores Fc gamma, Fc alfa o Fc épsilon. Adicionalmente, o como alternativa, el patrón de glucosilación puede potenciar su citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) y/o su citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC, por sus siglas en inglés). Finalmente, se puede usar un patrón de glucosilación especial para regular el tiempo de residencia del anticuerpo en el organismo de acuerdo con la necesidad médica. Para este fin, el patrón de glucosilación del anticuerpo o fragmento del mismo puede optimizarse o modificarse por ingeniería, por ejemplo, usando líneas celulares específicas que son capaces de producir el patrón de glucosilación deseado.

En determinadas realizaciones, el anticuerpo modificado por ingeniería o fragmento del mismo de acuerdo con la invención se acopla a un agente adicional, formando un conjugado. El agente adicional es preferentemente útil en tratamiento, diagnóstico, pronóstico y/o seguimiento de una enfermedad, en particular, de la esclerosis múltiple. Por ejemplo, el agente adicional puede seleccionarse del grupo que consiste en anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, en particular los de diferentes especies y/o diferente especificidad, enzimas, dominios de interacción, dominios estabilizadores, secuencias de señalización, marcadores detectables, colorantes fluorescentes, toxinas, anticuerpos catalíticos, componentes citolíticos, inmunomoduladores, inmunoefectores, antígenos MHC de clase I o de clase II, quelantes para el marcado radiactivo, radioisótopos, liposomas, dominios transmembrana, virus y células. Puede estar fijado de forma covalente, en particular mediante fusión o acoplamiento químico, o de forma no covalente al anticuerpo o fragmento del mismo.

El término "conjugado" significa preferentemente dos o más compuestos que están unidos entre sí de modo que al menos algunas de las propiedades de cada compuesto se conservan en el conjugado. La unión se puede lograr mediante un enlace covalente o no covalente. Preferentemente, los compuestos del conjugado están unidos mediante un enlace covalente. Los diferentes compuestos de un conjugado pueden unirse directamente entre sí mediante uno o más enlaces covalentes entre átomos de los compuestos. Como alternativa, los compuestos se pueden unir entre sí mediante una molécula enlazadora en donde el enlazador está fijado covalentemente a átomos de los compuestos. Si el conjugado está compuesto por más de dos compuestos, entonces estos compuestos pueden, por ejemplo, estar unidos en una conformación de cadena, un compuesto fijado al siguiente compuesto, o varios compuestos, pueden estar fijados cada uno a un compuesto central.

De acuerdo con un segundo aspecto, el problema subyacente a la presente invención se resuelve mediante un anticuerpo producido por un hibridoma depositado seleccionado del grupo que consiste en hibridomas depositados en la DSMZ con los números de acceso DSM ACC3203, DSM ACC3217, DSM ACC3216, DSM ACC3214, DSM ACC3220 y DSM ACC3215 o un fragmento de los mismos, que muestra reactividad cruzada con dicho anticuerpo. En un tercer aspecto de la presente invención, se proporciona un ácido nucleico que codifica el anticuerpo o un fragmento del mismo de acuerdo con la invención.

La expresión "ácido nucleico" incluye ácidos nucleicos y ácidos ribonucleicos monocatenarios y bicatenarios, así como ácidos desoxirribonucleicos. Puede comprender nucleótidos de origen natural, así como sintéticos. Un ácido nucleico puede ser natural o sintéticamente modificado, por ejemplo, por metilación, protección con caperuza 5' y/o 3'.

La secuencia del ácido nucleico del ácido nucleico de acuerdo con la invención puede tener cualquier secuencia de nucleótidos adecuada para codificar el anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con la invención. Sin embargo, preferentemente, la secuencia del ácido nucleico está adaptada al menos parcialmente al uso de codones específicos de la célula u organismo hospedador en el que se va a expresar el ácido nucleico de acuerdo con la invención. El ácido nucleico de acuerdo con la invención puede ser ADN o ARN bicatenario o monocatenario, preferentemente ADN bicatenario tal como ADNc o ARN monocatenario tal como ARNm. Puede ser una molécula de ácido nucleico consecutiva o puede estar compuesto por varias moléculas de ácido nucleico, cada una de los cuales codifica una parte diferente del anticuerpo o un fragmento del mismo de acuerdo con la invención.

Si el anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con la invención es una construcción monocatenaria, el ácido nucleico de acuerdo con la invención es preferentemente una molécula de ácido nucleico sencilla que contiene una región codificante que codifica el anticuerpo completo o fragmento o derivado del mismo. Si el anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con la invención está compuesto por más de una cadena de aminoácidos, el ácido nucleico de acuerdo con la invención puede, por ejemplo, ser una molécula de ácido nucleico sencilla que contiene varias regiones codificantes, cada una de las cuales codifica una de las cadenas de aminoácidos del anticuerpo o fragmento del mismo, preferentemente separadas por elementos reguladores tales como elementos IRES para generar cadenas de aminoácidos separadas, o el ácido nucleico de acuerdo con la invención puede estar compuesto por varias moléculas de ácido nucleico en donde cada molécula de ácido nucleico comprende una o más regiones codificantes, que codifica cada una, una de las cadenas de aminoácidos del anticuerpo o fragmento del mismo. Además de las regiones codificantes que codifican el anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con la invención, el ácido nucleico de acuerdo con la invención también puede comprender otras secuencias de un ácido nucleico u otras modificaciones que, por ejemplo, pueden codificar otras proteínas, pueden influir en la transcripción y/o traducción de la región o regiones codificantes, pueden influir en la estabilidad u otras propiedades físicas o químicas del ácido nucleico, o puede no tener ninguna función.

Un cuarto aspecto de la presente invención se refiere a un casete o vector de expresión que comprende el ácido nucleico de acuerdo con la invención y un promotor conectado operativamente con dicho ácido nucleico.

La expresión "casete de expresión" se refiere preferentemente a una construcción de un ácido nucleico que es capaz de permitir y regular la expresión de una secuencia de un ácido nucleico codificante introducida en el mismo. Un casete de expresión puede comprender promotores, sitios de unión a ribosomas, potenciadores y otros elementos de control que regulan la transcripción de un gen o la traducción de un ARNm. La estructura exacta de un casete de expresión puede variar en función de la especie o el tipo celular, pero generalmente comprende secuencias 5' no transcritas y 5' y 3' no traducidas que están implicadas en el inicio de la transcripción y traducción, respectivamente, tales como caja TATA, secuencia de protección con caperuza, secuencia CAAT y similares. Más específicamente, las secuencias de control de la expresión 5' no transcritas comprenden una región promotora que incluye una secuencia promotora para el control transcripcional del ácido nucleico conectado operativamente. Los casetes de expresión también pueden comprender secuencias potenciadoras o secuencias activadoras cadena arriba.

