ES2857151T3 - Mediciones de la viscosidad - Google Patents

Abstract

Un método para medir la viscosidad de una muestra de fluido, el método que comprende las siguientes etapas: (ii) proporcionar un primer flujo de la muestra de fluido; (iii) proporcionar un flujo de componentes, en donde el flujo de componentes es un segundo flujo de la muestra de fluido que comprende además un componente trazador; (iv) generar un flujo laminar del primer flujo con el segundo bajo en un canal de difusión, tal como un canal de difusión de microfluido; (iv) medir la difusión lateral del componente trazador a través de los flujos; y (v) determinar la viscosidad del fluido a partir del perfil de difusión medido, en donde el tamaño del componente trazador se conoce o se determina.

Description

DESCRIPCIÓN

Mediciones de la viscosidad

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos de difusión de flujo para determinar la viscosidad de una muestra de fluido. Antecedentes

La medición de la viscosidad de soluciones complejas es un problema omnipresente en las ciencias biológicas, biofísicas y biotecnológicas. Además, la viscosidad juega un papel importante en una amplia gama de aplicaciones tecnológicas basadas en el flujo de fluido.

Se desea medir la viscosidad de una muestra de fluido con técnicas de alto rendimiento usando volúmenes bajos de muestra. Se han descrito varios enfoques microrreológicos como alternativas a los viscosímetros y reómetros convencionales.

Una estrategia común para determinar la viscosidad del fluido implica monitorear el movimiento de difusión de partículas trazadoras de tamaño conocido. El movimiento de una sola partícula trazadora puede ser monitoreado por video­ microscopía (ver, por ejemplo, Valentine y otros y Tseng y otros). Alternativamente, el movimiento de las partículas trazadoras se puede controlar registrando las fluctuaciones en la dispersión de luz promedio o la señal de fluorescencia de las partículas trazadoras (ver, por ejemplo, Mason y otros.; He y otros; Palmer y otros; y Goins y otros). En estos enfoques, la viscosidad del fluido se cuantifica fácilmente a partir del coeficiente de difusión aparente de la partícula trazadora medido, como se entiende a partir de la relación de Stokes-Einstein entre viscosidad y difusión.

En la espectroscopia de ondas de difusión (DWS por sus siglas en inglés) y el seguimiento de partículas individuales, se puede aplicar una ecuación de movimiento de Langevin generalizada para correlacionar la evolución en el tiempo del desplazamiento cuadrático medio medido con los módulos de almacenamiento y pérdida del fluido (ver, por ejemplo, Tseng y otros y Mason y otros).

La patente de los Estados Unidos núm. US5948684 describe un método que permite determinar la viscosidad de una corriente de muestra mediante la detección de la posición dentro de un canal de flujo laminar de partículas de analito de una corriente de muestra que se difunde en una corriente indicadora que provoca un cambio detectable en la corriente indicadora o en una sustancia indicadora en la corriente indicadora.

La presente invención proporciona métodos alternativos para determinar la viscosidad, como la viscosidad relativa. Resumen de la invención

La presente invención proporciona en general un método para determinar la viscosidad de una muestra de fluido. El método comprende la etapa de controlar la difusión de un componente añadido de tamaño conocido a través de la muestra de fluido a lo largo del tiempo. A partir de los perfiles de difusión medidos es posible determinar la viscosidad de la muestra de fluido.

Por consiguiente, en la reivindicación 1 se proporciona un método para determinar la viscosidad de una muestra de fluido, en donde el método comprende las etapas de:

(ii) proporcionar un primer flujo de la muestra de fluido;

(iii) proporcionar un flujo de componentes, en donde el flujo de componentes es un segundo flujo de la muestra de fluido que comprende además un componente trazador;

(iv) generar un flujo laminar del primer flujo con el segundo flujo en un canal, tal como un canal de microfluidos;

(iv) medir la difusión lateral del componente trazador a través de los flujos; y

(v) determinar la viscosidad del fluido a partir del perfil de difusión medido,

en donde el tamaño del componente trazador se conoce o se determina.

En una modalidad de la invención, el método comprende además la etapa preliminar de (i) añadir un componente trazador a una parte del fluido de muestra.

El componente trazador es un componente que se agrega a la muestra de fluido con el fin de determinar la viscosidad de la muestra.

Los métodos de la invención se llevan a cabo en un dispositivo de flujo, tal como un dispositivo de microfluidos. El uso de dispositivos de fluido en el método de la invención proporciona una instrumentación relativamente sencilla y de bajo coste, en comparación con, por ejemplo, los métodos que utilizan un autocorrector relativamente caro. Además, las técnicas de fluido pueden permitir el uso de muestras de pequeño volumen y permitir tiempos de análisis rápidos.

Los métodos de la invención son insensibles a la composición de la muestra de fluido y los métodos también son insensibles al tamaño del componente trazador añadido a una parte de la muestra de fluido. Como se muestra en esta descripción, esto contrasta con los métodos de viscosidad basados en la dispersión dinámica de la luz, donde las mediciones de la viscosidad son complicadas cuando un componente trazador añadido es de un tamaño similar a otros componentes dentro de la muestra de fluido.

Por consiguiente, los métodos de la invención no se restringen al uso de componentes específicos o muestras de fluido específicas.

Además, los métodos de fluidos de la presente invención se pueden combinar con otras técnicas de fluido. Los dispositivos de fluido usados en los métodos de la invención se pueden proporcionar en conmutación de fluidos con otros dispositivos fluidos, y estos dispositivos se pueden integrar dentro de un solo chip de flujo.

En ejemplos que no caen dentro del alcance de la invención reivindicada, se proporcionan dispositivos de fluido para su uso en los métodos de la invención.

Otras modalidades de la invención se comentan con más detalle a continuación.

Resumen de las figuras

Las Figuras 1a y 1b son esquemas de un dispositivo de fluido para usar en un método de difusión de acuerdo con una modalidad de la invención.

La Figura 2 muestra los perfiles de difusión para partículas de 47 nm en 10 % en peso (azul) y 50 % en peso (rojo) en soluciones acuosas de glicerol medidas en el dispositivo de fluido de las Figuras 1a y 1b. Los perfiles de difusión se midieron en doce tiempos de difusión diferentes, en 12 posiciones a lo largo del canal de difusión. La distancia de difusión (mm) es la distancia desde las uniones del canal de sección transversal grande con el canal de difusión. Las muestras de baja y alta viscosidad fueron soluciones al 10 % en peso y al 50 % en peso de glicerol en agua, respectivamente.

La Figura 3 es una serie de imágenes (izquierda) que muestran la difusión de partículas a través de los flujos de fluido en un canal de difusión en el dispositivo de fluido de las figuras 1a y 1b. También se proporcionan los perfiles de difusión (derecha) para cada una de las imágenes, donde los perfiles incluyen los perfiles de difusión medidos (líneas discontinuas) y simulados (líneas continuas). Las imágenes utilizan una solución de glicerol en agua al 10 % en peso. Las posiciones I, II, III y IV se encuentran a 5,3 mm, 18,6 mm, 30,4 y 88,7 mm respectivamente a lo largo del canal de difusión.

La Figura 4 muestra el cambio en la viscosidad relativa (r|^r) con cambio en la concentración de glicerol (mg/mL) en una solución de muestra acuosa, medida en el dispositivo de fluido de las figuras 1a y 1b (círculos) a 25 °C, y mediante la técnica de dispersión dinámica de luz convencional (cuadrados). También se muestran los valores de la literatura informada (triángulos). La línea discontinua representa una función empírica reportada en la literatura.

La Figura 5 muestra el cambio en la viscosidad relativa (r|^r) con el cambio en la concentración de albúmina de suero bovino (BSA) (mg/mL) en una solución de muestra acuosa, medida en el dispositivo de fluido de las figuras 1a y 1b (círculos) utilizando nanopartículas estándar de 100 nm de diámetro a 25 °C, y mediante técnicas convencionales de dispersión dinámica de luz (cuadrados).

La Figura 6 muestra las distribuciones de tamaño (nm) medidas por dispersión dinámica de luz para una solución de 100 g/L de BSA con nanopartículas estándar al 0,05 % de 47 nm de diámetro (a) o 100 nm de diámetro (b).

Las Figuras 7a y 7b son esquemas de dispositivos de fluido para usar en un método de difusión de acuerdo con modalidades de la invención, en donde (a) es un dispositivo en serie que tiene una configuración de 2 canales y (b) es un dispositivo en serie que tiene una configuración de 3 canales.

Las figuras 8a y 8b son esquemas de dispositivos de fluido para usar en un método de difusión de acuerdo con modalidades de la invención, en donde (a) es un dispositivo en paralelo que tiene una configuración de 2 canales y (b) es un dispositivo en paralelo que tiene una configuración de 3 canales.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona un método para determinar la viscosidad de una muestra de fluido. La muestra de fluido a analizar se usa en partes, una parte con un componente trazador agregado, mientras la otra parte no está modificada. Se genera un flujo laminar de las partes fluidas en un canal, y se permite que el componente trazador en una parte se difunda hacia la otra parte. Se monitorea el movimiento del componente marcador a lo largo del tiempo. A partir de los perfiles de difusión medidos, se puede determinar la viscosidad de la muestra de fluido.

Los flujos de fluido se proporcionan en un canal de un dispositivo de flujo, como un dispositivo de microfluidos. Los dispositivos de flujo para medir la difusión son conocidos en la técnica y se describen con más detalle a continuación.

Los presentes inventores han descrito previamente en la patente internacional núm. WO 2014/064438 el uso de técnicas de difusión para analizar mezclas multicomponente. En una validación de ese enfoque, los inventores monitorearon la difusión de componentes que tienen un tamaño conocido. Sin embargo, de este trabajo anterior no es evidente que las técnicas de difusión se puedan y se deban usar para determinar la viscosidad de una muestra de prueba usando un componente trazador.

