ES2856937T3 - Medios de cultivo celular - Google Patents

Abstract

Medio de cultivo celular de polvo seco que comprende al menos un componente incrustado en polímero mediante lo cual el componente se dispersa dentro del polímero mediante lo cual el polímero es soluble en agua y se selecciona de un copolímero de bloque de polietilenglicol (PEG)/polipropilenglicol (PPG), una polivinilpirrolidona o un copolímero de injerto de polivinilcaprolactama - poli(acetato de vinilo) - polietilenglicol y mediante lo cual los componentes incrustados en polímeros se han preparado mediante extrusión por fusión en caliente.

Description

DESCRIPCIÓN

Medios de cultivo celular

La presente invención se refiere a medios de cultivo celular secos que comprenden componentes incrustados en polímeros. Algunos componentes muestran mala estabilidad en medios de cultivo celular de polvo seco, mientras que otros son higroscópicos. Algunos componentes tardan mucho tiempo en disolverse completamente. Tales componentes pueden incrustarse en polímeros para aumentar la estabilidad y reducir la aglutinación.

Los medios de cultivo celular en disolución acuosa pueden proporcionar un entorno que soporta y mantiene el crecimiento de células y/o mantiene una condición celular fisiológica adventicia a la producción objetivo de ciertos productos.

Los medios de cultivo celular comprenden una mezcla compleja de componentes, algunas veces más de cien componentes diferentes, dependiendo del tipo de organismo cuyo crecimiento y/o estado fisiológico objetivo debe soportarse.

Los medios de cultivo celular requeridos para la propagación de células de mamífero, insecto o planta normalmente son mucho más complejos que los medios para soportar el crecimiento de bacterias, levaduras u hongos.

Los primeros medios de cultivo celular que se desarrollaron eran medios complejos que consistían en diversas mezclas de componentes que estaban muy mal definidos químicamente, mal caracterizados y eran difíciles de fabricar con una calidad constante, tales como plasma, suero, extractos de embriones y/u otros extractos biológicos o peptonas. Por tanto, se realizó un avance importante con el desarrollo de los medios químicamente definidos. Los medios químicamente definidos a menudo comprenden, pero no se limitan exclusivamente a, aminoácidos, vitaminas, azúcares, sales de metales, antioxidantes, quelantes, factores de crecimiento, tampones, hormonas, y muchas más sustancias conocidas por los expertos en la técnica.

Algunos medios de cultivo celular se ofrecen como líquidos acuosos estériles. La desventaja de los medios de cultivo celular líquidos es su semivida reducida y sus dificultades para transporte y almacenamiento. Como consecuencia, muchos medios de cultivo celular se ofrecen actualmente como mezclas en polvo seco finamente molido. Estas se fabrican con el fin de disolverse en agua y/o disoluciones acuosas y en el estado disuelto están diseñadas, a menudo con otros complementos, para suministrar a las células una base nutritiva sustancial para el crecimiento y/o la producción de productos biofarmacéuticos a partir de dichas células y/o usarse como alimentación para suministrar a las células cuando nutrientes específicos se vuelven limitantes.

Un factor limitante para la preparación y el uso de medios de cultivo celular a partir de polvo seco es la mala estabilidad de algunos componentes, que tienden a degradarse y/u oxidarse durante el almacenamiento del medio de polvo seco. Algunos componentes son higroscópicos, lo que a menudo da como resultado la aglutinación del medio conduciendo a problemas de estabilidad y/u otros problemas de calidad que restringen su(s) aplicación/aplicaciones industrial(es). Además, el agua atraída por los compuestos higroscópicos podría conducir a un crecimiento microbiano aumentado así como a degradación de componentes vecinos.

En consecuencia, sería favorable encontrar un modo de mejorar la estabilidad de componentes de medios sensibles y reducir la influencia negativa de componentes higroscópicos.

El documento WO 2013/096858 da a conocer la generación de tecnologías de microsuspensión y/o encapsulación para aumentar la estabilidad de componentes de medios de cultivo celular lábiles.

