ES2864584T3 - Procedimiento de fermentación - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para la expresión periplásmica de un toxoide bacteriano que comprende las etapas de: a) hacer crecer un cultivo de una célula huésped gramnegativa en un medio de fermentación, en el que la célula huésped se transforma con un polinucleótido, y en el que el polinucleótido codifica el toxoide bacteriano y una secuencia señal periplásmica; a(i)) inducir la expresión del toxoide bacteriano; b) dejar madurar la célula huésped, en el que la etapa de maduración comprende: I) someter la célula huésped a un shock de pH; II) incubar la célula huésped sin adición de alimentación; o III) someter la célula huésped a una temperatura por debajo de -20 °C; y c) extraer el toxoide bacteriano de la célula huésped en el que el procedimiento de extracción comprende un shock osmótico en el que la célula huésped gramnegativa se selecciona del grupo que consiste en E. coli, Pseudomonas y Moraxella, en el que la célula huésped está viva durante la etapa b) y en el que el procedimiento se lleva a cabo en un fermentador que contiene 10-5000 litros de cultivo.
Description
d e s c r ip c ió n
Procedimiento de fermentación
Antecedentes
Se sabe que la expresión de ciertas toxinas es un desafío, por ejemplo, la toxina diftérica. La DT se puede producir mediante la purificación de la toxina a partir de un cultivo de Corynebacterium diphtheriae seguido de desintoxicación química, o se puede producir mediante la purificación de un análogo recombinante o genéticamente detoxificado de la toxina (por ejemplo, CRM197, u otra mutantes como se describe en los documentos US4.709.107, US5.846.711, US5.601.827 y US5.917.017).
La producción de cantidades significativas de toxinas diftéricas tales como CRM197 para su uso en vacunas ha estado obstaculizada debido a la baja abundancia de proteínas. Este problema se ha abordado previamente mediante la expresión de CRM197 en E. coli (Bishai et al J. Bacteriol. 169: 5140-5151), Bishai et al describe la expresión de una proteína de fusión recombinante que contiene toxina diftérica (que incluye la secuencia señal de tox) condujo a la producción de proteína degradada.
La clonación de fragmentos de difteria que contienen la secuencia señal tox y la expresión de estas secuencias en Escherichia coli implica ciertas dificultades. La proteína expresada se secreta en el espacio periplásmico y esta secreción se asocia con una disminuida viabilidad de las células huésped (O'Keefe et al Proc. Nati, Acad. Scí. 86: 343-346) y un aumento de la proteólisis de la proteína recombinante (Bishai et al., J. Bacteriol. 169: 5140-5151). Por estos motivos, se ha sugerido la eliminación de la secuencia señal de toxina para que la expresión ya no sea periplásmica, lo que puede aumentar la expresión de toxoides diftéricos (Bishai et al).
Los documentos PCT/EP2010/065047 (WO 2011/042516) divulgan, por primera vez, la expresión periplásmica exitosa de CRM197. Esto aumenta el rendimiento de CRM197, sin embargo, incluso aquí se pueden realizar mejoras en el procedimiento de extracción para aumentar el rendimiento. Rathore describe la optimización de un procedimiento de shock osmótico para el aislamiento de un producto proteico expresado en E. coli (Rathore et al Biotechnol.Prog. 2003, 19, 1541-1546). Bochner et al también describen un procedimiento para recuperar proteína periplásmica de una célula huésped (US4680262).
Por tanto, la presente invención proporciona un procedimiento mejorado para la producción de un polipéptido recombinante que comprende una etapa de maduración de la célula huésped, en el que esta etapa puede comprender uno cualquiera o más de los siguientes:
(1) someter la célula huésped a un shock de pH;
(2) incubar la célula huésped sin adición de alimentación; o
(3) congelar la célula huésped a una temperatura por debajo de -20 °C.
Esta etapa de maduración de la célula huésped tiene el sorprendente resultado de aumentar sustancialmente la eficiencia de la extracción de proteínas. El documento W02005/019466 divulga procedimientos para la preparación de un polipéptido recombinante por fermentación usando un sistema de expresión recombinante capaz de efectuar la secreción del polipéptido en el periplasma, pero no contiene descripción de estas etapas de maduración.
Breve sumario
En una primera realización se proporciona un procedimiento para la expresión periplásmica de un toxoide bacteriano que comprende las etapas de:
a) hacer crecer un cultivo de una célula huésped gramnegativa en un medio de fermentación, en el que la célula huésped se transforma con un polinucleótido, y en el que el polinucleótido codifica el toxoide bacteriano y una secuencia señal periplásmica;
a(i)) inducir la expresión del toxoide bacteriano;
b) dejar madurar la célula huésped, en el que la etapa de maduración comprende:
I) someter la célula huésped a un shock de pH;
II) incubar la célula huésped sin adición de alimentación; y/o
III) someter la célula huésped a una temperatura por debajo de -20 °C; y
c) extraer el toxoide bacteriano de la célula huésped en el que el procedimiento de extracción comprende shock osmótico.
En una segunda realización se proporciona un procedimiento para la expresión periplásmica de un toxoide bacteriano
que comprende las etapas de:
a) proporcionar una célula huésped gramnegativa que comprende el toxoide bacteriano expresado en el periplasma;
b) dejar madurar la célula huésped, en el que la etapa de maduración comprende:
I) someter la célula huésped a un shock de pH;
II) incubar la célula huésped sin adición de alimentación; y/o
III) someter la célula huésped a una temperatura por debajo de -20 °C; y
c) extraer el toxoide bacteriano de la célula huésped en el que el procedimiento de extracción comprende shock osmótico.
También se describe un toxoide bacteriano que se puede obtener o se obtiene mediante el procedimiento de la invención.
También se describe una composición inmunogénica que comprende el toxoide bacteriano de la invención y un excipiente aceptable para uso farmacéutico.
También se describe una vacuna que comprende la composición inmunogénica.
También se describe el uso de la composición inmunogénica o la vacuna en la fabricación de un medicamento para la prevención o tratamiento de una enfermedad.
También se describe un procedimiento de prevención o tratamiento de una enfermedad que comprende administrar la composición inmunogénica o vacuna a un paciente.
Breve descripción de Ios dibujos
FIG. 1 - Representación de un perfil de fermentación con los parámetros del procedimiento controlados durante la fermentación alimentada por lote a escala de 20 litros. La línea 1 describe la cantidad de sustrato agregado (gramos), la línea 2 describe el pH, la línea 3 describe la tasa de agitación (rpm), la línea 4 describe la p02 (%), la línea 5 describe la temperatura (°C) y la línea 6 describe la cantidad de base agregada (gramos)
FIG,2 - Representación de la producción de CRM197 en las fracciones periplásmicas y asociadas a células en función de la tasa de alimentación y el pH durante la inducción, para el cultivo realizado a pH 6,8. El panel de la izquierda muestra la producción periplásmica de CRM197. El panel de la derecha describe la producción de CRM197 asociada a células.
FIG.3 - Representación de un perfil de fermentación con los parámetros del procedimiento controlados durante la fermentación por lote alimentado de escala de 20 litros. La línea 1 describe la cantidad de sustrato agregado (gramos), la línea 2 describe el pH, la línea 3 describe la tasa de agitación (rpm), la línea 4 describe la p02 (%), la línea 5 describe la temperatura (°C) y la línea 6 describe la cantidad de base agregada (gramos). La flecha indica el inicio de la etapa de maduración. La etapa de maduración se amplía en el panel derecho.
FIG. 4 - listados de secuencias de polinucleótidos y polipéptidos de la invención
Descripción detallada
La presente invención proporciona un procedimiento para la expresión periplásmica de un toxoide bacteriano que comprende las etapas de:
a) hacer crecer un cultivo de una célula huésped gramnegativa en un medio de fermentación, en el que la célula huésped se transforma con un polinucleótido, y en el que el polinucleótido codifica el toxoide bacteriano y una secuencia señal periplásmica;
a(i)) inducir la expresión del toxoide bacteriano;
b) dejar madurar la célula huésped, en el que la etapa de maduración comprende:
I) someter la célula huésped a un shock de pH;
II) incubar la célula huésped sin adición de alimentación; y/o
III) someter la célula huésped a una temperatura por debajo de -20 °C; y
c) extraer el toxoide bacteriano de la célula huésped en el que el procedimiento de extracción comprende shock
osmótico.
En una realización adicional se proporciona a procedimiento para la expresión periplásmica de un toxoide bacteriano que comprende las etapas de:
a) proporcionar una célula huésped gramnegativa que comprende el toxoide bacteriano expresado en el periplasma;
b) dejar madurar la célula huésped, en el que la etapa de maduración comprende:
I) someter la célula huésped a un shock de pH;
II) incubar la célula huésped sin adición de alimentación; y/o
III) someter la célula huésped a una temperatura por debajo de -20 °C; y
c) extraer el toxoide bacteriano de la célula huésped en el que el procedimiento de extracción comprende shock osmótico.
El periplasma es el espacio entre la membrana citoplasmática y la membrana externa en las bacterias gramnegativas. El término "expresión periplásmica" se refiere a la expresión/producción de una proteína (tal como el toxoide bacteriano) dentro de una célula huésped y su secreción en el espacio periplásmico de la célula huésped. La expresión periplasmática se logra de forma adecuada usando una secuencia señal que es capaz de dirigir una proteína expresada al periplasma. Normalmente al menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 1o0% del polipéptido de interés se dirige al periplasma cuando se expresa en una bacteria gramnegativa con una secuencia señal periplásmica.
Un ácido nucleico "recombinante" es uno que tiene una secuencia que no se produce de forma natural o tiene una secuencia que se produce mediante una combinación artificial de dos segmentos de secuencia separados de otro modo. Esta combinación artificial se puede lograr mediante síntesis química o, más comúnmente, mediante la manipulación artificial de segmentos aislados de ácidos nucleicos, por ejemplo, mediante técnicas de ingeniería genética. Una proteína "recombinante" es una que está codificada por un ácido nucleico heterólogo (por ejemplo, recombinante), que se ha introducido en una célula huésped, tal como una célula bacteriana o eucariota. El ácido nucleico se puede introducir en un vector de expresión que tiene señales capaces de expresar la proteína codificada por el ácido nucleico introducido o el ácido nucleico se puede integrar en el cromosoma de la célula huésped.
El término “maduración de la célula huésped” se refiere a un procedimiento que se lleva a cabo antes de la etapa c) y aumenta la eficiencia con la que un polipéptido recombinante tal como el toxoide bacteriano se libera de la célula huésped o periplasma. La eficiencia de liberación del polipéptido recombinante del periplasma se puede determinar de varias formas. Por ejemplo mediante la medición de la cantidad del polipéptido recombinante que se libera del periplasma después del shock osmótico, y la cantidad del polipéptido recombinante que permanece asociado a la célula después de este shock osmótico, esto se puede usar para calcular la cantidad total de polipéptido de interés producido (citoplasmático y periplásmico). La cantidad de polipéptido restante que permanece en la célula asociado después del shock osmótico se puede determinar mediante la medición del nivel de proteína después de la ruptura celular usando una prensa francesa. Para calcular si ha aumentado la eficiencia con la que se libera el polipéptido recombinante del periplasma, se puede medir el porcentaje del polipéptido de interés que se libera del periplasma después de realizar el procedimiento con y sin la etapa de maduración, y se comparan los porcentajes.