Para validar las mediciones de las dimensiones, la patente internacional núm. WO 2014/064438 describe la difusión de partículas de poliestireno de 25 y 100 nm marcadas con fluorescencia, por separado y juntas, en un flujo acuoso en blanco. Las partículas de poliestireno se utilizan a una concentración de 0,2 % en volumen. A partir de este trabajo, no es evidente que se puedan y deban añadir partículas de tamaño conocido y concentración relativamente baja a una muestra de prueba, para determinar la viscosidad de esa muestra de prueba.

Los métodos de la patente internacional núm. WO 2014/064438 tienen en cuenta el movimiento de los componentes desde el flujo de fluido de muestra hacia un flujo de fluido en blanco (de tampón). Por el contrario, los métodos del presente caso analizan el movimiento de un componente trazador hacia un flujo de fluido de muestra.

Muestra de fluido

Los métodos de la invención permiten determinar la viscosidad de una muestra de fluido. Los métodos de la invención permiten analizar fluidos de composición desconocida y no existe limitación en cuanto a la naturaleza y concentración de los componentes dentro de la muestra de fluido.

En una modalidad, la muestra de fluido es una muestra de fluido cuya viscosidad se desconoce.

La muestra de fluido puede ser una muestra de líquido.

En los métodos de la invención, la muestra de fluido se proporciona en al menos dos partes. La primera parte de la muestra de fluido es una parte que tiene un componente trazador. Este componente trazador se puede agregar a la muestra de fluido antes del análisis. La otra parte es una muestra de fluido que no contiene el componente trazador. En los métodos de la invención, los flujos de estas partes de la muestra de fluido se ponen en contacto para formar un flujo laminar. A continuación, se permite que el componente se difunda desde el flujo de la primera parte hacia el flujo de la otra parte.

Una referencia a un flujo de la muestra es una referencia a un flujo de fluido de una parte de la muestra de fluido que no contiene el componente trazador.

Una referencia al flujo de un componente trazador es una referencia a un flujo de fluido de una parte de la muestra de fluido que contiene el componente trazador.

Por tanto, la composición del flujo de la muestra y el flujo del componente trazador pueden ser idénticos excepto por la presencia del componente trazador en el flujo del componente trazador. Por tanto, una referencia a las propiedades del flujo de la muestra se puede considerar una referencia al flujo del componente trazador, según lo dicte el contexto.

El fluido de muestra puede contener, disuelto o disperso, uno o más componentes. Dichos componentes incluyen moléculas biológicas, y los componentes pueden contener grupos polipéptidos, polisacáridos o polinucleótidos.

Por ejemplo, un componente del fluido de muestra puede ser una proteína, incluido un anticuerpo.

En una modalidad, el fluido de muestra contiene una pluralidad de componentes. De ello se deduce que las mediciones de la difusión siguen el movimiento del componente trazador a través de flujos multicomponente. En una modalidad, la muestra de fluido es una mezcla multicomponente.

En una realización, la composición de la muestra de fluido o la concentración de componentes dentro del fluido puede ser desconocida.

Cuando el componente trazador se proporciona en una parte de la muestra de fluido, este componente trazador se suma a los componentes dentro de la muestra de fluido.

La muestra de fluido puede contener un componente que tenga un peso molecular, tal como un peso molecular medio ponderado, de al menos 300 Da, 500 Da, al menos 1000 Da (1 kDa) o al menos 2 kDa.

El fluido puede contener un componente que tiene un peso molecular, tal como un peso molecular medio ponderado, de como máximo 5 kDa, como máximo 10 kDa, como máximo 20 kDa, como máximo 50 kDa o como máximo 100 kDa. Por ejemplo, como se indicó anteriormente, el fluido de muestra puede contener una o más proteínas.

El fluido de muestra puede contener (o se sospecha que contiene) componentes que son de un tamaño similar al componente trazador. Los inventores han descubierto que las técnicas de fluido de la invención permiten determinar la viscosidad independientemente del tamaño del componente trazador e independientemente del tamaño de los componentes que están presentes dentro de la muestra de fluido. Por tanto, los métodos de la invención se pueden usar para determinar la viscosidad de una muestra de fluido que tiene una composición compleja y/o desconocida.

Los presentes inventores han descubierto que los métodos de dispersión de luz dinámica descritos anteriormente para determinar la viscosidad resultan un problema cuando un componente trazador añadido tiene un tamaño similar a uno o más componentes dentro de la muestra de fluido. En particular, la convolución de las señales de dispersión de luz del componente trazador y los componentes de tamaño similar en la muestra de fluido no permiten un dimensionamiento exacto de las partículas trazadoras, lo que da como resultado una determinación inexacta de la viscosidad. Esto se muestra en los ejemplos trabajados del presente caso.

Puede que los resultados de los experimentos de dispersión de luz dinámica no siempre sean fiables, por lo que puede que sea necesario repetir los experimentos de dispersión de luz dinámica utilizando componentes trazadores de tamaño variable para validar los valores de viscosidad calculados. Alternativamente, puede ser necesario aumentar la intensidad de la señal de dispersión de luz de alguna otra manera, como aumentar la concentración de los componentes trazadores dentro de la muestra de fluido. Sin embargo, este último enfoque no suele ser deseable, ya que es probable que la adición de una cantidad significativa del componente trazador provoque un cambio en la viscosidad de la muestra.

Una referencia al tamaño de un componente en la muestra de fluido puede ser una referencia al radio, tal como el radio hidrodinámico, del componente. El tamaño de los componentes se puede determinar utilizando técnicas analíticas estándar. Por ejemplo, se pueden usar mediciones de la difusión para determinar el tamaño de los componentes dentro de la muestra de fluido.

Un componente presente en una muestra de fluido puede tener un radio de al menos 0,05 nm, al menos

0,1 nm, al menos 0,5 nm, al menos 1 nm o al menos 5 nm.

Un componente presente en una muestra de fluido puede tener un radio de como máximo 10 nm, como máximo 15 nm, como máximo 25 nm, como máximo 50 nm, como máximo 100 nm, como máximo 200 nm o como máximo 500 nm. Un componente puede tener un radio en un rango con límites superior e inferior seleccionados de los mencionados anteriormente. Por ejemplo, la presente invención es particularmente adecuada para determinar la viscosidad de muestras de fluidos que contienen componentes que tienen radios en el rango de 0,5 a 500 nm, como de 0,5 a 200 nm, como de 0,5 a 100 nm, como de 0,5 a 15 nm.

Normalmente, la muestra de fluido es un fluido acuoso. Un fluido acuoso puede comprender adicionalmente un disolvente orgánico miscible. Este se puede proporcionar para retener componentes en solución o suspensión. Por ejemplo, puede estar presente DMSO junto con agua.

En los métodos de la invención, a partir de la muestra de fluido se prepara un fluido que contiene un componente trazador, mediante la adición del componente trazador a una parte de la muestra de fluido. Se proporciona una parte adicional de la muestra de fluido, y esta parte no contiene el componente trazador. Esta parte adicional se utiliza para generar el flujo de la muestra.

Una parte de la muestra de fluido que contiene el componente trazador se puede preparar mediante la mezcla simple del componente trazador con una parte de la muestra de fluido.

El componente trazador se puede utilizar en concentraciones relativamente bajas. Los métodos de detección para usar en la presente invención, tales como la detección fluorescente, permiten la detección del componente trazador a concentraciones muy bajas.

El componente trazador se añade a la muestra de fluido a un nivel suficiente para mantener sustancialmente la viscosidad del fluido. Por tanto, la viscosidad del flujo de la muestra y el flujo del componente trazador son sustancialmente iguales, si no iguales.

Los valores de viscosidad determinados para el fluido de muestra no serán lo suficientemente precisos si hay una gran diferencia en la viscosidad del fluido de muestra y el fluido del componente trazador.

El componente trazador se proporciona en una cantidad suficiente para permitir su detección en los flujos de fluido. La cantidad mínima de componente trazador que se puede utilizar dependerá de las propiedades analíticas del componente trazador, como el componente trazador de eficacia de fluorescencia y la eficacia de detección del detector que se utilice.

El componente trazador se puede proporcionar en una parte de la muestra de fluido a una concentración de al menos 0,001, al menos 0,005 o al menos 0,01 % en peso.

El componente trazador se puede proporcionar en una parte de la muestra de fluido a una concentración de como máximo 0,05, como máximo 0,1, como máximo 0,2, como máximo 0,5 o como máximo 1,0 % en peso.

El componente trazador se puede usar a una concentración que se selecciona de un rango que tiene límites superior e inferior seleccionados de los valores dados anteriormente. Por ejemplo, el componente trazador se puede proporcionar en una parte de la muestra de fluido a una concentración en el rango de 0,01 a 0,05 % en peso.

La muestra de fluido puede contener uno o más componentes, y estos componentes también estarán presentes en el flujo del componente trazador. La concentración de estos componentes en el flujo del componente trazador es sustancialmente la misma que la de los componentes dentro del flujo de la muestra. Por tanto, la adición del componente trazador a una parte de la muestra de fluido no está asociada con una dilución o concentración de los componentes en el fluido. Por consiguiente, cuando el flujo del componente trazador y el flujo de la muestra entran en contacto en un flujo laminar, sustancialmente no hay gradiente de concentración de los componentes a través de los flujos de fluido. En contraste, existe un gradiente de concentración del componente trazador a través de los flujos de fluido, y es el cambio en este gradiente de concentración lo que se monitorea a lo largo del tiempo.

En determinadas modalidades de la invención, el método proporciona el uso de dos flujos de la muestra de fluido, que no contienen el componente trazador. Estos flujos de fluido se pueden generar a partir de una sola parte de la muestra de fluido o a partir de dos partes de la muestra de fluido, como se describe con más detalle a continuación. Estos dos flujos se proporcionan a ambos lados del flujo del componente trazador.

Componente trazador

El componente trazador a utilizar en los métodos de la invención es un componente cuyo tamaño se conoce. El tamaño del componente puede ser conocido en la técnica o se puede determinar antes de usar el componente en los métodos de la invención. El tamaño del componente trazador puede conocerse de la literatura y/o esta información puede ser proporcionada por un proveedor comercial del componente.

Alternativamente, el tamaño del componente trazador se puede determinar después de que el componente se haya utilizado en los métodos de la invención.