El documento US 4.416.898 da a conocer la generación de gránulos que comprenden metionina y otros componentes como pluronic F 68 para generar formas de dosificación oral de metionina.

Se ha encontrado que pueden estabilizarse componentes de medios sensibles y/o higroscópicos incrustándolos en una matriz de polímero. La atracción de agua por componentes higroscópicos se reduce y los componentes sensibles a la oxidación o degradación muestran una estabilidad aumentada al incrustarlos en otros componentes, lo que aumenta la estabilidad de dichos componentes ya se induzca la inestabilidad y/o disminución de la calidad por la oxidación y/o higroscopicidad y/o aglomeración debida a fuerzas de van de waals y/o electrostáticas, reduciendo así el efecto que tales componentes oxidados y/o húmedos/mojados/pegajosos pueden tener sobre componentes vecinos.

La presente invención se refiere por tanto a un medio de cultivo celular de polvo seco que comprende al menos un componente incrustado en polímero mediante lo cual el polímero es soluble en agua y se selecciona de los polímeros enumerados en la reivindicación 1 y mediante lo cual los componentes incrustados en polímeros se han preparado mediante extrusión por fusión en caliente.

En una realización preferida, el polímero es un poloxámero.

En otra realización preferida, el componente es L-glutamina, hidrogenocarbonato de sodio, cloruro de calcio x 2 H2O, cloruro de colina, nitrato férrico x 9 H2O, sulfato ferroso x 7 H2O, fosfato de sodio o fosfato de monosodio (NaH2PO4) monohidratado.

En una realización, el medio de cultivo celular comprende dos o más componentes incrustados en polímeros.

Las figuras 1 y 2 muestran las pruebas de rendimiento en CHO S. Pueden encontrarse detalles adicionales en el ejemplo 2.

Un medio de cultivo celular según la presente invención es cualquier mezcla de componentes que mantiene y/o soporta el crecimiento de células in vitro y/o soporta un estado fisiológico particular. Podría ser un medio complejo o un medio químicamente definido. El medio de cultivo celular puede comprender todos los componentes necesarios para mantener y/o soportar el crecimiento de células in vitro o solo algunos componentes, de modo que los componentes adicionales se añaden por separado. Ejemplos de medios de cultivo celular según la presente invención son medios completos que comprenden todos los componentes necesarios para mantener y/o soportar el crecimiento de células in vitro así como complementos o alimentos de medios. En una realización preferida, el medio de cultivo celular es un medio completo o un medio que carece de unos cuantos componentes.

Normalmente, los medios de cultivo celular según la invención se usan para mantener y/o soportar el crecimiento de células y/o soportan un estado fisiológico particular en un biorreactor.

Un medio de cultivo celular de mamífero es una mezcla de componentes que mantienen y/o soportan el crecimiento in vitro de células de mamífero. Ejemplos de células de mamífero son células humanas o de animales, preferiblemente células CHO, células COS, células I VERO, células BHK, células AK-1, células SP2/0, células L5.1, células de hibridoma o células humanas.

Los medios de cultivo celular químicamente definidos son medios de cultivo celular que no comprenden ninguna sustancia indefinida químicamente. Esto significa que se conoce la composición química de todos los compuestos químicos usados en los medios. Los medios químicamente definidos no comprenden ningún tejido de levadura, animal o planta; no comprenden células alimentadoras, suero, extractos o digestos u otros componentes que pueden contribuir con proteínas y/o péptidos y/o hidrolizados químicamente mal definidos al medio. Los componentes químicos químicamente indefinidos o mal definidos son aquellos cuya estructura y composición química no se conocen bien, que están presentes en una composición mal definida y variable o que solo podrían definirse con un enorme esfuerzo experimental (comparable con la evaluación de la estructura y composición química de una proteína como albúmina o caseína).

