ES2856872T3

ES2856872T3 - Procedimiento para la producción de células productoras de insulina

Info

Publication number: ES2856872T3
Application number: ES16721711T
Authority: ES
Inventors: Anant Mamidi; Henrik Semb
Original assignee: Københavns Universitet
Current assignee: Københavns Universitet
Priority date: 2015-04-24
Filing date: 2016-04-21
Publication date: 2021-09-28
Anticipated expiration: 2036-04-21
Also published as: EP3285572A1; EP3285572B1; PL3285572T3; WO2016170067A1; PT3285572T; HK1251120A1; US20180119105A1; DK3285572T3

Abstract

Un procedimiento in vitro para la diferenciación de células en células β productoras de insulina, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de: i) inactivar Yap1 en una población de células progenitoras pancreáticas que comprende al menos una célula capaz de diferenciarse; ii) diferenciar las células de la etapa i) y comprometerlas al destino endocrino, preferiblemente al destino de las células β productoras de insulina; obteniendo de este modo una población celular enriquecida con células β productoras de insulina, en comparación con las células en las que Yap1 no se inactivó.

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimiento para la producción de células productoras de insulina

Campo técnico

La presente descripción se refiere a un procedimiento para la diferenciación de células en células productoras de insulina, a una población de células enriquecida con células p productoras de insulina y al uso de dicha población de células para el tratamiento de un trastorno metabólico en un individuo que necesite el mismo. También se describe un procedimiento para tratar un trastorno metabólico.

Antecedentes

El tratamiento con terapia celular de la diabetes dependiente de insulina se ve facilitado por la producción de un número ilimitado de células pancreáticas que pueden y podrán funcionar de forma similar a los islotes humanos. Por ejemplo, el uso de células p productoras de insulina derivadas de células madre embrionarias humanas (hESC) ofrecería una amplia mejora con respecto a los procedimientos de terapia celular actuales que utilizan células de páncreas de donantes. Actualmente, los tratamientos con terapia celular para la diabetes mellitus, tal como la diabetes tipo 1 o tipo 2, que utilizan células de páncreas de donantes, están limitados por la escasez de células de islotes de alta calidad necesarias para el trasplante. Por ejemplo, la terapia celular para un único paciente diabético de tipo 1 requiere un trasplante de aproximadamente 8 x 108 células de islotes pancreáticos (Shapiro y col., 2000, N Engl J Med 343:230-238; Shapiro y col., 2001a, Best Pract Res Clin Endocrinol Metab 15:241-264; Shapiro y col., 2001b, British Medical Journal 322:861). Como tal, se requieren al menos dos órganos donantes sanos para obtener suficientes células de islotes para un trasplante exitoso.

Por tanto, las células madre embrionarias (ES) representan un poderoso sistema modelo para la investigación de los mecanismos subyacentes a la biología celular pluripotente y la diferenciación dentro del embrión temprano, además de brindar oportunidades para la manipulación genética de mamíferos y las aplicaciones comerciales, médicas y agrícolas resultantes. Además, la proliferación y diferenciación apropiadas de células ES pueden usarse potencialmente para generar una fuente ilimitada de células adecuadas para el trasplante para el tratamiento de enfermedades que son el resultado de daño o disfunción celular. Otras células pluripotentes y líneas celulares, incluyendo las células similares al ectodermo primitivo temprano (EPL), el epiblasto/ICM derivado in vivo o in vitro, el ectodermo primitivo derivado in vivo o in vitro, las células germinales primordiales (células EG), las células de teratocarcinoma (células EC) , y también se pueden usar células pluripotentes derivadas por desdiferenciación o por transferencia nuclear.

D'Amour y col. (2006) describen un protocolo de cinco etapas para la diferenciación de células ES en células productoras de insulina.El documento WO 2014/201167 describe la generación de células beta humanas funcionales a partir de células madre pluripotentes humanas y hiPSC.El documento WO 2013/163739 describe la generación de células NKX6-1+ a partir de células ES humanas y su posterior diferenciación en células productoras de insulina.El documento WO 2007/130474 describe procedimientos para la diferenciación de hESC en células beta.El documento WO 2013/188138 describe un procedimiento para ralentizar o impedir el cáncer y la progresión tumoral mediante la inhibición de la ruta de señalización Hippo/YAP.

Por consiguiente, existe la necesidad de producir estos tipos de células pancreáticas derivadas de células hES, así como procedimientos fiables para purificar dichas células.

Resumen

En la presente memoria se describen procedimientos para la diferenciación de células en células p productoras de insulina, una población celular enriquecida con células p productoras de insulina que se puede obtener mediante los procedimientos descritos en la presente memoria, así como procedimientos para tratar una trastorno metabólico.

Descripción de los dibujos

Figura 1: Ratones knockout Pdx1 Cre Yap1.(A) Imagen de crías P4 de ratones de control y knockout Yap1 (Yap KO). Las crías de KO Yap muestran un tamaño corporal más pequeño que la camada de control. (B) Vísceras de ratones naturales de control y knockout Yap. Los KO Yap muestran hipoplasia pancreática severa con una masa pancreática reducida en al menos un tercio en comparación con la camada de control. (C) Las crías de KO Yap son severamente hipoglucémicos. Los niveles de glucosa en sangre se midieron desde el día postnatal P4 antes de que se sacrificaran las crías y se recolectara el páncreas para el examen histológico. Yap het: Yap1fl/+. Eje Y: glucosa en sangre (mmol/L). (D) Las crías de KO Yap han reducido significativamente el peso corporal en P4. Eje Y: peso corporal en gramos.

Figura 2: Las crías knockout Pdx1 Cre Yap1 muestran una expresión de insulina elevada. (A) Imágenes confocales de controles y páncreas de knockout Yap P4 teñidas con DAPI (gris claro), Ecad (blanco) e insulina (gris oscuro), muestran un área elevada de insulina en los knockouts a pesar del fenotipo de páncreas hipoplásico. (B) Las secciones de páncreas naturales P4 y knockout Yap se tiñeron inmunológicamente con anticuerpos contra Ecad, insulina y DAPI en la figura 2A. Se calculó la proporción entre el área de expresión de insulina y el área total de DAPI del páncreas. En el Yap, la expresión de insulina diferenciación endocrina de knockout se incrementó significativamente (n = 3). Eje Y: área de insulina/área de DAPI. (C) El análisis de RT-qPCR de páncreas P4 muestra un incremento significativo en los niveles de ARNm de insulina en el páncreas de knockout Yap. Eje Y: expresión génica relativa. (D) La expresión de ARNm de glucagón no se altera significativamente en knockouts Yap en comparación con los controles. (E) Los niveles de ARNm de Yap1 están significativamente regulados por disminución en el páncreas de knockout en comparación con los controles de la camada.

Figura 3: La pérdida de Yap1 en Sox9 que expresa progenitores pancreáticos da lugar a una expresión elevada de insulina.(A) Imágenes confocales de z-stack de controles (de tipo salvaje, wt) y explantes pancreáticos de ratón Sox9 Cre ER E11.5 knockout Yap1 (Yap1 KO) cultivados ex-vivo durante 5 días en presencia de OHT 1uM teñido con E-cadherina y la insulina muestran un área de expresión de insulina elevada en los knockouts Yap1. (B) Imágenes confocales de Z-stack de la figura A de explantes pancreáticos de tipo salvaje Sox9 Cre ER y de knockout Yap1 se cuantificaron para la proporción de volumen de expresión de insulina con respecto al volumen de expresión de E-cadherina total. En el Yap1, la expresión de insulina/diferenciación endocrina de knockout se incrementó significativamente (n = 7). Eje Y: área de insulina/área de Ecad (pm2). (C) El análisis de RT-qPCR de explantes Sox9 Cre ER E11.5 5 días muestra una reducción significativa en los niveles de ARNm de Yap1 en explantes de knockout Yap1. Yap het = heterocigoto Yap1fl/+. (D) La expresión de ARNm de insulina se regula significativamente por incremento en knockouts Yap1 en comparación con los controles. (E) Los niveles de ARNm de glucagón están significativamente regulados por incremento en los explantes de knockout en comparación con los controles. (C-E): eje Y: expresión génica relativa (cambio en veces frente a tipo salvaje).

Figura 4: La inhibición de Yap1 usando verteporfina en explantes pancreáticos de ratón de tipo salvaje da lugar a una diferenciación endocrina mejorada. Los explantes pancreáticos de ratón C57bl6 de tipo salvaje en las etapas embrionarias E11.5 se cultivaron ex vivo durante las primeras 24 horas en un medio de cultivo normal suplementado con 1 ug/ml de verteporfina durante 72 horas y nuevamente en un medio de cultivo normal sin verteporfina durante otras 48 horas. horas. Los explantes se analizaron mediante RT-qPCR para determinar la expresión génica endocrina después de 6 días de cultivo. La inhibición de Yap1 usando verteporfina da lugar a una regulación por incremento significativa de los progenitores endocrinos Neurogenina (Ngn3) (A), NeuroD (B), Insml (C), expresión de Arx (D). Esto finalmente da lugar a una diferenciación endocrina mejorada según se analiza para la expresión de insulina (E) y glucagón (F). Eje Y: expresión relativa (cambio en veces en relación con la expresión de Ecad).

Figura 5: La inhibición de YAP1 en progenitores pancreáticos derivados de células hES da lugar a la diferenciación de células p. (A) Esquema del protocolo de 15 días (modificado de Rezania y col., 2010) usado para generar progenitores pancreáticos a partir de células ES humanas. Al final del protocolo, la mayoría de las células expresan los marcadores progenitores PDX1 y NKX6.1. El inhibidor de YAP1-TEAD verteporfina (VP) se añadió al medio durante el día 4 de PE y las células se trataron durante 4 o 5 días. (B, C, D, E, F, G) El análisis de PCR en tiempo real de la expresión de genes específicos de células beta y endocrinas de las células tratadas con verteporfina por 4 días muestra una mayor expresión de insulina, glucagón, ISL-1, MAFA, MAFB pero disminución de la expresión del gen exocrino CPA1. Eje Y: expresión de ARNm relativa como cambio en veces.

Figura 6: El tratamiento con verteporfina durante 5 días da lugar a una mayor expresión de genes específicos de islotes. El análisis de PCR en tiempo real de los progenitores pancreáticos tratados con verteporfina durante 5 días muestra una regulación por incremento del gen progenitor endocrino Neurogenina3 (NGN3), genes específicos de células beta, insulina, MAFA, MAFB, INSM1, regulación por disminución del glucagón y genes exocrinos específicos CPA1 y PTF1a. La expresión de NKX6.1 no se altera, ya que se expresa tanto en los progenitores pancreáticos como en las células beta maduras. Eje Y: expresión de ARNm relativa (cambio en veces frente al control DMSO).

Figura 7: El tratamiento de progenitores pancreáticos derivados de células hES con verteporfina durante 5 días da lugar a una expresión mejorada de insulina. Las células ES humanas PDX1-eGFP estables se diferenciaron con el estadio progenitor pancreático y se trataron con DMSO (controles) o verteporfina durante 5 días y se tiñeron inmunológicamente con péptido C (blanco), glucagón (gris oscuro) y GFP PDX1 (gris claro). Los progenitores tratados con verteporfina muestran una diferenciación mejorada de las células endocrinas/beta y expresan niveles más altos de péptido C, mientras que las células tratadas con DMSO expresan niveles bajos de péptido C y glucagón.

Figura 8: Los progenitores pancreáticos derivados de células hES tratados con VP durante 5 días muestran una diferenciación endocrina y expresión de insulina mejoradas.Se diferenciaron células ES humanas Pdx1 Gfp estables con el estadio progenitor pancreático y a continuación, se trataron con DMSO (control) o verteporfina (VP, 1 |jg/ml) durante 5 días adicionales. Los cultivos se tiñeron inmunológicamente con péptido c (gris claro) y anticuerpos de Neurogenina3 (gris oscuro) y se obtuvieron imágenes usando microscopio confocal. Los cultivos tratados con verteporfina presentan una diferenciación de células beta y endocrina mejorada y expresan niveles más altos de Ngn3 y péptido c en comparación con las células tratadas con DMSO.

Figura 9: La pérdida transitoria de Yap1 en células hES Pdx1 GFP da lugar a una regulación por incremento de la expresión del gen progenitor endocrino. Las células ES humanas Pdx1 Gfp estables se diferenciaron con el estadio progenitor pancreático y a continuación, se transfectaron transitoriamente con control (Cosi) o siRNA Yap1. Los cultivos se analizaron usando RT-qPCR después de 3 días de transfección de siRNA. Las células transfectadas con siRNA de Yap1 mostraron una reducción del 50 % en los niveles de ARNm de Yap1 (A) y esto da como resultado un aumento de la expresión de los progenitores endocrinos Ngn3 (B) e Insml (C). Eje Y: expresión génica relativa.

Figura 10: Esquema que muestra las etapas intermedias de la diferenciación de hESC hacia células productoras de insulina. Los nuevos marcadores de superficie celular GP2, FOLR1 y CD49d se pueden usar para aislar células progenitoras pancreáticas en el estadio PE. Estas células progenitoras pancreáticas tienen la capacidad de diferenciarse en células acinares, ductales y también endocrinas que comprenden el páncreas.

Descripción detallada

La invención es como se define en las reivindicaciones. Cualquier realización que no se encuentre dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas no forma parte de la invención.

En un aspecto, la presente descripción se refiere a un procedimiento para la diferenciación de células en células p productoras de insulina, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:

i) proporcionar una población de células progenitoras pancreáticas que comprende al menos una célula capaz de diferenciarse;

ii) incubar dicha población celular en presencia de un inhibidor de Yap1 tal como verteporfina;

obteniendo de este modo una población celular enriquecida con células p productoras de insulina.

