ES2859661T3 - Vectores de virus adenoasociados para el tratamiento de mucopolisacaridosis - Google Patents

Abstract

Un polinucleótido que comprende un casete de expresión donde dicho casete de expresión comprende una región reguladora de la transcripción unida operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína GNS donde dicha secuencia de nucleótidos es la SEQ ID NO: 4.

Description

DESCRIPCIÓN

Vectores de virus adenoasociados para el tratamiento de mucopolisacaridosis

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a polinucleótidos y a vectores útiles para la expresión de proteínas de interés y a su utilización en terapia génica. La presente invención también se refiere a vectores y a secuencias de ácidos nucleicos útiles para el tratamiento de mucopolisacaridosis tipo IIID.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El lisosoma es un orgánulo que se encuentra en el citoplasma de las células animales que contiene más de 50 hidrolasas que descomponen las biomoléculas durante el reciclado de los componentes celulares agotados o después de la fagocitosis de virus y bacterias. Este orgánulo contiene diversos tipos de enzimas hidrolíticas, incluyendo proteasas, nucleasas, glucosidasas, lipasas, fosfolipasas, fosfatasas y sulfatasas. Todas las enzimas son hidrolasas ácidas.

Las enfermedades de almacenamiento lisosómico (EAL) están provocadas por defectos genéticos que afectan a una o más enzimas lisosómicas. Estas enfermedades genéticas son generalmente el resultado de una deficiencia en una actividad enzimática en particular presente en el lisosoma. En menor grado, estas enfermedades pueden ser debidas a deficiencias en las proteínas implicadas en la biogénesis lisosómica.

Las EAL son individualmente raras, aunque como grupo estos trastornos son relativamente comunes en la población en general. La prevalencia combinada de las EAL es de aproximadamente 1 por 5.000 nacidos vivos. Sin embargo, algunos grupos de la población general están particularmente afectados por una alta incidencia de las EAL. Por ejemplo, la prevalencia de las enfermedades de Gaucher y de Tay-Sachs en los descendientes de individuos judíos de Europa central y del este (Ashkenazi) es de 1 por 600 y de 1 por 3.900 nacimientos, respectivamente.

Las mucopolisacaridosis (MPS) son un grupo de siete (I-VII) enfermedades EAL caracterizadas por una ausencia o una deficiencia de una enzima lisosómica específica implicada en el metabolismo de los glucosaminoglucanos (GAG). Todas las MPS tienen un patrón hereditario autosómico recesivo, con excepción de la MPSII (enfermedad de Hunter) que tiene una herencia ligada al cromosoma X.

De las siete MPS, la mucopolisacaridosis de tipo III (MPSIII o síndrome de Sanfilippo) es la más habitual, con una prevalencia al nacer que se ha descrito que varía entre 0,28 y 4,1 por 100.000 nacimientos. Este síndrome está causado por una deficiencia en una de las enzimas implicadas en la degradación del heparán sulfato de los GAG (HS). Se han definido cuatro subtipos de Sanfilippo, cada uno causado por una deficiencia en una enzima diferente: los tipos A (MPSIIIA), B (MPSIIIB), C (MPSIIIC) y D (MPSIIID). Los genes que codifican para estas enzimas han sido identificados y se han descrito diversas mutaciones.

La MPSIIID está causada por la deficiencia en la actividad de la enzima N-acetilglucosamina-6-sulfatasa (GNS, EC 3.1.6.14). La GNS cataliza la hidrólisis de los grupos 6-sulfato de las unidades de 6-sulfato de la N-acetil-D-glucosamina del HS. Como consecuencia de la acumulación sostenida del HS no degradado se produce un daño celular progresivo, que da como resultado una enfermedad multisistémica. La MPSIIID es la forma más rara de las MPS conocidas, habiéndose descrito hasta ahora únicamente 31 pacientes en la bibliografía. Se han identificado veintidós mutaciones diferentes en el gen humano de la GNS que dan lugar a la deficiencia en la actividad de la enzima GNS.

Parece que los pacientes con MPSIIID siguen el patrón general de presentación clínica del síndrome de Sanfilippo, caracterizado por una degeneración progresiva del sistema nervioso central (SNC) y una enfermedad somática relativamente leve. Después de un periodo temprano de desarrollo normal, los primeros signos de la enfermedad habitualmente se manifiestan en forma de un retraso en el habla y en el desarrollo. Esto está seguido por la aparición de otros síntomas durante la infancia que pueden incluir una pérdida progresiva de las capacidades psicomotoras, pérdida del habla, comportamiento incierto, hiperactividad, trastornos del sueño, pérdida de contacto con el entorno y retraso mental. Además de los síntomas neurológicos, otras comorbilidades no neurológicas tales como infecciones del tracto respiratorio superior, hirsutismo, macrocefalia, hepatomegalia, movilidad articular reducida y unos rasgos faciales toscos también son comunes entre los pacientes con MPSIIID. Al final, la MPSIIID evoluciona a un estado confinado en cama. El índice de progresión de la enfermedad y las características fenotípicas presentes son muy variables entre los pacientes, con unas esperanzas de vida que se ha descrito que varían desde tan poco como 14 años hasta la cuarta década. Esta variabilidad puede estar relacionada con múltiples factores, tales como la naturaleza de la mutación, la etnia o las diferencias en la atención sanitaria que recibe el paciente.

Hasta la fecha no hay terapias específicas para la MPSIIID y el control de la enfermedad es sintomático y aspira a mejorar la calidad de vida de los pacientes y de sus familias. Como para otras MPS, en los últimos años han aparecido dos principales opciones terapéuticas: la terapia de sustitución enzimática (TSE) y el trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT). El diseño de ambas estrategias terapéuticas se basa en la posibilidad de una corrección cruzada, basada en el hecho de que las células normales secretan unas cantidades significativas de enzimas lisosómicas solubles marcadas con manosa-6-fosfato (M6P), tales como la GNS, que pueden ser posteriormente captadas desde el compartimento extracelular por otras células a través de los receptores de la M6P de la membrana plasmática, y dirigirse a los lisosomas. Además, existe un umbral de actividad enzimática residual, generalmente muy bajo, por encima del cual la célula es capaz de hacer frente a la entrada de sustrato, y los sujetos no están afectados por la enfermedad, lo que sugiere que la restauración de una actividad normal no es un requisito para modificar el curso clínico.

Para la MPSIIID, se ha ensayado una TSE en un modelo caprino de la enfermedad. Véase Thompson, y col., J Inherit Metab Dis. 1992; 15 (5): 760-8. En este estudio se administró una dosis de 1 mg/kg de GNS caprina recombinante (rcGNS) por vía intravenosa a una cabra con MPSIIID a las 2, 3 y 4 semanas de edad. Cinco días después de la última dosis se observó una notable reducción en las vacuolas de almacenamiento lisosómicas y en las cantidades de ácido urónico (un constituyente del HS de los GAG) en el hígado, poniendo en evidencia la corrección somática por la infusión de la rcGNS. Los estudios morfológicos y la cuantificación del ácido urónico no mostraron ninguna mejora en el SNC. Aparte de este estudio, no se ha realizado hasta la fecha ningún otro estudio sobre la eficacia de la TSE para la MPSIIID.

La TSE con una enzima recombinante humana está disponible comercialmente para las MPS I, II y VI. Los beneficios descritos de la TSE incluyen mejoras en la movilidad articular, en la capacidad para caminar, en las funciones pulmonar y respiratoria, junto con reducciones en la excreción urinaria de GAG, y en los volúmenes del hígado y del bazo cuando la enzima es infundida por vía intravenosa. Sin embargo, debido a la hipersensibilidad a las proteínas infundidas, debe haber soporte médico disponible durante la administración intravenosa del producto. Estas reacciones anafilácticas, que pueden comprometer la vida del paciente, incluyen distrés respiratorio, hipoxia, hipotensión, urticaria y/o angioedema de garganta o de lengua, y pueden requerir intervenciones tales como una reanimación o una traqueotomía de emergencia, y el tratamiento con agonistas beta-adrenérgicos inhalados, epinefrina o corticosteroides intravenosos. Otros inconvenientes de la TSE incluyen: 1) la dificultad para llevar a cabo infusiones intravenosas de 1-3 horas de duración en pacientes pediátricos, muchos de los cuales padecen una enfermedad mental, 2) el hecho de que los pacientes pueden ser positivos para los anticuerpos contra la enzima con una significación clínica todavía desconocida, pero que podría limitar la eficacia del producto a largo plazo, y 3) el elevado coste de la terapia, que también incluye la atención en domicilio. Independientemente de las preocupaciones sobre la seguridad o el coste, a las dosis recomendadas, la TSE intravenosa no es capaz de mejorar la enfermedad neurológica de la MPS, ya que la enzima no atraviesa de forma eficaz la barrera hematoencefálica (BHE).

Una alternativa a la administración intravenosa de la TSE es la provisión de la enzima exógena en el líquido cefalorraquídeo (LCR) con objeto de que alcance directamente el SNC. Los experimentos en modelos animales de MPSIIIA demostraron que la administración de la enzima recombinante en el espacio intratecal puede atravesar el tejido cerebral y promover el aclaramiento del material lisosómico almacenado y mejorar el comportamiento. Se han llevado a cabo ensayos clínicos para analizar la administración enzimática intratecal para la MPSIIIA (NCT01155778) y la M^pSII (NCT00920647). A pesar de los potenciales beneficios de la T^s E intratecal, la implantación del dispositivo de administración de fármacos intratecal permanente que requiere la terapia está relacionada con unos riesgos e inconvenientes sustanciales, y la propia terapia tiene un coste económico muy elevado por paciente/año.

El trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT) que usa células madre derivadas de médula ósea (trasplante de médula ósea, TMO) ha demostrado ser eficaz en el tratamiento de ambas patologías, somática y neurológica, en pacientes con otras MPS. El principio subyacente a la corrección mediante un HSCT es que los monocitos del donante son capaces de atravesar la pared capilar, incluso en la BHE, tras lo cual se diferencian en macrófagos tisulares, microglía en el caso del SNC, y secretan la enzima deficiente para su administración a las diversas células. Sin embargo, el trasplante de médula ósea ha resultado insatisfactorio en los pacientes con MPSIII, incluso si se tratan en estadios presintomáticos, y no se considera una opción terapéutica para esta enfermedad. Con respecto al trasplante de células madre derivadas de la sangre del cordón umbilical, todavía no está claro si esta estrategia da como resultado una protección del SNC frente a la degradación en los pacientes con MPSIII.

La terapia de privación de sustrato (TPS) aspira a reducir la tasa de síntesis de GAG, de forma que si queda alguna actividad residual, ésta podría ser suficiente para impedir la excesiva acumulación de GAG o al menos ralentizar la tasa de acumulación. Se ha sugerido que la genisteína, una isoflavona de soja, actúa como un inhibidor de la producción de HS al disminuir la actividad quinasa del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR). Véase Piotrowska E, y col., Eur J Hum Genet. 2006; 14 (7): 846-52. Algunos estudios recientes indican que la genisteína inhibe la síntesis de GAG en los fibroblastos de los pacientes que padecen diversas mucopolisacaridosis (los tipos I, II, IIIA y IIIB). Véase Piotrowska E, y col., supra. Cuando se administra por vía intravenosa, se espera que la genisteína sea capaz de atravesar la BHE, permitiendo el tratamiento de la patología del SNC. Para apoyar esta noción, un estudio piloto sin enmascaramiento en el que se administró un extracto de soja enriquecido en genisteína a 5 pacientes con MPSIIIA y 5 con MPSIIIB durante 12 meses dio como resultado una mejora significativa tanto en los parámetros somáticos como en los neurológicos. Sin embargo, los estudios posteriores no mostraron una mejora en las escalas de discapacidad ni en las puntuaciones de comportamiento tras la administración de genisteína a pacientes con MPSIIIA, con MPSIIIB y con MPSIIIC durante 12 meses.

Dadas las limitaciones de las actuales opciones terapéuticas para la MPSIIID, son necesarias estrategias alternativas. La terapia génica in vivo ofrece la posibilidad de un tratamiento en una sola sesión para la MPSIIID y otras enfermedades hereditarias, con la perspectiva de unos efectos beneficiosos de por vida.

La transferencia génica mediada por un vector vírico adenoasociado (AAV), en particular, está surgiendo rápidamente como la estrategia de elección para muchas aplicaciones de terapia génica in vivo, debido a la elevada eficacia de transducción y a la ausencia de patogenicidad de estos vectores. Los vectores AAV pueden transducir células post-mitóticas y numerosos estudios preclínicos y clínicos han demostrado el potencial de la transferencia génica mediada por vectores AAV para guiar eficazmente una expresión sostenida de los transgenes terapéuticos para una variedad de enfermedades.

Numerosas estrategias de terapia génica basadas en el uso de AAVs han demostrado ser eficaces para mejorar la enfermedad en modelos de ratón de la MPSIII. Dado el fuerte componente neurodegenerativo de estos síndromes, los estudios más relevantes se han centrado en la administración de vectores terapéuticos en el SNC. Después de un pretratamiento con manitol para permeabilizar la BHE, una única infusión intravenosa de vectores AAV2 que codifican para la N-acetilglucosaminidasa alfa (NAGLU) en un modelo de ratón de la MPSIIIB dio lugar a una significativa prolongación de la supervivencia, una mejora en el rendimiento de comportamiento y una reducción en la patología lisosómica cerebral, aunque únicamente se consiguió una corrección parcial de la patología somática. Véase McCarty, y col., Gene Ther. 2009; 16 (11): 1340-52. Recientemente se ha demostrado que los vectores AAV9 administrados por vía intravenosa, capaces de atravesar la BHE, son eficaces para aumentar la actividad enzimática y promover la corrección de la patología de almacenamiento lisosómico en el SNC y en los órganos somáticos, dando lugar a una mejora en el rendimiento del comportamiento y a una prolongación en la esperanza de vida en los modelos de ratón de MPSIIIA y de MPSIIIB. A pesar de que las dosis necesarias para conseguir la corrección en el SNC son generalmente muy altas, actualmente se está realizando un ensayo clínico en fase I/II para la MPSIIIA mediante el uso de AAV9 administrado en una vena periférica de una extremidad (NCT02716246).

Una alternativa para llegar al SNC es la administración directamente de los AAV en el parénquima cerebral. La administración estereotáctica de vectores AAV en el cerebro se ha ensayado en modelos de ratón y de perro de MPSIII. Debido a la limitada difusión de los AAV desde el sitio de inyección, la estrategia requiere múltiples inyecciones para mejorar la biodistribución del vector. A pesar de que se detectó actividad enzimática en todo el cerebro de los perros con MPSIIIB tratados con 4 inyecciones de vectores AAV5 que codifican para la NAGLU, la patología lisosómica mejoró pero no se corrigió totalmente, lo que indica que los niveles de actividad enzimática conseguidos con esta estrategia fueron insuficientes para hacer frente al almacenamiento de GAG. Los ratones con MPSIIIA tratados con vectores AAVrh10 que codifican para la sulfamidasa y el factor modificador de sulfatasa 1 (SUMF1) mostraron una mejora en el catabolismo del heparán sulfato y signos de una reducción en la inflamación, pero únicamente en unas áreas restringidas o cercanas al punto de inyección. Véase Tardieu M, y col., Hum Gene Ther. 2014; 25 (6): 506-16. A pesar de estas limitaciones se están llevando a cabo dos ensayos clínicos para la MPSIIIA (NCT02053064) y la MPSIIIB (ISRCTN19853672) mediante el uso de los vectores AAVrh10 y AAV5, respectivamente. Cuanto mayor es el cerebro más difícil resulta cubrir el volumen total del órgano con inyecciones intraparenquimatosas, y la administración en seres humanos requiere la administración del vector en diversas zonas, lo que hace que la administración suponga un reto técnico y requiera el desarrollo de procedimientos quirúrgicos específicos.

A pesar de que se han desarrollado numerosas estrategias terapéuticas para otras formas de la MPSIII, ninguna de las estrategias mencionadas anteriormente se ha aplicado a la MPSIIID. Por lo tanto, existe una necesidad de nuevas estrategias para el tratamiento de la MPSIIID.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona nuevos polinucleótidos y vectores para el tratamiento de mucopolisacaridosis de tipo III D (MPSIID).

En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un polinucleótido que comprende un casete de expresión donde dicho casete de expresión comprende una región reguladora de la transcripción unida operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína GNS donde dicha secuencia de nucleótidos es la SEQ ID NO: 4.

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona nuevos vectores que contienen un polinucleótido de acuerdo con la invención. En una forma de realización particular, dichos vectores son nuevos vectores recombinantes para el tratamiento de la mucopolisacaridosis de tipo IIID. Dichos vectores recombinantes son, en particular, vectores víricos adenoasociados (AAV).

Un aspecto adicional de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva del polinucleótido o del vector descrito en esta invención.

Aún, un aspecto adicional de la invención se refiere al polinucleótido de la invención o a un vector descrito en esta invención, o a una composición farmacéutica descrita en esta invención para su uso como un medicamento, en particular para el tratamiento de la mucopolisacaridosis de tipo IIID.

La presente invención también proporciona un método para la producción del vector vírico adenoasociado de serotipo 9 de acuerdo con la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Figura 1. Generación de pAAV-CAG-hGNS y de AAV9-CAG-hGNS. (A) Representación esquemática del plásmido pAAV-CAG-hGNS y de sus componentes. (B) Representación esquemática del genoma de un vector adenoasociado que contiene la secuencia codificante de la hGNS.

