ES2862700T3 - Péptido para utilizar en el tratamiento de afecciones médicas con componentes inflamatorios o autoinmunes - Google Patents

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Abstract

Formulación que comprende una fibrilla o un péptido formador de fibrillas, en la que la fibrilla o el péptido formador de fibrillas es la SEQ ID NO: 1053, para su uso en un procedimiento de activación de linfocitos B-1a para tratar una afección inflamatoria o autoinmune en un sujeto que la encesite, en la que la afección inflamatoria o autoinmune comprende esclerosis múltiple, artritis reumatoide, artritis, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) o enfermedad alérgica de las vías respiratorias, que comprende: administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la formulación al tracto respiratorio del sujeto que la necesite, activando de este modo los linfocitos B-1a y tratando la afección inflamatoria o autoinmune en el sujeto que lo necesite.

Description

DESCRIPCIÓN
Péptido para utilizar en el tratamiento de afecciones médicas con componentes inflamatorios o autoinmunes
CAMPO DE LA DIVULGACIÓN
Se describen formulaciones y formulaciones para uso, tal como se reivindica, para direccionar y activar linfocitos B-1a.
ANTECEDENTES DE LA DIVULGACIÓN
Las células B del sistema inmunológico producen anticuerpos. Históricamente, se pensaba que todas las células B producían anticuerpos después de la exposición a un patógeno. Sin embargo, ahora se sabe que las células B2 producen anticuerpos después de la exposición a un patógeno, mientras que las células B1 producen anticuerpos en ausencia de exposición a un patógeno. Las células B1 también difieren funcionalmente de las células B2 en presentar eficazmente el antígeno a las células T y en mostrar evidencia de señalización tónica en ausencia de estimulación específica.
Los anticuerpos producidos por las células B1 (referidas como inmunoglobulinas "naturales" o en "reposo" (por ejemplo, IgM o IgA en reposo)) difieren de otros anticuerpos en que son más ampliamente reactivos y seleccionado repertorio. Ahora se sabe que las inmunoglobulinas en reposo juegan un papel importante en la defensa temprana contra infecciones bacterianas y virales, y también juegan un papel en una amplia variedad de enfermedades, mediante el reconocimiento de autoantígenos y la unión de desechos celulares.
Las células B1 se pueden subdividir además en linfocitos B-1a y linfocitos B-1b. Ambos tipos tienen el perfil de marcador CD20+CD27+CD43+CD70'. Los linfocitos B-1a son CD5+mientras que los linfocitos B-1b son CD5-. Las células precursoras de B-1a y B-1b también difieren en los niveles de expresión de CD138.
Los macrófagos son glóbulos blancos producidos por la división de monocitos. Los monocitos y macrófagos son fagocitos y desempeñan un papel en la inmunidad innata (defensas inmunitarias no específicas), además de ayudar a iniciar la inmunidad adaptativa (mecanismos de defensa específicos). Estas células fagocitan (engullen y luego digieren) restos celulares y patógenos como células estacionarias o móviles. Cuando son activados por patógenos o por otros mecanismos, los macrófagos estimulan y reclutan linfocitos y otras células inmunes para responder a la agresión.
A pesar de que los macrófagos juegan un papel vital en las defensas inmunitarias del huésped, los macrófagos activados están también implicados en la progresión de varias enfermedades y trastornos. Los macrófagos activados provocan una infiltración masiva de leucocitos e inundan el tejido circundante con mediadores inflamatorios, factores proapoptóticos y proteasas que degradan la matriz. Estas acciones pueden provocar una inflamación que puede desmantelar los tejidos hasta el punto de causar lesiones graves. La destrucción de tejido perpetrada por la inflamación inducida por macrófagos se ha asociado con el desarrollo de tumores, trastornos autoinmunes y otras afecciones. Kurnellas et al (2013), Science Translational Medicine, 5, 179, 1-12 describen que las fibrillas amiloides compuestas de péptidos hexaméricos atenúan la neuroinflamación. El documento US 2007/0053844 A1 describe formulaciones para la alteración de las propiedades biofísicas del revestimiento de la mucosa. El documento US 2012/0328703 A1 describe partículas hinchables para la administración de fármacos. El documento US 2009/0325931 A1 describe el uso de inhibidores de CDK para el tratamiento de trastornos mediados por granulocitos. Meredith et al (2015), The AAPS Journal, 17, 4, 780-787 describe la administración intranasal de proteínas y péptidos en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas. Kurnellas et al (2014), Journal of Experimental Medicine, 211, 9, 1847-1856 describe los mecanismos de acción de hexapéptidos amiloidogénicos terapéuticos en la mejora de la enfermedad inflamatoria cerebral.
RESUMEN DE LA DIVULGACIÓN
La presente invención se define por las reivindicaciones. La presente invención proporciona que el direccionamiento y la activación de linfocitos B-1a a lo largo del tracto respiratorio pueden tratar afecciones médicas que tienen componentes inflamatorios o autoinmunitarios, tal como se reivindica. Los linfocitos B-1a pueden dirigirse y activarse eficazmente usando fibrillas o péptidos formadores de fibrillas, tal como se reivindica.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Muchos de los dibujos presentados en el presente documento se entienden mejor en color, que no está disponible en las publicaciones de solicitud de patentes en el momento de la presentación. Los solicitantes consideran las versiones en color de los dibujos como parte del documento original y se reservan el derecho de presentar imágenes en color de los dibujos en procedimientos posteriores.
Figuras 1A-1C. Las fibrillas amiloides compuestas de Tau 623-628 se unen y son endocitosadas por linfocitos B-1a (CD19 CD5) y LPM (MO peritoneales CD11bhi F4/80hi). (Figura 1A) Una combinación de una imagen confocal (aumento de 40x) y (Figura 1B) un corte en Z único (63x) de una película construida a partir del conjunto de imágenes confocales de células de la cavidad peritoneal de ratones de tipo salvaje inyectados con 10 |jg FITC-Tau 623-628 y teñidas con CD19 (PE) antirratón de rata, F4/80 (Alexa Fluor 647) y DAPI. Las células se visualizaron usando un microscopio confocal de láser de luz blanca Leica TCS SP8. (Figura 1C) Se inyectaron ratones de tipo salvaje con 10 jg de FITC-Tau 623-628 y se aislaron células peritoneales después de 10 minutos y se compararon con células peritoneales de un animal no inyectado. Las células se lavaron y se tiñeron con CD11b (PE) de rata anti-ratón, CD19 (Pacific Blue), CD5 (APC), CD3 (PerCP-Cy5.5), y yoduro de propidio para viabilidad. Las puertas que delimitan los diferentes tipos de células se muestran en los dos paneles superiores (10 minutos después de la inyección), y la cantidad de tinción con FITC-Tau para cada tipo de célula se muestra en los cinco paneles inferiores.
Figuras 2A-2D. Estrategia de entrada selectiva (“gating”) utilizada para identificar las diversas poblaciones de células peritoneales murinas. Las células totales del lavado peritoneal se tiñeron con CD11b (PE) antirratón de rata, CD19 (Pacific Blue), CD5 (APC), CD3 (PerCP-Cy5.5) y yoduro de propidio (marcador de viabilidad). (Figura 2A) Las células peritoneales de ratones no inmunizados se seleccionaron secuencialmente para identificar macrófagos (CD11b), eosinófilos (CD11bloSSChi), mastocitos (CD11b-SSChi), células T (C011b-CDShiCD19‘), células B-1a (CD19hi CDS+) y B-2 (CD19+CD5'). (Figura 2B) Los diversos subconjuntos de células peritoneales de ratones no inmunizados se analizaron para determinar sus niveles de autofluorescencia emitidos en el canal FITC para establecer el umbral negativo (es decir, FITC-Taunegativo), que se utilizó para determinar la unión de FITC-Tau mostrado en la figura 1. (Figura 2C) Se procesaron y tiñeron células peritoneales vivas totales 10 min y 5 h después de la inyección intraperitoneal de 10 jg de FITC-Tau, tal como se describe anteriormente, y se seleccionaron para identificar macrófagos, eosinófilos y mastocitos. Los macrófagos CD11bhi disminuyen drásticamente 5 h después de la inyección, es decir, de > 40% (panel izquierdo) a < 3% (panel derecho). (Figura 2D) Los paneles muestran células B peritoneales (B-1 y B-2) 10 min y 5 h después de la inyección de FITC-Tau. Diez minutos después de la inyección, la mayoría (> 70%) de las células peritoneales B-1a y B-2 endocitan FITC-Tau (panel central). Por el contrario, 5 h después de la inyección, el porcentaje de células B-1a y B-2 peritoneales disminuye drásticamente, y las células B-1a y B-2 residentes restantes son negativas para FITC-Tau (panel derecho).
Figura. 3. La incubación de Amilina 28-33 con células peritoneales in vitro no afecta la viabilidad celular. Las células peritoneales se aislaron mediante lavado de ratones C57BL/6, se tomaron alícuotas de 500.000 células por pocillo de una placa de base redonda de 96 pocillos y se trataron con 1,0, 0,5, 0,25, 0,125 jg/pocillo de Amilina 28-33 durante 30 minutos o 120 minutos en DMEM con f Cs al 10 %. Al final de la incubación, las células se centrifugaron, se aspiró el sobrenadante y las células se tiñeron con CD11b anti-ratón de rata (Pacific Blue), CD5 (PE), CD19 (APC) y se incubaron durante 30 minutos en hielo. Las células se lavaron una vez, se transfirió el aspirado a tubos FACS, se añadió PI y se analizaron mediante citometría de flujo.
Figuras 4A-4F. Los linfocitos B-1a y IL-10 son necesarios para la eficacia terapéutica de los péptidos amiloidogénicos. Se trataron diariamente ratones jM T con inyecciones intraperitoneales (i.p.) de 10 jg (Figura 4A) de Amilina 28-33 (n = 10) o (Figura 4B) Tau 623-628 (n = 10) al inicio de los síntomas. (Figura 4C) Se trataron diariamente por vía intraperitoneal ratones con EAE de tipo salvaje con 10 jg de Amilina 28-33 (n = 10). (Figura 4D) Se trataron ratones deficientes en IL-10 (n = 7) y (Figura 4E) de tipo salvaje (n = 10) diariamente con 10 jg de amilina 28-33. Los valores en el gráfico representan la media /- SEM * p <0,05 y ** p <0,005 según la prueba de U de Mann-Whitney. Todos los experimentos se repitieron al menos dos veces. (Figura 4F) Transferencia adoptiva de 3,5 x 105 células B-1a en ratones jM T antes de los signos de EAE se trataron diariamente por vía i.p. con 10 jg de Amilina 28­ 33 o tampón de control (n = 6). Los ratones sin transferencia de células se trataron con 10 jg de Amilina 28-33. Los valores en el gráfico representan la media /- SEM * p <0,05 según la prueba de U de Mann-Whitney.
Figura 5. Medición en tiempo real del tráfico de linfocitos B-1a y LPM transferidos adoptivamente mediante bioluminiscencia inducida por péptidos amiloidogénicos. (Figura 5, arriba a la izquierda) Se inyectaron 1x105 y 2x105 i.p. células clasificadas B-1a en ratones albinos C57BL/6 y el sustrato luciferina, 5 minutos más tarde se obtuvieron imágenes de bioluminiscencia usando una cámara CCD en serie cada 5 minutos. Se detectó una señal bioluminiscente en el área del peritoneo que disminuyó con el tiempo y se relocalizó en el área de los ganglios linfáticos inguinales. (Figura 5, arriba a la derecha) Cuantificación de la distribución de células B-1a Luc+ midiendo la emisión de luz de los ratones albinos C57BL/6 a lo largo del tiempo después de la inyección de Tau 623-628. (Figura 5, abajo a la izquierda) Se inyectaron 1x106 LPM luc+ i.p. en ratones albinos C57BL/6 y se volvió a inyectar luciferasa cada 30 minutos antes de obtener una imagen. Los MO salieron del peritoneo (círculo más grande) y migraron a diferentes tejidos, incluidos los ganglios linfáticos inguinales (círculo más pequeño). (Figura 5, abajo a la derecha) Cuantificación de las células MO que migran a los ganglios linfáticos desde el peritoneo midiendo la emisión de luz. La BLI medida de los ganglios linfáticos aumentó 10 veces a los 60 min en comparación con la medición inicial a los 5 min.
Figuras 6A-6D. Las fibrillas amiloides, compuestas por Tau 623-628 o Amilina 28-33, inducen un patrón de expresión génica diferente a los LPS en linfocitos B-1a y MO peritoneales, SPM y LPM. (Figura 6A) Expresión génica diferencial (720 genes anotados) expresada como un mapa de calor inducido por LPS y los dos tipos de fibrillas amiloides. El ARN aislado de linfocitos B-1a purificados y MO CD11bhi aislados de grupos de tres ratones C57BL/6 inyectados con 10 jg de LPS, Amilina 28-33, Tau 623-628 o tampón. Cada una de las muestras de ARN se hibridó con una placa de micromatrices (SurePrint G3 Mouse; Agilent Technologies) y se cuantificó y analizó utilizando el software GeneSpring e Ingenuity. Medición por qPCR de la inducción génica en comparación con células de animales no inyectados de conjuntos de genes que representan (Figura 6B) citocinas inflamatorias, (Figura 6C) genes inmunosupresores o (Figura 6D) genes de activación. Los gráficos representan los resultados de tres mediciones independientes. El conjunto completo de datos se ha depositado en el banco de datos Geo.
Figuras 7A y 7B. La administración intranasal de Amilina 28-33 reduce los signos clínicos de EAE. (Figura 7A) Los ratones con EAE se trataron diariamente por vía intranasal con 10 jg de Amilina 28-33 (n = 16) durante 10 días al inicio de los síntomas. Los valores en el gráfico representan la media /- SEM * p <0,05 y ** p <0,005 mediante la prueba U de Mann-Whitney. Los experimentos se repitieron dos veces. (Figura 7B) Los esplenocitos de ratones EAE tratados con 10 |jg de Amilina 28-33 se estimularon con 0, 5, 10 y 20 |jg/ml de MOG35-55 y se midieron los niveles de citocinas IL-6, IFNy, IL-2 e IL-17 (n = 3). Los valores en el gráfico representan la media /- SEM *p <0.01, **p <0,001 y *** p <0,0001 según la prueba t de Student.
Figura 8. Ejemplos de secuencias de Ap42 y Ap40 (SEQ ID NO: 1063 y 1064).
DESCRIPCIÓN DETALLADA
Las células B del sistema inmunológico producen anticuerpos. Históricamente, se pensaba que todas las células B producían anticuerpos después de la exposición a un patógeno. Sin embargo, ahora se sabe que las células B2 producen anticuerpos después de la exposición a un patógeno, mientras que las células B1 producen anticuerpos en ausencia de exposición a un patógeno. Las células B1 también difieren funcionalmente de las células B2 en presentar eficazmente el antígeno a las células T y en mostrar evidencia de señalización tónica en ausencia de estimulación específica.
Los anticuerpos producidos por las células B1 (referidas como inmunoglobulinas "naturales" o en "reposo" (por ejemplo, IgM o IgA en reposo)) difieren de otros anticuerpos en que son más ampliamente reactivos y seleccionado repertorio. Ahora se sabe que las inmunoglobulinas en reposo juegan un papel importante en la defensa temprana contra infecciones bacterianas y virales, y también juegan un papel en una amplia variedad de enfermedades, mediante el reconocimiento de autoantígenos y la unión de desechos celulares.
Las células B1 se pueden subdividir además en linfocitos B-1a y linfocitos B-1b. Ambos tipos tienen el perfil de marcador CD20+CD27+CD43+CD70-. Los linfocitos B-1a son CD5+ mientras que los linfocitos B-1b son CD5-. Las células precursoras de B-1a y B-1b también difieren en los niveles de expresión de CD138.
Los macrófagos son glóbulos blancos producidos por la división de monocitos. Los monocitos y macrófagos son fagocitos y desempeñan un papel en la inmunidad innata (defensas inmunitarias no específicas), además de ayudar a iniciar la inmunidad adaptativa (mecanismos de defensa específicos). Estas células fagocitan (engullen y luego digieren) restos celulares y patógenos como células estacionarias o móviles. Cuando son activados por patógenos o por otros mecanismos, los macrófagos estimulan y reclutan linfocitos y otras células inmunes para responder a la agresión.
A pesar de que los macrófagos juegan un papel vital en las defensas inmunitarias del huésped, los macrófagos activados están también implicados en la progresión de varias enfermedades y trastornos. Los macrófagos activados provocan una infiltración masiva de leucocitos e inundan el tejido circundante con mediadores inflamatorios, factores proapoptóticos y proteasas que degradan la matriz. Estas acciones pueden provocar una inflamación que puede desmantelar los tejidos hasta el punto de causar lesiones graves. La destrucción de tejido perpetrada por la inflamación inducida por macrófagos se ha asociado con el desarrollo de tumores, trastornos autoinmunes y otras afecciones.
La presente invención proporciona que el direccionamiento y la activación de linfocitos B-1a a lo largo del tracto respiratorio pueden tratar afecciones médicas que tienen componentes inflamatorios o autoinmunes, tal como se reivindica. Los linfocitos B-1a pueden dirigirse y activarse eficazmente usando fibrillas o péptidos formadores de fibrillas, tal como se reivindica.