El tamaño del componente trazador se puede determinar (o confirmar) utilizando técnicas analíticas estándar.

Una referencia al tamaño del componente trazador puede ser una referencia al radio, tal como el radio hidrodinámico, del componente.

El componente trazador utilizado en el método de la invención puede tener un radio de al menos 0,05 nm, al menos 0,1 nm, al menos 0,5 nm, al menos 1 nm o al menos 5 nm.

El componente trazador utilizado en el método de la invención puede tener un radio de como máximo 10 nm, como máximo 15 nm, como máximo 25 nm, como máximo 50 nm, como máximo 100 nm o como máximo 200 nm o como máximo 500 nm.

El componente trazador puede tener un radio en un rango con límites superior e inferior seleccionados de los mencionados anteriormente. Por ejemplo, la presente invención es particularmente adecuada para usarla con componentes trazadores que tienen radios en el intervalo de 0,5 a 500 nm, como de 0,5 a 200 nm, como de 0,5 a 100 nm, como de 0,5 a 15 nm.

El tamaño del componente trazador puede ser de un tamaño sustancialmente similar al de un componente contenido dentro de la muestra de fluido.

En una modalidad, el componente trazador tiene un radio que es al menos 10 %, al menos 20 %, al menos 40 % al menos 50 %, al menos 60 %, al menos 70 %, al menos 80 % o al menos el 90 % del radio de un componente en la muestra de fluido.

En una modalidad, el componente trazador tiene un radio que es como máximo 100 % (es decir, el mismo que el del componente), como máximo 150 %, como máximo 200 %, como máximo 500 % o como máximo 1000 % del radio de un componente en la muestra de fluido.

El componente trazador puede tener un radio que esté en un rango seleccionado de los límites superior e inferior mencionados anteriormente. Por ejemplo, el componente trazador tiene un radio que es de 10 % a 200 % del radio de un componente en la muestra de fluido.

Cuando se vayan a realizar mediciones de difusión para múltiples muestras de fluido que tienen un rango de viscosidades (o un rango de viscosidades previsto), se prefiere que se utilice un componente trazador que tenga un tamaño pequeño para todos los experimentos.

Como se explicó anteriormente, los métodos de la invención permiten determinar la viscosidad incluso cuando el componente trazador tiene un tamaño similar a un componente dentro de la muestra de fluido.

Los componentes trazadores suelen tener un tamaño uniforme entre su población. El uso de una población sustancialmente homogénea de partículas trazadoras asegura que los valores de viscosidad determinados sean precisos.

Por tanto, en una modalidad, los componentes trazadores a usaren la invención son sustancialmente monodispersos. En una modalidad, el componente trazador tiene una distribución de tamaño en la que la desviación estándar es menos de 15 %, menos de 10 %, menos de 5 % o menos de 1 % de la media. La distribución del tamaño del componente indicador se puede conocer a partir de la información proporcionada por el proveedor comercial del componente trazador. La distribución del tamaño también se puede determinar mediante mediciones espectroscópicas, incluidas las mediciones microscópicas de una población de muestra de componentes trazadores.

Es posible utilizar componentes trazadores que tengan diferentes tamaños, en donde se conocen los números relativos de cada uno de los componentes trazadores de diferentes tamaños. Los perfiles de difusión de mezclas multicomponente se pueden resolver, por ejemplo mediante el uso de las técnicas desarrolladas por los presentes inventores como se describe en la patente internacional núm. WO 2014/064438. Por simplicidad, se prefiere que se utilicen componentes trazadores que tengan sustancialmente el mismo tamaño.

El componente trazador puede estar disuelto en la muestra de fluido. Sin embargo, la presente invención también se puede utilizar para seguir el movimiento de los componentes trazadores que están dispersos dentro de un fluido. Por tanto, los fluidos usados en el método pueden ser coloidales y pueden ser una solución o una emulsión, en donde el componente trazador es la fase dispersa.

La cantidad de componente trazador requerida para realizar un análisis de acuerdo con el método de la invención no es grande y a través del dispositivo de microfluidos pueden pasar cantidades muy pequeñas de material. También es posible recolectar el fluido que sale del canal de difusión, y este se puede volver a analizar.

El método de la invención incluye la etapa de medir la difusión del componente trazador a través de los flujos de fluido. El componente trazador se puede detectar usando técnicas analíticas estándar tales como espectroscopia fluorescente, espectroscopia luminiscente, espectroscopia UV-vis, entre otras.

El componente trazador es típicamente un componente que no reacciona o no se espera que reaccione con componentes dentro de la muestra de fluido. Por esta razón, se debe evitar el uso de proteínas como componentes trazadores al medir la viscosidad de fluidos biológicos. Existe el riesgo de que un trazador de proteínas interactúe con componentes del fluido biológico (como, por ejemplo, otras proteínas).

El componente trazador puede ser una molécula, tal como una molécula polimérica.

El componente trazador puede ser una partícula.

En una modalidad, el componente trazador es un polímero, tal como una partícula de polímero. El componente trazador puede ser poliestireno, como una partícula de poliestireno.

En una modalidad, el componente trazador es una molécula de colorante.

Es posible que un componente esté etiquetado para ayudar a la detección. Por ejemplo, en los métodos ejemplares descritos en el presente documento, se utilizan como componente trazador partículas de poliestireno marcadas con fluorescencia.

El componente trazador se puede elegir por sus propiedades analíticas. Por ejemplo, el trazador puede poseer una funcionalidad detectable que no está presente (o no se cree que esté presente) dentro del fluido de muestra.

Por ejemplo, el componente trazador puede ser fluorescente activo, y las longitudes de onda de excitación y emisión fluorescentes pueden ser tales que no son típicas o esperadas para los componentes dentro del fluido de muestra. En el presente caso, los componentes trazadores que tienen actividad fluorescente se utilizan para determinar la viscosidad de las soluciones que contienen albúmina de suero bovino. La actividad fluorescente de las partículas trazadoras no se comparte con la albúmina de suero bovino. Por tanto, las señales fluorescentes detectadas se asocian únicamente con el componente trazador y no con ningún otro componente del fluido de muestra.

Métodos

La presente invención se puede usar para determinar la viscosidad, tal como la viscosidad relativa, de una muestra de fluido. Los métodos de la invención buscan medir la difusión de un componente indicador de tamaño conocido a través de la muestra de fluido. La difusión del componente trazador a lo largo del tiempo permite determinar la viscosidad del fluido.

En los métodos de la invención se establece un flujo de la muestra de fluido. Este es el flujo de la muestra. También se establece un flujo de una muestra de fluido que contiene un componente trazador. Este es el flujo de componentes. Estos flujos de muestras y componentes se ponen en contacto y se genera un flujo laminar en un canal de difusión. Una vez que se establece el flujo laminar, se controla la difusión del componente desde el flujo del componente hacia el flujo de la muestra. Por tanto, la ubicación del componente a través de uno o todos los flujos de fluido se puede determinar en diferentes tiempos de difusión. A partir de los perfiles de difusión medidos del componente, se puede determinar la viscosidad de la muestra de fluido.

El canal se denomina canal de difusión, ya que es un canal de fluido donde se permite y se controla la difusión del componente.

El caudal de cada flujo se mantiene a un nivel sustancialmente constante durante los pasos de análisis. El análisis solo se puede realizar cuando se establece un flujo estable en el canal de difusión.

Los caudales usados no están particularmente limitados, y no es necesario que los caudales del flujo de la muestra y del componente trazador sean iguales.

El caudal del componente trazador se puede alterar independientemente del caudal del flujo de la muestra.

En la práctica, los caudales se seleccionan para acomodar la difusión del componente a través de los flujos de fluido. El caudal se selecciona de manera que haya suficiente tiempo de permanencia dentro del canal de flujo para permitir que se controle la difusión del componente trazador.

El canal es parte de un dispositivo de fluido. El dispositivo de fluido está adaptado para usarlo con un detector en una pluralidad de ubicaciones en el canal. El canal está en comunicación fluida con los canales de suministro para el flujo de la muestra y el flujo de componentes.

En algunas modalidades, se proporcionan dos flujos de muestra a cada lado del flujo del componente trazador. Por lo tanto, el método de la invención puede considerar la difusión del componente trazador en el flujo del componente trazador en uno o en ambos flujos de fluido de muestra flanqueadores. El uso de dos flujos de fluido de muestra es ventajoso, ya que estos se pueden usar para proporcionar una presión de equilibrio estable a través del flujo del componente trazador.

La composición de los dos flujos de muestra es idéntica. Normalmente, el caudal de los dos flujos de muestra es idéntico.

Los métodos de la invención se realizan típicamente en flujos que tienen un número de Reynolds bajo. Por ejemplo, el número de Reynolds de un flujo puede ser 1 o menos, 0,5 o menos, 0,1 o menos, o 0,05 o menos.

Los métodos de la invención se pueden realizar a temperatura ambiente o alrededor de ella, por ejemplo 15, 20 o 25 °C. Alternativamente, los métodos de la invención se pueden realizar a temperaturas más bajas, como 5 o 10 °C, o temperaturas más altas, como 35, 40 o 50 °C. El método de la invención también puede incluir la etapa de medir la temperatura de los fluidos a usar en la invención.

En una modalidad, el caudal de fluido del flujo laminar es al menos 1, al menos 5, al menos 10, al menos 50 o al menos 100 pLh-1.

En una modalidad, el caudal de fluido del flujo laminar es como máximo 200, como máximo 400, como máximo 500, como máximo 1000, como máximo 2000 o como máximo 5000 pLh-1.

En una modalidad, el caudal del flujo laminar es un valor seleccionado de un rango que tiene valores superior e inferior seleccionados de los valores anteriores. Por ejemplo, el caudal puede estar en el rango de 5 a 400 pLh-1.

El caudal de fluido es el caudal en estado estable.

El caudal de fluido laminar se refiere al caudal combinada del flujo de la muestra (o flujos de muestra) y el flujo del componente trazador. los caudales del componente trazador y el flujo de la muestra se pueden ajustar para lograr el caudal deseada en el canal de difusión.