En otro aspecto, la presente descripción se refiere a un procedimiento para la diferenciación de células en células p productoras de insulina, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:

i) inactivar Yap1 en dichas células;

ii) diferenciar las células de la etapa i) y comprometerlas al destino endocrino, preferiblemente al destino de las células p productoras de insulina;

En otro aspecto más, la presente descripción se refiere a una población celular enriquecida con células p productoras de insulina que se pueden obtener mediante los procedimientos descritos en la presente memoria.

En otro aspecto más, la presente descripción se refiere a una población celular enriquecida con células p productoras de insulina que se pueden obtener mediante los procedimientos descritos en la presente memoria para el tratamiento de un trastorno metabólico en un individuo que lo necesita.

En otro aspecto más, la presente descripción se refiere a un inhibidor de Yap1 para su uso como medicamento para tratar un trastorno metabólico en un individuo que lo necesita.

En otro aspecto más, la presente descripción se refiere a un procedimiento de tratamiento de un trastorno metabólico en un individuo que lo necesita, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:

ii) incubar dicha población celular en presencia de un inhibidor de Yap1 tal como verteporfina, obteniendo de este modo una población celular enriquecida con células p productoras de insulina;

iii) trasplantar dicha población celular enriquecida con células p productoras de insulina en dicho individuo.

En otro aspecto más, la descripción se refiere a un procedimiento para identificar un inhibidor de Yap1, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:

i) proporcionar un compuesto;

ii) incubar dicho compuesto en presencia de Yap1;

iii) medir la actividad de Yap1 y determinar si dicho compuesto es un inhibidor de Yap1.

Definiciones

Anticuerpo. El término "anticuerpo" describe un componente funcional de suero y a menudo se refiere a una colección de moléculas (anticuerpos o inmunoglobulina) o a una molécula (la molécula de anticuerpo o molécula de inmunoglobulina). Una molécula de anticuerpo es capaz de unirse a o reaccionar con un determinante antigénico específico (el antígeno o el epítopo antigénico), que a su vez puede dar lugar a la inducción de mecanismos efectores inmunológicos. Una molécula de anticuerpo individual generalmente se considera monoespecífica, y una composición de moléculas de anticuerpo puede ser monoclonal (es decir, que consiste en moléculas de anticuerpo idénticas) o policlonal (es decir, que consiste en moléculas de anticuerpo diferentes que reaccionan con el mismo o diferentes epítopos en el mismo antígeno o en antígenos distintos, diferentes). Cada molécula de anticuerpo tiene una estructura única que le permite unirse específicamente a su antígeno correspondiente, y todas las moléculas de anticuerpo naturales tienen la misma estructura básica general de dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas pesadas idénticas. Los anticuerpos también se conocen colectivamente como inmunoglobulinas. El término anticuerpo o anticuerpos, tal y como se usa en la presente memoria, se usa en el sentido más amplio y abarca anticuerpos intactos, anticuerpos quiméricos, humanizados, completamente humanos y de cadena simple, así como fragmentos de unión de anticuerpos, tales como fragmentos Fab, F(ab')², Fv o fragmentos scFv, así como formas multiméricas tales como moléculas de IgA diméricas o IgM pentavalentes.

Antígeno. Un antígeno es una molécula que comprende al menos un epítopo. El antígeno puede ser, por ejemplo, un polipéptido, polisacárido, proteína, lipoproteína o glicoproteína.

Células progenitoras pancreáticas bona fide. El término "célula progenitora pancreática bona fide" o "progenitor pancreático verdadero" se refiere en la presente memoria a una célula, que es capaz de diferenciarse en todos los linajes pancreáticos, incluyendo acinar, ductal y endocrino, tales como las células productoras de insulina.

Endodermo definitivo. Tal y como se usa en la presente memoria, "endodermo definitivo" o "DE" se refiere a una célula multipotente que puede diferenciarse en células del tubo intestinal u órganos derivados del tubo intestinal. De acuerdo con determinadas realizaciones de la presente descripción, las células del endodermo definitivo y las células derivadas del mismo son células de mamífero y, en una realización preferida de la presente descripción, las células del endodermo definitivo son células humanas. En algunas realizaciones de la presente descripción, las células del endodermo definitivo expresan o no expresan significativamente determinados marcadores. En algunas realizaciones de la presente descripción, en las células del endodermo definitivo se expresan uno o más marcadores seleccionados de SOX17, CXCR4, MIXLI, GAT A4, FOXA2, GSC, FGF 17, VWF, CALCR, FOXQI, CMKORI, CER y CRIPI. En otras realizaciones de la presente descripción, en las células del endodermo definitivo no se expresan significativamente uno o más marcadores seleccionados de OCT4, HNF4A, alfa-fetoproteína (AFP), trombomodulina (TM), SPARC y SOX7. Las células del endodermo definitivo no expresan PDX-1.

Célula diferenciable o diferenciada. Tal y como se usa en la presente memoria, la frase "célula diferenciable" o "célula diferenciada" o "célula derivada de hES" puede referirse a células pluripotentes, multipotentes, oligopotentes o incluso unipotentes, como se define con detalle a continuación. En determinadas realizaciones de la presente descripción, las células diferenciables son células diferenciables pluripotentes. En realizaciones más específicas de la presente descripción, las células diferenciables pluripotentes se seleccionan del grupo que consiste en células madre embrionarias, células de ectodermo primitivo, células germinales primordiales y células de teratocarcinoma. En una realización particular de la presente descripción, las células diferenciables son células madre embrionarias de mamífero. En una realización más particular de la presente descripción, las células diferenciales son células madre embrionarias humanas. Determinadas realizaciones de la presente descripción también contemplan células diferenciables de cualquier fuente dentro de un animal, siempre que las células sean diferenciables como se define en la presente memoria. Por ejemplo, las células diferenciables se pueden recoger de embriones no humanos o de cualquier capa germinal primordial en los mismos, de tejido placentario o coriónico, o de tejido más maduro tales como células madre adultas que incluye, pero no se limita a, tejido adiposo, de médula ósea, tejido nervioso, tejido mamario, tejido hepático, páncreas, tejido epitelial, respiratorio, gonadal y muscular. En realizaciones específicas de la presente descripción, las células diferenciables son células madre embrionarias obtenidas sin la destrucción de embriones. En otras realizaciones específicas de la presente descripción, las células diferenciables son células madre adultas. En otras realizaciones específicas más de la presente descripción, las células madre son células madre derivadas de la placenta o coriónicas. Diferenciación. Tal y como se usa en la presente memoria, el término "diferenciación" se refiere a la producción de un tipo celular que es más diferenciado que el tipo celular del que se deriva. Por lo tanto, el término engloba tipos celulares que están parcial y terminalmente diferenciados. De forma similar, "producido a partir de hESC", "derivado de hESC", "diferenciado de hESC", "célula derivada de hES" y expresiones equivalentes se refieren a la producción de un tipo celular diferenciado a partir de hESC in vitro e in vivo.

Embrionario. Tal y como se usa en la presente memoria, "embrionario" se refiere a un intervalo de etapas de desarrollo de un organismo que comienza con un solo cigoto y termina con una estructura multicelular que ya no comprende células pluripotentes o totipotentes distintas de las células gaméticas desarrolladas.

Nivel de expresión. Tal y como se usa en la presente memoria, el término "nivel de expresión" puede referirse al nivel de transcrito (ARNm) o al nivel de proteína para un gen o proteína en particular, respectivamente. Por tanto, los niveles de expresión pueden determinarse mediante procedimientos conocidos en la técnica, determinando el nivel de transcripción o el nivel de proteína. Los niveles de transcripción se pueden medir cuantificando la cantidad de transcrito mediante procedimientos tales como, pero no limitados a, transferencia Northern, RT-PCR o procedimientos basados en micromatrices. Los niveles de proteína se pueden medir mediante procedimientos tales como, pero no limitados a, transferencia Western e inmunotinción.

Células madre embrionarias humanas. Las células madre embrionarias humanas son pluripotentes y se pueden diferenciar en todos los derivados de las tres capas germinales primarias, a saber: ectodermo, endodermo y mesodermo (Thomson y col., 1998). Tal y como se usa en la presente memoria, el término "células madre pluripotentes humanas" (hPS) se refiere a células que son capaces, en condiciones apropiadas, de producir progenie humana de diferentes tipos celulares que son derivados de las 3 capas germinales (endodermo, mesodermo y ectodermo). Las células hPS pueden tener la capacidad de formar un teratoma en ratones SCID de 8-12 semanas de edad y/o la capacidad de formar células identificables de las tres capas germinales en cultivo de tejidos. En la definición de células madre pluripotentes humanas se incluyen las células embrionarias de varios tipos, así como las células madre pluripotentes inducidas (véase, por ejemplo, Yu y col. (2007) Science 318:5858; Takahashi y col. (2007) Cell 131 (5):861). Los diversos procedimientos y otras realizaciones de la presente descripción descritos en la presente memoria pueden requerir o utilizar células hPS (hPSC) de una variedad de fuentes. Por ejemplo, se pueden obtener células hPS adecuadas para su uso a partir de embriones en desarrollo. Adicionalmente o de forma alternativa, se pueden obtener células hPS adecuadas a partir de líneas celulares establecidas y/o células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPS) mediante procedimientos que no requieren la destrucción de embriones (Chung y col. 2008).

Tal y como se usa en la presente memoria, "células hiPS" se refiere a células madre pluripotentes inducidas humanas.

Tal y como se usa en la presente memoria, el término "célula madre derivada de blastocisto" se indica como célula BS, y la forma humana se denomina "células hBS". En la bibliografía, las células a menudo se denominan células madre embrionarias y, más específicamente, células madre embrionarias humanas (hESC). Las células madre pluripotentes usadas en la presente descripción pueden ser, entre otras, células o líneas celulares hBS disponibles comercialmente. Sin embargo, se prevé además que cualquier célula madre pluripotente humana puede usarse en la presente descripción, incluyendo las células adultas diferenciadas que se reprograman a células pluripotentes, por ejemplo, mediante el tratamiento de células adultas con determinados factores de transcripción, tales como OCT4, So X2, NANOG y LIN28 como se describe en Yu, y col., 2007, Takahashi y col. 2007 y Yu y col.

2009. En la medida en que la población de células progenitoras pancreáticas de la presente descripción se derive de células madre embrionarias humanas, las células madre embrionarias humanas se han generado con procesos que no implican el uso de embriones humanos con fines industriales o comerciales.

Inactivación: El término 'inactivación' se usa en la presente memoria en conexión con la inactivación de la función de Yap1 en una célula y se refiere a manipulaciones de la célula para obtener una reducción de la función de Yap1 en la célula. Yap1 se puede inactivar mediante el uso de un inhibidor de Yap1, tal como la verteporfina. Yap1 también se puede inactivar mediante mutación o deleción del gen YAP1. El silenciamiento de Yap1, por ejemplo, mediante el uso de siRNA, también se puede usar para inactivar Yap1, como es conocido por el experto en la materia. La inactivación puede ser transitoria o permanente. La inactivación también puede ser reversible o irreversible. Por ejemplo, la incubación de una población celular con un inhibidor de Yap1 dará como resultado típicamente una inactivación transitoria de Yap1 mientras el inhibidor sea efectivo. La eliminación del inhibidor del entorno en general dará como resultado el alivio de la inactivación de Yap1. Asimismo, los siRNA típicamente solo tendrán un Yap1 silenciador mientras se expresen o estén presentes. La deleción o mutación de Yap1 dará como resultado típicamente la inactivación permanente, aunque el experto en la materia sabrá cómo revertir los efectos de la deleción o mutación de Yap1, por ejemplo, mediante procedimientos de edición génica.

Célula madre pluripotente inducida. Las células madre pluripotentes inducidas (o iPSC) se pueden derivar directamente de células adultas mediante reprogramación (Takashashi y col., 2006). Las iPSC se pueden inducir por proteínas y se denominan a continuación células madre pluripotentes inducidas por proteínas (piPSC).

Ligando. Tal y como se usa en la presente memoria, "ligando" se refiere a un resto o compañero de unión que se une específicamente o reacciona de forma cruzada con el marcador o la diana o el receptor o la proteína de membrana en la célula o con el analito soluble en una muestra o solución. La diana en la célula incluye, pero no se limita a, un marcador. Los ejemplos de dichos ligandos incluyen, pero no se limitan a, un anticuerpo que se une a un antígeno celular, un anticuerpo que se une a un antígeno soluble, un antígeno que se une a un anticuerpo ya unido al antígeno celular o soluble; una lectina que se une a un carbohidrato soluble o a un resto de carbohidrato que es parte de una glicoproteína o glicolípido; o fragmentos funcionales de dichos anticuerpos y antígenos que son capaces de unirse; una secuencia de ácido nucleico suficientemente complementaria a una secuencia de ácido nucleico diana de la diana celular o analito soluble para unir la secuencia diana o analito, una secuencia de ácido nucleico suficientemente complementaria a una secuencia de ácido nucleico de ligando ya unida al marcador celular o diana o analito soluble, o un compuesto químico o proteico, tal como biotina o avidina. Los ligandos pueden ser solubles o pueden inmovilizarse en el medio de captura (es decir, unidos sintéticamente covalentemente a una perla), como se indica en el formato del ensayo, p. ej., cromatografía de afinidad de anticuerpos. Como se define en la presente memoria, los ligandos incluyen, pero no se limitan a, varios agentes que detectan y reaccionan con uno o más marcadores o dianas celulares específicos o analitos solubles.