El tracto respiratorio es la estructura implicada en el intercambio de gases entre la atmósfera y el torrente sanguíneo. El tracto respiratorio abarca las vías respiratorias superiores, incluidas la orofaringe y la laringe, seguidas de las vías respiratorias inferiores, que incluyen la tráquea seguida de bifurcaciones en los bronquios y los bronquiolos. Las vías respiratorias superiores e inferiores se denominan vías respiratorias conductoras. Los bronquiolos terminales entonces se dividen en bronquiolos respiratorios que conducen a la zona respiratoria final, los alvéolos o pulmón profundo donde se produce el intercambio de gases. El área de superficie alveolar es la más grande del sistema respiratorio donde se produce la absorción del agente activo (por ejemplo, el fármaco).
La pleura es una membrana que rodea los pulmones y tiene una estructura de dos capas que incluye una pleura exterior o parietal que normalmente está unida a la pared del pecho y una pleura interior o visceral que cubre los pulmones y las estructuras contiguas. El espacio entre las pleuras interior y exterior se conoce como cavidad pleural, espacio pleural o espacio intrapleural.
La invención reivindicada incluye la administración de formulaciones que incluyen el agente activo de la SEQ ID NO: 1053 a diversas partes del tracto respiratorio. Las realizaciones particulares incluyen la administración al tracto respiratorio para direccionary activar linfocitos B-1a en la cavidad pleural.
La administración pulmonar se refiere a la administración de formulaciones para que lleguen a los pulmones y en realizaciones particulares las regiones alveolares del pulmón. En realizaciones particulares, la administración pulmonar se produce mediante inhalación o administración a través de la nariz o la boca.
La geometría de las vías respiratorias es una barrera importante para la dispersión del agente activo dentro de los pulmones. Hay tres mecanismos básicos de deposición: impactación, sedimentación y movimiento browniano (Padfield. 1987. En: D. Ganderton & T. Jones eds. Drug Delivery to the Respiratory Tract, Ellis Harwood, Chicherster, Reino Unido). La impactación tiene lugar cuando las partículas no pueden permanecer dentro de la corriente de aire, particularmente en las ramificaciones de las vías respiratorias. Se adsorben sobre la capa mucosa que recubre las paredes bronquiales y se limpian por acción mucociliar. La impactación tiene lugar con mayor frecuencia con partículas de más de 5 |jm de diámetro. Las partículas más pequeñas (<5 |jm) permanecen dentro de la corriente de aire con mayor facilidad y pueden transportarse profundamente a los pulmones. La sedimentación a menudo se produce en el sistema respiratorio inferior donde el flujo de aire es más lento. Las partículas muy pequeñas (<0,6 jm ) pueden depositarse por el movimiento browniano. En realizaciones particulares, esta deposición es indeseable porque no está dirigida a lo alveolos (Worakul y Robinson 2002. En: Polymeric Biomaterials, 2a edición, S. Dumitriu ed. Marcel Dekker. Nueva York).
Las formulaciones pueden administrarse a diversas partes del tracto respiratorio en, por ejemplo, gotitas, formas de polvo seco, espumas, geles, nieblas, partículas, soluciones, pulverizaciones, suspensiones y/o vapores. En realizaciones particulares, las formulaciones se pueden aerosolizar.
Un aerosol se refiere a cualquier preparación de una fina niebla de partículas, típicamente de menos de 10 micrómetros de diámetro. En realizaciones particulares, el diámetro promedio para formulaciones acuosas de partículas de aerosol es, por ejemplo, entre 0,1 y 30 micrones, entre 0,5 y 20 micrones, entre 0,5 y 10 micrones o 5 micrones.
Los aerosoles para el suministro de agentes activos al tracto respiratorio se describen, por ejemplo, en Adjei y Garren, J. Pharm. Res. 7: 565 - 569 (1990); Zanen y Lamm, J. Int. J. Pharm., 114: 111 - 115 (1995); Gonda, Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 6: 273-313 (1990); y Moren, "Aerosol dosage forms and formulations”, en: Aerosols in Medicine, Principles, Diagnosis and Therapy, Moren, et al., Eds. Esevier, Amsterdam, 1985.
Los aerosoles se forman típicamente atomizando una solución o suspensión bajo presión a través de un nebulizador, un recipiente presurizado, un rociador continuo o mediante el uso de un inhalador dosificador ("MDI") o inhalador dosificador presurizado (pMDI).
Los nebulizadores crean una fina niebla a partir de una solución o suspensión, que es inhalada por un sujeto. Durante mucho tiempo, las soluciones salinas nebulizadas se administran de forma crónica a los pulmones con pequeñas cantidades de agentes activos, tales como beta agonistas, corticosteroides o antibióticos. A menudo, estas soluciones salinas son hipertónicas (concentraciones de cloruro de sodio superiores al 0,9 % en peso, a menudo tan altas como el 5 % en peso) y generalmente se administran durante hasta 20 minutos. La solución de inhalación VENTOLIN® (GSK) es una solución de sulfato de albuterol que se puede nebulizar para su administración en los pulmones. Se puede preparar una solución de VENTOLIN® para nebulización mezclando, por ejemplo, 1,25-2,5 mg de sulfato de albuterol en 0,25-0,5 ml de solución acuosa en solución salina normal estéril para lograr un volumen total de 3 ml. No se ha encontrado ningún efecto adverso asociado con el suministro a los pulmones por nebulización de VENTOLIN®. Los dispositivos de nebulización se describen, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos N° 5.709.202.
Los pMDI incluyen típicamente un recipiente presurizado que tiene una válvula dosificadora, en los que el recipiente se llena con una solución o suspensión y un propelente. En realizaciones particulares, la solución o suspensión actúa como propelente. En otras realizaciones, los propelentes pueden incluir propelentes de hidrofluoroalcano (HFA) (por ejemplo, HFA Proventil® (Schering-Plough Corporation) o FREON® (E.I. Du Pont De Nemours and Co. Corp.). Cuando se libera del recipiente, la formulación es una niebla fina, y el propelente y el disolvente pueden evaporarse total o parcialmente debido a la disminución de la presión.
Las formulaciones de polvo seco también se pueden utilizar. Las formulaciones de polvo seco (DPF) con partículas de gran tamaño tienen características de fluidez mejoradas, tales como menos agregación, aerosolización más fácil y potencialmente menos fagocitosis. Los aerosoles de polvo seco para inhalación se producen generalmente usando partículas con diámetros promedio principalmente en el intervalo de menos de 5 micrómetros, aunque en realizaciones particulares, el intervalo está entre uno y diez micrómetros de diámetro aerodinámico. Se han coadministrado partículas grandes "portadoras" (que no contienen agente activo) con aerosoles de polvo seco para ayudar a lograr una aerosolización eficiente, entre otros posibles beneficios. Las partículas con tiempos de degradación y liberación que varían de segundos a meses pueden diseñarse y fabricarse mediante procedimientos conocidos en la técnica.
En realizaciones particulares, se pueden utilizar "partículas aerodinámicamente ligeras" en formulaciones de polvo seco. Las "partículas aerodinámicamente ligeras" son partículas que tienen una densidad media o de compactación (“tap”) inferior a 0,4 g/cm3. La densidad de compactación es una medida estándar de la densidad de masa de la envoltura. La densidad de masa de la envoltura de una partícula isotrópica se define como la masa de la partícula dividida por el volumen mínimo de la envoltura de la esfera en la que puede encerrarse. Las características que contribuyen a la baja densidad de compactación incluyen una textura de superficie irregular y una estructura porosa. La densidad de compactación de las partículas de un polvo seco se puede obtener mediante la medición estándar de la densidad de compactación de la USP.
El diámetro medio actualmente preferido para partículas aerodinámicamente ligeras para la inhalación es de entre 3 y 30 micras de diámetro, o entre 5 y 7 micras. Las partículas aerodinámicamente ligeras se pueden fabricar con el material, la rugosidad de la superficie, el diámetro y la densidad de compactación apropiados para el suministro localizado a regiones seleccionadas del tracto respiratorio, tales como el pulmón profundo o las vías respiratorias superiores. Por ejemplo, se pueden usar partículas de mayor densidad o más grandes para la administración en las vías respiratorias superiores. De manera similar, se puede administrar una mezcla de partículas de diferentes tamaños, provistas con el mismo o diferente agente activo, para dirigirse a diferentes regiones del pulmón en una sola administración.
En realizaciones particulares, se pueden usar formulaciones conductoras para la administración al tracto respiratorio. Las formulaciones conductoras son particularmente útiles para suprimir la exhalación de partículas. La conductividad de la solución es un producto de la fuerza iónica, la concentración y la movilidad (las dos últimas contribuyen a la conductividad de la formulación en su conjunto). Puede usarse cualquier forma de componentes iónicos (aniónicos, catiónicos o bipolares). Estos materiales conductores pueden alterar las propiedades del revestimiento mucoso del tracto respiratorio actuando, por ejemplo, como un agente de reticulación dentro del moco. Los componentes iónicos en las formulaciones conductoras pueden interactuar con las glicoproteínas aniónicas fuertemente unidas dentro del moco traqueobronquial normal. Estas interacciones influyen en el estado de la superficie aire/líquido del fluido del revestimiento de las vías respiratorias y de forma transitoria en la naturaleza de los entrelazamientos físicos debido a interacciones covalenes y no covalentes, incluyendo enlaces de hidrógeno, interacciones hidrófobas y electroestáticas.
Las sustancias útiles para formar formulaciones conductoras son aquellas que se ionizan fácilmente en un entorno de disolvente acuoso u orgánico (también denominadas en el presente documento "agentes conductores"). Ejemplos de tales sustancias incluyen sales, tensioactivos iónicos, aminoácidos cargados, proteínas cargadas, u otros materiales cargados.
Las sales adecuadas incluyen cualquier forma de sal de sodio, potasio, magnesio, calcio, aluminio, silicio, escandio, titanio, vanadio, cromo, cobalto, níquel, cobre, manganeso, zinc, estaño y elementos similares. Los ejemplos incluyen cloruro de sodio, acetato de sodio, bicarbonato de sodio, carbonato de sodio, sulfato de sodio, estearato de sodio, ascorbato de sodio, benzoato de sodio, bifosfato de sodio, fosfato de sodio, bisulfito de sodio, citrato de sodio, borato de sodio, gluconato de sodio, cloruro de calcio, carbonato de calcio, acetato de calcio, fosfato de calcio, alginita de calcio, estearato de calcio, sorbato de calcio, sulfato de calcio, gluconato de calcio, carbonato de magnesio, sulfato de magnesio, estearato de magnesio, trisilicato de magnesio, bicarbonato de potasio, cloruro de potasio, citrato de potasio, borato de potasio, bisulfito de potasio, bifosfato de potasio, alginato de potasio, benzoato de potasio, cloruro de magnesio, sulfato cúprico, cloruro de cromo, cloruro estannoso y metasilicato de sodio.
Los tensioactivos iónicos adecuados incluyen dodecil sulfato de sodio (SDS) (también conocido como lauril sulfato sódico (SLS)), lauril sulfato de magnesio, polisorbato 20, polisorbato 80, y agentes tensioactivos similares.
Los aminoácidos cargados adecuados incluyen L-lisina. L-arginina, histidina, aspartato, glutamato, glicina, cisteína y tirosina.
Las proteínas cargadas adecuadas incluyen la calmodulina (CaM), la troponina C y fosfolípidos cargados. Los fosfolípidos cargados negativamente incluyen fosfatidilinositol, fosfatidilserina, fosfatidilglicerol, ácido fosfatídico, cardiolipinas, dialcanoil fosfatidil gliceroles (dipalmitoil fosfatidil glicerol y dimiristoil fosfatidil glicerol), fosfatidilinositol 4-fosfato (PIP), fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato (PIP2) y fosfatidiletanolaminas. Los fosfolípidos cargados positivamente incluyen dioleoil trimetilamonio propano, ésteres de ácidos fosfatídicos, ácido dipalmitoilfosfatídico y ácido diestearoilfosfatídico con aminoalcoholes, tales como hidroxietilendiamina.
En realizaciones particulares, las formulaciones conductoras pueden tener valores de conductividad de más de 5.000 pS/cm, más de 10000 pS/cm, o más de 20.000 pS/cm. En realizaciones particulares, las formulaciones conductoras pueden tener valores de conductividad dentro de intervalos de 4.000 - 50.000 pS/cm; 10.000 - 40.000 pS/cm; 30.000 - 60.000 pS/cm. En realizaciones particulares, las formulaciones conductoras tienen una conductividad específica que es mayor que la conductividad específica de la solución salina isotónica.
Las realizaciones particulares de formulaciones conductoras incluyen sales, tales como solución salina (NaCl 0,15 M o 0,9%), solución de CaCh, CaCh en solución salina o solución salina que contiene tensioactivos iónicos, tales como SDS o SLS. En realizaciones particulares, la formulación incluye solución salina y CaCh. Los intervalos de concentración adecuados de la sal u otros compuestos conductores/cargados pueden variar del 0,01 % al 20 %, del 0,1 % al 10 % o del 0,1 al 7% (peso del compuesto conductor o cargado/peso total de la formulación). En realizaciones particulares, la formulación contiene una solución salina hipertónica (es decir, una concentración de cloruro de sodio superior al 0,9 % en peso).
En realizaciones particulares, las formulaciones incluyen un agente mucoactivo o mucolítico, que es una sustancia que puede modificar la producción, la secreción, la composición y/o interacciones del moco con el epitelio. Los ejemplos de agentes mucoactivos o mucolíticos incluyen mucinas MUCSAC y MUC5B, ADN, N-acetilcisteína (NAC), cisteína, nacistelina, dornasa alfa, gelsolina, heparina, sulfato de heparina, agonistas de P2Y2 (por ejemplo, UTP, INS365) y nedocromil sódico.
El direccionamiento y activación de linfocitos B-1a (por ejemplo, linfocitos B-1a de la cavidad pleural) mediante la administración de formulaciones al tracto respiratorio puede tratar numerosas afecciones médicas con componentes inflamatorios o autoinmunitarios según se reivindica.
Las afecciones con componentes inflamatorios o autoinmunes descritas en este documento incluyen enfermedad alérgica de las vías respiratorias, enfermedad de Alpers, enfermedad de Alzheimer (EA), nefropatía amiloide, neuropatía amiloide, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), asma, enfermedad de Batten, cáncer, lesión por isquemiareperfusión cardíaca, enfermedad celíaca. enfermedad, síndrome cerebro-óculo-facio-esquelético, deterioro cognitivo y demencia asociados a la quimioterapia, hepatitis crónica, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), artritis inducida por colágeno, degeneración corticobasal, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, enfermedad de Crohn, demencia inducida por depresión, ataxia de Friedreich, demencia frontotemporal, enfermedad de Gerstmann-Straussler-Scheinker, glaucoma, enfermedad de Graves, deterioro cognitivo relacionado con el VIH, enfermedad de Huntington (EH), púrpura trombocitopenia inmune, enfermedad inflamatoria intestinal, resistencia a la insulina, lesión por isquemia/reperfusión, artritis juvenil, síndromes lacunares, enfermedad con cuerpos de Lewy, lupus, degeneración macular, deterioro cognitivo leve, amiotrofia monomélica, enfermedades de las neuronas motoras (EMN), esclerosis múltiple, atrofia de múltiples sistemas, atrofia de múltiples sistemas con hipotensión ortostática (síndrome de Shy-Drager), miastenia grave, neurodegeneración con acumulación de hierro en el cerebro, opsoclono mioclono, enfermedad de Parkinson (EP), demencia posencefalítica, trastorno por estrés postraumático, síndrome de atrofia cortical posterior, enfermedades priónicas, síndrome antifosfolípido primario, afasia primaria progresiva, síndrome de Sjogren primario, leucoencefalopatía multifocal progresiva, parálisis supranuclear progresiva, pseudodemencia, lesión por isquemia-reperfusión retiniana, retinitis pigmentosa, artritis reumatoide, lesión de la médula espinal, atrofia muscular espinal (AME), ataxia espinocerebelosa (SCA), accidente cerebrovascular, lupus eritematoso sistémico, lesión cerebral traumática, diabetes tipo 1, diabetes tipo 2, demencia vascular y síndrome de Wernicke-Korsakoff.
La isquemia, por ejemplo, es una restricción en el suministro de sangre que causa daño tisular en las áreas afectadas debido a un suministro insuficiente de oxígeno y glucosa para mantener el metabolismo celular. El flujo sanguíneo inadecuado puede ser causado por vasoconstricción, bloqueo de las arterias, presión arterial baja, shock séptico, anemia, insuficiencia cardíaca o trasplante de órganos. Dependiendo del tipo de tejido afectado, el daño irreversible puede tener lugar en 3-5 minutos (por ejemplo, en el cerebro o el corazón) o dentro de 10-20 minutos en órganos con menor intensidad aeróbica (por ejemplo, piel). La isquemia conduce a la acumulación de desechos metabólicos y pérdida de células, y los síntomas pueden incluir angina, inflamación, manchas o decoloración de la piel.
Después de la isquemia, se puede producir lesión por reperfusión cuando se reintroduce el flujo sanguíneo, donde el retorno de oxígeno puede conducir a la sobreproducción de radicales libres y especies reactivas de oxígeno (ROS), y causar un daño oxidativo a los tejidos, por ejemplo causado por la actividad de Nox2. La reperfusión puede provocar arritmia cardíaca, autodestrucción celular acelerada e inflamación exagerada del tejido ya inflamado debido a la isquemia, ya que los glóbulos blancos reaccionan de forma exagerada al daño tisular.
