ES2860938T3 - Dispositivo microfluídico para la generación de muestras combinatorias - Google Patents

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Abstract

Un dispositivo microfluídico para producir gotitas de al menos una muestra en una fase inmiscible, comprendiendo el dispositivo un formador de gotitas (100) que conecta un canal de fase inmiscible (42) y un canal de muestra que tiene una pluralidad de entradas de muestra (25) conectadas a una pluralidad de canales de entrada de muestra (27) que inyectan la al menos una muestra en el canal de muestra (29), en donde la inyección de la al menos una muestra se controla mediante una pluralidad de válvulas de muestra (20), de manera que la al menos una muestra fluye o bien hacia una salida de residuos de muestra (30) o hacia un canal de la pluralidad de canales de entrada de muestra (27), en donde la pluralidad de canales de entrada de muestra (27) tienen la misma resistencia hidrodinámica resultante de la longitud, la altura y la anchura del canal de entrada de muestra (27) corriente arriba del formador de gotitas (100), el dispositivo microfluídico tiene un canal de salida (60) corriente abajo del formador de gotitas (100), en el que las gotitas fluyen hacia dicho canal de salida, caracterizado por que la resistencia hidrodinámica del canal de salida (60) es menor que la resistencia hidrodinámica del canal de fase inmiscible (42), y en donde dicha resistencia hidrodinámica del canal de salida resultante de la longitud, la altura y la anchura del canal de salida es menor que la resistencia hidrodinámica de los canales de entrada de muestra.

Description

DESCRIPCIÓN
Dispositivo microfluídico para la generación de muestras combinatorias
Campo de la invención
La presente divulgación se refiere a un dispositivo microfluídico y a un método que permite la generación y cribado de muestras combinatorias.
Antecedentes de la invención
Los dispositivos microfluídicos consisten habitualmente en redes de canales con dimensiones de canal de 10-500 pm en las que los líquidos pueden accionarse por diferentes medios. Se han desarrollado sistemas de análisis microfluídicos más sofisticados usando polímeros con el fin de miniaturizar las configuraciones experimentales existentes a escala de laboratorio, para reducir el consumo de reactivos de muestra y, por lo tanto, el coste, pero también para ganar capacidades de sensibilidad, rendimiento y multiplexación.
Una de las tecnologías básicas para la microfluídica moderna se desarrolló en la década de 1990 y se ha denominado litografía blanda (Xia y Whitesides, 1998). Se basa en técnicas fotolitográficas anteriores desarrolladas para fabricar dispositivos microelectrónicos (Nall y Lathrop, 1958). La litografía blanda permite el prototipado rápido de nuevos diseños de chips microfluídicos mediante el plegado de réplicas. Brevemente, permite la fabricación repetitiva de chips microfluídicos idénticos usando estructuras a microescala modeladas en una oblea de silicio como molde negativo. El tiempo requerido desde la fabricación del molde hasta el uso de un chip microfluídico terminado es como máximo un día. Los moldes se llenan con polidimetilsiloxano (PDMS) y se hornean. El chip de PDMS curado puede cortarse con un bisturí. Los moldes pueden volver a llenarse con PDMS y, de este modo, pueden reutilizarse muchas veces (Duffy et al., 1998). Tiene muchas ventajas cuando se usa para la producción de chips microfluídicos en el contexto de aplicaciones biológicas y biomédicas. El polímero curado es biocompatible y altamente permeable a los gases, lo que permite el cultivo de células en chip y la realización de muchos ensayos bioquímicos. Dado que el PDMS tiene propiedades ópticas similares a las del vidrio, los dispositivos microfluídicos fabricados con este material son transparentes y los procesos que se realizan en chip pueden monitorizarse directamente con un microscopio óptico convencional. Además, es muy flexible y fácil de manejar, lo que lo hace muy fácil de usar en el desarrollo de nuevos chips prototipo (Xia y Whitesides, 1998).
El documento WO 2007/081386 proporciona un canal microfluídico para mezclar e investigar gotitas de fase acuosa encapsuladas en una corriente de aceite.
Una publicación de Shaojiang Zeng et al. "Microvalve-actuated precise control of individual droplets in microfluidic devices", LabChip, 21 de mayo de 2009; 9(10): 1340-1343 describe un ejemplo para la generación de secuencias de gotitas individuales separadas por un aceite inmiscible en un canal microfluídico. Se describe un formador de gotitas que es capaz de generar cuatro especies de gotitas diferentes que pueden fusionarse una a una de forma combinatoria. Si bien, en teoría, este enfoque permite la generación de muchas mezclas de diferentes compuestos (que pueden cribarse para obtener un efecto deseado o aprovecharse para la síntesis en chip de bancos de compuestos), el sistema tiene varias limitaciones: el sistema depende de la fusión de gotitas y solo permite la generación de pares de gotitas combinatorios; el sistema se acciona por presión negativa. Todo el flujo se genera aspirando desde la salida, lo que da como resultado diferentes tamaños de gotita para los diferentes compuestos cuando se aplican tiempos de apertura de válvula constantes. Aunque esto puede compensarse en teoría ajustando los tiempos de apertura de válvula individuales, solo puede lograrse un pobre nivel de control. Dado que cada compuesto infundido necesita un tiempo de apertura de válvula específico, parece muy difícil generar sistemáticamente todos los pares de gotitas posibles (y sincronizar la generación de las gotitas individuales para permitir el emparejamiento). En conclusión, el sistema apenas puede ampliarse (el principio de funcionamiento se mostró para 4 compuestos infundidos, solamente, y solo se fusionaron dos especies de gotitas). Además, un sistema accionado por presión negativa tiene limitaciones estrictas en términos de los caudales máximos y, por lo tanto, el rendimiento.