Se proporcionan ejemplos de etapas que son capaces de dejar madurar la célula huésped e incluyen
(1) someter la célula huésped a un shock de pH
(2) incubar la célula huésped, sin la adición de alimentación, durante al menos 5 minutos, al menos 10 minutos, al menos 30 minutos, al menos 1 hora o al menos 2 horas a una temperatura mayor de 0 °C, mayor de 10 °C mayor de 20 °C o mayor de 23 °C.
(3) someter la célula huésped a una temperatura por debajo de -20 °C durante al menos 1 hora, 2 horas, 5 horas, 12 horas, 24 horas, 1 día, 2 días o 5 días.
La etapa b) del procedimiento para la expresión periplásmica de un toxoide bacteriano puede comprender cualquiera de estas etapas, o dos o tres de estas etapas en combinación.
La frase "extraer una proteína recombinante de la célula huésped" se refiere a cualquier procedimiento capaz de liberar una proteína recombinante (tal como un toxoide bacteriano) de la célula huésped, típicamente proteína recombinante presente en el periplasma. La frase "extraer el toxoide bacteriano de la célula huésped" se refiere a cualquier procedimiento capaz de liberar un toxoide bacteriano de la célula huésped, típicamente toxoide bacteriano presente en el periplasma. Tales técnicas son bien conocidas por el experto en la materia e incluyen, por ejemplo, procedimientos de shock osmótico o enzimáticos. Opcionalmente, el procedimiento enzimático comprende el uso de digestión con lisozima, zimolasa o lisostafina.
La frase “secuencia señal periplásmica” se refiere a una secuencia señal que es capaz de dirigir una proteína expresada (tal como un toxoide bacteriano) al periplasma, esto puede ocurrir durante la traducción (secuencias señal co-traduccionales) o después de la traducción (secuencias señal post-traduccionales). Una secuencia señal es capaz de dirigir una proteína expresada al periplasma si, cuando está unida a un polipéptido de interés, durante o después de la traducción del polipéptido en una bacteria gramnegativa, se encuentra más de dicho polipéptido en el periplasma de un bacterias gramnegativas que en ausencia de la secuencia señal. En una realización, al menos 50, 60, 70, 80, 90 o 100% del polipéptido de interés se dirige al periplasma cuando se expresa en una bacteria gramnegativa tal como E. coIÍ. Se puede llevar a cabo un ensayo para probar si una secuencia señal es capaz de dirigir la expresión periplásmica usando proteínas informadoras. Por ejemplo, se puede insertar una secuencia señal periplásmica corriente arriba de un gen que codifica una proteína verde fluorescente, esta proteína se puede expresar en una célula huésped. Se puede usar un microscopio para juzgar los niveles comparativos de la proteína verde fluorescente en el citoplasma y el periplasma. En algunas realizaciones, la proteína recombinante se puede secretar.
El polinucleótido codifica una secuencia señal periplásmica operativamente unida una secuencia que codifica un toxoide bacteriano.
En una realización, el procedimiento comprende además una etapa a (i)) de inducción de la expresión del toxoide bacteriano. El término "inducir la expresión de la proteína" se refiere a un procedimiento de adición de un agente inductor tal como IPTG (isopropilp-D-l-tiogalactopiranósido) al cultivo, o la modificación de la temperatura del cultivo, lo que provoca la expresión del polipéptido en una tasa aumentada. El término "inducir la expresión de la proteína" abarca además la incubación del cultivo en condiciones adecuadas para permitir que la expresión tenga lugar durante un determinado período de tiempo antes de la siguiente etapa del procedimiento. El período de tiempo completo necesario tanto para iniciar la expresión (mediante la adición de un agente inductor o cambio de temperatura) como para permitir que tenga lugar la expresión (incubación en condiciones adecuadas) se denomina en la presente memoria "fase de inducción". De acuerdo con una realización de la invención, la fase de inducción puede durar de 5 minutos a 72 horas, de 30 minutos a 48 horas, de 1 a 36 horas, de 6 a 26 horas o de 12 a 24 horas, por ejemplo aproximadamente 6, 12, 18, 24, 26, 36, 48 o 72 horas. De acuerdo con un aspecto de la invención, la etapa a(i)) de inducción de la expresión del toxoide bacteriano tiene lugar después de la etapa a) y antes de la etapa b), y se denomina de aquí en adelante etapa a(i)).
En una realización, la etapa b) comprende someter la célula huésped a un shock de pH. Para los propósitos de la invención, la frase “someter la célula huésped a un shock de pH” se refiere a aumentar o disminuir el pH del medio de fermentación. El shock de pH se puede realizar en células huéspedes que se han concentrado mediante, por ejemplo, centrifugación. El shock de pH se puede realizar mediante la adición de ácido o base a la solución en la que está suspendida la célula huésped.
En una realización el shock de pH comprende cambiar el pH del medio de fermentación en más de 0,2 unidades de pH, más de 0,3 unidades de pH, más de 0,4 unidades de pH, más de 0,5 unidades de pH o más de 0,6 unidades de pH. En general, “cambiar el pH del medio de fermentación” comprende aumentar o disminuir el pH del medio de fermentación y esto se puede realizar mediante la adición de componentes al medio de fermentación, por ejemplo, adición de un ácido o una base al medio de fermentación.
En una realización el shock de pH comprende aumentar el pH del medio de fermentación en más de 0,2 unidades de pH, más de 0,3 unidades de pH, más de 0,4 unidades de pH, más de 0,5 unidades de pH o más de 0,6 unidades de pH. Esto se puede realizar, por ejemplo, mediante la adición un agente alcalinizante tal como una base del medio de fermentación.
En una realización el shock de pH comprende disminuir el pH del medio de fermentación en más de 0,2 unidades de pH, más de 0,3 unidades de pH, más de 0,4 unidades de pH, más de 0,5 unidades de pH o más de 0,6 unidades de pH. Esto se puede realizar por ejemplo mediante la adición un agente acidificante tal como un ácido al medio de fermentación.
En una realización adicional el shock de pH comprende cambiar el pH del medio de fermentación entre 0,1 y 2,0 unidades de pH, entre 0,1 y 2,0 unidades de pH, entre 0,1 y 1,5 unidades de pH, entre 0,2 y 2,0 unidades de pH, entre 0,2 y 1,5 unidades de pH, entre 0,2 y 1,0 unidades de pH, entre 0,5 y 2,0 unidades de pH, entre 0,5 y 1,5 unidades de pH, entre 0,5 y 2,0 unidades de pH o entre 0,7 y 1,5 unidades de pH.
En una realización adicional el shock de pH comprende aumentar el pH del medio de fermentación entre 0,1 y 2,0 unidades de pH, entre 0,1 y 2,0 unidades de pH, entre 0,1 y 1,5 unidades de pH, entre 0,2 y 2,0 unidades de pH, entre 0,2 y 1,5 unidades de pH, entre 0,2 y 1,0 unidades de pH, entre 0,5 y 2,0 unidades de pH, entre 0,5 y 1,5 unidades de pH, entre 0,5 y 2,0 unidades de pH o entre 0,7 y 1,5 unidades de pH.
En una realización adicional el shock de pH comprende disminuir el pH del medio de fermentación entre y 2,0 unidades de pH, entre 0,1 y 2,0 unidades de pH, entre 0,1 y 1,5 unidades de pH, entre 0,2 y 2,0 unidades de pH, entre y 1,5 unidades de pH, entre 0,2 y 1,0 unidades de pH, entre 0,5 y 2,0 unidades de pH, entre 0,5 y 1,5 unidades de pH, entre 0,5 y 2,0 unidades de pH o entre 0,7 y 1,5 unidades de pH.
En una realización el shock de pH se obtiene mediante la adición de una base. En una realización, la base se
selecciona del grupo que consiste en hidróxido de sodio, hidróxido de amonio, carbonato de sodio, fosfato de sodio y bicarbonato de sodio. En una realización adicional la base es hidróxido de amonio (NH4OH) o hidróxido de sodio (NaOH). En una realización adicional la base es hidróxido de amonio. En una realización adicional la base es hidróxido de sodio.
En una realización el shock de pH se obtiene mediante la adición de un ácido. En una realización del ácido se selecciona del grupo que consiste en ácido clorhídrico, ácido sulfúrico, ácido carbónico, ácido fosfórico, ácido acético y ácido láctico. En una realización el ácido es ácido fosfórico (H3PO4).
En una realización la etapa b) comprende una etapa de incubación en el que la etapa de incubación comprende incubar la célula huésped durante al menos 5 minutos, al menos 10 minutos, al menos 30 minutos, al menos 1 hora o al menos 2 horas a una temperatura mayor de 0 °C, mayor de 5 °C, mayor de 10 °C, mayor de 15 °C, mayor de 20 °C o mayor de 23 °C. En una realización la etapa de incubación comprende incubar la célula huésped a una temperatura entre 10 °C-50 °C, 15 °C-45 °C, 20 °C-40 °C, 22 °C- 38 °C, 15 °C-50 °C, 15 °C-40 °C, 20 °C-38 °C, 20 °C-50 °C 22 °C-50 °C, 22 °C-45 °C 22 °C-40 °C, 23 °C-50 °C, 23 °C-45 °C, 23 °C- 40 °C, 23 °C-38 °C, 23 °C-30 °C, 25 °C-,50 °C, 25 °C,-45 °C, 25 °C-40 °C, 25 °C-38 °C, 25 °C-30 °C.
En una realización la etapa de incubación comprende incubar la célula huésped a una temperatura alrededor de 23 °C o alrededor de 37 °C.
En una realización la etapa de incubación comprende incubar la célula huésped durante al menos 5 minutos, al menos 7 minutos, al menos 10 minutos, al menos 15 minutos, al menos 30 minutos, al menos 1 hora, al menos 90 minutos, al menos 2 horas, al menos 3 horas, al menos 5 horas, al menos 24 horas o al menos 2 días. En una realización adicional la etapa de incubación comprende incubar la célula huésped durante entre 5 minutos y dos años, entre 5 minutos y un año, entre 5 minutos y 6 meses, entre 5 minutos y 3 meses, entre 5 minutos y un mes, entre 5 minutos y 2 semanas, entre 5 minutos y una semana, entre 5 minutos y 24 horas, entre 5 minutos y 12 horas, entre 5 minutos y 6 horas, entre 5 minutos y 3 horas, entre 5 minutos y 2 horas, entre 5 minutos y 1 hora, entre 5 minutos y 30 minutos entre 5 minutos y 15 minutos, entre 10 minutos y un año, entre 10 minutos y 6 meses, entre 10 minutos y 3 meses, entre 10 minutos y un mes, entre 10 minutos y 2 semanas, entre 10 minutos y una semana, entre 10 minutos y 24 horas, entre 10 minutos y 12 horas, entre 10 minutos y 6 horas, entre 10 minutos y 3 horas, entre 10 minutos y 2 horas, entre 10 minutos y 1 hora, entre 10 minutos y 30 minutos entre 10 minutos y 15 minutos, entre 30 minutos y un año, entre 30 minutos y 6 meses, entre 30 minutos y 3 meses, entre 30 minutos y un mes, entre 30 minutos y 2 semanas, entre 30 minutos y una semana, entre 30 minutos y 24 horas, entre 30 minutos y 12 horas, entre 30 minutos y 6 horas, entre 30 minutos y 3 horas, entre 30 minutos y 2 horas, entre 30 minutos y 1 hora, entre 1 hora y un año, entre 1 hora y 6 meses, entre 1 hora y 3 meses, entre 1 hora y un mes, entre 1 hora y 2 semanas, entre 1 hora y una semana, entre 1 hora y 24 horas, entre 1 hora y 12 horas, entre 1 hora y 6 horas, entre 1 hora y 3 horas o entre 1 hora y 2 horas.
