ES2857551T3 - Calibración de anticoagulante lúpico - Google Patents
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Abstract
Material calibrador que se compone de plasma que, en comparación con plasma normal humano, presenta una deficiencia en al menos un factor de coagulación del grupo factor II y factor X, en el que el plasma, en comparación con plasma normal humano, contiene 0 % de factor II y/o 0 % de factor X y asimismo al menos una sustancia desencadenante de anticoagulante lúpico.
Description
DESCRIPCIÓN
Calibración de anticoagulante lúpico
La invención pertenece al campo del diagnóstico de la coagulación y se refiere a un material calibrador para la calibración de pruebas de coagulación que sirven para la detección de anticoagulante lúpico.
Los anticoagulantes lúpicos son inmunoglobulinas y pertenecen al grupo de autoanticuerpos adquiridos. Provocan el síndrome antifosfolipídico (SAF), una de las enfermedades autoinmunitarias más comunes, y provocan trombosis, abortos espontáneos recurrentes así como complicaciones del embarazo. Las inmunoglobulinas anticoagulantes lúpicos son los denominados anticuerpos antifosfolipídicos (APA) que se unen a fosfolípidos aniónicos, a proteínas o a complejos de proteína/fosfolípido. Los anticuerpos antifosfolipídicos, que forman complejos con determinadas proteínas y fosfolípidos, representan un grupo muy heterogéneo de autoanticuerpos que pueden dirigirse contra una pluralidad de antígenos, tales como por ejemplo contra la apolipoproteína p2-glicoproteína I (p2GPI), cardiolipina, protrombina, proteína C, proteína S, trombomodulina, factor XII y otros, así como contra complejos de estas proteínas con fosfolípidos.
Los denominados anticoagulantes lúpicos son anticuerpos antifosfolipídicos que, por definición, prolongan los tiempos de coagulación de determinadas pruebas de coagulación, por ejemplo de APTT. Paradójicamente, los anticoagulantes lúpicos provocan in vitro una inhibición de la reacción de coagulación mientras que in vivo una reacción de coagulación elevada (hipercoagulabilidad) se asocia con el síndrome antifosfolipídico (SAF).
El diagnóstico de laboratorio del síndrome antifosfolipídico (SAF) se dificulta por la heterogeneidad de los anticuerpos antifosfolipídicos. Para la detección directa de los anticuerpos se emplean procedimientos inmunológicos. En este sentido, no obstante, se detectan también muchos anticuerpos que in vivo no son protrombóticos. Para la detección indirecta de los anticuerpos se emplean pruebas de coagulación. En una prueba de coagulación, una muestra de plasma del paciente se mezcla normalmente con un activador de la coagulación, fosfolípidos e iones calcio, y se mide el tiempo hasta la formación de coágulo. En particular, pruebas que se basan en la determinación de DRVVT (tiempo de veneno de víbora de Russell diluido), muestran una correlación relativamente buena con la eficacia protrombótica de los anticuerpos antifosfolipídicos. El diagnóstico del lupus es muy costoso, porque cada muestra de paciente tiene que pasar por varias etapas de ensayo (para una descripción general: Devreese, K. y Hoylaerts, M.F., Challenges in the diagnosis of the antiphospholipid syndrome. Clin. Chem. 2010, 56(6): 930-940).
Normalmente, se examina una muestra de paciente para el diagnóstico de un anticoagulante lúpico con dos variantes de al menos una prueba de coagulación. En la primera variante sensible a anticoagulante lúpico, la prueba se lleva a cabo en presencia de una concentración de fosfolípidos relativamente baja; en la segunda, variante insensible a anticoagulante lúpico, se lleva a cabo la misma prueba en presencia de una concentración de fosfolípidos relativamente alta. Un tiempo de coagulación más largo en la primera variante de prueba con respecto a muestras normales (que no contienen anticoagulante lúpico) en combinación con un tiempo de coagulación normal en la segunda variante de prueba con respecto a muestras normales, habla de la presencia de anticoagulante lúpico.
El problema es que cada prueba de coagulación por sí sola no es específica del anticoagulante lúpico. Las pruebas también responden en diversos grados a las deficiencias de factor de coagulación o anticoagulantes terapéuticos en una muestra.
Una prueba que se utiliza con especial frecuencia es la prueba DRVVT, en donde la primera variante sensible a anticoagulante lúpico se lleva a cabo con un reactivo de activación con veneno de víbora de Russel y una concentración de fosfolípidos relativamente baja (reactivo de detección LA1) y la segunda variante insensible a anticoagulante lúpico se lleva a cabo con un reactivo de activación con veneno de víbora de Russel y una concentración de fosfolípidos alta (reactivo de confirmación LA2). Si la prueba LA1 es negativa, es decir, si no se mide un tiempo de coagulación superior al normal, la realización de la prueba de LA2 ya no es necesaria.
