ES2858403T3 - Acidos nucleicos de doble hebra modificados por ligando - Google Patents

Acidos nucleicos de doble hebra modificados por ligando Download PDF

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Abstract

Un ácido nucleico bicatenario (dsNA) que comprende: una hebra en sentido que comprende 21 a 83 nucleótidos; una hebra antisentido que comprende de 15 a 39 nucleótidos; un doble formado por dicha hebra en sentido y antisentido, que tiene una longitud de 15 a 35 pares de bases; en donde el dsNA comprende una discontinuidad entre el terminal 5' de la hebra en sentido y el terminal 3' de la hebra antisentido o entre el terminal 3' de la hebra en sentido y el terminal 5' de la hebra antisentido; en donde la hebra en sentido comprende un tetrabucle y el tetrabucle comprende al menos un nucleótido conjugado con el ligando; en donde cada ligando está conjugado con un nucleótido del tetrabucle a través de un enlazador acetal y en donde dicha hebra antisentido es complementaria a un ARNm diana a lo largo de al menos 15 nucleótidos de dicha hebra antisentido y dicho dsNA reduce la expresión del gen diana cuando se introduce en un mamífero o una célula de mamífero.

Description

DESCRIPCIÓN
Ácidos nucleicos de doble hebra modificados por ligando
Antecedentes
Los agentes de ARN de doble hebra (ARNds) que poseen longitudes de hebra de 25 a 35 nucleótidos han sido descritos como inhibidores efectivos de la expresión del gen diana en células de mamífero (Rossi et al., Publicaciones de Patentes de los Estados Unidos Nos. 2005/0244858 y 2005/0277610). Se cree que los agentes de ARNds de tal longitud son procesados por la enzima Dicer de la ruta de interferencia de ARN (iARN), lo que lleva a dichos agentes a denominarse agentes "ARNsi de sustrato de Dicer" ("DARNsi"). Previamente se describieron ciertas estructuras modificadas de los agentes de DARNsi (Rossi et al., Publicación de Patente de los Estados Unidos No. 2007/0265220). La Publicación de Patente de los Estados Unidos No. 2014/350074 (Brown) describe un DARNsi que comprende una primera y una segunda hebra cada una de 26-60 nucleótidos de longitud y formando un doble donde la primera hebra comprende un bucle adyacente a dicho doble y donde dicha molécula comprende una discontinuidad entre un terminal de dicha primera hebra y un terminal de dicha segunda hebra caracterizado porque dicho conjugado en el bucle con una unidad estructural de ácido no nucleico.
Breve resumen de la invención
La presente invención proporciona un ácido nucleico bicatenario (dsNA) que comprende una hebra en sentido que comprende de 21 a 83 nucleótidos; una hebra antisentido que comprende de 15 a 39 nucleótidos; un doble formado por la hebra en sentido y antisentido, que tiene una longitud de 15 a 35 pares de bases; en donde el dsNA comprende una discontinuidad entre el terminal 5' de la hebra en sentido y el terminal 3' de la hebra antisentido o entre el terminal 3' de la hebra en sentido y el terminal 5' de la hebra antisentido; en donde la hebra en sentido comprende un tetrabucle y el tetrabucle comprende al menos un nucleótido conjugado de ligando, en donde cada ligando se conjuga con un nucleótido del tetrabucle a través de un enlazador acetal y en donde la hebra antisentido es complementaria a un ARNm diana junto con al menos 15 nucleótidos de la hebra antisentido y el dsNA reduce la expresión del gen diana cuando se introduce en un mamífero o una célula de mamífero.
Un tallo y un tetrabucle pueden estar formados por la hebra en sentido, un tallo que comprende una región de pares de bases de 1 a 20 nucleótidos y el tetrabucle que comprende 4 nucleótidos no emparejados.
En una realización, la hebra antisentido tiene un intervalo de longitud de: 15-30 nucleótidos, 18-25 nucleótidos o 19­ 24 nucleótidos.
En otra realización, el doble tiene un rango de longitud de: 15-22 nucleótidos o 15-30 nucleótidos.
En otra realización, la discontinuidad está flanqueada a cada lado por un nucleótido modificado con fosforotioato.
En otra realización, al menos una hebra del dsNA comprende una extensión 3'.
En otra realización, la extensión 3' tiene una longitud de 1-2, 1-4 o 1-6 nucleótidos.
En otra realización, la extensión 3' tiene una longitud de 1-10, 10-20 o 20-30 nucleótidos.
En otra realización, un tallo comprende una región de pares de bases de al menos 15 nucleótidos y además comprende uno o más no coincidencias.
En otra realización, un tallo comprende una región de pares de bases de al menos 15 nucleótidos y comprende además 1-10 no coincidencias consecutivas o no consecutivas.
En otra realización, el dsNA tiene al menos dos nucleótidos conjugados con ligando, donde cada nucleótido conjugado con ligando está separado de un segundo nucleótido conjugado con ligando por al menos un nucleótido espaciador.
En otra realización, el dsNA tiene al menos dos nucleótidos conjugados con ligando, en donde los nucleótidos conjugados con ligando son adyacentes.
En otra realización, el ligando se selecciona del grupo que consiste en: un lipófilo, un esteroide, una proteína, una vitamina, un carbohidrato y un terpeno.
En otra realización, el ligando se selecciona del grupo que consiste en: colesterol, ácido cólico, ácido adamantina acético, ácido 1-pireno butírico, dihidrotestosterona, 1,3-Bis-O (hexadecil) glicerol, grupo geraniloxihexilo, hexadecilglicerol, borneol, mentol, 1,3-propanodiol, grupo heptadecilo, ácido palmítico, ácido mirístico, ácido O3-(oleoil)litocólico, ácido O3-(oleoil)colénico, dimetoxitritilo o fenoxazina), ácido biliar, PEG, folato, vitamina A, vitamina E, biotina, piridoxal, un péptido, péptido imitador, manosa-6-fosfato, galactosa, fructosa, ribosa, xilosa, arabinosa, lixosa, alosa, altrosa, gulosa, yodosa, glucosa, talosa, disacárido, trisacárido, tetrasacárido, oligosacárido, polisacárido, un componente endosomolítico, uvaol, hecigenina, diosgenina, triterpenosarsasapogenina, Friedelina, ácido litocólico derivado con epifriedelanol, un lípido catiónico y un anticuerpo.
En otra realización, el ligando comprende colesterol.
En otra realización, el ligando comprende manosa-6-fosfato.
En otra realización, una extensión monocatenaria 5' tiene una longitud de 1-10, 10-20 o 20-30 nucleótidos.
En otra realización, el dsNA comprende al menos un nucleótido modificado.
En otra realización, los nucleótidos de dicho dsNA se seleccionan del grupo que consiste en: ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos, nucleótidos abásicos, nucleótidos abásicos invertidos, nucleótidos modificados con azúcar, nucleótidos modificados en el esqueleto, análogos nucleotídicos y análogos no nucleósidos.
En otra realización, el nucleótido es un ácido nucleico bloqueado (LNA) o un ácido nucleico desbloqueado (UNA).
En otra realización, una extensión 3' proporciona un sobresaliente 3' que tiene una longitud de 1-2, 1-4 o 1-6 nucleótidos.
En otra realización, al menos un nucleótido de dicha extensión 3' comprende un azúcar y/o una modificación del esqueleto.
En otra realización, al menos un nucleótido comprende un azúcar y/o una modificación del esqueleto.
En otra realización, el uno o más nucleótidos comprende una modificación de azúcar seleccionada del grupo que consiste en: 2'-O-metilo, 2'-metoxietoxi, 2'-fluoro, 2'-alilo, 2'-0-[2-(metilamino)-2-oxoetil], 4'-tio, 4'-CH2-0-2'-puente, 4'-(CH2)2-0-2'-puente, 2'-amino y modificación de 2'-O-(N-metilcarbamato).
En otra realización, el dsNA comprende una modificación del esqueleto seleccionada del grupo que consiste en: fosfonato, fosforotioato, fosfotriéster, metilfosfonato, morfolino, fosfato modificado por SATE (S-acil-2-tioetil), fosfato modificado por BMEG (isobutiril mercapto etil glicol).
En otra realización, el dsNA comprende una región que contiene al menos un enlace fosforotioato.
En otra realización, el dsNA comprende una región que contiene enlaces fosforotioato 1-5, 1-10 o 1-20.
En otra realización, el dsNA comprende una región que contiene al menos dos enlaces fosforotioato consecutivo
En otra realización, el dsNA comprende un análogo de ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en: hipoxantina (I), xantina (X), 3p-D-ribofuranosil-(2,6-diaminopirimidina) (K), 3 p-D-ribofuranosil-(1-metil-pirazolo[4,3-d]pirimidina-5,7(4H,6H)-diona) (P), iso-citosina (iso-C), iso-guanina (iso-G), 1-p-D-ribofuranosil-(5-nitroindol), 1-p-D-ribofuranosil-(3-nitropirrol), 5-bromouracil, 2-aminopurina, 4-tio-dT, 7-(2-tienil)-imidazo[4,5-b]piridina (Ds), pirrol-2-carbaldehído (Pa), 2-amino-6-(2-tienil)purina (S), 2-oxopiridina (Y), difluorotolilo, 4-fluoro-6-metilbencimidazol, 4-metilbencimidazol, 3-metil isocarbostirililo, 5-metil isocarbostirililo, 3-metil-7-propinil isocarbostirililo, 7-azaindolilo, 6-metil-7-azaindolilo, imidizopiridinilo, 9-metil-imidizopiridinilo, pirrolopirizinilo, isocarbostirililo, 7-propinil isocarbostirililo, propinil-7-azaindolilo, 2,4,5-trimetilfenilo, 4-metilindolilo, 4,6-dimetilindolilo, fenilo, naftalenilo, antracenilo, fenantracenilo, pirenilo, setilbencilo, tetracenilo y pentacenilo.
En otra realización, las cadenas en sentido y antisentido se alinean para una máxima complementariedad en la región doble.
En otra realización, el dsNA es un sustrato de escisión de Dicer.
En otra realización, el dsNA no es un sustrato de escisión de Dicer.
En otra realización, de 1 a 30 nucleótidos terminales 3' consecutivos de dicha hebra antisentido no se emparejan con dicha hebra en sentido, formando una extensión monocatenaria 3' de 1 a 30 nucleótidos.
En otra realización, la extensión monocatenaria 3' tiene una longitud de 1-10, 10-20 o 20-30 nucleótidos.
En otra realización, el doble comprende uno o más nucleótidos seleccionados del grupo que consiste en: ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos, nucleótidos modificados, nucleótidos abásicos, nucleótidos abásicos invertidos, análogos de nucleótidos y combinaciones de los mismos.
En otra realización, la extensión 3' comprende uno o más nucleótidos seleccionados del grupo que consiste en: ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos, nucleótidos modificados, nucleótidos abásicos, nucleótidos abásicos invertidos, análogos de nucleótidos y combinaciones de los mismos.
En otra realización, la extensión 5' comprende uno o más nucleótidos seleccionados del grupo que consiste en: ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos, nucleótidos modificados, nucleótidos abásicos, nucleótidos abásicos invertidos y análogos de nucleótidos.
En otra realización, la extensión monocatenaria 5' comprende al menos 10 desoxirribonucleótidos.
En otra realización, la extensión monocatenaria 5' comprende al menos un nucleótido modificado con fosforotioato. En otra realización, la extensión monocatenaria 5' comprende enlaces de fosforotioato 1-5, 1-10 o 1-20.
En otra realización, la extensión monocatenaria 5' comprende al menos dos enlaces de fosforotioato consecutivos. En otra realización, el ligando es una unidad estructural de ácido no nucleico.
En otra realización, el ligando es un péptido o un compuesto orgánico.
En otra realización, el compuesto orgánico es un colorante.
En otra realización, el compuesto orgánico es colesterol.
En otra realización, la unidad estructural de ácido no nucleico comprende un marcador detectable.
En otra realización, el nucleótido conjugado con ligando tiene un direccionamiento celular incrementado en comparación con un dsNA que carece de un nucleótido conjugado con ligando.
En otra realización, el nucleótido conjugado con ligando tiene una captación celular mejorada en comparación con un dsNA que carece de un nucleótido conjugado con ligando.
En otra realización, el nucleótido conjugado con ligando tiene un suministro mejorado en comparación con un dsNA que carece de un nucleótido conjugado con ligando.
En otra realización, el nucleótido conjugado con ligando tiene estabilidad aumentada en comparación con un dsNA que carece de un nucleótido conjugado con ligando.
En otra realización, el dsNA que comprende un nucleótido conjugado con ligando tiene un seguimiento aumentado en comparación con un dsNA que carece de un nucleótido conjugado con ligando.
En otra realización, el dsNA que comprende un nucleótido conjugado con ligando tiene una afinidad de unión aumentada por una diana en comparación con un dsNA que carece de un nucleótido conjugado con ligando.
En otra realización, el dsNA que comprende un nucleótido conjugado con ligando tiene una inmunogenicidad disminuida en comparación con un dsNA que carece de un nucleótido conjugado con ligando.
En otra realización, el dsNA que comprende un nucleótido conjugado con ligando tiene propiedades farmacocinéticas mejoradas en comparación con un dsNA que carece de un nucleótido conjugado con ligando.
En otra realización, el dsNA que comprende un nucleótido conjugado con ligando tiene propiedades de biodistribución mejoradas en comparación con un dsNA que carece de un nucleótido conjugado con ligando.
En otra realización, el terminal 5' de la hebra en sentido y/o antisentido contiene un fosfato no modificado.
En otra realización, el terminal 5' de la hebra en sentido y/o antisentido contiene un fosfato químicamente modificado. En otra realización, la extensión 3' comprende una modificación de fosforotioato.
En otra realización, el doble comprende un nucleótido abásico.
En otra realización, la hebra en sentido consiste en hasta un 100% de nucleótidos modificados químicamente. En otra realización, la hebra antisentido consiste en hasta un 100% de nucleótidos modificados químicamente. En otra realización, las hebras tanto en sentido como antisentido consisten en hasta 100% de nucleótidos modificados químicamente.
En otra realización, la hebra en sentido es resistente a la degradación de la nucleasa en ausencia de un nucleótido modificado.
En otra realización, la hebra antisentido es resistente a la degradación de la nucleasa en ausencia de un nucleótido modificado.
En otra realización, el dsNA comprende más de una especie de ligando.
En otra realización, el dsNA comprende un nucleótido conjugado con GalNac y un nucleótido conjugado con colesterol.
En otra realización, el dsNA comprende un nucleótido conjugado con GalNac y un nucleótido conjugado con manosa-6-fosfato.
En otra realización, el dsNA comprende un nucleótido conjugado con GalNac, un nucleótido conjugado con manosa-6-fosfato, un nucleótido conjugado con folato y/o un nucleótido conjugado con colesterol.
En otra realización, la molécula de dsNA comprende un nucleótido conjugado con al menos dos ligandos.
La inclusión de uno o más nucleótidos modificados, modificaciones del esqueleto de fosfato y/o análogos de nucleótidos dentro de la región monocatenaria de un dsNA extendido monocatenario puede impartir ciertas ventajas a dicha molécula de dsNA modificada, que incluye, por ejemplo, una eficacia mejorada (incluida una potencia mejorada y/o duración mejorada del efecto), presentacióm de un dominio de reconocimiento y otros atributos asociados con una región de nucleótidos monocatenaria.
La invención también proporciona una composición farmacéutica para reducir la expresión de un gen diana en una célula de un sujeto, comprendiendo dicha composición el dsNA de la invención en una cantidad eficaz para reducir la expresión del gen diana en dicha célula y un portador farmacéuticamente aceptable.
A modo de ejemplo, la invención proporciona un nucleótido conjugado con ligando que comprende: un nucleótido y un ligando conjugado mediante un enlazador, en el que el enlazador se selecciona del grupo que consiste en:
a.
Figure imgf000005_0001
y
b.
Figure imgf000005_0002
donde n = 0-20
en donde dicho ligando se conjuga con el azúcar o la base de dicho nucleótido; y en donde dicho nucleótido conjugado con ligando se usa para sintetizar el dsNA de la reivindicación 1.
También se divulga un método para aumentar la potencia y la vida media de un dsNA mediante la conjugación de un ligando a un nucleótido de dicho dsNA, en donde dicho ligando se selecciona del grupo que consiste en colesterol, manosa-6-fosfato, GalNAc y folato.
También se divulga un método para producir un dsNA de la invención, comprendiendo el método: proporcionar una pluralidad de nucleótidos seleccionados del grupo que consiste en nucleótidos de ADN, nucleótidos de ARN, nucleótidos abásicos, nucleótidos abásicos invertidos, análogos de nucleótidos o nucleótidos modificados; en donde uno o más nucleótidos están conjugados a un ligando; y sintetizar un dsNA que comprende nucleótidos que no están conjugados a un ligando y nucleótidos que son ligandos conjugados, en donde los nucleótidos de dicho dsNA están en un patrón predeterminado, produciendo así el dsNA.
En otra realización, el enlazador (L) comprende la estructura de fórmula VI:
Figure imgf000006_0001
en donde:
B es una nucleobase o H;
Z es O, S, N(R1), o CH2;
V y W son cada uno O;
R1 y R2 son cada uno H;
m y n son cada uno independientemente 1 - 20.
X es un ligando seleccionado del grupo que consiste en: GalNAc, folato, manosa-6-fosfato y colesterol.
A modo de ejemplo, el enlazador (L) puede comprender la estructura de fórmula VII:
Figure imgf000006_0002
B es una nucleobase;
m y n son cada uno independientemente 1 - 20;
X tiene la estructura
Figure imgf000006_0003
Las características anteriores de las realizaciones se entenderán más fácilmente con referencia a la siguiente descripción detallada, tomada con referencia a los dibujos adjuntos.
Breve descripción de los dibujos
Las figuras 1A y 1B muestran algunas estructuras y el procesamiento mediado por Dicer predicho de sustratos de Dicer extendidos de hebra sencilla de ejemplo. En la figura 1A, el Panel A representa un DARNsi sin una sola extensión trenzada. El panel B representa un agente de DARNsi de "hebra guía extendida", que tiene una hebra guía 5' que sobresale de 1 a 30 nucleótidos de longitud (15 nucleótidos como se muestra). El panel C representa un agente de DARNsi de "hebra guía extendida" de ejemplo, que tiene una hebra guía 5' que sobresale de 1 a 30 nucleótidos de longitud (15 nucleótidos como se muestra), con un oligo corto complementario a la región extendida monocatenaria (complemento discontinuo"; complemento discontinuo para 3 pasajeras como se muestra). El panel D representa un agente de DARNsi de "hebra pasajera extendida" de ejemplo, que tiene una hebra pasajera 3' que sobresale en 1-30 nucleótidos de longitud (15 nucleótidos como se muestra). El panel E representa un agente DARNsi de "hebra pasajera extendida", que tiene una hebra pasajera 5' que sobresale de 1 a 50 nucleótidos de longitud (15 nucleótidos como se muestra). En cada par de hebras de oligonucleótidos que forman un DARNsi, la hebra superior es la hebra pasajera y la hebra inferior es la hebra guía. Blanco = nucleótido (por ejemplo, un ribonucleótido, desoxirribonucleótido, ribonucleótido modificado). La figura 1B muestra modificaciones de nucleótidos y patrones de modificaciones de sustratos de Dicer extendidos de hebra sencilla de ejemplo. El panel A representa un DARNsi sin una sola extensión trenzada. El panel B representa un agente de DARNsi de "hebra guía extendida", que tiene una hebra guía 5' que sobresale de 1 a 50 nucleótidos de longitud (15 nucleótidos como se muestra). El panel C representa un agente de DARNsi de "hebra guía extendida" de ejemplo, que tiene una hebra guía 5' que sobresale en 1-50 nucleótidos de longitud (15 nucleótidos como se muestra), con un oligo corto complementario a la región extendida monocatenaria (complemento discontinuo"; complemento discontinuo para 3 pasajeras como se muestra). El panel D representa un ejemplo de agente DARNsi de "hebra pasajera extendida", que tiene una hebra pasajera 3' que sobresale en 1-50 nucleótidos de longitud (15 nucleótidos como se muestra). En cada par de hebras de oligonucleótidos que forman un DARNsi, la hebra superior es la hebra pasajera y la hebra inferior es la hebra guía. Azul = ribonucleótido o ribonucleótido modificado (por ejemplo, 2'-O-metil ribonucleótido); Gris = desoxirribonucleótido o ribonucleótido; Blanco = ribonucleótido; Amarillo oscuro = desoxirribonucleótido, ribonucleótido o nucleótido modificado (por ejemplo, 2'-O-metil ribonucleótido, fosforotioato desoxirribonucleótido; metilfosfonato desoxirribonucleótido). Flecha pequeña = sitio de escisión de Dicer; flecha grande = discontinuidad. A = posición a partir del residuo de nucleótido de la hebra guía que es complementaria al residuo de nucleótido terminal 5' de la hebra pasajera (posición 1A); B = posición a partir del residuo de nucleótido terminal 5' de la hebra guía (posición 1B); C = posición a partir del nucleótido terminal 5' del oligo corto complementario a la región extendida monocatenaria (posición 1C); D = posición a partir del residuo de nucleótido terminal 3' de la hebra pasajera (ID de posición); E = posición a partir del residuo de nucleótido terminal 3' de la hebra pasajera (posición IE); F = posición comenzando desde el nucleótido terminal 5' consecutivo a la hebra antisentido 5' sobresaliente monocatenario (posición IF). Las flechas pequeñas indican sitios predichos de escisión de Dicer; una flecha grande indica una discontinuidad.
La figura 2 muestra la estructura y el procesamiento predicho mediado por Dicer de agentes de DARNsi de "hebra guía extendida" de ejemplo, que tienen una hebra guía 5' que sobresale en 1-30 nucleótidos de longitud (10-15 nucleótidos como se muestra). Azul=2'-O-metil ribonucleótido; Gris = desoxirribonucleótido; Blanco = ribonucleótido; Amarillo oscuro = fosforotioato desoxirribonucleótido; Verde = fosforotioato 2'-O-metil ribonucleótido; Rosa = fosforotioato ribonucleótido; Amarillo claro = metilfosfonato desoxirribonucleótido. A = posición a partir del residuo de nucleótido de dicha hebra en sentido que es complementaria al residuo de nucleótido terminal 5' de la hebra pasajera (posición 1A); B = posición a partir del residuo de nucleótido terminal 5' de la hebra guía (posición 1B). Las flechas indican sitios predichos de escisión de Dicer.
La figura 3 muestra la estructura y el procesamiento predicho mediado por Dicer de agentes de DARNsi de "hebra pasajera extendida" de ejemplo, que tienen una hebra pasajera 3' que sobresale en 1-30 nucleótidos de longitud (10­ 15 nucleótidos, como se muestra). Azul=2'-O-metil ribonucleótido; Gris = desoxirribonucleótido; Blanco = ribonucleótido; Amarillo oscuro = fosforotioato desoxirribonucleótido; Verde = fosforotioato 2'-O-metil ribonucleótido; Rosa = fosforotioato ribonucleótido; Amarillo claro = metilfosfonato desoxirribonucleótido. A = posición a partir del residuo de nucleótido de dicha hebra en sentido que es complementaria al residuo de nucleótido terminal 5' de la hebra pasajera (posición 1A); D=posición a partir del residuo de nucleótido terminal 3' de la hebra pasajera. Las flechas indican sitios predichos de escisión de Dicer.
La figura 4 muestra la estructura y el procesamiento predicho mediado por Dicer de agentes de DARNsi de "hebra guía extendida" de ejemplo, que tienen una hebra guía 5' que sobresale de 1 a 30 nucleótidos de longitud. Agentes de DARNsi de guía monocatenaria extendidos que tienen una hebra pasajera con el patrón de modificación representado por DP1301P y una hebra de guía con un patrón de modificación representado por DP1337G; DP1339G; DP1371G; y se generaron Dp 1338G. Además, los agentes de DARNsi extendidos monocatenarios que tienen una hebra pasajera con el patrón de modificación representado en DP1301P, una hebra guía con un patrón de modificación representado por DP1337G; DP1339G; DP1371G; y DP1338G, y se generó una hebra de "complemento de pasajera 3' discontinuo" con un patrón de modificación representado por DP1372P y DP1373P. Los agentes de DARNsi que tienen una hebra guía con la modificación representada DP1370G se usaron como referencia. Azul = 2'-O-metil ribonucleótido; Gris = desoxirribonucleótido; Blanco = ribonucleótido; Amarillo oscuro = fosforotioato desoxirribonucleótido; Verde = fosforotioato 2'-O-metil ribonucleótido; Rosa = fosforotioato ribonucleótido; Amarillo claro = metilfosfonato desoxirribonucleótido. Las flechas indican sitios predichos de escisión de Dicer.
La figura 5 muestra la estructura y el procesamiento predicho mediado por Dicer de agentes de DARNsi de "hebra pasajera extendida" de ejemplo, que tienen una hebra pasajera 3' que sobresale en 1-30 nucleótidos de longitud. Agentes DARNsi extendidos pasajeras monocatenarios que tienen una hebra guía con el patrón de modificación representado por DP1XXXG y una hebra pasajera con un patrón de modificación representado por DP1YYXP; Dp1YxxP; y DP1YxxP se generaron. Los agentes de DARNsi que tienen una hebra pasajera con la modificación representada DP1301P se usaron como referencia. Azul = 2'-O-metil ribonucleótido; Gris = desoxirribonucleótido; Blanco = ribonucleótido; Amarillo oscuro = fosforotioato desoxirribonucleótido; Verde = fosforotioato 2'-O-metil ribonucleótido; Rosa = fosforotioato ribonucleótido; Amarillo claro = metilfosfonato desoxirribonucleótido. Las flechas indican sitios predichos de escisión de Dicer.
La figura 6 muestra la secuencia, estructura y procesamiento mediado por Dicer predicho de agentes de DARNsi de "hebra guía extendida" de ejemplo dirigidos a KRAS-249M, que tienen una hebra guía 5' que sobresale de 1 a 15 nucleótidos de longitud. Agentes de DARNsi de guía monocatenaria extendidos que tienen una hebra pasajera representada por DP 1301 P (SEQ ID NO: 13) y una hebra guía representada por DP1337G (SEQ ID NO: 15); DP1338G (SEQ ID NO: 16); DP1340G (SEQ ID NO: 17); DP1341G (SEQ ID NO: 18); y DP1342G (SEQ ID NO: 18) fueron generados y probados. Los agentes de DARNsi que tienen una hebra pasajera representada por DP1301P y una hebra guía representada por DP 1336G se usaron como referencia. Las descripciones de los patrones de modificación de los complementos discontinuos se etiquetan a la derecha. ARN = ribonucleótido; PS = fosforotioato; ADN = desoxirribonucleótido; 2'OMe = 2'-O-metilo; Subrayado = 2'-O-metil ribonucleótido; Negrita = hebra guía 5' sobresaliente; Inferior = desoxirribonucleótido; Superior = ribonucleótido. Las flechas indican sitios predichos de escisión de Dicer. DP1336 G es SEQ ID NO: 14.
La figura 7 es un histograma que muestra la expresión de pliegue normalizado de KRAS-249M usando agentes DARNsi que tienen las hebras pasajeras y las hebras de guía representadas en la figura 5. Las células Hela se trataron con 0.1 nM de los agentes DARNsi en IARNMAX, 24 h.
La figura 8 muestra la secuencia, la estructura y el procesamiento predicho mediado por Dicer de agentes de DARNsi de "hebra guía extendida" de ejemplo que se dirigen a HPRT 1, que tienen una hebra guía 5' que sobresale en 1-15 nucleótidos de longitud. Agentes de DARNsi con guía monocatenaria extendida que tienen una hebra pasajera representada por DP 1001 P (SEQ ID NO: 19) y una hebra guía representada por DP1350G (SEQ ID NO: 21); DP1351G (SEQ ID NO: 22); DP1352G (SEQ ID NO: 22); DP1353G (SEQ ID NO: 23); DP1354G (SEQ ID NO: 24); y DP1355G (SEQ ID NO: 24) fueron generados y probados. Los agentes de DARNsi que tienen una hebra pasajera representada por DP 1001 P y una hebra guía representada por DP 1002G se usaron como referencia. Las descripciones de los patrones de modificación de los complementos discontinuos se etiquetan a la derecha. ARN = ribonucleótido; PS = fosforotioato; ADN = desoxirribonucleótido; 2'OMe = 2'-O-metilo; Subrayado = 2'-O-metil ribonucleótido; Negrita = hebra guía 5' sobresaliente; inferior = desoxirribonucleótido; Superior = ribonucleótido. Las flechas indican sitios predichos de escisión de Dicer. DP 1002G es SEQ ID NO: 20.
La figura 9 es un histograma que muestra la expresión de plegado normalizado de HPRT1 usando agentes DARNsi que tienen las hebras pasajeras y las hebras de guía representadas en la figura 7. Las células Hela se trataron con 0.1 nM de los agentes DARNsi en IARNMAX, 24 h.
La figura 10 es una imagen de un gel que muestra una actividad de Dicer en agentes DARNsi extendidos de guía monocatenaria (hebras de pasajera+guía) dirigidos a KRAS-249M o HPRT1. Tratamiento: 2 horas a 37 C Turbo Dicer (1 U/reacción). Gel: 18% Tris 90' @ 10 W. Carga: (1 pl 50 pM+50 pl de regulador y cargar 10 pl) o (5 pl de reacción+20 |jl de regulador y cargar 10 pl).
La figura 11 muestra la secuencia y estructura de ejemplos de oligos cortos que complementan extensiones de hebra guía ("complementos discontinuos"), que tienen 1-16 nucleótidos de longitud, base emparejada con extensiones de hebra guía 5'. Agentes de DARNsi extendidos de guía monocatenaria que tienen un complemento discontinuo representado por DP 1365P; DP 1366P; DP1367P; DP1368P; y DP1369P fueron generados y probados. Las descripciones de los patrones de modificación de los complementos discontinuos se etiquetan a la derecha. ARN = ribonucleótido; PS = fosforotioato; ADN = desoxirribonucleótido; 2'OMe = 2'-O-metilo; Subrayado = 2'-O-metil ribonucleótido; Negrita = hebra guía 5' sobresaliente; Inferior = desoxirribonucleótido; Superior = ribonucleótido. Las flechas indican sitios predichos de escisión de Dicer. La hebra inferior en cada par de oligonucleótidos es la SEQ ID NO: 27.
La figura 12 es un histograma que muestra la expresión de plegado normalizado de KRAS-249M usando agentes DARNsi que tienen las hebras pasajeras y las hebras de guía representadas en la figura 7 y los complementos discontinuos representados en la figura 10. Los complementos discontinuos utilizados están etiquetados encima de cada conjunto de las tres barras correspondientes a los agentes de DARNsi que tienen una extensión monocatenaria de guía 5' (1.-r. ADN, ARN, ARN 2'OMe). Las células Hela se trataron con 0.1 nM de los agentes DARNsi en IARNMAX, 24 horas.
La figura 13 es un histograma que muestra la expresión de pliegues normalizados de HPRT1 usando agentes DARNsi que tienen las hebras pasajeras y las hebras de guía representadas en la figura 7 y los complementos discontinuos representados en la figura 10. El complemento discontinuo utilizado está marcado encima de cada conjunto de las tres barras correspondientes a los agentes de DARNsi que tienen una extensión monocatenaria de guía 5' (1.-r. ADN, ARN, ARN 2'OMe). Las células Hela se trataron con 0.1 nM de los agentes DARNsi en IARNMAX, 24 horas.
La figura 14 muestran la estructura y el procesamiento mediado por Dicer de sustratos de Dicer extendidos de hebra sencilla de ejemplo en un experimento in vivo (Condiciones experimentales: Tratamiento: 10 mg/kg una inyección; Diana: KRAS; Transfección: Fectamina in vivo; Tejido: Hígado). El panel A representa un patrón de modificación utilizado en un DARNsi de control negativo sin una extensión monocatenaria. El panel B representa un patrón de modificación utilizado en un DARNsi de control positivo sin una sola extensión trenzada. El panel C representa un patrón de modificación utilizado en un DARNsi de prueba sin una sola extensión trenzada. El panel D representa un patrón de modificación utilizado en un agente de prueba de DARNsi de "hebra guía extendida", que tiene una hebra guía 5' que sobresale de 1 a 30 nucleótidos de longitud (10 nucleótidos como se muestra). El panel E representa un patrón de modificación utilizado en un agente de prueba de DARNsi de "hebra guía extendida", que tiene una hebra guía 5' que sobresale en 1-30 nucleótidos de longitud (10 nucleótidos como se muestra). En cada par de hebras de oligonucleótidos que forman un DARNsi, la hebra superior es la hebra pasajera y la hebra inferior es la hebra guía. Azul = ribonucleótido o ribonucleótido modificado (por ejemplo, 2'-O-metil ribonucleótido); Gris = desoxirribonucleótido o ribonucleótido; Blanco = ribonucleótido; Amarillo oscuro = desoxirribonucleótido, ribonucleótido o nucleótido modificado (por ejemplo, 2'-O-metil ribonucleótido, fosforotioato desoxirribonucleótido; metilfosfonato desoxirribonucleótido). Flecha pequeña = sitio de escisión de Dicer; flecha grande = discontinuidad. A = posición a partir del residuo de nucleótido de dicha hebra en sentido que es complementaria al residuo de nucleótido terminal 5' de la hebra pasajera (posición 1A); B = posición a partir del residuo de nucleótido terminal 5' de la hebra guía. Las flechas pequeñas indican sitios predichos de escisión de Dicer; una flecha grande indica una discontinuidad.
La figura 15 muestra la secuencia, estructura y el procesamiento predicho mediado por Dicer de agentes de DARNsi de "hebra guía extendida" de ejemplo dirigidos a KRAS-249M y HPRT 1, que tienen una hebra guía 5' que sobresale en 1-15 nucleótidos de longitud. La secuencia y estructura de los oligos cortos de ejemplo que complementan las extensiones de hebra guía ("complementos discontinuos") se muestran emparejados con bases de secuencias de extensión de hebra guía 5'. Agentes DARNsi de guía monocatenarios extendidos que tienen una hebra pasajera con el patrón de modificación representado por DP 1301 P y una hebra guía con un patrón de modificación representado por DP1337G, DP1338G, DP1339G (SEQ ID NO 16), DP1371G (SEQ ID NO 16), y se generaron DP 1352G. Además, los agentes de DARNsi extendidos monocatenarios que tienen una hebra pasajera con el patrón de modificación representado en DP 1301 P (SEQ ID NO 13), una hebra guía con un patrón de modificación representado por DP1337G (SEQ ID NO 15), DP1338G (SEQ ID NO 13), DP1339G (SEQ ID NO 16), DP 1371G (SEQ ID NO 16) y DP1352G (SEQ ID NO 22); y se generó una hebra de "complemento discontinuo" con un patrón de modificación representado por DP1372P (SeQ ID NO 28) y DP1373P (SeQ ID NO 28). Los agentes de DARNsi que tienen una hebra pasajera con la modificación representada por DP1301P (SEQ ID NO 13) se usaron como referencia y una hebra guía con la modificación representada por DP1370G (SEQ ID NO 13) se utilizó como referencia. La dosificación de hebras pasajeras, hebras de guía y complementos discontinuos están etiquetados a la derecha. Las descripciones de los patrones de modificación de los complementos discontinuos también se etiquetan a la derecha. ARN = ribonucleótido; PS = fosforotioato; ADN = desoxirribonucleótido; 2'OMe = 2'-O-metilo; Subrayado = 2'-O-metil ribonucleótido; Negrita = hebra guía 5' sobresaliente; Inferior = desoxirribonucleótido; Superior = ribonucleótido. Las flechas indican sitios predichos de escisión de Dicer. SEQ ID NO: 28 es la base emparejada con SEQ ID NO: 29. DP1370G es SEQ ID NO: 14.
La figura 16 es un histograma que muestra la expresión del pliegue normalizado de mKRAS en el hígado de animales individuales tratados con agentes de DARNsi que tienen las hebras pasajeras y las hebras guía representadas en las figuras 14 y/o 15. Los animales se trataron con una inyección de 10 mg/kg de los agentes de DARNsi en fectamina in vivo y se analizaron muestras de hígado.
La figura 17 es un histograma que muestra la expresión del pliegue normalizado de mKRAS en el hígado de animales tratados con agentes de DARNsi que tienen las hebras pasajeras y las hebras guía representadas en las figuras 14 y/o 15. Los animales se trataron con una inyección de 10 mg/kg de los agentes de DARNsi en fectamina in vivo y se analizaron muestras de hígado.
La figura 18 son gráficos que muestran la expresión de pliegues normalizados de mKRAS en el hígado de animales tratados con agentes DARNsi que tienen las hebras pasajeras y las hebras guía representadas en las figuras 14 y/o 15. Los animales se trataron con una inyección de 10 mg/kg de los agentes de DARNsi en fectamina in vivo y se analizaron muestras de hígado.
La figura 19 es un histograma que muestra la expresión del pliegue normalizado de mKRAS en el bazo de animales individuales tratados con agentes de DARNsi que tienen las hebras pasajeras y las hebras de guía representadas en las figuras 14 y/o 15. Los animales se trataron con una inyección de 10 mg/kg de los agentes de DARNsi en fectamina in vivo y se analizaron muestras de bazo.
La figura 20 es un histograma que muestra la expresión del pliegue normalizado de mKRAS en el bazo de animales tratados con agentes de DARNsi que tienen las hebras pasajeras y las hebras de guía representadas en las figuras 14 y/o 15. Los animales se trataron con una inyección de 10 mg/kg de los agentes de DARNsi en fectamina in vivo y se analizaron muestras de bazo.
La figura 21 son gráficos que muestran la expresión de pliegues normalizados de mKRAS en el bazo de animales tratados con agentes DARNsi que tienen las hebras pasajeras y las hebras guía representadas en las figuras 14 y/o 15. Los animales se trataron con una inyección de 10 mg/kg de los agentes de DARNsi en fectamina in vivo y se analizaron muestras de bazo.
La figura 22 es un histograma que muestra la expresión de pliegue normalizado de mKRAS en riñón de animales individuales tratados con agentes de DARNsi que tienen las hebras pasajeras y las hebras de guía representadas en las figuras 14 y/o 15. Los animales fueron tratados con una inyección de 10 mg/kg de los agentes de DARNsi en fectamina in vivo y se analizaron muestras de riñón.
La figura 23 es un histograma que muestra la expresión de pliegue normalizado de mKRAS en riñón de animales tratados con agentes de DARNsi que tienen las hebras pasajeras y las hebras de guía representadas en las figuras 14 y/o 15. Los animales fueron tratados con una inyección de 10 mg/kg de los agentes de DARNsi en fectamina in vivo y se analizaron muestras de riñón.
La figura 24 son gráficos que muestran la expresión de pliegue normalizado de mKRAS en riñón de animales tratados con agentes DARNsi que tienen las hebras pasajeras y las hebras guía representadas en las figuras 14 y/o 15. Los animales fueron tratados con una inyección de 10 mg/kg de los agentes de DARNsi en fectamina in vivo y se analizaron muestras de riñón.
La figura 25A muestra la actividad de oligómeros que contienen N-acetilgalactosamina (DP2421P:DP2460G; DP2421P:DP2461G; DP2422P:DP2462G y DP2286P-GalNac: DP2281G) en cultivos primarios de hepatocitos de ratón. El panel 1 muestra la actividad de DP2421P:DP2460G con respecto a la concentración, el panel 2 muestra la actividad de DP2421P:DP2461G con respecto a la concentración, el panel 3 muestra la actividad de DP2422P:DP2462G con respecto a la concentración, y el panel 4 muestra la actividad de DP2286P-GalNac:DP2281G con respecto a la concentración. Las actividades de autoadministración exhibidas por diferentes clases de oligómeros se examinaron con oligómeros de dsNA construidos con una extensión 5' de la hebra antisentido o en sentido, conteniendo la extensión 0 a cuatro ligandos de N-acetilgalactosamina o ligandos tricatenarios, así como oligonucleótidos de dsNA que tienen un tetrabucle, con tetrabucle tres o cuatro ligandos de N-acetilgalactosamina o colocados en el bucle, o un ligando tricatenario de N-acetilgalactosamina en el bucle, o tres o cuatro ligandos de N-acetilgalactosamina colocados en el tallo.
La figura 25B muestra la actividad de los oligómeros que contienen N-acetilgalactosamina (DP2421P:DP2460G, DP2421P:DP2461G; DP2422P:DP2462G; DP2463P:DP2382G; DP2464P:DP2382G; DP2465P:DP2382G; DP2466P:DP2382G; DP2467:DP2382G; DP2286P-GalNAc:DP2281G) en cultivos primarios de hepatocitos de ratón. El panel 1 muestra la actividad de DP2421P:DP2460G con respecto a la concentración, el panel 2 muestra la actividad de DP2421P:DP2461G con respecto a la concentración, el panel 3 muestra la actividad de DP2422P:DP2462G con respecto a la concentración, el panel 4 muestra la actividad de DP2463P:DP2382G con respecto a la concentración, el Panel 5 muestra la actividad de DP2464P:DP2382G con respecto a la concentración, el Panel 6 muestra la actividad de DP2465P:DP2382G con respecto a la concentración, el Panel 7 muestra la actividad de DP2466P:DP2382G con respecto a la concentración, y el Panel 8 muestra la actividad de DP2467:DP2382G con respecto a la concentración y el Panel 9 muestra la actividad de DP2286P-GalNAc:DP2281G con respecto a la concentración. Las actividades de autoadministración exhibidas por diferentes clases de oligómeros se examinaron con oligómeros de dsNA construidos con una extensión 5' de la hebra antisentido o en sentido, conteniendo la extensión 0 a cuatro ligandos de N-acetilgalactosamina o ligandos tricatenarios, así como oligonucleótidos de dsNA que tienen un tetrabucle, en algunos ejemplos, el tetrabucle tiene tres o cuatro ligandos de N-acetilgalactosamina colocados en el bucle, o un ligando tricatenario de N-acetilgalactosamina en el bucle, o tres o cuatro ligandos de N-acetilgalactosamina colocados en el tallo.
La figura 26 muestra las afinidades de unión de ligandos que contienen N-acetilgalactosamina (DP2421P:DP2460G, DP2421P:DP2461G; DP2422P:DP2462G; DP2463P:DP2382G; DP2464P:DP2382G; DP2465P:DP2382G; DP2466P:DP2382G; DP2467:DP2382G; DP2286P-GalNAc: DP2281G) a ASGPr utilizando mediciones de polarización de fluorescencia. El panel 1 muestra la afinidad de unión de DP2421P: DP2460G hacia ASGPr con respecto a la concentración, el panel 2 muestra la afinidad de unión de DP2421P: DP2461G hacia ASGPr con respecto a la concentración, el panel 3 muestra la afinidad de unión de DP2422P: DP2462G hacia ASGPr con respecto a la concentración, el Panel 4 muestra la afinidad de unión de DP2463P: DP2382G hacia ASGPr con respecto a la concentración, el Panel 5 muestra la afinidad de unión de DP2464P: DP2382G hacia ASGPr con respecto a la concentración, el Panel 6 muestra la afinidad de unión de DP2465P: DP2382G hacia ASGPr con respecto a concentración, el Panel 7 muestra la afinidad de unión de DP2466P: DP2382G hacia ASGPr con respecto a la concentración, y el Panel 8 muestra la afinidad de unión de DP2467:DP2382G hacia ASGPr con respecto a la concentración y el Panel 9 muestra la afinidad de unión de DP2286P-GalNAc:DP2281G hacia ASGPr con respecto a la concentración. Se examinaron las afinidades de unión exhibidas por diferentes grupos de oligómeros, incluidos los oligómeros de dsNA que tienen una extensión 5' de la hebra antisentido o en sentido, conteniendo la extensión tres o cuatro ligandos de N-acetilgalactosamina o ligandos tricatenarios. Oligómeros adicionales que comprenden dsNA que forman un tetrabucle con tres o cuatro ligandos de N-acetilgalactosamina o un ligando tricatenario de N-acetilgalactosamina en el bucle, o que tienen tres o cuatro ligandos de N-acetilgalactosamina en el tallo.
La figura 27 y la figura 28 muestran la actividad de eliminación de ARNm de CTNNB1 en ratones tratados con conjugados de DARNsi de N-acetilgalactosamina. Cada conjugado en las figuras contiene un tetrabucle pero tiene diferentes modificaciones de los nucleótidos. Se examinó la eficacia de eliminación de varios de los oligómeros, incluidos los oligómeros de dsNA con extensiones 5' de la hebra antisentido o en sentido que contienen tres o cuatro ligandos de N-acetilgalactosamina o ligandos tricatenarios oligonucleótidos de dsNA que tienen un tetrabucle con tres o cuatro ligandos de N-acetilgalactosamina o N-acetilgalactosamina tricatenaria en el bucle, y aquellos que tienen los ligandos de N-acetilgalactosamina colocados en el tallo del tetrabucle.
La figura 29 muestra la actividad de eliminación de ARNm de HAO1 en ratones tratados con DARNsi de N-acetilgalactosamina a una dosis de 25 mpk. Se examinó la eficiencia de eliminación de oligómeros con extensiones 5' o configuraciones de tetrabucle, incluidas aquellas con extensiones 5' de las hebras en sentido y antisentido, y un tetrabucle, cada uno con el ligando N-acetilgalactosamina unido a la extensión 5' o al tetrabucle, donde configuraciones de tres o cuatro ligandos o ligandos tricatenarios unidos a la extensión 5' o al tallo o bucle del tetrabucle. En la figura 29, las primeras seis moléculas de dsNA después de la muestra de PBS son moléculas de tetrabucle y las siguientes seis moléculas de dsNA son moléculas de extensión. Las seis moléculas de tetrabucle difieren entre sí en los patrones de modificación y asimismo las seis moléculas de extensión difieren entre sí en los patrones de modificación química. Los detalles de los patrones de modificación se describen en la Tabla 3.
La figura 30 muestra los resultados de un estudio de respuesta a la dosis que administra un conjugado de N-acetilgalactosamina DARNsi HAO1 a ratones. Los datos de respuesta a la dosis se muestran para los oligonucleótidos administrados a ratones construidos con una extensión 5' en la hebra en sentido o antisentido, y para una configuración tetrabucle, donde se unieron tres o cuatro ligandos de N-acetilgalactosamina a la extensión 5' o al tallo o bucle de la configuración tetrabucle.
Las figuras 31, 31A, 31B, 31C y 31D muestran algunas estructuras. La figura 31A muestra un dsNA "antisentido con muesca" que contiene una hebra en sentido con un bucle extendido (Región E) en el terminal 5', una región doble formada por la hebra antisentido con la porción monocatenaria de la hebra en sentido (Región B). Cuando el dsNA se duplica, existe una discontinuidad en la que Dicer corta la hebra antisentido (que se muestra con una flecha negra). La figura 31B muestra un dsNA "antisentido con muesca" que contiene una hebra en sentido con un bucle extendido (Región E) en el extremo 5', una región doble formada por la hebra antisentido con la porción monocatenaria de la hebra en sentido (Región B), y un sobresaliente de 3' en la hebra antisentido (Región F, que se muestra con un círculo discontinuo). Cuando el dsNA se duplica, existe una discontinuidad en la que Dicer corta la hebra antisentido (que se muestra con una flecha negra). La figura 31C muestra un dsNA de "sentido con muesca" que contiene una hebra en sentido con un bucle extendido (Región J) en el extremo 3', y una región doble formada por la hebra antisentido con la porción monocatenaria de la hebra en sentido (Región H). Cuando el dsNA está duplicado, existe una discontinuidad en la que Dicer corta la hebra en sentido (que se muestra con una flecha negra). El nucleótido inmediatamente proximal al sitio de escisión de Dicer debe ser un ribonucleótido (gris). La figura 31D muestra un dsNA de "sentido con muesca" que contiene una hebra en sentido con un bucle extendido (Región J) en el terminal 3', y una región doble formada por la hebra antisentido con la porción monocatenaria de la hebra en sentido (Región H), y un sobresaliente de 3' en la hebra antisentido (Región F mostrada por un círculo discontinuo). Cuando el dsNA está duplicado, existe una discontinuidad en la que Dicer corta la hebra en sentido (flecha negra). El nucleótido inmediatamente proximal al sitio de escisión de Dicer debe ser un ribonucleótido (gris).
Las figuras 32A y 32B muestran cómo se calculan las posiciones de los nucleótidos a partir de los extremos 5' y 3' de las hebras en sentido y antisentido de los dsNA. La figura 32A representa cómo se calculan las posiciones de los nucleótidos a partir de los extremos 5' y 3' de las hebras en sentido y antisentido cuando la hebra en sentido tiene un bucle extendido con un tetrabucle (es decir, la discontinuidad está en el mismo lado del dsNA que la hebra antisentido) Se muestra el sitio de escisión de Dicer en la hebra en sentido (flecha corta, negra). La figura 32B representa cómo se calculan las posiciones de los nucleótidos a partir de los extremos 5' y 3' de las hebras en sentido y antisentido cuando la hebra antisentido tiene un bucle extendido con un tetrabucle (es decir, la discontinuidad está en el mismo lado del ARNds que la hebra en sentido). Se muestra el sitio de escisión de Dicer en la hebra antisentido (flecha negra corta).
Las figuras 33A-33C representa ejemplos de dsNA donde existe una discontinuidad en el mismo lado de la molécula de dsNA que la hebra antisentido, es decir, "dsNA antisentido con muesca". La figura 33A representa ejemplos de ARNds "antisentido con muescas" que tienen un extremo romo. La figura 33B representa ejemplos de "antisentido con muescas" que tienen un sobresaliente 3' de 2 nucleótidos. La figura 33C representa ejemplos de dsNA "antisentido con muescas" que tienen un sobresaliente 3' de 4 nucleótidos. Cuando el dsNA se duplica, existe una discontinuidad en la que Dicer corta la hebra antisentido (flecha negra).
Las figuras 34A-34C representan ejemplos de dsNAs en los que existe una discontinuidad en el mismo lado de la molécula de dsNA que la hebra en sentido, es decir, "dsNA en sentido con muesca". La figura 34A representa ejemplos de ARNds de "sentido con muesca" que tienen un extremo romo. La figura 34B representa ejemplos de dsNA de "sentido con muesca" que tienen un sobresaliente 3' de 2 nucleótidos. La figura 34C representa ejemplos de dsNA de "sentido con muesca" de la invención que tienen una proyección 3' de 4 nucleótidos. Cuando el dsNA está duplicado, existe una discontinuidad en la que Dicer corta la hebra en sentido (flecha negra).
Las figuras 35A y 35B representan ubicaciones en las que pueden estar presentes modificaciones en los dsNA. La figura 35A representa un dsNA que muestra las posiciones de las modificaciones 2'-0-metil (mostradas por O) en la Región C de la molécula. La figura 35B representa un dsNA en donde la hebra en sentido tiene un bucle extendido con un tetrabucle (es decir, la discontinuidad está en el mismo lado del dsNA que la hebra antisentido; se muestra con una flecha negra). En el dsNA representado en la figura 35B, el extremo 5' de la hebra en sentido puede estar fosforilado (mostrado por una "p-"); el terminal 5' de la hebra guía puede estar desfosforilada; la hebra antisentido puede modificarse en las posiciones 1, 2 y 3 desde el extremo 3' de la hebra antisentido con 2'-0-metilo (mostrado por O); y la hebra antisentido puede modificarse en posiciones impares comenzando en la posición 5 desde el extremo 3' de la hebra antisentido con 2'-0-metilo (mostrado por O). En el dsNA representado en la figura 35B, la hebra en sentido puede contener desoxirribonucleótidos (mostrados por •) en las posiciones 11 y 12 del extremo 3' de la hebra antisentido.
Las figuras 36A y 36B representan ubicaciones en las que pueden estar presentes modificaciones en los dsNA. La figura 36A representa un dsNA que muestra las posiciones de las modificaciones 2'-0-metil (mostradas por O) en la Región C de la molécula. La figura 36B representa un dsNA en donde la hebra antisentido tiene un bucle extendido con un tetrabucle (es decir, la discontinuidad está en el mismo lado del ARNds que la hebra en sentido; se muestra con una flecha negra). En el dsNA representado en la figura 34B, el extremo 5' de la hebra en sentido puede estar fosforilado (mostrado por una "p-"); el terminal 5' de la hebra guía puede estar desfosforilada; la hebra antisentido puede modificarse en las posiciones 1, 2 y 3 desde el extremo 3' de la hebra antisentido con 2'-0-metilo (mostrado por O); y la hebra antisentido puede modificarse en posiciones impares comenzando en la posición 5 desde el extremo 3' de la hebra antisentido con 2'-0-metilo (mostrado por O). En el dsNA representado en la figura 36B, la hebra antisentido puede contener desoxirribonudeótidos (mostrados por •) en las posiciones 3 y 4 del extremo 5' de la hebra antisentido.
La figura 37 muestra constructos de ARNds para usar en experimentos que comparan el efecto de un ARNds sin tetrabucle, el efecto de un ARNds con un tetrabucle (es decir, UUCG), el efecto de un ARNds con un tetrabucle (es decir, UUCG) en combinación con una muesca en el mismo lado que la hebra en sentido, el efecto de un ARNds con un tetrabucle (es decir, UUCG) en combinación con una muesca en el mismo lado que la hebra antisentido, y el efecto de otro tetrabucle (es decir, GAAA) en combinación con una muesca en el mismo lado que la hebra antisentido. Todas las secuencias en los ARNds se basan en la hipoxantina fosforibosiltransferasa 1 humana (HPRT-1CC; bases de datos de NCBI Nos. NM-000194 y GI: 164518913).
La figura 38 muestra constructos de ARNds para su uso en experimentos que modifican la hebra antisentido discontinua para determinar sus efectos en la ruta de ARNi en la etapa de procesamiento de Dicer y etapas posteriores a la escisión de Dicer (por ejemplo, interacción Ago2, reconocimiento de objetivos, escisión Ago2). Todas las secuencias en los ARNds se basan en la hipoxantina fosforibosiltransferasa 1 humana (HPRT-1CC; bases de datos de NCBI Nos. NM-000194 y GI: 164518913).
La figura 39 muestra constructos de ARNds para su uso en experimentos que modifican la hebra en sentido extendida para determinar sus efectos en la ruta de ARNi en la etapa de procesamiento de Dicer y etapas anteriores a la escisión de Dicer. Todas las secuencias en los ARNds se basan en la hipoxantina fosforibosiltransferasa 1 humana (HPRT-1CC; bases de datos de NCBI Nos. NM-000194 y GI: 164518913).
La figura 40 muestra cómo la colocación de una discontinuidad define los productos de escisión fabricados por Dicer. La estructura dsNA con muescas dirige un producto de escisión único con la ventaja de que se produce una hebra antisentido de 21 bases definida y se carga en RISC. Al mover la muesca, se dirigen producciones de otras longitudes de hebras antisentido. Las modificaciones químicas imponen la producción de productos no 21-mero.
La figura 41 muestra que los tetrabucles de ADN y los extremos de ADN controlan la actividad de Dicer en el ARNds. Los constructos de ARN bicatenario se usan en experimentos que comparan el efecto de un ARNds sin tetrabucle, el efecto de un ARNds con un DNA tetrabucle (es decir, d(GTTA)), el efecto de un ARNds con un DNA tetrabucle (es decir, d(GTTA)) en combinación con una muesca en el mismo lado que la hebra en sentido, el efecto de un ARNds con un ADN tetrabucle (es decir, d(GTTA)) en combinación con una muesca en el mismo lado que la hebra antisentido, y el efecto de otro ADN tetrabucle (es decir, d(TTTT)) en combinación con una muesca en el mismo lado que la hebra antisentido. Todas las secuencias en los ARNds se basan en la hipoxantina fosforibosiltransferasa 1 humana (HPRT-1CC; bases de datos de NCBI Nos. NM-000194 y GI: 164518913).
La figura 42 muestra un diseño conjugado de ligando en donde la molécula de dsNA comprende un tetrabucle con muesca y el ligando, por ejemplo, GalNac, colesterol, folato, 6-fosfato de manosa.
La figura 43 muestra un dsNA conjugado con ligando que comprende una extensión 5' en la hebra guía y que comprende un ligando, por ejemplo, GalNac, colesterol, ácido fólico y manosa-6-fosfato.
La figura 44 muestra un dsNA conjugado con ligando que comprende una extensión 5' en la hebra pasajera y un ligando, por ejemplo, GalNac, colesterol, ácido fólico y manosa-6-fosfato.
La figura 45 muestra las posibles combinaciones iterativas de una extensión monocatenaria en la molécula de dsNA, la molécula de dsNA también se contempla con uno o dos sobresalientes en los extremos sin extensiones.
La figura 46 presenta dsNAs.
La figura 47 presenta los dsNAcon un tetrabucle.
Descripción detallada
La divulgación proporciona composiciones y métodos para reducir la expresión de un gen diana en una célula, que implica poner en contacto una célula con un ácido nucleico bicatenario aislado en una cantidad eficaz para reducir la expresión de un gen diana en una célula. Además de los dsNA que contienen tetrabucle de la invención, la aplicación también proporciona dsNA que poseen una región de nucleótidos monocatenaria en el extremo 5' de la hebra antisentido, el terminal 3' de la hebra en sentido, el terminal 5' del sentido hebra o el extremo 3' de la hebra antisentido o combinaciones de las mismas en donde la extensión se conjuga al menos un ligando como se define en el presente documento. Estas estructuras son agentes de interferencia de ARN efectivos (véase figuras 25-30 y Ejemplos asociados). En la mayoría de las realizaciones, la extensión monocatenaria comprende al menos una modificación de nucleótidos y/o fosfatos modificados. Sorprendentemente, como se demuestra en el presente documento, los siARN de Dicer-sustrato extendido monocatenario (ARNsi) o siARN sin sustrato-Dicer conjugados con un ligando o en ausencia de un ligando son agentes inhibidores de ARN eficaces en comparación con los correspondientes DARNsi o sustrato no Dicer ARNsi.
La capacidad de conjugar ligandos a la región tetrabucle de las moléculas de dsNA de acuerdo con la invención reivindicada permite el suministro de las moléculas de dsNA a la región de interés que, por ejemplo, pueden ser hepatocitos.
Los hallazgos informados en este documento proporcionan motivación para generar DARNsi funcionales que tienen una región extendida que permite la unión de grupos funcionales adicionales y/o distintos, inclusión/diseño de modificaciones estabilizadoras (por ejemplo, unidades estructurales PS-NA) u otras formas de modificaciones capaces de agregar funcionalidad adicional y/o potenciar, por ejemplo, farmacocinética, farmacodinámica o biodistribución de dichos DARNsi extendidos, en comparación con los DARNsi que no contienen dichos dominios extendidos híbridos de ADN o ARN o ADN/ARN de hebra sencilla.
Las ventajas de un DARNsi con una hebra de guía extendida de 5', una hebra pasajera extendida de 3', una hebra pasajera extendida de 5' o una hebra de guía extendida de 3' que tiene una mayor actividad de un post-Dicer procesado en comparación con el agente ARNsi de longitud similar es enfatizado por los resultados presentados aquí. La capacidad de extender la hebra guía 5', la hebra pasajera 3', la hebra pasajera 5' o la hebra guía 3' de los agentes DARNsi sin observar una reducción correspondiente en la actividad silenciadora de ARN permite que ciertos grupos funcionales se unan a tales agentes que no podrían agregarse a moléculas no extendidas sin interferir con la actividad de silenciamiento de ARN debido a configuraciones más estrictas. El sorprendente descubrimiento de que los sustratos no Dicer extendidos monocatenarios reducen la expresión de un gen diana así como los dsNA no extendidos permite la generación de sustratos no Dicer funcionales que tienen una región extendida que permite la unión de adicionales y/o grupos funcionales distintos, inclusión/diseño de modificaciones estabilizadoras (por ejemplo, unidades estructurales PS-NA) u otras formas de modificaciones tales modificaciones o unidades estructurales unidos que agregan funcionalidad adicional y/o mejoran, por ejemplo, farmacocinética, farmacodinámica o biodistribución de dicho ADN extendido , en comparación con los agentes de ARNds de longitud correspondiente que no contienen dichos ADN o ARN únicos o dominios extendidos híbridos de ADN/ARN.
La ventaja proporcionada por la nueva capacidad de alargar la hebra guía de 5', la hebra pasajera 3' o la hebra pasajera 5' de sustratos no Dicer que contienen doble de dsNA a la vez que retiene la actividad de agente de ARNsi procesado después de Dicer niveles mayores que los dobles de ARNds de longitud similar se enfatiza por los resultados presentados aquí. La capacidad de extender la hebra guía 5', la hebra 3' pasajera o la hebra 5' pasajera de sustratos que no son de Dicer sin observar una reducción correspondiente en la actividad silenciadora de ARN también puede permitir que ciertos grupos funcionales se unan a dichos agentes que de lo contrario no sería posible, debido a la capacidad de tales grupos funcionales para interferir con la actividad de silenciamiento de ARN cuando están presentes en configuraciones más estrictas.
Además, los agentes de DARNsi extendidos monocatenarios pueden incluir un tercer oligonucleótido corto (1-16 nucleótidos de longitud) que se empareja con la región monocatenaria de DARNsi extendidos monocatenarios, por ejemplo, qué pares de bases a una guía 5' región extendida monocatenaria. El tercer oligo funciona ventajosamente: (a) para estabilizar la extensión monocatenaria y (b) para proporcionar una entidad independiente a la que se podría unir una molécula dirigida (u otro agente activo), y que luego se podría unir a la hebra sencilla DARNsi extendido mediante fusión (frente a la unión directa de la molécula de direccionamiento al DARNsi extendido monocatenario).