De acuerdo con la invención, el término "promotor" se refiere a una secuencia de un ácido nucleico que está ubicada cadena arriba (5') de la secuencia del ácido nucleico que se va a expresar y controla la expresión de la secuencia proporcionando un sitio de reconocimiento y unión para las ARN polimerasas. El "promotor" puede incluir más sitios de reconocimiento y unión para factores adicionales que están implicados en la regulación de la transcripción de un gen. Un promotor puede controlar la transcripción de un gen procariota o eucariota. Asimismo, un promotor puede ser "inducible", es decir, iniciar la transcripción en respuesta a un agente inductor, o puede ser "constitutivo" si la transcripción no está controlada por un agente inductor. Un gen que está bajo el control de un promotor inducible no se expresa o solamente se expresa en una pequeña extensión si no hay un agente inductor. En presencia del agente inductor, el gen se activa o aumenta el nivel de transcripción. Este proceso está mediado, en general, por la unión de un factor de transcripción específico.

El término "vector" se usa en el presente documento en su significado más general y comprende cualquier vehículo intermediario para un ácido nucleico que permite que dicho ácido nucleico, por ejemplo, se introduzca en células procariotas y/o eucariotas y, cuando sea adecuado, se integre en un genoma. Los vectores de este tipo se replican y/o expresan preferentemente en las células. Los vectores comprenden plásmidos, fagémidos, bacteriófagos o genomas víricos. El término "plásmido" como se usa en el presente documento generalmente se refiere a una construcción de material genético extracromosómico, generalmente una doble hélice de ADN circular, que puede replicarse independientemente del ADN cromosómico.

Además del ácido nucleico de acuerdo con la invención y el promotor, el casete o vector de expresión de acuerdo con la invención puede comprender elementos adicionales, en particular elementos que sean capaces de influir y/o regular la transcripción y/o traducción del ácido nucleico de acuerdo con la invención, la amplificación y/o reproducción del casete o vector de expresión, la integración del casete o vector de expresión en el genoma de una célula hospedadora, y/o el número de copias del casete o vector de expresión en una célula hospedadora. Los casetes y vectores de expresión adecuados que comprenden los correspondientes casetes de expresión para expresar anticuerpos son bien conocidos en la técnica y, por lo tanto, no necesitan más descripción en este caso.

En un quinto aspecto, la presente invención se refiere a una célula hospedadora que comprende el ácido nucleico de acuerdo con la invención o el casete o vector de expresión de acuerdo con la invención.

De acuerdo con la invención, la expresión "célula hospedadora" se refiere a cualquier célula que pueda transformarse o transfectarse con un ácido nucleico exógeno. La expresión "células hospedadoras" comprende células procariotas (por ejemplo, E. coli) o eucariotas (por ejemplo, células de mamífero, en particular células humanas, células de levadura y células de insecto). Se da preferencia particular a células de mamífero tales como células de seres humanos, ratones, hámsteres, cerdos, cabras o primates. Las células pueden proceder de una multiplicidad de tipos de tejidos y pueden comprender células primarias y líneas celulares. Un ácido nucleico puede estar presente en la célula hospedadora en forma de una sola copia o de dos o más copias y, en una realización, se expresa en la célula hospedadora.

La célula hospedadora de acuerdo con la invención puede ser cualquier célula hospedadora. Puede ser una célula aislada o una célula incluida en un tejido. Preferentemente, la célula hospedadora es una célula cultivada, en particular una célula primaria o una célula de una línea celular establecida. Preferentemente, es una célula bacteriana tal como E. coli, una célula de levadura tal como una célula de Saccharomyces (en particular S. cerevisiae), una célula de insecto, tal como una célula Sf9, o una célula de mamífero, en particular una célula humana, una célula de hámster tal como una célula CHO o una célula de primate. En realizaciones preferidas, la célula hospedadora está optimizada para la expresión de glucoproteínas, en particular, anticuerpos, que tiene un patrón de glucosilación específico. Preferentemente, el uso de codones en la región codificante del ácido nucleico de acuerdo con la invención y/o el promotor y los elementos adicionales del casete o del vector de expresión son compatibles con y, más preferentemente, están optimizados para el tipo de célula hospedadora utilizada. Preferentemente, el anticuerpo o fragmento o derivado del mismo de acuerdo con la invención es producido por una célula o línea celular hospedadora como se describe anteriormente.

En un sexto aspecto, la presente invención también proporciona una composición (preferentemente una composición farmacéutica) que comprende el anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con la invención, el ácido nucleico de acuerdo con la invención, el casete o vector de expresión de acuerdo con la invención o la célula hospedadora de acuerdo con la invención, y opcionalmente uno o más componentes seleccionados del grupo que consiste en transportadores, disolventes, diluyentes y excipientes, tales como un tampón, conservante o modificador de la tonicidad.

La composición también puede contener más de uno de cada uno de los componentes mencionados. En una composición farmacéutica preferida de acuerdo con la invención, todos los componentes son farmacéuticamente aceptables. La composición puede ser una composición sólida o líquida, en particular una solución, preferentemente acuosa, emulsión o suspensión o un polvo liofilizado.

la expresión "composición farmacéutica" se refiere particularmente a una composición adecuada para administrar a un paciente, es decir, una composición que contiene componentes que son farmacéuticamente aceptables.

El término "paciente" significa, de acuerdo con la invención, un ser humano, un primate no humano u otro animal, en particular, un mamífero tal como una vaca, caballo, cerdo, oveja, cabra, perro, gato o un roedor tal como un ratón y una rata. En una realización particularmente preferida, el paciente es un ser humano.

En un séptimo aspecto, la invención proporciona el anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con la invención, el ácido nucleico de acuerdo con la invención, el casete o vector de expresión de acuerdo con la invención, la célula hospedadora de acuerdo con la invención, o la composición (preferentemente farmacéutica) de acuerdo con la invención para su uso en medicina.