En una realización la tasa de alimentación durante la etapa de incubación es menor que la tasa de alimentación durante la etapa a). La tasa de alimentación (o tasa de provisión de sustrato) es la tasa de adición de sustrato (ml min-1) en la que el sustrato comprende la fuente de alimentación para la célula huésped cultivada. En la presente memoria se describen las tasas de alimentación durante la etapa de incubación por debajo de 75%, 50%, 35%, 25%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% o 1% de la tasa de alimentación usada en la etapa a). En una realización adicional, no existe adición de alimentación durante la etapa de incubación, en general esto significa que no se agrega sustrato durante la etapa de incubación.
En una realización el pH del medio de cultivo se deja fluctuar durante la etapa de incubación. En una realización el pH se altera en alrededor de 0,1 unidades. En una realización adicional no existe control de pH durante la etapa de incubación. Esto significa que no se agrega ácido o base adicional durante la etapa de incubación a fin de mantener un pH constante.
En una realización adicional la etapa b) comprende someter la célula huésped a una temperatura por debajo de -20 °C durante al menos 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 5 horas, 12 horas, 24 horas, 1 día, 3 días, 4 días, 5 días, 15 días, 1 mes, 6 meses, 12 meses, 1 año o 2 años. En una realización la célula huésped se somete a una temperatura por debajo de -20 °C, -40 °C, -60 °C,-70 °C o -80 °C. En una realización adicional, la célula huésped se somete a una temperatura de -20 a -80 °C, o de -25 a -80 °C, por ejemplo una temperatura de aproximadamente -22 °C, -25 °C, -30 °C, -40 °C, -50 °C, -60 °C, -70 °C o -80 °C. En una realización la célula huésped se somete a una temperatura por debajo de -20 °C durante entre 5 minutos y 10 años, 15 minutos y 10 años, 40 minutos y 10 años, 1 hora y 10 años, 15 minutos y 5 años, 30 minutos y 5 años, 1 hora y 5 años, 15 minutos y 3 años, 30 minutos y 3 años, 1 hora y 3 años, 15 minutos y 2 años, 30 minutos y 2 años, 1 hora y 2 años, 15 minutos y 1 año, 30 minutos y 1 año, 1 hora y 1 año, 1 hora y 15 días, 2 horas y 10 días, 12 horas y 7 días o 2 y 5 días, por ejemplo aproximadamente 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 5 horas, 12 horas, 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 10 días, 15 días, 1 mes, 6 meses o 12 meses.
En una realización adicional la etapa b) comprende congelar la célula huésped a una temperatura por debajo de -20 °C durante al menos 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 3 horas, 5 horas, 12 horas, 24 horas, 1 día, 2 días, 5 días 15 días, 1 mes, 3 meses, 6 meses, 1 año, 2 años, 5 años o 10 años. En una realización adicional la etapa b) comprende congelar la célula huésped durante entre 5 minutos y 10 años, entre 5 minutos y 5 años, entre 5 minutos y 2 años, entre 30
minutos y 10 años, entre 30 minutos y 5 años, entre 30 minutos y 2 años, entre 1 hora y 10 años, entre 1 hora y 5 años o entre 1 hora y 2 años. El término "congelar" se refiere a exponer la célula huésped a una temperatura por debajo de 0 °C. En una realización adicional etapa c) comprende congelar la célula huésped a una temperatura por debajo de -20 °C, -30 °C, -40 °C,- 50 °C, -70 °C o -80 °C. Congelar la célula huésped puede generar la producción de cristales de hielo, sin embargo, bajar la temperatura de la célula huésped por debajo de 0 °C sin generar la producción de cristales de hielo también se considera que es “congelar la célula huésped”.
En una realización la etapa b) además comprende descongelar las células. El término "descongelar las células" se refiere a elevar la temperatura de la célula huésped por encima de 0 °C, 10 °C o 20 °C. En general, la "descongelación de las células" se producirá después de que las células se han congelado, pero antes de la etapa c).
En una realización la etapa b) comprende someter la célula huésped a un shock de pH seguido por una etapa de incubación en el que la etapa de incubación comprende incubar la célula huésped durante al menos 5 minutos, al menos 10 minutos, al menos 30 minutos, al menos 1 hora o al menos 2 horas a una temperatura mayor de 0 °C, mayor de 10 °C o mayor de 20 °C.
En una realización adicional la etapa b) comprende una etapa de incubación en el que la etapa de incubación comprende incubar la célula huésped durante al menos 5 minutos, al menos 10 minutos, al menos 30 minutos, al menos 1 hora o al menos 2 horas a una temperatura mayor de 0 °C, mayor de 10 °C o mayor de 20 °C, seguido por el sometimiento de la célula huésped a un shock de pH.
En una realización adicional la etapa b) comprende una etapa de incubación en el que la etapa de incubación comprende incubar la célula huésped durante al menos 5 minutos, al menos 10 minutos, al menos 30 minutos, al menos 1 hora o al menos 2 horas a una temperatura mayor de 0 °C, mayor de 10 °C o mayor de 20 °C seguido por la congelación de la célula huésped durante al menos 1 hora, 2 horas, 5 horas, 12 horas, 24 horas, 1 día, 2 días o 4 días.
En una realización adicional la etapa b) comprende someter la célula huésped un shock de pH seguido por la congelación de la célula huésped durante al menos 1 hora, 2 horas, 5 horas, 12 horas, 24 horas, 1 día, 2 días o 4 días.
En una realización adicional la etapa b) comprende someter la célula huésped a un shock de pH seguido por una etapa de incubación en el que la etapa de incubación comprende incubar la célula huésped durante al menos 5 minutos, al menos 10 minutos, al menos 30 minutos, al menos 1 hora o al menos 2 horas a una temperatura mayor de 0 °C, mayor de 10 °C o mayor de 20 °C seguido por la congelación de la célula huésped durante al menos 1 hora, 2 horas, 5 horas, 12 horas, 24 horas, 1 día, 2 días o 4 días.
En una realización adicional la etapa b) comprende una etapa de incubación en el que la etapa de incubación comprende incubar la célula huésped durante al menos 5 minutos, al menos 10 minutos, al menos 30 minutos, al menos 1 hora o al menos 2 horas a una temperatura mayor de 0 °C, mayor de 10 °C o mayor de 200C, seguido por el sometimiento de la célula huésped a un shock de pH seguido por la congelación de la célula huésped durante al menos 1 hora, 2 horas, 5 horas, l2 horas, 24 horas, 1 día, 2 días o 4 días.
La etapa b) se puede realizar directamente en las células dentro del caldo completo (el producto de la etapa a) y/o etapa a) ( í)), alternativamente, las células se pueden retirar del fermentador antes de la etapa b), en una realización adicional las células se retiran del fermentador y se concentran por ejemplo mediante centrifugación antes de la etapa b).
La célula huésped descrita en la presente memoria es una célula huésped gramnegativa, por ejemplo una bacteria gramnegativa, por ejemplo, del grupo que consiste en E. coIÍ, Aánetobacter, Actinobacillus, Bordetella, Brucella, Campylobacter, Cyanobacteria, Enterobacter, Erwinia, Franciscella, Helicobacter, Hemophilus, Klebsiella, Legionella, Moraxella, Neisseria, Pasteurella, Pseudomonas, Proteus, Salmonella, Serratia, Shigella, Treponema, Vibrio, y Yersinia. De acuerdo con la presente invención, la célula huésped gramnegativa se selecciona del grupo que consiste en E.coIÍ, Pseudomonas, y Moraxella. En una realización adicional la célula huésped gramnegativa es E. coIÍ.
De acuerdo con la invención la etapa c) comprende el shock osmótico.
De acuerdo con la invención, la etapa b) se realiza en células huésped vivas. Se considera que una célula huésped está "viva" si la mayoría de las células del cultivo de la célula huésped son capaces de replicarse. Los ejemplos de procedimientos que se sabe que "destruyen" células incluyen la exposición de la célula huésped al alcohol o a altas temperaturas. En una realización, la célula huésped no se somete a temperaturas mayores de 40 °C, mayores de 50 °C o mayores de 60 °C antes de la etapa b). En una realización adicional, no se agrega alcohol al cultivo de la célula huésped antes de la etapa b). El término "vivo durante la etapa b)" significa que la mayoría de las células dentro del cultivo de la célula huésped están vivas durante todo la etapa de maduración b) o una porción sustancial de la misma.
Los ejemplos de proteínas recombinantes incluyen un antígeno bacteriano, viral o cáncer, una proteína procariota. La proteína recombinante no es una hormona de crecimiento u hormona de crecimiento humano. En una realización la proteína recombinante no es CRM197. En una realización la proteína recombinante no es CRM197 y la secuencia señal periplásmica no es flgl. De acuerdo con la invención, la proteína recombinante es un toxoide bacteriano. En una realización adicional la proteína recombinante es un toxoide bacteriano derivado de C. diphtheriae, S. pneumoniae, H.
influenzae, Moraxella, N. meningitidis, S. aureus, E. faecalius, E. faecium, Salmonella, C. trachomatis, o S. epidermidis. En una realización adicional la proteína recombinante es CRM197.
En una realización la secuencia señal periplásmica es una secuencia señal heteróloga.
El término "heterólogo" se refiere a dos componentes, por ejemplo, secuencias de polipéptidos o polinucleótidos, de dos fuentes diferentes. Por ejemplo, una proteína heteróloga es una que está codificada por un polinucleótido o ácido nucleico derivado de diferentes fuentes, que comprende una combinación artificial de secuencias de polinucleótidos o ácidos nucleicos de diferentes fuentes, o una que no es nativa del tipo celular en el que se expresa. Por ejemplo, esto se refiere a una secuencia señal que normalmente no está asociada con la proteína recombinante, por ejemplo una secuencia señal que, en su estado nativo, dirige una proteína diferente al periplasma. Por ejemplo, flgl dirige la proteína flgl al periplasma en su estado nativo, por lo que se puede considerar una secuencia señal heteróloga si dirige una proteína diferente de flgl al periplasma.
En una realización la secuencia señal periplásmica comprende
a) cualquiera de las SEQ ID NÚM.: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 18, 20, 22, 24, o 26;
b) variantes de la SEQ ID NÚM.: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 18, 20, 22, 24, o 26 que contienen 1, 2, o 3 mutaciones puntuales, inserciones o supresiones; o
c) fragmentos de al menos 10 aminoácidos de la SEQ ID NÚM.: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 18, 20, 22, 24, o 26.