El tetrabucle proporciona una mayor estabilidad al oligómero, incluida una mayor resistencia a la nucleasa en comparación con un oligómero que carece de un tetrabucle. La presencia de una muesca en la hebra antisentido permite que el oligómero funcione como una molécula de ARNsi y como un sustrato de Dicer; dependiendo de la longitud del doble. El oligómero incluye una hebra antisentido precortada debido a la presencia de la muesca, que proporciona un sustrato de Dicer escindible y/o un sustrato de unión a Dicer. La estructura tetrabucle se puede unir covalentemente a un ligando en varios lugares dentro de la estructura, incluidas las regiones de tallo y bucle. Sorprendentemente, la adición de un ligando no afecta la estructura del tetrabucle. En particular, los oligómeros que contienen el tetrabucle y la muesca donde los nucleótidos del tetrabucle se conjugaron con el ligando sorprendentemente mantuvieron su función como moléculas de ARNsi (ver, por ejemplo, Ejemplo 22-24). La presencia de una muesca en el oligómero proporciona la utilización de una variedad de modificaciones químicas en la hebra antisentido. La estructura tetrabucle descrita en este documento no requiere la escisión de Dicer para la actividad de ARNi.
El sorprendente descubrimiento de que los sustratos no Dicer monocatenarios que comprenden un tetrabucle no exhiben disminuciones en la eficacia permite la generación de sustratos no Dicer que permanecen efectivos mientras proporcionan mayor espacio para, por ejemplo, la unión de sustratos no Dicer a otros y/o grupos funcionales distintos, inclusión/diseño de modificaciones estabilizadoras (por ejemplo, unidades estructurales PS-NA) u otras formas de modificaciones capaces de agregar funcionalidad adicional y/o potenciar, por ejemplo, farmacocinética, farmacodinámica o biodistribución de dichos agentes, como en comparación con los agentes de ARNds de longitud correspondiente que no contienen dichos dominios extendidos de ADN monocatenarios.
En una realización de la presente invención, el tetrabucle está ubicado en el extremo 5' de la hebra en sentido. En otra realización, el tetrabucle está ubicado en el extremo 3' de la hebra en sentido. En otra realización, el tetrabucle está ubicado en el extremo 5' de la hebra antisentido. En otra realización, el tetrabucle está ubicado en el extremo 3' de la hebra antisentido. El tetrabucle, ubicado en cualquier posición de la molécula de dsNA, extremo 5' o 3', hebra en sentido o antisentido, se puede conjugar fácilmente con uno o más ligandos como GalNAc, fosfato de manosa-6, colesterol y ácido fólico. Aquí se proporcionan métodos de síntesis de dsNA, métodos de conjugación, ensayos de la actividad de un dsNA que comprende un tetrabucle ubicado en el extremo 5' de la hebra en sentido o en el extremo 5' de un dsNA a un ligando y la hebra antisentido. Los métodos descritos de conjugación y síntesis pueden modificarse para generar moléculas de dsNA que comprenden un tetrabucle en el extremo 3' de la hebra en sentido o en el extremo 3' de la hebra antisentido.
Definiciones
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en este documento tienen el significado comúnmente entendido por un experto en la materia a la que pertenece esta invención. Las siguientes referencias proporcionan a los expertos una definición general de muchos de los términos utilizados en esta invención: Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Ed. Walker, 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); y Hale and Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991). Como se usa en este documento, los siguientes términos tienen los significados que se les atribuyen a continuación, a menos que se especifique lo contrario.
Como se usa en el presente documento, el término "ácido nucleico" se refiere a desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos o nucleótidos modificados, y sus polímeros en forma monocatenaria o bicatenaria. El término abarca ácidos nucleicos que contienen análogos de nucleótidos conocidos o residuos o enlaces de hebra principal modificados, que son sintéticos, naturales y no naturales, que tienen propiedades de unión similares al ácido nucleico de referencia, y que, en ciertos casos, se metabolizan en de manera similar a los nucleótidos de referencia. Ejemplos de tales análogos incluyen, sin limitación, fosforotioatos, fosforamidatos, metilfosfonatos, metilfosfonatos quirales, 2-O-metil ribonucleótidos, ácidos peptidonucleicos (PNA).
Como se usa en el presente documento, "nucleótido" se usa como se reconoce en la técnica para incluir aquellos con bases naturales (estándar) y bases modificadas bien conocidas en la técnica. Dichas bases están generalmente ubicadas en la posición 1' de una unidad estructural de azúcar nucleótido. Los nucleótidos generalmente comprenden una base; azúcar y un grupo fosfato. Los nucleótidos también incluyen ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos, nucleótidos abásicos, nucleótidos abásicos invertidos y análogos de nucleótidos. Los nucleótidos pueden ser no modificados o modificados en la unidad estructural de azúcar, fosfato y/o base, (también denominados indistintamente como análogos de nucleótidos, nucleótidos modificados, nucleótidos no naturales, nucleótidos no estándar y otros; véase, por ejemplo, Usman and McSwiggen, supra; Eckstein, et al., Publicación internacional PCT No. WO 92/07065; Usman et al., Publicación internacional PCT No. WO 93/15187; Uhlman and Peyman, supra). Algunos de los ejemplos conocidos de nucleótidos modificados incluyen un análogo de base seleccionado del grupo que consiste en: hipoxantina (I), xantina (X), 3p-D-ribofuranosil-(2,6-diaminopirimidina) (K), 3p-D-ribofuranosil-(1-metil-pirazolo[4,3-d] pirimidina-5,7(4H,6H)-diona) (P), iso-citosina (iso-C), iso-guanina (iso-G), 1-p-D-ribofuranosil-(5-nitroindol), 1-p-D-ribofuranosil-(3-nitropirrol), 5-bromouracilo, 2-aminopurina, 4-tio-dT, 7-(2-tienilo)- imidazo[4,5-b]piridina (Ds), pirrol-2-carbaldehído (Pa), 2-amino-6-(2-tienil)purina (S), 2-oxopiridina (Y), difluorotolilo, 4-fluoro -6-metilbencimidazol, 4-metilbencimidazol, 3-metil isocarboestirililo, 5-metil isocarboestirililo, 3-metil-7-propinil isocarboestilrilo, 7-azaindolilo, 6-metil-7-azaindolilo, imidizopiridinilo, 9-metilimidizopiridinilo, pirrolopirizinilo, isocarboestirililo, 7-propinil isocarboestirililo, propinil-7-azaindolilo, 2,4,5-trimetilfenilo, 4-metilindolilo, 4,6-dimetilindolilo, fenilo, naftalenilo, antracenilo, fenantracenilo, pirenilo, estilbencilo, tetracenilo y pentacenilo. Algunas de las modificaciones comunes a la unidad estructural de azúcar se seleccionan del grupo que comprende 2'-O-metilo, 2'-metoxietoxi, 2'-fluoro, 2'-alilo, 2'-O-[2-(metilamino)-2-oxoetilo], 4'-tio, puente 4'-Ch2-O-2'-, puente 4'-(Ch2)2-O-2'-, 2'-LNA, 2'-amino, o modificaciones de 2'-O-(N-metilcarbamato). En la técnica se conocen otros ejemplos de bases de ácido nucleico modificadas, por ejemplo, tal como se resume en Limbach et al., Nucleic Acids Res. 22: 2183, 1994. Algunos de los ejemplos no limitantes de modificaciones de bases que pueden introducirse en moléculas de ácido nucleico incluyen, hipoxantina, purina, piridin-4-ona, piridin-2-ona, fenilo, pseudouracilo, 2,4, 6-trimetoxibenceno, 3-metil uracilo, dihidrouridina, naftilo, aminofenilo, 5-alquilcitidinas (por ejemplo, 5-metilcitidina), 5-alquiluridinas (por ejemplo, ribotimidina), 5-halouridina (por ejemplo, 5-bromouridina) o 6-azapirimidinas o 6-alquilpirimidinas (por ejemplo, 6-metiluridina), propino y otros (Burgin, et al., Biochemistry 35: 14090, 1996; Uhlman and Peyman, supra). Por "bases modificadas" en este aspecto se entiende bases de nucleótidos distintas de adenina, guanina, citosina y uracilo en la posición 1' o sus equivalentes.
Como se usa en el presente documento, el término "monómero" se usa indistintamente con "nucleótido".
Como se usa en este documento, un "ácido nucleico bicatenario" o "dsNA" es una molécula que comprende dos hebras de oligonucleótidos que forman un doble. Un dsNA puede contener ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos, nucleótidos modificados y combinaciones de los mismos. Las moléculas de dsNA pueden ser un sustrato de Dicer o un sustrato no Dicer. En realizaciones en las que la molécula de dsNA es un sustrato de Dicer, la molécula de dsNA se denomina sustrato de Dicer NA (dsiNA). En realizaciones en las que el dsiNA comprende una pluralidad de ARN, se denomina un ARNsi sustrato de Dicer (DARNsi). Las moléculas de DARNsi comprenden moléculas de ADN y ARN. DARNsi es un subconjunto de DsiNA que es un subconjunto de dsNA. Por lo tanto, el término dsNA incluye dsiNA, doble de ADN, doble de ADN/ARN, doble de ARN y DARNsi. Los NA de doble hebra de la presente invención incluyen sustratos para proteínas y complejos de proteínas en la ruta de interferencia de ARN, por ejemplo, Dicer y RISC. La estructura de ejemplo de los dsNA se muestra en la figura 1, B. En ciertas realizaciones, los dsNA comprenden un doble de ARN en una región que es capaz de funcionar como un ARNsi de sustrato de Dicer (DARNsi) y una región monocatenaria, que se encuentra en una posición 5' del sitio de escisión de Dicer proyectado de la segunda hebra del agente DARNsi/ADN. En otra realización, el dsNA comprende un doble de ARN en una región que es capaz de funcionar como un ARNsi de sustrato de Dicer (DARNsi) y una región monocatenaria, que se encuentra en una posición 3' del sitio de escisión Dicer proyectado de la primera hebra del agente DARNsi/ADN. En otra realización, el dsNA comprende un doble de ARN que es un ARNsi de sustrato de Dicer (DARNsi) y una región monocatenaria que comprende al menos una modificación de nucleótidos y/o fosfato modificada, que se encuentra en una posición 3' del sitio de escisión de Dicer proyectado de la segunda hebra del agente DARNsi/ADN. En realizaciones alternativas, el dsNA comprende un doble de ARN que es un ARNsi de sustrato de Dicer (DARNsi) y una región monocatenaria que comprende al menos una modificación de nucleótidos modificados y/o esqueleto de fosfato, que se encuentra en una posición 5' del sitio de escisión de Dicer proyectado de la primera hebra del agente DARNsi/ADN.
Como se usa en el presente documento, el término "oligómero" se usa indistintamente con "ácido nucleico bicatenario" (dsNA). Un oligómero (molécula de dsNA) comprende monómeros (nucleótidos).
Como se usa en el presente documento, el término "pluralidad" significa un número mayor que dos, por ejemplo, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más.
Como se usa en el presente documento, el término "espaciador" significa un nucleótido que separa los nucleótidos modificados con el ligando entre sí.
Como se usa en el presente documento, el término "conector liberable" se refiere a un conector que es capaz de experimentar la escisión del enlace que conecta un ligando con un nucleótido en condiciones fisiológicas dentro de una célula o animal o en condiciones in vivo. Un conector liberable incluye un conector biolábil y, tras la escisión, libera el ligando de la molécula de dsNA. Las unidades estructurales enlazadoras también son capaces de escindirse en diversas condiciones. Las condiciones adecuadas para la escisión pueden incluir, pero no se limitan a, pH, irradiación UV, actividad enzimática, temperatura, hidrólisis, reacciones de eliminación y sustitución, y también propiedades termodinámicas del enlace. Los enlazadores liberables pueden ser de naturaleza fotolábil en la que los enlazadores se escinden bajo longitudes de onda UV particulares, los dsNA que contienen enlazadores fotolábiles pueden usarse para suministrar compuestos a una célula o tejido objetivo de interés y pueden liberarse posteriormente en presencia de una fuente UV.
Como se usa en el presente documento, el término "enlazador biodegradable" se refiere a un ácido nucleico o una molécula de ácido no nucleico que está diseñado para ser biodegradable y sirve como un enlazador para conectar una molécula con otra molécula, por ejemplo, una molécula bioactiva. La estabilidad del enlazador biodegradable se puede modular mediante el uso de varias combinaciones de nucleótidos, desoxirribonucleótidos y nucleótidos modificados químicamente, por ejemplo 2'-O-metil, 2'-O-fluoro, 2'-amino, 2'-O-amino, 2'-C-alilo, 2'-O-alilo y otros nucleótidos 2'-modificados o modificados en base. El enlazador biodegradable puede ser un dímero, trímero, tetrámero o más largo, por ejemplo, un oligonucleótido de aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 nucleótidos de longitud o pueden comprender un solo nucleótido de longitud con un enlace basado en fósforo. El enlazador biodegradable también puede comprender una hebra principal de ácido nucleico, azúcar ácido nucleico o modificaciones de bases de ácido nucleico.
Como se usa en el presente documento, el término "biodegradable" se refiere a la degradación en un sistema biológico, por ejemplo, degradación enzimática o degradación química.
Como se usa en el presente documento, el término "etiqueta detectable" se refiere a cualquier etiqueta adecuada conocida en la técnica e incluye, pero no se limita a etiquetas radiomarcadas, quimioluminiscentes y fluorescentes. En muchos casos, la etiqueta es de un tipo que no alterar sustancialmente la absorción celular de las moléculas de ácido nucleico marcadas.
Como se usa en el presente documento, el término "colorante" se refiere a una etiqueta que puede detectarse por quimioluminiscencia o fluorescencia, los ejemplos usados comúnmente incluyen, pero no se limitan a TAMRa , fluoresceína, cy3 y cy5, etc. La señal o señales generadas por la etiqueta(s) puede medirse de varias maneras, incluyendo visualmente (por ejemplo, por microscopía) o clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). En cualquier caso, la medición de la(s) señal(es) generada(s) etiqueta(s) se puede utilizar para determinar (a) el número o porcentaje de celdas que han tomado la etiqueta(s), (b) la cantidad de una o más etiquetas captado por células individuales o grupos de células, o (c) tanto (a) como (b).
Como se usa en el presente documento, el término "vida media" se refiere al tiempo que le toma a una molécula, por ejemplo, un dsNA, un metabolito, un producto farmacéutico, un nucleótido radiactivo, una molécula terapéutica, un colorante o una molécula de señalización para usar la mitad de su actividad farmacológica, fisiológica o radiológica o la mitad de su intensidad.
Como se usa en el presente documento, los términos "nucleótido modificado por ligando" o "nucleótido conjugado con ligando" o "nucleótido que contiene ligando" se usan indistintamente para denotar un nucleótido al que está unido un ligando, siendo la unión al azúcar o la base o al fosfato terminal mediante el uso de un enlazador.
Como se usa en el presente documento, un agente de ARNsi de sustrato "DARNsi" o Dicer es una molécula que comprende dos hebras de oligonucleótidos que forman un doble. Un agente de DARNsi puede contener ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos, nucleótidos modificados y combinaciones de los mismos. Los agentes de DARNsi deben ser procesados por la enzima Dicer de la ruta de interferencia de IARN.
En ciertas realizaciones, los DARNsi de la invención pueden poseer residuos de desoxirribonucleótidos en sitios inmediatamente adyacentes al sitio o sitios de escisión de la enzima Dicer proyectados. Por ejemplo, en todos los DARNsi mostrados en la figura 2 y en los DARNsi sexto, séptimo, octavo, noveno, décimo, undécimo y duodécimo que se muestran en la figura 3, se pueden encontrar desoxirribonucleótidos (comenzando en el residuo terminal 5' de la primera hebra como posición 1) en la posición 24 y sitios 3' de la posición 24 (por ejemplo, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, etc.). Los desoxirribonucleótidos también pueden estar en la segunda hebra que comienza en el nucleótido que es complementario a la posición 20 de la primera hebra, y también en las posiciones en la segunda hebra que se encuentran en la dirección 5' de este nucleótido. Por lo tanto, ciertos DARNsi efectivos de la invención poseen solo 19 ribonucleótidos duplicados antes del comienzo de la introducción de desoxirribonucleótidos dentro de la primera hebra, la segunda hebra y/o ambas hebras de dichos DARNsi.
Como se usa en el presente documento, "doble" se refiere a una estructura helicoidal doble formada por la interacción de dos ácidos nucleicos monocatenarios. De acuerdo con la presente invención, un doble puede contener hebras primera y segunda que son sentido y antisentido, o una hebra diana y antisentido del dsNA. Un doble se forma típicamente por el enlace de bases de hidrógeno por pares, es decir, "emparejamiento de bases", entre dos ácidos nucleicos monocatenarios que están orientados antiparalelos entre sí. Como se usa en el presente documento, el término "doble" se refiere a regiones de la primera y segunda hebras que se alinean de tal manera que, si las bases alineadas de las hebras son complementarias, pueden formar un par de bases Watson-Crick. El término "doble" no incluye uno o más nucleótidos monocatenarios que comprenden uno o más nucleótidos monocatenarios terminales 5' o 3'. En algunas realizaciones, el doble incluye una región de primer y segunda hebras alineados que pueden estar completamente (100%) emparejados con bases y una región de hebras alineados primero y segundo que contiene 1, 2, 3, 4, 5 o más bases sin emparejar, como siempre que el nucleótido terminal 5' de la primera hebra del doble y el nucleótido terminal 3' de la primera hebra del doble sean bases de Watson-Crick emparejadas con un nucleótido correspondiente de la segunda hebra. Como se usa en el presente documento, "completamente duplicado" se refiere a todos los nucleótidos entre los nucleótidos terminales 5' y 3' emparejados que están emparejados con bases. Como se usa en el presente documento, "sustancialmente doble" se refiere a un doble entre las hebras en donde hay 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 30, 40, 50 pares de bases no emparejadas (consecutivos o no consecutivos) entre los nucleótidos terminales 5' y 3' terminales de la primera hebra.
En el contexto de "sustancialmente duplicado", "consecutivo", "consecutivo", en cuanto a que se refiere a nucleótidos duplicados, significa un tramo de más de dos nucleótidos adyacentes en un sentido o una hebra antisentido que no forma el emparejamiento de bases Watson-Crick con la otra hebra.
En el contexto de "sustancialmente duplicado", "no consecutivo", ya que se refiere a nucleótidos duplicados, significa no coincidencias en la hebra en sentido o antisentido que están separados por más de un nucleótido entre sí.
El emparejamiento en doble generalmente ocurre mediante el emparejamiento de bases de Watson-Crick, por ejemplo, guanina (G) forma un par de bases con citosina (C) en ADN y ARN (por lo tanto, el nucleótido afín de un desoxirribonucleótido de guanina es un desoxirribonucleótido de citosina, y viceversa), la adenina (A) forma un par de bases con timina (T) en el ADN, y la adenina (A) forma un par de bases con uracilo (U) en el ARN. Las condiciones bajo las cuales se pueden formar pares de bases incluyen condiciones fisiológicas o biológicamente relevantes (por ejemplo, intracelular: pH 7,2, ion potasio 140 mM; pH extracelular 7,4, ion sodio 145 mM). Además, los dobles se estabilizan mediante el apilamiento de interacciones entre nucleótidos adyacentes. Como se usa en este documento, se puede establecer o mantener un doble mediante emparejamiento de bases o interacciones de apilamiento. Un doble está formado por dos hebras de ácido nucleico complementarias, que pueden ser sustancialmente complementarias o completamente complementarias (véase más abajo).
Como se usa en el presente documento, "corresponde a" o "correspondiente a" se refiere a las bases de la primera y segunda hebra que están alineadas en un doble de modo que el residuo de nucleótido de la segunda hebra se alinee con el residuo de la primera hebra, cuando la primera hebra la posición 1 está emparejada con un nucleótido de dicha segunda hebra de manera que dicha segunda hebra comprende un sobresaliente de hebra sencilla 3' de 1-6 nucleótidos de longitud. "Corresponde a" no requiere emparejamiento mediante la formación de un par de bases Watson-Crick, sino que incluye nucleótidos alineados y no emparejados de primera hebra/segunda hebra, así como nucleótidos alineados y emparejados de primera hebra/segunda hebra.
Por "complementario" o "complementariedad" se entiende que un ácido nucleico puede formar enlaces de hidrógeno con otra secuencia de ácido nucleico mediante el emparejamiento de bases tradicional de Watson-Crick o Hoogsteen. En referencia a las moléculas de ácido nucleico de La presente divulgación, la energía libre de unión para una molécula de ácido nucleico con su secuencia complementaria es suficiente para permitir que proceda la función relevante del ácido nucleico, por ejemplo, actividad de ARNi. La determinación de las energías libres de unión para las moléculas de ácido nucleico es bien conocida en la técnica (véase, por ejemplo, Turner, et al., CSH Symp. Quant. Biol. LII, págs.
123-133, 1987; Frier, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 83: 9373-9377, 1986; Turner, et al., J. Am. Chem. Soc. 109: 3783-3785, 1987). Un porcentaje de complementariedad indica el porcentaje de residuos contiguos en una molécula de ácido nucleico que puede formar enlaces de hidrógeno (por ejemplo, emparejamiento de bases de Watson-Crick) con una segunda secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 nucleótidos de un total de 10 nucleótidos en el primer oligonucleótido que se empareja con una segunda secuencia de ácido nucleico que tiene 10 nucleótidos representa 50%, 60%, 70%, 80%, 90% y 100% complementario, respectivamente). Para determinar que un porcentaje de complementariedad es de al menos un cierto porcentaje, el porcentaje de residuos contiguos en una molécula de ácido nucleico que puede formar enlaces de hidrógeno (por ejemplo, emparejamiento de bases de Watson-Crick) con una segunda secuencia de ácido nucleico se calcula y se redondea a la número entero más cercano (por ejemplo, 12, 13, 14, 15, 16 o 17 nucleótidos de un total de 23 nucleótidos en el primer oligonucleótido que se basa emparejado con una segunda secuencia de ácido nucleico que tiene 23 nucleótidos representa el 52%, 57%, 61%, 65%, 70% y 74%, respectivamente; y tiene al menos 50%, 50%, 60%, 60%, 70% y 70% de complementariedad, respectivamente). Como se usa en el presente documento, "sustancialmente complementario" se refiere a la complementariedad entre las hebras de modo que sean capaces de hibridarse en condiciones biológicas. Las secuencias sustancialmente complementarias tienen 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o incluso 100% de complementariedad. Además, las técnicas para determinar si dos hebras son capaces de hibridarse en condiciones biológicas mediante el examen de sus secuencias de nucleótidos son bien conocidas en la técnica.
Como se usa en el presente documento, la "región 3 '" con respecto a la hebra antisentido se refiere a los nucleótidos consecutivos de la hebra antisentido que son 3' distales (en la hebra antisentido) al nucleótido de la hebra antisentido que se alinea con las correspondientes posiciones 1-19, 1-20 o 1-21 de la hebra en sentido. Para evitar dudas, la "región 3'", cuando se refiere a la hebra antisentido, debe abarcar nucleótidos antisentido en un doble formado entre la hebra antisentido y su ARN diana afín 3' distal a (en la hebra antisentido que corresponde a los nucleótidos en el ARN diana que está 5' distal a) el sitio de corte proyectado de Argonaute 2 (Ago2).
Como se usa en el presente documento, "sintón" significa una unidad estructural nucleótido o no nucleótido que puede usarse en métodos de síntesis en fase sólida para producir una molécula de ADN, ARN o ADN/ARN modificada que tiene una secuencia particular de interés. En ciertas realizaciones, un sintón es una unidad estructural nucleótido o no nucleótido conjugado con un ligando, por ejemplo, GalNac, manosa-6-fosfato, colesterol o folato, en donde la unidad estructural nucleótido conjugado o no nucleótido puede usarse en síntesis en fase sólida para producir una molécula de ácido nucleico de interés. En ciertas realizaciones, un sintón comprende además un conector a través del cual la unidad estructural nucleótido o no nucleótido se conjuga con el ligando.
El término "alquilo" incluye grupos alifáticos saturados, que incluyen grupos alquilo de hebra lineal (por ejemplo, metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, hexilo, heptilo, octilo, nonilo, decilo, etc.), grupos alquilo de hebra ramificada (isopropilo, tert-butilo, isobutilo, etc.), grupos cicloalquilo (alicíclico) (ciclopropilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo, ciclooctilo), grupos cicloalquilo sustituidos con alquilo y grupos alquilo sustituidos con cicloalquilo. En ciertas realizaciones, un alquilo de hebra lineal o hebra ramificada tiene 6 átomos de carbono o menos en su hebra principal (por ejemplo, C1-C6 para hebra lineal, C3-C6 para hebra ramificada), y más preferiblemente 4 o menos. Asimismo, los cicloalquilos preferidos tienen de 3-8 átomos de carbono en su estructura de anillo, y más preferiblemente tienen 5 o 6 carbonos en la estructura de anillo. El término C1-C6 incluye grupos alquilo que contienen de 1 a 6 átomos de carbono.
Además, a menos que se especifique lo contrario, el término alquilo incluye tanto "alquilos no sustituidos" como "alquilos sustituidos", el último de los cuales se refiere a unidades estructurales alquilo que tienen sustituyentes seleccionados independientemente que reemplazan un hidrógeno en uno o más carbonos de la hebra principal de hidrocarburos. Tales sustituyentes pueden incluir, por ejemplo, alquenilo, alquinilo, halógeno, hidroxilo, alquilcarboniloxi, arilcarboniloxi, alcoxicarboniloxi, ariloxicarboniloxi, carboxilato, alquilcarbonilo, arilcarbonilo, alcoxicarbonilo, aminocarbonilo, alquilaminocarbonilo, dialquilaminocarbonilo, alquiltiocarbonilo, alcoxilo, fosfato, fosfonato, fosfinato, ciano, amino (incluyendo alquilamino, dialquilamino, arilamino, diarilamino y alquilarilamino), acilamino (incluyendo alquilcarbonilamino, arilcarbonilamino, carbamoilo y ureido), amidino, imino, sulfhidrilo, alquiltio, ariltio, tiocarboxilato, sulfatos, alquilsulfinilo, sulfonato, sulfamoilo, sulfonamido, nitro, trifluorometilo, ciano, azido, heterociclilo, alquilarilo o una unidad estructural aromático o heteroaromático. Los cicloalquilos se pueden sustituir adicionalmente, por ejemplo, con los sustituyentes descritos anteriormente. Una unidad estructural "alquilarilo" o "arilalquilo" es un alquilo sustituido con un arilo (por ejemplo, fenilmetilo (bencilo)). El término "alquilo" también incluye las hebras laterales de aminoácidos naturales y no naturales. El término "n-alquilo" significa un grupo alquilo no sustituido de hebra lineal (es decir, no ramificado).
El término "alquenilo" incluye grupos alifáticos insaturados de longitud análoga y posible sustitución de los alquilos descritos anteriormente, pero que contienen al menos un doble enlace. Por ejemplo, el término "alquenilo" incluye grupos alquenilo de hebra lineal (por ejemplo, etilenilo, propenilo, butenilo, pentenilo, hexenilo, heptenilo, octenilo, nonenilo, decenilo, etc.), grupos alquenilo de hebra ramificada, grupos cicloalquenilo (alicíclico) (ciclopropenilo, ciclopentenilo, ciclohexenilo, cicloheptenilo, ciclooctenilo), grupos cicloalquenilo sustituidos con alquilo o alquenilo, y grupos cicloalquilo o alquenilo sustituido con cicloalquenilo. En ciertas realizaciones, un grupo alquenilo de hebra lineal o hebra ramificada tiene 6 átomos de carbono o menos en su hebra principal (por ejemplo, C2-C6 para hebra lineal, C3-C6 para hebra ramificada). Asimismo, los grupos cicloalquenilo pueden tener de 3 a 8 átomos de carbono en su estructura de anillo, y más preferiblemente tienen 5 o 6 carbonos en la estructura de anillo. El término C2-C6 incluye grupos alquenilo que contienen de 2 a 6 átomos de carbono.
Además, a menos que se especifique lo contrario, el término alquenilo incluye tanto “alquenilos no sustituidos” como “alquenilos sustituidos”, el último de los cuales se refiere a unidades estructurales alquenilo que tienen sustituyentes seleccionados independientemente que reemplazan un hidrógeno en uno o más carbonos de la hebra principal de hidrocarburos. Dichos sustituyentes pueden incluir, por ejemplo, grupos alquilo, grupos alquinilo, halógenos, hidroxilo, alquilcarboniloxi, arilcarboniloxi, alcoxicarboniloxi, ariloxicarboniloxi, carboxilato, alquilcarbonilo, arilcarbonilo, alcoxicarbonilo, aminocarbonilo, alquilaminocarbonilo, dialquilaminocarbonilo, alquiltiocarbonilo, alcoxilo, fosfato, fosfonato, fosfinato, ciano, amino (incluyendo alquilamino, dialquilamino, arilamino, diarilamino y alquilarilamino), acilamino (incluyendo alquilcarbonilamino, arilcarbonilamino, carbamoilo y ureido), amidino, imino, sulfhidrilo, alquiltio, ariltio, tiocarboxilato, sulfatos, alquilsulfinilo, sulfonato, sulfamoilo, sulfonamido, nitro, trifluorometilo, ciano, azido, heterociclilo, alquilarilo o una unidad estructural aromático o heteroaromático.
El término "alquinilo" incluye grupos alifáticos insaturados de longitud análoga y posible sustitución a los alquilos descritos anteriormente, pero que contienen al menos un triple enlace. Por ejemplo, el término "alquinilo" incluye grupos alquinilo de hebra lineal (por ejemplo, etinilo, propinilo, butinilo, pentinilo, hexinilo, heptinilo, octinilo, noninilo, decinilo, etc.), grupos alquinilo de hebra ramificada y cicloalquilo o cicloalquenilo sustituido grupos alquinilo. En ciertas realizaciones, un grupo alquinilo de hebra lineal o hebra ramificada tiene 6 átomos de carbono o menos en su hebra principal (por ejemplo, C2-C6 para hebra lineal, C3-C6 para hebra ramificada). El término C2-C6 incluye grupos alquinilo que contienen de 2 a 6 átomos de carbono.
Además, a menos que se especifique lo contrario, el término alquinilo incluye tanto "alquinilos no sustituidos" como "alquinilos sustituidos", el último de los cuales se refiere a unidades estructurales alquinilo que tienen sustituyentes seleccionados independientemente que reemplazan un hidrógeno en uno o más carbonos de la hebra principal de hidrocarburos. Dichos sustituyentes pueden incluir, por ejemplo, grupos alquilo, grupos alquinilo, halógenos, hidroxilo, alquilcarboniloxi, arilcarboniloxi, alcoxicarboniloxi, ariloxicarboniloxi, carboxilato, alquilcarbonilo, arilcarbonilo, alcoxicarbonilo, aminocarbonilo, alquilaminocarbonilo, dialquilaminocarbonilo, alquiltiocarbonilo, alcoxilo, fosfato, fosfonato, fosfinato, ciano, amino (incluyendo alquilamino, dialquilamino, arilamino, diarilamino y alquilarilamino), acilamino (incluyendo alquilcarbonilamino, arilcarbonilamino, carbamoilo y ureido), amidino, imino, sulfhidrilo, alquiltio, ariltio, tiocarboxilato, sulfatos, alquilsulfinilo, sulfonato, sulfamoilo, sulfonamido, nitro, trifluorometilo, ciano, azido, heterociclilo, alquilarilo o una unidad estructural aromático o heteroaromático.
A menos que se especifique lo contrario el número de carbonos, "alquilo inferior" como se usa en el presente documento significa un grupo alquilo, como se definió anteriormente, pero que tiene de uno a cinco átomos de carbono en su estructura principal. "Alquenilo inferior" y "alquinilo inferior" tienen longitudes de hebra de, por ejemplo, 2-5 átomos de carbono.
El término "alcoxi" incluye grupos alquilo, alquenilo y alquinilo sustituidos y no sustituidos unidos covalentemente a un átomo de oxígeno. Ejemplos de grupos alcoxi incluyen grupos metoxi, etoxi, isopropiloxi, propoxi, butoxi y pentoxi. Ejemplos de grupos alcoxi sustituidos incluyen grupos alcoxi halogenados. Los grupos alcoxi pueden estar sustituidos con grupos seleccionados independientemente, tales como alquenilo, alquinilo, halógeno, hidroxilo, alquilcarboniloxi, arilcarboniloxi, alcoxicarboniloxi, ariloxicarboniloxi, carboxilato, alquilcarbonilo, arilcarbonilo, alcoxicarbonilo, aminocarbonilo, alquilaminocarbonilo, dialquilaminocarbonilo, alquiltiocarbonilo, alcoxilo, fosfato, fosfonato, fosfinato, ciano, amino (incluyendo alquilamino, dialquilamino, arilamino, diarilamino y alquilarilamino), acilamino (incluyendo alquilcarbonilamino, arilcarbonilamino, carbamoilo y ureido), amidino, imino, sulfhidrilo, alquiltio, ariltio, tiocarboxilato, sulfatos, alquilsulfinilo, sulfonato, sulfamoilo, sulfonamido, nitro, trifluorometilo, ciano, azido, heterociclilo, alquilarilo o unidades estructurales aromáticos o heteroaromáticos. Ejemplos de grupos alcoxi sustituidos con halógeno incluyen, pero no se limitan a, fluorometoxi, difluorometoxi, trifluorometoxi, clorometoxi, diclorometoxi, triclorometoxi, etc.
El término "heteroátomo" incluye átomos de cualquier elemento que no sea carbono o hidrógeno. Los heteroátomos preferidos son nitrógeno, oxígeno, azufre y fósforo.
El término "hidroxi" o "hidroxilo" incluye grupos con un -OH u -O-(con un contraión apropiado).
El término "halógeno" incluye flúor, bromo, cloro, yodo, etc. El término "perhalogenado" generalmente se refiere a una unidad estructural en donde todos los hidrógenos se reemplazan por átomos de halógeno.
El término "sustituido" incluye sustituyentes seleccionados independientemente que pueden colocarse en la unidad estructural y que permiten que la molécula realice su función prevista. Ejemplos de sustituyentes incluyen grupos alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, (CR'R")0-3NR'R", (CR'R")0-3CN, NO2, halógeno, (CR'R")0-3C(halógeno)3, (CR'R")0-3CH(halógeno)2, (CR'R")0-3CH2(halógeno), (CR'R")0-3CONR'R", (CR'R")0-3S(O)1-2NR'R", (CR'R")0-3CHO, (CR'R")0-30(CR'R")0-3H, (CR'R")0-3S(O)0-2R', (CR'R")0-3O(CR'R")0-3H, (CR'R")0-3COR', (CR'R")0-3CO2R', o (CR'R")0-30R'; en donde cada R' y R" son cada uno independientemente hidrógeno, un alquilo C1-C5, alquenilo C2-C5, alquinilo C2-C5, o grupo arilo, o R ' y R" tomados juntos son un grupo bencilideno o un grupo -(CH2)2O(CH2)2-.
El término "amina" o "amino" incluye compuestos o unidades estructurales en los que un átomo de nitrógeno está unido covalentemente a al menos un carbono o heteroátomo. El término "alquilamino" incluye grupos y compuestos en los que el nitrógeno está unido a al menos un grupo alquilo adicional. El término "dialquil amino" incluye grupos en los que el átomo de nitrógeno está unido a al menos dos grupos alquilo adicionales.
El término "éter" incluye compuestos o unidades estructurales que contienen un oxígeno unido a dos átomos de carbono o heteroátomos diferentes. Por ejemplo, el término incluye "alcoxialquilo", que se refiere a un grupo alquilo, alquenilo o alquinilo unido covalentemente a un átomo de oxígeno que está unido covalentemente a otro grupo alquilo.
No se requiere que las hebras primera y segunda de los agentes de la invención (oligonucleótidos sentido y antisentido) sean completamente complementarias en la región duplicada. En una realización, la secuencia de ARN de la hebra antisentido contiene uno o más no coincidencias (1, 2, 3, 4, 5, 6, consecutivos o no consecutivos), es decir, desajustados con respecto a la hebra en sentido duplicado del nucleico bicatenario aislado ácido según la invención, contiene uno o más (1, 2, 3, 4 o 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 consecutivos o no consecutivos), nucleótidos modificados (análogos de bases). En una realización de ejemplo, tales no coincidencias ocurren dentro de la región 3', como se definió anteriormente, de la secuencia de ARN de la hebra antisentido. En un aspecto, se incorporan dos, tres, cuatro o cinco no coincidencias o nucleótidos modificados con análogos de bases dentro de la secuencia de ARN de la hebra antisentido que está 3' en la hebra antisentido del sitio de escisión de Ago2 proyectado de la secuencia de ARN diana cuando la secuencia de ARN diana se hibrida.
El uso de no coincidencias o disminución de la estabilidad termodinámica (específicamente en o cerca de los residuos 3'-terminales en sentido/5'-terminales de la región antisentido de ARNsis) se ha propuesto para facilitar o favorecer la entrada de la hebra antisentido en RISC (Schwarz et al., 2003; Khvorova et al., 2003), presumiblemente al afectar algunos pasos de desenrollamiento que limitan la velocidad que ocurren con la entrada del ARNsi en RISC. Por lo tanto, la composición de la base terminal se ha incluido en los algoritmos de diseño para seleccionar doble de ARNsi 21-mero activos (Ui-Tei et al., 2004; Reynolds et al., 2004).
La inclusión de tales no coincidencias dentro de los agentes de DARNsi de la presente invención puede permitir que dichos agentes ejerzan efectos inhibitorios que se asemejan a los de ARNmi naturales, y opcionalmente pueden dirigirse contra no solo ARN diana de ARNmi naturales (por ejemplo, 3' regiones UTR de transcripciones diana) pero también contra secuencias de ARN para las cuales no se sabe que exista un miARN antagonista natural. Por ejemplo, los DARNsi de la invención que poseen pares de bases no coincidentes que están diseñados para parecerse y/o funcionar como ARNmi pueden sintetizarse para dirigirse a secuencias repetitivas dentro de genes/transcripciones que podrían no ser objeto de ARNmi de origen natural (por ejemplo, secuencias repetidas dentro de la proteína Notch puede ser dirigida, donde las repeticiones individuales dentro de Notch pueden diferir entre sí (por ejemplo, ser degeneradas) a nivel de ácido nucleico, pero que pueden ser dirigidas efectivamente a través de un mecanismo de miARN que permite la no coincidencia(s) pero también permite un efecto inhibitorio más promiscuo que un correspondiente agente de ARNsi de combinación perfecta). En tales realizaciones, la escisión de ARN diana puede o no ser necesaria para que el agente de DARNsi que contiene no coincidencia ejerza un efecto inhibidor.
En una realización, una molécula de ácido nucleico bicatenario de la invención comprende o funciona como microARN (miARN). Por "microARN" o "miARN" se entiende un pequeño ARN bicatenario que regula la expresión de ARN mensajeros diana, ya sea por escisión de ARNm, represión/inhibición de traducción o silenciamiento heterocromático (véase, por ejemplo, Ambros, 2004, Nature, 431, 350-355; Bartel, 2004, Cell, 116, 281-297; Cullen, 2004, Virus Research., 102, 3-9; He et al., 2004, Nat. Rev. Genet., 5, 522-531; y Ying et al., 2004, Gene, 342, 25-28). En una realización, el microARN de la invención, tiene complementariedad parcial (es decir, menos del 100% de complementariedad) entre la hebra en sentido (por ejemplo, la primera hebra) o la región en sentido y la hebra antisentido (por ejemplo, la segunda hebra) o la región antisentido de la molécula de ARNmi o entre la hebra antisentido o región antisentido del ARNmi y una molécula de ácido nucleico diana correspondiente (por ejemplo, ARNm diana). Por ejemplo, la complementariedad parcial puede incluir diversos emparejamientos erróneos o nucleótidos emparejados no básicos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 o más emparejamientos erróneos o nucleótidos emparejados no basados, como protuberancias de nucleótidos) dentro de la estructura de la molécula de ácido nucleico bicatenario, lo que puede dar como resultado protuberancias, bucles o sobresalientes que resultan entre la hebra en sentido o la región en sentido y la hebra antisentido o la región antisentido del ARNmi o entre la hebra antisentido o la región antisentido del ARNmi y una molécula de ácido nucleico diana correspondiente.
Se dice que los ácidos nucleicos monocatenarios que se emparejan en varias bases se "hibridan". La hibridación se determina típicamente en condiciones fisiológicas o biológicamente relevantes (por ejemplo, intracelulares: pH 7.2, ion potasio 140 mM; extracelulares, pH 7.4, ion sodio 145 mM). Las condiciones de hibridación generalmente contienen un catión monovalente y un regulador biológicamente aceptable y pueden contener o no un catión divalente, aniones complejos, por ejemplo, gluconato de potasio, especies no cargadas como sacarosa y polímeros inertes para reducir la actividad del agua en la muestra, por ejemplo, PEG. Dichas condiciones incluyen condiciones bajo las cuales se pueden formar pares de bases.
La hibridación se mide por la temperatura requerida para disociar los ácidos nucleicos monocatenarios que forman un doble, es decir, (la temperatura de fusión; Tm). Las condiciones de hibridación también son condiciones bajo las cuales se pueden formar pares de bases. Se pueden usar varias condiciones de rigurosidad para determinar la hibridación (véase, por ejemplo, Wahl, G. M. and S. L. Berger(1987) Methods Enzymol. 152: 399; Kimmel, A. R. (1987) Methods Enzymol. 152: 507). Las condiciones de temperatura rigurosas normalmente incluirán temperaturas de al menos aproximadamente 30°C, más preferiblemente de al menos aproximadamente 37°C, y lo más preferiblemente de al menos aproximadamente 42°C. La temperatura de hibridación para los híbridos que se prevé sea inferior a 50 bases los pares de longitud deben ser 5-10°C menos que la temperatura de fusión (Tm) del híbrido, donde Tm se determina de acuerdo con las siguientes ecuaciones. Para híbridos de menos de 18 pares de bases de longitud, Tm (°C) =2(# de bases A+T)+4(# de bases G+C). Para híbridos entre 18 y 49 pares de bases de longitud, Tm (°C) =81.5+16.6 (log 10[Na+])+0.41 (% G+C)-(600/N), donde N es el número de bases en el híbrido, y [Na+] es la concentración de iones de sodio en el regulador de hibridación ([Na+] para 1xSSC=0.165 M). Por ejemplo, el regulador de determinación de hibridación se muestra en la Tabla 1
Tabla 1
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Variaciones útiles en las condiciones de hibridación serán fácilmente evidentes para los expertos en la materia. Las técnicas de hibridación son bien conocidas por los expertos en la materia y se describen, por ejemplo, en Benton and Davis (Science 196: 180, 1977); Grunstein and Hogness (Proc. Natl. Acad. Sci., Estados Unidos 72: 3961, 1975); Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, Nueva York, 2001); Berger and Kimmel (Antisense to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, Nueva York); and Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York.
Como se usa en el presente documento, "hebra de oligonucleótidos" es una molécula de ácido nucleico de hebra sencilla. Un oligonucleótido puede comprender ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos, nucleótidos modificados (por ejemplo, nucleótidos con modificaciones 2', análogos de bases sintéticas, etc.) o combinaciones de los mismos. Tales oligonucleótidos modificados se pueden preferir a las formas nativas debido a propiedades tales como, por ejemplo, una captación celular mejorada y una mayor estabilidad en presencia de nucleasas.
Ciertos dsNA, de la invención son dsNA quiméricos. Los "dsNA quiméricos" o "quimeras", en el contexto de esta invención, son dsNA que contienen dos o más regiones químicamente distintas, cada una compuesta de al menos un nucleótido. Los dsNA quiméricos pueden ser sustratos Dicer o sustratos no Dicer. En algunas realizaciones, estos dsNA contienen típicamente al menos una región que comprende principalmente ribonucleótidos (que incluyen opcionalmente ribonucleótidos modificados) que forman una molécula de siARN de sustrato de Dicer ("DARNsi"). Esta región de DARNsi está unida covalentemente, por ejemplo, mediante enlaces fosfato convencionales o mediante enlaces fosfato modificados (por ejemplo, fosforotioato) a una segunda región que comprende una región de nucleótidos monocatenarios ("una región extendida monocatenaria") que confiere una o más propiedades beneficiosas (tales como, por ejemplo, una mayor eficacia, por ejemplo, una mayor potencia y/o duración de la actividad de DARNsi, funcionan como un dominio de reconocimiento o un medio para dirigir un dsNA quimérico a una ubicación específica, por ejemplo, cuando se administra a células en cultivo o a un sujeto, que funciona como una región extendida para una mejor unión de grupos funcionales, cargas útiles, unidades estructurales de detección/detectables, que funcionan como una región extendida que permite modificaciones más deseables y/o un espaciado mejorado de tales modificaciones, etc.). Esta segunda región también puede incluir nucleótidos modificados o sintéticos y/o desoxirribonucleótidos modificados o sintéticos.
Como se usa en el presente documento, el término "ribonucleótido" abarca ribonucleótidos naturales y sintéticos, no modificados y modificados. Las modificaciones incluyen cambios en la unidad estructural azúcar, en la unidad estructural de base y/o en los enlaces entre los ribonucleótidos en el oligonucleótido. Como se usa en el presente documento, el término "ribonucleótido" excluye específicamente un desoxirribonucleótido, que es un nucleótido que posee un único grupo de protones en la posición del anillo de ribosa 2'.
Como se usa en el presente documento, el término "desoxirribonucleótido" abarca desoxirribonucleótidos naturales y sintéticos, no modificados y modificados. Las modificaciones incluyen cambios en la unidad estructural azúcar, en la unidad estructural de base y/o en los enlaces entre desoxirribonucleótidos en el oligonucleótido. Como se usa en el presente documento, el término "desoxirribonucleótido" también incluye un ribonucleótido modificado que no permite la escisión por Dicer de un agente de dsNA, por ejemplo, un ribonucleótido 2'-O-metil, un residuo de ribonucleótido modificado con fosforotioato, etc., que no permite que se produzca la escisión de Dicer en un enlace de dicho residuo.
Como se usa en el presente documento, el término "PS-NA" se refiere a un residuo de nucleótido modificado con fosforotioato. Por lo tanto, el término "PS-NA" abarca tanto los ribonucleótidos modificados con fosforotioato ("ARN-PS") como los desoxirribonucleótidos modificados con fosforotioato ("ADN-PS").
En ciertas realizaciones, un agente DARNsi/ADN quimérico de la invención comprende al menos una región doble de al menos 23 nucleótidos de longitud, dentro de la cual al menos el 50% de todos los nucleótidos son ribonucleótidos no modificados. Como se usa en el presente documento, el término "ribonucleótido no modificado" se refiere a un ribonucleótido que posee un grupo hidroxilo (-OH) en la posición 2' del azúcar ribosa.
En ciertas realizaciones, un agente quimérico de DARNsi/ADN de la invención comprende al menos una región, ubicada 3' del sitio de escisión Dicer proyectado en la primera hebra y 5' del sitio de escisión Dicer proyectado en la segunda hebra, que tiene una longitud de al menos 2 nucleótidos pares de bases de longitud, en donde al menos el 50% de todos los nucleótidos dentro de esta región de al menos 2 nucleótidos pares de bases de longitud son desoxirribonucleótidos no modificados. Como se usa en el presente documento, el término "desoxirribonucleótido no modificado" se refiere a un ribonucleótido que posee un único protón en la posición 2' del azúcar ribosa.
Como se usa en el presente documento, la hebra antisentido, la hebra guía y el segundo oligonucleótido se refieren a la misma hebra de una molécula de sustrato de Dicer dada de acuerdo con la invención; mientras que la hebra en sentido, la hebra pasajera y el primer oligonucleótido se refieren a la misma hebra de un sustrato de Dicer dado.
Como se usa en el presente documento, "hebra antisentido" se refiere a una molécula de ácido nucleico monocatenario que tiene una secuencia complementaria a la de un ARN diana. Cuando la hebra antisentido contiene nucleótidos modificados con análogos de bases, no es necesariamente complementaria en toda su longitud, pero al menos debe ser lo suficientemente complementaria para hibridarse con un ARN diana. En ciertas realizaciones, la hebra antisentido es suficientemente complementaria para inhibir la expresión del objetivo, por ejemplo, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% complementario.
Como se usa en el presente documento, "hebra en sentido" se refiere a una molécula de ácido nucleico monocatenario que tiene una secuencia complementaria a la de una hebra antisentido. Cuando la hebra antisentido contiene nucleótidos modificados con análogos de bases, la hebra en sentido no necesita ser complementaria en toda la longitud de la hebra antisentido, sino que al menos debe ser capaz de formar un híbrido y, por lo tanto, ser capaz de duplicarse con la hebra antisentido.
Como se usa en este documento, "hebra guía" se refiere a una molécula de ácido nucleico monocatenario de una molécula que contiene dsNA o dsNA, que tiene una secuencia suficientemente complementaria a la de un ARN diana para producir interferencia de ARN. En algunas realizaciones, la escisión de Dicer no es necesaria para la incorporación de una hebra guía en RISC. En algunas realizaciones después de la escisión de dsNA o de la molécula que contiene dsNA por Dicer, un fragmento de la hebra guía permanece asociado con RISC, se une a un ARN diana como un componente del complejo RISC y promueve la escisión de un ARN diana por RISC. Una hebra guía es una hebra antisentido.
Como se usa en el presente documento, "ARN diana" se refiere a un ARN que estaría sujeto a modulación guiada por la hebra antisentido, tal como escisión dirigida o bloqueo estérico. El ARN diana podría ser, por ejemplo, ARN viral genómico, ARNm, un preARNm o un ARN no codificante. La diana preferida es el ARNm, tal como el ARNm que codifica una proteína asociada a la enfermedad, como ApoB, Bc12, Hif-1 alfa, Survivin o un p21 ras, como Ha-ras, K-ras o N-ras.
Como se usa en el presente documento, "hebra pasajera" se refiere a una hebra de oligonucleótidos de una molécula que contiene dsNA o dsNA, que tiene una secuencia que es complementaria a la de la hebra guía. Una hebra pasajera es una hebra en sentido.
Como se usa en el presente documento, "Dicer" se refiere a una endoribonucleasa en la familia RNasa III que escinde un ARNds o una molécula que contiene ARNds, por ejemplo, ARN bicatenario (ARNds) o pre-microARN (ARNmi), en fragmentos de ácido nucleico bicatenario de aproximadamente 19-25 nucleótidos de longitud, generalmente con un sobresaliente de dos bases en el extremo 3'. Con respecto a los dsNA de la invención, el doble formado por una región de ARNds de un dsNA de la invención es reconocido por Dicer y es un sustrato de Dicer en al menos una hebra del doble. Dicer cataliza el primer paso en la vía de interferencia de ARN, que en consecuencia da como resultado la degradación de un ARN diana. La secuencia de proteínas de Dicer humano se proporciona en la base de datos NCBI con el número de acceso NP-085124.
La "escisión" de Dicer se determina como sigue (por ejemplo, véase Collingwood et al., Oligonucleotides 18: 187-200 (2008)). En un ensayo de escisión de Dicer, los dobles de ARN (100 pmol) se incuban en 20 pL de Tris 20 mM pH 8.0, NaCl 200 mM, MgCl22.5 mM con o sin 1 unidad de Dicer humano recombinante (Stratagene, La Jolla, California) en 37°C durante 18-24 horas. Las muestras se desalan usando una placa Performa SR de 96 pocillos (Edge Biosystems, Gaithersburg, Md.). La espectroscopia de masas con cromatografía líquida con ionización por electropulverización (ESI-LCMS) de ARN doble antes y después del tratamiento con Dicer se realiza utilizando un sistema Oligo HTCS (Novatia, Princeton, N.J.; Hail et al., 2004), que consiste en un ThermoFinnigan TSQ7000, sistema de datos Xcalibur, software de procesamiento de datos ProMass y Paradigm MS4 HPLC (Michrom BioResources, Auburn, California). En este ensayo, la escisión Dicer ocurre cuando al menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, o incluso el 100% de Dicer de un ARNds del sustrato (es decir, 25-35 por ARNds, preferiblemente 26-30 por ARNds, opcionalmente extendido como se describe en el presente documento) se divide en un ARNds más corto (por ejemplo, 19-23 por ARNds, preferiblemente, 21-23 por ARNds).
Como se usa en el presente documento, "sitio de escisión de Dicer" se refiere a los sitios en los que Dicer escinde un ARNds (por ejemplo, la región ARNds de un dsNA de la invención). Dicer contiene dos dominios RNasa III que típicamente cortan las hebras tanto en sentido como antisentido de un ARNds. La distancia promedio entre los dominios RNasa III y el dominio PAZ determina la longitud de los fragmentos cortos de ácido nucleico bicatenario que produce y esta distancia puede variar (Macrae I, et al. (2006) "Structural basis for double-stranded RNA processing by Dicer". Science 311 (5758): 195-8.). Como se muestra, por ejemplo, en la figura 2, se proyecta que Dicer escinde ciertos ácidos nucleicos bicatenarios de la presente invención que poseen una hebra antisentido que tiene un sobresaliente 2' de 2 nucleótidos en un sitio entre los nucleótidos 21 y 22 eliminados del extremo 3' de la hebra antisentido, y en un sitio correspondiente entre los nucleótidos 21 y 22 eliminados del extremo 5' de la hebra en sentido. Los sitios de escisión de Dicer proyectados y/o prevalentes para moléculas de dsNA distintas de las representadas en la figura 2 puede identificarse de manera similar a través de métodos reconocidos en la técnica, incluidos los descritos en Macrae et al. Mientras que el evento de escisión de Dicer representado en la figura 2 genera un ARNsi de 21 nucleótidos, se observa que la escisión de un dsNA por parte de Dicer (por ejemplo, DARNsi) puede dar como resultado la generación de longitudes de ARNsi procesadas por Dicer de 19 a 23 nucleótidos de longitud. De hecho, en un aspecto de la invención que se describe con mayor detalle a continuación, se incluye una región de ADN bicatenario dentro de un dsNA con el fin de dirigir la escisión Dicer prevalente de un ARNsi 19-mero típicamente no preferido.
Como se usa en el presente documento, "sobresaliente" se refiere a nucleótidos no apareados, en el contexto de un doble que tiene dos o cuatro extremos libres en el terminal 5' o el terminal 3' de un dsNA. En ciertas realizaciones, el sobresaliente es un sobresaliente de 3' o 5' en la hebra antisentido o Hebra en sentido. "Sobresaliente" y "extensión" se utilizan como sinónimos en todo momento.
Como se usa en el presente documento, "diana" se refiere a cualquier secuencia de ácido nucleico cuya expresión o actividad se va a modular. En realizaciones particulares, el objetivo se refiere a ARN que se duplica a un ácido nucleico monocatenario que es una hebra antisentido en un complejo RISC. La hibridación del ARN diana con la hebra antisentido da como resultado el procesamiento por el complejo RISC. En consecuencia, la expresión del ARN o proteínas codificadas por el ARN, por ejemplo, ARNm, se reduce.
Como se usa en el presente documento, el término "procesamiento de ARN" se refiere a actividades de procesamiento realizadas por componentes de las rutas ARNsi, ARNmi o RNasa H (por ejemplo, Drosha, Dicer, Argonaute2 u otras endoribonucleasas RISC y RNasaH), que se describen en mayor detalle a continuación (véase la sección "Procesamiento de ARN" a continuación). El término se distingue explícitamente de los procesos postranscripcionales de la limitación de 5' de ARN y la degradación de ARN a través de procesos no mediados por RISC o sin ARNasa H. Tal "degradación" de un ARN puede tomar varias formas, por ejemplo, desadenilación (eliminación de una cola de poli (A) 3') y/o digestión de nucleasas de parte o la totalidad del cuerpo del ARN por cualquiera de varias endo- o exonucleasas (por ejemplo, RNasa III, RNasa P, RNasa Tl, RNasa A (1, 2, 3, 4/5), oligonucleotidasa, etc.).
Como se usa en el presente documento, "referencia" significa un estándar o control. Como es evidente para un experto en la materia, una referencia apropiada es cuando solo se cambia un elemento para determinar el efecto de un elemento.
Como se usa en el presente documento, "nucleótido modificado" se refiere a un nucleótido que tiene una o más modificaciones en el nucleósido, la nucleobase, el anillo de furanosa o el grupo fosfato. Por ejemplo, los nucleótidos modificados excluyen los ribonucleótidos que contienen monofosfato de adenosina, monofosfato de guanosina, monofosfato de uridina y monofosfato de citidina y desoxirribonucleótidos que contienen monofosfato de desoxiadenosina, monofosfato de desoxiguanosina, monofosfato de desoxitimidina y monofoscitidina. Las modificaciones incluyen aquellas que ocurren naturalmente como resultado de la modificación por enzimas que modifican nucleótidos, como las metiltransferasas. Los nucleótidos modificados también incluyen nucleótidos sintéticos o de origen no natural. Las modificaciones sintéticas o no naturales en los nucleótidos incluyen aquellas con modificaciones 2', por ejemplo, 2'-metoxietoxi, 2'-fluoro, 2'-alilo, 2'-O-[2-(metilamino)-2-oxoetilo], 4'-tio, 4-CH2-O-2'-puente, 4'-(CH2)2-O-2'-puente, 2'-LNA y 2'-O-(N-metilcarbamato) o aquellos que comprende análogos de base. En relación con los nucleótidos modificados en 2' como se describe para La presente divulgación, por "amino" se entiende 2'-NH2 o 2'-O-NH2, que puede modificarse o no modificarse. Dichos grupos modificados se describen, por ejemplo, en Eckstein et al., U.S. Pat. 5.672.695 y Matulic-Adamic et al., Patente de EE.UU. No. 6.248.878.
El término "in vitro" tiene su significado reconocido en la técnica, por ejemplo, que implica reactivos o extractos purificados, por ejemplo, extractos celulares. El término "in vivo" también tiene su significado reconocido en la técnica, por ejemplo, involucrando células vivas, por ejemplo, células inmortalizadas, células primarias, líneas celulares y/o células en un organismo.
En referencia a las moléculas de ácido nucleico de La presente divulgación, se pueden especificar nucleótidos en ciertas posiciones en cualquiera de las hebras del dsNA. Con referencia a las figuras 1-3, las convenciones para denotar posiciones de los DARNsi de la invención se muestran en la Tabla 2.
En referencia a las moléculas de ácido nucleico de La presente divulgación, las modificaciones pueden existir en patrones en una hebra del dsNA. Como se usa en este documento, "posiciones alternas" se refiere a un patrón en donde cualquier otro nucleótido es un nucleótido modificado o hay un nucleótido no modificado (por ejemplo, un ribonucleótido no modificado) entre cada nucleótido modificado en una longitud definida de una hebra del dsNA (por ejemplo, 5'-MNMNMN-3'; 3'-Mn MNMN-5'; donde M es un nucleótido modificado y N es un nucleótido no modificado). El patrón de modificación comienza desde la primera posición de nucleótidos en el extremo 5' o 3' de acuerdo con cualquiera de las convenciones de numeración de posición descritas en el presente documento (en ciertas realizaciones, la posición 1 se designa en referencia al residuo terminal de una hebra que sigue a un Dicer proyectado evento de escisión de un agente de DARNsi de la invención; por lo tanto, la posición 1 no siempre constituye un residuo 3' terminal o 5' terminal de un agente preprocesado de la invención).
Tabla 2: Descripción de la convención de numeración en cuanto a posiciones en la hebra
Posición 1: Una posición ubicada en la hebra pasajera se denota con un número sin una etiqueta de superíndice. (por ejemplo, posición 1). La posición 1 de la hebra pasajera es el nucleótido terminal 5', a excepción de las hebras pasajeras extendidas 5', donde el nucleótido terminal 5' ocurre en la región extendida y se le asigna el número más alto con un superíndice E (véase abajo y la figura 1A).
Posición A: Una posición ubicada en la hebra guía se designa con un superíndice A (por ejemplo, posición 1A. La hebra guía se numera de tal manera que el primer nucleótido emparejado de base en su terminal 3' se denomina (por ejemplo, posición 1A). Cuando la hebra guía contiene un sobresaliente de hebra sencilla de 3' terminal de 1-6 nucleótidos, esos nucleótidos simplemente se denominan residuos de hebra de hebra terminal 3' no apareados o residuos monocatenarios.
Posición A1: Una posición ubicada en la hebra guía en la región extendida de 5' está marcada con un superíndice B (por ejemplo, la posición 1B representa el nucleótido terminal 5' de una hebra guía extendida (véase la figura 1A)).
Posición C: Una posición ubicada en el tercer oligonucleótido. El tercer oligonucleótido es complementario a la región extendida de la hebra guía y es discontinuo con la hebra pasajera. La posición 1C (véase la figura 1A) representa el nucleótido terminal 5' del tercer oligonucleótido.
Posición D: Una posición ubicada en una hebra pasajera extendida de 3', de modo que la posición 1D hace referencia al residuo de nucleótido terminal 3' de la hebra pasajera extendida.
Posición E: Una posición ubicada en la región extendida de una posición extendida 1E de 5' de la hebra pasajera, que es un nucleótido no apareado de la extensión monocatenaria de 5' (véase la figura 1A).
Posición IE: es el nucleótido no emparejado consecutivo (es decir, adyacente) al nucleótido emparejado de la primera base de la hebra pasajera (véase la figura 1A).
Posición F: una posición ubicada en la región doble de una hebra pasajera extendida de 5', de modo que la posición IF hace referencia al primer nucleótido emparejado de base en la hebra pasajera de 5' (comenzando desde el extremo de 5').
El patrón de nucleótidos modificados en posiciones alternas puede recorrer la longitud completa de la hebra, pero en ciertas realizaciones incluye al menos 4, 6, 8, 10, 12, 14 nucleótidos que contienen al menos 2, 3, 4, 5, 6 o 7 nucleótidos modificados, respectivamente. Como se usa en este documento, "pares alternos de posiciones" se refiere a un patrón en donde dos nucleótidos modificados consecutivos están separados por dos nucleótidos consecutivos no modificados sobre una longitud definida de una hebra de dsNA (por ejemplo, 5'-MMNNMMNNMMNN-3'; 3'-MMNNMMNNMMNN-5'; donde M es un nucleótido modificado y N es un nucleótido no modificado). El patrón de modificación comienza desde la primera posición de nucleótidos en el extremo 5' o 3' de acuerdo con cualquiera de las convenciones de numeración de posición descritas aquí. El patrón de nucleótidos modificados en posiciones alternas puede recorrer la longitud completa de la hebra, pero preferiblemente incluye al menos 8, 12, 16, 20, 24, 28 nucleótidos que contienen al menos 4, 6, 8, 10, 12 o 14 nucleótidos modificados, respectivamente. Se enfatiza que los patrones de modificación anteriores son de ejemplo y no pretenden ser limitaciones del alcance de la invención.