Marcador. Tal y como se usa en la presente memoria, "marcador'', "epítopo", "diana", "receptor" o equivalentes de los mismos pueden referirse a cualquier molécula que se pueda observar o detectar. Por ejemplo, un marcador puede incluir, pero no está limitado a, un ácido nucleico, tal como un transcrito de un gen específico, un producto polipeptídico de un gen, tal como una proteína de membrana, un polipéptido que no es producto de un gen, una glicoproteína, un carbohidrato, un glicolípido, un lípido, una lipoproteína o una molécula pequeña (por ejemplo, moléculas que tienen un peso molecular menor de 10.000 amu). Un "marcador de superficie celular" es un marcador presente en la superficie celular.

Célula multipotente. Tal y como se usa en la presente memoria, "multipotente" o "célula multipotente" se refiere a un tipo celular que puede dar lugar a un número limitado de otros tipos celulares particulares. Las células multipotentes están comprometidas con uno o más destinos de células embrionarias y, por tanto, a diferencia de las células pluripotentes, no pueden dar lugar a cada uno de los tres linajes de capa germinal, así como a las células extraembrionarias.

Célula madre naíf y célula madre estimulada. Las células madre naíf tienen el potencial de desarrollarse en cualquier tipo de célula, a diferencia de las células madre estimuladas, que pueden diferenciarse en varios tipos de células, pero que ya están predeterminadas hasta cierto punto. Se sabe que existen células madre naíf en ratones, pero las células madre naíf humanas solo se han descrito recientemente (Takashima y col., 2014). Las células madre naíf pueden autorrenovarse continuamente sin señalización de ERK, son fenotípicamente estables y están cariotípicamente intactas. Se diferencian in vitro y forman teratomas in vivo. El metabolismo se reprograma con la activación de la respiración mitocondrial como en la ESC. El estado pluripotente de las células humanas se puede restablecer mediante la expresión a corto plazo de dos componentes, NANOG y KLF2, como se describe en Takashima y col., 2014. Las PSC naíf comparten muchas propiedades con la masa celular interna del blastocisto, mientras que las PSC estimuladas se asemejan a las células de epiblastos de un embrión en un estadio pregastrulante más avanzado. En el ratón, el estado naíf está representado por células madre embrionarias (mESC) y el estado estimulado por células madre del epiblasto (EpiSC). En los seres humanos, las ESC derivadas de blastocistos se han considerado hasta hace poco como el equivalente humano de las mESC. Sin embargo, sin pretender la vinculación a ninguna teoría, en base a múltiples características tales como morfología plana, dependencia de factores de crecimiento o inactivación del cromosoma X, las hESC (y las células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC)) están más cerca de las EpiSC de ratón que de las mESC y, como tales, es más probable que correspondan al estado de pluripotencia estimulado en lugar del naíf (Tesar y col. 2007; Stadtfeld y Hochedlinger 2010).

Anticuerpo presente de forma natural. El término "anticuerpo presente de forma natural" se refiere a glicoproteínas heterotetraméricas capaces de reconocer y unirse a un antígeno y que comprenden dos cadenas pesadas (H) idénticas y dos cadenas ligeras (L) idénticas interconectadas mediante enlaces disulfuro. Cada cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada (abreviada en la presente memoria como V^h) y una región constante de cadena pesada (abreviada en la presente memoria como C^h). Cada cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (abreviada en la presente memoria como V^l) y una región constante de cadena ligera (abreviada en la presente memoria como C^l). Las regiones V^hy V^lse pueden además subdividir en regiones hipervariables, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Los anticuerpos pueden comprender diversos heterotetrámeros diferentes.

Célula progenitora pancreática o célula progenitora pancreática multipotente. Una célula progenitora es una célula que está comprometida a diferenciarse en un determinado tipo de célula. Por tanto, las células progenitoras pancreáticas son multipotentes y pueden diferenciarse y dar lugar a todos los tipos celulares del páncreas.

Célula parcialmente madura. Tal y como se usa en la presente memoria, "células parcialmente maduras" se refiere a células que presentan al menos una característica del fenotipo, tal como morfología o expresión de proteínas, de una célula madura del mismo órgano o tejido. Algunas realizaciones de la presente descripción contemplan el uso de células diferenciables de cualquier animal capaz de generar células diferenciables, p. ej., células de tipo pancreático tales como células beta. Los animales de los que se recogen las células diferenciables pueden ser vertebrados o invertebrados, mamíferos o no mamíferos, humanos o no humanos. Los ejemplos de fuentes animales incluyen, pero no se limitan a, primates, roedores, caninos, felinos, equinos, bovinos y porcinos.

Célula pluripotente. Por "pluripotente" se entiende que la célula puede dar lugar a cada uno de los tres linajes de capa germinal. Sin embargo, es posible que las células pluripotentes no sean capaces de producir un organismo completo. En determinadas realizaciones de la presente descripción, las células pluripotentes usadas como material de partida son células madre, incluyendo células madre embrionarias humanas. Las células pluripotentes pueden derivarse explantando células de embriones en diferentes estadios de desarrollo. Las PSC (células madre pluripotentes) se pueden clasificar en dos estadios distintos, naíf y estimulado, dependiendo de en qué estadio se encuentren durante el desarrollo embrionario.

Célula madre. Una célula madre es una célula indiferenciada que puede diferenciarse en células especializadas y puede dividirse para producir más células madre. El término célula madre comprende células madre embrionarias, células madre adultas, células madre naíf, así como células madre pluripotentes inducidas. Las células madre se definen por su capacidad a nivel de una sola célula para autorrenovarse y diferenciarse para producir células de progenie, incluyendo las progenitoras autorrenovables, las progenitoras no renovables y las células diferenciadas terminalmente. Las células madre también se caracterizan por su capacidad para diferenciarse in vitro en células funcionales de varios linajes celulares de múltiples capas germinales (endodermo, mesodermo y ectodermo), así como para dar lugar a tejidos de múltiples capas germinales después del trasplante y contribuir sustancialmente a la mayoría, si no todos, los tejidos después de la inyección en blastocistos. Las células madre se clasifican por su potencial de desarrollo en: (1) totipotente, que significa capaz de dar lugar a todos los tipos de células embrionarias y extraembrionarias; (2) pluripotente, que significa capaz de dar lugar a todos los tipos de células embrionarias; (3) multipotente, que significa capaz de dar lugar a un subconjunto de linajes celulares, pero todos dentro de un tejido, órgano o sistema fisiológico particular (por ejemplo, las células madre hematopoyéticas (HSC) pueden producir una progenie que incluye HSC (autorrenovables), progenitores oligopotentes restringidos a células sanguíneas y todos los tipos y elementos celulares (p. ej., plaquetas) que son componentes normales de la sangre); (4) oligopotente, que significa capaz de dar lugar a un subconjunto más restringido de linajes celulares que las células madre multipotentes; y (5) unipotente, que significa capaz de dar lugar a un solo linaje celular (p. ej., células madre espermatogénicas).

Célula madre totipotente: El término se refiere a una célula que tiene el potencial de dar lugar a todos y cada uno de los tipos de células humanas, tales como los tres linajes de capa germinal y los linajes extraembrionarios. Puede dar lugar a un organismo funcional completo.

Inhibidor de Yap1. El término se usará en la presente memoria de forma intercambiable con los términos inhibidor de Yap-TEAD, inhibidor de YAP1-TEAD. Se refiere a compuestos capaces de inhibir la actividad de Yap1, por ejemplo, interrumpiendo la interacción entre los factores de transcripción de Yap1 y TEAD.

En la presente descripción, cualquier nombre de gen o proteína puede hacer referencia al gen o la proteína en cualquier especie. Por ejemplo, PDX1 o Pdx1 se usan de forma intercambiable y pueden referirse a Pdx1 murino o PDX1 humano o a Pdx1 en otra especie.

En la presente descripción, un signo "-" después del nombre de un gen o proteína significa que el gen o la proteína no se expresa, mientras que un signo "+" después del nombre de un gen o proteína significa que el gen o la proteína se expresa. Por tanto, las células PDX1- o PDX1- son células que no expresan PDX1, mientras que las células PDX1+ o PDX1 son células que expresan PDX1.

YAP1 (proteína 1 asociada a Yes) es un efector nuclear descendente de la ruta de señalización Hippo, que está implicada en el desarrollo, crecimiento, reparación y homeostasis. Se sabe que la hiperactivación de Yap1 juega un papel en el desarrollo y progresión de múltiples cánceres y puede funcionar como una diana potencial para el tratamiento del cáncer. El empalme alternativo da como resultado múltiples variantes de transcrito que codifican diferentes isoformas. Yap1 puede actuar como coactivador y correpresor y juega un papel fundamental en el control del tamaño de los órganos y la supresión de tumores al restringir la proliferación y promover la apoptosis. El núcleo de esta ruta está compuesto por una cascada de quinasas donde STK3/MST2 y STK4/MST1, en complejo con su proteína reguladora SAV1, fosforila y activa LATS1/2 en complejo con su proteína reguladora MOB1, que a su vez fosforila e inactiva la oncoproteína de YAP1 y WWTR1/TAZ. También juega un papel en el control de la proliferación celular en respuesta al contacto celular. La fosforilación de YAP1 por LATS1/2 inhibe su translocación al núcleo para regular genes celulares importantes para la proliferación celular, muerte celular y migración celular. Para ello se requiere la presencia de factores de transcripción de TEAD para estimular la expresión génica, el crecimiento celular, el crecimiento independiente del anclaje y la inducción de la transición mesenquimatosa epitelial (EMT).

La verteporfina es una molécula pequeña que es capaz de inhibir la interacción de Yap1 con factores de transcripción de TEAD, inhibiendo por tanto la actividad de Yap1. Este derivado de benzoporfirina es un medicamento que se usa como fotosensibilizador para el tratamiento fotodinámico para eliminar los vasos sanguíneos anormales.

En el páncreas, se pueden encontrar varios tipos diferentes de células pancreáticas. Las células pancreáticas incluyen, por ejemplo, células progenitoras pancreáticas multipotentes, células progenitoras ductales/acinares, células acinares/exocrinas completamente diferenciadas, células progenitoras ductales/endocrinas, células progenitoras endocrinas, células endocrinas tempranas y/o células endocrinas completamente diferenciadas. Los diferentes estadios de hPSC hacia células endocrinas se representan en la figura 6. Las células progenitoras del endodermo pancreático que expresan PDX1 y NKX6-1 tienen la capacidad de diferenciarse en células acinares, células ductales o células endocrinas. El término "célula progenitora pancreática bona fide" o "progenitor pancreático verdadero" se refiere en la presente memoria a una célula, que es capaz de diferenciarse en todos los linajes pancreáticos, incluyendo acinar, ductal y endocrino, tales como linajes de células productoras de insulina.

Las células endocrinas pancreáticas tempranas son células que han iniciado la expresión de una de las hormonas endocrinas pancreáticas (insulina, glucagón, somatostatina y polipéptido pancreático) pero no comparten todas las características de las células endocrinas pancreáticas completamente maduras que se encuentran en el islote de Langerhans en el páncreas adulto. Estas células pueden ser células endocrinas que han desactivado Ngn3 pero no comparten todas las características de las células endocrinas pancreáticas completamente diferenciadas que se encuentran en el islote de Langerhans en el páncreas adulto, tal como la capacidad de respuesta a la glucosa, y son positivas para una de las hormonas endocrinas pancreáticas (insulina, glucagón, somatostatina, polipéptido pancreático y grelina).

Las células endocrinas pancreáticas, o células productoras de hormonas pancreáticas, son células capaces de expresar al menos una de las siguientes hormonas: insulina, glucagón, somatostatina, polipéptido pancreático y grelina.

Las "células endocrinas pancreáticas completamente diferenciadas" (también denominadas "células endocrinas completamente diferenciadas", "células endocrinas pancreáticas maduras", "células endocrinas pancreáticas" o "células endocrinas pancreáticas adultas") son células que comparten todas las características de las células endocrinas pancreáticas completamente diferenciadas que se encuentran en el islote de Langerhans en el páncreas adulto.

PDX1 (caja homeótica pancreática y duodenal 1), también conocido como factor promotor de insulina 1, es un factor de transcripción necesario para el desarrollo pancreático y la maduración de las células p. En el desarrollo embrionario, PDX1 se expresa por una población de células en la región del intestino anterior posterior del endodermo definitivo, y las células epiteliales PDX1 dan lugar a las yemas pancreáticas en desarrollo y, eventualmente, a todo el páncreas: sus poblaciones de células exocrinas, endocrinas y ductales. PDX1 también es necesario para la maduración de las células p: las células p en desarrollo coexpresan PDX1, NKX6-1 e insulina, un proceso que da como resultado el silenciamiento de MafB y la expresión de MafA, un cambio necesario en la maduración de las células p. Las células progenitoras pancreáticas PDX1 también coexpresan HLXB9, HNF6, PTF1a y NKX6-1 (proteína de caja homeótica Nkx-6.1), y estas células progenitoras forman las yemas pancreáticas iniciales, que pueden proliferar más. Las células endocrinas pancreáticas expresan PDX1 y NKX6-1 (células PDX1+ NKX6-1+).

La presente descripción se basa en el sorprendente hallazgo de que los inhibidores de Yap1 pueden usarse para inducir la diferenciación de células progenitoras pancreáticas en células p productoras de insulina. También se pueden emplear otros procedimientos para inactivar, tales como procedimientos genéticos, por ejemplo, mutación, deleción o silenciamiento.