Opcionalmente la secuencia señal periplásmica comprende cualquiera de las SEQ ID NÚM.: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, o 26, o cualquiera de las SEQ ID NÚM.: 2, 4, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, o 26, o cualquiera de las SEQ ID NÚM.: 2, 4, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, o 24, o SEQ ID NÚM.: 24 o cualquiera de las SEQ ID NÚM.: 2, 4, o 24, o cualquiera de las SEQ ID NÚM.: 2, 10, o 24, o cualquiera de las SEQ ID NÚM.: 2, 12, o 24, o cualquiera de las SEQ ID NÚM.: 2, 14, o 24, o cualquiera de las S e Q ID NÚM.: 4, 10 o 24, o cualquiera de las S e Q ID NÚM.: 4, 12, o 24, o cualquiera de las SEQ ID NÚM.: 4, 16, o 24, o cualquiera de las SEQ ID NÚM.: 4, 18 o 24, o cualquiera de las SEQ ID NÚM.: 4, 20 o 24, o cualquiera de las SEQ ID N ú M.: 4, 22, o 24, o cualquiera de las SEQ ID NÚM.: 10, 12, o 24, o cualquiera de las SEQ ID N ú M.: 10, 14, o 24, o cualquiera de las SEQ ID N ú M.: 10, 16, o 24, o cualquiera de las SEQ ID N ú M.: 10, 18, o 24, o cualquiera de las SEQ ID N ú M.: 10, 22 o 24, o cualquiera de las SEQ ID N ú M.: 12, 14, o 24, o cualquiera de las SEQ ID N ú M.: 12, 16, o 24, o cualquiera de las SEQ ID N ú M.: 12, 18, o 24, o cualquiera de las SEQ ID N ú M.: 12, 20, o 24, o cualquiera de las SEQ ID N ú M.: 12, 22, o 24, o cualquiera de las SEQ ID N ú M.: 14, 16, o 24, o cualquiera de las SEQ ID N ú M.: 14, 18, o 24, o cualquiera de las SEQ ID N ú M.: 14, 20 o 24, o cualquiera de las SEQ ID N ú M.: 14, 22, o 24, o cualquiera de las SEQ ID N ú M.: 16, 18, o 24, o cualquiera de las SEQ ID N ú M.: 16, 20 o 24, o cualquiera de las SEQ ID N ú M.: 16, 22, o 24, o cualquiera de las SEQ ID N ú M.: 18, 20 o 24, o cualquiera de las SEQ ID NÚM. 18, 22, o 24.
En una realización adicional la secuencia señal periplásmica comprende (variantes que contienen) 1,2 o 3 mutaciones puntuales, inserciones o supresiones, de cualquiera de las SEQ ID N ú M.: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, o 26 o cualquiera de las SEQ ID N ú M.: 2, 4, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, o 26, o cualquiera de las SEQ ID N ú M.: 2, 4, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, o 24, o SEQ ID N ú M.: 24 o cualquiera de las SEQ ID N ú M.: 2, 4, o 24, o cualquiera de las SEQ ID N ú M.: 2, 10, o 24, o cualquiera de las SEQ ID N ú M.: 2, 12, o 24, o cualquiera de las SEQ ID N ú M.: 2, 14, o 24, o cualquiera de las SEQ ID NÚM.: 4, 10 o 24, o cualquiera de las SEQ ID NÚM.: 4, 12, o 24, o cualquiera de las SEQ ID NÚM.: 4, 16, o 24, o cualquiera de las SEQ ID N ú M.: 4, 18 o 24, o cualquiera de las SEQ ID N ú M.: 4, 20 o 24, o cualquiera de las SEQ ID N ú M.: 4, 22, o 24, o cualquiera de las SEQ ID N ú M.: 10, 12, o 24, o cualquiera de las SEQ ID N ú M.: 10, 14, o 24, o cualquiera de las SEQ ID N ú M.: 10, 16, o 24, o cualquiera de las SEQ ID N ú M.: 10, 18, o 24, o cualquiera de las SEQ ID N ú M.: 10, 22 o 24, o cualquiera de las SEQ ID N ú M.: 12, 14, o 24, o cualquiera de las SEQ ID N ú M.: 12, 16, o 24, o cualquiera de las SEQ ID N ú M.: 12, 18, o 24, o cualquiera de las SEQ ID N ú M.: 12, 20, o 24, o cualquiera de las SEQ ID N ú M.: 12, 22, o 24, o cualquiera de las SEQ ID N ú M.: 14, 16, o 24, o cualquiera de las SEQ ID N ú M.: 14, 18, o 24, o cualquiera de las SEQ ID N ú M.: 14, 20 o 24, o cualquiera de las SEQ ID N ú M.: 14, 22, o 24, o cualquiera de las SEQ ID NÚM.: 16, 18, o 24, o cualquiera de las SEQ ID N ú M.: 16, 20 o 24, o cualquiera de las SEQ ID N ú M.: 16, 22, o 24, o cualquiera de las SEQ ID NÚM.: 18, 20 o 24, o cualquiera de las SEQ ID N ú M.
18, 22, o 24.
En una realización adicional la secuencia señal periplásmica comprende fragmentos de al menos 10, 12, 15, 18 o 20 aminoácidos de cualquiera de la SEQ ID N ú M.: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, o 26 o cualquiera de la SEQ ID N ú M.: 2, 4, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, o 26, o cualquiera de las SEQ ID NÚM.: 2, 4, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, o 24, o SEQ ID N ú M.: 24, o cualquiera de las SEQ ID N ú M.: 2, 4, o 24, o cualquiera de las SEQ ID N ú M.: 2, 10, o 24, o cualquiera de las SEQ ID N ú M.: 2, 12, o 24, o cualquiera de las SEQ ID N ú M.: 2, 14, o 24, o cualquiera de las SEQ ID N ú M.: 4, 10 o 24, o cualquiera de las SEQ ID N ú M.: 4, 12, o 24, o cualquiera de las SEQ ID N ú M.: 4, 16, o 24, o cualquiera de las SEQ ID NÚM.: 4, 18 o 24, o cualquiera de las SEQ ID N ú M.: 4, 20 o 24, o cualquiera de las SEQ ID N ú M.: 4, 22, o 24, o cualquiera de las S e Q ID N ú M.: 10, 12, o 24, o cualquiera de las SEQ ID N ú M.: 10, 14, o 24, o cualquiera de las SEQ ID N ú M.: 10, 16, o 24, o cualquiera de las SEQ ID N ú M.: 10, 18, o 24, o cualquiera de las SEQ ID N ú M.: 10, 22 o 24, o cualquiera de las SEQ ID N ú M.: 12, 14, o 24, o cualquiera de las SEQ ID N ú M.: 12, 16, o 24, o cualquiera de las SEQ ID N ú M.: 12, 18, o 24, o cualquiera de las SEQ ID N ú M.: 12, 20, o 24, o cualquiera de las
SEQ id NÚM.: 12, 22, o 24, o cualquiera de las SEQ ID NÚM.: 14, 16, o 24, o cualquiera de las SEQ ID NÚM.: 14, 18, o 24, o cualquiera de las SEQ ID NÚM.: 14, 20 o 24, o cualquiera de las SEQ ID NÚM.: 14, 22, o 24, o cualquiera de las SEQ ID NÚM.: 16, 18, o 24, o cualquiera de las SEQ ID NÚM.: 16, 20 o 24, o cualquiera de las SEQ ID NÚM.: 16,
22, o 24, o cualquiera de las SEQ ID NÚM.: 18, 20 o 24, o cualquiera de las SEQ ID NÚM. 18, 22, o 24 que son capaces de dirigir el transporte de una proteína al periplasma bacteriano.
En una realización adicional la secuencia señal comprende SEQ ID NÚM.:24.
En una realización la secuencia señal periplásmica está codificada por cualquiera de las SEQ ID NÚM.: 1, 3, 5, 7, 9,
11, 13, 15, 17, 19, 21 o 23. En una realización adicional la secuencia señal periplásmica está codificada por la SEQ
ID NÚM.:23.
En una realización el polinucleótido comprende un promotor inducible.
En una realización la etapa b) comprende una etapa de concentración de la célula huésped por centrifugación.
Opcionalmente esto implica centrifugar las células a entre 5000xg y 8000xg, 6000xg y 7000xg o alrededor de 6500xg.
Opcionalmente las células se centrifugan durante entre 30 minutos y 2 horas, opcionalmente las células se centrifugan durante alrededor de 1 hora.
En una realización la etapa a) tiene lugar a un pH entre 4,5 y 8,5, entre 5,0 y 8,0, entre 5,5 y 7,5, entre 5,0 y 7,0, entre
4,5 y 6,5 o entre 6,0 y 7,0, o alrededor de pH 6,0.
En una realización la etapa a) tiene lugar a una temperatura de entre 20 °C y 40 °C, entre 25 °C y 35 °C, entre 27 °C y 32 °C o alrededor de 28 °C.
En una realización, el nivel de oxígeno disuelto dentro del cultivo para la mayor parte de la etapa a) está entre el 5% y el 40%, entre el 10% y el 30%, entre el 15% y el 25% o alrededor del 20%.
En una realización, la etapa a) se lleva a cabo a una Kla de entre 10-1000 h-1. KLa es una medida de la tasa a la que el oxígeno entra en el cultivo. Cuanto mayor sea KLa, mayor será la velocidad a la que se introduce oxígeno en el cultivo.
KLa se puede medir de la siguiente manera. El procedimiento implica configurar el fermentador con las condiciones de volumen medio, temperatura, presión, agitación y aireación para las que se va a medir el KLa, desgasificar mediante el reemplazo del aire con gas nitrógeno, gasificar mediante la restauración de la aireación del aire y medir la tasa en la que la p02 vuelve a su nivel de estado estacionario.
In (100-pO2) = -KLa. T C
Al graficar In(100-p02) frente al tiempo, el gradiente (o coeficiente angular) de la línea es -KLa. p02 es el % de oxígeno disuelto en el caldo, T es el tiempo y C es una constante.
La KLa de una etapa de fermentación está influenciada por varios factores que incluyen la cantidad de agitación del
cultivo y la tasa de aireación del cultivo. Se puede mantener una KLa constante mientras, por ejemplo, se disminuye
la agitación del cultivo y se aumenta la tasa de aireación o viceversa. Sin embargo, en una realización, tanto la agitación del cultivo como la velocidad de aireación son constantes durante la etapa de fermentación.
La Etapa a) y/o etapa a(i)) tienen lugar, por ejemplo, a una KLa de entre 10-1000 h-1, 10-200 h-110 -150 h-1, 10-100 h-1, 10-80 h-1, 10-50 h-1, 10-40 h-1, 10-30 h-1, 20-150 h-1, 20-100 h-1, 20-50 h-1, 20-60 h-1, 20-8 h-1, 30-60 h-1, 60-80 h-1, 60-150 h-1 o 60-200 h-1.
En una realización el medio de fermentación comprende un medio seleccionado del grupo que consiste en CY, SOC, o un medio similar. En una realización, el medio es CY o SOC.
En una realización etapa a(i)) comprende la adición de un agente inductor. Un agente inductor es un compuesto que se añade al cultivo, en el que la adición del agente inductor aumenta la tasa de expresión de la proteína. En una realización, el agente inductor es IPTG.
En una realización, el procedimiento comprende una etapa adicional d) de purificar el toxoide bacteriano. En una realización, la etapa d) implica la purificación celular mediante cromatografía. En una realización, la técnica de cromatografía es cromatografía de afinidad, filtración en gel, cromatografía líquida de alta presión (HPLC) o cromatografía de intercambio iónico. Opcionalmente, la cromatografía de afinidad usa una columna de purificación de etiquetas de afinidad, una columna de purificación de anticuerpos, una columna de afinidad de lectina, una columna de purificación de prostaglandinas o una columna de estreptavidina. Opcionalmente, la HPLC usa una columna de intercambio iónico, una columna de fase inversa o una columna de exclusión por tamaño. Opcionalmente, la columna de intercambio iónico es una columna de intercambio aniónico o una columna de intercambio catiónico.