El documento EP 1601 874 describe el uso de dispositivos mecánicos tales como una pantalla Braille para cerrar y abrir válvulas en un sistema microfluídico. El documento WO 2013/037962 desvela un dispositivo microfluídico de acuerdo con el preámbulo de la reivindicación 1.
Un objetivo de la presente divulgación es superar al menos una de las desventajas de la técnica anterior.
Sumario de la invención
La presente divulgación proporciona un dispositivo microfluídico de acuerdo con la reivindicación 1 para producir gotitas de al menos una muestra en una fase inmiscible, comprendiendo el dispositivo un formador de gotitas que conecta un canal de fase inmiscible y un canal de muestra que tiene una pluralidad de entradas de muestra conectadas a una pluralidad de canales de entrada de muestra que inyectan la al menos una muestra en el canal de muestra, en el que la inyección de la al menos una muestra está controlada por una pluralidad de válvulas de muestra, de manera que la al menos una muestra fluye o bien hacia una salida de residuos de muestra o hacia un canal de la pluralidad de canales de entrada de muestra, en el que la pluralidad de canales de entrada de muestra tienen la misma resistencia hidrodinámica resultante de la longitud, altura y anchura del canal de entrada de muestra corriente arriba del formador de gotitas, el dispositivo microfluídico tiene un canal de salida corriente abajo del formador de gotitas, en el que las gotitas fluyen hacia dicho canal de salida. La resistencia hidrodinámica del canal de salida es menor que la resistencia hidrodinámica del canal de fase inmiscible, y dicha resistencia hidrodinámica del canal de salida resultante de la longitud, altura y anchura del canal de salida es menor que la resistencia hidrodinámica de los canales de entrada de muestra.
El al menos un canal de entrada de muestra puede tener un resistor fluídico de muestra para ajustar su longitud. Es evidente para los expertos en la materia que la resistencia hidrodinámica de un canal está relacionada con los parámetros de longitud, altura y anchura de un canal. De este modo, los expertos en la materia podrán determinar sin una carga excesiva la resistencia hidrodinámica de un canal o tubo específicos.
La al menos una válvula puede conectarse a un depósito de muestra presurizado para permitir que la muestra fluya hacia el dispositivo microfluídico. En esta realización, la al menos una válvula se usa para permitir que las muestras almacenadas en un depósito de muestra presurizado fluyan hacia el dispositivo o chip microfluídico.
La longitud, altura y anchura del canal de fase inmiscible corriente arriba del formador de gotitas también deben tenerse en cuenta para garantizar una mayor resistencia hidrodinámica del canal de fase inmiscible que el canal de muestra para evitar que la al menos una muestra entre preferentemente en el canal de fase inmiscible. De nuevo, los expertos en la materia podrán elegir fácilmente parámetros que garanticen la relación de resistencia deseada.
Una posibilidad para garantizar una mayor resistencia en el canal de fase inmiscible es un resistor fluídico de fase inmiscible del canal de fase inmiscible corriente arriba del formador de gotitas para garantizar una resistencia del canal de fase inmiscible mayor que la resistencia del canal de muestra para evitar que la al menos una muestra pueda entrar en el canal de fase inmiscible.
Puede conectarse un canal de lectura de salida al canal de salida, siendo el canal de lectura de salida un tubo separable. De este modo, los canales de lectura de salida pueden llenarse con gotitas o una secuencia de gotitas como un código binario y el canal de lectura de salida puede separarse después de finalizar la secuencia o el código de barras respectivos.
El dispositivo microfluídico de la presente divulgación puede tener entradas de fase inmiscible adicionales directamente en un punto de transición donde las muestras se descargan de al menos un depósito de almacenamiento de muestras en un segundo dispositivo microfluídico. El al menos un depósito de almacenamiento de muestras puede ser un tubo o una placa de micropocillos.
Se pretende que el diámetro del al menos un depósito de almacenamiento de muestras sea al menos el doble del diámetro del canal de lectura de salida.
Además, las entradas de fase inmiscible adicionales pueden disponerse como canales exteriores adicionales o canales dispuestos coaxialmente con el almacenamiento de muestras.
