ES2860573T3 - Células madre ABCB5(+) para el tratamiento de enfermedades oculares - Google Patents

Abstract

Un método para aislar las células madre del limbo de una población mixta de células oculares, que comprende: aislar células madre del limbo ABCB5(+) de una población mixta de células oculares proporcionada, en donde las células madre del limbo ABCB5(+) se aíslan con un anticuerpo que se une de manera selectiva a ABCB5 humana.

Description

DESCRIPCIÓN

Células madre ABCB5(+) para el tratamiento de enfermedades oculares

Investigación subvencionada federalmente

Esta invención se realizó con el apoyo del gobierno con la subvención 5R01CA113796 otorgada por los National Institutes of Health y el National Cancer Institute. El gobierno posee determinados derechos sobre la invención.

Antecedentes

Las células madre del limbo se han identificado como células de ciclo lento, que conservan marcadores en ratones. Las células madre del limbo expresan el factor de transcripción nuclear ANp63a en seres humanos y carecen de expresión de marcadores de diferenciación del epitelio corneal tal como KRT12 [2,8] (figura 1A). Las células madre del limbo generan células de amplificación transitorias, que expresan el regulador maestro de desarrollo ocular PAX6 [9] y, durante el desarrollo y la regeneración de la córnea, migran fuera del limbo para dar lugar al epitelio corneal central KRT12(+) [10].

Sumario de la divulgación

La presente invención se define en las reivindicaciones adjuntas y se refiere a métodos para aislar células madre del limbo de una población mixta de células oculares y métodos para producir un injerto ocular. Las realizaciones de la invención se describen en los siguientes párrafos numerados:

(1) . Un método para aislar las células madre del limbo de una población mixta de células oculares, que comprende: aislar células madre del limbo ABCB5(+) de una población mixta de células oculares proporcionada, en donde las células madre del limbo ABCB5(+) se aíslan con un anticuerpo que se une de manera selectiva a ABCB5 humana. (2) . Un método para producir un injerto ocular, que comprende

(i) aislar células madre del limbo ABCB5(+) de una población mixta de células oculares proporcionada, en donde las células madre del limbo ABCB5(+) se aíslan con un anticuerpo que se une de manera selectiva a ABCB5 humana; y

(ii) sembrar un sustrato con las células madre del limbo ABCB5(+) aisladas.

(3) . El método del párrafo 2, en donde el sustrato comprende gel de fibrina, membrana amniótica, aminoglucanos o una combinación de los mismos.

(4) . El método del párrafo 2 o del párrafo 3, en donde el injerto ocular es para trasplante en un sujeto que lo necesite.

(5) . El método del párrafo 4, en donde las células madre del limbo ABCB5(+) aisladas son células madre alogénicas para el sujeto, células madre singénicas para el sujeto, xenogénicas para el sujeto, células madre oculares ABCB5(+), células madre del limbo ABCB5(+), o no son células madre de la piel.

(6) . El método del párrafo 5, en donde el sujeto tiene una afección ocular, tal como enfermedad de la córnea, una enfermedad de la retina o una herida ocular.

(7) . El método del párrafo 6, en donde la enfermedad de la córnea es ceguera debido a deficiencia de células madre del limbo (LSCD, por sus siglas en inglés).

(8) . El método del párrafo 6, en donde la enfermedad de la retina es degeneración macular o retinitis.

La presente divulgación, en algunos aspectos, se refiere generalmente al uso de células madre ABCB5(+) (por ejemplo, células madre humanas) para el tratamiento de afecciones oculares tales como, por ejemplo, enfermedades de la córnea y/o enfermedades de la retina. La divulgación está basada, en parte, en el descubrimiento de que ABCB5 se expresa en células madre del ojo, tales células madre ABCB5(+) son necesarias para el desarrollo normal del ojo, y cuando se administran a sujetos que tienen heridas oculares (p. ej., heridas en la superficie ocular), estas células son capaces de regeneración celular. Por ejemplo, las células madre del limbo ABCB5(+), necesarias para el desarrollo corneal normal, son capaces de regenerar la córnea. De manera similar, las células del epitelio pigmentario de la retina (RPE, por sus siglas en inglés) ABCB5(+), necesarias para el desarrollo normal de la retina, son capaces de regenerar la retina.

Por tanto, en algunos aspectos de la divulgación, se proporcionan en el presente documento métodos para tratar un sujeto que tiene una afección ocular, que comprende administrar al sujeto células madre ABCB5(+) aisladas en una cantidad eficaz para regenerar células oculares en el sujeto.

En algunas opciones, la afección ocular es una enfermedad de la córnea. En algunas opciones, la enfermedad de la córnea es ceguera debido a deficiencia de células madre del limbo (LSCD). "Deficiencia de células madre del limbo" se refiere, en el presente documento, a LSCD grave o total, unilateral o parcial [5]. En algunas opciones, Se administran células madre del limbo ABCB5(+) aisladas a un sujeto para tratar una enfermedad de la córnea.

En algunas opciones, la afección ocular es una enfermedad de la retina. En algunas opciones, la enfermedad de la retina es degeneración macular. En algunas opciones, la enfermedad de la retina es retinitis. En algunas opciones, se administran células madre retinianas ABCB5(+) aisladas (por ejemplo, células madre de RPE ABCB5(+)) a un sujeto para tratar una enfermedad de la córnea.

En algunas opciones, la afección ocular es una herida ocular.

En algunas opciones, las células madre ABCB5(+) aisladas se administran como un injerto ocular. En algunas opciones, los injertos oculares contienen de una a aproximadamente 107 células madre ABCB5(+) aisladas. En algunas opciones, se pueden administrar más de 107 células madre ABCB5(+) aisladas como un injerto ocular.

En otros aspectos de la divulgación, se proporcionan, en el presente documento, métodos para aislar células madre del limbo de una población mixta de células oculares, comprendiendo los métodos proporcionar una población mixta de células oculares y aislar células madre del limbo ABCB5(+) de la población mixta.

En otros aspectos más de la divulgación, se proporcionan, en el presente documento, métodos para identificar el número de células madre del limbo ABCB5(+) en el injerto ocular, comparando el número de células madre del limbo ABCB5(+) con la población celular total del injerto, y basándose en la comparación, selección el injerto ocular para trasplante.

En algunas opciones, los métodos comprenden poner en contacto células de la población mixta con un anticuerpo que se une de manera selectiva a ABCB5 humana.

En otros aspectos más de la divulgación, se proporcionan, en el presente documento, métodos para producir injertos oculares para trasplante a un sujeto, comprendiendo los métodos sembrar un sustrato con células madre ABCB5(+) aisladas para producir el injerto ocular.

En algunas opciones, el sustrato comprende gel de fibrina, membrana amniótica, aminoglucanos o una combinación de los mismos. En algunas opciones, el sustrato es una córnea artificial. En dichas opciones, el sustrato, por ejemplo, una córnea artificial, comprende colágeno acelular.

En algunos aspectos de la divulgación, se proporcionan, en el presente documento, injertos oculares enriquecidos con células madre ABCB5(+) aisladas para trasplante en un sujeto.

En otros aspectos más de la divulgación, se proporcionan, en el presente documento, métodos para promover la regeneración de células oculares, que comprenden identificar las células madre del limbo como células madre del limbo ABCB5(+) y administrar a un sujeto que lo necesite las células madre del limbo ABCB5(+) en una cantidad eficaz para promover la regeneración de las células oculares.

En aspectos adicionales de la divulgación, se proporcionan, en el presente documento, preparaciones aisladas de células madre del limbo caracterizadas por la expresión de ABCB5 en la superficie celular.

En algunas opciones, las células madre del limbo ABCB5(+) aisladas se administran como un injerto ocular.

En algunas opciones, al sujeto se le administra de una a aproximadamente 107 células madre del limbo ABCB5(+) aisladas mediante injerto.

En algunas opciones, las células madre ABCB5(+) aisladas son células madre ABCB5(+) humanas aisladas.

En algunas opciones, las células madre ABCB5(+) aisladas son células madre alogénicas. En algunas opciones, las células madre ABCB5(+) aisladas son células madre singénicas.

En algunas opciones, las células madre ABCB5(+) aisladas son células madre oculares ABCB5(+). En algunas opciones, las células madre oculares ABCB5(+) aisladas son células madre del limbo ABCB5(+) aisladas. En algunas opciones, las células madre del limbo ABCB5(+) aisladas son células madre del limbo ABCB5(+) humanas aisladas.

En algunas opciones, las células madre ABCB5(+) aisladas no son células madre de la piel (p. ej., células madre mesenquimales).

En algunas opciones, las células madre ABCB5(+) aisladas se expanden ex vivo antes de la etapa de administración.

En algunas opciones, el sujeto es un mamífero. En algunas opciones, el mamífero es un ser humano.

En algunos aspectos de la divulgación, en el presente documento se proporcionan kits que incluyen un recipiente que aloja cualquiera de los injertos o preparaciones de células madre anteriores e instrucciones para administrar el injerto o la preparación a un sujeto que lo necesite.

El uso de un injerto o preparación de células madre de la divulgación para tratar una afección ocular también se proporciona como un aspecto de la divulgación.

También se proporciona un método para fabricar un medicamento de una preparación de células madre de la divulgación para tratar una afección ocular.

La presente invención no está limitada en su aplicación a los detalles de construcción y la disposición de componentes expuestos en la descripción a continuación o ilustrados en los dibujos. La divulgación tiene capacidad para otras opciones y puede practicarse o llevarse a cabo de diversas maneras. Cada una de las opciones y aspectos anteriores pueden estar vinculados a cualquier otra opción o aspecto. También, la fraseología y terminología usadas en el presente documento son para fines de descripción y no deberían considerarse limitantes. El uso de "que incluye/n", "que comprende/n", o "que tiene/n", "que contiene/n", "que implica/n", y variaciones de los mismos en el presente documento, pretende abarcar los elementos enumerados a continuación en el presente documento y equivalentes de los mismos, así como elementos adicionales.

Breve descripción de los dibujos

No se pretende que los dibujos adjuntos estén dibujados a escala. Por razones de claridad, no puede marcarse cada componente en cada dibujo. En los dibujos:

La figura 1A muestra una ilustración esquemática de las estructuras corneales y el nicho de células madre del limbo.

La figura 1B muestra análisis de citometría de flujo representativos de queratocitos murinos disociados marcados con BrdU que identifican la presencia de una población de células que conservan marcadores en el limbo.

La figura 1C muestra imágenes de inmunofluorescencia que representan la expresión conjunta de ABCB5 y BrdU en el limbo murino.

La figura 1D muestra análisis de citometría de flujo representativos que representan la expresión conjunta de ABCB5 y BrdU en el limbo murino. El gráfico de barras (derecha) ilustra el análisis cuantitativo de experimentos independientes (n = 4).

La figura 1E muestra análisis inmunohistoquímicos representativos de secciones transversales tangenciales del limbo de córneas humanas que representan la expresión de ABCB5 (verde) en la capa epitelial basal.

La figura 1F muestra análisis inmunohistoquímicos representativos de secciones transversales tangenciales del limbo de córneas humanas que representan la expresión conjunta de ABCB5 (rojo) con ANp63a (verde).

La figura 1G muestra análisis citométricos representativos de células epiteliales del limbo humano que representan la expresión conjunta de ABCB5 con ANp63a. Los gráficos de barras muestran la expresión de ANp63a en células ABCB5(+) y ABCB5(-) (panel izquierdo), y la expresión de ABCB5 en células ANp63a(+) y ANp63a (-) (panel derecho). Los datos se representan como media ± e.e.m., n = 3 experimentos.

La figura 1H muestra análisis de citometría de flujo de dos colores de la expresión conjunta de ABCB5 y KRT12. La figura 1I muestra análisis inmunohistoquímicos representativos de la expresión de ABCB5 en biopsias del limbo de pacientes con deficiencia de células madre del limbo (LSCD) realizadas en el momento de la cirugía y de sus correspondientes donantes. Los gráficos de barras muestran el número de células ABCB5(+) (verde) en donantes sanos y pacientes con LSCD (n = 8 secciones por paciente/donante).

La figura 2A muestra un esquema del locus del gen Abcb5 murino y topología de proteínas. La estructura topológica se determinó mediante el algoritmo de predicción de topología de membrana TMHMM y se mostró utilizando el programa informático TOPO2. Los restos de aminoácidos eliminados en ratones (mutantes) (KO, por sus siglas en inglés) con el gen Abcb5 desactivado están resaltados en rojo.

La figura 2B muestra un sumario esquemático de la estrategia empleada para la generación del ratón Abcb5 KO. La figura 2C, panel izquierdo, muestra imágenes de electroforesis de un análisis de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) del ADN genómico utilizado para la genotipificación del ratón, demostrando un alelo de tipo silvestre de (TS) de 113 pares de bases y un alelo eliminado de 322 pares de bases. La figura 2C, panel derecho, muestra transferencias Western de lisados de proteínas murinas con anticuerpo monoclonal (mAb, por sus siglas en inglés) 3C2-1D12 contra ABCB5, que puso de manifiesto la pérdida de una banda de proteína de 80 kD del tamaño previsto en ratones Abcb5 KO.

La figura 2D muestra imágenes de una caracterización fenotípica de córneas Abcb5 TS y Abcb5 KO murinas mediante examen con lámpara de hendidura (paneles izquierdos), tinción con hematoxilina y eosina (H&E) (paneles intermedios) y tinción con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (paneles derechos). Los gráficos de barras a continuación representan el número de células epiteliales DAPI(+) en córnea central y limbo Abcb5 KO y Abcb5 TS murinos. Los datos mostrados representan medias ± e.e.m., n = 4 experimentos.

La figura 2E muestra análisis de difusión de LC-biotina y análisis de expresión de proteínas de inmunofluorescencia de PAX6, KRT12 y KRT14 en ratones Abcb5 TS y Abcb5 KO. Los gráficos de barras representan el porcentaje de células epiteliales PAX6(+) y KRT12(+) en ratones Abcb5 KO y Abcb5 TS. Los datos mostrados representan medias ± e.e.m., n = 6 experimentos.

La figura 2F muestra tinción con H&E y DAPI de córneas Abcb5 TS y Abcb5 KO 48 horas después de la herida por desbridamiento epitelial. El gráfico de barras (abajo) representa el número de células DAPI(+) por sección en ratones Abcb5 TS y Abcb5 KO. Los datos mostrados representan medias ± e.e.m., n = 4 experimentos.

La figura 2G muestra análisis de inmunofluorescencia de Ki67 en el limbo y córnea central de ratones Abcb5 TS y Abcb5 KO 48 horas después de la herida por desbridamiento epitelial. Los gráficos de barras (abajo) representan el porcentaje de Ki67(+) en el limbo y en la córnea de ratones Abcb5 KO y Abcb5 TS (medias ± e.e.m., n = 4 experimentos, respectivamente).

La figura 2H muestra análisis de inmunofluorescencia de tinción TUNEL en el limbo y córnea central de ratones Abcb5 TS y Abcb5 KO 48 horas después de la herida por desbridamiento epitelial. Los gráficos de barras (abajo) representan el porcentaje de células epiteliales TUNEL+ en el limbo y en la córnea en ratones Abcb5 KO y Abcb5 TS (medias ± e.e.m., n = 4 experimentos, respectivamente).