Procedimiento para la diferenciación de células en células p productoras de insulina

En un primer aspecto, la descripción se refiere a un procedimiento para la diferenciación de células en células p productoras de insulina, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:

En algunas realizaciones de la presente descripción, la población de células progenitoras pancreáticas proporcionada en la etapa i) está enriquecida con células progenitoras pancreáticas bona fide. En algunas realizaciones de la presente descripción, las células progenitoras pancreáticas bona fide expresan Pdx1. En algunas realizaciones de la presente descripción, las células progenitoras pancreáticas bona fide expresan Pdx1 y Nkx6-1.

Población celular de partida

El término "población de células de partida" en la presente memoria se refiere a la población de células progenitoras pancreáticas proporcionada en la etapa i) que comprende al menos una célula capaz de diferenciarse.

En algunas realizaciones de la presente descripción, la población celular puede derivarse o aislarse de un individuo, tal como, pero no limitado a, un mamífero, por ejemplo, un ser humano.

En algunas realizaciones de la presente descripción, las células se derivan de células capaces de diferenciarse, tales como células madre pluripotentes, por ejemplo, células madre pluripotentes humanas (hPSC). Las hPSC incluyen células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC), células madre embrionarias humanas (hESC) y células madre humanas naíf (NhSC).

En una realización de la presente descripción, la población celular de partida se obtiene de un páncreas, incluyendo un páncreas fetal o un páncreas adulto. En un aspecto de la presente descripción, el páncreas es de un mamífero, tal como un ser humano.

En otra realización de la presente descripción, la población celular de partida es una población de células somáticas. En algunas realizaciones de la presente descripción, la población celular de partida se obtiene de una población de células somáticas. En un aspecto adicional de la presente descripción, la población de células somáticas ha sido inducida para desdiferenciarse en una célula madre de tipo embrionario (ESC, p. ej., una célula pluripotente, o hESC para ESC humanas). Dichas células desdiferenciadas también se denominan células madre pluripotentes inducidas (IPSC o hIPSC para IPSC humanas).

En otra realización más de la presente descripción, la población celular de partida es ESC o hESC. En una realización de la presente descripción, la población celular de partida se obtiene a partir de ESC o hESC. En algunas realizaciones de la presente descripción, la población celular de partida es una población de células pluripotentes tales como células similares a ESC.

En algunas realizaciones de la presente descripción, la población de células de partida comprende al menos algunas células capaces de madurar en células p bona fide.

En un aspecto de la descripción, la población de células de partida es de origen mamífero. En algunos aspectos de la descripción, la población celular se ha diferenciado al linaje endocrino pancreático.

En un aspecto de la descripción, la población celular de partida se obtiene de uno o más páncreas donados. Los procedimientos descritos en la presente memoria no dependen de la edad del páncreas donado. Por consiguiente, se puede usar material pancreático aislado de donantes de edades comprendidas entre embriones y adultos.

Una vez que se recoge un páncreas de un donante, se procesa típicamente para obtener células individuales o pequeños grupos de células para su cultivo usando una variedad de procedimientos. Uno de dichos procedimientos requiere que el tejido pancreático recogido se limpie y prepare para la digestión enzimática. El procesamiento enzimático se usa para digerir el tejido conectivo de modo que el parénquima del tejido recogido se disocie en unidades más pequeñas de material celular pancreático. El tejido pancreático recogido se trata con una o más enzimas para separar el material celular pancreático, las subestructuras y las células pancreáticas individuales de la estructura general del órgano recogido. Se contemplan preparaciones de colagenasa, ADNasa, lipasa y otras enzimas para su uso con los procedimientos descritos en la presente memoria.

El material de origen aislado puede procesarse adicionalmente para enriquecerlo con una o más poblaciones celulares deseadas antes de realizar los presentes procedimientos. En algunos aspectos de la presente descripción, el tejido pancreático no fraccionado, una vez disociado para cultivo, también puede usarse directamente en los procedimientos de cultivo de la presente descripción sin separación adicional. Sin embargo, el tejido pancreático no fraccionado, una vez disociado para cultivo, también puede usarse directamente en los procedimientos de cultivo de la presente descripción sin separación adicional, y rendirá la población celular intermedia. En una realización de la presente descripción, el material celular pancreático aislado se purifica mediante centrifugación a través de un gradiente de densidad (p. ej., Nycodenz, Ficoll o Percoll). La mezcla de células recogida de la fuente donante será típicamente heterogénea y, por lo tanto, contendrá células alfa, células beta, células delta, células ductales, células acinares, células progenitoras facultativas y otros tipos de células pancreáticas.

Un procedimiento de purificación típico da como resultado la separación del material celular aislado en varias capas o interfaces. Típicamente, se forman dos interfaces. La interfaz superior está enriquecida con islotes y contiene típicamente del 10 al 100 % de células de los islotes en suspensión.

La segunda interfaz es típicamente una población mixta de células que contiene células de islotes, acinares y ductales. La capa inferior es el sedimento, que se forma en la parte inferior del gradiente. Esta capa contiene típicamente principalmente células acinares, algunos islotes atrapados y algunas células ductales. Los componentes del árbol ductal se pueden recoger por separado para su posterior manipulación.

La constitución celular de las fracciones seleccionadas para una manipulación adicional variará dependiendo de la fracción del gradiente que se seleccione y los resultados finales de cada aislamiento. Cuando las células de islote son el tipo celular deseado, una población adecuadamente enriquecida con células de islote dentro de una fracción aislada contendrá al menos del 10 % al 100 % de células de islote. También se pueden recoger otros tipos y concentraciones de células pancreáticas después del enriquecimiento. Por ejemplo, los procedimientos de cultivo descritos en la presente memoria se pueden usar con células aisladas de la segunda interfaz, del sedimento o de otras fracciones, dependiendo del gradiente de purificación usado.

En una realización de la presente descripción, los cultivos de células pancreáticas intermedias se generan a partir de la fracción (superior) enriquecida con islotes. Adicionalmente, sin embargo, también se puede usar en cultivo la segunda interfaz más heterogénea y las fracciones de capa inferior que típicamente contienen poblaciones de células mixtas de células de islotes, acinares y ductales o componentes del árbol ductal, células acinares y algunas células de islotes atrapadas, respectivamente. Si bien ambas capas contienen células capaces de dar lugar a la población de células progenitoras pancreáticas bona fide enriquecida descrita en la presente memoria, cada capa puede tener ventajas particulares para su uso con los procedimientos descritos.

En una realización de la presente descripción, la población celular de partida es una población de o que comprende células madre. En otra realización de la presente descripción, la población celular de partida es una población de o que comprende células madre diferenciadas al linaje endocrino pancreático. En una realización de la presente descripción, la población celular es una población de células madre que se obtiene sin la destrucción de un embrión. Se conocen en la técnica procedimientos para obtener células madre sin destruir embriones (Chung y col., 2008).

Un protocolo para obtener células pancreáticas a partir de células madre se ejemplifica mediante, pero no está limitado a, los protocolos descritos en D'Amour, K. A. y col. (2006); Jiang, J. y col. (2007); y Kroon, E. y col. (2008), Rezania y col. (2012, 2014), Felicia W. Pagliuca y col. (2014).

Un protocolo para obtener células pancreáticas a partir de células somáticas o células somáticas inducidas para desdiferenciarse en células pluripotentes tales como células similares a ES se ejemplifica mediante, pero no está limitado a, los protocolos descritos en Aoi, T. y col. (2008), D'Amour, K. A. y col. (2006), Jiang, J. y col. (2007), Kroon, E. y col. (2008), Takahashi, K. y col. (2007), Takahashi y Yamanaka (2006), y Wernig, M. y col. (2007).

La diferenciación es el proceso mediante el cual una célula no especializada ("no comprometida") o menos especializada adquiere las características de una célula especializada tal como, por ejemplo, una célula nerviosa o una célula muscular. Una célula diferenciada o inducida para diferenciarse es aquella que ha asumido una posición más especializada ("comprometida") dentro del linaje de una célula. El término "comprometida", cuando se aplica al proceso de diferenciación, se refiere a una célula que ha avanzado en la ruta de diferenciación hasta un punto en el que, en circunstancias normales, continuará diferenciándose en un tipo de célula o subconjunto de tipos de células específicos y no puede, en circunstancias normales, diferenciarse en un tipo de célula diferente o revertir a un tipo de célula menos diferenciado. La desdiferenciación se refiere al proceso por el cual una célula vuelve a una posición menos especializada (o comprometida) dentro del linaje de una célula. Tal y como se usa en la presente memoria, el linaje de una célula define la herencia de la célula, es decir, de qué células proviene y a qué células puede dar lugar. El linaje de una célula coloca a la célula dentro de un esquema hereditario de desarrollo y diferenciación. Un marcador específico de linaje se refiere a una característica asociada específicamente con el fenotipo de las células de un linaje de interés y se puede usar para evaluar la diferenciación de una célula no comprometida al linaje de interés.

En algunos aspectos de la presente descripción, "diferenciar" o "diferenciación", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a un proceso en el que las células progresan desde un estado inmaduro a un estado menos inmaduro. En otro aspecto de la presente descripción, "diferenciar" o "diferenciación", tal y como se usa en la presente memoria, se refiere a un proceso en el que las células progresan desde un estado indiferenciado a un estado diferenciado o desde un estado inmaduro a un estado maduro. Por ejemplo, las células pancreáticas indiferenciadas pueden proliferar y expresar marcadores característicos, como PDX1. Las células pancreáticas embrionarias indiferenciadas tempranas pueden proliferar y expresar marcadores característicos, como PDX1. En una realización de la presente descripción, las células pancreáticas maduras o diferenciadas no proliferan y secretan niveles altos de hormonas endocrinas pancreáticas. En algunas realizaciones de la presente descripción, las células pancreáticas maduras o diferenciadas no proliferan y secretan niveles altos de hormonas endocrinas pancreáticas o enzimas digestivas. En una realización de la presente descripción, p. ej., las células beta maduras secretan insulina a niveles altos. En algunas realizaciones de la presente descripción, p. ej., las células beta maduras secretan insulina a niveles altos en respuesta a la glucosa. Los cambios en la interacción y maduración celular ocurren cuando las células pierden marcadores de células indiferenciadas o ganan marcadores de células diferenciadas. En una realización de la presente descripción, la pérdida o ganancia de un único marcador puede indicar que una célula ha "madurado o se ha diferenciado". En algunas realizaciones de la presente descripción, la pérdida o ganancia de un único marcador puede indicar que una célula ha "madurado o se ha diferenciado completamente". El término "factores de diferenciación" se refiere a un compuesto añadido a las células pancreáticas para aumentar su diferenciación a células endocrinas maduras que también contienen células beta productoras de insulina. Los factores de diferenciación ejemplares incluyen factor de crecimiento de hepatocitos, factor de crecimiento de queratinocitos, exendina-4, factor de crecimiento de fibroblastos básico, factor de crecimiento similar a insulina I, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento derivado de plaquetas, y péptido 1 similar a glucagón. En una realización de la presente descripción, la diferenciación de las células comprende cultivar las células en un medio que comprende uno o más factores de diferenciación.

En algunas realizaciones de la presente descripción, la población celular de partida se analiza para identificar si al menos una de las células de la población de partida expresa marcadores característicos del linaje endocrino pancreático y seleccionados del grupo que consiste en NGN3, NEUROD, ISL1, PDX1, NKX6.1, NKX2.2, MAFA, MAFB, ARX, BRN4, PAX4 y PAX6, GLUT2, iNs , GCG, SST, polipéptido pancreático (PP). En algunas realizaciones de la presente descripción, los marcadores característicos del linaje endocrino pancreático se seleccionan del grupo que consiste en PDX1 y NKX6-1. En una realización de la presente descripción, una célula endocrina pancreática es capaz de expresar al menos una de las siguientes hormonas: insulina, glucagón, somatostatina y PP. En algunas realizaciones de la presente descripción, una célula endocrina pancreática es capaz de expresar al menos una de las siguientes hormonas: insulina, glucagón, somatostatina, PP y grelina. Una población celular de partida adecuada para su uso en la presente descripción es una que comprende al menos una célula que expresa al menos uno de los marcadores característicos del linaje endocrino pancreático. En un aspecto de la presente descripción, una célula que expresa marcadores característicos del linaje endocrino pancreático es una célula endocrina pancreática. La célula endocrina pancreática puede ser una célula que exprese hormonas pancreáticas. De forma alternativa, la célula endocrina pancreática puede ser una célula que secreta hormonas pancreáticas.

En una realización de la presente descripción, la célula endocrina pancreática es una célula que expresa marcadores característicos del linaje de células beta. Una célula que expresa marcadores característicos del linaje de células beta expresa PDX1 y al menos uno de los siguientes factores de transcripción: NGN-3, NKX2-2, NKX6-1, NeuroD, Isl-1, Hnf-3 beta, MAFa , PAX-4, Insm1, Arx y PAX-6. En una realización de la presente descripción, una célula que expresa marcadores característicos del linaje de células beta es una célula beta. En una realización de la presente descripción, la célula endocrina pancreática es una célula que expresa el marcador NKX6-1. En otro aspecto de la presente descripción, la célula endocrina pancreática es una célula que expresa el marcador PDX1. En un aspecto adicional de la presente descripción, la célula endocrina pancreática es una célula que expresa los marcadores NKX6-1 y PDX1.