Figura 2. Generación de pAAV-CAG-ohGNS-version1 y de AAV9-CAG-ohGNS-version1. (A) Representación esquemática del plásmido pAAV-CAG-ohGNS-version1 y de sus componentes. (B) Representación esquemática del genoma de un vector adenoasociado que contiene la secuencia codificante de la ohGNS-version1.

Figura 3. Generación de pAAV-CAG-ohGNS-version2 y de AAV9-CAG-ohGNS-version2. (A) Representación esquemática del plásmido pAAV-CAG-ohGNS-version2 y de sus componentes. (B) Representación esquemática del genoma de un vector adenoasociado que contiene la secuencia codificante de la ohGNS-version2.

Figura 4. Generación de pAAV-CAG-ohGNS-version3 y de AAV9-CAG-ohGNS-version3. (A) Representación esquemática del plásmido pAAV-CAG-ohGNS-version3 y de sus componentes. (B) Representación esquemática del genoma de un vector adenoasociado que contiene la secuencia codificante de la ohGNS-version3.

Figura 5. Generación de pAAV-CAG-omGNS y de AAV9-CAG-omGNS. (A) Representación esquemática del plásmido pAAV-CAG-omGNS y de sus componentes. (B) Representación esquemática del genoma de un vector adenoasociado que contiene la secuencia codificante de la omGNS.

Figura 6. Ensayo in vitro de pAAV-CAG-hGNS, pAAV-CAG-ohGNS-version1, pAAV-CAG-ohGNS-version2 y pAAV-CAG-ohGNS-version3. Transfección transitoria de células HEK293 con 4 |ig de pAAV-CAG-hGNS, pAAV-CAG-ohGNS-v1, pAAV-CAG-ohGNS-v2 o pAAV-CAG-ohGNS-v3. (A) Cuantificación mediante RT-PCR cuantitativa de la expresión de la GNS a partir de diferentes constructos. (B) y (C) Comparación de los niveles de actividad de la GNS en el medio o en extractos celulares mediada por los diferentes casetes de expresión. Los valores son las medias ± SEM de 3 pocillos por afección. * P<0,05; *** P<0,001 frente a células transfectadas con pAAV-CAG-hGNS. “NT” no transfectada.

Figura 7. Inyección intravenosa de AAV-CAG-hGNS, AAV-CAG-ohGNS-version1, AAV-CAG-ohGNS-version2 o AAV-CAG-ohGNS-version3 a ratones con MPSIIID. (A) y (B) Actividad de la GNS en el hígado y suero de ratones silvestres (sanos) (WT), ratones Gns-/- sin tratar y ratones Gns-/- a los que se les ha administrado, a través de inyección en la vena caudal, 1x1010 genomas de vector de los vectores AAV9-CAG-hGNS, AAV-CAG-ohGNS-version1, AAV-CAG-ohGNS-versión2 o AAV-CAG-ohGNS-versión3. (C) Cuantificación de glucosaminoglucanos (GAG) en el hígado de las mismas cohortes que en (A). Los valores son las medias ± SEM de 2-5 animales por grupo. Para el suero, el n=1 para AAV-CAG-ohGNS-version1. * P<0,05, ** P<0,01, *** P<0,001 frente a ratones Gns-tratados con AAV-CAG-hGNS.

Figura 8. Administración intra-LCR de vectores AAV9 que codifican para la GNS murina optimizada (AAV9-CAG-omGNS). Estudio a corto plazo. Actividad de la GNS en el cerebro de ratones silvestres (sanos) (WT), de ratones G ns/ sin tratar y de ratones Gns/ a los que se les ha administrado en el LCR, a través de una inyección intracisternal (IC), 5 x 1010 vg del vector de control (AAV9-Null) o de AAV9-CAG-omGNS. La actividad de la G^ns de los WT se estableció como el 100 %. Los valores son las medias ± SEM de 4-5 ratones por grupo. * P < 0,05 frente a ratones Gns/ tratados con AAV9-Null.

Figura 9. Administración intra-LCR de vectores AAV9 que codifican para la GNS murina optimizada (AAV9-CAG-omGNS) a ratones macho. (A) Cuantificación de los glucosaminoglucanos (GAG) en diferentes partes del cerebro (secciones I-V) en ratones silvestres (sanos) (WT) y en ratones macho sin tratar GnsZ y en ratones macho G ns/ a los que se les ha administrado en la cisterna magna 5 x 1010 vg del vector de control (AAV9-null) o 5 x 1010 vg de AAV9-CAG-omGNS. (B) Cuantificación de la intensidad de la señal obtenida en diferentes áreas del cerebro después de la tinción para el marcador lisosómico LAMP-2 en el mismo grupo de animales que en (A). (C) Actividad de otras enzimas lisosómicas en extractos cerebrales obtenidos a partir de los mismos grupos de animales que en (A) . IDUA, iduronidasa, alfa-L-, GALNS (N-acetil)-6-sulfatasa de galactosamina, GUSB, glucuronidasa, beta, B-HEXO, hexosaminidasa B. Los valores son las medias ± SEM de 4-5 ratones por grupo. ** P < 0,01, *** P < 0,001 frente a ratones macho Gns-/- tratados con AAV9-Null.

Figura 10. Administración intra-LCR de vectores AAV9 que codifican para la GNS murina optimizada (AAV9-CAG-omGNS) a machos. Estudio a corto plazo. Análisis ultraestructural de la corteza cerebral de ratones macho silvestres (WT) sanos de 6 meses de edad y crías Gns-- de la misma camada inyectados a la edad de 2 meses con 5x1010 vg de vectores AAV9-Null o AAV9-Gns. La administración del vector terapéutico aclaró completamente las células gliales perineuronales (indicadas mediante asteriscos) de los lisosomas agrandados (indicados mediante puntas de flecha blancas). Barra de escala: 10 pm.

Figura 11. Administración intra-LCR de vectores AAV9 que codifican para la GNS murina optimizada (AAV9-CAG-omGNS) a machos. Estudio a corto plazo. (A, B) Los histogramas representan la intensidad de la señal medida después de la inmunotinción del marcador de astrocitos GFAP (A) y del marcador de la microglía BSI-B4 (B) en secciones de la corteza frontal, parietal y occipital, del colículo superior y del tálamo de ratones silvestres (sanos), y de ratones macho Gns-/- a los que se les ha administrado en la cisterna magna 5 x 1010 vg del vector de control (AAV-null) o 5 x 1010 vg de AAV9-CAG-omGNS. Los resultados se muestran como las medias ± SEM de 5 ratones por grupo. ** P < 0,01, **** P < 0,0001 frente a ratones macho Gns-/ tratados con AAV9-Null.

Figura 12. Administración intra-LCR de vectores AAV9 que codifican para la GNS murina optimizada (AAV9-CAG-omGNS). Estudio a corto plazo. Actividad de la GNS en el hígado de ratones silvestres (sanos), de ratones macho Gns-/- sin tratar y de ratones macho Gns-/- a los que se les ha administrado en el LCR, a través de una inyección intracisternal (IC), 5 x 1010 vg del vector de control (AAV9-Null) o de AAV9-CAG-omGNS. La actividad de la G^ns de los WT se estableció como el 100 %. Los valores son las medias ± SEM de 4-5 ratones por grupo. *** P < 0,001 frente a ratones macho Gns-/ - tratados con AAV9-Null.

Figura 13. Administración intra-LCR de vectores AAV9 que codifican para la GNS murina optimizada (AAV9-CAG-omGNS). Estudio a corto plazo. Actividad de la GNS en la circulación, expresada como % de la actividad de los WT, en ratones macho de 6 meses de edad, es decir, 4 meses después de la administración de 5x1010 vg de AAV9-CAG-omGNS o AAV9-Null al LCR de animales deficientes en GNS. Los ratones Gns-1- de la misma edad sin tratar también sirvieron como controles. La actividad de la GNS de los WT se estableció como el 100 %. Los valores son las medias ± SEM de 5 ratones por grupo. *** P < 0,001 frente a ratones macho Gns-/- tratados con AAV9-Null.

Figura 14. Administración intra-LCR de vectores AAV9 que codifican para la GNS murina optimizada (AAV9-CAG-omGNS). Estudio a corto plazo. (A) Cuantificación de los glucosaminoglucanos (GAG) en órganos somáticos de ratones silvestres (sanos) y de ratones macho Gns-/ - sin tratar o de ratones macho Gns-/ - a los que se les ha administrado en la cisterna magna 5 x 1010 vg del vector de control (AAV-null) o 5 x 1010 vg de AAV9-CAG-omGNS. (B) Actividad de otras enzimas lisosómicas en extractos hepáticos obtenidos a partir de los mismos grupos de animales que en (A). IDUA, iduronidasa, alfa-L-, SGSH, sulfohidrolasa de N-sulfoglucosamina, NAGLU, N-acetilglucosaminidasa, alfa, HGSNAT, N-acetiltransferasa de heparan-alfa-glucosaminida, GALNS (N-acetil)-6-sulfatasa de galactosamina, GUSB, glucuronidasa, beta, B-HEXO, hexosaminidasa B. Las actividades de las enzimas de los WT se establecieron como el 100 %. Los valores son las medias ± SEM de 4-5 ratones por grupo. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001, **** P < 0,0001 frente a ratones macho Gns-/ - tratados con AAV9-Null.

Figura 15. Administración intra-LCR de vectores AAV9 que codifican para la GNS murina optimizada (AAV9-CAG-omGNS). Estudio a corto plazo. Peso en húmedo del hígado (A) y del bazo (B) con respecto al peso corporal total en ratones silvestres (sanos), en ratones machos Gns-/- sin tratar y en ratones macho Gns-/- a los que se les ha administrado en el LCR 5 x 1010 vg del vector de control (AAV9-Null) o 5 x 1010 vg del vector AAV9-CAG-omGNS a los dos meses de edad, y analizados 4 meses después. Los valores son las medias ± SEM de n = 8-13 animales/grupo. *P < 0,05 frente a los WT. *** P < 0,001 frente a ratones macho Gns-/- tratados con AAV9-Null. Figura 16. Administración intra-LCR de vectores AAV9 que codifican para la GNS murina optimizada (AAV9-CAG-omGNS). Estudio a corto plazo. Análisis mediante microscopía electrónica de transmisión de la ultraestructura de los hepatocitos (hígado) y las células bronquiales ciliadas (pulmón) de órganos recolectados de WT sanos de 6 meses de edad y machos Gns-/- a los que se les ha administrado en el LCR 5x1010 vg de vector de control null (AAV9-Null) o una dosis equivalente de vectores que codifican para la GNS murina optimizada (AAV9-CAG-omGNS). Los lisosomas agrandados se indican mediante puntas de flecha. Barra de escala: hígado, 10 pm; pulmón, 5 pm.

Figura 17. Administración intra-LCR de vectores AAV9 que codifican para la GNS murina optimizada (AAV9-CAG-omGNS). Estudio a corto plazo. Evaluación de la actividad locomotora y exploratoria del ensayo de campo abierto en ratones silvestres sin tratamiento previo (sanos), en ratones macho Gns-/ - sin tratar y en ratones macho Gns-/ - a los que se les ha administrado en el LCR 5 x 1010 vg del vector de control (AAV9-Null) o 5 x 1010 vg del vector AAV9CAG-omGNS a los dos meses de edad y analizados cuatro meses después. Distancia total recorrida, Tiempo de reposo. Los resultados se muestran como la media ± SEM, n = 15-18 animales por grupo.

Figura 18. Administración intra-LCR de vectores AAV9 que codifican para la GNS murina optimizada (AAV9-CAG-omGNS)- Estudio a largo plazo. (A) Cuantificación de glucosaminoglucanos (GAG) en diferentes partes del cerebro (secciones I-IV) en ratones silvestres (sanos) (WT), ratones macho Gns~A sin tratar y ratones macho Gns~A a los que se les han administrado en la cisterna magna 5x1010 vg del vector de control (AAV9-null) o 5x1010 vg de AAV9-CAG-omGNS. Los ratones se trataron a la edad de 2 meses y se analizaron 10 meses después. Los valores son las medias ± SEM de 5 ratones por grupo. (B) Los histogramas representan la intensidad de la señal obtenida en diferentes áreas del encéfalo después de la tinción de secciones del cerebro con un anticuerpo que reconoce el marcador lisosómico LAMP-2. Los valores son las medias ± SEM de 3-5 ratones por grupo. * P<0,05, ** P<0,01, *** P<0,001 frente a ratones macho Gns~A tratados con AAV9-Null.

Figura 19. Administración intra-LCR de vectores AAV9 que codifican para la GNS murina optimizada (AAV9-CAG-omGNS). Estudio a largo plazo. (A, B) Cuantificación de la intensidad de la señal medida después de inmunotinción para el marcador de astrocitos GFAP (A) y para el marcador de la microglía BSI-B4 (B) en secciones de la corteza frontal, parietal y occipital, del colículo superior y del tálamo de ratones silvestres (sanos) y ratones macho Gns~A a los que se les ha administrado en la cisterna magna 5x1010 vg del vector de control (AAV-null) o 5x1010 vg de AAV9-CAG-omGNS a la edad de 2 meses y se han analizado 10 meses después. Los resultados se muestran como las medias ± SEM de 3-5 ratones por grupo. * P<0,05, ** P<0,01, *** P<0,001 frente a ratones macho Gns~A tratados con AAV9-Null.

Figura 20. Administración intra-LCR de vectores AAV9 que codifican para la GNS murina optimizada (AAV9-CAG-omGNS). Estudio a largo plazo. (A) Cuantificación de glucosaminoglucanos (GAG) en órganos somáticos de ratones silvestres (sanos) y ratones macho Gns~A sin tratar o ratones macho Gns~A a los que se les ha administrado en la cisterna magna 5x1010 vg del vector de control (AAV-null) o 5x1010 vg de AAV9-CAG-omGNS. Los ratones se trataron a la edad de 2 meses y se analizaron 10 meses después. (B) Actividad de las enzimas lisosómicas no afectadas por la mutación en extractos de hígado de las mismas cohortes de animales que en (A). IDUA, iduronidasa, alfa-L-, SGSH, sulfohidrolasa de N-sulfoglucosamina, NAGLU, N-acetilglucosaminidasa, alfa, HGSNAT, N-acetiltransferasa de heparan-alfa-glucosaminida, GALNS (N-acetil)-6-sulfatasa de galactosamina, GUSB, glucuronidasa, beta, B-HEXo, hexosaminidasa B. Las actividades de las enzimas WT se establecieron como el 100 %. Los valores son las medias ± SEM de 4-8 ratones por grupo. * P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001 frente a ratones macho Gns-/- tratados con AAV9-Null.

Figura 21. Administración intra-LCR de vectores AAV9 que codifican para la GNS murina optimizada (AAV9-CAG-omGNS). Estudio a largo plazo. Evaluación de campo de la actividad locomotora y exploratoria de ratones silvestres (sanos) que nunca han recibido tratamiento, ratones macho Gns~A sin tratar y ratones macho Gns~A a los que se les ha administrado en el LCR 5x1010 vg del vector de control (AAV9-Null) o 5x1010 vg del vector AAV9-CAG-omGNS a los dos meses de edad y se han analizado 10 meses después. Distancia total viajada, tiempo de descanso y número total de exploraciones en posición erguida. Los resultados se muestran como la media ± s Em , n = 5-15 animales por grupo, *P < 0,05 frente a los ratones macho Gns~A.

Figura 22. Administración intra-LCR de vectores AAV9 que codifican para la GNS murina optimizada (AAV9-CAG-omGNS). Estudio a largo plazo. Actividad de la GNS en el cerebro de ratones silvestres (sanos) (WT) y ratones Gns-A a los que se les ha administrado en el LCR, a través de una inyección intracisternal (IC), 5x1010 vg de AAV9-CAG-omGNS. La actividad de la GNS de los WT se estableció como el 100 %. La actividad se analizó a los 22 meses de edad, es decir, 20 meses después de la administración del vector. Los valores son las medias ± SEM de 4 ratones por grupo.

Figura 23. Administración intra-LCR de vectores AAV9 que codifican para la GNS murina optimizada (AAV9-CAG-omGNS). Estudio a largo plazo. (A) Contenido de glucosaminoglucanos (GAG) en el cerebro de ratones silvestres (sanos) (WT) y ratones macho Gns~A a los que se les ha administrado en la cisterna magna 5x1010 genomas de vector de vectores AAV9-CAG-omGNS. El análisis se llevó a cabo 20 meses después de la administración del vector. (B) Cuantificación de la intensidad de la señal en diferentes áreas del cerebro después de la tinción para el marcador lisosómico LAMP-2 en la misma cohorte de animales que en (A). (C) Actividad de otras enzimas lisosómicas en extractos cerebrales obtenidos a partir de las mismas cohortes de animales que en (A). GALNS (N-acetil)-6-sulfatasa de galactosamina, GUSB, glucuronidasa, beta, B-HEXO, hexosaminidasa B. Los valores son las medias ± SEM de 4 ratones por grupo.

Figura 24. Administración intra-LCR de vectores AAV9 que codifican para la GNS murina optimizada (AAV9-CAG-omGNS). Estudio a largo plazo. Evaluación de la neuroinflamación en secciones del cerebro de ratones macho silvestres (sanos) y Gns~A a los que se les ha administrado en la cisterna magna 5x1010 genomas de vector de vectores AAV9-CAG-omGNS y se han analizado 20 meses después. Los histogramas representan la intensidad de la señal del marcador de astrocitos GFAP (A) y del marcador de la microglía BSI-B4 (B) en secciones de la corteza frontal, parietal y occipital, del colículo superior y del tálamo. Los resultados se muestran como las medias ± SEM de 4 ratones por grupo.