La figura 3A muestra análisis de citometría de flujo que muestran la pérdida de células que conservan el marcador BrdU en células epiteliales del limbo Abcb5 KO y Abcb5 TS después de una persecución de 8 semanas.

La figura 3B muestra análisis de citometría de flujo que muestran la pérdida de células que conservan el marcador BrdU en células epiteliales de limbo Abcb5 KO y Abcb5 TS después de una persecución de 1 semana (medias ± e.e.m., n = 6 experimentos).

La figura 3C muestra análisis de inmunofluorescencia de la expresión de Ki67 en limbo y córnea de ratones Abcb5 TS y Abcb5 KO. Los gráficos de barras de la derecha ilustran los porcentajes de células Ki67(+) en ratones Abcb5 TS y Abcb5 KO en el limbo y la córnea. Se ilustran las medias ± e.e.m. (n = 3 experimentos).

La figura 3D muestra un gráfico de expresión de ARNm de p53, p63, p21 y p16 en córneas Abcb5 TS y Abcb5 KO. Las barras representan los niveles relativos de expresión de ARNm en ratones Abcb5 KO como porcentaje de los niveles de expresión de ARNm en ratones Abcb5 TS (medias ± e.e.m., n = 4 experimentos).

La figura 3E muestra un sumario esquemático del papel de ABCB5 en la regulación del ciclo celular y en el desarrollo y regeneración de la córnea normales. La anulación de la expresión de ABCB5 en ratones Abcb5 KO (azul) da como resultado la pérdida de células que conservan el marcador BrdU(+) y la regulación negativa de los reguladores fundamentales del ciclo celular, incluyendo p63. Esto conduce a una mayor proliferación celular como lo demuestra la expresión potenciada de Ki67 en ratones Abcb5 KO. La proliferación aumentada y la incapacidad para abandonar el ciclo celular explican las profundas deficiencias de diferenciación, evidenciadas por una disminución de la expresión de PAX6 y KRT12 y un aumento de las tasas de apoptosis en ratones Abcb5 KO, evidenciado por una tinción TUNEL potenciada.

La figura 4A muestra análisis de trasplantes de células de donantes singénicos murinos injertados en ratones C57BL/6 receptores.

La figura 4B muestra análisis de trasplantes de células de donantes xenogénicos humanos injertados en ratones NSG receptores inmunodeficientes. Las imágenes muestran tejidos cinco semanas después de haberse realizado el trasplante para el tratamiento de LSCD inducida experimentalmente. En las figuras 4A y 4B, los ratones receptores recibieron injertos en gel de fibrina que contenían ninguna célula de donantes (filas 2, respectivamente), células ABCB5(-) (filas 3, respectivamente), células epiteliales del limbo no separadas (filas 4, respectivamente), o células ABCB5(+) (filas 5, respectivamente). Como referencia, las córneas murinas normales no tratadas (sin LSCD inducida) C57BL/6 y NSG se muestran en las filas 1 de la figura 4A y figura 4B, respectivamente. La transparencia de la córnea se evaluó mediante examen con lámpara de hendidura (figura 4A, 4B, columnas 1). La integridad y regeneración epiteliales se evaluaron mediante tinción con H&E (columnas 2 - aumento de 20x; columnas 3 -aumento de 40x) para determinar el espesor y la estratificación del epitelio, mediante tinción con ácido peryódico de Schiff (PAS, por sus siglas en inglés) para la detección de células caliciformes asociadas con la neovascularización (figura 4A, columna 4) y tinción con Krt12 (verde) para la detección de células epiteliales corneales diferenciadas (figura 4A, 4B, columnas 5). Los núcleos se tiñen con DAPI (rojo). Los gráficos de barras de la derecha muestran los porcentajes de células KRT12(+) murinas (figura 4A) o células KRT12(+) humanas (figura 4B) en las córneas receptoras 5 semanas después del trasplante. El panel inferior derecho en (figura 4B) muestra análisis por RT-PCR de ojos murinos trasplantados con células humanas para la evaluación de la contribución de las células donantes humanas a la reparación de la córnea.

La figura 5A muestra un sumario esquemático del diseño experimental para experimentos de persecución por pulsos de BrdU.

La figura 5B muestra análisis de citometría de flujo representativos que representan la tinción específica de células que conservan el marcador BrdU en células epiteliales del limbo de ratones TS que no recibieron BrdU (dos paneles de la izquierda) o ratones TS que recibieron BrdU seguido de una persecución de 8 semanas (dos paneles de la derecha). Se recuperaron células epiteliales del limbo y se tiñeron con anticuerpo (Ab, por sus siglas en inglés) anti-BrdU o con un Ab de control de isotipo. Los porcentajes de células BrdU positivas dentro de la ventana de análisis se indican en cada gráfico.

La figura 6 muestra una ilustración esquemática de secciones transversales tangenciales del limbo de córneas de donantes humanos, indicando la ubicación del epitelio del limbo. Se encontraron células ABCB5(+) (representadas esquemáticamente como células de color verde) ubicadas en la capa epitelial basal.

La figura 7 muestra biopsias del limbo de un paciente con LSCD (paciente 1). Se obtuvieron biopsias de limbo del paciente 1 con una quemadura química antes de recibir una queratoplastia penetrante más aloinjerto queratolímbico de un ojo de donante cadáver (donante 1). Se tiñeron secciones transversales en serie de las biopsias con H&E, Ab de control de isotipo o mAb ABCB5. La tinción con ABCB5 en el epitelio del limbo del donante 1 puso de manifiesto nidos de células ABCB5 positivas, mientras que la positividad de ABCB5 se redujo en el epitelio del limbo del paciente 1. Las fotografías de tinción inmunofluorescente son montajes de fotografías secuenciales con un aumento de 20x.

La figura 8 muestra biopsias del limbo de un paciente con LSCD (paciente 2). Se obtuvieron biopsias del limbo del paciente 2 con una queratólisis marginal autoinmunitaria, queratitis ulcerosa periférica y deficiencia parcial de células madre del limbo antes de recibir un autoinjerto queratolímbico del ojo contralateral normal del paciente (donante 2). Las secciones en serie de las biopsias se tiñeron con H&E, Ab de control de isotipo o mAb ABCB5. La positividad de ABCB5 estuvo presente en la capa basal del epitelio del limbo del donante 2, mientras que en el limbo del paciente 2 se observó una capa epitelial drásticamente reducida y sin tinción de ABCB5. Las fotografías de tinción inmunofluorescente son montajes de fotografías secuenciales con un aumento de 20x.

La figura 9 muestra análisis de citometría de flujo representativos del epitelio del limbo o corneal central de ratones Abcb5 TS y Abcb5 KO. La dispersión frontal (FSC, por sus siglas en inglés) y la dispersión lateral (SSC, por sus siglas en inglés) indican el tamaño celular y la granularidad, respectivamente. El epitelio corneal central de ratones Abcb5 KO mostraron un número reducido de células epiteliales en comparación con el epitelio Abcb5 TS (paneles izquierdos), causado por una reducción en las células más grandes (ventanas de análisis de la derecha), pero no de células más pequeñas (ventanas de análisis de la izquierda). No hubo reducción en el número de células epiteliales del limbo (paneles de la derecha). Se muestran los resultados representativos de las muestras agrupadas de cuatro ojos (n = 3 experimentos).

La figura 10 muestra análisis de citometría de flujo representativos de células epiteliales recogidas del limbo (parte superior) o de la córnea central (parte inferior) de ratones Abcb5 TS y Abcb5 KO. Las células recuperadas se tiñeron con anticuerpo de control de isotipo, anticuerpo anti-Pax6 o anticuerpo anti-Krt12. Hubo una frecuencia reducida de células epiteliales PAX6(+) y KRT12(+) en la córnea central de ratones Abcb5 KO y una frecuencia reducida correspondiente de células PAX6(+) en el limbo de ratones Abcb5 KO. Las ventanas de análisis de color rojo identifican las células PAX6(+) o KRT12(+) en comparación con la tinción de control de isotipo. Se muestran análisis representativos de n = 3 experimentos.

La figura 11A muestra un área de la herida a desbridar marcada con una trefina de 2 mm y el epitelio eliminado. La figura 11B muestra una sección transversal teñida con DAPI de la córnea inmediatamente después del desbridamiento del epitelio central que muestra los márgenes de la herida y el estroma corneal central expuesto. La imagen es un montaje de fotografías secuenciales con un aumento de 10x.

La figura 11C muestra imágenes fluorescentes del control del cierre de la herida del epitelio corneal 1, 24 y 48 horas después del desbridamiento.

La figura 11D muestra un gráfico de velocidades de cierre de heridas, que no fueron significativamente diferentes entre ratones Abcb5 TS y Abcb5 KO (sumario de n = 2 experimentos repetidos).

La figura 12 muestra secciones transversales corneales compuestas teñidas con DAPI representativas de ratones Abcb5 TS (arriba) y Abcb5 KO (abajo) 48 horas después de una herida por desbridamiento del epitelio corneal, demostrando un número reducido de células epiteliales en ratones Abcb5 KO. La línea discontinua blanca delimita el epitelio del estroma; el cuadro blanco indica el área que se muestra con un aumento de 20x (las imágenes de montaje tienen un aumento de 10x); las líneas blancas delimitan el área en la que se contaron las células epiteliales. Las células epiteliales se contaron dentro del área normalizada en al menos tres cortes transversales compuestos consecutivos en tres ratones repetidos por grupo en dos experimentos separados (datos mostrados en la figura 2F).

La figura 13 muestra secciones transversales corneales compuestas teñidas con TUNEL representativas de ratones Abcb5 TS (arriba) y Abcb5 KO (abajo) 48 horas después de una herida por desbridamiento del epitelio corneal, demostrando un mayor número de células apoptóticas en ratones Abcb5 KO. Las áreas definidas por el cuadro blanco se muestran con un aumento de 20x (imágenes de montaje con un aumento de 10x). Se contó el número de células epiteliales TUNEL positivas y los datos de dos experimentos repetidos se resumen en la figura 2H.

La figura 14A muestra una ilustración esquemática de la recuperación y separación de las células epiteliales del limbo ABCB5(+) y ABCB5(-) de las córneas de donantes, seguidas de la preparación de geles de fibrina que contienen células de donantes.

La figura 14B muestra una ilustración esquemática de la inducción de la deficiencia de células madre del limbo en ratones receptores y el trasplante de injertos de donantes.

La figura 15A muestra análisis de citometría de flujo representativos que muestran las ventanas de análisis y la viabilidad de las células epiteliales del limbo de donantes murinos. La viabilidad se muestra como el porcentaje de células excluyendo DAPI.

La figura 15B muestra análisis posteriores a la clasificación que representan la pureza y la viabilidad de subpoblaciones de células epiteliales del limbo enriquecidas con ABCB5(+) y enriquecidas con ABCB5(-) aisladas de donantes murinos. La viabilidad se muestra como el porcentaje de células excluyendo DAPI.

La figura 15C muestra análisis de citometría de flujo representativos que muestran las ventanas de análisis y la viabilidad de las células epiteliales del limbo de donantes humanos.

La figura 15D muestra análisis posteriores a la clasificación que representan la pureza y la viabilidad de subpoblaciones de células epiteliales del limbo enriquecidas con ABCB5(+) y enriquecidas con ABCB5(-) aisladas de donantes humanos. La viabilidad se muestra como el porcentaje de células excluyendo DAPI.

La figura 16 muestra cortes transversales corneales compuestos con H&E representativos de ratones C57BL/6J receptores 5 semanas después de recibir una deficiencia de células madre del limbo (LSCD) inducida seguida de injerto de trasplantes de gel de fibrina de donante que contienen las siguientes subpoblaciones de células epiteliales del limbo murinas singénicas: (i) sin células (control negativo), (ii) células ABCB5(+), (iii) células ABCB5(-) o (iv) células sin separar. Una córnea normal sin tratar (sin LSCD) sirvió como control positivo. El control positivo muestra el epitelio corneal estratificado y el ángulo iridocorneal normales. Los ratones que recibieron trasplantes sin células mostraron la conjuntivalización normal que se produce después de una LSCD, es decir, el epitelio conjuntival no estratificado cubre la córnea con una inflamación extensa, neovascularización y edema estromal. La sinequia (donde el iris se adhiere a la córnea) es típica de una intensa inflamación del segmento anterior. Por el contrario, los ratones que recibieron trasplantes de células ABCB5(+), pero no las células ABCB5(-), mostraron un epitelio corneal estratificado restaurado sin evidencia de inflamación, neovascularización, edema estromal o sinequia. Los ratones que recibieron trasplantes de células epiteliales del limbo sin separar mostraron áreas de edema estromal con epitelio no estratificado, mientras que otras partes de la córnea contenían células epiteliales estratificadas normales.

La figura 17 muestra secciones transversales corneales compuestas con H&E representativas de ratones NSG inmunodeficientes receptores 5 semanas después de la inducción de LSCD seguida del trasplante de injertos en gel de fibrina de donantes que contienen las siguientes subpoblaciones de células epiteliales del limbo humanas: (i) sin células (control negativo), (ii) células ABCB5(+), (iii) células ABCB5(-) y (iv) células sin separar. Una córnea NSG normal sin tratar (sin LSCD) sirvió como control positivo. El control positivo muestra el epitelio corneal estratificado y el ángulo iridocorneal normales. Los ratones que recibieron trasplantes sin células mostraron evidencia de conjuntivalización que se produce después de una deficiencia de LSC, es decir, el epitelio conjuntival no estratificado cubre la córnea con una extensa neovascularización y sinequia (la inflamación del segmento anterior está atenuada en los ratones NSG debido a su inmunodeficiencia). Por el contrario, los ratones que recibieron trasplantes que contenían células ABCB5(+) mostraron áreas de epitelio estratificado restaurado, mientras que los ratones que recibieron injertos de células ABCB5(-) no.

La figura 18 muestra la tinción inmunofluorescente de Krt12 representativa (verde) de ratones C57BL/6J receptores 5 semanas después de una inducción de LSCD seguida de un trasplante de injertos en gel de fibrina de donantes que contienen las siguientes subpoblaciones de células epiteliales del limbo murinas singénicas: (i) sin células (control negativo), (ii) células ABCB5(+), (iii) células ABCB5(-) o (iv) células sin separar. La córnea murina normal no tratada (sin LSCD), mostrada en este caso como un control positivo, presentó una alta intensidad de tinción de KRT12. Como cabía esperar, los ratones que recibieron injertos que no contenían células, no mostraron ninguna expresión de KRT12. Por el contrario, los ratones trasplantados con células ABCB5(+), mostraron una expresión de KRT12 significativamente potenciada en comparación con los ratones trasplantados con células epiteliales del limbo sin separar. No se detectó expresión de KRT12 en ratones trasplantados con células ABCB5(-). El cuadro blanco representa el área mostrada con un aumento de 40x. Las imágenes de montaje se muestran con un aumento de 10x.