PDX1 es un factor de transcripción de dominio homeótico implicado en el desarrollo del páncreas. PAX-4 es un factor específico de células beta y PAX-6 es un factor de transcripción (específico) de células de islotes pancreáticos; ambos están implicados en el desarrollo de los islotes. HNF-3 beta (también conocido como FOXA2) pertenece a la familia de factores nucleares hepáticos de factores de transcripción, que se caracteriza por un dominio de unión al ADN altamente conservado y dos dominios carboxi-terminales cortos. NeuroD es un factor de transcripción básico de hélicebucle-hélice (bHLH) implicado en la neurogénesis. NGN3 es un miembro de la familia de neurogeninas de factores de transcripción básicos de bucle-hélice-bucle. NKX2-2 y NKX6-1, tal y como se usan en la presente memoria, son miembros de la familia de factores de transcripción Nkx. Islet-1 o ISL-1 es miembro de la familia de factores de transcripción LIM/dominio homeótico, y se expresa en el páncreas en desarrollo. MAFA es un factor de transcripción expresado en el páncreas y controla la expresión de genes implicados en la biosíntesis y secreción de insulina. INSM1 codifica la proteína 1 asociada a insulinoma. INSM1 representa un actor importante en la neurogénesis embrionaria temprana. En la diferenciación de células endocrinas pancreáticas, Ngn3 activa primero INSM1 y a continuación NeuroD/p2. Por el contrario, INSM1 ejerce un mecanismo de retroalimentación para suprimir NeuroD/p2 y su propia expresión génica. La ablación del gen INSM1 en el ratón da como resultado el deterioro de la maduración de las células endocrinas pancreáticas. Además, la deleción de INSM1 deteriora seriamente la biosíntesis y secreción de catecolaminas de la glándula suprarrenal, lo que da como resultado una letalidad embrionaria temprana. Arx codifica la caja homeótica relacionada con Aristaless, que participa en el desarrollo del páncreas y el sistema nervioso central. Las mutaciones de Arx en ratones están asociadas con la hipoglucemia. Arx presenta expresión dependiente de Ngn3 a lo largo del desarrollo del páncreas endocrino en células a, p-precursoras y 8.

NKX6-1 y PDX1 se coexpresan con PTF1a en la célula multipotente pancreática temprana que puede desarrollarse en todos los tipos de células que se encuentran en el páncreas adulto (p. ej., células acinares, ductales y endocrinas). Dentro de esta población celular, se encuentran células que también expresan transitoriamente NGN3. Una vez que una célula expresa o ha expresado NGN3, formará parte del linaje endocrino, dando lugar a células endocrinas (siendo un tipo la célula beta productora de insulina) que posteriormente formarán los islotes de Langerhans. En ausencia de NGN3, no se forman células endocrinas durante el desarrollo del páncreas. A medida que avanza el desarrollo, NKX6-1 y PDX1 se coexpresan en el dominio más central del páncreas, que ahora queda desprovisto de expresión de PTF1a y las células positivas para NKX6-1 y PDX1 ya no pueden dar lugar a células acinares. Dentro de esta población de células positivas para NKX6-1 y PDX1, un número significativo de células coexpresan transitoriamente NGN3, marcándolas para el linaje endocrino como antes en el desarrollo.

En una realización de la presente descripción, la población celular de partida se deriva de células capaces de diferenciarse. En una realización específica de la presente descripción, la al menos una célula capaz de diferenciarse es una célula madre pluripotente humana. En algunas realizaciones de la presente descripción, la al menos una célula capaz de diferenciarse se selecciona del grupo que consiste en células iPS humanas (hIPSC), células ES humanas (hEsC) y células madre humanas naíf (NhSC).

Las células capaces de diferenciarse se pueden derivar de células aisladas de un individuo.

En una realización de la presente descripción, al menos una célula de la población celular de partida tiene la capacidad de diferenciarse más. Puede tener la capacidad de diferenciarse aún más en células productoras de hormonas pancreáticas. En algunas realizaciones de la presente descripción, al menos una de las células productoras de hormonas pancreáticas es una célula productora de insulina. En algunas realizaciones de la presente descripción, al menos una de las células productoras de hormonas pancreáticas responde a la glucosa. En algunas realizaciones de la presente descripción, al menos una de las células productoras de hormonas pancreáticas es una célula productora de insulina que también responde a la glucosa. En algunas realizaciones de la presente descripción, al menos una célula de la población celular de partida puede producir células de islotes productoras de insulina.

En algunas realizaciones de la presente descripción, al menos una de las células productoras de hormonas pancreáticas es capaz también de expresar MAFA. En una realización de la presente descripción, la célula productora de hormonas pancreáticas es una célula p madura.

Los expertos en la materia conocen procedimientos para obtener células de endodermo pancreático a partir de células de endodermo definitivas. Un ejemplo de dicho procedimiento se da en el ejemplo 4. En resumen, las células del endodermo definitivo se pueden diferenciar en células primitivas del tubo intestinal, a continuación en células del intestino anterior posterior y finalmente en células del endodermo pancreático. El experto en la materia sabe cómo realizar estas etapas. La etapa de diferenciar las células del endodermo pancreático en células p maduras se puede realizar como se describe en la presente memoria, por ejemplo, inhibiendo Yap1 con un inhibidor tal como verteporfina, o silenciando, mutando o delecionando Yap1.

En algunas realizaciones de la presente descripción, la población celular de partida comprende al menos una célula progenitora pancreática bona fide, que expresa preferiblemente PDX1 y NKX6-1. En algunas realizaciones de la presente descripción, la población de células de partida puede estar enriquecida con células progenitoras PDX1 NKX6-1+. Los procedimientos para obtener una población celular enriquecida con células progenitoras PDX1+ NKX6-1+ se proporcionan en la solicitud de patente en tramitación conjunta "Isolation of bona fide pancreatic progenitor cells" (inventores: Jacqueline Ameri y Henrik Semb, solicitante: Universidad de Copenhague) depositada en la misma fecha.

En consecuencia, en algunas realizaciones de la presente descripción, la población de células de partida está enriquecida con células progenitoras PDX1+ NKX6-1+ y se puede obtener mediante un procedimiento que comprende las etapas de:

i) proporcionar una población celular que comprende al menos una célula progenitora pancreática bona fide, donde la célula progenitora pancreática bona fide expresa PDX1 y NKX6-1;

ii) exponer dicha población celular a:

a) un primer ligando que se une a un primer marcador específico para células PDX1- y seleccionar las células que no se unen a dicho primer ligando de dicha población celular, enriqueciendo de este modo la población celular para células PDX1+;

y/o

b) un segundo ligando que se une a un segundo marcador específico para células PDX1 y seleccionar las células que se unen a dicho segundo ligando de las células que no se unen a dicho segundo ligando, enriqueciendo de este modo la población celular para células PDX1+;

y/o

c) un tercer ligando que se une a un tercer marcador específico para células PDX1+ NKX6-1+ y seleccionar las células que se unen a dicho tercer ligando de las células que no se unen a dicho tercer ligando, enriqueciendo de este modo la población celular para células PDX1+ NKX6-1+;

obteniendo de este modo una población celular enriquecida con células progenitoras pancreáticas bona fide.

En realizaciones particulares de la presente descripción, el primer ligando reconoce y se une a CD49d, el segundo ligando reconoce y se une a FOLR1, y el tercer ligando reconoce y se une a GP2.

Dichos procedimientos como se describe en dicha solicitud de patente de tramitación conjunta son útiles para obtener una población celular de partida que comprende al menos un 70 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 75 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 80 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 85 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 90 % de células progenitoras pancreáticas bona fide.

Por tanto, en algunas realizaciones de la presente descripción, la población celular de partida enriquecida con células progenitoras pancreáticas bona fide comprende al menos un 70 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 71 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 72 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 73 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 74 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 75 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 76 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 77 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 78 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 79 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 80 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 81 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 82 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 83 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 84 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 85 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 86 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 87 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 88 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 89 % de células progenitoras pancreáticas bona fide, tal como al menos un 90 % de células progenitoras pancreáticas bona fide.

Para determinar la fracción de células progenitoras bona fide comprendida en la población celular de partida, se pueden emplear procedimientos conocidos en la técnica, tales como, pero no limitado a, procedimientos de inmunotincióny citometría de flujo.

Inhibidor de Yap1

YAP1 (proteína 1 asociada a Yes) es un efector nuclear descendente de la ruta de señalización Hippo, que está implicada en el desarrollo, crecimiento, reparación y homeostasis. La verteporfina es una molécula pequeña, que es capaz de inhibir la actividad de Yap1.

Después de que se haya proporcionado una población de células progenitoras pancreáticas que comprende al menos una célula capaz de diferenciarse como se ha descrito anteriormente, la población celular se incuba en presencia de un inhibidor de Yap1. En algunas realizaciones de la presente descripción, el inhibidor de Yap1 es verteporfina.

En algunas realizaciones de la presente descripción, la población celular se incuba en presencia de verteporfina a una concentración de entre 0,1 y 10 pg/mL, tal como entre 0,2 y 9 pg/mL, tal como entre 0,3 y 8 pg/mL, tal como entre 0,4 y 7 pg/mL, tal como entre 0,5 y 6 pg/mL, tal como entre 0,6 y 5 pg/mL, tal como entre 0,7 y 4 pg/mL, tal como entre 0,8 y 3 pg/mL, tal como entre 0,9 y 2 pg/mL, tal como 1 pg/mL. En una realización de la presente descripción, la población celular se incuba en presencia de 1 pg/mL de verteporfina.

En algunas realizaciones de la presente descripción, la población celular se incuba en presencia de verteporfina durante una duración de al menos 3 días, tal como al menos 4 días, tal como al menos 5 días, tal como al menos 6 días, tal como al menos 7 días, tal como al menos 8 días, tal como al menos 9 días, tal como al menos 10 días. En algunas realizaciones de la presente descripción, la incubación en presencia de verteporfina se realiza durante una duración de 5 días.

Población enriquecida con células ¡3 productoras de insulina

Los presentes procedimientos comprenden las etapas de proporcionar una población de células progenitoras pancreáticas que comprende al menos una célula capaz de diferenciarse y de incubar dicha población celular en la que Yap1 ha sido inactivado, por ejemplo incubando las células en la presencia de un inhibidor de Yap1 tal como verteporfina o inactivando Yap1 por medios genéticos como se describe a continuación, se puede usar para obtener una población celular enriquecida con células p productoras de insulina, también denominada "población celular enriquecida" en lo sucesivo.

En algunas realizaciones de la presente descripción, al menos algunas de las células de la población celular enriquecida son capaces de madurar en células p bona fide. En otras realizaciones de la presente descripción, al menos algunas de las células de la población celular enriquecida son capaces de madurar en células a bona fide.

La inactivación de Yap1, por ejemplo mediante la adición de un inhibidor de Yap1 tal como verteporfina o mediante inactivación por medios genéticos, induce la diferenciación de células en células p productoras de insulina, donde las células p productoras de insulina tienen una mayor expresión de al menos un marcador seleccionado del grupo que consiste en péptido C, Arx, Ngn3, Insm-1, Isl-1, MafA y MafB en comparación con las células donde Yap1 no ha sido inactivado. En algunas realizaciones de la presente descripción, las células tienen una mayor expresión de al menos uno de Ngn3, Arx, Insm-1, Isl-1, MafA y MafB. En algunas realizaciones de la presente descripción, las células tienen una mayor expresión de al menos MafA. En algunas realizaciones de la presente descripción, las células tienen una mayor expresión de al menos Ngn3. Por consiguiente, las células tienen preferiblemente una diferenciación endocrina incrementada en comparación con las células que se incubaron en ausencia del inhibidor de Yap1. En algunas realizaciones de la presente descripción, la inactivación de Yap1 da como resultado una mayor diferenciación hacia las células pancreáticas alfa. En algunas realizaciones de la presente descripción, la inactivación de Yap1 da como resultado una mayor diferenciación hacia las células pancreáticas beta. En algunas realizaciones de la presente descripción, la inactivación de Yap1 da como resultado una mayor diferenciación hacia las células pancreáticas alfa y beta.

El término "expresión" o "nivel de expresión "se referirá en la presente memoria al nivel de ARNm (transcrito) o a los niveles de proteína.

Los procedimientos para determinar si las células p productoras de insulina tienen una mayor expresión de un marcador tal como péptido C, Ngn3, Insm-1, Isl-1, MafA o MafB están disponibles para el experto en la materia. Los niveles de expresión se pueden medir al nivel de ARNm o al nivel de proteína. Los procedimientos para medir los niveles de ARNm son conocidos en la técnica e incluyen, pero no se limitan a: análisis de PCR en tiempo real, RT-qPCR, transferencia Northern y micromatrices de hibridación. Los procedimientos para medir los niveles de expresión de proteínas también son conocidos por los expertos en la materia e incluyen, pero no se limitan a: procedimientos de inmunotinción, transferencia Western, inmunoprecipitación de proteínas e inmunoelectroforesis.

En algunas realizaciones de la presente descripción, la población celular enriquecida tiene una mayor expresión de glucagón en al menos 1,5 veces, tal como al menos 1,6 veces, tal como al menos 1,7 veces, tal como al menos 1,8

l menos l menos

l menos 8,0 veces, tal como al menos 9,0 veces, tal como al menos 10 veces.

En algunas realizaciones de la presente descripción, la expresión de glucagón en la población celular enriquecida no cambia esencialmente en comparación con las células que se incubaron en células donde Yap1 no se inactivó, por ejemplo en ausencia del inhibidor de Yap1. En otras realizaciones de la presente descripción, la expresión de glucagón en la población celular enriquecida disminuye en comparación con la expresión en células en las que Yap1 no se inactivó, por ejemplo, en células que se incubaron en ausencia del inhibidor de Yap1.