Como se usa en el presente documento, "análogo de base" se refiere a una unidad estructural heterocíclica que se encuentra en la posición 1' de una unidad estructural de azúcar nucleótido en un nucleótido modificado que puede incorporarse en un doble de ácido nucleico (o la posición equivalente en un nucleótido sustitución de fracción de azúcar que puede incorporarse en un doble de ácido nucleico). En los dsNA de la invención, un análogo de base es generalmente una base de purina o pirimidina, excluyendo las bases comunes guanina (G), citosina (C), adenina (A), timina (T) o uracilo (U). Los análogos de base pueden duplicarse con otras bases o análogos de base en ARNdss. Los análogos de base incluyen aquellos útiles en los compuestos y métodos de la invención, por ejemplo, los descritos en la Patente de los Estados Unidos Nos. 5,432,272 y 6,001,983 de Benner y la Publicación de Patente de los Estados Unidos No. 20080213891 de Manoharan. Ejemplos no limitantes de bases incluyen hipoxantina (I), xantina (X), 3p-D-ribofuranosil-(2,6-diaminopirimidina) (K), 3-p-D-ribofuranosil-(1-metil-pirazolo[4,3-d]pirimidina-5,7(4H,6H)-diona) (P), iso-citosina (iso-C), iso-guanina (iso-G), 1-p-D-ribofuranosil-(5-nitroindol), 1-p-D-ribofuranosil-(3-nitropirrol), 5-bromouracilo, 2-aminopurina, 4-tio-dT, 7-(2-tienil)-imidazo[4,5-b]piridina (Ds) y pirrol-2-carbaldehído (Pa), 2-amino-6-(2-tienil)purina (S), 2-oxopiridina (Y), difluorotolilo, 4-fluoro-6-metilbencimidazol, 4-metilbencimidazol, 3-metil isocarboestirililo, 5-metil isocarboestirililo, y 3-metil-7-propinilo isocarboestirililo, 7-azaindolilo, 6-metil-7-azaindolilo, imidizopiridinilo, 9-metil-imidizopiridinilo, pirrolopirizinilo, isocarboestirililo, 7-propinilo isocarboestirililo, propinil- 7-azaindolilo, 2,4,5-trimetilfenilo, 4-metilindolilo, 4,6-dimetilindolilo, fenilo, naftalenilo, antracenilo, fenantracenilo, pirenilo, estilbencilo, tetracenilo, pentacenilo y derivados estructurales de los mismos (Schweitzer et al., J. Org. Chem., 59: 7238-7242 (1994); Berger et al., Nucleic Acids Research, 28(15): 2911-2914 (2000); Moran et al., J. Am. Chem Soc., 119: 2056-2057 (1997); Morales et al., J. Am. Chem Soc., 121: 2323-2324 (1999); Guckian et al., J. Am. Chem Soc., 118: 8182-8183(1996); Morales etal., J. Am. Chem Soc., 122(6): 1001-1007(2000); McMinn etal., J. Am. Chem Soc., 121: 11585-11586 (1999); Guckian et al., J. Org. Chem., 63: 9652-9656 (1998); Moran et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 94: 10506-10511 (1997); Das et al., J. Chem. Soc., Perkin Trans., 1: 197-206 (2002); Shibata et al., J. Chem. Soc., Perkin Trans., 1: 1605-1611 (2001); Wu et al., J. Am. Chem Soc., 122(32): 7621-7632 (2000); O'Neill et al., J. Org. Chem., 67: 5869-5875 (2002); Chaudhuri etal., J. Am. Chem Soc., 117: 10434-10442 (1995); y la Patente de los Estados Unidos No. 6,218,108.). Los análogos de base también pueden ser una base universal.
Como se usa en el presente documento, "base universal" se refiere a una unidad estructural heterocíclica ubicada en la posición 1' de una unidad estructural de azúcar nucleótido en un nucleótido modificado, o la posición equivalente en una sustitución de unidad estructural de azúcar nucleótido, que, cuando está presente en un nucleico ácido doble, se puede colocar frente a más de un tipo de base sin alterar la estructura helicoidal doble (por ejemplo, la estructura del esqueleto de fosfato). Además, la base universal no destruye la capacidad del ácido nucleico monocatenario en donde reside para duplicarse a un ácido nucleico diana. La capacidad de un ácido nucleico monocatenario que contiene una base universal para duplicar un nucleico diana se puede analizar mediante métodos aparentes para un experto en la materia (por ejemplo, absorbancia UV, dicroísmo circular, desplazamiento en gel, sensibilidad a nucleasa monocatenaria, etc.). Además, las condiciones bajo las cuales se observa la formación de doble pueden variar para determinar la estabilidad o la formación de doble, por ejemplo, la temperatura, ya que la temperatura de fusión (Tm) se correlaciona con la estabilidad de los dobles de ácido nucleico. En comparación con un ácido nucleico monocatenario de referencia que es exactamente complementario a un ácido nucleico diana, el ácido nucleico monocatenario que contiene una base universal forma un doble con el ácido nucleico diana que tiene una Tm más baja que un doble formado con el ácido nucleico complementario. Sin embargo, en comparación con un ácido nucleico monocatenario de referencia en donde la base universal ha sido reemplazada por una base para generar un desajuste único, el ácido nucleico monocatenario que contiene la base universal forma un doble con el ácido nucleico diana que tiene una Tm más alta que un doble formado con el ácido nucleico que tiene la base no coincidente.
Algunas bases universales son capaces de emparejar bases formando enlaces de hidrógeno entre la base universal y todas las bases guanina (G), citosina (C), adenina (A), timina (T) y uracilo (U) bajo condiciones de formación de pares de bases. Una base universal no es una base que forma un par de bases con una sola base complementaria. En un doble, una base universal puede no formar enlaces de hidrógeno, un enlace de hidrógeno o más de un enlace de hidrógeno con cada uno de G, C, A, T y U opuestos a él en la hebra opuesta de un doble. Preferiblemente, las bases universales no interactúan con la base opuesta a ella en la hebra opuesto de un doble. En un doble, el emparejamiento de bases entre una base universal ocurre sin alterar la estructura helicoidal doble del esqueleto de fosfato. Una base universal también puede interactuar con bases en nucleótidos adyacentes en la misma hebra de ácido nucleico al apilar interacciones. Dichas interacciones de apilamiento estabilizan el doble, especialmente en situaciones en las que la base universal no forma ningún enlace de hidrógeno con la base posicionada opuesta a ella en la hebra opuesta del doble. Ejemplos no limitantes de nucleótidos de unión universal incluyen inosina, 1-p-D-ribofuranosil-5-nitroindol y/o 1 -p-D-ribofuranosil-3-nitropirrol (Patente de los Estados Unidos, Publ. No. 20070254362 a Quay et al.; Van Aerschot et al., An acyclic 5-nitroindazole nucleoside analogue as ambiguous nucleoside. Nucleic Acids Res. 1995 Nov. 11; 23(21): 4363-70; Loakes et al., 3-Nitropyrrole and 5-nitroindole as universal bases in primers for DNA sequencing and PCR. Nucleic Acids Res. 1995 Jul. 11; 23(13):2361-6; Loakes and Brown, 5-Nitroindole as a universal base analogue. Nucleic Acids Res. 1994 Oct. 11; 22(20):4039-43).
Como se usa en el presente documento, "bucle" se refiere a una estructura formada por una hebra sencilla de un ácido nucleico, en la que las regiones complementarias que flanquean una región particular de nucleótidos monocatenarios hibridan de una manera que la región nucleotídica monocatenaria entre las regiones complementarias está excluida de la formación doble o del emparejamiento de bases Watson-Crick. Un bucle es una región de nucleótidos monocatenarios de cualquier longitud, por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más. Ejemplos de bucles incluyen los nucleótidos no apareados presentes en estructuras tales como horquillas, bucles de tallo o bucles extendidos.
Como se usa en el presente documento, "bucle extendido" en el contexto de un ARNds se refiere a un bucle monocatenario y además 1, 2, 3, 4, 5, 6 o hasta 55 pares de bases o doble que flanquean el bucle. En un bucle extendido, los nucleótidos que flanquean el bucle en el lado 5' forman un doble con nucleótidos que flanquean el bucle en el lado 3'. Un bucle extendido puede formar una horquilla o un bucle del tallo.
Como se usa en este documento, "tetrabucle" en el contexto de un ARNds se refiere a un bucle (una región monocatenaria) que consta de cuatro nucleótidos que forman una estructura secundaria estable que contribuye a la estabilidad de los nucleótidos hibridados adyacentes de Watson-Crick. Sin limitarse a la teoría, un tetrabucle puede estabilizar un par de bases adyacentes de Watson-Crick al apilar interacciones. Además, las interacciones entre los cuatro nucleótidos en un tetrabucle incluyen, entre otras, el emparejamiento de bases no Watson-Crick, interacciones de apilamiento, enlaces de hidrógeno e interacciones de contacto (Cheong et al., Nature 1990 16 de agosto; 346 (6285): 680-2; Heus and Pardi, Science, 12 de julio de 1991; 253(5016): 191-4). Un tetrabucle confiere un aumento en la temperatura de fusión (Tm) de un doble adyacente que es más alto de lo esperado de una secuencia de bucle de modelo simple que consta de cuatro bases aleatorias. Por ejemplo, un tetrabucle puede conferir una temperatura de fusión de al menos 50°C, al menos 55°C, al menos 56°C, al menos 58°C, al menos 60°C, al menos 65°C o al menos 75°C en NaHPO4 10 mM a una horquilla que comprende un doble de al menos 2 pares de bases de longitud. Un tetrabucle puede contener ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos, nucleótidos modificados y combinaciones de los mismos. Ejemplos de tetrabucles de ARN incluyen la familia de tetrabucles UNCG (por ejemplo, UUCG), la familia de tetrabucles GNRA (por ejemplo, GAAA) y el tetrabucle CUUG. (Woeseetal., ProcNatlAcad Sci USA. 1990 noviembre; 87(21): 8467-71; Antao et al., Nucleic Acids Res. 1991 11 de noviembre; 19(21): 5901-5). Ejemplos de tetrabucles de ADN incluyen la familia d (GNNA) de tetrabucles (por ejemplo, d(GTTA), la familia d(GNRA)) de tetrabucles, la familia d(GNAB) de tetrabucles, la familia d(CNNG) de tetrabucles, el d(TNCG) familia de tetrabucles (por ejemplo, d(TTCG)). (Nakano et al. Biochemistry, 41(48), 14281-14292, 2002. SHINJI et al. Nippon Kagakkai Koen Yokoshu VOL. 78th; NO. 2; PÁG. 731 (2000)).
Como se usa en el presente documento, "aumentar" o "mejorar" pretende alterar positivamente en al menos un 5% en comparación con una referencia en un ensayo. Una alteración puede ser dos veces o tres veces o cuatro veces o cinco veces o diez veces o 100 veces o, 5%, 10%, 25%, 30%, 50%, 75%, o incluso un 100% en comparación con una referencia en un ensayo. Por "mejorar la escisión de Dicer", se entiende que el procesamiento de una cantidad de ARNds o molécula que contiene ARNds por Dicer da como resultado más productos de ARNds escindidos por Dicer, que la reacción de escisión de Dicer ocurre más rápidamente en comparación con el procesamiento de la misma cantidad de una ARNds de referencia o una molécula que contiene ARNds en un ensayo in vivo o in vitro de esta descripción, o que la escisión de Dicer se dirige a escindirse en un sitio específico y preferido dentro de un dsNA y/o generar una mayor prevalencia de una población preferida de productos de escisión (por ejemplo, mediante la inclusión de residuos de ADN como se describe en el presente documento). En una realización, la escisión de Dicer mejorada o aumentada de una molécula de dsNA está por encima del nivel observado con una molécula de dsNA de referencia apropiada. En otra realización, la escisión de Dicer mejorada o aumentada de una molécula de dsNA está por encima del nivel observado con una molécula inactiva o atenuada. El aumento en lo que se refiere a la afinidad de unión de un dsNA conjugado a ligando de la invención significa, por ejemplo, que el dsNA conjugado a ligando se une a su objetivo con una afinidad que es 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces o más que un dsNA que no está conjugado con un ligando, pero se dirige al mismo objetivo. El aumento en lo que se refiere a la absorción celular significa, por ejemplo, que la cantidad de dsNA conjugado con ligando que es absorbido por las células, por ejemplo, por endocitosis mediada por receptor es 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 10 veces o más que un dsNA que no está conjugado con un ligando. El aumento en lo que se refiere al seguimiento significa que la progresión o movimiento de un ARNds se puede determinar más fácilmente.
Como se usa en el presente documento, "reducir" pretende alterar negativamente en al menos un 5% en comparación con una referencia en un ensayo. Una alteración puede ser dos veces o tres veces o cuatro veces o cinco veces o diez veces o 100 veces o más o 5%, 10%, 25%, 30%, 50%, 75%, o incluso en un 100% en comparación con una referencia en un ensayo. Por "reducir la expresión" se entiende la expresión del gen, o nivel de moléculas de ARN o moléculas de ARN equivalentes que codifican una o más proteínas o subunidades de proteínas, o nivel o actividad de una o más proteínas o subunidades de proteínas codificadas por un objetivo gen, se reduce por debajo de lo observado en ausencia de las moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, molécula de ARNds o molécula que contiene ARNds) en un ensayo in vivo o in vitro de esta descripción. En una realización, la inhibición, la regulación a la baja o la reducción con una molécula de dsNA está por debajo de ese nivel observado en presencia de una molécula inactiva o atenuada. En otra realización, la inhibición, regulación a la baja o reducción con moléculas de dsNA está por debajo de ese nivel observado en presencia de, por ejemplo, una molécula de dsNA con secuencia codificada o con no coincidencias. En otra realización, la inhibición, la regulación negativa o la reducción de la expresión génica con una molécula de ácido nucleico de la descripción instantánea es mayor en presencia de la molécula de ácido nucleico que en su ausencia.
Como se usa en el presente documento, "célula" pretende incluir tanto células procariotas (por ejemplo, bacterianas) como eucariotas (por ejemplo, mamíferos o plantas). Las células pueden ser de origen somático o de línea germinal, pueden ser totipotentes o pluripotentes y pueden dividirse o no dividirse. Las células también pueden derivarse o pueden comprender un gameto o un embrión, una célula madre o una célula completamente diferenciada. Por lo tanto, el término "célula" está destinado a conservar su significado biológico habitual y puede estar presente en cualquier organismo, como, por ejemplo, un pájaro, una planta y un mamífero, incluido, por ejemplo, humano, vaca, ovejas, simios, monos, cerdos, perros y gatos. Dentro de ciertos aspectos, el término "célula" se refiere específicamente a células de mamífero, tales como células humanas, que contienen una o más moléculas de dsNA aisladas de La presente divulgación. En aspectos particulares, una célula procesa ARNdss o moléculas que contienen ARNds que resultan en interferencia de ARN de ácidos nucleicos diana, y contiene proteínas y complejos de proteínas requeridos paraARNi, por ejemplo, DiceryRISC.
Como se usa en este documento, "animal" significa un organismo eucariota multicelular, que incluye un mamífero, cerdo, mono, perro, gato, ratón, caballo, vaca, rata o más preferiblemente un ser humano. Los métodos en general comprenden la administración de una cantidad efectiva de los agentes de la presente memoria, tal como un agente de las estructuras de fórmulas de la presente memoria, a un sujeto (por ejemplo, animal, humano) que lo necesite, incluido un mamífero, por ejemplo, cerdo, mono, perro, gato, ratón, caballo, vaca, rata o más preferiblemente un ser humano. Tal tratamiento se administrará adecuadamente a sujetos, particularmente humanos, que padecen, tienen, son susceptibles o están en riesgo de una enfermedad o un síntoma de la misma.
Por "vehículo farmacéuticamente aceptable" se entiende una composición o formulación que permite la distribución efectiva de las moléculas de ácido nucleico de la divulgación instantánea en la ubicación física más adecuada para su actividad deseada.
La presente divulgación está dirigida a composiciones que comprenden tanto un doble de NA de doble hebra ("dsNA") como una región extendida de hebra única, en la mayoría de las realizaciones, un doble de dsDNA dentro del mismo agente, y métodos para prepararlos, que son capaces de reducir la expresión de genes diana en células eucariotas. Una de las hebras de la región dsNA contiene una región de secuencia de nucleótidos que tiene una longitud que varía de aproximadamente 15 a aproximadamente 22 nucleótidos que pueden dirigir la destrucción del ARN transcrito desde el gen diana. Como se indicó aquí anteriormente, un bucle extendido que contiene un tetrabucle puede estar presente en el terminal 3' de la hebra en sentido.
En algunas realizaciones, los agentes de dsNA son sustratos de Dicer y son escindidos por Dicer. En otras realizaciones, los agentes de dsNA no son sustratos de Dicer y Dicer no escinde.
En algunas realizaciones el doble contiene una extensión de 1-50 nucleótidos que se encuentra en la hebra en sentido o en la hebra antisentido o en ambas. La extensión en la realización podría estar en el extremo 5' de la hebra en sentido o en el terminal 5' de la hebra antisentido o ambos. La extensión en otra realización podría estar en el término 3' de la hebra en sentido o el término 3' de la hebra antisentido o ambos. En otra realización, la extensión está en el extremo 5' de la hebra con sentido o en el extremo 3' de la hebra antisentido o ambos. Los agentes de dsNA de las realizaciones mencionadas también comprenden al menos un nucleótido modificado con ligando.
Agentes de dsNA "extendidos" pueden ser "guiados extendidos" (la región de nucleótidos en el extremo 5' de la hebra antisentido que está presente en la molécula además de la secuencia antisentido de 15-35 bases requerida para la participación de la hebra antisentido en un sustrato de Dicer) o "pasajeras extendidos" (la región de nucleótidos en el extremo 3' de la hebra en sentido que está opcionalmente presente en la molécula además de la secuencia sensorial de 15-35 bases requerida para la participación de la hebra en sentido en un sustrato de Dicer; o la región de nucleótidos en el extremo 5' de la hebra en sentido que está opcionalmente presente en la hebra en sentido además de la secuencia de bases 15-35 requerida para la participación de la hebra en sentido en un sustrato de Dicer). Por lo tanto, como se usa en el presente documento, el término "extendido" no se refiere al antisentido (o segunda hebra, o hebra guía) 3' sobresaliente de 1-6 nucleótidos monocatenarios; más bien "extendido", como se usa en el presente documento, se refiere al extremo opuesto de la molécula de sustrato de Dicer, es decir, una hebra 5' en sentido o antisentido extendida, donde la región extendida es 1-50, preferiblemente 10-15 nucleótidos de longitud o un 3' hebra en sentido extendida, donde la región extendida es 1-30, preferiblemente 10-15 nucleótidos de longitud. La hebra antisentido extendida 5' puede ser monocatenaria, y opcionalmente puede duplicarse con una tercera molécula de ácido nucleico que es complementaria, preferiblemente completamente (100%) complementaria, a la región de hebra sencilla extendida 5' de la hebra antisentido. Por lo tanto, en algunas realizaciones, es decir, cuando está presente la tercera molécula de ácido nucleico, la región extendida 5' de la hebra antisentido no es de hebra sencilla, sino que es una región de doble hebra o doble hebra. Preferiblemente, la tercera molécula de ácido nucleico, es decir, la región en sentido que es complementaria a la región antisentido extendida 5' no está presente a menos que esté presente una región antisentido extendida 5' afín.
Los agentes de dsNA extendidos de la presente invención pueden potenciar los siguientes atributos de dichos agentes en relación con los dsNA que carecen de una extensión como se define aquí: eficacia in vitro (por ejemplo, potencia y duración del efecto), eficacia in vivo (por ejemplo, potencia, duración del efecto, farmacocinética, farmacodinámica, captación intracelular, toxicidad reducida). En ciertas realizaciones, la región extendida 5' de la primera o segunda hebra puede proporcionar opcionalmente un agente adicional, tal como un aptámero o fragmento del mismo; o un sitio de unión (por ejemplo, un sitio de unión "señuelo") para una unidad estructural nativa o capaz introducida de forma exógena. Por lo tanto, la unidad estructural puede unirse a la extensión de una manera no selectiva de secuencia o específica de secuencia a través del sitio de unión. Por ejemplo, la región extendida de un dsNA puede diseñarse para comprender una o más secuencias de reconocimiento del factor de transcripción y/o un dominio de reconocimiento específico de secuencia para una sonda, marcador, etc.).
Como se usa en el presente documento, el término "farmacocinética" se refiere al proceso por el cual un fármaco es absorbido, distribuido, metabolizado y eliminado por el cuerpo. En ciertas realizaciones de la presente invención, la farmacocinética mejorada de un agente de ADNds de segunda hebra extendida 5' o 3' de hebra extendida larga 3' con respecto a un dsNA de control apropiado se refiere a una mayor absorción y/o distribución de dicho agente, y/o metabolismo lento y/o eliminación de dicho agente de dsNA extendido de 5' de la segunda hebra o agente de dsNA extendido de 3' de la primera hebra de un sujeto al que se le administró dicho agente.
Como se usa en el presente documento, el término "farmacodinámica" se refiere a la acción o efecto de un fármaco en un organismo vivo. En ciertas formas de realización de la presente invención, la farmacodinámica mejorada de un agente de dsNA extendido de 5' segunda hebra o un agente de dsNA extendido de 3' primera hebra en relación con un dsNA de control apropiado se refiere a una acción o efecto incrementado (por ejemplo, más potente o más prolongado) de un agente de dsNA extendido de 5' segunda hebra o un agente de dsNA extendido de 3' primera hebra, respectivamente, sobre un sujeto al que se le administró dicho agente, en relación con un dsNA de control apropiado.
Como se usa en este documento, el término "estabilización" se refiere a un estado de persistencia mejorada de un agente en un entorno seleccionado (por ejemplo, en una célula u organismo). En ciertas realizaciones, los dsNA extendidos de segunda hebra 5' o los agentes de dsNA extendidos de primera hebra 3' de la presente invención exhiben una estabilidad mejorada con respecto a los dsNA de control apropiados. Tal estabilidad mejorada se puede lograr a través de la resistencia mejorada de dichos agentes a las enzimas degradantes (por ejemplo, nucleasas) u otros agentes.
Además de los atributos descritos anteriormente para los dsNA extendidos antisentido 5', la tercera molécula de detección de ácido nucleico opcional de 10-30, y preferiblemente 10-15 nucleótidos, cuando está presente, estabiliza el dsNA, y/o aumenta la potencia, prolonga la acción o el efecto, aumenta los efectos farmacodinámicos o farmacológicos, y/o proporciona un agente adicional (o parte del mismo), como un aptámero o fragmento del mismo; o un sitio de unión (por ejemplo, un sitio de unión "señuelo") para una unidad estructural nativa o introducida de forma exógena (por ejemplo, una etiqueta).
Diseño/Síntesis de dARNsi
Se demostró previamente que las especies de ARNds más largas de 25 a aproximadamente 30 nucleótidos (DARNsi) producen resultados inhibidores de ARN inesperadamente efectivos en términos de potencia y duración de la acción, en comparación con los agentes de ARNsi de 19-23-mero. Sin desear limitarse a la teoría subyacente del mecanismo de procesamiento de ARNds, se cree que las especies de ARNds más largas sirven como sustrato para la enzima Dicer en el citoplasma de una célula. Además de escindir el dsNA de la invención en segmentos más cortos, se cree que Dicer facilita la incorporación de un producto de escisión monocatenario derivado del dsNA escindido en el complejo RISC que es responsable de la destrucción del ARN citoplasmático o derivado del gen diana. Estudios previos (Rossi et al., Solicitud de Patente de los Estados Unidos No. 2007/0265220) han demostrado que la escisión de una especie de ARNds (específicamente, un agente de DARNsi) por Dicer se corresponde con una mayor potencia y duración de la acción de las especies de ARNds. La presente invención, al menos en parte, proporciona el diseño de agentes inhibidores de ARN que dirigen el sitio de escisión de Dicer, de tal manera que se generan especies preferidas de productos de escisión de Dicer.
En un modelo de procesamiento de DARNsi, la enzima Dicer se une a un agente de DARNsi, lo que da como resultado la escisión del DARNsi en una posición 19-23 nucleótidos eliminados de una secuencia de proyección 3' asociada al dominio Dicer PAZ de la hebra antisentido del DARNsi agente. Este evento de escisión de Dicer da como resultado la escisión de aquellos ácidos nucleicos duplicados previamente ubicados en el extremo 3' de la hebra pasajera (sentido) y el extremo 5' de la hebra guía (antisentido). La escisión de un DARNsi generalmente produce un doble de 19-mero con sobresalientes de 2 bases en cada extremo. Como se modela actualmente en la figura 2, este evento de escisión de Dicer genera una hebra de guía de nucleótidos de 21-23 (antisentido) (o, en ciertos casos donde está presente un sobresaliente de 3' de hebra guía más larga, 24-27 hebras de guía de nucleótidos podrían resultar de la división de Dicer) capaz de dirigir la inhibición específica de la secuencia del ARNm objetivo como componente RISC.
No se requiere que el primer y segundo oligonucleótidos de los agentes de DARNsi de la presente invención sean completamente complementarios en la región duplicada. En una realización, el extremo 3' de la hebra en sentido contiene uno o más no coincidencias. En un aspecto, se incorporan aproximadamente dos no coincidencias en el extremo 3' de la hebra en sentido. En otra realización, el DARNsi es una molécula de ARN bicatenario que contiene dos oligonucleótidos de ARN en el rango de 25-66 nucleótidos de longitud y, cuando se recogen entre sí, tienen un desajuste de dos nucleótidos en el extremo 3' de la hebra en sentido (el 5'-terminal de la hebra antisentido). Se ha propuesto el uso de no coincidencias o disminución de la estabilidad termodinámica (específicamente en la posición antisentido/sentido 3') para facilitar o favorecer la entrada de la hebra antisentido en RISC (Schwarz et al., 2003; Khvorova et al., 2003), presumiblemente al afectar algunos pasos de desenrollado que limitan la velocidad que ocurren con la entrada del ARNsi en RISC. Por lo tanto, la composición de la base terminal se ha incluido en los algoritmos de diseño para seleccionar doble de ARNsi 21-mero activos (Ui-Tei et al., 2004; Reynolds et al., 2004). Con la escisión de Dicer de la región de ARNds de esta realización, la pequeña secuencia extrema terminal que contiene las no coincidencias no se emparejará con la hebra antisentido (se convertirá en parte de un sobresaliente 3') o se escindirá por completo del 21-mero final ARNsi. Estas formas específicas de "no coincidencias", por lo tanto, no persisten como no coincidencias en el componente de ARN final de RISC. El hallazgo de que las no coincidencias de bases o la desestabilización de segmentos en el extremo 3' de la hebra en sentido del sustrato de Dicer mejoraron la potencia de los dobles sintéticos en ARNi, presumiblemente al facilitar el procesamiento por Dicer, fue un hallazgo sorprendente de trabajos pasados que describen el diseño y el uso. de 25-30-mero ARNdss (también denominados "DARNsi" en este documento; Rossi et al., Solicitudes de Patente de los Estados Unidos Nos. 2005/0277610, 2005/0244858 y 2007/0265220). Ejemplos de pares de agentes de bases que no coinciden o fluctúan que poseen no coincidencias son G:A, C:A, C:U, G:G, A:A, C:C, U:U, I:A, I:U e I:C . La fuerza del par de bases de dichos agentes también puede disminuirse mediante la modificación de los nucleótidos de dichos agentes, que incluyen, por ejemplo, modificaciones de 2-amino o 2,6-diamino de nucleótidos de guanina y adenina. Los sustratos de Dicer y las moléculas de sustrato que no son de Dicer pueden tener cualquiera de las estructuras contempladas a continuación. Las figuras 43-46 presentan moléculas de dsNA que comprenden extensiones. La figura 47 presenta una molécula de dsNA que comprende un tetrabucle ubicado en el extremo 5' o 3' o en ambos extremos de la hebra antisentido.
Estructuras de ejemplo de agentes dsNA
Las composiciones de la invención comprenden un dsNA que es una molécula precursora, es decir, el dsNA de la presente invención se procesa in vivo para producir un pequeño ácido nucleico interferente activo (ARNsi). Dicer procesa el dsNA en un ARNsi activo que se incorpora a RISC. En algunas realizaciones, la molécula de dsNA de la invención no es escindida por Dicer, pero todavía está incorporada en RISC. Los dsNA pueden tener cualquiera de las estructuras descritas a continuación para dARNsi.
En un aspecto, la presente divulgación proporciona composiciones para la interferencia de ARN (ARNi) que tiene una primera o segunda hebra que tiene al menos 8 ribonucleótidos consecutivos. En ciertos aspectos, un agente de dsNA tiene 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o más (por ejemplo, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 26 o más, hasta la longitud total de la hebra) ribonucleótidos, ribonucleótidos modificados (2'-O-metil ribonucleótidos, enlaces de fosforotioato). En ciertos aspectos, los ribonucleótidos o los ribonucleótidos modificados son consecutivos.
En un aspecto, la presente invención proporciona composiciones para la interferencia de ARN (ARNi) que poseen uno o más desoxirribonucleótidos dentro de una región de un ácido nucleico bicatenario que se coloca 3' de un sitio de escisión de Dicer de hebra en sentido proyectado y correspondientemente 5' de un sitio de escisión de Dicer de hebra antisentido proyectado. En un ejemplo, al menos un nucleótido de la hebra guía entre e incluyendo los nucleótidos de la hebra guía correspondientes y, por lo tanto, la base emparejada con las posiciones 24 de la hebra pasajera al residuo de nucleótido terminal 3' de la hebra pasajera es un desoxirribonucleótido. En algunas realizaciones, el ácido nucleico bicatenario posee uno o más desoxirribonucleótidos pareados de bases dentro de una región del ácido nucleico bicatenario que se coloca 3' de un sitio de escisión de Dicer de hebra en sentido proyectado y correspondientemente 5' de un sitio de escisión de Dicer de hebra antisentido proyectada
En ciertas realizaciones, los agentes de dsNA pueden tener cualquiera de las siguientes estructuras de ejemplo:
En una de tales realizaciones, el dsNA comprende:
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*-3' en donde "X"=ARN, "Y" es un dominio del sobresaliente opcional compuesto de 0-10 monómeros de ARN que son opcionalmente monómeros de ARN 2'-O-metilo; en ciertas realizaciones, "Y" es un dominio del sobresaliente compuesto de 0-4 monómeros de ARN que son opcionalmente monómeros de ARN 2'-O-metilo, "Z"=ADN, ARN o nucleótido modificado, y "N"=1 a 50 o más, pero es opcionalmente 1-30 u, opcionalmente 1-15 o, opcionalmente, 1-10. En una realizaxión, N comprende al menos 9 enlaces de fosforotioato consecutivos. "N*"=0 a 15 o más, pero opcionalmente es 0, 1, 2, 3, 4 o 5. En una realización, la hebra superior es la hebra en sentido y la hebra inferior es la hebra antisentido. Alternativamente, la hebra inferior es la hebra en sentido y la hebra superior es la hebra antisentido.
En una de tales realizaciones, el dsNA comprende:
5'-Zm(Z)2Zm(Z)2Zm(Z)2Zm(Z)25N-3'
3'-Y(Z)25N-5'
en donde "Y" es un dominio del sobresaliente opcional compuesto de 0-10 monómeros de ARN que son opcionalmente monómeros de ARN 2'-O-metilo y/o monómeros de 2'-fluoro en ciertas realizaciones, "Y" es un dominio del sobresaliente compuesto por monómeros de ARN 0-4 que son opcionalmente monómeros de ARN 2'-O-metilo o monómeros de 2'-fluoro, "Z"=ADN, ARN o nucleótido modificado que son opcionalmente 2'-O monómeros de ARN metílico y/o monómeros 2'-fluoro, Zm es un nucleótido modificado con ligando que opcionalmente son timinas o adenosinas conjugadas con GalNac a través del azúcar o la base del nucleótido, y "N"=1 a 50 o más, pero es opcionalmente 1-30 u, opcionalmente 1-15 u, opcionalmente, 1-10. En una realización, N comprende al menos 9 enlaces de fosforotioato consecutivos. En una realización, la hebra superior es la hebra en sentido y la hebra inferior es la hebra antisentido. Alternativamente, la hebra inferior es la hebra en sentido y la hebra superior es la hebra antisentido.
En una de tales realizaciones, el dsNA comprende:
5'-Zm(Z)Zm(Z)Zm(Z)Zm(Z)25N-3'
3'-Y(Z)25N-5'
en donde "Y" es un dominio del sobresaliente opcional compuesto por 0-10 monómeros de ARN que son opcionalmente monómeros de ARN 2'-O-metilo y/o monómeros de 2'-fluoro-en ciertas realizaciones, "Y" es un dominio del sobresaliente compuesto por 0-4 monómeros de ARN que son opcionalmente monómeros de ARN 2'-O-metilo o monómeros de 2'-fluoro, "Z"=ADN, ARN o nucleótido modificado que son opcionalmente monómeros de ARN 2'-O-metilo y monómeros de 2'-fluoro, Zm es un nucleótido modificado con ligando que opcionalmente son timinas o adenosinas conjugadas con GalNac a través del azúcar o la base del nucleótido, y "N"=1 a 50 o más, pero es opcionalmente 1-30 nucleótidos u, opcionalmente 1-15 nucleótidos u, opcionalmente, 1-10 nucleótidos. En una realización, N comprende al menos 9 enlaces de fosforotioato consecutivos. En una realización, la hebra superior es la hebra en sentido y la hebra inferior es la hebra antisentido. Alternativamente, la hebra inferior es la hebra en sentido y la hebra superior es la hebra antisentido.
En una de tales realizaciones, el dsNA comprende:
5'-(Zm)4(Z)25N-3'
3'-Y(Z)25N-5'
en donde "Y" es un dominio del sobresaliente opcional compuesto de 0-10 monómeros de ARN que son opcionalmente monómeros de ARN 2'-O-metilo y/o monómeros de 2'-fluoro en ciertas realizaciones, "Y" es un dominio del sobresaliente compuesto por monómeros de ARN 0-4 que son opcionalmente monómeros de ARN 2'-O-metilo o monómeros de 2'-fluoro, "Z"=ADN, ARN o nucleótido modificado que son opcionalmente 2'-O monómeros de ARN metílico y/o monómeros 2'-fluoro, Zm es un nucleótido modificado con ligando que opcionalmente son timinas o adenosinas conjugadas con GalNac a través del azúcar o la base del nucleótido, y "N"=1 a 50 o más, pero es opcionalmente 1-30 nucleótidos u, opcionalmente, 1-15 nucleótidos u, opcionalmente, 1-10 nucleótidos. En una realización, N comprende al menos 9 enlaces de fosforotioato consecutivos. En una realización, la hebra superior es la hebra en sentido y la hebra inferior es la hebra antisentido. Alternativamente, la hebra inferior es la hebra en sentido y la hebra superior es la hebra antisentido.
En una de tales realizaciones, el dsNA comprende:
5'-(Zm)4(Z)8N(Z)25NDD-3'
3'-DDY(Z)25N-5'
en donde "Y" es un dominio del sobresaliente opcional compuesto de 0-10 monómeros de ARN que son opcionalmente monómeros de ARN 2'-O-metilo y/o monómeros de 2'-fluoro en ciertas realizaciones, "Y" es un dominio del sobresaliente compuesto por monómeros de ARN 0-4 que son opcionalmente monómeros de ARN 2'-O-metilo o monómeros de 2'-fluoro, "Z"=ADN, ARN o nucleótido modificado que son opcionalmente 2'-O monómeros de ARN metílico y/o monómeros 2'-fluoro, Zm es un nucleótido modificado con ligando que opcionalmente son timinas o adenosinas conjugadas con GalNac a través del azúcar o la base del nucleótido, "D"=ADN" y "N"=1 a 50 nucleótidos o más, pero es opcionalmente 1-30 nucleótidos u, opcionalmente 1-15 nucleótidos u, opcionalmente, 1-10. En una realización, N comprende al menos 9 enlaces de fosforotioato consecutivos. En una realización, la hebra superior es la hebra en sentido, y la hebra inferior es la hebra antisentido. Alternativamente, la hebra inferior es la hebra en sentido y la hebra superior es la hebra antisentido.
En una realización relacionada, el dsNA comprende:
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DD-3'
3 -YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*XXZN-5r
en donde "X"=ARN, "Y" es un dominio del sobresaliente opcional compuesto de 0-10 monómeros de ARN que son opcionalmente monómeros de ARN 2'-O-metilo; en ciertas realizaciones, "Y" es un dominio del sobresaliente compuesto de 1-4 monómeros de ARN que son opcionalmente monómeros de ARN 2'-O-metilo, "D"=ADN, "Z"=ADN, ARN o nucleótido modificado, y "N"=1 a 50 o más, pero es opcionalmente 1-30 u, opcionalmente 1-15 u, opcionalmente, 1-10. En una realización, N comprende al menos 9 enlaces de fosforotioato consecutivos. "N*"=0 a 15 o más, pero opcionalmente es 0, 1, 2, 3, 4 o 5. En una realización, la hebra superior es la hebra en sentido y la hebra inferior es la hebra antisentido. Alternativamente, la hebra inferior es la hebra en sentido y la hebra superior es la hebra antisentido.
En cualquiera de las estructuras representadas anteriormente, el extremo 5' de la hebra en sentido o la hebra antisentido opcionalmente comprende un grupo fosfato. En otra de tales realizaciones, el DARNsi comprende:
5 '-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN* IEN - 3'
3 YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*ZN-5f
en donde "X"=ARN, "X"=2'-O-metil ARN, "Y" es un dominio del sobresaliente opcional compuesto de 0-10 monómeros de ARN que son opcionalmente monómeros de ARN 2'-O-metilo, en ciertas realizaciones, "Y" es un dominio del sobresaliente compuesto por 1-4 monómeros de ARN que son opcionalmente monómeros de ARN 2'-O-metilo, "Z"=ADN, ARN o nucleótido modificado, y "N"=1 a 50 nucleótidos o más, pero es opcionalmente 1-30 u, opcionalmente 1-15 u, opcionalmente, 1-10. "E"=ADN, ARN o nucleótido modificado, "|"=una discontinuidad, y "N"=1 a 50 o más, pero es opcionalmente 1-15 u, opcionalmente, 1-10. "N*"=0 a 15 o más, pero opcionalmente es 0, 1, 2, 3, 4 o 5. En una realización, la hebra superior es la hebra en sentido y la hebra inferior es la hebra antisentido. Alternativamente, la hebra inferior es la hebra en sentido y la hebra superior es la hebra antisentido. En un ejemplo, la hebra superior es la hebra en sentido y la hebra inferior es la hebra antisentido. Alternativamente, la hebra inferior es la hebra en sentido y la hebra superior es la hebra antisentido, con monómeros de ARN 2'-O-metilo ubicados en residuos alternos a lo largo de la hebra superior, en lugar de la hebra inferior representada actualmente en el esquema anterior.
En otra de tales realizaciones, el dsNA comprende:
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*|EN-3'
3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*ZN-5'
en donde “X”=ARN "Y" es un dominio del sobresaliente opcional compuesto de 0-10 monómeros de ARN que son opcionalmente monómeros de ARN 2'-O-metilo,- en ciertas realizaciones "Y" es un dominio del sobresaliente compuesto por 0-4 monómeros de ARN que son opcionalmente monómeros de ARN 2'-O-metilo, “Z”=ADN, ARN o nucleótido modificado, y “N”=1 a 50 o más, pero es opcionalmente 1-30 u, opcionalmente 1-15 u, opcionalmente, 1­ 10. “E” = ADN, ARN o nucleótido modificado, "1"=una discontinuidad, y “N” = 1 a 50 o más, pero es opcionalmente 1­ 15 u, opcionalmente, 1-10. En una realización, N comprende al menos 9 enlaces de fosforotioato consecutivos. "N*"= 0 a 15 o más, pero es opcionalmente 0, 1, 2, 3, 4, o 5. En una realización, la hebra superior es la hebra en sentido y la hebra inferior es la hebra antisentido. Alternativamente, la hebra inferior es la hebra en sentido y la hebra superior es la hebra antisentido.
En una realización, la hebra superior es la hebra en sentido y la hebra inferior es la hebra antisentido. Alternativamente, la hebra inferior es la hebra en sentido y la hebra superior es la hebra antisentido, con monómeros de ARN 2'-O-metil ubicados en residuos alternos a lo largo de la hebra superior, en lugar de la hebra inferior representada actualmente en el esquema anterior.
En una realización relacionada, el dsNA comprende:
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DD|EN-3'
3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*XXZN-5'
en donde “X”=ARN "Y" es un dominio del sobresaliente opcional compuesto de 0-10 monómeros de ARN que son opcionalmente monómeros de ARN 2'-O-metilo-en ciertas realizaciones "Y" es un dominio del sobresaliente compuesto de 1-4 monómeros de ARN que son opcionalmente monómeros de ARN 2'-O-metilo, "D"=ADN, "Z"=ADN, ARN, o nucleótido modificado, y “N” = 1 a 50 o más, pero es opcionalmente 1-30 u, opcionalmente 1-15 u, opcionalmente, 1-10. En una realización, N comprende al menos 9 enlaces de fosforotioato consecutivos. "N*"= 0 a 15 o más, pero es opcionalmente 0, 1, 2, 3, 4, o 5. En una realización, la hebra superior es la hebra en sentido y la hebra inferior es la hebra antisentido. Alternativamente, la hebra inferior es la hebra en sentido y la hebra superior es la hebra antisentido.
En otra de tales realizaciones, el dsNA comprende:
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*ZN-3'
3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*-5'
en donde “X”=ARN "Y" es un dominio del sobresaliente opcional compuesto de 0-10 monómeros de ARN que son opcionalmente monómeros de ARN 2'-O-metilo-en ciertas realizaciones "Y" es un dominio del sobresaliente compuesto de 1-4 monómeros de ARN que son opcionalmente monómeros de ARN 2'-O-metilo, "Z"=ADN, ARN, o nucleótido modificado, y “N” = 1 a 50 o más, pero es opcionalmente 1-30 u, opcionalmente 1-15 u, opcionalmente, 1­ 10. En una realización, N comprende al menos 9 enlaces de fosforotioato consecutivos. "N*"= 0 a 15 o más, pero es opcionalmente 0, 1, 2, 3, 4, o 5. En una realización, la hebra superior es la hebra en sentido y la hebra inferior es la hebra antisentido. Alternativamente, la hebra inferior es la hebra en sentido y la hebra superior es la hebra antisentido.
En una realización relacionada, el dsNA comprende:
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DDZN-3'
3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*XX-5'
en donde “X”=ARN "Y" es un dominio del sobresaliente opcional compuesto de 0-10 monómeros de ARN que son opcionalmente monómeros de ARN 2'-O-metilo-en ciertas realizaciones "Y" es un dominio del sobresaliente compuesto de 1-4 monómeros de ARN que son opcionalmente monómeros de ARN 2'-O-metilo, "D"=ADN, "Z"=ADN, ARN, o nucleótido modificado, y “N” = 1 a 50 o más, pero es opcionalmente 1-30 u, opcionalmente 1-15 u, opcionalmente, 1-10. En una realización, N comprende al menos 9 enlaces de fosforotioato consecutivos. "N*"= 0 a 15 o más, pero es opcionalmente 0, 1, 2, 3, 4, o 5. En una realización, la hebra superior es la hebra en sentido y la hebra inferior es la hebra antisentido. Alternativamente, la hebra inferior es la hebra en sentido y la hebra superior es la hebra antisentido.
En una realización adicional, el dsNA comprende:
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DDZN-3'
3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*XX-5'
en donde “X”=ARN "X"=ARN 2'-O-metilo, "Y" es un dominio del sobresaliente opcional compuesto de 0-10 monómeros de ARN que son opcionalmente monómeros de ARN 2'-O-metilo-en ciertas realizaciones "Y" es un dominio del sobresaliente compuesto de 1-4 monómeros de ARN que son opcionalmente monómeros de ARN 2'-O-metilo, "D"=ADN, "Z"=ADN, ARN, o nucleótido modificado, y “N” = 1 a 50 o más, pero es opcionalmente 1-30 u, opcionalmente 1-15 u, opcionalmente, 1-10. En una realización, N comprende al menos 9 enlaces de fosforotioato consecutivos. "N*"= 0 a 15 o más, pero es opcionalmente 0, 1, 2, 3, 4, o 5. En una realización, la hebra superior es la hebra en sentido y la hebra inferior es la hebra antisentido. Alternativamente, la hebra inferior es la hebra en sentido y la hebra superior es la hebra antisentido.
En otra de tales realizaciones, el dsNA comprende:
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*-3'
3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*ZN-5'
en donde “X”=ARN "X"=ARN 2'-O-metilo, "Y" es un dominio del sobresaliente opcional compuesto de 0-10 monómeros de ARN que son opcionalmente monómeros de ARN 2'-O-metilo-en ciertas realizaciones "Y" es un dominio del sobresaliente compuesto de 1-4 monómeros de ARN que son opcionalmente monómeros de ARN 2'-O-metilo, "Z"=ADN, ARN, o nucleótido modificado, y “N” = 1 a 50 o más, pero es opcionalmente 1-30 u, opcionalmente 1-15 u, opcionalmente, 1-10. En una realización, N comprende al menos 9 enlaces de fosforotioato consecutivos. "N*"= 0 a 15 o más, pero es opcionalmente 0, 1, 2, 3, 4, o 5. En una realización, la hebra superior es la hebra en sentido y la hebra inferior es la hebra antisentido. Alternativamente, la hebra inferior es la hebra en sentido y la hebra superior es la hebra antisentido. En una realización, la hebra superior es la hebra en sentido y la hebra inferior es la hebra antisentido. Alternativamente, la hebra inferior es la hebra en sentido y la hebra superior es la hebra antisentido, con monómeros de ARN 2'-O-metil ubicados en residuos alternos a lo largo de la hebra superior, en lugar de la hebra inferior representada actualmente en el esquema anterior.
En otra de tales realizaciones, el dsNA comprende:
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DD-3'
3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN* XXZN-5'
en donde “X”=ARN "X"=ARN 2'-O-metilo, "Y" es un dominio del sobresaliente opcional compuesto de 0-10 monómeros de ARN que son opcionalmente monómeros de ARN 2'-O-metilo-en ciertas realizaciones "Y" es un dominio del sobresaliente compuesto de 1-4 monómeros de ARN que son opcionalmente monómeros de ARN 2'-O-metilo, "D"=ADN, "Z"=ADN, ARN, o nucleótido modificado, y “N” = 1 a 50 o más, pero es opcionalmente 1-30 u, opcionalmente 1-15 u, opcionalmente, 1-10. En una realización, N comprende al menos 9 enlaces de fosforotioato consecutivos. "N*"= 0 a 15 o más, pero es opcionalmente 0, 1, 2, 3, 4, o 5. En una realización, la hebra superior es la hebra en sentido y la hebra inferior es la hebra antisentido. Alternativamente, la hebra inferior es la hebra en sentido y la hebra superior es la hebra antisentido.
En una realización, la hebra superior es la hebra en sentido y la hebra inferior es la hebra antisentido. Alternativamente, la hebra inferior es la hebra en sentido y la hebra superior es la hebra antisentido, con monómeros de ARN 2'-O-metil ubicados en residuos alternos a lo largo de la hebra superior, en lugar de la hebra inferior representada actualmente en el esquema anterior.
En cualquiera de las estructuras descritas anteriormente, el extremo 5' de bien sea la hebra en sentido o de la hebra antisentido comprende opcionalmente un grupo fosfato.
En otra de tales realizaciones, el DARNsi comprende:
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*|EN-3'
3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*ZN-5'
en donde “X”=ARN "X"=ARN 2'-O-metilo, "Y" es un dominio del sobresaliente opcional compuesto de 0-10 monómeros de ARN que son opcionalmente monómeros de ARN 2'-O-metilo-en ciertas realizaciones "Y"es un dominio del sobresaliente compuesto de 1-4 monómeros de ARN que son opcionalmente monómeros de ARN 2'-O-metilo, “Z”=ADN, ARN o nucleótido modificado, y “N”=1 a 50 o más, pero es opcionalmente 1-30 u, opcionalmente 1-15 u, opcionalmente, 1-10. “E” = ADN, ARN o nucleótido modificado, "|"=una discontinuidad, y “N” = 1 a 50 o más, pero es opcionalmente 1-15 u, opcionalmente, 1-10. "N*"= 0 a 15 o más, pero es opcionalmente 0, 1, 2, 3, 4, o 5. En una realización, la hebra superior es la hebra en sentido y la hebra inferior es la hebra antisentido. Alternativamente, la hebra inferior es la hebra en sentido y la hebra superior es la hebra antisentido. En una realización, la hebra superior es la hebra en sentido y la hebra inferior es la hebra antisentido. Alternativamente, la hebra inferior es la hebra en sentido y la hebra superior es la hebra antisentido, con monómeros de ARN 2'-O-metil ubicados en residuos alternos a lo largo de la hebra superior, en lugar de la hebra inferior representada actualmente en el esquema anterior.
En una realización relacionada, el DARNsi comprende:
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DD|EN-3'
3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*XXZN-5'
en donde "X"=ARN, "X"=ARN 2'-O-metilo, "Y" es un dominio del sobresaliente opcional compuesto de 0-10 monómeros de ARN que son opcionalmente monómeros de ARN 2'-O-metilo; en ciertas realizaciones, "Y" es un dominio del sobresaliente compuesto de 1-4 monómeros de ARN que son opcionalmente monómeros de ARN 2'-O-metilo, “D”=ADN, "Z"=ADN, ARN o nucleótido modificado, y "N"=1 a 50 o más, pero es opcionalmente 1-30 u, opcionalmente 1-15 u, opcionalmente, 1-10. "N*"=0 a 15 o más, pero opcionalmente es 0, 1, 2, 3, 4 o 5. En una realización, la hebra superior es la hebra en sentido y la hebra inferior es la hebra antisentido. Alternativamente, la hebra inferior es la hebra en sentido y la hebra superior es la hebra antisentido. En una realización, la hebra superior es la hebra en sentido, y la hebra inferior es la hebra antisentido. Alternativamente, la hebra inferior es la hebra en sentido y la hebra superior es la hebra antisentido, con monómeros de ARN 2'-O-metilo ubicados en residuos alternos a lo largo de la hebra superior, en lugar de la hebra inferior representada actualmente en el esquema anterior.
En otra de tales realizaciones, el DARNsi comprende:
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*ZN-3'
3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*-5
en donde “X”=ARN "X"=ARN 2'-O-metilo, "Y" es un dominio del sobresaliente opcional compuesto de 0-10 monómeros de ARN que son opcionalmente monómeros de ARN 2'-O-metilo-en ciertas realizaciones "Y"es un dominio del sobresaliente compuesto de 1-4 monómeros de ARN que son opcionalmente monómeros de ARN 2'-O-metilo, "Z"=ADN, ARN, o nucleótido modificado, y “N” = 1 a 50 o más, pero es opcionalmente 1-30 u, opcionalmente 1-15 u, opcionalmente, 1-10. "N*"= 0 a 15 o más, pero es opcionalmente 0, 1,2, 3, 4, o 5. En una realización, la hebra superior es la hebra en sentido y la hebra inferior es la hebra antisentido. Alternativamente, la hebra inferior es la hebra en sentido y la hebra superior es la hebra antisentido. En una realización, la hebra superior es la hebra en sentido y la hebra inferior es la hebra antisentido. Alternativamente, la hebra inferior es la hebra en sentido y la hebra superior es la hebra antisentido, con monómeros de ARN 2'-O-metil ubicados en residuos alternos a lo largo de la hebra superior, en lugar de la hebra inferior representada actualmente en el esquema anterior.
En una realización relacionada, el DARNsi comprende:
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DDZN-3'
3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*XX-5'
en donde “X”=ARN "X"=ARN 2'-O-metilo, "Y" es un dominio del sobresaliente opcional compuesto de 0-10 monómeros de ARN que son opcionalmente monómeros de ARN 2'-O-metilo-en ciertas realizaciones "Y" es un dominio del sobresaliente compuesto de 1-4 monómeros de ARN que son opcionalmente monómeros de ARN 2'-O-metilo, "D"=ADN, "Z"=ADN, ARN, o nucleótido modificado, y “N” = 1 a 50 o más, pero es opcionalmente 1-30 u, opcionalmente 1-15 u, opcionalmente, 1-10. "N*"= 0 a 15 o más, pero es opcionalmente 0, 1, 2, 3, 4, o 5. En una realización, la hebra superior es la hebra en sentido y la hebra inferior es la hebra antisentido. Alternativamente, la hebra inferior es la hebra en sentido y la hebra superior es la hebra antisentido. En una realización, la hebra superior es la hebra en sentido y la hebra inferior es la hebra antisentido. Alternativamente, la hebra inferior es la hebra en sentido y la hebra superior es la hebra antisentido, con monómeros de ARN 2'-O-metil ubicados en residuos alternos a lo largo de la hebra superior, en lugar de la hebra inferior representada actualmente en el esquema anterior.
En una realización, se proporciona un agente de dsNA extendido que comprende desoxirribonucleótidos posicionados en sitios modelados para funcionar a través de la dirección específica de la escisión de Dicer. Se muestra una estructura de ejemplo para dicha molécula:
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*XXDD-3'
3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DDXXZN-5'
en donde "X"=ARN, "Y" es un dominio del sobresaliente opcional compuesto por 0-10 monómeros de ARN que son opcionalmente monómeros de ARN 2'-O-metilo en ciertas realizaciones, “Y” es un dominio del sobresaliente compuesto por 1-4 monómeros de ARN que son opcionalmente monómeros de ARN 2'-O-metilo, "D"=ADN, "Z"=ADN, ARN o nucleótido modificado y "N"=1 a 50 o más, pero es opcionalmente 1-30, opcionalmente 1-15 u, opcionalmente, 1-10. "N*"=0 a 15 o más, pero opcionalmente es 0, 1, 2, 3, 4 o 5. En una realización, la hebra superior es la hebra en sentido y la hebra inferior es la hebra antisentido. Alternativamente, la hebra inferior es la hebra en sentido y la hebra superior es la hebra antisentido.
La estructura anterior está modelada para forzar a Dicer a cortar un máximo de un doble de 21-mero como su forma principal de postprocesamiento. En las realizaciones en las que la hebra inferior de la estructura anterior es la hebra antisentido, la colocación de dos residuos desoxirribonucleótido en los últimos y penúltimos residuos del extremo 5' de la hebra antisentido es probable que reduzca los efectos fuera de la diana (como estudios anteriores han demostrado una modificación 2'-O-metilo de al menos la penúltima posición del extremo 5' de la hebra antisentido para reducir los efectos fuera de la diana; véase, por ejemplo, el documento US 2007/0223427).
En una realización relacionada, el dsNA comprende:
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*XXDD|EN-3'
3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DDXXZN-5'
en donde "X"=ARN, "Y" es un dominio del sobresaliente opcional compuesto de 0-10 monómeros de ARN que son opcionalmente monómeros de ARN 2'-O-metilo; en ciertas realizaciones, "Y" es un dominio del sobresaliente compuesto de 1-4 monómeros de ARN que son opcionalmente monómeros de ARN 2'-O-metilo, "D"=ADN, "Z"=ADN, ARN o nucleótido modificado, y "N"=1 a 50 o más, pero es opcionalmente 1-30 u, opcionalmente 1-15 u, opcionalmente, 1-10. "N*"=0 a 15 o más, pero opcionalmente es 0, 1, 2, 3, 4 o 5. En una realización, la hebra superior es la hebra en sentido y la hebra inferior es la hebra antisentido. Alternativamente, la hebra inferior es la hebra en sentido y la hebra superior es la hebra antisentido.
En una realización relacionada, el dsNA comprende:
5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*XXDDZN-3'
3'-YXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DDXX-5'
en donde "X"=ARN, "Y" es un dominio del sobresaliente opcional compuesto por 0-10 monómeros de ARN que son opcionalmente monómeros de ARN 2'-O-metilo en ciertas realizaciones, “Y” es un dominio del sobresaliente compuesto por 1-4 monómeros de ARN que son opcionalmente monómeros de ARN 2'-O-metilo, "D"=ADN, "Z"=ADN, ARN o nucleótido modificado y "N"=1 a 50 o más, pero es opcionalmente 1-30, opcionalmente 1-15 u, opcionalmente, 1-10. "N*"=0 a 15 o más, pero opcionalmente es 0, 1, 2, 3, 4 o 5. En una realización, la hebra superior es la hebra en sentido y la hebra inferior es la hebra antisentido. Alternativamente, la hebra inferior es la hebra en sentido y la hebra superior es la hebra antisentido.
En cualquiera de las estructuras representadas anteriormente, el extremo 5' de la hebra en sentido o la hebra antisentido opcionalmente comprende un grupo fosfato.
En una realización, la presente invención proporciona un ácido nucleico bicatenario que tiene una región sustancialmente duplicada entre la primera y la segunda hebra que comprende una región completamente duplicada que no tiene bases sin emparejar entre los nucleótidos 5' terminal y 3' terminal de la primera hebra que están emparejados con los nucleótidos correspondientes de la segunda hebra. En otra realización, la presente invención proporciona un ácido nucleico bicatenario que tiene una región sustancialmente doble que comprende, entre los nucleótidos 5' terminales y 3' terminales de la primera hebra que se emparejan con los nucleótidos correspondientes de la segunda hebra, 1, 2, 3, o 5 bases sin emparejar. En algunas realizaciones, las bases no emparejadas son consecutivas. En otras realizaciones, las bases no emparejadas no son consecutivas.
Como se usa en el presente documento, "DARNsimm" se refiere a un DARNsi que tiene una "región tolerante a la no coincidencia" que contiene uno, dos, tres o cuatro no coincidentes o cinco o seis o siete o ocho o nueve o diez o once o doce o trece o catorce o quince o veinte o treinta pares de bases no coincidentes del doble formado por las hebras en sentido y antisentido del DARNsi, donde dichas no coincidencias se colocan dentro del DARNsi en una ubicación(es) que se encuentra entre (y por lo tanto no incluye) los dos pares de bases terminales de cualquier extremo de la región bicatenaria del DARNsi. Los pares de bases que no coinciden se encuentran dentro de una "región tolerante a la no coincidencia" que se define aquí con respecto a la ubicación del sitio de corte Ago2 proyectado del ácido nucleico diana correspondiente. La región tolerante a la no coincidencia se encuentra "corriente arriba” del sitio de corte Ago2 proyectado de la hebra diana. “Corriente arriba” en este contexto se entenderá como la porción más 5' del doble DARNsimm, donde 5' se refiere a la orientación de la hebra en sentido del doble DARNsi. Por lo tanto, la región tolerante a la no coincidencia está corriente arriba de la base en la hebra en sentido (pasajera) que corresponde al sitio de corte Ago2 proyectado del ácido nucleico diana; alternativamente, cuando se refiere a la hebra antisentido (guía) del DARNsimm, la región tolerante a la no coincidencia también se puede describir como posicionada corriente abajo de la base que es complementaria al sitio de corte Ago2 proyectado del ácido nucleico diana, es decir, la porción más 3' de la hebra antisentido del DARNsimm (donde la posición 1 de la hebra antisentido es el nucleótido terminal 5' de la hebra antisentido).
En una realización, por ejemplo, la región tolerante a la no coincidencia se coloca entre los pares de bases 3-9 incluidos, cuando se numera desde el nucleótido que comienza en el extremo 5' de la hebra en sentido del doble. Por lo tanto, un DARNsimm de la invención posee un único par de bases no coincidentes en cualquiera de las posiciones 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 de la hebra en sentido de un DARNsi extendido a la derecha (donde la posición 1 es el nucleótido terminal 5' de la hebra de sentido y la posición 9 es el residuo de nucleótido de la hebra de sentido que es inmediatamente 5' del sitio de corte Ago2 proyectado de la secuencia de ARN diana correspondiente a la secuencia de hebra de sentido). En ciertas realizaciones, para un DARNsimm que posee un nucleótido de pares de bases no coincidentes en cualquiera de las posiciones 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 de la hebra en sentido, el correspondiente nucleótido de pares de bases no coincidentes de la hebra antisentido no solo forma un par de bases no coincidentes con la secuencia de hebra en sentido DARNsimm, pero también forma un par de bases no coincidentes con una secuencia de ARN diana DARNsimm (por lo tanto, la complementariedad entre la secuencia de hebra antisentido y la secuencia de hebra en sentido se interrumpe en el par de bases no coincidentes dentro del DARNsimm, y complementariedad se altera de manera similar entre la secuencia de hebra antisentido de DARNsimm y la secuencia de ARN diana). En realizaciones alternativas, el nucleótido del par de bases de la hebra antisentido de un DARNsimm solo forma un par de bases no coincidentes con un nucleótido correspondiente de la secuencia de la hebra en sentido del DARNsimm, pero pares de bases con su correspondiente nucleótido de secuencia de ARN diana (por lo tanto, complementariedad entre la secuencia de hebra antisentido y la secuencia de hebra en sentido se interrumpe en el par de bases no coincidentes dentro del DARNsimm, aunque se mantiene la complementariedad entre la secuencia de hebra antisentido del DARNsimm y la secuencia de ARN diana).