Descripción detallada

La homeostasis y la regeneración del epitelio corneal están sostenidas por una población de células madre del limbo (LSC, por sus siglas en inglés) que residen en el epitelio basal del limbo del ojo [1-3]. Estas células generan nuevos queratocitos para reemplazar los dañados, y la pérdida de LSC debido a lesiones o enfermedades es una de las principales causas de ceguera en todo el mundo [4]. El trasplante de LSC de un ojo sano es con frecuencia, la única opción terapéutica disponible para los pacientes con LSCD. El éxito del trasplante depende principalmente de la frecuencia de LSC dentro de los injertos [5]. Sin embargo, antes de la presente divulgación, no se ha informado de un gen de células madre del limbo que permita el enriquecimiento esperado de este subconjunto de células [5].

La presente divulgación está basada, en parte, en los hallazgos de que el miembro 5 de la subfamilia B (MDR/TAP) del casete de unión a ATP (ABCB5) [6,7] marca las LSC y es necesario para el mantenimiento de las células madre del limbo, desarrollo y reparación de la córnea, y que las lSc ABCB5 positivas (ABCB5(+)) aisladas de forma esperada de donantes poseen la capacidad exclusiva de restaurar la córnea tras el injerto. Por tanto, diversos aspectos y opciones de la divulgación se refieren a métodos para tratar a un sujeto que tiene una afección ocular, métodos para aislar células madre ABCB5(+) del ojo, métodos para seleccionar y/o producir injertos oculares para trasplante, y métodos para promover la regeneración de células oculares, así como para injertos y preparaciones que contienen células madre oculares aisladas caracterizadas por la expresión de ABCB5 en su superficie celular.

Los inventores de la presente divulgación demuestran, en el presente documento, que ABCB5 se expresa de manera uniforme en LSC que conservan marcadores in vivo en ratones de tipo silvestre y en LSC Anp63a positivas en seres humanos sanos. De acuerdo con estos hallazgos, los inventores también demuestran que la frecuencia de células madre del limbo ABCB5 positivas se reduce significativamente en pacientes con LSCD. Estudios de pérdida de función de ABCB5 utilizando ratones con el gen Abcb5 desactivado (KO) generados recientemente causaron el agotamiento de las LSC quiescentes debido a una proliferación y apoptosis potenciadas y dieron como resultado una diferenciación corneal y una cicatrización de heridas defectuosas, lo que explica la capacidad demostrada de las LSC ABCB5(+) para restaurar la córnea. Los resultados del gen KO murino, el rastreo de células madre del limbo in vivo y los modelos de trasplante de células madre del limbo, y los hallazgos concurrentes en análisis de trasplantes fenotípicos y funcionales de muestras de biopsias humanas, proporcionan líneas convergentes de evidencia de que ABCB5 identifica LSC de mamíferos. La identificación y el aislamiento esperado de las LSC definidas molecularmente con funciones esenciales en el desarrollo y la reparación de la córnea tienen implicaciones importantes para el tratamiento de enfermedades de la córnea, particularmente ceguera corneal debida a LSCD.

"Células madre ABCB5(+)", como se usa en el presente documento, se refiere a células que tienen la capacidad de autorrenovarse y diferenciarse en células maduras de múltiples linajes de células adultas. Estas células se caracterizan por la expresión de ABCB5 en la superficie celular. En algunas opciones de la divulgación, las células madre ABCB5(+) son células madre del limbo. En algunas opciones de la divulgación, las células madre ABCB5(+) son células madre de la retina. Las células madre ABCB5(+) pueden obtenerse del (por ejemplo, aislarse de o derivar de) epitelio del limbo basal del ojo o del epitelio pigmentario de la retina (RPE). En algunas opciones, las células madre ABCB5(+) se obtienen del ojo humano. Otros tipos de células madre ABCB5(+) tal como, por ejemplo, las obtenidas de la córnea central pueden usarse en diversos aspectos y opciones de la divulgación.

Las células madre oculares ABCB5(+) pueden obtenerse de un sujeto aislando una muestra de tejido ocular, incluyendo células oculares del epitelio del limbo basal o RPE, y purificando, después, las células madre ABCB5(+). Será evidente para los expertos en la materia que una muestra puede enriquecerse en células madre oculares que tienen ABCB5 de varias formas. Por ejemplo, las células madre oculares pueden seleccionarse mediante la unión de ABCB5 en moléculas de la superficie celular con anticuerpos u otras moléculas de unión. Las células oculares pueden obtenerse directamente de un donante o recuperarse del almacenamiento con crioconservadores. Las células madre oculares pueden, por ejemplo, aislarse utilizando anticuerpos contra ABCB5 y mantenerse en cultivo utilizando metodología convencional o congelarse, p. ej., en nitrógeno líquido, para su uso posterior. Un ejemplo no limitante de un método que puede usarse de acuerdo con la divulgación para obtener células del ojo se describe en la sección de ejemplos y se representa en la figura 14A.

La presente divulgación contempla cualquier método adecuado para emplear moléculas de unión a ABCB5 tales como, por ejemplo, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos humanos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos monocatenarios, fragmentos F(ab')2, Fab, Fd, Fv o Fv monocatenarios para separar las células madre ABCB5(+) de una población mixta de células oculares. Por consiguiente, en la presente divulgación se incluye un método para producir una población de células madre ABCB5(+) que comprende las etapas de proporcionar una suspensión celular de células oculares; poner en contacto la suspensión celular con un anticuerpo monoclonal, o una combinación de anticuerpos monoclonales, que reconoce o reconocen un epítopo, incluyendo ABCB5, en las LSC ABCB5(+); y separar y recuperar de la suspensión celular las células unidas por los anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales pueden unirse a una fase sólida y utilizarse para capturar células madre del limbo de muestras de tejido ocular. Las células unidas se pueden separar después de la fase sólida mediante métodos conocidos dependiendo de la naturaleza del anticuerpo y de la fase sólida.

"Anticuerpo monoclonal", como se usa en el presente documento, se refiere a un anticuerpo obtenido de una única población clonal de inmunoglobulinas que se unen al mismo epítopo de un antígeno. Los sistemas basados en monoclonales apropiados para preparar poblaciones de células de la divulgación incluyen columnas de perlas magnéticas/partículas paramagnéticas que utilizan anticuerpos para la selección positiva o negativa; separación basada en afinidad por biotina o estreptavidina; y clasificación por citometría de flujo de alta velocidad de LSC teñidas con inmunofluorescencia mezcladas en una suspensión de otras células. Por tanto, los métodos de la presente divulgación incluyen el aislamiento de una población de LSC y la potenciación utilizando anticuerpos monoclonales producidos contra el antígeno de superficie ABCB5 (por ejemplo, anticuerpos monoclonales que se unen de manera selectiva a ABCB5). En algunos casos, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo disponibles en el mercado que se unen de manera selectiva a ABCB5 pueden usarse en los métodos divulgados en el presente documento. Se considera que dichos anticuerpos se unen de manera selectiva a ABCB5 si se unen o son capaces de unirse a ABCB5 con una afinidad mayor que la afinidad con la que los anticuerpos monoclonales pueden unirse a otros antígenos (es decir, antígenos diferentes a ABCB5). Dicha unión se puede medir o determinar mediante ensayos convencionales de interacción proteína-proteína (por ejemplo, ensayos anticuerpo-antígeno o ligando-receptor) tales como, por ejemplo, ensayos competitivos, ensayos de saturación o inmunoensayos convencionales que incluyen, sin limitación, ensayos de inmunoabsorción ligada a enzimas, radioinmunoensayos y ensayos de unión de radioinmunofiltro.

Pueden aislarse las células madre ABCB5(+) (por ejemplo, LSC ABCB5(+)). Una "célula madre ABCB5(+) aislada", como se usa en el presente documento, se refiere a una célula que se ha extraído de un organismo en el que se encontraba de manera original, o un descendiente de dicha célula. Una célula aislada también se refiere a una célula que se coloca en condiciones distintas del entorno natural. Posteriormente, dicha célula puede introducirse en un segundo organismo o reintroducirse en el organismo del que se aisló (o la célula o población de células de la que descendió). Dicha una célula, una vez manipulada de acuerdo con los métodos de la divulgación todavía se considera que es una célula aislada. El término "aislada" no excluye el uso posterior de la célula a partir de entonces en combinaciones o mezclas con otras células o en un entorno in vivo.

"Composiciones", en el presente documento, puede referirse a preparaciones o injertos de células aisladas, incluyendo injertos de tejido e injertos artificiales (por ejemplo, injertos de colágeno acelular). Las composiciones de la divulgación, en algunos casos, están enriquecidas con células madre ABCB5(+) aisladas. Se considera que una composición está enriquecida con células madre ABCB5(+) aisladas si las células madre ABCB5(+) son el subtipo celular predominante presente en la preparación. Por ejemplo, una composición enriquecida con células madre ABCB5(+) es una composición en la que al menos el 50 %, al menos el 55 %, al menos el 60 %, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o el 100 % de las células de la composición son células madre ABCB5(+) (por ejemplo, LSC ABCB5(+)). En algunas opciones, una composición enriquecida con células madre ABCB5(+) aisladas es aquella en la que menos del 50 %, menos del 45 %, menos del 40 %, menos del 35 %, menos del 30 %, menos del 25 %, menos del 20 %, menos del 15 %, menos del 10 %, menos del 9 %, menos del 8 %, menos del 7 %, menos del 6 %, menos del 5 %, menos del 4 %, menos del 3 %, menos del 2 % o menos del 1 % de las células de la composición son células ABCB5(-). En algunas opciones, las células de una composición son solamente células oculares. Es decir, en algunas opciones, una composición no puede contener células no oculares. En algunas opciones, una composición puede no contener células ABCB5(-).

Las células madre ABCB5(+) (por ejemplo, LSC ABCB5(+)) se pueden preparar como preparaciones sustancialmente puras. La expresión "sustancialmente pura", como se usa en el presente documento, se refiere a una preparación que está sustancialmente libre de células diferentes a las células madre ABCB5(+) (por ejemplo, LSC ABCB5(+)). Por ejemplo, una preparación sustancialmente pura de células madre ABCB5(+) puede constituir una preparación en la que al menos el 85 %, al menos el 86 %, al menos el 87 %, al menos el 88 %, al menos el 89 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, al menos el 92 %, al menos el 93 %, al menos el 94 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o el 100 % del total de células presentes en una preparación son células madre ABCB5(+) (por ejemplo, LSC ABCB5(+)).

En algunas opciones, las preparaciones de células ABCB5(+) aisladas y/o sustancialmente puras se pueden envasar en un recipiente farmacéutico terminado, tal como un vial de inyección, ampolla, o bolsa de infusión junto con cualquier otro componente que se desee, p. ej., agentes para conservar las células o reducir el crecimiento bacteriano. Las preparaciones celulares pueden estar en forma de dosificación unitaria.

Las células madre ABCB5(+) (por ejemplo, LSC ABCB5(+)) son útiles para tratar afecciones oculares. En algunas opciones, la afección ocular es una herida ocular, que puede provocar cicatrices oculares, lo que a su vez puede causar disminución de la visión o ceguera. En algunas opciones, las células madre ABCB5(+) (p. ej., LSC ABCB5(+)) se pueden usar para tratar enfermedades de la córnea como, por ejemplo, ceguera debido a deficiencia de células madre del limbo (LSCD). En algunas opciones, las células madre ABCB5(+) (p. ej., LSC ABCB5(+) y/o células madre PRE ABCB5(+)) se pueden usar para tratar enfermedades de la retina tales como, por ejemplo, degeneración macular o retinitis/retinitis pigmentosa. La degeneración macular se refiere a un grupo de afecciones que incluyen un deterioro de la mácula que causa una pérdida de la visión central necesaria para una visión aguda y clara. Es una de las principales causas de pérdida de visión y ceguera en personas de 65 años o mayores. La degeneración macular también puede denominarse AMD o ARMD (por sus siglas en inglés, degeneración macular relacionada con la edad). La retinitis se refiere a la inflamación de la retina, lo que puede provocar ceguera. La retinitis pigmentosa, que puede ser el resultado de una afección genética o una respuesta inflamatoria, se refiere a un grupo de trastornos hereditarios caracterizados por una pérdida progresiva de la visión periférica y dificultades en la visión nocturna (nictalopía) que pueden conducir a la pérdida de la visión central.

Las células madre ABCB5(+) aisladas (p. ej., LSC ABCB5(+)S y/o células madre de RPE ABCB5(+)) pueden administrarse a un sujeto que lo necesite en una cantidad eficaz para regenerar células oculares en el sujeto (denominada en el presente documento "cantidad eficaz" de células madre ABCB5(+)). En algunas opciones, se administra una a aproximadamente 107 células madre ABCB5(+) a un sujeto. En algunas opciones, se administra una única célula madre ABCB5(+) aislada a un sujeto. En algunas opciones, se administran de aproximadamente 101 a aproximadamente 107, se administran de aproximadamente 101 a aproximadamente 106, se administran de aproximadamente 101 a aproximadamente 105, se administran de aproximadamente 101 a aproximadamente 104, se administran de aproximadamente 101 a aproximadamente 103, de aproximadamente 101 a aproximadamente 102 células madre ABCB5(+) aisladas a un sujeto. En algunas opciones, se administran aproximadamente 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107 o más células madre ^a B^c B5(+) aisladas a un sujeto. En algunas opciones, se administran menos de aproximadamente 101 células madre ABCB5(+) aisladas a un sujeto.

En algunas opciones, las células madre ABCB5(+) aisladas (por ejemplo, como una composición en forma de una preparación o injerto de células madre ABCB5(+)) se pueden administrar a un sujeto más de una vez. Por tanto, en algunas opciones, a un sujeto se le pueden administrar múltiples dosis o injertos (p. ej., 2, 3, 4 o más) de células madre ABCB5(+) aisladas en el transcurso de varias semanas, meses o años. En algunas opciones, las células madre se administran nuevamente 3 meses, 6 meses, 9 meses, 12 meses, 18 meses, 21 meses o 24 meses después de la primera aplicación. El número de aplicaciones y la frecuencia de aplicación pueden depender, por ejemplo, del grado de regeneración celular logrado después de la primera administración/trasplante de células madre. Un profesional médico (por ejemplo, cirujano o médico) puede determinar el número y la frecuencia de las aplicaciones de células madre.

En algunas opciones, un sujeto que tiene una afección ocular tiene una herida ocular (p. ej., células oculares muertas, dañadas o infectadas) en, por ejemplo, el epitelio corneal. Por tanto, el epitelio corneal puede estar herido en un sujeto que tiene una afección ocular de acuerdo con la divulgación. Se ha descubierto que los injertos de células madre del limbo ABCB5(+) se pueden utilizar para restaurar la córnea. Por tanto, en algunas opciones, la integridad de la superficie del epitelio corneal del sujeto se restaura después de la administración de una cantidad eficaz de LSC ABCB5(+). La regeneración de la córnea se puede evaluar basándose en, por ejemplo, la transparencia de la córnea (p. ej., desarrollo de córnea clara, en lugar de opaca) y/o agudeza visual. Los métodos para evaluar el éxito del trasplante de células madre/células oculares (por ejemplo, grado de regeneración celular, agudeza visual) son conocidos en la técnica, pudiéndose utilizar cualquiera de ellos de acuerdo con la divulgación. Ejemplos de métodos para evaluar el éxito de un trasplante de células madre/células oculares incluyen, sin limitación, obtención de imágenes con la lámpara de hendidura, tomografía de retina de Heidelberg (HRT, por sus siglas en inglés), tomografía de coherencia óptica (OCT, por sus siglas en inglés) y obtención de imágenes de 2 fotones. Otros ejemplos incluyen, sin limitación, el uso de colorante Rosa de Bengala (4,5,6,7-tetracloro-2',4',5',7'-tetrayodofluoresceína) y otras soluciones de tinción epitelial.