En algunas realizaciones de la presente descripción, la población celular enriquecida tiene una mayor expresión de Isl-1 en al menos 1,5 veces, tal como al menos 1,6 veces, tal como al menos 1,7 veces, tal como al menos 1,8 veces, tal como al menos 1,9 veces, tal como al menos 2 veces, tal como al menos 2,1 veces, tal como al menos 2,2 veces, tal como al menos 2,3 veces, tal como al menos 2,4 veces, tal como al menos 2,5 veces, tal como al menos 2,6 veces, tal como al menos 2,7 veces, tal como al menos 2,8 veces, tal como al menos 2,9 veces, tal como al menos 3,0 veces, tal como al menos 3,1 veces, tal como al menos 3,2 veces, tal como al menos 3,3 veces, tal como al menos 3,4 veces, tal como al menos 3,5 veces.

En algunas realizaciones de la presente descripción, la población celular enriquecida tiene una mayor expresión de MafA en al menos 1,5 veces, tal como al menos 1,6 veces, tal como al menos 1,7 veces, tal como al menos 1,8 veces, tal como al menos 1,9 veces, tal como al menos 2 veces, tal como al menos 2,1 veces, tal como al menos 2,2 veces, tal como al menos 2,3 veces, tal como al menos 2,4 veces, tal como al menos 2,5 veces, tal como al menos 2,6 veces, tal como al menos 2,7 veces, tal como al menos 2,8 veces, tal como al menos 2,9 veces, tal como al menos 3,0 veces.

En algunas realizaciones de la presente descripción, la población celular enriquecida tiene una mayor expresión de MafA en al menos 10 veces, tal como al menos 50 veces, tal como al menos 100 veces, tal como al menos 150 veces, tal como al menos 200 veces, tal como al menos 250 veces, tal como al menos 300 veces, tal como al menos 350 veces, tal como al menos 400 veces, tal como al menos 450 veces, tal como al menos 500 veces, tal como al menos 550 veces, tal como al menos 600 veces, tal como al menos 650 veces, tal como al menos 700 veces, tal como al menos 750 veces, tal como al menos 800 veces, tal como al menos 850 veces, tal como al menos 900 veces, tal como al menos 950 veces, tal como al menos 1000 veces.

En algunas realizaciones de la presente descripción, la población celular enriquecida tiene una mayor expresión de MafB en al menos 1,5 veces, tal como al menos 1,6 veces, tal como al menos 1,7 veces, tal como al menos 1,8 veces, tal como al menos 1,9 veces, tal como al menos 2 veces, tal como al menos 2,1 veces, tal como al menos 2,2 veces, tal como al menos 2,3 veces, tal como al menos 2,4 veces, tal como al menos 2,5 veces, tal como al menos 2,6 veces, tal como al menos 2,7 veces, tal como al menos 2,8 veces, tal como al menos 2,9 veces, tal como al menos 3,0 veces, tal como al menos 3,1 veces, tal como al menos 3,2 veces, tal como al menos 3,3 veces, tal como al menos 3,4 veces, tal como al menos 3,5 veces, tal como al menos 3,6 veces, tal como al menos 3,7 veces, tal como al menos 3,8 veces, tal como al menos 3,9 veces, tal como al menos 4,0 veces, tal como al menos 4,5 veces, tal como al menos 5,0 veces, tal como al menos 6,0 veces, tal como al menos 6,5 veces, tal como al menos 7,0 veces, tal como al menos 7,5 veces, tal como al menos 8,0 veces.

En algunas realizaciones de la presente descripción, la población celular enriquecida tiene una mayor expresión de Insm-1, donde la expresión de Isnm-1 se incrementa en al menos 1,1 veces, tal como al menos 1,2 veces, tal como al menos 1,3 veces, tal como al menos 1,4 veces, tal como al menos 1,5 veces, tal como al menos 2 veces, tal como al menos 3 veces, tal como al menos 4 veces, tal como al menos 5 veces, tal como al menos 6 veces, tal como al menos 7 veces, tal como al menos 8 veces, tal como al menos 9 veces, tal como al menos 10 veces, tal como al menos 20 veces, tal como al menos 30 veces, tal como al menos 40 veces, tal como al menos 50 veces, tal como al menos 60 veces, tal como al menos 70 veces, tal como al menos 80 veces, tal como al menos 90 veces, tal como al menos 100 veces, tal como al menos 120 veces, tal como al menos 130 veces, tal como al menos 140 veces, tal como al menos 150 veces, tal como al menos 160 veces, tal como al menos 170 veces, tal como al menos 180 veces, tal como al menos 190 veces, tal como al menos 200 veces, tal como al menos 210 veces, tal como al menos 220 veces.

En algunas realizaciones de la presente descripción, la población celular enriquecida tiene una mayor expresión de Ngn3, donde la expresión de Ngn3 se incrementa en al menos 1,1 veces, tal como al menos 1,2 veces, tal como al menos 1,3 veces, tal como al menos 1,4 veces, tal como al menos 1,5 veces, tal como al menos 2 veces, tal como al menos 3 veces, tal como al menos 4 veces, tal como al menos 5 veces, tal como al menos 6 veces, tal como al menos 7 veces, tal como al menos 8 veces, tal como al menos 9 veces, tal como al menos 10 veces, tal como al menos 15 veces, tal como al menos 20 veces.

En algunas realizaciones de la presente descripción, la población celular enriquecida tiene una mayor expresión de NeuroD en al menos 1,5 veces, tal como al menos 1,6 veces, tal como al menos 1,7 veces, tal como al menos 1,8 veces, tal como al menos 1,9 veces, tal como al menos 2 veces, tal como al menos 2,1 veces, tal como al menos 2,2 veces, tal como al menos 2,3 veces, tal como al menos 2,4 veces, tal como al menos 2,5 veces, tal como al menos 2.6 veces, tal como al menos 2,7 veces, tal como al menos 2,8 veces, tal como al menos 2,9 veces, tal como al menos 3.0 veces, tal como al menos 3,1 veces, tal como al menos 3,2 veces, tal como al menos 3,3 veces, tal como al menos 3,4 veces, tal como al menos 3,5 veces, tal como al menos 4 veces, tal como al menos 5 veces, tal como al menos 6 veces.

En algunas realizaciones de la presente descripción, la población celular enriquecida tiene una mayor expresión de Arx en al menos 1,5 veces, tal como al menos 1,6 veces, tal como al menos 1,7 veces, tal como al menos 1,8 veces, tal como al menos 1,9 veces, tal como al menos 2 veces, tal como al menos 2,1 veces, tal como al menos 2,2 veces, tal como al menos 2,3 veces, tal como al menos 2,4 veces, tal como al menos 2,5 veces, tal como al menos 2,6 veces, tal como al menos 2,7 veces, tal como al menos 2,8 veces, tal como al menos 2,9 veces, tal como al menos 3,0 veces, tal como al menos 3,5 veces, tal como al menos 4,0 veces, tal como al menos 4,5 veces, tal como al menos 5,0 veces.

En algunas realizaciones de la presente descripción, la población celular enriquecida es capaz de producir más insulina que una población celular incubada en ausencia de un inhibidor de Yap1 tal como verteporfina. El experto en la materia dispone de procedimientos para determinar cuánta insulina produce una población celular. Por ejemplo, la insulina se puede medir a nivel de proteína con un ensayo ELISA, o a nivel de ARNm usando procedimientos conocidos en la técnica tales como, pero no limitado a: análisis de PCR en tiempo real, RT-qPCR, transferencia Northern y micromatrices de hibridación.

En consecuencia, en algunas realizaciones de la presente descripción, la población celular enriquecida es capaz de producir al menos 1,5 veces más insulina que las células obtenidas cuando la población celular de la etapa i) se incuba en ausencia del inhibidor de Yap1, tal como al menos 1,6 veces más insulina, tal como al menos 1,7 veces más insulina, tal como al menos 1,8 veces más insulina, tal como al menos 1,8 veces más insulina, tal como al menos 1,9 veces más insulina, tal como al menos 2,0 veces más insulina, tal como al menos 2,5 veces más insulina, tal como al menos 3,0 veces más insulina, tal como al menos 3,5 veces más insulina, tal como al menos 4,0 veces más insulina, tal como al menos 4,5 veces más insulina, tal como al menos 5,0 veces más insulina, tal como al menos 5,5 veces más insulina, tal como al menos 6,0 veces más insulina, tal como al menos 6,5 veces más insulina, tal como al menos 7.0 veces más insulina, tal como al menos 7,5 veces más insulina, tal como al menos 8,0 veces más insulina, tal como al menos 8,5 veces más insulina, tal como al menos 9,0 veces más insulina, tal como al menos 9,5 veces más insulina, tal como al menos 10 veces más insulina, tal como al menos 12,5 veces más insulina, tal como al menos 15 veces más insulina, tal como al menos 17,5 veces más insulina, tal como al menos 20 veces más insulina, tal como al menos 25 veces más insulina, tal como al menos más que las células incubadas en ausencia del inhibidor de Yap1.

En algunas realizaciones de la presente descripción, los niveles de insulina y/o de transcrito de insulina en la población celular enriquecida se incrementan al menos 1,5 veces en comparación con los niveles observados en una población celular incubada en ausencia del inhibidor de proliferación de Yap1, tal como al menos 1,6 veces, tal como al menos 1.7 veces, tal como al menos 1,8 veces, tal como al menos 1,8 veces, tal como al menos 1,9 veces, tal como al menos 2.0 veces, tal como al menos 2,5 veces, tal como al menos 3,0 veces, tal como al menos 3,5 veces, tal como al menos 4,0 veces.

La capacidad de una población celular para producir insulina también se puede medir determinando el área de insulina de la población celular. El área de insulina es la proporción entre el número de células que expresan insulina y el número total de células. El número de células productoras de insulina se puede determinar visualmente mediante procedimientos de inmunotinción, mientras que el número total de células se puede determinar visualmente usando marcadores tal como DAPI. El área celular de insulina se puede calcular a partir de secciones en serie que abarcan tejido pancreático teñido para insulina y DAPI (núcleos). Los valores medios de las áreas de expresión de la sección transversal de las imágenes confocales adquiridas se pueden determinar usando un software apropiado para cuantificar el área celular de insulina.

En consecuencia, el presente procedimiento se puede usar para obtener una población celular enriquecida, donde el área de insulina en dicha población celular enriquecida se incrementa al menos 1,5 veces en comparación con el área de insulina en células incubadas en ausencia del inhibidor de proliferación de Yap1, tal como al menos 1,6 veces, tal como al menos 1,7 veces, tal como al menos 1,8 veces, tal como al menos 1,8 veces, tal como al menos 1,9 veces, tal como al menos 2,0 veces, tal como al menos 2,5 veces, tal como al menos 3,0 veces, tal como al menos 3,5 veces, tal como al menos 4,0 veces.

Sin pretender imponer ninguna teoría, se cree que el aumento de los niveles de expresión de insulina, péptido C, Insm-1, Isl-1, MafA o MafB observados en la población celular enriquecida es consecuencia de una mayor proporción de células p productoras de insulina en dicha población en comparación con la proporción de células p productoras de insulina en una población celular incubada en ausencia del inhibidor de Yap1.

En consecuencia, en algunas realizaciones de la presente descripción, la población celular enriquecida comprende al menos un 5 % de células p productoras de insulina, tal como al menos un 10 % de células p productoras de insulina, tal como al menos un 15 % de células p productoras de insulina, tal como al menos un 20 % de células p productoras de insulina, tal como al menos un 25 % de células p productoras de insulina, tal como al menos un 30 % de células p productoras de insulina, tal como al menos un 35 % de células p productoras de insulina, tal como al menos un 40 % de células p productoras de insulina, tal como al menos un 45 % de células p productoras de insulina, tal como al menos un 50 % de células p productoras de insulina, tal como al menos un 55 % de células p productoras de insulina, tal como al menos un 60 % de células p productoras de insulina, tal como al menos un 65 % de células p productoras de insulina, tal como al menos un 70 % de células p productoras de insulina, tal como al menos un 75 % de células p productoras de insulina, o más.

Inactivación de Yap1

Se entenderá que aunque los procedimientos descritos anteriormente se refieren a procedimientos de diferenciación de células en células p productoras de insulina mediante el uso de un inhibidor de Yap1, la presente descripción se puede adaptar para inactivar Yap1 directamente en las células, por ejemplo mediante procedimientos de edición génica.

En consecuencia, en un aspecto, la presente descripción se refiere a un procedimiento para la diferenciación de células en células p productoras de insulina, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:

i) inactivar Yap1 en dichas células;

Más específicamente, se proporciona un procedimiento para la diferenciación de células en células p productoras de insulina, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:

ii) inactivar Yap1 en dicha población celular;

iii) diferenciar las células de la etapa ii) y comprometerlas al destino endocrino, preferiblemente al destino de las células p productoras de insulina;

Yap1 se puede inactivar en dichas células usando un inhibidor de Yap1 como se describe anteriormente. De forma alternativa, Yap1 se puede inactivar en dichas células mediante procedimientos tales como procedimientos de edición génica o procedimientos de silenciamiento.

En algunas realizaciones de la presente descripción, la inactivación de Yap1 da como resultado una reducción de la expresión de Yap1 en al menos un 10 %, tal como al menos un 20 %, tal como al menos un 30 %, tal como al menos un 40 %, tal como al menos un 50 %, tal como al menos un 60 %, tal como al menos un 70 %, tal como al menos un 80 %, tal como al menos un 90 %, tal como al menos un 95 %, tal como un 100 %. En algunas realizaciones de la presente descripción, la inactivación de Yap1 da como resultado una reducción de la función de Yap1 en al menos un 10 %, tal como al menos un 20 %, tal como al menos un 30 %, tal como al menos un 40 %, tal como al menos un 50 %, tal como al menos un 60 %, tal como al menos un 70 %, tal como al menos un 80 %, tal como al menos un 90 %, tal como al menos un 95 %, tal como un 100 %.