Figura 25. Administración intra-LCR de vectores AAV9 que codifican para la GNS murina optimizada (AAV9-CAG-omGNS). Estudio a largo plazo. Cuantificación de glucosaminoglucanos (GAG) en órganos somáticos de ratones silvestres (sanos) y ratones macho Gns-/- a los que se les ha administrado en la cisterna magna 5x1010 genomas de vector del vector AAV9-CAG-omGNS a los 2 meses de edad y se han analizado a los 22 meses de edad. Los resultados se muestran como las medias ± SEM de 4 ratones por grupo.

Figura 26. Administración intra-LCR de vectores AAV9 que codifican para la GNS murina optimizada (AAV9-CAG-omGNS). Análisis de Kaplan-Meier de la supervivencia de ratones macho silvestres (sanos), Gns-/- sin tratar y Gns-/ a los que se les ha administrado en el LCR 5 x 1010 vg del vector de control (AAV9-Null) o 5 x 1010 vg del vector AAV9-CAG-omGNS a los dos meses de edad. n = 20 para los WT, 19 para los ratones Gns-/ sin tratar, 19 para los ratones Gns-/- a los que se les ha inyectado AAV9-Null, y 20 para los ratones Gns-/- a los que se les ha inyectado AAV9-CAG-omGNS.

DEPÓSITO DE MICROORGANISMOS

Los plásmidos pAAV-CAG-hGNS (SEQ ID NO: 5), pAAV-CAG-ohGNS-version1 (SEQ ID NO: 6), pAAV-CAG-ohGNS-version2 (SEQ ID NO: 7) y pAAV-CAG-ohGNS-version3 (SEQ ID NO: 8) fueron depositados el 21 de julio de 2016 con los números de registro DSM 32342, DSM 32343, DSM 32344 y DSM 32345 respectivamente en el DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, InhoffenstralJe 7 B, D-38124 Braunschweig, República Federal de Alemania.

DEFINICIONES

Los términos “secuencia de nucleótidos” o “secuencia de nucleótidos aislada” o “secuencia de polinucleótidos” o “polinucleótido” se usan de forma intercambiable en esta invención y se refieren a una molécula de un ácido nucleico, tanto de ADN como de ARN, que contiene desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, respectivamente. El ácido nucleico puede ser bicatenario, monocatenario o contener porciones de una secuencia tanto bicatenaria como monocatenaria.

Los términos “% de identidad de la secuencia”, “% de identidad” o “% de homología de la secuencia” se refieren al porcentaje de nucleótidos o de aminoácidos de una secuencia candidata que son idénticos a los nucleótidos o a los aminoácidos de la secuencia de referencia después de alinear las secuencias para conseguir el máximo % de identidad de la secuencia. En una forma de realización preferida, la identidad de la secuencia se calcula basándose en la longitud completa de dos SEQ ID NO dadas o de una parte de las mismas. El % de identidad de la secuencia puede ser determinado mediante cualquier método o algoritmo establecido en la técnica, tales como los algoritmos ALIGN, BLAST y BLAST 2.0. Véase Altschul S, y col., Nuc Acids Res. 1977; 25: 3389-3402 y Altschul S, y col., J Mol Biol. 1990; 215: 403-410.

En esta invención, el “% de identidad de la secuencia”, “% de identidad” “o “% de homología de la secuencia” se calcula dividiendo el número de nucleótidos o de aminoácidos que son idénticos después de alinear la secuencia de referencia y la secuencia candidata, por el número total de nucleótidos o de aminoácidos de la secuencia de referencia, y multiplicando el resultado por 100.

Opcionalmente, en la determinación del grado de similitud de aminoácidos, la persona experta también puede tener en cuenta las denominadas sustituciones de aminoácidos "conservativas", como será evidente para la persona experta. Las sustituciones de aminoácidos conservativas se basan en la intercambiabilidad de los residuos que tienen unas cadenas laterales similares. Por ejemplo, el grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales alifáticas incluye glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; el grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales alifáticashidroxilo incluye serina y treonina; el grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales que contienen amida incluye asparagina y glutamina; el grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales aromáticas incluye fenilalanina, tirosina y triptófano; el grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales básicas incluye lisina, arginina e histidina; y el grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales que contienen azufre incluye cisteína y metionina. Las variantes de sustitución de la secuencia de aminoácidos descritas en esta invención son aquellas en las que al menos un residuo de las secuencias descritas ha sido eliminado y en su lugar se ha insertado un residuo diferente. Preferiblemente, el cambio de aminoácido es conservativo. Algunas sustituciones conservativas preferidas para cada uno de los aminoácidos naturales son: Ala por Ser; Arg por Lys; Asn por Gin o His; Asp por Glu; Cys por Ser o Ala; Gin por Asn; Glu por Asp; Gly por Pro; His por Asn o Gin; He por Leu o Val; Leu por He o Val; Lys por Arg; Gin por Glu; Met por Leu o He; Phe por Met, Leu o Tyr; Ser por Thr; Thr por Ser; Trp por Tyr; Tyr por Trp o Phe; y, Val por He o Leu.

Los términos “codificar” o “codificante” se refieren al código genético que determina cómo se traduce una secuencia de nucleótidos en un polipéptido o en una proteína. El orden de los nucleótidos en una secuencia determina el orden de aminoácidos a lo largo de un polipéptido o de una proteína.

El término “proteína” se refiere a una macromolécula formada por una o más cadenas lineales de aminoácidos o de polipéptidos. Las proteínas pueden sufrir modificaciones post-traduccionales, como la conversión de un residuo de cisteína en 3-oxoalanina, una glicosilación o una unión a un metal. La glicosilación de una proteína es la adición de diferentes carbohidratos que están unidos covalentemente a la cadena del aminoácido.

El término "región reguladora de la transcripción", según se usa en esta invención, se refiere a un fragmento de un ácido nucleico capaz de regular la expresión de uno o más genes. Las regiones reguladoras de los polinucleótidos de la invención pueden incluir un promotor, más elementos de respuesta, secuencias activadoras y potenciadoras para la unión de los factores de transcripción, para ayudar a la ARN polimerasa a unirse y promover la expresión, y secuencias operadoras o silenciadoras a las cuales se unen proteínas represoras para bloquear la unión de la ARN polimerasa e impedir la expresión.

El término "promotor" debe entenderse como un fragmento de un ácido nucleico que funciona para controlar la transcripción de uno o más polinucleótidos, por ejemplo, secuencias codificantes, que está ubicado secuencia arriba en 5' de la(s) secuencia(s) de polinucleótido(s) y que es identificado estructuralmente por la presencia de un sitio de unión para la ARN polimerasa dependiente de ADN, sitios de inicio de la transcripción y, pero no se limitan a, sitios de unión para los factores de transcripción, los represores y cualquier otra secuencia de nucleótidos conocida en la materia que actúa directa o indirectamente para regular la cantidad de transcripción a partir del promotor.

Se dice que un promotor es activo, o se dice que dirige la expresión de una secuencia de nucleótidos unida operativamente a él, cuando puede iniciar la transcripción de dicha secuencia de nucleótidos en un sistema de expresión que usa un constructo génico que comprende dicho promotor unido operativamente a una secuencia de nucleótidos de interés usando un ensayo adecuado tal como una RT- qPCR o una inmunotransferencia Northern (detección del transcrito). La actividad de dicho promotor también puede ser evaluada a nivel de la proteína mediante el uso de un ensayo adecuado para la proteína codificada, tal como una inmunotransferencia Western o un ELISA. Se dice que un promotor es capaz de iniciar la transcripción si puede detectarse un transcrito o si se encuentra un aumento en el nivel de un transcrito o de una proteína de al menos el 5 %, el 10 %, el 15 %, el 20 %, el 30 %, el 40 %, el 50 %, el 60 %, el 70 %, el 80 %, el 90 %, el 100 %, el 200 %, el 300 %, el 500 %, el 1.000 %, el 1.500 % o el 2.000 % en comparación con la transcripción que usa un constructo que únicamente difiere en que está exento de dicho promotor.

El término promotor "constitutivo" se refiere a un promotor que es activo en la mayoría de las condiciones fisiológicas y de desarrollo. Un promotor "inducible" es un promotor que está regulado preferiblemente dependiendo de las condiciones fisiológicas o de desarrollo. Un promotor inducible puede ser activo tras la administración de un fármaco o la exposición a la luz. Por lo tanto, un promotor "constitutivo" no está regulado en el sentido de un promotor "inducible". Un promotor "específico tisular" es activo preferiblemente en tipos específicos de células/tejidos. Por oposición a un promotor “específico tisular", el promotor usado en el contexto de la descripción es un promotor "ubicuo". Un promotor ubicuo puede definirse como un promotor que es activo en muchos o en cualquier tejido diferente. Habitualmente, "muchos" en este contexto significa más de 5 o al menos 6, 10, 15, 20 o en 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 tejidos diferentes.

El término promotor “CAG” se refiere a un promotor que comprende el promotor de la p actina de pollo y un potenciador de citomegalovirus (Alexopoulou A. y col. BMC Cell Biology 2008; 9 (2): 1-11). De forma más precisa, dicho promotor CAG comprende (i) el elemento potenciador temprano de citomegalovirus (CMV), (ii) el promotor de la beta-actina de pollo, (iii) el primer intrón del gen de la beta-actina de pollo y (iv) el intrón 2/exón 3 del gen de la beta- globina de conejo.

El término “unido operativamente” se refiere a la relación funcional y a la ubicación de la secuencia del promotor con respecto al gen de interés (por ejemplo, un promotor o un potenciador está unido operativamente a una secuencia codificante si afecta a la transcripción de la secuencia). Generalmente, un promotor unido operativamente es contiguo a la secuencia de interés. Sin embargo, un potenciador no tiene por qué ser contiguo a la secuencia de interés para controlar su expresión.

El término "región reguladora post-transcripcional", según se usa en esta invención, se refiere a cualquier polinucleótido que facilita la expresión, la estabilización o la localización de las secuencias contenidas en el casete o en el producto génico resultante.

El término "vector", según se usa en esta invención, se refiere a un constructo capaz de administrar y opcionalmente expresar uno o más polinucleótidos de interés en una célula hospedadora. Algunos ejemplos de vectores incluyen, pero no se limitan a, vectores virales, vectores de expresión de ADN o de ARN desnudos, vectores plasmídicos, de cósmido o de fago, vectores de expresión de ADN o de ARN asociados con agentes de condensación catiónicos, vectores de expresión de ADN o de ARN encapsulados en liposomas, y ciertas células eucariotas, tales como células productoras. Los vectores pueden ser estables y pueden ser autorreplicantes. No existen limitaciones relativas al tipo de vector que se puede usar. El vector puede ser un vector de clonación, adecuado para la propagación y la obtención de polinucleótidos, constructos génicos o vectores de expresión incorporados en numerosos organismos heterólogos. Algunos vectores adecuados incluyen vectores de expresión procariotas (por ejemplo, pUC18, pUC19, Bluescript y sus derivados), mpl8, mpl9, pBR322, pMB9, CoIEl, pCRl, RP4, vectores de fagos y de lanzadera (por ejemplo, pSA3 y pAT28) y vectores de expresión eucariotas basados en vectores virales (por ejemplo, adenovirus, virus adenoasociados, así como retrovirus y lentivirus), así como vectores no víricos tales como pSilencer 4.1-CMV (Ambion®, Life Technologies Corp., Carslbad, CA, EE.UU.), pADNc3, pADNc3.1/hyg pHCMV/Zeo, pCR3.1, pEFl/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAXl, pZeoSV2, pCI, pSVL y pKSV-10, pBPV-l, pML2d y pTDTl.

El término “plásmido recombinante” o “plásmido” se refiere a pequeñas moléculas de ADN circulares bicatenarias autorreplicantes obtenidas mediante técnicas de ingeniería genética capaces de transferir el material genético de interés a una célula, lo que da como resultado la producción del producto codificado por dicho material genético (por ejemplo, un polipéptido de una proteína, un péptido o un ARN funcional) en la célula diana. Adicionalmente, el término “plásmido recombinante” o “plásmido” también se refiere a una pequeña molécula de ADN circular bicatenaria autorreplicante obtenida mediante técnicas de ingeniería genética usada durante la elaboración de vectores virales como portadores del genoma del vector recombinante.

El término “vector viral recombinante” o “vector viral” se refiere a un agente obtenido a partir de un virus natural mediante técnicas de ingeniería genética capaz de transferir el material genético de interés (por ejemplo, ADN o ARN) a una célula, lo que da como resultado la producción del producto codificado por dicho material genético (por ejemplo, un polipéptido de una proteína, un péptido o un ARN funcional) en la célula diana.

Los términos "virus adenoasociado", "virus AAV", "virión AAV", "partícula vírica AAV" y "partícula AAV", usados como sinónimos en esta invención, se refieren a una partícula vírica formada por al menos una proteína de la cápside de un AAV (formada preferiblemente por todas las proteínas de la cápside de un serotipo en particular de AAV) y un polinucleótido encapsulado correspondiente al genoma del AAV. El AAV silvestre se refiere a un virus que pertenece al género Dependovirus, familia Parvoviridae. El genoma del AAV silvestre tiene una longitud de aproximadamente 4,7 kb y consiste en un ácido desoxirribonucleico monocatenario (ADNmc) que puede ser sentido o antisentido. El genoma silvestre incluye repeticiones terminales invertidas (ITR) en ambos extremos de la hebra de ADN y tres marcos abiertos de lectura (ORFs). El ORF rep codifica para cuatro proteínas Rep necesarias para el ciclo de vida del AAV. El ORF cap contiene secuencias de nucleótidos que codifican para las proteínas de la cápside: VP1, VP2 y VP3, que interactúan para formar una cápside con una simetría icosaédrica. Finalmente, el ORF AAP, que se solapa con el ORF Cap, codifica para la proteína AAP que parece promover el ensamblaje de la cápside. Si la partícula comprende un polinucleótido heterólogo (es decir, un polinucleótido diferente al de un genoma de un AAV silvestre, tal como un transgen que se va a administrar a una célula de mamífero) flanqueado por las ITR del AAV, entonces se conoce típicamente como "partícula de vector AAV" o "vector viral AAV” o "vector AAV". La invención también engloba el uso de AAV bicatenarios, denominados también dsAAV o scAAV.

El término "ITR de virus adenoasociado" o "ITR de AAV", según se usa en esta invención, se refiere a las repeticiones terminales invertidas presentes en ambos extremos de la hebra de ADN del genoma de un AAV. Las secuencias ITR son necesarias para una multiplicación eficaz del genoma del AAV. Otra propiedad de estas secuencias es su capacidad para formar una horquilla. Esta característica contribuye a su autocebado, que permite la síntesis independiente de primasa de la segunda hebra de ADN. También se ha demostrado que las ITR son necesarias tanto para la integración del ADN del AAV silvestre en el genoma de la célula hospedadora (por ejemplo, en el cromosoma humano 19 para el serotipo 2 AAV) como para rescatarlo a partir de ella, así como para una encapsidación eficiente del ADN del AAV en una partícula de AAV totalmente ensamblada resistente a la desoxirribonucleasa. Las secuencias ITR tienen una longitud de aproximadamente 145 pb. Preferiblemente se usan las secuencias completas de ITR en el genoma del vector viral AAV, aunque es permisible un cierto grado de modificaciones menores en estas secuencias. Una secuencia ITR silvestre puede ser alterada mediante una inserción, una deleción o un truncamiento, siempre que la ITR medie en las funciones deseadas, por ejemplo, replicación, mellado, empaquetamiento del virus, integración y/o rescate del provirus, y similares. Los procedimientos para la modificación de estas secuencias ITR son bien conocidos en la técnica. La ITR puede ser de cualquier AAV silvestre, incluyendo, pero no se limitan a, los serotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12 o cualquier otro AAV conocido o descubierto posteriormente. El AAV comprende dos ITR, que pueden ser iguales o diferentes. Además, las dos ITR del AAV pueden ser del mismo serotipo de AAV que la cápside del AAV, o pueden ser diferentes. En una forma de realización preferida, las ITR en 5' y 3' del AAV derivan del AAVl, del AAV2, del AAV4, del AAV5, del AAV7, del AAV8 y/o del AAV9. Preferiblemente, las ITR son del AAV2, del AAV8 y/o del AAV9, siendo la más preferida la del AAV2. En una forma de realización, las ITR del AAV2 se seleccionan para generar un AAV pseudotipado (es decir, un AAV que tiene una cápside y unas ITR derivadas de diferentes serotipos).

La expresión "genoma vírico recombinante", según se usa en esta invención, se refiere al genoma de un AAV en el que se ha insertado al menos un polinucleótido externo en el genoma del AAV natural. El genoma del AAV de acuerdo con la invención comprende típicamente las secuencias de repeticiones terminales invertidas que actúan en cis en 5' y 3' (ITR) y un casete de expresión.

El término “terapia génica” se refiere a la transferencia de material genético de interés (por ejemplo, de ADN o de ARN) a una célula para el tratamiento o la prevención de una afección o de una enfermedad adquirida o genética. El material genético de interés codifica para un producto (por ejemplo, un polipéptido de una proteína, un péptido o un ARN funcional) cuya producción se desea in vivo. Por ejemplo, el material genético de interés puede codificar para una enzima, una hormona, un receptor o un polipéptido de valor terapéutico.