La al menos una muestra puede ser al menos una de una solución acuosa, un disolvente orgánico o una combinación de los mismos y la fase inmiscible puede comprender aceite, como aceite mineral, aceite fluorado o cualquier otro líquido no miscible con un líquido acuoso, un disolvente orgánico o una combinación de los mismos. Está dentro del alcance de la presente divulgación que pueda usarse una fase inmiscible diferente, como diferentes tipos de aceite o fases inmiscibles que tengan diferentes propiedades, por ejemplo, diferentes propiedades ópticas.
El dispositivo microfluídico puede tener un módulo de lectura de salida para analizar la gotita de muestra o la secuencia de gotitas de muestra en el canal de salida o en el canal de lectura de salida. Como alternativa, puede transferirse un canal de lectura de salida separable a un dispositivo de lectura de salida externo.
Otro objetivo de la presente divulgación es un método para proporcionar una secuencia de gotitas de al menos una muestra, de acuerdo con la reivindicación 8, comprendiendo el método:
• proporcionar al menos dos compuestos a un dispositivo microfluídico de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 7;
• producir al menos una muestra combinatoria de los al menos dos compuestos que tenga una mezcla específica de los al menos dos compuestos;
• inyectar la al menos una muestra combinatoria en un dispositivo microfluídico;
• generar al menos una gotita de al menos una muestra combinatoria en una fase inmiscible; y
• separar la al menos una gotita con al menos una fase inmiscible;
• proporcionar al menos una gotita de cebado delante de la primera de la al menos una gotita de la al menos una muestra combinatoria.
El método de la presente divulgación puede usarse para generar una secuencia de gotitas que comprenden diferentes muestras combinatorias, en el que una secuencia de gotitas puede comprender al menos 50 gotitas.
El método de la presente divulgación puede comprender la preparación de una gotita de cebado o una pluralidad de gotitas de cebado, que comprende el disolvente de la al menos una muestra combinatoria o solo uno de los al menos dos compuestos para preparar la muestra combinatoria.
Además, el al menos un compuesto de los al menos dos compuestos puede ser una célula procariota o eucariota o en el que la al menos una muestra combinatoria comprende una célula procariota o eucariota.
El al menos un compuesto de los al menos dos compuestos puede aspirarse o transferirse desde un depósito de almacenamiento.
La muestra combinatoria puede transferirse desde un depósito de almacenamiento a un canal de lectura de salida que tiene un diámetro, que no es más de la mitad del diámetro del depósito de almacenamiento.
Está dentro del alcance de la presente divulgación que las gotitas puedan producirse con un diámetro significativamente menor que el del canal de salida o el canal de lectura de salida y en el que las gotitas se confinan o se separan de las gotitas que contienen una composición de muestra diferente usando tapones de una tercera fase inmiscible que tiene un diámetro significativamente superior al diámetro del depósito para separar las gotitas.
El al menos un compuesto puede aspirarse de las placas de micropocillos para su suministro a un dispositivo microfluídico usando una fase portadora miscible.
La aspiración del al menos un compuesto puede sincronizarse con las válvulas del dispositivo microfluídico. La sincronización garantiza que las gotitas o tapones contengan solo muestras puras o muestras que contengan sustratos adicionales.
Otra forma de producir solo las muestras deseadas es que solo se usará una sección media del al menos un compuesto aspirado.
El método de la presente divulgación comprende además la generación de un identificador óptico entre códigos de barras ópticos, en el que el código de barras óptico comprende secuencias de gotitas secuenciales que usan diferentes propiedades de las gotitas y en el que el final de cada código de barras óptico está marcado por gotitas que tienen una composición única.
Además, puede usarse una gotita o una pluralidad de gotitas para producir una señal única diferente de las señales usadas para la generación de dígitos individuales de un código de barras secuencial.
Antes de inyectar la al menos una muestra combinatoria en un dispositivo microfluídico, los restos de una muestra combinatoria anterior pueden descargarse en el formador de gotitas usando la siguiente muestra combinatoria para producir un tapón de residuos y, a continuación, transferir todos los líquidos acuosos a los residuos mientras la fase inmiscible sigue inyectándose en el formador de gotitas de manera que un espaciador de la fase inmiscible separa el tapón de residuos de la siguiente muestra combinatoria.
El canal de salida o canal de lectura de salida puede llenarse con una secuencia de gotitas de cebado antes de generar gotitas de una muestra para garantizar que el canal de salida o de lectura de salida lleno ya proporcione las condiciones durante la producción de las gotitas de las muestras.
Breve descripción de las figuras
A continuación, se describirán y mostrarán ejemplos y realizaciones de la presente divulgación en las siguientes figuras. Para los expertos en la materia es evidente que la presente divulgación no se limita a las realizaciones mostradas. Se muestra:
Figura 1 Representación esquemática de proporcionar unas condiciones óptimas de inicio.
Figura 2 Ilustración esquemática de una realización de la invención.
Figura 3 Representación esquemática de una configuración 2D y 3D para inyectar aceite de revestimiento adicional.
Figura 4 Comparación de la lectura de salida de gotitas multicelulares y gotitas unicelulares.