En un octavo aspecto, la invención proporciona el anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con la invención, el ácido nucleico de acuerdo con la invención, el casete o vector de expresión de acuerdo con la invención, la célula hospedadora de acuerdo con la invención, o la composición (preferentemente farmacéutica) de acuerdo con la invención para su uso en el tratamiento, pronóstico, diagnóstico y/o seguimiento de un trastorno neurológico o neurodegenerativo o como un neuroprotector.

El término "tratamiento" se refiere a cualquier medida médica para prevenir, reducir, mitigar o curar trastornos fisiológicos en un paciente que lo necesite.

La expresión "trastorno neurológico", como se usa en el presente documento, se define como una enfermedad, trastorno o afección que afecta directa o indirectamente al normal funcionamiento o a la anatomía del sistema nervioso del sujeto.

En el contexto de la invención, la expresión "trastorno neurodegenerativo" se define como una enfermedad en la que las células del sistema nervioso central o periférico se ven afectadas o se pierden.

Preferentemente, el trastorno neurológico o neurodegenerativo se selecciona del grupo que consiste en esclerosis múltiple, trastorno trombótico, accidente cerebrovascular, TIA, hemorragias intracerebrales (incluido accidente cerebrovascular hemorrágico), epilepsia, epilepsia del lóbulo temporal (TLE, por sus siglas en inglés), esclerosis lateral amiotrófica, tumores cerebrales, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, edema cerebral, complicación del SNC resultado de infecciones por parásitos, bacterianas, fúngicas o víricas, meningitis y encefalitis. Un trastorno neurológico o neurodegenerativo particularmente preferido es la esclerosis múltiple.

Ejemplos de trastornos neurológicos y/o neurodegenerativos también son daños cerebrales traumáticos, daño de la médula espinal, lesiones intracraneales o lesiones intravertebrales que incluyen, pero sin limitación, lesiones por contusión, penetración, cizalla, compresión o laceración de la médula espinal o síndrome del lactante sacudido por latigazo cervical.

En el contexto de la presente invención, los trastornos neurológicos también incluyen eventos isquémicos, o isquemia o trastornos isquémicos que pueden definirse como cualquier estado de hipoxia local o regional en células o tejidos que normalmente se debe a un suministro (circulación) de sangre inadecuado, por ejemplo, causados por un bloqueo u obstrucción de un vaso sanguíneo en esta área.

La hipoxia puede causar lesiones agudas o crónicas como en la hipoxia y/o isquemia que incluyen, pero sin limitación, insuficiencia cerebrovascular, isquemia cerebral o infarto cerebral (incluyendo isquemia o infartos cerebrales originados por oclusión embólica y trombosis), isquemia retiniana (diabética o no, tal como por oclusión vascular aguda, en particular daño del nervio óptico después de una oclusión vascular aguda), glaucoma (en particular daño del nervio óptico en el glaucoma), degeneración retiniana, esclerosis múltiple, neuropatía óptica isquémica, reperfusión después de una isquemia cerebral aguda, daño hipóxico-isquémico perinatal o hemorragia intracraneal de cualquier tipo (incluyendo, pero sin limitación, hemorragia epidural, subdural, subaracnoidea o intracerebral).

Por consiguiente, la expresión "trastorno isquémico" abarca trastornos trombóticos que incluyen afecciones asociadas con o resultado de trombosis o una tendencia a la trombosis. Estas afecciones incluyen afecciones asociadas con trombosis arterial o venosa que pueden tratarse con un fármaco trombolítico.

La presente invención también se refiere a un método de tratamiento de un trastorno neurológico o neurodegenerativo mediante la administración a un paciente que lo necesite de una cantidad con efecto terapéutico del anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con la invención, el ácido nucleico de acuerdo con la invención, el casete o vector de expresión de acuerdo con la invención, la célula hospedadora de acuerdo con la invención, o la composición (preferentemente farmacéutica) de acuerdo con la invención.

Una "cantidad terapéuticamente eficaz" se define como la cantidad de principio activo que reducirá los síntomas asociados con una enfermedad neurológica o neurodegenerativa, tal como esclerosis múltiple. "Terapéuticamente eficaz" también se refiere a cualquier mejora en la gravedad del trastorno o la frecuencia de incidencias en comparación con ningún tratamiento.

Para su uso como agente de detección en el diagnóstico, pronóstico y/o seguimiento de una enfermedad, el anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con la invención se acopla preferentemente a un agente de marcado que es capaz de producir una señal detectable. En particular, dicho agente de marcado puede ser un radionúclido, un fluoróforo o una enzima.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona el anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con la invención, el ácido nucleico de acuerdo con la invención, el casete o vector de expresión de acuerdo con la invención, la célula hospedadora de acuerdo con la invención, o la composición (preferentemente farmacéutica) de acuerdo con la invención para su uso como primer agente en una terapia de combinación (preferentemente de un trastorno neurológico o neurodegenerativo como se define anteriormente, en particular esclerosis múltiple) junto con un segundo agente para el tratamiento de un trastorno neurológico o neurodegenerativo, en donde el segundo agente puede ser como alternativa un neuroprotector.

El primer y el segundo agente pueden estar presentes en una única composición o pueden administrarse en dos composiciones diferentes de forma simultánea o secuencial.

Descripción de las figuras

La Figura 1 muestra los resultados obtenidos después de mapear el epítopo de unión de los anticuerpos monoclonales 15a4b2e5 y 15a4b2 con péptidos solapantes de 15 aminoácidos cada uno, de la subunidad NR1-1a de rata.

El carril 1 corresponde al anticuerpo 15a4b2 purificado, el carril 2 corresponde al anticuerpo 15a4b2e5 purificado y el carril 3 corresponde al sobrenadante obtenido del hibridoma 15A4B2E5.

Puede verse que los anticuerpos reconocen los péptidos "110" a "113".

En el ejemplo 4 se describen más detalles.

La Figura 2 muestra los resultados de ensayos de neurotoxicidad en vivo realizados con NMDA /- t-PA / anticuerpo monoclonal 15a4b2e5, como se describe en el ejemplo 5.

Puede verse que el anticuerpo monoclonal 15a4b2e5 bloquea la potenciación de la neurotoxicidad de NMDA por t-PA y también la neurotoxicidad de NMDA en ausencia de t-PA exógeno.