Las células que se van a diferenciar se pueden derivar de un organismo tal como un mamífero. En algunas realizaciones de la presente descripción, el mamífero es un ratón o una rata. En otras realizaciones de la presente descripción, el mamífero es un ser humano. En algunas realizaciones de la presente descripción, las células se aíslan del organismo como se describe anteriormente y Yap1 se inactiva, por ejemplo, mutando o delecionando el gen Yap1 de forma condicional en el páncreas en desarrollo usando recombinación mediada por Cre - flox o introduciendo medios de silenciamiento tal como siRNA en las células.

Población celular enriquecida con células p productoras de insulina

En un aspecto, la presente descripción se refiere a una población celular enriquecida con células p productoras de insulina que se pueden obtener mediante los procedimientos descritos en la presente memoria.

En consecuencia, en la presente memoria se describe una población celular que comprende al menos un 5 % de células p productoras de insulina, tal como al menos un 10 % de células p productoras de insulina, tal como al menos un 15 % de células p productoras de insulina, tal como al menos un 20 % de células p productoras de insulina, tal como al menos un 25 % de células p productoras de insulina, tal como al menos un 30 % de células p productoras de insulina, tal como al menos un 35 % de células p productoras de insulina, tal como al menos un 40 % de células p productoras de insulina, tal como al menos un 45 % de células p productoras de insulina, tal como al menos un 50 % de células p productoras de insulina, tal como al menos un 55 % de células p productoras de insulina, tal como al menos un 60 % de células p productoras de insulina, tal como al menos un 65 % de células p productoras de insulina, tal como al menos un 70 % de células p productoras de insulina, tal como al menos un 75 % de células p productoras de insulina, o más.

Tratamiento de un trastorno metabólico

En la presente memoria también se describe una población celular enriquecida con células p productoras de insulina que se pueden obtener mediante uno cualquiera de los procedimientos descritos en la presente memoria para el tratamiento de un trastorno metabólico en un individuo que lo necesita.

Las poblaciones celulares enriquecidas que se pueden obtener mediante los procedimientos descritos en la presente memoria se pueden usar para el tratamiento de trastornos metabólicos. Estas poblaciones celulares enriquecidas se pueden almacenarse antes de su uso o se pueden usar inmediatamente. Una vez que se obtiene una población celular con las características deseadas, las células se pueden trasplantar en un individuo que lo necesite. Como ejemplo, dicho tratamiento basado en células es útil para trasplantar células p productoras de insulina en individuos que padecen diabetes, mediante lo cual se puede restablecer la producción de insulina in vivo.Si la población celular de partida se deriva del propio paciente, se pueden reducir los riesgos de reacciones inmunitarias adversas, tales como el rechazo de las células trasplantadas.

El término "trastorno metabólico", tal y como se usa en la presente memoria, debe considerarse que se refiere a enfermedades endocrinas, nutricionales y metabólicas. Preferiblemente, el trastorno está relacionado con un trastorno pancreático. Los ejemplos de trastornos metabólicos son: diabetes mellitus, incluyendo la diabetes tipo 1 y tipo 2.

La diabetes mellitus, comúnmente conocida como diabetes, es un grupo de enfermedades metabólicas en las que hay niveles altos de azúcar en sangre durante un período prolongado. Existen varios tipos de diabetes, incluyendo la diabetes tipo 1, la diabetes tipo 2 y la diabetes gestacional. La diabetes tipo 1 se caracteriza por la pérdida de las células p productoras de insulina de los islotes de Langerhans en el páncreas, lo que da lugar a una deficiencia de insulina. La diabetes tipo 2 se caracteriza por resistencia a la insulina, que puede combinarse con una secreción de insulina relativamente reducida. Se cree que la respuesta defectuosa de los tejidos corporales a la insulina implica al receptor de la insulina. La diabetes gestacional, que se asemeja a la diabetes tipo 2, ocurre en aproximadamente el 2-10 % de todos los embarazos. El tipo de diabetes también se puede clasificar como diabetes mellitus dependiente de insulina, diabetes mellitus no dependiente de insulina, diabetes mellitus relacionada con la malnutrición o diabetes mellitus no especificada.

Los procedimientos descritos en la presente memoria se pueden usar para obtener una población celular enriquecida con células p productoras de insulina. En consecuencia, en algunas realizaciones de la presente descripción se proporciona una población celular para el tratamiento de un trastorno metabólico en un individuo que lo necesite. En algunas realizaciones de la presente descripción, el trastorno metabólico se selecciona del grupo que consiste en diabetes mellitus o un trastorno de secreción interna pancreática. En algunas realizaciones de la presente descripción, el trastorno metabólico es diabetes mellitus, tal como diabetes mellitus dependiente de insulina, diabetes mellitus no dependiente de insulina, diabetes mellitus relacionada con la malnutrición o diabetes mellitus no especificada.

En un aspecto de la presente descripción, se proporciona un procedimiento de tratamiento de un trastorno metabólico en un individuo que lo necesita, donde el procedimiento comprende una etapa de proporcionar una población celular enriquecida con células p productoras de insulina que se pueden obtener mediante los procedimientos descritos en la presente memoria.

En algunas realizaciones de la presente descripción, los presentes procedimientos comprenden una etapa de trasplantar al menos parte de dicha población celular enriquecida en el individuo que padece un trastorno metabólico.

En algunas realizaciones de la presente descripción, la población celular enriquecida tiene una mayor expresión de al menos uno de insulina, Insm-1, Isl-1, MafA, MafB o péptido C en comparación con poblaciones celulares obtenidas de células en las que Yap1 no ha sido inactivado, como se describe anteriormente. En algunas realizaciones de la presente descripción, la población celular enriquecida tiene un área de insulina mayor en comparación con las poblaciones celulares obtenidas de células en las que Yap1 no se ha inactivado, como se describe anteriormente.

En algunas realizaciones de la presente descripción, la población celular comprende al menos un 5 % de células p productoras de insulina, tal como al menos un 10 % de células p productoras de insulina, tal como al menos un 15 % de células p productoras de insulina, tal como al menos un 20 % de células p productoras de insulina, tal como al menos un 25 % de células p productoras de insulina, tal como al menos un 30 % de células p productoras de insulina, tal como al menos un 35 % de células p productoras de insulina, tal como al menos un 40 % de células p productoras de insulina, tal como al menos un 45 % de células p productoras de insulina, tal como al menos un 50 % de células p productoras de insulina, tal como al menos un 55 % de células p productoras de insulina, tal como al menos un 60 % de células p productoras de insulina, tal como al menos un 65 % de células p productoras de insulina, tal como al menos un 70 % de células p productoras de insulina, tal como al menos un 75 % de células p productoras de insulina, o más.

Inhibidor de Yap1 para su uso como medicamento

En un aspecto, la presente descripción se refiere al uso de un inhibidor de Yap1 para el tratamiento de un trastorno metabólico en un individuo que lo necesita.

El trastorno metabólico puede ser cualquier trastorno metabólico como se describe anteriormente. Preferiblemente, el trastorno está relacionado con un trastorno pancreático. Los ejemplos de trastornos metabólicos son: diabetes mellitus, incluyendo la diabetes tipo 1 y tipo 2.

En algunas realizaciones de la presente descripción, el inhibidor de Yap1 es verteporfina. En consecuencia, se describe el uso de la verteporfina para el tratamiento de un trastorno metabólico en un individuo que lo necesite.

En algunas realizaciones de la presente descripción, el uso de la verteporfina para el tratamiento de un trastorno metabólico implica los procedimientos descritos en la presente memoria anteriormente, es decir, la diferenciación de células en células p productoras de insulina incubando dichas células en presencia de un inhibidor de Yap1.

Identificación del inhibidor de Yap1

i) proporcionar un compuesto;

ii) incubar dicho compuesto en presencia de Yap1;

Ejemplos

Ejemplo 1: introducción

La diabetes es una enfermedad metabólica crónica que afecta a alrededor de 387 millones de personas en todo el mundo, lo que representa 1 de cada 12 personas, según el atlas mundial de diabetes. Los síntomas de la enfermedad incluyen pacientes que tienen niveles altos de glucosa en sangre, ya sea debido a una producción inadecuada de insulina o células corporales que responden inadecuadamente a la insulina o ambos. El tratamiento podría realizarse mediante la regeneración o el trasplante de las células productoras de insulina. El trasplante de islotes humanos ha sido la opción terapéutica prometedora para los pacientes con diabetes tipo 1 en comparación con el tratamiento con insulina; sin embargo, está limitado por su escasez de donaciones de órganos, los desafíos con el aislamiento de los islotes del páncreas y el uso de por vida de fármacos inmunosupresores.

Sin embargo, la generación de progenitores pancreáticos o células beta productoras de insulina a partir de células madre embrionarias humanas puede ser una fuente alternativa y prometedora para el trasplante que podría extender este tratamiento a millones de nuevos pacientes. Estas células beta derivadas in vitro también se pueden usar en cribados de fármacos in vitro.

Aunque hay varios protocolos informados para la derivación del endodermo pancreático a partir de la diferenciación de células madre pluripotentes humanas, la generación de insulina funcional que produzca células beta maduras sigue siendo una cuestión sin resolver. En particular, los factores que controlan la última etapa de diferenciación, en la que las células progenitoras pancreáticas se convierten en células funcionales que expresan insulina, están caracterizados todavía de forma incompleta.

Se ha descubierto que al anular Yap1 en ratones en las células progenitoras pancreáticas que expresan el gen Pdx1, los progenitores se diferencian hacia el destino endocrino, específicamente a las células beta productoras de insulina. Los ratones knockout son hipoglucémicos (menos niveles de glucosa en sangre), tienen un área de insulina alta en comparación con los controles y expresan más transcrito de insulina. Este fenotipo único da lugar a la generación in vivo de más células beta maduras y funcionales productoras de insulina.

Además, con esta fuerte evidencia genética, se aplica esta estrategia en células ES humanas mediante la inhibición farmacológica de la actividad de YAP1 (usando el inhibidor de YAP-TEAD Verteporfina) en progenitores pancreáticos derivados de células ES humanas que expresan PDX1. Después de 5 días de tratamiento con inhibidores, los progenitores pancreáticos se convirtieron en insulina y células beta que expresan MAFA; esto último indica que las células alcanzaron un estado maduro que normalmente se asocia con la liberación de insulina sensible a la glucosa.

Ejemplo 2: las eliminaciones condicionales para Yap1 en el páncreas de ratón da lugar a la hipoplasia e hipoglucemia

Las inmunotinciones y los datos de transferencia Western (no mostrados) para Yap1 indican que Yap1 se expresa altamente tanto a niveles de ARNm como de proteína en células progenitoras positivas para Pdx1 durante el estadio temprano del desarrollo del páncreas de ratón, lo que indica la importancia de esta molécula durante la especificación del páncreas, el mantenimiento y la expansión de los progenitores.

Para abordar la importancia de Yap1 en el desarrollo del páncreas, se utiliza un enfoque de pérdida de función para eliminar condicionalmente Yap1 en células que expresan Pdx1 usando ratones Pdx1 Cre que expresan Cre recombinasa a partir de un estadio embrionario temprano (E9.5) en todo el epitelio de la yema pancreática. El cruce de ratones Yap1fl/f con ratones Pdx1-Cre da lugar a una deficiencia de Yap1 específica del páncreas.

Como se esperaba, los Pdx1-Cre; Yap1fl/fl mostraron un fenotipo severo, que es hipoplasia pancreática en el día 4 después del nacimiento (Fig. 1). El tamaño del páncreas se redujo al menos un tercio en los knockouts de Yap1 en comparación con la camada de control (Fig. 1B). Las crías Knockout mostraron un peso corporal reducido (Fig. 1A y Fig. 1D), hipoglucemia severa (Fig. 1C) y no se habían recuperado después del día P6.

Este es un fenotipo único e interesante en el que la pérdida de un factor de transcripción Yap1 da lugar a una naturaleza hipoglucémica.

Ejemplo 3: eliminación de Yap1 en ratones

Para comprender mejor el fenotipo de eliminación de Yap1 en ratones, se han realizado inmunotinciones del páncreas P4 y se ha buscado la expresión de genes pancreáticos. Como se muestra en la figura 2, los ratones KO Yap1 (Yap KO) mostraron un área aumentada de expresión de insulina en comparación con los controles a pesar de su tamaño más pequeño (Fig. 2A y Fig. 2B). La cuantificación de la proporción de células que expresan insulina con respecto al área total de DAPI mostró que el área de insulina en los ratones Yap KO era significativamente mayor que en los ratones de control. El área celular de insulina se calculó a partir de secciones en serie que abarcan todo el tejido del páncreas del ratón que se tiñeron para insulina y DAPI (núcleos). Los valores medios de las áreas de expresión de la sección transversal de las imágenes confocales adquiridas se midieron usando el software IMARIS para obtener cuantificaciones del área celular de insulina. Como se esperaba, los niveles de ARNm de Yap1 estaban significativamente regulados por disminución en el páncreas de knockout en comparación con los controles (Fig. 2E). El análisis de qRT PCR reveló una regulación por incremento significativa en el transcrito de ARNm de insulina en Yap KO (Fig. 2C) pero los niveles de ARNm de glucagón no se alteraron significativamente (Fig. 2D).