Figura 5 Representación esquemática de la adición de un final de señal de código de barras.
Figura 6 Encapsulación de muestras combinatorias evitando la contaminación cruzada.
Figura 7 Encapsulación de compuestos concentrados homogéneamente suministrados por un muestreador automático en forma dispersa separados por una fase portadora miscible.
Descripción detallada de la invención
La presente divulgación proporciona un dispositivo microfluídico que permite la generación y el cribado de muestras combinatorias en un modo de alto rendimiento. A partir de un número de n entradas (en las que pueden inyectarse n compuestos diferentes) puede generarse un total de hasta 2n-1 muestras químicamente distintas de forma automatizada.
Todos los canales que proporcionan un líquido al formador de gotitas están dispuestos "corriente arriba" del formador de gotitas con arreglo a la presente divulgación. El canal de salida que transporta las gotitas o la secuencia de gotitas está dispuesto "corriente abajo" del formador de gotitas. Los términos gotitas o tapones se usan como sinónimos.
Un líquido acuoso con arreglo a la presente divulgación comprende todo líquido que sea miscible con agua. Por el contrario, la fase inmiscible comprende todo líquido que no sea miscible con agua, como el aceite.
El dispositivo de la presente divulgación puede usarse para generar un sistema de código de barras óptico para las muestras combinatorias recién generadas, facilitando drásticamente, por lo tanto, la aplicación de un cribado posterior (por ejemplo, el cribado de las muestras para detectar efectos biológicos). La tecnología es muy útil para diversas aplicaciones, incluida la diferenciación de células madre, los cribados de fármacos combinatorios y la química combinatoria.
El documento WO2013037962 desvela un dispositivo y un enfoque de código de barras de muestra. La presente divulgación proporciona más detalles del dispositivo que son novedosos e inventivos sobre la divulgación del documento Wo 2013037962.
La figura 1 muestra en R1 a R4 diferentes condiciones de inicio antes de analizar una secuencia de gotitas. La resistencia (R) de un depósito, tal como un tubo, depende del medio interno y es especialmente alta para los sistemas bifásicos. R1 muestra un tubo lleno de aire, R2 muestra un tubo lleno de líquido, R3 muestra un tubo lleno de solo unos cuantos tapones y R4 muestra un tubo lleno de muchos tapones. Básicamente, la resistencia hidrodinámica en las configuraciones mostradas en R1 a R4 es diferente. Como consecuencia, el tubo tiene que llenarse con tapones o gotitas "falsos" antes de que se generen las muestras a analizar para lograr una resistencia más constante durante todo el experimento (R5).
Después de generar las muestras combinatorias usando, por ejemplo, un chip de pantalla braille, se almacenan de forma secuencial, ya sea en un canal de tubo, capilar o microfluídico. Al comienzo del experimento, este depósito no contiene ningún tapón, sino más bien aire o cualquier líquido de cebado, tal como aceite o agua. Sin embargo, mover este sistema monofásico habitualmente requiere una contrapresión más baja en comparación con mover una serie de tapones (un sistema bifásico). Por lo tanto, durante el transcurso del experimento, en el que cada vez se generan más tapones y se inyectan en el depósito, los cambios de contrapresión dan como resultado tamaños de muestra no homogéneos y fracciones no homogéneas de compuestos individuales dentro de las mezclas. Este efecto puede superarse cebando el sistema con "tapones de cebado" (por ejemplo, tapones de agua en aceite), generados de la misma manera que las muestras posteriores para el análisis, de modo que solo después de que el tubo se haya llenado completamente con los tapones o gotitas de cebado (u, opcionalmente, incluso enjuagado durante un período de tiempo más largo), se generan las muestras de ensayo para el análisis. Las muestras de ensayo experimentarán un cambio mucho menor en la contrapresión a lo largo del tiempo (ya que el número total de tapones en el sistema permanece casi constante) y, por lo tanto, apenas cambian de tamaño.
La operación exitosa del dispositivo Braille combinatorio (dispositivo microfluídico) requiere ajustes cuidadosos de las resistencias de todos los canales. Por ejemplo, los canales para todas las muestras acuosas deben tener la misma resistencia, que puede lograrse mediante el uso de resistores (para compensar las diferencias de longitud, anchura o altura). Además, el canal corriente abajo de la entrada de aceite debe tener una resistencia mayor que el canal entre el formador de gotitas (unión en T) y la salida de muestra, ya que, de lo contrario, las muestras acuosas se empujan ocasionalmente hacia el canal de aceite, cambiando la dirección de flujo deseada (desde la entrada de aceite a la salida de muestra) dentro del dispositivo.