La Figura 3 muestra que el anticuerpo monoclonal 15a4b2e5 bloquea los efectos de t-PA en cultivo celular, como se describe en el ejemplo 6. El anticuerpo monoclonal 15a4b2e5 evita la señalización del receptor NMDA promovida por t-PA in vitro, sin modificación de la actividad basal de los receptores.

El panel superior muestra los efectos sobre la muerte neuronal. El panel inferior muestra los efectos sobre la entrada de calcio.

La Figura 4 muestra que el anticuerpo monoclonal 15a4b2e5 provoca una gran reducción de la puntuación clínica en la encefalitis autoinmunitaria experimental (EAE) en ratones, como se describe en el ejemplo 7.

La Figura 5 muestra que el anticuerpo monoclonal 15a4b2e5 conduce a un bloqueo de la difusión de los receptores NMDA extrasinápticos como se describe en el ejemplo 8.

Las figuras 6, 7 y 8 muestran porciones torácicas de ratones modelo de EAE teñidas para desmielinización, infiltración celular e inflamación con y sin tratamiento con el anticuerpo 15a4b2e5, como se describe en el ejemplo 9.

Las figuras 9 y 10 muestran los resultados de la prueba del anticuerpo 15a4b2e5 para determinar sus efectos de transmigración de monocitos y linfocitos T a través de un modelo de la barrera hematoencefálica, como se describe en el ejemplo 10.

Descripción detal lada de la invención

Ejemplo 1: Generación de los hibridomas 15A4B2E5 15A4B2F3, 15A4B2, 6C9A3, 6C9A3F4 y 6C9A3F6 y los anticuerpos monoclonales 15a4b2e5, 15a4b2f3, 15a4b2, 6c9a3, 6c9a3f4 y 6c9a3f6

Un dominio aminoterminal etiquetado con polihistidina de la subunidad NR1-1a (GluN1-1a) (rATD-NR1, aminoácidos 19 a 371 (una secuencia ausente de otras subunidades del receptor de glutamato y correspondiente al dominio de interacción con t-PA) del receptor NMDA de rata se produjo de forma recombinante como lo describe Benchenane et al. (2007). La región de la subunidad NR1-1a que codifica los aminoácidos 19-371 correspondientes al NTD se amplificó a partir del ADNc de NR1-1a de rata de longitud completa, como se describe previamente (Fernandez-Monreal et al., 2004). Las proteínas recombinantes se purificaron a partir de cuerpos de inclusión de cultivos bacterianos inducidos por isopropil 1-tio-D-galactopiranósido (Escherichia coli, cepa M15) en una matriz de afinidad de níquel como describe el fabricante (Qiagen, Courtaboeuf, Francia).

El producto se utilizó como inmunógeno para ratones BALB/C con el fin de generar un anticuerpo policlonal de ratón. Se inmunizaron tres ratones por diana. Cada ratón recibió tres inyecciones y un último refuerzo con el inmunógeno antes de la fusión; se utilizaron dos adyuvantes diferentes, RIBI y Alum.

La prueba de sangrado se realizó el día 25 y el día 40 después de la inmunización con el fin de seleccionar ratones candidatos para la fusión determinando el título de anticuerpos mediante ELISA indirecto. Se aislaron esplenocitos de ratones seleccionados.

Las células de hibridoma se crearon mediante fusión automatizada con células de mieloma SP2/O-Ag14 en un robot TeMo Tecan. Después de la fusión, las células se sembraron y cultivaron en 20 placas de 96 pocillos en una etapa automática con el robot TeMo Tecan. Las células de hibridoma se cultivaron en medio selectivo patrón que contenía azaserina como compuesto selectivo. La evaluación del crecimiento de hibridomas y la determinación de la velocidad de fusión se realizaron mediante examen microscópico.

La exploración primaria de alto rendimiento se ha realizado mediante ELISA indirecto, utilizando la forma recombinante del dominio aminoterminal de GluN1 de rata como cebo.

La exploración de clones secretores de IgG e IgM se realizó en los siguientes antígenos: inmunógeno, proteína etiquetada con polihistidina negativa, membrana celular positiva al receptor NMDA y membrana celular negativa al receptor NMDA de control.

Después de la exploración primaria por ELISA, 94 clones presentaron señales positivas; entre los 94 clones seleccionados, se confirmaron adicionalmente 2 clones positivos mediante ELISA indirecto. Estos 2 clones se congelaron (1 vial cada uno) y se subclonaron mediante dilución limitante patrón para generar los subclones 15A4B5 y 6C9A3. Estos 2 subclones se congelaron (2 viales/clon) y se subclonaron de nuevo para generar los subclones 15A4B2E5 y 15A4B2F3, así como 6C9A3F4 y 6C9A3F6. Estos subclones finales se congelaron (5 viales cada uno).

Las pruebas funcionales en neuronas se realizaron de la siguiente manera:

(a) Excitotoxicidad In vitro

Se indujo excitotoxicidad rápidamente desencadenada, sola o en combinación con rt-PA (20 |jg/ml) y/o aATD-GluN1 o Ig de control (0,01 mg/ml), exponiendo las neuronas a 50 jmol/l de NMDA durante 1 hora y transfiriendo las células de nuevo al medio sin suero. La muerte neuronal se cuantificó 24 horas después mediante la liberación de lactato deshidrogenasa (Roche).

(b) Videomicroscopía de calcio

La entrada de calcio suscitada por NMDA en neuronas corticales cultivadas se registró como se describe anteriormente (Nicole et al., 2001). De forma detallada, los cultivos celulares se cargaron con fura-2 (30 min, temperatura ambiente) en fura-2/am 5 jM más pluronic F-127 al 0,1 % (Molecular Probes, Leiden, Países Bajos) y se incubó durante un período adicional de 30 min en una solución salina tamponada con HEPES. Los experimentos se realizaron a temperatura ambiente, en el escenario de un microscopio invertido Nikon Eclipse equipado con una lámpara de xenón de 75 W y un objetivo de inmersión en aceite de epifluorescencia de apertura numérica 1,3, Nikon 40 x. Se adquirieron imágenes de la razón de Fura-2 (excitación: 340, 380 nm, emisión: 510 nm) con una cámara CCD (Princeton Instrument, Trenton, New Jersey) y se digitalizaron (256 x 512 píxeles) con el programa informático Metafluor 4.11 (Universal Imaging Corporation, Chester, Pensilvania). Las neuronas se trataron con NMDA (50 jmol/l) solo o después de un tratamiento de 30 minutos en presencia de rt-PA (20 jg/ml) y/o aATD-GLuN1 o Ig de control (0,01 mg/ml).