El término "transducir" o "transducción", según se usa en esta invención, se refiere al proceso mediante el cual se introduce una secuencia de nucleótidos foránea en una célula a través de un vector viral.

El término "transfección", según se usa en esta invención, se refiere al proceso de introducir deliberadamente ácidos nucleicos purificados mediante métodos no víricos en células eucariotas.

El término "tratar" o "tratamiento", según se usa en esta invención, se refiere a la administración de un compuesto o de una composición de la invención para controlar la progresión de una enfermedad. Se entiende por control de la progresión de una enfermedad conseguir unos resultados clínicos beneficiosos o deseados que incluyen, pero no se limitan a, una reducción de los síntomas, una reducción de la duración de la enfermedad, una estabilización de los estados patológicos (específicamente para evitar un deterioro adicional), un retraso en la progresión de la enfermedad, una mejora en el estado patológico y una remisión (tanto parcial como total). El control de la progresión de la enfermedad también implica una prolongación de la supervivencia, en comparación con la supervivencia esperada si no se aplicara el tratamiento.

El término “cantidad efectiva” se refiere a una cantidad de una sustancia suficiente para conseguir el fin previsto. Por ejemplo, una cantidad efectiva de un vector AAV9 para aumentar la actividad de la N-acetilglucosamina-6-sulfatasa (GNS) es una cantidad suficiente para reducir la acumulación de glucosaminoglucano. Una “cantidad terapéuticamente efectiva” de un vector de expresión para el tratamiento de una enfermedad o de un trastorno es una cantidad del vector de expresión suficiente para reducir o erradicar los signos y los síntomas de la enfermedad o del trastorno. La cantidad efectiva de una sustancia dada variará dependiendo de factores tales como la naturaleza de la sustancia, la vía de administración, el tamaño y la especie del animal que va a recibir la sustancia, y el propósito de la administración de la sustancia. La cantidad efectiva puede ser determinada en cada caso individual empíricamente por el experto en la materia de acuerdo con los métodos establecidos en la técnica.

El término “individuo” se refiere a un mamífero, preferiblemente a un ser humano o a un mamífero no humano, más preferiblemente a un ratón, una rata, otros roedores, un conejo, un perro, un gato, un cerdo, una vaca, un caballo o un primate, aún más preferiblemente a un ser humano.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona nuevos polinucleótidos y vectores para el tratamiento de mucopolisacaridosis de tipo III (MPSIIID).

Por lo tanto, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a un polinucleótido (denominado en lo sucesivo "polinucleótido de la invención") que comprende un casete de expresión donde dicho casete de expresión comprende una región reguladora de la transcripción unida operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína GNS donde dicha secuencia de nucleótidos es la SEQ ID NO: 4.

Como se ha mencionado anteriormente, la N-acetilglucosamina-6-sulfatasa (GNS) es una enzima lisosómica que se encuentra en todas las células. Está implicada en el catabolismo del heparán sulfato (HS) de glucosaminoglucano (GAG). Esta enzima cataliza la hidrólisis de los grupos 6-sulfato de las unidades 6-sulfato de la N-acetil-D-glucosamina del heparán sulfato. Una deficiencia en esta enzima da como resultado la acumulación de sustrato no degradado y el trastorno de almacenamiento lisosómico de la mucopolisacaridosis de tipo IIID (síndrome de Sanfilippo D).

La presente descripción también contempla secuencias de polinucleótidos que codifican para variantes y fragmentos de la GNS conocidos en la técnica. Por lo tanto, debe interpretarse que la descripción incluye ADN que codifica para variantes funcionalmente equivalentes de la GNS.

El término "variante funcionalmente equivalente", según se usa en esta invención, se refiere a cualquier polipéptido sustancialmente homólogo a la secuencia de la GNS definida anteriormente y que preserva la actividad biológica de la GNS. La secuencia de dichas variantes equivalentes funcionales puede obtenerse a partir de la secuencia de la GNS según se ha definido anteriormente mediante una inserción, una sustitución o una deleción de uno o más aminoácidos y que sustancialmente preserve la actividad biológica de la GNS. Los métodos para determinar si una variante preserva la actividad biológica de la GNS nativa son ampliamente conocidos por la persona experta e incluyen cualquiera de los ensayos usados en la parte experimental de dicha solicitud. Particularmente, las variantes funcionalmente equivalentes de la GNS englobadas por la presente invención tienen al menos una de las funciones de la GNS tales como, por ejemplo, normalizar o reducir los niveles de glucosaminoglucano (GAG), en particular, los niveles de HS.

Según se muestra en los Ejemplos que acompañan a la presente descripción, se han usado secuencias codificantes de la GNS optimizadas o no optimizadas para el tratamiento de animales con MPSIIID. Los resultados muestran una restauración de la actividad de la GNS después de la administración del vector, que dio lugar a una normalización prácticamente completa de la acumulación del sustrato (GAG) característica de la enfermedad en todas las regiones del sistema nervioso central analizadas en los modelos animales.

Un método adecuado para la determinación de la capacidad para reducir o normalizar los niveles de GAG se detalla en la sección de Ejemplos de la presente descripción.

Un polipéptido se considera una variante funcionalmente equivalente de la GNS si muestra capacidad en las funciones según se ha mencionado anteriormente, particularmente si es capaz de hidrolizar los grupos 6-sulfato de las unidades 6-sulfato de la N-acetil-D-glucosamina del heparán sulfato, con al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 100 % de la capacidad del polipéptido de la GNS silvestre.

Las variantes funcionalmente equivalentes de la GNS son polipéptidos sustancialmente homólogos a la GNS nativa. La expresión "sustancialmente homólogo", se refiere a una secuencia de una proteína cuando dicha secuencia de la proteína tiene un grado de identidad con respecto a la secuencia de la GNS silvestre de al menos el 50 %, de al menos el 55 %, de al menos el 60 %, de al menos el 65 %, de al menos el 70 %, de al menos el 75 %, de al menos el 80 %, de al menos el 85 %, de al menos el 90 %, de al menos el 91 %, de al menos el 92 %, de al menos el 93 %, de al menos el 94 %, de al menos el 95 %, de al menos el 96 %, de al menos el 97 %, de al menos el 98 %o o de al menos el 99 %. El grado de identidad entre dos polipéptidos se determina mediante el uso de algoritmos informáticos y de métodos que son ampliamente conocidos por las personas expertas en la técnica. La identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina preferiblemente mediante el uso del algoritmo BLASTP [BLAST Manual, Altschul, S., y col, NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., y col, J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)], aunque también pueden usarse otros algoritmos similares.

Las variantes funcionalmente equivalentes de la GNS pueden obtenerse mediante la sustitución de nucleótidos dentro su polinucleótido codificante, teniendo en cuenta la preferencia de codón en la célula hospedadora que se va a usar para la producción de la GNS.

Las variantes funcionalmente equivalentes de la GNS pueden generarse mediante la realización de cambios conservativos de aminoácidos y el ensayo de la variante resultante en uno de los ensayos funcionales descritos anteriormente o en otros ensayos funcionales conocidos en la técnica. Las sustituciones conservativas de aminoácidos se refieren a la intercambiabilidad de los residuos que tienen unas cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales alifáticas es glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tiene unas cadenas laterales alifáticas-hidroxilo es serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tiene unas cadenas laterales que contienen amida es asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tiene unas cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina y triptófano; un grupo de aminoácidos que tiene unas cadenas laterales básicas es lisina, arginina e histidina; y un grupo de aminoácidos que tiene unas cadenas laterales que contienen azufre es cisteína y metionina. Los grupos preferidos para las sustituciones conservativas de aminoácidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina y asparagina-glutamina.

En la presente descripción, la secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína GNS o para una variante funcionalmente equivalente de la misma contenida en el polinucleótido, tiene una identidad de entre el 70 % y el 85 % con la SEQ ID NO: 1 o entre el 75 % y el 85 % con la SEQ ID NO: 1 o entre el 75 % y el 80 % con la SEQ ID NO: 1. Alternativamente, dicha secuencia de nucleótidos de la GNS se selecciona del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 2 y la SEQ ID NO: 3.

En la presente descripción, la proteína GNS codificada por el polinucleótido de la descripción se selecciona del grupo que consiste en la GNS humana y la GNS de ratón.

El casete de expresión que forma parte del polinucleótido de la presente descripción puede comprender adicionalmente secuencias de control de la expresión que incluyen, pero no se limitan a, secuencias reguladoras de la transcripción apropiadas (es decir, de iniciación, de terminación, promotora y potenciadora), señales para un procesado eficiente del ARN (por ejemplo, señales de corte y empalme y de poliadenilación (poliA)), secuencias que estabilizan el ARNm citoplasmático, secuencias que potencian la eficacia de la traducción (es decir, secuencias consenso de Kozak), secuencias que potencian la estabilidad de la proteína y cuando se desee, secuencias que potencian la secreción del producto codificado. En la técnica se conocen un gran número de secuencias de control de la expresión y pueden ser utilizadas de acuerdo con la presente descripción.

De acuerdo con la invención, el polinucleótido de la invención comprende un casete de expresión donde dicho casete de expresión comprende una región reguladora de la transcripción unida operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica para la GNS donde dicha secuencia de nucleótidos es la SEQ ID NO: 4. En una forma de realización en particular de la invención, dicha región reguladora de la transcripción comprende un promotor. En una forma de realización más particular, dicho promotor es un promotor constitutivo. En una forma de realización preferida, dicho promotor es el promotor CAG.

En otra forma de realización, el casete de expresión está flanqueado por las ITR del AAV. En la presente descripción, dichas ITR del AAV son las ITR del a Av 2.

El casete de expresión de la presente descripción comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para la GNS o una variante de la misma funcionalmente equivalente. Dicha secuencia de nucleótidos es la secuencia de nucleótidos que codifica para la GNS humana, que se corresponde con la secuencia de la base de datos del NCBI con el número de registro NM_002076.3, más particularmente es la SEQ ID NO: 1. En la presente descripción, la secuencia de nucleótidos es una variante de la secuencia de nucleótidos que codifica para la GNS humana, preferiblemente es una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 2 y la SEQ ID NO: 3. El casete de expresión que forma parte del polinucleótido de la presente descripción comprende adicionalmente una región reguladora post-transcripcional. El término "región reguladora post-transcripcional", según se usa en esta invención, se refiere a cualquier polinucleótido que facilita la expresión, la estabilización o la localización de las secuencias contenidas en el casete o del producto génico resultante. La región reguladora post-transcripcional puede ser, sin limitación, la región post-transcripcional del virus de la hepatitis Woodchuck (WPRE). El término "elemento post-regulador del virus de la hepatitis B woodchuck" o "WPRE", según se usa en esta invención, se refiere a una secuencia de ADN que, cuando se transcribe, crea una estructura terciaria capaz de potenciar la expresión de un gen.

En la presente descripción, el casete de expresión comprende adicionalmente una señal de poliadenilación.

El término "señal de poliadenilación", según se usa en esta invención, se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos que media en la unión de una cola de poliadenina al 3' terminal del ARNm. Algunas señales de poliadenilación adecuadas incluyen, sin limitación, la señal de poliadenilación temprana del SV40, la señal de poliadenilación tardía del SV40, la señal de poliadenilación de la quinasa de timidina de1HSV, la señal de poliadenilación del gen de la protamina, la señal de poliadenilación del adenovirus 5 Elb, la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina, la señal de poliadenilación de una variante de la hormona de crecimiento humana, la señal de poli A de la beta-globina de conejo, y similares. Preferiblemente, la señal de poliadenilación es la señal de poli A de la beta-globina de conejo o variantes y fragmentos funcionales de la misma.

El polinucleótido de la invención podría ser incorporado en un vector. Por lo tanto, en otro aspecto, la invención se refiere a un vector, denominado en esta invención “vector de la invención”, que contiene el polinucleótido de la invención. En una forma de realización en particular, dicho vector es un plásmido. En otra forma de realización en particular, dicho vector es un vector AAV, comprendiendo dicho vector AAV un genoma vírico recombinante que comprende un polinucleótido de acuerdo con la invención.

Todas las formas de realización descritas en el contexto del polinucleótido de la invención también son aplicables al vector de la invención.

En la presente descripción, dicho vector se selecciona del grupo que consiste en el plásmido pAAV-CAG-hGNS, con el número de registro DSM 32342, según se establece en la SEQ ID NO: 5, el plásmido pAAV-CAG-ohGNS-version1, con el número de registro DSM 32343, según se establece en la SEQ ID NO: 6 y el plásmido pAAV-CAG-ohGNS-version2 con el número de registro DSM 32344, según se establece en la SEQ ID NO: 7. En una realización particular de la presente invención, dicho vector es el plásmido pAAV-CAG-ohGNS-version3 con el número de registro DSM 32345, según se establece en la SEQ ID NO: 8.

La presente descripción se refiere a un vector viral adenoasociado, un vector AAV, conteniendo dicho vector AAV un genoma vírico recombinante donde dicho genoma vírico recombinante comprende un polinucleótido que comprende un casete de expresión que comprende una región reguladora de la transcripción unida operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica para la GNS o una variante equivalente funcional de la misma.

El AAV de acuerdo con la presente descripción incluye cualquier serotipo de los serotipos conocidos de AAV. En general, los diferentes serotipos del AAV tienen unas secuencias genómicas con una homología significativa, proporcionando una serie idéntica de funciones genéticas, producen viriones que son esencialmente equivalentes en términos físicos y funcionales y se replican y ensamblan a través de mecanismos prácticamente idénticos. En particular, el AAV de la presente descripción puede pertenecer al serotipo 1 de AAV (AAV1), AAV2, AAV3 (incluyendo los tipos 3A y 3B), AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV10, AAV11, AAV de ave, AAV bovino, AAV canino, AAV equino, AAV ovino y cualquier otro AAV. Algunos ejemplos de las secuencias del genoma de los diferentes serotipos de AAV pueden encontrarse en la bibliografía o en bases de datos públicas tales como el GenBank. Véanse los números de registro del GenBank AF028704.1 (AAV6), NC006260 (AAV7), NC006261 (AAV8) y AX753250.1 (AAV9). El vector AAV de la presente descripción es de un serotipo seleccionado del grupo que

consiste en los serotipos AAV2, AAV5, AAV7, AAV8, AAV10 y AAVrhIO. En una forma de realización preferida de la

invención, dicho vector AAV de la invención es del serotipo 9, el AAV9.

En la presente descripción, dicho vector AAV contiene una secuencia de la GNS humana o murina. El vector AAV de

acuerdo con la descripción comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para la GNS que tiene entre un

70 % y un 85 % de identidad con la SEQ ID NO: 1. En una forma de realización más particular de la presente

invención, el vector AAV comprende una secuencia GNS, dicha secuencia de nucleótidos que codifica para la GNS

es la SEQ ID NO: 4.

En una forma de realización en particular de la presente invención, la región reguladora de la transcripción en el

casete de expresión comprende un promotor. En una forma de realización más particular, dicho promotor es un

promotor constitutivo.

En la presente descripción, el vector AAV es el AAV9-CAG-hGNS, SEQ ID NO: 9, que contiene la secuencia de

nucleótidos SEQ ID NO: 1 unida al promotor CAG. En la presente descripción, el vector AAV es el AAV9-C ohGNS-version1, SEQ ID NO: 10 que contiene la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 2 unida al promotor C En la presente descripción, el AAV es el AAV9-CAG-ohGNS-version2, SEQ ID NO: 11 que contiene la secuencia de

nucleótidos SEQ ID NO: 3 unida al promotor CAG. En la presente descripción, el vector AAV es el AAV9-C ohGNS-version3, SEQ ID NO: 12 que contiene la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 4 unida al promotor CAG.

En la presente descripción, el AAV de la invención contiene un genoma vírico recombinante que comprende una

secuencia de nucleótidos que contiene un casete de expresión que comprende en la dirección de 5' a 3', (i) una ITR

del AAV2 en 5', (ii) un potenciador inmediato-temprano del ^c M^v , (iii) un promotor de la B-actina de pollo, (iv) el

primer intrón del gen de la beta-actina de pollo, (v) el intrón 2/exón 3 del gen de la beta-globina de conejo, (vi) el

ADNc de la GNS o una variante funcionalmente equivalente del mismo, (vii) una señal de poli A, tal como la señal de

poli A de la beta-globina de conejo y (viii) una ITR del AAV2 en 3'. Los expertos en la materia apreciarán que el

genoma del vector puede comprender otras secuencias (por ejemplo, secuencias intervinientes entre las secuencias

descritas específicamente anteriormente). Los componentes (i) hasta (v) tienen el significado entendido típicamente

por la persona experta en la materia.

En la presente descripción, el genoma vírico recombinante comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 9.

Específicamente, la iTr del AAV en 5' comprende los nucleótidos 1-120, el potenciador del CMV comprende los

nucleótidos 194-557, el promotor de la B-actina comprende los nucleótidos 558-839, el primer intrón del gen de la

beta-actina de pollo comprende los nucleótidos 840-1804, el intrón 2/exón 3 del gen de la beta-globina de conejo

comprende los nucleótidos 1805-1906, el ADNc de la GNS humana comprende los nucleótidos 1934-3592, la señal

de poli A de la beta-globina de conejo comprende los nucleótidos 3619-4147 y la ITR del AAV2 en 3' comprende los

nucleótidos 4206-4313 de la SEQ ID NO: 5.

En la presente descripción, el genoma vírico recombinante comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 10.