El uso de dispositivos microfluidos con caudales en el rango indicado anteriormente significa que se pueden usar cantidades relativamente pequeñas de fluido componente en una ejecución analítica. Por ejemplo, los volúmenes en el rango son suficientes para establecer un flujo de estado estable en el canal de difusión con el fin de obtener al menos una lectura del perfil de difusión.

En una modalidad, el volumen total de fluido usado en el método es como máximo 50, como máximo 100, como máximo 200, como máximo 500 o como máximo 1000 pl.

En una modalidad, el volumen total de fluido usado en el método es al menos 0,1, es al menos 0,5, es al menos 1, es al menos 5, o es al menos 10 pl.

En una modalidad, el volumen total de fluido usado es un valor seleccionado de un rango que tiene valores superior e inferior seleccionados de los valores anteriores. Por ejemplo, el volumen total puede estar en el rango de 1 a 50 pL. El volumen total de fluido se refiere a los volúmenes combinados del líquido del componente trazador y el fluido de muestra utilizado en el método.

En una modalidad, la difusión lateral del componente trazador desde el flujo del componente trazador al flujo del fluido de muestra se mide en una pluralidad de tiempos de difusión.

Por tanto, la difusión lateral se puede medir en una pluralidad de ubicaciones a lo largo del canal de difusión. La separación entre los puntos de medición no está particularmente limitada, pero puede ser de una distancia suficiente para que los perfiles de difusión registrados hayan cambiado notablemente entre los puntos de medición.

En una modalidad alternativa, la difusión lateral del componente trazador se mide en una única ubicación en el canal. Una vez que se ha registrado la difusión lateral, se alteran los caudales del componente trazador y los flujos de fluido de muestra, y una vez que se establece un flujo estable, se mide la difusión lateral del componente trazador en un solo lugar. Por tanto, se pueden obtener perfiles de difusión en diferentes tiempos de difusión mediante cambios en los caudales. Los caudales se pueden cambiar una, dos, tres o más veces.

Dispositivo de fluido

El método de la invención hace uso de un canal de difusión que forma parte de un dispositivo de fluido, por ejemplo, un dispositivo de microfluido.

Por tanto, el dispositivo de fluido comprende un canal de difusión. El canal de difusión contiene el flujo laminar del componente trazador con un flujo de fluido de muestra, o el canal de difusión contiene el flujo laminar del flujo del componente trazador con dos flujos de fluido de muestra, que se proporcionan a ambos lados del flujo del componente trazador.

El canal de difusión está adaptado para su uso con un dispositivo analítico, que es adecuado para determinar la distribución lateral de un componente trazador en una o más ubicaciones a lo largo del canal de difusión.

El canal de difusión puede estar en comunicación fluida con un canal aguas arriba que tiene una sección transversal más grande (un canal de sección transversal grande). Por consiguiente, el canal de difusión se puede denominar canal de sección transversal pequeña. El uso de canales de sección transversal grande y pequeña en un dispositivo de difusión es descrito por los presentes inventores en la patente internacional núm. WO 2014/064438.

El uso de canales de microfluidos para contener el componente trazador y los flujos de fluido de muestra asegura que los flujos tengan lugar en números de Reynolds bajos y, en consecuencia, la convección y la difusión son el único mecanismo relevante de transporte de masa dentro del sistema. Por consiguiente, esto permite realizar cálculos numéricos precisos.

Las dimensiones generales de los canales en el dispositivo se seleccionan para proporcionar tasas de movilización y tiempos de análisis razonables. Las dimensiones del dispositivo también se pueden seleccionar para reducir la cantidad de fluido requerida para un análisis suficiente.

El canal de difusión (y el canal de sección transversal grande, cuando está presente) es un canal que tiene dimensiones adecuadas que permiten la generación y mantenimiento de un flujo laminar de dos (o tres) corrientes en su interior. El flujo laminar de dos corrientes significa que los flujos están uno al lado del otro y son estables. Por lo tanto, normalmente no hay regiones donde los fluidos recirculan y la turbulencia es mínima. Normalmente, estas condiciones las proporcionan canales pequeños, como microcanales.

Los dispositivos a usar en mediciones de dispersión son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, por Kamholz y otros.Biophysical Journal, 80 (4): 1967-1972, 2001) y en la patente internacional núm. WO 2014/064438.

En esta descripción, una referencia a un canal, tal como un canal de difusión, es una referencia a un canal que tiene una sección transversal sustancialmente rectangular. Por tanto, el canal puede estar formado por una base sustancialmente plana con paredes que se extienden sustancialmente verticalmente desde la misma, y opcionalmente una cubierta superior. Normalmente, la base y las paredes se forman en un sustrato de silicona. La cubierta puede ser una cubierta de vidrio, por ejemplo, un portaobjetos de vidrio estándar o una oblea de borosilicato. El aparato de detección se puede colocar encima del canal de difusión.

Una referencia al ancho es una referencia a la dimensión de difusión lateral en el canal (que se denomina d en algunas referencias de la técnica anterior).

El canal de difusión tiene un ancho sustancialmente constante en toda su longitud.

El ancho del canal de difusión puede ser como máximo de 500 pm, como máximo de 700 pm, como máximo de 1000 pm, o como máximo de 2000 pm.

El ancho del canal de difusión puede ser de al menos 5 pm, al menos 10 pm, al menos 50 pm, al menos 100 pm o al menos 200 pm.

En una modalidad, el ancho del canal de difusión puede estar en un rango seleccionado entre los valores superior e inferior mencionados anteriormente. Por ejemplo, el ancho puede estar en el rango de 10 a 500 pm.

La longitud del canal de difusión puede ser de una longitud adecuada para permitir la difusión del componente en el flujo del componente hasta el borde del canal que forma el límite para el flujo del fluido de muestra. Por tanto, cuando los flujos de fluido han alcanzado el final del canal de difusión, todos los componentes presentes en el flujo de componentes han alcanzado la configuración entrópica máxima.

La longitud del canal de difusión es suficiente para permitir que un componente trazador se difunda desde el flujo de fluido del componente trazador al flujo de fluido de muestra. Para componentes trazadores, tales como polímeros, que tienen los pesos moleculares descritos en este documento, generalmente son suficientes longitudes de canal de difusión de 1 mm o más.

En una modalidad, el canal de difusión tiene al menos 0,5 mm, al menos 1 mm, al menos 2 mm o al menos 5 mm de largo. En una modalidad, el canal de difusión tiene como máximo 10 mm, como máximo 20 mm o como máximo 50 mm de largo.

En una modalidad, la longitud del canal de difusión puede estar en un rango seleccionado entre los valores superior e inferior mencionados anteriormente. Por ejemplo, la longitud del canal de difusión puede estar en el rango de 0,5 a 50 mm, tal como de 1 a 20 mm.

El flujo de fluidos es a lo largo del eje longitudinal del canal de difusión. La difusión del componente trazador en el flujo del componente trazador en el flujo de la muestra es transversal al eje longitudinal del flujo, a lo ancho del canal.

En algunas modalidades, al menos una parte del canal de difusión es enrollado. Así, el canal de difusión puede incluir una vuelta o una serie de vueltas, por ejemplo. El uso de una geometría enrollada permite minimizar el tamaño del dispositivo. El uso de una trayectoria enrollada también puede proporcionar múltiples canales de flujo dentro de una sola zona de detección. En una sola zona de detección, múltiples canales (correspondientes a diferentes distancias de flujo y, por lo tanto, diferentes tiempos de difusión) pueden pasar a través de un detector, lo que permite realizar mediciones múltiples y simultáneas.

El canal de difusión puede recibir los flujos de fluido de muestra y componente trazador directamente desde los canales de suministro para cada uno de los fluidos de muestra y componente trazador. Por tanto, los flujos de fluido entran en contacto en una unión de la región aguas arriba del canal de difusión.

En otra modalidad, el canal de difusión puede recibir la muestra y el flujo de fluido del componente trazador desde un canal de sección transversal grande aguas arriba.

El fluido que sale del canal de difusión se puede recolectar para un análisis adicional. Por tanto, el canal de difusión está en comunicación fluida con un depósito de recogida de muestras. Alternativamente, el canal de difusión puede estar en comunicación fluida con otro dispositivo de fluido, por ejemplo un dispositivo para medir una segunda propiedad física del fluido. En una modalidad, el canal de difusión está aguas arriba de un segundo dispositivo analítico para determinar el radio hidrodinámico de un componente dentro de la muestra de fluido (cuyo componente se puede denominar analito).

El dispositivo de fluido puede estar provisto de canales de suministro que proporcionen comunicación fluida entre el depósito y el canal de difusión, ya sea directamente o a través de un canal de sección transversal grande. Cuando se vayan a proporcionar dos flujos de muestra en el canal de difusión (y a cada lado del flujo del componente trazador), cada uno de los flujos de fluido de muestra se puede suministrar independientemente desde diferentes depósitos. Sin embargo, cada uno de los flujos de fluido de muestra se puede proporcionar a partir de un único depósito que está vinculado al canal de sección transversal grande a través de dos canales de suministro.

Las dimensiones de cada canal de suministro no están particularmente limitadas y pueden ser similares o iguales al canal de difusión. En una modalidad, cada canal de suministro tiene un ancho que es mayor que el ancho del canal de difusión. En una modalidad, cada canal de suministro tiene un ancho que es menor que el ancho del canal de difusión.

Cada depósito puede ser una jeringa que está conectada a una línea de suministro del dispositivo de fluido. La jeringa puede estar bajo el control de un ordenador adecuadamente programado que sea capaz de controlar indecentemente el caudal de fluido desde el depósito al canal de sección grande. El control de tales dispositivos es bien conocido en la técnica.

Alternativamente, cada depósito puede proporcionarse como parte del dispositivo de microfluido.

En otras modalidades, el flujo de fluido de uno o más depósitos puede ser una alimentación por gravedad.

