ES2861477T3

ES2861477T3 - Método para determinar la clonalidad celular

Info

Publication number: ES2861477T3
Application number: ES16809319T
Authority: ES
Inventors: Neve Fabio La; Georg Feger; Emiliano Toso
Original assignee: Ares Trading SA
Current assignee: Ares Trading SA
Priority date: 2015-12-03
Filing date: 2016-12-01
Publication date: 2021-10-06
Anticipated expiration: 2036-12-01
Also published as: HK1253370A1; EP3384045B1; CN108368549A; IL259750A; JP6904953B2; CN108368549B; US20230151421A1; AU2023204140A1; AU2026200380A1; HUE054222T2; DK3384045T3; KR20180088867A; IL259750B; PL3384045T3; CA3005386A1; WO2017093400A1; AU2016363746A1; US20180327830A1; JP2018537097A; EP3384045A1

Abstract

Un método para determinar la clonalidad de un Banco Maestro de Células (MCB), siendo dicho MCB el resultado de la inserción predecible o no predecible de un transgén de secuencia conocida en el genoma de una célula progenitora anfitriona (HPC) de secuencia conocida, comprendiendo dicho método las etapas de: a) Identificar una o más regiones de inserción de transgenes (TIR) en el genoma de una célula subclonal de referencia (RSC), en donde la RSC se ha aislado del MCB para el que se va a determinar la clonalidad y en donde dicha identificación se logra mediante i. secuenciación de extremos emparejados de dicho genoma de RSC para obtener una secuencia del genoma de RSC o secuencias de genoma de RSC; y ii. alineamiento de dicha secuencia o secuencias del genoma de RSC con dicha secuencia del genoma de HPC conocida y dicha secuencia del transgén conocida, produciendo así una o más regiones de inserción de transgenes (TIR); b) Determinar una o más TIR identificadas en la etapa (a) con el mayor grado de cobertura de secuencia, en donde dicha cobertura de secuencia se refiere al número de veces que se lee una secuencia de ácido nucleico dada que contiene una TIR dada durante el procedimiento de secuenciación mediante lecturas parcialmente solapantes; en donde dichas una o más TIR con el grado más alto de cobertura de secuencia se asignan como TIR de referencia (RTIR); c) Identificar una o más regiones de inserción de transgenes (TIR) en los genomas respectivos de los uno o más subclones (SC); en donde cada una de las SC se ha aislado del MCB para el que se va a determinar la clonalidad pero es independiente de dicha RSC, en donde dicha identificación se logra mediante i. secuenciación de extremos emparejados de cada genoma de SC respectivo para obtener una secuencia del genoma de SC o secuencias del genoma de SC; y ii. alineamiento de cada secuencia o secuencias del genoma de SC respectivo con dicha secuencia del genoma de HPC conocida y dicha secuencia del transgén conocida, produciendo así una o más regiones de inserción de transgenes comparativas (CTIR); d) Comparar dichas una o más RTIR determinadas en la etapa (b) con las CTIR respectivas determinadas en la etapa (c); e) Evaluar la correspondencia entre cada una de dichas una o más CTIR presentes en una SC respectiva y las RTIR correspondientes presentes en dicha RSC, donde la relación entre dicha RSC y cada una de dichas una o más SC se evalúa mediante el cálculo de una matriz de distancia; y f) Determinar la clonalidad de dicho MCB basándose en dicha correspondencia evaluada en la parte (e), en donde dicho MCB se considera monoclonal, si dicha RSC y dichas una o más SC están agrupadas en la misma agrupación, y en donde la matriz de distancia se calcula basándose en la siguiente fórmula (I), **(Ver fórmula)** en donde DD (RSC, SCm) representa la función de distancia entre dicho genoma de RSC y un genoma de SCm respectivo, en donde N(total) es el número de regiones de inserción presentes tanto en dicho genoma de RSC como en dicho genoma de SCm; N(CTIR) es el número total de regiones de inserción presentes en dicho genoma de SCm; y N(RTIR) es el número total de regiones de inserción presentes en dicho genoma de RSC; en donde DD (RSC, SCm) representa la distancia, en una escala de 0 a 1, en donde una distancia de 0 representa identidad clonal entre dicha RSC y una SCm respectiva y 1 representa diferencia clonal.

Description

DESCRIPCIÓN

Método para determinar la clonalidad celular

Antecedentes

Las líneas de células de mamíferos recombinantes son una herramienta poderosa para la producción de proteínas terapéuticas debido a su capacidad para plegar y ensamblar proteínas adecuadamente y añadir modificaciones postraduccionales a proteínas complejas similares a las que se encuentran en los seres humanos. De hecho, la mayoría de las líneas celulares utilizadas para la producción de proteínas biofarmacéuticas hasta la fecha se han originado en mamíferos a través de diversas formas de inmortalización. En la actualidad, aproximadamente de 60 a 70% de todos los productos farmacéuticos de proteínas recombinantes se producen en células de mamíferos. Además, varios cientos de proteínas terapéuticas candidatas clínicas se encuentran en las líneas de empresas actuales. Muchas de estas proteínas se expresan en células de ovario de hámster chino (CHO) inmortalizadas, pero otras líneas celulares, como las derivadas de mieloma de ratón (NS0, SP2/0), riñón de cría de hámster (BHK), riñón de embrión humano (HEK-293) y células retinianas humanas han obtenido la aprobación regulatoria como herramienta común para la producción de proteínas en la industria farmacéutica.

La primera etapa en la fabricación de una proteína biofarmacéutica en un sistema celular de mamífero es la generación de una línea celular monoclonal estable que ha integrado de manera estable el transgén que codifica la proteína de interés en su genoma. Se utilizan habitualmente varios métodos de transfección, como precipitación con fosfato cálcico, electroporación, lipofectamina y transfección viral para suministrar el transgén al núcleo de la célula anfitriona para la integración cromosómica. Uno de los métodos de transfección más comúnmente utilizados en la investigación clínica es la transfección mediada por virus, también conocida como transducción. Esta tecnología también se ha utilizado para generar líneas celulares recombinantes para la fabricación de proteínas terapéuticas. La transfección mediada por virus es muy eficaz y es fácil lograr una expresión transgénica sostenible. Una vez que el ADN entra en el núcleo, el transgén se integra en el genoma de la célula anfitriona y la expresión del gen de interés (GOI) que lo contiene está determinada, en parte, por la estructura cromosómica circundante y las características asociadas. Sin embargo, un inconveniente importante de la transfección viral es la inserción impredecible del transgén en el genoma de la célula anfitriona. Tal inserción tiene el efecto de que tanto la calidad como la cantidad de proteínas se vuelven altamente dependientes de la ubicación genómica del transgén que codifica la proteína.

Para la generación de la línea celular productora de proteínas, se cotransfecta un marcador de selección con el GOI en el genoma de la célula anfitriona. A continuación, las células transfectadas positivamente se seleccionan mediante cultivo en el medio de selección apropiado. Los genes más comunes para la selección son la dihidrofolato reductasa (DHFR), una enzima involucrada en el metabolismo de los nucleótidos, y la glutamina sintetasa (GS). En ambos casos, la selección se produce en ausencia del metabolito apropiado, lo que evita el crecimiento de las células no transfectadas. Por lo general, las células transfectadas se escrutan primero en busca de proliferación y expresión de proteínas para identificar los candidatos con el mejor potencial de producción y características de crecimiento. En la siguiente etapa, se aísla y enriquece un conjunto de células para obtener clones con una productividad muy específica. Sufficool et al. (J. Am. Acad. Derm. Agosto de 2015, Vol. 73, Nr. 2, páginas 228-36.E2) describen un método para determinar si en un conjunto de células T presentes en una muestra de tejido se ha producido una expansión clonal de células T. Este método se basa en el hecho de que si la expansión clonal de la célula T tuvo lugar en el tejido, existe un número inusualmente alto de copias de la secuencia de TCR única de esa célula T en particular presente en el conjunto de todas las variantes de secuencias de TCR en dicho tejido. El método de Sufficool et al. determina las cantidades relativas de secuencias únicas del gen TCR. Este conjunto, sin embargo, es heterogéneo; comprende células con diferentes sitios de inserción de transgenes y números de copias en sus genomas, lo que da como resultado una variación del nivel de expresión de la proteína.

Un componente crítico en el control de la producción de productos biológicos a partir de líneas celulares de mamíferos es la caracterización y prueba del sustrato celular para asegurar la identidad, pureza e idoneidad de estas células para el procedimiento de fabricación. Por lo tanto, es necesario aislar clones derivados de células individuales (ICH Q5D) que presenten los niveles más altos de expresión de proteínas, tasas de proliferación y la mejor calidad de producto. Con este fin, las células individuales se recuperan del conjunto de células heterogéneas mediante una serie de etapas de dilución limitada o depósito de células individuales por FACS con generación de imágenes concomitante y un escrutinio elaborado para aislar un pequeño número de clones candidatos. A continuación, los candidatos más prometedores se criopreservan como banco pre-maestro de células (pre-MCB) y se evalúan para determinar la estabilidad del paso que debería cubrir la mayor duración de fabricación posible. Además de la estabilidad fenotípica, es necesario evaluar la estabilidad genética de las líneas celulares en ausencia de presión selectiva, que generalmente no se aplica en la fase de producción. Una vez que se ha identificado una línea celular óptima, se produce un banco maestro de células (MCB). Un MCB se define como una alícuota de un único conjunto de células que se ha preparado a partir de un único clon de células seleccionado en condiciones definidas, se ha distribuido en varios viales y se ha almacenado en condiciones definidas (normalmente -100°C y menos). El desarrollo del procedimiento para la producción comercial se inicia basándose a tal MCB, que se expande para generar los bancos de células de trabajo (WCB), que se utilizan para el procedimiento de fabricación. La aprobación de un MCB y WCB como línea celular de producción en la industria farmacéutica depende del cumplimiento de estrictos requisitos impuestos por las autoridades sanitarias nacionales e internacionales. Los requisitos importantes para la aprobación de líneas celulares recombinantes como línea celular de producción incluyen la validación de la clonalidad y las pruebas de contaminación microbiana de la línea celular (p. ej., retrovirus o micoplasma).

En caso de falta de evidencia documentada de clonalidad que podría deberse a una sola ronda limitada de clonación por dilución en lugar de dos rondas, falta de generación de imágenes el primer día en caso de clonación FACS o documentación incompleta, las autoridades sanitarias requerirán evidencia adicional para aumentar la garantía de clonalidad del MCB. Los métodos más aceptados son FISH y análisis de transferencia Southern de MCB y WCB. Sin embargo, este método a menudo carece de sensibilidad, especialmente en líneas celulares con un número bajo de copias del GOI y, por lo tanto, a menudo es difícil de interpretar. Además, todas las líneas celulares con más de unos pocos sitios de inserción, tales como las generadas por la transducción viral que contienen decenas o incluso cientos de sitios de inserción, no pueden analizarse mediante FISH. También se pueden usar análisis de transferencia Southern, pero carecen de sensibilidad en caso de que haya un porcentaje muy bajo de contaminación y a menos que se use una cantidad suficiente de enzimas de restricción. Requiere el conocimiento de las regiones genómicas que flanquean el sitio de inserción de GOI. Se podrían obtener pruebas de apoyo adicionales del seguimiento de los títulos de producción de proteínas y varias características específicas, incluida la morfología celular, los parámetros del cultivo celular, incluida la viabilidad celular, el crecimiento celular y la calidad del producto. Sin embargo, tales procedimientos son muy laboriosos y requieren mucho tiempo. Por lo tanto, existe una fuerte motivación para proporcionar nuevas formas de determinar la clonalidad de las líneas celulares de producción (MCB) para eludir el laborioso, costoso y lento escrutinio de clones actualmente necesario antes de que una línea celular determinada pueda aprobarse para el uso en la producción de una proteína farmacéutica. Proporcionar un método para determinar la clonalidad de un MCB dado por medios que reduzcan en gran medida las etapas de evaluación que requieren mucho tiempo y trabajo, ayudaría en gran medida a promover una evaluación de calidad rápida y confiable de la clonalidad de las líneas celulares de producción. Es un objetivo de la presente invención abordar tales necesidades.

Compendio de la invención

De acuerdo con el objetivo anterior, la presente divulgación se refiere a un método para determinar la clonalidad de un Banco Maestro de Células (MCB), resultando dicho MCB de la inserción predecible o no predecible de un transgén de secuencia conocida en el genoma de una célula progenitora anfitriona (HPC) de secuencia conocida.

En un aspecto de la presente divulgación, el método comprende las etapas de:

a) Identificar una o más regiones de inserción de transgenes (TIR) en el genoma de una célula subclonal de referencia (RSC), en donde la RSC se ha expandido a partir del MCB para el que se va a determinar la clonalidad, y en donde dicha identificación se logra mediante

i. secuenciación de extremos emparejados de dicho genoma de RSC para obtener una secuencia de genoma de RSC o secuencias de genoma de RSC; y

ii. alineamiento de dicha secuencia o secuencias del genoma de RSC con dicha secuencia de genoma de HPC conocida y dicha secuencia de transgén conocida,

produciendo así una o más regiones de inserción de transgenes (TIR);

b) Determinar una o más TIR identificadas en la etapa (a) con el mayor grado de cobertura de secuencia,

en donde dicha cobertura de secuencia se refiere al número de veces que se lee una secuencia de ácido nucleico dada que contiene una TIR dada durante el procedimiento de secuenciación mediante lecturas que se solapan parcialmente;

en donde dichas uno o más TIR con el grado más alto de cobertura de secuencia se asignan como TIR de referencia (RTIR);

c) Identificar una o más regiones de inserción de transgenes (TIR) en los genomas respectivos de una o más células subclonales (SC);

en donde cada una de las SC se ha expandido desde el MCB para el que se va a determinar la clonalidad pero es independiente de dicha RSC,

en donde dicha identificación se logra mediante

i. secuenciación de extremos emparejados de cada genoma de la SC respectiva para obtener una secuencia del genoma de la SC o secuencias del genoma de la SC; y

ii. alineamiento de cada secuencia o secuencias del genoma de la SC respectiva con dicha secuencia de genoma de HPC conocida y dicha secuencia de transgén conocida,

produciendo así una o más regiones de inserción de transgenes comparativas (CTIR);

d) Comparar dichas una o más RTIR determinadas en la etapa (b) con las CTIR respectivas determinadas en la etapa (c);

e) Evaluar la correspondencia entre cada una de dichas una o más CTIR presentes en una SC respectiva y las RTIR correspondientes presentes en dicha RSC; y

f) Determinar la clonalidad de dicho MCB basándose en dicha correspondencia evaluada en la parte (e). En un aspecto alternativo del presente, el método comprende las etapas de:

g) Identificar una o más regiones de inserción de transgenes (TIR) en el genoma de una célula subclonal de referencia (RSC), en donde la RSC se ha expandido desde el MCB para el que se va a determinar la clonalidad, y en donde dicha identificación se logra mediante

iii. secuenciación de extremos emparejados de dicho genoma de RSC para obtener una secuencia de genoma de RSC o secuencias de genoma de RSC; y

iv. alineamiento de dicha secuencia o secuencias del genoma de RSC con dicha secuencia del genoma de HPC conocida y dicha secuencia de transgén conocida, produciendo así una o más regiones de inserción de transgenes (TIR);

h) Determinar una o más TIR identificadas en la etapa (a) con el mayor grado de cobertura de secuencia, en donde dicha cobertura de secuencia se refiere al número de veces que se lee una secuencia de ácido nucleico dada que contiene una TIR dada durante el procedimiento de secuenciación mediante lecturas que se solapan parcialmente;

en donde dichas una o más TIR con el grado más alto de cobertura de secuencia se asignan como TIR de referencia (RTIR);

i) Identificar una o más regiones de inserción de transgenes (TIR) en los genomas respectivos de una o más células subclonales (SC);

en donde dicha identificación se logra mediante

iii. secuenciación de extremos emparejados de cada genoma de SC respectivo para obtener una secuencia del genoma de SC o secuencias del genoma de SC; y

iv. alineamiento de cada secuencia o secuencias del genoma de SC respectivo con dicha secuencia del genoma de HPC conocida y dicha secuencia de transgén conocida,

j) Comparar dichas una o más RTIR determinadas en la etapa (b) con las CTIR respectivas determinadas en la etapa (c);

k) Evaluar la correspondencia entre cada una de dichas una o más CTIR presentes en una SC respectiva y las RTIR correspondientes presentes en dicha RSC; y

l) Determinar la clonalidad de dicho MCB basándose en dicha correspondencia evaluada en la parte (e), en donde dicho MCB se considera monoclonal, si dicha RSC y dichas una o más SC se agrupan en la misma agrupación.

Como se explicó anteriormente, la monoclonalidad de los MCB se logra tradicionalmente mediante la dilución limitada de un conjunto de células en donde se ha insertado un transgén para producir una sola célula por pocillo de una placa de múltiples pocillos. Debido a que la inserción del transgén en cada célula diana individual es diferente (aleatoria o cuasialeatoria), se espera que una célula de MCB en un pocillo sea diferente de otra célula de MCB en otro pocillo, ya que cada célula de MCB representa el resultado de la inserción de un transgén independiente en diferentes ubicaciones dentro del genoma de la célula. Esto significa que, después de la inserción del transgén en una población previamente homogénea de células progenitoras del anfitrión, se obtiene una mezcla transgénicamente heterogénea de diferentes células que, después de la dilución, se aíslan, por separado de las células transgénicamente distintas, en un solo pocillo de una placa de múltiples pocillos.

Sin embargo, tal aislamiento por dilución se basa en una probabilidad estadística calculada. Por lo tanto, aunque la mayoría de los pocillos de una placa de múltiples pocillos probablemente contendrán solo una célula de MCB, no se puede excluir que algunos pocillos puedan contener más de una célula de MCB, mientras que otros pocillos podrían no contener ninguna. Especialmente el primer escenario, en el que un solo pocillo contiene múltiples células transgénicamente heterogéneas, lo que daría lugar a un MCB heterogéneo, complicará e incluso pondrá en peligro el procedimiento de aprobación regulador para una proteína farmacéutica resultante de la expresión de un transgén insertado. Esto se debe a que en tal escenario se asumiría incorrectamente (basándose en el cálculo estadístico del factor de dilución) que la proteína en cuestión se está expresando a partir de un solo tipo de célula, con un perfil de inserción de transgenes uniforme, cuando en realidad la proteína se está expresando a partir de múltiples tipos de células, cada una con un perfil de inserción de transgenes distinto. Tal variación puede dar lugar a diferencias en la naturaleza de la proteína producida, cuya exclusión es un requisito previo en el procedimiento de aprobación regulador. Por lo tanto, normalmente se aplican dos rondas de clonación de dilución limitada para minimizar la posibilidad de tener más de una célula de MCB por pocillo. Alternativamente, se puede realizar el seguimiento de una sola ronda de dilución limitada o depósito de una sola célula mediante generación de imágenes que confirme que se ha colocado una sola célula de MCB en un solo pocillo. Sin embargo, ninguno de estos métodos puede garantizar el hecho de que se haya depositado una sola célula en el pocillo. En el caso de la dilución limitada, siempre existe una incertidumbre estadística, aunque pequeña en el caso de dos rondas de clonación de dilución limitada. En el caso de la generación de imágenes de células, es posible que no se detecte una segunda célula ya que está en una esquina del pocillo, adherida al costado del pocillo o fuera del plano focal de la cámara.