Un medio de cultivo celular en polvo o un medio en polvo seco es un medio de cultivo celular que normalmente resulta de un proceso de molienda o un proceso de liofilización. Esto significa que el medio de cultivo celular en polvo es un medio granular, particulado, no un medio líquido. El término “polvo seco” puede usarse indistintamente con el término “polvo”; sin embargo, “polvo seco” tal como se usa en el presente documento, se refiere simplemente al aspecto macroscópico del material granulado y no se pretende que signifique que el material esté completamente libre de disolvente complejado o aglomerado, a menos que se indique otra cosa.

Las células que van a cultivarse con los medios según la presente invención pueden ser células procariotas como células bacterianas o células eucariotas como células de levaduras, hongos, vegetales o animales. Las células pueden ser células normales, células inmortalizadas, células enfermas, células transformadas, células mutantes, células somáticas, células germinales, células madre, células precursoras o células embrionarias, pudiendo ser cualquiera de las cuales líneas celulares establecidas o transformadas u obtenidas de fuentes naturales.

El tamaño de una partícula significa el diámetro medio de la partícula. El diámetro de partícula se determina mediante dispersión de luz láser en aceite de silicona.

Se genera una atmósfera inerte mediante el llenado del recipiente o aparato respectivo con un gas inerte. Los gases inertes adecuados son gases nobles como argón o preferiblemente nitrógeno. Estos gases inertes son mínimamente reactivos e impiden que se produzcan reacciones químicas indeseables. En el procedimiento según la presente invención, generar una atmósfera inerte significa que la concentración de oxígeno se reduce por debajo del 10% (v/v) absoluto, por ejemplo mediante la introducción de nitrógeno líquido o gas nitrógeno.

Un experto en la técnica conoce diferentes tipos de molinos.

Un molino de púas, también denominado molino de impacto centrífugo, pulveriza sólidos mediante lo cual las púas que sobresalen en discos rotatorios a alta velocidad proporcionan la energía de rotura. Los molinos de púas se venden por ejemplo en Munson Machinery (EE. UU.), Premium Pulman (India) o Sturtevant (EE. UU.).

Un molino de chorro usa gas comprimido para acelerar las partículas, haciendo que impacten unas contra otras en la cámara de proceso. Los molinos de chorro los venden por ejemplo Sturtevant (EE. UU.) o PMT (Austria).

Un molino tipo Fitzmill comercializado por Fitzpatrick (EE. UU.), usa un rotor con cuchillas para la molienda.

Un procedimiento que se ejecuta de manera continua es un procedimiento que no se ejecuta de manera discontinua. Si un procedimiento de molienda se ejecuta de manera continua significa que los componentes de los medios se alimentan de manera permanente y constante en el molino a lo largo de un tiempo determinado.

Los medios de cultivo celular según la presente invención normalmente comprenden al menos uno o más componentes de sacárido, uno o más aminoácidos, una o más vitaminas o precursores de vitaminas, una o más sales, uno o más componentes tampón, uno o más cofactores y uno o más componentes de ácido nucleico.

Los medios pueden comprender también piruvato de sodio, insulina, proteínas vegetales, digestos o extractos, ácidos grasos y/o derivados de ácidos grasos y/o componentes de productos pluronic (copolímeros en bloque basados en óxido de etileno y óxido de propileno) en particular Poloxamer 188 algunas veces denominado Pluronic F 68 o Kolliphor P 188 o Lutrol F 68 y/o componentes activos de superficie como surfactantes no iónicos químicamente preparados. Un ejemplo de un surfactante no iónico adecuado son surfactantes de copolímero de bloque difuncional que terminan en grupos hidroxilo primarios también denominados poloxámeros, por ejemplo disponibles con el nombre comercial Pluronic® de BASF, Alemania.

Los componentes de sacárido son todos mono o disacáridos, como glucosa, galactosa, ribosa o fructosa (ejemplos de monosacáridos) o sacarosa, lactosa o maltosa (ejemplos de disacáridos). Los componentes de sacárido pueden ser también oligo o polisacáridos

Ejemplos de aminoácidos según la invención son tirosina, los aminoácidos proteinogénicos, especialmente los aminoácidos esenciales, leucina, isoleucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptófano y valina, así como los aminoácidos no proteinogénicos como D-aminoácidos.