En una realización el procedimiento además comprende una etapa e) de conjugación del toxoide bacteriano a un sacárido.
En una realización el sacárido es un sacárido bacteriano. Por ejemplo, el sacárido bacteriano es un sacárido capsular originado de S. pneumoniae, H. influenzae, S. aureus, E. faecalis E. faedum, Salmonella o S. epidermidis. Como se define en la presente memoria, un "sacárido" puede ser un oligosacárido o un polisacárido.
En una realización, el sacárido bacteriano es un sacárido capsular de S. pneumoniae seleccionado del grupo que consiste en 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10a , 11a , 12F, 14, 15b , 17F, 18c , 19a , 19F, 20, 22F, 23F y 33F. En una realización, el sacárido bacteriano es un polisacárido u oligosacárido de Haemophilus influenzae b (Hib).
La conjugación se puede producir mediante cualquier técnica de acoplamiento conocida. El procedimiento de conjugación puede depender de la activación del sacárido con tetrafluoroborato de 1-ciano-4-dimetilamino piridinio (CDAP) para formar un éster de cianato. Por tanto, el sacárido activado se puede acoplar directamente o mediante un grupo espaciador (ligador) a un grupo amino en la proteína portadora. Por ejemplo, el espaciador podría ser cistamina o cisteamina para dar un polisacárido tiolado que se puede acoplar al portador mediante un enlace tioéter obtenido después de la reacción con una proteína portadora activada por maleimida (por ejemplo, usando GMBS) o una proteína portadora haloacetilada (por ejemplo usando yodoacetimida [por ejemplo, etil yodoacetimida HCl] o bromoacetato de N-succinimidilo o SIAB, o SlA o SBAP). Preferiblemente, el éster de cianato (preparado opcionalmente mediante química de CDAP) se acopla con hexano diamina o ADH y el sacárido derivatizado con amino se conjuga con la proteína portadora usando la química de carbodiimida (por ejemplo, EDAC o EDC) a través de un grupo carboxilo en la proteína portadora. Dichos conjugados se describen en la solicitud publicada PCT WO 93/15760 Uniformed Services University y WO 95/08348 y WO 96/29094.
Otras técnicas adecuadas usan carbodiimidas, hidrazidas, ésteres activos, norborano, ácido p-nitrobenzoico, N-hidroxisuccinimida, S-NHS, EDC, TSTU. Muchos se describen en el documento WO 98/42721. La conjugación puede implicar un ligador de carbonilo que puede formarse por reacción de un grupo hidroxilo libre del sacárido con CDl (Bethell et al J. Biol. Chem. 1979, 254; 2572-4, Hearn et al J. Chromatogr. 1981. 218; 509-18) seguido de reacción con una proteína para formar un enlace carbamato. Esto puede implicar la reducción del extremo terminal anomérico a un grupo hidroxilo primario, protección/desprotección opcional de la reacción del grupo hidroxilo primario del grupo hidroxilo primario con CDl para formar un intermedio de carbamato de CDl y acoplar el intermedio de carbamato de CDl con un grupo amino en un proteína. Los conjugados también se pueden preparar mediante procedimientos de aminación reductora directa como se describe en los documentos US 436517o Jennings) y US 4673574 (Anderson). Otros procedimientos se describen en los documentos EP-0-161-188, EP-208375 y EP-0-477508. Un procedimiento adicional implica el acoplamiento de un sacárido activado con bromuro de cianógeno (o CDAP) derivatizado con dihidrazida de ácido adípico (ADH) a la proteína portadora por condensación de carbodiimida (Chu C. et al Infect. Immunity, 1983245256), por ejemplo usando E d A c .
En una realización, un grupo hidroxilo (preferiblemente un grupo hidroxilo activado, por ejemplo, un grupo hidroxilo activado para producir un éster de cianato [por ejemplo, con CDAP]) en un sacárido se une a un grupo amino o carboxílico en una proteína, ya sea directa o indirectamente (a través de un ligador). Cuando está presente un ligador, un grupo hidroxilo en un sacárido se une preferiblemente a un grupo amino en un ligador, por ejemplo, usando la conjugación CDAP. Un grupo amino adicional en el ligador, por ejemplo ADH), se puede conjugar con un grupo de ácido carboxílico en una proteína, por ejemplo usando química de carbodiimida, por ejemplo usando EDAC. En una realización, el sacárido capsular neumocócico se conjuga primero con el ligador antes de que el ligador se conjugue con la proteína portadora. Alternativamente, el ligador se puede conjugar con el portador antes de la conjugación con el sacárido.
En general, los siguientes tipos de grupos químicos en una proteína portadora se pueden usar para el acoplamiento/conjugación:
A) Carboxilo (por ejemplo mediante ácido aspártico o ácido glutámico). En una realización, este grupo está unido a grupos amino en sacáridos directamente o a un grupo amino en un ligador con química de carbodiimida, por ejemplo, con EDAC.
B) Grupo amino (por ejemplo, a través de lisina). En una realización, este grupo está unido a grupos carboxilo en sacáridos directamente o a un grupo carboxilo en un ligador con química de carbodiimida, por ejemplo, con EDAC. En otra forma de realización el grupo está unido a grupos hidroxilo activados con CDAP o CNBr en sacáridos directamente o a dichos grupos en un ligador; a sacáridos o ligadores que tienen un grupo aldehido; a sacáridos o ligadores que tienen un grupo éster de succinimida.
C) Sulfidrilo (por ejemplo, a través de cisteína). En una realización, este grupo está unido a un sacárido o ligador bromo o cloro acetilado con química de maleimida. En una realización, este grupo se activa/modifica con bis diazobencidina.
D) Grupo hidroxilo (por ejemplo, a través de tirosina). En una realización, este grupo se activa/modifica con bis diazobencidina.
E) Grupo imidazolilo (por ejemplo, mediante histidina). En una realización, este grupo se activa/modifica con bis diazobencidina.
F) Grupo guanidilo (por ejemplo, a través de arginina).
G) Grupo indolilo (por ejemplo, a través de triptofano).
En un sacárido, en general se pueden usar los siguientes grupos para un acoplamiento: OH, COOH o NH2. Los grupos aldehido se pueden generar después de diferentes tratamientos conocidos en la técnica tales como: peryodato, hidrólisis ácida, peróxido de hidrógeno, etc.
Enfoques de acoplamiento directo:
Sacárido-OH CNBr o CDAP-----> éster cianato NH2-Prot---------------- > conjugado
Sacárido-aldehido NH2-Prot — > base de Schiff NaCNBH3---------- > conjugado
Sacárido-COOH NH2-Prot EDAC------------- > conjugado
Sacárido-NH2 COOH-Prot EDAC------------- > conjugado
Acopiamiento indirecto mediante enfoques de espaciador (ligador)
Sacárido-OH CNBr o CDAP —> éster de cianato NH2 — NH2 — > sacárido NH2 COOH-Prot EDAC -— > conjugado
Sacárido-OH CNBr o CDAP — > éster de cianato NH2-----SH ------> sacárido SH SH-Prot (proteina nativa con una cisterna expuesta u obtenida después de la modificación de grupos amino de la proteina por SPDP por ejemplo)-----> sacárido- SS-Prot
Sacárido-OH CNBr o CDAP —> éster de cianato NH2 — SH -------> sacárido SH maleimida-Prot (modificación de grupos amino)> conjugado
Sacárido-OH CNBr o CDAP —> éster de cianato N H 2-----SH —> Sacárido- SH haloacetilado-Prot> Conjugado
Sacárido-COOH EDAC NH2-----NH2 —> sacárido------- NH2 EDAC COOH-Prot> conjugado Sacárido-COOH EDAC NH2 — SH -----> sacárido SH SH-Prot (proteina nativa con una cisterna expuesta u obtenido después de la modificación de grupos amino de la proteina por SPDP, por ejemplo)> sacárido-S-S-Prot
Sacárido-COOH EDAC NH2 — S H -----> sacárido SH maleimida-Prot (modificación de grupos amino) -> conjugado
Sacárido-COOH EDAC NH2 — SH —> Sacárido-SH haloacetilado-Prot> Conjugado
Sacárido-Aldehido NH2-----NH2 — > sacárido — NH2 EDAC COOH-Prot> conjugado
Nota: en lugar del EDAC anterior, se puede usar cualquier carbodiimida adecuada.
En resumen, los tipos de grupos químicos de proteínas portadoras que se pueden usar generalmente para el acoplamiento con un sacárido son grupos amino (por ejemplo, en residuos de lisina), grupos COOH (por ejemplo, en residuos de ácido aspártico y glutámico) y grupos SH (sí es accesible) (por ejemplo, en residuos de cisterna.
En una realización, el pH de la etapa a) es menor que el pH de la etapa a (í)). En una realización, la temperatura de la etapa a) es más alta que la temperatura de la etapa a (í)). En una realización, la tasa de alimentación del sustrato de la etapa a) es mayor que la alimentación de sustrato de la velocidad a (í)).
En una realización adicional el pH de la etapa a) varia de 5,0-7,0, 5,0-6,0, 6,0-7,0 o de 6,5-7,0.
En una realización se mantiene el pH en la etapa a(i)). En una realización el pH se mantiene a mayor de pH 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0 o entre 6,5 y 10,0, 6,5 y 9,5, 6,5 y 9,0, 6,5 y 8,5, 6,5 y 7,5, 6,5 y 7,0, 7,0 y 10,0, 7,0 y 9,5, 7,0 y 9,0, 7,0 y 8,5, 7,0 y 8,0, 7,0 y 7,5, 7,5 y 10,0, 7,5 y 9,5, 7,5 y 9,0, 7,5 y 8,5, 7,5 y 8,0, 8,0 y 10,0, 8,0 y 9,5, 8,0 y 9,0, 8,0 y 8,5, 8,5 y 10,0, 8,5 y 9,5, 8,0 y 9,0,8,0 y 8,5, 8,5 y 10,0, 8,5 y 9,5, 8,5 y 9,0, 9,0 y 10,0, 9,0 y 9,5 o 9,5 y 10,0. En una realización adicional el pH se mantiene usando un tampón del grupo que consiste en tampón fosfato, tampón Tris y tampón histidina. Opcionalmente, el tampón está a una concentración de 10-200 mM, 50-100 mM, 100-200 mM, 10-50 mM o 50-150 mM. Opcionalmente, el tampón es tampón fosfato a 80-120 mM, 80-100 mM o 100 mM.
En una realización el pH en la etapa a(i)) es al menos, exactamente o aproximadamente 2,0, 1,5, 1,0, 0,5, 0,3, 0,2 o 0,1 unidades de pH mayor que el pH en la etapa a).
Opcionalmente esta disminución en el pH se obtiene mediante la adición de base por ejemplo, hidróxido de sodio o
amoníaco.
En una realización la temperatura de etapa a) es mayor que la temperatura de etapa a(l)). En una realización etapa a) del procedimiento se lleva a cabo a una temperatura de 20-40 °C. Opcionalmente etapa a(i)) del procedimiento se lleva a cabo a una temperatura de 20-28 °C, 21-27 °C, 22-26 °C, 23-24 °C, 21-24 °C, o 22-23 °C.