Comparando los sitios de inserción de transgenes seleccionados entre una célula de referencia elegida aleatoriamente expandida del MCB (supuestamente monoclonal) con los sitios de inserción correspondientes en otras células expandidas independientemente del MCB (supuestamente monoclonal), el método anterior permite ventajosamente la determinación confiable de la monoclonalidad. En el caso de que todas las células expandidas a partir de un MCB supuestamente monoclonal dado exhiban sitios de inserción transgénicos idénticos, se puede concluir de manera confiable que el MCB es de hecho monoclonal. Sin embargo, en caso de que las células se expandieran a partir de un MCB supuestamente monoclonal dado, exhibieran perfiles de inserción de transgenes divergentes, se puede concluir de manera confiable que el MCB supuestamente monoclonal no es de hecho monoclonal, sino que resulta de la inserción del transgén en ubicaciones genómicas incongruentes. Esta información confiable es invaluable en el procedimiento de aprobación regulador para proteínas producidas de manera recombinante destinadas a aplicaciones farmacéuticas.

En una realización de la invención, la secuenciación de extremos emparejados implica la secuenciación de una molécula de ácido nucleico dada de ambos extremos de dicha molécula de ácido nucleico, generando así pares de lecturas para una molécula de ácido nucleico dada que representa un fragmento del genoma que se debe secuenciar. En una realización adicional de la invención, la RSC se secuencia con una cobertura de secuencia más alta en comparación con dichas una o más SC.

En una realización adicional de la invención, dicho MCB resulta de la inserción de dicho transgén en múltiples posiciones en dicho genoma de HPC, en donde dicha inserción se efectúa preferiblemente usando un vector retroviral.

En una realización adicional de la invención, la determinación de las TIR comprende la clasificación de secuencias de la "lectura 1" de extremos emparejados y secuencias de la "lectura 2" de extremos emparejados obtenidas de las bibliotecas de extremos emparejados en 4 clases,

en donde la clase 1 comprende secuencias de la "lectura 1" que mapean dicho transgén; la clase 2 comprende secuencias de la "lectura 1" que mapean dicho genoma de HPC; la clase 3 comprende secuencias de la "lectura 2" que mapean dicho transgén; y la clase 4 comprende secuencias de la "lectura 2" que mapean dicho genoma de HPC,

donde dicha "lectura 1" y dicha "lectura 2" representan lecturas respectivas hacia adelante y hacia atrás correspondientes a los extremos 5' y 3' de una molécula de ácido nucleico dada dentro de una agrupación de ácidos nucleicos generada en la secuenciación de una biblioteca de ácido nucleico de dicha RSC o dichas una o más SC.

en donde la clase 1 comprende secuencias de la "lectura 1" que mapean exclusivamente dicho transgén; la clase 2 comprende secuencias de la "lectura 1" que mapean exclusivamente dicho genoma de HPC; la clase 3 comprende secuencias de la "lectura 2" que mapean exclusivamente dicho transgén; y la clase 4 comprende secuencias de la "lectura 2" que mapean exclusivamente a dicho genoma de HPC,

En una realización adicional de la invención, las secuencias de la “lectura 1" se combinan con las correspondientes secuencias de la “lectura 2" utilizando un identificador de secuencia de celda de flujo,

en donde dicho identificador de secuencia comprende información de la calle de la celda de flujo, el número de tesela dentro de la celda de flujo, la coordenada "x" de la agrupación de ácidos nucleicos dentro de una tesela y la coordenada "y" de la agrupación de ácidos nucleicos dentro de una tesela, asignando de ese modo a cada par de secuencias correspondiente a las secuencias de la “lectura 1" y la "lectura 2" una posición única dentro de la celda de flujo. En una realización adicional de la invención, las respectivas secuencias de la “lectura 1" y la "lectura 2" de un par de lectura respectivo se alinean por separado con las secuencias conocidas del transgén y el genoma de HPC.

En una realización adicional de la invención, solo se seleccionan los pares de lectura que comprenden secuencias de clase 1 y 4 y los pares de lectura que comprenden secuencias de clase 2 y clase 3 para análisis adicional.

En una realización adicional de la invención, dichas TIR se identifican alineando las secuencias de lectura de extremos emparejados correspondientes a la clase 2 y clase 4 con el genoma de HPC, definiendo así una región de 2 kb para cada una de dichas TIR en el genoma de HPC.

En una realización adicional de la invención, el método para determinar la clonalidad de un MCB comprende determinar n RTIR con la cobertura de secuencia más alta en la biblioteca de NGS de extremos emparejado, en donde n es un número entero de 5 a 50. Por ejemplo, el número entero n puede configurarse como 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50. En una realización adicional de la invención, las primeras n RTIR con la cobertura de secuencia más alta se determinan en función de (a) el número de lecturas de una secuencia de extremos emparejados respectiva correspondiente a la clase 2 y la clase 4 que mapean el genoma de HPC, en donde el número más alto de lecturas indica la inclusión como una RTIR, y (b) el solapamiento parcial del número de lecturas de una secuencia de lectura de extremos emparejados respectiva correspondiente a la clase 2 y la clase 4, en donde el solapamiento parcial inferior del número de lecturas indica la inclusión como una RTIR.

En una realización adicional de la invención, cada una de las primeros n RTIR en dicho genoma de RSC se compara con la ubicación genómica correspondiente de dichas CTIR en cada uno de dichos uno o más genomas de SC. En una realización adicional de la invención, la comparación de dichas RTIR en dicha RSC y dichas CTIR en dichas una o más SC se logra generando una matriz de presencia/ausencia de regiones de inserción, en donde una dimensión de matriz representa dichas n RTIR de dicho transgén en dicho genoma de RSC y otra dimensión de matriz, preferiblemente ortogonal, representan dicha RSC y cada una de dichas una o más SC.

En una realización adicional de la invención, la presencia o ausencia de una CTIR respectiva en dichas una o más SC con relación a una RTIR respectiva en dicha RSC se representa en la matriz como un código de color binario, en donde un primer color representa la presencia o ausencia respectivas de una RTIR respectiva en dicha RSC, la presencia o ausencia respectivas de una CTIR respectiva en dichas una o más SC; y en donde un segundo color representa la ausencia o presencia respectivas de una RTIR respectiva en dicha RSC, la ausencia o presencia respectivas de una CTIR respectiva en dichas una o más SC.

En una realización adicional de la invención, la relación entre dicha RSC y cada uno de dichas una o más SC se evalúa mediante el cálculo de una matriz de distancias.

En una realización adicional de la invención, la matriz de distancias se calcula basándose en la siguiente fórmula (I),

Dd (RSC.SCm) = 1 -(2* N(total) / [N(CTIR) N(RT|R)])

donde Dd (RSC, SCm) representa la función de distancia entre dicho genoma de RSC y un genoma de SCm respectivo, en donde N(total) es el número de regiones de inserción presentes tanto en dicho genoma de RSC como en dicho genoma de SCm; N(ctir) es el número total de regiones de inserción presentes en dicho genoma de SCm ; y N(rtir) es el número total de regiones de inserción presentes en dicho genoma de RSC; en donde Dd (RSC, SCm) representa la distancia, a una escala de 0 a 1; en donde una distancia de 0 representa la identidad clonal entre dicha RSC y una SCm respectiva y 1 representa la diferencia clonal.

En una realización adicional de la invención, los parámetros N(total), N(ctir) y/o N(rtir) se calculan en función de la matriz de presencia/ausencia de las regiones de inserción.

En una realización adicional de la invención, el método comprende representar dichas una o más SC con relación a la RSC en una matriz de distancia común.

En una realización adicional de la invención, se considera que dos genomas respectivos pertenecen a una agrupación común si la distancia entre ellos calculada de acuerdo con la Fórmula (I) es 0.

En una realización adicional de la invención, dicho MCB se considera monoclonal, si dicha RSC y dichas una o más SC se agrupan en la misma agrupación.

Descripción de las figuras

La figura 1 es un diagrama de flujo continuo de tres partes que ilustra una realización del método inventivo para determinar la clonalidad de un banco maestro de células (MCB).

Figura 1 (a): después de la transfección, por ejemplo la transfección mediada por retrovirus, de una célula progenitora anfitriona (HPC) (100) con un transgén y una dilución limitante (101) (es decir, una dilución para dar como resultado no más de una célula por volumen previsto de alícuota), los posibles candidatos para MCB (102), que contienen el transgén en múltiples posiciones en sus respectivos genomas, se aíslan y las células individuales se expanden adicionalmente (103) para obtener uno o más subclones (SC) (104). En el caso de análisis de células individuales, las células individuales se someten directamente a extracción de ADN. A continuación, el ADN total de los uno o más subclones se extrae (105, 106) y se convierte en las respectivas bibliotecas de ADN (107, 108) en preparación para la secuenciación (p. ej., ''secuenciación de nueva generación" (NGS)). Como parte de esta preparación, cada biblioteca respectiva se puede hibridar sobre una celda de flujo (109) que se prepara previamente con secuencias adaptadoras direccionadas complementarias a los fragmentos de ADN genómico. A continuación, sigue la amplificación y la generación de agrupaciones (110) de los moldes direccionados. Esto da como resultado agrupaciones de secuencias direccionadas sobre una tesela respectiva de la celda de flujo (111), reflejando el direccionamiento el direccionamiento original de las secuencias adaptadoras complementarias mencionadas anteriormente.

Figura 1(b): Se realiza la secuenciación de los extremos emparejados de las bibliotecas (112) y a continuación, se alinean las secuencias obtenidas, por ejemplo, se alinean mediante ordenador con las secuencias correspondientes al genoma de HPC o al transgén, ambos conocidos (113) . A continuación, las secuencias se separan conceptualmente en 4 clases como sigue: la clase 1 corresponde a las secuencias de lectura 1 que se alinean con el transgén (114); clase 2 correspondiente a las secuencias de lectura 1 que se alinean con el genoma de HPC (115); clase 3 correspondiente a las secuencias de la lectura 2 que se alinean con el transgén (116); y la clase 4 correspondiente a las secuencias de la lectura 2 que se alinean con el genoma de HPC (117). Las secuencias de la lectura 1 y la lectura 2 representan lecturas respectivas hacia adelante y hacia atrás correspondientes a los respectivos extremos 5' y 3' de una molécula de ácido nucleico dada dentro de una agrupación de ácidos nucleicos dada (111) generado en la secuenciación de una biblioteca de ácido nucleico dada (108) .. Siguiendo la clasificación de secuencia anterior, se asignan pares de lectura (118). Las secuencias de lectura 1 de clase 1 o 2 se combinan con las secuencias de lectura 2 correspondientes de clase 3 o 4. La asignación correcta de los pares de lectura complementarios se puede lograr, p. ej. mediante un identificador de secuencia que está codificado en el archivo FastQ generado durante la etapa de secuenciación para cada molécula de ácido nucleico. Las respectivas secuencias de la lectura 1 y la lectura 2 de un par de lectura respectivo se alinean a continuación por separado con la secuencia del transgén o con el genoma de HPC. Los pares de secuencia en los que la lectura 1 mapea el transgén (114) y la lectura 2 mapea el genoma de HPC (117) (es decir, los pares de clase 1/4 (120)) y los pares de secuencia en los que la lectura 1 mapea el genoma de HPC (115) y la lectura 2 mapea el transgén (116) (es decir, pares de clase 2/3 (122)) se mantienen para un análisis adicional. Los pares de secuencias en los que las secuencias de la lectura 1 y la lectura 2 mapean el transgén (114, 116, 119) o el genoma de HPC (115, 117, 121) no son adecuados para la identificación de la región de inserción del transgén (TIR) y son por lo tanto, descartados (119, 121) del conjunto de pares de secuencias. Los pares de secuencias que mapean el genoma de HPC y que corresponden a los pares de lectura de clase 1/4 (114, 117, 120) y clase 2/3 (115, 116, 122) comprenden secuencias genómicas del genoma que representan regiones dentro del genoma de HPC que cubren los límites entre el genoma de HPC y el transgén.

Figura 1 (c): las TIR se identifican mediante el alineamiento de secuencias de extremos emparejados correspondientes a la clase 2 y la clase 4 para el genoma de HPC (123). Por razones de claridad, la Figura 1 (c) muestra solo el primer caso de alineamiento de secuencias de clase 2 con el genoma de HPC, pero se puede imaginar un caso de imagen especular en donde las secuencias de clase 4 se alinearían con el genoma de HPC en el lado opuesto del transgén insertado. El alineamiento de las lecturas con el genoma de HPC da como resultado una ventana de aproximadamente 1000 nucleótidos (1 kb) para una región de inserción de transgenes dentro del genoma de HPC. La ventana de aproximadamente 1000 nucleótidos está determinada por el tamaño medio de inserción de la biblioteca de ADN y, por lo tanto, puede ajustarse a necesidades específicas. Es decir, los alineamientos descritos anteriormente y mostrados en la Figura 1 (c) (123) permiten señalar la región de inserción del transgén dentro de aproximadamente 1 kb. Para fortalecer la robustez estadística de esta predicción de la ubicación de TIR, la TIR determinada se extiende a una ventana de 2 kb, comenzando desde el centro de la región de 1 kb y extendiendo esta región de 1 kb en ambos lados en 500 pb (124). A continuación, las TIR identificadas en un subclón seleccionado al azar (RSC), que se secuenció con una cobertura de secuencia más alta en comparación con los subclones restantes (SC), se analizan para determinar su cobertura de secuencia y el número de lecturas para obtener una o más regiones de inserción del transgén de referencia (RTIR) (125). En particular, las RTIR se seleccionan en función del número total de lecturas de secuencia que mapean una posición dada del genoma de HPC. Las TIR que están representadas por una cobertura de secuencia más alta que otras se asignan como RTIR. Otro requisito para la asignación como RTIR es un bajo grado de solapamiento entre las lecturas de secuencia respectivas que representan una TIR dada. Las TIR en la que las lecturas de secuencia tienen un bajo grado de solapamiento (p. ej., TIR2, TIR5, TIR6 y TIRs en la Figura 1(c) (126)) tienen más probabilidades de representar regiones de inserción creíbles dentro del genoma de HPC que las secuencias que se caracterizan por grandes solapamientos de su número de lecturas (p. ej., TIR1, TIR7 y TIR10 en la Figura 1(c) (126)). Esto se debe a que las supuestas TIR caracterizadas por un alto grado de solapamiento exacto probablemente representan artefactos de PCR del procedimiento de amplificación. Las RTIR obtenidas en el subclón elegido aleatoriamente (RSC) se utilizan a continuación para la comparación (127) con las regiones de inserción de transgenes comparativas correspondientes (CTIR) en los uno o más subclones (SC), determinados de forma análoga al procedimiento expuesto anteriormente. Las CTIR en un genoma de SC dado pueden, por ejemplo, compararse con las RTIR correspondientes en la RSC en una matriz de presencia/ausencia como un código de color binario (128).

En tal matriz, un color (p. ej., color negro en (128)) indica que una CTIR en una SC respectiva es congruente con una RTIR correspondiente en la RSC. A la inversa, otro color (p. ej., color blanco en (128)) indica que una CTIR en una SC respectiva no es congruente con una RTIR correspondiente en la RSC. En la matriz ilustrativa de presencia/ausencia (128), la congruencia de todas las CTIR en SC2, SC3 y SC5 con cada una de las RTIR en la RSC sugiere que SC2, SC3 y SC5 son idénticas entre sí en cuanto a composición genética, así como a la RTIR con respecto a las ubicaciones de inserción del transgén. Por el contrario, la presencia de casillas de color blanco en las columnas correspondientes a SC1 y SC4 indica que ciertas RTIR en la RSC están ausentes en estas SC; SC1 y SC4 no son idénticas entre sí o a la RSC con respecto a las ubicaciones de inserción del transgén.

Dado que cada una de las SC y la RSC resultaron de la expansión independiente del mismo MCB (supuestamente monoclonal), en principio una desviación en cualquier CTIR en una SC dada de la RTIR correspondiente en la RSC (es decir, una casilla de color blanco en cualquier lugar de la matriz de presencia/ausencia (128)), es una indicación de que el MCB que se asumió originalmente, basándose en una dilución estadísticamente limitante, que era monoclonal, en realidad no es monoclonal, sino que probablemente contenía múltiples células genéticamente distintas en el mismo pocillo o la cobertura de secuencias es demasiado pequeña y se encuentran presentes muy pocos sitios de inserción en la SC, pero técnicamente se han perdido, ya que no se obtuvieron lecturas de secuencia. Alternativamente, las líneas celulares clonales originales han cambiado genéticamente de tal manera que algunas células han perdido ciertos sitios de inserción mientras que otras han mantenido los sitios de inserción de transgenes originales lo que indica que el MCB es inestable y se ha vuelto policlonal. Por el contrario, la congruencia entre todas y cada una de las CTIR en cada SC evaluada con la RTIR correspondiente en la RSC (es decir, casillas de color negros en todas partes en la matriz de presencia/ausencia (128)) es una indicación de que la suposición original de que el MCB era monoclonal era correcta, y que de hecho solo había una célula en el pocillo inicial después de una dilución estadísticamente limitante. Por tanto, la matriz de presencia/ausencia (128) puede verse como una indicación cualitativa de clonalidad. La clonalidad entre la RSC y las una o más SC puede evaluarse adicionalmente cuantitativamente, p. ej. calculando el coeficiente de Dice para cada una de las CE evaluadas. El coeficiente de Dice es una expresión del grado de similitud entre la RSC y una SC respectiva basado en el grado de congruencia entre las RTIR en la RSC y las CTIR correspondientes en una SC dada. De esta forma, los resultados obtenidos de la matriz de presencia/ausencia (128) pueden representarse adicionalmente en una matriz de distancias (130). Las distancias de las respectivas SC con respecto a la RSC pueden representarse como puntos a lo largo de una escala de 0 a 1 en una matriz de distancia bidimensional (130), donde 0 indica la identidad clonal completa con respecto a todas las TIR evaluadas y 1 representa disimilitud clonal completa con respecto a todas las TIR evaluadas. Los puntos que se superponen entre sí forman una llamada "agrupación", que es un grupo de genomas de SC respectivos que exhiben la misma distancia y, por lo tanto, congruencia genética con el genoma de RSC. Este es, por ejemplo, el caso en (130) para SC2, SC3 y SC5. Se considera que uno o más genomas de SC respectivos pertenecen a la misma agrupación en comparación con el genoma de RSC si la distancia entre ellos calculada según el coeficiente de Dice es 0 (es decir, siempre que los puntos de datos se superpongan). Un coeficiente de Dice de "0" entre dos clones respectivos significa que los dos clones en cuestión comparten identidad genómica, es decir, tienen regiones de inserción de transgenes congruentes. Si la RSC y cada una de las una o más SC se agrupan en la misma agrupación, el MCB para el que se debe determinar la clonalidad se considera monoclonal.