El asma es una enfermedad respiratoria en la que la inflamación bronquial desencadenada por una reacción alérgica o una infección con una bacteria o virus se vuelve crónica y de ese modo provoca un aumento de la hiperreactividad de las vías respiratorias y un estrechamiento reversible de las vías respiratorias, dando lugar a síntomas tales como ataques de sibilancias, tos, apnea, y opresión en el pecho. Estos síntomas son más comunes por la noche o temprano en la mañana. A medida que aumenta la capacidad de respuesta de las vías respiratorias, los síntomas se vuelven más graves y continuos, y aumenta la variación diaria de la función pulmonar.
La enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) es una enfermedad pulmonar crónica que conduce a dificultades para respirar. Puede ser bronquitis crónica (a largo plazo, una tos productiva) o enfisema (destrucción de los pulmo­ nes), o una combinación de ambos. Es más comúnmente causado por fumar, con otros factores de riesgo que incluyen la inhalación de gases o humos, la exposición al humo de segunda mano o altos niveles de contaminación. Los sínto­ mas incluyen tos, fatiga, infecciones respiratorias, dificultad para respirar y sibilancias.
El cáncer (neoplasia) se caracteriza por un crecimiento celular desregulado y una división celular. Ejemplos de cáncer con componentes inflamatorios incluyen neuroma acústico, adenocarcinoma, astrocitoma, cáncer de células basales, cáncer de conductos biliares, cáncer de vejiga, cáncer de cerebro, cáncer de mama, cáncer broncogénico, cáncer del sistema nervioso central, cáncer de cuello uterino, condrosarcoma, coriocarcinoma, leucemia linfocítica crónica, cáncer de colon, craneofarogioma, ependimoma, tumor de Ewing, fibrosarcoma, cáncer glandular, glioma, leucemia de células pilosas, hemangioblastoma, carcinoma hepatocelular, hepatoma, cáncer de riñón, leiomiosarcoma, cáncer de hígado, liposarcoma, cáncer de pulmón, melanoma, meduloblastoma, cáncer medular, menangioma, mesotelioma, mixosarcoma, neuroblastoma, linfoma no Hodgkin, oligodendroglioma, sarcoma osteogénico, cáncer de ovario, adenocarcinomas papilares, cáncer de tiroides papilar, cáncer de páncreas, cáncer papilar de feocromocitomas, cáncer pineal, leucemia prolinfocítica, cáncer de próstata, cáncer de células renales, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, sarcoma, cáncer de glándulas sebáceas, seminoma, cáncer de piel, cáncer de células escamosas, cáncer de glándulas sudoríparas, sinovioma, cáncer testicular y/o tumor de Wilms.
Los tratamientos efectivos contra el cáncer pueden disminuir el número de células cancerosas, disminuir el número de metástasis, disminuir el volumen del tumor, inducir la apoptosis de las células cancerosas, inducir la muerte de las células cancerosas, inducir la quimiosensibilidad o radiosensibilidad en las células cancerosas, inhibir la angiogénesis cerca de células cancerosas, inhiben la proliferación de células cancerosas y/o inhibir el crecimiento tumoral. Los tratamientos eficaces contra el cáncer también pueden aumentar la esperanza de vida, prolongar la vida de un sujeto, reducir el dolor asociado al cáncer y/o reducir la recaída o la reaparición del cáncer después del tratamiento. Los tratamientos eficaces contra el cáncer pueden prevenir, reducir o retrasar el número o la gravedad de los tumores metastásicos.
La artritis reumatoide es un síndrome crónico caracterizado por la inflamación generalmente simétrica de las articulaciones periféricas, que potencialmente da lugar a la destrucción progresiva de estructuras articulares y periarticulares, con o sin manifestaciones generalizadas. El inicio de la artritis reumatoide suele ser insidioso, con afectación articular progresiva, pero puede ser abrupto, con inflamación simultánea en múltiples articulaciones. La sensibilidad en casi todas las articulaciones inflamadas es el hallazgo físico más sensible. El engrosamiento sinovial, el hallazgo físico más específico, finalmente se produce en la mayoría de las articulaciones afectadas. Es típica la afectación simétrica de las pequeñas articulaciones de las manos (especialmente interfalángica proximal y metacarpofalángica), articulaciones de los pies (metatarsofalángicas), muñecas, codos y tobillos, pero las manifestaciones iniciales pueden aparecer en cualquier articulación.
La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad neurológica inflamatoria caracterizada por diversos síntomas y signos de disfunción del SNC, con remisiones y exacerbaciones recurrentes. Los síntomas de presentación más comunes son parestesia en una o más extremidades, en el tronco o en un lado de la cara; debilidad o torpeza de una pierna o mano; o alteraciones visuales, por ejemplo ceguera parcial y dolor en un ojo (neuritis óptica retrobulbar), visión borrosa 0 escotomas. Otros síntomas tempranos comunes son parálisis ocular que produce visión doble (diplopía), debilidad transitoria de una o más extremidades, rigidez leve o fatiga inusual de una extremidad, alteraciones leves de la marcha, dificultad con el control de la vejiga, vértigo y alteraciones emocionales leves; todos indican afectación dispersa del SNC y a menudo aparecen meses o años antes de que se reconozca la enfermedad.
La EM remitente recidivante (EM RR) se caracteriza clínicamente por recaídas y remisiones que se producen durante meses o años, con recuperación parcial o total de los déficits neurológicos entre ataques. Estos pacientes manifiestan 1 ataque o recaída por año. Durante 10 a 20 años, el 50 % de los pacientes con EM con RR desarrollan EM secundaria progresiva (EM SP) que se caracteriza por una recuperación incompleta entre los ataques y la acumulación de déficits neurológicos que dan lugar a una discapacidad creciente.
El diagnóstico de EM es indirecto, por deducción de características clínicas, radiográficas (placas cerebrales en escáner por resonancia magnética [RM]) y, en menor medida, de laboratorio (bandas oligoclonales en análisis de CSF).
La enfermedad de Huntington (EH) es una enfermedad genética neurodegenerativa e inflamatoria que afecta a la coordinación muscular y conduce al deterioro cognitivo y problemas psiquiátricos. Los síntomas clínicos de la EH incluyen movimientos anormales y/o inusuales, ansiedad, alteraciones del comportamiento, corea, deterioro cognitivo, confusión, dificultad para tragar, desorientación, inquietud, alucinaciones, giro de la cabeza para cambiar la posición de los ojos, muecas involuntarias, movimientos espasmódicos de brazos, piernas, cara y otras partes del cuerpo, irritabilidad, falta de coordinación, cambios de personalidad, pérdida de memoria, mal humor, paranoia, psicosis, inquietud, rigidez, pequeños movimientos involuntarios iniciados o incompletos, movimientos lentos, cambios en el habla, alteración del habla, pensamientos suicidas e intentos de suicidio, temblores y pérdida de peso.
La enfermedad de Parkinson (EP) es un trastorno degenerativo e inflamatorio del sistema nervioso central. Cuatro síntomas motores se consideran característicos de la EP: temblor, rigidez, lentitud de movimiento e inestabilidad postural. Más adelante en la progresión de la enfermedad, pueden surgir problemas de pensamiento y comportamiento que pueden variar de leves a graves, y la demencia aparece comúnmente en las etapas avanzadas de la enfermedad. La depresión es el síntoma psiquiátrico más común. Otros síntomas comunes incluyen trastornos del habla, cognición, estado de ánimo, comportamiento y pensamiento. Las alteraciones cognitivas incluyen además disfunción ejecutiva, que pueden incluir problemas con la planificación, flexibilidad cognitiva, pensamiento abstracto, adquisición de reglas, iniciar acciones apropiadas e inhibir acciones inapropiadas, seleccionar información sensorial relevante, fluctuaciones en la atención, ralentización de la velocidad cognitiva y pérdida de memoria. Otros síntomas incluyen alteraciones del sueño.
La esclerosis lateral amiotrófica (ELA) es una enfermedad de las motoneuronas mortal que afecta tanto a las motoneuronas de primer orden como de segundo orden. Los primeros síntomas clínicos de la ELA son típicamente debilidad y/o atrofia muscular. Otros síntomas tempranos incluyen dificultad para tragar (disfagia), calambres o rigidez de los músculos afectados; debilidad muscular que afecta un brazo o una pierna; y/o dificultad para hablar o dificultad para pronunciar palabras (disartria) y, en algunos casos, demencia. Se observan contracciones de los músculos que se pueden ver debajo de la piel (fasciculaciones) y un reflejo anormal comúnmente llamado signo de Babinski indica daño de las neuronas motoras superiores.
La tasa de progresión de la ELA se puede medir usando una medida de resultado llamada "ALS Functional Rating Scale Revised (ALSFRS-R)", un instrumento de 12 puntos que se administra como una entrevista clínica o un cuestionario informado por el paciente que produce una puntuación entre 48 (función normal) y 0 (discapacidad grave). Un estudio basado en una encuesta entre médicos mostró que calificaron un cambio del 20% en la pendiente del a Ls FRS-R clínicamente significativo (Castrillo-Viguera, et al., Amyotroph Lateral Scler, 11 (1-2): 178-80 (2010)).
La lesión cerebral traumática (LCT) aparece cuando una fuerza mecánica externa, generalmente un traumatismo craneal, causa una disfunción cerebral. La LCT puede tener efectos físicos y psicológicos de gran alcance. Algunos síntomas aparecen inmediatamente, mientras que otros pueden no aparecer hasta días o semanas después del evento traumático. Los síntomas de TBI incluyen pérdida del conocimiento; un estado de aturdimiento, confusión o desorientación; problemas de memoria o concentración; dolor de cabeza, mareos o pérdida del equilibrio; náuseas o vómitos; problemas sensoriales, tales como visión borrosa, zumbido en los oídos o mal sabor de boca; sensibilidad a la luz o al sonido; cambios de humor o variaciones de humor; sentirse deprimido o ansioso; fatiga o somnolencia; dificultad para dormir; dormir más de lo habitual, agitación, combatividad u otro comportamiento inusual; habla arrastrada; incapacidad para despertar del sueño; debilidad o entumecimiento en los dedos de las manos y los pies; pérdida de coordinación; convulsiones o ataques, dilatación de una o ambas pupilas de los ojos; y/o fluidos claros que salen de la nariz o los oídos. En los niños, los síntomas adicionales incluyen cambios en los hábitos alimenticios o de lactancia; llanto persistente e incapacidad de ser consolado; irritabilidad inusual o fácil; cambio en la capacidad de prestar atención; cambio en los hábitos de sueño; estado de ánimo triste o deprimido; y/o pérdida de interés en juguetes o actividades favoritas.
Los tratamientos efectivos contra las afecciones con un componente inflamatorio o autoinmune descritos en este documento pueden identificarse observando una mejora estadísticamente significativa en un síntoma asociado con la afección en un entorno clínico y/o de investigación. Para las afecciones en las que no se describen síntomas particulares en este documento, se puede utilizar cualquier modelo clínicamente relevante de la afección conocido y aceptado por médicos e investigadores en el campo relevante para evaluar la efectividad de un tratamiento.
En realizaciones particulares, las afecciones inflamatorias o autoinmunes con un componente del sistema nervioso central pueden evaluarse usando pruebas de deterioro cognitivo y/o morbilidades neuropsiquiátricas, tales como trastornos de la función cognitiva, memoria, estado de ánimo, comportamiento, pensamiento, trastorno de la conducta del sueño REM, apatía, fatiga, indiferencia y falta de compromiso sociale insulsez. Los procedimientos para medir y monitorear estos aspectos son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, pruebas de posición en serie que se centran en los procesos de la memoria humana (Surprenant, Perception and Psychophysics, 63 (4): 737-745 (2001)), pruebas de superioridad de palabras. que se centran en el habla y el lenguaje humanos (Krueger, Memory & Cognition, 20 (6): 685-694 (1992)), la prueba de Brown-Peterson que se centra en la memoria humana a corto plazo (Nairne, et al., Quarterly Journal of Psicología experimental A: Human Experimental Psychology, 52: 241-251 (1999)), pruebas de capacidad de memoria (May, et al., Memory & Cognition, 27 (5): 759-767 (1999)), pruebas de búsqueda visual (Wolfe, et al. , Journal of Experimental Psychology: Human Perception and Performance, 15 (3): 419-433 (1989)), y pruebas de representación del conocimiento (por ejemplo, red semántica). Las pruebas adicionales examinan la velocidad de procesamiento, el tiempo de reacción, es decir, la velocidad del reloj; flexibilidad y capacidad para adaptarse a los cambios en las reglas de las tareas; atención, enfoque y concentración; resolución de problemas; memoria; y fluidez verbal. Las pruebas e instrumentos representativos incluyen pruebas de CI tradicionales como WAIS y Progressive Ravens Matrices, y la batería de pruebas disponibles a través de Luminosity (Lumos Labs, Inc.).
Las afecciones médicas con componentes inflamatorios o autoinmunes pueden ser tratadas mediante direccionamiento y activación de linfocitos B-1a, tal como se reivindica.
En realizaciones particulares, el direccionamiento y la activación de los linfocitos B-1a se evidencia por un aumento de la expresión de IL-10 por los linfocitos B-1a. IL-10 es una citocina antiinflamatoria que puede inhibir la producción de citocinas proinflamatorias.
En realizaciones particulares, el direccionamiento y activación de linfocitos B-1a conduce a la supresión de citocinas proinflamatorias. Los ejemplos de citocinas proinflamatorias incluyen IL-6, TNF-a, IL-2 e IFN-y. La supresión de citocinas proinflamatorias puede significar una reducción estadísticamente significativa en la expresión de una o más citocinas proinflamatorias.
En realizaciones particulares, el direccionamiento y la activación de los linfocitos B-1a se ponen de manifiesto por la migración de los linfocitos B-1a a los ganglios linfáticos. En realizaciones particulares, el direccionamiento y la activación de los linfocitos B-1a se evidencia por un aumento en la expresión de IL-10 y la migración de los linfocitos B-1a a los ganglios linfáticos. En realizaciones particulares, el direccionamiento y la activación de linfocitos B-1a pueden evidenciarse mediante una producción disminuida de citocinas proinflamatorias. En realizaciones particulares, el direccionamiento y la activación de linfocitos B-1a se evidencia por una reducción estadísticamente significativa en un síntoma asociado con una afección médica.
Los linfocitos B-1a se dirigen y activan usando fibrillas o péptidos formadores de fibrillas, tal como se reivindica. En realizaciones particulares, una fibrilla se refiere a una agregación de proteínas o péptidos en una formación fibrosa, por lo que muchas copias de las proteínas o péptidos se unen entre sí para formar fibras insolubles. En realizaciones particulares, un péptido formador de fibrillas puede denominarse amiloidogénico. Los ejemplos de proteínas y/o péptidos que forman fibrillas de forma natural incluyen beta amiloide, tau y amilina.
En este documento se describen fibrillas o péptidos formadores de fibrillas que incluyen péptidos beta amiloides (Ap). Los péptidos Ap incluyen las secuencias expuestas en SEQ ID NO: 1063 y SEQ ID NO: 1064 (Figura 8) y fragmentos y derivados de las mismas. Ap es el componente principal de las placas amiloides. Ap se forma después de la escisión secuencial de la proteína precursora amiloide (APP), una glicoproteína transmembrana de función indeterminada. La APP puede ser procesada por a-, p- y y-secretasas; la proteína Ap se genera por la acción sucesiva de las secretasas p y y. La y secretasa, que produce el extremo C-terminal del péptido Ap, se escinde dentro de la región transmembrana de APP y puede generar varias isoformas de 36-43 residuos de aminoácidos de longitud. Las isoformas más comunes son Ap 1-40 y Ap 1-42 ("Ap40" y "Ap42"); la forma más corta se produce típicamente por escisión que se produce en el retículo endoplásmico, mientras que la forma más larga se produce por escisión en la red trans-Golgi. La Ap40 es la más común de las dos, pero la Ap42 es más fibrilogénica.
Tal como se describe en el presente documento, las fibrillas o los péptidos formadores de fibrillas pueden ser fragmentos activos de Ap. Los fragmentos activos del péptido Ap comparten una propiedad funcional o de unión con el péptido Ap de longitud completa. En realizaciones particulares, un fragmento activo de Ap puede ser cualquier fragmento del Ap de longitud completa que pueda autopolimerizarse para formar fibrillas o agregados. Un fragmento activo de Ap puede tener cualquier longitud de 5 a 43 aminoácidos de longitud. Los fragmentos epitópicos de péptidos Ap son fragmentos que retienen la capacidad de unirse a uno o más anticuerpos monoclonales anti-Ap. Ap está intrínsecamente desestructurado, lo que significa que en solución no adquiere un pliegue terciario compacto, sino que puebla un conjunto de estructuras. Mediante simulaciones guiadas por RMN, Ap40 y Ap42 también parecen presentar estados conformacionales muy diferentes, siendo el extremo C-terminal de Ap42 más estructurado que Ap40.
La amilina es una hormona peptídica que se secreta con insulina desde el páncreas. Las fibrillas o péptidos formadores de fibrillas son los residuos 28-33 de la proteína amilina, conocida como amilina 28-33 (SEQ ID NO: 1053). Los análogos amiloidogénicos de la amilina 28-33 se describen en el presente documento. Los análogos amiloidogénicos de amilina 28-33 pueden incluir las SEQ ID NO: 1062 y SEQ ID NO: 449 (Kurnellas, et al. (2014) JEM 211 (9): 1847).