El tamaño de los tapones o gotitas acuosos también varía si los canales de muestra corriente arriba del formador de gotitas tienen resistencias significativamente diferentes. Este es el caso de la geometría mostrada en el documento WO2013037962, ya que la longitud de los canales desvelados difiere significativamente. La presente divulgación proporciona un dispositivo microfluídico (chip) con canales de muestra corriente arriba del formador de gotitas que tienen la misma longitud. De este modo, se evitan tamaños de muestra variables y fracciones variables de compuestos individuales dentro de una mezcla. Puede usarse un resistor fluídico en la entrada de la fase inmiscible (aceite) para evitar que las muestras acuosas (opcionalmente inyectadas a caudales mucho más altos en comparación con el aceite) entren en el canal de aceite tras abrir las válvulas (haciendo referencia a las válvulas que controlan el flujo de muestras acuosas hacia el formador de gotitas).
La figura 2 muestra una configuración de un dispositivo microfluídico que tiene unos resistores fluídicos de los canales de entrada de muestra 40 así como un resistor fluídico del canal de fase inmiscible 42. Los resistores fluídicos del canal de entrada de muestra 40 se usan para ajustar la misma longitud para cada canal de entrada de muestra. El resistor fluídico del canal de fase inmiscible 42 debe garantizar que la resistencia del canal de fase inmiscible sea mayor que la resistencia del canal de salida y/o canal de lectura de salida corriente abajo del formador de gotitas. Corriente arriba de los resistores fluídicos 40 están dispuestas las entradas de muestra 25 y la salida de residuos 30. En la parte superior de la figura 2, las válvulas 20 están dispuestas en un denominado módulo de válvulas. Puede usarse una entrada de célula 15 para descargar las células en el dispositivo microfluídico. La entrada de fase inmiscible 50 aplica la fase inmiscible 85.
El formador de gotitas 100 comprende una unión en T 35 en la realización de la figura 1, así como un canal de muestra 29 y un canal de entrada de muestra 27. Se forma una gotita 80 en la fase inmiscible 85.
Muchos ensayos biológicos y químicos requieren la adición de más sustratos a las muestras después de su generación inicial. Esto se ha realizado, por ejemplo, después de un tiempo de incubación para iniciar una reacción de lectura de salida basada en la fluorescencia. Técnicamente, esta tarea puede lograrse usando un módulo de fusión como se describe en Clausell-Tormos et al. (Chem Biol. mayo de 2008; 15(5): 427-437). Sin embargo, cuando se usan muestras que contienen células o altas concentraciones de proteínas, este enfoque es difícil, ya que la humectación se observa con frecuencia en el punto donde las muestras salen del depósito de almacenamiento y entran en el chip de fusión microfluídico. Los inventores han descubierto que esto puede evitarse inyectando un aceite portador adicional (que actúa de manera similar al fluido de revestimiento en las aplicaciones FACS) con una baja concentración de tensioactivo en este punto. Geométricamente, esto requiere unos canales exteriores adicionales (configuración 2D) o un flujo coaxial de aceite (configuración 3D) usando un tubo adicional alrededor del depósito en el que el aceite se inyecta continuamente y fluye aún más hacia el chip de fusión microfluídico, aislando de este modo las muestras acuosas de las paredes de canal.
La figura 3 muestra esquemáticamente configuraciones para la adición de sustratos adicionales mediante unas entradas de fase inmiscible adicionales 120 a las muestras. Tal adición requiere una etapa de fusión que implica la inyección de todos los tapones de muestra a través de un puerto de conexión para la fusión de gotitas 130 en un segundo dispositivo microfluídico. Los electrodos de fusión 110 pueden disponerse en la cámara de fusión 90, así como en el formador de gotitas de sustrato 100. La humectación se produce con frecuencia en el punto de transición del tubo a las paredes de canal. Esto puede superarse inyectando "aceite de revestimiento" adicional, ya sea en una configuración 2D o 3D (120 arriba y abajo).
Cuando se generan tapones que albergan células, es difícil obtener el mismo número de células en todas las muestras (Clausell-Tormos et al, Chem Biol. mayo de 2008; 15(5): 427-437). Esto puede provocar problemas en las aplicaciones de cribado de fármacos, ya que una señal de lectura de salida intensa (por ejemplo, en un ensayo de fluorescencia basado en células) podría deberse o bien a un fármaco especialmente eficaz o simplemente a una muestra con un número extraordinariamente alto de células. En teoría, este problema puede superarse realizando ensayos unicelulares: usando una densidad de célula correspondiente a menos de una célula por volumen de tapón, la mayoría de los tapones contendrán una célula o ninguna. Esto permite omitir todas las muestras que muestran solo señales de fondo (= tapones vacíos), mientras que los tapones que muestran una intensidad de señal, que está significativamente por encima del fondo, albergarán muy probablemente el mismo número de células (n=1). Sin embargo, dado que los ensayos unicelulares están sujetos a variación biológica, este enfoque requiere un gran número de réplicas. Generar gotitas de manera experimental, que son mucho más pequeñas que los tapones descritos en el documento WO2013037962 a alta frecuencia, puede resolver este problema. Sin embargo, debido al tamaño reducido, estas gotitas habitualmente no mantendrán un orden secuencial: si su diámetro es menor que el diámetro del depósito, las diferentes muestras pueden mezclarse, haciendo así imposible rastrear la identidad de muestra. Sin embargo, esto puede evitarse usando tapones de aceite mineral más grandes (diámetro significativamente superior al diámetro del depósito) para separar las gotitas pequeñas.