La formación de la relación LA1/LA2 (cociente) a partir de los dos resultados de prueba refleja la dependencia de los fosfolípidos de la prolongación del tiempo de coagulación de LA1 y, por lo tanto, es relativamente específica del anticoagulante lúpico. Sin embargo, las grandes deficiencias de factor de coagulación o altas concentraciones de anticoagulantes terapéuticos en una muestra también pueden influir en la relación, de modo que no es posible la detección específica de un anticoagulante lúpico.
Tanto la prueba de LA1 como la prueba de LA2, y por lo tanto también la relación LA1/IA2, pueden producir resultados de prueba que difieren considerablemente de un laboratorio a otro, de un analizador a otro, de un lote de reactivo a otro para una misma muestra. Esta variación en los resultados de prueba, que incidentalmente se aplica no solo a pruebas basadas en DRVVT, sino también a pruebas que se basan en la determinación de otros tiempos de coagulación, hace que sea difícil establecer un punto de decisión médica a partir del cual un resultado pueda clasificarse como patológico. Por lo tanto, es deseable la calibración de pruebas de anticoagulante lúpico basadas en
pruebas de coagulación.
Dado que una prueba de coagulación sensible a lupus está diseñada para detectar la presencia de anticoagulante lúpico, un material calibrador adecuado contendrá normalmente anticoagulante lúpico. Le Querrec y col. proponen para ello un conjunto de plasma normal al que se añaden dos inmunoglobulinas anticoagulantes lúpicos diferentes, un anticuerpo anti-p2-glicoproteína I y un anticuerpo anti-protrombina (Le Querrec, A. et al., Quantification of lupus anticoagulants in clinical samples using anti-p2-GP1 and anti-prothrombin monoclonal antibodies. Thromb Haemost 2001, 86: 584-589). En el documento EP-A2-0898168, se añade una anexina a una matriz de plasma para simular el anticoagulante lúpico.
No obstante, pruebas de coagulación insensibles a anticoagulante lúpico también muestran resultados de prueba variables influenciados por los diversos factores que influyen, de modo que también sería deseable una calibración para ello. Idealmente, debería estar disponible un único material de calibración tanto para la prueba sensible a anticoagulante lúpico como para la prueba insensible a anticoagulante lúpico para mantener lo más baja posible la complejidad durante el procesamiento.
Es decir, la presente invención se basaba en el objetivo de proporcionar un material calibrador adecuado para la calibración de pruebas de coagulación, en particular de pruebas de coagulación sensibles a anticoagulante lúpico y pruebas de coagulación insensibles a anticoagulante lúpico asociadas, que se llevan a cabo para la determinación de anticoagulantes lúpicos.
El objetivo se consigue por que se proporciona un material calibrador que se compone de plasma que, en comparación con plasma normal humano, presenta una deficiencia en al menos un factor de coagulación del grupo factor II y factor X, en el que el plasma, en comparación con plasma normal, contiene 0 % de factor II y/o 0 % de factor X y que asimismo contiene al menos una sustancia desencadenante de anticoagulante lúpico.
Se estableció que la calibración de resultados de prueba de pruebas de coagulación sensibles a anticoagulante lúpico y pruebas de coagulación insensibles a anticoagulante lúpico asociadas con una curva de calibración que se creó con materiales calibradores de acuerdo con la invención reduce las desviaciones de los resultados de prueba debidas a los lotes de reactivo así como al analizador y, por lo tanto, provoca una mejor comparabilidad de los resultados de prueba.
Es decir, es objeto de la presente invención un material calibrador tal como se describe en la reivindicación 1.
Un plasma que presenta una deficiencia en al menos un factor de coagulación siempre presenta una concentración de factor de coagulación menor que un plasma normal humano cuya concentración de factor de coagulación es por definición del 100 %. En el caso de un plasma que presenta una deficiencia en al menos un factor de coagulación, se trata preferentemente de plasma humano, de manera especialmente preferente de plasma normal de un donante sano o de un conjunto de plasma normal de plasmas normales de varios donantes sanos que no presentan un trastorno de coagulación obvio, al que se extrajeron por completo el uno o varios factores de coagulación, tal como, por ejemplo, factor II (protrombina) y/o factor X. Procedimientos conocidos para la producción de plasma deficiente en factor de coagulación son, por ejemplo, procedimientos cromatográficos de inmunoafinidad. Como alternativa, en el caso del plasma que presenta una deficiencia en al menos un factor de coagulación también puede tratarse de un plasma animal, tal como, por ejemplo, plasma bovino o plasma de conejo, o de una mezcla de plasma humano y animal.