Un DARNsimm de la invención que posee un único par de bases no coincidentes dentro de la región tolerante a la no coincidencia (región de la no coincidencia) como se describe anteriormente (por ejemplo, un DARNsimm que alberga un residuo de nucleótido no coincidente en cualquiera de las posiciones 3, 4, 5, 6, 7, 8 o 9 de la hebra en sentido) pueden incluir además uno, dos o incluso tres pares de bases adicionales no coincidentes. En las realizaciones preferidas, estos uno, dos o tres pares de bases adicionales no coincidentes del DARNsimm se producen en las posiciones 3, 4, 5, 6, 7, 8 y/o 9 de la hebra en sentido (y en los residuos correspondientes de la hebra antisentido). En una realización en donde un par de bases adicional no coincidente está presente dentro de un DARNsimm, los dos pares de bases no coincidentes de la hebra en sentido pueden ocurrir, por ejemplo, en los nucleótidos de la posición 4 y la posición 6 de la hebra en sentido (con la no coincidencia también en el nucleótido correspondiente residuos de la hebra antisentido).
En los agentes DARNsimm que poseen dos pares de bases no coincidentes, pueden producirse no coincidencias consecutivas (por ejemplo, en posiciones consecutivas a lo largo de la secuencia de nucleótidos de la hebra en sentido). Alternativamente, los nucleótidos de la hebra en sentido que forman pares de bases no coincidentes con la secuencia de hebra antisentido pueden estar intercalados por nucleótidos que se emparejan con la secuencia de hebra antisentido (por ejemplo, para un DARNsimm que posee nucleótidos no coincidentes en las posiciones 3 y 6, pero no en las posiciones 4 y 5, los residuos no coincidentes de las posiciones 3 y 6 de la hebra en sentido están intercalados por dos nucleótidos que forman pares de bases coincidentes con los residuos correspondientes de la hebra antisentido). Por ejemplo, dos residuos de la hebra en sentido (ubicados dentro de la región tolerante a la no coincidencia de la hebra en sentido) que forman pares de bases no coincidentes con la secuencia de hebra antisentido correspondiente pueden ocurrir con cero, uno, dos, tres, cuatro o cinco pares de bases coincidentes ubicados entre estos pares de bases no coincidentes.
Para ciertos agentes DARNsimm que poseen tres pares de bases no coincidentes, pueden producirse no coincidencias consecutivas (por ejemplo, en un triplete a lo largo de la secuencia de nucleótidos de la hebra en sentido). Alternativamente, los nucleótidos de la hebra en sentido que forman pares de bases no coincidentes con la secuencia de hebra antisentido pueden estar intercalados por nucleótidos que forman pares de bases coincidentes con la secuencia de hebra antisentido (por ejemplo, para un DARNsimm que posee nucleótidos no coincidentes en las posiciones 3, 4 y 8, pero no en las posiciones 5, 6 y 7, los residuos no coincidentes de las posiciones 3 y 4 de la hebra en sentido son adyacentes entre sí, mientras que los residuos no coincidentes de las posiciones 4 y 8 de la hebra en sentido están intercalados por tres nucleótidos que forman pares de bases coincidentes con los residuos correspondientes de la hebra antisentido). Por ejemplo, tres residuos de la hebra en sentido (ubicados dentro de la región tolerante a la no coincidencia de la hebra en sentido) que forman pares de bases no coincidentes con la secuencia de hebra antisentido correspondiente pueden ocurrir con cero, uno, dos, tres o cuatro pares de bases coincidentes ubicados entre cualquiera de estos dos pares de bases no coincidentes.
Para ciertos agentes DARNsimm que poseen cuatro pares de bases no coincidentes, pueden producirse no coincidencias consecutivas (por ejemplo, en un cuadruplete a lo largo de la secuencia de nucleótidos de la hebra en sentido). Alternativamente, los nucleótidos de la hebra en sentido que forman pares de bases no coincidentes con la secuencia de hebra antisentido pueden estar intercalados por nucleótidos que forman pares de bases coincidentes con la secuencia de hebra antisentido (por ejemplo, para un DARNsimm que posee nucleótidos no coincidentes en las posiciones 3, 5, 7 y 8 , pero no en las posiciones 4 y 6, los residuos no coincidentes de las posiciones 7 y 8 de la hebra en sentido son adyacentes entre sí, mientras que los residuos no coincidentes de las posiciones 3 y 5 de la hebra en sentido están intercalados por un nucleótido que forma un par de bases coincidentes con el correspondiente residuo de la hebra antisentido de manera similar, los residuos no coincidentes de las posiciones 5 y 7 de la hebra en sentido también están intercalados por un nucleótido que forma un par de bases coincidentes con el residuo correspondiente de la hebra antisentido). Por ejemplo, cuatro residuos de la hebra en sentido (ubicados dentro de la región tolerante a la no coincidencia de la hebra en sentido) que forman pares de bases no coincidentes con la secuencia de hebra antisentido correspondiente pueden ocurrir con cero, uno, dos o tres pares de bases coincidentes ubicados entre dos de estos pares de bases no coincidentes.
En otra realización, un DARNsimm de la invención comprende una región tolerante no coincidente que posee un único nucleótido de pares de bases no coincidentes en cualquiera de las posiciones 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21 de la hebra antisentido de un DARNsi extendido a la izquierda (donde la posición 1 es el nucleótido terminal 5' de la hebra antisentido y la posición 13 es el residuo de nucleótidos de la hebra antisentido que está inmediatamente 3' (corriente abajo) en la hebra antisentido del sitio de corte Ago2 proyectado del secuencia de ARN diana suficientemente complementaria a la secuencia de hebra antisentido). En ciertas realizaciones, para un DARNsimm que posee un nucleótido de par de bases no coincidente en cualquiera de las posiciones 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21 de la hebra antisentido con respecto a la hebra en sentido del DARNsimm, el nucleótido de pares de bases no coincidentes de la hebra antisentido no solo forma un par de bases no coincidentes con la secuencia de la hebra en sentido DARNsimm, sino que también forma un par de bases no coincidentes con una secuencia de ARN diana de DARNsimm (por lo tanto, la complementariedad entre la secuencia de hebra antisentido y la secuencia de la hebra en sentido es interrumpido en el par de bases no coincidentes dentro del DARNsimm, y la complementariedad se altera de manera similar entre la secuencia de hebra antisentido del DARNsimm y la secuencia de ARN diana). En realizaciones alternativas, el nucleótido del par de bases de la hebra antisentido de un DARNsimm solo forma un par de bases no coincidentes con un nucleótido correspondiente de la secuencia de la hebra en sentido del DARNsimm, pero pares de bases con su correspondiente nucleótido de secuencia de ARN diana (por lo tanto, complementariedad entre la secuencia de hebra antisentido y la secuencia de hebra en sentido se interrumpe en el par de bases no coincidentes dentro del DARNsimm, aunque se mantiene la complementariedad entre la secuencia de hebra antisentido del DARNsimm y la secuencia de ARN diana).
Un DARNsimm de la invención que posee un único par de bases no coincidentes dentro de la región tolerante a la no coincidencia como se describió anteriormente (por ejemplo, un DARNsimm que alberga un residuo de nucleótido no coincidente en las posiciones 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o 21 de la hebra antisentido) pueden incluir además uno, dos o incluso tres pares de bases adicionales no coincidentes. En las realizaciones preferidas, estos uno, dos o tres pares de bases adicionales no coincidentes del DARNsimm se producen en las posiciones 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 y/o 21 de la hebra antisentido (y en el correspondiente residuo de la hebra en sentido). En una realización en donde un par de bases no coincidentes adicional está presente dentro de un DARNsimm, los dos pares de bases no coincidentes de la hebra antisentido pueden ocurrir, por ejemplo, en los nucleótidos de la posición 14 y la posición 18 de la hebra antisentido (con la no coincidencia también en el nucleótido correspondiente residuos de la hebra en sentido).
En los agentes DARNsimm que poseen dos pares de bases no coincidentes, pueden producirse no coincidencias consecutivas (por ejemplo, en posiciones consecutivas a lo largo de la secuencia de nucleótidos de la hebra antisentido). Alternativamente, los nucleótidos de la hebra antisentido que forman pares de bases no coincidentes con la secuencia de hebra en sentido pueden ser intercalados por nucleótidos que se emparejan con la secuencia de hebra en sentido (por ejemplo, para un DARNsimm que posee nucleótidos no coincidentes en las posiciones 13 y 16, pero no en las posiciones 14 y 15, los residuos no coincidentes de las posiciones de hebra antisentido 13 y 16 están intercalados por dos nucleótidos que forman pares de bases coincidentes con los residuos correspondientes de la hebra en sentido). Por ejemplo, dos residuos de la hebra antisentido (ubicados dentro de la región tolerante a la no coincidencia de la hebra en sentido) que forman pares de bases incompatibles con la secuencia de hebra en sentido correspondiente pueden ocurrir con cero, uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete pares de bases coincidentes ubicados entre estos pares de bases no coincidentes.
Para ciertos agentes DARNsimm que poseen tres pares de bases no coincidentes, pueden producirse no coincidencias consecutivas (por ejemplo, en un triplete a lo largo de la secuencia de nucleótidos de la hebra antisentido). Alternativamente, los nucleótidos de la hebra antisentido que forman pares de bases no coincidentes con la secuencia de la hebra en sentido pueden ser intercalados por nucleótidos que forman pares de bases coincidentes con la secuencia de la hebra en sentido (por ejemplo, para un DARNsimm que posee nucleótidos no coincidentes en las posiciones 13, 14 y 18, pero no en las posiciones 15, 16 y 17, los residuos no coincidentes de las posiciones de hebra antisentido 13 y 14 son adyacentes entre sí, mientras que los residuos no coincidentes de las posiciones de hebra antisentido 14 y 18 están intercalados por tres nucleótidos que forman pares de bases coincidentes con los residuos correspondientes de la hebra de los sentidos). Por ejemplo, tres residuos de la hebra antisentido (ubicados dentro de la región tolerante a la no coincidencia de la hebra antisentido) que forman pares de bases no coincidentes con la secuencia de hebra en sentido correspondiente pueden ocurrir con cero, uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis coincidentes pares de bases ubicados entre dos de estos pares de bases no coincidentes.
Para ciertos agentes DARNsimm que poseen cuatro pares de bases no coincidentes, pueden producirse no coincidencias consecutivas (por ejemplo, en un cuadruplete a lo largo de la secuencia de nucleótidos de la hebra antisentido). Alternativamente, los nucleótidos de la hebra antisentido que forman pares de bases no coincidentes con la secuencia de la hebra en sentido pueden estar intercalados por nucleótidos que forman pares de bases coincidentes con la secuencia de la hebra en sentido (por ejemplo, para un DARNsimm que posee nucleótidos no coincidentes en las posiciones 13, 15, 17 y 18 , pero no en las posiciones 14 y 16, los residuos no coincidentes de las posiciones de hebra antisentido 17 y 18 son adyacentes entre sí, mientras que los residuos no coincidentes de las posiciones de hebra antisentido 13 y 15 están intercalados por un nucleótido que forma un par de bases coincidentes con el correspondiente residuo de la hebra en sentido de manera similar, los residuos no coincidentes de las posiciones de hebra antisentido 15 y 17 también están intercalados por un nucleótido que forma un par de bases coincidentes con el residuo correspondiente de la hebra en sentido). Por ejemplo, cuatro residuos de la hebra antisentido (ubicados dentro de la región tolerante a la no coincidencia de la hebra antisentido) que forman pares de bases no coincidentes con la secuencia de hebra en sentido correspondiente pueden ocurrir con cero, uno, dos, tres, cuatro o cinco pares de bases coincidentes ubicado entre dos de estos pares de bases no coincidentes.
En una realización adicional, un DARNsimm de la invención posee un único nucleótido de pares de bases no coincidentes en cualquiera de las posiciones 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 o 19 de la hebra antisentido de un DARNsi extendido a la izquierda (donde la posición 1 es el nucleótido terminal 5' de la hebra antisentido y la posición 11 es el residuo de nucleótido de la hebra antisentido que está inmediatamente 3' (corriente abajo) en la hebra antisentido del sitio de corte Ago2 proyectado de la secuencia de ARN diana suficientemente complementaria a la secuencia de hebra antisentido). En ciertas realizaciones, para un DARNsimm que posee un nucleótido de pares de bases no coincidentes en cualquiera de las posiciones 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 o 19 de la hebra antisentido con respecto a la hebra en sentido del DARNsimm, el nucleótido de pares de bases no coincidentes de la hebra antisentido no solo forma un par de bases no coincidentes con la secuencia de la hebra en sentido de DARNsimm, sino que también forma un par de bases no coincidentes con una secuencia de ARN diana de DARNsimm (por lo tanto, la complementariedad entre la secuencia de la hebra antisentido y la secuencia de la hebra en sentido es interrumpido en el par de bases no coincidentes dentro del DARNsimm, y la complementariedad se altera de manera similar entre la secuencia de hebra antisentido del DARNsimm y la secuencia de ARN diana). En realizaciones alternativas, el nucleótido de pares de bases con no coincidencia de la hebra antisentido de un DARNsimm solo forma un par de bases con no coincidencia con un nucleótido correspondiente de la secuencia de hebra en sentido de DARNsimm, pero este mismo par de bases de nucleótidos con hebra antisentido con su correspondiente nucleótido de secuencia de ARN diana (por lo tanto, la complementariedad entre la secuencia de hebra antisentido y la secuencia de hebra en sentido se interrumpe en el par de bases no coincidentes dentro del DARNsimm, aunque se mantiene la complementariedad entre la secuencia de hebra antisentido del DARNsimm y la secuencia de ARN diana).
Un DARNsimm de la invención que posee un único par de bases no coincidentes dentro de la región tolerante a la no coincidencia como se describió anteriormente (por ejemplo, un DARNsimm que alberga un residuo de nucleótido no coincidente en las posiciones 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 o 19 de la hebra antisentido) puede incluir además uno, dos o incluso tres pares de bases adicionales no coincidentes. En realizaciones preferidas, estos uno, dos o tres pares de bases adicionales no coincidentes del DARNsimm se producen en las posiciones 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 y/o 19 de la hebra antisentido (y en el correspondiente residuo de la hebra en sentido). En una realización en donde un par de bases no coincidentes adicional está presente dentro de un DARNsimm, los dos pares de bases no coincidentes de la hebra antisentido pueden ocurrir, por ejemplo, en los nucleótidos de la posición 14 y la posición 18 de la hebra antisentido (con la no coincidencia también en el nucleótido correspondiente residuos de la hebra en sentido).
En los agentes DARNsimm que poseen dos pares de bases no coincidentes, pueden producirse no coincidencias consecutivas (por ejemplo, en posiciones consecutivas a lo largo de la secuencia de nucleótidos de la hebra antisentido). Alternativamente, los nucleótidos de la hebra antisentido que forman pares de bases no coincidentes con la secuencia de hebra en sentido pueden ser intercalados por nucleótidos que se emparejan con la secuencia de hebra en sentido (por ejemplo, para un DARNsimm que posee nucleótidos no coincidentes en las posiciones 12 y 15, pero no en las posiciones 13 y 14, los residuos no coincidentes de las posiciones de hebra antisentido 12 y 15 están intercalados por dos nucleótidos que forman pares de bases coincidentes con los residuos correspondientes de la hebra en sentido). Por ejemplo, dos residuos de la hebra antisentido (ubicados dentro de la región tolerante a la no coincidencia de la hebra en sentido) que forman pares de bases incompatibles con la secuencia de hebra en sentido correspondiente pueden ocurrir con cero, uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete pares de bases coincidentes ubicados entre estos pares de bases no coincidentes.
Para ciertos agentes DARNsimm que poseen tres pares de bases no coincidentes, pueden producirse no coincidencias consecutivas (por ejemplo, en un triplete a lo largo de la secuencia de nucleótidos de la hebra antisentido). Alternativamente, los nucleótidos de la hebra antisentido que forman pares de bases no coincidentes con la secuencia de la hebra en sentido pueden ser intercalados por nucleótidos que forman pares de bases coincidentes con la secuencia de la hebra en sentido (por ejemplo, para un DARNsimm que posee nucleótidos no coincidentes en las posiciones 13, 14 y 18, pero no en las posiciones 15, 16 y 17, los residuos no coincidentes de las posiciones de hebra antisentido 13 y 14 son adyacentes entre sí, mientras que los residuos no coincidentes de las posiciones de hebra antisentido 14 y 18 están intercalados por tres nucleótidos que forman pares de bases coincidentes con los residuos correspondientes de la hebra de los sentidos). Por ejemplo, tres residuos de la hebra antisentido (ubicados dentro de la región tolerante a la no coincidencia de la hebra antisentido) que forman pares de bases no coincidentes con la secuencia de hebra en sentido correspondiente pueden ocurrir con cero, uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis coincidentes pares de bases ubicados entre dos de estos pares de bases no coincidentes.
Para ciertos agentes DARNsimm que poseen cuatro pares de bases no coincidentes, pueden producirse no coincidencias consecutivas (por ejemplo, en un cuadruplete a lo largo de la secuencia de nucleótidos de la hebra antisentido). Alternativamente, los nucleótidos de la hebra antisentido que forman pares de bases no coincidentes con la secuencia de la hebra en sentido pueden estar intercalados por nucleótidos que forman pares de bases coincidentes con la secuencia de la hebra en sentido (por ejemplo, para un DARNsimm que posee nucleótidos no coincidentes en las posiciones 13, 15, 17 y 18, pero no en las posiciones 14 y 16, los residuos no coincidentes de las posiciones de hebra antisentido 17 y 18 son adyacentes entre sí, mientras que los residuos no coincidentes de las posiciones de hebra antisentido 13 y 15 están intercalados por un nucleótido que forma un par de bases coincidentes con el correspondiente residuo de la hebra en sentido de manera similar, los residuos no coincidentes de las posiciones de hebra antisentido 15 y 17 también están intercalados por un nucleótido que forma un par de bases coincidentes con el residuo correspondiente de la hebra en sentido). Por ejemplo, cuatro residuos de la hebra antisentido (ubicados dentro de la región tolerante a la no coincidencia de la hebra antisentido) que forman pares de bases no coincidentes con la secuencia de hebra en sentido correspondiente pueden ocurrir con cero, uno, dos, tres, cuatro o cinco pares de bases coincidentes ubicado entre dos de estos pares de bases no coincidentes.
En una realización adicional, un DARNsimm de la invención posee un único nucleótido de pares de bases no coincidentes en cualquiera de las posiciones 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 o 23 de la hebra antisentido de un DARNsi extendido a la izquierda (donde la posición 1 es el nucleótido terminal 5' de la hebra antisentido y la posición 15 es el residuo de nucleótido de la hebra antisentido que está inmediatamente 3' (corriente abajo) en la hebra antisentido del sitio de corte Ago2 proyectado de la secuencia de ARN diana suficientemente complementaria a la secuencia de hebra antisentido). En ciertas realizaciones, para un DARNsimm que posee un nucleótido de pares de bases no coincidentes en cualquiera de las posiciones 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 o 23 de la hebra antisentido con respecto a la hebra en sentido del DARNsimm, el nucleótido de pares de bases no coincidentes de la hebra antisentido no solo forma un par de bases no coincidentes con la secuencia de la hebra en sentido DARNsimm, sino que también forma un par de bases no coincidentes con una secuencia de ARN diana de DARNsimm (por lo tanto, la complementariedad entre la secuencia de hebra antisentido y la secuencia de la hebra en sentido es interrumpido en el par de bases no coincidentes dentro del DARNsimm, y la complementariedad se altera de manera similar entre la secuencia de hebra antisentido del DARNsimm y la secuencia de ARN diana). En realizaciones alternativas, el nucleótido de pares de bases con no coincidencia de la hebra antisentido de un DARNsimm solo forma un par de bases con no coincidencia con un nucleótido correspondiente de la secuencia de hebra en sentido de DARNsimm, pero este mismo par de bases de nucleótidos con hebra antisentido con su correspondiente nucleótido de secuencia de ARN diana (por lo tanto, la complementariedad entre la secuencia de hebra antisentido y la secuencia de hebra en sentido se interrumpe en el par de bases no coincidentes dentro del DARNsimm, aunque se mantiene la complementariedad entre la secuencia de hebra antisentido del DARNsimm y la secuencia de ARN diana).
Un DARNsimm de la invención que posee un único par de bases no coincidentes dentro de la región tolerante a la no coincidencia como se describió anteriormente (por ejemplo, un DARNsimm que alberga un residuo de nucleótido no coincidente en las posiciones 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 o 23 de la hebra antisentido) puede incluir además uno, dos o incluso tres pares de bases adicionales no coincidentes. En ejemplos preferidos, estos uno, dos o tres pares de bases adicionales no coincidentes del DARNsimm se producen en las posiciones 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 y/o 23 de la hebra antisentido (y en el correspondiente residuo de la hebra en sentido). En una realización en donde un par de bases no coincidentes adicional está presente dentro de un DARNsimm, los dos pares de bases no coincidentes de la hebra antisentido pueden ocurrir, por ejemplo, en los nucleótidos de la posición 16 y la posición 20 de la hebra antisentido (con la no coincidencia también en el nucleótido correspondiente residuos de la hebra en sentido).
En los agentes DARNsimm que poseen dos pares de bases no coincidentes, pueden producirse no coincidencias consecutivas (por ejemplo, en posiciones consecutivas a lo largo de la secuencia de nucleótidos de la hebra antisentido). Alternativamente, los nucleótidos de la hebra antisentido que forman pares de bases no coincidentes con la secuencia de la hebra en sentido pueden ser intercalados por nucleótidos que se emparejan con la secuencia de la hebra en sentido (por ejemplo, para un DARNsimm que posee nucleótidos no coincidentes en las posiciones 16 y 20, pero no en las posiciones 17, 18 y 19, los residuos no coincidentes de las posiciones de hebra antisentido 16 y 20 están intercalados por tres nucleótidos que forman pares de bases coincidentes con los residuos correspondientes de la hebra en sentido). Por ejemplo, dos residuos de la hebra antisentido (ubicados dentro de la región tolerante a la no coincidencia de la hebra en sentido) que forman pares de bases incompatibles con la secuencia de hebra en sentido correspondiente pueden ocurrir con cero, uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis o siete pares de bases coincidentes ubicados entre estos pares de bases no coincidentes.
Para ciertos agentes DARNsimm que poseen tres pares de bases no coincidentes, pueden producirse no coincidencias consecutivas (por ejemplo, en un triplete a lo largo de la secuencia de nucleótidos de la hebra antisentido). Alternativamente, los nucleótidos de la hebra antisentido que forman pares de bases no coincidentes con la secuencia de la hebra en sentido pueden estar intercalados por nucleótidos que forman pares de bases coincidentes con la secuencia de la hebra en sentido (por ejemplo, para un DARNsimm que posee nucleótidos no coincidentes en las posiciones 16, 17 y 21, pero no en las posiciones 18, 19 y 20, los residuos no coincidentes de las posiciones de hebra antisentido 16 y 17 son adyacentes entre sí, mientras que los residuos no coincidentes de las posiciones 17 y 21 de hebra antisentido están intercalados por tres nucleótidos que forman pares de bases coincidentes con residuos correspondientes de la hebra de los sentidos). Por ejemplo, tres residuos de la hebra antisentido (ubicados dentro de la región tolerante a la no coincidencia de la hebra antisentido) que forman pares de bases no coincidentes con la secuencia de hebra en sentido correspondiente pueden ocurrir con cero, uno, dos, tres, cuatro, cinco o seis coincidentes pares de bases ubicados entre dos de estos pares de bases no coincidentes.
Para ciertos agentes DARNsimm que poseen cuatro pares de bases no coincidentes, pueden producirse no coincidencias consecutivas (por ejemplo, en un cuadruplete a lo largo de la secuencia de nucleótidos de la hebra antisentido). Alternativamente, los nucleótidos de la hebra antisentido que forman pares de bases no coincidentes con la secuencia de la hebra en sentido pueden ser intercalados por nucleótidos que forman pares de bases coincidentes con la secuencia de la hebra en sentido (por ejemplo, para un DARNsimm que posee nucleótidos no coincidentes en las posiciones 17, 19, 21 y 22 , pero no en las posiciones 18 y 20, los residuos no coincidentes de las posiciones de hebra antisentido 21 y 22 son adyacentes entre sí, mientras que los residuos no coincidentes de las posiciones de hebra antisentido 17 y 19 están intercalados por un nucleótido que forma un par de bases coincidentes con el correspondiente residuo de la hebra en sentido de manera similar, los residuos no coincidentes de las posiciones de hebra antisentido 19 y 21 también están intercalados por un nucleótido que forma un par de bases coincidentes con el residuo correspondiente de la hebra en sentido). Por ejemplo, cuatro residuos de la hebra antisentido (ubicados dentro de la región tolerante a la no coincidencia de la hebra antisentido) que forman pares de bases no coincidentes con la secuencia de hebra en sentido correspondiente pueden ocurrir con cero, uno, dos, tres, cuatro o cinco pares de bases coincidentes ubicado entre dos de estos pares de bases no coincidentes.
Por razones de claridad, la(s) ubicación(es) de los residuos de nucleótidos no coincidentes dentro de los agentes de DARNsimm anteriores se numeran en referencia al residuo terminal 5' de las hebras en sentido o antisentido de DARNsimm. La numeración de las posiciones ubicadas dentro de la región tolerante a la no coincidencia (región de no coincidencia) de la hebra antisentido puede cambiar con variaciones en la proximidad del extremo 5' de la hebra antisentido al sitio de escisión Ago2 proyectado. Por lo tanto, la(s) ubicación(es) de los sitios no coincidente preferidos dentro de la hebra antisentido o la hebra en sentido también se puede identificar como la proximidad permisible de tales no coincidencias al sitio de corte Ago2 proyectado. Por consiguiente, en una realización preferida, la posición de un nucleótido no coincidente de la hebra en sentido de un DARNsimm es el residuo de nucleótido de la hebra en sentido que se encuentra inmediatamente 5' (corriente arriba) del sitio de escisión de Ago2 proyectado de la secuencia de ARN diana correspondiente. En otras realizaciones preferidas, un nucleótido no coincidente de la hebra en sentido de un DARNsimm se coloca en el residuo de nucleótido de la hebra en sentido que se encuentra dos nucleótidos 5' (corriente arriba) del sitio de escisión Ago2 proyectado, tres nucleótidos 5' (corriente arriba) del sitio de escisión de Ago2 proyectado, cuatro nucleótidos 5' (corriente arriba) del sitio de escisión de Ago2 proyectado, cinco nucleótidos 5' (corriente arriba) del sitio de escisión de Ago2 proyectado, seis nucleótidos 5' (corriente arriba) del sitio de escisión de Ago2 proyectado, siete nucleótidos 5' (corriente arriba) del sitio de escisión Ago2 proyectado, ocho nucleótidos 5' (corriente arriba) del sitio de escisión Ago2 proyectado, o nueve nucleótidos 5' (corriente arriba) del sitio de escisión Ago2 proyectado.
Los ejemplos de DARNsi extendidos de hebra única de 5' que contienen incompatibilidades individuales (DARNsimm) incluyen las siguientes estructuras (tales estructuras que contienen incompatibilidades también pueden incorporarse en otras estructuras de DARNsi de ejemplo mostradas aquí).
5'-XXMXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DD-3'
3'-YXXMXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*XXZN-5'
5'-XXXMXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DD-3'
3'-YXXXMXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*XXZN-5'
5'-XXXXMXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DD-3'
3'-YXXXXMXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*XXZN-5'
5'-XXXXXMXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DD-3'
3'-YXXXXXMXXXXXXXXXXXXXXXXXN*XXZN-5'
5'-XXXXXXMXXXXXXXXXXXXXXXXN*DD-3'
3'-YXXXXXXMXXXXXXXXXXXXXXXXN*XXZN-5'
5'-XXXXXXXMXXXXXXXXXXXXXXXN*DD-3'
3'-YXXXXXXXMXXXXXXXXXXXXXXXN*XXZN-5'
5'-XXXXXXXXMXXXXXXXXXXXXXXN*DD-3'
3'-YXXXXXXXXMXXXXXXXXXXXXXXN*XXZN-5'
Donde "X"=ARN, "Y" es un dominio del sobresaliente opcional compuesto de 0-10 monómeros de ARN que son opcionalmente monómeros de ARN 2'-O-metilo; en ciertas realizaciones, "Y" es un dominio del sobresaliente compuesto de 1-4 monómeros de ARN que son opcionalmente monómeros de ARN 2'-O-metilo, "Z"=ADN, ARN o nucleótido modificado, "N"=1 a 50 o más, pero es opcionalmente 1-30 u, opcionalmente 1-15 u, opcionalmente, 1-10. "N*"=0 a 15 o más, pero opcionalmente es 0, 1, 2, 3, 4 o 5, y "D"=ADN, "M"=residuos de ácido nucleico (ARN, ADN o ácidos nucleicos no naturales o modificados) que no forman un par de bases (enlace de hidrógeno) con los residuos "M" correspondientes de la hebra complementaria cuando las hebras se fusionan. Cualquiera de los residuos de dichos agentes puede ser opcionalmente monómeros de ARN 2'-O-metil con posicionamiento alternativo de monómeros de ARN 2'-O-metilo que comienza desde el residuo 3'-terminal de la hebra inferior (segunda), como se muestra arriba, también se puede usar en los agentes DARNsimm anteriores. Para las estructuras no coincidente anteriores, la hebra superior es la hebra en sentido y la hebra inferior es la hebra antisentido.
En ciertas realizaciones, un DARNsi de la invención puede contener no coincidencias que existen en referencia a la secuencia de ARN diana, pero no necesariamente existen como pares de bases no coincidentes dentro de las dos hebras del DARNsi, por lo tanto, un DARNsi puede poseer una complementariedad perfecta entre el primero y el segundo las hebras de un DARNsi, aún poseen residuos no coincidentes en referencia a un ARN diana (que, en ciertas realizaciones, puede ser ventajoso para promover la eficacia y/o potencia y/o duración del efecto). En ciertas realizaciones, donde se producen no coincidencias entre la hebra antisentido y la secuencia de ARN diana, la posición de un desajuste se encuentra dentro de la hebra antisentido en una posición(es) que corresponde a una secuencia de la hebra en sentido ubicada a 5' del sitio de corte Ago2 proyectado de la región diana, por ejemplo, residuos de la hebra antisentido colocados dentro de la hebra antisentido al 3' del residuo antisentido que es complementario al sitio de corte Ago2 proyectado de la secuencia objetivo.
Ejemplos de 25/27-mero DARNsis que albergan un único residuo no emparejado en referencia a secuencias diana incluyen las siguientes estructuras preferidas;
Secuencia de ARN diana: 5'-.AXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX.-3'
Hebra en sentido DARNsimm: 5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DD-3'
Hebra antisentido DARNsimm: 3'-EXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*XXZN-5'
Secuencia de ARN diana: 5 '- ..XAXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
Hebra en sentido DARNsimm: 5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DD-3'
Hebra antisentido DARNsimm: 3'-XEXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*XXZN-5'
Secuencia de ARN diana: 5'- ...AXXXXXXXXXXXXXXXXXX-3'
Hebra en sentido DARNsimm: 5'-BXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DD-3'
Hebra antisentido DARNsimm: 3'-XXEXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*XXZN-5'
Secuencia de ARN diana: 5'-... XAXXXXXXXXXXXXXXXXX .-3'
Hebra en sentido DARNsimm: 5'-XBXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DD-3'
Hebra antisentido DARNsimm: 3'-XXXEXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*XXZN-5'
Secuencia de ARN diana: 5'-... XXAXXXXXXXXXXXXXXXX .-3'
Hebra en sentido DARNsimm: 5'-XXBXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DD-3'
Hebra antisentido DARNsimm: 3'-XXXXEXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*XXZN-5'
Secuencia de ARN diana: 5'-... XXXAXXXXXXXXXXXXXXX.-3'
Hebra en sentido DARNsimm: 5'-XXXBXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DD-3'
Hebra antisentido DARNsimm: 3'-XXXXXEXXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*XXZN-5'
Secuencia de ARN diana: 5'-... XXXXAXXXXXXXXXXXXXX.-3'
Hebra en sentido DARNsimm: 5'-XXXXBXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DD-3'
Hebra antisentido DARNsimm: 3'-XXXXXXEXXXXXXXXXXXXXXXXXXN*XXZN-5'
Secuencia de ARN diana: 5'-... XXXXXAXXXXXXXXXXXXX.-3'
Hebra en sentido DARNsimm: 5'-XXXXXBXXXXXXXXXXXXXXXXXN*DD-3'
Hebra antisentido DARNsimm: 3'-XXXXXXXEXXXXXXXXXXXXXXXXXN*XXZN-5'
Secuencia de ARN diana: 5'-... XXXXXXAXXXXXXXXXXXX.-3'
Hebra en sentido DARNsimm: 5'-XXXXXXBXXXXXXXXXXXXXXXXN*DD-3'
Hebra antisentido DARNsimm: 3'-XXXXXXXXEXXXXXXXXXXXXXXXXN*XXZN-5'
Secuencia de ARN diana: 5'-... XXXXXXXAXXXXXXXXXXX.-3'
Hebra en sentido DARNsimm: 5'-XXXXXXXBXXXXXXXXXXXXXXXN*DD-3'
Hebra antisentido DARNsimm: 3'-XXXXXXXXXEXXXXXXXXXXXXXXXN*XXZN-5'
Secuencia de ARN diana: 5'-... XXXXXXXXAXXXXXXXXXX.-3'
Hebra en sentido DARNsimm: 5'-XXXXXXXXBXXXXXXXXXXXXXXN*DD-3'
Hebra antisentido DARNsimm: 3'-XXXXXXXXXXEXXXXXXXXXXXXXXN*XXZN-5'
Donde "X"=ARN, "Y" es un dominio del sobresaliente opcional compuesto por 0-10 monómeros de ARN que son opcionalmente monómeros de ARN 2'-O-metilo; en ciertas realizaciones, "Y" es un dominio del sobresaliente compuesto de 1-4 monómeros de ARN que son opcionalmente monómeros de ARN 2'-O-metilo, "Z"=ADN, ARN o nucleótido modificado, "N"=1 a 50 o más, pero es opcionalmente 1-30 u, opcionalmente 1-15 u, opcionalmente, 1-10. "N*"=0 a 15 o más, pero opcionalmente es 0, 1, 2, 3, 4 o 5, "D"=ADN, "p"=un grupo fosfato, "E"=residuos de ácido nucleico (ARN, ADN o ácidos nucleicos no naturales o modificados) que no forman un par de bases (enlace de hidrógeno) con los residuos de ARN "A" correspondientes de la hebra complementaria (diana) cuando se recogen hebras, pero opcionalmente hacen un par de bases con los residuos "B" correspondientes (Los residuos "B" también son ARN, ADN o ácidos nucleicos no naturales o modificados). Cualquiera de los residuos de dichos agentes puede ser opcionalmente monómeros de ARN 2'-O-metilo, por ejemplo, con posicionamiento alternativo de monómeros de ARN 2'-O-metilo que comienza desde el residuo 3'-terminal de la hebra inferior (segunda), como se mostró anteriormente, u otros patrones de 2'-O-metilo y/u otras modificaciones como se describe en el presente documento también pueden usarse en los agentes de DARNsi anteriores.
Además de las estructuras ejemplificadas anteriormente, los DARNsi de la invención también pueden poseer uno, dos o tres residuos adicionales que forman no coincidencias adicionales con la secuencia de ARN diana. Tales no coincidencias pueden ser consecutivos, o pueden estar intercalados por nucleótidos que forman pares de bases coincidentes con la secuencia de ARN diana. Cuando están intercalados por nucleótidos que forman pares de bases coincidentes, los residuos no coincidentes se pueden separar entre sí dentro de una sola hebra en un intervalo de uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete u incluso ocho nucleótidos pares de bases formando residuos entre tales no coincidencias.
En cuanto a los agentes DARNsimm descritos anteriormente, una ubicación preferida dentro de los DARNsis para los nucleótidos de hebra antisentido que forman pares de bases no coincidentes con la secuencia de ARN diana (aunque puede o no formar no coincidencias con los nucleótidos de hebra en sentido correspondientes) está dentro de la región de hebra antisentido que se encuentra 3' (corriente abajo) de la secuencia de hebra antisentido que es complementaria al sitio de corte Ago2 proyectado del DARNsi. Por lo tanto, en una realización preferida, la posición de un nucleótido no coincidente (en relación con la secuencia de ARN diana) de la hebra antisentido de un DARNsimm es el residuo de nucleótido de la hebra antisentido que se encuentra inmediatamente 3' (corriente abajo) dentro de la hebra antisentido secuencia del sitio de escisión de Ago2 proyectado de la secuencia de ARN diana correspondiente. En otras realizaciones preferidas, un nucleótido no coincidente de la hebra antisentido de un DARNsimm (en relación con la secuencia de a Rn diana) se coloca en el residuo de nucleótido de la hebra antisentido que se encuentra dos nucleótidos 3' (corriente abajo) de la división Ago2 proyectada correspondiente sitio, tres nucleótidos 3' (corriente abajo) del sitio de escisión Ago2 proyectado correspondiente, cuatro nucleótidos 3' (corriente abajo) del sitio de escisión Ago2 proyectado correspondiente, cinco nucleótidos 3' (corriente abajo) del sitio de escisión Ago2 proyectado correspondiente, seis nucleótidos 3' (corriente abajo) del sitio de escisión Ago2 proyectado, siete nucleótidos 3' (corriente abajo) del sitio de escisión Ago2 proyectado, ocho nucleótidos 3' (corriente abajo) del sitio de escisión Ago2 proyectado, o nueve nucleótidos 3' (corriente abajo) del proyectado Ago2 sitio de escisión.
En los agentes de DARNsi que poseen dos nucleótidos formadores de no coincidencia de la hebra antisentido (donde los nucleótidos formadores de no coincidencia se están formando no coincidencia en relación con la secuencia de ARN diana), pueden producirse no coincidencias consecutivamente (por ejemplo, en posiciones consecutivas a lo largo de la secuencia de nucleótidos de la hebra antisentido). Alternativamente, los nucleótidos de la hebra antisentido que forman pares de bases no coincidentes con la secuencia de ARN diana pueden ser intercalados por nucleótidos que se emparejan con la secuencia de ARN diana (por ejemplo, para un DARNsi que posee nucleótidos formadores de no coincidencia en las posiciones 13 y 16 (comenzando desde el Terminal 5' (posición 1) de la hebra antisentido), pero no en las posiciones 14 y 15, los residuos no coincidentes de las posiciones 13 y 16 de la hebra en sentido están intercalados por dos nucleótidos que forman pares de bases coincidentes con los residuos correspondientes de la secuencia de ARN diana). Por ejemplo, dos residuos de la hebra antisentido (ubicados dentro de la región tolerante a la no coincidencia de la hebra antisentido) que forman pares de bases no coincidentes con la secuencia de ARN diana correspondiente pueden ocurrir con cero, uno, dos, tres, cuatro o cinco pares de bases coincidentes (con respecto a la secuencia de ARN diana) ubicada entre estos pares de bases formadoras de no coincidencia.
Para ciertos DARNsi que poseen tres pares de bases formadoras de no coincidencia (formando no coincidencia con respecto a la secuencia de ARN diana), los nucleótidos formadores de no coincidencia pueden ocurrir consecutivamente (por ejemplo, en un triplete a lo largo de la secuencia de nucleótidos de la hebra antisentido). Alternativamente, los nucleótidos de la hebra antisentido que forman pares de bases no coincidentes con la secuencia de ARN diana pueden ser intercalados por nucleótidos que forman pares de bases coincidentes con la secuencia de ARN diana (por ejemplo, para un DARNsi que posee nucleótidos no coincidentes en las posiciones 13, 14 y 18, pero no en las posiciones 15, 16 y 17, los residuos formadores de no coincidencia de las posiciones de hebra antisentido 13 y 14 son adyacentes entre sí, mientras que los residuos formadores de no coincidencia de las posiciones 14 y 18 de hebra antisentido están intercalados por tres nucleótidos que forman pares de bases coincidentes con los residuos correspondientes del ARN diana). Por ejemplo, tres residuos de la hebra antisentido (ubicados dentro de la región tolerante a la no coincidencia de la hebra antisentido) que forman pares de bases no coincidentes con la secuencia de ARN diana correspondiente pueden ocurrir con cero, uno, dos, tres o cuatro pares de bases coincidentes ubicados entre cualquiera de estos dos pares de bases formadoras de no coincidencia.
Para ciertos DARNsi que poseen cuatro pares de bases formadoras de no coincidencia (formando no coincidencia con respecto a la secuencia de ARN diana), los nucleótidos formadores de no coincidencia pueden ocurrir consecutivamente (por ejemplo, en un cuadruplete a lo largo de la secuencia de nucleótidos de la hebra en sentido). Alternativamente, los nucleótidos de la hebra antisentido que forman pares de bases no coincidentes con la secuencia de ARN diana pueden ser intercalados por nucleótidos que forman pares de bases coincidentes con la secuencia de ARN diana (por ejemplo, para un DARNsi que posee nucleótidos formadores de no coincidencia en las posiciones 13, 15, 17 y 18, pero no en las posiciones 14 y 16, los residuos formadores no coincidente de las posiciones 17 y 18 de la hebra antisentido son adyacentes entre sí, mientras que los residuos formadores no coincidente de las posiciones 13 y 15 de la hebra antisentido están intercalados por un nucleótido que forma un par de bases emparejado con el residuo correspondiente de la secuencia de ARN diana, de manera similar, los residuos formadores de emparejamiento incorrecto de las posiciones de hebra antisentido 15 y 17 también están intercalados por un nucleótido que forma un par de bases emparejado con el residuo correspondiente de la secuencia de ARN diana). Por ejemplo, cuatro residuos de la hebra antisentido (ubicados dentro de la región tolerante a la no coincidencia de la hebra antisentido) que forman pares de bases no coincidentes con la secuencia de ARN diana correspondiente pueden ocurrir con cero, uno, dos o tres pares de bases coincidentes ubicados entre dos de estos pares de bases formadoras de no coincidencia.
El DARNsimm anterior y otras estructuras de DARNsi se describen con el fin de ejemplificar ciertas estructuras de agentes de DARNsimm y DARNsi. El diseño de las estructuras de DARNsimm y DARNsi anteriores se puede adaptar para generar, por ejemplo, formas de DARNsimm de un agente de DARNsi extendido que se muestra más adelante (incluido, por ejemplo, diseño de agentes de DARNsimm que no coinciden). Como se ejemplificó anteriormente, los DARNsi también se pueden diseñar de manera que posean no coincidencias únicas (o dos, tres o cuatro no coincidencias) entre la hebra antisentido del DARNsi y una secuencia diana, aunque opcionalmente pueden retener la complementariedad perfecta entre las secuencias de la hebra en sentido y antisentido de un DARNsi.
Se observa además que los agentes de DARNsi ejemplificados infra también pueden poseer estructuras de inserción/eliminación (en/del) dentro de sus estructuras de doble hebra y/o alineadas con ARN diana. Por consiguiente, los DARNsi de la invención pueden diseñarse para poseer variaciones en/del, por ejemplo, en la secuencia de hebra antisentido en comparación con la secuencia de ARN diana y/o la secuencia de hebra antisentido en comparación con la secuencia de hebra en sentido, con ubicaciones preferidas para la colocación de tal en/del nucleótidos correspondientes a las ubicaciones descritas anteriormente para el posicionamiento de pares de bases mal formados y/o mal formados.
En ciertas realizaciones, los residuos "D" de cualquiera de las estructuras anteriores incluyen al menos un PS-DNA o PS-RNA. Opcionalmente, los residuos "D" de cualquiera de las estructuras anteriores incluyen al menos un nucleótido modificado que inhibe la escisión de Dicer.
En una realización, el agente DARNsi tiene una estructura asimétrica, con la hebra en sentido con una longitud de 25 pares de bases, la hebra antisentido que tiene una longitud de 42 nucleótidos con un alero 3' de 2 bases (y, por lo tanto, el agente de DARNsi posee un sobresaliente de 5' de 15 nucleótidos de longitud en el extremo 3' de la hebra en sentido/5' de la hebra antisentido), y con desoxirribonucleótidos ubicados en las posiciones 24 y 25 de la hebra en sentido (numeración desde la posición 1 en el 5' de la hebra en sentido) y cada base emparejada con un nucleótido afín de la hebra antisentido. El sobresaliente 5' comprende un nucleótido modificado, preferiblemente un 2'-O-metil ribonucleótido, y/o una modificación del esqueleto de fosfato, preferiblemente fosforotioato.
En otra realización, el agente de DARNsi tiene una estructura, con la hebra en sentido con una longitud de 40 nucleótidos, la hebra antisentido que tiene una longitud de 27 nucleótidos con un sobresaliente de 2 bases 3' (y, por lo tanto, el agente de DARNsi posee un sobresaliente de 3' de 15 nucleótidos de longitud en el extremo 3' de la hebra en sentido/5' de la hebra antisentido), y con desoxirribonucleótidos ubicados en las posiciones 24 y 25 de la hebra en sentido (numeración desde la posición 1 en el 5' de la hebra en sentido) y cada base emparejada con un nucleótido afín de la hebra antisentido. El sobresaliente 3' comprende un desoxirribonucleótido y/o una modificación del esqueleto de fosfato, preferiblemente metilfosfonato.
Modificación de dsNAs
Un factor principal que inhibe el efecto de los ARN bicatenarios ("ARNdss") es la degradación de los ARNdss (por ejemplo, ARNsis y DARNsis) por las nucleasas. Una 3'-exonucleasa es la actividad de nucleasa primaria presente en el suero y la modificación de los extremos 3' de los oligonucleótidos de ADN antisentido es crucial para prevenir la degradación (Eder et al., 1991). Se ha identificado una nucleasa de la familia RNasa-T llamada ERI-1 que tiene una actividad de exonucleasa de 3'a 5' que está involucrada en la regulación y degradación de los ARNsi (Kennedy et al., 2004; Hong et al., 2005). Este gen también se conoce como Thex1 (NM-02067) en ratones o THEX1 (NM-153332) en humanos y está involucrado en la degradación del ARNm de histona; también media la degradación de los sobresalientes 3' en los ARNsi, pero no degrada el ARN doble (Yang et al., 2006). Por lo tanto, es razonable esperar que la estabilización del extremo 3' de los ARNds, incluidos los dsNA de la presente invención, mejore la estabilidad.
XRN1 (NM-019001) es una exonucleasa de 5' a 3' que reside en cuerpos P y se ha implicado en la degradación del ARNm dirigido por ARNmi (Rehwinkel et al., 2005) y también puede ser responsable de completar la degradación iniciada por escisión interna dirigida por un ARNsi. XRN2 (NM-012255) es una exonucleasa distinta de 5' a 3' que participa en el procesamiento de ARN nuclear. Aunque actualmente no está implicada en la degradación o el procesamiento de ARNsis y ARNmis, ambas son nucleasas conocidas que pueden degradar los RNA y también pueden ser importantes para tener en cuenta.
La RNasa A es una actividad principal de endonucleasa en mamíferos que degrada los ARN. Es específico para ARNss y escinde en el extremo 3' de las bases de pirimidina. Los productos de degradación de ARNsi compatibles con la escisión de RNasa A se pueden detectar por espectrometría de masas después de la incubación en suero (Turner et al., 2007). Los sobresalientes 3' aumentan la susceptibilidad de los ARNsi a la degradación de RNasa. El agotamiento de la RNasa A del suero reduce la degradación de los ARNsis; esta degradación muestra cierta preferencia de secuencia y es peor para las secuencias que tienen secuencia de poli A/U en los extremos (Haupenthal et al., 2006). Esto sugiere la posibilidad de que las regiones de menor estabilidad del doble "respiren" y ofrezcan especies transitorias monocatenarias disponibles para la degradación por la ARNasa A. Se pueden agregar inhibidores de la ARNasa A al suero y mejorar la longevidad y potencia del ARNsi (Haupenthal et al., 2007).
En 21-meros, las modificaciones de fosforotioato o boranofosfato estabilizan directamente el enlace fosfato internucleosídico. Los ARN modificados con boranofosfato son altamente resistentes a las nucleasas, potentes como agentes silenciadores y son relativamente no tóxicos. Los ARN modificados con boranofosfato no pueden fabricarse utilizando métodos estándar de síntesis química y, en cambio, se fabrican por transcripción in vitro (IVT) (Hall et al., 2004 and Hall et al., 2006). Las modificaciones de fosforotioato (PS) pueden colocarse fácilmente en un doble de ARN en cualquier posición deseada y pueden realizarse utilizando métodos de síntesis química estándar, aunque la capacidad de usartales modificaciones dentro de un doble de ARN que retiene la actividad silenciadora de ARN puede ser limitada.
En ciertas realizaciones, la región extendida de hebra sencilla de 5' de la hebra guía o la región extendida de hebra sencilla de 3' de la hebra pasajera tiene al menos una modificación del esqueleto de fosforotioato. En algunas realizaciones, cada enlace de la región extendida de hebra sencilla de 5' de la hebra guía o región extendida de hebra sencilla de 3' de la hebra pasajera tiene una modificación del esqueleto de fosforotioato. En algunas realizaciones, cada enlace de la región extendida de hebra sencilla 5' de la hebra guía tiene una modificación del esqueleto de fosforotioato, excepto el enlace del nucleótido terminal 5' de la hebra guía. En ciertas realizaciones, la región extendida de hebra sencilla de 5' de la hebra guía o la región extendida de hebra sencilla de 3' de la hebra pasajera tiene al menos una modificación del esqueleto de metilfosfonato. En algunas realizaciones, cada enlace de la región extendida de hebra sencilla de 5' de la hebra guía o región extendida de hebra sencilla de 3' de la hebra pasajera tiene una modificación del esqueleto de metilfosfonato. En algunas realizaciones, cada enlace de la región extendida de hebra sencilla de 3' de la hebra pasajera tiene una modificación del esqueleto de fosforotioato, excepto el nucleótido terminal 5' de la hebra de guía.
Sin embargo, se observa que la modificación de PS muestra toxicidad dependiente de la dosis, por lo que la mayoría de los investigadores han recomendado una incorporación limitada en los ARNsi, favoreciendo históricamente los extremos 3' donde la protección contra las nucleasas es más importante (Harborth et al., 2003; Chiu and Rana, 2003; Braasch et al., 2003; Amarzguioui et al., 2003). Una modificación PS más extensa puede ser compatible con una potente actividad de IARN; sin embargo, el uso de modificaciones de azúcar (como 2'-O-metil ARN) puede ser superior (Choung et al., 2006).
Se puede colocar una variedad de sustituciones en la posición 2' de la ribosa que generalmente aumenta la estabilidad doble (Tm) y puede mejorar en gran medida la resistencia a la nucleasa. El 2'-O-metil ARN es una modificación natural que se encuentra en los ARN ribosómicos de mamíferos y en los ARN de transferencia. Se conoce la modificación de 2'-O-metilo en los ARNsis, pero la posición precisa de las bases modificadas dentro del doble es importante para retener la potencia y la sustitución completa del ARN 2'-O-metil por ARN inactivará el ARNsi. Por ejemplo, un patrón que emplea bases 2'-O-metil alternadas puede tener una potencia equivalente al ARN no modificado y es bastante estable en suero (Choung et al., 2006; Czauderna et al., 2003).
La modificación 2'-fluoro (2'-F) también es compatible con la función ARNds (por ejemplo, ARNsi y dsNA); se coloca más comúnmente en sitios de pirimidina (debido al costo y disponibilidad del reactivo) y se puede combinar con la modificación 2'-O-metilo en las posiciones de purina; las purinas 2'-F están disponibles y también se pueden usar. Los dobles muy modificados de este tipo pueden ser potentes desencadenantes de IARN in vitro (Allerson et al., 2005; Prakash et al., 2005; Kraynack and Baker, 2006) y pueden mejorar el rendimiento y extender la duración de la acción cuando se usan in vivo (Morrissey et al., 2005a; Morrissey et al., 2005b). Allerson enseña un doble de 19 meros romo, estable, altamente potente, que contiene bases alternativas 2'-F y 2'-O-Me. En este diseño, los residuos alternos se colocan en un patrón idéntico al empleado por Czauderna, sin embargo, los residuos de ARN restantes se convierten en bases modificadas 2'-F. Un ARNsi altamente potente, resistente a nucleasas empleado por Morrissey empleó un ARNsi altamente potente, resistente a nucleasas in vivo. Además del ARN y el ARN 2'-F, este doble incluye ADN, ARN, residuos abásicos invertidos y un enlace internucleósido PS 3'-terminal. Si bien la modificación extensa tiene ciertos beneficios, una modificación más limitada del doble también puede mejorar el rendimiento in vivo y es más simple y menos costosa de fabricar. Soutschek et al. (2004) empleó un doble in vivo y fue principalmente ARN con dos bases de ARN 2'-O-Me y enlaces internucleósidos PS 3'-terminales limitados.
Los ácidos nucleicos bloqueados (LNA) y los ácidos nucleicos desbloqueados (UNA) son una clase diferente de modificación 2' que puede usarse para estabilizar ARNds (por ejemplo, ARNsi y dsNA). Los patrones de incorporación de LNA que retienen la potencia son más restringidos que las bases 2'-O-metil o 2'-F, por lo que se prefiere una modificación limitada (Braasch et al., 2003; Grunweller et al., 2003; Elmen et al., 2005) Incluso con una incorporación limitada, el uso de modificaciones de LNA puede mejorar el rendimiento de ARNds in vivo y también puede alterar o mejorar los perfiles de efectos fuera de la diana (Mook et al., 2007).
Los ácidos nucleicos sintéticos introducidos en células o animales vivos pueden reconocerse como "extraños" y desencadenar una respuesta inmune. La estimulación inmune constituye una clase principal de efectos fuera de la diana que pueden cambiar drásticamente los resultados experimentales e incluso conducir a la muerte celular. El sistema inmune innato incluye una colección de moléculas receptoras que interactúan específicamente con el ADN y el ARN que median estas respuestas, algunas de las cuales se encuentran en el citoplasma y otras residen en los endosomas (Marques and Williams, 2005; Schlee et al., 2006) La administración de ARNsis por lípidos catiónicos o liposomas expone el ARNsi a los compartimentos citoplasmático y endosómico, maximizando el riesgo de desencadenar una respuesta de interferón tipo 1 (IFN) tanto in vitro como in vivo (Morrissey et al., 2005b; Sioud and Sorensen, 2003; Sioud, 2005; Ma et al., 2005). Los ARN transcritos dentro de la célula son menos inmunogénicos (Robbins et al., 2006) y los ARN sintéticos que son inmunogénicos cuando se administran utilizando métodos basados en lípidos pueden evadir la estimulación inmune cuando se introducen en las células por medios mecánicos, incluso in vivo (Heidel et al., 2004). Sin embargo, los métodos de administración basados en lípidos son convenientes, efectivos y ampliamente utilizados. Se necesita alguna estrategia general para prevenir las respuestas inmunes, especialmente para la aplicación in vivo donde todos los tipos de células están presentes y el riesgo de generar una respuesta inmune es mayor. El uso de ARN modificados químicamente puede resolver la mayoría o incluso todos estos problemas.
Aunque ciertos motivos de secuencia son claramente más inmunogénicos que otros, parece que los receptores del sistema inmune innato en general distinguen la presencia o ausencia de ciertas modificaciones de bases que se encuentran más comúnmente en los ARN de mamíferos que en los ARN procariotas. Por ejemplo, las bases modificadas con pseudouridina, N6-metil-A y 2'-O-metilo se reconocen como "propias" y la inclusión de estos residuos en un ARN sintético puede ayudar a evadir la detección inmune (Kariko et al., 2005). La modificación 2' de una secuencia que es fuertemente inmunoestimuladora ya que el ARN no modificado puede bloquear una respuesta inmune cuando se administra a ratones por vía intravenosa (Morrissey et al., 2005b). Sin embargo, no es necesaria una modificación extensa para escapar de la detección inmune y la sustitución de tan pocos dos bases 2'-O-metil en una sola hebra de un doble de ARNsi pueden ser suficientes para bloquear una respuesta de IFN tipo 1 tanto in vitro como in vivo; las bases U y G modificadas son más efectivas (Judge et al., 2006). Como beneficio adicional, la incorporación selectiva de bases 2'-O-metil puede reducir la magnitud de los efectos fuera de la diana (Jackson et al., 2006). Por lo tanto, el uso de bases 2'-O-metil debe considerarse para todos los ARNdss previstos para aplicaciones in vivo como un medio para bloquear las respuestas inmunes y tiene el beneficio adicional de mejorar la estabilidad de la nucleasa y reducir la probabilidad de efectos fuera de la diana.
Aunque la muerte celular puede ser el resultado de la estimulación inmune, evaluar la viabilidad celular no es un método adecuado para controlar la inducción de las respuestas de IFN. Las respuestas de IFN pueden estar presentes sin muerte celular, y la muerte celular puede ser el resultado de la anulación de la diana en ausencia de activación de IFN (por ejemplo, si el gen diana es esencial para la viabilidad celular). Las citoquinas relevantes pueden medirse directamente en medio de cultivo y existen una variedad de kits comerciales que hacen que la realización de tales ensayos sea rutinaria. Si bien se puede medir una gran cantidad de moléculas efectoras inmunes diferentes, los niveles de prueba de IFN-a, TNF-a e IL-6 a las 4 y 24 horas después de la transfección generalmente son suficientes para fines de detección. Es importante incluir un "control de reactivo de transfección solamente" ya que los lípidos catiónicos pueden desencadenar respuestas inmunes en ciertas células en ausencia de cualquier carga de ácido nucleico. La inclusión de controles para la inducción de la vía IFN debe considerarse para el trabajo de cultivo celular. Es esencial evaluar la estimulación inmunológica cuando se administran ácidos nucleicos in vivo, donde el riesgo de desencadenar respuestas de IFN es mayor.
Los dsNA de la invención pueden tener cualquiera de los patrones de modificación descritos a continuación en el presente documento para DARNsi. Se pueden incluir modificaciones en los agentes de dsNA de la presente invención siempre que la modificación no impida que el agente de dsNA sirva como sustrato para Dicer. De hecho, un hallazgo sorprendente de la presente invención es que una región de nucleótidos de hebra sencilla extendida de 5' de la hebra antisentido o la región de nucleótidos de hebra sencilla extendida de 3' de la hebra en sentido se puede unir a moléculas de dsNA descritas previamente, dando como resultado una eficacia mejorada de IARN y duración, siempre que dicha extensión se realice en una región de la molécula extendida que no interfiera con el procesamiento de Dicer (por ejemplo, 3' del sitio de escisión de Dicer de la hebra en sentido/5' del sitio de escisión de Dicer de la hebra antisentido). En una realización, se realizan una o más modificaciones que mejoran el procesamiento de Dicer del agente dsiNA. En una segunda realización, se realizan una o más modificaciones que dan como resultado una generación de IARN más efectiva. En una tercera realización, se realizan una o más modificaciones que apoyan un mayor efecto de ARNi. En una cuarta realización, se realizan una o más modificaciones que dan como resultado una mayor potencia por cada molécula de agente de dsNA que se entregará a la célula. Se pueden incorporar modificaciones en la región 3'-terminal, la región 5'-terminal, tanto en la región 3'-terminal como en la región 5'-terminal o, en algunos casos, en varias posiciones dentro de la secuencia. Teniendo en cuenta las restricciones mencionadas anteriormente, se puede incorporar cualquier número y combinación de modificaciones en el agente de dsNA. Cuando hay múltiples modificaciones, pueden ser iguales o diferentes. Se contemplan modificaciones en las bases, unidades estructurales de azúcar, el esqueleto de fosfato y sus combinaciones. Cualquiera de los extremos 5' puede fosforilarse.
Los ejemplos de modificaciones contempladas para el esqueleto de fosfato incluyen fosfonatos, que incluyen modificaciones de metilfosfonato, fosforotioato y fosfotriéster tales como alquilfosfotriésteres, ácidos nucleicos bloqueados (LNA), ácido nucleico desbloqueado, morfolino, análogos bicíclicos de furanosa y similares. Ejemplos de modificaciones contempladas para la unidad estructural de azúcar incluyen 2'-alquilpirimidina, tal como modificaciones 2'-O-metil, 2'-fluoro, amino y desoxi y similares (véase, por ejemplo, Amarzguioui et al., 2003). Ejemplos de modificaciones contempladas para los grupos base incluyen azúcares abásicos, pirimidinas modificadas con 2-O-alquilo, 4-tiouracilo, 5-bromouracilo, 5-yodouracilo y 5-(3-aminoalil)-uracilo y similares. Los ácidos nucleicos bloqueados, o LNA, ácidos nucleicos desbloqueados o UNA también podrían incorporarse. Se conocen muchas otras modificaciones y se pueden usar siempre que se cumplan los criterios anteriores. También se describen ejemplos de modificaciones en la Patente de los Estados Unidos Nos. 5,684,143, 5,858,988 y 6,291,438 y en la Solicitud de Patente Publicada de los Estados Unidos No. 2004/0203145 A1. Se describen otras modificaciones en Herdewijn (2000), Eckstein (2000), Rusckowski et al. (2000), Stein et al. (2001); Vorobjev et al. (2001).
Se pueden incorporar una o más modificaciones contempladas en cualquiera de las hebras. La colocación de las modificaciones en el agente de dsNA puede afectar en gran medida las características del agente de dsNA, lo que incluye conferir una mayor potencia y estabilidad, reducir la toxicidad, mejorar el procesamiento de Dicer y minimizar una respuesta inmune. En una realización, la hebra antisentido o la hebra en sentido o ambas hebras tienen uno o más nucleótidos modificados con 2'-O-metilo. En otra realización, la hebra antisentido contiene nucleótidos modificados con 2'-O-metilo. En otra realización, el soporte antisentido contiene un sobresaliente 3' que comprende nucleótidos modificados con 2'-O-metilo. La hebra antisentido también podría incluir nucleótidos modificados con 2'-O-metilo adicionales.