Finalmente, las muestras se descargan para la lectura de salida a través de un canal con un diámetro comparable al de las gotitas pequeñas, de manera que cada muestra se mide individualmente sin la posibilidad de que dos muestras pasen por el detector al mismo tiempo. Es importante señalar que el diámetro del depósito para la incubación (entubación) no puede tener un diámetro tan pequeño, ya que esto daría como resultado resistencias que no pueden manejarse experimentalmente. Por lo tanto, se sugiere que el depósito para la incubación tenga un diámetro relativamente grande (> 100 jm ), mientras se hacen pasar las muestras a través de una estrecha constricción (<100 |jm) corriente arriba o en el punto de lectura de salida.
La figura 4 muestra en la parte superior que el tapón que alberga diferentes números de células (A 68 células; B 75 células; C 53 células) provocará diferentes intensidades de señal en la lectura de salida. Esto puede superarse mediante un análisis unicelular. Si una muestra específica tiene menos células, el número de picos positivos disminuirá, pero su intensidad media seguirá siendo la misma (parte inferior de la figura 4). Experimentalmente, esto requiere el uso de depósitos de gran diámetro y canales de lectura de salida de pequeño diámetro para la lectura de salida de señal 150. Las gotitas unicelulares se separan con unos tapones de fase inmiscible más grandes 140.
Es posible usar un dispositivo microfluídico para una estrategia de códigos de barras de muestras haciendo uso de tapones que contienen diferentes fluoróforos (o concentraciones de los mismos). Como su secuencia se mantiene constante durante todo el experimento, las muestras pueden usarse para escribir códigos binarios (por ejemplo, alta intensidad = 1; baja intensidad = 0). Se ha descubierto que este tipo de código de barras se vuelve mucho más fiable cuando se añade una señal única para codificar el final del código de barras. Esto puede hacerse generando una muestra con una intensidad de señal intermedia o una señal (color) completamente diferente.
La figura 5 muestra que la legibilidad de los códigos de barras binarios (1 y 0) puede mejorarse drásticamente añadiendo una señal de "final de código de barras" adicional 230. Esto es especialmente relevante ya que el número de dígitos por código de barras no es constante, lo que hace difícil la definición del final de un código de barras. Cada código de barras puede estar separado por tapones de fase inmiscible 200.
La contaminación cruzada puede producirse en dispositivos microfluídicos que hacen uso de canales a través de los que se descargan secuencialmente diferentes reactivos (basándose en la mezcla a generar). Esto es especialmente relevante, ya que cada canal corriente arriba del formador de gotitas tiene un cierto volumen muerto, que permanece después de la generación de una mezcla específica. Para superar este problema, la presente divulgación proporciona un método para descargar estos restos y encapsularlos en un denominado "tapón de residuos" entre cada mezcla de muestra.
El método se basa en dividir la generación de cada nueva muestra (cada nueva mezcla combinatoria) en dos fases: en primer lugar, la configuración de válvula para la generación de esta mezcla específica (VC i) se establece para un período de tiempo muy corto (un período de tiempo que corresponde a menos del tamaño de muestra deseado para un ensayo determinado; por ejemplo, Is) durante el que los restos de la muestra anterior se descargan en el formador de gotitas (mezclándose con y contaminando la muestra actual). A continuación, la configuración de válvula se cambia de manera que todos los líquidos acuosos se envíen a los residuos mientras se sigue inyectando aceite en el formador de gotitas. En consecuencia, se genera un espaciador de aceite que separa físicamente este tapón de residuos recién generado de la siguiente muestra. A continuación, la configuración de válvula se cambia de nuevo a VC i. Dado que el volumen muerto de los canales ahora ya está lleno con la mezcla deseada, no se produce contaminación cruzada y se genera un tapón con una composición de muestra conocida. Es digno de atención que apenas hay alternativa a este procedimiento: enjuagar los canales con un tampón de lavado entre cada muestra no solucionaría el problema de la contaminación cruzada, ya que también permanecería en el volumen muerto de la red de canales, contaminando así, o al menos diluyendo, la siguiente (i 1) muestra.
La figura 6 muestra la encapsulación de una muestra combinatoria en gotitas sin contaminación cruzada significativa entre las muestras. Una válvula abierta 300 permite que la muestra respectiva entre en el canal y una válvula cerrada 310 impedirá que la muestra respectiva entre en el canal. A1-A5: después de la encapsulación de una primera muestra combinatoria específica 320, los canales corriente arriba del formador de gotitas siguen llenos con esta muestra y las gotitas 321 de la misma. Estos restos pueden eliminarse enjuagando brevemente los canales con una segunda mezcla de muestra 330, seguido de la inyección de solo una fase inmiscible como el aceite. En consecuencia, se genera un tapón de residuos 341 a partir de la mezcla de las muestras 340, mientras que los canales corriente arriba del formador de gotitas se llenan con una muestra pura 330. Por lo tanto, abrir las válvulas para la generación de 330 da como resultado de nuevo la generación de una nueva gotita de muestra combinatoria pura 331, sin ninguna contaminación significativa de la muestra anterior. La parte B de la figura 6 muestra una secuencia de tapones de residuos y de muestras generados como se describe en A1 a A5.