Un dispositivo de fluido de acuerdo con la presente invención y para usar en los métodos descritos en este documento se puede preparar usando técnicas estándar conocidas en la técnica. Por tanto, la fotolitografía se puede usar para generar canales de fluido y opcionalmente depósitos de fluido, en un sustrato apropiado, tal como un sustrato de silicona. Las técnicas descritas en Kamholz y otros (Biophysical Journal) se pueden utilizar con las adaptaciones apropiadas a la máscara fotolitográfica para permitir la introducción de un canal de sección transversal grande y canales de flujo de fluido de muestra adicionales, cuando sea apropiado.

Los canales de fluido preparados mediante técnicas fotolitográficas se pueden terminar proporcionando puertos de acceso y salida de fluidos, por ejemplo, perforando el sustrato para proporcionar acceso a los canales correspondientes. Cuando se utilizan depósitos externos, como jeringas, para suministrar fluidos directamente al canal de sección transversal grande o al canal de suministro, se puede utilizar un colector apropiado.

El dispositivo de fluido se puede utilizar en combinación con un ordenador programable y adecuadamente programado para controlar los flujos hacia el canal de sección transversal grande y para gestionar el dispositivo de detección. La computadora también puede analizar los datos registrados y proporcionar valores de difusión en tiempo real.

El dispositivo es adecuado para la integración con un detector para medir la difusión lateral de uno o más componentes en el canal de difusión.

La profundidad del canal de difusión se puede seleccionar para reducir la escala de tiempo para la difusión del analito a través del ancho del canal (para reducir así el tiempo necesario para acercarse a la solución de estado estacionario). La profundidad del canal se puede seleccionar para minimizar o eliminar los artefactos que están asociados con los canales más profundos (ver Kamholz y otros, Biophysical). La profundidad del canal se puede seleccionar para minimizar o eliminar los problemas de carga y la alta resistencia a los fluidos que están asociados con canales muy poco profundos (ibídem.). Cuando hay un canal de sección transversal grande, su profundidad puede ser la misma que la del canal de difusión.

En algunas referencias de la técnica anterior, la altura o profundidad del canal se denomina ancho, w.

La relación de aspecto, la relación entre el ancho del canal y la altura del canal, puede ser 100 o menos, 50 o menos, 25 o menos, o 10 o menos.

La relación de aspecto puede ser 1 o más, 2 o más, 4 o más, o 5 o más.

En una modalidad, la relación de aspecto puede estar en un rango seleccionado entre los valores superior e inferior dados anteriormente. Por ejemplo, la relación de aspecto puede estar en el rango de 5 a 100.

Generalmente se favorecen relaciones de aspecto más grandes, como 4 o más, ya que los perfiles de velocidad completamente desarrollados serán parabólicos a lo largo de la altura del canal y aproximadamente romos a lo largo del ancho del canal (ver Kamholz y otros, Biophysical).

La altura del canal (o profundidad del canal) del canal de difusión no está particularmente limitada, salvo por las consideraciones expuestas anteriormente. Cuando está presente un canal de sección transversal grande, la altura del canal de los canales de sección grande puede ser la misma que la del canal de difusión. La altura del canal es sustancialmente constante en todo el canal.

En una modalidad, la altura del canal es de al menos 5 pm, al menos 10 pm o al menos 15 pm.

En una modalidad, la altura del canal es como máximo de 30 pm, como máximo de 50 pm, como máximo de 100 pm o como máximo de 500 pm.

En una modalidad, la altura del canal puede estar en un rango seleccionado entre los valores superior e inferior mencionados anteriormente. Por ejemplo, la altura del canal puede estar en el rango de 10 a 50 pm.

Los canales conocidos de la técnica anteriortienen típicamente una profundidad en el rango de 10 a 100 pm (ver Kamholz y otros).

Como se indicó anteriormente, la profundidad del canal se puede seleccionar en relación con el ancho del canal para proporcionar una relación de aspecto adecuada.

No es necesario separar los flujos laminares entre sí para realizar el análisis analítico. La medición analítica se puede registrar tanto en el flujo del componente como en el flujo de la muestra.

El dispositivo también está provisto de un detector para detectar la ubicación del componente en el canal de difusión. Esto se describirá más detalladamente a continuación.

En una modalidad, el dispositivo de fluido está provisto de una sección transversal grande aguas arriba y en comunicación fluida con el canal de difusión. El uso de una sección transversal grande está destinado a minimizar el estancamiento de fluido en el dispositivo y minimizar la región de desarrollo del flujo que se extiende desde el punto de estancamiento, permitiendo así que se forme un flujo estable en un tiempo reducido.

El canal de sección grande es la región donde el flujo del fluido del componente trazador se pone en contacto con el flujo del fluido de muestra. A continuación, los flujos son dirigidos por el canal de sección transversal grande hacia el canal de difusión. Es en el canal de difusión donde se controla la difusión del componente trazador en el flujo de la muestra. El canal de sección transversal grande está en comunicación fluida con el canal de difusión. Cuando está presente un canal de sección transversal grande, el canal de difusión puede ser sustancialmente recto y en línea con el canal de sección transversal grande.

El canal de sección grande se puede denominar boquilla convergente.

El canal de sección transversal grande puede tener una región de ancho máximo sustancialmente constante seguida aguas abajo por una región convergente donde el ancho del canal se estrecha hasta que el ancho coincide con el del canal de difusión.

Alternativamente, el canal de sección transversal grande puede comprender solo una región convergente, donde el ancho del canal se estrecha desde un ancho máximo hasta que el ancho coincide con el del canal de difusión.

La tasa a la que se estrecha la región convergente puede ser constante.

La tasa precisa a la que se estrecha la región convergente (el ángulo de la boquilla) no está particularmente limitada ya que el estrechamiento suele estar muy alejado del flujo del componente. Sin embargo, generalmente los presentes inventores han descubierto que las boquillas tienen un ángulo en el rango de 40° a 70°, tal como 50° a 70°, tal como 55° a 65°. Aquí, el ángulo es con respecto a la dirección de flujo del flujo del componente trazador en el canal de sección transversal ancha.

El ancho máximo, w, del canal de sección transversal grande es mayor que el ancho del canal de difusión.

En una modalidad, no hay sección en el canal de sección transversal grande que tenga un ancho menor que el ancho del canal de difusión. En una modalidad, el ancho mínimo del canal de sección transversal grande es el mismo que el ancho del canal de difusión.

El ancho máximo, w del canal de sección grande puede ser como máximo 500 pm, como máximo 700 pm, como máximo 1000 pm, como máximo 2000 pm, como máximo 5000 pm o como máximo 10 000 pm. Generalmente, los anchos de canal de más de 10 000 pm no son prácticos, ya que es probable que el material del que está hecho el dispositivo, típicamente PDMS, se combe.

El ancho máximo, w, del canal de sección grande puede ser de al menos 50 pm, al menos 100 pm, al menos 200 pm o al menos 500 pm.

En una modalidad, el ancho máximo del canal de sección transversal grande puede estar en un rango seleccionado entre los valores superior e inferior mencionados anteriormente. Por ejemplo, el ancho puede estar en el rango de 200 a 5000 pm, como de 200 a 1000 pm, o como de 1000 a 5000 pm.

La longitud del canal de sección grande es como máximo 500 pm, como máximo 700 pm o como máximo 1000 pm. La longitud del canal de sección grande es de al menos 10 pm, al menos 50 pm, al menos 100 pm o al menos 200 pm. En una modalidad, la longitud del canal de sección transversal grande puede estar en un rango seleccionado de los valores superior e inferior dados anteriormente. Por ejemplo, la longitud puede estar en el rango de 50 a 500 pm, tal como de 100 a 500 pm.

Donde el canal de sección transversal grande comprende una región de ancho máximo sustancialmente constante y una región aguas abajo donde el ancho converge con el ancho del canal de difusión, la región de ancho máximo sustancialmente constante puede ser al menos 50 %, al menos 60 %, en al menos el 70 %, al menos el 80 % o al menos el 90 % de la longitud total del canal de sección transversal grande.

En una modalidad, el ancho máximo del canal de sección grande es al menos 1,2 veces, al menos 1,5 veces, al menos 2 veces, al menos 5 veces, o al menos 10 veces el ancho del canal de difusión.

En una modalidad, el ancho máximo del canal de sección grande es como máximo 20 veces, como máximo 50 veces, como máximo 100 veces el ancho del canal de difusión.

En una modalidad, el ancho máxima del canal de sección transversal grande en relación con el canal de difusión puede estar en un rango seleccionado entre los valores superior e inferior mencionados anteriormente. Por ejemplo, el ancho máximo del canal de sección transversal grande puede estar en el rango de 5 a 20 veces el ancho del canal de difusión.

La longitud del canal de sección grande es la distancia desde el punto en el que los flujos de fluido de la muestra y del componente trazador entran en contacto hasta el punto en el que el ancho del canal del canal de sección grande coincide con el del canal de difusión. El canal de difusión recibe la muestra y el flujo de fluido del componente trazador desde el canal de sección transversal grande.

Detección

Los métodos de la invención incluyen la etapa de determinar la distribución lateral del componente trazador a través del canal de difusión. No existen restricciones particulares sobre la forma en que se mide la difusión de un componente trazador en el flujo de la muestra, y el método de detección empleado se puede basar en el componente trazador a detectar.

El detector es adecuado para usarlo con canales de flujo de fluido y, en particular, canales de microfluidos. Los métodos de detección por difusión son bien conocidos en la técnica y fueron descritos, por ejemplo, por Kamholz y otros (Biophysical). Los ejemplos incluyen métodos espectroscópicos UV-vis, fluorescentes o luminiscentes, entre otros.

La distribución lateral del componente trazador se puede determinar en un lugar del canal de difusión. Aquí, la medición de diferentes tiempos de difusión se puede lograr variando el caudal de los fluidos en el canal de difusión.

La distribución del componente se puede determinar en dos o más, como tres, cuatro o cinco, ubicaciones a lo largo del canal de difusión. Como se señaló anteriormente, el método puede incluir la etapa de determinar el perfil de difusión del componente en una pluralidad de ubicaciones en el canal de difusión.