En ciertas realizaciones, la región extendida de hebra sencilla de 5' de la hebra guía, la región extendida de hebra sencilla de 3' de la hebra pasajera, o la región extendida de hebra sencilla de 5' de la hebra pasajera tiene al menos un nucleótido modificado, opcionalmente un 2'-O-metil ribonucleótido. En algunas realizaciones, cada nucleótido de la región extendida de hebra sencilla de 5' de la hebra guía o región extendida de hebra sencilla de 3' de la hebra pasajera es un ribonucleótido modificado, opcionalmente un ribonucleótido 2'-O-metil. En ciertas realizaciones, un oligonucleótido complementario a la región extendida de hebra sencilla 5' de la hebra guía tiene al menos un nucleótido modificado, opcionalmente un ribonucleótido 2'-O-metil. En algunas realizaciones, cada nucleótido de un oligonucleótido complementario a la región extendida de hebra sencilla 5' de la hebra guía es un nucleótido modificado, opcionalmente un ribonucleótido 2'-O-metil.
En ciertas realizaciones de la presente invención, el agente dsiNA tiene una o más propiedades que mejoran su procesamiento por Dicer. De acuerdo con estas realizaciones, el agente dsiNA tiene una longitud suficiente para que Dicer lo procese para producir un ARNsi activo y al menos una de las siguientes propiedades: (i) el agente dsiNA es asimétrico, por ejemplo, tiene un sobresaliente de 3' en la hebra antisentido y (ii) el agente dsiNA tiene un extremo 3' modificado en la hebra en sentido para dirigir la unión de Dicer y el procesamiento de la región de ARNds a un ARNsi activo. En ciertas realizaciones de este tipo, la presencia de uno o más desoxirribonucleótidos pareados de bases en una región de la hebra en sentido que está a 3' del sitio proyectado de la escisión de la enzima Dicer y la región correspondiente de la hebra antisentido que es 5' del sitio proyectado de la escisión de la enzima Dicer también puede servir para orientar dicha molécula para la direccionalidad apropiada de la escisión enzimática Dicer.
En ciertas realizaciones, la longitud de la región extendida antisentido monocatenaria es 1-30 nucleótidos, 1-15 nucleótidos, 10-15 nucleótidos, 11-15 nucleótidos. Por lo tanto, un dsNA extendido de hebra sencilla de la presente invención puede poseer una región extendida de hebra única en el extremo 5' de una hebra antisentido/guía o en el extremo 3' de una hebra en sentido/pasajera que es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más (por ejemplo, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 o más) nucleótidos de longitud.
En algunas realizaciones, la hebra más larga en el ácido nucleico bicatenario comprende 36-66 nucleótidos. En una realización, el agente de dsNA tiene una estructura tal que el extremo 5' de la hebra antisentido sobresale del extremo 3' de la hebra en sentido, o el extremo 3' de la hebra antisentido sobresale del extremo 5' de la hebra en sentido. En ciertas realizaciones, la extensión 5' de la hebra antisentido es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más (por ejemplo, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 o más) nucleótidos de longitud, y opcionalmente es de 10-30 nucleótidos, por ejemplo 15 nucleótidos. En otra realización, el agente de dsNA tiene una estructura tal que el extremo 3' de la hebra en sentido sobresale del extremo 5' de la hebra antisentido, y el extremo 3' de la hebra antisentido sobresale del extremo 5' de la hebra en sentido. En ciertas realizaciones, la extensión 3' de la hebra en sentido es de 1-30 nucleótidos, y opcionalmente es de 10-30 nucleótidos, por ejemplo 15 nucleótidos. En ciertas realizaciones, la extensión 3' de la hebra antisentido es 1-10 nucleótidos, y opcionalmente es 1-6 nucleótidos, preferiblemente 1-4 nucleótidos, por ejemplo 2 nucleótidos. En otra realización, el agente DsNA tiene una estructura tal que el extremo 5' de la hebra en sentido sobresale del extremo 3' de la hebra antisentido. En ciertas realizaciones, el sobresaliente 5' de la hebra en sentido es de 4-30 nucleótidos, y opcionalmente es de 10-30 nucleótidos, por ejemplo 15 nucleótidos. Tanto la hebra en sentido como la antisentido también pueden tener un fosfato 5'. Una combinación iterativa de las características de extensión en diferentes terminales 5' y 3' de hebras en sentido y antisentido como se muestra en las figuras 34, 35 y 36 también se contempla en la presente invención.
En ciertas realizaciones, la hebra en sentido de un dsNA de la invención tiene una longitud total de al menos 25 nucleótidos (por ejemplo, la hebra en sentido posee una longitud de 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más (por ejemplo, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 o más (nucleótidos). En ciertas realizaciones, la longitud de la hebra en sentido está entre 25 nucleótidos y 30 nucleótidos, por ejemplo, entre 26 y 30 nucleótidos, o entre 27 y 30 nucleótidos de longitud. En realizaciones relacionadas, la hebra antisentido tiene una longitud de al menos 36 nucleótidos (por ejemplo, la hebra en sentido posee una longitud de 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66 o más (por ejemplo, 67, 28, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80 o más (nucleótidos). En ciertas realizaciones de este tipo, la hebra antisentido tiene una longitud de entre 37 y 57 nucleótidos de longitud, o entre 37 y 52 nucleótidos de longitud, o entre 37 y 47 nucleótidos de longitud, o entre 42 y 62 nucleótidos de longitud, o entre 42 y 57 nucleótidos de longitud, o entre 42 y 47 nucleótidos de longitud.
En ciertas realizaciones, la hebra en sentido de un DsNA de la invención tiene una longitud total de 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 o más (por ejemplo, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70 o más (nucleótidos). En ciertas realizaciones, la longitud de la hebra en sentido está entre 25 nucleótidos y 30 nucleótidos, opcionalmente entre 35 y 55 nucleótidos, entre 40 y 55 nucleótidos de longitud, entre 40 y 60 nucleótidos de longitud, o entre 45 y 60 nucleótidos de longitud. En realizaciones relacionadas, la hebra antisentido tiene una longitud de 25, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 o más (por ejemplo, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 nucleótidos). En ciertas realizaciones de este tipo, la hebra antisentido tiene una longitud de entre 27 y 32 nucleótidos de longitud.
En ciertas realizaciones, la presencia de uno o más desoxirribonucleótidos pareados de bases en una región de la hebra en sentido que es 3' del sitio proyectado de la escisión de la enzima Dicer y la región correspondiente de la hebra antisentido que es 5' del sitio proyectado de la escisión de la enzima Dicer puede servir para dirigir la escisión de la enzima Dicer de dicha molécula. Si bien ciertos agentes ejemplificados de la invención poseen un desoxirribonucleótido de hebra en sentido que se encuentra en la posición 24 o más 3' cuando se cuenta desde la posición 1 en el extremo 5' de la hebra en sentido, y que tiene esta posición 24 o más desoxirribonucleótido 3' del sentido emparejamiento de la base de la hebra con un desoxirribonucleótido afín de la hebra antisentido, en algunas realizaciones, también es posible ordenar a Dicer que corte un producto más corto, por ejemplo, un 19-mero o un 20-mero mediante la inclusión de residuos de desoxirribonucleótidos en, por ejemplo, la posición 20 del sentido hebra.
Tal posición 20 pares de bases de desoxirribonucleótidos con un desoxirribonucleótido correspondiente de la hebra antisentido, dirigiendo así la escisión mediada por Dicer de un 19-mero como el producto Dicer más frecuente (se observa que la hebra antisentido también puede comprender uno o dos residuos de desoxirribonucleótidos inmediatamente 3' del residuo antisentido que la base se empareja con el residuo desoxirribonucleótido de la posición 20 de la hebra en sentido en tales realizaciones, para dirigir adicionalmente la escisión de Dicer de la hebra antisentido). En tales realizaciones, la región de ADN bicatenario (que incluye ácidos nucleicos modificados que bloquean la escisión de Dicer) generalmente poseerá una longitud mayor de 1 o 2 pares de bases (por ejemplo, de 3 a 5 pares de bases o más), en orden para dirigir la escisión de Dicer para generar lo que normalmente es una longitud no preferida del producto de escisión de Dicer. También se puede adoptar un enfoque paralelo para dirigir la escisión de Dicer de ARNsi de 20-mero, con la colocación del primer residuo desoxirribonucleótido de la hebra en sentido (cuando se examina la hebra en sentido desde la posición 1 en el extremo 5' de la hebra en sentido) en la posición 21.
En ciertas realizaciones, el agente de DsNA de la invención puede comprender generalmente nucleótidos modificados de aproximadamente 5 a aproximadamente 100% de las posiciones de nucleótidos (por ejemplo, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 100% de las posiciones de nucleótidos). El porcentaje real de nucleótidos modificados presentes en una molécula de siNA dada depende del número total de nucleótidos presentes en el siNA. Si la molécula de siNA es monocatenaria, el porcentaje de modificación puede basarse en el número total de nucleótidos presentes en las moléculas de siNA monocatenaria. Del mismo modo, si la molécula de siNA es bicatenaria; el porcentaje de modificación puede basarse en el número total de nucleótidos presentes en la hebra en sentido, la hebra antisentido o las hebras en sentido y antisentido. Además, el porcentaje real de nucleótidos modificados presentes en una molécula de siNA dada también puede depender del número total de nucleótidos de purina y pirimidina presentes en el siNA, por ejemplo, en donde todos los nucleótidos de pirimidina y/o todos los nucleótidos de purina presentes en la molécula de siNA son modificados En algunos casos, incluso el 100% de la hebra en sentido y/o la hebra antisentido pueden modificarse por completo.
En ciertas realizaciones, la hebra en sentido del agente DsiNA se modifica para el procesamiento de Dicer mediante modificadores adecuados ubicados en el extremo 3' de la hebra en sentido, es decir, el agente de DsiNA está diseñado para dirigir la orientación de la unión y el procesamiento de Dicer a través de sentido modificación de la hebra. Los modificadores adecuados incluyen nucleótidos tales como desoxirribonucleótidos, didesoxirribonucleótidos, aciconucleótidos y similares y moléculas con impedimento estérico, tales como moléculas fluorescentes y similares. Los aciconucleótidos sustituyen un grupo 2-hidroxietoximetilo por el azúcar 2'-desoxirribofuranosilo normalmente presente en los dNMP. Otros modificadores de nucleótidos podrían incluir 3'-desoxiadenosina (cordicepina), 3'-azido-3'-desoxitimidina (AZT), 2',3'-didesoxiinosina (ddl), 2',3'-didesoxi-3'-tiacitidina (3TC), 2',3'-didehidro-2',3'-didesoxitimidina (d4T) y los nucleótidos monofosfato de 3'-azido-3'-desoxitimidina (AZT), 2',3'-didesoxi-3'- tiacitidina (3TC) y 2',3'-didehidro-2',3'-didesoxitimidina (d4T). En una realización, los desoxirribonucleótidos se usan como modificadores. Cuando se utilizan modificadores de nucleótidos, se sustituyen los modificadores de 1-3 nucleótidos, o 2 modificadores de nucleótidos por los ribonucleótidos en el extremo 3' de la hebra en sentido. Cuando se utilizan moléculas estéricamente impedidas, se unen al ribonucleótido en el extremo 3' de la hebra antisentido. Por lo tanto, la longitud de la hebra no cambia con la incorporación de los modificadores. En otra realización, la invención contempla sustituir dos bases de ADN en el agente DsiNA para dirigir la orientación del procesamiento Dicer de la hebra antisentido. En una realización adicional de la presente invención, dos bases de ADN terminales se sustituyen por dos ribonucleótidos en el extremo 3' de la hebra en sentido formando un extremo romo del doble en el extremo 3' de la hebra en sentido y el extremo 5' de la hebra antisentido, y un sobresaliente de ARN de dos nucleótidos se encuentra en el extremo 3' de la hebra antisentido. Esta es una composición asimétrica con ADN en el extremo romo y bases de ARN en el extremo sobresaliente. En ciertas realizaciones de la presente invención, los nucleótidos modificados (por ejemplo, desoxirribonucleótidos) de las posiciones penúltima y última del extremo 3' del par de bases de la hebra en sentido con los nucleótidos modificados correspondientes (por ejemplo, desoxirribonucleótidos) de la hebra antisentido (opcionalmente, el residuos penúltimos y últimos del extremo 5' de la hebra antisentido en aquellos agentes DsiNA de la presente invención que poseen un extremo romo en el extremo 3' de la hebra en sentido/terminal 5' de la hebra antisentido).
Las hebras en sentido y antisentido de un agente DsiNA de la presente invención se recogen en condiciones biológicas, tales como las condiciones encontradas en el citoplasma de una célula. Además, una región de una de las secuencias, particularmente de la hebra antisentido, del agente DsiNA tiene una longitud de secuencia de al menos 19 nucleótidos, en donde estos nucleótidos están en la región de 21 nucleótidos adyacente al extremo 3' del antisentido hebra y son suficientemente complementarios a una secuencia de nucleótidos del ARN producido a partir del gen diana para recocer y/o disminuir los niveles de dicho ARN diana.
El agente de DsiNA de la presente invención puede poseer uno o más pares de bases de desoxirribonucleótidos ubicados en cualquier posición de las hebras en sentido y antisentido que se encuentran 3' del sitio de escisión de Dicer proyectado de la hebra en sentido y 5' de la escisión Dicer proyectada sitio de la hebra antisentido. En ciertas realizaciones, una, dos, tres o las cuatro posiciones 24-27 de la hebra en sentido (comenzando desde la posición 1 en el extremo 5' de la hebra en sentido) son desoxirribonucleótidos, cuya base de cada desoxirribonucleótido se empareja con un desoxirribonucleótido correspondiente de la hebra antisentido. En ciertas realizaciones, los desoxirribonucleótidos de la región 5' de la hebra antisentido (por ejemplo, la región de la hebra antisentido ubicada 5' del sitio de escisión de Dicer proyectado para una molécula de DsiNA dada) no son complementarios al ARN diana al cual se dirige el agente DsiNA. En realizaciones relacionadas, toda la región de la hebra antisentido ubicada en 5' del sitio de escisión de Dicer proyectado de un agente DsiNA no es complementaria al ARN diana al que se dirige el agente DsiNA. En ciertas realizaciones, los desoxirribonucleótidos de la hebra antisentido o toda la región de la hebra antisentido que se encuentra 5' del sitio de escisión de Dicer proyectado del agente DsiNA no es lo suficientemente complementario al ARN diana para mejorar el fusión de la hebra antisentido del DsiNA para el ARN diana cuando la hebra antisentido se recuece al ARN diana en condiciones suficientes para permitir el fusión entre la hebra antisentido y el ARN diana (por ejemplo, una secuencia de la hebra antisentido "central" que carece de la región extendida de ADN se junta igualmente bien para el ARN diana como la misma secuencia de hebra antisentido "central" también se extendió con la secuencia de la región extendida de ADN).
El agente DsNA también puede tener una o más de las siguientes propiedades adicionales: (a) la hebra antisentido tiene un desplazamiento a la derecha o izquierda del típico 21-mero, (b) las hebras pueden no ser completamente complementarias, es decir, las hebras pueden contener emparejamientos no coincidente simples y (c) pueden incluirse modificaciones de bases tales como ácido nucleico bloqueado y ácido nucleico desbloqueado (UNA) en el extremo 5' de la hebra en sentido. Se diseña un ARNsi 21-mero "típico" utilizando técnicas convencionales. En una técnica, una variedad de sitios se prueba comúnmente en paralelo o agrupaciones que contienen varios doble de ARNsi distintos específicos para el mismo objetivo con la esperanza de que uno de los reactivos sea efectivo (Ji et al., 2003). Otras técnicas utilizan reglas de diseño y algoritmos para aumentar la probabilidad de obtener moléculas efectoras de ARNi activo (Schwarz et al., 2003; Khvorova et al., 2003; Ui-Tei et al., 2004; Reynolds et al., 2004; Krol et al. al., 2004; Yuan et al., 2004; Boese et al., 2005). También se ha desarrollado una selección de alto rendimiento de ARNsi (solicitud de patente publicada de los Estados Unidos No. 2005/0042641 A1). Los posibles sitios objetivo también pueden analizarse mediante predicciones de estructura secundaria (Heale et al., 2005). Este 21-mero se usa para diseñar un desplazamiento a la derecha para incluir 3-9 nucleótidos adicionales en el extremo 5' del 21-mero. La secuencia de estos nucleótidos adicionales puede tener cualquier secuencia. En una realización, los ribonucleótidos añadidos se basan en la secuencia del gen diana. Incluso en esta realización, no se requiere una completa complementariedad entre la secuencia diana y el ARNsi antisentido.
No se requiere que el primer y segundo oligonucleótidos de un agente DsNA de la presente invención sean completamente complementarios. Solo necesitan ser sustancialmente complementarios a lal fusión en condiciones biológicas y proporcionar un sustrato para Dicer que produzca un ARNsi lo suficientemente complementario a la secuencia diana. Los ácidos nucleicos bloqueados, o LNA, los ácidos nucleicos desbloqueados (UNA), son bien conocidos por un experto en la técnica (Elman et al., 2005; Kurreck et al., 2002; Crinelli et al., 2002; Braasch and Corey, 2001; Bondensgaard et al., 2000; Wahlestedt et al., 2000). En una realización, se incorpora un LNA en el extremo 5' de la hebra en sentido. En otra realización, se incorpora un LNA en el extremo 5' de la hebra en sentido en doble diseñados para incluir un sobresaliente de 3' en la hebra antisentido.
En ciertas realizaciones, el agente de DsNA de la presente invención tiene una estructura asimétrica, con la hebra en sentido con una longitud de 27 pares de bases, y la hebra antisentido que tiene una longitud de 29 pares de bases y un sobresaliente de 2 bases 3'. Dichos agentes pueden poseer entre uno y cuatro desoxirribonucleótidos en la región terminal 3' (específicamente, la región 3' del sitio de escisión de Dicer proyectado) de la hebra en sentido, en al menos uno de los cuales la base de desoxirribonucleótidos se empareja con un desoxirribonucleótido afín de los 5' región terminal (específicamente, la región 5' del sitio de escisión de Dicer proyectado) de la hebra antisentido. En otras realizaciones, la hebra en sentido tiene una longitud de 28 pares de bases, y la hebra antisentido tiene una longitud de 30 pares de bases y un sobresaliente de 2 bases 3'. Dichos agentes pueden poseer entre uno y cinco desoxirribonucleótidos en la región terminal 3'(específicamente, la región 3' del sitio de escisión de Dicer proyectado) de la hebra en sentido, en al menos uno de los cuales la base de desoxirribonucleótidos se empareja con un desoxirribonucleótido afín de los 5' región terminal (específicamente, la región 5' del sitio de escisión de Dicer proyectado) de la hebra antisentido. En realizaciones adicionales, la hebra en sentido tiene una longitud de 29 pares de bases, y la hebra antisentido tiene una longitud de 31 pares de bases y un sobresaliente de 3 bases de 3'. Dichos agentes pueden poseer entre uno y seis desoxirribonucleótidos en la región terminal 3' (específicamente, la región 3' del sitio de escisión de Dicer proyectado) de la hebra en sentido, en al menos uno de los cuales la base de desoxirribonucleótidos se empareja con un desoxirribonucleótido afín de los 5' región terminal (específicamente, la región 5' del sitio de escisión de Dicer proyectado) de la hebra antisentido. En realizaciones adicionales, la hebra en sentido tiene una longitud de 30 pares de bases, y la hebra antisentido tiene una longitud de 32 pares de bases y un sobresaliente de 2 bases 3'. Tales agentes poseen opcionalmente entre uno y siete desoxirribonucleótidos en la región terminal 3' (específicamente, la región 3' del sitio de escisión de Dicer proyectado) de la hebra en sentido, en al menos uno de los cuales la base de desoxirribonucleótidos se empareja con un desoxirribonucleótido afín de los 5' región terminal (específicamente, la región 5' del sitio de escisión de Dicer proyectado) de la hebra antisentido. En otras realizaciones, la hebra en sentido tiene una longitud de 31 pares de bases, y la hebra antisentido tiene una longitud de 33 pares de bases y un sobresaliente de 3 bases de 3'. Dichos agentes pueden poseer entre uno y ocho desoxirribonucleótidos en la región terminal 3' (específicamente, la región 3' del sitio de escisión de Dicer proyectado) de la hebra en sentido, en al menos uno de los cuales la base de desoxirribonucleótidos se empareja con un desoxirribonucleótido afín de los 5' región terminal (específicamente, la región 5' del sitio de escisión de Dicer proyectado) de la hebra antisentido. En realizaciones adicionales, la hebra en sentido tiene una longitud de 32 pares de bases, y la hebra antisentido tiene una longitud de 34 pares de bases y un sobresaliente de 2 bases 3'. Tales agentes poseen opcionalmente entre uno y nueve desoxirribonucleótidos en la región terminal 3' (específicamente, la región 3' del sitio de escisión de Dicer proyectado) de la hebra en sentido, en al menos uno de los cuales la base de desoxirribonudeótidos se empareja con un desoxirribonucleótido afín de los 5' región terminal (específicamente, la región 5' del sitio de escisión de Dicer proyectado) de la hebra antisentido. En ciertas realizaciones adicionales, la hebra en sentido tiene una longitud de 33 pares de bases, y la hebra antisentido tiene una longitud de 35 pares de bases con un sobresaliente de 2 bases 3'. Tales agentes poseen opcionalmente entre uno y diez desoxirribonucleótidos de la región terminal 3' (específicamente, la región 3' del sitio de escisión de Dicer proyectado) de la hebra en sentido, en al menos uno de los cuales la base se empareja con un desoxirribonucleótido afín de la región terminal 5' (específicamente, la región 5' del sitio de escisión de Dicer proyectado) de la hebra antisentido. En aún otras realizaciones, cualquiera de estos agentes de DsNA tiene una estructura asimétrica que contiene además 2 desoxirribonucleótidos en el extremo 3' de la hebra en sentido que puede emparejarse con desoxirribonucleótidos afines de la hebra antisentido.
Ciertas composiciones de agente de DsNA que contienen dos oligonucleótidos separados se pueden unir mediante una tercera estructura. La tercera estructura no bloqueará la actividad de Dicer en el agente DsNA y no interferirá con la destrucción dirigida del ARN transcrito desde el gen diana. En una realización, la tercera estructura puede ser un grupo de enlace químico. Muchos grupos de enlace químicos adecuados son conocidos en la técnica y pueden usarse. Alternativamente, la tercera estructura puede ser un oligonucleótido que une los dos oligonucleótidos del agente de DsNA de tal manera que se produzca una estructura de horquilla al recocer los dos oligonucleótidos que forman la composición de dsNA. La estructura de horquilla no bloqueará la actividad de Dicer en el agente de DsNA y no interferirá con la destrucción dirigida del ARN diana.
En ciertas realizaciones, el agente DsNA de la invención tiene varias propiedades que mejoran su procesamiento por Dicer. De acuerdo con tales realizaciones, el agente DsNA tiene una longitud suficiente para que Dicer lo procese para producir un ARNsi y al menos una de las siguientes propiedades: (i) el agente DsNA es asimétrico, por ejemplo, tiene un sobresaliente de 3' en la hebra en sentido y (ii) el agente de DsNA tiene un extremo 3' modificado en la hebra antisentido para dirigir la unión de Dicer y el procesamiento de la región de ARNds a un ARNsi activo. De acuerdo con estas realizaciones, la hebra más larga en el agente DsNA comprende 25-43 nucleótidos. En una realización, la hebra en sentido comprende 25-39 nucleótidos y la hebra antisentido comprende 26-43 nucleótidos. El dsNA resultante puede tener un sobresaliente en el extremo 3' de la hebra en sentido. El sobresaliente es de 1-4 nucleótidos, como 2 nucleótidos. La hebra antisentido o en sentido también puede tener un 5' fosfato.
En ciertas realizaciones, el agente DsNA de la invención tiene varias propiedades que mejoran su procesamiento por Dicer. De acuerdo con tales realizaciones, el agente DsNA tiene una longitud suficiente para que Dicer lo procese para producir un ARNsi y al menos una de las siguientes propiedades: (i) el agente DsNA es asimétrico, por ejemplo, tiene un sobresaliente de 5' en la hebra en sentido y (ii) el agente de DsNA tiene un extremo 3' modificado en la hebra antisentido para dirigir la unión de Dicer y el procesamiento de la región de ARNds a un ARNsi activo. De acuerdo con estas realizaciones, la hebra más larga en el agente DsNA comprende 25-43 nucleótidos. En una realización, la hebra en sentido comprende 25-43 nucleótidos y la hebra antisentido comprende 25-39 nucleótidos. El dsNA resultante puede tener un sobresaliente en el extremo 3' de la hebra en sentido. El sobresaliente es de 1-4 nucleótidos, como 2 nucleótidos. La hebra antisentido o en sentido también puede tener un 5' fosfato.
En ciertas realizaciones, la hebra en sentido de un agente de DsiNA se modifica para el procesamiento de Dicer mediante modificadores adecuados ubicados en el extremo 3' de la hebra en sentido, es decir, el agente de DsiNA está diseñado para orientar directamente la unión y el procesamiento de Dicer. Los modificadores adecuados incluyen nucleótidos tales como desoxirribonucleótidos, didesoxirribonucleótidos, aciconucleótidos y similares y moléculas con impedimento estérico, tales como moléculas fluorescentes y similares. Los aciconucleótidos sustituyen un grupo 2-hidroxietoximetilo por el azúcar 2'-desoxirribofuranosilo normalmente presente en los dNMP. Otros modificadores de nucleótidos podrían incluir 3'-desoxiadenosina (cordicepina), 3'-azido-3'-desoxitimidina (AZT), 2',3'-didesoxiinosina (ddI), 2',3'-didesoxi-3'-tiacitidina (3TC), 2',3'-didehidro-2',3'-didesoxitimidina (d4T) y los nucleótidos monofosfato de 3'-azido-3'-desoxitimidina (AZT), 2',3'-didesoxi-3'-tiacitidina (3TC) y 2',3'-didehidro-2',3'-didesoxitimidina (d4T). En una realización, los desoxirribonucleótidos se usan como modificadores. Cuando se utilizan modificadores de nucleótidos, se sustituyen los modificadores de 1-3 nucleótidos, o 2 modificadores de nucleótidos por los ribonucleótidos en el extremo 3' de la hebra en sentido. Cuando se utilizan moléculas estéricamente impedidas, se unen al ribonucleótido en el extremo 3' de la hebra antisentido. Por lo tanto, la longitud de la hebra no cambia con la incorporación de los modificadores. En otra realización, la invención contempla sustituir dos bases de ADN en el dsNA para dirigir la orientación del procesamiento de Dicer. En una realización adicional, dos bases de ADN terminales se ubican en el extremo 3' de la hebra en sentido en lugar de dos ribonucleótidos que forman un extremo romo del doble en el extremo 5' de la hebra antisentido y el extremo 3' de la hebra en sentido, y un sobresaliente de ARN de dos nucleótidos se encuentra en el extremo 3' de la hebra antisentido. Esta es una composición asimétrica con ADN en el extremo romo y bases de ARN en el extremo sobresaliente.
En ciertas otras realizaciones, la hebra antisentido de un agente DsiNA se modifica para el procesamiento de Dicer mediante modificadores adecuados ubicados en el extremo 3' de la hebra antisentido, es decir, el agente DsiNA está diseñado para orientar directamente la unión y el procesamiento de Dicer. Los modificadores adecuados incluyen nucleótidos tales como desoxirribonucleótidos, didesoxirribonucleótidos, aciconucleótidos y similares y moléculas con impedimento estérico, tales como moléculas fluorescentes y similares. Los aciconucleótidos sustituyen un grupo 2-hidroxietoximetilo por el azúcar 2'-desoxirribofuranosilo normalmente presente en los dNMP. Otros modificadores de nucleótidos podrían incluir 3'-desoxiadenosina (cordicepina), 3'-azido-3'-desoxitimidina (AZT), 2',3'-didesoxiinosina (ddl), 2',3'-didesoxi-3'-tiacitidina (3TC), 2',3'-didehidro-2',3'-didesoxitimidina (d4T) y los nucleótidos monofosfato de 3'-azido-3'-desoxitimidina (AZT), 2',3'-didesoxi-3'-tiacitidina (3TC) y 2',3'-didehidro-2',3'-didesoxitimidina (d4T). En una realización, los desoxirribonucleótidos se usan como modificadores. Cuando se utilizan modificadores de nucleótidos, se sustituyen de 1 a 3 modificadores de nucleótidos, o 2 modificadores de nucleótidos por los ribonucleótidos en el extremo 3' de la hebra antisentido. Cuando se utilizan moléculas estéricamente impedidas, se unen al ribonucleótido en el extremo 3' de la hebra antisentido. Por lo tanto, la longitud de la hebra no cambia con la incorporación de los modificadores. En otra realización, la invención contempla sustituir dos bases de ADN en el dsNA para dirigir la orientación del procesamiento de Dicer. En otra invención, dos bases de ADN terminales se ubican en el extremo 3' de la hebra antisentido en lugar de dos ribonucleótidos que forman un extremo romo del doble en el extremo 5' de la hebra en sentido y el extremo 3' de la hebra antisentido, y un sobresaliente de ARN de dos nucleótidos se encuentra en el extremo 3' de la hebra en sentido. Esta también es una composición asimétrica con ADN en el extremo romo y bases de ARN en el extremo sobresaliente
Las hebras en sentido y antisentido se recogen en condiciones biológicas, tales como las condiciones encontradas en el citoplasma de una célula. Además, una región de una de las secuencias, particularmente de la hebra antisentido, del dsNA tiene una longitud de secuencia de al menos 19 nucleótidos, en donde estos nucleótidos son adyacentes al extremo 3' de la hebra antisentido y son suficientemente complementarios a un nucleótido secuencia del ARN diana para dirigir la interferencia de ARN.
Además, la estructura del agente DsiNA puede optimizarse para asegurar que el oligonucleótido generado por la escisión de Dicer sea el más eficaz para inhibir la expresión génica. Por ejemplo, en una realización de la invención, se sintetiza un oligonucleótido de 27-35 pb de la estructura del agente DsiNA en donde el segmento anticipado de 21 a 22 pb que inhibirá la expresión génica se encuentra en el extremo 3' de la hebra antisentido. Dicer escindirá las bases restantes ubicadas en el extremo 5' de la hebra antisentido y se descartarán. Esta porción escindida puede ser homóloga (es decir, basada en la secuencia de la secuencia diana) o no homóloga y agregarse para extender la hebra de ácido nucleico. Como sorprendentemente identificado en la presente invención, dicha extensión puede realizarse con residuos de ADN apareados en bases (ADN bicatenario: extensiones de ADN), lo que da como resultado agentes DsiNA extendidos que tienen una eficacia o duración de efecto mejoradas que los correspondientes agentes DsiNA de ARN bicatenario: ARN extendido.
El documento US 2007/0265220 describe que los DsNA de 27-mero muestran una estabilidad mejorada en el suero sobre composiciones de ARNsi de 21-mero comparables, incluso sin modificación química. Las modificaciones de los agentes de DsNA, como la inclusión de 2'-O-metil ARN en la hebra antisentido, en patrones como se detalla en el documento US 2007/0265220 y en los ejemplos instantáneos, cuando se combinan con la adición de un 5' fosfato, pueden mejorar la estabilidad de agentes DsNA. La adición de 5'-fosfato a todas las hebras en doble de ARN sintético puede ser un método económico y fisiológico para conferir cierto grado limitado de estabilidad de la nucleasa.
Los patrones de modificación química de los agentes de DsNA de la presente invención están diseñados para mejorar la eficacia de dichos agentes. En consecuencia, tales modificaciones están diseñadas para evitar reducir la potencia de los agentes de DsNA; para evitar interferir con el procesamiento Dicer de agentes DsNA; para mejorar la estabilidad en fluidos biológicos (reducir la sensibilidad a la nucleasa) de los agentes de DsNA; o para bloquear o evadir la detección por el sistema inmune innato. Dichas modificaciones también están diseñadas para evitar ser tóxicos y evitar aumentar el costo o afectar la facilidad de fabricación de los agentes de DsNA instantáneos de la invención.
ARNsi de procesamiento de ARN
El proceso de IARN mediado por ARNsi se desencadena por la presencia de moléculas largas de ARNds en una célula. Durante el paso de iniciación de IARN, Dicer, una familia conservada de enzimas que contienen dos dominios similares a RNasa III (Bernstein et al. 2001; Elbashir et al. 2001). Los ARNsi se caracterizan por una región doble de 19-21 pares de bases y 2 sobresalientes de nucleótidos 3' en cada hebra. Durante el paso efector de IARN, los ARNsi se incorporan a un complejo proteico multimérico llamado complejo de silenciamiento inducido por RNA (RISC), donde sirven como guías para seleccionar sustratos de ARNm completamente complementarios para la degradación. La degradación se inicia por escisión endonucleolítica del ARNm dentro de la región complementaria al ARNsi. Más precisamente, el ARNm se escinde en una posición a 10 nucleótidos del extremo 5' del ARNsi guía (Elbashir et al.
2001 Genes and Dev. 15: 188-200; Nykanen et al. 2001 Cell 107: 309-321; Martínez et al.2002 Cell 110: 563-574). Una endonucleasa responsable de esta escisión se identificó como Argonaute2 (Ago2; Liu et al. Science, 305: 1437­ 41).
ARNmi
La mayoría de los miARN humanos (70%), y presumiblemente la mayoría de los miARN de otros mamíferos, se transcriben de intrones y/o exones, y aproximadamente el 30% se encuentran en regiones intergénicas (Rodriguez et al., Genome Res. 2004, 14 (10A), 1902-1910). En humanos y animales, los miARN generalmente se transcriben mediante ARN polimerasa II (Farh et al. Science 2005, 310(5755), 1817-1821), y en algunos casos por pol III (Borchert et al. Nat. Struct. Mol. Biol 2006, 13(12), 1097-1101). Ciertos ARNmis codificados por virus son transcritos por la ARN polimerasa III (Pfeffer et al. Nat. Methods 2005, 2(4), 269-276; Andersson et al. J. Virol. 2005, 79(15), 9556-9565), y algunos se encuentran en el marco de lectura abierta del gen viral (Pfeffer et al. Nat. Methods 2005, 2(4), 269-276; Samols et al. J. Virol. 2005, 79(14), 9301-9305). La transcripción de miARN da como resultado la producción de grandes transcripciones primarias monocistrónicas, bicistrónicas o policistrónicas (pri-ARNmi). Un solo pri-ARNmi puede variar de aproximadamente 200 nucleótidos (nt) a varias kilobases (kb) de longitud y tener protectores de 5' 7-metilguanosina (m7) y una cola de poli (A) 3'. De forma característica, las secuencias de miARN maduras se localizan en regiones de secuencias imperfectas de tallo-bucle dentro de los pri-miARN (Cullen, Mol. Cell. 2004, 16(6), 861­ 865).
El primer paso de la maduración de miARN en el núcleo es el reconocimiento y la escisión de los pri-miARN por el complejo de microprocesador nuclear RNasa III Drosha-DGCR8, que libera una molécula precursora que contiene horquilla de ~70 nt llamada pre-ARNmi, con un monofosfato en el terminal 5' y un sobresaliente de 2 nt con un grupo hidroxilo en el terminal 3' (Cai et al. RNA 2004, 10(12), 1957-1966; Lee et al. Nature 2003, 425(6956), 415-419; Kim Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2005, 6(5), 376-385). El siguiente paso es el transporte nuclear de los pre-ARNmi fuera del núcleo hacia el citoplasma por Exportin-5, una proteína transportadora (Yi et al. Genes. Dev. 2003, 17(24), 3011-3016, Bohnsack et al. ARN 2004, 10(2), 185-191). Exportin-5 y la forma unida a GTP de su cofactor Ran juntos reconocen y unen el sobresaliente de 2 nucleótidos 3' y el tallo adyacente que son características del pre-ARNmi (Basyuk et al. Nucl. Acids Res. 2003, 31(22), 6593-6597, Zamore Mol. Cell. 2001, 8(6), 1158-1160). En el citoplasma, la hidrólisis de GTP resulta en la liberación del pre-ARNmi, que luego es procesado por una enzima endonucleasa III celular Dicer (Bohnsack et al.). Dicer fue reconocido por primera vez por su papel en la generación de ARNsi que median la interferencia de ARN (ARNi). Dicer actúa en concierto con sus cofactores TRBP (proteína de unión a la región de activación Trans; Chendrimata et al. Nature 2005, 436(7051), 740-744) y PACT (activador de proteína quinasa dependiente de ARN de doble hebra inducible por interferón; Lee et al. Em BÓ J. 2006, 25(3), 522-532). Estas enzimas se unen en el sobresaliente de 3' 2 nucleótidos en la base de la horquilla pre-ARNmi y eliminan el bucle terminal, produciendo un intermedio doble de ARNmi de aproximadamente 21 nt con ambos extremos con 5' monofosfatos, 3' 2 sobresalientes de nucleótidos y 3' grupos hidroxilo. La hebra guía de ARNmi, cuyo terminal 5' es energéticamente menos estable, se selecciona para su incorporación en el RISC (complejo silenciador inducido por ARN), mientras que la hebra 'pasajera' se libera y degrada (Maniataki et al. Genes. Dev 2005, 19(24), 2979-2990; Hammond et al. Nature 2000, 404(6775), 293-296). La composición de RISC permanece incompleta, pero un componente clave es un miembro de la familia de proteínas Argonaute (Ago) (Maniataki et al.; Meister et al. Mol. Cell. 2004, 15(2), 185-197).
El miARN maduro luego dirige el RISC a especies de ARNm complementarias. Si el ARNm objetivo tiene una complementariedad perfecta con el RISC armado con miARN, el ARNm se escindirá y degradará (Zeng et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003, 100(17), 9779-9784; Hutvagner et al. Science 2002, 297(55 89), 2056-2060). Pero como la situación más común en las células de mamíferos, los ARNmi se dirigen a los ARNm con complementariedad imperfecta y suprimen su traducción, lo que resulta en una expresión reducida de las proteínas correspondientes (Yektaetal. Science 2004, 304(5670), 594-596; Olsen etal. Dev. Biol. 1999, 216(2), 671-680). La región 5' del ARNmi, especialmente la coincidencia entre ARNmi y la secuencia diana en los nucleótidos 2-7 u 8 de ARNmi (comenzando desde la posición 1 en el terminal 5'), que se denomina región semilla, es esencialmente importante para la selección de ARNmi, y esta coincidencia de semillas también se ha convertido en un principio clave ampliamente utilizado en la predicción por computadora del objetivo de ARNmi (Lewis et al. Cell 2005, 120(1), 15-20; Brennecke et al. PLoS Biol.
2005, 3(3), e85). La regulación de miARN de los dobles de miARN-ARNm está mediada principalmente a través de múltiples sitios complementarios en los 3' UTR, pero hay muchas excepciones. Los miARN también pueden unirse al 5' UTR y/o la región codificante de los ARNm, dando como resultado un resultado similar (Lytle et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2007, 104(23), 9667-9672).
RNasa H
La RNasa H es una ribonucleasa que escinde el enlace 3'-O-P de ARN en un doble de ADN/ARN para producir productos terminados en 3'-hidroxilo y 5'-fosfato. La RNasa H es una endonucleasa no específica y cataliza la escisión del ARN a través de un mecanismo hidrolítico, ayudado por un ion metálico divalente unido a la enzima. Los miembros de la familia RNasa H se encuentran en casi todos los organismos, desde arqueas y procariotas hasta eucariotas. Durante la replicación del ADN, se cree que la RNasa H corta los cebadores de ARN responsables de la generación de cebadores de fragmentos de Okazaki; sin embargo, la enzima RNasa H puede emplearse más generalmente para escindir cualquier secuencia híbrida de ADN:ARN de longitud suficiente (por ejemplo, típicamente secuencias híbridas de ADN:ARN de 4 o más pares de bases de longitud en mamíferos).
Terapias MicroARN y tipo MicroARN
Se ha descrito que los microARN (miARN) actúan uniéndose al 3' UTR de una transcripción de plantilla, inhibiendo así la expresión de una proteína codificada por la transcripción de plantilla mediante un mecanismo relacionado pero distinto de la interferencia de ARN clásica. Específicamente, se cree que los ARNmi actúan reduciendo la traducción de la transcripción objetivo, en lugar de disminuir su estabilidad. Los miARN de origen natural son típicamente de aproximadamente 22 nt de longitud. Se cree que se derivan de precursores más grandes conocidos como pequeños ARN temporales (ARNt) de aproximadamente 70 nt de longitud.
Agentes de interferencia tales como ARNsis, y más específicamente tales como ARNmis, que se unen dentro del 3' UTR (o en otra parte de una transcripción de destino, por ejemplo, en elementos repetidos de, por ejemplo, Notch y/o transcripciones de la familia Notch) e inhiben la traducción pueden tolerar un mayor número de no coincidencias en el doble ARNsi/plantilla (ARNmi/plantilla), y particularmente pueden tolerar no coincidencias dentro de la región central del doble. De hecho, existe evidencia de que algunas no coincidencias pueden ser deseables o requeridas, ya que los ARNt de origen natural exhiben frecuentemente tales no coincidencias, como lo hacen los ARNmi que han demostrado inhibir la traducción in vitro (Zeng et al., Molecular Cell, 9: 1-20) Por ejemplo, cuando se hibrida con la transcripción objetivo, tales ARNmis frecuentemente incluyen dos tramos de complementariedad perfecta separados por una región no coincidente. Tal complejo hibridado incluye comúnmente dos regiones de complementariedad perfecta (porciones doble) que comprenden pares de nucleótidos, y al menos un único par de bases no coincidentes, que pueden ser, por ejemplo, G:A, G:U, G:G, A:A, A:C, U:U, U:C, C:C, G:-, A:-, U:-, C:-, etc. Tales nucleótidos no coincidentes, especialmente si están presentes en tándem (por ejemplo, un dos, tres o área de cuatro nucleótidos no coincidente) puede formar una protuberancia que separa las porciones dobles que se encuentran en cualquier flanco de dicha protuberancia. Una variedad de estructuras es posible. Por ejemplo, el ARNmi puede incluir múltiples áreas de no identidad (no coincidencia). Las áreas de no identidad (no coincidencia) no necesitan ser simétricas en el sentido de que tanto el objetivo como el ARNmi incluyen nucleótidos no apareados. Por ejemplo, se han descrito estructuras en las que solo una hebra incluye nucleótidos no apareados (Zeng et al.). Típicamente, los tramos de complementariedad perfecta dentro de un agente de miARN tienen al menos 5 nucleótidos de longitud, por ejemplo, 6, 7 o más nucleótidos de longitud, mientras que las regiones de no coincidencia pueden tener, por ejemplo, 1, 2, 3 o 4 nucleótidos en longitud.
En general, cualquier ARNsi particular podría funcionar para inhibir la expresión génica tanto a través de (i) la ruta de ARNsi "clásica", en la que la estabilidad de un transcrito diana se reduce y en la que frecuentemente se prefiere la complementariedad perfecta entre el ARNsi y el objetivo, y también por (ii) la ruta "alternativa" (generalmente caracterizada como la ruta de miARN en animales), en la que se inhibe la traducción de una transcripción diana. En general, las transcripciones dirigidas por un ARNsi particular a través del mecanismo (i) serían distintas de la transcripción dirigida a través del mecanismo (ii), aunque es posible que una sola transcripción pueda contener regiones que puedan servir como objetivos para las rutas clásicas y alternativas. (Nótese que los términos "clásico" y "alternativo" se usan simplemente por conveniencia y generalmente se cree que reflejan el momento histórico del descubrimiento de tales mecanismos en las células animales, pero no reflejan la importancia, efectividad u otras características de cualquiera de los mecanismos). Un objetivo común del diseño de ARNsi ha sido apuntar a una única transcripción con gran especificidad, a través del mecanismo (i), mientras se minimizan los efectos fuera de la diana, incluidos los efectos potencialmente provocados a través del mecanismo (ii). Sin embargo, uno de los objetivos de la presente invención es proporcionar agentes de interferencia de ARN que posean residuos de emparejamiento erróneo por diseño, ya sea con el fin de imitar las actividades de los miARN naturales, o para crear agentes dirigidos contra los ARN diana para los que no hay un miARN correspondiente. actualmente conocido, con las eficacias/potencias inhibitorias y/o terapéuticas de tales agentes de DARNsi que contienen no coincidencia (por ejemplo, agentes de DARNsimm)tolerantes y, de hecho, posiblemente potenciados portales no coincidencias.
La tolerancia de los agentes de ARNmi para los nucleótidos no coincidentes (y, de hecho, la existencia y el uso natural del mecanismo (ii) anterior en la célula) sugiere el uso de ARNmi en formas que son ventajosas y/o se expanden sobre el uso "clásico" de ARNsi perfectamente complementarios que actúan a través del mecanismo (i). Debido a que los ARNmi son moléculas de origen natural, es probable que existan ventajas distintas al aplicar los ARNmi como agentes terapéuticos. Los miARN se benefician de cientos de millones de años de "ajuste" evolutivo de su función. Por lo tanto, los efectos "fuera de la diana" específicos de la secuencia no deberían ser un problema con los ARNmi naturales, ni, por extensión, con ciertos DARNsi sintéticos de la invención (por ejemplo, agentes DARNsimm) diseñados para imitar los ARNmi naturales. Además, los ARNmi han evolucionado para modular la expresión de grupos de genes, impulsando la regulación hacia arriba y hacia abajo (en ciertos casos, realizando ambas funciones simultáneamente dentro de una célula con un solo ARNmi que actúa de manera promiscua sobre múltiples ARN diana), con el resultado de que ese complejo las funciones de la celda pueden ser moduladas con precisión. Tal reemplazo de ARNmis naturales puede implicar la introducción de ARNmis sintéticos o miméticos de ARNmi (por ejemplo, ciertos DARNsimms) en tejidos enfermos en un esfuerzo por restaurar la proliferación normal, la apoptosis, el ciclo celular y otras funciones celulares que han sido afectadas por la baja regulación de uno o más ARNmis. En ciertos casos, la reactivación de estas vías reguladas por miARN ha producido una respuesta terapéutica significativa (por ejemplo, en un estudio sobre hipertrofia cardíaca, sobreexpresión de miR-133 por administración mediada por adenovirus de un casete de expresión de miARN animales protegidos de hipertrofia cardíaca inducida por agonista, mientras que la reducción recíproca de miR-133 en ratones de tipo salvaje por los antagómeros causó un aumento en los marcadores hipertróficos (Care et al. Nat. Med. 13: 613-618)).
Hasta la fecha, se han identificado más de 600 ARNmi codificados dentro del genoma humano, con tales ARNmi expresados y procesados por una combinación de proteínas en el núcleo y el citoplasma. Los miARN están altamente conservados entre los vertebrados y comprenden aproximadamente el 2% de todos los genes de mamíferos. Dado que cada ARNmi parece regular la expresión de múltiples, por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o incluso decenas a cientos de genes diferentes, los ARNmi pueden funcionar como "interruptores maestros", regulando y coordinando múltiples vías y procesos celulares. Al coordinar la expresión de múltiples genes, los miARN desempeñan funciones clave en el desarrollo embrionario, la inmunidad, la inflamación, así como en el crecimiento y la proliferación celular.
Los estudios funcionales y de expresión sugieren que la expresión alterada de ARNmi específicos es crítica para una variedad de enfermedades humanas. La creciente evidencia indica que la introducción de miARN específicos en células y tejidos de enfermedades puede inducir respuestas terapéuticas favorables (Pappas et al., Expert Opin Ther Targets. 12: 115-27). La promesa de la terapia con miARN es quizás mayor en el cáncer debido al papel aparente de ciertos miARN como supresores de tumores. La justificación de la terapéutica basada en ARNmi para, por ejemplo, el cáncer está respaldada, al menos en parte, por las siguientes observaciones:
(1) Los miARN con frecuencia están mal regulados y se expresan a niveles alterados en los tejidos enfermos en comparación con los tejidos normales. Varios estudios han demostrado niveles alterados de ARNmi en tejidos cancerosos en relación con sus tejidos normales correspondientes. A menudo, la expresión alterada es la consecuencia de mutaciones genéticas que conducen a una expresión aumentada o reducida de ARNmis particulares. Las enfermedades que poseen firmas de expresión de miARN únicas pueden explotarse como marcadores de diagnóstico y pronóstico, y pueden dirigirse con los agentes DARNsi (por ejemplo, DARNsimm) de la invención.
(2) Los miARN mal regulados contribuyen al desarrollo del cáncer al funcionar como oncogenes o supresores de tumores. Los oncogenes se definen como genes cuya sobreexpresión o activación inapropiada conduce a la oncogénesis. Los supresores de tumores son genes necesarios para evitar que las células sean cancerosas; La baja regulación o inactivación de los supresores tumorales es un inductor común de cáncer. Ambos tipos de genes representan objetivos farmacológicos preferidos, ya que dicho objetivo puede actuar específicamente sobre la base molecular de un cáncer en particular. Ejemplos de ARNmis oncogénicos son miR-155 y miR-17-92; let-7 es un ejemplo de un miARN supresor de tumores.
(3) La administración de ARNmi induce una respuesta terapéutica al bloquear o reducir el crecimiento tumoral en estudios preclínicos en animales. La literatura científica proporciona estudios de prueba de concepto que demuestran que restaurar la función de ARNmi puede prevenir o reducir el crecimiento de células cancerosas in vitro y también en modelos animales. Un ejemplo bien caracterizado es la actividad antitumoral de let-7 en modelos para cáncer de mama y pulmón. Los DARNsi (por ejemplo, DARNsimms) de la invención que están diseñados para imitar let-7 pueden usarse para atacar tales cánceres, y también es posible usar los parámetros de diseño de DARNsi descritos en este documento para generar nuevos agentes DARNsi (por ejemplo, DARNsimm) dirigidos contra ARN diana para los que no se conoce ARNmi natural de contrapartida (por ejemplo, repeticiones dentro de Notch u otras transcripciones), para detectar compuestos líderes terapéuticos, por ejemplo, agentes que sean capaces de reducir la carga tumoral en modelos animales preclínicos.
(4) Un ARNmi dado controla múltiples vías celulares y, por lo tanto, puede tener una actividad terapéutica superior. Según su biología, los ARNmi pueden funcionar como "interruptores maestros" del genoma, regulando múltiples productos génicos y coordinando múltiples vías. Los genes regulados por ARNmi incluyen genes que codifican oncogenes y supresores de tumores convencionales, muchos de los cuales son perseguidos individualmente como objetivos farmacológicos por la industria farmacéutica. Por lo tanto, la terapia de ARNmi podría poseer una actividad superior a los ARNsi y otras formas de compuestos principales al dirigirse a múltiples enfermedades y/o genes asociados al cáncer. Dada la observación de que la regulación errónea de los miARN es con frecuencia un evento temprano en el proceso de tumorigénesis, la terapia de miARN, que reemplaza a los miARN faltantes, puede ser la terapia más adecuada.
(5) los ARNmi son moléculas naturales y, por lo tanto, son menos propensos a inducir efectos secundarios no específicos. Millones de años de evolución ayudaron a desarrollar la red reguladora de ARNmis, afinando la interacción de ARNmi con los ARN mensajeros objetivo. Por lo tanto, los miARN y los derivados de miARN (por ejemplo, los ARNsi diseñados para imitar a los miARN naturales) tendrán pocos o ningún efecto "fuera de la diana" específica de la secuencia cuando se apliquen en el contexto adecuado.
Las características físicas de ARNsis y ARNmis son similares. Por consiguiente, las tecnologías que son efectivas en la administración de ARNsis (por ejemplo, DARNsis de la invención) también son efectivas en la administración de ARNmis sintéticos (por ejemplo, ciertos DARNsimms de la invención).
Conjugación y entrega de agentes de dsNA
En ciertos ejemplos, la presente divulgación se refiere a un método para tratar a un sujeto que tiene o está en riesgo de desarrollar una enfermedad o trastorno. En tales ejemplos, el dsNA puede actuar como un nuevo agente terapéutico para controlar la enfermedad o trastorno. El método comprende administrar una composición farmacéutica de la invención al paciente (por ejemplo, humano), de modo que se reduzca la expresión, nivel y/o actividad de un ARN diana. La expresión, nivel y/o actividad de un polipéptido codificado por el ARN diana también podría reducirse mediante un DsNA de la presente invención.
En el tratamiento de una enfermedad o trastorno, el DARNsi puede entrar en contacto con las células o el tejido que presenta o está asociado con una enfermedad o trastorno. Por ejemplo, el DsNA sustancialmente idéntico a todo o parte de una secuencia de ARN diana puede entrar en contacto o introducirse en una célula enferma, asociada a la enfermedad o infectada, in vivo o in vitro. De manera similar, el DsNA sustancialmente idéntico a la totalidad o parte de una secuencia de ARN diana puede administrarse directamente a un sujeto que tiene o está en riesgo de desarrollar una enfermedad o trastorno.
El uso terapéutico de los agentes de DsNA de la presente invención puede implicar el uso de formulaciones de agentes de DsNA que comprenden múltiples secuencias de agentes de DsNA diferentes. Por ejemplo, dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, etc. de los agentes descritos actualmente pueden combinarse para producir una formulación que, por ejemplo, se dirige a múltiples regiones diferentes de uno o más ARN(s) objetivo. Un agente de DsNA de la presente invención también se puede construir de tal manera que cualquiera de las hebras del agente de DsNA se dirijan independientemente a dos o más regiones de un ARN diana. Se espera que el uso de moléculas de DsNA multifuncionales que se dirigen a más de una región de una molécula de ácido nucleico diana proporcione una inhibición potente de los niveles y la expresión de ARN. Por ejemplo, un único constructo de DsNA multifuncional de la invención puede apuntar a regiones tanto conservadas como variables de una molécula de ácido nucleico diana, permitiendo así la regulación negativa o la inhibición de, por ejemplo, diferentes variantes de cepa de un virus, o variantes de empalme codificadas por un solo gen objetivo.
Un agente de DsNA de la invención se conjuga a otra unidad estructural por ejemplo, una unidad estructural de ácido no nucleico tal como un péptido, o un compuesto orgánico, por ejemplo, un colorante, colesterol o similar. La modificación de los agentes de DsNA de esta manera puede mejorar la absorción celular o mejorar las actividades de direccionamiento celular del derivado del agente de DsNA resultante en comparación con el correspondiente agente de DsNA no conjugado, son útiles para rastrear el derivado del agente de DsNA en la célula o mejorar la estabilidad del agente de DsNA derivado en comparación con el agente de DsNA no conjugado correspondiente. Los dsNAs de la inención se conjugan con GalNAc, folato, colesterol, manosa-6-fosfato. En una realización, un único dsNA de la invención comprende más de una molécula de GalNAc y más de una molécula de folato y más de una molécula de colesterol y más de una molécula de manosa-6-fosfato o cualquier combinación de todas.
Un ligando GalNAc no solo se puede unir a la nucleobase de un monómero nucleósido (es decir, la posición C5 de timidina como se muestra en el ejemplo 6), sino que también se puede unir al azúcar ribosa a través de 2'-OH (o 3'-OH) con un enlazador. El 2'-OH como sitio de conjugación es particularmente útil en el caso del DARNsi de tetrabucle porque los 2'-OH de los cuatro nucleótidos en el bucle están expuestos al solvente y no están involucrados en el enlace de hidrógeno y el apilamiento de bases que es necesario para formar El bucle estable basado en su estructura cristalina.
Se pueden usar diversos enlazadores para conjugar ligandos con agentes de dsNA. Los enlazadores de uso común en la técnica pueden usarse para conjugar ligandos con moléculas de dsNA. Algunos de esos enlazadores se ejemplifican en las tablas 4 y 5.
En particular, los agentes de dsNA como ahora se reivindeican que usan un enlazador acetal demostraron una potencia de inducción y eliminación de células in vitro e in vivo comparables a un enlazador de clic. La química del acetal utilizada para instalar el conector a 2'-OH es mucho más suave en comparación con las condiciones de alquilación tradicionales; por lo tanto, permita la conjugación selectiva a la posición 2'. Esto evitará la tediosa separación de la mezcla de isómeros 2' y 3' y mejorará significativamente el rendimiento.
Ensayo in vitro de IARN para evaluar la actividad de DARNsi
Un ensayo in vitro que recapitula ARNi en un sistema libre de células puede usarse opcionalmente para evaluar constructos de dsNA. Por ejemplo, dicho ensayo comprende un sistema descrito por Tuschl et al., 1999, Genes and Development, 13, 3191-3197 y Zamore et al., 2000, Cell, 101, 25-33, adaptado para su uso con agentes de dsNA dirigidos contra ARN diana y kits disponibles comercialmente, incluido Turbo Dicer (Genlantis). Se utiliza un extracto de Drosophila derivado del blastodermo sincicial para reconstituir la actividad de ARNi in vitro. El ARN diana se genera a través de la transcripción in vitro a partir de un plásmido apropiado usando ARN polimerasa T7 o mediante síntesis química. Las hebras de dsNA con sentido y antisentido (por ejemplo, 20 pM cada una) se fusionan mediante incubación en regulador (tal como acetato de potasio 100 mM, HEpES-KOH 30 mM, pH 7.4, acetato de magnesio 2 mM) durante 1 minuto a 90°C seguido de 1 hora a 37°C, luego diluido en regulador de lisis (por ejemplo, acetato de potasio 100 mM, HEPES-KOH 30 mM a pH 7.4, acetato de magnesio 2 mM). La fusión puede controlarse mediante electroforesis en gel en un gel de agarosa en regulador TBE y teñirse con bromuro de etidio. El lisado de Drosophila se prepara usando embriones de cero a dos horas de edad de moscas R de Oregon recolectadas en agar de melaza con levadura que son descorionadas y sometidas a lisis. El lisado se centrifuga y se aísla el sobrenadante. El ensayo comprende una mezcla de reacción que contiene 50% de lisado [vol/vol], ARN (concentración final 10-50 pM) y 10% [vol/vol] regulador de lisis que contiene dsNA (concentración final 10 nM). La mezcla de reacción también contiene 10 mM de creatina fosfato, 10 ug/ml de creatina fosfocinasa, 100 um GTP, 100 uM UTP, 100 uM CTP, 500 uM ATP, 5 mM DTT, 0.1 U/uL RNasin (Promega) y 100 uM de cada aminoácido. La concentración final de acetato de potasio se ajusta a 100 mM. Las reacciones se ensamblan previamente en hielo y se incuban previamente a 25°C durante 10 minutos antes de agregar ARN, luego se incuban a 25°C durante 60 minutos adicionales. Las reacciones se apagan con 4 volúmenes de 1.25 * regulador de lisis pasivo (Promega). La escisión del ARN diana se analiza mediante análisis de RT-PCR u otros métodos conocidos en la técnica y se comparan con las reacciones de control en las que se omite DARNsi de la reacción.
Alternativamente, el ARN diana marcado internamente para el ensayo se prepara mediante transcripción in vitro en presencia de [alpha-32P] CTP, se pasa sobre una columna Sephadex G50 por cromatografía de rotación y se usa como ARN diana sin purificación adicional. Opcionalmente, el ARN diana se marca en el extremo 5'-32P usando la enzima polinucleótido quinasa T4. Los ensayos se realizan como se describió anteriormente y el ARN diana y los productos de escisión de ARN específicos generados por ARNi se visualizan en una autorradiografía de un gel. El porcentaje de escisión se determina mediante la cuantificación de PHOSPHOR IMAGER® (autorradiografía) de bandas que representan ARN de control intacto o ARN de las reacciones de control sin dsNA y los productos de escisión generados por el ensayo.
La capacidad de una composición de molécula de ácido nucleico de doble hebra (dsNA) de la invención para inhibir la síntesis de proteínas puede medirse usando técnicas que son conocidas en el arte, por ejemplo, detectando una inhibición en la transcripción génica o síntesis de proteínas. El nivel o actividad de un ARN diana puede determinarse mediante cualquier método adecuado ahora conocido en la técnica o que se desarrolle más tarde. Se puede apreciar que el método utilizado para medir un ARN diana y/o la expresión de un ARN diana puede depender de la naturaleza del ARN diana. Por ejemplo, si el ARN diana codifica una proteína, el término "expresión" puede referirse a una proteína o al ARN/transcripción derivado del ARN diana. En tales casos, la expresión de un ARN diana puede determinarse midiendo la cantidad de ARN correspondiente al ARN diana o midiendo la cantidad de esa proteína. La proteína se puede medir en ensayos de proteínas, como por tinción o inmunotransferencia o, si la proteína cataliza una reacción que se puede medir, midiendo las velocidades de reacción. Todos estos métodos son conocidos en la técnica y pueden usarse. Cuando se deben medir los niveles de ARN diana, se puede usar cualquier método reconocido en la técnica para detectar niveles de ARN (por ejemplo, RT-PCR, transferencia de Northern, etc.). Al dirigirse a los ARN virales con los agentes de dsNA de la presente invención, también se anticipa que la medición de la eficacia de un agente de dsNA para reducir los niveles de un virus objetivo en un sujeto, tejido, células, in vitro o in vivo, o en extractos celulares también se pueden usar para determinar el grado de reducción de los niveles de ARN viral objetivo. Cualquiera de las medidas anteriores se puede realizaren células, extractos celulares, tejidos, extractos de tejidos o cualquier otro material fuente adecuado.
Ensayo de resistencia a la nucleasa
La resistencia a la nucleasa de las moléculas de dsNA se analiza a un oligonucleótido 0.1 pM usando 5 x 10-3 unidades/ml de fosfodiesterasa de veneno de serpiente (US Biochemical Corp.) en un regulador de Tris-HCl 50 mM, pH 8.5, CaCl2 72 mM, y MgCh 14 mM en un volumen final de 50 pl. Para los ensayos de nucleasa Bal31, las estabilidades de nucleasa de las moléculas de dsNA se analizan a oligonucleótido 0.1 pM utilizando 2 * 10-3 unidades/ml de nucleasa Bal31 (Boehringer Mannheim) en un regulador de Tris-HCl 20 mM, pH 7.5, NaCl 10 mM, CaCl2 5 mM, MgCh 5 mM, EDTA 5 mM (volumen final = 100 pl). Para ambos ensayos de nucleasas, se extraen alícuotas de reacción de 5 pl en los tiempos indicados, se añaden a un volumen igual de 80% de formamida que contiene colorantes de rastreo de azul de bromofenol y gel de xileno cianol, y luego se calientan durante 2 minutos a 95°C. Las alícuotas se almacenan a -20°C hasta el análisis desnaturalizando la electroforesis de poliacrilamida. La cuantificación se realiza en un PhosphorImager de Molecular Dynamics (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA). El mismo protocolo puede repetirse con extractos lisosomales y extractos endosomales para imitar la resistencia a la nucleasa de las moléculas de dsNA contra los entornos lisosomales.