De acuerdo con la invención, el plasma del que se compone el material calibrador presenta una deficiencia en factor II y/o factor X. Cuanto mayor sea la deficiencia del factor, mayor será la prolongación del tiempo de coagulación en pruebas de coagulación sensibles anticoagulante lúpico e insensibles a anticoagulante lúpico asociadas.
De acuerdo con la invención, el plasma, del que se compone el material calibrador, en comparación con plasma normal humano, contiene 0 % de factor II y/o 0 % de factor X.
Este plasma deficiente, del que se compone el material calibrador, contiene asimismo una sustancia desencadenante de anticoagulante lúpico. Por una "sustancia desencadenante de anticoagulante lúpico" se entiende, por un lado, sustancias que in vivo provocan un síndrome antifosfolipídico, es decir, anticuerpos antifosfolipídicos y, por otro lado, sustancias que fisiológicamente no son la causa de un síndrome antifosfolipídico, sino que únicamente simulan in vitro un anticoagulante lúpico porque, con respecto al diagnóstico in vitro, presentan las mismas propiedades funcionales que un anticoagulante lúpico, como por ejemplo anexinas. En el documento EP-A2-0898168, párrafo 0008 se describen los criterios funcionales para sustancias desencadenantes de anticoagulante lúpico in vitro.
Un material calibrador preferido se compone de plasma que contiene al menos un anticuerpo antifosfolipídico como sustancia desencadenante de anticoagulante lúpico. El plasma puede contener preferentemente dos, tres, cuatro o más anticuerpos antifosfolipídicos diferentes. El plasma contiene preferentemente uno, dos o más anticuerpos antifosfolipídicos del grupo anticuerpos anti-p2-glicoproteína I, anticuerpos anti-protrombina, anticuerpos anticardiolipina, anticuerpos anti-proteína C, anticuerpos anti-proteína S, anticuerpos anti-trombomodulina y anticuerpos anti-factor XII.
El anticuerpo respectivo está contenido preferentemente en una concentración de 0,5 a 500 |jg/ml en el plasma del que está compuesto el material calibrador.
Otro material calibrador preferido se compone de plasma que contiene al menos una anexina, preferentemente anexina V, como sustancia desencadenante de anticoagulante lúpico. La anexina respectiva está contenida preferentemente en una concentración de 0,5 a 500 jg/m l en el plasma del que está compuesto el material calibrador.
Un material calibrador de acuerdo con la invención especialmente preferido se compone de plasma del que se ha retirado por completo al menos un factor de coagulación (por ejemplo 0 % de factor II y/o 0 % de factor X) y que contiene al menos un anticuerpo antifosfolipídico en una concentración de 50 a 500 |jg/ml. Este material calibrador es adecuado como "material calibrador de origen" a partir del cual se pueden producir materiales calibradores de concentración de factor de coagulación en aumento sucesivo y concentración de anticuerpo en disminución sucesiva simultánea mediante la adición de plasma normal humano.
Otro objeto de la presente invención es un procedimiento para la producción de un material calibrador de acuerdo con la invención, en el que se añade al plasma que, en comparación con plasma normal humano, contiene 0 % de factor II y/o 0 % de factor X, una cantidad definida de al menos una sustancia desencadenante de anticoagulante lúpico. Otro objeto más de la presente invención es un conjunto de calibrador que contiene un primer recipiente que contiene un material calibrador de acuerdo con la invención y, opcionalmente, un segundo recipiente que contiene plasma normal humano. El material calibrador contenido en el primer recipiente es preferentemente el "material calibrador de origen" descrito anteriormente, a partir del cual se pueden producir materiales calibradores con una concentración de factor de coagulación que aumenta sucesivamente y una concentración de anticuerpo que disminuye sucesivamente al mismo tiempo añadiendo el plasma normal humano contenido en el segundo recipiente.
Como alternativa, un conjunto calibrador de acuerdo con la invención también puede contener dos, tres, cuatro o más recipientes, estando contenido en cada recipiente un material calibrador con una deficiencia de factor de coagulación definida y una concentración definida de una sustancia desencadenante de anticoagulante lúpico.
Los recipientes pueden ser tubos o frascos de vidrio o de plástico que contienen el material calibrador en forma líquida o liofilizada. En el caso de que estén previstos materiales de calibrador liofilizados, el conjunto de calibrador contiene preferentemente un recipiente adicional con un medio de solución, tal como por ejemplo una solución tampón o agua.
Tanto los materiales calibradores de acuerdo con la invención como los conjuntos de calibrador de acuerdo con la invención son adecuados para su uso para la calibración de pruebas de coagulación que se llevan a cabo para la determinación de anticoagulante lúpico. Pruebas de coagulación conocidas que se llevan a cabo para la determinación de anticoagulante lúpico son, por ejemplo, APTT, dAPTT, PT, dPT, KCT, dTT, tiempo de veneno de serpiente Taipán y DRVVT.