Tirosina significa L- o D-tirosina, preferiblemente L-tirosina.

Cisteína significa L- o D-cisteína, preferiblemente L-cisteína.

Ejemplos de vitaminas son vitamina A (retinol, retinal, diversos retinoides y cuatro carotenoides), vitamina B1 (tiamina), vitamina B2 (riboflavina), vitamina B3 (niacina, niacinamida), vitamina B5 (ácido pantoténico), vitamina B6 (piridoxina, piridoxamina, piridoxal), vitamina B7 (biotina), vitamina B9 (ácido fólico, ácido folínico), vitamina B12 (cianocobalamina, hidroxicobalamina, metilcobalamina), vitamina C (ácido ascórbico), vitamina D (ergocalciferol, colecalciferol), vitamina E (tocoferoles, tocotrienoles) y vitamina K (filoquinona, menaquinonas). También se incluyen precursores y análogos de vitaminas.

Ejemplos de sales son componentes que comprenden iones inorgánicos tales como bicarbonato, calcio, cloruro, magnesio, fosfato, potasio y sodio u oligoelementos tales como Co, Cu, F, Fe, Mn, Mo, Ni, Se, Si, Ni, Bi, V y Zn. Ejemplos son sulfato de cobre (II) pentahidratado (CuSO45H2O), cloruro de sodio (NaCI), cloruro de calcio (CaCh-2H2O), cloruro de potasio (KCI), sulfato de hierro (II), fosfato de sodio monobásico anhidro (NaH2PO4), sulfato de magnesio anhidro (MgSO4), fosfato de sodio dibásico anhidro (Na2HPO4), cloruro de magnesio hexahidratado (M gCh6 H2O), sulfato de cinc heptahidratado.

Ejemplos de tampones son CO2/HCO3 (carbonato), fosfato, HEPES, PIPES, ACES, BES, TES, MOPS y TRIS.

Ejemplos de cofactores son derivados de tiamina, biotina, vitamina C, NAD/NADP, cobalamina, vitamina B12, flavina mononucleótido y derivados, glutatión, grupo hemo, fosfatos de nucleótidos y derivados.

Los componentes de ácido nucleico, según la presente invención, son las bases nitrogenadas, como citosina, guanina, adenina, timina o uracilo, los nucleósidos como citidina, uridina, adenosina, guanosina y timidina, y los nucleótidos como adenosina monofosfato o adenosina difosfato o adenosina trifosfato.

Congelar, según la presente invención, significa enfriar hasta una temperatura por debajo de 0°C.

La esencia de la presente invención es proporcionar medios de cultivo celular en polvo que son estables para su almacenamiento y pueden procesarse fácilmente sin aglutinación o degradación de componentes. Cuando los medios de polvo seco se disuelven en un disolvente adecuado mezclando el polvo y el disolvente, el polvo se disuelve y produce un medio de cultivo celular líquido tal como un medio completo, un complemento de medio, un subgrupo de medio o un alimentación con una concentración deseada y homogénea de componentes de los medios.

En principio, todos los componentes de los medios de cultivo celular pueden incrustarse en polímeros. Normalmente, componentes que son sensibles a la degradación u oxidación u otra modificación química, componentes cuya solubilidad debe mejorarse y/o componentes higroscópicos se incrustan en polímeros. Ejemplos de tales componentes de medios son L-glutamina, hidrogenocarbonato de sodio, cloruro de calcio x 2 H2O, cloruro de colina, nitrato férrico x 9 H2O, sulfato ferroso x 7 H2O, fosfato de sodio o fosfato de monosodio (NaH2PO4) monohidratado.

La tabla 1 muestra una lista de componentes de medio DMEM F12. Para todos los componentes, se muestra el efecto de la incrustación en el polímero.