Se debe registrar al menos una medición de difusión antes de que el componente trazador se haya difundido hacia el borde del canal que es el límite del dispositivo al flujo de fluido de muestra. Se apreciará que un componente trazador pequeño se difundirá rápidamente hasta el borde del canal, mientras que un componente trazador más grande requerirá más tiempo.

Cuando se realizan múltiples mediciones de difusión a lo largo del canal de difusión, la ubicación de cada una de las segundas y posteriores a lo largo del canal no está particularmente limitada. Normalmente, las mediciones posteriores se toman a distancias suficientemente mayores a lo largo del canal de difusión para dar perfiles de difusión de diferencias útiles con respecto a las mediciones anteriores.

Los métodos de la presente invención no requieren la separación del flujo de la muestra del flujo del componente. Por tanto, el perfil de difusión de uno o más componentes se puede medir mientras el flujo del componente y el flujo de la muestra están en contacto.

El componente trazador se puede seleccionar por su facilidad de detección. El componente trazador puede poseer funcionalidad en forma de un grupo químico que es detectable, por ejemplo, por espectroscopia estándar ÚV-vis, fluorescente o luminiscente.

Determinación de la viscosidad

En los métodos de la invención, el flujo de fluidos se produce en régimen laminar. Por ejemplo, los números de Reynolds generalmente son del orden de 1 x l0 -7. Como se señaló anteriormente, el transporte de componentes dentro de un canal de difusión se rige únicamente por movimientos de convección y de difusión. Esto se puede modelar fácilmente mediante las correspondientes ecuaciones de transportación de masa.

La comparación entre las simulaciones del modelo y los datos experimentales muestra que el coeficiente de difusión de un componente trazador se debe determinar con alta precisión. Puede encontrar una descripción detallada de las simulaciones de modelos y los procedimientos de ajuste en Arosio y otros (en imprenta) y también en la patente internacional núm. WO 2014/064438. Un ejemplo de ajuste de datos experimentales a teóricos se muestra en la Figura 3 del presente caso.

La adquisición de un gran número de perfiles de difusión es ventajosa: aumentar el contenido de información de las mediciones de difusión permite una estimación precisa del coeficiente de difusión. Por tanto, en los métodos de la invención, la difusión del componente se mide en una pluralidad de tiempos de difusión. Normalmente, la difusión del componente se mide en una pluralidad de ubicaciones a lo largo de un canal de difusión.

A partir del coeficiente de difusión aparente de un componente (D), la viscosidad (n) de un fluido se puede calcular de acuerdo con la relación de Stokes-Einstein como:

en donde T es la temperatura, k es la constante de Boltzmann y Rh es el radio hidrodinámico del componente trazador.

La medición de la viscosidad (n) se puede denominar medición de la viscosidad relativa (nr), que se define como la relación entre la viscosidad de un fluido de muestra dado (n) y la viscosidad del agua pura (no), como el agua milli-Q. Los valores de viscosidad se pueden determinar y acotar con respecto a la temperatura del fluido de muestra en el momento del experimento de difusión.

Otras preferencias

Todas y cada una de las combinaciones compatibles de las modalidades descritas anteriormente se describen explícitamente en el presente documento, como si todas y cada una de las combinaciones se describieran individual y explícitamente.

Varias modalidades adicionales de la presente invención resultarán evidentes para los expertos en la técnica a la vista de la presente descripción.

Cuando en esta descripción se utiliza "y/o" se debe tomar como descripción específica de cada una de las dos características o componentes especificados con o sin el otro. Por ejemplo, "A y/o B" se debe tomar como descripción específica de cada uno de (i) A, (ii) B y (iii) A y B, como si cada uno se estableciera individualmente en el presente documento.

A menos que el contexto indique lo contrario, las descripciones y definiciones de las características expuestas anteriormente no se limitan a ninguna modalidad particular de la invención y se aplican igualmente a todas las modalidades descritas.

A continuación se describirán algunas modalidades de la invención a modo de ejemplo tomando como referencia las figuras descritas anteriormente.

Experimentos

Materiales

Nanopartículas de poliestireno fluorescente con diámetros nominales de 47 nm (verde) o 100 nm (rojo) y densidad de 1,06 kg/dm3 fueron suministrados por ThermoFisher Scientific (Reino Unido). Los máximos de excitación y emisión fueron 468 y 508 nm para las partículas verdes y 542 y 612 nm para las partículas rojas, respectivamente. Sigma Aldrich (EE.UU.) suministró glicerol y albúmina de suero bovino (BSA). Todas las soluciones acuosas se prepararon en agua milli-Q. La concentración de las nanopartículas de la sonda fue de 0,05 % en peso.

Dispositivo de microfluido

Se preparó un dispositivo de microfluidos de acuerdo con el diseño del dispositivo que se muestra en las Figuras 1a y 1b. La Figura 1a muestra una parte del dispositivo de la Figura 1b.

El dispositivo de microfluidos 1 tiene un canal de difusión 2 enrollado para contener el flujo laminar del flujo de la muestra y el flujo del componente trazador (en la Figura 1b solo se muestra una parte del canal de difusión). En el extremo aguas abajo del canal de difusión 2 se puede proporcionar un colector 3 para recoger la muestra de fluido. El colector 3 puede ser el depósito de una bomba de jeringa, para extraer fluido a través del dispositivo. Alternativamente, el extremo aguas abajo del canal de difusión 2 puede estar en comunicación fluida con otro dispositivo analítico de microfluidos.

El canal de difusión 2 está adaptado para permitir que se tomen mediciones de la difusión en una o más posiciones a lo largo del canal. Cuando hay múltiples posiciones para registrar la difusión del componente trazador, cada posición corresponde a un tiempo de difusión diferente. La posición del componente trazador a través del canal se puede determinar usando técnicas espectroscópicas estándar, incluidas, por ejemplo, técnicas fluorescentes. El aparato para determinar la posición del componente trazador no se muestra en las Figuras 1a y 1b.

Aguas arriba del canal de difusión 2 hay un canal de sección transversal grande 4, que tiene una sección transversal mayor que el canal de difusión. El canal de sección transversal grande está ahusado en su extremo aguas abajo donde está en comunicación fluida con el canal de difusión 2. El canal de sección transversal grande 4 se puede denominar boquilla.

El canal de sección transversal grande 4 está en comunicación fluida con tres canales de suministro 5, 6, 7 que se encuentran en una unión en el extremo aguas arriba de la boquilla. El canal de sección transversal grande 4 se proporciona para establecer un flujo estable del flujo del componente trazador y el flujo de la muestra. El canal de sección transversal grande 4 asegura que haya una permanencia (estancamiento) mínima del componente trazador en la unión.

El canal de sección transversal grande 4 está provisto de un canal 5 de suministro central para el suministro del flujo del componente trazador, y dos canales 6, 7 de suministro flanqueadores a cada lado del canal 5 de suministro central para el suministro de flujos de muestra.

Aguas arriba del canal de suministro central 5 hay un depósito 8, que contiene el fluido del componente trazador, que es una parte del fluido de muestra que comprende además un componente trazador. Aguas arriba de los canales de suministro flanqueadores 6, 7 hay un depósito común 9, que contiene una parte del fluido de muestra. Alternativamente, cada uno de los canales de suministro flaqueadores 6, 7 puede ser alimentado por un depósito separado, cada uno de los cuales contiene partes del fluido de muestra.

Durante el uso, los fluidos de muestra y los fluidos del componente trazador pueden fluir a través de sus respectivos canales de suministro 5, 6, 7 y entrar en contacto en la unión del canal de sección transversal grande 4.

En la unión en el extremo aguas arriba del canal de sección transversal grande 4, los flujos de muestra se proporcionan a ambos lados del flujo del componente trazador. Se permite que los flujos fluyan aguas abajo hacia el canal de difusión 2.

El flujo de fluidos a través del dispositivo 1 se puede controlar mediante una bomba de jeringa colocada en el extremo aguas abajo del canal de difusión 2. Por tanto, la bomba de jeringa se puede usar para extraer fluido a través del dispositivo desde los depósitos de suministro 8, 9.

Alternativamente, cada uno de los depósitos 8, 9 pueden ser depósitos de bombas de jeringa. Por tanto, cada bomba de jeringa puede impulsar fluido a través del dispositivo desde los depósitos de suministro. En este caso, los caudales del flujo de la muestra y el flujo del componente trazador se pueden variar independientemente.

Se fabricó un dispositivo de microfluidos con el diseño que se muestra en la Figura 1b mediante la técnica de litografía blanda estándar, mediante la fundición de polidimetilsiloxano (PDMS) (kit Sylgard 184; Dow Corning) en una oblea maestra, con curado a 65 °C durante 75 minutos, despegando el producto curado y uniéndolo a un portaobjetos de vidrio después de la activación con plasma. La altura del canal fue de 25 pm. El ancho del canal fue de 300 pm en la región de detección (canal de difusión), 3000 pm en la boquilla (canal de sección transversal grande) y 100 pm en las resistencias hidrodinámicas (canales de suministro) que introducen tampón y analito en la boquilla.

El flujo en el canal se controló aplicando presión negativa en la salida con una bomba de jeringa externa (Cetoni neMESYS). La resolución de la técnica en un rango de viscosidad dado se puede optimizar fácilmente controlando el tiempo de permanencia en el canal ajustando el caudal. La selección del tiempo de permanencia se optimizó para tener suficiente transporte de difusión en el canal para proporcionar información significativa sobre la difusividad y, al mismo tiempo, evitar la difusión del analito hacia el lado del canal, punto en el que se pierde información sobre el movimiento de difusión.

Los fluidos se iluminaron usando una fuente de luz LED (Cairn Research) equipada con conjuntos de filtros adecuados (Chroma Technology Corporation, Bellows Falls, VT, EE.UU.) para el fluoróforo específico. En particular, el rango de excitación y emisión fue 450-490 nm y 500-550 nm (49002 ET-EGFP) para las nanopartículas verdes, y 624-654 nm y 668-718 nm (49009 ET-Cy5) para las nanopartículas rojas, respectivamente. Las imágenes se recolectaron en doce puntos diferentes a lo largo del canal en un rango de distancia de 10 a 100 mm usando un microscopio invertido (Zeiss Axio Observer D1) equipado con un sistema de iluminación fluorescente (Cairn Research OptoLED) y una cámara CCD enfriada (Photometrics Evolve 512). Los tiempos de exposición típicos estuvieron en el rango de 0,5 a 1 s.