Otro objeto de la presente invención es un procedimiento para la calibración de pruebas de coagulación que se llevan a cabo para la determinación del anticoagulante lúpico. El procedimiento comprende las etapas:
a) llevar a cabo de una primera prueba de coagulación sensible a anticoagulante lúpico, determinándose el tiempo de coagulación de un plasma normal humano y el tiempo de coagulación de al menos un material calibrador de acuerdo con la invención;
b) llevar a cabo una segunda prueba de coagulación insensible a anticoagulante lúpico, determinándose el tiempo de coagulación del mismo plasma normal humano y el tiempo de coagulación del mismo material calibrador; c) crear una primera curva de calibración para la primera prueba de coagulación sensible a anticoagulante lúpico y una segunda curva de calibración para la segunda prueba de coagulación insensible a anticoagulante lúpico, asociándose a los tiempos de coagulación determinados en las etapas a) y b) valores en una unidad artificial.
En el caso de la "unidad artificial" puede tratarse de valores numéricos relativos que indican en el orden de magnitud las propiedades de prolongación del tiempo de coagulación de un material calibrador, por ejemplo, el valor 0 para un calibrador con una deficiencia de factor de coagulación total (por ejemplo, 0 % de factor X) y al mismo tiempo concentración muy alta sustancia desencadenante de anticoagulante lúpico y, por lo tanto, con propiedades de prolongación del tiempo de coagulación máximas; el valor 100 para plasma normal (con 100 % de factor X y sin sustancia desencadenante de anticoagulante lúpico) sin propiedades de prolongación del tiempo de coagulación; y valores entre 0 y 100 para calibradores que, en comparación con el calibrador 0, presentan concentraciones de factor de coagulación crecientes y concentraciones decrecientes de sustancia desencadenante de anticoagulante lúpico.
Preferentemente se determinan los tiempos de coagulación de al menos dos materiales calibradores de acuerdo con la invención, presentando el primer material calibrador una mayor deficiencia en un factor de coagulación y una mayor
concentración de la sustancia desencadenante de anticoagulante lúpico que el segundo material calibrador, y estando asociado al primer material calibrador un valor más bajo en una unidad artificial que al segundo material calibrador.
Otro objeto de la presente invención es un procedimiento para la determinación de anticoagulante lúpico en la muestra de plasma de un paciente. El procedimiento comprende las etapas:
a) llevar a cabo una primera prueba de coagulación sensible a anticoagulante lúpico, determinándose el tiempo de coagulación del plasma del paciente;
b) llevar a cabo una segunda prueba de coagulación insensible a anticoagulante lúpico, determinándose el tiempo de coagulación del mismo plasma del paciente;
c) determinar el valor asociado al tiempo de coagulación determinado respectivo en la unidad artificial en una curva de calibración correspondiente que se creó con un procedimiento de acuerdo con la invención;
d) formar el cociente a partir de los valores determinados para el plasma del paciente; y
e) establecer anticoagulante lúpico cuando el cociente formado supera un cociente de referencia predeterminado.
La formación de cociente (formación de relación) a partir de los dos resultados de prueba de coagulación es un modo de proceder habitual en el diagnóstico de anticoagulante lúpico. Se determina un cociente de referencia examinándose un número estadísticamente suficiente de muestras de pacientes positivos para anticoagulante lúpico y negativos para anticoagulante lúpico con la primera y segunda prueba de coagulación, se forman los cocientes y se determina un valor de cociente (valor límite, valor de corte), que permite una diferenciación lo más segura posible entre muestras de pacientes positivas para anticoagulante lúpico y negativas para anticoagulante lúpico.
Otro objeto de la presente invención es otro procedimiento para la calibración de pruebas de coagulación que se llevan a cabo para la determinación del anticoagulante lúpico. El procedimiento comprende las etapas:
a) llevar a cabo de una primera prueba de coagulación sensible a anticoagulante lúpico, determinándose el tiempo de coagulación de un plasma normal humano y el tiempo de coagulación de al menos un material calibrador de acuerdo con la invención;
b) llevar a cabo una segunda prueba de coagulación insensible a anticoagulante lúpico, determinándose el tiempo de coagulación del mismo plasma normal humano y el tiempo de coagulación del mismo material calibrador; c) formar el cociente de los tiempos de coagulación del plasma normal y formar el cociente de los tiempos de coagulación del material calibrador;
d) crear una curva de calibración, asociándose a los cocientes determinados en la etapa c) valores en una unidad artificial.