Ejemplo 2: Características de los hibridomas 15A4B2E5, 15A4B2F3, 15A4B2, 6C9A3, 6C9A3F4 y 6C9A3F6 Los hibridomas 15A4B2E5, 15A4B2F3, 15A4B2, 6C9A3, 6C9A3F4 y 6C9A3F6 (véase el ejemplo 1) se depositaron en la DSMZ (Leibniz-Institut DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, InhoffenstraUe 7B, 38124 Braunschweig, Alemania) y se les han otorgado los números de acceso DSM ACC3203 (recibido el 29 de mayo de 2013), DSM ACC3217 (recibido el 25 de septiembre de 2013), DSM ACC3216 (recibido el 25 de septiembre de 2013), DSM ACC3214 (recibido el 25 de septiembre de 2013), dSm ACC3200 (recibido el 29 de mayo de 2013) y DSM ACC3215 (recibido el 25 de septiembre de 2013), respectivamente. Los solicitantes son PAION Deutschland GmbH, MartinstraBe 10 - 12, D-52062 Aachen, Alemania e INSERM, 101 rue de Tolbiac, F-75013 París, Francia, actuando a través de su unidad INSERM - UCBN, UMR-S U919, GIP CYCERON, Boulevard Henri Becquerel, BP 5229 - 14074 Caen Cedex, Francia.

Todos estos hibridomas producen anticuerpos del isotipo IgG2 (cadenas ligeras kappa).

Las condiciones de cultivo adecuadas son las siguientes.

Medio de cultivo: DMEM (4,5 g/l con glutamina y piruvato de sodio) ref PAA E15-843 complementado con FCS al 10 %; cultivo en incubadora a 37 °C, CO2del 5 al 10 %; descongelar las células en un baño de agua a 37 °C durante unos segundos y transferir cubitos de hielo al medio calentado previamente de 30 ml (37 °C); después de la centrifugación (7 min, 1200 rpm) volver a suspender las células en 10 ml de medio de cultivo calentado previamente (37 °C) y transferir en un matraz T25 cm2; colocar el matraz horizontalmente en la incubadora; dividir las células 1:5 lunes y miércoles; 1:10 viernes.

Puede utilizarse 0,1 mg/ml de gentamicina.

Ejemplo 3: Determinación de la secuencia de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo monoclonal 15a4b2e5

1. Extracción de ARNm y transcripción inversa.

Se utilizó el clon 15A4B2E5.

El ARN total se extrajo del hibridoma por triplicado (A, B, C) con reactivo RNAble ® de células en la fase exponencial.

Las muestras se trataron con DNasa 1 para eliminar todos los rastros de ADN genómico. Los ADNc se sintetizaron a partir de 2 j l de ARN tratado con DNAsa 1 en un volumen final de 40 j l (volumen necesario para la realización de diferentes amplificaciones por PCR) a partir de oligo-d (T) para realizar la transcripción inversa de todas las hebras de ARNm. Una muestra tratada en las mismas condiciones, pero sin transcriptasa inversa (RT, por sus siglas en inglés) sirvió como control en la PCR para verificar la ausencia de ADN genómico.

2. Amplificación por PCR de ADNc A, B, C.

Los segmentos génicos VH y VL de 15a4b2e5 se amplificaron mediante PCR utilizando condiciones de amplificación (ciclos de hibridación T °C) descritas por Lefranc y Lefranc, 1997.

Los productos de amplificación se visualizaron en un gel de agarosa al 1 % (Life Technologies, ref: AM9046, lote 1205021) que contenía GelRedTM al 0,1 % (INTERCHIM, ref: 41003, lote 12G0509) después de depositar las muestras: 5 pl de productos de PCR/pocillo. Marcador de 100 pb (Life Technologies, ref: 15628-019, lote 954661) y cuantificación de marcadores Low DNA Mass ™ Ladder (Life Technologies, ref: 10068-013, lote 1169490) 0. 5 pg/pocillo.

3. Secuenciación

Las secuencias de los productos de amplificación se determinaron mediante técnicas convencionales.

Ejemplo 4: Mapeo del epí topo de unión de los anticuerpos monoclonales 15a4b2e5 y 15a4b2

1. Se sintetizaron en puntos péptidos solapantes que tenían una longitud de 15 aminoácidos que cubrían la secuencia completa del inmunógeno del ejemplo 1. La membrana de puntos se incubó con los anticuerpos monoclonales purificados 15a4b2 y 15a4b2e5 (1 pg/ml cada uno) y con el sobrenadante obtenido del hibridoma 15A4B2E5.

Se utilizó un conjunto de péptidos (15 aminoácidos cada uno) que solapaban la secuencia completa del dominio aminoterminal de GluN1 de rata (aminoácidos 19 a 371) con un desfase de tres aminoácidos para un ensayo de inmunotransferencia. R

Los resultados se representan en la figura 1.

Solo se muestran los datos para los péptidos 91 a 120. Los péptidos que no se muestran en la figura 1 solamente produjeron señales de fondo. La siguiente tabla muestra las secuencias de los péptidos 91 a 120:

Los puntos que se ven en la Figura 1 muestran que los anticuerpos probados reconocen los péptidos 110 a 113, mientras que los péptidos 91 a 109 y los péptidos 114 a 120 produjeron solamente señales de fondo.

2. Se repitió un experimento similar incluyendo el péptido más reactivo identificado en 1, ya sea como de tipo silvestre o que contenga una mutación puntual única para cada uno de sus aminoácidos como alternativa.

Este experimento confirmó los resultados obtenidos en 1. anterior.

También se realizó un experimento de mapeo de epítopos como se describe en 1. anterior con sobrenadantes de los hibridomas 6C9A3F4 y 6C9A3. Los resultados fueron comparables.