En la tabla 1, "Solu" significa que si el componente se incrusta según la presente invención y se usa en la composición de los medios en su forma incrustada, la solubilidad de dicho componente se mejora en comparación con la forma no incrustada.

En la tabla 1, "Estab" significa que si el componente se incrusta según la presente invención y se usa en la composición de los medios en su forma incrustada, la estabilidad de dicho componente se mejora en comparación con la forma no incrustada.

En la tabla 1, "Oxid" significa que si el componente se incrusta según la presente invención y se usa en la composición de los medios en su forma incrustada, la estabilidad frente a la oxidación de dicho componente se mejora en comparación con la forma no incrustada.

En la tabla 1, "Higros" significa que si el componente se incrusta según la presente invención y se usa en la composición de los medios en su forma incrustada, la capacidad de dicha sustancia de atraer y contener moléculas de agua del entorno circundante se reduce en comparación con la forma no incrustada. En otras palabras, el componente incrustado es menos higroscópico.

En la tabla 1, "NA" significa "no aplicable". Eso significa para componentes para los que la tabla dice NA que la incrustación según la presente invención no conduce a ningún efecto obvio.

Incrustado en polímeros significa que los componentes están parcial o completamente recubiertos por un polímero o dispersados en una matriz de polímero. Los componentes podrían estar dispersados en la matriz de polímero como partículas o a un nivel molecular, formando así disoluciones sólidas.

Polímeros adecuados para incrustar componentes según la presente invención son ciertos polímeros solubles en agua. Ejemplos de polímeros son derivados de celulosa solubles tales como etilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, metilcelulosa, carboximetilcelulosa, hidroximetilcelulosa, hidroxietilcelulosa; poli(alcohol vinílico), poli(alcohol vinílico) parcialmente hidrolizado, acetato de celulosa, ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa, acetato-ftalato de celulosa, acetato-trimelitato de celulosa, polietilen-polipropilenglicol (por ejemplo poloxámero(TM)), carbómero, policarbófilo, quitosano; gomas naturales tales como goma guar, goma arábiga, goma tragacanto o goma xantana, y povidona; ceras tales como polietilenglicol; o polímeros de ácido metacrílico tales como Eudragit(R) RL y Eudragit(R) RS; o polivinilpirrolidonas, poliacrilamidas, polimetacrilamidas, polifosfazinas, polioxazolidinas, poli(ácidos hidroxialquilcarboxílicos), alginatos de carragenato, carbómero, alginato de amonio, alginato de sodio, o mezclas de los mismos.

En una realización preferida, el polímero es un copolímero de bloque de polietilenglicol (PEG)/polipropilenglicol (PPG), una polivinilpirrolidona o un copolímero de injerto de polivinilcaprolactama - poli(acetato de vinilo) - polietilenglicol.

Los copolímeros de bloque de polietilenglicol (PEG)/polipropilenglicol (PPG) se denominan también poloxámeros. Los poloxámeros, número c As 9003-11-6, que van a usarse preferiblemente como polímero según la presente invención, tienen la fórmula general I

siendo preferiblemente x y z independientemente de 2 a 130 y siendo preferiblemente de 15 a 67.

Están comercialmente disponibles (Pluronics® o Lutrole®, por ejemplo, una disolución, gel o sólido de Pluronic(R) tal como Pluronic(R) F-127). Alternativamente, el poloxámero puede prepararse a partir de materias primas según métodos conocidos en la técnica (véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses n.os 3.579.465 y 3.740.421).

Puede encontrarse información adicional sobre poloxámeros en Hagers Handbuch der Pharmazeutischen Praxis, volumen 9 "Stoffe P-Z", 1994, páginas 282 a 284.

Los polímeros de polivinilpirrolidona están disponibles comercialmente como Kollidon® de BASF, Alemania.

Los copolímeros de injerto de polivinilcaprolactama - poli(acetato de vinilo) - polietilenglicol están disponibles comercialmente como Soluplus® de BASF, Alemania.

Los componentes de los medios se dispersan en una matriz formada por el polímero.