El documento WO2013037962 también desvela la idea de inyectar secuencialmente diferentes compuestos en al menos una de las entradas del chip microfluídico combinatorio. Esto puede, por ejemplo, lograrse conectando un muestreador automático al chip microfluídico. Sin embargo, cada compuesto aspirado por un muestreador automático de placas de micropocillos se transporta al chip microfluídico usando una fase portadora miscible (por ejemplo, un tampón). Esto puede provocar dos problemas: el compuesto se diluye de acuerdo con la dispersión Tailor-Aris y, además, la fase miscible también se inyecta en el chip combinatorio. Sin embargo, para la generación de mezclas combinatorias sistemáticas, habitualmente es deseable tratar con compuestos puros concentrados homogéneamente. Para lograr esto, el principio y el final de cada tapón compuesto procedente del muestreador automático pueden truncarse y enviarse a los residuos (comp. figura 2). La actual divulgación proporciona un método que instala un circuito de retroalimentación entre el muestreador automático y el control de la pantalla braille: siempre que el muestreador automático inyecte un nuevo compuesto en el tubo que conduce al chip microfluídico, se envía una señal eléctrica (señal de relé) al software de control. Después de un retraso constante en el tiempo para cada compuesto, el tapón de compuesto dispersado llega al chip microfluídico, donde su comienzo y final se transfiere a los residuos cambiando las válvulas en consecuencia (basándose en una secuencia de tiempo predeterminada para las configuraciones de válvula). Debido a la señal de referencia interna para cada muestra (la señal de relé procedente del muestreador automático), se garantiza una sincronización eficaz entre los dos dispositivos.
La figura 7 muestra la encapsulación de compuestos homogéneamente concentrados suministrados por un muestreador automático 400 en forma dispersa separados por una fase portadora miscible. El principio y el final (dispersos) de cada tapón compuesto, así como el espaciador, pueden enviarse a los residuos sincronizando la configuración de válvula de la pantalla braille con la llegada de los tapones compuestos al chip microfluídico. Cada vez que el muestreador automático 400 inyecta un compuesto en el tubo que conduce al chip microfluídico, se envía una señal eléctrica que sirve como punto de referencia interno 450 al software de control de la pantalla braille. Solo después de un retraso predeterminado en el tiempo 430 y solo por una duración predeterminada 440, las válvulas se cambian para permitir el suministro del compuesto puro 421 y 441 al formador de gotitas. Durante todos los demás tiempos, la configuración de válvula envía todo el líquido procedente del muestreador automático a los residuos. La flecha del lado derecho indica la dirección del flujo.
Lista de números de referencia
0 codificación de gotitas 0
1 codificación de gotitas 1
15 entrada de célula
20 válvula
25 entradas de muestra
27 canal de entrada de muestra
29 canal de muestra
30 salida de residuos
35 unión en T
40 resistor fluídico
42 resistor fluídico de fase inmiscible
50 entrada de fase inmiscible
60 canal de salida
80 canal de gotitas
85 fase inmiscible
90 cámara de fusión
100 formador de gotitas de sustrato
110 electrodos de fusión
120 entradas de fase inmiscible adicionales
130 puerto de conexión para fusión de gotitas
140 aceite mineral
150 lectura de salida de señal
200 espaciador
230 gotita que codifica el final de la secuencia
300 válvula abierta
310 válvula cerrada
320 primera muestra
321 gotita de la primera muestra
330 segunda muestra
331 gotita de la segunda muestra
340 mezcla de la primera y segunda muestra
341 gotita de mezcla de la primera y segunda muestra
350 fase inmiscible
400 muestra automática
410 control de válvula
421 gotita de la primera muestra
430 retraso tw
440 suministro de segunda muestra td
441 gotita de la segunda muestra
450 señal eléctrica que sirve como punto de referencia interno

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Un dispositivo microfluídico para producir gotitas de al menos una muestra en una fase inmiscible, comprendiendo el dispositivo un formador de gotitas (100) que conecta un canal de fase inmiscible (42) y un canal de muestra que tiene una pluralidad de entradas de muestra (25) conectadas a una pluralidad de canales de entrada de muestra (27) que inyectan la al menos una muestra en el canal de muestra (29), en donde la inyección de la al menos una muestra se controla mediante una pluralidad de válvulas de muestra (20), de manera que la al menos una muestra fluye o bien hacia una salida de residuos de muestra (30) o hacia un canal de la pluralidad de canales de entrada de muestra (27), en donde la pluralidad de canales de entrada de muestra (27) tienen la misma resistencia hidrodinámica resultante de la longitud, la altura y la anchura del canal de entrada de muestra (27) corriente arriba del formador de gotitas (100), el dispositivo microfluídico tiene un canal de salida (60) corriente abajo del formador de gotitas (100), en el que las gotitas fluyen hacia dicho canal de salida,
caracterizado por que
la resistencia hidrodinámica del canal de salida (60) es menor que la resistencia hidrodinámica del canal de fase inmiscible (42), y en donde dicha resistencia hidrodinámica del canal de salida resultante de la longitud, la altura y la anchura del canal de salida es menor que la resistencia hidrodinámica de los canales de entrada de muestra.