Específicamente, la ITR del AAV en 5' comprende los nucleótidos 1-120, el potenciador del CMV comprende los

nucleótidos 194-557, el promotor de la B-actina comprende los nucleótidos 558-839, el primer intrón del gen de la

beta-actina de pollo comprende los nucleótidos 840-1804, el intrón 2/exón 3 del gen de la beta-globina de conejo

comprende los nucleótidos 1805-1906, el ADNc de la GNS humana comprende los nucleótidos 1934-3592, la señal

de poli A de la beta-globina de conejo comprende los nucleótidos 3619-4147 y la ITR del AAV2 en 3' comprende los

nucleótidos 4206-4313 de la SEQ ID NO: 6.

En la presente descripción, el genoma vírico recombinante comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 11.

Específicamente, la ITR del AAV en 5' comprende los nucleótidos 1-120, el potenciador del CMV comprende los

nucleótidos 194-557, el promotor de la B-actina comprende los nucleótidos 558-839, el primer intrón del gen de la

beta-actina de pollo comprende los nucleótidos 840-1804, el intrón 2/exón 3 del gen de la beta-globina de conejo

comprende los nucleótidos 1805-1906, el ADNc de la GNS humana comprende los nucleótidos 1934-3592, la señal

de poli A de la beta-globina de conejo comprende los nucleótidos 3619-4147 y la ITR del AAV2 en 3' comprende los

nucleótidos 4206-4313 de la SEQ ID NO: 7.

En la presente descripción, el genoma vírico recombinante comprende la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 12.

Específicamente, la ITR del AAV en 5' comprende los nucleótidos 1-120, el potenciador del CMV comprende los

nucleótidos 194-557, el promotor de la B-actina comprende los nucleótidos 558-839, el primer intrón del gen de la

beta-actina de pollo comprende los nucleótidos 840-1804, el intrón 2/exón 3 del gen de la beta-globina de conejo

comprende los nucleótidos 1805-1906, el ADNc de la GNS humana comprende los nucleótidos 1934-3592, la señal

de poli A de la beta-globina de conejo comprende los nucleótidos 3619-4147 y la ITR del AAV2 en 3' comprende los

nucleótidos 4206-4313 de la SEQ ID NO: 8.

También pueden usarse secuencias modificadas del AAV en el contexto de la presente descripción. Dichas

secuencias modificadas incluyen, por ejemplo, secuencias que tienen al menos aproximadamente un 70 %, al menos aproximadamente un 75 %, al menos aproximadamente un 80 %, al menos aproximadamente un 85 %, al menos aproximadamente un 90 %, al menos aproximadamente un 95 % o más de identidad en la secuencia de nucleótidos y/o de aminoácidos (por ejemplo, una secuencia que tiene aproximadamente un 75-99 % de identidad en la secuencia de nucleótidos o de aminoácidos) con una ITR de un AAV o de un VP de cualquiera de los serotipos conocidos, y que mantiene la función de dichos componentes. Los ensayos para la determinación de la función de la ITR del AAV o del VP son conocidos en la técnica. Dichas secuencias modificadas pueden usarse en lugar de las secuencias naturales de la ITR del AAV o del VP.

El vector AAV de la presente descripción comprende una cápside de cualquier serotipo. En general, los diferentes serotipos de los AAV tienen unas secuencias genómicas con una homología significativa a nivel de los aminoácidos y de los ácidos nucleicos, proporcionando un conjunto idéntico de funciones genéticas, producen viriones que son esencialmente equivalentes en términos físicos y funcionales y se replican y ensamblan a través de mecanismos prácticamente idénticos. El AAV de la presente descripción puede pertenecer al serotipo 1 del AAV (AAV1), AAV2, AAV3 (incluyendo los tipos 3 A y 3B), AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV10, AAV11, AAV de ave, AAV bovino, AAV canino, AAV equino, AAV ovino y cualquier otro AAV. Algunos ejemplos de las secuencias del genoma de los diferentes serotipos de AAV pueden encontrarse en la bibliografía o en bases de datos públicas tales como el GenBank. Véanse los números de registro del GenBank AF028704.1 (AAV6), NC006260 (AAV7), NC006261 (AAV8) y AX753250.1 (AAV9). En la presente descripción, el vector vírico adenoasociado es de un serotipo seleccionado del grupo que consiste en los serotipos AAV2, AAV5, AAV7, AAV8, AAV10 y AAVrh10. En una forma de realización preferida de la presente invención, dicho AAV es el AAV del serotipo 9, el AAV9.

El genoma del vector AAV de la invención carece de los marcos abiertos de lectura rep y cap. Dichos vectores AAV sólo pueden ser replicados y empaquetados en partículas víricas infecciosas en células hospedadoras que hayan sido transfectadas con un vector que codifique y exprese los productos de los genes rep y cap (es decir, las proteínas Rep y Cap del AAV) y en los que las células hospedadoras han sido transfectadas con un vector que codifica y expresa proteínas del adenovirus.

COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS DE LA INVENCIÓN

El polinucleótido, el vector o el vector AAV de la invención pueden ser administrados al cuerpo humano o animal mediante los métodos convencionales, que requieren su formulación en una composición farmacéutica. Por lo tanto, en un segundo aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica (denominada en lo sucesivo "composición farmacéutica de la invención") que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva del polinucleótido de la invención, o del vector de la invención o del vector vírico adenoasociado (AAV) de la invención. La composición farmacéutica puede incluir adicionalmente un portador farmacéuticamente aceptable.

Todas las formas de realización descritas en el contexto del polinucleótido de la invención o del vector de la invención o del vector AAV de la invención también son aplicables a las composiciones farmacéuticas de la invención.

El término "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad del polinucleótido, del vector o del vector AAV de la invención calculada para producir el efecto deseado, y generalmente será determinada, entre otras razones, según las propias características del polinucleótido, del vector o del vector AAV de la invención y el efecto terapéutico que se va a obtener. Por lo tanto, dicha cantidad que será efectiva en el tratamiento de una enfermedad puede ser determinada mediante las técnicas clínicas estándar descritas en esta invención o de otra forma conocida en la técnica. La dosis precisa usada en la formulación dependerá de la vía de administración. Las dosis iniciales pueden estimarse a partir de datos in vivo (por ejemplo, de modelos animales) mediante el uso de técnicas bien conocidas en el estado de la técnica. Cualquiera con una experiencia normal en el estado de la técnica puede optimizar fácilmente la administración a seres humanos basándose en los datos de animales.

En la presente descripción, la dosis de la formulación puede medirse o calcularse en forma de partículas víricas o de copias genómicas ("GC")/genomas víricos ("vg").

Para la determinación del número de copias genómicas (GC) por mililitro de las composiciones víricas de la invención puede usarse cualquier método conocido en la técnica. Un método para llevar a cabo la titulación del número de GC del AAV es el siguiente: en primer lugar se tratan muestras purificadas del vector AAV con DNasa para eliminar el ADN del genoma del AAV no encapsidado o el ADN de plásmido contaminante de los procesos de producción. Las partículas resistentes a la DNasa se someten a continuación a un tratamiento térmico para liberar el genoma de la cápside. Los genomas liberados se cuantifican después mediante una PCR en tiempo real mediante el uso de conjuntos de cebador/sonda dirigidos a una región específica del genoma vírico.

Los términos "portador farmacéuticamente aceptable", "diluyente farmacéuticamente aceptable", "excipiente farmacéuticamente aceptable" o "vehículo farmacéuticamente aceptable", usados de forma intercambiable en esta invención, se refieren a un agente de relleno, un diluyente, un material de encapsulación no tóxico sólido, semisólido o líquido, o a una formulación auxiliar de cualquier tipo convencional. Un portador farmacéuticamente aceptable es esencialmente no tóxico para los receptores a las dosis y las concentraciones empleadas, y es compatible con los demás ingredientes de la formulación. El número y la naturaleza de los portadores farmacéuticamente aceptables dependerán de la forma de administración deseada. Los portadores farmacéuticamente aceptables son conocidos y pueden ser preparados mediante métodos bien conocidos en la técnica.

La composición farmacéutica puede formularse de acuerdo con los procedimientos rutinarios en forma de una composición farmacéutica adaptada para su administración intravenosa, subcutánea, intramuscular, intra-líquido cefalorraquídeo (LCR), por ejemplo, intracisternal o intra-cerebroventricular, a seres humanos.

El vector AAV puede formularse para su administración parenteral mediante inyección (por ejemplo, mediante una inyección en bolo o una infusión continua). Las formulaciones para inyección pueden presentarse en formas de dosificación unitarias (por ejemplo, en ampollas o en recipientes mono o multidosis) con un conservante añadido. Las composiciones víricas pueden tomar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos u acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes suspensores, estabilizantes o dispersantes. Las preparaciones líquidas de las formulaciones de AAV pueden prepararse mediante medios convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables tales como agentes suspensores (por ejemplo, jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas hidrogenadas comestibles), agentes emulsionantes (por ejemplo, lecitina o acacia), vehículos no acuosos (por ejemplo, aceite de almendras, ésteres oleosos, alcohol etílico o aceites vegetales fraccionados) y conservantes (por ejemplo, metil o propil p-hidroxibenzoatos o ácido sórbico). Las preparaciones también pueden contener sales tamponantes. Alternativamente, las composiciones pueden estar en forma de polvo para su combinación con un vehículo adecuado (por ejemplo, agua estéril exenta de pirógenos) antes de su uso. Cuando sea necesario, la composición también puede incluir un anestésico local tal como lidocaína para aliviar el dolor en el sitio de inyección. Cuando la composición va a ser administrada mediante una infiltración, puede ser dispensada con un frasco de infiltración que contiene agua o solución salina de calidad farmacéutica. Cuando la composición es administrada mediante inyección puede proporcionarse un vial de agua para la inyección o una solución salina estéril, de forma que los ingredientes puedan mezclarse antes de la administración. Preferiblemente, el portador farmacéuticamente aceptable es solución salina y un detergente tal como un copolímero en bloque de polietileno-polioxipropileno, Pluronic F68®.

Las composiciones de la invención pueden formularse para su administración a animales con fines veterinarios (por ejemplo, ganado (reses, cerdos, otros)) y otros sujetos mamíferos no humanos, así como a sujetos humanos. La composición farmacéutica de la invención puede ser formulada con un portador fisiológicamente aceptable para su uso en aplicaciones de transferencia génica y de terapia génica.

También se engloba el uso de adyuvantes en combinación o en una mezcla con el polinucleótido, el vector o el vector AAV de la invención. Los adyuvantes contemplados incluyen, pero no se limitan a, adyuvantes de sales minerales adyuvantes de geles de sales minerales, adyuvantes particulados, adyuvantes microparticulados, adyuvantes mucosales.

Los adyuvantes pueden ser administrados a un sujeto en forma de una mezcla con el polinucleótido, el vector o el vector AAV de la invención, o usarse en combinación.

La composición farmacéutica puede ser administrada localmente o sistémicamente. En la presente descripción, la composición farmacéutica es administrada cerca del tejido o del órgano cuyas células van a ser transducidas o es administrada localmente en el ventrículo lateral o es administrada sistémicamente.

El término "administrada sistémicamente" y "administración sistémica", según se usa en esta invención, significa que el polinucleótido, los vectores, los vectores AAV o las composiciones de la invención pueden ser administrados a un sujeto de una forma no localizada. La administración sistémica puede alcanzar numerosos órganos o tejidos de todo el cuerpo del sujeto, o pueden alcanzar órganos o tejidos específicos del sujeto. Por ejemplo, la administración intravenosa puede dar como resultado la transducción de más de un tejido u órgano en un sujeto. Las composiciones farmacéuticas pueden ser administradas en una única dosis, o en algunas formas de realización en particular de la invención, pueden emplearse dosis múltiples (por ejemplo, en dos, tres, cuatro o más administraciones) para conseguir un efecto terapéutico.

Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invención se refiere a un polinucleótido, a un vector o a un vector AAV de acuerdo con la invención, o a una composición farmacéutica de acuerdo con la invención, para su uso en medicina. En un aspecto adicional, la invención se refiere a un polinucleótido, a un vector o a un vector AAV de acuerdo con la invención, o a una composición farmacéutica de acuerdo con el segundo aspecto de la invención, para su uso en el tratamiento de la mucopolisacaridosis de tipo IIID.

La presente descripción se refiere a un polinucleótido, a un vector o a un vector AAV o a una composición farmacéutica de acuerdo con la descripción, para aumentar la actividad de la N-acetilglucosamina-6-sulfatasa.

Los términos "prevenir", “previniendo” y "prevención", según se usan en esta invención, se refieren a la inhibición del inicio o la disminución de la frecuencia de una enfermedad en un sujeto. La prevención puede ser completa (por ejemplo, la ausencia total de células patológicas en un sujeto) o parcial. La prevención también se refiere a una susceptibilidad reducida a una afección clínica. El término "tratar" o "tratamiento", según se usa en esta invención, se refiere a la administración de un polinucleótido, o de un vector o de un vector AAV o de una composición farmacéutica de la invención, para controlar la progresión de una enfermedad después de que hayan aparecido sus signos clínicos. Se entiende que el control de la progresión de la enfermedad significa conseguir los resultados clínicos beneficiosos o deseados que incluyen, pero no se limitan a, una reducción de los síntomas, una reducción de la duración de la enfermedad, una estabilización de los estados patológicos (específicamente para evitar un deterioro adicional), un retraso en la progresión de la enfermedad, una mejora del estado patológico y una remisión (tanto parcial como total). El control de la progresión de la enfermedad también implica una prolongación de la supervivencia en comparación con la supervivencia esperada si no se aplicara el tratamiento.

El término "sujeto", según se usa en esta invención, se refiere a un individuo o a un animal, tal como un ser humano, a un primate no humano (por ejemplo, chimpancés y otras especies de simios y monos), a un animal de granja (por ejemplo, aves, peces, reses, ovejas, cerdos, cabras y caballos), a un animal doméstico (por ejemplo, perros y gatos) o a un animal de laboratorio (por ejemplo, roedores, tales como ratones, ratas y cobayas). El término incluye un sujeto de cualquier edad o sexo. En una forma de realización preferida el sujeto es un mamífero, preferiblemente un ser humano.

MÉTODOS PARA LA OBTENCIÓN DE LOS AAV DE LA INVENCIÓN

La invención también se refiere a un método para la obtención de los vectores AAV de la invención. Dichos vectores AAV pueden obtenerse mediante la introducción de los polinucleótidos de la invención en células que expresan constitutivamente las proteínas Rep y Cap o en las que se proporcionan las secuencias codificantes de la Rep y de la Cap en plásmidos o en vectores.

Por lo tanto, en otro aspecto, la invención se refiere a un método para producir un vector AAV de serotipo 9, AAV9, que comprende las etapas de:

(i) proporcionar una célula con un primer vector plasmídico que comprende el promotor CAG operativamente unido a la secuencia de nucleótidos que codifica para la GNS interpuesto entre una primera repetición terminal del AAV y una segunda repetición terminal del AAV; un segundo vector plasmídico que comprende un gen rep del AAV y un gen cap del AAV de serotipo 9; un tercer vector plasmídico que comprende el gen de la función auxiliar del adenovirus;

(ii) mantener la célula en unas condiciones adecuadas para el ensamblaje del AAV y (iii) purificar el vector vírico adenoasociado producido por la célula. En la presente invención puede usarse cualquier célula capaz de producir los vectores AAV.

Cualquiera de las formas de realización descritas en el contexto de los polinucleótidos de la invención es aplicable en el contexto de los métodos para producir el AAV de serotipo 9 de la invención.

El término "proteína cap", según se usa en esta invención, se refiere a un polipéptido que tiene al menos una actividad funcional de una proteína cap nativa del AAV (por ejemplo, VPl, VP2, VP3). Algunos ejemplos de actividades funcionales de las proteínas cap incluyen la capacidad para inducir la formación de una cápside, facilitar la acumulación de ADN monocatenario, facilitar el empaquetamiento del ADN del AAV en cápsides (es decir, la encapsidación), unirse a los receptores celulares y facilitar la entrada del virión en las células hospedadoras. En principio puede usarse cualquier proteína cap en el contexto de la presente invención.

El término "cápside", según se usa en esta invención, se refiere a la estructura en la que está empaquetado el genoma vírico. Una cápside consiste en varias subunidades estructurales oligoméricas formadas por proteínas. Por ejemplo, el AAV tiene una cápside icosaédrica formada por la interacción de las tres proteínas de la cápside: VP1, VP2 y VP3.

El término "proteína rep", según se usa en esta invención, se refiere a un polipéptido que tiene al menos una actividad funcional de una proteína rep nativa del AAV. Una "actividad funcional" de una proteína rep es cualquier actividad asociada con la función fisiológica de la proteína, incluyendo la facilitación de la replicación del ADN a través del reconocimiento, la unión y el mellado del origen de la replicación del ADN del AAV, así como la actividad de helicasa del ADN. Algunas funciones adicionales incluyen la modulación de la transcripción de los promotores del AAV (o de otros heterólogos) y una integración específica de sitio del ADN del AAV en el cromosoma de un hospedador. En la presente descripción, los genes rep del AAV derivan del serotipo AAV2.