Una dispersión de este tipo se prepara mediante extrusión por fusión en caliente.

La extrusión puede definirse simplemente como el proceso de formar un nuevo material (el producto extruido) forzándolo a través de un orificio o boquilla en condiciones controladas, tales como temperatura, mezclado, velocidad de alimentación y presión. En la extrusión por fusión en caliente, el polímero está en el estado fundido. Después de la extrusión, el producto extruido por fusión en caliente es un sólido que comprende el polímero y el componente del medio dispersado.

Si los componentes se incrustan en el polímero mediante extrusión por fusión en caliente, los polímeros deben tener un punto de fusión por debajo de 200°C. Preferiblemente, los polímeros tienen un punto de fusión por debajo de 150°C, lo más preferido por debajo de 75°C.

Se encontró que el enfoque de extrusión por fusión en caliente (HME) puede aplicarse adecuadamente cuando se usa un poloxámero como el Poloxamer 188 (Lutrol F68) como polímero.

El sólido obtenido después de la extrusión por fusión en caliente se muele entonces preferiblemente, por ejemplo en un molino de bolas, para generar partículas de tamaño homogéneo. Las partículas resultantes que comprenden el al menos un componente del medio incrustado en un polímero tienen normalmente un tamaño de partícula por debajo de 200 |jm. Se prefieren tamaños de partícula por debajo de 100 jm . Tamaños de partícula favorables están entre 15 jm y 100 jm .

Se entiende que el componente incrustado en polímero puede ser un único tipo de componente o una mezcla de dos o más componentes. Se entiende además que el polímero del componente incrustado en polímero podría ser un único tipo de polímero o una mezcla de dos o más polímeros. En una realización preferida, cada componente incrustado en polímero contiene solo un componente de medio y un polímero. El componente incrustado en polímero podría comprender adicionalmente estabilizadores o plastificantes pero, en una realización preferida, el componente incrustado en polímero contiene solo el componente del medio y el polímero.

Normalmente, los componentes incrustados en polímeros comprenden entre el 0,01 y el 99% en peso del componente del medio y entre el 99,99 y el 1% en peso del polímero. Preferiblemente, comprenden entre el 10 y el 90% en peso del componente del medio y entre el 90 y el 10% en peso del polímero.

Los medios de cultivo celular en polvo de la presente invención se producen preferiblemente mezclando todos los componentes además de los componentes incrustados en polímeros y moliéndolos. El mezclado de los componentes lo conoce un experto en la técnica de producción de medios de cultivo celular en polvo seco mediante molienda. Preferiblemente, todos los componentes se mezclan minuciosamente antes de la molienda de modo que todas las partes de la mezcla tienen casi la misma composición. Cuanto mayor es la uniformidad de la composición, mejor es la calidad del medio resultante con respecto al crecimiento celular homogéneo. Los componentes incrustados en polímeros se añaden preferiblemente a la mezcla después de la molienda, especialmente cuando los componentes incrustados en polímeros son componentes recubiertos. Si el componente está dispersado en una matriz de polímero, puede mezclarse también con los otros componentes antes de la molienda y someterse a molienda con ellos.

La molienda puede realizarse con cualquier tipo de molino adecuado para producir medios de cultivo celular en polvo. Los ejemplos típicos son molinos de bolas, molinos de púas, molinos de tipo Fitzmill o molinos de chorro. Se prefiere un molino de púas, un molino de tipo Fitzmill o un molino de chorro, siendo muy preferido un molino de púas.

Un experto en la técnica sabe cómo hacer funcionar tales molinos.

Un molino de equipo a gran escala con un diámetro de disco de aproximadamente 40 cm se hace funcionar por ejemplo normalmente a 1-6500 revoluciones por minuto en el caso de un molino de púas, prefiriéndose 1-3000 revoluciones por minuto.

La molienda puede realizarse en condiciones de molienda convencionales que dan como resultado polvos con tamaños de partícula de entre 10 y 300 jm , lo más preferiblemente entre 25 y 100 jm .