En una realización adicional la tasa de alimentación de sustrato en la etapa a(i)) se mantiene entre 5% y 90%, 20% y 80% o 20% y 30% de la tasa de alimentación de sustrato mantenida durante la etapa a).
De acuerdo con la presente invención, el procedimiento se lleva a cabo en un termentador. En una realización, el agente antiespumante se añade en la etapa a) y/o etapa a(i)). En una realización adicional una sonda de espuma y rompedor de espuma mecánico se usa en la etapa a) y/o etapa a(i)). En una realización adicional el agente antiespumante, y una sonda de espuma y rompedor de espuma mecánico se usa en la etapa a) y/o etapa a(i)).
De acuerdo con la presente invención, el termentador contiene 10-5000 litros de cultivo. En una realización adicional el termentador contiene al menos 500 litros de cultivo, en una realización adicional el termentador contiene al menos 1000 litros de cultivo. En una realización adicional el termentador contiene entre 50-1000, 100-500, o 100-200 litros de cultivo. En una realización adicional el termentador contiene alrededor de 150 litros de cultivo.
En una realización adicional el procedimiento además comprende una etapa t) de mezcla del toxoide bacteriano con antígenos adicionales. En una realización los antígenos adicionales son antígenos de cáncer, virales o bacterianos.
Los toxoides bacterianos producidos por el procedimiento de la invención se pueden mezclar con un excipiente aceptable para uso Farmacéutico. Por ejemplo, el toxoide bacteriano se puede mezclar con un adyuvante. La elección de un adyuvante adecuado para mezclar con toxinas bacterianas o conjugados preparados usando los procedimientos de la invención está dentro del conocimiento del experto en la técnica. Los adyuvantes adecuados incluyen una sal de aluminio tal como hidróxido de aluminio, gel de hidróxido de aluminio o tostato de aluminio o alúmina, pero también pueden ser otras sales metálicas como las de calcio, magnesio, hierro o zinc, o pueden ser una suspensión insoluble de tirosina acilada, o azúcares acilados, sacáridos derivatizados catiónica o aniónicamente o politostacenos.
También se describe en la presente memoria una proteína recombinante (tal como un toxoide bacteriano producido por el procedimiento de la invención) obtenible por el procedimiento de la invención. También se describe en la presente memoria una proteína recombinante (tal como un toxoide bacteriano) obtenida por el procedimiento de la invención.
También se describe en la presente memoria una composición inmunogénica que comprende una proteína recombinante (tal como a toxoide bacteriano producido por el procedimiento de la invención) y un excipiente aceptable para uso Farmacéutico. Tales composiciones inmunogénicas comprenden antígenos adicionales. Opcionalmente estos antígenos adicionales son antígenos derivados de S. pneumoniae, H. influenzae, N. meningitidis, E. coli, C. trachomatis, M. cattarhalis, tétano, difteria, pertussis, S. epidermidis, enterococci, o S. aureus.
También se describe una composición inmunogénica para su uso en la prevención o el tratamiento de enfermedades. También se describe la composición para su uso en la prevención o el tratamiento enfermedades bacterianas, virales o cáncer.
También se describe una vacuna que comprende la composición inmunogénica.
Las preparaciones de vacuna que contienen composiciones inmunogénicas se pueden usar para proteger o tratar a un mamífero susceptible de infección, mediante la administración de dicha vacuna por vía sistémica o mucosa. Estas administraciones pueden incluir inyección por vía intramuscular, intraperitoneal, intradérmica o subcutánea; o mediante administración mucosa a los tractos oral/alimentario, respiratorio, genitourinario. Se pretiere la administración intranasal de vacunas para el tratamiento de la neumonía u otitis media (ya que el transporte nasofaríngeo de neumococos se puede prevenir más eficazmente, de este modo se atenúa la infección en su etapa más temprana). Aunque la vacuna se puede administrar como una dosis única, sus componentes también se pueden coadministrar juntos al mismo tiempo o en momentos diferentes (por ejemplo, los conjugados de sacárido neumocócico se pueden administrar por separado, al mismo tiempo o 1-2 semanas después de la administración del componente de proteína bacteriana de la vacuna para una coordinación óptima de las respuestas inmunitarias entre s í). Además de una única vía de administración, se pueden usar 2 vías de administración diferentes. Por ejemplo, los sacáridos o conjugados de sacáridos se pueden administrar IM (o ID) y las proteínas bacterianas se pueden administrar IN (o Id ). Además, las vacunas se pueden administrar IM para las dosis iniciales e IN para las dosis de retuerzo.
El contenido de toxinas en la vacuna estará típicamente en el intervalo de 1 a 100 |jg, preferiblemente de 5 a 50 |jg, más típicamente en el intervalo de 5 a 25 |jg. Después de una vacunación inicial, los sujetos pueden recibir una o varias inmunizaciones de retuerzo adecuadamente espaciadas. La preparación de vacunas se describe generalmente en Vaccine Design (("The subunit and adjuvant approach" (eds Powell M.F. & Newman M.J.) (1995) Plenum Press New York). La encapsulación dentro de los liposomas está descrita por Fullerton, Patente Estadounidense 4.235.877.
En una divulgación adicional se proporciona un uso de la composición inmunogénica o vacuna en la prevención o el tratamiento de enfermedades. En una divulgación se proporciona un uso de la composición inmunogénica o vacuna en la prevención de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en cáncer, enfermedad viral y bacteriana.
En una divulgación adicional se proporciona un uso de la composición inmunogénica o la vacuna en la fabricación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de una enfermedad. En una descripción adicional se proporciona un uso de la composición inmunogénica o vacuna en la fabricación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en cáncer, enfermedad viral y bacteriana.
En una divulgación adicional se proporciona un procedimiento para prevenir o tratar una enfermedad que comprende administrar la composición inmunogénica o vacuna a un paciente. En una divulgación adicional se proporciona un procedimiento para prevenir o tratar una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en cáncer, enfermedad viral y bacteriana que comprende administrar la composición inmunogénica o vacuna a un paciente.
Los términos "que comprende", "comprender" y "comprende" en la presente memoria están destinados por los inventores a ser opcionalmente sustituibles por los términos "que consiste en", "consiste en", respectivamente, en todos los casos.
A menos que se explique lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto en la técnica a la que pertenece esta descripción. Las definiciones de términos comunes en biología molecular se pueden encontrar en Benjamin Lewin, Genes V, publicado por Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Science Ltd., 1994 (|Sb N 0-632-02182-9); and Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).
Los términos singulares "un", "una" y "el/la" incluyen referentes en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. De manera similar, la palabra "o" se considera que incluye "y" a menos que el contexto indique claramente lo contrario. El término "pluralidad" se refiere a dos o más. También se debe entender que todos los tamaños de bases o tamaños de aminoácidos, y todos los valores de peso molecular o masa molecular, dados para ácidos nucleicos o polipéptidos, son aproximados y se proporcionan para su descripción. Además, las limitaciones numéricas dadas con respecto a las concentraciones o niveles de una sustancia, tal como un antígeno, se consideran aproximadas. Por tanto, cuando se indica que una concentración es al menos (por ejemplo) 200 pg, se considera que se entiende que la concentración es al menos aproximadamente (o "aproximadamente" o "~") 200 pg.
e j e m p l o s
Ejemplo 1: Precultivo de Escheríchia coIÍ B2355
Se preparó un precultivo usando un cultivo de siembra congelado de la cepa B2355 de Escheríchia coli. Esta cepa es una cepa B834 (DE3) transformada con un derivado de pET26b que contiene una secuencia que codifica una proteína de fusión entre el péptido señal de Flgl de E. coli (SEQ ID NÚM.: 23) y CRM197 (SEQ lD NÚM.: 27). La capacidad de cultivo de la semilla se determinó como aproximadamente 1x 1010 unidades formadoras de colonias por ml.
El cultivo de siembra se descongeló a temperatura ambiente y se usaron 400 pl para inocular un matraz Erlenmeyer de 2 litros que contiene 400 ml de medio de precultivo (adaptado de Zabriskie et al. (J. Ind. Microbiol. 2: 87-95 (1987))).
A continuación, se incubó el matraz inoculado a 370C ( ± 10C) y 200 rpm. La fase de precultivo se detuvo cuando el cultivo obtuvo una densidad óptica a 650 nm (OD650 nm) de entre 0,5 y 1,5, (alrededor de 5 horas de incubación). El precultivo se utilizó para inocular medio en un fermentador tan pronto como se detuvo el cultivo (ejemplo 2).
Ejemplo 2: Fermentación por lote alimentado en escala de 20L
Se utilizó un fermentador de 20 litros (Biolafitte). Se transfirieron asépticamente nueve litros de medio de fase por lotes al fermentador (adaptado de Zabriskie et al. (J. Ind. Microbiol. 2: 87-95 (1987)). El pH del medio se ajustó a 6,8 con la adición de base. También se agregaron 3 ml de antiespumante irradiado sin diluir (SAG 471) al fermentador. A continuación, se ajustaron la temperatura (28 °C), presión de cabezal (0,5 bar), tasa de aireación (20 litros de aire burbujeado por minuto) y velocidad de agitación inicial (300 rpm) antes de la inoculación. El nivel de oxígeno disuelto en estas condiciones fue del 100% La presión de cabezal y la tasa de aireación se mantuvieron a un nivel constante durante la fermentación.
La inoculación se logró mediante la adición de aproximadamente 20 ml de precultivo (preparado como se describe en el Ejemplo 1).
Durante la fase por lotes (0-15 horas), la temperatura se mantuvo a 28 oc. El nivel de oxígeno disuelto se ajustó a
20%. El nivel de oxígeno disuelto (DO) se reguló mediante el aumento de la agitación cuando el DO cayó por debajo del 20%. El agotamiento de la glucosa dio como resultado un aumento de DO y una disminución concomitante de la agitación.
Después de 15 horas de fermentación, se agregó sustrato adicional de acuerdo con el siguiente perfil de adición de alimentación:
Tabla 1
Durante la fase de alimentación por lotes (15-46 horas), el pH se mantuvo a 6,8 mediante la adición de base, la temperatura se reguló a 280C y el nivel de DO se mantuvo al 20% mediante el control de la velocidad de agitación.
A las 46 horas, se añadió IPTG a una concentración final de 1 mM para inducir las bacterias. Además, el pH se aumentó después de 46 horas mediante la adición de base y la temperatura se redujo a 23 °C (estos cambios pueden conducir a altos niveles de expresión periplásmica). El pH y la temperatura se mantuvieron durante toda la fase de inducción (46-72 h). El nivel de DO se mantuvo al 20% mediante el control de la tasa de agitación.
Al final de la fase de inducción (72 horas), se recogió la pasta celular mediante centrifugación (6.500xg, 4 oc durante 1 hora) y se almacenó a -20 oc.
La extracción periplasmática se realizó mediante shock osmótico usando un procedimiento adaptado de Chen et al. (Biochem. Eng. J. 19: 211-215 (2004) diferencias descritas en la tabla 2 a continuación). El contenido de CRM197 en las fracciones periplásmica y citoplásmica fue analizado por Elisa.
Tabla 2
La Figura 1 muestra un perfil de fermentación típico con los parámetros del procedimiento controlados durante la
fermentación por lotes alimentados a escala 20L.
