ES2864825T3 - Derivados de azetidina para la obtención de imágenes Tau - Google Patents

Abstract

Un compuesto de fórmula: **(Ver fórmula)** o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Description

DESCRIPCIÓN

Derivados de azetidina para la obtención de imágenes Tau

La presente invención se refiere a un nuevo compuesto 3-(3-fluoroazetidin-1-il) -8-metilbenzo [4,5] imidazo [1,2-a] piridina, y la versión marcada con 18F 3-(3-[18F]-fluoroazetidin-1-ii) -8-metilbenzo [4,5] imidazo [1,2-a] piridina, y a los intermedios para la preparación de estos compuestos, y a los procedimientos de uso de estos compuestos para la obtención de imágenes de tau, y a las composiciones y formulaciones de estos compuestos para la obtención de imágenes de diagnóstico, y procedimientos de obtención de imágenes utilizando estos compuestos, composiciones y formulaciones.

La enfermedad de Alzheimer (EA), una de las principales causas de demencia, se desarrolla en el uno por ciento de la población entre los 65 y los 69 años, y aumenta al 40-50% en los de 95 años o más. Los pacientes con EA presentan síntomas clínicos reveladores que incluyen deterioro cognitivo y déficits en la función de la memoria. En estos pacientes, la presencia de EA se confirma por la carga de placa senil pesada y ovillos neurofibrilares (NFT) que se encuentran en la corteza cerebral tras el examen histopatológico post mortem. Las placas seniles maduras consisten en péptidos p-amiloides extracelulares derivados del procesamiento enzimático de la proteína precursora amiloide y ovillos neurofibrilares intracelulares (NFT), que se derivan de filamentos de proteínas tau hiperfosforiladas. Los agregados de tau hiperfosforilada, como los ovillos neurofibrilares, están relacionados con el grado de deterioro cognitivo en la enfermedad de Alzheimer. En la EA y varias otras tauopatías, los agregados de tau aparecen en regiones cerebrales y patrones particulares que están vinculados al riesgo, inicio o progresión de la enfermedad, y estas regiones y patrones son conocidos por los expertos en la materia. En los pacientes con EA, los ovillos que contienen tau aparecen por primera vez en regiones del cerebro que están muy estrechamente vinculadas a la memoria, y los estudios patológicos muestran que los ovillos pueden correlacionarse aún más con la cognición que las placas. Los expertos en la técnica pueden utilizar las señales que surgen de un agente de obtención de imágenes tau en estas regiones y patrones para controlar y diagnosticar mejor el riesgo, la aparición y la progresión del estado de enfermedad particular. (Véase Correlation of Alzheimer disease neuropathologic changes with cognitive status: a review of the literature. Nelson PT, et al., J Neuropathol Exp Neurol. 2012 May; 71(5):362-81.) Por tanto, se buscan con empeño procedimientos sencillos y no invasivos para la detección y/o cuantificación de los depósitos de tau en los pacientes. (Véase M. Maruyama et al., "Imaging of tau pathology in a tauopathy mouse model and in Alzheimer patients compared to normal controls ", Neuron, 79: 1094-1108, 2013, C. Mathis and W. Klunk, "Imaging Tau Deposits In Vivo: Progress in Viewing More of The Proteopathy Picture ", Neuron, 79: 1035-10-37, 2013).

Los agentes existentes para la obtención de imágenes por PET de tau son conocidos en la técnica; por ejemplo, dichos agentes se enuncian en el documento WO2009/102498, y un compuesto recientemente en evaluación clínica, [18F]T807 (también conocido como AV-1451), se enuncia en el documento WO 2013/176698. (Véase también [(18)F]T807, a novel tau positron emission tomography imaging agent for Alzheimer's disease. Xia CF, et al., Alzheimer's Dement. 2013 Nov; 9(6):666-76.)

Sin embargo, los compuestos de obtención de imágenes de tau existentes tienen atributos técnicos que podrían mejorarse mediante el diseño de agentes innovadores que pueden proporcionar imágenes de tau mejoradas, con una señalización de tau mejorada y una señalización mínima de no tau. Por tanto, se buscan con empeño procedimientos mejorados para detectar y/o cuantificar tau en pacientes.