Preferiblemente, todos los componentes de la mezcla que se someten a molienda están secos. Esto significa que si comprenden agua, solo comprenden agua de cristalización, pero no más del 10%, preferiblemente no más del 5%, lo más preferido no más del 2% en peso de moléculas de agua no unidas o no coordinadas.

En una realización preferida, la molienda se realiza en una atmósfera inerte. El gas protector inerte preferido es nitrógeno.

En otra realización preferida, todos los componentes de la mezcla están congelados antes de la molienda. La congelación de los componentes antes de la molienda puede realizarse mediante cualquier medio que garantice un enfriamiento de los componentes hasta una temperatura por debajo de 0°C y lo más preferiblemente por debajo de -20°C. En una realización preferida, la congelación se realiza con nitrógeno líquido Esto significa que los componentes se tratan con nitrógeno líquido, por ejemplo vertiendo nitrógeno líquido en el recipiente en el que se almacenan los componentes antes de su introducción en el molino. En una realización preferida, el recipiente es un alimentador. Si el recipiente es un alimentador, el nitrógeno líquido se introduce preferiblemente en el lado o cerca del lado del alimentador en el que se introducen los componentes.

Normalmente, los componentes se tratan con el nitrógeno líquido a lo largo de 2 a 20 segundos.

Preferiblemente, el enfriamiento de los componentes se realiza de modo que todos los componentes que entran en el molino estén a una temperatura por debajo de 0°C, lo más preferido por debajo de -20°C.

En una realización preferida, todos los componentes se colocan en un recipiente del que se transfiere la mezcla a un alimentador, lo más preferido a un alimentador sin fin de dosificación. En el alimentador, los componentes en ocasiones se mezclan adicionalmente (dependiendo del tipo de alimentador) y se enfrían adicionalmente. La mezcla congelada se transfiere entonces desde el alimentador hasta el molino, de modo que la mezcla que se muele en el molino tiene todavía preferiblemente una temperatura por debajo de 0°C, lo más preferido por debajo de -20°C.

Normalmente, el tiempo de combinación, que significa el tiempo de residencia de la mezcla de componentes en el alimentador, es de más de un minuto, preferiblemente entre 15 y 60 minutos.

Un alimentador sin fin de dosificación, también denominado espiral de dosificación, normalmente se hace funcionar a una velocidad de 10 a 200 revoluciones por minuto, preferiblemente se hace funcionar a de 40 a 60 revoluciones por minuto. Normalmente, la temperatura del molino se mantiene a entre -50 y 30°C. En una realización preferida, la temperatura se mantiene a alrededor de 10°C.

El nivel de oxígeno durante la molienda preferiblemente está por debajo del 10% (v/v).

El procedimiento puede ejecutarse por ejemplo de manera discontinua o de manera continua. En una realización preferida, el procedimiento según la presente invención se realiza de manera continua llenando de manera permanente, durante un tiempo determinado, la mezcla de componentes en un alimentador para enfriar y llenar de manera permanente la mezcla enfriada desde el alimentador al interior del molino.

Para el uso de los medios en polvo molidos, se añade un disolvente, preferiblemente agua (lo más particularmente agua destilada y/o desionizada o agua purificada o agua para inyección) o un tampón acuoso a los medios y los componentes se mezclan hasta que el medio se disuelve totalmente en el disolvente.

El agua o tampón acuoso también puede comprender solución salina, iones básicos o ácidos solubles que proporcionan un intervalo de pH adecuado (normalmente en el intervalo de entre pH 1.0 y pH 10.0), estabilizadores, surfactantes, conservantes y alcoholes u otros disolventes orgánicos polares.

También es posible añadir sustancias adicionales como sustancias tampón para el ajuste del pH, suero bovino fetal, azúcares, etc., a la mezcla del medio de cultivo celular y el disolvente. El medio de cultivo celular líquido resultante se pone entonces en contacto con las células que han de hacerse crecer o mantenerse.