Las células madre ABCB5(+) (por ejemplo, LSC ABCB5(+)) pueden ser autólogas para el sujeto (obtenidas del mismo sujeto) o no autólogas, tal como las células que son alogénicas o singénicas para el sujeto. Como alternativa, las células madre ABCB5(+) (por ejemplo, LSC a Bc B5(+)) pueden obtenerse de una fuente que sea xenogénica para el sujeto.

Alogénico se refiere a células que son genéticamente diferentes, aunque pertenecen a o se obtienen de la misma especie que el sujeto. Por tanto, una célula madre del limbo ABCB5(+) alogénica humana es una célula madre del limbo obtenida de un ser humano que no es el receptor previsto de las células madre del limbo. Singénica se refiere a células que son genéticamente idénticas o estrechamente relacionadas e inmunitariamente compatibles con el sujeto (es decir, de individuos o tejidos que tienen genotipos idénticos). Xenogénica se refiere a células derivadas u obtenidas de un organismo de una especie diferente a la del sujeto.

Las células madre ABCB5(+) (por ejemplo, LSC ABCB5(+)) de acuerdo con la divulgación pueden expandirse ex vivo antes de la etapa de administración. Por tanto, en algunos casos, la expresión de ABCB5 proporciona una base para identificar, aislar, clonar, propagar y expandir células madre ABCB5(+) (por ejemplo, LSC ABCB5(+)) in vitro. La presente divulgación contempla cualquier método adecuado para emplear agentes, p. ej., péptidos aislados, p. ej., anticuerpos, que se unen a ABCB5 para separar las células madre ABCB5(+) de otras células. Las células madre ABCB5(+) aisladas se pueden mantener en un entorno de cultivo apropiado utilizando, por ejemplo, una combinación de medios, suplementos y reactivos. Opcionalmente, se pueden usar poblaciones de células alimentadoras o medios acondicionados obtenidos de poblaciones de células alimentadoras para expandir las poblaciones de células madre ABCB5(+).

Factores de adhesión, fijación y matriz que pueden usarse para la expansión de células madre de acuerdo con la divulgación incluyen, sin limitación, E-cadherina, colágeno, fibronectina, superfibronectina, proteoglicano de sulfato de heparina, ICAM-I, laminina, osteopontina, proteoglicano, E-selectina, L-selectina, VCAM y vitronectina.

Bioactivos y suplementos que pueden usarse para la expansión de células madre de acuerdo con la divulgación incluyen, sin limitación, enzimas (por ejemplo, catepsina G, Flt-3/Fc), proteínas y péptidos (p. ej., activina A, albúmina, angiogenina, angiopoyetina, péptido inhibidor de BAX, heregulina beta-1, SMAC/Diablo), vitaminas, hormonas y diversas sustancias diferentes (p. ej., ácido L-ascórbico, dexametasona, EGF, receptor de EGF, líquido embrionario (bovino), ligando flt3, progesterona, ácido retinoico, acetato de retinilo, trombopoyetina y TPO), anticuerpos, quimiocinas, citocinas, factores de crecimiento y receptores.

Reactivos de cultivo que pueden usarse para la expansión de células madre de acuerdo con la divulgación incluyen, sin limitación, antibióticos (por ejemplo, cicloheximida, etopósido, gentamicina, mitomicina, penicilina-estreptomicina), medios clásicos (p. ej., medio claycomb, medio Eagle modificado de Dulbecco, medio de Dulbecco modificado de Iscove, medio esencial mínimo), medio de congelación celular DMSO, medio claycomb sin L-glutamina, medio Stemline® (Sigma-Aldrich, EE. UU.).

Como se usa en el presente documento, un sujeto puede ser un mamífero tal como, por ejemplo, un ser humano, primate no humano, vaca, caballo, cerdo, oveja, cabra, perro, gato o roedor. Las células madre humanas ABCB5(+) (por ejemplo, LSC ABCB5(+)) y los sujetos humanos son opciones particularmente importantes.

Las composiciones de la presente divulgación pueden comprender células madre (por ejemplo, células madre del limbo) o una preparación aislada de células madre, las células madre caracterizadas por la expresión de ABCB5 en su superficie celular. Una composición puede comprender una preparación enriquecida con células madre ABCB5(+) aisladas (por ejemplo, LSC ABCB5(+)), o puede comprender una población sustancialmente pura de células madre ABCB5(+) (por ejemplo, LSC ABCB5(+)). Las composiciones pretenden abarcar injertos oculares, analizados en el presente documento.

Las composiciones, en algunas opciones, pueden comprender bioactivos y suplementos adicionales para promover la regeneración y diferenciación celular. Dichos bioactivos y suplementos que pueden usarse de acuerdo con la divulgación se describen anteriormente e incluyen, sin limitación, diversas enzimas, proteínas y péptidos, vitaminas, anticuerpos, quimiocinas, citocinas, factores de crecimiento y receptores. En algunas opciones, las composiciones pueden comprender un inmunosupresor y/o un agente contra la vasculogénesis. Por ejemplo, en algunas opciones, una composición puede comprender ciclosporina (por ejemplo, CyA), que puede usarse para prevenir y/o tratar rechazos de injertos. En algunas opciones, las composiciones pueden comprender bevacizumab (por ejemplo, AVASTIN®). Puede usarse el uso de un agente contra la vasculogénesis, en algunos casos, para prevenir la formación de vasos sanguíneos, que con frecuencia se produce después del trasplante y puede conducir al rechazo del injerto. En algunas opciones, no se administra un inmunosupresor y/o un agente contra la vasculogénesis como componente de una composición, sino que se administra de forma independiente antes o después de la administración de células madre ABCB5(+).

En algunas opciones, las composiciones están formuladas para administración tópica. Un ejemplo de una composición formulada para administración tópica es un injerto ocular. Un injerto ocular para trasplante de acuerdo con la divulgación se refiere a un sustrato que contiene células madre ACBC5(+) (por ejemplo, LSC ACBC5(+)) y opcionalmente otras células oculares y factores bioactivos (por ejemplo, citocinas, factores de crecimiento) que promueven la regeneración de las células oculares, cuyo sustrato se puede trasplantar o implantar en un ojo de un sujeto para reemplazar tejido dañado o infectado (por ejemplo, para tratar una herida ocular). Un injerto ocular puede contener una población mixta de células que incluyen células oculares tales como, por ejemplo, células corneales y/o retinianas. En algunas opciones, un injerto ocular para trasplante está enriquecido con LSC ABCB5(+).

La córnea es la parte frontal transparente del ojo que cubre el iris, la pupila y la cámara anterior. La córnea, con la cámara anterior y el cristalino, refracta la luz, y la córnea representa aproximadamente dos tercios de la potencia óptica total del ojo. La córnea de los primates tiene cinco capas: epitelio corneal (capa de tejido epitelial multicelular), capa de Bowman (capa condensada de fibras de colágeno), estroma corneal (capa media de fibras de colágeno, p. ej., fibrillas de colágeno de tipo I y queratocitos), membrana de descemet (capa delgada de la que proceden las células del epitelio corneal, compuesta por fibrillas de colágeno de tipo IV) y endotelio corneal (capa simple escamosa o cúbica baja de células ricas en mitocondrias). Las composiciones, incluyendo preparaciones aisladas e injertos oculares, de acuerdo con la divulgación pueden comprender, además de las células madre ABCB5(+), uno cualquiera o más de los subtipos de células de las cinco capas corneales. En algunas opciones, las composiciones no contienen uno cualquiera o más de los subtipos de células de las cinco capas corneales.

La retina es la capa de tejido sensible a la luz que recubre la superficie interna del ojo. La retina misma tiene varias capas de neuronas interconectadas por sinapsis, incluyendo células fotorreceptoras tales como bastones, conos y células ganglionares. Las composiciones, incluyendo preparaciones aisladas e injertos oculares, de acuerdo con la divulgación pueden comprender, además de las células madre ABCB5(+), uno cualquiera o más de los subtipos de células neuronales de la retina, incluyendo las células epiteliales retinianas del RPE. En algunas opciones, las composiciones no contienen uno cualquiera o más de los subtipos de células neuronales de la retina.

Las células de una composición destinada para su uso en trasplantes (por ejemplo, injerto ocular) pueden ser alogénicas o singénicas. En algunas opciones, las células no son células madre de la piel (p. ej., células madre mesenquimales). Por tanto, en algunas opciones, las células de una composición de la divulgación no contienen (es decir, excluyen) células madre mesenquimales ABCB5(+).

En algunas opciones, las composiciones, incluyendo injertos oculares, están enriquecidos con células madre ABCB5(+). En algunas opciones, los injertos oculares están enriquecidos con LSC ABCB5(+). En algunas opciones, los injertos oculares están enriquecidos con células madre de RPE ABCB5(+). Por ejemplo, un injerto ocular se considera que está enriquecido con LSC ABCB5(+) si la célula madre del limbo ABCB5(+) es el subtipo celular predominante presente en el injerto. Por ejemplo, un injerto ocular está enriquecido con LSC ABCB5(+) si las LSC superan en número a los otros subtipos de células en el injerto. En algunas opciones, al menos el 50 % de las células del injerto son células madre ABCB5(+) o células madre del limbo ABCB5(+). Por ejemplo, en algunas opciones, al menos el 55 %, al menos el 60 %, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 %, al menos el 99 % o el 100 % de las células del injerto ocular son células madre ABCB5(+) o células madre del limbo ABCB5(+). En algunas opciones, menos del 15%, menos del 10 %, menos del 5 % o menos del 1 % de las células de un injerto ocular son células ABCB5(-).

Las composiciones de la divulgación pueden comprender un sustrato tal como, por ejemplo, un material biocompatible que favorezca la cicatrización de heridas, incluyendo armazones biodegradables tales como, por ejemplo, gel de fibrina. Los geles de fibrina se preparan normalmente a partir de fibrinógeno y trombina, proteínas clave implicadas en la coagulación de la sangre. Otros ejemplos de sustratos que pueden usarse de acuerdo con la divulgación incluyen, sin limitación, membrana amniótica, armazones de aminoglucanos y adhesivos. Se pueden añadir células madre ABCB5(+) al sustrato para formar, por ejemplo, injertos oculares para trasplante.

Las composiciones de la divulgación se pueden trasplantar a, por ejemplo, la superficie de la córnea o la retina. Por tanto, en algunas opciones, las composiciones se administran por vía tópica. En los casos en que se trasplanta un injerto de células madre al ojo, el injerto se puede suturar en su lugar. En otras opciones, se inyectan las composiciones de células madre. En algunas opciones, las composiciones se inyectan por vía intravenosa, intraarterial o intravascular. Se contemplan otras vías de administración. Debe entenderse que las composiciones y/o las células madre ABCB5(+) de la divulgación pueden administrarse con o sin un transportador. Por tanto, en algunas opciones, se puede administrar una población sustancialmente pura de células madre ABCB5(+) aisladas a un sujeto para, por ejemplo, tratar una afección ocular.

La expresión de ABCB5 puede usarse para seleccionar preparaciones de células oculares (p. ej., Injertos) para trasplante, permitiendo, de este modo, la selección de preparaciones de células oculares enriquecidas con células madre ABCB5(+). Dichos métodos de acuerdo con la divulgación incluyen identificar el número de células madre ABCB5(+) (por ejemplo, células madre del limbo ABCB5(+)) en las preparaciones de células oculares, comparar el número de células madre ABCB5(+) con la población celular total de las preparaciones celulares, y basándose en la comparación, seleccionar las preparaciones de células oculares para trasplante. El número de células madre ABCB5(+) en las preparaciones de células oculares puede identificarse utilizando una cualquiera o más moléculas conocidas que se unen de manera selectiva a ABCB5. Por ejemplo, en algunas opciones, las células madre ABCB5(+) pueden identificarse poniendo en contacto las células con un anticuerpo u otra molécula de unión que se une de manera selectiva a ABCB5. También se pueden usar colorantes viables (por ejemplo, rodamina u otros colorantes marcadores de células madre) para identificar células madre ABCB5(+). Las células madre ABCB5(+) también se pueden aislar basándose en la presencia o ausencia de otros marcadores específicos de interés. Por ejemplo, se pueden usar agentes para reconocer marcadores específicos de células madre, por ejemplo, se pueden usar anticuerpos marcados que reconocen y se unen a marcadores de superficie celular o antígenos en células madre para separar y aislar células madre ABCB5(+) utilizando clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), métodos de selección, selección de partículas magnéticas, selección del clasificador de partículas y otros métodos conocidos por los expertos en la materia, incluyendo la separación por densidad. Normalmente, las preparaciones de células oculares se seleccionan para trasplante si están enriquecidas con células madre ABCB5(+) (p. ej., células madre del limbo ABCB5(+)). Dichas preparaciones de células enriquecidas con ABCB5(+) aumentan el éxito del trasplante. En algunas opciones, las preparaciones de células oculares (por ejemplo, injertos) pueden seleccionarse para trasplante si al menos el 0,03% de la población celular total es ABCB5(+). En algunas opciones, las preparaciones de células oculares se seleccionan para trasplante si al menos el 0.04 %, al menos el 0,05 %, al menos el 0,06 %, al menos el 0,07 %, al menos el 0,08 %, al menos el 0,09 %, al menos el 0,10 %, al menos el 0,15 %, al menos el 0,20 %, al menos el 0,30 %, al menos el 0,40 %, al menos el 0,50 %, al menos el 0,60 %, al menos el 0,70 %, al menos el 0,80 %, al menos el 0,90 %, al menos el 1,0 %, al menos el 2,0 %, al menos el 3,0 %, al menos el 4,0 %, al menos el 5,0 %, al menos el 10,0 %, al menos el 20,0 %, al menos el 30,0 %, al menos el 40,0 %, al menos el 50,0 %, al menos el 60,0 %, al menos el 70,0 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 98 %, al menos el 99 %, al menos el 99,9 % o el 100 % de la población celular total es ABCB5(+).

Las células madre ABCB5(+) de la divulgación también se pueden usar para preparar/producir injertos artificiales tales como, por ejemplo, injertos de córnea artificiales. Dichos injertos pueden estar hechos de colágeno acelular u otro material biocompatible acelular. En algunas opciones, las células madre ABCB5(+) aisladas se siembran en una matriz acelular para producir un injerto artificial tal como, por ejemplo, una córnea artificial.

Se pueden administrar composiciones para administración tópica tales como, por ejemplo, un injerto ocular por cualquier medio conocido en la técnica, como, por ejemplo, los descritos por Rama, J. et al [5].