Ensayo de captación celular
Los experimentos de captación celular se llevaron a cabo siguiendo los protocolos descritos en Ts'o et al., mejora específica de tipo celular y ligando específico de captación celular de oligodesoxinucleósido-metilfosfonatos unidos covalentemente con un neoglicopéptido, YEE(ah-GalNAc)s, Bioconjugate Chem. 1995, 6, 695-701.
Métodos de introducción de ácidos nucleicos, vectores y células huésped
Los agentes de DsNA de la invención pueden introducirse directamente en una célula (es decir, intracelularmente); o se introduce extracelularmente en una cavidad, espacio intersticial, en la circulación de un organismo, se introduce por vía oral, o se puede introducir bañando una célula u organismo en una solución que contiene el ácido nucleico. La circulación vascular o extravascular, el sistema sanguíneo o linfático y el líquido cefalorraquídeo son sitios donde se puede introducir el ácido nucleico.
Los agentes de DsNA de la invención pueden introducirse usando métodos de suministro de ácido nucleico conocidos en la técnica, incluida la inyección de una solución que contiene el ácido nucleico, el bombardeo por partículas cubiertas por el ácido nucleico, empapando la célula u organismo en una solución del ácido nucleíco o electroporación de membranas celulares en presencia del ácido nucleico. Se pueden usar otros métodos conocidos en la técnica para introducir ácidos nucleicos a las células, tales como transporte de vehículo mediado por lípidos, transporte mediado por productos químicos y transfección catiónica de liposomas como fosfato de calcio y similares. El ácido nucleico puede introducirse junto con otros componentes que realizan una o más de las siguientes actividades: mejorar la absorción de ácido nucleico por la célula o aumentar de otro modo la inhibición del ARN diana.
Una célula que tiene un ARN diana puede ser de la línea germinal o somática, totipotente o pluripotente, dividida o no divisoria, parénquima o epitelio, inmortalizada o transformada, o similares. La célula puede ser una célula madre o una célula diferenciada. Los tipos de células que se diferencian incluyen adipocitos, fibroblastos, miocitos, cardiomiocitos, endotelio, neuronas, glía, células sanguíneas, megacariocitos, linfocitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, basófilos, mastocitos, leucocitos, granulocitos, queratinocitos, queratinocitos, condrocitos, osteoblastos, osteoclastos, hepatocitos y células de las glándulas endocrinas o exocrinas.
Dependiendo de la secuencia de ARN diana particular y la dosis de material de agente de DsNA suministrado, este proceso puede proporcionar una pérdida de función parcial o completa para el ARN diana. Es de ejemplo una reducción o pérdida de los niveles o expresión de ARN (ya sea expresión de ARN o expresión de polipéptidos codificados) en al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 99% o más de células objetivo. La inhibición de los niveles o expresión de ARN diana se refiere a la ausencia (o disminución observable) en el nivel de proteína codificada por ARN o ARN. La especificidad se refiere a la capacidad de inhibir el ARN diana sin efectos manifiestos en otros genes de la célula. Las consecuencias de la inhibición pueden confirmarse mediante el examen de las propiedades externas de la célula u organismo (como se presenta a continuación en los ejemplos) o mediante técnicas bioquímicas como la hibridación de la solución de ARN, la protección de la nucleasa, la hibridación Northern, la transcripción inversa, la monitorización de la expresión génica con un microarreglos, unión de anticuerpos, ensayo de inmunosorción ligada a enzimas (ELISA), transferencia Western, radioinmunoensayo (RIA), otros inmunoensayos y análisis de células activadas por fluorescencia (FACS). La inhibición de la(s) secuencia(s) de ARN diana por los agentes de DsNA de la invención también se puede medir en función del efecto de la administración de dichos agentes de DsNA sobre fenotipos medibles tales como el tamaño del tumor para el tratamiento del cáncer, la carga/título viral para enfermedades infecciosas virales, etc., in vivo o in vitro. Para las enfermedades infecciosas virales, las reducciones en la carga viral o el título pueden incluir reducciones de, por ejemplo, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 99% o más, y a menudo se miden en términos logarítmicos, por ejemplo, Se puede lograr una reducción de 10 veces, 100 veces, 1000 veces, 105 veces, 106 veces, 107 veces la carga viral o título mediante la administración de los agentes de DsNA de la invención a células, un tejido o un sujeto.
Para la inhibición mediada por ARN en una línea celular u organismo completo, se puede medir la expresión de un gen informador o de resistencia a fármacos cuyo producto proteico se analiza fácilmente. Dichos genes informadores incluyen acetohidroxiácido sintasa (AHAS), fosfatasa alcalina (AP), beta galactosidasa (LacZ), beta glucoronidasa (GUS), cloranfenicol acetiltransferasa (CAT), proteína verde fluorescente (GFP), peroxidasa de rábano picante (HRP), luciferasa (Luc), nopalina sintasa (NOS), octopina sintasa (OCS) y sus derivados. Se encuentran disponibles múltiples marcadores seleccionables que confieren resistencia a la ampicilina, bleomicina, cloranfenicol, gentamicina, higromicina, kanamicina, lincomicina, metotrexato, fosfinotricina, puromicina y tetraciclina. Dependiendo del ensayo, la cuantificación de la cantidad de expresión génica permite determinar un grado de inhibición superior al 10%, 33%, 50%, 90%, 95% o 99% en comparación con una célula no tratada según la presente invención.
Dosis más bajas de material inyectado y tiempos más largos después de la administración del agente silenciador de ARN pueden dar como resultado la inhibición en una fracción más pequeña de células (por ejemplo, al menos 10%, 20%, 50%, 75%, 90% o 95% de células específicas). La cuantificación de la expresión génica en una célula puede mostrar cantidades similares de inhibición a nivel de acumulación de ARN diana o traducción de proteína objetivo. Como ejemplo, la eficacia de la inhibición puede determinarse evaluando la cantidad de producto génico en la célula; el ARN puede detectarse con una sonda de hibridación que tiene una secuencia de nucleótidos fuera de la región utilizada para el DsNA inhibidor, o el polipéptido traducido puede detectarse con un anticuerpo generado contra la secuencia de polipéptidos de esa región.
El agente de DsNA se puede introducir en una cantidad que permita la entrega de al menos una copia por celda. Dosis más altas (por ejemplo, al menos 5, 10, 100, 500 o 1000 copias por celda) de material pueden producir una inhibición más efectiva; dosis más bajas también pueden ser útiles para aplicaciones específicas.
Terapia basada en interferencia de ARN
Como se sabe, los métodos de ARNi son aplicables a una amplia variedad de genes en una amplia variedad de organismos y las composiciones y métodos descritos pueden utilizarse en cada uno de estos contextos. Ejemplos de genes que pueden ser dirigidos por las composiciones y métodos descritos incluyen genes endógenos que son genes nativos de la célula o genes que normalmente no son nativos de la célula. Sin limitación, estos genes incluyen oncogenes, genes de citoquinas, genes de proteínas idiotípicas (Id), genes de priones, genes que expresan moléculas que inducen la angiogénesis, genes para moléculas de adhesión, receptores de la superficie celular, proteínas involucradas en metástasis, proteasas, genes de apoptosis, genes de control del ciclo celular, genes que expresan EGF y el receptor de EGF, genes de resistencia a múltiples fármacos, como el gen MDR1.
Más específicamente, un ARNm objetivo de la invención puede especificar la secuencia de aminoácidos de una proteína celular (por ejemplo, una proteína nuclear, citoplasmática, transmembrana o asociada a la membrana). En otra realización, el ARNm objetivo de la invención puede especificar la secuencia de aminoácidos de una proteína extracelular (por ejemplo, una proteína de matriz extracelular o proteína secretada). Como se usa en el presente documento, la expresión "especifica la secuencia de aminoácidos" de una proteína significa que la secuencia de ARNm se traduce en la secuencia de aminoácidos de acuerdo con las reglas del código genético. Las siguientes clases de proteínas se enumeran con fines ilustrativos: proteínas de desarrollo (por ejemplo, moléculas de adhesión, inhibidores de la ciclina quinasa, miembros de la familia Wnt, miembros de la familia Pax, miembros de la familia de la hélice alada, miembros de la familia Hox, citoquinas/linfoquinas y sus receptores, crecimiento/diferenciación factores y sus receptores, neurotransmisores y sus receptores); proteínas codificadas por oncogén (por ejemplo, ABLI, BCLI, BCL2, BCL6, CBFA2, CBL, CSFIR, ERBA, ERBB, EBRB2, ETSI, ETSI, ETV6, FGR, FOS, FYN, HCR, HRAS, JUN, KRAS, LCK, LYN , MDM2, MLL, MYB, MYC, MYCLI, MYCN, NRAS, PIM I, PML, RET, SRC, TALI, TCL3 y YES); proteínas supresoras de tumores (por ejemplo, APC, BRCA1, BRCA2, MADH4, MCC, NF I, NF2, RB I, TP53 y WTI); y enzimas (por ejemplo, ACC sintasas y oxidasas, ACP desaturasas e hidroxilasas, ADP-glucosa piroforilasas, ATPasas, alcohol deshidrogenasas, amilasas, amiloglucosidasas, catalasas, celulasas, calconas sintasas, quitinasas, ciclooxigenasas, descarboxilasas, dextriinasas, ADN y ARN polimerasas, galactosidasas, glucanasas, glucosa oxidasas, almidón sintasas unidas a gránulos, GTPasas, helicasas, hernicelulasas, integrasas, inulinasas, invertasas, isomerasas, quinasas, lactasas, lipasas, lipoxigenasas, lisozimas, nopalinas sintasas, octopina sintasas, octopinas pectinesterasas, peroxidasas, fosfatasas, fosfolipasas, fosforilasas, fitasas, sintasas reguladoras del crecimiento de las plantas, poligalacturonasas, proteinasas y peptidasas, pullanasas, recombinasas, transcriptasas inversas, RUBISCO, topoisomerasas y xilanasas).
En un aspecto, la molécula de ARNm objetivo de la invención especifica la secuencia de aminoácidos de una proteína asociada con una afección patológica. Por ejemplo, la proteína puede ser una proteína asociada al patógeno (por ejemplo, una proteína viral involucrada en la inmunosupresión del huésped, la replicación del patógeno, la transmisión del patógeno o el mantenimiento de la infección), o una proteína del huésped que facilita la entrada del patógeno en el huésped, el metabolismo del fármaco por el patógeno o el huésped, la replicación o integración del genoma del patógeno, el establecimiento o la propagación de la infección en el huésped o el ensamblaje de la próxima generación de patógenos. Los patógenos incluyen virus de ARN como flavivirus, picornavirus, rabdovirus, filovirus, retrovirus, incluidos lentivirus, o virus de ADN como adenovirus, virus de la viruela, virus herpes, citomegalovirus, hepadnavirus u otros. Los patógenos adicionales incluyen bacterias, hongos, helmintos, esquistosomas y tripanosomas. Otros tipos de patógenos pueden incluir elementos transponibles de mamíferos. Alternativamente, la proteína puede ser una proteína asociada a tumor o una proteína asociada a enfermedad autoinmune.
El gen diana puede derivarse de o estar contenido en cualquier organismo. El organismo puede ser una planta, animal, protozoo, bacteria, virus u hongo. Véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 6,506,55.
El perfil de estabilidad, la faramacocinética, la capacidad de direccionamiento celular y las características de biodistribución de las moléculas de dsNA se evalúan mediante métodos adecuados conocidos en la técnica que incluyen, pero no se limitan a, métodos basados en los protocolos enseñados por Rice et al. (In vivo targeting function of N-linked oligosaccharides with terminating galactose and N-acetylgalactosamine residues, Chiu MH, Tamura T, Wadhwa MS, Rice KG, J Biol Chem. 1994 10 de junio; 269 (23): 16195-202). 125I (yoduro de sodio), Sephadex G-10, cloramina T, metabisulfito de sodio, heparina, BSA, HEPES, colagenasa, clorhidrato de ketamina, hidrocloruro de xilazina y ratones ICR se obtienen todos de proveedores comerciales.
Radiomarcación de moléculas de dsNA
Las moléculas de dsNA de la invención conjugadas con ligandos como GalNac, colesterol, folato o manosa-6-fosfato se marcan con 125I usando los procedimientos descritos por Rice et al. Los dsNAs radioyodados se someten a cromatografía en una columna SephadexG-10 (0.8 x 25 cm) y se eluyen con cloruro de sodio 0.15 M (pH 7.0) y se recogen en fracciones de 0.5 ml. La pureza de cada dsNA yodado que comprende, por ejemplo, un ligando GalNac se analiza detectando 1 pl (2 nCi) en el origen de una placa de cromatografía de capa fina (TLC) desarrollada con acetato de etilo: ácido acético:piridina:agua en una proporción optimizado para cada dsNA. La densitometría cuantitativa se realiza en un Phosphor Imager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) después de una exposición radiográfica automática de 12 horas a temperatura ambiente. El software ImageQuant (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) se utiliza para integrar la traza de densitometría y establecer >95% de pureza para cada oligonucleótido yodado.
Ensayo de estabilidad in vitro para moléculas de dsNA
Cada oligosacárido radioyodado (1.5 pl, 75 nCi) se agrega a 100 pl de sangre de ratón entera heparinizada y se incuba a 37°C. Los puntos de tiempo (10 pl) se eliminan a los 10, 20 y 30 min y 1, 2, 3, 4, 5 y 6 h, y se analizan usando TLC y autorradiografía cuantitativa como se describió anteriormente.
Análisis farmacocinético
La farmacocinética de los dsNA se realiza en tres a cuatro ratones. Los ratones se anestesian y se realiza una doble canalización de la vena yugular. Los dsNAs con ligandos GalNAc se dosifican en la vena izquierda mientras que los puntos de tiempo de sangre se toman a 1, 3, 6, 10, 15, 20, 30, 40 y 60 min de la vena derecha. Los puntos de tiempo en sangre en serie se analizan mediante recuento directo de y, después de lo cual, el dsNA se extrae de la sangre al agregar 60 pl de agua y 200 pl de acetonitrilo. Las proteínas se precipitan por centrifugación durante 10 min (13.000 x g)
Ec. 1 C'b = Ae-at Be-|M
y el sedimento se lava dos veces con 50 pl de acetonitrilo al 80% v/v, lo que da como resultado la recuperación del 80% de la radiactividad. Los extractos se combinan y se evaporan a sequedad en un Centra-Vap a presión reducida y se reconstituyen en 3 |jl de agua. Cada punto de tiempo se analiza colocando 1 |jl en una placa de TLC que luego se desarrolla y se radiografía automáticamente como se describió anteriormente. Los parámetros farmacocinéticos se derivan de los recuentos sanguíneos directos versus el tiempo para los conjuntos de datos por triplicado de cada oligosacárido y luego se promedian para obtener la desviación media y estándar. Los ajustes de mínimos cuadrados iterativos no lineales para conjuntos de datos individuales se obtienen con PCNONLIN (SCI Software, Lexington, KY) utilizando un modelo abierto de dos compartimentos descrito por la ecuación integrada 1:
Cb es la concentración de oligosacárido en la sangre. A y B son constantes, y a y p son constantes híbridas de primer orden que caracterizan las pendientes de las fases de disminución rápida y lenta en un perfil de concentración plasmática versus tiempo. El tiempo medio de residencia (MRT) se calcula de acuerdo con la ecuación 2:
Figure imgf000057_0001
El tiempo medio de residencia (MRT) es el tiempo promedio que el oligosacárido estuvo en el ratón (Riegelman and Collier, J. Pharmacokinet. BioPharm. 8,509-534,1980). El aclaramiento corporal total (Cltb) se calcula utilizando la ecuación 3 y el volumen de distribución en estado estacionario (Vdss) se calcula de acuerdo con la ecuación 4 (Benet and Galeazzi, J.Pharm.Sci, 68, 1071-1074, 1979).
Figure imgf000057_0002
Autorradiografía de cuerpo entero
La orientación y/o biodistribución de un dsNA de la invención se determina mediante métodos adecuados conocidos en la técnica, que incluyen los métodos descritos a continuación.
Los ratones son anestesiados por vía intraperitoneal. inyección de clorhidrato de ketamina (100 mg/kg) y clorhidrato de xilazina (10 mg/kg). Se inserta un único catéter silástico en la vena yugular derecha y se administra una dosis intravenosa en bolo de dsNA radiomarcado con ligando GalNAc (0 j l, 7 jC i, en solución salina) después de lo cual se extrae el catéter y se liga la vena. Después de 30 minutos, los ratones se sacrifican mediante inyección letal de fenobarbital (100 mg/kg). Inmediatamente después del sacrificio, los ratones se sumergen en un baño de hielo seco con hexano (-70°C) durante 5 minutos y se montan en un bloque de carboximetilcelulosa al 4% (p/v) que luego se enfría a -20°C. Se cortan secciones longitudinales de 25 jm cerca de la línea media de los ratones a una temperatura de -15°C en un criomicrótomo (LKB 2250, Suecia). Las secciones se recogen en cinta adhesiva (Scotch 810, 3M Co., Minneapolis, MN), se deshidratan a -15°C durante 24 h, y luego se autorradiografían durante 48 h usando un Phosphor Imager.
Ensayo de biodistribución de dsNA
Los ratones se anestesian, como se describe anteriormente, seguido de la inserción de una única cánula en la vena yugular derecha. El dsNA (15 jl, 2 jC i, en solución salina) se dosifica por vía intravenosa y se permite la biodistribución 30 minutos después de lo cual los ratones se sacrifican por dislocación cervical. Los órganos principales (hígado, pulmones, bazo, estómago, riñones, corazón, intestino grueso e intestino delgado) se recolectaron, se enjuagaron con solución salina y se midieron mediante recuento y directo para la radiactividad total. El nivel de radioactividad indica las áreas de distribución y permite determinar qué tejidos se están enriqueciendo para la molécula de dsNA.
Direccionamiento celular y administración
Se selecciona un tiempo de biodistribución óptimo basado en el ensayo descrito anteriormente para analizar la inyección de moléculas de dsNA. El análisis radiográfico automático de cuerpo entero permite la detección de todos los tejidos para identificar los principales sitios de biodistribución. El recuento y directo de los tejidos disecados se utiliza para confirmar los resultados observados por la autorradiografía de cuerpo entero. El análisis cuantitativo de biodistribución se utiliza para determinar las eficiencias de las moléculas de dsNA con ligandos GalNac. El objetivo celular de los dsNA se establece a partir de la proporción de la dosis radiactiva en las células hepáticas no parenquimales y parenquimatosas.
Ensayos de afinidad de unión:
La afinidad de unión se mide a través de varios métodos bien establecidos en la técnica. Uno de los métodos para medir la afinidad de unión es mediante la polarización de fluorescencia como se muestra en el Ejemplo 20. Seth et al enseñan otro método que también se usa (Targeted delivery of antisense oligonucleotides to hepatocytes using triantennary N-acetyl galactosamine improves potency 10-fold in mice, Nucleic Acids Res.2014 julio; 42(13): 8796­ 807).
La desialilación y el marcado con 125I de la glucoproteína ácida a l (AGP) para el ensayo de competición en hepatocitos primarios de ratón (100 nmol AGP) se incuban en regulador de acetato de sodio 50 mM (pH 5) con 1 U de neuraminidasa-agarosa durante 16 h a 37°C. La desialilación se confirma por ensayo de ácido siálico o por cromatografía de exclusión por tamaño (SEC). La yodación con monocloruro de yodo se logra según lo descrito por Atsma et al (Atsma D.E., Kempen H.J., Nieuwenhuizen W., van 't Hooft, F.M., Pauwels E.K., Partial characterization of low density lipoprotein preparations isolated from fresh and frozen plasma after radiolabeling by seven different methods, J. Lipid Res. 1991; 32: 173-181). Se agrega un mililitro de glicoproteína ácida a1 desialilada (de-AGP, 1 mg/ml) y 0.2 ml de glicina 1-M en NaOH 0.25 M (pH 10) a una mezcla de solución de cloruro de yodo 10-MM (7 pl/mg proteína), Na125I (2.5 pl/mg de proteína) y glicina 1 M en NaOH 0.25 M (25 pl/mg de proteína). Después de la incubación durante 10 minutos a temperatura ambiente, el de-AGP marcado con 1251 se separa del 1251 libre concentrando la mezcla dos veces utilizando una columna de centrifugación MWCO de 3 kDa. Se prueba la eficacia y la pureza del etiquetado de la proteína en un sistema HPLC equipado con una columna Agilent SEC-3 (7.8 * 300 mm) y un contador de p-RAM.
Los experimentos de competición que utilizan de-AGP y dsNA marcados con 125I con ligandos de GalNAc se realizan como sigue: los hepatocitos de ratón recién aislados (106 células/ml) se colocan en placas de seis pocillos en 2 ml de medio de crecimiento apropiado. Los hepatocitos primarios se cultivan en medios de William que contienen 10% de suero bovino fetal (FBS), 1 * aminoácidos no esenciales y 1 * piruvato de sodio. Las células se incuban 16-20 h a 37°C con 5 y 10% de CO2, respectivamente. Las células se lavan luego con medios sin FBS antes del experimento. Las células se incuban durante 30 minutos a 37°C con una mezcla de competición de 1 ml que contiene medios de crecimiento apropiados con FBS al 2%, 10-8 M marcado con 1251 de-AGP y dsNA que contienen GalNAc a concentraciones que varían de 10-11 a 10-5 M. La unión no específica se determina en presencia de azúcar GalNAc 10-2 M. Las células se lavan dos veces con medios sin FBS para eliminar de-AGP sin unir con etiqueta 1251 y el competidor GalNAc -dsNA. Las células se someten a lisis usando el regulador RLT de Qiagen que contiene 1% de pmercaptoetanol. Los lisados se transfieren a tubos de ensayo de fondo redondo después de un breve ciclo de congelación/descongelación de 10 minutos y se analizan en un contador y. La unión no específica se resta antes de dividir 1251 recuentos de proteínas por el valor de los recuentos de concentración más bajos de GalNAc-dsNA. Las curvas de inhibición se ajustan de acuerdo con una ecuación de unión de competencia de sitio único utilizando un algoritmo de regresión no lineal.
Ensayo de inmunogenicidad
Los dobles de ARNsi sintéticos pueden inducir altos niveles de citoquinas inflamatorias e interferones de tipo I, en particular interferón-a, después de la administración sistémica en mamíferos y en cultivos primarios de células sanguíneas humanas. Los niveles de inmunogenicidad se determinan midiendo la cantidad de interferón-a antes y después de que las moléculas de dsNA de interés a concentraciones variables se administran como se describió anteriormente. Se usa Synthetic Poly (I:C) (Sigma-Aldrich) para inducir una respuesta inmune en PBMC como control positivo. Después de 24 horas de incubación, los sobrenadantes de cultivo se recogen y se analizan para determinar INF-a mediante un ELISA en sándwich (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del proveedor.
Composiciones Farmacéuticas
En ciertas realizaciones, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende el agente DsNA de la presente invención. La muestra del agente dsNA puede formularse e introducirse adecuadamente en el entorno de la célula por cualquier medio que permita que una porción suficiente de la muestra ingrese a la célula para inducir el silenciamiento génico, si es que ocurre. Muchas formulaciones para dsNA son conocidas en la técnica y se pueden usar siempre que el dsNA ingrese a las células objetivo para que pueda actuar. Véanse, por ejemplo, las solicitudes de patente publicadas en los Estados Unidos Nos. 2004/0203145 A1 y 2005/0054598 A1. Por ejemplo, el agente de DsNA de la presente invención puede formularse en soluciones regulador tales como soluciones salinas reguladas con fosfato, liposomas, estructuras micelares y cápsidas. Las formulaciones del agente DsNA con lípidos catiónicos se pueden usar para facilitar la transfección del agente DsNA en las células. Por ejemplo, pueden usarse lípidos catiónicos, tales como lipofectina (Patente de los Estados Unidos No. 5,705,188), derivados de glicerol catiónicos y moléculas policatiónicas, tales como polilisina (solicitud internacional PCT publicada WO 97/30731). Los lípidos adecuados incluyen Oligofectamina, Lipofectamina (Life Technologies), NC388 (Ribozyme Pharmaceuticals, Inc., Boulder, Colo.) o FuGene 6 (Roche), todos los cuales pueden usarse de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Dichas composiciones incluyen típicamente la molécula de ácido nucleico y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se usa en el presente documento, la expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye solución salina, disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción, y similares, compatibles con la administración farmacéutica. Los compuestos activos suplementarios también se pueden incorporar en las composiciones.
Una composición farmacéutica está formulada para ser compatible con su ruta de administración prevista. Ejemplos de vías de administración incluyen la administración parenteral, por ejemplo, intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral (por ejemplo, inhalación), transdérmica (tópica), transmucosa y rectal. Las soluciones o suspensiones utilizadas para la aplicación parenteral, intradérmica o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros solventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o metilparabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético; tampones como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad como cloruro de sodio o dextrosa. El pH se puede ajustar con ácidos o bases, como el ácido clorhídrico o el hidróxido de sodio. La preparación parenteral puede encerrarse en ampollas, jeringas desechables o viales de dosis múltiples de vidrio o plástico.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (donde son solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. Para la administración intravenosa, los portadores adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, N.J.) o solución salina regulada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debe ser estéril y debe ser fluida en la medida en que exista una fácil aplicación con jeringa. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe preservarse contra la acción contaminante de microorganismos como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. Se puede mantener la fluidez adecuada, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento como la lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de los microorganismos se puede lograr mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol y cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede lograrse incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de esterilización filtrada. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril, que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son el secado al vacío y la liofilización que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución previamente filtrada estéril del mismo.
Las composiciones orales generalmente incluyen un diluyente inerte o un vehículo comestible. Para el propósito de la administración terapéutica oral, el compuesto activo puede incorporarse con excipientes y usarse en forma de tabletas, pastillas o cápsulas, por ejemplo, cápsulas de gelatina. Las composiciones orales también se pueden preparar usando un vehículo fluido para usar como enjuague bucal. Los agentes de unión farmacéuticamente compatibles y/o los materiales adyuvantes pueden incluirse como parte de la composición. Las tabletas, píldoras, cápsulas, pastillas y similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes, o compuestos de naturaleza similar: un aglutinante tal como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidón o lactosa, un agente desintegrante tal como ácido algínico, primogel o almidón de maíz; un lubricante tal como estearato de magnesio o Sterotes; un deslizante tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sacarosa o sacarina; o un agente aromatizante como menta, salicilato de metilo o aroma de naranja.
Para la administración por inhalación, los compuestos se administran en forma de aerosol desde un recipiente o dispensador presurizado que contiene un propulsor adecuado (por ejemplo, un gas tal como dióxido de carbono o un nebulizador). Dichos métodos incluyen los descritos en la Patente de los Estados Unidos No. 6,468,798.
La administración sistémica también puede ser por medios transmucosa o transdérmicos. Para la administración transmucosa o transdérmica, se usan en la formulación agentes de penetración apropiados para la barrera que se va a atravesar. Tales agentes de penetración son generalmente conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, para administración transmucosa, detergentes, sales biliares y derivados de ácido fusídico. La administración transmucosa se puede lograr mediante el uso de aerosoles nasales o supositorios. Para la administración transdérmica, los compuestos activos se formulan en pomadas, ungüentos, geles o cremas como se conoce generalmente en la técnica.
Los compuestos también se pueden preparar en forma de supositorios (por ejemplo, con bases de supositorios convencionales tales como manteca de cacao y otros glicéridos) o enemas de retención para el suministro rectal.
Los compuestos también se pueden administrar portransfección o infección usando métodos conocidos en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a, los métodos descritos en McCaffrey et al. (2002), Nature, 418(6893), 38-9 (transfección hidrodinámica); Xia et al. (2002), Nature Biotechnol., 20(10), 1006-10 (suministro mediado por virus); o Putnam (1996), Am. J. Health Syst. Pharm 53(2), 151-160, erratum at Am. J. Health Syst. Pharm 53(3), 325 (1996).
Los compuestos también pueden administrarse por cualquier método adecuado para la administración de agentes de ácidos nucleicos, tal como una vacuna de ADN. Estos métodos incluyen pistolas de genes, bioinyectores y parches para la piel, así como métodos sin agujas, como la tecnología de vacuna por micropartículas de ADN descrita en la Patente de los Estados Unidos No. 6,194,389, y la vacuna transdérmica sin aguja para mamíferos con vacuna en forma de polvo como se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 6,168,587. Además, la administración intranasal es posible, como se describe, entre otros, en Hamajima et al. (1998), Clin. Immunol Immunopathol., 88(2), 205-10. También se pueden usar liposomas (por ejemplo, como se describe en la Patente de los Estados Unidos No.
6,472,375) y microencapsulación. También se pueden usar sistemas de suministro de micropartículas dirigibles biodegradables (por ejemplo, como se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 6,471,996).
En una realización, los compuestos activos se preparan con vehículos que protegerán el compuesto contra la eliminación rápida del cuerpo, como una formulación de liberación controlada, que incluye implantes y sistemas de administración microencapsulados. Se pueden usar polímeros biodegradables y biocompatibles, tales como acetato de etileno y vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Dichas formulaciones pueden prepararse usando técnicas estándar. Los materiales también se pueden obtener comercialmente de Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. Las suspensiones liposomales (incluidos los liposomas dirigidos a células infectadas con anticuerpos monoclonales contra antígenos virales) también se pueden usar como vehículos farmacéuticamente aceptables. Estos pueden prepararse de acuerdo con métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, como se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 4,522,811.
La toxicidad y la eficacia terapéutica de tales compuestos pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, para determinar la DL50 (la dosis letal para el 50% de la población) y la ED50 (la dosis terapéuticamente efectiva en 50% de la población). La relación de dosis entre los efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico y puede expresarse como la relación LD50/ED50. Se prefieren los compuestos que exhiben altos índices terapéuticos. Si bien se pueden usar compuestos que exhiben efectos secundarios tóxicos, se debe tener cuidado al diseñar un sistema de administración que dirija dichos compuestos al sitio del tejido afectado para minimizar el daño potencial a las células no infectadas y, por lo tanto, reducir los efectos secundarios.
Los datos obtenidos de los ensayos de cultivo celular y estudios en animales pueden usarse para formular un rango de dosificación para uso en humanos. La dosificación de tales compuestos se encuentra preferiblemente dentro de un rango de concentraciones circulantes que incluyen la DE50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este rango dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. Para cualquier compuesto utilizado, la dosis terapéuticamente efectiva se puede estimar inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Se puede formular una dosis en modelos animales para lograr un rango de concentración plasmática circulante que incluya la IC50 (es decir, la concentración del compuesto de prueba que logra una inhibición de síntomas medio máxima) como se determina en el cultivo celular. Dicha información se puede utilizar para determinar con mayor precisión las dosis útiles en humanos. Los niveles en plasma pueden medirse, por ejemplo, mediante cromatografía líquida de alta resolución.
Como se define en el presente documento, una cantidad terapéuticamente efectiva de una molécula de ácido nucleico (es decir, una dosificación efectiva) depende del ácido nucleico seleccionado. Por ejemplo, si se selecciona un plásmido que codifica un agente de DsNA, se pueden administrar cantidades de dosis únicas en el intervalo de aproximadamente 1 pg a 1000 mg; en algunas realizaciones, se pueden administrar 10, 30, 100 o 1000 pg, o 10, 30, 100 o 1000 ng, o 10, 30, 100, o 1000 pg, o 10, 30, 100, o 1000 mg. En algunas ealizaciones, se pueden administrar 1-5 g de las composiciones. Las composiciones se pueden administrar de una o más veces por día a una o más veces por semana; incluyendo una vez cada dos días. El experto en la materia apreciará que ciertos factores pueden influir en la dosis y el tiempo necesarios para tratar eficazmente a un sujeto, incluidos, entre otros, la gravedad de la enfermedad o trastorno, los tratamientos previos, la salud general y/o la edad del sujeto, y otras enfermedades presentes. Además, el tratamiento de un sujeto con una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína, polipéptido o anticuerpo puede incluir un tratamiento único o, preferiblemente, puede incluir una serie de tratamientos.
Se puede apreciar que el método de introducción de agentes de DsNA en el entorno de la célula dependerá del tipo de célula y la composición de su entorno. Por ejemplo, cuando las células se encuentran dentro de un líquido, una formulación preferible es con una formulación lipídica como en la lipofectamina y los agentes de DsNA se pueden agregar directamente al ambiente líquido de las células. Las formulaciones de lípidos también pueden administrarse a animales tales como por inyección intravenosa, intramuscular o intraperitoneal, o por vía oral o por inhalación u otros métodos como se conocen en la técnica. Cuando la formulación es adecuada para la administración en animales tales como mamíferos y más específicamente humanos, la formulación también es farmacéuticamente aceptable. Las formulaciones farmacéuticamente aceptables para administrar oligonucleótidos son conocidas y pueden usarse. En algunos casos, puede ser preferible formular agentes de DsNA en un regulador o solución salina e inyectar directamente los agentes de DsNA formulados en las células, como en los estudios con ovocitos. También se puede hacer la inyección directa de agentes DsNA doble. Para métodos adecuados de introducción de dsNA (por ejemplo, agentes de DsNA), hágase referencia a la solicitud de Patente Publicada de los Estados Unidos 2004/0203145 A1.
Deben introducirse cantidades adecuadas de un agente de DsNA y estas cantidades pueden determinarse empíricamente usando métodos estándar. Típicamente, las concentraciones efectivas de especies de agentes de DsNA individuales en el entorno de una célula serán de aproximadamente 50 nanomolar o menos, 10 nanomolar o menos, o composiciones en las que se pueden usar concentraciones de aproximadamente 1 nanomolar o menos. En otra realización, los métodos que utilizan una concentración de aproximadamente 200 picomolar o menos, e incluso una concentración de aproximadamente 50 picomolar o menos, aproximadamente 20 picomolar o menos, aproximadamente 10 picomolar o menos, o aproximadamente 5 picomolar o menos pueden usarse en muchas circunstancias.
El método puede llevarse a cabo mediante la adición de las composiciones de agente de DsNA a cualquier matriz extracelular en la que las células puedan vivir, siempre que la composición del agente de DsNA esté formulada de manera que una cantidad suficiente del agente de DsNA pueda entrar en la célula para ejercer su efecto. Por ejemplo, el método se puede usar con células presentes en un líquido, como un cultivo líquido o medio de crecimiento celular, en explantes de tejidos o en organismos completos, incluidos animales, como mamíferos y especialmente humanos.
El nivel o actividad de un ARN diana puede determinarse mediante cualquier método adecuado ahora conocido en la técnica o que se desarrolle más tarde. Se puede apreciar que el método utilizado para medir un ARN diana y/o la expresión de un ARN diana puede depender de la naturaleza del ARN diana. Por ejemplo, si el ARN diana codifica una proteína, el término "expresión" puede referirse a una proteína o al ARN/transcripción derivado del ARN diana. En tales casos, la expresión de un ARN diana puede determinarse midiendo la cantidad de ARN correspondiente al ARN diana o midiendo la cantidad de esa proteína. La proteína se puede medir en ensayos de proteínas, como por tinción o inmunotransferencia o, si la proteína cataliza una reacción que se puede medir, midiendo las velocidades de reacción. Todos estos métodos son conocidos en la técnica y pueden usarse. Cuando se deben medir los niveles de ARN diana, se puede usar cualquier método reconocido en la técnica para detectar niveles de ARN (por ejemplo, RT-PCR, inmunotransferencia Northern, etc.). Al dirigirse a los ARN virales con los agentes DsNA de la presente invención, también se anticipa que la medición de la eficacia de un agente DsNA para reducir los niveles de un virus objetivo en un sujeto, tejido, células, in vitro o in vivo, o en extractos celulares, también se puede usar para determinar el grado de reducción de los niveles de ARN viral objetivo. Cualquiera de las mediciones anteriores se puede realizar en células, extractos celulares, tejidos, extractos de tejidos o cualquier otro material fuente adecuado.
La determinación de si la expresión de un ARN diana se ha reducido puede hacerse mediante cualquier método adecuado que pueda detectar de manera confiable los cambios en los niveles de ARN. Típicamente, la determinación se realiza mediante la introducción en el entorno de un DsNA celular no digerido de manera que al menos una parte de ese agente de DsNA ingrese al citoplasma y luego mida el nivel del ARN diana. Se realiza la misma medición en células idénticas no tratadas y se comparan los resultados obtenidos de cada medición.
El agente de DsNA puede formularse como una composición farmacéutica que comprende una cantidad farmacológicamente eficaz de un agente de DsNA y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Una cantidad farmacológica o terapéuticamente efectiva se refiere a la cantidad de un agente de DsNA eficaz para producir el resultado farmacológico, terapéutico o preventivo deseado. Las expresiones "cantidad farmacológicamente efectiva" y "cantidad terapéuticamente efectiva" o simplemente "cantidad efectiva" se refieren a esa cantidad de ARN eficaz para producir el resultado farmacológico, terapéutico o preventivo deseado. Por ejemplo, si un tratamiento clínico dado se considera efectivo cuando hay al menos una reducción del 20% en un parámetro medible asociado con una enfermedad o trastorno, una cantidad terapéuticamente efectiva de un medicamento para el tratamiento de esa enfermedad o trastorno es la cantidad necesaria para efectuar al menos una reducción del 20% en ese parámetro.
Las composiciones farmacéuticas adecuadamente formuladas de esta invención pueden administrarse por cualquier medio conocido en la técnica, tal como por vías parenterales, que incluyen administración intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, subcutánea, transdérmica, vía aérea (aerosol), rectal, vaginal y tópica (incluyendo bucal y sublingual). En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas se administran por infusión o inyección intravenosa o intraparenteral.
En general, una unidad de dosificación adecuada de dsNA estará en el rango de 0.001 a 0.25 miligramos por kilogramo de peso corporal del receptor por día, o en el rango de 0.01 a 20 microgramos por kilogramo de peso corporal por día, o en el rango de 0.01 a 10 microgramos por kilogramo de peso corporal por día, o en el rango de 0.10 a 5 microgramos por kilogramo de peso corporal por día, o en el rango de 0.1 a 2.5 microgramos por kilogramo de peso corporal por día. La composición farmacéutica que comprende el dsNA se puede administrar una vez al día. Sin embargo, el agente terapéutico también puede dosificarse en unidades de dosificación que contienen dos, tres, cuatro, cinco, seis o más subdosis administradas a intervalos apropiados durante todo el día. En ese caso, el dsNA contenido en cada subdosis debe ser correspondientemente más pequeño para lograr la unidad de dosificación diaria total. La unidad de dosificación también se puede combinar para una dosis única durante varios días, por ejemplo, usando una formulación convencional de liberación sostenida que proporciona una liberación sostenida y consistente del dsNA durante un período de varios días. Las formulaciones de liberación sostenida son bien conocidas en la técnica. En esta realización, la unidad de dosificación contiene un múltiplo correspondiente de la dosis diaria. Independientemente de la formulación, la composición farmacéutica debe contener dsNA en una cantidad suficiente para inhibir la expresión del gen diana en el animal o ser humano tratado. La composición puede combinarse de tal manera que las sumas de las múltiples unidades de dsNA juntas contengan una dosis suficiente.
Se pueden obtener datos de ensayos de cultivo celular y estudios en animales para formular un rango de dosificación adecuado para humanos. La dosificación de las composiciones de la invención se encuentra dentro de un rango de concentraciones circulantes que incluyen la DE50 (según lo determinado por métodos conocidos) con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este rango dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. Para cualquier compuesto utilizado, la dosis terapéuticamente efectiva se puede estimar inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Se puede formular una dosis en modelos animales para lograr un rango de concentración en plasma circulante del compuesto que incluye la IC50 (es decir, la concentración del compuesto de prueba que logra una inhibición de síntomas medio máxima) como se determina en el cultivo celular. Dicha información se puede utilizar para determinar con mayor precisión las dosis útiles en humanos. Los niveles de dsNA en plasma pueden medirse mediante métodos estándar, por ejemplo, mediante cromatografía líquida de alta resolución.
Las composiciones farmacéuticas pueden incluirse en un kit, contenedor, paquete o dispensador junto con instrucciones para la administración.
Métodos de tratamiento
La presente divulgación proporciona métodos tanto profilácticos como terapéuticos para tratar a un sujeto en riesgo de (o susceptible a) una enfermedad o trastorno causado, en todo o en parte, por la expresión de un ARN diana y/o la presencia de dicho ARN diana (por ejemplo, en el contexto de una infección viral, la presencia de un ARN diana del genoma viral, cápside, componente de la célula huésped, etc.).
"Tratamiento", o "tratar" como se usa en el presente documento, se define como la aplicación o administración de un agente terapéutico (por ejemplo, un agente DsNA o vector o transgén que lo codifica) a un paciente, o la aplicación o administración de un agente terapéutico agente a un tejido aislado o línea celular de un paciente, que tiene la enfermedad o trastorno, un síntoma de enfermedad o trastorno o una predisposición a una enfermedad o trastorno, con el propósito de curar, sanar, aliviar, atenuar, alterar, remediar, recuperar, mejorar o afectar la enfermedad o trastorno, los síntomas de la enfermedad o trastorno, o la predisposición a la enfermedad.
En un aspecto, la divulgación proporciona un método para prevenir en un sujeto, una enfermedad o trastorno como se describe anteriormente, administrando al sujeto un agente terapéutico (por ejemplo, un agente DsNA o vector o transgén que lo codifica). Los sujetos en riesgo de contraer la enfermedad pueden identificarse mediante, por ejemplo, cualquiera o una combinación de ensayos de diagnóstico o pronóstico como se describe en este documento. La administración de un agente profiláctico puede ocurrir antes de la detección de, por ejemplo, partículas virales en un sujeto, o la manifestación de síntomas característicos de la enfermedad o trastorno, de modo que la enfermedad o trastorno se prevenga o, alternativamente, se retrase su progresión.
Otro aspecto de la divulgación se refiere a métodos de tratamiento terapéutico de los sujetos, es decir, alterar la aparición de síntomas de la enfermedad o trastorno. Estos métodos pueden realizarse in vitro (por ejemplo, cultivando la célula con el agente DsNA) o, alternativamente, in vivo (por ejemplo, administrando el agente DsNA a un sujeto).
Con respecto a los métodos de tratamiento tanto profilácticos como terapéuticos, dichos tratamientos pueden adaptarse o modificarse específicamente, en base al conocimiento obtenido en el campo de la farmacogenómica. "Farmacogenómica", como se usa en el presente documento, se refiere a la aplicación de tecnologías genómicas tales como secuenciación génica, genética estadística y análisis de expresión génica a fármacos en desarrollo clínico y en el mercado. Más específicamente, el término se refiere al estudio de cómo los genes de un paciente determinan su respuesta a un medicamento (por ejemplo, el "fenotipo de respuesta al medicamento" o "genotipo de respuesta al medicamento"). Por lo tanto, otro aspecto de la divulgación proporciona métodos para adaptar el tratamiento profiláctico o terapéutico de un individuo con las moléculas de ARN diana de la presente invención o con moduladores de ARN diana de acuerdo con el genotipo de respuesta al fármaco de ese individuo. La farmacogenómica permite a un doctor o médico dirigir tratamientos profilácticos o terapéuticos a los pacientes que se beneficiarán más del tratamiento y evitar el tratamiento de pacientes que experimentarán efectos secundarios tóxicos relacionados con los medicamentos.
Los agentes terapéuticos pueden ensayarse en un modelo animal apropiado. Por ejemplo, un agente DsNA (o vector de expresión o transgén que lo codifica) como se describe en el presente documento puede usarse en un modelo animal para determinar la eficacia, toxicidad o efectos secundarios del tratamiento con dicho agente. Alternativamente, se puede usar un agente terapéutico en un modelo animal para determinar el mecanismo de acción de dicho agente. Por ejemplo, un agente puede usarse en un modelo animal para determinar la eficacia, la toxicidad o los efectos secundarios del tratamiento con dicho agente. Alternativamente, se puede usar un agente en un modelo animal para determinar el mecanismo de acción de dicho agente.
La práctica de la presente invención emplea, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de química, biología molecular, microbiología, ADN recombinante, genética, inmunología, biología celular, cultivo celular y biología transgénica, que están dentro de la habilidad de la técnica. Véase, por ejemplo, Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.); Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, 2nd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.); Sambrook y Russell, 2001, Molecular Cloning, 3rd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.); Ausubel et al., 1992), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, incluidas actualizaciones periódicas); Glover, 1985, DNA Cloning (IRL Press, Oxford); Anand, 1992; Guthrie and Fink, 1991; Harlow and Lane, 1988, Antibodies (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.); Jakoby and Pastan, 1979; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames and S. J. Higgins eds. 1984); Transcription and Translation (B. D. Hames and S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); el tratado, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986); Riott, Essential Immunology, 6th Edition, Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1988; Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986); Westerfield, M., The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio), (4th Ed., Univ. of Oregon Press, Eugene, 2000).
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende un experto en la materia a la que pertenece esta invención.
La presente invención se ilustra con referencia a los siguientes ejemplos, que proporcionan información tanto sobre los constructos de la invención como se reivindica ahora como sobre los constructos comparativos.
Ejemplos
Ejemplo 1 Métodos de síntesis
Síntesis de oligonucleótidos, uso in vitro e in vivo
Se sintetizaron hebras de ARN individuales y se purificaron por HPLC según métodos estándar (Integrated DNA Technologies, Coralville, Iowa). Todos los oligonucleótidos se liberaron mediante control de calidad sobre la base de la pureza química mediante análisis HPLC y la pureza de la hebra completa mediante análisis de espectrometría de masas. Los DsNA de ARN doble se prepararon antes de su uso mezclando cantidades iguales de cada hebra, calentando brevemente a 100°C en regulador de ARN (IDT) y luego permitiendo que las mezclas se enfriaran a temperatura ambiente.
Cultivo celular y transfección de ARN
Se obtuvieron células HeLa de ATCC y se mantuvieron en medio Eagle modificado de Dulbecco (HyClone) suplementado con suero bovino fetal al 10% (HyClone) a 37°C bajo 5% de CO2. Para las transfecciones de ARN de las figuras 7, 9, 12 y 13, las células HeLa se transfectaron con DsNA como se indica a una concentración final de 0.1 nM usando Lipofectamine™ IARNMAX (Invitrogen) y siguiendo las instrucciones del fabricante. En resumen, se mezclaron 2.54 de una solución madre 0.0204 de cada DsNA con 46.54, de Opti-MEM I (Invitrogen) y 14, de Lipofectamine™ IARNMAX. La mezcla 504 resultante se añadió a pocillos individuales de placas de 12 pocillos y se incubó durante 20 minutos a temperatura ambiente para permitir que se formaran los complejos de ARNMAX DsNA:Lipofectamine™. Mientras tanto, las células HeLa se tripsinizaron y se resuspendieron en medio a una concentración final de 367 células/pL. Finalmente, se añadieron 4504 de la suspensión celular a cada pocillo (volumen final 500 pl) y las placas se colocaron en la incubadora durante 24 horas.
Aislamiento y análisis de ARN, in vitro
Las células se lavaron una vez con 2 ml de PBS, y el ARN total se extrajo usando RNeasy Mini Kit™ (Qiagen) y se eluyó en un volumen final de 30 pL. Se realizó transcripción reversa a 1 pg de ARN total usando Transcriptor 1st Strand cDNA Kit™ (Roche) y hexámeros aleatorios siguiendo las instrucciones del fabricante. Una trigésima parte (0.66 pL) del ADNc resultante se mezcló con 54, de iQ™ Multiplex Powermix (Bio-Rad) junto con 3.334, de H2O y 14, de una mezcla 304 que contenía 2 conjuntos de cebadores y sondas específicas para genes humanos Genes HPRT-1 (número de acceso NM-000194) y s Fr S9 (número de acceso NM-003769):
(SEQ ID NO:1) Hu HPRT cebador de avance F517 GACTTTGCTTTCCTTGGTCAG
(SEQ ID NO:2) Hu HPRT cebador reverso R591 GGCTTATATCCAACACTTCGTGGG
(SEQ ID NO:3) Hu HPRT sonda P554 Cy5-ATGGTCAAGGTCGCAAGCTTGCTGGT-IBFQ
(SEQ ID NO:4) Hu SFRS9 cebador de avance F569 TGTGCAGAAGGATGGAGT
(SEQ ID NO:5) Hu SFRS9 cebador reverso R712 CTGGTGCTTCTCTCAGGATA
(SEQ ID NO:6) Hu SFRS9 sonda P644 HEX-TGGAATATGCCCTGCGTAAACTGGA-IBFQ
Preparación e inyección de muestras in vivo
El DsNA se formuló en Invivofectamine™ de acuerdo con el protocolo del fabricante (Invitrogen, Carlsbad, CA). En resumen, se determinó el grupo N/ratones y el peso corporal de los ratones utilizados, luego se calculó la cantidad de DsNA necesaria para cada grupo de ratones tratados. Un ml de FIV-oligo fue suficiente para 4 ratones de 25 g/ratón con una dosis de 10 mg/kg. Se añadió un mg de DsNA a un ml de Invivofectamine™, y se mezcló a temperatura ambiente durante 30 minutos en un rotador. Se usaron 14 ml de glucosa al 5% para diluir IVF-DsNA formulado y se aplicó a concentradores por rotación de corte de peso molecular de 50 kDa (Amicon). Los concentradores por rotación se centrifugaron a 4000 rpm durante ~2 horas a 4°C hasta que el volumen de IVF-DsNA se redujo a menos de 1 ml. El IVF-DsNA recuperado se diluyó a un ml con glucosa al 5% y se preparó para inyección en animales.
Inyección en animales y recolección de tejidos
Los animales fueron sometidos a anestesia quirúrgica por inyección i.p. con ketamina/xilacina. Cada ratón se pesó antes de la inyección. Se inyectó IVF-DsNA formulado i.v. a 100 ul/10 g de peso corporal. Después de 24 horas, los ratones fueron sacrificados por inhalación de CO2. Los tejidos para el análisis se recogieron y se colocaron en tubos que contenían 2 ml de RNAlater™ (Qiagen) y se rotaron a temperatura ambiente durante 30 minutos antes de la incubación a 4°C durante la noche. Los tejidos se almacenaron posteriormente a -80°C hasta su uso.
Preparación y cuantificación de ARN tisular
Se homogeneizaron aproximadamente 50-100 mg de piezas de tejido en 1 ml de QIAzol™ (Qiagen) en Tissue Lyser™ (Qiagen). Luego, se aisló el ARN total de acuerdo con el protocolo del fabricante. En resumen, se añadieron 0.2 ml de cloroformo (Sigma-Aldrich) a los lisados QIAzol™ y se mezclaron vigorosamente mediante agitación vorticial. Después de girar a 14.000 rpm durante 15 minutos a 4°C, se recogió la fase acuosa y se mezcló con 0.5 ml de isopropanol. Después de otra centrifugación a 14.000 rpm durante 10 minutos, el sedimento de ARN se lavó una vez con etanol al 75% y se secó brevemente. El ARN aislado se resuspendió en 100 pl de agua libre de ARNasa y se sometió a limpieza con el kit de preparación de ARN total RNeasy™ (Qiagen) o el Sistema de aislamiento de ARN total SV 96 (Promega) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Síntesis de ADNc de primera hebra, in vivo
1 pg de ARN total se realizó transcripción reversa usando Transcriptor 1st Strand cDNA Kit™ (Roche) y oligo-dT siguiendo las instrucciones del fabricante. Una cuadragésima parte (0.66 pL) del ADNc resultante se mezcló con 54, de IQ Multiplex Powermix (Bio-Rad) junto con 3.33 pL de H2O y 1 pL de una mezcla de 3 pM que contiene 2 conjuntos de cebadores y sondas específicas para genes de ratón. Genes HPRT-1 (número de acceso NM-013556) y KRAS (número de acceso NM-021284):
(SEQ ID NO:7) Mm HPRT cebador de avance F576 CAAACTTTGCTTTCCCTGGT
(SEQ ID NO:8) Mm HPRT cebador reverso R664 CAACAAAGTCTGGCCTGTATC
(SEQ ID NO:9) Mm HPRT sonda P616 Cy5-TGGTTAAGGTTGCAAGCTTGCTGGTG-IBFQ
(SEQ ID NO:10) Mm KRAS cebador de avance F275 CTTTGTGGATGAGTACGACC
(SEQ ID NO:11) Mm KRAS cebador reverso R390 CACTGTACTCCTCTTGACCT
(SEQ ID NO:12) Mm KRAS sonda P297 FAM-CGATAGAGGACTCCTACAGGAAACAAGT - IBFQ
RT-PCR cuantitativa
Se usó un sistema de tiempo real CFX96 con un ciclizador térmico C1000 (Bio-Rad) para las reacciones de amplificación. Las condiciones de PCR fueron: 95°C durante 3 min; y luego ciclizar a 95°C, 10 segundos; 55°C, 1 min por 40 ciclos. Cada muestra se analizó por triplicado. Para el experimento HPRT, los niveles relativos de ARNm de HPRT se normalizaron a los niveles de ARNm de SFRS9 y se compararon con los niveles de ARNm obtenidos en muestras de control tratadas con el reactivo de transfección más un doble de no coincidencia de control, o sin tratamiento. Para los ejemplos de KRAS, los niveles relativos de ARNm de KRAS se normalizaron a niveles de ARNm de HPRT-1 y se compararon con los niveles de ARNm obtenidos en muestras de control de ratones tratados con glucosa al 5%. Los datos se analizaron usando el software Bio-Rad CFX Manager versión 1.0 (ejemplos in vitro) o 1.5 (ejemplo in vivo).
Ejemplo 2 Eficacia de agentes de DARNsi que poseen extensiones monocatenarias
Los agentes de DARNsi que poseen extensiones monocatenarias se examinaron para determinar la eficacia de la inhibición de ARNm diana específica de secuencia. Específicamente, los dobles de DARNsi dirigidos a KRAS-249M y HPRT que poseen extensiones de guía monocatenarias 5' se transfectaron en células HeLa a una concentración fija de 20 nM y los niveles de expresión de HPRT se midieron 24 horas más tarde (Figuras 7 y 9). Las transfecciones se realizaron por duplicado, y cada duplicado se analizó por triplicado para la expresión de KRAS-249M y HPRT, respectivamente, por qPCR.
En estas condiciones (doble 0.1 nM, transfección Lipofectamine™ IARNMAX), la expresión del gen KRAS-249 se redujo en aproximadamente un 60-85% por doble DNA10PS, RNA10PS, RNA10PS-2'-OME, DNA15PS, RNA15PS y RNA15PS- 2'OME (figura 7). En comparación, un doble sin extensiones de guía monocatenarias redujo la expresión del gen KRAS-249 en aproximadamente un 90%. Por lo tanto, los dobles que tienen extensiones de guía monocatenarias fueron tan efectivos para silenciar KRAS-249 como un doble sin las extensiones de guía monocatenaria. Todos los dobles extendidos monocatenarios contenían modificaciones del esqueleto de fosforotioato en la región de extensión monocatenaria. Para los dobles DNA10PS, RNA10PS, RNA10PS-2'-OME, que tienen extensiones de guía monocatenarias de 10 nucleótidos, la expresión del gen KRAS-249 se redujo aproximadamente 75-85%. Para los dobles DNA10PS, RNA10PS, RNA10PS-2'-OME, que tienen extensiones de guía monocatenarias de 15 nucleótidos, la expresión del gen KRAS-249 se redujo en un 60-70%. En general, los dobles que tienen las extensiones de guía de 10 nucleótidos reducen la expresión del gen diana KRAS más que los dobles que tienen las extensiones de guía de 15 nucleótidos, independientemente de los nucleótidos presentes en las extensiones de guía 5'. En particular, la actividad silenciadora de los dobles que tienen extensiones de guía que contienen desoxirribonucleótidos, fue más sensible a la longitud aumentada de 15 nucleótidos, en comparación con los dobles que contienen ribonucleótidos y 2'-O-metil ribonucleótidos. El procesamiento de doble extendido de hebra guía 5' por Dicer, que se usan en los experimentos dirigidos a la expresión génica de KRAS-249, también se mostró mediante ensayo in vitro (Figura 10).
De manera similar, en las mismas condiciones (doble 0.1 nM, transfección Lipofectamine™ IARNMAX), la expresión del gen HPRT1 se redujo en aproximadamente 65-85% por doble DNA10PS, RNA10PS, RNa 10PS-2'-OME, DNA15PS, RNA15PS y RNA15PS-2'OME (Figura 9). En comparación, un doble sin extensiones de guía monocatenarias redujo la expresión del gen HPRT1 en aproximadamente un 90%. Por lo tanto, los dobles que tienen extensiones de guía monocatenarias fueron tan efectivos para silenciar HPRT1 como un doble sin las extensiones de guía monocatenaria. Todos los dobles extendidos monocatenarios contenían modificaciones del esqueleto de fosforotioato en la región de extensión monocatenaria. Para los dobles DNA10PS, RNA10PS, RNA10PS-2'-OME, que tienen extensiones de guía de hebra sencilla de 10 nucleótidos, la expresión del gen KRAS-249 se redujo aproximadamente 80-85%. Para los dobles DNA10PS, RNA10PS, RNA10PS-2'-OME, que tienen extensiones de guía monocatenarias de 15 nucleótidos, la expresión del gen KRAS-249 se redujo en un 60-80%. En general, los dobles que tienen las extensiones de guía de 10 nucleótidos reducen la expresión del gen diana KRAS más que los dobles que tienen las extensiones de guía de 15 nucleótidos, independientemente de los nucleótidos presentes en las extensiones de guía 5'. En particular, la actividad silenciadora de los dobles que tienen extensiones de guía que contienen desoxirribonucleótidos o 2'-O-metil ribonucleótidos, fue más sensible a la longitud aumentada de 15 nucleótidos, en comparación con los dobles que contienen ribonucleótidos. El procesamiento de doble extendido de hebra guía 5' por Dicer, que se usaron en los experimentos dirigidos a la expresión génica de HPRT1, también se mostró mediante ensayo in vitro (Figura 10).
Debido a que el doble que tiene las extensiones de guía monocatenarias fue tan eficaz para silenciar KRAS-249 y HPRT1, respectivamente, como un doble sin las extensiones de guía monocatenarias, este descubrimiento permite la modificación de agentes DARNsi con extensiones de guía monocatenarias sin pérdida de eficacia.
Ejemplo 3. Eficacia de agentes de DARNsi que poseen extensiones monocatenarias en combinación con un oligonucleótido corto complementario a la extensión monocatenaria
Los agentes de DARNsi que poseen extensiones monocatenarias se examinaron para determinar la eficacia de la inhibición de ARNm diana específica de secuencia en combinación con un oligo corto complementario a la extensión monocatenaria. Específicamente, los dobles DARNsi dirigidos a KRAS-249M y HPRT que poseen extensiones de guía monocatenarias 5' de 15 nucleótidos de longitud que incluyen un complemento discontinuo de 15 nucleótidos se transfectaron en células HeLa a una concentración fija de 20 nM y los niveles de expresión de HPRT se midieron 24 horas más tarde (Figuras 12 y 13). Las transfecciones se realizaron por duplicado, y cada duplicado se analizó por triplicado para la expresión de KRAS-249M y HPRT, respectivamente, por qPCR.
En estas condiciones (doble 0.1 nM, transfección Lipofectamine™ IARNMAX), la expresión del gen KRAS-249 se redujo en aproximadamente un 15-60% por doble DNA15PS (1301 1340), RNA15PS (1301+1341), RNA15PS-2'-OME (1301 1342) en presencia de complementos discontinuos RNA15, PS-RNA15, PS-DNA15, PS-2'OMe-RNA15 y 2'OMe-RNA15 (figura 12). Un doble sin las extensiones de guía monocatenarias redujo la expresión del gen KRAS-249 en aproximadamente un 85%. Todos los dobles extendidos monocatenarios contenían modificaciones del esqueleto de fosforotioato en la región de extensión monocatenaria. Generalmente, los dobles que tienen extensiones de guía de ribonucleótidos o ribonucleótidos de 2'-O-metilo reducen la expresión del gen diana KRAS más que los dobles que tienen extensiones de guía de desoxirribonucleótidos, independientemente del complemento discontinuo presente. Para los dobles DNA15PS (1301 1340), RNA15PS (1301+1341), RNA15PS-2'-OME (1301 1342), las reducciones en la expresión génica fueron comparables con o sin el complemento discontinuo 2'OMe-RNA15.
De manera similar, bajo las mismas condiciones (doble 0.1 nM, transfección Lipofectamine™ IARNMAX), la expresión del gen HPRT1 se redujo en aproximadamente 30-85% por doble DNA15PS (1001 1353), RNA15PS (1001 1354) y RNA15PS-2'OME (1001 1355) en presencia de complementos discontinuos RNA15, PS-RNA15, PS-DNA15, PS-2'OMe-RNA15 y 2'OMe-RNA15 (figura 13). Un doble sin las extensiones de guía monocatenarias redujo la expresión del gen HPRT1 en aproximadamente un 90%. Todos los dobles extendidos monocatenarios contenían modificaciones del esqueleto de fosforotioato en la región de extensión monocatenaria. Generalmente, los dobles que tienen extensiones de guía de ribonucleótidos o ribonucleótidos de 2'-O-metilo reducen la expresión del gen diana KRAS más que los dobles que tienen extensiones de guía de desoxirribonucleótidos, independientemente del complemento discontinuo presente. Los dobles RNA15PS (1301 1341) y RNA15PS-2'-OME (1301 1342) mostraron una reducción mejorada en la expresión génica en presencia de complementos discontinuos RNA15, PS-RNA15, PS-2'OMe-RNA15, 2'OMe-RNA15, en comparación con los mismos doble RNA15PS (1301 1341) y RNA15PS-2'-OME (1301 1342) sin ningún complemento discontinuo.