Aún otro objeto de la presente invención es un procedimiento adicional para la determinación de anticoagulante lúpico en la muestra de plasma de un paciente. El procedimiento comprende las etapas:
a) llevar a cabo una primera prueba de coagulación sensible a anticoagulante lúpico, determinándose el tiempo de coagulación del plasma del paciente;
b) llevar a cabo una segunda prueba de coagulación insensible a anticoagulante lúpico, determinándose el tiempo de coagulación del mismo plasma del paciente;
c) formar el cociente a partir de los tiempos de coagulación determinados para el plasma del paciente;
d) determinar el valor asociado al cociente respectivo en la unidad artificial en una curva de calibración correspondiente que se creó con el procedimiento de calibración descrito anteriormente; y
e) establecer anticoagulante lúpico cuando el valor determinado supera un valor de referencia predeterminado.
La determinación del valor de referencia tiene lugar de manera análoga a la determinación de un cociente de referencia descrita anteriormente.
En los procedimientos de calibración y procedimientos para la determinación de anticoagulante lúpico descritos, la primera prueba de coagulación sensible a anticoagulante lúpico y la segunda prueba de coagulación insensible a anticoagulante lúpico normalmente solo se diferencian en que se emplean más fosfolípidos en la segunda prueba de coagulación insensible a anticoagulante lúpico que en la primera prueba de coagulación sensible a anticoagulante lúpico.
Pruebas de coagulación que se sabe que son adecuadas para ello se seleccionan del grupo APTT, dAPTT, PT, dPT, KCT, dTT, tiempo de veneno de serpiente Taipán y DRVVT.
Descripción de las figuras
La figura 1 muestra las curvas de calibración creadas de acuerdo con la invención en un analizador de coagulación BCS para la prueba DRVVT sensible a anticoagulante lúpico (LA1), la prueba DRVVT insensible a anticoagulante lúpico (LA2) así como para la relación de los resultados de prueba de LA1 y LA2 (LAR)
("calibración MP+MAK"); los tiempos de coagulación de LA1 y LA2 medidos [s] o la relación (R) se representaron frente a unidades artificiales [U] de los materiales calibradores, en donde el valor 100 U representa un plasma normal y el valor 0 U representa un calibrador con 0 % de factor X y al mismo tiempo una concentración muy alta de anticoagulante lúpico-MAK.
La Figura 2 muestra curvas de calibración creadas en un analizador de coagulación BCS para la prueba DRVVT sensible a anticoagulante lúpico (LA1), la prueba DRVVT insensible a anticoagulante lúpico (LA2) así como para la relación de los resultados de prueba de LA1 y LA2 (LAR), aquellos con calibradores que, a diferencia de los calibradores de acuerdo con la invención, no presentaban deficiencia de factor de coagulación, sino que solo contenían el anticoagulante lúpico MAK ("calibración MAK"); los tiempos de coagulación de LA1 y LA2 medidos [s] o la relación (R) se representaron frente a las unidades artificiales [U] de los materiales calibradores, en donde el valor 100 U representa un plasma normal y el valor 0 U representa un calibrador con contenido de factor normal y al mismo tiempo, una concentración muy alta de anticoagulante lúpico-MAK.
Los siguientes ejemplos sirven para ilustración y no han de considerarse limitativos.
A continuación, la expresión "anticoagulante lúpico" se abrevia con "LA".
Ejemplos
EJEMPLO 1: Producción de calibradores de acuerdo con la invención
Para la producción del material calibrador de origen, se añadió un anticuerpo monoclonal anti-protrombina que simula al anticoagulante lúpico (anticuerpo 195/097 producido de acuerdo con el documento WO-A1-00/02925) a un plasma deficiente en factor X humano (0 % de factor X; Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH). Se añadieron 5 |jl de una solución de anticuerpos (16,49 mg/ml) a 1000 j l de plasma deficiente, de modo que el calibrador de origen (por definición 0 unidades artificiales) presenta una concentración de anticuerpo de 82,0 jg/m l y no contiene ningún factor X.
Para crear calibradores con una concentración creciente de factor X y una concentración decreciente de anticuerpos, se prepararon mezclas del calibrador de origen con plasma normal humano (plasma humano estándar; Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH) en distintas relaciones de mezcla.
EJEMPLO 2: Creación de curvas de calibración para una prueba de coagulación DRVVT sensible a LA (LA1) e insensible a LA (LA2)
Con los materiales calibradores descritos en el Ejemplo 1, se llevaron a cabo en cada caso una prueba de coagulación DRVVT sensible a LA (LA1) y una insensible a LA (LA2) con el reactivo de selección LA1 o con el reactivo de confirmación LA2 (Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH). Las pruebas se procesaron automáticamente en los aparatos de coagulación BCS y BCT (Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH). En el aparato BCS, se pipetearon 100 |jl de muestra y 100 |jl del reactivo de selección LA1 o del reactivo de confirmación lA2 (Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH) en diferentes cubetas del rotor y entonces se incubaron durante 230 segundos con el fin de controlar la temperatura. Después tuvo lugar el mezclado de muestra y reactivo y se inició la reacción. El comienzo de la coagulación se registró fotométricamente al superarse un umbral de turbidez y se emitió por el aparato como tiempo de coagulación [s]. En el aparato BCT, se añadieron 100 j l de muestra a la cubeta de medición, se incubó durante 60 segundos y se mezcló entonces con 100 j l del reactivo LA1 o LA2. El tiempo de coagulación [s] se registró asimismo fotométricamente. Para crear una curva de calibración, se representaron los resultados de prueba en función de las unidades artificiales de los materiales calibradores (véase la figura 1) y se almacenaron en el software del aparato.