Mediciones de la difusión de microfluidos

El método para determinar la viscosidad de la muestra se validó utilizando muestras acuosas que contenían cantidades variables de glicerol. La viscosidad de las muestras se determinó utilizando el dispositivo de microfluidos descrito anteriormente y mostrado esquemáticamente en la Figura 1b.

Se prepararon muestras acuosas que contenían de 0 a 50 % en peso de glicerol.

Los fluidos para el flujo de la muestra y el flujo del componente trazador se prepararon a partir de cada muestra acuosa. El flujo de la muestra fue simplemente un flujo de la muestra sin modificar. El flujo del componente trazador fue un flujo de la muestra acuosa, a la que se le había añadido un componente trazador (al 0,05 %).

Los valores de viscosidad se determinaron a partir de mediciones de difusión realizadas a 20 °C utilizando nanopartículas de 47 nm como componente trazador dentro del flujo del componente trazador. El caudal para el flujo combinado (de convección) del flujo de la muestra y el flujo del componente trazador en el canal de difusión fue de 40 pLh o 5 pL/h para los experimentos en los que las concentraciones de glicerol eran menores o mayores de 40 % en peso, respectivamente.

Los perfiles de difusión de las nanopartículas de 47 nm se midieron en 12 ubicaciones a lo largo del canal de difusión, a una distancia de hasta aproximadamente 90 mm desde el extremo aguas arriba del canal de difusión. En la Figura 2 se muestran ejemplos de perfiles de difusión para muestras acuosas que contienen 10 % en peso (azul) y 50 % en peso (rojo) de glicerol. Como se esperaba, la difusión de las nanopartículas de 47 nm a lo largo del tiempo es más lenta para los flujos derivados de la muestra de glicerol al 50 % en peso de alta viscosidad. Los perfiles de difusión se midieron a 3,52 mm, 5,29 mm, 8,57 mm, 10,33 mm, 18,61 mm, 20,37 mm, 28,65 mm, 30,41 mm, 58,69 mm, 60,45 mm, 88,73 mm y 90,5 mm a lo largo del canal de difusión desde el punto en el que el canal de sección transversal grande converge en el canal de difusión.

La Figura 3 muestra imágenes del canal de difusión en cuatro ubicaciones diferentes a lo largo del canal. La difusión de las nanopartículas de 47 nm a lo largo del tiempo es observable claramente como la difusión de la señal detectable a través de la imagen. También se muestran los perfiles de difusión para cada una de las cuatro imágenes (línea continua en los perfiles de difusión) junto con los perfiles de difusión simulados para cada uno de los diferentes tiempos de difusión (línea discontinua en los perfiles de difusión). Los perfiles de difusión se midieron a 5,3 mm, 18,6 mm, 30,4 mm y 88,7 mm a lo largo del canal de difusión desde el punto en el que el canal de sección transversal grande converge en el canal de difusión. Se utilizó una solución de glicerol en agua al 10 % en peso.

El aumento de la viscosidad relativa (qr) de mezclas de agua-glicerol con contenido creciente de glicerol se muestra en la Figura 4 (en forma de círculos). Las mediciones de viscosidad de las mismas muestras determinadas por la dispersión dinámica de la luz (cuadrados) también se muestran en la Figura 4, junto con los valores de viscosidad informados en la literatura por Segur y otros (triángulos) y los valores de viscosidad determinados empíricamente informados por Cheng (línea discontinua). A continuación se describe con más detalle la dispersión dinámica de la luz.

Se utilizaron los mismos aparatos y técnicas para determinar la viscosidad de soluciones que tienen concentraciones variables de albúmina de suero bovino (BSA). Se prepararon muestras que contenían de 0 a 100 mg/ml de BSA en tampón fosfato 20 mM a pH 7,0. Para cada una de las soluciones de BSA, se realizaron mediciones a 25 °C utilizando nanopartículas de 100 nm, aplicando un caudal de 40 pL/h.

Al igual que con las muestras de glicerol, se midieron los perfiles de difusión de las nanopartículas de 47 nm en 12 ubicaciones a lo largo del canal de difusión, a una distancia de hasta aproximadamente 90 mm desde el extremo aguas arriba del canal de difusión.

El aumento de la viscosidad relativa (r|^r) de mezclas de agua-BSA con un contenido creciente de BSA se muestra en la Figura 5 (en forma de círculos). Las mediciones de viscosidad de las mismas muestras determinadas por la dispersión dinámica de la luz (cuadrados) también se muestran en la Figura 5.

De los experimentos de BSA, se deduce que los métodos descritos en este documento son particularmente atractivos para medir la viscosidad de soluciones de proteínas en estudios biotecnológicos y biológicos.

Es probable que una muestra de fluido, como una muestra de fluido biológico, contenga componentes, como proteínas o agregados de proteínas, que tengan un tamaño similar al de los componentes trazadores utilizados para determinar la viscosidad.

Los métodos de la invención se pueden usar para determinar la viscosidad de una muestra y en gran medida independientemente del tamaño del componente trazador y del tamaño de los componentes dentro de la muestra de fluido.

No ocurre lo mismo con los experimentos de dispersión dinámica de luz. Por el contrario, la presencia de componentes, como agregados, que tienen un tamaño similar al de los componentes trazadores puede comprometer la aplicación de técnicas basadas en la detección de dispersión de luz dinámica convencional.

Esto se puede ver en experimentos simples de intensidad de dispersión de luz dinámica para muestras que contienen BSA junto con partículas de 47 nm o 100 nm. En este caso, las muestras contenían 100 mg/ml de BSA en tampón fosfato 20 mM a pH 7,0 y las partículas se proporcionaron al 0,05 % en peso. La distribución del tamaño de la intensidad de cada solución se midió mediante dispersión dinámica de luz. Los resultados se muestran en la figura 6.

Cuando el componente trazador no es lo suficientemente más grande que las moléculas de proteína (Figura 6a), las señales de dispersión de luz de proteínas y nanopartículas son enrevesadas. En este caso, el tamaño exacto del pico correspondiente a las nanopartículas y, por lo tanto, la estimación de la viscosidad de la solución, es complicada.

De hecho, el diámetro aparente de las nanopartículas estimado en la distribución del tamaño de intensidad en la Figura 6a es 103,97 ± 0,34 nm, lo que da una viscosidad relativa de 2,21. Esto difiere del valor de 1,73 determinado por los métodos de la invención y del valor de 1,77 determinado por dispersión de luz dinámica utilizando partículas trazadoras más grandes (Figura 6b).

Esta limitación se puede aliviar aumentando la intensidad de la señal de dispersión de luz del componente trazador, por ejemplo, aumentando el tamaño o la concentración del componente. Sin embargo, este procedimiento de optimización puede resultar complicado en situaciones en las que se desconoce la composición de la solución.

Como se señaló anteriormente, los métodos de la invención son en gran parte insensibles al tamaño del componente trazador y a la composición de la mezcla.

Dispersión dinámica de la luz

Las mediciones de dispersión dinámica de luz (DLS) se realizaron en un instrumento Zetasizer Nano (Malvern, Reino Unido) que funciona con el modo de retrodispersión a 163°, equipado con una fuente de luz con una longitud de onda de 633 nm. La viscosidad de las mezclas de agua-glicerol se evaluó midiendo el coeficiente de difusión aparente de las partículas de 47 nm, mientras que para las soluciones de BSA se consideraron coloides de 100 nm, ya que la señal de dispersión de las partículas de 47 nm se enrevesó con la señal de las moléculas de proteína.

Dispositivos en serie y en paralelo

Los métodos de la invención se pueden combinar convenientemente con otros métodos de análisis de fluidos. Por tanto, el flujo de fluido laminar que comprende el flujo de la muestra y el flujo del componente se puede dirigir a un dispositivo de microfluido adicional después de que se hayan medido los perfiles de difusión necesarios. Por tanto, el extremo aguas abajo del canal de difusión puede estar en comunicación fluida con un segundo dispositivo de fluido, tal como un segundo dispositivo analítico. El segundo dispositivo analítico se puede usar para determinar una propiedad adicional del fluido de muestra usando técnicas de fluido.

Los presentes inventores han descrito previamente el uso de técnicas de fluido para determinar la composición de una muestra de fluido y el tamaño de los componentes dentro de ese fluido (ver, por ejemplo, la patente internacional núm. WO 2014/064438), la masa de componentes dentro de un líquido (ver, por ejemplo, la patente internacional núm. WO 2015/071681) y la relación carga-tamaño de los componentes dentro de un líquido (ver, por ejemplo, la patente internacional núm. WO 2015/071683).

Por ejemplo, la medición del tamaño de un analito utilizando técnicas de difusión fluídica requiere un conocimiento preciso de la viscosidad de la muestra de fluido que contiene el analito.

En una etapa preliminar, la viscosidad de una muestra de fluido se puede determinar mediante los métodos del presente caso. Por tanto, como se explicó anteriormente, se añade un componente trazador a una parte del fluido de muestra y se permite que el componente trazador se difunda en una parte separada del fluido de muestra.

Posteriormente, la muestra de fluido se lleva a un segundo dispositivo de difusión donde se puede estudiar la difusión de un analito dentro o fuera del fluido. De esta manera, se puede determinar el tamaño del analito, como el radio hidrodinámico.

En un método, la viscosidad del fluido de muestra se determina sin el analito presente. Por ejemplo, la muestra de fluido puede ser una solución tampón que contenga desnaturalizantes o co-solutos a altas concentraciones. El analito, tal como una proteína, se puede añadir al fluido de muestra y se puede medir la difusión de ese analito en el fluido de muestra sin el analito. Los perfiles de difusión recodificados aquí permiten determinar el tamaño del analito.