Existen varios beneficios potenciales de obtener imágenes de tau en el cerebro con agentes de obtención mejorada de imágenes. La obtención mejorada de imágenes de tau mejorará el diagnóstico al identificar pacientes potenciales, aquellos que tienen altos niveles de tau en el cerebro, que pueden tener una mayor probabilidad de desarrollar EA. La obtención de imágenes con un agente PET mejorado también será útil para controlar la acumulación y localización de tau, y/o la progresión de la EA u otras tauopatías, y cuando estén disponibles los tratamientos con fármacos anti-tau, la obtención de imágenes de tau podrá proporcionar una herramienta esencial para controlar el tratamiento.

La presente invención proporciona nuevos compuestos, composiciones, formulaciones y procedimientos para obtener imágenes de tau. Por lo tanto, también se necesita una tecnología mejorada que promueva la capacidad de obtener imágenes de tau en pacientes para expandir los beneficios clínicos y el impacto de la obtención de imágenes diagnósticas de tau. Un agente de obtención de imágenes mejorado proporcionará imágenes tau mejoradas, en comparación con agentes conocidos, produciendo imágenes con mejor claridad debido a señales tau fuertes y señales no tau disminuidas.

La presente invención proporciona el compuesto 3-(3-[18F]-fluoroazetidin-1-yl)-8-methylbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]pyridine, también denominado en el presente documento como "Compuesto 8", que se puede representar estructuralmente como el compuesto de fórmula I:

También se divulga el compuesto 3-(3-fluoroazetidin-1-yl)-8-methylbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]pyridine, también denominado en el presente documento como "Compuesto 4", que puede ser representado estructuralmente como el compuesto de fórmula II:

La presente invención proporciona además el uso del compuesto de fórmula I o mezclas del compuesto de fórmula I y el compuesto de fórmula II, para la preparación de agentes de obtención de imágenes de tau y obtención de imágenes de PET de tau.

La presente invención proporciona además productos intermedios para la preparación del compuesto de fórmula I o el compuesto de fórmula II. La presente invención proporciona un compuesto de fórmula II (indicado como Compuesto 8 más adelante) preparado a partir de un compuesto de fórmula 7:

La invención proporciona además un compuesto de fórmula I preparado a partir de un compuesto de fórmula Ia o fórmula Ib. Una especie preferida de la presente invención es un compuesto de fórmula Ia.

Otra especie preferida de la presente invención es un compuesto de fórmula Ib:

La presente invención proporciona el uso de compuestos de fórmula I, la, Ib o II, para la fabricación de un radiofármaco para la obtención de imágenes de tau en seres humanos. En otro aspecto, la invención proporciona procedimientos para preparar compuestos de fórmula I, Ia, Ib o II. En otro aspecto, la invención proporciona procedimientos para preparar el Compuesto 8 a partir de compuestos de fórmula Ia o Ib. Es particularmente preferido el procedimiento para preparar el Compuesto 8, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, a partir del compuesto de fórmula Ia. En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende el Compuesto 8, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable. En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende el Compuesto 8, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y el Compuesto 4, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable. En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende el Compuesto 8, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, que se formula en EtOH al 10% (v/v), ascorbato de sodio al 0,45% (p/v) en cloruro de sodio al 0,9%, preferiblemente para su uso en humanos. En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende el Compuesto 8, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, preparada a partir de un compuesto de fórmula Ia o Ib, que se formula en EtOH al 10% (v/v), ascorbato de sodio al 0,45% (p/v) en cloruro de sodio al 0,9%, preferiblemente para uso en humanos. La presente invención también proporciona procedimientos de obtención de imágenes de tau que comprenden introducir en un paciente una cantidad detectable de Compuesto 8, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, o una composición del mismo, preferiblemente preparada a partir de un compuesto de un compuesto de fórmula Ia o Ib.

La presente invención proporciona un procedimiento para preparar un compuesto de fórmula I:

que comprende la reacción de 4-metilbencenosulfonato de 1-(8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridin-3-il)azetidin-3-ilo, representado por la fórmula:

con una fuente de fluoruro [18F].

La presente invención proporciona un procedimiento para preparar un compuesto de fórmula I:

que comprende hacer reaccionar un compuesto de fórmula Ib:

con una fuente de fluoruro [18F].

La presente invención proporciona un procedimiento de obtención de imágenes de tau que comprende: introducir en un mamífero una cantidad detectable del compuesto:

dejar tiempo suficiente para que dicho compuesto se asocie con tau, y detectar dicho compuesto.