2. El dispositivo microfluídico de la reivindicación 1, en el que unos canales de la pluralidad de canales de entrada de muestra tienen un resistor fluídico de muestra para ajustar la longitud.
3. El dispositivo microfluídico de la reivindicación 1, que comprende además un resistor fluídico de fase inmiscible (42) del canal de fase inmiscible corriente arriba del formador de gotitas (100) para garantizar una resistencia del canal de fase inmiscible mayor que la resistencia del canal de muestra para evitar que la al menos una muestra pueda entrar en el canal de fase inmiscible.
4. El dispositivo microfluídico de una de las reivindicaciones 1 a 3, en el que las gotitas de muestra fluyen hacia un canal de lectura de salida.
5. El dispositivo microfluídico de la reivindicación 3, que comprende unas entradas de fase inmiscible (120) situadas en un punto de transición donde las muestras se descargan de al menos un depósito de almacenamiento de muestras en un segundo dispositivo microfluídico.
6. El dispositivo microfluídico de la reivindicación 4, en el que el diámetro del canal de lectura de salida es comparable en tamaño con las gotitas de la al menos una muestra.
7. El dispositivo microfluídico de la reivindicación 5, en el que las entradas de fase inmiscible (120) son canales exteriores adicionales o canales dispuestos coaxialmente con el almacenamiento de muestras.
8. Un método para proporcionar una secuencia de gotitas de al menos una muestra, comprendiendo el método:
- proporcionar al menos dos compuestos a un dispositivo microfluídico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7;
- producir al menos una muestra combinatoria a partir de los al menos dos compuestos que tenga una mezcla específica de los al menos dos compuestos;
- inyectar la al menos una muestra combinatoria en el dispositivo microfluídico;
- generar en el dispositivo microfluídico al menos una gotita de la al menos una muestra combinatoria en una fase inmiscible; y
- separar la al menos una gotita con al menos una fase inmiscible;
- proporcionar al menos una gotita de cebado delante de la primera de la al menos una gotita de la al menos una muestra combinatoria.
9. El método de la reivindicación 8, en el que la al menos una muestra combinatoria comprende preferentemente una célula procariota o eucariota.
10. El método de una de las reivindicaciones 8 o 9, en el que al menos un compuesto de los al menos dos compuestos se aspira o se transfiere desde un depósito de almacenamiento.
11. El método de una de las reivindicaciones 8 a 10, en el que una muestra combinatoria se transfiere desde un depósito de almacenamiento a un canal de lectura de salida que tiene un diámetro, que no es más de la mitad del diámetro del depósito de almacenamiento.
12. El método de una de las reivindicaciones 8 a 11, en el que la secuencia de las gotitas se produce con un diámetro significativamente menor que el canal de salida y en el que unas gotitas de la secuencia de gotitas se confinan o se separan de otras gotitas de la secuencia de gotitas que contienen una composición de muestra diferente usando tapones de una tercera fase inmiscible que tienen un diámetro significativamente superior al diámetro del depósito para separar las gotitas de la secuencia de gotitas.
13. El método de una de las reivindicaciones 8 a 12, en el que directamente en el punto de transición de un dispositivo microfluídico a un segundo dispositivo microfluídico, se usan unas entradas de fase inmiscible adicionales (120) para descargar la al menos una muestra en el segundo dispositivo microfluídico.
14. El método de una de las reivindicaciones 8 a 13, en el que la aspiración del al menos un compuesto se sincroniza con las válvulas del dispositivo microfluídico de manera que solo se usa una sección media del al menos un compuesto aspirado para formar gotitas.
15. El método de una de las reivindicaciones 8 a 14, en el que se genera un identificador óptico entre códigos de barras ópticos, en edonde el código de barras óptico comprende secuencias de gotitas secuenciales que usan diferentes propiedades de las gotitas y en donde el final de cada código de barras óptico está marcado por gotitas que tienen una composición única.
16. El método de una de las reivindicaciones 8 a 15, en el que antes de inyectar la al menos una muestra combinatoria en el dispositivo microfluídico, los restos de una muestra combinatoria anterior se descargan en el formador de gotitas (100) usando la siguiente muestra combinatoria para producir un tapón de residuos seguido de la transferencia de todos los líquidos acuosos a los residuos mientras la fase inmiscible sigue inyectándose en el formador de gotitas (100) de manera que un espaciador de la fase inmiscible separa el tapón de residuos de la siguiente muestra combinatoria.
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