La expresión "proteínas víricas de las cuales depende el AAV para su replicación", según se usa en esta invención, se refiere a los polipéptidos que llevan a cabo las funciones de las cuales depende el AAV para su replicación (es decir, "funciones auxiliares"). Algunas funciones auxiliares incluyen, sin limitación, aquellas funciones necesarias para la activación de la transcripción génica del AAV, la etapa de corte y empalme específico del ARNm del AAV, la replicación del ADN del AAV, la síntesis de las proteínas cap y el ensamblaje de la cápside del AAV. Algunas funciones accesorias basadas en virus pueden derivar de cualquiera de los virus colaboradores conocidos tales como adenovirus, herpesvirus (distintos al virus del herpes simple de tipo 1) y Vaccinia virus. Algunas funciones auxiliares incluyen, sin limitación, los adenovirus El, E2a, VA y E4 o los herpesvirus UL5, UL8, UL52 y UL29 y la polimerasa de herpesvirus.

El polinucleótido de la invención, o los genes rep del AAV, cap del AAV y los genes que proporcionan funciones auxiliares, pueden ser introducidos en la célula mediante la incorporación de dichos genes en un vector tal como, por ejemplo, un plásmido, e introduciendo dicho vector en la célula. Los genes pueden ser incorporados en el mismo plásmido o en plásmidos diferentes. En una forma de realización preferida, el polinucleótido de la invención es incorporado en un plásmido, los genes rep y cap del AAV se incorporan en otro plásmido y los genes que proporcionan las funciones auxiliares se incorporan en un tercer plásmido.

Los plásmidos que contienen el polinucleótido de la invención y o los genes rep y cap del AAV, o los genes que proporcionan las funciones auxiliares, pueden ser introducidos en la célula mediante el uso de cualquier método adecuado bien conocido en la técnica. Algunos ejemplos de métodos de transfección incluyen, pero no se limitan a, precipitación conjunta con fosfato de calcio, DEAE-dextrano, polibreno, electroporación, microinyección, fusión mediada por liposomas, lipofección, infección por retrovirus y transfección biolística. Cuando la célula carece de la expresión de cualquiera de los genes rep y cap del AAV y de los genes que proporcionan las funciones auxiliares adenovíricas, dichos genes pueden ser introducidos en la célula simultáneamente junto con el polinucleótido de la invención. Alternativamente, dichos genes pueden ser introducidos en la célula antes o después de la introducción del polinucleótido de la invención.

En la presente descripción, las células son transfectadas simultáneamente con tres plásmidos, i) un plásmido que comprende el polinucleótido de la invención, ii) un plásmido que comprende los genes rep y cap del AAV y iii) un plásmido que comprende los genes que proporcionan las funciones auxiliares.

La etapa (ii) del método de la invención implica mantener la célula en unas condiciones adecuadas para el ensamblaje del AAV.

Los métodos para el cultivo de las células y las condiciones ejemplares que promueven la liberación de las partículas del vector AAV, tales como el lisado de las células, pueden llevarse a cabo según se describe en los ejemplos de esta invención. Las células productoras se cultivan durante un periodo de tiempo adecuado con objeto de promover el ensamblaje del AAV y liberar los vectores víricos en el medio. Generalmente al tiempo de cultivo se mide desde el punto de la producción vírica. Por ejemplo, en el caso del AAV, la producción vírica comienza generalmente tras el suministro de la función auxiliar del virus en una célula productora apropiada según se describe en esta invención.

La etapa (iii) del método de la invención implica la purificación del vector AAV producido por la célula.

Para la obtención del AAV de la invención, puede usarse cualquier método para la purificación del AAV a partir de dichas células o dicho medio de cultivo. En la presente descripción, el AAV se purifica siguiendo un método optimizado basado en una etapa de precipitación con polietilenglicol y dos gradientes consecutivos de cloruro de cesio (CsCl).

En la técnica se conocen diversos AAV naturales y modificados, sus ácidos nucleicos codificantes, las proteínas cap y rep del AAV, así como los métodos para el aislamiento o la generación, la propagación y la purificación de dichos AAV y en particular, de sus cápsides, adecuadas para su uso en la producción de los AAV.

La presente descripción proporciona adicionalmente una célula aislada que comprende la secuencia de polinucleótidos de la descripción que codifica para la proteína GNS o para una variante funcionalmente equivalente de la misma.

Todas las formas de realización descritas en el contexto de los polinucleótidos, los vectores o los vectores AAV de la invención y las composiciones farmacéuticas de la invención, son aplicables a los usos terapéuticos de la invención.

PROCEDIMIENTOS GENERALES

1. Vectores AAV recombinantes

Los vectores AAV descritos en esta invención se obtuvieron mediante una transfección triple. Los materiales necesarios para la creación de los vectores eran: células HEK293 (que expresan los genes adenovíricos E1), un plásmido auxiliar que proporciona las funciones del adenovirus, un plásmido que proporciona los genes rep del AAV del serotipo 2 y los genes cap del serotipo 9 (AAV9) y finalmente, el plásmido de esqueleto con las ITR del AAV2 y el constructo de interés.

Para generar vectores AAV que expresan la N-acetilglucosamina-6-sulfatasa, se clonó la secuencia codificante optimizada o no optimizada de la N-acetilglucosamina-6-sulfatasa humana o murina en un plásmido de esqueleto de AAV bajo el control de un promotor CAG ubicuo híbrido. La producción a gran escala de los plásmidos se llevó a cabo mediante el uso del kit EndoFree Plasmid Megaprep (Qiagen).

Los vectores fueron generados mediante una transfección exenta de virus auxiliares de células HEK293 mediante el uso de los tres plásmidos con modificaciones. Véase Matsushita T, y col., Gene Ther. 1998; 5: 938-945 y Wright J, y col., Mol. Ther. 2005; 12: 171-178. Las células se cultivaron hasta una confluencia del 70 % en frascos rotatorios (FR) (Corning, Corning, NY, EE.UU.) en DMEM complementado con un 10 % de FBS y después se transfectaron conjuntamente con: 1) un plásmido portador del casete de expresión flanqueado por las ITR víricas del AAV del serotipo 2 (descrito anteriormente); 2) un plásmido portador de los genes rep2 y cap9 del AAV; y 3) un plásmido portador de las funciones auxiliares del adenovirus. Los vectores se purificaron mediante dos gradientes consecutivos con cloruro de cesio mediante el uso de un protocolo optimizado, según se ha descrito previamente. Véase Ayuso E, y col., Gene Ther. 2010; 17: 503-510. Los vectores se dializaron contra PBS un 0,001 % de Pluronic® F68, se filtraron, se titularon mediante una qPCR y se almacenaron a -80 °C hasta su uso.

Los vectores de la presente invención fueron construidos de acuerdo con las técnicas de biología molecular bien conocidas en la técnica.

2. Estudios de transfección in vitro

Se transfectaron células HEK293 con 4 |ig de pAAV-CAG-hGNS, pAAV-CAG-ohGNS-v1, pAAV-CAG-ohGNS-v2 o pAAV-CAG-ohGNS-v3 usando Lipofectamine® 2000 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, CA, EE.UU.) siguiendo instrucciones del fabricante. Después de 48 horas, se recolectaron las células y el medio de cultivo y se procesaron para la extracción del ARN y la proteína.

El ARN total se obtuvo usando el kit RNeasy Mini Kit (Quiagen, Hilden, Alemania), siguiendo las instrucciones del fabricante, y se retrotranscribió con el kit Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche). Se evaluó la expresión de las diferentes versiones del gen GNS humano mediante PCR cuantitativa en tiempo real usando cebadores específicos para el hGNS (SEQ ID NO: 19: Fw: 5' AAA CTG GTC AAG AGG CTG GA 3', SEQ ID NO: 20: Rv: 5' TGG TTT GAT CCC AGG TCC TC 3'), ohGNS-v1 (SEQ ID NO: 21: Fw: 5' CCA ACA GCA GCA TCC AGT TT 3', SEQ ID NO: 22: Rv: 5' CGT TGT CGC TGG TGT AGA AG 3'), ohGNS-v2 (SEQ ID NO: 23: Fw: 5' CTG AAG AAA ACC AAG GCG CT 3', SEQ ID NO: 24: Rv: 5' AGT TCC CCT CGA GAG TGT TG 3') y ohGNS-v3 (SEQ ID NO: 25: Fw: 5' AAC TTC AAC ATC CAC GGC AC 3’, SEQ ID NO: 26: Rv: ACT CCA GTC TCT TCA CCA GC 3'). Se normalizaron los valores para la expresión de RPLPP0 humana (SEQ ID NO: 27: Fw: 5' CTC TGG AGA AAC TGC TGC CT 3', SEQ ID NO: 28: Rv: 5' CTG CAC ATC ACT CAG GAT TTC AA 3'). La PCR en tiempo real se llevó a cabo en una plataforma Light Cycler® 480 (Roche, Mannheim, Alemania) usando el kit Light Cycler® 480 SYBR Green I Master (Roche, Mannheim, Alemania).

Se obtuvieron extractos de proteínas mediante sonicación de las células en 250 |il de agua Mili-Q y se cuantificó el contenido proteico usando el ensayo de proteínas de Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.). Se determinó la actividad de la N-acetilglucosamina-6-sulfatasa en 5 |ig de extractos de proteínas celulares y 5 |il de medio de cultivo y se normalizaron mediante la cantidad total de proteína y el volumen, respectivamente, con un sustrato fluorogénico derivado de la 4-metilumbeliferona (Moscerdam Substrates, Oegstgeest, Países Bajos), tal y como se ha descrito anteriormente. Véase Wang He y col., J Inher Metab Diss 1993;16:935-941.

3. Animales

Se obtuvieron células madre embrionarias C57BL/6N-A/a portadoras de una inserción etiquetada de un gen indicador (LacZ) en el gen Gns disponibles a través del International Mouse Phenotyping Consortium (IMPC, www. mousephenotype.org). Los clones se microinyectaron en blastocitos C57BL/6J en la unidad de animales transgénicos del Center of Animal Biotechnology and Gene Therapy (CBATEG) de la Universitat Autónoma de Barcelona (UAB) y las quimeras macho resultantes se cruzaron con hembras C57BI/6N para generar una progenie con el Gns inactivado. El genotipo se determinó sobre el ADN genómico obtenido a partir de muestras de la cola con un análisis mediante una PCR que amplificó una secuencia que engloba la mutación de interés. Las secuencias de los respectivos cebadores directo e inverso eran: cebador directo: 5'- CCACACAGGCGAGTTCTCTT-3' (SEQ ID NO: 13). Cebador inverso: 5'- GTGGGACCCAAGTCGATGTT-3' (SEQ ID NO: 14). Los ratones fueron alimentados ad libitum con una dieta estándar (Harlan, Tekland) y se mantuvieron bajo un ciclo de luz-oscuridad de 12 h (luces encendidas a las 9:00 A.M.).

Debido a la ausencia de actividad de la GNS, estos animales muestran a los dos meses de edad numerosas características patológicas típicas de la enfermedad de la MPSIIID, incluyendo la acumulación de GAG y el agrandamiento del compartimento lisosómico en diferentes regiones del cerebro y de órganos periféricos tales como el hígado, el corazón, el bazo, el pulmón y el riñón. Se detectó una neuroinflamación en diferentes áreas del cerebro, según se reveló por la presencia de microgliosis y astrogliosis. Adicionalmente, muchos de estos hallazgos patológicos están exacerbados cuando los animales tienen 6 meses de edad, lo que sugiere un empeoramiento de la patología al envejecer el animal. Consecuentemente, los ratones Gns-/- se comportan de forma normal a los 2 meses de edad pero muestran un comportamiento hipoactivo a los 6 meses. Finalmente, los ratones con MPSIIID tienen una esperanza de vida más corta.

4. Administración del vector a los ratones

Para la administración intravenosa del vector, se administró a los ratones 1x1010 genomas de vector de vectores AAV9 que llevaban diferentes versiones de la secuencia de codificación de la N-acetilglucosamina-6-sulfatasa humana en un volumen total de 200 pl a través de inyección en la vena caudal. Los animales WT y Gns-/- no tratados se usaron como control. Para la administración intra-LCR de los vectores AAV9-CAG-omGNS a los ratones, se inyectó una dosis total de 5 x 1010 vg en la cisterna magna de animales Gns'A de 2 meses de edad. A un grupo de animales similar se le inyectaron 5 x 1010 vg del vector de control no codificante (AAV9-null). A los 6, 12 y 22 meses de edad, es decir, 4, 10 y 20 meses después de la administración del vector, los ratones fueron sacrificados y se recogieron los tejidos.

5. Recolección de las muestras

Para el sacrificio, los animales fueron anestesiados profundamente y después perfundidos transcardiacamente con 12 ml de PBS para eliminar completamente la sangre de los tejidos. Se recogieron la totalidad de los cerebros y múltiples tejidos somáticos (incluyendo hígado, bazo, riñón, pulmón, corazón y tejido adiposo) y bien se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C, o bien se sumergieron en formalina para un posterior análisis histológico.

6. Actividad de la N-acetilglucosamina-6-sulfatasa y cuantificación del glucosaminoglucano

Se aplicaron ultrasonidos a muestras de hígado y de cerebro en agua Mili-Q. La actividad de la N-acetilglucosamina-6-sulfatasa se determinó con un sustrato fluorogénico derivado de la 4-metilumbeliferona (Moscerdam Substrates, Oegstgeest, NL), según se ha descrito previamente. Véase Wang He y col., J Inher Metab Diss 1993; 16: 935-941. Los niveles de actividad en el cerebro y en el hígado se normalizaron frente a la cantidad total de proteína, se cuantificaron mediante el uso del ensayo de proteínas de Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.).

Para la cuantificación del glucosaminoglucano (GAG), se pesaron muestras tisulares y después se digirieron con proteinasa K, y los extractos se clarificaron mediante una centrifugación y una filtración. Los niveles del GAG se determinaron en los extractos tisulares con el kit Blyscan sulfated glycosaminoglycan (Biocolor, Carrickfergus, County Antrim, Gran Bretaña), mediante el uso de 4-sulfato de condroitina como patrón. Los niveles del GAG se normalizaron al peso de tejido húmedo.

7. Actividad de otras enzimas lisosómicas

Se aplicaron ultrasonidos a muestras de hígado y de cerebro en 500 pl de agua Mili-Q y se determinaron las actividades enzimáticas en los sobrenadantes mediante el uso de sustratos fluorogénicos derivados de la 4-metilumbeliferona. La actividad de la IDUA se analizó en 15 pg de proteína incubada durante 1 h a 37 °C con 4-metilumbeliferil-a-L-idurónido (Glycosynth). Véase Bacter y col., Blood 2002; 99 (5) 1857-9. La actividad de la SGSH se midió según se ha descrito previamente. Véase Karpova y col., J Inherit Metab Dis. 1996; 19 (3): 278-285, Haurigot V, y col., J Clin Invest. 2013; 1; pii: 66778. En resumen, en primer lugar se incubaron 30 pg de la proteína con 4-MU-aGlcNS durante 17 horas a 47 °C. La segunda incubación se llevó a cabo en presencia de 10 U/ml de aglucosidasa (Sigma-Aldrich) en BSA al 0,2 % durante 24 horas a 37 °C. Para la actividad de la NAGLU, se incubaron 30 pg de extracto de proteínas tisulares con 4-metilumbeliferil-a-N-acetil-D-glucosaminida (Moscerdam Substrates) durante 3 h a 37 °C, según se ha descrito previamente. Véase Marsh y col., Clin Genet. 1985; 27 (3): 258-62, Ribera A, y col., Hum Mol Genet. 2015; 24 (7): 2078-95.

La actividad de la HGSNAT se determinó a partir de 30 pg de extracto de la proteína incubado con acetilcoenzima A y 4-metilumbeliferil-p-D-glucosamina (MU-pGlcNH², Moscerdam Substrates) durante 17 h a 37 °C. Véase Voznyi y col., J Inh Metab Dis 1993; 16: 465-72. La actividad de la GALNS se ensayó mediante un protocolo en dos etapas mediante el uso de 10 pg de extracto de la proteína y la sal sódica del 4-metilumbeliferil--p-D-galactopiranósido-6-sulfato (MU-pGal-6S) durante la primera incubación durante 17 h a 37 °C. La segunda etapa se llevó a cabo mediante la adición de tampón P¡ (tampón de Na2HPO40,9 M / NaH2PO40,9 M, a pH 4,3 un 0,02 % (p/v) de azida de sodio) y p-galactosidasa (p-Gal-Ao, Sigma) e incubando la mezcla durante 2 h a 37 °C. Véase van Diggelen y col., Clin Chim Acta 1990; 187: 131-40. La actividad de la enzima GUSB se determinó a partir de 10 pg de extracto de la proteína incubado con 4-metilumbeliferil-p-D-glucurónido (Sigma) a 37 °C durante 1 h. La actividad de la HEXB se analizó mediante la incubación de 0,1 pg de extracto de la proteína con 4-metilumbeliferil N-acetil-p-D-glucosaminida (Sigma) durante 1 h a 37 °C. Después de detener las reacciones mediante un aumento en el pH, la fluorescencia liberada se midió con un fluorímetro FLx800 (BioTek Instruments). Todos los niveles de actividad en el cerebro y en el hígado se normalizaron frente a la cantidad total de proteína, se cuantificaron mediante el uso del ensayo de proteínas de Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.).