Ejemplo 5: Supresión de la neurotoxicidad de NMDA por el anticuerpo monoclonal 15a4b2e5

Las lesiones excitotóxicas se efectuaron con anestesia inducida por isoflurano en ratones swiss macho (25-30 g; CURB, Caen, Francia). Las inyecciones estriatales (coordenadas: 0,5 mm posterior, 2,0 mm lateral, -3,0 mm ventral al bregma) de 10 nmol de NMDA se realizaron después de colocar a los animales en un marco estereotáxico. Al mismo tiempo, se inyectó t-PA (10 mg/kg) por vía intravenosa solo o en combinación con el anticuerpo 15a4b2e5 (160 |jg). Se utilizaron como control IgG de control de un clon negativo. Después de 24 h, se recogieron los cerebros, se congelaron en isopentano, se cortaron con criostato (secciones de 20 jm), se tiñeron con tionina y se analizaron.

Los resultados se muestran en la figura 2.

El volumen de las lesiones se representa como barras (Barra 1: NMDA solo, Barra 2: NMDA t-PA, Barra 3: NMDA t-PA anticuerpo monoclonal 15a4b2e5, Barra 4: NMDA anticuerpo monoclonal 15a4b2e5).

La barra 1 muestra la neurotoxicidad inducida por NMDA. La barra 2 muestra la neurotoxicidad inducida por NMDA reforzada por t-PA. La barra 3 muestra la supresión del refuerzo de la neurotoxicidad inducida por NMDA por el anticuerpo. La barra 4 muestra la inhibición de la neurotoxicidad inducida por NMDA por el anticuerpo(antagonismo de t-PA endógeno).

Una comparación del tamaño de las barras muestra lo siguiente:

Barra 1 frente a Barra 2: t-PA potencia la neurotoxicidad de NMDA.

Barra 2 frente a Barra 3: el anticuerpo monoclonal 15a4b2e5 bloquea el efecto nocivo de t-PA

Barra 1 frente a Barra 3 y Barra 1 frente a Barra 4: el efecto del anticuerpo va más allá de bloquear el daño por t-PA; también reduce el efecto nocivo de NMDA, explicado por el antagonismo de t-PA endógeno. El anticuerpo monoclonal 15a4b2e5 bloquea, de este modo, la potenciación de las lesiones inducidas por t-PA y también es beneficioso en ausencia de t-PA exógeno. Esto muestra que, por ejemplo, los anticuerpos de la presente invención tienen potencial como fármaco independiente.

Los anticuerpos producidos por la familia de hibridomas 6C9A3 mostraron efectos similares.

Ejemplo 6: Bloqueo de los efectos de t-PA por el anticuerpo monoclonal 15a4b2e5 en cul t ivo celular Los resultados se representan en la figura 3.

La figura 3A (panel superior de la figura 3) muestra una evaluación de la excitotoxicidad. Se estudiaron cultivos primarios de neuronas corticales de ratón (E16), mantenidos de 12 a 14 días in vitro como se describe previamente (Nicole et al., 2001). La muerte neuronal completa se definió mediante la destrucción de todas las neuronas usando exposición a Triton X100. Todos los resultados se normalizaron a Triton X100.

La muerte neuronal se midió después de la administración de NMDA, t-PA y anticuerpo monoclonal 15a4b2e5 in vitro en las combinaciones mencionadas. Las concentraciones utilizadas fueron las siguientes: t-PA 300 nM, NMDA 12.5 jM, anticuerpo 0,01 mg/ml.

De izquierda a derecha, las barras muestran lo siguiente: control (sin muerte celular), muerte celular causada por NMDA, falta de efecto de t-PA, refuerzo por t-PA de la muerte celular inducida por NMDA, falta de efecto del anticuerpo solo, supresión por anticuerpos del refuerzo de la muerte celular inducida por NMDA y falta de influencia del anticuerpo sobre la muerte celular inducida por NMDA (sin t-PA).

En ausencia de NMDA, ni t-PA ni el anticuerpo tuvieron ningún efecto sobre la muerte neuronal. La administración de NMDA causó la muerte neuronal. Este efecto se potenció cuando se administró NMDA en combinación con t-PA. La administración adicional del anticuerpo redujo la muerte neuronal al nivel observado con NMDA solo, lo que indica que el anticuerpo bloqueó la interacción entre t-PA y el receptor NMDA, pero no el efecto de NMDA real. Esto se confirmó por el hallazgo de que la administración de NMDA junto con el anticuerpo en ausencia de t-PA causó muerte neuronal en el mismo grado que la administración de NMDA solo. Esto muestra que el efecto del anticuerpo depende de t-PA. En resumen, el anticuerpo suprimió la capacidad de t-PA para potenciar la muerte celular inducida por NMDA, pero no influyó en el efecto de NMDA solo

La figura 3B (panel inferior de la figura 3) muestra los resultados obtenidos por obtención de imágenes por vídeo de calcio in vitro. La concentración de t-PA fue 300 nM. En cada caso, se examinaron de 100 a 150 células; se registró el área bajo la curva de la respuesta de calcio y se normalizó a la exposición a NMDA (50 j M) solo.

La figura muestra cuatro pares de barras. En cada par, la barra de la izquierda corresponde a la adición de NMDA solo (control) y la barra de la derecha corresponde a la adición adicional de t-PA y/o del anticuerpo indicado (segundo, tercer y cuarto par) o una repetición de la medición de NMDA solo ( primer par).

Por tanto, los cuatro pares de barras de izquierda a derecha muestran lo siguiente: NMDA control, refuerzo de NMDA por t-PA, bloqueo del refuerzo de t-PA por un anticuerpo eficaz y falta de bloqueo del refuerzo de t-PA por un anticuerpo ineficaz.

t-PA aumentó significativamente la entrada de Ca2+ inducida por NMDA en las neuronas corticales. Este efecto se evitó aplicando conjuntamente un anticuerpo eficaz. En la figura 3B se ilustra un clon eficaz y uno ineficaz.

Ejemplo 7: Efectos del anticuerpo monoclonal 15a4b2e5 en un modelo de EAE en ratones

Los ratones se inmunizaron por vía subcutánea con 200 jg de péptido MOG35-55 en CFA (Sigma) que contenía 4 jg de M. tuberculosis (H37Ra, Difco). Los animales de control recibieron PBS en lugar de péptido MOG. Todos los animales recibieron 250 ng de toxina pertussis (Sigma) por vía intravenosa mediante inyección en la vena de la cola en el momento de la inmunización y 48 horas después.