Se da a conocer además un procedimiento para cultivar células

a) proporcionando un biorreactor

b) mezclando las células que van a cultivarse con un medio de cultivo celular según la presente invención que se ha disuelto en agua o un tampón acuoso

c) incubando la mezcla de la etapa b)

Un biorreactor es cualquier unidad adecuada para el cultivo de células, como un recipiente, vaso o tanque en el que pueden cultivarse células. Un biorreactor normalmente se esteriliza antes de su uso. La incubación normalmente se realiza en condiciones adecuadas como temperatura adecuada, etc. Un experto en la técnica conoce las condiciones de incubación adecuadas para soportar o mantener el crecimiento/cultivo de las células.

Los medios de cultivo celular de la presente invención que comprenden uno o más componentes incrustados en polímeros muestran mejor estabilidad en comparación con medios convencionales cuando se almacenan.

Además, las propiedades de flujo de los medios de cultivo celular de la presente invención que comprenden uno o más componentes incrustados en polímeros son mejores que las de medios convencionales comparables ya que los componentes higroscópicos están protegidos.

La presente invención se ilustra adicionalmente mediante las siguientes figuras y ejemplos, sin restringirse sin embargo a los mismos.

Tabla 1

Ejemplos

Los siguientes ejemplos representan aplicaciones prácticas de la invención.

1. Preparación de hidrogenocarbonato de sodio incrustado en poloxámero

El hidrogenocarbonato de sodio incrustado en poloxámero se prepara mediante extrusión por fusión en caliente usando un instrumento de fusión en caliente Unilab H00533.

Eductos:

2500 g de hidrogenocarbonato de sodio en forma de partículas entre aproximadamente 100 y 200 |jm.

1000 g de poloxámero (BASF, Alemania) en forma de una masa fundida como líquido de pulverización.

Especificaciones:

2 boquillas Hüttlin de 3 componentes, 1,2 mm de diámetro

Tubos de teflón de 4x1 mm

Aleta de aire de pulverización: 2,3 mm

Microclima: estacionario 40°C

Tubos: 100°C

Vaso: 130°C

Aire de pulverización: 130°C

2. Prueba de rendimiento en CHO S de hidrogenocarbonato de sodio y L-glutamina incrustados en poloxámero Los componentes incrustados en poloxámero se preparan según el procedimiento del ejemplo 1.

Se siembran células CHO S en un instrumento Cellvento CHO 100 (EMD Millipore, EE.UU.) con hidrogenocarbonato de sodio y L-glutamina nativos e incrustados y se almacenan a lo largo de 4 semanas a 4°C.

Las figuras 1 y 2 muestran las pruebas de rendimiento en CHO S.

Claims (6)

REIVINDICACIONES

1. Medio de cultivo celular de polvo seco que comprende al menos un componente incrustado en polímero mediante lo cual el componente se dispersa dentro del polímero mediante lo cual el polímero es soluble en agua y se selecciona de un copolímero de bloque de polietilenglicol (PEG)/polipropilenglicol (PPG), una polivinilpirrolidona o un copolímero de injerto de polivinilcaprolactama - poli(acetato de vinilo) - polietilenglicol y mediante lo cual los componentes incrustados en polímeros se han preparado mediante extrusión por fusión en caliente.

2. Medio de cultivo celular según la reivindicación 1, caracterizado porque el polímero es un poloxámero.

3. Medio de cultivo celular según una o más de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado porque el componente es L-glutamina, hidrogenocarbonato de sodio, cloruro de calcio x 2 H2O, cloruro de colina, nitrato férrico x 9 H2O, sulfato ferroso x 7 H2O, fosfato de sodio o fosfato de monosodio (NaH2PO4) monohidratado.

4. Medio de cultivo celular según una o más de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el medio de cultivo celular comprende dos o más componentes incrustados en polímeros.

5. Medio de cultivo celular según una o más de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el medio de cultivo celular es un medio de cultivo celular de mamíferos.

6. Medio de cultivo celular según una o más de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el medio de cultivo celular es un medio de cultivo celular químicamente definido.