La figura 7 es un esquema que muestra la disposición de dos dispositivos de fluido en línea. Cada dispositivo tiene un primer canal de difusión para determinar la viscosidad de una muestra de fluido, y un segundo canal de difusión aguas abajo para determinar el tamaño de un analito agregado a la muestra de fluido. Una parte del fluido en el extremo aguas abajo del canal de difusión se separa y se desvía hacia el canal de difusión del segundo dispositivo, donde se permite que entre en contacto con una muestra de fluido que contiene el analito.

Por tanto, la Figura 7a muestra un dispositivo de fluido 11, que tiene un primer canal de difusión 12, que es alimentado por los canales de suministro aguas arriba 13 y 14. Un canal de suministro 13 suministra un flujo de una muestra de fluido que tiene una viscosidad desconocida, mientras que el segundo canal de suministro 14 suministra un flujo de la muestra de fluido que además comprende un componente trazador de tamaño conocido, tal como una nanopartícula estándar. Este fluido es el fluido del componente trazador. Se permite que los flujos del fluido de muestra y el fluido del componente trazador entren en contacto en la región aguas arriba del canal de difusión 12, y se genera un flujo laminar. A medida que el flujo de fluido pasa por el canal de difusión, se permite que el componente trazador se difunda desde el flujo del componente trazador al flujo de fluido de muestra. La difusión del componente trazador se mide en una o más ubicaciones a lo largo del canal de difusión 12. A partir de estas mediciones, se puede determinar la viscosidad del fluido de muestra.

En el extremo aguas abajo del canal de difusión 12, una parte del flujo laminar, tal como una parte del flujo del fluido de muestra, se desvía a un segundo canal de difusión 15, a través de un canal de suministro 16. El segundo canal de difusión 15 es alimentado por el canal de suministro de aguas arriba 16 y un canal de suministro adicional 17, que suministra un flujo de una muestra de fluido que tiene un analito con un radio hidrodinámico desconocido. Este último flujo es el flujo de analito. Se permite que el flujo de analito y el flujo de fluido desviado del primer canal de difusión 12 entren en contacto en la región aguas arriba del segundo canal de difusión 15, y se genera un flujo laminar. A medida que el flujo de fluido pasa por el segundo canal de difusión 15, se permite que el analito se difunda desde el flujo de analito hacia el flujo de fluido desviado de la primera difusión. La difusión del analito se mide en una o más ubicaciones a lo largo del segundo canal de difusión 15. A partir de estas mediciones, se puede determinar el radio hidrodinámico del analito.

El dispositivo de la Figura 7a es un esquema de un dispositivo de dos canales, donde cada canal de difusión 12, 15 está provisto de dos canales de suministro aguas arriba 13, 14, 16, 17. La figura 7b es un esquema de un dispositivo 21 de tres canales, donde cada canal de difusión 22, 25 está provisto de tres canales de suministro aguas arriba. En un dispositivo de tres canales se genera un flujo laminar en el canal de difusión 22, 25, que tiene un flujo de fluido central con dos flujos flaqueadores. El componente, como el componente trazador o el analito, cuya difusión se va a estudiar, está contenido dentro del flujo central. Los flujos flaqueadores contienen el flujo de la muestra o el flujo de analito. Una parte del flujo de un primer canal de difusión 22 se suministra como flujo central para un segundo canal de difusión 25. Como antes, el primer canal de difusión 22 es para controlar la difusión con el fin de determinar la viscosidad del fluido, y el segundo canal de difusión 25 es para controlar la difusión con el fin de determinar un radio hidrodinámico del analito.

El primer canal de difusión 22 es alimentado por los canales de suministro flaqueadores 23 aguas arriba y el canal de suministro central 24 aguas arriba. Los canales de suministro 23 suministran flujos de muestra de fluido que tienen una viscosidad desconocida, mientras que el canal de suministro central 24 suministra un flujo de la muestra de fluido que adicionalmente comprende un componente trazador de tamaño conocido, tal como una nanopartícula estándar. Se permite que los flujos del fluido de muestra y el fluido del componente trazador entren en contacto en la región aguas arriba del canal de difusión 22, y se genera un flujo laminar.

A medida que el flujo de fluido pasa por el canal de difusión 22, se permite que el componente trazador se difunda desde el flujo del componente trazador central hacia cada uno de los flujos de fluido de muestra flaqueadores. La difusión del componente trazador se mide en una o más ubicaciones a lo largo del primer canal de difusión 22. A partir de estas mediciones, se puede determinar la viscosidad del fluido de muestra.

Una parte del flujo laminar del primer canal de difusión 22 se desvía al segundo canal de difusión 25 a través de canales de suministro flanqueadores 26. Se proporciona un flujo central que contiene un analito de radio hidrodinámico al segundo canal de difusión 25 desde el canal de suministro central 27. Se permite que los flujos del fluido de muestra desviado y el fluido del analito entren en contacto en la región aguas arriba del canal de difusión 25, y se genera un flujo laminar. A medida que el flujo de fluido pasa por el canal de difusión 25, se permite que el analito se difunda desde el flujo de analito central hacia cada uno de los flujos de fluido flaqueadores. La difusión del analito se mide en una o más ubicaciones a lo largo del segundo canal de difusión 25. A partir de estas mediciones se puede determinar el radio hidrodinámico.

La figura 8 es un esquema de dispositivos fluídicos para determinar la viscosidad de una muestra de fluido y el tamaño de un analito en paralelo. La figura 8a es un esquema de un dispositivo de dos canales y la figura 8b es un esquema de un dispositivo de tres canales.

La configuración experimental del dispositivo paralelo es similar a la utilizada en los dispositivos en serie descritos anteriormente. En el dispositivo en paralelo, el fluido de un canal de difusión no se desvía a otro canal de difusión. Las mediciones de difusión para la determinación de la viscosidad y la determinación del radio hidrodinámico se realizan en paralelo. Las mediciones de viscosidad son las descritas anteriormente para el dispositivo en tándem. Para las mediciones del radio hidrodinámico, el fluido de muestra no se proporciona desde el canal de difusión para mediciones de viscosidad, sino que se suministra directamente al canal de difusión para mediciones de radio hidrodinámico.

Referencias

US 5948684

WO 2014/064438

WO 2015/071681

WO 2015/071683

M. T. Valentine, P. D. Kaplan, D. Thota, J. C. Crocker, T. Gisler, R. K. Prud'homme, M. Beck y D. A. Weitz, Physical Review E, 2001,64.

Y. Tseng, T. P. Kole y D. Wirtz, Biophysical Journal, 2002, 83, 3162-3176.

T. G. Mason, H. Gang y D. A. Weitz, journal of the Optical Society of America a-Optics Image Science and Vision, 1997, 14, 139-149.

F. He, G. W. Becker, J. R. Litowski, L. 0. Narhi, D. N. Brems and V. I. Razinkov, Analytical Biochemistry, 2010, 399, 141­ 143.

A. Palmer, T. G. Mason, J. Y. Xu, S. C. Kuo y D. Wirtz, Biophysical journal, 1999, 76, 1063-1071.

A. B. Goins, H. Sanabria y M. N. Waxham, Biophysical journal, 2008, 95, 5362-5373.

A. E. Kamholz, B. H. Weigl, B. A. Finlayson y P. Yager, Analytical Chemistry, 1999, 71, 5340-5347.

A. E. Kamholz, E.A. Schilling, y P. Yager. Biophysical Journal, 80(4):1967-1972, 2001.

J. B. Segur y H. E. Oberstar, Industrial and Engineering Chemistry, 1951, 43, 2117-2120.

Claims (16)

1. REIVINDICACIONES

   i. Un método para medir la viscosidad de una muestra de fluido, el método que comprende las siguientes etapas:

   (ii) proporcionar un primer flujo de la muestra de fluido;

   (iii) proporcionar un flujo de componentes, en donde el flujo de componentes es un segundo flujo de la muestra de fluido que comprende además un componente trazador;

   (iv) generar un flujo laminar del primer flujo con el segundo bajo en un canal de difusión, tal como un canal de difusión de microfluido;

   (iv) medir la difusión lateral del componente trazador a través de los flujos; y

   (v) determinar la viscosidad del fluido a partir del perfil de difusión medido,

   en donde el tamaño del componente trazador se conoce o se determina.
2. 2. El método de la reivindicación 1, que comprende la etapa preliminar (i) de agregar un componente trazador a una parte de la muestra de fluido.
3. 3. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la etapa (iv) es medir la difusión lateral del componente trazador a través de los flujos en una pluralidad de tiempos de difusión.
4. 4. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el componente trazador es fluorescente y la difusión lateral del componente se mide por fluorescencia.
5. 5. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el canal es un canal de microfluidos.
6. 6. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el primer flujo y el segundo flujo se ponen en contacto en un canal de sección transversal grande, y se permite que los flujos en contacto fluyan desde el canal de sección transversal grande hacia el canal de difusión.
7. 7. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la etapa (ii) proporciona dos flujos de la muestra de fluido, y los flujos de fluido de muestra se ponen en contacto con y se proporcionan a ambos lados del flujo de fluido que comprende el componente trazador.
8. 8. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el componente tiene un radio, tal como un radio hidrodinámico, en el rango de 0,5 a 200 nm, tal como 0,5 a 100 nm.
9. 9. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el flujo del componente es un flujo de la muestra de fluido que comprende además un componente trazador, y el componente trazador está presente en 0,2 % en peso o menos.
10. 10. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el componente es sustancialmente monodisperso.
11. 11. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el componente es una molécula polimérica.
12. 12. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la muestra de fluido es una muestra acuosa.
13. 13. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la muestra de fluido comprende uno o más componentes.
14. 14. El método de la reivindicación 13, en donde la muestra de fluido comprende un componente que tiene un grupo polipéptido, polinucleótido o polisacárido.
15. 15. El método de la reivindicación 13 o la reivindicación 14, en donde la muestra de fluido comprende un componente que tiene un radio, tal como un radio hidrodinámico, en el rango de 0,5 a 200 nm, tal como 0,5 a 100 nm.
16. 16. El método de cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en donde el componente trazadortiene un radio, tal como un radio hidrodinámico, que es de 10 % a 200 % del radio de un componente en la muestra de fluido.