Lo anterior significa que si todos los loci en una matriz de presencia/ausencia, incluidos los de RSC y todos los de SC, son del mismo color, se puede concluir monoclonalidad. Si los resultados de la matriz de presencia/ausencia se expresan numéricamente por el coeficiente de Dice, lo anterior significa que se puede concluir monoclonalidad si todos los puntos de datos correspondientes a las SC se superponen en un solo punto, y un solo punto corresponde al coeficiente de Dice igual a 0.

El grado de certeza aumenta con el número de TIR comparadas y se determina que son congruentes. En última instancia, si los genomas completos de RSC y SC están completamente secuenciados, esto daría como resultado una certeza de 100% de que una SC dada es idéntica a una RSC. Cuanto mayor sea el número de SC analizadas, más probable será determinar si un MCB es monoclonal. En un caso ideal, varios cientos o incluso miles de clones se analizan de esta manera.

La Figura 2 ilustra el diseño esquemático de una celda de flujo ilustrativa (200) en la que se inmovilizan las moléculas de ADN de una biblioteca de ADN determinada, se amplifican en "puente" para generar agrupaciones y se secuencian para obtener millones de copias de una molécula de ADN respectiva. Una celda de flujo se divide en 8 calles (201) y cada calle (202) comprende 50 teselas (203) a las que se unen las moléculas de ADN mediante la hibridación con el adaptador. A continuación, las moléculas de ADN se amplifican para generar miles de copias de una sola molécula de ADN ("agrupaciones" (204)). A cada una de estas agrupaciones se le pueden asignar coordenadas "x" e "y" durante la secuenciación para identificar con precisión la ubicación exacta de una agrupación determinada (204) o molécula de ADN dentro de la tesela (203) de la celda de flujo (200). Durante la secuenciación de nueva generación (NGS) se generan datos sin procesar. A continuación, estos datos sin procesar se convierten en archivos FastQ. Los archivos FastQ almacenan la secuencia biológica de la molécula de ADN y sus correspondientes puntuaciones de calidad en un formato de texto. Los archivos FastQ contienen adicionalmente un identificador de secuencia que comprende información sobre el nombre único del aparato utilizado para la secuenciación, la calle de la celda de flujo, el número de tesela dentro de la celda de flujo y las coordenadas "x" (205) e "y" (206) de una agrupación de ADN (204) correspondiente a una molécula de ADN dada dentro de la tesela (203). El identificador de secuencia comprende adicionalmente información sobre el miembro de una lectura de secuenciación de extremos emparejados dada (es decir, identifica una secuencia dada como "lectura 1" o como "lectura 2"). En base a este identificador de secuencia, por lo tanto, es posible identificar exactamente la posición, o dirección, de una agrupación de ADN o una molécula de ADN dentro de la celda de flujo (200). Más importante aún, es posible identificar los pares de lectura correspondientes (es decir, lectura 1 y lectura 2) generados en la etapa de secuenciación de extremos emparejados en función de la información del identificador de secuencia almacenada en archivos FastQ generados para la molécula de ADN secuenciada.

La Figura 3 ilustra la identificación de regiones de inserción de transgenes (TIR) por alineamiento de lecturas de clase 2 (302) con el genoma de HPC (300) y lecturas de clase 3 (303) al transgén (301). De manera similar, sería posible representar lecturas de clase 1 y clase 4 en el otro lado del transgén (301) en la Figura 3, pero análogamente a la descripción de la Figura 1 anterior, estas se han omitido por razones de concisión. Las lecturas alineadas abarcan una región de aproximadamente 1000 nucleótidos (1 kb) (304) dentro del genoma de HPC (300), que define la supuesta región de inserción del transgén. Para aumentar la solidez estadística y hacer que la predicción de la ubicación de TIR sea más creíble, las supuestas regiones de inserción del transgén se extienden a una ventana de 2 kb (306) comenzando desde el centro de la región de 1 kb (304) y extendiéndose en ambos lados por una región de 500 pb (casillas de color gris (305)). El centro de la región de inserción de 1 kb se define como el nucleótido en el genoma de HPC con la cobertura de secuencia más alta (véase la distribución gaussiana (307)). La consideración una región de inserción de 2 kb del transgén hace que la predicción de las TIR en el genoma de HPC sea mucho más creíble porque permite una comparación más confiable de TIR entre diferentes subclones incluso en el caso en que se produzcan pequeñas variaciones en el alineamiento de secuencia de los uno o más subclones. Además, el alineamiento de las secuencias de clase 2 (302) y clase 3 (303) con el genoma de HPC (300) no representa la posición exacta de la región de inserción del transgén en el genoma de HPC ya que las secuencias correspondientes a la lectura 1 o la lectura 2 de un par de secuenciación de extremos emparejados suele abarcar sólo de 200 a 500 pb. Sin embargo, el molde que se va a secuenciar puede tener una longitud de 800 pb o más (determinada por el tamaño medio del inserto de la biblioteca de ADN). Esta diferencia puede conducir potencialmente a un espacio de 300 a 600 pb en la que podría estar ubicado el sitio de inserción del transgén real. Por lo tanto, la expansión de la región de inserción del transgén predicha en una región adicional de 500 pb en cada sitio de la región de 1 kb aumenta la credibilidad de las TIR predichas ya que esta expansión tiene en cuenta posibles espacios en las secuencias en las que se podrían situar los sitios de inserción del transgén reales.

La Figura 4 ilustra el concepto de determinación de las regiones de inserción de transgenes de referencia (RTIR) en el genoma de RSC (400). Las TIR identificadas en la RSC se analizan para determinar su cobertura de secuencia y el número de lecturas para obtener TIR creíbles que se pueden utilizar como referencias para la comparación de TIR en una o más SC. La RSC se secuencia con cobertura de secuencia más alta para permitir una predicción más confiable de las regiones de inserción de transgenes en el genoma de la RSC (400). En particular, una cobertura de secuencia más alta evita la identificación de falsas TIR en el genoma de RSC debido a artefactos de PCR. Las RTIR se seleccionan en función del número total de lecturas de secuencia y un bajo solapamiento de lecturas de secuencia. La razón de esto es que los artefactos de PCR tienden a generar múltiples copias, que son exactamente la misma secuencia, mientras que muchas secuencias parcialmente solapantes que convergen en una única ubicación pueden haberse originado solo a partir de la fragmentación aleatoria del genoma del anfitrión durante la preparación de la biblioteca. Las primeras deben excluirse por no predecir verdaderamente la ubicación de las (R) TIR, mientras que las segundas deben incluirse.

Para ilustrar esto, la Figura 4 muestra 10 regiones de inserción de transgenes diferentes (TIR1 a TIR10) ubicadas en el genoma de RSC. Aunque TIR7 tiene la cobertura de secuencia más alta de las diez TIR (es decir, el mayor número de lecturas solapantes) probablemente no representa una TIR creíble porque las lecturas en TIR7 son idénticas. Lo mismo se aplica para TIR1, TIR10 y TIR3; mientras que el número de lecturas solapantes en cada una de las 3 últimas TIR es menor que el número en TIR7. Como se explicó anteriormente, tales secuencias "acumuladas" se deben más probablemente a "artefactos" de secuenciación que podrían haberse introducido durante la preparación de la biblioteca o la amplificación por PCR, p. ej. debido a sesgos de secuencia, pero no representan regiones de inserción de transgenes confiables que sean adecuadas como referencias para la comparación de las una o más SC con la RSC. Según los requisitos anteriores, las cinco mejores regiones de inserción, en orden de confiabilidad descendente, serían TIR2 (p. ej., RTIR2) seguido de RTIR5, RTIRs, RTIR6 y RTIR4. Cada una de estas cinco TIR exhibe un solapamiento de secuencia parcial, con un mayor número de lecturas parcialmente solapantes en una ubicación, lo que indica una mayor confiabilidad.

La Figura 5 ilustra los resultados (p. ej., del Ejemplo 5) obtenidos mediante la comparación de las regiones de inserción de transgenes (TIR) entre 25 subclones ilustrativos, el MCB y un MCBá divergente (el MCBá resultante de la inserción de un gen diferente del MCB), que se muestra en una matriz de presencia/ausencia como se describe anteriormente. El eje "y" de la matriz de presencia/ausencia representa las posiciones de 20 RTIR (p. ej., las 20 RTIR con la cobertura de secuencia más alta, como se describe anteriormente) en el genoma del subclón núm. 25 (SC25). En la figura ilustrativa, SC25 se secuencia en 3 calles de la celda de flujo para obtener un mayor grado de cobertura de secuencia en comparación con otras bibliotecas relevantes (es decir, bibliotecas de MCB, MCBá y SC1 a SC24 que están secuenciadas cada una en la calle 1 de la celda de flujo (véase la Tabla 1; columna 2). Esta cobertura de secuencia más alta y la correspondiente mayor robustez en los resultados obtenidos para SC25 por lo tanto, justifican la asignación de SC25 como la RSC. Por tanto, las posiciones de las 20 RTIR se determinan en función de la cobertura de secuencia más alta en la biblioteca de SC25 en comparación con la cobertura de secuencia de las otras bibliotecas secuenciadas.

El eje "x" representa cada uno de los 25 subclones probados, el MCB y el MCBá. Como lo indica el código de color binario, ninguno de las 20 RTIR identificadas en SC25 está presente en el MCBá, mientras que el MCB y la mayoría de los subclones probados (es decir, SC1 a SC3 y SC5 a SC23) comparte las 20 RTIR con SC25, la RSC (véanse las bandas de color "blanco" en la calle más a la derecha que representan MCBá). Este resultado confirma que el MCBá es el resultado de una transfección aleatoria diferente de la que conduce al MCB, lo que da como resultado la inserción del transgén en diferentes posiciones en el genoma de HPC. Además, los datos ilustrativos muestran que el MCB y la mayoría de los 25 subclones comparten todos las RTIR identificadas (excepto SC4 y SC24), lo que indica que estos SC se originaron a partir de una sola célula monoclonal (MCB). SC4 y SC24, sin embargo, parece que carecen de una RTIR en su genoma respectivo. SC4 carece aparentemente de RTIR18, mientras que SC24 carece aparentemente de RTIR1.

En casos como estos, en los que casi todas las RTIR están presentes en una SC dada, existe una alta probabilidad de que la SC en cuestión sea de hecho idéntica en sus TIR a la RSC, y que la desviación en una sola TIR en la SC de su correspondiente RTIR en la RSC se deba a un artefacto de secuenciación.

Por lo tanto, para excluir esta posibilidad y determinar definitivamente si una SC dada es idéntica a la RSC correspondiente, puede ser útil analizar más a fondo la TIR aberrante en cuestión. Esto se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante secuenciación de Sanger. Si tal análisis de secuenciación adicional muestra que la desviación observada de la TIR en la SC de la RTIR correspondiente en la RSC es una aberración, y que la SC es de hecho idéntica a la RSC en esta posición, se puede concluir razonablemente que la ausencia aparente de la TIR en la SC puede deberse a una cobertura de secuencia baja, pero no a una ausencia real, de las TIR respectivas en la SC respectiva. En tal caso, la presencia de p. ej. RTIR18 en SC4 y RTIR1 en SC24 puede confirmarse, lo que indica que todos los subclones probados comparten las mismas (R) TIR con el MCB para el que se va a determinar la clonalidad. En tal caso, se puede concluir que la suposición inicial, basada en la dilución limitante, de que el MCB es monoclonal era correcta y que el MCB es de hecho monoclonal. La monoclonalidad de un MCB dado se puede concluir basándose en una matriz de presencia/ausencia si el perfil TIR en todas las SC que se obtienen del MCB es idéntico al perfil RTIR en la RSC.

La Figura 6 muestra una matriz de distancia que representa espacialmente la congruencia entre las RTIR/TIR en el MCB, cada una de las SC1 a SC25 y el MCBá divergente. Las distancias representadas se basan en el cálculo de los respectivos coeficientes de Dice de acuerdo con la fórmula (I), que se muestran en la presente memoria y en la Figura 6. Como se puede ver en la matriz de distancias calculada, todos los subclones, excepto SC4 y SC24, se agrupan en la misma agrupación con respecto al MCB para el que se va a determinar la clonalidad. SC4 y SC24 divergen ligeramente de este grupo debido a la aparente falta de RTIR1 en SC24 y RTIR18 en SC4. Sin embargo, como se explicó anteriormente para la Figura 5, se puede realizar un análisis adicional de las TIR divergentes mediante otros métodos (p. ej., secuenciación de Sanger) para determinar si las TIR aparentemente ausentes están de hecho presentes. En este caso, la matriz de presencia/ausencia (Figura 5) y la matriz de distancia correspondiente (Figura 6) se pueden corregir en consecuencia. La monoclonalidad de un MCB dado se puede concluir basándose en una matriz de distancia si la distancia calculada según la fórmula (I) es "0" para los subclones probados. Como era de esperar, el MCBá genéticamente distinto tiene una distancia calculada de "1" que indica que este clon se obtuvo de una célula transfectada independientemente.

Definiciones

Clonalidad

Como se emplea en la presente memoria, el término "clonalidad" describe la constitución genética de una célula en cuestión, en particular con respecto a la similitud o disimilitud con una constitución genética de referencia. Por ejemplo, un "clon" se refiere a un grupo de células genéticamente idénticas que comparten un progenitor común, es decir, derivan de una sola célula y, por lo tanto, tienen genomas idénticos. El término "monoclonal" como se emplea en la presente memoria describe un grupo de células genéticamente idénticas, que derivan de una única célula progenitora genéticamente idéntica. Las células monoclonales se definen como un grupo de células producidas a partir de una única célula progenitora mediante replicación celular repetida y, por tanto, pueden configurarse para formar un único "clon" con perfiles de expresión génica y características de proliferación similares. En particular, el término "monoclonal", como se emplea en la presente memoria, se refiere a un grupo de células o clones que comparten ubicaciones genómicas idénticas de inserción de transgenes. El término "policlonal", como se emplea en la presente memoria, se refiere a un grupo de células derivadas de más de una célula progenitora, que son genéticamente distintas entre sí. Las células policlonales comprenden una mezcla de más de una célula con diferentes orígenes genéticos que tienen diferentes perfiles de expresión génica y/o características de proliferación. En particular, el término "policlonal" como se emplea en la presente memoria se refiere a una serie de células o clones que difieren en sus ubicaciones genómicas de inserción de transgenes.

Banco Maestro de Células (MCB)

El término "banco maestro de células" (MCB), como se emplea en la presente memoria, se refiere a una alícuota de un conjunto de células que se ha preparado a partir del clon de células seleccionado en condiciones definidas, dispensado en múltiples recipientes y almacenado en condiciones definidas. El MCB deriva de una célula progenitora anfitriona transfectada que incorporó una secuencia de ácido nucleico recombinante (o transgén), que normalmente comprende un gen de interés, en su genoma (es decir, la secuencia de ácido nucleico recombinante está en ese caso comprendida en el MCB). Las células transfectadas positivamente se cultivan a continuación en condiciones de selección para obtener un conjunto de células policlonales que incorporan el transgén de interés en el genoma, aunque en ubicaciones genómicas que difieren de una célula a otra. A continuación, este conjunto de células se prueba en busca de los mejores candidatos para la expresión transgénica mediante una serie de diluciones limitantes (es decir, una dilución para dar como resultado menos de una célula por volumen de alícuota previsto) combinada con análisis de la expresión de proteínas y los perfiles de proliferación. A continuación, los mejores candidatos se diluyen adicionalmente para producir estadísticamente una sola célula a partir de la cual se origina el MCB. Estos candidatos a MCB (pre-MCB) se someten a pruebas adicionales para determinar la expresión de proteínas y diversas características específicas, incluida la morfología celular, los niveles de expresión de proteínas, la estabilidad de expresión, las tasas de proliferación y la calidad del producto. Además, el MCB debe probarse para detectar agentes endógenos, p. ej. contaminación por retrovirus, hongos o micoplasmas. El MCB establecido con características conservadas representa así una "reserva celular" que se almacena en condiciones definidas y que se puede usar como una línea celular de producción para, p. ej. expresión de proteínas recombinantes.

Célula progenitora anfitriona

El término "célula progenitora anfitriona" (HPC) como se emplea en la presente memoria se refiere a una célula, que sirve como anfitrión para la incorporación, p. ej. incorporación genómica, de una secuencia de ácido nucleico recombinante, también denominada transgén. La secuencia de ácido nucleico recombinante normalmente comprende un Gen De Interés (GOI) que codifica, p. ej. una proteína terapéuticamente relevante. En algunos casos, la secuencia de ácido nucleico recombinante también puede comprender un ADN o ARN terapéutico, p. ej. aptámeros de ADN o ARNip. La secuencia de ácido nucleico recombinante puede introducirse e integrarse de forma estable en el genoma de HPC mediante métodos de transfección conocidos. Las HPC son comúnmente de origen mamífero e incluyen p. ej. Células de ovario de hámster chino (CHO), mieloma de ratón (NS0, SP2/0), riñón de cría de hámster (BHK), riñón de embrión humano (HEK-293) y células retinianas humanas, pero no se limitan a estas.

Integración génica estable

El término "integración génica estable" o términos gramaticalmente relacionados tales como "integrado establemente", etc. se refiere a la incorporación de un transgén dado que comprende un GOI en el genoma de HPC, de modo que el transgén que comprende el GOI se mantiene en el genoma de la célula anfitriona durante los ciclos de proliferación celular y se replica junto con el genoma del anfitrión y aparece en las células de la progenie. Por lo tanto, una línea celular que ha experimentado una integración génica estable ha incorporado un transgén que comprende un GOI en su genoma y sus células hijas también contendrán el transgén que comprende el GOI en cada célula hija replicada.

Cuando se desarrolla una transfección estable, es ventajoso el uso de marcadores seleccionables, por ejemplo también comprendidos en el transgén, para distinguir la transfección transitoria de la estable. La coexpresión del marcador con un GOI determinado ayuda a identificar y seleccionar células que tienen la secuencia de ácido nucleico recombinante dada integrada en sus genomas, mientras que también selecciona células transfectadas transitoriamente, es decir, células que no han incorporado la secuencia de ácido nucleico recombinante dada con el marcador y el GOI en sus genomas. Por ejemplo, un método de selección común es la transfección de un transgén que codifica un GOI y un gen que confiere resistencia a antibióticos (p. ej., el gen de resistencia a neomicina, neo). Las células transfectadas transitoriamente se tratan a continuación con el antibiótico apropiado para la selección (p. ej., geneticina o G418 para células neo-transfectadas). Solo aquellas células que han integrado de manera estable la secuencia de ácido nucleico recombinante que comprende el GOI y el gen que confiere resistencia a antibióticos sobrevivirán en cultivos a largo plazo, permitiendo la selección y expansión de las células deseadas que han integrado de manera estable el transgén.

Transfección retroviral

Los retrovirus son virus de ARN de hebra sencilla que se integran de manera estable en el genoma de la célula anfitriona a través de un intermedio de ADN de doble hebra. Por tanto, los sistemas de vectores retrovirales tales como los vectores derivados del virus de la leucemia murina pueden usarse como herramientas eficaces para integrar de manera estable una secuencia de ácido nucleico recombinante en el genoma de la célula progenitora anfitriona (HPC), y este es el significado de "transfección retroviral" como se emplea en la presente memoria. Un vector retroviral puede comprender secuencias provirales que pueden acomodar la secuencia de ácido nucleico recombinante para permitir la incorporación de esta última en el genoma de HPC. El vector también puede comprender promotores de genes virales y celulares, tales como el promotor fuerte de CMV, para potenciar la expresión del transgén, incluido el GOI, en la célula progenitora anfitriona. La transfección mediada por virus da como resultado la inserción aleatoria o cuasialeatoria, p. ej. inserción preferida en sitios transcripcionalmente activos en el genoma de HPC de la secuencia de ácido nucleico recombinante en múltiples sitios en el genoma de HPC.