En realizaciones particulares, la formación de fibrillas o agregación de un péptido o proteína se puede medir usando técnicas que incluyen el ensayo de tioflavina T, dispersión dinámica de luz, y la cromatografía de exclusión por tamaño. El ensayo de tioflavina T puede usarse para medir la formación de fibrillas tratando una muestra de proteína/péptido con tioflavina T y a continuación medir la fluorescencia por microscopía o espectroscopía.
En realizaciones particulares, las fibrillas se refieren a un agregado fibroso de cuatro o más moléculas de péptidos unidos a través de enlaces no covalentes. En realizaciones particulares, los agregados incluyen cien o más, mil o más, cinco mil o más, o diez mil o más moléculas de péptidos. En realizaciones particulares, un péptido formador de fibrillas o amiloidogénico es un péptido que, de forma espontánea o tras la exposición a determinadas condiciones, tales como temperatura o salinidad, se oligomeriza mediante interacciones no covalentes para formar fibrillas.
En realizaciones particulares, los péptidos formadores de fibrillas incluyen hexapéptidos con aminoácidos de configuración L, configuración D o una mezcla de configuraciones. En realizaciones particulares, los péptidos formadores de fibrillas son péptidos que generan una energía de unión Rosetta de -23 kcal/mol o menos (es decir, más negativa). Rosetta es un paquete de software que se utiliza para el modelado computacional de proteínas y péptidos. El valor de corte de -23 kcal/mol para el potencial de formación de fibrillas se basa en un modelo validado experimentalmente (ver Goldschmidt et al (2010) PNAS 107 (5): 3487-3492, para métodos de cálculo de energía de Rosetta para los hexapéptidos).
Los péptidos que incluyen 1, 2, o 3 aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas polares se describen en el presente documento.
Las cadenas laterales básicas polares pueden tener un amino terminal o un grupo imidazol terminal. En otros casos, los péptidos incluyen 1 cadena lateral ácida polar. En otros casos, los péptidos incluyen 0, 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos que tienen cadenas laterales hidrófobas. En otros casos, los péptidos incluyen 0, 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos que tienen cadenas laterales polares sin carga, en los que el péptido tiene una carga positiva.
El término carboxi de los péptidos descritos en el presente documento es típicamente un ácido carboxílico (es decir, -COOH) o una amida (es decir, -C(O)NR2 , donde R es un sustituyente, tal como alquilo o hidrógeno) . El término amino de los péptidos descritos en este documento es típicamente una amina (es decir, N(R')2 , donde R' es un sustituyente, tal como alquilo o hidrógeno) o un grupo acetato (es decir, -C(O)R", donde R" es un sustituyente, tal como metilo, etilo o alquilo más largo).
Los péptidos formadores de fibrillas descritos en el presente documento pueden incluir uno o más de los siguientes hexapéptidos, donde cada aminoácido indicado es un L-aminoácido o un D-aminoácido (símbolo del hexapéptido indicado como su SEQ ID NO: identificador entre paréntesis después del hexámero): SVNVDL (SEQ ID NO: 1); SLNVDV (SEQ ID NO: 2); SVDVNL (SEQ ID NO: 3); DLSVVL (SEQ ID NO: 4); SVNLDV (SEQ ID NO: 5); SVVNDV (SEQ ID NO: 6); DVSLVN (SEQ ID NO: 7); DVSVLN (SEQ ID NO: 8); SDLVNV (SEQ ID NO: 9); SLNVVS (SEQ ID NO: 10); LNVDSV (SEQ ID NO: 11); NDLSVV (SEQ ID NO: 12); VDNLVS (SEQ ID NO: 13); VNDVSL (SEQ ID NO: 14); VSDNVL (SEQ ID NO: 15); LNDVVS (SEQ ID NO: 16); LSVDVN (SEQ ID NO: 17); NSVDLV (SEQ ID NO: 18); VDVLNS (SEQ ID NO: 19); VNDSVL (SEQ ID NO: 20); VNVSLD (SEQ ID NO: 21); LDVNSV (SEQ ID NO: 22); LNVVDS (SEQ ID NO: 23); LSDVVN (SEQ ID NO: 24); LVVNDS (SEQ ID NO: 25); NSLDVV (SEQ ID NO: 26); VLVDNS (SEQ ID NO: 27); VNLSDV (SEQ ID NO: 28); VNVDLS (SEQ ID NO: 29); DNVSVD (SEQ ID NO: 30); LSDNVV (SEQ ID NO: 31); LSVVDN (SEQ ID NO: 32); VLDVSN (SEQ ID NO: 33); VNDLVS (SEQ ID NO: 34); VNVSDL (SEQ ID NO: 35); VVLSDN (SEQ ID NO: 36); LVSVNL (SEQ ID NO: 37); LVNVSV (SEQ ID NO: 38); SLNVSV (SEQ ID NO: 39); LVSVNS (SEQ ID NO: 40); SVDVNV (SEQ ID NO: 41); LVVSVL (SEQ ID NO: 42); VNLVVS (SEQ ID NO: 43); SNLVSV (SEQ ID NO: 44); SVNVLS (SEQ ID NO: 45); VLVSVL (SEQ ID NO: 46); LVNVSL (SEQ ID NO: 47); SVNVDS (SEQ ID NO: 48); VLSVNV (SEQ ID NO: 49); NLVVSV (SEQ ID NO: 50); SVVLNV (SEQ ID NO: 51); LSVVNL (SEQ ID NO: 52); SNLVVS (SEQ ID NO: 53); SVVLDV (SEQ ID NO: 54); LVSLNV (SEQ ID NO: 55); VSLNVV (SEQ ID NO: 56); VKVQIY (SEQ ID NO: 57); QVVIYK (SEQ ID NO: 58); KVIQVY (SEQ ID NO: 59); VYVKIY (SEQ ID NO: 60); QIVVYK (SEQ ID NO: 61); QVIKVY (SEQ ID NO: 62); VQVKIY (SEQ ID NO: 63); QVVKIY (SEQ ID NO: 64); QVIVYK (SEQ ID NO: 65); QIVKVY (SEQ ID NO: 66); QKIVVY (SEQ ID NO: 67); QKVVYI (SEQ ID NO: 68); KVQVYI (SEQ ID NO: 69); QVVKYI (SEQ ID NO: 70); KVQIYV (SEQ ID NO: 71); VKIQVY (SEQ ID NO: 72); VIQKVY (SEQ ID NO: 73); KVVIYK (SEQ ID NO: 74); QIVKYV (SEQ ID NO: 75); QKVIYV (SEQ ID NO: 76); KQVVIY (SEQ ID NO: 77); KIQVYV (SEQ ID NO: 78); KVYVQI (SEQ ID NO: 79); VVQIYK (SEQ ID NO: 80); KQVIVY (SEQ ID NO: 81); VQIKVY (SEQ ID NO: 82); QKIVYV (SEQ ID NO: 83); VIQVYK (SEQ ID NO: 84); KVVIQY (SEQ ID NO: 85); KVQVIY (SEQ ID NO: 86); QYVVIK (SEQ ID NO: 87); YVVIQK (SEQ ID NO: 88); KIVVQY (SEQ ID NO: 89); YQVIVK (SEQ ID NO: 90); KIYVQV (SEQ ID NO: 91); KVVIYQ (SEQ ID NO: 92); KYVVQI (SEQ ID NO: 93); YQIVVK (SEQ ID NO: 94); YVVIQY (SEQ ID NO: 95); KQVIYV (SEQ ID NO: 96); KYVQVI (SEQ ID NO: 97); KYVVIQ (SEQ ID NO: 98); QKVVIY (SEQ ID NO: 99); QYVIVK (SEQ ID NO: 100); IVQKVY (SEQ ID NO: 101); KYIVVQ (SEQ ID NO: 102); QVIKYV (SEQ ID NO: 103); YIVVQK (SEQ ID NO: 104); YQVVIK (SEQ ID NO: 105); IKVQVY (SEQ ID NO: 106); KVVQYI (SEQ ID NO: 107); KYVQIV (SEQ ID NO: 108); VKQVYI (SEQ ID NO: 109); VQVIYK (SEQ ID NO: 110); VVIQKY (SEQ ID NO: 111); IQVVYK (SEQ ID NO: 112); KIVVYQ (SEQ ID NO: 113); KYQVIV (SEQ ID NO: 114); KYVIVQ (SEQ ID NO: 115); VVYIQK (SEQ ID NO: 116); IVQVYK (SEQ ID NO: 117); KQIVYV (SEQ ID NO: 118); KYVIQV (SEQ ID NO: 119); QKVIVY (SEQ ID NO: 120); QYIKVV (SEQ ID NO: 121); QYIVKV (SEQ ID NO: 122); VQIVYK (SEQ ID NO: 123); VVQKYI (SEQ ID NO: 124); VYQIVK (SEQ ID NO: 125); YVQVIK (SEQ ID NO: 126); QIVYVK (SEQ ID NO: 127); IKVYQV (SEQ ID NO: 128); KVVYIQ (SEQ ID NO: 129); VQKYIV (SEQ ID NO: 130); VQKYVI (SEQ ID NO: 131); KVVQIY (SEQ ID NO: 132); YVIKIY (SEQ ID NO: 133); QVIVYV (SEQ ID NO: 134); VVIKVY (SEQ ID NO: 135); KVVIYI (SEQ ID NO: 136); VYVVIK (SEQ ID NO: 137); YIVQVY (SEQ ID NO: 138); YVIQVY (SEQ ID NO: 139); YVIVVY (SEQ ID NO: 140); KVIVYI (SEQ ID NO: 141); YVIKVY (SEQ ID NO: 142); VQVIVK (SEQ ID NO: 143); YVVKIY (SEQ ID NO: 144); YVVQVI (SEQ ID NO: 145); QIVVYQ (SEQ ID NO: 146); VVQIVK (SEQ ID NO: 147); VQIVVK (SEQ ID NO: 148); VIVVYK (SEQ ID NO: 149); IVQVYI (SEQ ID NO: 150); YVVIQV (SEQ ID NO: 151); VYQVVI (SEQ ID NO: 152); KYIQVY (SEQ ID NO: 153); KYVVIY (SEQ ID NO: 154); KYVQIY (SEQ ID NO: 155); VVQVIK (SEQ ID NO: 156); QKIVVK (SEQ ID NO: 157); KYVIVY (SEQ ID NO: 158); KQVVIK (SEQ ID NO: 159); YVQIYV (SEQ ID NO: 160); YKVQVY (SEQ ID NO: 161); IKVQIY (SEQ ID NO: 162); KIVVQK (SEQ ID NO: 163); VIKVVI (SEQ ID NO: 164); VYIKVV (SEQ ID NO: 165); VYIVQV (SEQ ID NO: 166); IVYVQI (SEQ ID NO: 167); KVQIYK (SEQ ID NO: 168); IYVIVY (SEQ ID NO: 169); VIYVIV (SEQ ID NO: 170); KYQVYI (SEQ ID NO: 171); VIQKVV (SEQ ID NO: 172); VKIVYV (SEQ ID NO: 173); VKQIVV (SEQ ID NO: 174); YIVKQY (SEQ ID NO: 175); YIVVQY (SEQ ID NO: 176); YKIQVY (SEQ ID NO: 177); YQVVIY (SEQ ID NO: 178); YVVKQY (SEQ ID NO: 179); VIVKVQ (SEQ ID NO: 180); QKVVIK (SEQ ID NO: 181); GMVVVG (SEQ ID NO: 182); GVVVMG (SEQ ID NO: 183); GVVMVG (SEQ ID NO: 184); GGVVVM (SEQ ID NO: 185); GVVGVM (SEQ ID NO: 186); GVVVGM (SEQ ID NO: 187); GVMVVG (SEQ ID NO: 188); GGVVMV (SEQ ID NO: 189); GGVMVV (SEQ ID NO: 190); GMVVGV (SEQ ID NO: 191); GVVMGV (SEQ ID NO: 192); GMVGVV (SEQ ID NO: 193); GVMVGV (SEQ ID NO: 194); GVVGMV (SEQ ID NO: 195); GGMVVV (SEQ ID NO: 196); GVGVMV (SEQ ID NO: 197); GVGVVM (SEQ ID NO: 198); MVVVGM (SEQ ID NO: 199); GMGVVV (SEQ ID NO: 200); MVVVGG (SEQ ID NO: 201); GVGMVV (SEQ ID NO: 202); GVVGGV (SEQ ID NO: 203); MVGVVG (SEQ ID NO: 204); VVMVGG (SEQ ID NO: 205); MGVVVG (SEQ ID NO: 206); MVGVGV (SEQ ID NO: 207); VGVMVG (SEQ ID NO: 208); MVVGVG (SEQ ID NO: 209); VVGVMG (SEQ ID NO: 210); VMGVVG (SEQ ID NO: 211); VGVGVM (SEQ ID NO: 212); VMVGVG (SEQ ID NO: 213); MGGVVV (SEQ ID NO: 214); VGMVVG (SEQ ID NO: 215); VVGVGM (SEQ ID NO: 216); VGGVVM (SEQ ID NO: 217); VVGMVG (SEQ ID NO: 218); VGVVMG (SEQ ID NO: 219); MVGGVV (SEQ ID NO: 220); VGMVGV (SEQ ID NO: 221); VMVVGG (SEQ ID NO: 222); VVGGVM (SEQ ID NO: 223); VGGVMV (SEQ ID NO: 224); VVVGMG (SEQ ID NO: 225); VVGMGV (SEQ ID NO: 226); MGVGVV (SEQ ID NO: 227); VGVVGM (SEQ ID NO: 228); VGGMVV (SEQ ID NO: 229); VVVMGG (SEQ ID NO: 230); VVMGGV (SEQ ID NO: 231); VVVGGM (SEQ ID NO: 232); VVGGMV (SEQ ID NO: 233); VGMGVV (SEQ ID NO: 234); VMGGVV (SEQ ID NO: 235); VGGVGV (SEQ ID NO: 236); VGVMGV (SEQ ID NO: 237); VGVGMV (SEQ ID NO: 238); y VMVGGV (SEQ ID NO: 239); ANSTSV (SEQ ID NO: 240); ANSVSG (SEQ ID NO: 241); ANSVSS (SEQ ID NO: 242); AQNSNV (SEQ ID NO: 243); AQNVNS (SEQ ID NO: 244); AQNVTS (SEQ ID NO: 245); AQSQSV (SEQ ID NO: 246); AQSSSV (SEQ ID NO: 247); AQSTSV (SEQ ID NO: 248); AQSVNS (SEQ ID NO: 249); AQSVQS (SEQ ID NO: 250); AQSVSQ (SEQ ID NO: 251); AQSVSS (SEQ ID NO: 252); AQSVST (SEQ ID NO: 253); ASNNNV (SEQ ID NO: 254); ASNQNQ (SEQ ID NO: 255); ASNQNV (SEQ ID NO: 256); ASNQTQ (SEQ ID NO: 257); ASNSNV (SEQ ID NO: 258); ASNSTV (SEQ ID NO: 259); ASNTNS (SEQ ID NO: 260); ASNTNV (SEQ ID NO: 261); ASNTSV (SEQ ID NO: 262); ASNVNG (SEQ ID NO: 263); ASNVNQ (SEQ ID NO: 264); ASNVNS (SEQ ID NO: 265); ASNVNT (SEQ ID NO: 266); ASNVTG (SEQ ID NO: 267); ASNVTT (SEQ ID NO: 268); ASSNSV (SEQ ID NO: 269); ASSVSG (SEQ ID NO: 270); ASSVSN (SEQ ID NO: 271); ATNVNS (SEQ ID NO: 272); ATNVTS (SEQ ID NO: 273); ATSQSQ (SEQ ID NO: 274); ATSQSV (SEQ ID NO: 275); ATSTSG (SEQ ID NO: 276); ATSTSV (SEQ ID NO: 277); ATSVSG (SEQ ID NO: 278); ATSVSS (SEQ ID NO: 279); AVNQNS (SEQ ID NO: 280); AVNQSQ (SEQ ID NO: 281); AVNSNG (SEQ ID NO: 282); AVNSNS (SEQ ID NO: 283); AVNSNT (SEQ ID NO: 284); AVNTNS (SEQ ID NO: 285); AVSNSG (SEQ ID NO: 286); AVSNSS (SEQ ID NO: 287); AVSQNQ (SEQ ID NO: 288); AVSQSG (SEQ ID NO: 289); AVSQSQ (SEQ ID NO: 290); AVSQTQ (SEQ ID NO: 291); AVSSNQ (SEQ ID NO: 292); AVSSNS (SEQ ID NO: 293); AVSSSQ (SEQ ID NO: 294); AVSTSG (SEQ ID NO: 295); GANTVS (SEQ ID NO: 296); GAQTSS (SEQ ID NO: 297); GASNQS (SEQ ID NO: 298); GASQQS (SEQ ID NO: 299); GASSQQ (SEQ ID NO: 300) GGQVTS (SEQ ID NO: 301); GGSNQV (SEQ ID NO: 302); GNNVQS (SEQ ID NO: 303); GNQVTS (SEQ ID NO: 304); GNSNQV (SEQ ID NO: 305); GNSQQQ (SEQ ID NO: 306); GNSQQS (SEQ ID NO: 307); GNSQQV (SEQ ID NO: 308); GNSSTV (SEQ ID NO: 309); GNSTQS (SEQ ID NO: 310); GNSTQV (SEQ ID NO: 311); GNSTVS (SEQ ID NO: 312); GNSVQS (SEQ ID NO: 313); GNSVSS (SEQ ID NO: 314); GNSVST (SEQ ID NO: 315); 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GSSSQQ (SEQ ID NO: 396); GSSSQS (SEQ ID NO: 397); GSSSQV (SEQ ID NO: 398); GSSTQA (SEQ ID NO: 399); GSSTQG (SEQ ID NO: 400); GSSTQT (SEQ ID NO: 401); GSSTQV (SEQ ID NO: 402); GSSTSV (SEQ ID NO: 403); GSSTVN (SEQ ID NO: 404); GSSVNS (SEQ ID NO: 405); GSSVQN (SEQ ID NO: 406); GSSVQT (SEQ ID NO: 407); GSSVSG (SEQ ID NO: 408); GSSVSS (SEQ ID NO: 409); GSSVST (SEQ ID NO: 410); GSSVTN (SEQ ID NO: 411); GTNSSV (SEQ ID NO: 412); GTNSVS (SEQ ID NO: 413); GTNTVS (SEQ ID NO: 414); GTNVQS (SEQ ID NO: 415); GTNVSS (SEQ ID NO: 416); GTNVTS (SEQ ID NO: 417); GTQQSQ (SEQ ID NO: 418); GTQSTS (SEQ ID NO: 419); GTQSTV (SEQ ID NO: 420); GTQTSA (SEQ ID NO: 421); GTQTSV (SEQ ID NO: 422); GTQVQS (SEQ ID NO: 423); GTQVSG (SEQ ID NO: 424); GTQVSN (SEQ ID NO: 425); GTQVSS (SEQ ID NO: 426); GTQVST (SEQ ID NO: 427); GTSAQS (SEQ ID NO: 428); GTSGQV (SEQ ID NO: 429); GTSNQA (SEQ ID NO: 430); GTSNQS (SEQ ID NO: 431); GTSNQT (SEQ ID NO: 432); GTSNQV (SEQ ID NO: 433); GTSNSV (SEQ ID NO: 434); GTSNVS (SEQ ID NO: 435); 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TVSSSQ (SEQ ID NO: 1035); TVSTSG (SEQ ID NO: 1036); TVSTSN (SEQ ID NO: 1037); TVSTSS (SEQ ID NO: 1038); TVSTST (SEQ ID NO: 1039); VGSTNS (SEQ ID NO: 1040); VNSTSG (SEQ ID NO: 1041); VNSTSN (SEQ ID NO: 1042); VSSQSQ (SEQ ID NO: 1043); VSSQVQ (SEQ ID NO: 1044); VSSTNG (SEQ ID NO: 1045); VTSNSG (SEQ ID NO: 1046); VTSQSQ (SEQ ID NO: 1047), SVNDLV (SEQ ID NO: 1059); LKVKVL (SEQ ID NO: 1060), NKGAII (SEQ ID NO: 1061) y NVSTSG (SEQ ID NO: 1062).