8. Análisis histológico

Los tejidos se fijaron durante 12-24 h en formalina, se incluyeron en parafina y se seccionaron. Para la detección inmunohistoquímica de LAMP2 en el cerebro, las secciones en parafina se sometieron a una recuperación del epítopo inducida por calor en tampón de citrato, a pH 6, y después se incubaron hasta el día siguiente a 4 °C con anticuerpo anti-LAMP2 de rata (Ab13524; Abcam, Cambridge, Reino Unido) diluido a 1:500 y posteriormente se incubaron con anticuerpo anti-rata de conejo biotinilado (Dako, Glostrup, DK) a 1:300. Para la inmunotinción con GFAP de las muestras cerebrales, las secciones en parafina se incubaron hasta el día siguiente a 4 °C con anticuerpo anti-GFAP de conejo (Ab6673; Abcam, Cambridge, Reino Unido) diluido a 1:1.000 y posteriormente se incubaron con anticuerpo anti-conejo de cabra biotinilado (31820; Vector Laboratories, Burlingame, CA, EE.UU.) a 1:300. Las señales de LAMP2 y de GFAP fueron amplificadas mediante la incubación de las secciones con un kit de tinción ABC-Peroxidase (Thermo Scientific, Waltham, MA, EE.UU.) a una dilución de 1:100 y se visualizaron mediante el uso de 3,3-diaminobenzidina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.) como cromógeno.

Para teñir las células microgliales de las muestras de cerebro, las secciones en parafina se incubaron hasta el día siguiente a 4 °C con lectina BSI-B4 (L5391; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.) diluida a 1:100. La señal de BSI-B4 se visualizó mediante el uso de 3,3-diaminobenzidina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.) como cromógeno. Se obtuvieron imágenes de campo claro con un microscopio óptico (Eclipse 90i; Nikon, Tokio, JP).

Se usó el programa informático NIS Elements Advanced Research 2.20 para la cuantificación de las señales de LAMP2, de GFAP y de BSI-B4 en 3-5 imágenes de cada región del cerebro (aumento original, *20) por animal, mediante el uso de los mismos ajustes de umbral de señal para todos los animales. Después se calculó el porcentaje de área positiva, es decir, el área, en pixeles, con una señal positiva a lo largo del área tisular total de la imagen.

9. Análisis por microscopía electrónica de transmisión

Los ratones se sacrificaron mediante una sobredosis de isofluorano (Isofluo, Labs. Esteve, Barcelona, España) y fueron perfundidos a través de la vena cava inferior con 1 ml de glutaraldehído al 2,5 % y paraformaldehído al 2 %. Se seccionó una pequeña porción (aproximadamente 1 mm3) de la corteza cerebral, del lóbulo lateral izquierdo del hígado o el pulmón y se incubó durante 2 horas a 4 °C en el mismo fijador. Después de lavar en tampón de cacodilato frío, los especímenes se posfijaron en tetraóxido de osmio al 1 %, se sometieron a tinción en acetato de uranilo acuoso y, a continuación, se deshidrataron a través de series de etanol graduado y se incluyeron en resina epoxi. Secciones ultrafinas (600-800 A) de los bloques de resina se sometieron a tinción usando citrato de plomo y se examinaron en un microscopio electrónico de transmisión (H-7000; Hitachi, Tokio, Japón).

10. Ensayo en campo abierto

Se analizó el comportamiento de ratones de 6 y 22 meses de edad mediante el ensayo en campo abierto llevado a cabo entre las 9:00 am y la 1:00 pm. Los animales se colocaron en la esquina inferior izquierda de una cámara brillantemente iluminada (de 41 x 41 x 30 cm) atravesada por 2 haces de fotorrayos (SedaCom32; Panlab) que detectaban los movimientos horizontales y verticales de los ratones. El área superficial se dividió en tres regiones cuadradas concéntricas: el centro (14 x 14 cm), la periferia (27 x 27 cm) y los bordes (41 x 41 cm). Se registró la actividad exploratoria y motora durante los primeros 3 minutos del ensayo mediante el uso de un sistema de seguimiento por video (SmartJunior, Panlab).

11. Análisis estadístico

Todos los resultados se expresaron como la media ±SEM. Las comparaciones estadísticas se realizaron mediante el uso de un ANOVA monofactorial. Las comparaciones múltiples entre los grupos de control y de tratamiento se realizaron mediante el uso de la prueba posterior de Dunnett, y entre todos los grupos mediante el uso de la prueba posterior de Tukey. Se consideraba significación estadística si P < 0,05.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: construcción del pAAV-CAG-hGNS

Como material de partida se usó la CDS de la N-acetilglucosamina-6-sulfatasa humana (secuencia de referencia del NCBI: NM_002076.3) y fue sintetizada químicamente para este fin (GeneArt; Life Technologies). La CDS se recibió clonada en el interior del plásmido pMA-RQ (AmpR) flanqueada por los sitios de restricción MluI y EcoRI en 5' y en 3', respectivamente.

El fragmento MluI/EcoRI de la CDS de la N-acetilglucosamina-6-sulfatasa humana fue escindido del plásmido pMA-RQ y clonado posteriormente entre los sitios de restricción MluI y EcoRI del plásmido pAAV-CAG del esqueleto del AAV. El plásmido resultante se denominó pAAV-CAG-hGNS (número de registro DSM 32342). Véanse la Figura 1A y la SEQ ID NO: 5.

El plásmido pAAV-CAG del esqueleto del AAV usado en esta invención había sido generado previamente y contenía las ITR del genoma del AAV2, el promotor CAG y la señal de poliA de la globina p de conejo, así como un sitio de multiclonación para la clonación de las CDS de interés. El promotor CAG es un promotor híbrido formado por el potenciador temprano/intermedio del CMV y el promotor de la p actina de pollo. Este promotor es capaz de dirigir una potente expresión de forma ubicua.

Ejemplo 2: construcción del pAAV-CAG-ohGNS-version1

Se diseñaron y obtuvieron los casetes de expresión que incluían una versión optimizada de la secuencia del ADNc de la N-acetilglucosamina-6-sulfatasa (ohGNS). Se llevó a cabo una optimización de la secuencia para maximizar la eficacia de la producción de la proteína N-acetilglucosamina-6-sulfatasa en seres humanos a través de la eliminación de los sitios de corte y empalme crípticos y de los elementos desestabilizadores de la secuencia del ARN para aumentar la estabilidad del ARN, la adición de elementos estabilizadores de la secuencia del ARN, la optimización del codón y la adaptación del contenido en G/C, evitando estructuras secundarias de ARN estables, entre otros cambios. La CDS de la N-acetilglucosamina-6-sulfatasa humana (secuencia de referencia del NCBI: NM_002076.3) se usó como punto de partida para la optimización de la secuencia.

La primera CDS optimizada (GeneArt; Life Technologies) se recibió clonada en el interior del plásmido pMA-T (AmpR) flanqueada por los sitios de restricción MluI y EcoRI en 5' y en 3', respectivamente.

El fragmento MluI/EcoRI de la CDS de la N-acetilglucosamina-6-sulfatasa humana optimizada fue escindido del plásmido pMA-T y clonado posteriormente entre los sitios de restricción MluI y EcoRI del plásmido pAAV-CAG del esqueleto del AAV. El plásmido resultante se denominó pAAV-CAG-ohGNS-version1 (número de registro DSM 32343) . Véanse la Figura 2A y la SEQ ID NO: 6.

Ejemplo 3: construcción del pAAV-CAG-ohGNS-version2

La CDS de la N-acetilglucosamina-6-sulfatasa humana (secuencia de referencia del NCBI: NM_002076.3) se sometió a una optimización de la secuencia (DNA2.0 Inc). La CDS optimizada se recibió clonada en el interior del plásmido pJ204 (AmpR) flanqueada por los sitios de restricción MluI y EcoRI en 5' y en 3', respectivamente.

El fragmento MluI/EcoRI de la CDS de la N-acetilglucosamina-6-sulfatasa humana optimizada fue escindido del plásmido pJ204 y clonado posteriormente entre los sitios de restricción MluI y EcoRI del plásmido pAAV-CAG del esqueleto del ^a A^v . El plásmido resultante se denominó pAAV-CAG-ohGNS-version2 (número de registro DSM 32344) . Véanse la Figura 3A y la SEQ ID NO: 7.

Ejemplo 4: construcción del pAAV-CAG-ohGNS-version3

La CDS de la N-acetilglucosamina-6-sulfatasa humana (secuencia de referencia del NCBI: NM_002076.3) se sometió a una optimización de la secuencia (Genescript Inc). La CDS optimizada se recibió clonada en el interior del plásmido pUC57 (AmpR) flanqueada por los sitios de restricción MluI y EcoRI en 5' y en 3', respectivamente.

El fragmento MluI/EcoRI de la CDS de la N-acetilglucosamina-6-sulfatasa humana optimizada fue escindido del plásmido pUC57 y clonado posteriormente entre los sitios de restricción MluI y EcoRI del plásmido pAAV-CAG del esqueleto del AAV. El plásmido resultante se denominó pAAV-CAG-ohGNS-version3 (número de registro DSM 32345) . Véanse la Figura 4A y la SEQ ID NO: 8.

Ejemplo 5: construcción del pAAV-CAG-omGNS

La CDS de la N-acetilglucosamina-6-sulfatasa murina (secuencia de referencia del NCBI: NM_029364.3) se sometió a una optimización de la secuencia (GeneArt; Life Technologies). La CDS optimizada; la SEQ ID NO: 16, se recibió clonada en el interior del plásmido pMA-RQ (AmpR) flanqueada por los sitios de restricción MluI y EcoRI en 5' y en 3', respectivamente.

El fragmento MluI/EcoRI de la CDS de la N-acetilglucosamina-6-sulfatasa murina optimizada fue escindido del plásmido pMA-RQ y clonado posteriormente entre los sitios de restricción MluI y EcoRI del plásmido pAAV-CAG del esqueleto del AAV. El plásmido resultante se denominó pAAV-CAG-omGNS. Véanse la Figura 5A y la SEQ ID NO: 17.

Ejemplo 6: producción del AAV9-CAG-hGNS

Los vectores AAV9-CAG-hGNS (SEQ ID NO: 9) fueron generados mediante una transfección exenta de virus colaboradores de células HEK293 mediante el uso de tres plásmidos con modificaciones. Véase Matsushita y col., Gene Ther. 1998; 5 (7): 938-45, Wright y col., Mol Ther. 2005; 12 (1) 171-8. Las células se cultivaron hasta una confluencia del 70 % en frascos rotatorios (FR) (Corning, Corning, NY, Estados Unidos) en DMEM complementado con un 10 % de FBS y después se transfectaron conjuntamente con: 1) un plásmido portador del casete de expresión flanqueado por las ITR del AAV2 (pAAV-CAG-hGNS; SEQ ID NO: 5); 2) un plásmido portador de los genes rep del AAV2 y cap del AAV9 (pREP2CAP9); y 3) un plásmido portador de funciones auxiliares de adenovirus. Los vectores se purificaron mediante dos gradientes consecutivos en cloruro de cesio mediante el uso de un protocolo optimizado, según se ha descrito previamente. Véase Ayuso y col., Gene Ther. 2010; 17 (4): 503-10. Los vectores se dializaron contra PBS un 0,001 % de Pluronic® F68, se filtraron, se titularon mediante una qPCR y se almacenaron a -80 °C hasta su uso. Véase la Figura 1B.

Ejemplo 7: producción del AAV9-CAG-ohGNS-version1

Los vectores AAV9-CAG-ohGNS-version1 (SEQ ID NO: 10) fueron generados mediante una transfección exenta de virus colaboradores de células HEK293 mediante el uso de tres plásmidos con modificaciones. Véase Matsushita y col. y Wright y col., supra. Las células se cultivaron hasta una confluencia del 70 % en frascos rotatorios (FR) (Corning, Corning, NY, Estados Unidos) en DMEM complementado con un 10 % de FBS y después se transfectaron conjuntamente con: 1) un plásmido portador del casete de expresión flanqueado por las ITR del AAV2 (pAAV-CAG-ohGNS-version1; S^eQ ID NO: 6); 2) un plásmido portador de los genes rep del AAV2 y cap del AAV9 (pREP2CAP9); y 3) un plásmido portador de funciones auxiliares de adenovirus. Los vectores se purificaron mediante dos gradientes consecutivos en cloruro de cesio mediante el uso de un protocolo optimizado, según se ha descrito previamente. Véase Ayuso y col., supra. Los vectores se dializaron contra PBS un 0,001 % Pluronic® F68, se filtraron, se titularon mediante una qPCR y se almacenaron a -80 °C hasta su uso. Véase la Figura 2B.

Ejemplo 8: producción del AAV9-CAG-ohGNS-version2

Los vectores AAV9-CAG-ohGNS-version2 (SEQ ID NO: 11) fueron generados mediante una transfección exenta de virus colaboradores de células HEK293 mediante el uso de tres plásmidos con modificaciones. Véase Matsushita y col. y Wright y col., supra. Las células se cultivaron hasta una confluencia del 70 % en frascos rotatorios (FR) (Corning, Corning, NY, Estados Unidos) en DMEM complementado con un 10 % de FBS y después se transfectaron conjuntamente con: 1) un plásmido portador del casete de expresión flanqueado por las ITR del AAV2 (pAAV-CAG-ohGNS-version2; SeQ ID NO: 7); 2) un plásmido portador de los genes rep del AAV2 y cap del AAV9 (pREP2CAP9); y 3) un plásmido portador de funciones auxiliares de adenovirus. Los vectores se purificaron mediante dos gradientes consecutivos en cloruro de cesio mediante el uso de un protocolo optimizado, según se ha descrito previamente. Véase Ayuso y col., supra. Los vectores se dializaron contra PBS un 0,001 % Pluronic® F68, se filtraron, se titularon mediante una qPCR y se almacenaron a -80 °C hasta su uso. Véase la Figura 3B.

Ejemplo 9: producción del AAV9-CAG-ohGNS-version3

Los vectores AAV9-CAG-ohGNS-version3 (SEQ ID NO: 12) fueron generados mediante una transfección exenta de virus colaboradores de células HEK293 mediante el uso de tres plásmidos con modificaciones. Véase Matsushita y col. y Wright y col., supra. Las células se cultivaron hasta una confluencia del 70 % en frascos rotatorios (FR) (Corning, Corning, NY, Estados Unidos) en DMEM complementado con un 10 % de FBS y después se transfectaron conjuntamente con: 1) un plásmido portador del casete de expresión flanqueado por las ITR del AAV2 (pAAV-CAG-ohGNS-version3; SeQ ID NO: 8); 2) un plásmido portador de los genes rep del AAV2 y cap del AAV9 (pREP2CAP9); y 3) un plásmido portador de funciones auxiliares de adenovirus. Los vectores se purificaron mediante dos gradientes consecutivos en cloruro de cesio mediante el uso de un protocolo optimizado, según se ha descrito previamente. Véase Ayuso y col., supra. Los vectores se dializaron contra PBS un 0,001 % Pluronic® F68, se filtraron, se titularon mediante una qPCR y se almacenaron a -80 °C hasta su uso. Véase la Figura 4B.

Ejemplo 10: producción del AAV9-CAG-omGNS

Los vectores AAV9-CAG-omGNS (SEQ ID NO: 18) fueron generados mediante una transfección exenta de virus colaboradores de células HEK293 mediante el uso de tres plásmidos con modificaciones. Véase Matsushita y col. y Wright y col., supra. Las células se cultivaron hasta una confluencia del 70 % en frascos rotatorios (FR) (Corning, Corning, NY, Estados Unidos) en DMEM complementado con un 10 % de FBS y después se transfectaron conjuntamente con: 1) un plásmido portador del casete de expresión flanqueado por las ITR del AAV2 (pAAV-CAG-omGNS; SEQ ID NO: 17); 2) un plásmido portador de los genes rep del AAV2 y cap del AAV9 (pREP2CAP9); y 3) un plásmido portador de funciones auxiliares de adenovirus. Los vectores se purificaron mediante dos gradientes consecutivos en cloruro de cesio mediante el uso de un protocolo optimizado, según se ha descrito previamente. Véase Ayuso y col., supra. Los vectores se dializaron contra PBS un 0,001 % Pluronic® F68, se filtraron, se titularon mediante una qPCR y se almacenaron a -80 °C hasta su uso. Véase la Figura 5B y la SEQ ID NO: 18.

Ejemplo 11: Ensayo in vitro de pAAV-CAG-hGNS, pAAV-CAG-ohGNS-version1. pAAV-CAG-ohGNS-version2 y pAAV-CAG-ohGNS-version3

Se transfectaron células HEK293 con 4 |ig de plásmidos pAAV-CAG-hGNS, pAAV-CAG-ohGNS-version1, pAAV-CAG-ohGNS-version2 y pAAV-CAG-ohGNS-version3 que contenían diferentes versiones de la N-acetilglucosamina-6-sulfatasa humana.

Cuarenta y ocho horas después de la transfección, se recogieron las células, se extrajo el ARN total y se midió la expresión de la N-acetilglucosamina-6-sulfatasa mediante RT-PCR cuantitativa usando cebadores específicos para cada secuencia. La transfección con los cuatro plásmidos que contenían N-acetilglucosamina-6-sulfatasa dio como resultado la detección de ARNm de la N-acetilglucosamina-6-sulfatasa. Véase la Figura 6A. Asimismo, la actividad de la N-acetilglucosamina-6-sulfatasa se incrementó tanto en el medio como en los extractos celulares de pocillos transfectados con los constructos terapéuticos. Véanse las Figuras 6B y 6C. En ambos casos, los plásmidos que codificaban para versiones con codones optimizados de la proteína (pAAV-ohGNS versiones 1 a 3) llevaron a niveles estadísticamente significativamente más altos de producción de N-acetilglucosamina-6-sulfatasa que el plásmido que contenía la secuencia silvestre. Véanse las Figuras 6B y 6C.