Secuencia de ácido nucleico recombinante

El término "secuencia de ácido nucleico recombinante", como se emplea en la presente memoria, se refiere a una molécula de ácido nucleico modificada genéticamente, por ejemplo, una molécula de ADN modificada genéticamente, que se genera mediante métodos de laboratorio (p. ej., clonación molecular). También se denomina transgén. La secuencia de ácido nucleico recombinante normalmente comprende un Gen De Interés (GOI) destinado a la expresión final en el MCB. Puede comprender adicionalmente secuencias de ácido nucleico adicionales útiles o necesarias para la identificación de células transfectadas de manera estable (p. ej., marcadores de resistencia a antibióticos y similares) y/o para facilitar la expresión del GOI en el MCB. La secuencia de ácido nucleico recombinante puede comprender material genético (p. ej., fragmentos de ADN) de diferentes fuentes biológicas (p. ej., células u organismos), creando así una secuencia recombinante que de otro modo no existiría en la naturaleza y que puede introducirse en el genoma de una célula progenitora anfitriona. La secuencia de ácido nucleico recombinante puede comprender alternativamente material genético (p. ej., fragmentos de ADN) de una única fuente biológica (p. ej., una sola célula u organismo), en la misma forma o similar en la que existe este material genético en la fuente biológica, pero manipulado y/o aislado mediante técnicas de laboratorio recombinantes conocidas por el personal experto. La secuencia de ácido nucleico recombinante comprende el GOI destinado a la expresión final en el MCB. En caso de que en la secuencia de ácido nucleico recombinante no estén comprendidas secuencias adicionales distintas de GOI, los términos "secuencia de ácido nucleico recombinante" y "GOI" se vuelven idénticos; en este caso, la secuencia de ácido nucleico recombinante, o transgén, consiste en el GOI. La presente divulgación prevé todas las variantes anteriores del término "secuencia de ácido nucleico recombinante".

Gen de Interés

El término "Gen De Interés" o "GOI", como se emplea en la presente memoria, se refiere a una secuencia de ácido nucleico, p. ej. una secuencia de ADN, que codifica al menos parte de una proteína recombinante. El GOI está comprendido en la secuencia de ácido nucleico recombinante. El GOI que codifica la proteína recombinante puede tomarse directamente del genoma de un organismo o una célula. Alternativamente, el GOI se puede obtener a partir de, o puede ser idéntico al, marco de lectura abierto resultante del corte y empalme de múltiples exones genómicos en una única secuencia de ácido nucleico contigua que codifica la proteína de interés, es decir, el GOI puede ser equivalente al ADN complementario (es decir, ADNc) al ARNm que codifica la proteína recombinante. El GOI puede aislarse en forma completa a partir de una fuente biológica apropiada o puede sintetizarse químicamente. El GOI puede comprender adicionalmente una modificación postranscripcional, p. ej. nucleósidos modificados y/o nucleótidos modificados. El GOI como parte del transgén se puede introducir en el genoma de la célula progenitora anfitriona. El GOI puede estar solo en el transgén, en cuyo caso el transgén y el GOI son coextensivos).

Proteína recombinante y expresión de proteína recombinante

El término "expresión de proteína recombinante" como se emplea en la presente memoria se refiere a la expresión de una proteína en una célula anfitriona que está codificada por una secuencia de ácido nucleico recombinante dada. En la mayoría de los casos, la proteína se expresará a partir del GOI comprendido en el transgén, es decir, la proteína recombinante será expresada por el GOI. Sin embargo, no se excluye que la proteína recombinante pueda expresarse a partir de una combinación del GOI y otras secuencias dentro del transgén.

Como se emplea en la presente memoria, el término "proteína recombinante" se refiere a una proteína, que se expresa a partir de la secuencia de ácido nucleico recombinante. En muchos casos, la proteína recombinante será una proteína de valor terapéutico y la secuencia de ácido nucleico recombinante se habrá integrado de forma estable en el genoma de una célula progenitora anfitriona para dar como resultado un MCB que se utilizará en la producción de esta proteína. Como se explicó anteriormente, la proteína puede considerarse "recombinante" en virtud de que está codificada y/o expresada a partir de una secuencia de ácido nucleico que resulta de la combinación, p. ej. utilizando metodología de laboratorio conocida para la manipulación controlada y/o aislamiento de secuencias genéticas in vitro, múltiples secuencias de ácidos nucleicos de diferentes fuentes biológicas u organismos en una forma que de otro modo no existe en la naturaleza. Alternativamente, la proteína puede considerarse "recombinante" en virtud de que está codificada y/o expresada a partir de una secuencia de ácido nucleico recombinante que, aunque ya existe en la naturaleza, fue manipulada y/o aislada utilizando una metodología de laboratorio conocida para la manipulación controlada y/o aislamiento de secuencias genéticas in vitro. La proteína recombinante puede codificarse y/o expresarse a partir de la secuencia de ácido nucleico recombinante, incluyendo el GOI comprendido en la secuencia de ácido nucleico recombinante junto con otras secuencias comprendidas en la secuencia de ácido nucleico recombinante. Alternativamente, la proteína recombinante puede codificarse y/o expresarse exclusivamente a partir del GOI comprendido en la secuencia de ácido nucleico recombinante, a pesar de la presencia de secuencias distintas del GOI en la secuencia de ácido nucleico recombinante. Alternativamente, la proteína recombinante puede codificarse y/o expresarse exclusivamente a partir del GOI comprendido en la secuencia de ácido nucleico recombinante cuando la secuencia de ácido nucleico recombinante no comprende secuencias distintas del GOI. En este último caso, se puede hacer referencia a que la proteína recombinante está codificada y/o expresada a partir del "transgén" o del "GOI", siendo estas dos entidades idénticas en ausencia de otros no GOI en la secuencia de ácido nucleico recombinante.

Promotor

Como se emplea en la presente memoria, el término "promotor" se refiere a un sitio específico de secuencia en el ADN, que es reconocido por los factores de transcripción y la ARN polimerasa para iniciar la transcripción del ARNm.

Virión

El término "virión", como se emplea en la presente memoria, se refiere a una partícula viral completa que consiste en ARN o ADN que están rodeados por una envoltura de proteína y que constituye la forma infecciosa de un virus. Alineamiento de secuencia (mapeo)

Como se emplea en la presente memoria, el término "alineamiento de secuencias" o "mapeo de secuencias" se refiere a una forma de ordenar las secuencias de ADN o ARN, en relación entre sí, para identificar regiones de similitud. Estas secuencias pueden ser consecuencia de relaciones funcionales, estructurales o evolutivas entre las secuencias. En el contexto de la presente invención, la alineamiento puede usarse en particular para dilucidar el origen de las células y el ácido nucleico comprendido en ellas, por ejemplo, si tales células resultan de un progenitor celular común o de progenitores celulares diferentes. Las secuencias alineadas de nucleótidos se representan típicamente como filas dentro de una matriz. Los términos "alineamiento" y "mapeo" como se emplea en la presente memoria tienen el mismo significado y, por lo tanto, son intercambiables entre sí. Los algoritmos bien conocidos para alineamientos de secuencia son, por ejemplo, el algoritmo de Needleman-Wunsch, el algoritmo de Smith-Waterman o el algoritmo de Waterman-Eggert o la transformada de Burrows-Wheeler. Herramientas bien conocidas para alineamientos de secuencias son, por ejemplo, BLAST, BLAT, WMBOSS, Clustal, BWA, Bowtie.

Subclón

El término "subclón" como se emplea en la presente memoria se refiere a un conjunto de células que se ha aislado de un banco maestro de células (MCB) como una sola célula, por ejemplo, como resultado de una dilución limitante (es decir, una dilución para dar como resultado no más de una célula por volumen de alícuota previsto) y posteriormente expandido a un conjunto de células. Todas las células del subclón comparten una organización genómica idéntica. En la presente invención, los subclones se expanden a partir de un cultivo de MCB dado que comprende un conjunto de células que se supone que son monoclonales. Por lo tanto, el MCB se divide en diferentes alícuotas de células en donde cada alícuota de células representa un subclón particular. Después de la expansión, los subclones se pueden usar para, por ejemplo, expresión de proteínas, análisis de clonalidad y similares. Los subclones que se originan a partir de un MCB monoclonal (un conjunto de células que se origina en una sola célula) comparten características genómicas idénticas y, por lo tanto, cada subclón se considera monoclonal con relación a cualquier otro subclón que se origine a partir del mismo, es decir, un MCB común. Los subclones que se originan a partir de un MCB policlonal (un conjunto de células que se originan en al menos dos células diferentes) tendrán diferentes características genómicas y perfiles de expresión de proteínas y, por lo tanto, se considerarán policlonales entre sí.

Subclón de referencia (RSC)

El término "subclón de referencia" (RSC), como se emplea en la presente memoria, se refiere a un subclón que se ha elegido aleatoriamente de un grupo de subclones expandidos a partir de un MCB, cuya clonalidad se va a determinar. El R SC se secuencia con una cobertura de secuencia más alta en comparación con los subclones restantes para obtener un número promedio más alto de lecturas que representan un nucleótido dado en la secuencia de referencia. Los datos de secuenciación del R SC se utilizan para identificar las una o más regiones de inserción de transgenes de referencia (RTIR).

Regiones de inserción de transgenes de referencia (RTIR)

El término "región de inserción de transgenes de referencia" (RTIR), como se emplea en la presente memoria, se refiere a una región de inserción de transgenes identificada en el genoma del subclón de referencia (RSC). Las regiones de inserción de transgenes se asignan como RTIR si tienen una alta cobertura de secuencia y un bajo solapamiento de número de lectura del número de lecturas de las lecturas en comparación con otras regiones de inserción de transgenes, como se explica en detalle en la presente memoria. Las RTIR en el R SC se comparan con las regiones de inserción de transgenes correspondientes en uno o más, mejor múltiples, subclones que se originan en el mismo MCB que el R SC para determinar la clonalidad del MCB.

Regiones de inserción de transgenes comparativas (CTIR)

El término "región de inserción de transgenes comparativa" (CTIR) como se emplea en la presente memoria se refiere a una región de inserción de transgenes en uno o más subclones que se originan en el mismo MCB que el RSC, comparándose dicha región de inserción de transgenes con una RTIR en el R SC en la posición genómica correspondiente .

Biblioteca de secuenciación de ADN

El término "biblioteca de secuenciación de ADN", como se emplea en la presente memoria, se refiere a una muestra de fragmentos de ADN genómico purificados a partir de una fuente biológica particular (p. ej., un MCB, RSC, S C o MCBá) que representa el genoma completo de dicha fuente biológica. En una biblioteca de secuenciación de ADN, los fragmentos de ADN genómico pueden ligarse en 3' y 5' a cebadores y secuencias adaptadoras para un análisis adicional de los fragmentos de ADN genómico (p. ej., análisis de secuenciación).

Por ejemplo, la preparación de una biblioteca de ADN para la secuenciación puede comenzar con la fragmentación de la muestra de ADN, que se purificó a partir de una fuente biológica particular. La fragmentación define los puntos de entrada de la molécula para las lecturas de secuenciación. En una etapa siguiente, los extremos del ADN se pueden reparar enzimáticamente y se puede añadir adenina (A) a los extremos 3' de los fragmentos de ADN. Los fragmentos de ADN con cola (A) pueden a continuación amplificarse como moldes para ligar adaptadores de doble hebra, parcialmente complementarios a los fragmentos de ADN. A continuación, la biblioteca de ADN puede seleccionarse por tamaño y amplificarse para mejorar la calidad de las lecturas de secuencia. La reacción de amplificación introduce cebadores de PCR específicos en las secuencias adaptadoras que se requieren para la secuenciación en la celda de flujo.

Secuenciación de una sola celular

La secuenciación del genoma del ADN de una sola célula implica el aislamiento de una sola célula y la posterior amplificación del genoma completo, y a continuación la secuenciación del ADN utilizando un secuenciador de próxima generación. La secuenciación de células individuales examina la información de la secuencia de células individuales.

Secuenciación de nueva generación

Como entenderá el experto en la técnica, la secuenciación de ácidos nucleicos es un método para determinar el orden exacto de los nucleótidos en una molécula de ácido nucleico dada. El término "secuenciación de nueva generación" (NGS), como se emplea en la presente memoria, se refiere a cualquier plataforma de secuenciación o tecnología de secuenciación, que permite la secuenciación simultánea en paralelo de muchos ácidos nucleicos. Esto permite secuenciar en paralelo muchos, por ejemplo millones, de fragmentos de ADN de una sola muestra. Por lo tanto, la tecnología NGS permite secuenciar hasta una resolución de 1 nucleótido y permite secuenciar rápidamente un genoma completo, p. ej. en cuestión de horas. "Metodología NGS" y "tecnología NGS", como se emplean en la presente memoria, comprenden la preparación del molde, la secuenciación y generación de imágenes, y el análisis de datos.

Por ejemplo, el enfoque Illumina/Solexa® logra la amplificación del ADN anclando fragmentos de ADN de hebra sencilla a una superficie sólida conocida como matriz de una sola molécula o celda de flujo, y realizando la amplificación en "puente" en fase sólida de los moldes de una sola molécula. En este procedimiento, un extremo de una sola molécula de ADN se ancla a una superficie sólida mediante un adaptador; las moléculas posteriormente se doblan e hibridan con adaptadores complementarios creando así un "puente" que forma el molde para la síntesis de la hebra complementaria. Después de la amplificación, la celda de flujo puede contener más de 40 millones de agrupaciones, en donde cada agrupación comprende hasta 1000 copias clonales (idénticas) de una única molécula molde. Los moldes se secuencian de forma paralela utilizando el método de secuenciación por síntesis de ADN (véase definición a continuación) que emplea terminadores reversibles con radicales de fluorescencia retirables y ADN polimerasas especiales que pueden incorporar estos terminadores a cadenas de oligonucleótidos en crecimiento. Los terminadores se marcan con cuatro colores diferentes para distinguir entre las diferentes bases en una posición de secuencia dada y la secuencia molde de cada agrupación se determina a continuación mediante la lectura de color de cada fluoróforo tras cada adición sucesiva de nucleótidos. Esta lectura se produce a través de un ciclo de lavado e inundación de los fragmentos con nucleótidos conocidos en un orden secuencial.

Una vez que se completa la secuenciación, los datos de la secuencia sin procesar deben someterse a varias etapas de análisis. Una línea de análisis de datos generalizado para datos NGS incluye el procesamiento previo de los datos para eliminar las secuencias adaptadoras y las lecturas de baja calidad, el mapeo de los datos para un genoma de referencia o alineamiento de novo de las lecturas de secuencia y análisis de las secuencias compiladas. El análisis de las secuencias puede incluir una amplia variedad de evaluaciones bioinformáticas, incluida la evaluación de variantes genéticas que requieren la detección de polimorfismos de nucleótidos pequeños (SNP), detección de genes nuevos, sitios de inserción de transgenes y/o evaluación de los niveles de expresión de los transcritos.

Celda de flujo

El término "celda de flujo" como se emplea en la presente memoria se refiere a un sustrato de múltiples calles, típicamente a base de vidrio en el que las agrupaciones de ácidos nucleicos se generan mediante amplificación en "puente" y se realiza la etapa de secuenciación. Cada una de las calles es direccionable individualmente, por lo que es posible secuenciar varias muestras distintas por celda de flujo.

Dentro de cada calle de la celda de flujo, millones de cebadores actúan como sondas de captura para las bibliotecas de ADN fragmentado. Cada calle de la celda de flujo es capaz de producir millones de agrupaciones distintas de ácidos nucleicos, cada una de las cuales comprende un fragmento de ADN particular para generar una gran profundidad de datos de secuenciación, es decir, fragmentos de ADN distintos se "amplifican en puente" y se secuencian un millón de veces dando lugar a resultados de secuenciación fiables.

Secuenciación por síntesis

Como se emplea en la presente memoria, el término "secuenciación por síntesis" denota un método en tiempo real en el que la señal de fluorescencia se detecta directamente después de la incorporación del nucleótido marcado con fluorescencia y antes de la incorporación del siguiente nucleótido. Específicamente, el método utiliza cuatro nucleótidos, cada uno marcado con fluorescencia con un fluoróforo de color diferente, para secuenciar los grupos de ácidos nucleicos en la celda de flujo en paralelo. Durante cada ciclo de secuenciación, se añade a la cadena de ácido nucleico un único terminador reversible marcado, desoxinucleótido trifosfato (dNTP). El marcador de nucleótidos sirve como terminador para la polimerización, por lo que después de cada incorporación de dNTP, se crea una imagen del tinte fluorescente para identificar la base y a continuación el bloque terminador 3' se escinde enzimáticamente para permitir la incorporación del siguiente nucleótido. Dado que los cuatro dNTP unidos a terminadores reversibles (A, C, T y G) están presentes como moléculas individuales separadas, la competencia natural minimiza los sesgos de incorporación. Las llamadas de base se realizan directamente a partir de las mediciones de intensidad de la señal durante cada ciclo. El resultado final es una secuenciación base por base que permite una llamada de base confiable y la eliminación de errores específicos del contexto de la secuencia.

La llamada de base es el procedimiento de asignar un nucleótido a una lectura de fluoróforo específica.

Los archivos de llamada de base (.bcl) son archivos binarios que contienen la llamada de base y la calidad para cada tesela en cada ciclo.

Secuenciación de extremos emparejados

Como se emplea en la presente memoria, el término "secuenciación de extremos emparejados" se refiere a un procedimiento en el que un solo fragmento se secuencia desde ambos extremos, 5' y 3', dando lugar a lecturas directas (lectura 1) e inversas (lectura 2). Los fragmentos secuenciados podrían estar separados por un espacio de ciertas bases o podrían solaparse, dando lugar a un fragmento contiguo de un solo extremo más largo después de la fusión. El uso de lecturas de extremos emparejados mejora la precisión de las lecturas que mapean el genoma de referencia o el transgén.