A continuación, se muestra un ejemplo de un método de la divulgación. Las células madre ABCB5(+) se obtienen y se cultivan en gel de fibrina (p. ej., utilizando células alimentadoras irradiadas letalmente, p. ej., células 3T3-J2). Se realiza una peritomía del limbo de 360° y se retira con cuidado el paño corneal fibrovascular. La lámina epitelial ABCB5(+) cultivada con fibrina se coloca sobre el lecho de la herida corneal preparado que abarca el limbo (por ejemplo, aproximadamente 2-3 mm para reducir la competencia con el crecimiento conjuntival hacia el interior). Después, la conjuntiva se sutura sobre la lámina de fibrina periférica con suturas (p.ej., suturas de vicryl 8,0) para proteger el borde de la lámina y ayudar a que se adhiera a la superficie. Los párpados se mantienen cerrados (por ejemplo, con STERI-STRIP™ (3M™ NEXCa Re ™)) y se parchean durante una semana.

La divulgación también contempla el uso de células madre ABCB5(+) aisladas (por ejemplo, células madre del limbo ABCB5(+) o células madre corneales ABCB5(+)) para producir células madre totipotentes, multipotentes o pluripotentes (p. ej., células madre pluripotentes inducidas (iPSC, por sus siglas en inglés)), a partir de las cuales se pueden desarrollar otras células, tejidos y/o animales enteros. Por tanto, se proporcionan métodos para reprogramar directamente, o inducir, células madre ABCB5(+) aisladas para volverse células madre totipotentes, multipotentes o pluripotentes en algunos aspectos de la divulgación. El término "reprogramación" como se usa en el presente documento, se refiere a un proceso que invierte el potencial de desarrollo de una célula o población de células (por ejemplo, una célula madre ABCB5(+) aislada). Por tanto, la reprogramación se refiere al proceso de conducir una célula a un estado con mayor potencial de desarrollo, es decir, hacia atrás a un estado menos diferenciado. La célula que se va a reprogramar puede diferenciarse parcial o terminalmente antes de la reprogramación. En algunas opciones, la reprogramación comprende una reversión total o parcial del estado de diferenciación, es decir, un aumento en el potencial de desarrollo de una célula, al de una célula que tiene un estado totipotente, multipotente o pluripotente. En algunas opciones, la reprogramación comprende conducir una célula madre ABCB5(+) aislada a un estado totipotente, multipotente o pluripotente, de manera que la célula tenga el potencial de desarrollo de una célula madre embrionaria, es decir, un fenotipo de célula madre embrionaria. La reprogramación también comprende la reversión parcial del estado de diferenciación de una célula a un estado que hace que la célula sea más susceptible a la reprogramación completa hacia un estado totipotente, multipotente o pluripotente cuando se somete a manipulaciones adicionales.

Se pueden generar células madre totipotentes, multipotentes o pluripotentes a partir de células madre ABCB5(+) (denominadas en el presente documento "células ABCB5(+) reprogramadas") utilizando varios factores de reprogramación. Las células resultantes, que tienen un mayor potencial de desarrollo que las células madre ABCB5(+) aisladas, pueden convertirse después en la fuente de células madre para manipulaciones adicionales. Un "factor de reprogramación" como se usa en el presente documento, se refiere a un factor de alteración del potencial de desarrollo, cuya expresión contribuye a la reprogramación de una célula, p. ej., una célula madre ABCB5(+) aislada, hacia un estado menos diferenciado o indiferenciado, p. ej., hacia una célula de un estado pluripotente o un estado parcialmente pluripotente. Factores de reprogramación incluyen OCT4, SOX2, KLF 4 y c-MYC (también conocidos como los "factores de Yamanaka" [32]). Otros factores de reprogramación incluyen, sin limitación, SOX 1, SOX 3, SOX15, SOX 18, NANOG, KLF1, KLF 2, KLF 5, NR5A2, LIN28, 1-MYC, n-MYC, REM2, TBX3, TERT y LIN28. Puede usarse cualquier combinación de dos o más de los factores de transcripción anteriores para reprogramar células madre ABCB5(+) aisladas. Métodos de reprogramación de células a estado totipotente, multipotente o pluripotente se describen por Stadtfeld y Hochedlinger [33].

Se pueden usar células ABCB5(+) reprogramadas, en algunas opciones de la divulgación, para aplicaciones básicas y/o clínicas, incluyendo el modelado de enfermedades, exploración de toxicidad de fármacos/descubrimiento de fármacos, terapia génica y terapia de reemplazo celular.

Por ejemplo, las células ABCB5(+) reprogramadas se pueden usar para tratar varias afecciones (p. ej., afecciones genéticas) que incluyen, sin limitación, anemia de células falciformes, enfermedad de Parkinson, hemofilia A, enfermedad cardíaca tal como enfermedad cardíaca isquémica, enfermedad de Alzheimer, daño de la médula espinal, accidente cerebrovascular, quemaduras, diabetes, osteoartritis y artritis reumatoide.

En algunas opciones, las células ABCB5(+) reprogramadas se pueden utilizar en trasplantes de órganos para proporcionar tipos celulares que sean genéticamente compatibles con un paciente.

Se contemplan otros usos básicos y clínicos de las células madre ABCB5(+) reprogramadas.

También se proporcionan, en el presente documento, métodos para producir células diferenciadas a partir de células ABCB5(+) reprogramadas. Los métodos pueden comprender expresar en las células ABCB5(+) reprogramadas uno o más factores de diferenciación necesarios para promover la diferenciación en un tipo celular más maduro, diferenciado tal como, por ejemplo, una célula sanguínea, plaqueta, célula estromal, célula ósea, miocito, célula de la piel, célula adiposa o célula neural. Como se usa en el presente documento, la expresión "factor de diferenciación" se refiere a un factor de alteración del potencial de desarrollo, tal como una proteína o una molécula pequeña, que induce a una célula a diferenciarse a un tipo celular deseado, p. ej., un factor de diferenciación reduce el potencial de desarrollo de una célula. La diferenciación a un tipo de célula específico puede implicar la expresión simultánea y/o sucesiva de más de un factor de diferenciación. Los métodos pueden comprender además hacer crecer las células ABCB5(+) reprogramadas en condiciones para promover la diferenciación para formar una célula diferenciada.

Por tanto, se pueden generar células ABCB5(+) reprogramadas a partir de células madre ABCB5(+) aisladas de la divulgación (p. ej., células madre del limbo ABCB5(+) aisladas o células madre de RPE ABCB5(+) aisladas), y las células ABCB5(+) reprogramadas se pueden diferenciar en uno o más tipos celulares deseados. Una "célula madre" como se usa en el presente documento es una célula indiferenciada o parcialmente diferenciada que tiene la capacidad de autorrenovarse y tiene el potencial de desarrollo para diferenciarse en múltiples tipos celulares. Una "célula pluripotente" es una célula con potencial de desarrollo, en diferentes condiciones, para diferenciarse en tipos celulares característicos de las tres capas de células germinales, es decir, endodermo (p. ej., tejido intestinal), mesodermo (incluida la sangre, músculos y vasos) y ectodermo (tal como piel y nervios). Una célula "multipotente" es una célula que tiene el potencial de desarrollo para diferenciarse en células de una o más capas germinales, pero no en las tres. Estas células incluyen, por ejemplo, células madre adultas, tal como, por ejemplo, células madre hematopoyéticas y células madre neurales. Una célula "totipotente" es una célula que tiene el potencial de desarrollo para diferenciarse en todas las células diferenciadas de un organismo, incluidos los tejidos extraembrionarios. Las células madre pueden tener una propensión a un fenotipo diferenciado; sin embargo, estas células pueden inducirse a revertir y volver a expresar el fenotipo de células madre. Este proceso se conoce como "desdiferenciación" o "reprogramación".

Las células madre ABCB5(+) aisladas, las células ABCB5(+) reprogramadas y las células diferenciadas de la divulgación pueden manipularse en condiciones habituales para estos tipos celulares. El tratamiento de las células puede realizarse in vitro, ex vivo o in vivo. Por ejemplo, las células pueden estar presentes en el organismo o en un medio de cultivo. Las manipulaciones se pueden realizar en condiciones de alto o bajo contenido de oxígeno.

Un "medio de cultivo" contiene nutrientes que mantienen la viabilidad celular y apoyan la proliferación. Un medio de cultivo habitual incluye: sales, tampones, aminoácidos, glucosa u otros azúcares, antibióticos, suero o reemplazo de suero y/u otros componentes tales como factores de crecimiento peptídicos. Medios de cultivo celular para su uso en la obtención y mantenimiento de células totipotentes, multipotentes y pluripotentes son conocidos en la técnica. El medio de cultivo también puede incluir factores de crecimiento específicos de las células, tal como la angiogenina, proteína morfogénica ósea 1, proteína morfogénica ósea 2, proteína morfogénica ósea 3, proteína morfogénica ósea 4, proteína morfogénica ósea 5, proteína morfogénica ósea 6, proteína morfogénica ósea 7, proteína morfogénica ósea 8, proteína morfogénica ósea 9, proteína morfogénica ósea 10, proteína morfogénica ósea 11, proteína morfogénica ósea 12, proteína morfogénica ósea 13, proteína morfogénica ósea 14, proteína morfogénica ósea 15, receptor IA de proteína morfogénica ósea, receptor IB de proteína morfogénica ósea, factor neurotrófico derivado del cerebro, factor neutrófico ciliar, receptor alfa del factor neutrófico ciliar, factor quimiotáctico de neutrófilos 1 inducido por citocinas, neutrófilos inducidos por citocinas, factor quimiotáctico 2-alfa, factor quimiotáctico de neutrófilos 2-beta inducido por citocinas, factor de crecimiento de células beta-endoteliales, endotelina 1, factor de crecimiento epidérmico, atrayente de neutrófilos derivado de células epiteliales, factor de crecimiento de fibroblastos 4, factor de crecimiento de fibroblastos 5, factor de crecimiento de fibroblastos 6, factor de crecimiento de fibroblastos 7, factor de crecimiento de fibroblastos 8, factor de crecimiento de fibroblastos b, factor de crecimiento de fibroblastos c, factor de crecimiento de fibroblastos 9, factor de crecimiento de fibroblastos 10, factor de crecimiento de fibroblastos ácido, factor de crecimiento de fibroblastos básico, receptor alfa-1 del factor neurotrófico derivado de la línea de células gliales, receptor alfa-2 del factor neurotrófico derivado de la línea de células gliales, proteína relacionada con el crecimiento, proteína alfa relacionada con el crecimiento, proteína beta relacionada con el crecimiento, proteína gamma relacionada con el crecimiento, factor de crecimiento epidérmico de unión a heparina, factor de crecimiento de hepatocitos, receptor del factor de crecimiento de hepatocitos, factor de crecimiento similar a la insulina I, receptor del factor de crecimiento similar a la insulina, factor de crecimiento similar a la insulina II, proteínas de unión a factor de crecimiento similar a la insulina, factor de crecimiento de queratinocitos, factor inhibidor de la leucemia, receptor alfa del factor inhibidor de la leucemia, factor de crecimiento nervioso, receptor del factor de crecimiento nervioso, neurotrofina-3, neurotrofina-4, factor de crecimiento placentario, factor 2 de crecimiento placentario, factor de crecimiento de células endoteliales derivadas de plaquetas, factor de crecimiento derivado de plaquetas, cadena A del factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor de crecimiento derivado de plaquetas a A, factor de crecimiento derivado de plaquetas AB, cadena B del factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor de crecimiento derivado de plaquetas BB, receptor alfa del factor de crecimiento derivado de plaquetas, receptor beta del factor de crecimiento derivado de plaquetas, factor estimulante del crecimiento de células pre-B, factor de células madre, receptor del factor de células madre, factor de crecimiento transformante alfa, factor de crecimiento transformante beta, factor de crecimiento transformante beta-1, factor de crecimiento transformante beta-1-2, factor de crecimiento transformante beta-2, factor de crecimiento transformante beta-3, factor de crecimiento transformante beta-5, factor de crecimiento transformante latente beta-1, proteína I de unión al factor de crecimiento transformante beta, proteína II de unión al factor de crecimiento transformante beta, proteína III de unión al factor de crecimiento transformante beta, receptor del factor de necrosis tumoral de tipo I, receptor del factor de necrosis tumoral de tipo II, receptor activador del plasminógeno de tipo uroquinasa, factor de crecimiento endotelial vascular y proteínas quiméricas y fragmentos biológica o inmunitariamente activos de los mismos.

El estado de diferenciación de la célula se puede evaluar utilizando cualquier método conocido en la técnica para realizar tales evaluaciones. Por ejemplo, el estado de diferenciación de una célula tratada de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento puede compararse con una célula no tratada o con células tratadas con ADN utilizando vectores víricos para suministrar ADN dando como resultado la expresión de los mismos factores de reprogramación o diferenciación.

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar casos específicos de la práctica de la presente divulgación y no pretenden limitar el alcance de la divulgación. Como será evidente para un experto en la materia, la presente divulgación encontrará aplicación en varias composiciones y métodos.

Ejemplos

Se adquirieron ratones C57BL/6J, NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG), B6; SJL-Tg (ACTFLPe) 9205Dym/J y B6.FVB-Tg (EIIa-cre)C5379Lmgd/J de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Se generaron ratones con el gen Abcb5 desactivado (KO) como se describe a continuación. Todos los animales se mantuvieron de acuerdo con las directrices institucionales del Boston Children's Hospital y el Schepens Eye Research Institute, Harvard Medical School. Se utilizaron ratones de cuatro a doce semanas para los siguientes experimentos.

Ejemplo 1. ABCB5 es un marcador molecular de células madre del limbo (LSC).

Para investigar si ABCB5 es un marcador de células madre del limbo de ciclo lento, que conservan marcadores en el ojo de los mamíferos, se realizaron experimentos de "pulso y persecución" in vivo basados en BrdU [2], en los que se sometieron ratones Abcb5 de tipo silvestre (TS) durante un período de 9 días a la administración sistémica diaria de BrdU para marcar las células de ciclo lento (pulso), seguido de un período sin BrdU de 8 semanas (persecución) antes de la evaluación de la conservación del marcador de células madre del limbo (figura 5A). El análisis de citometría de flujo de células epiteliales corneales y del limbo murinas disociadas puso de manifiesto que las células que conservan el marcador BrdU son detectables en el limbo, pero no en la córnea central (figura 1B y figura 5B). La tinción inmunohistoquímica con BrdU de las córneas murinas de espesor total confirmó que las células madre del limbo (LSC) que conservan el marcador, de manera coherente con los hallazgos anteriores [2], se localizan en la capa basal del epitelio del limbo murino (figura 1C). Por otra parte, las LSC que conservan el marcador expresan ABCB5 (figura 1C). La cuantificación por citometría de flujo confirmó que las células ABCB5(+) eran predominantemente BrdU positivas (90,5 ± 0,5 %, media ± e.e.m.), comprendiendo las células ABCB5/BrdU doble positivas el 1,8 % de todas las células epiteliales del limbo 4 (figura 1D).