Los péptidos que se describen en el presente documento incluyen uno o más de los siguientes hexapéptidos, donde cada aminoácido indicado es un L-aminoácido o un D-aminoácido: SVNLDV (SEQ ID NO: 5); VEAlYl (SEQ ID NO: 1048); LYQLEN (SEQ ID NO: 1049); VQIVYK (SEQ ID NO: 123); GYVIIK (SEQ ID NO: 1050); SNQNNF (SEQ ID NO: 1051); SSQVTQ (SEQ ID NO: 791); SVLTSL (SEQ ID NO: 1052); SVSSSY (SEQ ID NO: 1054); GAILSS (SEQ ID NO: 1055); GAIIGL (SEQ ID NO: 1056); AIIGLM (SEQ ID NO: 1057); MVGGVV (SEQ ID NO: 220); GGVVIA (SEQ ID NO: 1058).
En el presente documento se describen variantes de péptidos en los que la variante continúa contribuyendo a la formación de fibrillas. Las "variantes" incluyen secuencias de proteínas que tienen una o más adiciones, deleciones, posiciones de parada o sustituciones de aminoácidos, en comparación con una secuencia de proteínas descrita en otra parte del presente documento.
Una sustitución de aminoácidos puede ser una sustitución conservativa o no conservativa. Las variantes de la secuencia de proteínas descritas en el presente documento pueden incluir aquellas que tienen una o más sustituciones de aminoácidos conservativas. Una "sustitución conservativa" o "sustitución conservativa de aminoácidos" implica una sustitución que se encuentra en uno de los siguientes grupos de sustituciones conservativas: Grupo 1: Alanina (Ala; A), Glicina (Gly; G), Serina (Ser; S), Treonina (Thr; T); Grupo 2: ácido aspártico (Asp; D), ácido glutámico (Glu; E); Grupo 3: Asparagina (Asn; N), Glutamina (Gin; Q); Grupo 4: Arginina (Arg; R), Lisina (Lys; K), Histidina (His; H); Grupo 5: isoleucina (Ile; I), leucina (Leu; L), metionina (Met; M), valina (Val; V); y Grupo 6: Fenilalanina (Phe; F), Tirosina (Tyr; Y), Triptófano (Trp; W).
Además, los aminoácidos se pueden agrupar en grupos de sustitución conservativa de función, estructura química o composición similar (por ejemplo, ácidos, básicos, alifáticos, aromáticos o que contienen azufre). Por ejemplo, una agrupación alifática puede incluir, con fines de sustitución, G, A, V, L e I. Otros grupos que incluyen aminoácidos que se consideran sustituciones conservativas entre sí que incluyen: que contienen azufre: M y C; ácidos: D, E, N y Q; pequeños residuos alifáticos, apolares o ligeramente polares: A, S, T, P y G; residuos polares cargados negativamente y sus amidas: D, N, E y Q; residuos polares cargados positivamente: H, R y K; residuos alifáticos grandes no polares: M, L, I, V y C; y residuos grandes aromáticos: F, Y y W.
Las sustituciones no conservativas incluyen aquellas que afectan significativamente: la estructura de la cadena principal del péptido en el área de la alteración (por ejemplo, la estructura de hélice alfa o lámina beta); la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo; o la mayor parte de la cadena lateral. Las sustituciones no conservativas que en general se espera que produzcan los mayores cambios en las propiedades de la proteína son aquellas en las que (i) un residuo hidrófilo (por ejemplo, S o T) puede ser sustituido por (o por) un residuo hidrófobo (por ejemplo, F, V o A); (ii) un C o P puede ser sustituido por (o por) cualquier otro residuo; (iii) un residuo que tiene una cadena lateral electropositiva (por ejemplo, K, R o H) puede ser sustituida por (o por) un residuo electronegativo (por ejemplo, Q o D); o (iv) un residuo que tiene una cadena lateral voluminosa (por ejemplo, F), puede ser sustituido por (o por) uno que no tenga una cadena lateral voluminosa, (por ejemplo, G). Se encuentra información adicional en Creighton (1984) Proteins, WH Freeman and Company.
En el presente documento se describen variantes de péptidos formadores de fibrillas que se describen en el presente documento que incluyen proteínas que comparten: 70% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 1-1064; 75% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 1-1064; 80% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 1-1064; 81% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 1­ 1064; 82% de identidad de secuencia con cualquiera de 1-1064; 83% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 1-1064; 84% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 1-1064; 85% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 1-1064; 86% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 1-1064; 87% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 1-1064; 88% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 1-1064; 89% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 1­ 1064; 90% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 1-1064; 91% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 1-1064; 92% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 1-1064; 93% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 1-1064; 94% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 1-1064; 95% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 1-1064; 96% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 1-1064; 97% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 1-1064; 98% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 1-1064; o 99% de identidad de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NO: 1-1064.
El "porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" con respecto a las secuencias identificadas en este documento se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácidos en la secuencia de referencia después de alinear las secuencias e introducir espacios. si es necesario, para lograr el porcentaje máximo de identidad de secuencia. La alineación con el propósito de determinar el porcentaje de identidad de la secuencia de aminoácidos se puede lograr de varias formas que están dentro de la experiencia en la técnica, por ejemplo, usando software informático disponible públicamente, tal como software BLAs T, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar los parámetros apropiados para medir la alineación, incluidos los algoritmos necesarios para lograr la alineación máxima sobre la longitud de las secuencias que se comparan. Por ejemplo, los valores del % de identidad de secuencia de aminoácidos generados usando el programa informático WU-BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymology, 266: 460-480 (1996)) usan varios parámetros de búsqueda, la mayoría de los cuales se establecen en los valores predeterminados. Aquellos que no están configurados con los valores predeterminados (es decir, los parámetros ajustables) se configuran con los siguientes valores: intervalo de superposición = 1, fracción de superposición = 0,125, umbral de palabra (T) = 11 y matriz de puntuación BLOSUM62.
En realizaciones particulares, las fibrillas formadas a partir de los péptidos descritos en este documento son capaces de formar un complejo con una o más proteínas plasmáticas. Un "complejo" se refiere a una entidad molecular formada por asociación no covalente que involucra dos o más entidades moleculares componentes (iónicas o sin carga). El enlace entre los componentes es normalmente más débil que en un enlace covalente. Normalmente, la constante de disociación para un complejo ("Kd") es igual o superior a 1 |jM.
Los ejemplos no limitantes de tales proteínas plasmáticas incluyen (símbolo de proteína plasmática indicado entre paréntesis después de la proteína plasmática): apolipoproteína B-100 (A); Complemento C3 (B); Complemento C1s
(C); Beta-2-glicoproteína 1 (D); Clusterina (E); Factor de coagulación V (F); Complemento C1r (G); Apolipoproteína A­
I (H); ITIH2 (I); Complemento 1qB (J); Apolipoproteína A-IV (K); Factor de complemento H (L); Cadena beta de fibrinógeno (M); Complemento C4-A (N); Transtiretina (0); Inhibidor de la proteasa C1 plasmática de SerpinG1
(P); Cadena alfa de fibrinógeno (Q); Complemento C1qA (R); Vitronectina (S); Serpina-1 Alfa-1-antitripsina
(T); Proteína de unión a vitamina D (U); Proteína relacionada con la haptoglobina (V); ITIH4 (W); Cadena gamma de fibrinógeno (X); Antitrombina-III de SerpinC1 (Y); Apolipoproteína A-2 (Z); Proteína relacionada con el factor H del complemento (AA); Gelesolina (BB); Factor de complemento B (CC); Alfa-2-HS-glucoproteína
(DD); Paraoxinasa/arilesterasa 1 en suero (EE); Complemento C5 (FF); Apolipoproteína C5 (GG); Apolipoproteína C­
II (HH); Apolipoproteína C-I (II); ITIH1 (JJ); factor de von Willebrand (KK); Ceruloplasmina (LL); Apolipoproteína E
(MM); Filamina-A (NN); Glicoproteína rica en histidina (00); alfa-2-antiplasmina de SerpinF2 (PP); Protrombina del Factor de coagulación II (QQ); Factor de coagulación X (RR); Proteína dependiente de vitamina K
(SS); Apolipoproteína C-III (TT); Glicoproteína 2 alfa-1-ácida (UU); Factor de coagulación IX (VV); Apolipoproteína M
(WW); Albúmina sérica (XX).
Entre los ejemplos de complejos de fibrilla peptídica/proteína plasmática que son capaces de formarse se incluyen (símbolo para hexámero, seguido del símbolo para la proteína plasmática): 1B, 2B, 3B, 4B, 5B, 6B, 7B, 8B, 9B, 10B,
11B, 12B, 13B, 14B, 15B, 16B, 17B, 18B, 19B, 20B, 21B, 22B, 23B, 24B, 25B, 26B, 27B, 28B, 29B, 30B, 31B, 32B,
0
6 4 2
1 9 7 5 3
Figure imgf000016_0001
1
247C-1047C; 1F, 2F, 3F, 4F, 5F, 6F, 7F, 8F, 9F, 10F, 11F, 12F, 13F, 14F, 15F, 16F, 17F, 18F, 19F, 20F, 21F, 22F,
23F, 24F, 25F, 26F, 27F, 28F, 29F, 30F, 31F, 32F, 33F, 34F, 35F, 36F, 37F, 38F, 39F, 40F, 41F, 42F, 43F, 44F, 45F,
46F, 47F, 48F, 49F, 50F, 51F, 52F, 53F, 54F, 55F, 56F, 57F, 58F, 59F, 60F, 61F, 62F, 63F, 64F, 65F, 66F, 67F, 68F,
69F, 70F, 71F, 72F, 73F, 74F, 75F, 76F, 77F, 78F, 79F, 80F, 81F, 82F, 83F, 84F, 85F, 86F, 87F, 88F, 89F, 90F, 91F,
92F, 93F, 94F, 95F, 96F, 97F, 98F, 99F, 100F, 101F, 102F, 103F, 104F, 105F, 106F, 107F, 108F, 109F, 110F, 111F, 112F, 113F, 114F, 115F, 116F, 117F, 118F, 119F, 120F, 121F, 122F, 123F, 124F, 125F, 126F, 127F, 128F, 129F,
30F, 131F, 132F, 133F, 134F, 135F, 136F, 137F, 138F, 139F, 140F, 141F, 142F, 143F, 144F, 145F, 146F, 147F, 48F, 149F, 150F, 151F, 152F, 153F, 154F, 155F, 156F, 157F, 158F, 159F, 160F, 161F, 162F, 163F, 164F, 165F, 66F, 167F, 168F, 169F, 170F, 171F, 172F, 173F, 174F, 175F, 176F, 177F, 178F, 179F, 180F, 181F, 182F, 183F, 84F, 185F, 186F, 187F, 188F, 189F, 190F, 191F, 192F, 193F, 194F, 195F, 196F, 197F, 198F, 199F, 200F, 201F, 02F, 203F, 204F, 205F, 206F, 207F, 208F, 209F, 210F, 211F, 212F, 213F, 214F, 215F, 216F, 217F, 218F, 219F, 20F, 221F, 222F, 223F, 224F, 225F, 226F, 227F, 228F, 229F, 230F, 231F, 232F, 233F, 234F, 235F, 236F, 237F, 38F, 239F, 240F, 241F, 242F, 243F, 244F, 245F, 246F; y 247F-1047F; 1G, 2G, 3G, 4G, 5G, 6G, 7G, 8G, 9G, 10G, 1G, 12G, 13G, 14G, 15G, 16G, 17G, 18G, 19G, 20G, 21G, 22G, 23G, 24G, 25G, 26G, 27G, 28G, 29G, 30G, 31G, 2G, 33G, 34G, 35G, 36G, 37G, 38G, 39G, 40G, 41G, 42G, 43G, 44G, 45G, 46G, 47G, 48G, 49G, 50G, 51G, 52G, 3G, 54G, 55G, 56G, 57G, 58G, 59G, 60G, 61G, 62G, 63G, 64G, 65G, 66G, 67G, 68G, 69G, 70G, 71G, 72G, 73G, 4G, 75G, 76G, 77G, 78G, 79G, 80G, 81G, 82G, 83G, 84G, 85G, 86G, 87G, 88G, 89G, 90G, 91G, 92G, 93G, 94G, 5G, 96G, 97G, 98G, 99G, 100G, 101G, 102G, 103G, 104G, 105G, 106G, 107G, 108G, 1090, 110G, 1110, 112G, 13G, 114G, 115G, 116G, 117G, 118G, 119G, 120G, 121G, 122G, 123G, 124G, 125G, 126G, 127G, 128G, 129G, 30G, 131G, 1320, 133G, 134G, 135G, 136G, 137G, 138G, 139G, 140G, 141G, 142G, 143G, 144G, 145G, 146G, 47G, 148G, 149G, 150G, 151G, 152G, 153G, 154G, 155G, 156G, 157G, 158G, 159G, 160G, 161G, 162G, 163G, 64G, 165G, 166G, 167G, 168G, 169G, 170G, 171G, 172G, 173G, 1740, 175G, 176G, 177G, 178G, 179G, 180G, 81G, 182G, 183G, 184G, 185G, 186G, 187G, 188G, 189G, 190G, 191G, 192G, 193G, 194G, 195G, 196G, 197G, 98G, 199G, 200G, 201G, 202G, 203G, 204G, 205G, 206G, 207G, 208G, 209G, 210G, 211G, 212G, 213G, 214G, 15G, 216G, 217G, 218G, 219G, 220G, 221G, 222G, 223G, 224G, 225G, 226G, 227G, 228G, 229G, 230G, 231G, 32G, 233G, 234G, 235G, 236G, 237G, 238G, 239G, 240G, 241G, 242G, 243G, 244G, 245G, 246G; y 247G-1047G; M, 2M, 3M, 4M, 5M, 6M, 7M, 8M, 9M, 10M, 11M, 12M, 13M, 14M, 15M, 16M, 17M, 18M, 19M, 20M, 21M, 22M, 23M, 4M, 25M, 26M, 27M, 28M, 29M, 30M, 31M, 32M, 33M, 34M, 35M, 36M, 37M, 38M, 39M, 40M, 41M, 42M, 43M, 44M, 5M, 46M, 47M, 48M, 49M, 50M, 51M, 52M, 53M, 54M, 55M, 56M, 57M, 58M, 59M, 60M, 61M, 62M, 63M, 64M, 65M, 6M, 67M, 68M, 69M, 70M, 71M, 72M, 73M, 74M, 75M, 76M, 77M, 78M, 79M, 80M, 81M, 82M, 83M, 84M, 85M, 86M, 7M, 88M, 89M, 90M, 91M, 92M, 93M, 94M, 95M, 96M, 97M, 98M, 99M, 100M, 101M, 102M, 103M, 104M, 105M, 06M, 107M, 108M, 109M, 110M, 111M, 112M, 113M, 114M, 115M, 116M, 117M, 118M, 119M, 120M, 121M, 122M, 23M, 124M, 125M, 126M, 127M, 128M, 129M, 130M, 131M, 132M, 133M, 134M, 135M, 136M, 137M, 138M, 139M, 40M, 141M, 142M, 143M, 144M, 145M, 146M, 147M, 148M, 149M, 150M, 151M, 152M, 153M, 154M, 155M, 156M, 57M, 158M, 159M, 160M, 161M, 162M, 163M, 164M, 165M, 166M, 167M, 168M, 169M, 170M, 171M, 172M, 173M, 74M, 175M, 176M, 177M, 178M, 179M, 180M, 181M, 182M, 183M, 184M, 185M, 186M, 187M, 188M, 189M, 190M, 91M, 192M, 193M, 194M, 195M, 196M, 197M, 198M, 199M, 200M, 201M, 202M, 203M, 204M, 205M, 206M, 207M, 08M, 209M, 210M, 211M, 212M, 213M, 214M, 215M, 216M, 217M, 218M, 219M, 220M, 221M, 222M, 223M, 224M, 25M, 226M, 227M, 228M, 229M, 230M, 231M, 232M, 233M, 234M, 235M, 236M, 237M, 238M, 239M, 240M, 241M, 42M, 243M, 244M, 245M, 246M; y 247M-1047M; 1J, 2J, 3J, 4J, 5J, 6J, 7.1, 8J, 9J, 10J, 11J, 12J, 13J, 14J, 15J, 16J, 7J, 18J, 19J, 20J, 21J, 22J, 23J, 24.1, 25J, 26J, 27J, 28J, 29J, 30J, 31J, 32J, 33J, 34J, 35J, 36J, 37J, 38J, 39J, 40J, 1J, 42J, 43J, 44J, 45J, 46J, 47J, 48.1, 49J, 50J, 51J, 52J, 53J, 54J, 55J, 56J, 57J, 58J, 59J, 60J, 61J, 62J, 63J, 64J, 5J, 66J, 67J, 68J, 69J, 70J, 71.1, 72J, 73.1, 74J, 75J, 76J, 77J, 78J, 79J, 80J, 81J, 82J, 83J, 84J, 85J, 86J, 87J, 88J, 9J, 90J, 91J, 92J, 93J, 94J, 95J, 96J, 97J, 98J, 99J, 100J, 101J, 102J, 103J, 104J, 105J, 106J, 107J, 108J, 109J, 10J, 111J, 112J, 113J, 114J, 115J, 116J, 117J, 118J, 119J, 120J, 121J, 122J, 123J, 124.1, 125J, 126J, 127J, 128J, 29J, 130J, 131J, 132J, 133J, 134J, 135J, 136J, 137J, 138J, 139J, 140J, 141J, 142J, 143J, 144J, 145J, 146J, 147J, 48J, 149J, 150J, 151J, 152J, 153J, 154J, 155J, 156J, 157J, 158J, 159J, 160J, 161J, 162J, 163J, 164J, 165J, 166J, 67J, 168J, 169J, 170J, 171J, 172J, 173J, 174J, 175J, 176J, 177J, 178J, 179J, 180J, 181J, 182J, 183.1, 184J, 185J, 86.1, 187J, 188J, 189.1, 190J, 191J, 192J, 193J, 194J, 195J, 196J, 197J, 198J, 199J, 200J, 201J, 202J, 203J, 204J, 05J, 206J, 207J, 208J, 209J, 210J, 211J, 212J, 213J, 214J, 215J, 216J, 217J, 218J, 219J, 220J, 221J, 222J, 223J, 24J, 225J, 226J, 227J, 228J, 229J, 230J, 231J, 232J, 233J, 234.1, 235J, 236J, 237J, 238J, 239J, 240J, 241J, 242J,
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Como se ha indicado, estos péptidos se pueden formular para la administración al tracto respiratorio. Las cantidades terapéuticamente eficaces (también denominadas en el presente documento dosis) que conducen a tratamientos eficaces pueden estimarse inicialmente basándose en los resultados de ensayos in vitro y/o estudios de modelos de animales. Esta información se puede utilizar para determinar con mayor precisión dosis útiles en sujetos de interés.