Archivos FastQ e identificador de secuencia

El formato FastQ es un formato basado en texto para almacenar la secuencia biológica (p. ej., una secuencia de nucleótidos o secuencia de péptidos) utilizando un código de una sola letra y sus puntuaciones de calidad correspondientes (FastQ fue desarrollado por Wellcome Trust Sanger Institute). Tanto la letra de secuencia como la puntuación de calidad están codificadas con un único carácter ASCII (American Standard Code for Information Interchange). Un archivo FastQ consiste de 4 líneas por secuencia. La línea 1 comienza con un carácter "@" y va seguido de un identificador de secuencia y una descripción opcional. La línea 2 representa las letras de secuencia sin procesar. La línea 3 comienza con un carácter "+" y, opcionalmente, va seguido de nuevo por el mismo identificador de secuencia (y cualquier descripción). La línea 4 codifica los valores de calidad para la secuencia y debe contener el mismo número de símbolos que letras en la secuencia, es decir, para cada carácter que representa un nucleótido particular en la secuencia de ácido nucleico existe un carácter correspondiente que representa la puntuación de calidad para el nucleótido particular. El "identificador de secuencia" para cada lectura de secuenciación contiene información sobre el nombre único del aparato utilizado para la secuenciación, la calle de la celda de flujo, el número de tesela dentro de la calle de la celda de flujo, la coordenada "x" de la agrupación dentro de la tesela, la coordenada "y" de la agrupación dentro de la tesela, el número de índice para una muestra multiplexada y el miembro de un par (/1 o /2 para lecturas de extremos emparejados solamente). Basándose en este identificador de secuencia, las secuencias de la lectura 1 se pueden combinar con las secuencias de la lectura 2 correspondientes de los pares de secuencias correspondientes generados durante la secuenciación de extremos emparejados.

Numero de lecturas

El término "número de lecturas", como se emplea en la presente memoria, se refiere al número de veces que se amplifica una molécula de ácido nucleico respectiva durante el procedimiento NGS. El "número de lecturas" es una medida directa de la abundancia de una molécula de ácido nucleico respectiva en una biblioteca de ácido nucleico dada.

Cobertura de secuencia

El término "cobertura de secuencia", como se emplea en la presente memoria, se refiere al número de lecturas que cubren cada par de bases del genoma.

Cobertura de secuencia "alta" o "más alta"

Los términos cobertura de secuencia "alta" o "más alta" como se emplean en la presente memoria describen una biblioteca de ácidos nucleicos en la que el número promedio de lecturas que representan un nucleótido dado es mayor que el número promedio de lecturas que representan un nucleótido correspondiente en otra biblioteca de ácidos nucleicos. Esto es esencialmente una expresión de la redundancia de lectura con la que se secuencia cualquier posición genómica dada, correlacionándose los niveles más altos de redundancia de lectura con una cobertura de secuencia más alta (también denominada a veces "secuenciación más profunda"). Por ejemplo, se puede lograr una cobertura de secuencia "más alta" de una biblioteca de ácido nucleico dada secuenciando una biblioteca de ácido nucleico dada en calles múltiples, es decir, redundantes, de la celda de flujo. Los grados más altos de cobertura de secuencia permiten un análisis más robusto y, por lo tanto, estadísticamente más confiable de los datos de secuenciación de lo que es posible cuando se emplean grados más bajos de cobertura de secuencia.

Puntuación de calidad PHRED

Como se emplea en la presente memoria, el término "puntuación de calidad PHRED" (Q) se refiere a una propiedad que está relacionada logarítmicamente con las probabilidades de error de llamada de base (Ewing B y Green P (1998). Base-calling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities. Genome Res. 8:186-194). Las puntuaciones de calidad PHRED se calculan basándose en la fórmula Q = - 10 log10P, en donde P se define como la probabilidad de error de llamada de base. Por ejemplo, si PHRED asigna una puntuación Q de 30 (Q30) a una base, esto equivale a la probabilidad de una llamada de base incorrecta 1 en 1000 veces. Esto significa que la precisión de base (es decir, la probabilidad de una llamada de base correcta) es de 99,9%. Una precisión de llamada de base más baja de 99% (Q20) tendrá una probabilidad de llamada de base incorrecta de 1 en 100, lo que significa que cada 100 pb en una lectura de secuenciación determinada probablemente contenga un error. Cuando la calidad de secuenciación alcanza un PHRED de Q30, prácticamente todas las lecturas serán perfectas, sin errores ni ambigüedades.

Efecto de hebra retrasada y hebra adelantada (Phasing - Prephasing)

El término "efecto de hebra retrasada" como se emplea en la presente memoria se refiere a la incorporación de un nucleótido a una pequeña porción de hebras de ADN en una agrupación dada una posición por detrás (-1 nt) del nucleótido correcto del molde genómico en un ciclo de secuenciación dado. El término "efecto de hebra adelantada" como se emplea en la presente memoria se refiere a la incorporación de un nucleótido en una pequeña porción de hebras de ADN dentro de una agrupación dada una posición por delante (+1) del nucleótido correcto del molde genómico en un ciclo de secuenciación dado. Por ejemplo, una pequeña porción de hebras puede estar desfasada con el ciclo actual, ya sea cayendo una base atrás (efecto de hebra retrasada) o saltando una base hacia adelante (efecto de hebra adelantada) con respecto al nucleótido correcto en una posición particular en el molde. El efecto de hebra retrasada y el efecto de hebra adelantada son causados por la eliminación incompleta de los terminadores 3' y los fluoróforos, secuencias en la agrupación que carecen de un ciclo de incorporación, así como por la incorporación de nucleótidos sin terminadores 3' efectivos.

Cóntigo

El término "cóntigo", como se emplea en la presente memoria, se refiere a una secuencia contigua de ADN creada mediante el ensamblaje de fragmentos secuenciados solapantes de una secuencia de ácido nucleico, por ejemplo, que se origina en un cromosoma.

Armazón

El término "armazón" como se emplea en la presente memoria se refiere a una serie de cóntigos que están en el orden correcto pero no necesariamente conectados en un tramo continuo de secuencia.

Agrupación

El término "agrupación" puede tener diferentes significados dependiendo del contexto en el que se utilice. Si el término "agrupación" se usa en el contexto de describir la relación genética o la no relación genética de dos o más secuencias entre sí, el término como se emplea en la presente memoria se refiere a un grupo de subclones independientes que tienen sitios de inserción de transgenes idénticos. Los subclones que se agrupan en la misma agrupación se consideran monoclonales. Si el término "agrupación" se usa en el contexto de la ubicación física de las secuencias de ácido nucleico, el término como se emplea en la presente memoria se refiere al grupo de copias idénticas de una molécula de ácido nucleico "amplificada en puente" respectiva en una celda de flujo durante el procedimiento de secuenciación, p. ej. el procedimiento NGS, como se describe en la presente memoria.

Correspondencia

El término "correspondencia", como se emplea en la presente memoria, se refiere a la relación entre dos o más subclones determinada por la presencia o ausencia de una región de inserción de transgenes respectiva en cada uno de dichos dos o más subclones. Dos o más subclones "se corresponden" entre sí si sus regiones de inserción de transgenes son congruentes, es decir, idénticas, entre los dos o más subclones, o entre un subclón o grupo de subclones dado y un MCB, cuya clonalidad debe evaluarse. Por lo tanto, el término "correspondencia" puede tener el mismo significado que los términos "acuerdo", "congruencia" e "identidad" y, por lo tanto, deben entenderse como intercambiables entre sí.

Límites:

Los límites son la posición del genoma de la célula anfitriona donde se inserta el transgén. Corresponden a los "lados" del transgén o, en otros términos, a los sitios de inserción.

Descripción detallada

Como se mencionó anteriormente, un aspecto de la divulgación se refiere a un método para determinar la clonalidad de un banco maestro de células (MCB), que se genera mediante la inserción aleatoria de un transgén de secuencia conocida en un genoma de una célula progenitora anfitriona (HPC) de secuencia conocida.

Los MCB y WCB sirven como sistemas de expresión para la producción de proteínas terapéuticas a gran escala. Un requisito esencial para que un sistema de expresión se considere un MCB para la producción de proteína terapéutica es la expresión de proteína de alta calidad en la célula progenitora anfitriona en cantidades adecuadas para la producción a escala industrial. Las líneas de células de mamíferos cultivadas se han vuelto cada vez más importantes en la producción de productos proteicos terapéuticos. Una de las principales ventajas de los sistemas de expresión de mamíferos en comparación con, p. ej. los sistemas bacterianos o de levadura es la posibilidad de efectuar un plegamiento de proteínas, modificaciones postraduccionales y ensamblaje del producto adecuados, todos los cuales son requisitos importantes para la actividad biológica completa del producto proteico.

En la década anterior se han aplicado bioprocedimientos basados en sistemas de células de mamíferos en la fabricación de vacunas, proteínas diagnósticas y terapéuticas. Los sistemas de células de mamífero anfitrionas más utilizados son las células de ovario de hámster chino (CHO) y las células HEK 293 (riñón embrionario humano). Estas células se pueden transfectar mediante numerosos métodos de transfección, que incluyen polietilenimina (PEI), fosfato cálcico o vectores retrovirales, y ahora se utilizan ampliamente para la producción de proteínas recombinantes tanto por transfección transitoria como por formación de líneas celulares estables.

Otros sistemas de células de mamíferos que son adecuados para la producción de proteínas a gran escala incluyen, pero no se limitan a, HeLa, HEK293T, U2OS, A549, HT1080, CAD, P19, NIH 3T3 I, L929, N2a, células 293 de riñón embrionario humano, SP2/0, NS0 (véase por ejemplo Manual of industrial microbiology and biotechnology, 3a edición, capítulo 12 "Mammalian cel culture for biopharmaceutical production", Jinyou Zhang).

Después de la transfección, las líneas celulares se seleccionan y expanden bajo selección en condiciones de cultivo sin suero. Las células transfectadas son un conjunto de células policlonales que incorporaron el transgén en diferentes posiciones de sus genomas. Esta heterogeneidad suele atribuirse a la inserción aleatoria o semialeatoria del transgén en el genoma del anfitrión. A continuación, el conjunto heterogéneo de células se analiza en busca del candidato productor de proteínas más eficiente mediante un procedimiento llamado dilución limitante. En general, el término "dilución limitante" se refiere a una dilución, que puede realizarse en una sola etapa o en múltiples etapas en serie, para dar como resultado una célula por un volumen de alícuota previsto dado. Por ejemplo, cuando se pretende dividir en alícuotas una solución en pocillos individuales de una placa de pocillos múltiples, p. ej. una placa de 96 pocillos, la dilución limitante del cultivo de células policlonales da como resultado una concentración de células tal que, cuando el cultivo se divide en alícuotas en un volumen correspondiente a un solo pocillo, cada pocillo contiene (estadísticamente) solo una célula o menos. A continuación, las células respectivas en pocillos separados se expanden adicionalmente en condiciones apropiadas para obtener clones candidatos. Estos clones, que teóricamente se obtienen de una única célula progenitora, se prueban a continuación para determinar su perfil de proliferación y expresión de proteínas. A continuación, se utilizan los mejores clones para generar el banco maestro de células (MCB).

Un gran inconveniente de este enfoque es la suposición de que cada clon candidato se obtiene en realidad de una única célula por pocillo. Como se mencionó anteriormente, esta suposición se basa en un cálculo estadístico que rige el factor de dilución antes de la división en alícuotas. Sin embargo, debido a que este cálculo es estadístico, es difícil eliminar la posibilidad de que un MCB prometedor sea solo una de varias células en un solo pocillo, lo que lleva a una mezcla indeseablemente heterogénea (es decir, policlonal) de células cuando el contenido de este único pocillo es expandido. Esto podría potencialmente dar como resultado una menor reproducibilidad y variaciones en la calidad de la proteína dentro de un MCB dado. Además, sería difícil cumplir con los requisitos reguladores aplicables para la producción de una proteína destinada a la terapia con una mezcla tan heterogénea, ya que las agencias reguladoras normalmente requieren que el MCB utilizado para la producción de la proteína terapéutica sea homogéneo, es decir, monoclonal.

Tradicionalmente, la prueba del MCB para la producción de alta calidad del producto proteico se logra mediante una evaluación de las características del MCB que requiere mucho tiempo, trabajo y costes, incluyendo p. ej., morfología celular, estabilidad de la producción y calidad de las proteínas, y caracterización genotípica. Tales evaluaciones necesarias para la determinación de la monoclonalidad suelen requerir de 6 a 12 meses. Sin embargo, estos parámetros son simplemente indicaciones de que es probable que el MCB en cuestión sea monoclonal, estas pruebas aún no pueden demostrar de manera concluyente que un MCB dado es monoclonal. Actualmente, el principal método aceptado por las Autoridades Sanitarias es la clonación por dilución doble limitada.

La presente divulgación se refiere a un método novedoso para confirmar la clonalidad de un MCB mediante el análisis de una selección de regiones de inserción de transgenes únicas (TIR) en un genoma de HPC dado de secuencia conocida por medio de un nuevo enfoque combinado de subclonación, secuenciación, p. ej. secuenciación de nueva generación (NGS) y análisis bioinformático. Este enfoque novedoso no solo evita los esfuerzos intensivos en tiempo y mano de obra asociados con las pruebas de identidad tradicionales de un MCB, sino que también permite concluir sobre la clonalidad de un MCB en cuestión y, por lo tanto, sobre la confiabilidad del MCB para una calidad de expresión de proteína reproducible durante la línea de producción completa.

En general, el método implica la identificación de una o más regiones de inserción de transgenes (TIR) en el genoma de un subclón (RSC) aleatorio, es decir, elegido aleatoriamente, expandido a partir de un supuesto MCB . Por lo tanto, antes del método inventivo, el MCB se expande a uno o más subclones (SC) y los uno o más subclones se cultivan por separado en condiciones apropiadas. Después de la extracción de ADN y la preparación de la biblioteca, las bibliotecas de ADN de los uno o más subclones se analizan mediante secuenciación de extremos emparejados. La biblioteca de ADN de un subclón de referencia (RSC) (elegido al azar) se secuencia con una cobertura de secuencia más alta. Como se explica en otra parte de la presente memoria, se puede lograr una cobertura de secuencia "más alta" en la biblioteca de ADN de una RSC secuenciando la biblioteca de ADN de la RSC en múltiples calles de la celda de flujo, generando así un mayor número de lecturas de secuenciación en la biblioteca de ADN de la RSC en comparación con el número de lecturas de secuenciación en las bibliotecas de ADN de las SC restantes que se secuencian en una sola calle de la celda de flujo. Los datos de secuenciación obtenidos para la RSC se utilizan a continuación para identificar las regiones de inserción de transgenes (TIR) en el genoma de la RSC. La identificación de las TIR se puede lograr mediante el alineamiento separado de las secuencias obtenidas con el genoma de HPC y con la secuencia conocida del transgén. Las TIR identificadas en el genoma de la RSC se analizan a continuación para determinar su cobertura de secuencia y número de variaciones de lectura y una o más TIR con la cobertura de secuencia más alta y el número de lecturas parcialmente solapantes se asignan como TIR de referencia (RTIR). Estas RTIR se comparan a continuación con las TIR comparativas (CTIR) identificadas en el genoma de una o más SC que se generaron independientemente a partir del MCB y se secuenciaron, generando dichas CTIR de una manera análoga a la descrita anteriormente para las RTIR. En base a la correspondencia entre las RTIR presentes en el genoma de RSC y las CTIR presentes en uno o más genomas de SC, se determina a continuación la clonalidad del MCB.

Generalmente, la correspondencia de las CTIR que se originan a partir de múltiples subclones con las RTIR que se originan en el subclón de referencia elegido al azar puede tomarse como una indicación de que el MCB es de hecho monoclonal siempre que se pruebe un número suficiente de SC y RTIR. Esto se debe a que si el MCB fuera policlonal, se esperaría ver una divergencia entre las RTIR y uno o más CTIR como resultado del hecho de que los subclones de referencia y comparativos se originaron realmente a partir de células MCB diferentes, es decir, policlonales. Por otro lado, cuando las CTIR de cada uno de los subclones comparativos corresponden a las RTIR en el subclón aleatorio (de referencia) (y, por lo tanto, las CTIR de subclones comparativos separados también son idénticos entre sí), esto puede tomarse como una indicación de que el subclón de referencia elegido al azar, así como los subclones comparativos, se originaron todos en la misma célula de MCB y, por lo tanto, que la dilución límitante comentada anteriormente fue de hecho satisfactoria para producir, como se esperaba, una sola célula de MCB en un solo pocillo de la placa de 96 pocillos. En este caso, la correspondencia entre las RTIR y las CTIR en múltiples subclones comparativos puede tomarse como prueba de que el MCB es monoclonal y, por tanto, adecuado para su uso posterior en la producción de la proteína codificada por el transgén.

La identificación de las TIR se logra mediante la secuenciación de extremos emparejados. Esto implica la secuenciación de una determinada molécula de ácido nucleico de ambos extremos del molde, generando así pares de secuencias leídas para una determinada molécula de ácido nucleico. La secuenciación de extremos emparejados tiene la ventaja de aumentar la cobertura de secuencia del molde y, por lo tanto, la precisión del mapeo; la primera vez comenzando desde el extremo 5' (lectura 1) y a continuación comenzando desde el extremo 3' (lectura 2). Como se analiza con más detalle a continuación, la secuenciación de extremos emparejados es útil para identificar las TIR en el genoma de RSC y en los uno o más genomas de SC.

En una realización de la presente invención, un subclón aleatorio (RSC) se secuencia con una cobertura de secuencia más alta en comparación con las una o más SC (véase más arriba para el significado de "más alta"). Se logra una cobertura de secuencia más alta, p. ej. secuenciando la biblioteca de RSC varias veces o en más de una calle de la celda de flujo. Cuanto mayor sea la cobertura de secuencia en la biblioteca de RSC, más confiable será el análisis de las regiones de inserción de transgenes (TIR) en la RSC, y también aumentará la confiabilidad de la identificación de las regiones de inserción (RTIR). Como resultará evidente con mayor detalle a continuación, la identificación de RTIR creíbles en el genoma de RSC es importante para la presente invención, ya que estas RTIR sirven como referencias para comparar los uno o más subclones con la RSC. Las RTIR asignadas incorrectamente en la RSC podrían conducir a una evaluación incorrecta de la clonalidad de MCB porque la evaluación de la correspondencia entre las RTIR asignadas incorrectamente en el genoma de RSC y las CTIR en los uno o más genomas de SC también podría llevar a conclusiones erróneas sobre la clonalidad de los subclones en los que se van a comparar las RTIR (como las CITR). En particular, si una TIR dada en la RSC se asignara incorrectamente como una RTIR debido a la baja cobertura de secuencia en la biblioteca de secuenciación de la RSC, tal supuesta RTIR podría no corresponder a ninguna de las uno o más CTIR en un genoma de SC respectivo. En consecuencia, se puede concluir incorrectamente que la RSC y la SC respectiva, y por tanto también el MCB, son policlonales. Por tanto, la asignación correcta y fiable de una o más TIR en la RSC como RTIR es importante para la presente invención y la identificación fiable de las RTIR se consigue mediante una cobertura de secuencia más alta y un bajo solapamiento de secuencia en la biblioteca de RSC.