Se proporcionan los siguientes esquemas, preparaciones y ejemplos para dilucidar mejor la práctica de la presente invención. Las condiciones de reacción adecuadas para las etapas de estos esquemas, preparaciones y ejemplos son bien conocidas en la técnica y la modificación apropiada de las condiciones de reacción, incluida la sustitución de disolventes y co-reactivos, está dentro de la capacidad del experto en la materia.

Además, el experto en la materia apreciará que, en algunas circunstancias, el orden en el que se introducen los restos de molécula no es crítico. El orden particular de las etapas requeridas para preparar los compuestos de Fórmula I o Fórmula II depende del compuesto particular que se sintetiza, el compuesto de partida y la labilidad relativa de los restos sustituidos, como bien apreciará el químico experto. El experto en la materia apreciará que no todos los sustituyentes son compatibles con todas las condiciones de reacción. Estos compuestos pueden protegerse o modificarse en un punto conveniente de la síntesis mediante procedimientos bien conocidos en la técnica. Los productos intermedios y finales de la presente invención pueden purificarse adicionalmente, si se desea, mediante técnicas comunes tales como recristalización o cromatografía sobre soportes sólidos como gel de sílice o alúmina.

Los compuestos de la presente invención se formulan preferiblemente como composiciones radiofarmacéuticas administradas por diversas vías. Preferiblemente, tales composiciones son para uso intravenoso, preferiblemente en humanos. Tales composiciones farmacéuticas y procedimientos para preparar las mismas son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (P.P. Gerbino, 21a ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2006). Los expertos en la técnica conocen procedimientos para usar agentes de obtención de imágenes de tau para la obtención de imágenes de tau por PET. Véase, por ejemplo, [(18)F]T807, a novel tau positron emission tomography imaging agent for Alzheimer's disease. Xia CF, et al., Alzheimer's Dement. 2013 Nov; 9(6):666-76.). [(18)F]T807 también se conoce como [18F] AV-1451.

Las formulaciones preferidas de la presente invención son preparaciones del compuesto 8 preparadas a partir de un compuesto de fórmula Ia. Es particularmente preferido el Compuesto 8 preparado a partir del compuesto de fórmula Ia según los procedimientos descritos en este documento según el Esquema 2. Es particularmente preferido el Compuesto 8 preparado a partir del compuesto de fórmula Ia según los procedimientos descritos en el presente documento según el Ejemplo 2. Una formulación preferida del Compuesto 8 se formula en EtOH al 10% (v/v), ascorbato de sodio al 0,45% (p/v) en cloruro de sodio al 0,9%, preferiblemente para uso en seres humanos. Otra forma de realización de la invención es una formulación del Compuesto 8 preparada a partir del compuesto de fórmula Ia y formulada en EtOH al 10% (v/v), ascorbato de sodio al 0,45% (p/v) en cloruro de sodio al 0,9%. Es particularmente preferido el Compuesto 4 preparado de acuerdo con los procedimientos descritos en este documento de acuerdo con el Esquema 1. Es particularmente preferido el Compuesto 8 preparado a partir del compuesto de fórmula Ia según los procedimientos descritos en el presente documento según el Ejemplo 2 y formulado en EtOH al 10% (v/v), ascorbato de sodio al 0,45% (p/v) en cloruro de sodio al 0,9%. La presente invención proporciona un procedimiento de obtención de imágenes de tau que comprende introducir en un mamífero una cantidad detectable de una composición de diagnóstico como se describe de acuerdo con las formas de realización de la presente publicación, y dejar tiempo suficiente para que dicha composición de diagnóstico se asocie con tau; y detectar la composición de diagnóstico. Es particularmente preferido un procedimiento de obtención de imágenes de tau que comprende introducir en un mamífero una cantidad detectable de una composición de diagnóstico del Compuesto 8, preparada a partir del compuesto de fórmula Ia según los procedimientos descritos en el presente documento según el Ejemplo 2, y formulada en EtOH al 10% (v/v), ascorbato de sodio al 0,45% (p/v) en cloruro de sodio al 0,9%.