Ejemplo 4 Eficacia in vivo de agentes de DARNsi
Los agentes de DARNsi que poseen extensiones doble de ADN se examinaron para determinar la eficacia in vivo de la inhibición de ARNm diana específica de secuencia en un protocolo de dosis única o en un protocolo de dosis repetida (por ejemplo, inyección única de 10 mg/kg en in vivo Fectamine). La expresión de KRAS en tejidos de hígado, riñón, bazo y ganglios linfáticos se midió 24 horas después de la inyección, con PCR en tiempo real (RT-PCR) realizada por triplicado para evaluar la expresión de KRAS. En estas condiciones, los agentes DARNsi extendidos de guía monocatenaria exhibieron niveles estadísticamente significativos de inhibición del gen diana KRAS en todos los tejidos examinados. Los niveles de inhibición porcentual de KRAS en dichos tejidos tratados con DARNsi de extensión de guía monocatenaria fueron: hígado (10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%), bazo (10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%),), riñón (10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%) y ganglios linfáticos (10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%)). Por lo tanto, la eficacia in vivo de los DARNsi extendidos se demostró en muchos tipos de tejidos.
Se realizó una demostración adicional de la capacidad de los agentes de sustrato de Dicer extendidos para reducir la expresión génica de genes diana específicos in vivo mediante la administración de los DARNsi a ratones u otros sujetos mamíferos, ya sea sistémicamente (por ejemplo, mediante inyección intravenosa o i.p.) o mediante inyección directa de un tejido (por ejemplo, inyección del ojo, médula espinal/cerebro/SNC, etc.). La medición de los niveles de ARN diana adicionales se realizó en las células objetivo (por ejemplo, los niveles de ARN en las células hepáticas y/o renales se analizaron después de la inyección de ratones; las células oculares se analizaron después de la inyección oftálmica de los sujetos; o se analizaron las células de la médula espinal/cerebro/SNC después de la inyección directa de los mismos sujetos) mediante métodos estándar (por ejemplo, preparación de Trizol® (tiocianato de guanidiniofenol-cloroformo) seguido de qRT-PCR).
En cualquiera de estos experimentos in vivo adicionales, se puede considerar que un agente sustrato de Dicer extendido (por ejemplo, un DARNsi extendido 5' extendido o 3' extendido de guía) es un agente in vivo eficaz si una reducción estadísticamente significativa en los niveles de ARN fuera observado cuando se administró un agente de sustrato de Dicer extendido, en comparación con un control apropiado (por ejemplo, un control de vehículo solo, un control doble aleatorizado, un doble dirigido a un control de ARN diana diferente, etc.). En general, si el valor p (por ejemplo, generado a través de una prueba T sin cola y con 1 cola) asignada a dicha comparación fue inferior a 0.05, un agente sustrato de Dicer extendido (por ejemplo, agente DARNsi 5' extendido o pasajera 3' extendido) se considera un agente de interferencia de ARN eficaz. Alternativamente, se puede establecer el umbral del valor p por debajo del cual clasificar un agente de sustrato de Dicer extendido como un agente de interferencia de ARN eficaz, por ejemplo, a 0.01, 0.001, etc., para proporcionar un filtrado más estricto, identificar diferencias más robustas y/o ajustar para pruebas de hipótesis múltiples, etc. También se pueden establecer límites de nivel de actividad absoluta para distinguir entre agentes de sustrato de Dicer extendido efectivo y no efectivo. Por ejemplo, un agente sustrato de Dicer extendido efectivo fue uno que no solo muestra una reducción estadísticamente significativa de los niveles de ARN diana in vivo sino que también ejerce, por ejemplo, al menos una reducción de aproximadamente 10%, aproximadamente 15% de reducción, al menos aproximadamente un 20% de reducción, aproximadamente un 25% de reducción, aproximadamente un 30% de reducción, etc., en los niveles de ARN diana en el tejido o la célula que se examinó, en comparación con un control apropiado. De este modo, se realizaron pruebas de eficacia in vivo de los agentes de sustrato de Dicer extendidos (por ejemplo, agentes de DARNsi 5' extendidos y 3' extendidos de guía).
Los agentes de DARNsi que poseen extensiones monocatenarias (Figuras 14 y 15) inhibieron efectivamente la expresión de ARNm de KRAs diana específica de secuencia in vivo en hígado, bazo y riñón. En el hígado, los agentes de DARNsi extendido de 5' para pasajeras 1371 (PS 3M) y 1339 (PS10M) mostraron inhibición de la expresión de ARNm de KRAS en comparación con los agentes de DARNsi sin las extensiones pasajeras de 5' K249M y 1370 (3M), cuando se normalizaron para controlar solo la glucosa (Figuras 16-18). La inhibición de la expresión de ARNm de KRAS por parte de los agentes de DARNsi fue de al menos 75-90% en el hígado de animales inyectados con los agentes de DARNsi 5' de pasajera extendido 1371 (PS 3M) y 1339 (PS10M). La cantidad de inhibición de los agentes DARNsi extendidos para pasajeras 5' 1371 (PS 3M) y 1339 (PS10M) en el hígado fue comparable a la de los agentes DARNsi sin las extensiones para pasajeras 5' K249M y 1370 (3M), que fue significativa en comparación con el control negativo de glucosa.
En el bazo, los agentes DARNsi extendidos de 5' pasajeras 1371 (PS 3M) y 1339 (PS 10M) también mostraron inhibición de la expresión de ARNm de KRAS en comparación con los agentes DARNsi sin las extensiones pasajeras 5' K249M y 1370 (3M), cuando normalizado a control de solo glucosa (Figuras19-21). La inhibición de la expresión de ARNm de KRAS por los agentes de DARNsi fue al menos 90-95% en el bazo de los animales inyectados con los agentes de DARNsi extendido de pasajera 5' 1371 (PS 3M) y 1339 (PS10M). La cantidad de inhibición de los agentes DARNsi extendidos para pasajeras 5' 1371 (PS 3M) y 1339 (PS10M) en el bazo fue comparable a la de los agentes DARNsi sin las extensiones para pasajeras 5' K249M y 1370 (3M), que fue significativa en comparación con el control negativo de glucosa.
En el riñón, los agentes DARNsi extendidos de 5' pasajeras 1371 (PS 3M) y 1339 (PS 10M) mostraron inhibición de la expresión de ARNm de KRAS en comparación con los agentes DARNsi sin las extensiones pasajeras 5' K249M y 1370 (3M), cuando se normalizaron al control solo de glucosa (Figuras 22-24). La inhibición de la expresión de ARNm de KRAS por los agentes de DARNsi fue de al menos 20-40% en riñón de animales inyectados con los agentes de DARNsi extendido de pasajera 5' 1371 (PS 3M) y 1339 (PS10M). Sin embargo, la cantidad de inhibición de los agentes DARNsi extendidos para pasajeras 5' 1371 (p S 3M) y 1339 (p S 10M) fue comparable a la de los agentes DARNsi sin las extensiones para pasajeras 5' K249M y 1370 (3M). En estos experimentos, un agente DARNsi sin la extensión pasajera 5' M97M y sin secuencia específica para KRAS se usó como control positivo.
Debido a que los agentes de DARNsi que tienen una extensión de guía monocatenaria fueron tan efectivos para silenciar KRAS in vivo, como los agentes de DARNsi sin la extensión de guía monocatenaria, este descubrimiento permite la modificación de agentes de DARNsi con extensiones de guía monocatenaria sin pérdida de eficacia en vivo.
Ejemplo 5. Ensayo de cultivo celular in vitro para evaluar la inhibición de ácido nucleico del ARN diana
Los ARNds se administran a células de hepatoma humano (Huh7) y posteriormente se miden los niveles de ARNm dirigidos en las células de hepatoma humano (Huh7), para evaluar la eficacia in vitro para la reducción de la expresión diana de los ARNds contra las transcripciones específicas.
Los ARN bicatenarios específicos para el gen diana humano hipoxantina-guanina fosforibosil transferasa (HPRT1; GenBank Accession No. NM-000194 y GI: 164518913) se prueban para determinar su eficacia en células de hepatoma humano (Huh7). El gen diana anterior es un gen de "limpieza" reconocido en el arte. Los genes de mantenimiento se seleccionan como genes diana con el doble propósito de garantizar que los genes diana posean una expresión fuerte y homogénea en las células hepáticas humanas y minimizar la variabilidad del nivel de expresión entre especies. Pocos ejemplos de la divulgación se muestran en las figuras 37, 38, 39 y 41, incluidos los ARNds de control que se utilizarán como referencia para la comparación. Los ARNds específicos para dirigir HPRT1 se muestran, por ejemplo, en las figuras 37, 38, 39 y 41. Las secuencias específicas de ARNds que se dirigen a GAPDH, LMNA, Hn RpA 1 y ATP1B3 pueden construirse de manera similar para dirigirse a su respectivo transcrito en células hepáticas humanas.
Las moléculas de dsNA dirigidas al ARN se diseñan y sintetizan como se describe en el presente documento. Estas moléculas de ácido nucleico pueden analizarse in vivo para determinar la capacidad de reducir la expresión génica y la actividad de escisión de Dicer, por ejemplo, utilizando el siguiente procedimiento. Se utilizan dos formatos para probar la eficacia de dsNA. Los reactivos se prueban en cultivo celular utilizando, por ejemplo, células de hepatoma humano (Huh7), para determinar el grado de inhibición de ARN y proteínas. Los reactivos de dsNA se dirigen a un objetivo específico como se describe en este documento. La inhibición del ARN se mide después del suministro de estos reactivos por un agente de transfección adecuado a, por ejemplo, queratinocitos epidérmicos cultivados. Se miden cantidades relativas de ARN diana y se comparan con la actina usando la monitorización por PCR en tiempo real de la amplificación (por ejemplo, ABI 7700 TAQMAN). Se realiza una comparación con una mezcla de secuencias de oligonucleótidos realizadas con objetivos no relacionados o con un control de dsNA aleatorizado con la misma longitud y química general, pero sustituido aleatoriamente en cada posición. Los reactivos de plomo primario y secundario dirigidos al objetivo están optimizados. Después de elegir una concentración óptima de agente de transfección, se realiza un ciclo de inhibición de ARN con la molécula de dsNA principal. Además, se puede usar un formato de recubrimiento de células para determinar la inhibición de ARN.
Los constructos de dsNA se prueban para determinar su eficacia en la reducción de la expresión de ARN diana, por ejemplo, usando el siguiente protocolo. Las células se colocan en placas aproximadamente 24 horas antes de la transfección en placas de 96 pocillos a 5.000-7.500 células/pocillo, 100 ul/pocillo, de modo que en el momento de la transfección las células tienen una confluencia del 70-90%. Para la transfección, el dsNA fusionado se mezcla con el reactivo de transfección (Lipofectamine 2000, Invitrogen) en un volumen de 50 pl/pocillo y se incuba durante 20 minutos a temperatura ambiente. Las mezclas de transfección de dsNA se agregan a las células para dar una concentración final de dsNA de 50 pM, 200 pM o 1 nM en un volumen de 150 ul. Cada mezcla de transfección dsNA se prueba por triplicado. Las células se incuban a 37°C durante 24 horas en presencia continua de la mezcla de transfección de DARNsi. A las 24 horas, se prepara ARN a partir de cada pocillo de células tratadas. Después de la centrifugación de las muestras de células, los sobrenadantes con las mezclas de transfección se eliminan y desechan, las células se someten a lisis y se prepara ARN a partir de cada pocillo. El nivel o expresión de ARN diana después del tratamiento se evalúa mediante un método cuantitativo (por ejemplo, RT-PCR, transferencia Northern) para el gen diana y para un gen de control (por ejemplo, actina o 36B4, una subunidad de ARN polimerasa) para la normalización. Alternativamente, las células se someten a lisis y se prepara proteína total de cada pocillo. El nivel de proteína objetivo o la expresión después del tratamiento se evalúa mediante inmunotransferencia Western y la señal se cuantifica. Se promedian los datos por triplicado y se determinan las desviaciones estándar para cada tratamiento. Se grafican los datos normalizados y se determina la reducción porcentual del ARNm objetivo por los ARNds en comparación con los ARNds de control apropiados (por ejemplo, ARNds de control invertidos).
Por lo tanto, se puede demostrar que los ARNds con muescas, por ejemplo, las estructuras tetrabucle con muescas reducen la expresión génica de diana específica en las células, en comparación con un ARNds de referencia. Se espera que los ARNds cortados con un tetrabucle tengan una escisión mejorada por Dicer. Así, los ARNds que tienen una estructura tetrabucle con muescas reducen la expresión de un gen diana y mejoran la escisión por Dicer en comparación con un ARNds de referencia. Los dsNA que poseen estructuras abarcadas por la estructura de tetrabucle con muescas, son inhibidores de secuencia específica robustamente eficaces de la expresión in vitro de genes diana en células de hepatoma humano (Huh7).
Ejemplo 6. Ensayo in vitro para evaluar la estabilidad del suero
La estabilidad del suero de los agentes de dsNA se evalúa mediante la incubación de agentes de dsNA en suero bovino fetal al 50% durante varios períodos de tiempo (hasta 24 h) a 37°C. El suero se extrae y los ácidos nucleicos se separan en un gel no desnaturalizante al 20% usando PAGE y visualizado con tinción Gelstar. Los niveles relativos de protección contra la degradación de nucleasas se evalúan para dsNA (opcionalmente con y sin modificaciones).
Ejemplo 7. Ensayo in vivo de ARNds con muesca con tetrabucle
La divulgción proporciona composiciones para reducir la expresión de un gen diana en una célula, que implica poner en contacto una célula con ARNds con muesca que tiene un tetrabucle en una cantidad efectiva para reducir la expresión de un gen diana en un sujeto que lo necesita. Los ARNds se administran sistémicamente a ratones y posteriormente se miden los niveles de ARNm dirigidos en muestras de hígado de ratones tratados. El estudio evalúa la eficacia in vivo de los ARNdss frente a las transcripciones dirigidas.
Los agentes de ARN bicatenarios específicos para los siguientes genes diana de mantenimiento de ratones se prueban para determinar su eficacia en hígado de ratón: Hipoxantina-Guanina Fosforibosil Transferasa (HPRT1; N° de acceso de GenBank NM-013556); Gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH; número de acceso de GenBank NM-008084); Lamin A (LMnA; N° de acceso de GenBank NM-019390); Ribonucleoproteína nuclear heterogénea A1 (HNRpAl; Núm. De acceso GenBank NM-010447) y ATPasa, Na+/K+ transportador, polipéptido Beta 3 (ATP1B3; Núm. De acceso GenBank NM-007502; dos ubicaciones distintas fueron atacadas dentro del ARNm de ATP1B3).
Se construyen secuencias específicas de ARNds dirigidas a HPRT1, GAPDH, LMNA, HNRPA1 y ATP1B3 que tienen una estructura de los ARNds, por ejemplo, una estructura de tetrabucle con muescas que contiene cualquiera de las siguientes secuencias en la hebra antisentido para dirigir sus respectivos transcritos:
HPRT1 secuencia antisentido: 3'-UUCGGUCUGAAACAACCUAAACUUUAA-5'
GAPDH secuencia antisentido: 3'-ACUCGUAGAGGGAGUGUUAAAGGUAGG-5'
LMNA secuencia antisentido: 3'-CUCGAACUGAAGGUCUUCUUGUAAAUG-5'
HNRPA1 secuencia antisentido: 3'-GUCCUGACAUAAACACUGAUU AACAUA-5'
ATP1B3 secuencia antisentido: 3'-AUCCCUAUGUUACCAUGGAACGGUUGU-5'
ATP1B3 secuencia antisentido: 3'-GGUCUGCCUAUAGGUGUUUAUAGCACA-5'
Leyenda: mayúscula = residuos de ARN
Se compran, alojan, tratan y sacrifican ratones (hembras CD-1) que pesan aproximadamente 25 gramos.
Se realizó un estudio de selección de punto de tiempo y intervalo de dosis inicial para establecer la eficacia in vivo de los ARNds con muescas para reducir la expresión de transcripciones dirigidas al tiempo que se establece la dosis óptima de ARNds con muesca y el tiempo de recogida de muestras. Esto se hace, por ejemplo, para dos secuencias independientes y activas de orientación (HPRT1). Las diferentes dosis (50 y 200 |jg) de los ARNdss a analizar se disuelven en solución salina regulada con fosfato (PBS; 2.5 ml de volumen total por dosis) y se administran a ratones como inyecciones hidrodinámicas individuales a través de la vena de la cola. Se recogen muestras de hígado de ratones dosificados en los siguientes puntos de tiempo: 24, 48 y 72 horas, y 7 días después de la administración. Un total de cuatro animales por grupo se tratan con los ARNds para garantizar que al menos 3 animales se puedan evaluar en cada dosis/momento.
El estudio también se realiza usando las siguientes condiciones. Una dosis (200 jg ) del ARNds por analizar se disuelve en solución salina regulada con fosfato (PBS; 2.5 ml de volumen total por dosis) y se administra a ratones como inyecciones hidrodinámicas individuales a través de la vena de la cola. Se recogen muestras de hígado de ratones dosificados a las 24 horas después de la administración. Se trata un total de siete animales por grupo con cada agente de ARNds.
Los niveles de ARNm objetivo se evalúan usando una reacción en hebra de la transcriptasa-polimerasa inversa cuantitativa ("qRT-PCR"). Los ADNc se sintetizan usando una mezcla de oligo-dT y cebado aleatorio de hexámero. Las reacciones qPCR se ejecutan por triplicado. La cuantificación absoluta se realiza mediante extrapolación contra una curva estándar derivada de un objetivo de amplicón linealizado clonado. Los datos se normalizan utilizando el control como 100%. Los datos se normalizan estableciendo que el nivel de expresión del gen de control sea el valor de expresión de ARNm objetivo medido para todos los ratones que no se administraron agentes de DARNsi específicos de ARNm objetivo, que se promediaron para obtener un valor de control del 100% (por ejemplo, para ratones inyectados con DARNsi de Ga PDH, el conjunto de ratones HPRT1, LMNA, HNRPA1, ATP1B3-1 y ATP1B3-3 se utilizan como controles negativos para producir niveles de GAPDH basales normalizados. Por lo tanto, hay siete ratones de estudio y 35 ratones de control para cada brazo del estudio). Al evaluar la importancia de los resultados, los valores de P se calculan utilizando una prueba T sin cola de 1 cola. Los valores por debajo de 0.05 se consideran estadísticamente significativos.
Se observan niveles reducidos de ARNm dirigidos en muestras de hígado de ratones tratados debido al tratamiento con los ARNds tetrabucle con muesca. Los resultados de los estudios muestran que los agentes de ARNds dirigidos contra secuencias objetivo de HPRT1 reducen los niveles de ARNm objetivo in vivo cuando se administran a 50 microgramos y 200 microgramos u otras concentraciones, por ejemplo entre 1 |jg y 500 |jg, por ejemplo 1,2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500 jg con reducciones en los niveles de expresión de transcripción génica objetivo de al menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100% observado a las 24 horas después de la administración en comparación con un control que no se espera que reduzca los niveles de transcripción génica.
Ejemplo 8 Síntesis de derivados de ligando
Los derivados del ligando N-acetil galactosamina, denominado GalNac en este ejemplo, se sintetizaron de acuerdo con el esquema I: (Hágase referencia a la página 193)
Figure imgf000070_0001
Se cargó un matraz con una barra agitadora, alcohol bencílico (90 ml, 94 g, 0,87 mol, 8,0 equivalentes, Aldrich anhidro), delta-valerolactona (10.0 ml, 10.8 g, 0.108 mol, 1.0 equivalentes, Alfa, utilizado como se recibió) y resina Dowex 50W8X-100 (207 mg, Aldrich). El matraz se equipó con un tabique de goma con una aguja de entrada de N2 (nitrógeno), y el matraz se colocó en un baño de aceite precalentado a 75°C. La mezcla se agitó vigorosamente durante 4 h, y luego se apagó la energía del baño de aceite, y la solución se dejó agitar durante la noche, enfriando a temperatura ambiente bajo N2 (nitrógeno). La solución transparente e incolora se filtró para eliminar las perlas DOWEX, y las perlas y el filtro se enjuagaron con DCM. El filtrado se concentró en el evaporador rotatorio para eliminar el (diclorometano) DCM. La mezcla se purificó por cromatografía ultrarrápida (FC) en gel de sílice (ISCO) en 3 lotes, cada uno en una columna de gel de sílice de 330 g (la misma columna se reutilizó para los 3 lotes). Columna de 330 g, equilibrada con acetato de etilo al 5% (EtOAc)/hexanos. Se inyectaron 33-35 ml de la solución de reacción en la columna para cada ejecución y se eluyeron con EtOAc/Hexanos 5%-100%. UV 254 nm, 280 nm. Todas las fracciones deseadas de las 3 columnas se combinaron y se evaporaron para dar un D2 como un líquido incoloro: 15.82 g (0.076 mol, 70%). Esto fue repurificado por FC en gel de sílice:columna de 220 g, eluir con EtOAc/Hexanos 5%-70%, 254 nm, 280 nm. Las fracciones deseadas se combinaron y se evaporaron para dar un líquido incoloro que se secó a vacío completo durante 24 horas para dar D2 12.60 g (56%) como un líquido incoloro suficientemente puro para usar en el siguiente paso.
b. Síntesis de G1'
Escala de 4 g:
Se cargó un matraz secado al horno con el GalNAc (G1) (4.360 g, 11.20 mmol, 1.00 equivalentes) y una barra agitadora. Se añadió 1,2-dicloroetano (Aldrich. Anhidro, 26 ml) para dar una suspensión lechosa. A esta mezcla se añadió trifluorometanosulfonato de trimetilsililo (TMSOTf) (Alfa, 2.8 ml durante 1 minuto) mediante una jeringa a temperatura ambiente bajo N2. Esta mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos, pero permaneció heterogénea. El matraz se colocó en un baño de aceite precalentado a 50°C. En unos pocos minutos, la mezcla de reacción se volvió homogénea. Después de calentar durante 95 minutos, se desconectó la alimentación del baño de aceite y se dejó enfriar el matraz a temperatura ambiente durante la noche. Después de 21 horas, se retiró una alícuota, se diluyó con CH3CN y se verificó mediante espectroscopía de masas (MS) CIPOS: 362.1 (10), 330.1 (100), 210.1 (20), 168.1 (12), 150.1 (28).
La solución de reacción (color ámbar) se vertió en un embudo de separación de 500 ml que contenía 130 ml de NaHCO3 acuoso saturado helado, y el matraz de reacción se enjuagó con DCM (100 ml). Después de que la evolución del gas había disminuido, las fases se separaron (la fase orgánica inferior era de color amarillo turbio y la fase acuosa superior era lechosa con un poco de color). La fase acuosa se extrajo con DCM (1 x 50 ml). Las fases DCM combinadas se lavaron con H2O (120 ml) y NaCl acuoso saturado (120 ml). La fase DCM (transparente, amarillo claro) se secó sobre Na2SO4, se filtró (Na2SO4 se enjuagó con aproximadamente 100 ml de DCM) y se concentró mediante evaporador rotatorio para dar un aceite ámbar. Este se secó a temperatura ambiente bajo vacío total durante la noche (aproximadamente 3.7 g), y luego se almacenó en el congelador. Este material se usó sin más purificación en el siguiente paso.
Escala de 20 g:
A una mezcla de pentaacetato de galactosamina (G1) (20.0 g, 51.0 mmol, 1.0 equivalentes, LC Scientific) en diclorometano (120 ml) se añadió TMSOTf (14.0 ml, 77.0 mmol, 1.5 equivalentes, Alfa) a temperatura ambiente, y la reacción se calentó a reflujo y se agitó durante 90 minutos a reflujo. Posteriormente, la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se vertió en una solución de bicarbonato de sodio enfriada con hielo, se extrajo con diclorometano, se lavó con agua, se secó sobre sulfato de sodio y se filtró. Después de concentrar en el evaporador rotatorio, el producto esperado G1' se obtuvo como goma naranja oscura (aproximadamente 16 g). El producto bruto se usó sin purificación adicional.
c. Síntesis de G2
El éster bencílico del ácido 5-hidroxpentanoico D2 (12.44 g, 59.73 mmol, 1.75 equivalentes) se disolvió en 1,2-dicloroetano (80 ml, Aldrich anhidro), y esta solución se añadió al derivado bruto de GalNAc (G1') (11.24 g, 34.13 mmol, 1.00 equivalentes). Una vez que esta solución fue homogénea, se le añadieron tamices moleculares secos de 3Á (10.5 g, perlas). La mezcla se agitó a temperatura ambiente bajo N2 durante 30 minutos. Se añadió TMSOTf (3.2 ml, 18 mmol, 0.52 equivalentes) mediante una jeringa. La mezcla se agitó a temperatura ambiente bajo N2 durante la noche. La reacción se controló por MS (CI POS) y TLC (gel de sílice, EtOAc al 100%, teñida con PMAo H2SO4/MeOH). MS POS: 638.3 (15), 538.2 (100), 438.2 (10), 330.1 (40). Después de 24 horas a temperatura ambiente, la reacción se trató. La solución ámbar se vertió en un embudo separador que contenía 100 ml de NaHCO3 acuoso saturado, y el matraz y los tamices se enjuagaron con 80 ml de DCM, que también se añadió al embudo separador. Las fases se separaron y la fase acuosa se extrajo con 1 x 80 ml de DCM. Las fases orgánicas combinadas se lavaron con H2O (100 ml) y NaCl acuoso saturado (100 ml). La fase orgánica ámbar se secó (Na2SO4), se filtró (papel) y se evaporó para dar un líquido viscoso y ámbar: 26.54 g (145%). La muestra cruda se purificó directamente por FC sobre gel de sílice (ISCO): 330 g columna, compuesto inyectado en la columna equilibrada y enjuagado con 8 ml de DCM; eluido con 0%-100% EtOAc/Hexanos, UV 254 nm, 280 nm. Las fracciones deseadas se combinaron y se evaporaron para dar un líquido viscoso casi incoloro: 13.52 g (74%). Este material estaba contaminado por una pequeña cantidad de GalNAc-OBn (M+1 = 438) y pequeñas cantidades de "dímero" y derivados de "trímero" (homólogos de ácido pentanoico) (M+1 = 738 y 638).
d. Síntesis de G2'
El material de partida G2 (2.42 g, 4.50 mmol, 1.0 equivalentes) se disolvió en MeOH (60 ml) y la solución se colocó en una jarra Parr. Se añadió Pd/C al 5% (592 mg, Aldrich, Degussa E1002 U/W, húmedo). La jarra se colocó en el hidrogenador Parr, y la jarra se evacuó y se rellenó con H2 cuatro veces. La jarra se presurizó a 48 psi (hidrógeno) H2 y se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Después de 18 horas, se detuvo la reacción. La jarra se evacuó y se volvió a llenar con N2 cuatro veces. Se retiró una parte alícuota de la mezcla de reacción, se filtró, se diluyó con MeOH y se verificó por MS. MS POS: 448.2 (100), 330.1 (65), 210.1 (7), 150.1 (8); MS NEG: 560.2 (5), 446.2 (100). La reacción fue completa y limpia. La mezcla de reacción se filtró a través de Celite y se enjuagó con MeOH (100 ml). El filtrado transparente e incoloro se evaporó y se secó a vacío a temperatura ambiente para dar una espuma incolora/sólido de vidrio: 1.70 g (84%) de G2'.
e. Síntesis de G3
A una mezcla de G2' (2 g, 4.47 mmol) en diclorometano (100 ml) se añadió EDC (3.08 g, 16.06 mmol) y NHS (0.77 g, 6.71 mmol), y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se concentró en el evaporador rotatorio (40°C), y el residuo se lavó con agua saturada. Bicarbonato de sodio acuoso (200 ml) y extraído con EtOAc (2 X 500 ml). La solución orgánica combinada se secó sobre Na2SO4 anhidro y se evaporó. El G3 bruto se usó en el siguiente paso sin purificación (1.4 g, 57%).
1H RMN (300 MHz, DMSO-de)) 87.83 (d, J = 9.36 Hz, 1H), 5.21 (d, J = 3.27 Hz, 1H), 4.95 (dd, J = 11.28, 3.3 Hz, 1H), 4.5 (d, J = 8.49 Hz, 1H), 3.99 - 4.06 (m, 3H), 3.84 - 3.94 (m, 1H), 3.70 - 3.77 (m, 1H), 3.43 - 3.49 (m, 1H), 2.80 (s, 4H), 2.67 (t, J = 7.41 Hz, 2H), 2.1 (s, 3H), 1.99 (s, 3H), 1.89 (s, 3H), 1.76 (s, 3H), 1.57 - 1.62 (m, 4H).
13C RMN (75 MHz, DMSO-d6)
8 170.81, 170.58, 170.50, 170.21, 169.86, 169.49, 101.41, 71.04, 70.41, 68.54, 67.26, 62.01, 49.8 1, 30.31, 28.34, 25.99, 25.78, 23.28, 21.44, 21.08, 21.02, 21.01
MS: (APCI+) M 1 = 545.2
Ejemplo 9. Síntesis de derivados de ligando multivalente
Un ejemplo de esto es el GalNac tricatenario y la síntesis de estos derivados de GalNac ramificados se muestra en el Esquema II. (Hágase referencia a las páginas 194-196).
a. Síntesis de T5 (ácido 3-[2-(benciloxicarbonilamino)-3-(2-carboxietoxi)-2-(2-carboxietoximetil)-propoxi]propanoico)
Un matraz se cargó con ácido 3,3'-((2-(((benciloxi)carbonil)amino)-2-((2-carboxietoxi)metil)propano-1,3-diil)bis(oxi))dipropiónico (T4) (4.39 g, 9.31 mmol, 1.0 equivalente) (número de registro CAS: 200133-16-0) y DMF (44 ml) para dar una solución homogénea. Se añadió HOBtH2O (1.59 g, 9.30 mmol, 1.0 equivalentes) a temperatura ambiente bajo N2, y la mezcla se agitó durante aproximadamente 1 minuto hasta que fue homogénea. Se añadió DIEA (9.5 ml, 54.5 mmol, 5.9 equivalentes) mediante una jeringa. Se añadió HBTU (11.70 g, 30.9 mmol, 3.3 equivalentes) de una vez. La mezcla de reacción se agitó durante 1-2 minutos hasta homogeneidad. El matraz se sumergió en un baño de agua con hielo y se añadió lentamente BOC-1,3-diaminopropano (5.80 ml, 33.2 mmol, 3.6 equivalentes) con una jeringa durante aproximadamente 5 minutos. El baño se dejó en su lugar, y la solución de reacción (transparente, ligeramente amarillo-ámbar) se agitó bajo N2 durante 24 h, la solución de reacción se diluyó con CH2Cl2 (350 ml) y se lavó con H2O (150 ml), NaHcO3 acuoso saturado (2 x 150 ml), H2O (150 ml) y NaCl acuoso saturado (150 ml), se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se evaporaron para dar un líquido viscoso y ámbar. El material bruto se purificó por FC en SO2 (ISCO). Se eluyó con MeOH/EtOAc 0% a 20%, luego 10% MeOH/CH2Cl2 para proporcionar una espuma/aceite casi incoloro y pegajoso: 7.17 g (82%) T5.
1H RMN (300 MHz, CDCla): 87.34-7.28 (m, 5H), 6.85 (m, 3H), 5.55 (s, 1H), 5.18 (m, 3H), 5.01 (s, 2H), 3.68-3.63 (m, 12H), 3.28-3.21 (m, 6H), 3.13-3.07 (m, 6H), 2.39 (t, J = 5.5 Hz, 6H), 1.58 (br q, J = 6.0 Hz, 6H), 1.41 (s, 27H) MS (APCI+) M 1= 940.5
CAS Registry Number: 1162069-31-9
b. Síntesis de T8 (10-amino-10-(13,13-dimetil-5,11-dioxo-2,12-dioxa-6,10-diazatetradecil)-5,15-dioxo-8,12-dioxa-4,16-diazanonadecano-1,19-diil)dicarbamato de di-tert-butilo
Se disolvió T5 (2.84 g, 3.02 mmol) en MeOH (50 ml) a temperatura ambiente, y la solución se colocó en una jarra Parr. Se añadió Pd/C al 5% (0.6670 g, Degussa E1002 U/W, húmedo, Aldrich). La jarra se colocó en un hidrogenador Parr, se evacuó y se volvió a llenar con H2 cuatro veces. La jarra se presurizó a 47 psi H2 y se agitó a temperatura ambiente durante 6 h. La jarra se evacuó y se volvió a llenar con N2 cuatro veces. La mezcla de reacción se filtró a través de Celite, y el Celite se enjuagó con aproximadamente 200 ml de MeOH. El filtrado ligeramente turbio se filtró a través de papel de filtro con algo de CH2Cl2 para enjuagar, y el filtrado transparente resultante se evaporó y se secó a vacío completo para dar un sólido de espuma: 2.38 g (98%) de T8.
1H RMN (300 MHz, DMSO-d6): 87.85 (t, J = 5.5 Hz, 3H), 6.76 (t, J = 5.7 Hz, 3H), 3.55 (t, J = 6.4 Hz, 6H), 3.16 (s, 6H), 3.02 (dt, J = 6.5 Hz, 6H), 2.90 (q, J = 6.5 Hz, 6H), 2.26 (t, J =6.1 Hz, 6H), 1.48 (quint, J = 6.9 Hz, 6H), 1.36 (s, 27 H).
MS (APCI+) M 1= 806.5
c. Síntesis de T9 15,15-bis(13,13-dimetil-5,11-dioxo-2,12-dioxa-6,10-diazatetradecil)-2,2-dimetil-4,10,17-trioxo-3,13,20,23,26,29,32-heptaoxa-5,9,16-triazapentatriacontan-35-oato de metilo (T9):
Se cargó un matraz con ácido 3-oxo-2,6,9,12,15,18-hexaoxahenicosan-21-oico (532.0 mg, 4.06 mmol, 1.0 equivalentes, BroadPharm), T8 (3.385 g, 4.12 mmol 1,0 equivalentes), HBTU (1.888 g, 4.98 mmol, 1.2 equivalentes), HOBt H2O (710.3 mg, 4.15 mmol, 1.0 equivalentes) y DMF (15 ml). La mezcla se agitó unos minutos bajo N2 hasta que quedó transparente y homogénea. A esto se añadió DIEA (1.6 ml, 9.19 mmol, 2.3 equivalentes) mediante una jeringa durante 1 minuto. La solución de reacción se agitó bajo N2 a temperatura ambiente durante 41 h. La solución se diluyó con CH2O2 (180 ml) y se lavó con H2O/NaHCO3 acuoso saturado 1:1 (2 x 70 ml), NaHCO3 acuoso saturado (70 ml) y NaCI acuoso saturado (80 ml). Las fases acuosas combinadas se extrajeron con CH2CI2 (80 ml), y esta fase de CH2Cl2 se lavó con H2O (50 ml) y NaCl acuoso saturado (50 ml). Las fases combinadas de CH2Cl2 se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se evaporaron para dar un aceite. El petróleo crudo se purificó por FC sobre SO2 (ISCO), eluyendo con (NH30.7 M en MeOH)/CH2Cl2, 0%-10%, para dar 1.604 g (35%) de T9 como un aceite.
1H RMN (300 MHz, DMSO-d6): 87.81 (brt, J = 5.7 Hz, 3H), 7.11 (s, 1H), 6.76 (brt, J = 5.5 Hz, 3H), 3.61 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 3.59 (s, 3H), 3.56-3.47 (m, 32H), 3.02 (br q, J = 6.5 Hz, 6H), 2.90 (br q, J = 6.5 Hz, 6H), 2.53 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 2.26 (brt, J = 6.3 Hz, 6H), 1.48 (br quint, J = 6.9 Hz, 6H), 1.36 (s, 27 H).
MS (APCI+) M 1= 1140.7
d. Síntesis de T10 sal de tris (ácido 2,2,2-trifluoroacético) (30-amino-21,21-bis((3-((3-aminopropil)amino)-3-oxopropoxi)metil)-19,26-dioxo-4,7,10,13,16,23-hexaoxa-20,27-diazatriacontanoato de metilo) (T10):
En un matraz de fondo redondo de 100 ml, se agitó una mezcla de T9 (1.5 g, 1.315 mmol), TFA (6 ml) y diclorometano (24 ml) a temperatura ambiente durante 1 h. La mezcla de reacción se concentró mediante evaporador rotatorio, y el producto bruto se secó al vacío durante una noche. No se necesitó purificación, y se usó T10 crudo (1.55 g, rendimiento: cuant.) en el siguiente paso directamente.
1H RMN (300 MHz, DMSO-d6) 88.08 (t, J = 5.79 Hz, 3H), 7.72 (br, 9H), 7.14 (s, 1H), 3.61 (t, J = 6.03 Hz, 2H), 3.58 (m, 3H), 3.46-3.56 (m, 30H), 3.07-3.15 (m, 6H), 2.74-2.80 (m, 6H), 2.53 (t, J = 6.33 Hz, 2H), 2.28-2.34 (m, 8H), 1.62 - 1.71 (m, 6H).
13C RMN (75 MHz, DMSO-d6)
8 172.15, 171.31, 171.00, 70.28, 70.19, 70.01, 68.8, 67.84, 67.37, 66.49, 60.19, 51.83, 37.26, 37.1 1, 36.46, 36.09, 34.95, 27.95
MS: (APCI+) M 1 = 840.5
e. Síntesis de éster metílico de 3GT2:
Se añadió DIPEA (2.29 ml, 13.15 mmol) a una solución de T10 (1.55 g, 1.315 mmol) en diclorometano (45 ml) a 0°C (baño de hielo-agua) y la mezcla se agitó durante 5 minutos. Se añadió G3 y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se lavó con bicarbonato de sodio acuoso saturado (200 ml), y la fase acuosa se extrajo con diclorometano (500 ml). Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre Na2SO4 anhidro y se evaporaron. El residuo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (elución en gradiente de MeOH al 0% a 40%/CH2Cl2). El éster metílico de 3GT2 se obtuvo como espuma blanca (1.4 g, 51%).
1H RMN (300 MHz, DMSO-d6) 87.81 - 7.85 (m, 6H), 7.74 (t, J = 5.19 Hz, 3H), 7.13 (s, 1H), 5.21 (d, J = 3.3 Hz, 3H), 4.95 (dd, J = 11.25, 3.57 Hz, 3H), 4.47 (d, J = 8.25 Hz, 3H), 4.02-4.05 (m, 12H), 3.81- 3.91 (m, 6H), 3.38 - 3.73 (m, 83H), 2.53 (t, J = 6.33 Hz, 2H), 2.32 (t, J = 6.87 Hz, 2H), 2.27 (t, J = 6.33 Hz, 6H), 2.1 (s, 9H), 2.04 (t, J = 7.17 Hz, 6H), 1.99 (s, 9H), 1.88 (s, 9H), 1.76 (s, 9H), 1.45- 1.54 (m, 18H).
13C RMN (75 MHz, DMSO-d6)
8 172.51, 170.65, 170.58, 170.5, 170.21, 169.94, 101.53, 71.02, 70.32, 70.21,70.03, 69.22, 68.78, 67.90, 67.24, 66.52, 61.98, 51.87, 49.90, 36.92, 36.83, 36.57, 35.59, 34.98, 29.89, 29.13, 23.31, 22.39,21.01
f. Síntesis de 3GT3:
Se disolvió el éster metílico de 3GT2 (1.4 g, 0.66 mmol) en una solución de MeOH (30 ml) y H2O (10 ml), se añadió monohidrato de LiOH (1.1 g, 26.22 mmol) y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 4 h. La mezcla de reacción se concentró en el evaporador rotatorio, luego se diluyó con H2O (10 ml). La mezcla se acidificó con HCl 1 N, hasta pH = 3~4. La mezcla se cargó en una columna C18 (80 g) y se purificó por cromatografía de fase reversa (ISCO) (elución en gradiente de 0% a 60% de CH3CN/H2O). Después de la liofilización, se obtuvo 3GT3 como un sólido incoloro (634 mg, 55%).
1H RMN (300 MHz, DMSO-d6) 87.86 (t, J = 5.76 Hz, 3H), 7.74 (t, J = 5.76 Hz, 3H), 7.62 (d, J = 8.79 Hz, 3H), 7.15 (s, 1H), 4.48-4.63 (m, 9H, OH), 4.20 (d, J = 8.25 Hz, 3H), 3.47-3.73 (m, 52H), 3.26-3.37 (m, 4H), 2.95-3.10 (m, 12H), 2.42 (t, J = 6.33 Hz, 2H), 2.32 (t, J = 6.33 Hz, 2H), 2.27 (t, J = 6.33 Hz, 6H), 2.04 (t, J = 6.87 Hz, 6H), 1.79 (s, 9H), 1.40 - 1.51 (m, 18H).
13C RMN (75 MHz, DMSO-d6)
8 173.33, 172.62, 170.91, 170.67, 170.09, 101.94, 75.82, 72.08, 70.31,70.03, 68.77, 68.45, 68.08, 67.90, 67.41,66.93, 61.03, 60.17, 52.61, 37.11, 36.93, 36.83, 36.57, 35.65, 35.52, 29.88, 29.19, 23.60, 22.52
g. Síntesis del ligando de GalNActricatenario (3GT5S):
A una mezcla de 3GT3 (36 mg, 0.021 mmol) en DMF (3 ml) se añadió EDC (5.96 mg, 0.031 mmol) y NHS (6.99 mg, 0.061 mmol), y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se concentró en el evaporador rotatorio (40°C), y el residuo se cargó en una columna C18 (13 g) y se purificó por cromatografía de fase reversa (ISCO) (elución en gradiente de H2O (TFA al 0.1%) a CH3CN al 60%/H2O (0.1% TfA)). Después de la liofilización, se obtuvo 3GT5S como un sólido blanquecino (21 mg, 55%).
1H RMN (300 MHz, DMSO-d6) 87.85 (t, J = 5.76 Hz, 3H), 7.74 (t, J = 5.76 Hz, 3H), 7.62 (d, J = 8.79 Hz, 3H), 7.14 (s, 1H), 4.55 - 4.63 (m, 6H, OH), 4.48 (d, J = 3.84 Hz, 3H, OH), 4.20 (d, J = 7.95 Hz, 3H), 3.47 - 3.73 (m, 52H), 3.26 - 3.37 (m, 4H), 2.95 - 3.10 (m, 12H), 2.91 (t, J = 6.03 Hz, 2H), 2.80 (s, 4H), 2.32 (t, J = 6.33 Hz, 2H), 2.27 (t, J = 6.57 Hz, 6H), 2.03 (t, J = 7.29 Hz, 6H), 1.78 (s, 9H), 1.40-1.51 (m, 18H).
Ejemplo 10. Síntesis de monómero de fosfoamidita conjugado con N-acetil galactosamina (GalNAc) con el GalNAc unido a través de la nucleobase
El esquema III a continuación muestra los pasos implicados en la síntesis de monómeros conjugados con GalNac (D6). D3 se obtuvo comercialmente y es una timidina modificada que tiene el enlazador unido al grupo metilo en C5.
Esquema
Figure imgf000074_0001
a. Síntesis de D4
A una solución de (E)-3-(1-((2R,4S,5R)-5-((bis(4-metoxifenil)(fenil)metoxi)metil)-4-hidroxitetrahidrofurano-2-ilo)-2,4-dioxo-1,2,3,4-tetrahidropirimidin-5-il)-N-(6-(2,2,2-trifluoroacetamido)hexil)acrilamida (D3) (4.55 g, 5.73 mmol, 1 equivalente, Glen Research) en metanol (24 ml) se añadieron 36 ml de solución concentrada de hidróxido de amonio (Fisher) durante 5-10 minutos. La solución se agitó a temperatura ambiente y se controló mediante MS y TLC (gel de sílice, elución con EtOAc al 100% o 10% (NH3 7M en MeOH)/DCM, y visualizar con UV o teñir con ácido fosfomolibódico (PMA) o H2SO4/MeOH). Después de 24 horas, todavía quedaba una pequeña cantidad de SM. Se añadió K2CO3 (222 mg, 1,61 mmol, 0,28 equivalentes). La mezcla de reacción se agitó otras 15 horas, momento en el cual se añadió más K2CO3 (103 mg, 0,748 mmol, 0,13 equivalentes). La solución se agitó durante 3 horas a temperatura ambiente. Los volátiles se evaporaron en un evaporador rotatorio (temperatura del baño <33°C). MS CI POS: 795 (1), 753.3 (5), 699.3 (100), 303.1 (20). El residuo se disolvió en aproximadamente 10% de MeOH/DCM (aproximadamente 7 ml) con sonicación, y esta solución se depositó en una columna ISCO equilibrada: columna de 80 g (ISCO Gold), se eluyó con (NH37M en MeOH)/DCM 0.75% a 15%. UV 280 nm, 254 nm. Las fracciones deseadas se combinaron y se evaporaron para dar un sólido de espuma que se trituró hasta un polvo blanquecino que se secó a vacío a temperatura ambiente durante varios días para dar D4: 4.17 g (cuantitativamente).
b. Síntesis de D5
Ácido 5-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-acetamido-4,5-diacetoxi-6-(acetoximetil)tetrahidro-2H-piran-2-il)oxi)pentanoico (G2') (1.60 g, 3.58 mmol, 1.20 equivalentes) se disolvió en 12 ml de DMF seco a temperatura ambiente (con breve sonicación). A esta solución se añadió, en este orden: trietilamina (0.60 ml, 1.44 equivalentes, Aldrich anhidro), hidroxibenzotriazol hidrato (hidrato de HOBt), (0.459 g, 1.00 equivalentes, CHEM-IMPEX), CMC (1.65 g, 1.30 equivalentes, Aldrich), y la amina SM (D4) (2.09 g, 2.99 mmol, 1.0 equivalentes). Se añadieron 12 ml de DMF seco para enjuagar el matraz. La solución se sometió a sonicación brevemente para disolver el último trozo de amina SM (D4). La solución transparente se agitó bajo N2 a temperatura ambiente durante la noche, y se controló por TLC (gel de sílice, eluir con EtOAc al 100% o 10% (NH3 7M en MeOH)/DCM, y visualizar con UV o teñir con PmA o H2SO4/MeOH). Después de 19 horas, la solución de reacción se concentró en el evaporador rotatorio para eliminar casi todo el DMF (temperatura del baño de agua <39°C) para dar una suspensión. Esto se disolvió en MeOH (pocos ml) y DCM (6 ml) y se depositó en una columna ISCO equilibrada y se purificó por cromatografía instantánea: 120 g de gel de sílice, 0.5%-14% (NH3 2.3M en MeOH) en DCM. UV 214 nm, 254 nm. Las fracciones deseadas se combinaron y se evaporaron para dar D5: 2.36 g (70%).
c. Síntesis de D6
D5 (2.24 g, 1.99 mmol, 1 equivalentes) se disolvió en diclorometano (30 ml, Aldrich. Anhidro) a temperatura ambiente bajo N2. Se añadió diisopropiletilamina (1.40 ml, 8.18 mmol, 4.12 equivalentes, Aldrich. Anhidro). La solución se agitó durante unos minutos, luego se añadió 2-cianoetil N,N-diisopropilclorofosforamidita (0.90 ml, 4.0 mmol, 2.0 equivalentes, Toronto Research) mediante una jeringa, gota a gota durante aproximadamente 1 minuto. La solución transparente casi incolora resultante se agitó a temperatura ambiente y se controló por TLC: 10% (NH3 7M en MeOH)/DCM o MeOH al 10%/DCM; UV, PMA o H2SO4/MeOH. Quedaba muy poco D5 después de 3 horas. (D6 tiene un Rf mayor que D5). Después de 4.5 horas, la solución de reacción se inactivó con 1 ml de MeOH y se agitó durante 5 minutos. Luego se concentró hasta un volumen de aproximadamente 5 ml y se depositó en una columna equilibrada, y se purificó por FC sobre gel de sílice (ISCO): columna de 120 g, eluyendo con 2% a 60% [20% (NH32.33 M en MeOH)]/DCM. Las fracciones deseadas se combinaron y se evaporaron para dar un sólido de espuma vítrea casi incoloro que se secó a vacío a temperatura ambiente para dar 1.56 g (59%) de D6.
Ejemplo 11 Síntesis de dsNA que comprende un tallo-bucle con cuatro ligandos de N-acetil-galactosamina (GalNac) en el bucle
Se produjeron oligómeros de tallo-bucle en los que el ligando GalNac se conjuga con un monómero en el bucle se produjeron de acuerdo con el esquema A. (Hágase referencia a las páginas 208-209)
a. Síntesis de la hebra en sentido A2
En un tubo Falcon de 15 ml, el compuesto A1 (30 mg, 0.00252 mmol) se disolvió en dimetilacetamida 3:1 desgasificada/agua desionizada (750 pl). En un vial de centelleo de 2 ml, se disolvió azido-Pegl 1-amina (Quanta BioDesign, pedido #10524, 46 mg, (0.00806 mmol) en dimetilacetamida desgasificada/agua desionizada 3:1 (150 pl). En un vial de centelleo de 2 ml, se disolvió complejo de bromuro de cobre (I) dimetil sulfuro de 16.6 mg, 0.0806 mmol) en acetonitrilo desgasificado (300 pl).
La solución de peg-azida se añadió a la solución de ARN seguido de la adición de CuBr como solución/suspensión. La solución de reacción se volvió de color verde azulado tras la adición del reactivo CuBr. La mezcla de reacción se calentó a 40°C durante 1 hora en un agitador y la reacción se controló por LC-MS (2-40% de agua/ACN con HFIP 100 mM y gradiente de trietilamina 8.3 mM durante 2 minutos, BEH C182,1x50 mm).
El producto deseado se observó por LC-MS. La reacción se inactivó con ácido etilendiaminotetraacético 0.5 M, pH 8 (5 ml). Esta reacción se colocó en el agitador durante 15 minutos y luego se dializó contra agua (1x) usando una membrana Millipore 10K de 15 ml (4200 rpm, 15 minutos, 4°C).
La mezcla de reacción se purificó por cromatografía de emparejamiento de iones (5-25% de agua/acetonitrilo que contenía acetato de trietilamonio 100 mM durante 35 minutos, XBridge C18 19x150 mm). Las fracciones del producto se agruparon y se dializaron contra agua 3x usando una membrana Millipore 10K de 15 ml (4200 rpm, 15 minutos, 4°C) y se liofilizaron en un tubo Falcon de 15 ml para proporcionar un sólido blanco amorfo, Compuesto A2 (18 mg).
b. Síntesis de la hebra en sentido A3
En un vial Eppendorf de 1.5 ml, el Compuesto Organix 1 (27.6 mg, 0.066 mmol) se disolvió en DMSO anhidro (200 pl). En un tubo de halcón de 15 ml por separado, el Compuesto A2 (50 mg, 0.005 mmol) se disolvió en agua (2000 ul) y se diluyó con DMSO (200 ul). La solución que contenía G3 se añadió a la solución que contenía Compuesto A2 seguido de la adición de trietilamina (30.67ul).
La solución resultante se colocó en un agitador y se controló mediante UPLC-MS para la formación de producto deseado. La mezcla de reacción se purificó por cromatografía de apareamiento iónico (agua/acetonitrilo al 5-40% que contenía acetato de trietilamonio 100 mM durante 35 minutos, XBridge C18 19x150 mm). Las fracciones del producto se agruparon y se dializaron contra agua 3x usando una membrana Millipore 10K de 15 ml (4200 rpm, 15 minutos y 4°C) y se liofilizaron en un tubo Falcon de 15 ml para proporcionar una hebra A3 sólido, amorfo y blanco.
c. Síntesis de Doble A5
La hebra en sentido A3 (13.08 mg) se disolvió en agua DI (5 ml) y se añadió a un vial que contenía la hebra antisentido A4 (complementaria a A3, obtenida comercialmente) (0.812 mg) en agua (0.812 ml). La solución resultante se mezcló y se calentó a 90°C durante 3 minutos y se dejó enfriar a temperatura ambiente durante 5 minutos. La solución se liofilizó para proporcionar el doble como un sólido blanco amorfo, doble A5.
Ejemplo 12. Síntesis de dsNA de tallo-bucle con tres ligandos GalNac en el bucle
Se produjo un oligómero de tallo-bucle con los monómeros conjugados de GalNac en el bucle. El siguiente esquema ilustra la síntesis del oligómero de tallo-bucle conjugado de GalNac en donde los monómeros de GalNac están confinados al bucle y son tres en número (Esquema B) como se muestra en las páginas 216-217.
La hebra en sentido B1 y la hebra complementaria a la hebra en sentido B3 (denominada antisentido B4) se obtuvieron por síntesis de fabricantes comerciales usando procedimientos estándar de síntesis de ácidos nucleicos en fase sólida. La hebra en sentido B2 se sintetizó de manera similar a la síntesis de la hebra en sentido A2 como se describió anteriormente. La hebra en sentido B3 se sintetizó de manera similar a la síntesis de la hebra en sentido A3 como se describió anteriormente. El doble B5 se sintetizó de manera similar a la síntesis del compuesto A5 como se describió anteriormente.
Ejemplo 13. Síntesis de dsNA de tallo-bucle con ligandos de GalNac ramificados en el bucle
Se produjo un oligómero de tallo-bucle con los monómeros conjugados de GalNac en el bucle. El esquema C ilustra la síntesis del oligómero de tallo-bucle conjugado de GalNac donde el monómero de GalNac está confinado al bucle y contiene un ligando GalNac tricatenario como se muestra en Esquema C (Hágase referencia a las páginas 218-219) como 3GT3.
La hebra en sentido C1 y la hebra complementaria a C3 (denominada hebra antisentido C4) se obtuvieron por síntesis de fabricantes comerciales usando procedimientos estándar de síntesis de ácidos nucleicos en fase sólida. La hebra en sentido C2 se sintetizó de manera similar a la síntesis del compuesto A2 como se describió anteriormente.
En un tubo de falcón de 15 ml, la hebra C2 de detección (24 mg, 0.002 mmol) se disolvió en agua (400 j l ) y luego se diluyó con DMSO (1000 ul). En un vial Eppendorf de 1.5 ml separado, el compuesto 3GTS (40.79 mg, 0.023 mmol) se disolvió en DMSO anhidro (150 jl). A la solución que contiene 3GTS, HATU ((1-[Bis(dimetilamino)metileno]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinio 3-oxidi hexafluorofosfato, 8.93 mg, 0.023 mmol) en DMSO (50 ul) y se añadieron N,N-diisopropiletilamina (8.2 ul, 0.047 mmol). Después de 5 minutos, se añadió la solución que contenía la hebra en sentido C2 a la mezcla de reacción.
La mezcla de reacción se colocó en un agitador y se controló mediante UPLC-MS para la formación deseada del producto. La mezcla de reacción se purificó por cromatografía de apareamiento iónico (agua/acetonitrilo al 5-40% que contenía acetato de trietilamonio 100 mM durante 35 minutos, XBridge C18 19x150 mm). Las fracciones del producto se agruparon y se dializaron contra agua 3x usando una membrana Millipore 10K de 15 ml (4200 rpm, 15 minutos y 4°C) y se liofilizaron en un tubo Falcon de 15 ml para proporcionar un sólido amorfo de hebra blanca C3. El doble C5 se sintetizó de manera similar a la síntesis del doble A5 como se describió anteriormente.
Ejemplo 14. Síntesis de dsNA de tallo-bucle con cuatro ligandos GalNac en el tallo
Se produjo un oligómero de tallo-bucle con los monómeros conjugados de GalNac en el tallo. El siguiente esquema ilustra la síntesis del oligómero de tallo-bucle conjugado de GalNac donde los monómeros de GalNac están confinados al tallo y son cuatro en número (Esquema D) como se muestra en las páginas 220-221.
La hebra en sentido D1 y la hebra complementaria a D3 (denominada hebra antisentido D4) se obtuvieron por síntesis de fabricantes comerciales usando procedimientos estándar de síntesis de ácidos nucleicos en fase sólida. La hebra en sentido D2 se sintetizó de manera similar a la síntesis de la hebra en sentido A2 como se describió anteriormente. La hebra en sentido D3 se sintetizó de manera similar a la síntesis de la hebra en sentido A3 como se describió anteriormente. El doble D5 se sintetizó de manera similar a la síntesis del compuesto A5 como se describió anteriormente.
Ejemplo 15 Síntesis de oligómeros de dsNA con múltiples ligandos GalNac en la extensión 5' de la hebra antisentido
Se produjo un oligómero de dsNA con monómeros conjugados con GalNac en la región de extensión 5' de la hebra antisentido. El siguiente esquema ilustra la síntesis de un oligómero de dsNA que comprende ligandos GalNac donde los ligandos están confinados a la extensión en la región 5' de la hebra antisentido y son cuatro en número (Esquema E, hágase referencia a las páginas 222-233). Sin embargo, el número de monómeros conjugados con GalNac podría variar y la posición de los ligandos de GalNac también puede variar en cualquier lugar a lo largo de la hebra antisentido.
La hebra antisentido E1 y la hebra complementaria a E2 (denominada hebra en sentido E3) se obtuvieron por síntesis de fabricantes comerciales usando procedimientos estándar de síntesis de ácidos nucleicos en fase sólida. La hebra antisentido E2 se sintetizó de manera similar a la de los esquemas descritos anteriormente. El doble E4 se sintetizó de manera similar a la síntesis del doble A5 como se describió anteriormente.
Ejemplo 16. Síntesis de dsNA con múltiples ligandos GalNac en la extensión 5' de la hebra en sentido
Se produjo un oligómero de dsNA con monómeros conjugados con GalNac en la región de extensión 5' de la hebra en sentido. El siguiente esquema ilustra la síntesis de un oligómero de dsNA que comprende ligandos de GalNac donde los ligandos están confinados a la extensión en la región 5' de la hebra en sentido y son cuatro en número (Esquema F, hágase referencia a las páginas 224-225). Sin embargo, el número de monómeros conjugados con GalNac podría variar y la posición de los ligandos de GalNac también puede variar en cualquier lugar a lo largo de la hebra en sentido.
La hebra en sentido F1 y la hebra complementaria a F2 (denominada hebra antisentido F3) se obtuvieron por síntesis de fabricantes comerciales usando procedimientos estándar de síntesis de ácidos nucleicos en fase sólida. La hebra en sentido F2 se sintetizó de manera similar a la síntesis de la hebra en sentido A3 como se describió anteriormente. El doble F4 se sintetizó de manera similar a la síntesis del doble A5 como se describió anteriormente.
Ejemplo 17. Síntesis de dsNAs con múltiples ligandos de N-acetil-galactosamina separados por un espaciador en la extensión 5' de la hebra en sentido separada por un espaciador
Se produjo un oligómero de dsNA con monómeros conjugados con GalNac en la región de extensión 5' de la hebra en sentido separada por un espaciador. El siguiente esquema ilustra la síntesis de un oligómero de dsNA que comprende ligandos GalNac donde los ligandos están confinados a la extensión en la región 5' de la hebra en sentido y son cuatro en número (Esquema G, hágase referencia a las páginas 226-227). Sin embargo, el número de monómeros conjugados con GalNac podría variar y la posición de los ligandos de GalNac también puede variar en cualquier lugar a lo largo de la hebra en sentido. La extensión que comprende ligandos GalNac separados por un separador también se puede colocaren la región 5' de la hebra antisentido.
La hebra en sentido G1 y la hebra complementaria a G2 (denominada hebra antisentido G3) se obtuvieron por síntesis de fabricantes comerciales usando procedimientos estándar de síntesis de ácidos nucleicos en fase sólida. La hebra en sentido G2 se sintetizó de manera similar a la síntesis de la hebra en sentido A3 como se describió anteriormente. El doble G4 se sintetizó de manera similar a la síntesis del doble A5 como se describió anteriormente.
Ejemplo 18. Síntesis de dsNAs con múltiples ligandos de N-acetil-galactosamina separados por dos espaciadores en la extensión 5' de la hebra en sentido
Se produjo un oligómero de dsNA con monómeros conjugados con GalNac en la región de extensión 5' de la hebra en sentido separada por dos espaciadores. El siguiente esquema ilustra la síntesis de un oligómero de dsNA que comprende ligandos GalNac donde los ligandos están confinados a la extensión en la región 5' de la hebra en sentido y son cuatro en número (Esquema H, hágase referencia a las páginas 228-229). Sin embargo, el número de monómeros conjugados con GalNac, el número de espaciadores podría variar y la posición de los ligandos de GalNac también puede variar en cualquier lugar a lo largo de la hebra en sentido. La extensión que comprende ligandos GalNac separados por separadores también se puede colocar en la región 5' de la hebra antisentido.
La hebra en sentido H1 y la hebra complementaria a H2 (denominada hebra antisentido H3) se obtuvieron por síntesis de fabricantes comerciales usando procedimientos estándar de síntesis de ácidos nucleicos en fase sólida. La hebra en sentido H2 se sintetizó de manera similar a la síntesis de la hebra en sentido A3 como se describió anteriormente. El doble H4 se sintetizó de manera similar a la síntesis del doble A5 como se describió anteriormente.
Ejemplo 19. Síntesis de oligómeros de dsNA con múltiples ligandos de GalNac en la extensión 5' de la hebra en sentido separada del doble por múltiples espaciadores
Se produjo un oligómero de dsNA con monómeros conjugados con GalNac en la región de extensión 5' de la hebra en sentido separada de la región doble por múltiples espaciadores. El siguiente esquema ilustra la síntesis de un oligómero de dsNA que comprende ligandos GalNac donde los ligandos están confinados a la extensión en la región 5' de la hebra en sentido y son cuatro en número y están separados del doble por múltiples espaciadores. (Esquema I, hágase referencia a las páginas 230-231). Sin embargo, el número de monómeros conjugados con GalNac, el número de espaciadores podría variar y la posición de los ligandos de GalNac también pueden variar en cualquier lugar a lo largo de la hebra en sentido. La extensión que comprende ligandos GalNac separados por separadores del doble también se puede colocar en la región 5' de la hebra antisentido.