En una realización adicional de la presente invención, el banco maestro de células (MCB) se genera por transfección de una célula progenitora anfitriona (HPC) en la que el transgén se inserta aleatoriamente en una pluralidad de posiciones en su genoma. El sistema de células de mamífero utilizado como HPC puede ser, por ejemplo, una línea celular de ovario de hámster chino (CHO). Las células CHO son a menudo la línea celular de mamífero de elección para la producción de agentes terapéuticos basados en proteínas recombinantes por varias razones. Las células CHO son capaces de adaptarse y crecer en cultivo en suspensión, lo que es ideal para cultivos a gran escala en la industria farmacéutica. Las células CHO presentan menos riesgos que otras células, ya que solo unos pocos virus humanos pueden propagarse en ellas. Esto reduce el riesgo de contaminación infecciosa y propagación de virus en la línea de producción (Boeger et al. (2005). Structural basis of eukariotyc gene expression. FEBS Lett; 579:899-903). Además, las células CHO pueden crecer en medios químicamente definidos sin suero, lo que garantiza la reproducibilidad entre lotes separados de cultivos celulares y permite un registro exacto de las condiciones de cultivo de un MCB según lo requieran las autoridades sanitarias. Las células CHO también permiten modificaciones postraduccionales de proteínas recombinantes que son compatibles y bioactivas en seres humanos (Kim et al. (2012). CHO cells in biotechnology for production of recombinant proteins: Current state and further potential. Appl Microbiol Biotechnol; 93:917-30). Específicamente, la glicosilación de las glicoproteínas producidas por las células CHO es más parecida a la humana en ausencia de epítopos inmunogénicos de a-galactosa (Ghaderi et al. (2012). Production Platforms for biotherapeutic glycoproteins. Ocurrence, impact and challenges of no-human sialylation. Biotechnol Genet Eng Rev; 28:147-75). Finalmente, existen varios sistemas de amplificación de genes bien establecidos que hacen uso de la inestabilidad genómica de las células CHO para permitir la amplificación de genes que finalmente da como resultado un mayor rendimiento de proteína recombinante. A pesar de las ventajas expuestas anteriormente para el uso de células CHO como MCB, otros tipos de células de mamíferos, como se ha establecido antes en la presente memoria, también son adecuados para su uso en el método inventivo.

En una realización adicional, la inserción aleatoria o cuasialeatoria del transgén se efectúa usando un sistema de transfección de vector retroviral. Los retrovirus son virus de ARN que se replican a través de un intermedio de ADN de doble hebra (dh). Se pueden aplicar vectores retrovirales para preparar líneas celulares transformadas de manera estable. Además, la expresión de genes retrovirales es impulsada por promotores fuertes que pueden subvertirse para controlar la expresión de transgenes, produciendo así niveles de expresión más altos para una proteína de interés. Por último, los sistemas retrovirales tienen una amplia gama de anfitriones, lo que permite la transfección de muchos tipos de células diferentes. Un sistema retroviral que puede usarse ventajosamente en la presente invención para la transfección de HPC es el sistema GPEx®. Este método utiliza vectores retrovirales de replicación defectuosa, derivados del virus de la Leucemia Murina de Moloney (MLV) pseudotipado con la glicoproteína del Virus de la Estomatitis Vesicular (VSV-G), para insertar de forma estable copias únicas de genomas en múltiples ubicaciones genómicas en la HPC en división.

En otra realización de la presente invención, las regiones de inserción de transgenes (TIR) se identifican mediante la clasificación de las lecturas de secuenciación de extremos emparejados en cuatro clases. La clase 1 representa las secuencias de lectura 1 (es decir, hacia adelante) que mapean, p. ej. exclusivamente, la secuencia del transgén. La clase 2 representa las secuencias de lectura 1 (es decir, hacia adelante) que mapean, p. ej. exclusivamente, el genoma de HPC. La clase 3 representa las secuencias de lectura 2 (es decir, hacia atrás) que mapean, p. ej. exclusivamente, las secuencias transgénicas y la clase 4 representa las secuencias de lectura 2 (es decir, hacia atrás) que mapean, p. ej. exclusivamente, el genoma HPC. Dichas secuencias de lectura 1 y lectura 2 representan lecturas respectivas hacia adelante y hacia atrás correspondientes a los extremos 5' y 3' de una molécula de ácido nucleico dada dentro de una agrupación de ácidos nucleicos generada en la secuenciación de extremos emparejados de una biblioteca de ácidos nucleicos. Las lecturas de secuencia que mapean ambas referencias, es decir, la secuencia del transgén y el genoma de HPC, se eliminan de la línea de análisis porque tales secuencias no se pueden alinear correctamente con los genomas de referencia separados. La razón de esto es que el alineamiento de tales lecturas de secuencia en una de las dos secuencias de referencia, p. ej. el transgén o el genoma de HPC, daría como resultado un emparejamiento erróneo bastante largo de lecturas de secuencia que representan la secuencia de nucleótidos de la otra secuencia de referencia, p. ej. el genoma de HPC o el transgén, respectivamente, con el que la lectura de secuencia leída no estaba alineado. Por ejemplo, un mapeo de lectura de secuencia tanto para el transgén como para el genoma de HPC aún, si se alineara con el genoma de HPC, contendría una región no mapeada bastante grande que correspondería a la secuencia del transgén. En consecuencia, tales lecturas de secuencia que abarcan los límites entre el transgén y el genoma de HPC son descartadas por los programas de alineamiento como secuencias de baja calidad con un alto contenido de pares de bases incorrectos con respecto a una de las dos secuencias de referencia (es decir, el genoma de HPC o la secuencia de transgén).

En una realización adicional, las secuencias de lectura 1 de clase 1 o 2 se combinan con las correspondientes secuencias de lectura 2 de la respectiva clase 4 o 3. La asignación correcta de los pares de lectura complementarios se logra mediante un identificador de secuencia que está codificado en el archivo FastQ generado para las lecturas de la secuencia. El identificador de secuencia comprende información sobre el número de calle en la celda de flujo, el número de tesela dentro de la calle en la que se ancló la secuencia respectiva a la celda de flujo, así como las coordenadas "x" e "y" de la agrupación de ácidos nucleicos dentro de la tesela. Además, el identificador de secuencia comprende un número de índice que indica el miembro de un par de secuenciación de extremos emparejados (es decir, lectura 1 o lectura 2) (FIGURA 2).

En una realización adicional, las respectivas secuencias de lectura 1 y lectura 2 de un par de lectura se alinean por separado con la secuencia del transgén o con el genoma de HPC. Los pares de secuenciación en los que la lectura 1 mapea el transgén y la lectura 2 mapea el genoma de la célula progenitora anfitriona (HPC) (es decir, pares de clase 1/4) y los pares de secuenciación en los que la lectura 1 mapea el genoma de HPC y la lectura 2 mapea el transgén (es decir, pares de clase 2/3) se conservan para un análisis posterior. Los pares de lectura en los que las secuencias de lectura 1 y lectura 2 mapean el transgén (p. ej., pares de clase 1/3) o el genoma de HPC (p. ej., pares de clase 2/4) no son adecuados para la identificación de regiones de inserción de transgenes (TIR) y, por lo tanto, se descartan del conjunto de pares de lectura de secuencia. Este enfoque permite ventajosamente la identificación de TIR en el genoma de HPC sin conocer la posición exacta del sitio de inserción del transgén en el genoma de HPC. Como se explicó anteriormente, los métodos convencionales para el análisis de datos de NGS no pueden alinear las lecturas de secuencia correspondientes a regiones solapantes de uno o más genomas de referencia separados debido a la gran porción de emparejamientos erróneos resultantes. Por esta razón, la secuenciación convencional de un solo extremo o el procesamiento de datos de secuenciación convencional de extremos emparejados no son adecuados para la identificación de novo de TIR dentro de un genoma de HPC dado de secuencia conocida. Para lograr este objetivo, la presente invención utiliza la información contenida en los pares de lectura de clase 1/4 y clase 2/3 obtenidos mediante el enfoque de procesamiento de datos de secuenciación de extremos emparejados descrito anteriormente. Las lecturas de secuencia correspondientes a las secuencias de clase 1 y clase 3, es decir, las lecturas de secuencia que mapean la secuencia conocida del transgén, se utilizan para identificar las lecturas complementarias correspondientes que mapean el genoma de HPC, es decir, las lecturas de secuencia correspondientes a las secuencias de clase 4 y clase 3, respectivamente. Las secuencias que mapean el genoma de HPC y que corresponden a los pares de lectura de clase 1/4 y clase 2/3, por lo tanto, representan regiones dentro de los genomas de HPC que son adyacentes a los límites de una TIR dada debido a que su par de lectura complementario (ya sea de clase 1 o clase 3) mapea la secuencia de transgén. Este enfoque para el análisis de los datos de secuenciación de extremos emparejados permite la identificación de TIR dentro de un genoma de HPC que de otro modo sería imposible cuando se utilizan métodos comúnmente conocidos en la técnica. Como parte del método inventivo, es posible identificar regiones de inserción de transgenes en un genoma de HPC dado y comparar TIR dentro de diferentes muestras derivadas de un MCB dado, determinando así la clonalidad del MCB.

Por tanto, en una realización adicional de la presente invención, las TIR se identifican alineando las secuencias de extremos emparejados correspondientes a la clase 2 y la clase 4 con el genoma de HPC. El alineamiento de lecturas da como resultado la identificación de una región de inserción de transgenes de 1000 nucleótidos (1 kb) de longitud dentro del genoma de HPC que está representada por secuencias de clase 2 y clase 4 de lecturas de secuenciación de extremos emparejados. Para hacer que la predicción de TIR sea más confiable, la región de inserción del transgén se expande a 2 kb comenzando desde el centro de la región de 1 kb, extendiendo la región de 1 kb en ambos lados en 500 pares de bases. El centro de la región de inserción de 1 kb se define como el nucleótido dentro del genoma de HPC con la cobertura de secuencia más alta. Tomar en consideración una región de inserción de 2 kb del transgén hace que la predicción de TIR dentro del genoma de HPC sea mucho más confiable porque permite una comparación sólida de TIR entre diferentes subclones incluso en el caso de que ocurran pequeñas variaciones en el alineamiento de secuencia de los uno o más subclones.

Cabe señalar que el alineamiento de las secuencias de clase 2 y clase 4 con el genoma de HPC no representa la posición exacta de la región de inserción del transgén en el genoma de HPC ya que las secuencias correspondientes a la lectura 1 o la lectura 2 de un par de secuenciación de extremos emparejados generalmente abarcan solo de 200 a 500 pb. Sin embargo, el molde que se debe secuenciar puede tener una longitud de 800 pb o más. Esta diferencia puede potencialmente conducir a un espacio, p. ej. de 300 a 600 pb, en el que podría estar ubicado el sitio de inserción del transgén real. Por lo tanto, la expansión de la región de inserción del transgén predicha en una región adicional de 500 pb en cada sitio de la región de 1 kb aumenta la credibilidad de las TIR predichas (FIGURA 3).

En una realización de la invención, las TIR identificadas en el subclón aleatorio (RSC), que se secuenció con una cobertura de secuencia más alta en comparación con la cobertura de secuencia de los subclones (SC) restantes, se analizan para determinar su cobertura de secuencia y su variación en el número de lecturas para obtener una o más regiones de inserción de transgenes de referencia (RTIR). Las RTIR se seleccionan en función del número total de lecturas de secuencia que mapean a una posición determinada en el genoma de HPC. Dentro de cualquier conjunto dado de TIR, las TIR que están representadas por la cobertura de secuencia más alta se asignan como RTIR potenciales. Además de la alta cobertura de secuencia, un requisito adicional para la asignación como RTIR es un bajo grado de solapamiento entre las diferentes secuencias de lectura que representan un TIR determinado, es decir, el solapamiento entre las secuencias de lectura que representan una TIR dada debe ser parcial en lugar de idéntico, y cuanto más parcial sea el solapamiento, más robusta que predecible será la identificación de la TIR. Es más probable que las copias de secuencias en la misma región que tienen un bajo grado de solapamiento representen una región de inserción creíble dentro del genoma de HPC que las secuencias que se caracterizan por grandes solapamientos de su número de lecturas. Tal "acumulación" de secuencias idénticas, es decir coextensivas, es más probable debido a artefactos de secuenciación que podrían haberse introducido, p. ej. durante la preparación de la biblioteca y la amplificación por PCR, pero no representan regiones de inserción de transgenes confiables (FIGURA 4).

Como se mencionó anteriormente, la identificación de RTIR creíbles en el genoma de RSC es importante ya que estas RTIR sirven como referencias para comparar los uno o más subclones con RSC. Las RTIR asignadas incorrectamente en la RSC podrían conducir a una evaluación de clonalidad incorrecta del MCB porque una RTIR asignada incorrectamente de hecho podría faltar en el genoma de los uno o más subclones (SC) que se comparan con la RSC. Por lo tanto, si una RTIR asignada incorrectamente en el genoma de RSC no tiene la CTIR correspondiente en los uno o más genomas de SC, la evaluación de la correspondencia entre la RSC y las una o más SC podría llevar a la conclusión errónea de que las una o más SC son policlonales ya que carecen de una CTIR correspondiente a una RTIR dada, incluso aunque esta última no sea en realidad una verdadera región de inserción de transgenes. Por ejemplo, si una TIR dada en la RSC se asignara incorrectamente como una RTIR debido a la baja cobertura de secuencia en la biblioteca de secuenciación de la RSC, tal supuesta RTIR podría no corresponder a ninguna de las uno o más CTIR en un genoma de SC respectivo. En consecuencia, la RSC y la SC respectiva se determinarían (incorrectamente) como divergentes y, por lo tanto, el MCB se determinaría (también incorrectamente) como policlonal.

En una realización adicional, se determinan las primeras n RTIR con la cobertura de secuencia más alta y el número más bajo de solapamientos de lecturas, en donde n es un número entero preferiblemente de 5 a 50, por ejemplo, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 y 50 o cualquier otro valor entero entre estos. El número de RTIR que se debe determinar depende de varios parámetros, incluido el método de transfección, el número total de TIR, el tamaño del genoma de HPC y la calidad de los datos de secuenciación. Por tanto, el experto en la técnica debe evaluar el número de RTIR que se requiere para determinar la clonalidad de un Banco Maestro de Células (MCB) dado, caso por caso. El número de RTIR requeridas generalmente se ve afectado por: 1) El número de transgén insertado (p. ej., menor es el número de inserción y menor será el número de RSC necesarias para el análisis y 2) El número de lecturas para cada RSC. De hecho, en presencia de un ADN difícil (lo que significa que el transgén se inserta en una región de ADN difícil de secuenciar, como las regiones teloméricas), el número de lecturas que caracterizan a cada RSC será muy bajo, lo que significa que las RSC más robustas serán más bajas de lo esperado (p. ej., 10 en lugar de 20). Generalmente, valores más altos de n se correlacionarán con una mejor significación estadística de la determinación de clonalidad final. Por ejemplo, la probabilidad de que el MCB surja de 2 celdas diferentes es menor cuando 20 CTIR en SC son idénticas a las RTIR correspondientes en una RSC, que cuando, por ejemplo, 5 CTIR en SC son idénticas a las RTIR correspondientes en una RSC.

En una realización adicional de la presente invención, las regiones de inserción de transgenes de referencia (RTIR) obtenidas en el subclón aleatorio (RSC) se utilizan como base de comparación con las regiones de inserción de transgenes comparativas correspondientes (CTIR) en uno o más subclones (SC) que se han expandido independientemente del MCB y se han secuenciado. Por lo tanto, las ubicaciones genómicas de las CTIR en cada uno de los uno o más genomas de SC se comparan con las ubicaciones genómicas correspondientes de las RTIR en el genoma de RSC.

En una realización adicional de la invención, la comparación de las RTIR en el genoma de RSC y las CTIR correspondientes en los uno o más genomas de SC puede realizarse generando una matriz de presencia/ausencia. En esta matriz, cada región de inserción puede estar representada por un código de color binario que indica la presencia o ausencia de una CTIR correspondiente en un genoma de SC dado con respecto a una RTIR correspondiente en el genoma de RSC. Las RTIR están representadas por una primera dimensión de matriz mientras que la RSC y las una o más SC están representadas en una segunda dimensión de matriz, p. ej. ortogonal. Como se explicó anteriormente, la presencia o ausencia de una CTIR respectiva en un genoma de SC dado con relación a una RTIR respectiva en el genoma de RSC se representa en la matriz preferiblemente como un código de color binario, en donde un primer color, p. ej. color negro, representa la presencia o ausencia respectivas de una RTIR respectiva en el genoma de RSC, así como la presencia o ausencia respectivas de una CTIR respectiva en cada uno de los genomas de SC, y donde un segundo color, p. ej. color blanco, representa la ausencia o presencia respectivas de una RTIR respectiva en el genoma de RSC así como la ausencia o presencia respectivas de una CTIR respectiva en cada uno de los genomas de SC. Este enfoque facilita la comparación óptica fácil de las RTIR en el genoma de RSC con las respectivas CTIR en cada uno de los genomas de SC (FIGURA 1 (c)). Por ejemplo, en una realización adicional, la elección del color negro para representar la correspondencia de una CTIR con su RTIR correspondiente y del color blanco para representar la no correspondencia, una matriz de presencia/ausencia en la que todas las ubicaciones de la matriz son de color negro negras indicaría una correspondencia perfecta entre todas las CTIR en cada una de las SC y todas las RTIR en la RSC, lo que indica una clonalidad moderada del MCB.

Según una realización adicional de la presente invención, la relación entre el subclón aleatorio (RSC) y cada uno de los uno o más subclones (SC) puede evaluarse mediante el cálculo adicional de una matriz de distancia. Para confirmar la clonalidad, la distancia esperada es igual a 0. El cálculo adicional o, en otros términos, la cuantificación de las distancias, puede ayudar en la interpretación de los resultados. Se espera que una muestra "no clonal" muestre una similitud muy baja (o una distancia muy grande) en comparación con las muestras "clonales". La matriz de distancias se puede calcular, por ejemplo, basándose en la fórmula (I):

La fórmula (I) representa el coeficiente de Dice, un método estadístico comúnmente conocido para comparar la similitud de dos muestras. La función de distancia Dd (RSC, SCn) se calcula basándose en el coeficiente de Dice entre el genoma de RSC y uno de los m genomas de SC. La variable N(total) de Fórmula (I) representa el número total de regiones de inserción de transgenes presentes tanto en el genoma de RSC como en uno de los n genomas de SC. La variable N(ctir) representa el número total de regiones de inserción de transgenes presentes en uno de los m genomas de SC, mientras que N(rtir) representa el número total de regiones de inserción del transgén de referencia en el genoma de RSC según se determina en una de las realizaciones anteriores. Los resultados calculados de la función de distancia DD (RSC, SCm) proporcionan información sobre la distancia genética, es decir, la similitud o disimilitud genéticas, entre dos muestras individuales en una escala de 0 a 1, en donde la identidad genética y, por tanto, clonal entre dos muestras está representada por una distancia de 0, aumentando la disimilitud genética y, por tanto, clonal por encima de 0 para alcanzar una disimilitud completa, es decir, sin relación genética alguna, con un coeficiente de Dice calculado de 1.