De manera similar a los hallazgos en ratones, las células ABCB5(+) humanas también se localizaron en la capa basal del epitelio del limbo (figura 1E y figura 6), y el análisis inmunohistoquímico puso de manifiesto que las células ABCB5(+) expresaron de manera conjunta el marcador de células madre del limbo ANp63a (figuras 1F y 1G), ausencia de expresión del marcador de diferenciación corneal KRT12 (figura 1H). La citometría de flujo también puso de manifiesto que las células ABCB5(+), pero no las células ABCB5(-), expresaban niveles significativos de ANp63a (28,9 ± 5,7 % y 0,1 ± 0,1 %, respectivamente, P = 0,0364) (figura 1G) y mostró que esencialmente todas las LSC ANp63a(+) expresaban ABCB5 LSC (ANp63a(+): 95,3 ± 4,8%, células ANp63a(-): 3,6 ± 2,1 %, P=0,0032). Asimismo, los pacientes humanos con deficiencia de células madre del limbo (LSCD) mostraron frecuencias ABCB5(+) significativamente reducidas en comparación con donantes sanos (2,8 ± 1,6 % y 20,0 ± 2,6 %, respectivamente, P < 0.0001) (figura 1I, figuras 7 y 8, Tabla 1).

La expresión de ABCB5 en células madre del limbo que conservan el marcador en ratones Abcb5 TS y en LSC ANp63a(+) en seres humanos sanos, y el hallazgo concurrente de reducción de la frecuencia de células ABCB5(+) en pacientes clínicos con LSCD, mostró que ABCB5 marca las LSC.

Ejemplo 2. ABCB5 regula el desarrollo y la regeneración de la córnea.

Para investigar un posible papel funcional de las LSC ABCB5(+) en el desarrollo y la regeneración de la córnea, se generaron ratones Abcb5 KO portadores de una eliminación del exón 10 del gen Abcb5 murino (GenBank JQ655148). El exón 10 del gen Abcb5 murino codifica un dominio extracelular funcionalmente crítico de la molécula homóloga a los restos de aminoácidos 493-508 asociados al bucle extracelular de ABCB5 humana (GenBank NM_178559).

En primer lugar, se generó una construcción de direccionamiento de desactivación génica condicional mediante ingeniería de recombinación (es decir, ingeniería genética mediada por recombinación) [25]. Brevemente, se insertó un casete de resistencia a neomicina flanqueado por dos sitios loxP (basados en el plásmido pL-452) en el clon RP23-161L22 de BAC 458 pares de bases cadena arriba del exón 10 del gen Abcb5 murino (número de acceso de GenBank JQ655148) (figuras. 2A y 2B). La región dirigida del clon de BAC se recuperó mediante reparación de huecos en el plásmido pL-253. El plásmido recuperado contenía 6006 pares de bases cadena arriba del exón 10 (sin incluir el casete neo insertado) y 6384 pares de bases cadena abajo del exón 10. El casete de resistencia a neomicina se escindió mediante inducción de Cre recombinasa por arabinosa para dejar un único sitio loxP cadena arriba del exón 10. Se insertó un casete de resistencia a neomicina flanqueado por dos sitios FRT y un sitio loxP (basándose en el plásmido pL-451) 460 pares de bases cadena abajo del exón 10 para completar la construcción de direccionamiento. El plásmido de direccionamiento se verificó mediante secuenciación de ADN y mapeo de restricción. El plásmido linealizado se transfectó en células madre embrionarias (ES) TC1 (derivadas de 129S6/SvEvTac) y se seleccionó en G418 (Sigma-Aldrich, MO) y fialuridina (Moravek Biochemicals, CA). Las colonias resistentes se expandieron y se analizaron mediante PCR de largo alcance para identificar clones dirigidos [22]. El brazo izquierdo se amplificó con los cebadores 5'-GTTGAGGGGAGCAGCCAGAGCAAGGTGAGAAAGGTG-3'(SEQ ID NO: 1) y 5'-TTAAGGGTTATTGAATATGATCGGAATTGGGCTGCAGGAATT-3' (SEQ ID NO: 2) que producen un producto de PCR de 6250 pares de bases (figura 2B). El brazo derecho se amplificó con los cebadores 5'-TGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGAT-3'(SEQ ID NO: 3) y 5'-CTGGTCCCTCTCCTGTGATCTACACAGGCC-3' (SEQ ID NO: 4) que producen un producto de PCR de 6384 pares de bases (figura 2B). Se identificaron dos clones de ES dirigidos a Abcb5. Estos clones se expandieron e inyectaron en blastocistos C57BL/6 que después se transfirieron al útero de hembras pseudopreñadas. Se criaron ratones macho quiméricos de alto porcentaje (Abcb5neo-loxP/ts) en un fondo C57BL/6 para obtener transmisión a la línea germinal. La transmisión a la línea germinal del alelo Abcb5neo-loxP se confirmó mediante análisis de PCR de ADN genómico utilizando los cebadores 5'-GGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGG-3' (SEQ ID NO: 5), 5'-GGCTGGGGCAACTGAAAAGTAGCAT-3' (SEQ ID NO: 6), y 5'-TTTCAGCTTCAGTTTATCACAATGTGGGTT-3' (SEQ ID NO: 7) diseñados para amplificar el alelo dirigido de 385 pares de bases y el alelo TS de 284 pares de bases. A continuación de cruzaron ratones heterocigotos Abcb5neo-loxP con ratones transgénicos hACTB-FLPe [26] para eliminar el casete de resistencia a neomicina. Se realizó un análisis de PCR del ADN genómico para confirmar la eliminación del casete de resistencia a neomicina en el genoma de ratones Abcb5loxP/ts utilizando los cebadores 5'-ACTTGGTGCGGTGACTCTGAATTTTGC-3' (SEQ ID NO: 8) y 5'-TAGCAACATTTCTGGCATTTTAGGCTG-3' (SEQ ID NO: 9) diseñados para amplificar un alelo con casete de resistencia a neomicina eliminado de 494 pares de bases y un alelo TS de 390 pares de bases. La anulación de la expresión de la proteína ABCB5 en animales Abcb5 KO se determinaron mediante transferencias Western de tejidos murinos (figura 2C). Los lisados de células Abcb5 TS y Abcb5 KO se inmunotransfirieron usando anticuerpo monoclonal de ABCB53C2-1D12 [6,27] (5,5 |jg/ml) o anticuerpo policlonal contra a-tubulina de conejo (dilución 1:5000) (Abcam, MA). Después del tratamiento con anticuerpos secundarios específicos conjugados con HRP (dilución 1:5000) (Jackson ImmunoResearch, PA), las señales se visualizaron en una película mediante quimioluminiscencia potenciada.

Para determinar el resultado de una pérdida completa de la función de ABCB5, se eliminó el exón 10 del gen Abcb5 murino por apareamiento de ratones Abcb5loxP con ratones ElIa-Cre, que expresan Cre recombinasa en la etapa de cigoto [14,15] (figura 2B). La eliminación de la región genómica entre los dos sitios loxP se confirmó mediante análisis de PCR de ADN genómico utilizando los cebadores 5'-GGCTGGGGCAACTGAAAAGTAGCAT-3' (SEQ ID NO: 10), 5'-GCAAATGTGTACTCTGCGCTTATTTAATG-3' (SEQ ID NO: 11) y 5'-TGGTGCAGACTACAGACGTCAGTGG-3' (SEQ ID NO: 12) diseñados para amplificar un alelo con eliminación de cre de 322 pares de bases (nulo) y un alelo TS de 113 pares de bases (figura 2C). Se cruzaron ratones heterocigotos Abcb5nulo/TS con la eliminación del exón 10 en la línea germinal para producir mutantes homocigotos. Abcb5nulo/nul° (ratones Abcb5 KO). Los ratones se mantuvieron en un fondo genético mixto 129S6/SvEvTac/C57BL/6, y se utilizaron compañeros de camada como controles para los análisis experimentales.

Los ratones Abcb5 KO nacieron vivos y parecían indistinguibles de sus compañeros de camada TS al nacer tras el examen físico, sin grandes defectos anatómicos de córneas Abcb5 KO detectables mediante examen con lámpara de hendidura (figura 2D). Sin embargo, el análisis histológico de las córneas mutantes demostró profundas anomalías del desarrollo caracterizadas por el aplanamiento del epitelio corneal en comparación con los controles TS, con un número de células epiteliales significativamente reducido en la córnea central, pero no en el limbo, como lo demuestra la tinción con hematoxilina y eosina (H&E), tinción con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) y la citometría de flujo (córnea central: 2688 ± 399 células y 4427 ± 346 células, respectivamente, P=0,0165; limbo: 3015 ± 433 células y 3629 ± 94 células, respectivamente, P = 0,2377) (figura 2D y figura 9). Las córneas Abcb5 KO también mostraron graves defectos epiteliales de unión estrecha según lo determinado por tinción con biotina LC (figura 2E), y los ratones mutantes mostraron una disminución significativa de la expresión de PAX6 corneal y del limbo y KRT12 corneal en comparación con los ratones TS (PAX6 del limbo: 0,3 ± 0,3 % y 18,0 ± 4,6 %, respectivamente, P= 0.0181; PAX6 corneal: 8,3 ± 4,6 % y 42,0 ± 7,6 %, respectivamente, P= 0.0192; KRT12 corneal: 6,5 ± 6,5 % y 47,7 ± 8,2 %, respectivamente, P = 0,0382) (figura 2E, figura 10), lo que demuestra un nuevo papel esencial de ABCB5 en el desarrollo corneal normal.

Ejemplo 3. ABCB5 regula la quiescencia de las células madre del limbo.

Para determinar si la regeneración corneal depende de la función de ABCB5 intacta, se sometieron ratones Abcb5 KO y TS a una lesión por desbridamiento del epitelio corneal central seguida de la evaluación de la regeneración corneal (figuras 11A-11D). Después de la anestesia con inyección intraperitoneal de ketamina (120 mg/kg de peso corporal, Hospira, IL) y xilacina (10 mg/kg de peso corporal, Burns Veterinary Supply, Nueva York), seguida de la aplicación tópica de una gota de gotas oftálmicas de proparacaína al 0,5 % (Akorn, IL) en cada ojo, se generó una herida epitelial de 2 mm de diámetro delimitando un área de la córnea central con una trefina de 2 mm y retirando el epitelio dentro del círculo con un pequeño bisturí, dejando intacta la membrana basal. En cada animal, el procedimiento se realizó en el ojo derecho. Se aplicó pomada oftálmica Ak-Spore (bacitracina de zinc, sulfato de neomicina y sulfato de polimixina B, Akorn, IL) a ambos ojos inmediatamente después de la herida y después dos veces al día durante las siguientes 48 horas para prevenir la infección y la sequedad de la córnea. La analgesia se proporcionó mediante inyecciones subcutáneas de Buprenex (Reckitt Benckiser Pharmaceuticals, Berkshire, 30 Reino Unido) cada 12 horas durante 48 horas después de la operación a la dosis de 1 mg/kg. La cicatrización de la herida se controló como se describe anteriormente [29]. Los animales se sacrificaron a las 48 horas postoperatorias y se evaluó la integridad de las uniones estrechas del epitelio corneal utilizando el método de tinción con LC-Biotina realizado como se describe [31]. Brevemente, se aplicó solución de tinción con LC-biotina preparada disolviendo 1 mg/ml de EZ-Link-Sulfo-NHS-LC-Biotina (Pierce, IL) en HBSS (solución salina equilibrada de Hank, Lonza, MD) más MgCh 2 mM y CaCh 1 mM a los ojos con herida y sin herida durante 15 minutos en el momento del sacrificio. Los ojos se enjuagaron con PBS (Lonza, MD), se enuclearon y se colocaron en Tissue-Teck OCT (Sakura Finetek, CA) para corte congelado.

Si bien no se observaron diferencias significativas en la velocidad de cierre de heridas entre ratones Abcb5 TS y Abcb5 KO (figuras 11C y 11D), el análisis histológico puso de manifiesto una restauración corneal gravemente anómala en ratones Abcb5 KO, en comparación con los ratones Abcb5 TS, caracterizada por una apariencia muy irregular del epitelio con un número reducido de células epiteliales (403,3 ± 29,7 y 737,2 ± 28,2, respectivamente, P < 0,0001) (figura 2F y figura 12), proliferación celular significativamente aumentada como se demuestra por la expresión potenciada de Ki67 (limbo: 54,0 ± 5,0 % y 0,3 ± 0,2 %, respectivamente, P < 0,0001; córnea: 41,2 ± 12,8 % y 1,0 ± 0,5 %, respectivamente, P = 0,0257) (figura 2G), y tasas de apoptosis significativamente potenciadas como se demuestra por la tinción TUNEL (limbo: 41,2 ± 12,8 % y 1,0 ± 0,5 %, respectivamente, P=0,001; córnea: 49,0 ± 1,0 % y 0,4 ± 0,3 %, respectivamente, P < 0,0001) (figura 2H y figura 13).

El pulso-persecución del marcado con BrdU (figura 5A y 5B) y el análisis de citometría de flujo de células epiteliales del limbo murinas disociadas pusieron de manifiesto que después de un periodo de persecución temprano de 1 semana, no existía una diferencia significativa entre el número de células epiteliales marcadas con BrdU en muestras derivadas de Abcb5 KO y Abcb5 TS, siendo indicativo de una absorción por igual de BrdU por las células del limbo Abcb5 KO y Abcb5 TS (1,9 ± 0,7 % y 1,5 ± 0,4 %, respectivamente, P=0,6971). Por el contrario, después de un período de persecución de 8 semanas, la frecuencia de LSC que conservan el marcador se redujo notable y significativamente (en un 89 %) en ratones Abcb5 KO, en comparación con los controles Abcb5 TS (frecuencia: 0,1 ± 0,1 % y 0,9 ± 0,3 %, respectivamente P = 0,0152) (figuras 3A y 3B), lo que demuestra que la anulación de la función de ABCB5 induce la proliferación celular de LSC normalmente quiescentes. De manera coherente con este resultado, la expresión de Ki67, indicativa de proliferación celular, estaba significativamente potenciada en córneas Abcb5 KO, en comparación con córneas Abcb5 TS de control (limbo: 24,0 ± 5,0 % y 1,5 ± 1,5 %, respectivamente, P < 0,0001; córnea: 53,0 ± 16,0 % frente a 11,0 ± 2,1 %, P = 0,0297) (figura 3C). Por otra parte, de manera coherente con el aumento demostrado de la proliferación, el análisis por PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) de la expresión de ARN puso de manifiesto una regulación negativa significativa en las células epiteliales corneales Abcb5 KO de la familia p53 (p53 y p63) y la familia Cip/Kip (p21 y p27) de reguladores del ciclo celular, que controlan el punto de control del ciclo celular G0/G1 y la quiescencia celular, en comparación con los controles Ts (41,6 ± 16,4 % de p53 TS, P=0,0377; 31,2 ± 13,8 % de p63 TS, P=0,0155; 37,2 ± 13,8% de p21 TS, P=0,0197; 36,8 ± 7,0 % de p27 TS, P = 0,0029) (figura 3D). Por tanto, se necesita ABCB5 para el mantenimiento de LSC de ciclo lento. Debido a que la retirada del ciclo celular es un requisito previo para el mantenimiento de LSC y, por lo tanto, para la diferenciación normal, estos resultados proporcionan una explicación del defecto de diferenciación corneal observado en ratones Abcb5 KO (figura 3E).

Ejemplo 4. Papel regenerador de las células madre del limbo ABCB5(+) en el tratamiento de la deficiencia de células madre del limbo.