La cantidad de la dosis real administrada a un sujeto particular puede ser determinada por un médico, veterinario o el investigador teniendo en cuenta parámetros, tales como factores físicos, fisiológicos y psicológicos incluyendo objetivo, el peso corporal, el tipo de afección, etapa o la gravedad de la afección, intervenciones terapéuticas previas o concurrentes, idiopatía del sujeto, etc. Las dosis de ejemplo pueden incluir, por ejemplo, 0,1 pg/kg - 1000 mg/kg.
Ejemplo 1. Las fibrillas amiloides, compuestas de hexapéptidos, cuando se inyectan en el peritoneo de ratones, estimulan una respuesta inmunosupresora de magnitud suficiente para reducir los signos paralíticos de encefalomielitis autoinmune experimental (EAE). El análisis del patrón de expresión génica diferencial en PBMC reveló que los péptidos amiloidogénicos, por ejemplo, Tau 623-628 (SEQ ID NO: 123), indujeron una respuesta de interferón de tipo 1 (IFN). Las células dendríticas plasmacitoides fueron la fuente de IFN tipo 1, que fue inducido por NETosis que surge de la endocitosis de neutrófilos de las fibrillas amiloides. La producción del IFN tipo 1 fue terapéutica en la EAE inducida por Th1, pero exacerbó los signos paralíticos de la enfermedad inducida por Th17. Sin embargo, no todos los péptidos amiloidogénicos indujeron cantidades equivalentes de IFN de tipo 1. La inducción de IFN de tipo 1 pareció correlacionarse con la cantidad de formación de fibrillas medida por la tioflavina T. Un conjunto de péptidos con una interfaz de fibrillas polares, por ejemplo, Amilina 28-33 (SEQ ID NO: 1053), no formaron cantidades medibles de fibrillas en tampones fisiológicos, indujeron cantidades mínimas de IFN de tipo 1, pero, sin embargo, fueron terapéuticas, reduciendo la producción de IFNy, TNFa e IL-6 por las PBMC y, por lo tanto, proporcionando evidencia de una segunda vía inmunosupresora. Una prueba más de la importancia de esta segunda vía inmunosupresora fue la capacidad de los péptidos amiloidogénicos para ser terapéuticos en animales IFNa/pR -/- con EAE.
Para definir mejor esta segunda vía inmunosupresora, se investigaron los efectos inducidos de las fibrillas amiloides en el sitio de inyección en el peritoneo. La cavidad peritoneal contiene una variedad de células especializadas que incluyen dos tipos de macrófagos residentes (MO), M o peritoneales grandes (LPM) (CD11bhi F4/80hi MHC-II' ) y Mo peritoneales pequeños (SPM) (CD11b+ F4/80lD MHC-IIhi), linfocitos B-1a (CD19hi CD5+ CD23) y componentes más comunes de la sangre, incluidos los linfocitos B-2 (CD19+ CD5' CD23+ ), linfocitos T, mastocitos, neutrófilos, eosinófilos y células NK. Los LPM (F4/80hi) son más prevalentes que los SPM (MHC-II), que representan el 90 % de los MO peritoneales. Los B-1a y MOs (LPM SPM) incluyen cada uno el 30 % del total de células peritoneales. Varios grupos han establecido que los linfocitos B-1a se distinguen de los linfocitos B-2 más abundantes y están enriquecidos en las cavidades corporales. También se han definido las quimiocinas e integrinas, que son responsables de la localización de B-1a en la cavidad peritoneal y su éxodo cuando se activan. La población de células B-1a se destaca por su expresión constitutiva de IL-10, una citocina inmunosupresora bien establecida. Janeway y sus colegas demostraron inicialmente que las células B productoras de IL-10, células B10, eran necesarias para la recuperación de los signos de EAE y posteriormente demostraron ser inmunosupresoras en modelos animales de esclerosis múltiple, enfermedad inflamatoria intestinal, artritis inducida por colágeno, lupus, accidente cerebrovascular, resistencia a la insulina y enfermedad alérgica de las vías respiratorias. Las células B10 en muchos de estos estudios se aislaron del bazo y no de la cavidad peritoneal.
La supresión inmune máxima por células B10 se observa después de activar las células a través de la unión a TLR, CD40 o IL-21, todos los cuales inducen tanto un aumento en la producción de IL-10 como una salida de las células del peritoneo en secundaria órganos linfáticos. La reducción de los síntomas en cada una de las enfermedades inflamatorias autoinmunes se correlacionó con la reducción de TNFa, IL-6 e IFNy, un patrón similar al observado con la administración de péptidos amiloidogénicos.
Procedimientos. Inducción de EAE activa en ratones mediante inmunización con MOG y adyuvante. Se indujo EAE en ratones C57Bl/6 de tipo salvaje hembra o ratones deficientes en |jMT e IL-10 sobre una base C57Bl/6 (Jackson Laboratories) mediante procedimientos descritos previamente. Brevemente, se indujo EAE a las 9 semanas de edad mediante inmunización subcutánea en el flanco con una emulsión que contenía 200 jg de glicoproteína de oligodendrocitos de mielina 35-55 (MOG 5-55; MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK (SEQ ID NO: 1065)) en solución salina y un volumen igual de adyuvante completo de Freund que contiene 4 jg/m l de mycobacterium tuberculosis H37RA (Disco Laboratories). A todos los ratones se les administraron 400 ng de toxina pertussis (List Biological) intraperitoneal (i.p.) a las 0 y 48 h después de la inmunización. Los signos de deterioro neurológico se puntuaron de la siguiente manera: 0, sin enfermedad clínica; 1, debilidad de la cola; 2, debilidad de las patas traseras; 3, parálisis completa de las patas traseras; 4, parálisis de las patas traseras y algo de debilidad de las patas delanteras; 5, moribundo o muerto. Cuando los animales exhibieron un promedio de nivel uno a dos para los signos clínicos, se inyectaron en el peritoneo 10 jg de Tau 623-628, péptido Amilina 28-33 (SEQ ID NO: 1053) o PBS diariamente. Para la inoculación intranasal, se liberaron gradualmente 10 jg de Amilina 28-33 en 10 j l de PBS en las fosas nasales de los ratones anestesiados. Todos los protocolos de los animales fueron aprobados por IACUC institucional.
Transferencia adoptiva de linfocitos B-1a. Los linfocitos B-1a se purificaron mediante clasificación celular de células peritoneales de ratones C57BI/6 de tipo salvaje. Diez días después de la inducción de la EAE activa en ratones |jMT, 3,5x105 linfocitos B-1a se transfirieron a la cavidad peritoneal. Los ratones se trataron con 10 jg de amilina 28-33 o PBS diariamente durante 14 días. Se trataron ratones de control jM T con EAE con 10 jg de Amilina 28-33 sin transferencia de linfocitos B-1a. Los ratones se examinaron diariamente en busca de signos clínicos de EAE y se puntuaron en una escala de cinco puntos descrita anteriormente.
Microscopía. Se inyectaron ratones hembra C57BI/6 con FITC-Tau 623-628, y las células peritoneales se aislaron después de 10 minutos, se lavaron, se tiñeron con CD19 (PE) antirratón de rata, F4/80 (Alexa Fluor 647) y DAPI, se lavaron y se emplacaron en portaobjetos de microscopio recubiertos de polilisina. Las células se visualizaron usando un microscopio confocal de láser de luz blanca Leica TCS SP8.
Experimentos de bioluminiscencia. Los linfocitos B-1a y los MOs peritoneales se purificaron mediante clasificación celular de células peritoneales aisladas de ratones transgénicos con luciferasa ((B6.FVB-Ptprca Tg (CAG-luc, -GFP) L2G85Chco Thy1a/J), que expresan CAT-luc-eGFP, transgén L2G85). En el experimento inicial, 2 x 105 y 1 x 105 de linfocitos B-1a se inyectaron en el peritoneo de ratones albino hembra C57BL/6 (B6(Cg)-Tyr° '2J/J), seguido de la inyección de 10 |ig de Tau 623-628 para activar los linfocitos y 0,3 mg/g de peso corporal de sustrato de luciferina (D luciferin firefly L-8220 Biosynth) para iniciar la formación de imágenes por bioluminiscencia. La ubicación de las células que expresan luciferasa se midió mediante formación de imágenes cada 5 minutos durante 75 minutos.
Para confirmar que la disminución de la luminiscencia era debida al tráfico de células luc+ y no a la degradación de la luciferina, dos ratones C57BL/6 albinos fueron inyectados con 106 MOs peritoneales luc+, un tercio con 2x105 linfocitos B-1a y al cuarto ratón que sirve como control b L i se le inyectó luciferina solamente. Posteriormente, se inyectaron a los ratones 10 |jg de Tau 623-628 y 0,3 mg/gramo de luciferina. La bioluminiscencia se midió inmediatamente después de la inyección de luciferina y 5 minutos más tarde. Después de treinta minutos, los ratones se volvieron a inyectar con luciferina y se midió la luminiscencia resultante. Se realizó una inyección y medición similares después de 60 minutos. Las múltiples inyecciones de luciferina mantuvieron el nivel de fármaco cerca de la saturación durante todas las mediciones, por lo que cualquier cambio se debió al movimiento celular. Se obtuvieron imágenes de los ratones usando un sistema de imágenes de dispositivo de carga acoplada (CCD) IVIS100 (Xenogen, Alameda, CA). Los datos de las imágenes se analizaron y cuantificaron con el software Living Image 4.4 (Xenogen).
Síntesis de péptidos y preparación de FITC-Tau. Los péptidos se sintetizaron usando técnicas de fase sólida y aminoácidos Fmoc, resinas y reactivos disponibles comercialmente (PE Biosystems, Foster City CA y Bache, Torrance, CA) en un sintetizador de péptidos Applied Biosystems 433A como se describió anteriormente. Wender et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (24): 13003-13008. Se demostró que la pureza de los péptidos era superior al 90% usando una HPLC PE Biosystems 700E y una columna de fase inversa (Alltech Altima). El peso molecular de los péptidos se confirmó usando espectrometría de masas de desorción láser asistida por matriz. Para evitar cantidades excesivas de fluoróforo en las fibrillas, se mezcló Tau 623-628 en una proporción de 10:1 con un análogo con FITC unido al extremo amino terminal de Tau 623-628 con un enlazador de ácido aminocaproico. La mezcla de fibrillas resultante se refiere en el texto como FITC-Tau.
Aislamiento de ARN, hibridación de chips y qPCR. Se extrajo el ARN total de linfocitos B-1a purificados con FACS y MOs peritoneales combinados de 3-6 ratones hembra C57BL/6 inyectados con 10 jg de LPS, Tau 623-628, Amilina 28-33 o PBS usando reactivo Trizol y el microkit Qiagen RNeasy. El ADNc de la primera hebra se sintetizó con 30-50 ng de ARN total usando la supermezcla de síntesis de la primera hebra Superscript III para qRT-PCR. Los ensayos de QPCR se realizaron utilizando el sistema PCR de tiempo real 7900HT Fast (Applied Biosystems) y las matrices de expresión génica Taqman (Applied Biosystems) utilizando cebadores disponibles comercialmente (ABI). Todos los ensayos se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se utilizó el método Ct comparativo para la cuantificación relativa (AACt) para comparar la expresión génica. La expresión de genes constitutivos se utilizó para normalizar la expresión mediante la siguiente ecuación: Expresión normalizada = 2][Ct(gen constitutiv°) -Ct (aen)].
Los cambios en la expresión génica asociados con el tratamiento con LPS, Amilina 28-33 y Tau 623-628, se cuantificaron usando una micromatriz (SurePrint G3 Mouse; Agilent Technologies). Se demostró que la calidad del ARN es adecuada para experimentos con micromatrices (2100 Bioanalyzer, Agilent Technologies, Inc.). El análisis y la cuantificación de los datos se realizaron mediante el software GeneSpring e Ingenuity.
Citometría de flujo. Las células de la cavidad peritoneal se obtuvieron lavando la cavidad peritoneal con 10 ml de PBS frío que contenía albúmina de suero bovino al 0,1 % y EDTA 5 mM. Las suspensiones unicelulares se tiñeron con los siguientes conjugados fluorocromos: CD5 (PE Cy5, PE o APC), CD19 (PE Cy5.5, Pacific Blue o APC), CD11b (Pacific Blue o PE), F4/80 (APC), CD21 (APC), CD23 (PE), Gr-1 (PECy7), B220 (APC-Cy7), CD80/86 (biotina-Qdot605-estreptavidina), Cd 4 (FITC), CD3 (PerCP-Cy5.5) e IgM (Alexa Fluor 700). La clasificación de las células utilizó un FACS-Aria o un Fortessa (BD) equipado con cuatro láseres y óptica para el análisis de 22 parámetros. El análisis se realizó utilizando FlowJo.
Ensayos de unión a TLR. Se cultivaron en placas de 96 pocillos células HEK293 disponibles comercialmente transfectadas con TLR4, MD-2, CD14 o TLR2 murinos y una fosfatasa alcalina embrionaria secretada inducible (InVivoGen). El gen informador de SEAP en las células está bajo el control de un promotor mínimo p40 de IL-12 fusionado a cinco sitios de unión a NF-kB y AP-1. La estimulación con un ligando TLR4 o TLR 2 activa NF-kB y AP-1, lo que induce la producción de SEAP. Los niveles de fosfatasa alcalina secretada medidos en el medio de cultivo celular son proporcionales a la estimulación de la vía TLR. Los niveles de base se miden usando células HEK-Blue Null, que se transfectan con la fosfatasa alcalina, pero no con el receptor TLR. Las células transfectadas con TLR4 se cultivaron hasta la confluencia y se añadieron 2, 1, 0,2 jg de LPS o 10 j l de un conjunto de péptidos amiloidogénicos a cada pocillo por duplicado en medio de detección HEK-Blue (InVivoGen). En el caso de las células transfectadas con TLR2, PAM2CSK4 fue el control positivo y solo se analizaron 2 jg de LPS. Las placas se incubaron durante 12 horas a 37 °C y se midió el color azul resultante leyendo la absorción a 650 nm.