Se ha descubierto que los nuevos compuestos de Fórmula I y II son sorprendentemente e inesperadamente ventajosos para la obtención de imágenes de tau, que incluyen preferiblemente la obtención de imágenes clínicas en humanos. Un compuesto preferido, el compuesto de fórmula I, también denominado en el presente documento Compuesto 8, posee una combinación de propiedades particularmente útiles para la obtención de imágenes de tau, que incluyen alta afinidad por tau, selectividad, captación, eliminación y perfil metabólico. El compuesto 8 in vivo demuestra una distribución tisular ventajosa, farmacocinética y estabilidad metabólica. El compuesto 8, ex vivo y/o in vitro, demuestra una unión de alta afinidad a tau, y etiqueta muestras de tejido que contienen tau de un cerebro con EA con alta selectividad con respecto a la unión de Ap y/o no tau. El compuesto 8 demuestra alta afinidad y selectividad por tau, y exhibe señales radiográficas que son específicas del estado de enfermedad, tejido y ubicación celular. Las señales radiográficas generadas por el Compuesto 8 reflejan una detección mejorada de tau en comparación con señales no deseadas no tau, y una distribución de tejido in vivo y un perfil metabólico que son útiles para un agente de obtención de imágenes radiofarmacéuticas clínicas. El compuesto 8, que tiene esta combinación de propiedades particularmente útiles, proporciona imágenes de tau mejoradas, en comparación con agentes conocidos, y produce imágenes con claridad mejorada debido a señales tau robustas y señales no tau disminuidas. Esta combinación sorprendentemente ventajosa de propiedades proporciona un agente de obtención de imágenes clínicas de tau, eficaz, lo que facilita la obtención de imágenes de pacientes para tau. El uso del Compuesto 8 en la obtención de imágenes clínicas de PET de tau tendría un impacto positivo importante en la evaluación o el diagnóstico de la EA y avanzaría en la detección, el tratamiento, la monitorización y la evaluación de tau y el diagnóstico de enfermedades que implican tau.

Descripción de las Figuras:

Figura 1. Cromatograma representativo de HPLC semipreparativa de 3-(3-[18F]-Fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridine (Compuesto 8) Radiosíntesis. El panel superior ilustra un cromatógrafo HPLC con detección gamma. El panel inferior ilustra un cromatógrafo HPLC con detección UV. El segmento indicado como "pico de corte" indica las fracciones correspondientes recolectadas para obtener el producto 3-(3-[18F]-Fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridine (Compuesto 8).

Figura 2. Cromatograma representativo de HPLC analítica (QC) de 3-(3-[18F]-fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina (Compuesto 8). El panel superior etiquetado (HPLC Gamma Detector) ilustra un radio-cromatograma de 3-(3-[18F]-fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina (Compuesto 8). El panel inferior etiquetado (HPLC UV Detector) ilustra un cromatograma ultravioleta de 3-(3-[18F]-Fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina (Compuesto 8). El tiempo máximo de retención de 6,589 minutos se indica en el pico principal en el panel superior, y el tiempo máximo de retención de 6,607 minutos se indica en el pico principal en el panel inferior.

Figura 3. Autorradiografía de 3-(3-[18F]-Fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina (Compuesto 8) en secciones de cerebro con EA para la determinación de Kd. Véase Ejemplo de ensayo 4 para obtener una explicación de la configuración experimental y el análisis.

Figura 4. Autorradiografía de 3-(3-[18F]-Fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina en secciones de cerebro con EA para la determinación de la selectividad. véase Ejemplo de ensayo 5 para obtener una explicación de la configuración experimental y el análisis.

Figura 5. Autorradiografía de 3-(4-(2-[18F]-Fluoroetil)piperidin-1-il)-8-metoxibenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina en secciones de cerebro con EA para la determinación de la selectividad. Véase Ejemplo de ensayo 5 para obtener una explicación de la configuración experimental y el análisis.

Figura 6. Autorradiografía de 3-(4-[18F]-Fluoropiperidin-1-il)-8-metoxibenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina en secciones de cerebro con EA para la determinación de la selectividad. Véase Ejemplo de ensayo 5 para obtener una explicación de la configuración experimental y el análisis.

Figura 7. Autorradiografía de 3-(3-[18F]-Fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina, Compuesto 8 en secciones de cerebro normales frente a secciones de cerebro con EA. Véase Ejemplo de ensayo 6 para obtener una explicación de la configuración experimental y el análisis.