A los animales se les administró el anticuerpo monoclonal 15a4b2e5 o una IgG de control no relacionada de 160 jg i.v después de la aparición de los síntomas. Los efectos de este tratamiento se evaluaron mediante la curva de puntuación clínica media en animales simulados y tratados como se describe anteriormente (Liu et al., 1998) y la resonancia magnética se realizó en diferentes etapas. Toda la experimentación con animales se llevó a cabo de acuerdo con la normativa europea.

Los ratones se examinaron diariamente para detectar signos clínicos de EAE y se puntuaron como sigue ("Puntuación clínica"): 0, sin enfermedad; 1, cola flácida; 2, debilidad de las extremidades posteriores; 3, parálisis completa de las extremidades posteriores; 4, parálisis de las extremidades posteriores más parálisis de las extremidades anteriores; y 5, moribundo o muerto.

Los resultados se muestran en la figura 4.

Los cuadrados de la curva superior indican los resultados de los ratones de control (inyección de IgG de control no relacionada). Los diamantes de la curva inferior indican los resultados obtenidos con el anticuerpo 15a4b2e5.

Es evidente que el anticuerpo monoclonal 15a4b2e5 redujo considerable y persistentemente la puntuación clínica media desde el momento de su primera inyección.

La puntuación clínica media en el grupo de control aumentó de manera vertiginosa después de 10 días hasta que alcanzó un valor de aproximadamente 3,5. Por el contrario, la puntuación clínica media en el grupo de tratamiento con 15a4b2e5 solo aumentó levemente y nunca superó un valor de alrededor de 2 (debilidad de las extremidades posteriores), incluso después de 36 días (12 días después de la tercera inyección, cuando finalizó el seguimiento). Los ratones recibieron 160 jg de anticuerpo monoclonal 15a4b2e5 o de una IgG de control no relacionada por inyección. El número de inyecciones por ratón fue de 3. "1o", "2o" y " 3o" muestran los momentos en los que se realizaron las inyecciones.

No se encontraron indicios de encefalitis en el grupo de tratamiento con anticuerpo 15a4b2e5.

El beneficio observado se logró solamente con tres inyecciones únicas y, en particular, la primera inyección ya tuvo un efecto considerable. Las tres inyecciones se pusieron arbitrariamente a lo largo de la evolución de la enfermedad, de modo que pueden haber sido más de las necesarias.

En un escenario diferente, es decir, en un modelo de accidente cerebrovascular isquémico agudo, solo se necesitó una sola inyección para obtener beneficios.

Ejemplo 8: El anticuerpo 15a4b2e5 bloquea la di fusión del receptor NMDA extrasináptico neuronal promovida por t-PA

Se sabe que los autoanticuerpos encontrados en la enfermedad autoinmunitaria encefalitis contra receptores NMDA conducen a un bloqueo de la difusión del receptor NMDA sináptico (Mikasova et al., 2012).

En este ejemplo, la distribución del receptor NMDA después de la administración de anticuerpos de acuerdo con la invención se examinó mediante seguimiento de partículas individuales y cálculo de difusión en la superficie, esencialmente como se describe en Mikasova et al., 2012. El panel superior derecho de la figura 5, muestra las siguientes etapas: Las neuronas primarias del hipocampo se incubaron con el anticuerpo durante 10 min a 37 °C ("Ab 10"'), se lavaron e incubaron durante 10 min a 37 °C con anticuerpos secundarios marcados con puntos cuánticos ("QD 10, por sus siglas en inglés"'). Esto condujo al marcado en la superficie de las subunidades GluN1. Los puntos cuánticos se monitorizaron en regiones dendríticas seleccionadas al azar durante 20 a 30 min ("Imagen 20-30"') y se analizaron sus trayectorias.

El panel superior izquierdo de la figura 5, es una representación esquemática del marcado en superficie de una subunidad NR1 (= GluN1) del receptor NMDA, utilizando un complejo único anticuerpo anti-NR1 ("Ab anti-GluN1 ") punto cuántico ("QD"). El panel inferior muestra trayectorias representativas de un receptor NMDA marcado como se realiza el seguimiento con un anticuerpo de control ("Ab control"; anti-Nter-NR1, de laboratorios Alomone (AGC-001)) o con el anticuerpo 15a4b2e5 ("Ab"). Puede verse que el anticuerpo de control (que se dirige al extremo aminoterminal de la subunidad NR1 (GluN1), pero no su sitio de unión a t-PA no afecta la difusión de la membrana del receptor NMDA, que comprende trayectorias tanto sinápticas (encerradas en un círculo con una línea de puntos verde) como extrasinápticas. Por el contrario, el anticuerpo 15a4b2e5 ("Ab") conduce a un bloqueo selectivo de la difusión de los receptores NMDA extrasinápticos, como lo indica la falta de trayectorias extrasinápticas. Sin desear quedar ligados a teoría alguna, se supone que el efecto neuroprotector de los anticuerpos de acuerdo con la invención está relacionado con su capacidad para prevenir la difusión de los receptores NMDA extrasinápticos promovida por t-PA, que se sabe que tienen efectos neurotóxicos.

Ejemplo 9: El anticuerpo 15a4b2e5 detiene el daño de la miel ina

Se trataron ratones modelo de EAE con el anticuerpo 15a4b2e5 y se investigó el daño de la mielina en la médula espinal.

Las Figuras 6 a 8 muestran imágenes de la porción torácica de la médula espinal de ratones con EAE. Puede verse que el anticuerpo 15a4b2e5 detiene el daño de la mielina. Los detalles son los siguientes:

La figura 6 muestra que la proteína básica de mielina ("MBP, por sus siglas en inglés"), una proteína de la capa de mielina, que se utiliza como marcador de desmielinización, se detecta en EAE ("EAE"), pero en mucho menor grado con el anticuerpo 15a4b2e5 ("EAE Ab"). Se muestran los resultados correspondientes para los linfocitos T ("TL, por sus siglas en inglés"), que son predominantes en EAE ("EAE"), pero prácticamente ausentes con el anticuerpo 15a4b2e5 ("EAE Ab").

La Figura 7 muestra células de microglía infiltradas (detectadas con lectina de tomate), VCAM (proteína de adhesión de células vasculares, un marcador de inflamación, que se correlaciona con una pérdida creciente de función en el modelo de EAE en ratones) y fibrinógeno (un marcador de inflamación) en ratones con EAE ("EAE"). Los marcadores de inflamación se suprimieron en ratones con EAE tratados con 15a4b2e5 ("EAE Ab").