Para investigar si ABCB5 representa un marcador molecular para el enriquecimiento esperado de las células madre del limbo dentro de los injertos para mejorar los resultados de trasplantes, se examinó el potencial de regeneración de la córnea de las células epiteliales del limbo trasplantadas. (figuras 14A y 14B y figuras 15A-15C). Se trasplantaron células epiteliales del limbo de donantes murinos a los ojos de ratones receptores singénicos C57BL/6J con una deficiencia inducida de células madre del limbo (LSCD). Se trasplantaron células epiteliales del limbo de donantes humanos a los ojos de ratones NOD.Cg- PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) inmunodeficientes con una deficiencia inducida de células madre del limbo. Se realizaron cuatro tipos de trasplantes de donantes: (i) células epiteliales del limbo ABCB5(+), (ii) células epiteliales del limbo ABCB5(-), (iii) células epiteliales del limbo sin separar, y (iv) injertos que no contienen células (únicamente portador de gel de fibrina) (500 células en vehículo/injerto de gel de fibrina, 1 injerto de ojo unilateral/ratón, n = 5 ratones/grupo de tratamiento) (Tabla 2).

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Tres días antes del trasplante, se sembraron células de donantes murinos y humanos en un portador de fibrina, que se preparó disolviendo soluciones madre de fibrinógeno y trombina (TISSUCOL-Kit Immuno, Baxter, Alemania) en NaCl al 1,1 % y CaCl2 1 mM hasta una concentración final de 10 mg/ml de fibrinógeno y 3 UI/ml de trombina como se describe [30]. El día del trasplante, se indujo LSCD total en ratones receptores anestesiados mediante la eliminación del epitelio corneal y del limbo con un eliminador de anillos de óxido corneal Algerbrush II con una fresa de 0,5 mm (AMBLER Surgical, PA) [16]. Después de la inducción de LSCD, los ratones receptores recibieron trasplantes basados en portador de gel de fibrina que se aseguraron mediante cuatro suturas. Los párpados se suturaron con suturas de nailon 8-0 para mantener los ojos cerrados. Se aplicó pomada oftálmica Ak-Spore (bacitracina de zinc, sulfato de neomicina y sulfato de polimixina B, Akorn, IL) en ambos ojos inmediatamente después de la herida y después dos veces al día durante las siguientes 48 horas para prevenir la infección y la sequedad de la córnea. La analgesia se proporcionó mediante inyecciones subcutáneas de 5-10 mg/kg de metacam (Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, CT), administrado de manera preoperatoria y mediante inyecciones subcutáneas de 0,05 - 0,1 mg/kg de buprenex (Reckitt Benckiser Pharmaceuticals, Berkshire, Reino Unido) cada 12 horas durante las 24 horas postoperatorias. Además, después de la recuperación quirúrgica, los ratones también se trataron con gotas oftálmicas antiinflamatorias Inflanefran Forte (Allergan, MA) durante los primeros 5 días, y después con gotas oftálmicas de avastin al 1 % (Bevacizumab, Genentech, CA) diariamente durante 5 días. El examen con lámpara de hendidura se realizó semanalmente hasta el sacrificio. Los ojos se enuclearon después de la muerte y se fijaron en formalina tamponada al 10 % para embeberlos en metacrilato (Technovit, Heraeus Kulzer, Alemania) o se congelaron instantáneamente en Tissue-Teck OCT (Sakura Finetek, CA).

Los receptores de injertos singénicos de células del limbo Abcb5 (-) murinas o los controles negativos únicamente con vehículo mostraron córneas opacas, conjuntivalización epitelial con infiltración de células caliciformes y ausencia de células KRT12(+) diferenciadas (0 %, respectivamente) cuando se analizaron 5 semanas después del trasplante, de manera coherente con LSCD persistente (figura 4A, figura 16). Los receptores de injertos singénicos que contenían células del limbo sin separar mostraron una restauración corneal parcial con células KRT12(+) diferenciadas detectables en la córnea central (17% de las células, significativamente potenciadas en comparación con los regímenes de tratamiento con Abcb5(-) o únicamente con vehículo, P <0,01), pero mostraron persistencia de células caliciformes características de LSCD y conjuntivalización epitelial (figura 4A, figura 16). Por el contrario, los injertos de células del limbo ABCB5(+) singénicos dieron como resultado el desarrollo de córneas claras con histología normal en ratones receptores, dieron lugar a un mayor número de células epiteliales corneales KRT12(+) diferenciadas (47 % de las células, aumentaron significativamente en comparación con los regímenes de tratamiento de células del limbo sin separar o ABCB5(-) o en comparación con controles de vehículo solo, P <0,001) y evitaron la formación de células caliciformes o la conjuntivalización epitelial (figura 4A, figura 16).

Los receptores NSG inmunocomprometidos de injertos de células del limbo ABCB5(-) humanas recién aisladas o de controles negativos con vehículo solo también mostraron conjuntivalización epitelial y ausencia de células KRT12(+) diferenciadas (0 %, respectivamente) 5 semanas después del trasplante, de manera coherente con LSCD persistente (figura 4B, figuras 17 y 18). Los receptores NSG inmunocomprometidos de injertos de células del limbo humanas sin separar recién aisladas, de manera similar a los hallazgos en experimentos de trasplante de células del limbo sin separar murinas, presentaron una restauración corneal parcial con capacidad de detección de células KRT12(+) diferenciadas en la córnea central (12 % de las células, significativamente potenciadas frente a regímenes de tratamiento con ABCB5(-) o con vehículo solo, P <0,01), pero mostraron persistencia de la conjuntivalización epitelial característica de LSCD (figura 4B, figura 17). Sorprendentemente, solamente los injertos de células del limbo ABCB5(+) humanas recién aislados dieron como resultado el desarrollo de córneas claras con histología normal en ratones NSG receptores con presencia de una capa epitelial estratificada que contiene un alto número de células KRT12+ (31 % de las células, aumento significativo en comparación con regímenes de tratamiento con vehículo solo o en comparación con ABCB5(-) o con células del limbo sin separar, P <0,001) y ausencia de conjuntivalización epitelial característica de LSCD (figura 4B, figura 17).

Con el fin de confirmar que las células de donantes humanos habían provocado la restauración de la córnea en este modelo de xenotrasplante, el tejido corneal regenerado se analizó mediante RT-PCR para determinar la expresión de p2 microglobulina (p2M) específica de seres humanos, un identificador de todas las células de origen humano, y para determinar la expresión de PAX6 y KRT12 específicos de seres humanos como marcadores de diferenciación corneal. Solamente el epitelio corneal de los receptores injertados con células del limbo ABCB5(+) o sin separar humanas contenían transcritos de @2M, PAX6 y KRT12, mientras que los ojos de control injertados con vehículo solo que no mostraron restauración corneal no, confirmando la especificidad humana del sistema de ensayo de RT-PCR (figura 4B). Por otra parte, a pesar de una viabilidad similar en ABCB5(-) en comparación con los injertos de células sin separar o ABCB5(+) (Tabla 2, figuras 15A-15C), los ojos injertados con células ABCB5(-) eran deficientes en la expresión de los transcritos de @2M, PAX6 o KRT12 específicos de seres humanos (figura 4B), indicando que la capacidad de injerto a largo plazo se encuentra exclusivamente dentro de la población de células del limbo ABCB5(+) humanas.

Los ejemplos proporcionados en el presente documento demuestran que la frecuencia de las células ABCB5(+) se reduce en la deficiencia de células madre del limbo (LSCD), que la positividad de ABCB5 caracteriza preferentemente poblaciones de ciclo lento y Anp63a positivas enriquecidas con células madre del limbo (LSC), y que las células del limbo ABCB5(+) aisladas de forma esperada son exclusivamente capaces de revertir la LSCD, lo que indica que la positividad de ABCB5 define las LSC. Estos hallazgos están respaldados por datos que demuestran que la pérdida de función de ABCB5 en ratones con el gen Abcb5 desactivado (KO) causan LSCD y deterioran el desarrollo y la regeneración corneal dependiente de las LSC, mediante la anulación de la capacidad de autorrenovación de las LSC. Estos resultados tienen varias implicaciones importantes.

En primer lugar, el enriquecimiento exitoso de las LSC humanas tiene el potencial de avanzar de manera decisiva en el campo de la terapia de LSCD, porque se ha demostrado que el éxito clínico a largo plazo depende de la frecuencia de las células madre del limbo dentro de los injertos [5] y porque, antes de la presente divulgación, no se dispone de ningún marcador para el enriquecimiento esperado de células madre del limbo. De hecho, estos ejemplos muestran que el enriquecimiento esperado de células madre del limbo dentro de los injertos puede potenciar significativamente el éxito terapéutico de la LSCD. La expresión de ABCB5 en la superficie de las células madre del limbo permite estrategias de clasificación de células basadas en anticuerpos monoclonales y un enriquecimiento significativo de las células madre del limbo, como se demuestra en el presente documento, a diferencia de Anp63a o marcadores alternativos de células madre del limbo candidatos expresados intracelularmente [17] que no se han empleado con éxito para el aislamiento esperado de LSC capaces de reversión de la LSCD. Esto subraya la promesa de ABCB5 como un posible marcador para el aislamiento de células madre del limbo, así como para el trasplante clínico de células madre del limbo.

En segundo lugar, los datos proporcionados en el presente documento ponen de manifiesto un papel fisiológico in vivo novedoso de ABCB5 en el mantenimiento de la quiescencia de las células madre. Específicamente, la anulación de la función de ABCB5 en ratones Abcb5 KO recién generados dio como resultado la pérdida de LSC de ciclo lento con expresión inhibida de moléculas que regulan la progresión del ciclo celular G0/G1, incluyendo el marcador de células madre del limbo ANp63a. Esto explica la expresión conjunta observada de ABCB5 con ANp63a por las LSC normalmente quiescentes, y proporciona una explicación de la inducción de la proliferación de células madre del limbo y la apoptosis asociada con la reducción de células diferenciadas observadas en córneas Abcb5 KO, porque la capacidad de una célula para abandonar el ciclo celular es fundamental tanto para la conservación del conjunto de células madre como para la diferenciación normal.

Materiales y métodos adicionales:

Experimentos de pulso y persecución de BrdU. Se sometieron ratones de cuatro semanas de edad Abcb5 KO ratones y sus compañeros de camada Abcb5 TS a inyecciones intraperitoneales diarias de 50 mg/kg de bromodesoxiuridina (BrdU, BD Pharmingen, CA) durante 9 días consecutivos (figura 5A). Las células epiteliales de la córnea y del limbo aisladas de los ratones Abcb5 TS y Abcb5 KO sacrificados bien una semana u ocho semanas después de recibir la última inyección de BrdU se analizaron mediante citometría de flujo e inmunofluorescencia. Se utilizaron como controles experimentales células epiteliales del limbo y de la córnea central de compañeros de camada Abcb5 TS y Abcb5 KO. Se utilizó citometría de flujo y tinción inmunohistoquímica para determinar la frecuencia de células BrdU positivas y BrdU negativas dentro del epitelio del limbo y de la córnea central.

Aislamiento de queratocitos humanos y murinos. Los tejidos corneoesclerales humanos de cadáveres derivados de donantes consentidos se obtuvieron de Heartland Lions Eye Banks (Kansas City, MO), Bascom Palmer Eye Institute (Miami, FL) y Carver College of Medicine (lowa City, IA). Después de la extracción del borde escleral, del iris y de la malla trabecular, el limbo y la córnea central se diseccionaron al microscopio. Los tejidos del limbo y de la córnea central se incubaron posteriormente con 2,4 unidades/ml de Dispase II (Roche Diagnostics, IN) a 37 °C durante 1 hora, seguida de incubación con EDTA 0,5 M (Invitrogen, CA) a 37 °C durante diez ciclos de 5 minutos para recuperar las células epiteliales [22,23]. Las células epiteliales del limbo y de la córnea murinas se obtuvieron de ratones Abcb5 KO y Abcb5 TS de la siguiente manera. Inmediatamente después del sacrificio mediante narcosis con CO2 y posterior enucleación ocular, los tejidos del limbo y de la córnea central se retiraron con microtijeras bajo un microscopio de disección, se colocaron en medio sin suero de queratinocitos con bajo contenido en Ca2+ (KSFM, Invitrogen, CA) y se centrifugaron durante 5 min a 250 g a 4 °C. Después de eliminar el sobrenadante, los sedimentos de tejido se digirieron en solución de tripsina al 0,5 % (Lonza, MD) [24]. Para experimentos de trasplante, se aislaron células epiteliales del limbo ABCB5(+) y ABCB5(-) mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) utilizando marcado con anticuerpos monoclonales (mAb) contra ABCB5 [18]. Brevemente, se marcaron células epiteliales del limbo humana o murina con mAb contra ABCB5 primario (20 pg/pl) durante 30 minutos a 4 °C, se lavaron para eliminar el exceso de anticuerpo, seguido de una incubación de 30 minutos con anti-IgG de ratón secundario conjugado con FITC. Las ventanas de visualización de ABCB5(+) y ABCB5(-) se establecieron en un clasificador de células Modified Digital Vantage (Becton Dickinson y MGH Pathology Flow Citometry Core, Simches Research Building, Boston) como se muestra en las figuras 15A-15C. Solamente se seleccionaron células viables para clasificar excluyendo todas las células DAPI(+) (1 pg/ml de DAPI, Sigma-Aldrich, MO, añadido inmediatamente antes de la clasificación) como se identifica utilizando un láser UV de 70 MW para la excitación. La pureza y viabilidad de las células ABCB5(+) y ABCB5(-) clasificadas se establecieron en análisis representativos posteriores a la clasificación en los que se volvieron a analizar las muestras (figuras 15A-15C). La purificación de células ABCB5(+) dio como resultado un aumento de 255 veces para las células del limbo ABCB5(+) murinas (0,37 % de positividad antes y 51 % de positividad después de la clasificación, Tabla 2) y un aumento de 292 veces para las células del limbo ABCB5(+) humanas (0,03 % de positividad antes y 59 % de positividad después de la clasificación, Tabla 2). El enriquecimiento de células ABCB5(-) dio como resultado una ausencia completa de células ABCB5(+) en muestras de ratón y humanas (Tabla 2).