Figura 8. autorradiografía 3-(3-[18F]-Fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina (Compuesto 8) y [18F] AV-1451 (también conocido como [18F] T807), en secciones de cerebro normales frente a secciones de cerebro con EA utilizando lavados libres de alcohol. Véase Ejemplo de ensayo 6 para obtener una explicación de la configuración experimental y el análisis.

Figura 9. Curvas de actividad de tiempo de PET/CT de ratón de 3-(4-(2-[18F]-Fluoroetil)piperidin-1-il)-8-metoxibenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina (AKA T821) frente a 3-(3-[18F]-Fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina (Compuesto 8).

Figura 10. Curvas de actividad de tiempo de PET/CT de ratón de 3-(4-[18F]-Fluoropiperidin-1-il)-8-metoxibenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina (AkA T798) versus 3-(3-[18F]-Fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina (Compuesto 8).

Ejemplos y preparaciones

Procedimientos generales

Todas las reacciones se llevan a cabo en una atmósfera de nitrógeno a menos que se indique lo contrario. Los productos se purifican utilizando un sistema de cromatografía automatizado Teledyne Isco Flash®. Los espectros de RMN de 1H, 19F y 13C se registran en un espectrómetro Bruker® HD Avance III 400 en CDCh (Cambridge Isotope Laboratories, Cat. No. DLM-7-100) o DMSO-d6, (Cambridge Isotope Laboratories, Cat. No. DLM-10-25). Los datos de HRMS se obtienen en un espectrómetro de masas Waters® QTof usando un modo de barrido positivo de ionización por electropulverización. El análisis elemental se realiza en Galbraith Laboratories utilizando el procedimiento GLI ME-14 (Galbraith Inc., 2323 Sycamore Drive, Knoxville, TN 37921). Los reactivos, disolventes y suministros son conocidos para el químico experto. Los nombres de los compuestos de la presente invención se pueden generar, por ejemplo, usando Symyx Versión 3.2. NET con la funcionalidad de nomenclatura IUPAC.

Las abreviaturas representan el uso común y ordinario conocido por un experto en la técnica y las abreviaturas particulares utilizadas aquí tienen los siguientes significados:

Abreviaturas:

BPV Vial de producto a granel

bs singlete amplio

CDCla cloroformo deuterado

CH2Cl2 cloruro de metileno

d doblete

DAD detector de disposición de diodos

dd doblete de dobletes

dt doblete de tripletes

DMPAO acido [(2 ,6-dimetilfenil) amino] (oxo) acético

DMSO dimetilsulfóxido

DMSO-d6 hexadeuterodimetilsulfóxido

EtOH etanol

HPLC cromatografía líquida de alto rendimiento

HRMS epectrometría de masa de alta resolución

IHC inmunohistoquímica

K2CO3 carbonato de potasio

LCMS cromatografía líquida espectrometría de masa

N normal

NMR resonancia magnética nuclear

PHF filamentos helicoidales en pares

ppm partes por millón

QTof tiempo de vuelo cuaternario

s singlete

SUV valor de captación estandarizado de

SUVr relación de valor de captación estandarizado

t triplete

UPLC cromatografía líquida de ultra alto rendimiento

PBS solución salina con pH regulado con fosfato

WFI agua para inyección

Esquemas

El esquema 1 proporciona la síntesis de 3-(3-fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina. La síntesis comienza con la formación del núcleo de benzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina a través de un acoplamiento catalizado por cobre de 2-bromo-4-metilanilina y 2,4-dibromopiridina disponibles comercialmente seguido por ciclación intramolecular. El producto deseado, 3-(3-fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina, se obtiene mediante un segundo acoplamiento catalizado por cobre de 3-bromo-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina (3) e hidroclorato de 3-fluoroazetidina. Después de cromatografía en columna sobre gel de sílice, depuración de metales con resina Quadrasil MP y trituración, se obtiene 3-(3-fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina (Compuesto 4) como un sólido amarillo (4,44 g, rendimiento general del 21%).

Esquema 1: Síntesis de 3-(3-fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina.