Al final de la fermentación, la productividad periplásmica de CRM197 se analizó por ELISA;
Tabla 3
Esta técnica demostró mayores niveles de expresión y eficiencia de secreción.
Ejemplo 3: determinación de las tasas de alimentación y p H óptimos para su uso durante la fase de inducción En este experimento, se utilizó la metodología de superficie de respuesta (J.ind. Microbiol. Biotechnol. 37: 195-204 (2010)) para determinar los valores óptimos para tres parámetros, con el fin de maximizar la producción periplásmica de una proteína recombinante. Los tres parámetros de fermentación investigados fueron el pH durante la fase de crecimiento, el pH durante la inducción y la tasa de alimentación durante la inducción. Los valores para estos tres parámetros se eligieron de acuerdo con un diseño de capa uniforme de Doehlert (Doehlert (Applied Statistics 19: 231-239 (197o))). Se realizaron quince fermentaciones usando los valores descritos en la tabla 5.
Las fermentaciones se llevaron a cabo usando la cepa B2284, esta es una cepa de células BLR (DE3) transformadas con un derivado de pET26b que contiene una secuencia que codifica una proteína de fusión entre el péptido señal de Flgl (SEQ ID NÚM.: 23) de E coIÍ y la parte madura de CRM197 (SEQ ID NÚM.: 27).
Para cada fermentación, el cultivo de siembra se descongeló a temperatura ambiente y se usaron 500 |jl para inocular un matraz Erlenmeyer de 2 litros que contenía 400 ml de medio de precultivo (adaptado de Zabriskie et al. (J. Ind. Microbiol. 2:87) -95 (1987))).
A continuación, el matraz inoculado se incubó a 37 °C (± 1 °C) y 200 rpm. El precultivo se detuvo cuando la densidad óptica a 650 nm (DO 65o nm) alcanzó alrededor de 2,5 (alrededor de 6 horas de incubación). El precultivo se utilizó para inocular medio en un fermentador tan pronto como se detuvo el cultivo (adaptado de Zabriskie et al. (J. Ind. Microbiol.
2: 87-95 (1987)).
Se utilizó un fermentador de 20 litros (Biolafitte). Se transfirieron asépticamente nueve litros de medio de fase por lotes al fermentador. El pH del medio se ajustó al valor objetivo (Tabla 5) con adición de base. También se añadieron al fermentador 3 ml de antiespumante irradiado sin diluir (SAG 471). La temperatura (28 °C), presión de cabezal (0,5 bar), tasa de aireación (20 litros de aire burbujeado por minuto) y velocidad de agitación inicial (300 rpm) se ajustaron después antes de la inoculación. El nivel de oxígeno disuelto (DO) en estas condiciones fue 100%. La presión de cabezal y la tasa de aireación se mantuvieron a un nivel constante durante la fermentación.
Durante la fase por lotes (0-15 h), la temperatura se mantuvo a 28 °C. El nivel de oxígeno disuelto se fijó en 20% y se reguló mediante el aumento de la agitación cuando el DO cayó por debajo del 20%.
Durante la fase de alimentación por lotes (15-46 horas), el pH se mantuvo de acuerdo con una de las condiciones descritas en la tabla 5 mediante la adición de base. La temperatura se reguló a 28 °C. La tasa de agitación se mantuvo a un punto de ajuste constante (máximo 800 rpm) y el nivel de DO se mantuvo a 20% mediante la adición automática de una solución de alimentación concentrada (adaptado de Zabriskie et al. (J. Ind. Microbiol. 2: 87-95 (1987)) cuando el DO aumentó por encima del 20%.
Cuando el cultivo alcanzó una OD650nm de alrededor de 90, el punto de ajuste del pH se modificó de acuerdo con una de las condiciones descritas en la tabla 5 mediante la adición de base o ácido y la temperatura se redujo a 230C. Una vez que se alcanzaron estas condiciones, se añadió IPTG a una concentración final de 1 mM. El pH y la temperatura se mantuvieron durante la fase de inducción completa (24 h). Se utilizó una tasa de alimentación de sustrato constante durante la fase de inducción completa, de acuerdo con una de las condiciones descritas en la tabla 4. El nivel de DO se mantuvo en 20% mediante el control de la tasa de agitación.
Al final de la fase de inducción, se recogió la pasta celular mediante centrifugación (normalmente 6,500 xg, 4 °C durante 1 hora) y se almacenó a -20 °C.
La extracción periplasmática se realizó mediante shock osmótico usando un procedimiento adaptado de Chen et al. (Biochem. Eng. J. 19: 211-215 (2004) diferencias descritas en la tabla 2). El contenido de CRM197 en las fracciones periplásmica y citoplásmica se analizó por ELISA
Tabla 4
Tabla 5
Sobre la base de Ios resultados de las 15 fermentaciones, se utilizó el software NEMROD-W (LPRAI, Marsella, Francia) para modelar la producción de CRM197 en las fracciones periplásmica y citoplasmática.
Como se muestra en la Fig. 2, la producción de CRM197 periplásmico fue mayor a tasas de alimentación bajas durante la inducción (Figura 2a), mientras que la acumulación de C r M197 dentro de la celda fue mayor a tasas de alimentación más altas (Fig. 2b). La diferencia en la tasa de alimentación óptima para la producción de CRM197 periplásmico o asociado a células permite definir condiciones que mejoran selectivamente la producción de CRM197 periplásmico. Un aumento del pH en la inducción también lleva a niveles más altos de producción de CRM197 periplásmico (Fig. 2a).
Ejemplo 4: Efecto de la congelación de la pasta celular sobre la eficiencia de liberación periplásmica por shock osmótico
Se cultivaron células de Escherichia coli B834 (DE3) que expresan el constructo de flgl CRM197 en un cultivo de alimentación por lotes (escala 20L), y se realizó la inducción de la expresión y secreción de proteínas recombinantes en el espacio periplásmico como se describió anteriormente (ejemplos 1-3), aunque sería adecuado cualquier otro procedimiento de fermentación usando expresión periplásmica.
Veintiséis horas después de la adición de IPTG, las células se recogieron por centrifugación (14,000 xg, 10 min., 4 0C). La extracción de proteínas periplásmicas se realizó inmediatamente mediante shock osmótico usando un procedimiento adaptado de Chen et al. (Biochem. Eng. J. 19: 211-215 (2004), las diferencias se resumen en la Tabla 6) en sedimentos de células frescas equivalentes a 10 ml de caldo de fermentación. En paralelo, se almacenaron sedimentos celulares equivalentes a 10 ml de caldo a -20 °C durante 4 días, se descongelaron a temperatura ambiente y se sometieron a shock osmótico.
El contenido de CRM197 fue determinado por ELISA (la detección se llevó a cabo usando anticuerpo anti-CRM de conejo (Pims 20010665) e IgG anti-conejo (jackson 111-035-003)) en el sobrenadante y las fracciones asociadas a las células después del shock osmótico en células frescas o congeladas. El contenido de proteína total se determinó por el procedimiento de Lowry en las mismas fracciones (Tabla 7).
Mientras que solo el 19% del CRM197 total se liberó de las células frescas, el 92% se recuperó de las células congeladas, lo que representa una mejora > 5 veces en la cantidad total de CRM197 liberado después del shock osmótico. Esta mejora estuvo acompañada de una mayor liberación de proteínas totales (2,8 veces) y un aumento en la relación Elisa: proteína total (2 veces).
Ejemplo 5 - Efecto del shock de pH antes del shock osmótico sobre la eficiencia de la liberación periplásmica de las células frescas
Las células de Escherichia coli B834 (DE3) que expresan una proteína de fusión entre el péptido señal de Flgl de E. coIÍ (19 aa) (SEQ ID NÚM.: 24) y la parte madura de CRM197 (595 aa) (SEQ ID NÚM.: 28) _se cultivaron en un cultivo de alimentación por lotes (escala 20L), y la inducción de la expresión y secreción de proteínas recombinantes en el espacio periplásmico se realizó como se describió anteriormente, aunque sería adecuado cualquier otro procedimiento de fermentación usando expresión periplásmica.
Veinticuatro horas después de la adición de IPTG, las células se recogieron por centrifugación (14,000 xg, 10 min., 4 0C). La extracción de proteínas periplásmicas se realizó inmediatamente mediante shock osmótico usando un procedimiento adaptado de Chen et al. (Biochem. Eng. J. 19: 211-215 (2004), las diferencias se describen en la tabla 6 anterior) en sedimentos de células frescas equivalentes a 10 ml de caldo de fermentación. Como control, también se almacenaron sedimentos de células equivalentes a 10 ml de caldo a -20 °C durante 7 días, se descongelaron a temperatura ambiente y se sometieron a shock osmótico.
En paralelo, se incubaron adicionalmente alícuotas de 100 ml de la fermentación en matraces de agitación de 500 ml (23 oc, 200 rpm), con o sin adición de 600 |jl de NH4OH al 25% o 60 |jl de H3PO4 al 85%. Después de 2 h de incubación, las células se recogieron por centrifugación (14,000 xg, 10 min., 40C) y se sometieron inmediatamente a shock osmótico.
El contenido de CRM197 se determinó mediante Elisa (la detección se llevó a cabo usando anticuerpo anti-CRM de conejo (Pims 20010665) e IgG anti-conejo (Jackson 111-035-003)) en la fracción sobrenadante después del shock osmótico (Tabla 8).
En ausencia de cualquier tratamiento, la extracción periplásmica en células frescas solo pudo extraer el 30% de la cantidad extraída de las células congeladas. La incubación adicional de las células durante 2 h a 230C dio como resultado una mejora (1,2 veces versus células frescas sin tratar). Cuando se aplicó el mismo tratamiento después de un ligero cambio de pH (adición de 600 |jl de NH4OH al 25%), se observó una mejora de 1,4 veces. Finalmente, cuando el pH se redujo a -7,1 antes del período de incubación de 2 h, se observó una mejora de 1,7 veces en comparación con las células frescas no tratadas.
Por lo tanto, mediante la adición de una etapa de maduración que consiste en un descenso del pH, seguido de un período de incubación de 2 h en ausencia de cualquier adición de alimentación o control del pH, la eficiencia de la liberación periplásmica de las células frescas aumentó 1,7 veces. En términos de la cantidad total de CRM197, estas condiciones liberaron el 51% de la cantidad extraída de las células congeladas. Es importante destacar que esto no se debe a la lisis celular, como lo indica la OD650nm durante el tratamiento de 2 h.
Ejemplo 6 - Efecto de la amplitud de un cambio de descendente de pH antes del shock osmótico sobre la eficiencia de liberación periplásmica de las células frescas
Las células de Escherichia coli B834 (DE3) que expresan una proteína de fusión entre el péptido señal de Flgl de E. coIÍ (19 aa) (SEQ ID NÚM.: 24) y la parte madura de CRM197 (595 aa) (SEQ ID NÚM.: 28) se cultivaron en un cultivo de alimentación por lotes (escala 150L), y la inducción de la expresión y secreción de proteínas recombinantes en el espacio periplásmico se realizó como se describió anteriormente, aunque puede ser adecuado cualquier otro procedimiento de fermentación usando expresión periplásmica.