La hebra en sentido I1 y la hebra complementaria a I2 (denominada hebra antisentido 13) se obtuvieron por síntesis de fabricantes comerciales usando procedimientos estándar de síntesis de ácidos nucleicos en fase sólida. La hebra en sentido I2 se sintetizó de manera similar a la síntesis de la hebra en sentido A3 como se describió anteriormente. El doble I4 se sintetizó de manera similar a la síntesis del doble A5 como se describió anteriormente.
Ejemplo 20. Síntesis de oligómeros de dsNA con múltiples ligandos GalNac en la extensión 5' de la hebra antisentido separada por dos espaciadores
Se produjo un oligómero de dsNA con monómeros conjugados con GalNac en la región de extensión 5' de la hebra antisentido separada por dos espaciadores. El siguiente esquema ilustra la síntesis de un oligómero de dsNA que comprende ligandos GalNac donde los ligandos están confinados a la extensión en la región 5' de la hebra antisentido y son cuatro en número (Esquema J, hágase referencia a las páginas 232-233). Sin embargo, el número de monómeros conjugados de GalNac, el número de espaciadores podría variar y la posición de los ligandos de GalNac también puede variar en cualquier lugar a lo largo de la hebra antisentido. La extensión que comprende ligandos GalNac separados por espaciadores también se puede colocar en la región 5' de la hebra en sentido.
La hebra antisentido J1 y la hebra complementaria a J2 (denominada hebra antisentido J3) se obtuvieron por síntesis de fabricantes comerciales usando procedimientos estándar de síntesis de ácidos nucleicos en fase sólida. La hebra antisentido J1, J2 se sintetizó de manera similar a la síntesis de la hebra en sentido A3 como se describió anteriormente. El doble J4 se sintetizó de manera similar a la síntesis del doble A5 como se describió anteriormente.
Ejemplo 21 Síntesis de oligómeros de dsNA con múltiples ligandos GalNac en la extensión 5' de la hebra antisentido separada del doble por múltiples espaciadores
Se produjo un oligómero de dsNA con monómeros conjugados con GalNac en la región de extensión 5' de la hebra antisentido separada de la región doble por múltiples espaciadores. El siguiente esquema ilustra la síntesis de un oligómero de dsNA que comprende ligandos GalNac donde los ligandos están confinados a la extensión en la región 5' de la hebra antisentido y son cuatro en número y están separados del doble por múltiples espaciadores. (Esquema K1, hágase referencia a las páginas 235-236). Sin embargo, el número de monómeros conjugados de GalNac, el número de espaciadores podría variar y la posición de los ligandos de GalNac también puede variar en cualquier lugar a lo largo de la hebra antisentido. La extensión que comprende ligandos GalNac separados por separadores del doble también se puede colocar en la región 5' de la hebra en sentido.
La hebra antisentido K1 y la hebra complementaria a K2 (denominada hebra antisentido K3) se obtuvieron por síntesis de fabricantes comerciales usando procedimientos estándar de síntesis de ácidos nucleicos en fase sólida. La hebra antisentido K1 y K2 se sintetizaron de manera similar a la síntesis de la hebra en sentido A3 como se describió anteriormente. El doble K4 se sintetizó de manera similar a la síntesis del doble A5 como se describió anteriormente.
Ejemplo 22. Autoadministración in vitro de DARNsi conjugados con GalNAc a hepatocitos de ratón en cultivo
Se usaron ratones hembra CD-1 o C57-BL/6 de 8 a 10 semanas de edad para la preparación primaria de hepatocitos. Los ratones fueron anestesiados con isoflurano. Una vez anestesiados, se abrió la cavidad abdominal y se canuló la vena cava con un catéter de calibre 18 y se cortó la vena porta para drenar la sangre del hígado. El hígado se perfundió con regulador de perfusión [HBSS, EDTA 1 mM (Boston Bioproducts)] durante 5-10 minutos, a una velocidad de flujo de 5 ml/min hasta que el perfundido fue transparente. Luego se perfundió el hígado con regulador de colagenasa II [DMEM (Gibco), b Sa al 1% (Fisher), 0.8 mg/ml de colagenasa I (laboratorios Worthington)] a 37°C durante 5-10 minutos. El hígado digerido se transfirió a la solución fría III [DMEM (Gibco), BSA al 1% (Fisher)] y se trituró. La suspensión celular se pasó a través de una malla de 70 pm (Corning) y se centrifugó a 50 x g durante 3 minutos. El sobrenadante se desechó y el sedimento se lavó en solución fría III dos veces más, seguido de un lavado en regulador de William con suplementos de descongelación y recubrimiento (Life Technologies). La viabilidad y la concentración de los hepatocitos se estimaron por exclusión de azul Trypan y contando en un hemocitómetro. Las células se sembraron en placas de 96 pocillos recubiertas con colágeno I (Corning) a una concentración de 5 x 104 células por pocillo y se incubaron a 37°C, 5% de CO2 en una atmósfera humidificada durante 4-5 horas. El medio se cambió a medio de William con suplementos de mantenimiento (Life Technologies) y se añadieron concentraciones variables de oligonucleótidos conjugados con GalNAc al medio y las células se incubaron durante 24 horas, después de lo cual el medio se renovó y las células crecieron durante otras 24 horas. Luego se sometieron a lisis las células y se purificó el ARN usando el kit SV96 (Promega), el ARN se realizó transcripción reversa usando el kit de síntesis de la primera hebra Transcriptor (Roche).
La cantidad relativa del gen diana se midió por qPCR multiplexado en un sistema Bio-Rad CFX96, normalizado a un gen de mantenimiento multiplexado. Se calculó el porcentaje restante de una transcripción seleccionada en relación con un control no tratado y se estimaron los valores de IC50 por regresión no lineal. En la Figura 25 A y B se muestran ejemplos de datos de autoadministración in vitro (sin el uso de agentes transfectantes) de compuestos/conjugados seleccionados. La figura 25A muestra la actividad de las moléculas de dsNA con extensión y la figura 25B muestra la actividad de moléculas de dsNA con tetrabucle. Las moléculas de extensión difieren entre sí en el patrón y la naturaleza de las modificaciones, como lo ilustran las teclas digramáticas en la figura. Asimismo, las moléculas de tetrabucle en la figura 25B difieren entre sí en el patrón y la naturaleza de las modificaciones. La información de la secuencia para las moléculas de dsNA se muestra en la Tabla 3. Estos datos demostraron que los conjugados de dsNA de GalNAc, incluyendo la extensión 5' y el tetrabucle con muesca, se autoadministran a los hepatocitos primarios en cultivo con IC50 nM bajas.
Ejemplo 23. Unión libre de células in vitro a CD301
La unión de constructos monovalentes y tricatenarios de N-acetil-galactosamina se estimó usando un ensayo de unión por competición de polarización de fluorescencia. El ligando trazador era un constructo de N-acetil-galactosamina sintetizada FITC-tricatenario personalizada - 3GT1'-FITC. Se incubaron una concentración constante de 4 |jg/ml de receptor de asialoglicoproteína de macrófagos - CD301 (sistemas de I+D) y 3GT1' -FITC 50 nM a 25°C en regulador de unión (HEPES 20 mM pH 7.4, NaCl 150 mM, CaCl21 mM, MgCh 0.5 mM) junto con concentraciones variables de dsNAs. Las mediciones de polarización de fluorescencia se realizaron después de 30 minutos en un lector de microplacas Spectramax M5 (Molecular Devices). La unión de los conjugados de dsNA se estimó como una disminución en las unidades de polarización a través del desplazamiento de 3GT1'-FITC de CD301. La unión relativa de cada conjugado de dsNA se estima a través de la regresión no lineal y el cálculo de los valores de IC50. En la figura 13 se muestran ejemplos de datos de unión in vitro de compuestos/conjugados seleccionados. Estos datos demostraron que los conjugados de dsNA basados en la extensión 5' y el ASLOpr de enlace de tetrabucle con muesca efectivamente y en muchos casos mostraron una mejor afinidad de unión en comparación con el conector Tris GalNAc tri-catenario basado (DP2465P:DP2382G).
La unión libre de células a CD301 de un conjugado de dsNA unido a ligandos de GalNAc a través de un conector acetal (véase el Ejemplo 25 para síntesis) y un conjugado de dsNA unido a ligandos de GalNAc a través de un conector 2'-triazol fue comparable (Figura 48). Estos dos agentes de dsNA contenían la misma secuencia de ácido nucleico y el ligando GalNAc de modo que solo el conector difería entre los dos agentes. La unión libre de células del conjugado de dsNA con el conector 2'-triazol de la Figura 48 y un conjugado de dsNA con el mismo conector de triazol, pero con la misma longitud del conector de PEG que el conector acetal de la Figura 48 también fueron comparables (Hágase referencia a la Figura 49). Esto muestra que el uso de un conector acetal en lugar del conector 2'-triazol no dañó la unión del conjugado de dsNA. Es interesante observar que la actividad de las moléculas de dsNA en términos de anulación de la diana o unión al receptor no se vio muy afectada debido al aumento o disminución de la longitud del conector. Fue sorprendente saber que el conector de acetal fue capaz de sobrevivir a los rigores de la síntesis de ácidos nucleicos y todavía era funcional en condiciones in vivo/in vitro para entregar el conjugado al receptor. (Hágase referencia a las Figuras 48-50).
Se probó la potencia de eliminación in vitro de los dos dsNA GalNAc descritos anteriormente con conectores de triazol, pero con segmentos PEG de longitud diferente del conector. La Figura 50 muestra que los dos conjugados de dsNA tenían una potencia de anulación intrínseca comparable en ratones, lo que demuestra que cambiar la longitud de PEG en el conector no cambió la función in vivo del agente de dsNA.
Las preparaciones de ligandos de GalNAc, monómeros que contienen GalNAc y conjugados de oligonucleótidos de GalNAc se describen a continuación en los ejemplos y esquemas sintéticos. Las secuencias de oligonucleótidos específicos utilizados para los compuestos y/o conjugados descritos a continuación se muestran en la Tabla 3.
Ejemplo 24. Evaluación in vivo de la estabilidad, inmunogenicidad y actividad de IARN
Los ratones de ingeniería genética enfermos o de tipo salvaje se dosificaron mediante inyección subcutánea o intravenosa en menos de 200 ul de volumen. Los animales fueron observados por cambios de comportamiento o fisiológicos. Para el análisis farmacocinético y farmacodinámico, los animales fueron sacrificados 24 a 168 horas después de la última dosis, según lo indicado por la asfixia por CO2. Se recogieron muestras de sangre y tejidos siguiendo procedimientos estándar. Para el análisis de ARNm, los tejidos se almacenaron en el congelador más tarde hasta que se realizó RT-qPCR siguiendo protocolos estándar. Los tejidos congelados también se recolectaron para el análisis occidental e inmunohistoquímico. Se recogieron muestras de orina y se analizaron los metabolitos durante el curso del estudio utilizando el método enzimático o LC/MS. El análisis de citoquinas, recuento de células sanguíneas y química sanguínea se realizó siguiendo procedimientos estándar. Ejemplos de datos in vivo de compuestos/conjugados seleccionados se muestran en las Figuras 27, 28, 29 y 30. Estos datos demostraron que los conjugados de dsNA de GalNAc que incluyen la extensión 5' en la hebra en sentido y los constructos de tetrabucle con muesca son activos para derribar el ARNm objetivo en vivo en ratones cuando se dosifica por vía subcutánea e intravenosa.
Ejemplo 25. Síntesis del monómero de fosfoamidita conjugado con N-acetil galactosamina (GalNAc) con el GalNAc unido a través del conector 2'-acetal
El ligando de GalNAc no solo puede unirse a la nucleobase del monómero de nucleósidos (es decir, la posición C5 de timidina como se muestra en el ejemplo 8, 9), sino que también puede unirse al azúcar ribosa a través de 2'-OH (o 3'-OH) con un enlazador. El 2'-OH como sitio de conjugación es particularmente útil en el caso del DARNsi de tetrabucle porque los 2'-OH de los cuatro nucleótidos en el bucle están expuestos al solvente y no están involucrados en el enlace de hidrógeno y el apilamiento de bases que es necesario para formar el bucle estable basado en su estructura cristalina. La química de acetal utilizada para instalar el enlazador en 2'-OH (que se muestra en los siguientes esquemas IV-VI, hágase referencia a las páginas 198-200) es mucho más suave en comparación con las condiciones de alquilación tradicionales; por lo tanto, permita la conjugación selectiva a la posición 2'. Esto evitará la tediosa separación de la mezcla de isómeros 2' y 3' y mejorará significativamente el rendimiento. La síntesis de los compuestos 2-4 se representa en el esquema IV, la síntesis de los compuestos 5-9 se representa en el esquema V y la síntesis de los compuestos 10 y 11 se representa en el esquema VI. (Hágase referencia a la página 198-200).
a. Síntesis del Compuesto 2
Se añadieron 2-(2-aminoetoxi)etanol (105.0 g), trietilamina (101.0 g) y trifluoroacetato de etilo a un matraz y la mezcla se agitó durante 24 h. Se añadió diclorometano (1 L) y la solución se lavó con agua (500 ml). La capa orgánica se secó (MgSO4) y se evaporó para dar un líquido (161.0 g).
b. Síntesis del Compuesto 3
La mezcla del compuesto 2 (161.0 g) y paraformaldehído (24.0) en cloruro de metileno (200 ml) se enfrió en un baño de hielo con agitación. Se burbujeó cloruro de hidrógeno anhidro a través de la mezcla durante 3 h. La mezcla de reacción se dejó hasta temperatura ambiente y se separaron dos capas homogéneas claras. La capa orgánica se secó sobre cloruro de calcio anhidro y se concentró en un evaporador rotatorio a líquido (201 g).
c. Síntesis del Compuesto 4
El compuesto 3 obtenido se disolvió en acetonitrilo (200 ml) y se añadió acetato de sodio (100 g). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 14 h. El precipitado se filtró; el filtrado se concentró en un evaporador rotatorio a líquido. El residuo se disolvió en acetato de etilo (100 ml) y se lavó con una solución acuosa al 10% de hidrogenocarbonato de sodio (50 ml) y agua (2x50 ml). La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se concentró en un evaporador rotatorio a líquido (176.0 g) (MS M-1: 272,0).
d. Síntesis del Compuesto 69
A una solución fría (-15°C) bajo nitrógeno del nucleósido 5 (61.3 g) y el compuesto 4 (55 g) en 1,2-diclorometano (500 ml), se añadió tetracloruro de estaño (18 ml) y la solución se mantuvo a -12°C durante 20 min. Se añadieron una solución acuosa saturada de hidrogenocarbonato de sodio (500 ml) y cloruro de metileno (1 L) y la suspensión se agitó a 0 °C durante 20 min. La suspensión se filtró, la capa orgánica se separó, se lavó con agua (200 ml), se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se evaporó hasta sequedad. El residuo se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice. La columna se eluyó con cloruro de metileno-metanol (100:0-95:5), y luego la evaporación de las fracciones apropiadas para dar el compuesto 6 como una espuma (55.2 g) (MS M-1: 825.4).
e. Síntesis del Compuesto 7
El nucleósido 6 (55 g) se disolvió en trihidrato de fluoruro de tetrabutilamonio 0.5 M en tetrahidrofurano (1 L), se mantuvo durante 10 minutos a 20°C, se evaporó a sequedad, se evaporó con cloroformo (10 ml) y se aplicó en una columna con gel de sílice. La columna se eluyó con cloruro de metileno-metanol (100:0-90:10), y luego la evaporación de las fracciones apropiadas para dar el compuesto 7 como una espuma (30.5 g) (MS M-1: 583.2).
f. Síntesis del Compuesto 8
El nucleósido 7 (30.0 g) se secó por evaporación con piridina (2x20 ml). El residuo se disolvió en piridina seca (300 ml), se añadió cloruro de dimetoxitritilo (18.2 g) y la solución resultante se mantuvo durante 16 h a 20°C. Se añadió MeOH (10 ml) y después de 30 minutos, la mezcla se concentró al vacío hasta casi la sequedad. El residuo se disolvió en cloruro de metileno (500 ml) y se lavó con una solución acuosa al 10% de bicarbonato de sodio (200 ml) y agua (2x200 ml). La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio anhidro, se evaporó al vacío, se evaporó con tolueno (2x100 ml) y se purificó por cromatografía en columna sobre gel de sílice. La columna se eluyó con cloruro de metilenometanol (100:0 - 90:5), y luego la evaporación de las fracciones apropiadas para dar el compuesto 8 como una espuma (40.5 g) (MS M-1: 885.3).
g. Síntesis de fosforamidita [Compuesto 9]
El derivado dimetoxitritilado 8 (40.0 g) se disolvió en 600 ml de diclorometano bajo argón y se añadieron etil-(diisopropil)amina (10 ml) y 2-cianoetil diisopropilfosforamidocloridita (16.0 g). Después de agitar la solución durante 3 h, la TLC indicó reacción completa. Se añadió una solución acuosa al 10% de hidrogenocarbonato de sodio (2 ml), la solución se agitó durante 10 minutos y se repartió entre cloruro de metileno (500 ml) y carbonato de sodio acuoso (300 ml). La fase orgánica se lavó con cloruro de sodio acuoso (2x300 ml) y las fases acuosas se volvieron a extraer con cloruro de metileno (200 ml). La evaporación de los compuestos orgánicos dejó un aceite, que se purificó rápidamente en gel de sílice (hexano-acetato de etilo, 20:80) para proporcionar el producto como una espuma después de la coevaporación (36.5 g) (MS M-1: 1085.4). El compuesto 11 se hizo a partir del nucleósido 10 de la misma manera que se describió anteriormente. Del mismo modo, los esquemas VII (Hágase referencia a las páginas 201-202) y VlII (Hágase referencia a la página 203) representan la producción del compuesto 17, los procedimientos descritos anteriormente se pueden adoptar para hacer el compuesto 17.
Ejemplo 26. Síntesis de dsNA de tetrabucle con muesca conjugado con colesterol con ligandos de colesterol en el bucle
Las moléculas de dsNA conjugadas con colesterol pueden producirse siguiendo los protocolos establecidos para la síntesis de moléculas de dsNA conjugadas con GalNAc. Las moléculas de dsNA conjugadas con colesterol se sintetizan mediante el uso de la conjugación posterior a la fase sólida a través de métodos estándar de química de clic o de amida. En un ejemplo, las moléculas dsNA conjugadas con colesterol se hacen mediante síntesis en fase sólida usando fosforamiditas de colesterol.
Se produce un dsNA de tallo-bucle que tiene nucleótidos conjugados con colesterol en el bucle usando química de clic, por ejemplo, como se muestra en el esquema L (Hágase referencia a la página 239-240). El compuesto K2 requerido para la síntesis se produce siguiendo el protocolo ilustrado en el esquema Kb (Hágase referencia a las páginas 237-238). En un ejemplo, se produce un dsNA de tallo-bucle que tiene nucleótidos conjugados con colesterol en el bucle usando química de amida, por ejemplo, como se muestra en el esquema L1 (Hágase referencia a la página 241-242). Los esquemas L y L1 ilustran la síntesis de dsNA de tallo-bucle conjugado con colesterol en donde los monómeros de colesterol están confinados al bucle y tienen un número singular. De manera similar, el esquema M (Hágase referencia a las páginas 243-244) ilustra la síntesis de moléculas dsNA de tallo-bucle conjugadas con colesterol en las que los monómeros de colesterol están confinados en el bucle, pero son múltiples en número.
La hebra en sentido y su hebra antisentido complementaria, como se muestra en los esquemas mencionados anteriormente, se obtienen mediante síntesis de fabricantes comerciales usando procedimientos estándar de síntesis de ácidos nucleicos en fase sólida. La hebra en sentido se sintetiza de manera similar a la síntesis de la hebra en sentido A3 como se describió anteriormente. El doble mostrado en los esquemas mencionados anteriormente se sintetiza de manera similar a la síntesis del doble A5 como se describió anteriormente.
Ejemplo 27. Síntesis de dsNA de tetrabucle con muesca conjugado con colesterol con ligandos de colesterol en el tallo
Se produce un dsNA de tallo-bucle que tiene nucleótidos conjugados con colesterol en el tallo usando química de clic, por ejemplo, como se muestra en el esquema N (Hágase referencia a las páginas 245-246).
El compuesto K2 requerido para la síntesis se produce siguiendo el protocolo ilustrado en el esquema Kb. El esquema N (Hágase referencia a las páginas 245-246) ilustra la síntesis de dsNA de tallo-bucle conjugado con colesterol en la que los monómeros de colesterol están confinados a la raíz y tienen un número singular. De manera similar, el esquema O (Hágase referencia a las páginas 247-248) ilustra la síntesis de moléculas dsNA de tallo-bucle conjugados con colesterol en las que los monómeros de colesterol están confinados al tallo, pero son múltiples en número.
La hebra en sentido y la hebra antisentido complementaria, como se muestra en los esquemas mencionados anteriormente, se obtiene mediante síntesis, de fabricantes comerciales, usando procedimientos estándar de síntesis de ácidos nucleicos en fase sólida. La hebra en sentido se sintetiza de manera similar a la síntesis de la hebra en sentido A3 como se describió anteriormente. El doble mostrado en los esquemas mencionados anteriormente se sintetiza de manera similar a la síntesis del doble A5 como se describió anteriormente.
Ejemplo 28. Síntesis de dsNAs con ligandos de colesterol en la extensión 5' de la hebra antisentido
Una molécula de dsNA que tiene nucleótidos conjugados con colesterol en la extensión 5' de la hebra antisentido se produce usando conjugación post fase sólida a través de química de clic, por ejemplo, como se muestra en el esquema P (Hágase referencia a las páginas 249-250). El compuesto K2 requerido para la síntesis se puede producir siguiendo el protocolo ilustrado en el esquema Kb. (Hágase referencia a las páginas 237-238).
El esquema P1 (Hágase referencia a las páginas 251-252) ilustra la síntesis en fase sólida de moléculas de dsNA conjugadas con colesterol usando fosforamiditas de colesterol, en donde los monómeros de colesterol están confinados a la extensión 5' de la hebra antisentido, y son singulares en número. Sin embargo, el número de monómeros conjugados con colesterol puede variar, por ejemplo, un ligando puede conjugarse en la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta posición desde el extremo 5' o el extremo 3' de la hebra antisentido o en una posición más allá de la quinta posición. El esquema Q (Hágase referencia a las páginas 253-254) ilustra la conjugación de colesterol en fase sólida posterior a las moléculas de dsNA utilizando química de clic en la que los monómeros de colesterol están confinados a la extensión 5' de la hebra antisentido, pero son múltiples en números. El esquema Q1 (Hágase referencia a la página 255-256) ilustra la síntesis en fase sólida de moléculas de dsNA conjugadas con colesterol usando fosforamiditas de colesterol, en donde los monómeros de colesterol están confinados a la extensión 5' en la hebra antisentido, pero son múltiples en números.
La hebra en sentido y su hebra antisentido complementaria, como se muestra en los esquemas mencionados anteriormente, se obtiene mediante síntesis, de fabricantes comerciales, usando procedimientos estándar de síntesis de ácidos nucleicos en fase sólida. La hebra en sentido se sintetiza de manera similar a la síntesis de la hebra en sentido A3 como se describió anteriormente. El doble que se muestra en los esquemas mencionados anteriormente se sintetizará de manera similar a la síntesis del doble A5 como se describió anteriormente.
Ejemplo 29 Síntesis de dsNAs con ligandos de colesterol en la extensión 5' de la hebra en sentido
Una molécula de dsNA que tiene nucleótidos conjugados con colesterol en la extensión 5' de la hebra en sentido se produce usando conjugación post fase sólida a través de química de clic, por ejemplo, como se muestra en el esquema R (Hágase referencia a las páginas 257-258). El compuesto K2 requerido para la síntesis se produce siguiendo el protocolo ilustrado en el esquema Kb.
El esquema R1 (Hágase referencia a las páginas 259-260) ilustra la síntesis en fase sólida de la molécula de dsNA conjugada con colesterol usando fosforamiditas de colesterol, en donde los monómeros de colesterol están confinados a la extensión 5' de la hebra en sentido, y tienen un número singular. Sin embargo, el número de monómeros conjugados con colesterol puede variar, por ejemplo, un ligando se conjuga en la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta posición desde el extremo 5' o el extremo 3' de la hebra en sentido o en una posición más allá de la quinta posición. Usando los esquemas sintéticos discutidos previamente, se varía el número de nucleótidos conjugados con colesterol, así como la posición de los ligandos de colesterol, por ejemplo, un ligando también puede estar en cualquier lugar a lo largo de la hebra en sentido.
La hebra en sentido y su hebra antisentido complementaria, como se muestra en los esquemas mencionados anteriormente, se obtienen mediante síntesis de fabricantes comerciales usando procedimientos estándar de síntesis de ácidos nucleicos en fase sólida. La hebra en sentido se sintetiza de manera similar a la síntesis de la hebra en sentido A3 como se describió anteriormente. El doble mostrado en los esquemas mencionados anteriormente se sintetiza de manera similar a la síntesis del doble A5 como se describió anteriormente.
Ejemplo 30. Síntesis de dsNAs con múltiples ligandos de colesterol en la extensión 5' de la hebra en sentido separados por uno o más espaciadores
Un dsNA con nucleótidos conjugados con colesterol en la región extendida 5' de la hebra en sentido, los nucleótidos separados por un espaciador se producen siguiendo los protocolos desarrollados para la síntesis de moléculas de dsNA similares que comprenden un ligando GalNAc. Los esquemas G, H, I, J y K (Hágase referencia a las páginas 226-237) describen la síntesis de moléculas dsNA conjugadas con GalNAc en donde los nucleótidos conjugados con ligando están separados por uno o más espaciadores. Los nucleótidos conjugados con colesterol pueden estar en la región del tallo o en la región del bucle, en la extensión 5' de la hebra en sentido, o la extensión 5' de la hebra antisentido, la extensión 3' de la hebra en sentido o la extensión 3' de la hebra antisentido o una combinación de cualquiera de las opciones mencionadas anteriormente. Los esquemas G, H, I, J y K producen productos específicos para la conjugación de ligando GalNAc, se adaptan y modifican fácilmente para producir con conjugados de ligando de colesterol. El modo de conjugación de ligando a nucleótido es similar y puede ocurrir mediante conjugación postsintética mediante química de clic o química de amida o síntesis en fase sólida usando fosforamiditas de ligando.
Ejemplo 31. Síntesis de dsNA de tetrabucle con muesca conjugado con folato en el bucle
Las moléculas de dsNA conjugadas con folato se producen siguiendo los protocolos establecidos para la síntesis de moléculas de dsNA conjugadas con GalNAc. Las moléculas de dsNA conjugadas con folato se sintetizan mediante el uso de la conjugación posterior a la fase sólida, a través de métodos estándar de química de clic o de amida. En un ejemplo, las moléculas de dsNA conjugadas con folato se hacen mediante síntesis en fase sólida usando fosforamiditas de folato.
Se produce un dsNA de tallo-bucle que tiene nucleótidos conjugados con folato en el bucle usando química de clic, por ejemplo, como se muestra en el esquema U (Hágase referencia a las páginas 264-265). El compuesto S6 (química de clic) o S13 (química de amida) requerido para la síntesis se produce siguiendo el protocolo ilustrado en los esquemas S (Hágase referencia a las páginas 264-265) y T (Hágase referencia a la página 263) respectivamente. La producción de los compuestos T7 y S13 se representa en los esquemas T y S, respectivamente, siguiendo los mismos protocolos utilizados para preparar conjugados de GalNAc como se describió anteriormente. En un ejemplo, se produce un dsNA de tallo-bucle que tiene nucleótidos conjugados con folato en el bucle usando química de amida, por ejemplo, como se muestra en el esquema U1. Los esquemas U (Hágase referencia a las páginas 264-265) y U1 (Hágase referencia a la página 266) ilustran la síntesis de dsNA conjugado de folato en bucle en donde los monómeros de folato están confinados al bucle y tienen un número singular. De manera similar, los esquemas V (Hágase referencia a las páginas 267-268) y VI (Hágase referencia a las páginas 269-270) ilustran la síntesis de moléculas de dsNA conjugado de tallo y bucle folato en las que los monómeros de folato están confinados al bucle, pero son múltiples en número.
La hebra en sentido y su hebra antisentido complementaria, como se muestra en los esquemas mencionados anteriormente, se obtienen por síntesis de fabricantes comerciales usando procedimientos de síntesis de ácidos nucleicos en fase sólida estándar. La hebra en sentido se sintetiza de manera similar a la síntesis de la hebra en sentido A3 como se describió anteriormente. El doble mostrado en los esquemas mencionados anteriormente se sintetiza de manera similar a la síntesis del doble A5 como se describió anteriormente.
Ejemplo 32. Síntesis de dsNA de tetrabucle con muesca conjugado con folato en el tallo
Se produce un dsNA de tallo-bucle que tiene nucleótidos conjugados con folato en el tallo usando química de clic, por ejemplo, como se muestra en el esquema W (Hágase referencia a las páginas 271-272). El compuesto S6 (química de clic) o S13 (química de amida) requerido para la síntesis se produce siguiendo el protocolo ilustrado en los esquemas S (Hágase referencia a las páginas 261-262) y T (Hágase referencia a la página 263) respectivamente. El esquema W1 (Hágase referencia a las páginas 273-274) ilustra la síntesis de dsNA conjugado de tallo y bucle de folato utilizando la química de la amida, en donde los monómeros de folato están confinados al tallo y tienen un número singular. Del mismo modo, los esquemas X (Hágase referencia a las páginas 275-276) y XI (Hágase referencia a las páginas 277-278) ilustran la síntesis de moléculas de dsNA conjugado de folato en donde los monómeros de folato están confinados al tallo, pero son múltiples en número.
La hebra en sentido y su hebra antisentido complementaria, como se muestra en los esquemas mencionados anteriormente, se obtienen mediante síntesis de fabricantes comerciales usando procedimientos estándar de síntesis de ácidos nucleicos en fase sólida. La hebra en sentido se sintetiza de manera similar a la síntesis de la hebra en sentido A3 como se describió anteriormente. El doble mostrado en los esquemas mencionados anteriormente se sintetiza de manera similar a la síntesis del doble A5 como se describió anteriormente.
Ejemplo 33 Síntesis de dsNAs con ligandos de folato en la extensión 5' de la hebra antisentido
Una molécula de dsNA que tiene nucleótidos conjugados con folato en la extensión 5' de la hebra antisentido puede producirse usando conjugación postfase sólida a través de química de clic, por ejemplo, como se muestra en el esquema Y (Hágase referencia a las páginas 279-280). El compuesto S6 (química de clic) o S13 (química de amida) requerido para la síntesis se puede producir siguiendo el protocolo ilustrado en los esquemas S (Hágase referencia a las páginas 261-262) y T (Hágase referencia a la página 263) respectivamente.
El esquema Y1 (Hágase referencia a las páginas 281-282) ilustra la síntesis en fase sólida de la molécula de dsNA conjugada con folato utilizando fosforamiditas de folato, en donde los monómeros de folato están confinados a la extensión 5' de la hebra antisentido, y tienen un número singular. Sin embargo, el número de monómeros conjugados con folato puede variar, por ejemplo, un ligando puede conjugarse en la primera, segunda, tercera, cuarta o quinta posición desde el extremo 5' o el extremo 3' de la hebra antisentido o en una posición más allá de la quinta posición. El esquema Z (Hágase referencia a las páginas 283-284) ilustra la conjugación de folato en fase sólida posterior a moléculas de dsNA utilizando química de clic en la que los monómeros de folato están confinados a la extensión 5' de la hebra antisentido, pero son múltiples en números. El esquema Z1 (Hágase referencia a las páginas 285-286) ilustra la síntesis en fase sólida de moléculas de dsNA conjugadas con folato utilizando fosforamiditas de folato, en donde los monómeros de folato están confinados a la extensión 5' en la hebra antisentido, pero son múltiples en números.
La hebra en sentido y su hebra antisentido complementaria, como se muestra en los esquemas mencionados anteriormente, se obtienen mediante síntesis de fabricantes comerciales usando procedimientos estándar de síntesis de ácidos nucleicos en fase sólida. La hebra en sentido se sintetiza de manera similar a la síntesis de la hebra en sentido A3 como se describió anteriormente. El doble mostrado en los esquemas mencionados anteriormente se sintetiza de manera similar a la síntesis del doble A5 como se describió anteriormente.
Ejemplo 34 Síntesis de dsNAs con ligandos de folato en la extensión 5' de la hebra en sentido
Las moléculas de dsNA conjugadas con folato se producen siguiendo los protocolos establecidos para la síntesis de moléculas de dsNA conjugadas con GalNAc. Las moléculas de dsNA conjugadas con folato se sintetizan mediante el uso de la conjugación posterior a la fase sólida a través de métodos estándar de química de clic o de amida. En un ejemplo, las moléculas de dsNA conjugadas con folato se hacen mediante síntesis en fase sólida usando fosforamiditas de folato.
Una molécula de dsNA que tiene nucleótidos conjugados con folato en la extensión 5' de la hebra en sentido se produce usando conjugación post fase sólida a través de química de clic, por ejemplo, como se muestra en el esquema AA (Hágase referencia a las páginas 287-288). El compuesto S6 (química de clic) o S13 (química de amida) para la síntesis se produce siguiendo el protocolo ilustrado en los esquemas S (Hágase referencia a las páginas 261-262) y T (Hágase referencia a la página 263) respectivamente.
El esquema AA1 (Hágase referencia a las páginas 289-290) ilustra la síntesis en fase sólida de la molécula de dsNA conjugada con folato usando fosforamiditas de folato, en donde los monómeros de folato están confinados a la extensión 5' de la hebra en sentido, y son singulares en número. Sin embargo, el número de monómeros conjugados con folato puede variar, por ejemplo, un ligando puede conjugarse en la primera, segunda, tercera, cuarta o quinta posición desde el extremo 5' o el extremo 3' de la hebra en sentido o en una posición más allá de la quinta posición. Usando los esquemas sintéticos discutidos previamente, se puede variar el número de nucleótidos conjugados con folato, así como la posición de los ligandos de folato, por ejemplo, un ligando también puede estar en cualquier lugar a lo largo de la hebra en sentido.
La hebra en sentido y su hebra antisentido complementaria, como se muestra en los esquemas mencionados anteriormente, se obtienen mediante síntesis de fabricantes comerciales usando procedimientos estándar de síntesis de ácidos nucleicos en fase sólida. La hebra en sentido se sintetiza de manera similar a la síntesis de la hebra en sentido A3 como se describió anteriormente. El doble mostrado en los esquemas mencionados anteriormente se sintetiza de manera similar a la síntesis del doble A5 como se describió anteriormente.
Ejemplo 35. Síntesis de dsNAs con múltiples ligandos de folato en la extensión 5' de la hebra en sentido separada por uno o más espaciadores
Un dsNA con nucleótidos conjugados con folato en la región extendida 5' de la hebra en sentido, estando los nucleótidos separados por un espaciador se produce siguiendo los protocolos desarrollados para la síntesis de moléculas de dsNA similares en las que el ligando es GalNAc. Los esquemas G, H, I, J y K (Hágase referencia a las páginas 226-237) describen la síntesis de moléculas dsNA conjugadas con GalNAc en donde los nucleótidos conjugados con ligando están separados por uno o más espaciadores. Los nucleótidos conjugados con folato pueden estar en la extensión 5' de la hebra en sentido, la extensión 5' de la hebra antisentido, la extensión 3' de la hebra en sentido o la extensión 3' de la hebra antisentido o una combinación de cualquiera de las anteriores opciones. Los esquemas G, H, I, J y K específicos para la conjugación de ligando GalNAc, se adaptan y modifican fácilmente para producir conjugados de ligando de folato. El modo de conjugación de ligando a nucleótido es similar y a menudo ocurre a través de la conjugación postsintética a través de química de clic o química de amida o síntesis en fase sólida usando fosforamiditas de ligando. El esquema V (Hágase referencia a las páginas 267-268) y V1 (Hágase referencia a las páginas 269-270) muestra la síntesis de conjugados de dsNA de tetrabucle de folato con muestra con múltiples folatos en el bucle utilizando el método de conjugación de fase sólida posterior utilizando química de clic como se describió anteriormente para los conjugados GalNAc.
Ejemplo 36. Síntesis de dsNA de tetrabucle con muesca conjugado con manosa-6-fosfato con ligando de manosa-6-fosfato en el bucle
Las moléculas de dsNA conjugadas con manosa-6-fosfato se producen siguiendo los protocolos establecidos para la síntesis de moléculas de dsNA conjugadas con GalNAc. Las moléculas de dsNA conjugadas con manosa-6-fosfato se pueden sintetizar mediante el uso de la conjugación posterior a la fase sólida a través de métodos estándar de química de clic o de amida.
Un dsNA de tallo-bucle que tiene nucleótidos conjugados con manosa-6-fosfato en el bucle se produce usando química de clic, por ejemplo, como se muestra en el esquema AB (Hágase referencia a las páginas 291-292). El compuesto 114 (química de clic) o el compuesto 108 (química de amida) requeridos para la síntesis se producen siguiendo el protocolo ilustrado en los esquemas IX (Hágase referencia a la página 204) y X (Hágase referencia a las páginas 205­ 206) respectivamente. En un ejemplo, se produce un dsNA de tallo-bucle que tiene nucleótidos conjugados con manosa-6-fosfato en el bucle usando química de amida, por ejemplo, como se muestra en el esquema AC (Hágase referencia a las páginas 293-294). Los esquemas AB (Hágase referencia a las páginas 291-292) y AC (Hágase referencia a las páginas 293-294) ilustran la síntesis de moléculas dsNA conjugadas de tallo-bucle con manosa-6-fosfato en las que los monómeros de manosa-6-fosfato se limitan al bucle y se producen por métodos post sintéticos. De manera similar, los esquemas AD (Hágase referencia a las páginas 295-296) y AE (Hágase referencia a las páginas 297-298) ilustran la síntesis en fase sólida de las moléculas de dsNA conjugadas con bucle de manosa-6-fosfato utilizando fosfoamiditas de nucleósido de manosa-6-fosfato, en donde los monómeros manosa-6-de fosfato se limitan al bucle. En el esquema AD (Hágase referencia a las páginas 295-296), el ligando manosa-6-fosfato se une al nucleótido usando enlaces 2'-triazol y en el esquema AE el ligando manosa-6-fosfato se une al nucleótido usando enlaces 2'-acetal.
La hebra en sentido y su hebra antisentido complementaria, como se muestra en los esquemas mencionados anteriormente, se obtiene mediante síntesis, de fabricantes comerciales, usando procedimientos estándar de síntesis de ácidos nucleicos en fase sólida. La hebra en sentido se sintetiza de manera similar a la síntesis de la hebra en sentido A3 como se describió anteriormente. El doble mostrado en los esquemas mencionados anteriormente se sintetiza de manera similar a la síntesis del doble A5 como se describió anteriormente.
Ejemplo 37. Síntesis de dsNA de tetrabucle con muesca conjugado con manosa-6-fosfato con ligando de manosa-6-fosfato en el tallo
Un dsNA de tallo-bucle que tiene nucleótidos conjugados con manosa-6-fosfato en el tallo se produce usando química de clic, por ejemplo, como se muestra en el esquema AF (Hágase referencia a las páginas 299-300). El compuesto 114 (química de clic) o el compuesto 108 (química de amida) requerido para la síntesis se produce siguiendo el protocolo ilustrado en los esquemas IX (Hágase referencia a la página 204) y X (Hágase referencia a las páginas 205­ 206) respectivamente. El esquema AF (Hágase referencia a las páginas 299-300) ilustra la síntesis de dsNA conjugado de bucle de manosa-6-fosfato utilizando química de clic, en donde los monómeros de manosa-6-fosfato están confinados al tallo y están en múltiplos.
La hebra en sentido y su hebra antisentido complementaria, como se muestra en los esquemas mencionados anteriormente, se obtienen mediante síntesis de fabricantes comerciales usando procedimientos estándar de síntesis de ácidos nucleicos en fase sólida. La hebra en sentido se sintetiza de manera similar a la síntesis de la hebra en sentido A3 como se describió anteriormente. El doble mostrado en los esquemas mencionados anteriormente se sintetiza de manera similar a la síntesis del doble A5 como se describió anteriormente.
Ejemplo 38. Síntesis de dsNAs con ligandos de manosa-6-fosfato en la extensión 5' de la hebra antisentido
Una molécula de dsNA que tiene nucleótidos conjugados con manosa-6-fosfato en la extensión 5' de la hebra antisentido se produce usando conjugación en fase sólida posterior a través de química de clic, por ejemplo, como se muestra en el esquema AG (Hágase referencia a las páginas 301-302). El compuesto 114 (química de clic) o el compuesto 108 (química de amida) requerido para la síntesis se produce siguiendo el protocolo ilustrado en los esquemas IX (Hágase referencia a la página 204) y X (Hágase referencia a las páginas 205-206) respectivamente.
El esquema AG (Hágase referencia a las páginas 301-302) ilustra la síntesis de la molécula de dsNA conjugada con manosa-6-fosfato usando conjugación postsintética, en la que los monómeros de manosa-6-fosfato están confinados a la extensión 5' de la hebra antisentido. Sin embargo, el número de monómeros conjugados con manosa-6-fosfato puede variar, por ejemplo, un ligando puede conjugarse en la primera, segunda, tercera, cuarta o quinta posición desde el extremo 5' o 3' de la hebra antisentido o en una posición más allá de la quinta posición.
La hebra en sentido y su hebra antisentido complementaria, como se muestra en los esquemas mencionados anteriormente, se obtiene mediante síntesis, de fabricantes comerciales, usando procedimientos estándar de síntesis de ácidos nucleicos en fase sólida. La hebra en sentido se sintetiza de manera similar a la síntesis de la hebra en sentido A3 como se describió anteriormente. El doble mostrado en los esquemas mencionados anteriormente se sintetiza de manera similar a la síntesis del doble A5 como se describió anteriormente. Se muestran variaciones similares de moléculas de dsNA que contienen conjugados de manosa-6-fosfato en los esquemas AI, AJ, AK, AL y AM (Hágase referencia a las páginas 305-306). Estos se sintetizan siguiendo los mismos protocolos diseñados para GalNac y conjugados de colesterol como se describió anteriormente.
Ejemplo 39. Síntesis de dsNAs con ligandos de manosa-6-fosfato en la extensión 5' de la hebra en sentido
Una molécula de dsNA que tiene nucleótidos conjugados con manosa-6-fosfato en la extensión 5' de la hebra en sentido puede producirse usando conjugación en fase sólida posterior a través de química de amida, por ejemplo, como se muestra en el esquema AH. El compuesto 114 (química de clic) o el compuesto 108 (química de amida) para la síntesis se pueden producir siguiendo el protocolo ilustrado en los esquemas IX y X, respectivamente.
El esquema AH (Hágase referencia a las páginas 304-305) ilustra la síntesis de la molécula de dsNA conjugada con manosa-6-fosfato usando química de amida, en donde los monómeros de manosa-6-fosfato están confinados a la extensión 5' de la hebra en sentido. El esquema AN (Hágase referencia a la página 315) ilustra la síntesis en fase sólida de la molécula de dsNA conjugada con manosa-6-fosfato usando manosa-6-fosfato-amidita, en donde los monómeros de manosa-6-fosfato están confinados a la extensión 5' de la hebra en sentido. Sin embargo, el número de monómeros conjugados con manosa-6-fosfato puede variar, por ejemplo, un ligando puede conjugarse en la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta posición o más lejos del extremo 5' o del extremo 3' de la hebra en sentido o en una posición más allá de la quinta posición. Usando los esquemas sintéticos discutidos previamente, el número de nucleótidos conjugados con manosa-6-fosfato puede variarse, así como la posición de los ligandos de manosa-6-fosfato, por ejemplo, un ligando también puede estar en cualquier lugar a lo largo de la hebra en sentido.
La hebra en sentido y su hebra antisentido complementaria, como se muestra en los esquemas mencionados anteriormente, se obtienen mediante síntesis de fabricantes comerciales usando procedimientos estándar de síntesis de ácidos nucleicos en fase sólida. La hebra en sentido se sintetiza de manera similar a la síntesis de la hebra en sentido A3 como se describió anteriormente. El doble mostrado en los esquemas mencionados anteriormente se sintetiza de manera similar a la síntesis del doble A5 como se describió anteriormente.
Ejemplo 40. Síntesis de dsNAs con múltiples ligandos de manosa-6-fosfato en la extensión 5' de la hebra en sentido separada por uno o más espaciadores
Un dsNA con nucleótidos conjugados con manosa-6-fosfato en la región extendida 5' de la hebra en sentido, los nucleótidos separados por separadores se producen siguiendo los protocolos desarrollados para la síntesis de moléculas de dsNA similares en las que el ligando es GalNAc. Los esquemas G, H, I, J y K (Hágase referencia a las páginas 226-237) describen la síntesis de moléculas dsNA conjugadas con GalNAc en donde los nucleótidos conjugados con ligando están separados por uno o más espaciadores.
Los nucleótidos conjugados con manosa-6-fosfato pueden estar en la extensión 5' de la hebra en sentido, o en la extensión 5' de la hebra antisentido, o en la extensión 3' de la hebra en sentido, o en la extensión 3' de la hebra antisentido o una combinación de cualquiera de las opciones mencionadas anteriormente. Los esquemas G, H, I, J y K producen productos específicos para la conjugación de ligando GalNAc, se adaptan y modifican fácilmente para producir con conjugados de ligando de colesterol. El modo de conjugación de ligando a nucleótido es similar y puede ocurrir mediante conjugación postsintética mediante química de clic o química de amida o síntesis en fase sólida usando fosforamiditas de ligando.
Por ejemplo, los esquemas AI, AJ y AK (Hágase referencia a las páginas 305-310) ilustran la síntesis de un dsNA que comprende ligandos de fosfato de manosa-6 donde los ligandos están confinados en la región extendida de 5' de la hebra en sentido y están separados por uno o dos o más separadores respectivamente. Sin embargo, el número de nucleótidos conjugados con manosa-6-fosfato puede variar y la posición de los ligandos de manosa-6-fosfato también puede variar, por ejemplo, un ligando puede estar en cualquier lugar a lo largo de la hebra en sentido. Los nucleótidos conjugados de ligando de 6-fosfato de manosa separados por uno o más espaciadores también se pueden ubicar en la región 5' de la hebra antisentido y/o la hebra en sentido. Los esquemas AL y AM (Hágase referencia a las páginas 311-314) ilustran la síntesis de un dsNA que comprende ligandos de manosa-6- fosfato, donde los ligandos están confinados en la región extendida 5' de la hebra antisentido y están separados por dos o más espaciadores respectivamente.
La hebra en sentido y su hebra antisentido complementaria, como se muestra en los esquemas mencionados anteriormente, se pueden obtener mediante síntesis de fabricantes comerciales usando procedimientos estándar de síntesis de ácidos nucleicos en fase sólida. La hebra en sentido se sintetiza de manera similar a la síntesis de la hebra en sentido A3 como se describió anteriormente. El doble que se muestra en los esquemas mencionados anteriormente se sintetizará de manera similar a la síntesis del doble A5 como se describió anteriormente.
Ejemplo 41. Síntesis de sintonones de amidita de GalNAc
2-(2-cloroetoxi)etanol (124.6 g) y azida de sodio (130 g) en 5 l de H2O se calentaron a reflujo durante una noche. Al enfriar, la mezcla de reacción se extrajo con CH2O2 (3 x 2000 ml), las capas orgánicas se combinaron, se lavaron con salmuera, Na2SO4 anhidro, se filtraron y se concentraron a presión reducida para dar 2-(2-azidoetoxi)etanol en un líquido 105 g . Rendimiento: 80%. (Hágase referencia a el esquema XI, página 207). Una solución de 105 g de 2-(2-azidoetoxi)etanol y 200 ml de Et3N en 2 L de CH2Cl2 seco se enfrió a 0°C bajo una atmósfera de nitrógeno. Se añadió gota a gota una solución de cloruro de metanosulfonilo (116 g) en CH2Ch (500 ml) a esta mezcla durante un período de 30 minutos, y la solución se calentó a temperatura ambiente y se agitó durante 1.5 h. Después de que el precipitado se separó por filtración, el disolvente se evaporó y el producto bruto se purificó por cromatografía en columna eluyendo con una mezcla 2:1 de n-hexano y acetato de etilo para dar 2-(2-azidoetoxi)etil metanosulfonato como un aceite amarillo pálido (126 g). (Hágase referencia a el esquema XI, página 207).
Una solución de 126 g de compuesto 3 y 116.5 g de ftalimida de potasio en 4 L de DME seco se calentó a reflujo durante 18 h bajo una atmósfera de nitrógeno. Después de enfriar a temperatura ambiente y concentrar a vacío, el residuo resultante se diluyó con acetato de etilo (10 l) y los sólidos se filtraron. Concentración del filtrado al vacío seguido de purificación del producto bruto por cromatografía en columna eluyendo con una mezcla 4:1 de n-hexano y acetato de etilo para dar 4 como un sólido incoloro (103 g). (Hágase referencia a el Esquema XI, página 207).
Una solución de 100 g de compuesto 4 y 40 ml de hidrato de hidrazina al 80% en 2000 ml de etanol absoluto se calentó a 55°C durante 2 h, tiempo durante el cual se formó un precipitado blanco. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente y se concentró al vacío, después de lo cual el residuo bruto se diluyó con 2000 ml de CH2Cl2 seco. Después de que el precipitado se separó por filtración, el disolvente se secó y se concentró al vacío para proporcionar un aceite amarillo pálido, que se usó en la siguiente etapa sin purificación adicional (45.7 g). MS M+1: 131.0.
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El compuesto 6 (157 g) se disolvió en diclorometano seco (2 L). Se añadieron trietilamina (100 ml) y dic (75.7 g) y la mezcla se agitó durante 4 h a temperatura ambiente. Se añadió el compuesto 5 (45.7) en diclorometano (500 ml) y la mezcla de reacción se agitó durante 2 h. La mezcla se lavó con agua (1 L) y se concentró. El residuo se purificó por cromatografía en columna. El producto deseado se eluyó con MeOH-CH2Cl2 (0:100-10:90). La evaporación de las fracciones apropiadas dio el compuesto 7 como un sólido (138.0 g).MS M-1: 558.2.
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Una mezcla de 5'-DMT-N6-bz-adenosina (551.7 g; 80 mmol), bromuro de tetrabutilamonio (283.2 g), óxido de dibutilestaño (DBTO) (238.4 g) y bromuro de propargilo (338 ml) y DMF seco (2.5) se agitó durante 24 horas a 50°C. La mezcla se vertió luego sobre hielo triturado. El líquido se decantó. La masa gomosa se disolvió en diclorometano (5 L) y la capa orgánica se lavó tres veces con agua destilada. La capa orgánica se secó con sulfato de sodio y luego se concentró. La mezcla de reacción cruda se purificó en una columna de gel de sílice usando un sistema de gradiente de cloroformo:hexano:acetona (50:40:10 a 50:30:20). El rendimiento de 5'-DM T-2'-0-propargil-N-bzA puro fue de 60.5 g como una MS M-1 710.2 en sólido.
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El compuesto 7 (71 g) y el compuesto 8 (60.5 g) se disolvieron en THF (1 L). Se añadieron CuSO4.5H2O (2.1) y ascorbato de sodio (2.0) bajo nitrógeno. La mezcla se agitó durante la noche. Se añadió EDTA (5 g) en agua (1 L) y se agitó durante 30 minutos. Se añadió tolueno (1 L) y las dos capas se separaron. La capa orgánica se evaporó y el residuo se purificó por cromatografía sobre gel de sílice. El producto deseado se eluyó con MeOH-CH2Cl2 (0:100-10:90). La evaporación de las fracciones apropiadas dio el compuesto 9 como un sólido (91.0 g) .MS M-1: 1269.6.
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El derivado dimetoxitritilado 9 (40.0 g) se disolvió en 600 ml de diclorometano bajo argón y se añadieron etil(diisopropil)amina (10 ml) y 2-cianoetil diisopropilfosforamidocloridita (15.0 g). Después de agitar la solución durante 3 h, la TLC indicó una reacción completa. Se añadió una solución acuosa al 10% de hidrogenocarbonato de sodio (2 ml), la solución se agitó durante 10 minutos y se repartió entre cloruro de metileno (500 ml) y carbonato de sodio acuoso (300 ml). La fase orgánica se lavó con cloruro de sodio acuoso (2x300 ml) y las fases acuosas se volvieron a extraer con cloruro de metileno (200 ml). La evaporación de los compuestos orgánicos dejó un aceite, que se purificó rápidamente en gel de sílice (acetato de etilo) para proporcionar el producto como una espuma (34.5 g) (MS M-1: 1469.6).
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Una mezcla de 5'-DMT-N2-ibuG (328 g), bromuro de tetrabutilamonio (177 g), DBTO (150 g), bromuro de propargilo (420 ml) y DMF seco (1.3 L) se agitó durante 24 horas a 50°C. La mezcla se vertió sobre hielo picado. El líquido se decantó. La masa gomosa se disolvió en diclorometano (5 L) y la capa orgánica se lavó tres veces con agua destilada. La capa orgánica se secó con sulfato de sodio y luego se concentró. El residuo se purificó en una columna de gel de sílice usando un sistema de gradiente de cloroformo:hexano: acetona:metanol (50:30:20:0 a 50:30:20:2). El rendimiento de 5'-DMT-2'-0-propargil-N2-ibu-G puro fue de 45.0 g como un sólido MS M-1 692.2.
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El compuesto 7 (18.0 g) y el compuesto 11 (15.0 g) se disolvieron en THF (300 ml). Se añadieron CuSO4.5H2O (0.6 g) y ascorbato de sodio (0.5 g) bajo nitrógeno. La mezcla se agitó durante la noche. Se añadió EDTA (2.0 g) en agua (0.5 L) y se agitó durante 30 minutos. Se añadió tolueno (0.5 L) y las dos capas se separaron. La capa orgánica se evaporó y el residuo se purificó por cromatografía sobre gel de sílice. El producto deseado se eluyó con MeOH-CH2Cl2 (0:100-10:90). La evaporación de las fracciones apropiadas dio el compuesto 9 como un sólido (24.0 g) .MS M-1: 1251.6.
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El compuesto 12 (24 g) se disolvió en 500 ml de diclorometano bajo argón y se añadieron etil-(diisopropil)amina (8 ml) y 2-cianoetil diisopropilfosforamidocloridita (10.0 g). Después de agitar la solución durante 3 h, la TLC indicó una reacción completa. Se añadió una solución acuosa al 10% de hidrogenocarbonato de sodio (2 ml), la solución se agitó durante 10 minutos y se repartió entre cloruro de metileno (500 ml) y carbonato de sodio acuoso (300 ml). La fase orgánica se lavó con cloruro de sodio acuoso (2x300 ml) y las fases acuosas se volvieron a extraer con cloruro de metileno (200 ml). La evaporación de los productos orgánicos dejó un aceite, que se purificó rápidamente en gel de sílice (acetato de etilo) para proporcionar el producto como una espuma (19.5 g) (MS M-1: 1451.6).
Los siguientes compuestos se hacen usando los mismos protocolos para la síntesis del compuesto 13 con ligeras variaciones.
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Esquema X (continuación)
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Preparaciones de ligandos de N-acetilgalactosamina, nucleótidos que contienen N-acetilgalactosamina y conjugados de oligonucleótidos de N-acetilgalactosamina se describen anteriormente en los ejemplos y esquemas sintéticos. Las secuencias de oligonucleótidos específicos utilizados para los compuestos y/o conjugados descritos a continuación se muestran en la Tabla 2.
Tabla 4.
Enlazadores útiles para conjugar ligandos con dsNAs no se limitan a los enlazadores presentados en la Tabla 3. Un dsNA conjugado a un ligando único puede comprender más de un tipo de enlazador.
Tabla 5.
Enlazadores útiles para conjugar ligandos con dsNA.
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Como se usa aquí, m = 2'-O-metilo; f = 2'-fluoro; r = 2'-ribo; d = 2'-desoxi; “s” suscrito = fosforotioato; iB = abásico invertido; prg = 2'-propargilo.
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Tabla 5-Grupos enlazadores ab
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La Tabla 4 representa combinaciones potenciales de grupos enlazadores de diversos componentes mostrados en la fórmula a continuación
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La Tabla 4 representa las posibles combinaciones de grupos enlazadores de diversos componentes

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un ácido nucleico bicatenario (dsNA) que comprende:
una hebra en sentido que comprende 21 a 83 nucleótidos;
una hebra antisentido que comprende de 15 a 39 nucleótidos;
un doble formado por dicha hebra en sentido y antisentido, que tiene una longitud de 15 a 35 pares de bases;
en donde el dsNA comprende una discontinuidad entre el terminal 5' de la hebra en sentido y el terminal 3' de la hebra antisentido o entre el terminal 3' de la hebra en sentido y el terminal 5' de la hebra antisentido;
en donde la hebra en sentido comprende un tetrabucle y el tetrabucle comprende al menos un nucleótido conjugado con el ligando;
en donde cada ligando está conjugado con un nucleótido del tetrabucle a través de un enlazador acetal y
en donde dicha hebra antisentido es complementaria a un ARNm diana a lo largo de al menos 15 nucleótidos de dicha hebra antisentido y dicho dsNA reduce la expresión del gen diana cuando se introduce en un mamífero o una célula de mamífero.
2. Un dsNA como se reivindica en la reivindicación 1, en donde el tetrabucle comprende tres nucleótidos conjugados con ligando.
3. Un dsNA como se reivindica en la reivindicación 1, en donde el tetrabucle comprende cuatro nucleótidos conjugados con ligando.
4. Un dsNA como se reivindica en la reivindicación 1, en donde al menos un ligando está conjugado con un nucleótido del tetrabucle a través del 2'-hidroxilo en la ribosa del nucleótido; preferiblemente en donde cada ligando está conjugado con un nucleótido del tetrabucle a través del 2'-hidroxilo en la ribosa del nucleótido.
5. Un dsNA como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde el tetrabucle es el bucle de una estructura de tallo y bucle de la hebra en sentido y hay una discontinuidad entre el terminal 3' de la hebra en sentido y el terminal 5' de la hebra antisentido.
6. Un dsNA como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha hebra antisentido tiene un rango de longitud de: 15-30 nucleótidos, 18-25 nucleótidos o 19-24 nucleótidos.
7. Un dsNA como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicha hebra en sentido tiene un rango de longitud de 35-55 nucleótidos.
8. Un dsNA como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho doble tiene un rango de longitud de 15-22 pares de bases o 15-30 pares de bases.
9. Un dsNA como se reivindica en cualquiera de los anteriores, en donde dicho ligando se selecciona del grupo que consiste en: un lipófilo, un esteroide, una proteína, una vitamina, un carbohidrato y un terpeno.
10. Un dsNA como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde dicho ligando se selecciona del grupo que consiste en: colesterol, ácido cólico, ácido adamantina acético, ácido 1-pireno butírico, dihidrotestosterona, 1,3-Bis-O(hexadecil)glicerol, grupo geraniloxihexilo, hexadecilglicerol, borneol, mentol, 1,3-propanodiol, grupo heptadecilo, ácido palmítico, ácido mirístico, ácido 03-(oleoil)litocólico, ácido 03-(oleoil)colénico, dimetoxitritilo o fenoxazina, ácido biliar, PEG, folato, vitamina A, vitamina E, biotina, piridoxal, un péptido, péptido imitador, manosa-6-fosfato, galactosa, fructosa, ribosa, xilosa, arabinosa, lixosa, alosa, altrosa, gulosa, yodosa, glucosa, talosa, disacárido, trisacárido, tetrasacárido, oligosacárido, polisacárido, un componente endosomolítico, uvaol, hecigenina, diosgenina, triterpenosarsasapogenina, friedelina, ácido litocólico derivado de epifriedelanol, un lípido catiónico y un anticuerpo.
11. Un dsNA como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho dsNA comprende al menos un nucleótido modificado; preferiblemente en donde el al menos un nucleótido modificado comprende un azúcar y/o una modificación del esqueleto; preferiblemente en donde la modificación de azúcar se selecciona del grupo que consiste en: modificación de 2'-O-metilo, 2'-metoxietoxi, 2'-fluoro, 2'-alilo, 2'-O-[2-(metilamino)-2-oxoetilo], 4'-tio, 4'-CH2-0-2'-puente, 4'-(CH2)2-0-2'-puente, 2'-amino y 2'-O-(N-metilcarbamato) y la modificación del esqueleto se selecciona del grupo que consiste en: fosfonato, fosforotioato, fosfotriéster, metilfosfonato, morfolino, fosfato modificado por SATE (S-acil-2-tioetil) y fosfato modificado por BMEG (isobutiril mercapto etil glicol).
12. Un dsNA como se reivindica en la reivindicación 1, que comprende una región que contiene al menos un enlace de fosforotioato y/o en donde tanto las hebras en sentido como las antisentido consisten en hasta un 100% de nucleótidos modificados químicamente.
13. Un dsNA como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el terminal 3' de la hebra antisentido tiene una extensión 3’ monocatenaria que sobresale del extremo 5' de la hebra en sentido, en donde dicha extensión 3' es 1-4 nucleótidos, opcionalmente 2 nucleótidos.
14. Un dsNA como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde cada ligando se conjuga con el azúcar de un nucleótido del tetrabucle mediante un enlazador como se establece en la Fórmula VI:
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Z es O, S, N(Ri), o CH2;
V y W son cada uno O;
Ri y R2 son cada uno H;
m y n son cada uno independientemente 1-20;
X es un ligando seleccionado del grupo que consiste en: GalNAc, folato, manosa-6-fosfato y colesterol; o
en donde cada ligando se conjuga con un nucleótido del tetrabucle a través de un enlazador seleccionado del grupo que consiste en:
a)
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y
b)
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donde n = 0-20
en donde dicho ligando está conjugado con el azúcar o la base de dicho nucleótido; y en donde dicho nucleótido conjugado con ligando es adecuado para sintetizar el dsNA de cualquier reivindicación anterior.
15. Una composición farmacéutica que comprende el dsNA de cualquiera de las reivindicaciones anteriores y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
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