EJEMPLO 3: Calibración específica del lote de reactivo y aparato de resultados de medición de DRVVT de muestras positivas para LA y negativas para LA
EJEMPLO 3a): Calibración del valor de medición de LA1 y LA2 en diferentes aparatos
Para examinar el efecto de compensación de valores de medición de una calibración de acuerdo con la invención (con los calibradores descritos en el ejemplo 1, "calibración MP+MAK") de una prueba de LA basada en DRVVT, se midieron distintas muestras positivas para lA y negativas para LA en dos analizadores automáticos diferentes (BCS y BCT Analyzer, Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH). Para la comparación, se llevó a cabo una calibración con calibradores que, a diferencia de los calibradores de acuerdo con la invención, no presentaban deficiencia de factor de coagulación (es decir, aproximadamente 100 % de factor X), sino sólo contenían los anticuerpos monoclonales anti-protrombina simuladores del anticoagulante lúpico (anticuerpo 195/097 en plasma normal humano (plasma humano estándar; Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH) ("calibración MAK"). Para crear una curva de
calibración, se representaron los resultados de prueba en función de las unidades artificiales de los materiales calibradores (véase la figura 2) y se almacenaron en el software del aparato.
La Tabla 1 muestra las diferencias relativas (%) entre los valores brutos medidos en los dos aparatos (tiempo de coagulación de LA1 en segundos) y entre los valores de LA1 calibrados (unidades artificiales [U]) para los distintos tipos de muestra:
• plasma humano estándar (SHP),
• control de plasma con actividad de LA relativamente baja (control LA bajo),
• control de plasma con actividad de LA relativamente alta (control LA alto),
• un plasma que se compone de una mezcla de 80 % de SHP y 20 % de plasma deficiente en factor X con 0 % de factor X (80 % de SHP 20 % de FX-MP),
• plasma normal y
• una muestra de paciente positiva para LA (muestra de LA).
Por medio del valor medio de las diferencias relativas entre los resultados de pruebas BCS y BCT, queda claro que las desviaciones en los valores LA1 entre los dos aparatos son más pequeñas cuando se lleva a cabo una calibración de acuerdo con la invención (calibración MP+MAK).
Tabla 1: Diferencias relativas de los tiempos de coagulación de LA1 antes y después de la calibración en dos analizadores diferentes
La Tabla 2 muestra las diferencias relativas (%) entre los valores brutos medidos en los dos aparatos (tiempo de coagulación de LA2 en segundos) y entre los tiempos de coagulación de LA2 calibrados (unidades artificiales [U]) para los mismos tipos de muestra que se muestran en la Tabla 1.
Por medio del valor medio de las diferencias relativas entre los valores de medición de BCS y BCT, queda claro que las desviaciones en los valores de medición de LA2 entre los dos aparatos son más pequeñas cuando se lleva a cabo una calibración de acuerdo con la invención (calibración MP+MAK). Dos valores brutos (para las muestras n.° 5 y 6) no se pudieron calibrar con la calibración MAK porque la curva de calibración mostró solo una dispersión muy pequeña en esta zona.
Tabla 2: Diferencias relativas de los tiempos de coagulación de LA2 antes y después de la calibración en dos analizadores diferentes
EJEMPLO 3b): Calibración del valor de medición de LA1 y LA2 con diferentes lotes de reactivos
Para examinar el efecto de compensación de valores de medición de una calibración de acuerdo con la invención (con los calibradores descritos en el ejemplo 1, "Calibración MP+MAK") de una prueba de LA basada en DRVVT, se midieron distintas muestras positivas para LA y negativas para LA con distintos lotes de los reactivos de DRVVT. La Tabla 3 muestra las diferencias relativas (%) entre los valores brutos (tiempo de coagulación de LA1 en segundos) medidos con los distintos lotes de reactivos (lotes 1-4) y entre los valores de lA 1 calibrados (unidades artificiales) para los distintos tipos de muestras:
• plasma humano estándar (SHP),
• control de plasma con actividad de LA relativamente baja (control LA bajo),
• control de plasma con actividad de LA relativamente alta (control LA alto),
• un plasma que se compone de una mezcla de 20 % SHP y 80 % de plasma deficiente en factor X con 0 % de factor X (20 % de SHP 80 % de FX-MP), y
• un plasma que se compone de una mezcla de 20 % SHP y 80 % de plasma deficiente en factor II con 0 % de factor II (20 % de SHP 80 % de FII-MP).