En una realización adicional de la invención, las variables N(totai), N(ctir) y N(rtir) de Fórmula (I) se calculan basándose en los datos obtenidos por la matriz de presencia/ausencia de regiones de inserción de transgenes. La combinación de un análisis fácil de ver, es decir, la representación de las regiones de inserción de transgenes en una matriz de presencia/ausencia, con el análisis de similitud basado en el coeficiente de Dice proporciona un enfoque numérico, sencillo y confiable adicional para la evaluación de la correspondencia entre los diferentes subclones. Además de la matriz de presencia/ausencia descrita anteriormente, la similitud entre el subclón aleatorio (RSC) y cada uno de los uno o más subclones (SC) puede analizarse adicionalmente mediante una matriz de distancia. La matriz de distancia se genera transfiriendo los datos obtenidos calculando la función de distancia DD basándose en la similitud entre la RSC y cada una de las una o más SC en un sistema de coordenadas bidimensional, en el que el eje "y" representa la RSC y cada uno de los uno o más subclones y el eje "x" representa la distancia de una muestra particular con respecto a la RSC. Este gráfico bidimensional ilustra la distancia entre la RSC a sí misma y a cada una de las una o más SC. Si dos o más muestras son genéticamente idénticas, es decir, si las muestras comparten las mismas regiones de inserción de transgenes, la distancia entre estas dos o más muestras es "0". De lo contrario, si las muestras no son genéticamente idénticas, es decir, si las muestras tienen diferentes regiones de inserción de transgenes, la distancia entre estas muestras es mayor que "0", preferiblemente "1". Las distancias de las una o más SC con respecto a la RSC se representan como puntos en la matriz de distancias. Los puntos que se superponen entre sí forman lo que se denomina una agrupación. Una agrupación es un grupo de genomas de SC respectivos que tienen la misma distancia con respecto al genoma de RSC. Finalmente, se considera que los uno o más genomas de SC respectivos pertenecen a la misma agrupación que el genoma de RSC si la distancia entre ellos calculada de acuerdo con la Fórmula (I) es "0" (FIGURA 1 (c), (129)).

Según otra realización de la presente invención, el Banco Maestro de Células (MCB) para el que se va a determinar la clonalidad se considera monoclonal en función de la matriz de distancia si el subclón aleatorio (RSC) y las una o más SC, preferiblemente todas las SC se agrupan en la misma agrupación (es decir, coeficiente de Dice = 0). En este caso, el genoma de RSC y uno o más genomas de SC, preferiblemente todos los genomas de SC evaluados, comparten las mismas regiones de inserción de transgenes, lo que indica que la RSC y las una o más SC deben haberse expandido a partir de un conjunto de células genéticamente idéntico (MCB) que se originó a partir de una sola celda MCB. En este caso, el MCB puede considerarse monoclonal. Esto significaría que el MCB sería adecuado para la producción adicional de la proteína terapéutica codificada por el transgén insertado, de acuerdo con las normas reguladoras aplicables.

Por el contrario, si una o más de las SC evaluadas se desvían en una o más de sus CTIR de las correspondientes RTIR en la RSC, y esta desviación puede considerarse creíble (es decir, no relacionada con la secuenciación o artefactos de PCR), se puede suponer con seguridad que el conjunto de células (MCB) del que derivan la RSC y las SC no se originó a partir de una sola célula de MCB, sino de múltiples células de MCB. Esto puede tomarse como prueba de que, a pesar de la dilución limitante para dar como resultado estadísticamente una célula de MCB por pocillo, p. ej. una placa de 96 pocillos, el pocillo en cuestión en realidad contenía múltiples células genéticamente heterogéneas (resultantes de diferentes inserciones transgénicas aleatorias) o que la célula única original a través de la replicación del ADN y la duplicación celular perdió ciertos sitios de inserción generando así heterogeneidad del MCB. En este caso, se puede concluir que el MCB en cuestión no era monoclonal, sino policlonal o se ha vuelto policlonal debido a la inestabilidad genómica. Esto significaría que el MCB no sería adecuado para una producción adicional de la proteína terapéutica codificada por el transgén insertado, de acuerdo con las normas reguladoras aplicables y que, en consecuencia, se debe identificar un nuevo MCB monoclonal para producir la proteína de interés a partir del transgén insertado.

Todos los métodos y realizaciones descritos anteriormente también se aplican a una sola célula. En tal caso, se realiza el protocolo de Secuenciación de una Sola Célula. La diferencia entre la secuenciación de una sola célula y la secuenciación de MCB o subclones solo está relacionada con la forma en que se extrae el ADN (véase el ejemplo 9). Los métodos y realizaciones no se repiten completamente por concisión. Simplemente, se deben introducir algunos ajustes en la redacción: cuando se aplican a un método para la identificación de los sitios de inserción de transgenes en una sola célula, los términos RSC y HCP se cambian a RSgC (para la Referencia de una sola célula) y los términos SC y MCB se cambian a SgC (una sola célula).

En resumen, la presente divulgación también divulga un método para la identificación de los sitios de inserción del transgén en una sola célula, siendo dicha única célula el resultado de la inserción predecible o no predecible de un transgén de secuencia conocida en un genoma de referencia de una sola célula (RSgC) de secuencia conocida, comprendiendo dicho método las etapas de:

a) Identificar una o más regiones de inserción de transgenes (TIR) en el genoma de una sola célula (SgC), en donde la SgC se ha aislado y en donde dicha identificación se logra mediante la secuenciación de extremos emparejados de dicho genoma de SgC para obtener una secuencia del genoma de SgC o secuencias del genoma de SgC; y el alineamiento de dicha secuencia o secuencias del genoma de SgC con dicha secuencia del genoma de RSgC conocida y dicha secuencia de transgén conocida, produciendo así una o más regiones de inserción de transgenes (TIR);

b) Determinar una o más TIR como se identifica en la etapa (a) con el mayor grado de cobertura de secuencia, en donde dicha cobertura de secuencia se refiere al número de veces que se lee una secuencia de ácido nucleico dada que contiene una TIR dada durante el procedimiento de secuenciación por lecturas parcialmente solapantes; en donde dichas una o más TIR con el grado más alto de cobertura de secuencia se asignan como TIR de referencia (RTIR).

Preferiblemente, la secuenciación de extremos emparejados implica la secuenciación de una molécula de ácido nucleico dada de ambos extremos de dicha molécula de ácido nucleico, generando así pares de lectura para una molécula de ácido nucleico dada que representa un fragmento del genoma que se debe secuenciar. También preferiblemente, la SgC resulta de la inserción de dicho transgén en múltiples posiciones en dicho genoma de RSgC, en donde dicha inserción aleatoria se efectúa preferiblemente usando un vector retroviral. En dicho método, la determinación de TIR comprende la clasificación de secuencias de lectura 1 de extremos emparejados y secuencias de lectura 2 de extremos emparejados derivadas de bibliotecas de extremos emparejados en 4 clases, en donde

• la clase 1 comprende secuencias de lectura 1 que mapean dicho transgén;

• la clase 2 comprende secuencias de lectura 1 que mapean dicho genoma de RSgC;

• la clase 3 comprende secuencias de lectura 2 que mapean dicho transgén; y

• la clase 4 comprende secuencias de lectura 2 que mapean dicho genoma de RSgC;

en donde dicha lectura 1 y dicha lectura 2 representan lecturas respectivas hacia adelante y hacia atrás correspondientes a los extremos 5' y 3' de una molécula de ácido nucleico dada dentro de una agrupación de ácidos nucleicos generada en la secuenciación de una biblioteca de ácido nucleico de dicha RSgC o dichas una o más SgC. Preferiblemente, las secuencias de lectura 1 se combinan con las correspondientes secuencias de lectura 2 utilizando un identificador de secuencia de celda de flujo, en donde dicho identificador de secuencia comprende información de la calle de la celda de flujo, el número de tesela dentro de la celda de flujo, la coordenada "x" de la agrupación de ácidos nucleicos dentro de una tesela, y la coordenada "y" de la agrupación de ácidos nucleicos dentro de una tesela, asignando así a cada par de secuencias correspondiente a las secuencias de lectura 1 y lectura 2 una posición única dentro de la celda de flujo. También preferiblemente, las respectivas secuencias de lectura 1 y lectura 2 de un respectivo par de lectura se alinean por separado con las secuencias conocidas del transgén y el genoma de RSgC. Incluso preferiblemente, solo se seleccionan los pares de lectura que comprenden secuencias de clase 1 y 4 y los pares de lectura que comprenden secuencias de clase 2 y clase 3 para análisis adicional. Incluso más preferiblemente, las TIR se identifican alineando las secuencias de lectura de extremos emparejados correspondientes a la clase 2 y la clase 4 con el genoma de RSgC, definiendo así una región de 2 kb para cada una de dichas TIR en el genoma de RSgC. En resumen, los autores de la presente invención proporcionan un método novedoso para confirmar la clonalidad de un MCB, evitando las pruebas que requieren tradicionalmente mucho en tiempo y mano de obra del MCB requeridas por las autoridades sanitarias para aprobar el MCB como una línea celular de producción en la fabricación de proteínas previstas para aplicación farmacéutica. El presente método se beneficia de la reproducibilidad exacta, que permite la evaluación de clonalidad robusta de un MCB. Los autores de la presente invención logran este efecto beneficioso mediante un nuevo enfoque combinado de secuenciación de extremos emparejados y posterior procesamiento de datos bioinformáticos de los datos de secuenciación obtenidos. En particular, el nuevo enfoque para procesar los datos de secuenciación de extremos emparejados permite la identificación de regiones de inserción de transgenes en una secuencia conocida de un genoma de HPC de novo, lo que no es posible mediante la secuenciación convencional de una sola lectura o el procesamiento convencional de datos de secuenciación de extremos emparejados. Por tanto, la presente divulgación proporciona medios poderosos para evaluar de forma sólida la calidad de un MCB para su uso en la producción de productos proteicos destinados a la aplicación farmacéutica.

También proporciona un método novedoso para la identificación de los sitios de inserción de transgenes en una sola célula, basándose en el mismo enfoque que para evaluar la clonalidad de un MCB.

Los siguientes ejemplos, que incluyen los experimentos realizados y los resultados obtenidos, se proporcionan únicamente con fines ilustrativos y no se interpretan como limitantes de la presente invención.

Ejemplos

Ejemplo 1: Selección de clones y subclonación

El MCB, cuya clonalidad se va a evaluar, se generó mediante la transfección de dos transgenes que portaban cadenas ligeras y pesadas en el genoma de una línea celular de ovario de hámster chino (CHO) que sirvió como célula progenitora anfitriona (HPC). La transfección fue realizada por Gala @ (Catalent) utilizando la tecnología G PEx® y se realizó una única dilución limitante para obtener la línea celular monoclonal (Véase "GPEx®: A flexible method for the rapid generation of stable, high expressing, antibody producing mammalian cell lines”, Gregory T. Beck, Libro: Current Trends in Monoclonal Antibody developement and manufacturing, Editor: Springer New York, 2010). Para investigar la clonalidad de esta línea celular, se generaron 25 subclones (SC) por dilución del MCB. La dilución limitante se realizó como sigue. El MCB se descongeló a temperatura ambiente y a continuación se incubó en un matraz T 75 con 20 mL de DMEM con FBS al 10% durante 24 horas a 37°C , CO2 al 5% . Al día siguiente, se retiró el medio, se separaron las células con tripsina y se resuspendieron en medio de nueva aportación para el recuento celular. A continuación se realizaron diluciones limitantes para alcanzar una concentración de 5 células/ml. A continuación, la dilución se sembró en una placa de 96 pocillos, colocando 100 pl en cada pocillo para obtener teóricamente 0,5 células por pocillo. Aquí, se entendió que algunos de los pocillos podían no contener células, pero dada la baja razón célula/pocillo, existe una alta probabilidad de que si un pocillo contiene una célula, no contendrá más de una célula. A continuación, la placa se incubó a 37°C, CO2 al 5% durante 24 horas. Al día siguiente, la placa de 96 pocillos se analizó al microscopio y se marcaron los pocillos que contenían una célula por pocillo. La placa se incubó adicionalmente para obtener las células en un estado confluente que fueron previamente marcadas. Las células que alcanzaron la confluencia se seleccionaron como subclones para un análisis adicional.

Independientemente, se utilizó un MCB divergente (MCBá). El MCBá divergente resultó de la transfección independiente de la célula progenitora anfitriona con el transgén, y estaba destinada al uso previsto como control negativo, proporcionando una célula que se sabe desde el principio que es genéticamente diferente del MCB. Se espera por tanto que MCBá no tenga regiones de inserción de transgenes en común con los subclones o el MCB para el que se va a determinar la clonalidad. El MCB y el MCBá divergente sirven como controles positivos y negativos respectivos con el fin de evaluar el método reivindicado. En la práctica, la determinación de la clonalidad de MCB también puede evaluarse en ausencia de muestras de control basándose en la evaluación de la clonalidad de los subclones derivados de MCB.

Ejemplo 2: Extracción de ADN

La extracción de ADN de los 25 subclones, el MCB y el MCBá divergente se realizó en una columna de afinidad utilizando el kit QlAamp Blood DNA Mini (QIAGEN) de acuerdo con las instrucciones de funcionamiento internas y del fabricante. Brevemente, los sedimentos celulares se resuspendieron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) de acuerdo con la concentración de la muestra y se dividieron en diferentes alícuotas. Se añadieron 200 mL de tampón de lisis y 20 mL de proteinasa K a cada muestra. Las muestras se mezclaron minuciosamente mediante agitación vorticial y se incubaron a 56°C durante 10 minutos. A continuación, se añadieron 200 mL de etanol (96 a 100%) y la mezcla se transfirió a la columna de centrifugación DNeasy Mini (QIAGEN) colocada en un tubo de recogida de 2 mL. Las muestras se lavaron y centrifugaron durante un minuto a 13.000 rpm para eliminar cualquier etanol residual. La elución se realizó con 150 mL de agua añadidos directamente a la membrana DNeasy (QIAGEN). Los productos eluidos del mismo clon se combinaron.

Cada muestra se incubó con la enzima RNasa (Roche) a 37°C durante 30 minutos para eliminar cualquier ARN residual. Después de la incubación, las muestras se cuantificaron con el espectrofotómetro NanoDrop® ND-1000 y se evaluó la razón de absorbancia 260/280 para estimar la calidad del ADN.

Ejemplo 3: Preparación y secuenciación de la biblioteca Ilumina

La preparación de la biblioteca para los 25 subclones, el MCB y el MCBá se realizó utilizando el kit TruSeq DNA (Illumina) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, se fragmentaron 2,6 mg de cada subclón de ADN mediante el aparato Covaris S220 para obtener fragmentos de ADNdh de 300 pb con salientes 3' o 5'. Los salientes se convirtieron enzimáticamente en extremos romos. Se añadió un solo nucleótido de adenina (A) a los extremos 3' de los fragmentos romos para preparar los fragmentos para la ligación del adaptador. La ligación de múltiples adaptadores de indexación a los extremos de los fragmentos de ADN permite la hibridación en una celda de flujo. Se realizó un enriquecimiento selectivo de aquellos fragmentos de ADN que tenían moléculas adaptadoras en ambos extremos para aumentar el rendimiento de la biblioteca.

La calidad de las bibliotecas de ADN se analizó con un Bioanalizador Agilent 2100 para validar el tamaño medio de los fragmentos en las bibliotecas de ADN. Las bibliotecas se cuantificaron adicionalmente mediante el Fluorómetro Qubit® 2.0.

Los agrupaciones de las bibliotecas de ADN se generaron en el aparato Illumina cBot (Illumina, kit TruSeq PE Cluster Kit v3 cBot HS) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La secuenciación se realizó en modo de extremos emparejados (2x100 ciclos) utilizando el aparato Illumina HiSeq 1000. La secuenciación se realizó utilizando el kit TruSeq SBS Kit v3-HS-200-ciclos (Illumina®). Las muestras se cargaron en una celda de flujo v3. Los 25 subclones, el MCB y el MCBá divergente se cargaron cada uno en una calle separada. El subclón núm. 25 (SC25) se cargó en 3 calles para obtener una cobertura de secuenciación más alta. Estaba destinado a utilizar SC25 como el subclón aleatorio (RSC) en el que las TIR identificadas con el grado más alto de cobertura de secuencia parcialmente solapante se identificarían como TIR de referencia (RTIR). Por esta razón, se deseaba maximizar la cobertura de secuencia para SC25 para asegurar una identificación confiable de las RTIR. La carga redundante y posterior secuenciación de fragmentos de ADN derivados de SC25 fueros favorables para este fin.

Todas las muestras se secuenciaron en Illumina HiSeq1000. Para cada muestra se obtuvieron al menos 170 millones de lecturas de 2x100 pb. La puntuación de calidad PHRED para cada muestra analizada fue superior a 70%. Los resultados se resumen en Tabla 1. La cobertura media para cada muestra secuenciada fue de al menos 16X (considerando que el tamaño total del genoma de CHO es de 2,4 Gb). La cobertura para el SC25 en cambio, fue alrededor de 50X debido a la secuenciación de la biblioteca de SC25 en 3 calles, mientras que las bibliotecas restantes se secuenciaron en una calle (véase la tabla 1).

A continuación, los datos sin procesar se procesaron adicionalmente con CASAVA V. 1.8.2 (Illumina) para convertir los archivos basecall (.bcl) en archivos FastQ. Los archivos FastQ son archivos de texto que contienen la secuencia de nucleótidos de las lecturas y las puntuaciones de calidad relativas para cada par de bases. Los archivos FastQ obtenidos fueron a continuación procesados mediante la línea bioinformática que genera un archivo binario (.bam) para cada muestra que contiene todas las lecturas que mapean el genoma de referencia de CHO, incluidas sus coordenadas en el genoma de referencia.

Ejemplo 4: Análisis bioinformático

Para el análisis del MCB, los 25 subclones y el MCBá divergente, se aplicaron diferentes enfoques bioinformáticos para detectar los límites de los transgenes insertados aleatoriamente en el genoma de CHO. Para la detección de los límites se utilizó el concepto descrito en la Figura 1B. Una vez seleccionados, los límites se analizaron mediante herramientas estadísticas, véase por ejemplo el enfoque estadístico descrito en la Fórmula I.

La secuenciación de extremos emparejados realizada se utilizó considerando las secuencias de la lectura 1 y la lectura 2 separadas. El análisis bioinformático se realizó de la siguiente manera: la lectura 1 y la lectura 2 mapearon por separado la secuencia de transgén del genoma de CHO de secuencia conocida (correspondiente al genoma de la célula progenitora anfitriona (HPC)) utilizando Burrows-Wheeler Aligner (BWA) V. 0.6.1 -r104 (Li et al. (2009). Fast and accurate short read alignment with Burrows Wheeler transform. Bioinformatics; 25(14): 1754-60). Una vez mapeados, se obtuvieron cuatro tipos de archivos: la lectura 1 mapeó la secuencia del transgén (secuencia de clase 1), la lectura 1 mapeó el genoma de CHO (secuencia de clase 2), la lectura 2 mapeó la secuencia del transgén (secuencia de clase 3) y la lectura 2 mapeó el genoma de CHO (secuencia de clase 4) (FIGURA 1(b)).

Para la lectura 1 y la lectura 2 que mapean el transgén (clases 1 y 3 respectivas) se creó una lista de las lecturas. A continuación, se buscó la lectura correspondiente "emparejada" en las secuencias de la lectura 1 y la lectura 2 que mapean el genoma de CHO (clases 2 y 4 respectivas) mediante el identificador de secuencia de Illumina (FIGURA 2). Estas lecturas mapearon el genoma de referencia de CHO mediante Burrows-Wheeler Aligner (BWA) V. 0.6.1-r104.