En conjunto, estos datos indican que tras la pérdida de Yap1 en los progenitores pancreáticos que expresan Pdx1, las células tienden a diferenciarse hacia el linaje endocrino y especialmente hacia el destino de las células beta productoras de insulina.

Ejemplo 4: la pérdida de Yap1 en Sox9 que expresa progenitores pancreáticos da lugar a una expresión elevada de insulina

Se usó un Cre diferente para eliminar Yap1 en los progenitores pancreáticos. El cruce de ratones transgénicos Sox9 Cre ER (sistema de expresión de Cre inducido por tamoxiferina) con ratones floxados con Yap1 da como resultado la activación específica de Cre en los progenitores pancreáticos que expresan Sox9 tras el tratamiento con tamoxiferina, eliminando de este modo Yap1 en esos progenitores (figura 3B). Esto dio lugar a una expresión mejorada de insulina analizada mediante tinción inmunitaria para insulina como se muestra en la figura 3A, confirmada por RT-qPCR (figura 3C). La expresión de insulina y glucagón también resultó verse potenciada como se muestra por Rt qPCR (figuras 3D y 7E).

Este ejemplo, junto con el ejemplo 3, muestra que la eliminación genética de Yap1 en múltiples líneas de ratón que expresan Cre, Pdx1 o Sox9, da lugar a una diferenciación mejorada de las células beta.

Ejemplo de referencia 5: inhibición de YAP1 en células hES

Los datos genéticos del ratón revelaron un papel inesperado e interesante de Yap1 durante el desarrollo del páncreas, lo que indica la importancia de Yap1 durante la diferenciación de los progenitores pancreáticos hacia células beta que expresan insulina. Los interesantes hallazgos en ratones llevaron a proponer y comprobar la relevancia de YAP1 en progenitores pancreáticos derivados de células madre embrionarias humanas. El tratamiento de los progenitores pancreáticos derivados de hES de PDX1 con un inhibidor químico de Yap-TEAD, verteporfina, puede simular la pérdida de función de YAP1 en células cultivadas. Con este fin, se utiliza un clon PDX1eGFP de hES en el que un alelo de PDX1 fue reemplazado por eGFP y el segundo alelo era funcional. Estas células son heterocigóticas PDX1 y expresan eGFP cuando comienza la expresión de PDX1.

Se cultivaron las células PDX1 GFP hES usando un protocolo modificado de Rezania y col. 2010 (véase a continuación para el protocolo exacto, ilustrado en la Fig. 5A) que genera de forma eficiente progenitores pancreáticos que expresan principalmente PDX1, NKX6.1. En resumen, se cultivaron células Hues4 hES PDX1 GFP en un sistema DEF sin alimentador (""DEF-CS™", células madre Cellectis, Cellartis AB") hasta la confluencia total. Cuando se alcanzó la confluencia total, las células se sometieron a diferenciación como sigue durante 5 estadios diferentes para obtener células beta maduras productoras de insulina.

Estadio 1: Endodermo definitivo:

Las células se cultivaron en medio RPMI con CHIR99021 3 pM (un activador Wnt) durante 1 día. Durante el segundo día, las células se trataron con 100 ng/ml de Activina A. Durante los días 3 y 4, las células se trataron con 100 ng/ml de Activina A junto con B27 al 2% (v/v).

Estadio 2: Tubo intestinal primitivo:

Los cultivos se expusieron a medios F12 que contenían B27 al 2 %, bicarbonato de sodio 2 gm/L junto con vitamina C 0,25 mM y FGF750 ng/ml durante dos días.

Estadio 3: Intestino anterior posterior:

Se continuaron los cultivos durante cuatro días en medio DMEM con alto contenido de glucosa junto con B27 al 2 %, bicarbonato de sodio 2 g/L, vitamina C 0,25 mM, FGF72 ng/ml, Santl 0,25 jM , Noggin 100 ng/ml y ácido retinoico 2 |jM.

Estadio 4: Endodermo primitivo:

Las células del estadio 4 se cultivaron durante 5 días para obtener PDX1 y NKX6.1 que expresaban células progenitoras pancreáticas mediante cultivo en B27 al 2 %, bicarbonato de sodio 2 gm/L, vitamina C 0,25 mM, Noggin 100 ng/ml y TPB 500 nM (activador de PKC).

Estadio 5: células beta maduras:

Para obtener células beta maduras positivas para MAFA que expresan insulina, los cultivos se trataron con el inhibidor de YAP-TEAD Verteporfina a una concentración de 1 jg/m l en medio del estadio 4 y se cultivaron durante otros 4-9 días.

Después de cultivar las células durante los primeros 4 estadios anteriores (alrededor de 15 días), las células hES diferenciadas se enriquecieron para la expresión de PDX1 a medida que expresaban GFP. Estos cultivos progenitores pancreáticos enriquecidos se trataron con el inhibidor químico de YAP1-TEAD Verteporfina durante 4-5 días más y se verificó la expresión génica (estadio 5).

Como se esperaba de los estudios en ratones, la inhibición de la actividad de YAP1 en las células enriquecidas con PDX1, usando verteporfina después de 4 días, dio lugar a una diferenciación endocrina eficiente y mejorada especialmente hacia las células beta productoras de insulina a expensas del linaje acinar.

El análisis de qRT PCR de cultivos tratados con verteporfina de 4 días (Fig. 5B-5G) mostró una regulación por incremento de genes endocrinos tales como insulina, glucagón, ISL-1, MAFA y MAFB, mientras que genes exocrinos como CPA1 y PTF1a fueron regulados por disminución en comparación con los cultivos de control tratados con DMSO. Estos resultados indican que cuando YAP1 se inhibe en los progenitores pancreáticos, estos progenitores muestran una diferenciación mejorada hacia el destino de las células endocrinas.

Además, el análisis de qRT PCR de cultivos tratados con verteporfina de 5 días (Fig. 6) mostró que estas células experimentan una mejor diferenciación endocrina, ya que mostraban de forma constante una regulación por incremento de los marcadores de maduración de células beta como MAFA, ISL1 e INSM1 en comparación con cultivos del día 4. El tratamiento con verteporfina dirigió a los progenitores pancreáticos a la diferenciación del linaje endocrino a expensas del linaje acinar. Los niveles de ARNm de insulina fueron regulados por incremento 5 veces en comparación con los cultivos de control con DMSO.

Las células tratadas con DMSO o verteporfina durante 5 días e inmunoteñidas con péptido C, glucagón y anticuerpos GFP (figura 7) mostraron que la expresión de la proteína de insulina (péptido c) y glucagón mejoró en las células tratadas con verteporfina. Estas células que expresan insulina fueron positivas para MAFA, lo que indica que estas células son maduras y funcionales.

En conjunto, estos resultados apoyan los hallazgos en ratones, donde la pérdida/inhibición de Yap1 en células progenitoras pancreáticas Pdx1 dio lugar a una diferenciación endocrina mejorada, específicamente células beta maduras y que expresan insulina.

Ejemplo de 6: inhibición de YAP1 en células mES

Los explantes pancreáticos de ratón C57bl6 de tipo salvaje en estadios embrionarios E11.5 se cultivaron ex vivo durante las primeras 24 horas en un medio de cultivo normal suplementado con 1 ug/ml de verteporfina durante 72 horas y nuevamente en un medio de cultivo normal sin verteporfina durante otras 48 horas. horas. Los explantes se analizaron mediante RT-qPCR para determinar la expresión génica endocrina después de 6 días de cultivo. La inhibición de Yap1 usando verteporfina dio lugar a una regulación por incremento significativa de los progenitores endocrinos Neurogenin (Ngn3) (figura 4A), NeuroD (figura 4B), Insm1 (figura 4C) y expresión de Arx (figura 4D). La expresión de estos genes es característica del destino de las células de islote. Esto finalmente dio lugar a una diferenciación endocrina mejorada como se muestra por una mayor expresión de insulina (figura 4E) y glucagón (figura 4F).

Este ejemplo junto con el ejemplo 4 muestra que la inhibición química de Yap1 da lugar a una diferenciación mejorada de células beta en el páncreas de ratón.

Ejemplo de referencia 7: los progenitores pancreáticos derivados de células hES tratados con VP durante 5 días muestran una diferenciación endocrina y expresión de insulina mejoradas.

Se diferenciaron células ES humanas Pdx1 Gfp estables con el estadio progenitor pancreático y a continuación, se trataron con DMSO (control) o verteporfina (VP, 1 |jg/ml) durante 5 días adicionales. Los cultivos se tiñeron inmunológicamente con péptido c y anticuerpos Neurogenin3 y se obtuvieron imágenes mediante microscopía confocal (figura 8). Los cultivos tratados con verteporfina presentaron una diferenciación de células beta y endocrina mejorada y expresaron niveles más altos de Ngn3 y péptido c en comparación con las células tratadas con DMSO.

Ejemplo de referencia 8: la pérdida transitoria de Yap1 en células hES Pdx1 GFP da lugar a una regulación por incremento de la expresión del gen progenitor endocrino.

Las células ES humanas Pdx1 Gfp estables se diferenciaron con el estadio progenitor pancreático y a continuación, se transfectaron transitoriamente con control o siRNA de Yap1. Los cultivos se analizaron usando RT-qPCR después de 3 días de transfección de siRNA. Como se muestra en la figura 9, las células transfectadas con siRNA de Yap1 mostraron una reducción del 50 % en los niveles de ARNm de Yap1 (figura 9A) y esto da como resultado una mayor expresión de los progenitores endocrinos Ngn3 (figura 9B) e Insm1 (figura 9C).

Este ejemplo confirma que la inactivación de Yap1 da lugar a una diferenciación mejorada de las células beta.

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento in vitro para la diferenciación de células en células p productoras de insulina, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:

i) inactivar Yap1 en una población de células progenitoras pancreáticas que comprende al menos una célula capaz de diferenciarse;

obteniendo de este modo una población celular enriquecida con células p productoras de insulina, en comparación con las células en las que Yap1 no se inactivó.

2. El procedimiento según la reivindicación 1, donde las células p productoras de insulina son sensibles a la insulina.

3. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la población de células progenitoras pancreáticas se inactiva con un inhibidor de Yap1 y la población celular enriquecida con células p productoras de insulina es capaz de producir al menos 1,5 veces más insulina que las células obtenidas cuando la población celular de la etapa i) se incuba en ausencia del inhibidor de Yap1, opcionalmente al menos 1,6 veces más insulina, tal como al menos 1,7 veces más insulina, tal como al menos 1,8 veces más insulina, tal como al menos 1,8 veces más insulina, tal como al menos 1,9 veces más insulina, tal como al menos 2,0 veces más insulina, tal como al menos 2,5 veces más insulina, tal como al menos 3,0 veces más insulina, tal como al menos 3,5 veces más insulina, tal como al menos 4,0 veces más insulina, tal como al menos 4,5 veces más insulina, tal como al menos 5,0 veces más insulina, tal como al menos 5,5 veces más insulina, tal como al menos 6,0 veces más insulina, tal como al menos 6,5 veces más insulina, tal como al menos 7,0 veces más insulina, tal como al menos 7,5 veces más insulina, tal como al menos 8,0 veces más insulina, tal como al menos 8,5 veces más insulina, tal como al menos 9,0 veces más insulina, tal como al menos 9,5 veces más insulina, tal como al menos 10 veces más insulina, tal como al menos 12,5 veces más insulina, tal como al menos 15 veces más insulina, tal como al menos 17,5 veces más insulina, tal como al menos 20 veces más insulina, tal como al menos 25 veces más insulina, en comparación con una población celular incubada en ausencia del inhibidor de Yap1.

4. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la población de células progenitoras pancreáticas es una población celular enriquecida con células progenitoras pancreáticas bona fide obtenidas mediante un procedimiento que comprende exponer una población celular que comprende al menos una célula progenitora pancreática bona fide, donde la célula progenitora pancreática bona fide expresa PDX1 y NKX6-1 para:

y/o

5. El procedimiento según la reivindicación 4, donde el tercer ligando es un anticuerpo o fragmento del mismo dirigido frente a GP2.

6. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 5, donde el primer ligando es un anticuerpo o fragmento del mismo dirigido frente a CD49d y el tercer ligando es un anticuerpo dirigido frente a GP2.

7. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, donde el primer ligando es un anticuerpo o fragmento del mismo dirigido frente a CD49d, el segundo ligando es un anticuerpo o fragmento del mismo dirigido frente a FLOR1 y el tercer ligando es un anticuerpo o fragmento del mismo dirigido frente a GP2.

8. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, donde las células progenitoras pancreáticas bona fide se derivan de células capaces de diferenciarse tal como células madre pluripotentes humanas, tal como células iPS humanas (hIPSC), células ES humanas (hESC) y células madre humanas naíf (NhSC).

9. Un procedimiento in vitro para aumentar la diferenciación endocrina, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:

ii) diferenciar las células de la etapa i) hacia el destino endocrino;

obteniendo de este modo una población celular enriquecida con células endocrinas, en comparación con las células en las que Yap1 no se inactivó.

10. Un inhibidor de Yap1 para su uso en el tratamiento de un trastorno metabólico en un individuo que lo necesite, donde el trastorno metabólico preferiblemente es diabetes mellitus, tal como diabetes mellitus dependiente de insulina, tal como diabetes mellitus no dependiente de insulina, tal como diabetes mellitus relacionada con la malnutrición.

11. Un inhibidor de Yap1 para su uso según la reivindicación 10, donde el inhibidor de Yap1 es verteporfina.