Resultados. Las fibrillas amiloide son endocitosadas por células B peritoneales y MO. Las fibrillas amiloides son endocitosadas por MO, células dendríticas, microglía y neutrófilos. Para determinar si las células peritoneales se unen a las fibrillas amiloides, se mezcló Tau 623-628 marcado con fluorescencia con péptido no marcado en una proporción de 1:10, y las fibrillas resultantes se inyectaron en el peritoneo de ratones C57BL/6 de tipo salvaje sanos. Después de veinte minutos, las células peritoneales se recogieron mediante lavado, se tiñeron con anti-CD19 y anti-F4/80, y se colocaron en capas sobre portaobjetos revestidos con polilisina. Se realizó microscopía confocal que reveló la presencia de fibrillas fluorescentes intracelulares, lo que sugiere que las fibrillas estaban unidas y endocitosadas tanto por células B (CD19+) como por MOs (F4/80+) (Figuras 1A y B). La visualización de múltiples campos reveló que la mayoría de las fibrillas fluorescentes estaban unidas por células F4/80+ con un porcentaje más pequeño que se unía a células B CD19+.
Análisis de las células peritoneales aisladas de ratones inyectados con las fibrillas amiloides fluorescentes mediante citometría de flujo confirmó y amplió el estudio microscópico. La composición de los diversos tipos de células en el peritoneo se puede definir usando análisis de alta dimensión de 10 colores y 12 parámetros (Figuras 2A y 2B). Cuando los MOs peritoneales (tanto SPM como LPM), mastocitos, linfocitos T, B-2 y B-1 se definen con anticuerpos contra CD11b, CD5 y CD19, es evidente un patrón más complejo de captación y tráfico (FIG. 1C). A los 10 minutos de la inyección de FITC-Tau, más del 70% de los linfocitos B-1 y B-2 y LPM son FITC positivos. Los linfocitos T y los mastocitos se tiñen mínimamente, lo que demuestra una unión o captación específica por parte de las células B y MO. Cinco horas después de la inyección de las fibrillas amiloides, surge un patrón interesante. La mayoría de la población con alto contenido de CD11b se reduce significativamente del 45% al 3% del total de células peritoneales (Figura 2C). La mayor parte de la población de B-1a ha desaparecido, siendo las células restantes FITC-Tau negativas (Figura 2D). La mayoría de los linfocitos T y mastocitos permanecieron sin teñir con las fibrillas. En conjunto, los estudios de citometría de flujo revelaron que las células B y MO se unen a las fibrillas y que el número relativo de linfocitos B-1a (CD19hi CD5+) y los LPM (CD11bhi) se redujeron drásticamente 5 horas después de la inyección del amiloide.
Se evaluó si las fibrillas eran selectivamente tóxicas para B-1a y LPM. Esto se consideró improbable cuando no se observó muerte celular cuando las células peritoneales se cultivaron in vitro con el amiloide fluorescente (Figura 3). En lugar de matar las células, una hipótesis comprobable era que las fibrillas inducían el éxodo de las dos poblaciones celulares del peritoneo.
Los ratones con inactivación de |jMT e IL-10 no responden a la terapia. Para determinar la importancia de los linfocitos B en el modo de acción de las fibrillas amiloides, se indujo EAE en ratones j MT, que debido a una mutación en la región transmembrana de IgM carecen de expresión de todos los subtipos de linfocitos B. Los signos paralíticos de la enfermedad fueron inducidos en estos animales, consistente con la inducción de la enfermedad por los linfocitos T, pero ni Tau 623-628 ni Amilina 28-33 fueron terapéuticas en comparación con el efecto observado en ratones de tipo salvaje (Fig. 4A -4C). La actividad terapéutica de los péptidos amiloidogénicos pareció requerir la presencia de células B, muy probablemente linfocitos B-1a basándose en la composición del peritoneo y la microscopía.
Los linfocitos B-1a se caracterizan por la expresión constitutiva de cantidades relativamente grandes de IL-10. Para establecer si esta citocina era fundamental para los efectos terapéuticos de los péptidos y para correlacionar la actividad con este subtipo de células B, se usaron 10 jg de Amilina 28-33 para tratar EAE inducida en animales con inactivación de IL-10 (Figuras 4D y 4E). Nuevamente, el péptido fue ineficaz en este modelo animal, estableciendo que tanto la IL-10 como los linfocitos B son fundamentales para la actividad terapéutica de los péptidos amiloidogénicos.
La transferencia adoptiva de linfocitos B-1a restauró la eficacia terapéutica de los péptidos amiloidogénicos en animales jM T. Las características de los linfocitos B-1a peritoneales se correlacionan claramente con los requisitos aparentes para la función terapéutica. Por tanto, la sustitución de esta población en ratones jM T debería restaurar la actividad inmunosupresora de las fibrillas amiloides. Se aislaron células peritoneales de ratones C57BL/6 y se purificaron linfocitos B-1a (CD19hiCD5+) mediante clasificación celular. Se indujo EAE en ratones jM T y, el día 10 después de la inducción, antes de la aparición de los signos clínicos, se inyectó a los ratones en la cavidad peritoneal linfocitos B-1a purificados (3,5x105 células). Los ratones se dividieron en dos grupos y se trataron diariamente con Amilina 28-33 (10 jg ) o tampón solo (Figura 4F). Se usaron ratones jM T inducidos con EAE que no recibieron linfocitos B-1a pero fueron tratados con Amilina 28-33 para comparación. Curiosamente, solo los ratones que recibieron la transferencia de linfocitos B-1a tratados diariamente con el péptido amiloidogénico exhibieron signos paralíticos reducidos de EAE. La transferencia adoptiva de linfocitos B-1a no tratados fue tan ineficaz como el control de tampón, lo que establece no solo la importancia de los linfocitos B-1a, sino que la población celular necesita ser activada por las fibrillas para que sea eficaz. Esto corrobora los estudios de que las células B reguladoras son supresores de autoinmunidad más potentes que sus homólogas no activadas.
Los péptidos amiloidogénicos inducen el éxodo de linfocitos B-1a y LPM desde la cavidad peritoneal. La medición en tiempo real de la bioluminiscencia demostró que los péptidos amiloidogénicos inducen un éxodo de linfocitos B-1a y LPM desde el peritoneo. Se clasificaron linfocitos B-1a (CD19hiCD5 CD23') y LPM (CD11bhiF4/80hi) de células peritoneales aisladas de ratones transgénicos con luciferasa, C57BL/6 L2G85 (H-2d) (B6.FVB-Ptprca Tg (CAG-luc,-GFP) L2G85Chco Thy1a/J), que expresan el transgén CAT-luc-eGFP, L2G85. En el experimento inicial, se inyectaron 1 x 105 y 2 x 105 linfocitos B-1a en el peritoneo de ratones albinos hembra C57BL/6, seguido de una inyección de 10 jg de Tau 623-628 para activar los linfocitos y 300 jg/g de peso corporal del sustrato luciferina, para iniciar la reacción enzima-sustrato para la obtención de imágenes por bioluminiscencia. La ubicación de las células que expresan luciferasa se controló formando imágenes de los ratones cada 5 minutos durante 75 minutos (Figura 5, arriba a la izquierda). La distribución difusa de la luminiscencia, correspondiente a la cavidad peritoneal, observada en tiempos tempranos, se redujo en intensidad con el tiempo, con regiones focales de intensidad que parecían localizarse en los ganglios linfáticos inguinales a partir de los 35 minutos (Figura 5, arriba a la izquierda). La medición del número total de fotones por segundo en la región abdominal reveló una reducción rápida, dependiente de la dosis, de la luz emitida durante los 75 minutos del experimento (FIG. 5, arriba a la derecha). Aunque el tamaño de la señal fue proporcional al número de células inyectadas, la tasa de reducción, o pendiente de la curva, fue equivalente en los dos animales. Dicho resultado es consistente con las fibrillas amiloides que desencadenan la salida de los linfocitos B-1a del peritoneo.
El diseño experimental del experimento inicial no permitía asignar la reducción de la señal de manera inequívoca a la migración de los linfocitos porque la concentración de la luciferina también disminuye durante los 75 minutos de examen. Para asignar mejor la base de la reducción de luminiscencia a la migración de las células luc+, se realizó un segundo experimento con cuatro ratones receptores. Dos fueron inyectados con 1 x 106 MOs (LPMs) luc+, un tercero con 2x105 linfocitos B-1a y al cuarto ratón que sirve como control se le inyectó solo luciferina. En este experimento, los ratones fueron posteriormente inyectados con 10 |jg de Tau 623-628 y luciferina. La bioluminiscencia se midió inmediatamente después de la inyección de luciferina y 5 minutos más tarde. Después de treinta minutos, los ratones se volvieron a inyectar con luciferina y se midió la luminiscencia resultante. Se realizó una inyección y medición similares después de 60 minutos. Las múltiples inyecciones de luciferina mantuvieron el nivel del fármaco cerca de la saturación durante todas las mediciones, por lo que cualquier cambio se debió a la migración y el tráfico. Usando 1x106 LPM se produjo una señal vivida en todos los puntos de tiempo, cuyos detalles fueron similares a los observados en el experimento inicial; aumento de la distribución de la luz con el tiempo, junto con una concentración en un área sobre los ganglios linfáticos inguinales (Figura 5, parte inferior izquierda). En el ratón que recibió los linfocitos B-1a, se observó una señal menos intensa, pero sin embargo era clara la evidencia de éxodo de células luc+ del peritoneo. Cuando se midieron y representaron con el tiempo los fotones por segundo en todo el cuerpo de cada ratón, hubo un aumento proporcional de la señal en función del tiempo. En el caso del área correspondiente a los ganglios linfáticos inguinales, hubo un aumento de luminiscencia cercano a 10 veces a partir de la medición a los 5 a 60 minutos (Figura 5, abajo a la derecha). En conjunto, los experimentos de formación de imágenes establecen que los péptidos amiloidogénicos inducen una migración tanto de linfocitos B-1a como de LPM desde el peritoneo a los ganglios linfáticos inguinales.
Para examinar más a fondo cómo las fibrillas amiloides inducen un éxodo de linfocitos B-1a y LPM, se realizó una serie de experimentos utilizando ratones informadores IL-10 en los que IL-10 y GFP están conectados a través de un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) para crear un mensaje bicistrónico que marca las células secretoras de IL-10 con fluorescencia (Bouabe (2012) Scand. J. Immunol. 75 (6): 553-567). Debido a que el LPS induce la migración de células B-1a desde el peritoneo al bazo, los efectos de las fibrillas amiloides se compararon con los efectos observados con el ligando Tl R4 (Balabanian et al. (2003) J. Immunol. 170 (6): 3392- 3400; Ghosn y col. (2011) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108 (7): 2879-2884). Para permitir cambios máximos en la transcripción de IL-10, y debido a que la GFP resultante tiene una vida relativamente larga, el experimento se diseñó para confirmar el éxodo e identificar posibles sitios de migración. Debido a que experimentos previos establecieron que el 80% de B-1a y LPM salieron del peritoneo a las 5 horas, los puntos de tiempo para el análisis se eligieron a los 30 minutos y a las 24 horas después de la inyección de las fibrillas. Se inyectaron tres grupos de tres ratones hembra C57BL/6 informadores de IL-10 con 10 jg de LPS, 10 jg de amilina 28-33 o tampón solo y después de 5 o 24 horas se lavaron las células peritoneales, se diseccionaron el bazo y los ganglios linfáticos inguinales y axilares, agrupándose los ganglios linfáticos, y las suspensiones de células individuales se prepararon y definieron usando un análisis de alta dimensión de 10 colores y 12 parámetros. También se tomaron células y tejidos similares de tres ratones de tipo salvaje como controles adicionales. La inyección de LPS no solo aumentó el número relativo de linfocitos B-1a secretores de IL-10 (del 25 % al 40 % en 24 h), sino que también indujo niveles más altos de IL-10, tal como lo demuestran los niveles más altos de intensidad de fluorescencia media (MFI) de GFP. Por el contrario, la inyección de amilina 28-33 no aumentó la secreción de IL-10, sin embargo, hubo una disminución en el número de Linfocitos B-1a y LPM IL-10+ en el peritoneo a las 24 horas que no se observó con LPS.
En el bazo, el LPS indujo un aumento tanto del número de linfocitos B-1a como de la cantidad de IL-10 expresada por célula 24 horas después de la inyección. Las fibrillas de amilina no indujeron un aumento de los linfocitos B-1a en el bazo, sino más bien una aparente reducción tanto en el número como en la expresión de IL-10. Se observó el patrón opuesto en los ganglios linfáticos agrupados. El LPS dio como resultado un ligero aumento de linfocitos B-1a en los ganglios linfáticos agrupados. La inyección de amilina 28-33 aumentó el porcentaje de linfocitos B-1a en el ganglio linfático, con un aumento en la cantidad de expresión de IL-10. En ratones informadores de IL-10 con EAE, se observó un patrón adicional. No se detectó un aumento significativo de linfocitos B-1a en el cerebro o la médula espinal, de acuerdo con la hipótesis de que las poblaciones de B-1a y MO migran a los órganos linfáticos secundarios, y no a los sitios de inflamación primarios.
Los experimentos que utilizaron ratones informadores de IL-10 revelaron que tanto LPS como las fibrillas activaban los linfocitos B-1a, SPM y LPM, induciendo la expresión del gen de IL-10 y el posterior éxodo del peritoneo. Sin embargo, la magnitud del aumento y los detalles de las direcciones de migración difieren. Tal como se informó anteriormente, el LPS activa los linfocitos B-1a dando como resultado una mayor producción de IL-10 y migración al bazo, mientras que las fibrillas indujeron predominantemente la migración a los ganglios linfáticos. Curiosamente, sólo los linfocitos B-1a que expresan CD80/86 secretan IL-10, y se encontraron linfocitos B-1a secretores de IL-10 en los ganglios linfáticos de animales normales con un número relativo aumentado con la inyección de fibrillas de amilina. Los experimentos de citometría de flujo establecen que los péptidos amiloidogénicos activan tanto los linfocitos B-1a como los LPM, dando lugar a que ambos tipos de células circulan a los ganglios linfáticos de drenaje.
La expresión génica diferencial en linfocitos B-1a y MOs inducida por fibrillas amiloides. La migración de linfocitos B-1a y LPM después de la inyección de fibrillas amiloides fue consistente con la activación de ambos tipos de células. Sin embargo, el receptor o receptores de las fibrillas no se han definido ni para los linfocitos B-1a ni para los MOs peritoneales. A diferencia de la migración inducida por estimulación con LPS, las fibrillas compuestas por péptidos no se unen a TLR2 MD2/TLR4. Se seleccionó un conjunto de más de quince péptidos amiloidogénicos diferentes para la unión a células HEK disponibles comercialmente transfectadas con TLR2 o MD2/CD14/TLR4 murinos. Las células transfectadas contenían una forma secretable de fosfatasa alcalina bajo el control de un promotor NFkB. Ninguna de las fibrillas amiloides compuestas por los péptidos variables fue positiva en este ensayo.
Para confirmar y aumentar la comprensión de cómo las fibrillas están activando las células peritoneales, se analizó la inducción de genes diferenciales en B-1a y LPM purificados. La realización de tales mediciones fue complicada por el hecho de que el LPS y las fibrillas inducen una rápida migración de las células relevantes desde la cavidad peritoneal y, en consecuencia, un alto porcentaje no se aislaría mediante lavado una hora después de la inyección. Para minimizar el sesgo de la población y, sin embargo, dejar tiempo suficiente para que las fibrillas induzcan la expresión génica, las células se aislaron entre 30 y 40 minutos después de la inyección de LPS o los péptidos amiloidogénicos. En consecuencia, el análisis se limita a la expresión génica en los 30-40 minutos posteriores a la estimulación. Se aislaron células peritoneales de grupos de tres ratones hembra C57BL/6 después de la inyección con LPS, fibrillas compuestas por Amilina 28-33 o Tau 623-628, o control de tampón. Los linfocitos B-1a (CD19hi CD5+ CD23') y LPM (CD11b hi MOs) de los cuatro grupos de tres ratones se clasificaron en Trizol, se extrajo el ARN y se midió la expresión génica usando un microchip de expresión del genoma completo de Agilent murino. La expresión génica diferencial de B-1a y LPM se calculó restando los datos de expresión génica de las células aisladas de ratones inyectados con tampón de los datos de expresión de ratones inyectados con LPS o las fibrillas amiloides (Figura 6A). Todos los datos de las micromatrices están disponibles en la base de datos Gene Expression Omnibus (GEO) (número de acceso de la serie GEO: GSE73026).