La Figura 8 muestra varias áreas con células infiltradas (lectina de tomate, marcador de células de microglía; marrón) y desmielinización (detectadas con el marcador de mielina, eriocromocianina; azul) en animales con EAE ("EAE"). No hubo áreas desmielinizadas ni infiltradas en ratones con EAE tratados con el anticuerpo ("EAE Ab"). Ejemplo 10: El anticuerpo 15a4b2e5 suprime la migración de monoci tos y la migración de l infocitos T a través de la barrera hematoencefál ica

El anticuerpo 15a4b2e5 se probó en un modelo in vitro de la barrera hematoencefálica (hCMEC/D3 se sembraron en confluencia en un filtro Costar Transwell recubierto de colágeno (tamaño de poro 0,4 pm; Corning Incorporated) en medio de crecimiento que contenía FCS al 2,5 % y cultivaron durante 4 días) para determinar su influencia en la transmigración estimulada por TNFa de monocitos y linfocitos T.

Los resultados se muestran en la figura 9 (monocitos) y la figura 10 (linfocitos T). El anticuerpo 15a4b2e5 suprimió la transmigración estimulada por TNFa tanto de monocitos como de linfocitos T a través de la barrera hematoencefálica ("TNFa+Ab"). Por el contrario, las inmunoglobulinas de control ("TNFa/Iso1", "TNFa/Iso2") no suprimieron la transmigración estimulada por TNFa.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo monoclonal contra el receptor NMDA o un fragmento del mismo, en donde dicho anticuerpo o fragmento del mismo inhibe la interacción entre el receptor NMDA y t-PA, y

en donde dicho anticuerpo o fragmento del mismo es capaz de unirse a un epítopo que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 y los fragmentos peptídicos:

- LVSDDHEGRAAQKRL,

- DDHEGRAAQKRLETL,

- EGRAAQKRLETLLEE, y

- AAQKRLETLLEERES.

2. El anticuerpo o un fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 1, que

(a) comprende una o más regiones determinantes de la complementariedad que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 29, 30, 31, 32, 33 y 34; o

(b) comprende una o más regiones determinantes de la complementariedad que tienen una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 29, 30, 31, 32, 33 y 34 que está alterada en una o dos posiciones de aminoácidos o que contiene una inserción de uno o más aminoácidos, y que son equivalentes funcionales de las correspondientes regiones determinantes de la complementariedad inalteradas.

3. El anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con la reivindicación 2, que comprende seis regiones determinantes de la complementariedad que tienen las secuencias que consisten en las SEQ ID NO: 29, 30, 31, 32, 33 y 34.

4. El anticuerpo o fragmento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que tiene una o más de las siguientes características

- comprende una región marco de cadena pesada que comparte una homología o identidad del 80 % o más con una región marco que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 35, 36, 37 y 38 y/o una región marco de cadena ligera que comparte una homología o identidad del 80 % o más con una región marco que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 39, 40, 41 y 42; o

- muestra reactividad cruzada con un anticuerpo producido por un hibridoma depositado seleccionado del grupo que consiste en los hibridomas depositados en la DSMZ con los números de acceso DSM ACC3203, DSM ACC3217, DSM ACC3216, DSM ACC 3214, DSM ACC3220 y DSM ACC 3215.

5. El anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende una o dos regiones variables de cadena pesada que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 43 y/o que comprende una o dos regiones variables de cadena ligera que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 44, o un fragmento de las mismas que muestra reactividad cruzada con dicho anticuerpo.

6. El anticuerpo o fragmento del mismo que muestra reactividad cruzada con el anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 5, cuyas regiones variables de cadena pesada son idénticas entre sí y comparten una homología o identidad del 80 % o más en toda su longitud con una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 43 y/o cuyas regiones variables de cadena ligera son idénticas entre sí y comparten una homología o identidad del 80 % o más en toda su longitud con una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 44.

7. El anticuerpo o fragmento del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 o 6, que comprende dos regiones variables de cadena pesada que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:43, y dos regiones variables de cadena ligera que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:44.

8. Un anticuerpo producido por un hibridoma depositado seleccionado del grupo que consiste en los hibridomas depositados en la DSMZ con los números de acceso DSM ACC3203, DSM ACC3217, DSM ACC3216, DSM ACC 3214, DSM ACC3220 y DSM ACC 3215, o un fragmento del mismo, que muestra reactividad cruzada con dicho anticuerpo e inhibe la interacción entre el receptor NMDA y t-PA.

9. Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que es un anticuerpo humanizado o un fragmento del mismo.

10. Un ácido nucleico que codifica el anticuerpo o fragmento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

11. Un casete o vector de expresión que comprenden el ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 10 y un promotor conectado operativamente con dicho ácido nucleico.

12. Una célula hospedadora que comprende el ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 10 o el casete o vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 11.

13. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, el ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 10, el casete o vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 11 o la célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 12, y opcionalmente uno o más componentes seleccionados del grupo que consiste en transportadores, disolventes, diluyentes y excipientes.

14. El anticuerpo o fragmento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, el ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 10, el casete o vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 11, la célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 12 o la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 13 para su uso en medicina.

15. El anticuerpo o fragmento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, el ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 10, el casete o vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 11, la célula hospedadora de acuerdo con la reivindicación 12 o la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 13 para su uso en el tratamiento, pronóstico, diagnóstico y/o seguimiento de un trastorno neurológico o neurodegenerativo o como un neuroprotector.

16. El anticuerpo o fragmento del mismo, ácido nucleico, casete de expresión, vector, célula hospedadora o composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 15, en donde el trastorno neurológico o neurodegenerativo se selecciona del grupo que consiste en esclerosis múltiple, trastorno trombótico, accidente cerebrovascular, hemorragias intracerebrales TIA, epilepsia, epilepsia del lóbulo temporal, esclerosis lateral amiotrófica, tumores cerebrales, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, edema cerebral, complicación del SNC resultado de infecciones por parásitos, bacterianas, fúngicas o víricas, meningitis, encefalitis, daño cerebral traumático, daño de la médula espinal, lesiones intracraneales, lesiones intravertebrales, trastornos isquémicos y daño del nervio óptico después de una oclusión vascular aguda o en glaucoma.