Análisis de citometría de flujo. La citometría de flujo de dos colores se utilizó para determinar si las células epiteliales del limbo ABCB5(+) humanas expresaban conjuntamente ANp63a o KRT12 y si las células epiteliales del limbo ABCB5(+) murinas expresaban conjuntamente PAX6 y KRT12, y se realizó como se describe anteriormente [18]. Para el análisis de expresión conjunta de ABCB5 y KRT12 humanas y murinas, las células se incubaron primero con mAb anti-ABCB5 de ratón, contratiñeron con anti-IgG de ratón con FITC de cabra, seguido de incubación con anticuerpo policlonal anti-KRT12 de cabra y contratinción con anti-IgG de cabra de burro Dylight 649. Para los análisis de expresión conjunta de ABCB5 y ANp63a humanas y el de expresión conjunta de ABCB5 y PAX6 murinas, las células se incubaron con mAb anti-ABCB5 de ratón, contratiñeron con anti-IgG de ratón con FITC de cabra, permeabilizaron en tampón BD Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, CA), se tiñeron con Ab contra ANp63a o PAX6 y se contratiñeron con anti-IgG de conejo con Alexa 647 de cabra. Las etapas de lavado con tampón de tinción o tampón BD Perm/Wash (BD Biosciences, CA) se realizaron entre cada etapa. La citometría de flujo de dos colores se realizó mediante la adquisición de la emisión de fluorescencia en los espectros Fl1 (FITC) y Fl4 (Alexa 647 y/o Dylight 649) en un FACScan de Becton Dickinson (Becton Dickinson, NJ), como se describe [18]. El análisis de expresión conjunta ABCB5 murina y BrdU se realizó utilizando el kit FITC BrdU Flow (BD Biosciences, CA), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las diferencias estadísticas entre los niveles de expresión de los marcadores enumerados anteriormente por células ABCB5(+) y ABCB5(-) se determinaron utilizando la prueba t para datos no apareados. Se consideró significativo un valor de P bilateral de P < 0,05.

RT-PCR y PCR cuantitativa en tiempo real. Para los análisis de expresión génica del ciclo celular, el ARN total se aisló de córneas Abcb5 KO y Abcb5TS utilizando un kit de aislamiento de ARN de grado RT2 qPCR y después se transcribió de forma inversa utilizando un kit RT2 First Strand para PCR con transcriptasa inversa de acuerdo con el protocolo del fabricante (SABiosciences, CA). Las muestras se analizaron utilizando mezclas maestras de qPCR SYBR Green (SABiosciences, CA), matrices de ciclo celular murino (número de catálogo PAMM-020Z, SABiosciences, CA) y PCR cinética (detector de secuencias ABI 7700; Applied Biosystems, CA), como se describe [28]. Todas las cuantificaciones se normalizaron a los genes de control endógenos gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) y p-actina, para tener en cuenta la variabilidad en la concentración inicial y la calidad del ARN total y la eficacia de la reacción de transcripción inversa. Se determinaron diferencias estadísticas en los niveles de expresión génica entre ratones Abcb5 KO y Abcb5 TS utilizando la prueba t de una muestra. Se consideró significativo un valor de P bilateral de P < 0,05. Para la detección de transcritos de genes específicos para seres humanos, se aisló el ARN total de ojos murinos trasplantados y córneas de control murinas o humanas no dañadas utilizando el kit de aislamiento RNAeasy Plus (Qiagen, CA) y después se transcribió utilizando el kit High Fidelity RT (Applied Biosystems, CA). La PCR se realizó utilizando la mezcla maestra Taq 2X (New England Biolabs, MA) y los siguientes cebadores específicos de genes: p2-microglobulina humana (B2M, NM_004048): Directo 5'-GTGTCTGGGTTTCATCCATC-3' (SEQ ID NO:13), Inverso 5'-AATGCGGCATCTTCAACCTC-3' (SEQ ID NO:14); caja 6 pareada humana (PAX6, NM_000280.3): Directo 5'-CAGCGCTCTGCCGCCTAT-3' (SEQ ID NO:15), Inverso 5'-CATGACCAACACAGATCAAACATCC-3' (SEQ ID NO:16); queratina 12 humana (KRT12, NM_000223.3): Directo 5'-GAAGCCGAGGGCGATTACTG-3' (SEQ ID NO:17), Inverso 5'-GTGCTTGTGATTTGGAGTCTGTCAC-3' (SEQ ID NO:18); y p-actina murina (Actb, NM_007393): Directo 5'-TCCTAGCACCATGAAGATC-3' (SEQ ID NO:19), Inverso 5'-AAACGCAGCTCAGTAACAG-3' (SEQ ID NO:20).

Histopatología y tinción inmunohistoquímica. Para recuperar tejido ocular de ratón intacto, toda la cabeza de ratón decapitada se fijó en paraformaldehído (PFA) al 4 % durante la noche, después se enuclearon los ojos con los párpados fijados, se incubaron en sacarosa al 30 % en solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x durante la noche a 4 °C, se embebieron en el compuesto Tissue-Tek OCT (Sakura Finetek USA, CA) y se congelaron instantáneamente. Se tiñeron secciones de criostato representativas de cada bloque de tejido teñido con hematoxilina y eosina (H&E). Para la tinción por inmunofluorescencia, se fijaron secciones de criostato (10 pm) en metanol frío durante 10 minutos, se bloquearon en suero secundario al 10 % albúmina de suero bovino al 2 % (BSA) en PBS 1x durante 1 hora, se incubaron con el anticuerpo primario (o control de isotipo), seguido del anticuerpo secundario apropiado durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de varios lavados, los portaobjetos se cubrieron después con un cubreobjetos en un medio de montaje endurecido con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). La tinción con BrdU se realizó utilizando el kit BrdU In-situ (BD Pharmingen, CA) seguido de la tinción con anticuerpo contra ABCB5 de conejo a una dilución de 1:250 (NBP1-50547, Novus, CO). La tinción TUNEL se realizó utilizando el kit de muerte celular In Situ Cell Death (Roche, IN) y se usó DAPI (Invitrogen, MA) para teñir todas las células nucleadas. Todas las secciones de tejido se analizaron utilizando un microscopio de inmunofluorescencia Nikon Eclipse E800. Las fotografías compuestas de la córnea se ensamblaron utilizando Photoshop (Adobe) para superponer y hacer coincidir imágenes secuenciales. La unión se realizó reduciendo la fotografía añadida al 50 % de transparencia, haciendo coincidir las imágenes y devolviendo la fotografía compuesta al 0 % de transparencia. El número medio de células epiteliales por córnea (figura 2D) se determinó contando el número de células DAPI positivas dentro del área definida por un trefina de 2 mm en una fotografía compuesta de una sección de córnea completa. Se analizaron al menos tres secciones de córnea compuestas por ratón, y se analizaron cinco ratones por grupo en cuatro experimentos repetidos. Los porcentajes de células epiteliales que expresan Ki67 (figuras 2I y 3C), TUNEL (figura 2I) y KRT12 (figuras 4A y 4B) se determinaron contando el número de células positivas entre el número total de células epiteliales corneales DAPI positivas utilizando las técnicas descritas en el presente documento. Las comparaciones entre los ratones Abcb5 TS y Abcb5 KO se realizaron utilizando la prueba t para datos no apareados. Los resultados de los experimentos de trasplante se compararon utilizando ANOVA unidireccional seguido de pruebas posteriores de Bonferroni. Las diferencias con valores de P < 0,05 se consideraron estadísticamente significativas.

Anticuerpos. Se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios en experimentos de citometría de flujo: anticuerpo policlonal anti-ANp63a de conejo (clonH-129, Santa Cruz, CA), anticuerpo monoclonal anti-ABCB5 de ratón (clon 3C2-2D12) [6], anticuerpo policlonal anticitoqueratínico de cabra (clon L15, Santa Cruz, CA), anticuerpo policlonal antiPAX6 de conejo (Covance, CA), anticuerpo policlonal anti-ABCB5 de conejo (Novus Biologicals, CO), anticuerpo policlonal de control de isotipo IgG de conejo (Abcam, MA), anticuerpo de control de isotipo IgGlk de ratón (Bd Biosciences, CA) y anticuerpo de control de isotipo IgG de cabra (Santa Cruz, CA). Los anticuerpos secundarios fueron anti-ratón FICT de cabra (Sigma-Aldrich, MO), anti-IgG de conejo de cabra Alexa 647 (Invitrogen, NY) y anticabra de burro Dylight 649 (Jackson ImmunoResearch, PA). Para análisis de histopatología e inmunohistoquímica humana, se utilizaron los siguientes anticuerpos primarios: anti-ABCB5 monoclonal de ratón (clon 3C2-1D12) [6] y anticuerpo de conejo contra ANp63a a una dilución 1:75 (sc8344, Santa Cruz, CA) seguido de los anticuerpos secundarios apropiados obtenidos de Jackson ImmunoResearch, PA: FITC-anti-conejo de burro a una dilución 1:75 o Alexa Fluor 594-anti-ratón de cabra a una dilución 1:250. En todos los casos, los anticuerpos IgG de conejo de isotipo coincidente (550875, BD Pharmingen, CA) y el anticuerpo de control de isotipo IgGlkappa de ratón (BD Biosciences, CA) sirvieron como controles negativos. Para los análisis histopatológicos e inmunohistoquímicos, los tejidos de ratón se tiñeron con los siguientes anticuerpos primarios: anticuerpo anti-ABCB5 de conejo a una dilución 1:250 (NBP1-50547, Novus, CO), anti-Pax6 de conejo a una dilución 1:300 (PRB278P, Covance, CA), anticitoqueratina 12 de cabra (L15) a una dilución 1:50 (sc17101, Santa Cruz, CA), anticitoqueratina 14 de conejo (Af64) a una dilución de 1:1000 (PRB-155P, Covance, CA), anti-Ki67 de conejo a una dilución 1:200 (ab66155, Abcam, MA), seguidos de los anticuerpos secundarios apropiados obtenidos de Jackson ImmunoResearch, PA: anticabra de burro Alexa Fluor 488 a una dilución 1:250 (705-545-003), anticonejo de burro Alexa Fluor 594 a una dilución 1:20 (711-585-152), anticonejo de cabra DyLight 549 a una dilución 1:250 (111-504-144), o Cy3-anticonejo de burro a una dilución 1:250 (711-165-152). En todos los casos, los anticuerpos coincidentes isotipados (IgG de conejo (550875, BD Pharmingen, CA) e IgG de cabra (sc2028, SantaCruz, CA) sirvieron como controles negativos.

El listado de secuencias presentado simultáneamente, archivado como un archivo de texto, se incorpora a modo de referencia en el presente documento.

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19. Cheung, S.T., Cheung, P.F., Cheng, C.K., Wong, N.C. y Fan, S.T. Granulin-epithelin precursor and ATP-dependent binding cassette (ABC)B5 regulate liver cancer cell chemoresistance. Gastroenterology 140, 344-55 (2011).

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30. Pellegrini, G. et al. The control of epidermal stem cells (holoclones) in the treatment of massive full-thickness burns with autologous keratinocytes cultured on fibrin. Transplantation 68, 868-79 (1999).

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33. Stadfeld, M. y Hochedlinger, K. Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications, Genes and Development 24, 2239-2263 (2010).

Habiendo descrito así varios aspectos de al menos una opción de la presente divulgación, debe apreciarse que a los expertos en la materia se les ocurrirán diversas alteraciones, modificaciones y mejoras. Dichas alteraciones, modificaciones y mejoras están destinadas a ser parte de la presente divulgación y están destinadas a estar dentro del espíritu y alcance de la divulgación. Por consiguiente, la descripción anterior y los dibujos son solamente a modo ilustrativo.

EQUIVALENTES

Si bien se han descrito e ilustrado varias opciones inventivas en el presente documento, los expertos en la materia visualizarán fácilmente otros varios medios y/o estructuras para realizar la función y/u obtener los resultados y/o una o más de las ventajas descritas en el presente documento y cada una de dichas variaciones y/o modificaciones se considera que están dentro del alcance de las opciones inventivas descritas en el presente documento. De forma más general, los expertos en la materia apreciarán fácilmente que todos los parámetros, dimensiones, materiales y configuraciones descritos en el presente documento se entiende como ilustrativos y que los parámetros, dimensiones, materiales y/o configuraciones reales dependerán de la aplicación o aplicaciones específicas para las que se utilizan las enseñanzas inventivas. Los expertos en la materia reconocerán, o serán capaces de discernir utilizando no más que la experimentación habitual, muchos equivalentes a las opciones inventivas específicas descritas en el presente documento. Debe entenderse, por lo tanto, que las opciones anteriores se presentan únicamente a modo de ejemplo y que, dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas y equivalentes a las mismas, las opciones inventivas pueden practicarse de otra manera a la descrita y reivindicada específicamente. Las opciones inventivas de la presente divulgación se dirigen a cada característica, sistema, artículo, material, kit y/o método individual descrito en el presente documento. Además, cualquier combinación de dos o más de estas características, sistemas, artículos, materiales, kits y/o métodos, si tales características, sistemas, artículos, materiales, kits y/o métodos no son incompatibles entre sí, se incluye dentro del alcance inventivo de la presente divulgación.

Todas las definiciones, como se definen y usan en el presente documento, deben entenderse que dominan sobre las definiciones del diccionario, definiciones en documentos y/o significados habituales de los términos definidos.

Los artículos indefinidos "un" y "uno/a", como se usan en el presente documento en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, a menos que se indique claramente lo contrario, debe entenderse que significa "al menos uno".

La expresión "y/o", como se usa en el presente documento en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, debe entenderse que significa "uno o ambos" de los elementos unidos de este modo, es decir, elementos que están presentes conjuntamente en algunos casos y presentes por separado en otros casos. Múltiples elementos enumerados con "y/o" deberían interpretarse de la misma manera, es decir, "uno o más" de los elementos unidos de este modo. Pueden estar presentes opcionalmente otros elementos distintos de los elementos identificados específicamente por la cláusula "y/o", bien relacionados o no relacionados con los elementos identificados específicamente. Por tanto, como ejemplo no limitante, una referencia a "A y/o B", cuando se usa junto con lenguaje abierto tal como "que comprende" puede hacer referencia, en una opción, solamente a A (opcionalmente incluyendo elementos distintos de B); en otra opción, solamente a B (opcionalmente incluyendo elementos distintos de A); en otra opción más, tanto a A como a B (opcionalmente incluyendo otros elementos); etc.

Claims (8)

REIVINDICACIONES

1. Un método para aislar las células madre del limbo de una población mixta de células oculares, que comprende: aislar células madre del limbo ABCB5(+) de una población mixta de células oculares proporcionada, en donde las células madre del limbo ABCB5(+) se aíslan con un anticuerpo que se une de manera selectiva a ABCB5 humana.

2. Un método para producir un injerto ocular, que comprende

(i) aislar células madre del limbo ABCB5(+) de una población mixta de células oculares proporcionada, en donde las células madre del limbo ABCB5(+) se aíslan con un anticuerpo que se une de manera selectiva a ABCB5 humana; y

(ii) sembrar un sustrato con las células madre del limbo ABCB5(+) aisladas.

3. El método de la reivindicación 2, en donde el sustrato comprende gel de fibrina, membrana amniótica, aminoglucanos o una combinación de los mismos.

4. El método de la reivindicación 2 o de la reivindicación 3, en donde el injerto ocular es para trasplante en un sujeto que lo necesite.

5. El método de la reivindicación 4, en donde las células madre del limbo ABCB5(+) aisladas son células madre alogénicas para el sujeto, células madre singénicas para el sujeto, xenogénicas para el sujeto, células madre oculares ABCB5(+), células madre del limbo ABCB5(+), o no son células madre de la piel.

6. El método de la reivindicación 5, en donde el sujeto tiene una afección ocular, tal como enfermedad de la córnea, una enfermedad de la retina o una herida ocular.

7. El método de la reivindicación 6, en donde la enfermedad de la córnea es ceguera debido a deficiencia de células madre del limbo (LSCD).

8. El método de la reivindicación 6, en donde la enfermedad de la retina es degeneración macular o retinitis.