El patrón de expresión génica inducida por LPS está bien caracterizado en ambos tipos de células que se unen a CD14/TLR4 (Kawai y Akira (2010) Nat. Immunol. 11 (5): 373-384; Rossol, et al. (2011) Critical reviews in Immunol.31 (5): 379-446) lo que da lugar a la inducción de un amplio espectro de mediadores proinflamatorios, tales como IL-6, TNFa, IFN tipo 1, Serpins, IL-1a y p, quimiocinas CXCL10, CXCL3, MYD88, y más de 50 genes que se sabe que son inducidos por RelA/p65 NFkB (Bode et al. (2012) Cellular Signaling 24 (6): 1185-1194). En los Mo peritoneales, los péptidos amiloidogénicos estimularon un conjunto de genes claramente diferente de los inducidos por LPS. Para retratar la variación, un mapa de calor de la correlación de un conjunto de 730 genes anotados inducidos por LPS en MO demuestra que la firma de expresión génica inducida por los dos péptidos amiloidogénicos es similar y distinta del patrón generado por inyección con LPS (Figura 6A). La mayoría de los genes inducidos preferentemente por las fibrillas correspondían a las vías de estimulación MO, producción de citocinas, fosforilación oxidativa y disfunción mitocondrial. Se indujeron las vías de fosforilación oxidativa, demostradas por la expresión de un gran número de genes mitocondriales que componen los cinco complejos involucrados en el transporte de electrones mitocondriales y la producción de ATP, característicos de las interacciones de las fibrillas amiloides con las mitocondrias (DuBoff B, Feany M, & Gotz J (2013)) Trends in Neurosciences 36 (6): 325-335).
En el caso de los linfocitos B-1a, se observa una diferencia menos vívida entre los LPS y los péptidos, pero los patrones inducidos por los dos tipos de fibrillas son distinguibles de los del LPS. Por el contrario, con MOs, tanto los LPS como los péptidos amiloidogénicos indujeron un patrón de expresión característico de la activación de las células B. Los péptidos amiloidogénicos estimularon la proteína efectora pequeña CDC42), liberación de calcio (stim 1, orai 1 y 3), BcR (CD79, Syk, Lyn, PI3K, Akt, m-Tor, Bcl2A1d, c-src, PTEN y Vav-1) y señalización de CD40 (Traf 2, 4 y 5), todos los cuales inducen la activación de NFkB. Aunque los LPS y los péptidos amiloidogénicos indujeron una gran cantidad de genes similares involucrados en la activación de los linfocitos, se pudo observar una clara distinción, induciendo los péptidos amiloidogénicos un conjunto de proteínas inmunosupresoras, tales como BTLA, IRF4 y Siglec G.
Para confirmar los datos de expresión génica desde el chip, se analizó un conjunto de genes mediante qPCR (Figs.
6B a 6D). En estos experimentos, se aisló ARN de B-1a, MO grandes y pequeños usando métodos idénticos y tiempos similares después de la inyección de los estimulantes, tal como se hizo para la micromatriz. De acuerdo con el análisis de la vía de los datos del chip, IL-6, TNF, IL-1p e IFNp1 fueron inducidos significativamente por LPS en los MO peritoneales, y mínimamente por las fibrillas peptídicas. Curiosamente, los SPM (MO CD11b+ F4/80lo/_) expresaron uniformemente una mayor cantidad de genes inflamatorios, particularmente IL-1p, que los LPM (MO CD11bhi F4/80hi). En el peritoneo, los SPM componen menos del 10% de la población de MO, no son el tipo de célula dominante que endocitan las fibrillas, ni representan la principal población de células empobrecidas después de la inyección de LPS o las fibrillas. Por el contrario, las fibrillas indujeron un conjunto de genes asociados con la regulación inmunitaria, BTLA, Siglec G e IRF4 en linfocitos B-1a y CD274 en LPM. El LPS indujo algunos de estos genes, pero no todos. El tercer conjunto de genes analizados fueron los que se sabe están asociados con la activación celular. CD40, CD80, c D86 y semaforina 4D fueron inducidos tanto por LPS como por las fibrillas en linfocitos B-1a y ambos tipos de MO. CD83 fue inducido por ambos estímulos principalmente en los MO, mientras que CD79a y Raftlin fueron inducidos en los linfocitos B-1a.
El patrón de expresión génica indicó que ambos tipos de fibrillas amiloides activan los linfocitos B-1a y ambas poblaciones de los MO peritoneales (SPM y LPM). La expresión del gen de IL-10 se incrementó tanto en B-1a como en LPM, dos de los tipos de células que se muestra que transitan hacia los ganglios linfáticos. La inducción de BTLA y Siglec G en los linfocitos B-1a aumentaría su fenotipo inmunorregulador. La expresión de IL-10 en los LPM es cosistente con la conversión de estas células a un fenotipo M2, que también se cree que suprime las respuestas inflamatorias.
El suministro al tracto respiratorio conserva la eficacia terapéutica de los péptidos amiloidogénicos. La inyección peritoneal no es una vía práctica de administración de fármacos para la activación de linfocitos B-1a en humanos. Sin embargo, los linfocitos B-1a también abundan en la cavidad pleural tanto de ratones como de seres humanos (Yenson V y Baumgarth N (2014) Methods Mol. Biol. 1190: 17-34). Para examinar si esta vía alternativa de administración es práctica y suficiente para el tratamiento, se administraron diariamente 10 |jg de Amilina 28-33 por vía intranasal a grupos de 10 ratones C57BL/6 con EAE. Los signos paralíticos de la enfermedad se redujeron de una manera equivalente a la observada cuando se inyecta i.p. el péptido amiloidogénico (Figura 7A). Además, los esplenocitos de ratones tratados con péptidos mostraron una reducción en la secreción de citocinas proinflamatorias, IL-6, IFNy, IL-2, e IL-17, en respuesta a estimulación MOG35-55 in vitro, en comparación con el control (Figura 7B), un patrón idéntico al de cuando se inyectó Amilina 28-33 (Kurnellas et al. (2013) Sci. Transl. Med. 5 (179): 179ra142).
El éxito del suministro al tracto respiratorio es consistente con un modo de acción en el que los linfocitos B-1a juegan un papel central, pero también establecen una vía potencial de administración que se puede utilizar en ensayos clínicos en pacientes humanos.
Discusión. Las fibrillas amiloides compuestas de péptidos amiloidogénicos exhiben un amplio espectro de actividades biológicas, cuya suma da como resultado una respuesta inmunosupresora de magnitud suficiente para ser terapéutica en un modelo robusto de esclerosis múltiple. Como chaperonas moleculares, se unen a un espectro de mediadores proinflamatorios en el plasma. En la sangre son endocitosadas por neutrófilos, que inducen la producción de redes, que a su vez inducen a las células dendríticas plasmocitoides a secretar IFN tipo 1. Aquí se muestra que las fibrillas se unen y activan tanto a los linfocitos B-1a como a un subconjunto de MOs peritoneales conocidos como MO peritoneales grandes (LPM) (Ghosn EE, et al. (2010) Proc. Natl. Acad. Sci USA 107 (6): 2568-2573), que son inducidos para aumentar la transcripción de IL-10 y migrar fuera del peritoneo a los órganos linfáticos secundarios. El éxodo da como resultado el suministro selectivo de IL-10 a sitios inmunológicos compartidos con linfocitos T inflamatorios y sus células presentadoras de antígeno complementarias. IL-10 inhibe eficazmente ambas poblaciones de células inflamatorias, con reducción de la producción de citocinas proinflamatorias, IL-6, TNFa e IFNy. Esta reducción de citocinas fue el sello distintivo de la inmunosupresión inducida en EAE por los péptidos amiloidogénicos. Las células peritoneales no parecen migrar a los sitios de inflamación en el SNC y, en consecuencia, no necesitan cruzar la barrera hematoencefálica. Los ratones knockout fueron fundamentales para establecer el mecanismo. La incapacidad del péptido amiloide para reducir la inflamación en ratones jM T deficientes en células B con EAE destacó la importancia de las células B. Se utilizaron citometría de flujo y microscopía fluorescente para establecer que en el peritoneo la diana relevante en la población de células B fueron los linfocitos B-1a, un secretor de IL-10. Un respaldo adicional para el papel de los linfocitos B-1a secretores de IL-10 fue el fracaso de los ratones IL-10 -/- con EAE para responder a la terapia con amiloide. El apoyo adicional para el papel de los linfocitos B-1a secretores de IL-10 en el mecanismo de acción provino de los experimentos clásicos de transferencia adoptiva. La transferencia adoptiva de linfocitos B-1a purificados a ratones jM T convirtió a los ratones deficientes en células B de no respondedores a respondedores a los péptidos amiloidogénicos. Un punto importante fue que la transferencia de los linfocitos B-1a solos no redujo los signos paralíticos de EAE. Los signos se redujeron solo después de la inyección de las fibrillas, que se demostró que activan la población transferida.
Una vez activados, tanto los linfocitos B-1a como los LPM dejan el peritoneo, pero sus patrones de tráfico son menos claros. Estudios previos establecieron que la activación de LPS de linfocitos B-1a dieron lugar al tráfico desde el peritoneo al bazo. Tedder y sus colegas han demostrado la activación de una población esplénica de células B reguladoras que migran a los ganglios linfáticos de drenaje. Usando la medición en tiempo real del tráfico de linfocitos B-1a luminiscentes transferidos adoptivamente y LPM, reveló que la activación con las fibrillas amiloides dio lugar a la migración a los ganglios linfáticos inguinales. Los estudios de citometría de flujo con ratones reporteros de IL-10 apoyaron tanto el tiempo como la ubicación del tráfico.
En el caso de una inyección intraperitoneal, se esperaría que la activación de las células peritoneales preceda a cualquier actividad biológica estimulada por las fibrillas en suero y, en consecuencia, debería contribuir a un mayor porcentaje de la respuesta. El modo de acción propuesto es consistente con la farmacocinética y farmacodinámica relativamente largas de los péptidos amiloidogénicos. Las propias fibrillas tendrán una vida media esperada medida en minutos. Sin embargo, las fibrillas activan un conjunto de células peritoneales, que son los agentes terapéuticos y migran a los órganos linfáticos secundarios, donde secretan IL-10 inmunosupresoras. Las células no parecen circular hacia los sitios de inflamación en la columna y el cerebro en ratones con EAE y no cruzan la barrera hematoencefálica, lo cual es consistente con la escasez documentada de linfocitos B en las lesiones de EAE. El destino de los linfocitos B-1a activados y los LPM refleja la farmacodinámica de la terapia y no el destino de los péptidos amiloidogénicos. De forma similar, en la farmacocinética de la respuesta, el retraso de uno o dos días en la reducción de los signos paralíticos tras la inyección de las fibrillas refleja el tiempo necesario para la activación y migración de las células peritoneales, combinado con la inmunosupresión de un porcentaje suficientemente grande de los linfocitos T inflamatorios. Recíprocamente, el cese de la terapia da como resultado un retraso de 24 a 72 horas en la reaparición de los signos paralíticos, lo cual es consistente con la vida media de la inmunosupresión inducida por las células productoras de IL-10, y no con la vida media de las fibrillas. En muchos aspectos, los efectos terapéuticos de las fibrillas se asemejan a la farmacocinética de la terapia celular adoptiva más que a la terapéutica clásica de moléculas pequeñas. El mecanismo propuesto de migración de las células inmunosupresoras a los órganos linfáticos secundarios, donde suprimen tanto las células presentadoras de antígenos inflamatorios circulantes como los linfocitos T, es consistente con los estudios publicados sobre células B reguladoras (Baumgarth N, Waffarn EE y Nguyen TT (2015) Annals of the New York Academy of Sciences; Bouaziz JD, Yanaba K y Tedder TF (2008) Immunological Reviews 224: 201-214). El mecanismo también sostiene que este enfoque terapéutico podría ser beneficioso en una serie de indicaciones inflamatorias sistémicas.
Las fibrillas inducen una respuesta inflamatoria concomitante, más evidentemente en los SPM, con la inducción de IL-1p, TNF, y IL-6. El motivo por el cual esta respuesta no domina los efectos inmunosupresores puede explicarse mejor por el gran exceso de LPM y linfocitos B-1a y su mayor propensión a salir rápidamente del peritoneo a los tejidos linfoides secundarios.
La terapia eficaz con la administración en las vías respiratorias de las fibrillas va bien para la traducción a la terapia humana, en particular a la luz de la predominancia de linfocitos B-1a en la cavidad pleural.
Los péptidos amiloidogénicos descritos en el presente documento son los primeros agentes terapéuticos que reconocen células B de regulación. La extensa lista de indicaciones en las que esta población de células limita la inflamación respalda el potencial de la estrategia de usar las fibrillas amiloides en un espectro de afecciones con componentes inflamatorios o autoinmunitarios.
Tal como entenderá un experto en la técnica, cada realización descrita en el presente documento puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en su elemento, etapa, ingrediente o componente particular indicado. Por lo tanto, los términos "incluir" o "que incluye" deben interpretarse como si mencionan: "comprenden, consisten en o consisten esencialmente en". El término transitorio "comprende" o "comprenden" significa que incluye, pero no se limita a, y permite la inclusión de elementos, etapas, ingredientes o componentes no especificados, incluso en cantidades importantes. La frase transitoria "consistente en" excluye cualquier elemento, etapa, ingrediente o componente no especificado. La frase de transición "que consiste esencialmente en" limita el alcance de la realización a los elementos, etapas, ingredientes o componentes y aquellos que no afecten materialmente a la realización. Un efecto material causaría una reducción estadísticamente significativa en la efectividad en el modelo animal EAE de EM.
A menos que se indique lo contrario, todos los números que expresan cantidades de ingredientes, propiedades, tales como peso molecular, condiciones de reacción, etc., usados en la memoria descriptiva y las reivindicaciones deben entenderse como modificados en todos los casos por el término "aproximadamente". Por consiguiente, a menos que se indique lo contrario, los parámetros numéricos establecidos en la memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas son aproximaciones que pueden variar dependiendo de las propiedades deseadas que se pretenden obtener mediante la presente invención. Como mínimo, cada parámetro numérico debe interpretarse al menos a la luz del número de dígitos significativos descritos y aplicando técnicas de redondeo ordinarias. Cuando se requiere mayor claridad, el término "aproximadamente" tiene el significado que le atribuye un experto en la técnica cuando se usa junto con un valor numérico o intervalo establecido, es decir, que denota algo más o algo menos que el valor o intervalo establecido, dentro de un intervalo de ± 20 % del valor indicado; ± 19 % del valor indicado; ± 18 % del valor indicado; ± 17 % del valor indicado; ± 16 % del valor indicado; ± 15 % del valor indicado; ± 14 % del valor indicado; ± 13 % del valor indicado; ± 12 % del valor indicado; ± 11 % del valor indicado; ± 10 % del valor indicado; ± 9 % del valor indicado; ± 8 % del valor indicado; ± 7 % del valor indicado; ± 6 % del valor indicado; ± 5% del valor indicado; ± 4% del valor indicado; ± 3% del valor indicado; ± 2% del valor indicado; o ± 1% del valor indicado.
A pesar de que los intervalos y parámetros numéricos que exponen el amplio alcance de la invención son aproximaciones, los valores numéricos expuestos en los ejemplos específicos se indican con la mayor precisión posible. Sin embargo, cualquier valor numérico contiene inherentemente ciertos errores que resultan necesariamente de la desviación estándar encontrada en sus respectivas mediciones de prueba.
Los términos "un", "una", "el/la" y referencias similares utilizadas en el contexto de la descripción de la invención (especialmente en el contexto de las siguientes reivindicaciones) deben interpretarse que cubren tanto el singular como el plural, a menos que se indique lo contrario en el presente documento o se contradiga claramente por el contexto. La mención de intervalos de valores en el presente documento pretende simplemente servir como un procedimiento abreviado para hacer referencia individualmente a cada valor separado que se encuentre dentro del intervalo. A menos que se indique lo contrario en el presente documento, cada valor individual se incorpora en la memoria descriptiva como si se mencionara individualmente en el presente documento. Todos los procedimientos descritos en el presente documento pueden realizarse en cualquier orden adecuado a menos que se indique lo

Claims (8)

REIVINDICACIONES
1. Formulación que comprende una fibrilla o un péptido formador de fibrillas, en la que la fibrilla o el péptido formador de fibrillas es la SEQ ID NO: 1053, para su uso en un procedimiento de activación de linfocitos B-1a para tratar una afección inflamatoria o autoinmune en un sujeto que la encesite, en la que la afección inflamatoria o autoinmune comprende esclerosis múltiple, artritis reumatoide, artritis, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) o enfermedad alérgica de las vías respiratorias, que comprende:
administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la formulación al tracto respiratorio del sujeto que la necesite, activando de este modo los linfocitos B-1a y tratando la afección inflamatoria o autoinmune en el sujeto que lo necesite.
2. Formulación para su uso, según la reivindicación 1, en la que la administración al tracto respiratorio es a la región alveolar del pulmón.
3. Formulación para su uso, según la reivindicación 1, en la que la formulación comprende además un agente mucoactivo o mucolítico.
4. Formulación para su uso, según la reivindicación 1, en la que la formulación es una formulación de polvo seco.
5. Formulación para su uso, según la reivindicación 1, en la que la formulación comprende además un agente conductor, en la que el agente conductor es una solución salina hipertónica.
6. Formulación para su uso, según la reivindicación 1, en la que dicha activación de linfocitos B-1a se produce en la cavidad pleural.
7. Formulación conductora que comprende una fibrilla o péptido formador de fibrillas, en la que la fibrilla o el péptido formador de fibrillas es la SEQ ID NO: 1053, y un agente conductor, en la que el agente conductor es una solución salina hipertónica.
8. Formulación conductora, según la reivindicación 7, que comprende además un agente mucoactivo o mucolítico.
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