Ejemplo 12: Inyección intravenosa de AAV-CAG-hGNS. AAV-CAG-ohGNS-version1. AAV-CAG-ohGNS-version2 o AAV-CAG-ohGNS-version3 a ratones con MPSIIID

Se administró intravenosamente una dosis total de 1x1010 genomas de vector de AAV-CAG-hGNS, AAV-CAG-ohGNS-version1, AAV-CAG-ohGNS-version2 o AAV-CAG-ohGNS-version3 que contenían versiones diferentes del casete de expresión de la N-acetilglucosamina-6-sulfatasa humana a ratones de 2 meses de edad afectados por MPSIIID mediante inyección en la vena caudal.

El análisis se llevó a cabo 2 semanas después de la administración del vector. La transducción de los cuatro vectores que contenían N-acetilglucosamina-6-sulfatasa dio como resultado un aumento sustancial en la actividad de la N-acetilglucosamina-6-sulfatasa por encima de los niveles medidos en animales con MPSIIID. Los niveles de actividad de la N-acetilglucosamina-6-sulfatasa ARNm variaron desde el 1300 % hasta el 2700 % de los niveles WT en el hígado y del 900 % al 3300 % de los WT en el suero. Véanse las Figuras 7A y 7B. En el hígado, los niveles de actividad alcanzados con el casete de expresión que contenía la version3 de la N-acetilglucosamina-6-sulfatasa humana optimizada fueron estadísticamente superiores a los mediados por el vector que contenía la secuencia silvestre. Véase la Figura 7A. En el suero, tanto la version2 como la version3 de la N-acetilglucosamina-6-sulfatasa humana optimizada llevaron a incrementos estadísticamente significativos de la actividad enzimática. Véase la Figura 7B.

De forma coherente con los altos niveles de actividad de la N-acetilglucosamina-6-sulfatasa documentados en el hígado y el suero, el contenido de GAG estaba completamente normalizado en los hígados de los animales inyectados con todos los constructos de vector. Véase la Figura 7C.

Ejemplo 13: administración intracisternal del AAV9-CAG-omGNS - Estudio a corto plazo

Se inyectó una dosis total de 5 x 1010 genomas de vector del vector AAV9-CAG-omGNS en la cisterna magna de animales con MPSIIID de 2 meses de edad en un volumen total de 5 pl. Cuatro meses después de la administración del vector, la actividad enzimática de la GNS en el cerebro de los animales con MPSIIID tratados se normalizó, alcanzando unos valores similares a los observados en los animales sanos. Véase la Figura 8. La restauración de la actividad de la GNS dio lugar a una completa normalización de la acumulación de sustrato característica de la enfermedad en todas las regiones analizadas del SNC, según indica el nivel similar de formación de GAG en los ratones naturales de control y en los Gns~/- tratados. Véase la Figura 9A. Asimismo, la cuantificación de la intensidad de la señal de las secciones de cerebro teñidas con un anticuerpo reactivo al marcador lisosómico de la proteína de membrana asociada lisosómica 2 (LAMP2), usado como indicador del tamaño del compartimento lisosómico, reveló una reducción en el área de LAMP2+ de aproximadamente un 90 % en los ratones macho Gns-/- tratados con respecto a los valores documentados en los ratones deficientes en la GNS a los que se les ha administrado un vector de control “Null”. Véase la Figura 9B.

La disrupción de la homeostasis lisosómica normal debida a la acumulación de sustrato no degradado puede alterar la actividad de otras enzimas lisosómicas diferentes con respecto a la que está directamente afectada por la mutación. Véase Ribera y col., Hum Mol Genet. 2014; doi: 10.1093/hmg/ddu727. Las actividades de la IDUA (iduronidasa, alpha-L-), de la GALNS ( (N-acetil)-6-sulfatasa de galactosamina), de la GUSB (glucuronidasa, beta) y de la HEXB (hexosaminidasa B) estaban alteradas en los cerebros de los ratones macho Gns-/- sin tratar o de los ratones macho Gns-/- tratados con un vector de control “Null”, pero el tratamiento con AAV9-CAG-omGNS devolvió estas actividades a los niveles observados en los ratones naturales sanos, poniendo en evidencia que se había restaurado la homeostasis lisosómica mediante la expresión derivada del vector de la Gns. Véase la Figura 9C.

El análisis ultraestructural mediante microscopía electrónica de transmisión de la corteza cerebral de ratones macho de 6 meses de edad reveló la presencia en ratones deficientes en GNS inyectados con Null de grandes vacuolas que contenían sustancia electrolucente en el citoplasma de las células identificadas como células gliales perineuronales. Estas vesículas, que parecían ser lisosomas llenos de material almacenado, estaban completamente ausentes en las muestras de animales silvestres sanos o Gns-/- tratados con AAV9-Gns, lo que confirmaba la restauración del tamaño normal del compartimento lisosómico después de la transferencia genética. Véase la Figura 10.

La neuroinflamación, caracterizada por la activación de las células gliales del sistema nervioso central, es una característica del síndrome de Sanfilippo. La intensidad de la señal para la tinción usada para la detección de la astrocitosis (GFAP) y de la microgliosis (BSIB4) estaba aumentada en los ratones Gns-/- tratados con vectores Null en comparación con los controles sanos. El tratamiento de los ratones Gns-/- con vectores AAV9-CAG-omGNS disminuyó el % de área positiva de ambos marcadores de inflamación en todas las regiones cerebrales estudiadas. Véanse las Figuras 11A y 11B.

Los vectores AAV9 administrados en el LCR se extravasaron a la periferia y transdujeron el hígado. Véase Haurigot y col., Clin Invest. 2013; 123 (8): 3254-3271. Consecuentemente, la actividad de la Gns en el hígado de los ratones macho Gns-/- tratados con el AAV9-CAG-omGNS era aproximadamente 20 veces mayor que la observada en los animales sanos. Véase la Figura 12. Cuando están sobreexpresadas en el hígado, las proteínas lisosómicas solubles se secretan eficazmente al torrente sanguíneo, convirtiendo este órgano en una fuente de enzima circulante. Véase Ruzo y col., Mol Ther 2012; 20(2):254-66. En el suero de los ratones deficientes en GNS tratados con vectores AAV9-CAG-omGNS, la actividad de la GNS era 20 veces más alta que en las crías silvestres de la misma camada. Véase la Figura 13. Cuando se evaluó la eficacia somática de la terapia a través de la cuantificación del contenido en GAG en diferentes órganos, se observó una normalización completa en la mayor parte de los tejidos, incluyendo el hígado, el corazón, el bazo, el pulmón, el riñón y el tejido adiposo. Véase la Figura 14A.

Una demostración adicional del potencial del tratamiento intra-LCR con AAV9-CAG-omGNS para contrarrestar la patología lisosómica en ratones Gns-/- fue proporcionada por la medición de la actividad de otras enzimas lisosómicas en extractos hepáticos. La SGSH (sulfamidasa), la NAGLU (N-acetilglucosaminidasa alfa), la HGSNAT (N-acetiltransferasa de heparan-alfa-glucosaminida), la IDUA, la GUSB, la GALNS, la HEXB estaban considerablemente alteradas con respecto a los niveles naturales en ratones Gns-/- sin tratar o en ratones Gns-/-tratados con el vector de control “Null”. El tratamiento con AAV9-CAG-omGNS normalizó completamente las actividades de todas estas enzimas. Véase la Figura 14B. De acuerdo con los datos del contenido en GAG, el peso del hígado estaba normalizado en los ratones Gns-/- tratados con el AAV9-CAG-omGNS. Véase la Figura 15A. El peso del bazo también estaba normalizado en los animales tratados con el AAV9-CAG-omGNS. Véase la Figura 15B. Finalmente, el análisis por microscopía electrónica de transmisión reveló que los ratones deficientes en GNS de 6 meses de edad inyectados con AAV9-Null presentaban un gran número de vacuolas electrolucentes en sus hepatocitos y células bronquiales ciliadas del pulmón, mientras que los ratones WT sanos y los tratados con AAV9-CAG-omGNS no lo hacían. Véase la Figura 16.

El impacto de la administración intra-LCR del AAV9-CAG-omGNS sobre el comportamiento fue evaluado con un ensayo en campo abierto, que evalúa la actividad locomotora y exploratoria general de los ratones en un entorno desconocido. Los ratones Gns-/- sin tratar y los tratados con AAV9-null mostraron una actividad locomotora reducida en comparación con los ratones sanos en términos de la distancia total recorrida durante la prueba y la cantidad de tiempo que descansaron. La administración intracisternal del AAV9-CAG-omGNS corrigió completamente los déficits de comportamiento en los ratones macho Gns-/-. Véase la Figura 17.

Ejemplo 14: Administración intracisternal de AAV9-CAG-omGNS- Estudio a largo plazo

Para evaluar la eficacia terapéutica de una única administración de AAV9-CAG-omGNS en la mediación de la corrección a largo plazo de la MPSIIID, se inyectaron en la cisterna magna de una cohorte de animales deficientes en GNS 5x1010 genomas de vector del vector AAV9-CAG-omGNS a la edad de 2 meses y se analizaron 10 meses después de la administración del vector, es decir, cuando los ratones tenían 1 año de edad. La transferencia del gen GNS redujo el contenido de GAG en todo el encéfalo; a los 12 meses de edad, los animales tratados con AAV9-CAG-omGNS mostraban los mismos niveles de GAG que los animales sanos, lo que aporta pruebas de la eficacia terapéutica a largo plazo. Véase la Figura 18A.

Para evaluar además la capacidad de la terapia para proporcionar una corrección duradera de la enfermedad, se llevó a cabo la detección inmunohistoquímica del LAMP2 sobre secciones encefálicas de animales de 12 meses de edad. Como reflejo del almacenamiento patológico de GAG lisosómicos, los machos Gns-/- sin tratar o inyectados con Null mostraban incrementos en la intensidad de la señal de LAMP2 en todas las regiones del encéfalo analizadas. Véase la Figura 18B. En los ratones tratados con AAV9-CAG-omGNS, la reducción de la acumulación de GAG que se observaba después de la trasferencia genética se traducía en un descenso notable de la señal positiva para LAMP2 hasta casi niveles WT en las diferentes áreas, lo que indicaba el encogimiento del compartimento lisosómico a medida que los niveles de GAG se normalizaban. Véase la Figura 18B.

Cuando se analizaron la astrogliosis y microgliosis 10 meses después de una única administración del vector AAV9-CAG-omGNS, los ratones macho deficientes en GNS que habían recibido vectores AAV9-CAG-omGNS mostraban una reducción notable de la intensidad de la señal de ^g F^a P en todas las áreas del cerebro estudiadas, tal y como se demostró mediante análisis morfométrico. Véase la Figura 19A. De forma similar, el tratamiento con vectores que codifican para GNS reducía la señal positiva para BSI-B4 a niveles casi tan bajos como los cuantificados en animales silvestres sanos. Véase la Figura 19B.

Diez meses después de la administración de AAV9-CAG-omGNS, los ratones deficientes en GNS tratados mostraban un contenido de GAG normal o casi normal en órganos periféricos tales como el hígado, corazón, bazo, pulmón, riñón y tejido adiposo. Véase la Figura 20A.

De forma coherente con esta eliminación total de la acumulación patológica de HS, el hígado de los animales deficientes en GNS tratados con el vector AAV9-CAG-omGNS mostraba niveles normales de actividad de otras enzimas lisosómicas no afectadas por la mutación e implicadas en el catabolismo de1HS, tales como la IDUA, SGSH, NAGLU y HGSNAT, o no relacionadas con la ruta del HS tales como la GALNS, GUSB, y p-HEXO. Véase la Figura 20B. La actividad de estas enzimas ya se ve perturbada a la edad de tratamiento, es decir, en animales jóvenes de 2 meses de edad, lo que demuestra la disrupción temprana de la homeostasis lisosómica en el desarrollo de la enfermedad. Véase Roca y col., Hum Mol Genet 2017; 26(8):1535-51. Por tanto, los resultados sugieren la reversión sostenida de la alteración de la fisiología de los lisosomas con la terapia génica.

Finalmente, la persistencia del efecto terapéutico 10 meses después de una única administración de vectores AAV9-CAG-omGNS también resultó evidente cuando los animales se sometieron a pruebas conductuales. Los ratones macho Gns-/- de un año de edad tratados tuvieron el mismo comportamiento que las crías sanas de la misma camada, en contraposición a la reducción de la actividad motora observada en ratones con MPSIIID sin tratar de la misma edad. Véase la Figura 21.

Los modelos animales del síndrome de Sanfilippo tienen una esperanza de vida considerablemente reducida. Véase Haurigot V, y col., J Clin Invest. 2013;1; pii:66778; Ribera A, y col., Hum Mol Genet. 2015;24(7):2078-95. Para evaluar la eficacia terapéutica en lo que debería ser un estadio muy avanzado de la enfermedad, se trató otra cohorte de animales a los 2 meses de edad con 5x1010 genomas de vector del AAV9-CAG-omGNS y se analizaron 20 meses después de la administración del vector, es decir, cuando los ratones tenían casi 2 años de edad, y la mayoría de los animales con MPSIIID sin tratar ya no estaban vivos. En los animales con MPSIIID de 22 meses de edad tratados, la actividad de la GNS en el cerebro permanecía a niveles muy altos. Véase la Figura 22. Este mantenimiento de niveles terapéuticos de actividad de la GNS explicaba los niveles normales de GAG en el cerebro de los ratones con MPSIIID tratados, que mostraban un contenido de GAG similar al del cerebro de las crías silvestres sanas de la misma camada. Véase la Figura 23A. Por consiguiente, el tamaño del compartimento lisosómico, evaluado morfológicamente mediante cuantificación de la intensidad de la señal del marcador lisosómico LAMP-2, no estaba estadísticamente significativamente aumentado en ninguna de las regiones del SNC analizadas. Véase la Figura 23B. Del mismo modo, la actividad de otras enzimas lisosómicas no afectadas por la mutación era similar a la registrada en crías silvestres sanas de la misma camada, lo que confirmaba una homeostasis lisosómica normal en ratones viejos con MPSIIID tratados. Véase la Figura 23C. Los cerebros de los ratones de 22 meses de edad con MPSIIID tratados también mostraban señales de GFAP y BSI-B4 muy bajas, lo que indicaba que el profundo efecto de la terapia sobre la neuroinflamación persistía 20 meses después de una única administración de los vectores AAV9-CAG-omGNS terapéuticos. Véanse las Figuras 24 A y B. Finalmente, la producción sostenida de GNS llevaba a niveles normales de contenido de GAG en los órganos periféricos de ratones con MPSIIID tratados, en los que el hígado, corazón, bazo, pulmón, y tejido adiposo tenían el mismo contenido de GAG que los órganos periféricos de animales sanos de la misma edad. Véase la Figura 25.

Ejemplo 15: Administración intracisternal de AAV9-CAG-omGNS- Estudio de supervivencia

Finalmente, se evaluó el efecto de la administración intra-LCR de vectores AAV9-CAG-omGNS sobre la supervivencia. A los 18 meses, cuando todos los ratones silvestres de control estaban vivos, el 100 % de los ratones Gns~/- no tratados y el 80 % de los ratones Gns-/- tratados con AAV9-null habían muerto, lo que demuestra que la deficiencia de GNS acorta considerablemente la esperanza de vida. Sólo 2 de un grupo de 20 ratones Gns-/- a los que se les administró AAV9-CAG-omGns murieron a lo largo del mismo periodo, lo que proporciona una prueba adicional de la eficacia de la terapia. Véase la Figura 26.

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Un polinucleótido que comprende un casete de expresión donde dicho casete de expresión comprende una región reguladora de la transcripción unida operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína GNS donde dicha secuencia de nucleótidos es la SEQ ID NO: 4.

2. El polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 1 donde la región reguladora de la transcripción comprende un promotor.

3. El polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 2 donde dicho promotor es un promotor constitutivo.

4. El polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 3 donde dicho promotor es el promotor CAG.

5. El polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 donde el casete de expresión está flanqueado por las ITR de virus adenoasociados.

6. Un vector que comprende la secuencia de polinucleótidos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. El vector de acuerdo con la reivindicación 6 donde dicho vector es un plásmido o un vector vírico adenoasociado, comprendiendo dicho vector vírico adenoasociado un genoma vírico recombinante que comprende un polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

8. El vector de acuerdo con la reivindicación 6 o 7 donde dicho vector es el plásmido pAAV-CAG-ohGNS-version3 con el número de registro DSM 32345, según se establece en la SEQ ID NO: 8.

9. El vector de acuerdo con la reivindicación 7, donde dicho vector es un vector vírico adenoasociado de serotipo 9, AAV9.

10. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva del polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o del vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9.

11. El polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, el vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9 o la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 10 para su uso en medicina.

12. El polinucleótido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, el vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9 o la composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 10, para su uso en el tratamiento de la mucopolisacaridosis de tipo IIID.

13. Un método para producir el vector de acuerdo con la reivindicación 9, que comprende las etapas de:

(i) proporcionar una célula con un primer vector plasmídico que comprende el promotor CAG operativamente unido a la secuencia de nucleótidos que codifica para la GNS interpuesto entre una primera repetición terminal del AAV y una segunda repetición terminal del AAV; un segundo vector plasmídico que comprende un gen rep del AAV y un gen cap del AAV de serotipo 9; un tercer vector plasmídico que comprende el gen de la función auxiliar del adenovirus,

(ii) mantener la célula en unas condiciones adecuadas para el ensamblaje del AAV; y (iii) purificar el vector vírico adenoasociado producido por la célula.