Por medio del valor medio de las diferencias relativas entre los valores de medición del lote 1 y los valores de medición de los lotes 2, 3 y 4, queda claro que las desviaciones de los valores de medición de LA1 entre los distintos lotes se reducen cuando se lleva a cabo una calibración de acuerdo con la invención (calibración MP+MAK).
Tabla 3: Diferencias relativas de los tiempos de coagulación de LA1 antes y después de la calibración entre diferentes lotes de reactivos de DRVVT
La Tabla 4 muestra las diferencias relativas (%) entre los valores brutos (tiempo de coagulación de LA2 en segundos) medidos con los distintos lotes de reactivos (lotes 1-4) y entre los valores de lA2 calibrados (unidades artificiales) para los mismos tipos de muestras que en la Tabla 3.
Por medio del valor medio de las diferencias relativas entre los valores de medición del lote 1 y los valores de medición de los lotes 2, 3 y 4, queda claro que las desviaciones de los valores de medición de LA2 entre los distintos lotes se reducen cuando se lleva a cabo una calibración de acuerdo con la invención (calibración MP+MAK).
Tabla 4: Diferencias relativas de los tiempos de coagulación de LA2 antes y después de la calibración entre
diferentes lotes de reactivos de DRVVT
EJEMPLO 3c): Calibración de la relación LA1/lA2 en diferentes aparatos
Para examinar el efecto de la compensación de los valores de la relación LA1/IA2 mediante una calibración de acuerdo con la invención, se llevaron a cabo dos variantes de la calibración de la relación (con los calibradores descritos en el ejemplo 1, "calibración MP+MAK") para una prueba de LA basada en DRVVT y para distintas muestras positivas para LA y negativas para LA en dos analizadores automáticos distintos (BCS y BCT Analyzer, Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH).
En la primera variante, se usaron valores de LA1 y LA2 ya calibrados de acuerdo con la invención (de acuerdo con el ejemplo 3a) para calcular la relación LA1/lA2 ("variante 1").
En la segunda variante, la relación LA1/lA2 se formó a partir de los valores brutos no calibrados de los tiempos de coagulación de LA1 y LA2 y entonces se leyó en una curva de calibración creada de antemano, en la se habían determinado relaciones LA1/lA2 de calibradores de composición conocida (con los calibradores descritos en el ejemplo 1, "calibración MP+MAK").
En la tabla 5 se muestran las diferencias relativas (%) entre las relaciones de los valores brutos medidos en los dos aparatos y entre las relaciones calibradas de acuerdo con la variante 1 y la variante 2 para los mismos tipos de muestra que se muestran en la tabla 1.
Si se observan las diferencias relativas individuales entre las relaciones BCS y BCT, queda claro que las desviaciones en las relaciones LA1/IA2 entre los dos aparatos son menores para la mayoría de las muestras cuando se lleva a cabo una calibración de acuerdo con la invención (calibración MP+MAK). Los valores medios son menos significativos en este caso, dado que en ambas variantes de calibración una muestra en cada caso dio un resultado muy diferente.
Tabla 5: Diferencias relativas de las relaciones LA1/lA2 antes y después de la calibración en dos analizadores diferentes
Claims (15)
1. Material calibrador que se compone de plasma que, en comparación con plasma normal humano, presenta una deficiencia en al menos un factor de coagulación del grupo factor II y factor X, en el que el plasma, en comparación con plasma normal humano, contiene 0 % de factor II y/o 0 % de factor X y asimismo al menos una sustancia desencadenante de anticoagulante lúpico.
2. Material calibrador de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el plasma contiene como sustancia desencadenante de anticoagulante lúpico al menos un anticuerpo antifosfolipídico, preferentemente uno, dos o más anticuerpos antifosfolipídicos del grupo anticuerpos anti-p2-glicoproteína I, anticuerpos anti-protrombina, anticuerpos anticardiolipina, anticuerpos anti-proteína C, anticuerpos anti-proteína S, anticuerpos anti-trombomodulina y anticuerpos anti-factor XII.
3. Material calibrador de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el anticuerpo respectivo está contenido en una concentración de 0,5 a 500 |jg/ml.
4. Material calibrador de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 y 2, que contiene al menos una anexina, preferentemente anexina V, como sustancia desencadenante de anticoagulante lúpico.
5. Material calibrador de acuerdo con la reivindicación 4, en el que la anexina respectiva está contenida en una concentración de 0,5 a 500 jg/ml.
6. Procedimiento para la producción de un material calibrador de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5, en el que se añade plasma que, en comparación con plasma normal humano, contiene 0 % de factor II y/o 0 % de factor X, una cantidad definida de al menos una sustancia desencadenante de anticoagulante lúpico.