Veinticuatro horas después de la adición de IPTG, las células se recogieron por centrifugación (14000 xg, 10 min., 4 oc). La extracción de proteínas periplásmicas se realizó inmediatamente mediante shock osmótico usando un procedimiento adaptado de Chen et al. (Biochem. Eng. J. 19: 211-215 (2004) diferencias descritas en la tabla 6 anterior) en sedimentos de células frescas equivalentes a 10 ml de caldo de fermentación. Como control, también se almacenaron sedimentos celulares equivalentes a 10 ml de caldo a -20 °C durante 30 días, se descongelaron a temperatura ambiente y se sometieron a shock osmótico.
Paralelamente, se incubaron más alícuotas de 100 ml de la fermentación en matraces de agitación de 500 ml (23 °C, 200 rpm), a los que se añadieron cantidades crecientes de H3PO4 al 85% (0, 60, 120, 180 o 240 |jI). Después de 2 h de incubación, las células se recolectaron por centrifugación (14,000 xg, 10 min., 4 oc) y se sometieron inmediatamente a shock osmótico.
El contenido de CRM197 se determinó mediante Elisa (la detección se llevó a cabo usando anticuerpo anti-CRM de conejo (Pims 20010665) e IgG anti-conejo (Jackson 111 -035-003)) en la fracción sobrenadante después del shock osmótico (Tabla 9).
En ausencia de cualquier tratamiento, la extracción periplásmica en células frescas solo extrajo el 26% del CRM197 total disponible, en comparación con 88% en células congeladas (eficiencia 4,7 veces menor). La incubación adicional de las células durante 2 h a 230C dio como resultado una mejora de 2 veces en la cantidad de CRM197 liberada de las células frescas. Este efecto positivo se mejoró mediante la reducción del pH antes del período de incubación de 2 h. La cantidad de CRM197 liberada aumentó a un pH más bajo. Cuando se realizó un cambio por descenso del pH a aproximadamente 6,9, el 61% del CRM197 total disponible se liberó de las células frescas (mejora de 2,7 veces versus las células frescas no tratadas). A valores de pH por debajo de -6,9, no se observó ningún aumento adicional en la cantidad de CRM197 liberado, mientras que se halló que la proteína CRM197 era inestable.
Por lo tanto, mediante la adición de una etapa de maduración que consiste en un cambio por descenso del pH a 6,9, seguido de un período de incubación de 2 h en ausencia de cualquier adición de alimentación o control del pH, la eficiencia de la liberación periplásmica de las células frescas se puede aumentar de 21% a 72% de la cantidad de CRM197 liberado de células congeladas sin tratar (calculada como 100 x CRM197iiberado de células frescas/CRM197 liberado de células congeladas^
Ejemplo 7 - Efecto de un cambio por descenso de p H sobre la eficiencia de la liberación periplásmica de las células frescas en la escala de 20 L
Las células de Escherichia coli B834 (DE3) que expresan una proteína de fusión entre el péptido señal de Flgl de E. coIÍ (19 aa) (SEQ ID NÚM.: 24) y la parte madura de CRM197 (595 aa) (SEQ ID NÚM.: 28) se cultivaron en un cultivo por lote alimentado (escala 20L), y la inducción de la expresión y secreción de proteínas recombinantes en el espacio periplásmico se realizó como anteriormente, aunque puede ser adecuado cualquier otro procedimiento de fermentación usando expresión periplásmica.
Veintiséis horas después de la adición de IPTG, se recogieron alícuotas de 10 mi y se centrifugaron (14,000 xg, 10 min., 40C) para la extracción de proteínas periplásmicas mediante shock osmótico en células frescas (realizado inmediatamente) o células congeladas (sedimento celular almacenado a -20 °C durante 4 días), usando un procedimiento adaptado de Chen et al. (Biochem. Eng. J. 19: 211-215 (2004) diferencias descritas en la tabla 6 anterior).
Paralelamente, se añadieron 34 g de H3PO485% al caldo de fermentación para reducir el pH de 7,5 a 6,8 y se detuvo la adición de alimentación. Todos los demás parámetros se mantuvieron en sus puntos de ajuste anteriores. Después se prosiguió con la fermentación durante 2 horas a pH 6,8. Durante este período de maduración, se mantuvo la velocidad mínima de agitación a 300 rpm, lo que produjo un aumento de los niveles de oxígeno disuelto (consecuencia de la baja demanda de oxígeno como resultado de la ausencia de alimentación adicional). El perfil de fermentación durante el período de incubación de 2 horas a pH 6,8 se muestra en la Figura 3.
Después de la fase de maduración de 2 h, se recogieron alícuotas de 10 mi y se centrifugaron (14,000 xg, 10 min., 4 °C) para la extracción de proteínas periplásmicas mediante shock osmótico en células frescas (realizado inmediatamente) o células congeladas (sedimento de células almacenado a -20 °C durante 4 días).
El contenido de CRM197 fue determinado por Elisa (la detección se llevó a cabo usando anticuerpo anti-CRM de conejo (Pims 20010665) e IgG anti-conejo (Jackson 111 -035-003)) en el sobrenadante y las fracciones asociadas a células después del shock osmótico en o células frescas. El contenido de proteína total se determinó por Lowry en las mismas fracciones (Tabla 10).
En ausencia de tratamiento ácido, la liberación de CRM197 por shock osmótico fue 5,7 veces menos eficiente en células frescas en comparación con células congeladas. El tratamiento ácido de 2 horas mejoró la eficacia del shock osmótico en las células frescas: después de la etapa de maduración, el 49% del CRM197 total se pudo extraer de las células frescas, en comparación con solo el 19% en ausencia de maduración. Esta mejora estuvo acompañada de una mayor liberación de proteínas totales y un aumento en la relación Elisa: proteína total.
Por lo tanto, mediante la adición de una etapa de maduración que consiste en un cambio por descenso de pH a 6,8, seguido de un período de incubación de 2 h en ausencia de cualquier adición de alimentación, la eficiencia de la liberación periplásmica de las células frescas se puede aumentar de 18% a 50% de la cantidad de CRM197 liberada de células congeladas no tratadas (calculada como 100 X CRM197|iberada de células frescas/CRM197|iberada de células congeladas).
Claims (13)
1. Un procedimiento para la expresión periplásmica de un toxoide bacteriano que comprende las etapas de:
a) hacer crecer un cultivo de una célula huésped gramnegativa en un medio de fermentación, en el que la célula huésped se transforma con un polinucleótido, y en el que el polinucleótido codifica el toxoide bacteriano y una secuencia señal periplásmica;
a(i)) inducir la expresión del toxoide bacteriano;
b) dejar madurar la célula huésped, en el que la etapa de maduración comprende:
I) someter la célula huésped a un shock de pH;
II) incubar la célula huésped sin adición de alimentación; o
III) someter la célula huésped a una temperatura por debajo de -20 °C; y
c) extraer el toxoide bacteriano de la célula huésped en el que el procedimiento de extracción comprende un shock osmótico en el que la célula huésped gramnegativa se selecciona del grupo que consiste en E. coIÍ, Pseudomonas y Moraxella, en el que la célula huésped está viva durante la etapa b) y en el que el procedimiento se lleva a cabo en un fermentador que contiene 10-5000 litros de cultivo.
2. Un procedimiento para la expresión periplásmica de un toxoide bacteriano que comprende las etapas de: a) proporcionar una célula huésped gramnegativa en el que la célula huésped se transforma con un polinucleótido, el polinucleótido codifica el toxoide bacteriano y una secuencia señal periplásmica y en el que la célula huésped gramnegativa comprende el toxoide bacteriano expresado en el periplasma; b) dejar madurar la célula huésped, en el que la etapa de maduración comprende:
I) someter la célula huésped a un shock de pH;
II) incubar la célula huésped sin adición de alimentación; o
III) someter la célula huésped a una temperatura por debajo de -20 °C; y
c) extraer el toxoide bacteriano de la célula huésped en el que el procedimiento de extracción comprende un shock osmótico en el que la célula huésped gramnegativa se selecciona del grupo que consiste en E. coIÍ, Pseudomonas y Moraxella, en el que la célula huésped está vida durante la etapa b) y en el que el procedimiento se lleva a cabo en un fermentador que contiene 10-5000 litros de cultivo.
3. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2 en el que el shock de pH comprende aumentar o disminuir el pH del medio de fermentación en más de 0,2 unidades de pH o más que 0,5 unidades de pH o entre 0,1 y 2,0 unidades de pH o entre 0,2 y 1,0 unidades de pH.
4. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente en el que la etapa de incubación comprende incubar la célula huésped durante entre 10 minutos y 1 año, entre 10 minutos y 6 meses, entre 10 minutos y 12 horas, entre 10 minutos y 6 horas o entre 10 minutos y 2 horas, opcionalmente a una temperatura entre 20 °C y 40 °C, tal como una temperatura alrededor de 23 °C.
5. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente en el que la etapa b) comprende someter la célula huésped a una temperatura por debajo de -20 °C, -40 °C, -60 °C, -70 °C o -80 °C durante al menos 1 hora, 2 horas, 5 horas, 12 horas, 24 horas, 1 día, 2 días o 5 días.
6. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente en el que la etapa b) comprende congelar y después descongelar la célula huésped.
7. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente en el que la etapa b) comprende:
- someter la célula huésped a un shock de pH seguido por la incubación de la célula huésped sin adición de alimentación;
- incubar la célula huésped sin adición de alimentación seguido por el sometimiento de la célula huésped a un shock de pH;
- incubar la célula huésped sin adición de alimentación seguido por el sometimiento de la célula huésped a una temperatura por debajo de -20 °C;
- someter la célula huésped a un shock de pH seguido por el sometimiento de la célula huésped a una
temperatura por debajo de -20 °C;
- someter la célula huésped a un shock de pH seguido por la Incubación de la célula huésped sin adición de alimentación seguido por el sometimiento de la célula huésped a una temperatura por debajo de -20 °C; o
- incubar la célula huésped sin adición de alimentación seguido por el sometimiento de la célula huésped a un shock de pH seguido por el sometimiento de la célula huésped a una temperatura por debajo de -20 °C.
8. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente en el que la célula huésped gramnegativa está viva durante la etapa b).
9. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente en el que el toxoide bacteriano es un toxoide de difteria, tal como CRM197.
10. El procedimiento de una cualquiera de la reivindicación 1 en el que la secuencia señal periplásmica es:
a) cualquiera de SEQ ID NÚM.: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 18, 20, 22, 24, o 26;
b) variantes de SEQ ID NÚM.: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 18, 20, 22, 24, o 26 que contienen 1,2, o 3 mutaciones, inserciones o supresiones puntuales; o
c) fragmentos de al menos 10 aminoácidos de SEQ ID NÚM.: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 18, 20, 22, 24, o 26.
11. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente que además comprende una etapa d) de purificación del toxoide bacteriano.
12. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente que además comprende una etapa e) de conjugación del toxoide bacteriano a un sacárido, tal como un sacárido bacteriano originado de S. pneumoniae, H. influenzae, N. meningitidis, S. aureus, E. faecalis, E. faecium, Salmonella, o S. epidermidis, por ejemplo, un sacárido capsular de S. pneumoniae seleccionado del grupo que consiste en polisacárido u oligosacárido 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10a , 11a , 12F, 14, 15b , 17F, 18c , 19a , 19F, 20, 22F, 23F y 33F o Haemophilus influenzae b(Hib).
13. El procedimiento de cualquier reivindicación precedente que además comprende una etapa f) de mezcla del toxoide bacteriano con antígenos adicionales.
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