Aquellas lecturas que se alinearon con CHO representan regiones adyacentes a los límites del transgén insertado en el genoma de CHO porque tienen el par de lectura complementario que mapea el transgén. Finalmente, las regiones de inserción se identificaron en función de la posición en los diferentes armazones del genoma de referencia de CHO mediante el soporte lógico Geneious® V. 6.0 (este soporte lógico permite una identificación fácil de ver de la TIR a la cobertura más alta, y así simplifica la visualización de los resultados)

Después de la identificación de las regiones de inserción de transgenes en todas las muestras, se realizó un enfoque de análisis estadístico para determinar una o más regiones de inserción de transgenes de referencia (RTIR). Esta selección se realizó sobre la base de dos características: (1) el número de lecturas representativas para cada región de inserción y (2) el grado de solapamiento de estas lecturas en el área de la región de inserción (FIGURA 4). La combinación de estos dos parámetros fue importante para identificar los sitios de inserción con la cobertura más alta y, al mismo tiempo, evitar acumulaciones de lecturas aberrantes debido a sesgos resultantes de la PCR y/o la preparación de la biblioteca.

Como se mencionó anteriormente, la selección de RTIR se realizó en SC25, y esta fue la razón por la que SC25 se secuenció con la cobertura de secuencia más alta (redundancia Calle Celda de Flujo 3 como se explicó anteriormente). El archivo de alineamiento de esta muestra se abrió con el soporte lógico Geneious® y se determinaron las primeras 20 TIR que cumplían con los requisitos anteriores y, por cumplir con estos requisitos, se designaron como RTIR. Por tanto, estas 20 RTIR representaban las regiones de inserción de transgenes (TIR) más fiables y, por tanto, se utilizaron como base para la comparación en el análisis estadístico posterior (no se muestra la posición de las RTIR).

Ejemplo 5: Comparación de las regiones de inserción

Se creó una matriz de presencia/ausencia para proporcionar una comparación de las RTIR seleccionados entre todas las muestras. La matriz de presencia/ausencia se modeló a partir de un gel de electroforesis, representando las "bandas" la intersección entre las RTIR en SC25 (correspondiente a la RSC) y las CTIR correspondientes en una SC dada. La presencia/ausencia de una RTIR dada como una CTIR en una SC dada se indicó mediante un patrón de código binario, que representa la presencia (1, color negro) o ausencia (0, color blanco) de una CTIR dada. A continuación, todas las muestras se compararon entre sí para todas las regiones de inserción identificadas (FIGURAS 1(c) y 5).

En teoría, la base de este análisis se refiere al mecanismo del sistema GPEx® para insertar aleatoriamente el transgén en el genoma de HPC en una pluralidad de posiciones. De hecho, si el MCB, para el que se va a determinar la clonalidad, es monoclonal, las regiones de inserción de transgenes (TIR) insertadas aleatoriamente en el genoma de HPC deben ser idénticas entre los 25 subclones y el MCB, mientras que el MCBá divergente no debe tener ningún sitio de inserción en común con los subclones y el MCB. Por esta razón, la matriz de presencia/ausencia fue diseñada para entregar información relacionada con la presencia/ausencia de cada región de inserción del transgén de referencia (RTIR) en cada uno de los subclones (FIGURA 5). Los resultados indican que casi todos los subclones y el MCB comparten las mismas regiones de inserción de transgenes con respecto a las RTIR en el genoma del subclón aleatorio (RSC), es decir, SC25. Por el contrario, las TIR del MCBá divergente mostraron un resultado diferente en el que no estaba presente ninguna de las 20 RTIR.

Además, la matriz de presencia/ausencia mostró que para dos muestras aparentemente faltaba una región de inserción del transgén. En particular, no se observaron RTIR18 en SC4 y RTIR1 en SC24 (FIGURA 5). Se llevaron a cabo investigaciones adicionales en estas dos muestras mediante PCR y secuenciación tradicional de Sanger. Con este fin, se diseñaron dos conjuntos de cebadores específicos para amplificar RTIR1 y RTIR18 en SC4 y SC24 respectivos. Las reacciones de PCR se realizaron en SC4 y SC24 utilizando los conjuntos específicos de cebadores para RTIR1 y RTIR18. Además, SC1 y el ADN de la célula anfitriona CHO (que no contiene ninguna TIR) se utilizaron como controles positivos y negativos respectivos.

Se observaron los productos de PCR para RTIR1 y RTIR18 en ambas muestras de SC4 y SC24 así como en el control positivo de SC1. No se observó producto de PCR en la muestra de control negativo. Los productos de PCR de las respectivas RTIR se purificaron y los moldes purificados se secuenciaron en una plataforma de secuenciación ABI Prism 3130. Los resultados de la secuenciación de Sanger indican que tanto para RTIR1 como RTIR18 SC4 así como SC24 fueron positivos, lo que indica que también estaban presentes en estas dos muestras RTIR1 y RTIR18 (datos no mostrados).

Ejemplo 6: Análisis de similitud

La similitud entre las muestras se expresó numéricamente mediante el uso de un enfoque de análisis de agrupaciones. Específicamente, la distancia entre el MCB y cada uno de los 25 subclones, así como el MCBa divergente se calculó utilizando el coeficiente de Dice basado en la siguiente fórmula:

Dd (A, B) representa la función de distancia entre dos muestras A y B, en donde N(total) es el número de regiones de inserción presentes tanto en las muestras A como en B; N(a) es el número total de regiones de inserción presentes en la muestra A; y N(b) es el número total de regiones de inserción presentes en la muestra B; en donde Dd (A, B) representa la distancia, en una escala de 0 a 1, en donde una distancia de 0 representa la identidad clonal entre dicha RSC y un SCn respectivo y 1 representa la diferencia clonal.

Para mostrar gráficamente la distancia entre todas las muestras, se utilizó un enfoque de Escala MultiDimensional (MDS) (FIGURA 6) (Kruskal y Wish (1978), Multidimensional Scaling, Sage University Paper series on Quantitative Application in the Social Sciences, 07-011, Beverly Hills y Londres, Sage Publications; Michael R. Anderberg (1973) Custer analysis for applications, Academic Press, Nueva York)

Los resultados del análisis de similitud indican que se obtuvieron dos subgrupos distintos. El primer subgrupo corresponde a los 25 subclones y el MCB mientras que el segundo subgrupo corresponde al MCBa divergente. La distancia entre estos dos subgrupos fue 1 o 100%, lo que indica que los 25 subclones y el MCB corresponden al mismo subgrupo (agrupación) mientras que el MCB divergente corresponde a un grupo diferente (subclón) (FIGURA 6).

Ejemplo 7: Análisis de probabilidad

Para evaluar la probabilidad de que dos muestras de diferentes poblaciones, es decir, que tengan diferentes regiones de inserción de transgenes, compartan las mismas 20 RTIR, se realizó un cálculo experimental basado en la siguiente fórmula:

en donde M es el número de posibles regiones de inserción de transgenes y S es el número de lecturas del transgén transfectado.

El genoma de CHO tiene una longitud de 2,4 Gb. Sobre la base de la tecnología aplicada de análisis NGS combinado y procesamiento de datos bioinformáticos, las regiones de inserción de transgenes se pueden determinar con una resolución de 2 kb dentro del genoma de CHO. Basándose en el supuesto de que la tecnología puede identificar potencialmente 1,2 millones de posibles regiones de inserción de transgenes dentro del genoma de CHO (2,4 Gb/2kb) y la tasa de transfección supuesta de 700 copias del transgén en la célula progenitora CHO, se obtiene una probabilidad de p (1) 0 ~ 10-30.

Este resultado indica que la probabilidad de que dos subclones derivados de diferentes poblaciones de MCB compartan regiones de inserción de transgenes comunes tiende a ser 0. En la práctica, la cuestión de determinar la clonalidad de un MCB a menudo será una determinación binaria, lo que significa que los subclones son 100% idénticos entre sí, es decir, tienen todas las regiones de inserción en común, o tienen 0% o una fracción muy baja de regiones de inserción de transgenes (probablemente coincidentes) en común. Generalmente, una determinación de la monoclonalidad de MCB requerirá típicamente 100% de congruencia genética entre las RTIR en la RSC y todas las CTIR en cada uno de los subclones evaluados. Cualquier divergencia individual entre una RTIR dada y su CTIR correspondiente en un subclón dado puede evaluarse más de cerca usando una metodología de secuenciación alternativa, p. ej. secuenciación de Sanger.

La probabilidad se calculó teniendo en cuenta diferentes aspectos biológicos: 1) teóricamente, los retrovectores insertan el transgén aleatoriamente en el ADN (sin embargo, varios trabajos demuestran que hay algunas zonas particulares del genoma diana que los retrovirus (y retrovectores) prefieren para la inserción), y 2) la inserción de los GOI también está relacionada con el tipo de retrovector utilizado para la transfección (Bushman et al. Genome-wide analysis of retroviral DNA integration. Nat Rev Microbiol 2005; 3(11) 848-858; Felice et al. Transcription factor binding sites are genetic determinants of retroviral integration in the human genome. PLoS ONE 2009; 4(2):e4571). Por ejemplo, recientemente, estudios demostraron que los vectores derivados de MLV se integran preferentemente dentro o alrededor de genes implicados en la regulación celular, tales como los sitios de inicio de la transcripción, potenciadores o promotores. Además, parece que la accesibilidad del ADN diana juega un papel importante en la integración del transgén (p. ej., las regiones centroméricas de heterocromatina parecen estar menos favorecidas para la integración) (LaFavey et al., MLV integration site selection is driven by strong enhancers and active promoters Nucleic Acids Research, 2014, vol.42, núm. 74257-4269. Por estas razones, la inserción del vector retroviral se definió como no totalmente aleatoria y se aplicó el enfoque de probabilidad apropiado.

Ejemplo 8: Confirmación de la viabilidad de los métodos

Los métodos descritos en los Ejemplos 1 a 7 se han aplicado a un segundo tipo de MCB, que expresa un anticuerpo monoclonal diferente (mAb2). Este segundo MCB se generó mediante la transfección de un transgén que expresaba las cadenas ligera y pesada de mAb2 en el genoma de una línea celular CHO que sirvió como HPC. Fue posible evaluar la clonalidad de este MCB que expresaba mAb2 según los métodos de la invención (datos no mostrados), confirmando que los métodos según la invención son reproducibles cualquiera que sea el transgén y posiblemente cualquiera que sea la línea celular.

Ejemplo 9: Análisis de una sola célula

El método descrito para la identificación de los sitios de inserción del transgén se puede aplicar en una sola célula en caso de que se realice el protocolo de Secuenciación de una Sola Célula. La diferencia entre la secuenciación de una sola célula y la secuenciación de MCB o subclones solo está relacionada con la forma en que se extrae el ADN. En el caso de la Secuenciación de una Sola Célula, de hecho, las células se someten a Amplificación del Genoma Completo para obtener una cantidad suficiente de ADN. Por el contrario, la extracción de ADN de MCB y subclones se puede realizar con los métodos tradicionales de extracción de ADN descritos en el ejemplo 2.

Tabla 1: Resumen de los parámetros de calidad más importantes generados por el aparato HiSeq 1000, indicando los paréntesis los criterios de aceptación para cada valor.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para determinar la clonalidad de un Banco Maestro de Células (MCB), siendo dicho MCB el resultado de la inserción predecible o no predecible de un transgén de secuencia conocida en el genoma de una célula progenitora anfitriona (HPC) de secuencia conocida, comprendiendo dicho método las etapas de:

a) Identificar una o más regiones de inserción de transgenes (TIR) en el genoma de una célula subclonal de referencia (RSC), en donde la RSC se ha aislado del MCB para el que se va a determinar la clonalidad y en donde dicha identificación se logra mediante

i. secuenciación de extremos emparejados de dicho genoma de RSC para obtener una secuencia del genoma de RSC o secuencias de genoma de RSC; y

ii. alineamiento de dicha secuencia o secuencias del genoma de RSC con dicha secuencia del genoma de HPC conocida y dicha secuencia del transgén conocida,

produciendo así una o más regiones de inserción de transgenes (TIR);

b) Determinar una o más TIR identificadas en la etapa (a) con el mayor grado de cobertura de secuencia, en donde dicha cobertura de secuencia se refiere al número de veces que se lee una secuencia de ácido nucleico dada que contiene una TIR dada durante el procedimiento de secuenciación mediante lecturas parcialmente solapantes;

c) Identificar una o más regiones de inserción de transgenes (TIR) en los genomas respectivos de los uno o más subclones (SC);

en donde cada una de las SC se ha aislado del MCB para el que se va a determinar la clonalidad pero es independiente de dicha RSC,

en donde dicha identificación se logra mediante

i. secuenciación de extremos emparejados de cada genoma de SC respectivo para obtener una secuencia del genoma de SC o secuencias del genoma de SC; y

ii. alineamiento de cada secuencia o secuencias del genoma de SC respectivo con dicha secuencia del genoma de HPC conocida y dicha secuencia del transgén conocida,

e) Evaluar la correspondencia entre cada una de dichas una o más CTIR presentes en una SC respectiva y las RTIR correspondientes presentes en dicha RSC, donde la relación entre dicha RSC y cada una de dichas una o más SC se evalúa mediante el cálculo de una matriz de distancia; y

f) Determinar la clonalidad de dicho MCB basándose en dicha correspondencia evaluada en la parte (e), en donde dicho MCB se considera monoclonal, si dicha RSC y dichas una o más SC están agrupadas en la misma agrupación, y en donde la matriz de distancia se calcula basándose en la siguiente fórmula (I),

Dd (RSC,SCm) = 1 - (2* N(total) / [N(ctir) N(rhr)])

en donde Dd (RSC, SCm) representa la función de distancia entre dicho genoma de RSC y un genoma de SCm respectivo, en donde N(total) es el número de regiones de inserción presentes tanto en dicho genoma de RSC como en dicho genoma de SCm; N(ctir) es el número total de regiones de inserción presentes en dicho genoma de SCm; y N(rtir) es el número total de regiones de inserción presentes en dicho genoma de RSC; en donde Dd (RSC, SCm) representa la distancia, en una escala de 0 a 1, en donde una distancia de 0 representa identidad clonal entre dicha RSC y una SCm respectiva y 1 representa diferencia clonal.

2. El método de la reivindicación 1, en donde la secuenciación de extremos emparejados implica la secuenciación de una molécula de ácido nucleico dada de ambos extremos de dicha molécula de ácido nucleico, generando así pares de lecturas para una molécula de ácido nucleico dada que representa un fragmento del genoma que se debe secuenciar.

3. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde dicha RSC se secuencia con una cobertura de secuencia más alta en comparación con dichas una o más SC.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde dicho MCB resulta de la inserción de dicho transgén en múltiples posiciones en dicho genoma de HPC, en donde dicha inserción aleatoria se efectúa preferiblemente usando un vector retroviral.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la determinación de las TIR comprende la clasificación de secuencias de lectura 1 de extremos emparejados y secuencias de lectura 2 de extremos emparejados derivadas de bibliotecas de extremos emparejados en 4 clases, en donde

• la clase 1 comprende secuencias de lectura 1 que mapean dicho transgén;

• la clase 2 comprende secuencias de lectura 1 que mapean dicho genoma de HPC;

• la clase 3 comprende secuencias de lectura 2 que mapean dicho transgén; y

• la clase 4 comprende secuencias de lectura 2 que mapean dicho genoma de HPC;

en donde dicha lectura 1 y dicha lectura 2 representan lecturas respectivas hacia adelante y hacia atrás correspondientes a los extremos 5' y 3' de una molécula de ácido nucleico dada dentro de una agrupación de ácidos nucleicos generada en la secuenciación de una biblioteca de ácidos nucleicos de dicha RSC o dichas una o más SC.

6. El método de la reivindicación 5, en donde las secuencias de lectura 1 se combinan con las secuencias de lectura 2 correspondientes utilizando un identificador de secuencia de celda de flujo, en donde dicho identificador de secuencia comprende información de la calle de la celda de flujo, el número de tesela dentro de la celda de flujo, la coordenada "x" de la agrupación de ácidos nucleicos dentro de una tesela , y la coordenada "y" de la agrupación de ácidos nucleicos dentro de una tesela , asignando así a cada par de secuencias correspondiente a las secuencias de lectura 1 y lectura 2 una posición única dentro de la celda de flujo.

7. El método de las reivindicaciones 5 y 6, en donde las respectivas secuencias de lectura 1 y lectura 2 de un respectivo par de lectura se alinean por separado con las secuencias conocidas del transgén y del genoma de HPC.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en donde solo los pares de lectura que comprenden secuencias de clase 1 y 4 y los pares de lectura que comprenden secuencias de clase 2 y clase 3 se seleccionan para análisis adicional.

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en donde dichas TIR se identifican alineando las secuencias de lectura de extremos emparejados correspondientes a la clase 2 y clase 4 con el genoma de HPC, definiendo así una región de 2 kb para cada una de dichas TIR en el genoma de HPC.

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende determinar n RTIR con la cobertura de secuencia más alta en la biblioteca de NGS de extremos emparejados; en donde n es un número entero de 5 a 50, preferiblemente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50.

11. El método de la reivindicación 10, en donde las primeras n RTIR con la cobertura de secuencia más alta se determinan basándose en

a) el número de lecturas de una secuencia de lectura de extremos emparejados respectiva correspondiente a la clase 2 y la clase 4 que mapean el genoma de HPC, en donde un número mayor de lecturas indica inclusión como una RTIR; y

b) el solapamiento parcial del número de lecturas de una secuencia de lectura de extremos emparejados respectiva correspondiente a la clase 2 y la clase 4, en donde el solapamiento parcial inferior del número de lecturas indica la inclusión como una RTIR.

12. El método de la reivindicación 10 u 11, en donde cada una de las primeras n RTIR en dicho genoma de RSC se compara con la ubicación genómica correspondiente de dichas CTIR en cada uno de dichos uno o más genomas de SC.

13. El método de la reivindicación 12, en donde la comparación de dichas RTIR en dicha RSC y dichas CTIR en dichas una o más SC se logra generando una matriz de presencia/ausencia de regiones de inserción, en donde una dimensión de matriz representa dichas n RTIR de dicho transgén en dicho genoma de RSC y otra dimensión de matriz, preferiblemente ortogonal, representa dicha RSC y cada una de dichas una o más SC.

14. El método de la reivindicación 13, en donde la presencia o ausencia de una CTIR respectiva en dichas una o más SC con relación a una RTIR respectiva en dicha RSC se representa en la matriz como un código de color binario, en donde un primer color representa la presencia o ausencia respectiva. de una RTIR respectiva en dicha RSC, la presencia o ausencia respectiva de una CTIR respectiva en dichas una o más SC, y donde un segundo color representa la ausencia o presencia respectiva de una RTIR respectiva en dicha RSC, la ausencia o presencia respectiva de una CTIR respectiva en dichas una o más SC.

15. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde los parámetros N(total), N(ctir) y/o N(rtir) se calculan basándose en la matriz de presencia/ausencia de regiones de inserción generadas según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 14.

16. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el método comprende representar dichas una o más SC con respecto a la RSC en una matriz de distancia común.

17. El método de la reivindicación 16, en donde se considera que dos genomas respectivos pertenecen a una agrupación común si la distancia entre ellos calculada según la Fórmula (I) es 0.