7. Conjunto de calibrador que contiene un primer recipiente que contiene un material calibrador de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5 y, opcionalmente, un segundo recipiente que contiene plasma normal humano.
8. Uso de al menos un material calibrador de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5 o de un conjunto de calibrador de acuerdo con la reivindicación 7 para la calibración de pruebas de coagulación que se llevan a cabo para la determinación de anticoagulante lúpico.
9. Procedimiento para la calibración de pruebas de coagulación que se llevan a cabo para la determinación de anticoagulante lúpico, comprendiendo el procedimiento las etapas:
a) llevar a cabo una primera prueba de coagulación sensible a anticoagulante lúpico, determinándose el tiempo de coagulación de un plasma normal humano y el tiempo de coagulación de al menos un material calibrador de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5;
b) llevar a cabo una segunda prueba de coagulación insensible a anticoagulante lúpico, determinándose el tiempo de coagulación del mismo plasma normal humano y el tiempo de coagulación del mismo material calibrador; c) crear una primera curva de calibración para la primera prueba de coagulación sensible a anticoagulante lúpico y una segunda curva de calibración para la segunda prueba de coagulación insensible a anticoagulante lúpico, asociándose a los tiempos de coagulación determinados en las etapas a) y b) valores en una unidad artificial.
10. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en el que se determinan los tiempos de coagulación de al menos dos materiales calibradores, correspondiendo el primer material calibrador a una de las reivindicaciones 1-5 y, por lo tanto, presentando una mayor deficiencia de un factor de coagulación y una mayor concentración de la sustancia desencadenante de anticoagulante lúpico que el segundo material calibrador, que puede producirse mediante adición de plasma normal humano a un material calibrador de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-5, y en el que al primer material calibrador está asociado un valor más bajo en la unidad artificial que al segundo material calibrador.
11. Procedimiento para la determinación de anticoagulante lúpico en una muestra de plasma de un paciente, comprendiendo el procedimiento las etapas:
a) llevar a cabo una primera prueba de coagulación sensible a anticoagulante lúpico, determinándose el tiempo de coagulación del plasma del paciente;
b) llevar a cabo una segunda prueba de coagulación insensible a anticoagulante lúpico, determinándose el tiempo de coagulación del mismo plasma del paciente;
c) determinar el valor asociado al tiempo de coagulación determinado respectivo en la unidad artificial en una curva de calibración correspondiente que se creó con un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9;
d) formar el cociente a partir de los valores determinados para el plasma del paciente; y
e) establecer anticoagulante lúpico cuando el cociente formado supera un cociente de referencia predeterminado.
12. Procedimiento para la calibración de pruebas de coagulación que se llevan a cabo para la determinación de anticoagulante lúpico, comprendiendo el procedimiento las etapas:
a) llevar a cabo una primera prueba de coagulación sensible a anticoagulante lúpico, determinándose el tiempo de coagulación de un plasma normal humano y el tiempo de coagulación de al menos un material calibrador de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5;
b) llevar a cabo una segunda prueba de coagulación insensible a anticoagulante lúpico, determinándose el tiempo de coagulación del mismo plasma normal humano y el tiempo de coagulación del mismo material calibrador; c) formar el cociente de los tiempos de coagulación del plasma normal y formar el cociente de los tiempos de coagulación del material calibrador;
d) crear una curva de calibración, asociándose a los cocientes determinados en la etapa c) valores en una unidad artificial.
13. Procedimiento para la determinación de anticoagulante lúpico en una muestra de plasma de un paciente, comprendiendo el procedimiento las etapas:
a) llevar a cabo una primera prueba de coagulación sensible a anticoagulante lúpico, determinándose el tiempo de coagulación del plasma del paciente;
b) llevar a cabo una segunda prueba de coagulación insensible a anticoagulante lúpico, determinándose el tiempo de coagulación del mismo plasma del paciente;
c) formar el cociente a partir de los tiempos de coagulación determinados para el plasma del paciente;
d) determinar el valor asociado al cociente respectivo en la unidad artificial en una curva de calibración correspondiente que se creó con un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12; y
e) establecer anticoagulante lúpico cuando el valor determinado supera un valor de referencia predeterminado.
14. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 9 a 13, en el que la primera prueba de coagulación sensible a anticoagulante lúpico y la segunda prueba de coagulación insensible a anticoagulante lúpico se diferencian solo en que en la segunda prueba de coagulación insensible a anticoagulante lúpico se emplean más fosfolípidos que en la primera prueba de coagulación sensible a anticoagulante lúpico.
15. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 14, en el que las pruebas de coagulación se seleccionan del grupo APTT, dAPTT, PT, dPT, KCT, dTT, tiempo de veneno de la serpiente Taipán y DRVVT.
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