F r z i in H

El esquema 2 proporciona la síntesis de 1-(8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridin-3-il) azetidin-3-il 4-metilbencenosulfonato, que es el precursor de 3-(3-[18F]-fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina. El acoplamiento catalizado con cobre de 3-bromo-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina (3) y 3-hidroxiazetidina ofrece el producto intermedio de hidroxilo 1-(8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridin-3-il) azetidin-3-ol (5), que también se purifica mediante cromatografía en columna de gel de sílice. El producto intermedio puro se hace reaccionar luego con anhídrido de tosilo y trietilamina, seguido por cromatografía en columna de gel de sílice para dar el producto deseado, 4-metilbencenosulfonato de 1-(8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridin-3-il)azetidina-3-ilo (6), como un sólido beige (3,21 g, 31% de rendimiento general).

Esquema 2: Síntesis de 4-metilbencenosulfonato de 1-(8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridin-3-il)azetidin-3-ilo

Según el esquema 3, se prepara 3-(3-[18F]-fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina, compuesto 8, a partir de un compuesto de fórmula 7 donde R es un grupo saliente adecuado. Más específicamente, un compuesto de fórmula 7 donde R es un grupo saliente tal como metanosulfonilo (mesilo) o 4-metilbencenosulfonilo (tosilo); se puede hacer reaccionar con una fuente adecuada de 18F fluoruro ([18F]F-) en presencia de una base adecuada tal como carbonato de potasio. Las fuentes de 18F fluoruro ([18F]F-) incluyen [18F]F K222. Los disolventes adecuados incluyen dimetilsulfóxido.

Esquema 3: Síntesis de 3-(3-[18F]-Fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina (8).

Ejemplo 1

Síntesis de 3-(3-fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina (Compuesto 4).

Etapa 1: Síntesis de 3-Bromo-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina (Compuesto 3).

En un matraz de fondo redondo de 1 l se combinan 2,4-dibromopiridina (20,0 g, 84,6 mmol), yoduro de cobre (3,22 g, 16,9 mmol), 1 ,10-fenantrolina (6,10 g, 33,8 mmol), carbonato de cesio (110 g, 338 mmol), Celite® (16 g) y p-xileno (170 ml). A la suspensión resultante se le añade 2-bromo-4-metilanilina (10,6 ml, 84,6 mmol) y se burbujea nitrógeno a través de la mezcla vigorosamente agitada durante 10 minutos. El matraz está equipado con un condensador de reflujo y el sistema se calienta a 135 °C durante 24 horas. La mezcla de reacción se enfría a temperatura ambiente y se filtra. La torta de filtración se enjuaga con cloruro de metileno y acetato de etilo, y los filtrados orgánicos combinados se concentran a presión reducida sobre gel de sílice. El producto de reacción crudo se purifica por cromatografía sobre gel de sílice usando un gradiente de acetato de etilo del 0 al 10% en cloruro de metileno. El sólido marrón resultante se suspende en cloruro de metileno y se tritura usando hexanos, luego se aísla por filtración para proporcionar el compuesto del título (6,52 g, 25,0 mmol, 30% de rendimiento) en forma de un sólido amarillo brillante: 1H NMR (400,13 MHz, DMSO-d6 con TFA-d) 8 ppm: 9,40 (dd, J=0,9, 7,2Hz, 1H), 8,45 (dd, J=0,7, 1,8Hz, 1H), 8,42 (bs, 1H), 7,86 (dd, J=2,1, 7,3Hz, 1H), 7,83 (d, J=8,4Hz, 1H), 7,64 (dd, J=0,9, 8,4Hz, 1H), 2.57 (s, 3H); 13C NMR (100,62 MHz, DMSO-d6 con TFA-d) 8 ppm 142,6, 134,6, 131,9, 130,8, 129,9, 129,4, 127,0, 119,7, 115,0, 113,8, 113,4, 21,1; HRMS (m/z): encontrado: 261,0013 (M+H), calculado para C12H1üN2Br: 261,0027, Err = -5,4 ppm.

Etapa 2: Síntesis de 3-(3-fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina (Compuesto 4).

A una mezcla sólida de 3-bromo-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina (6,52 g, 25,0 mmol), clorhidrato de 3-fluoroazetidina (3,90 g, 35,0 mmol), yoduro de cobre (I) (475 mg, 2,50 mmol), ácido [(2,6-dimetilfenil)amino](oxo) acético (DMPAO, 963 mg, 4,99 mmol) y fosfato de potasio (15,9 g, 74,9 mmol) se añade dimetilsulfóxido (110 ml). Se inicia la agitación y se burbujea nitrógeno a través de la suspensión durante 15 minutos. El sistema está equipado con un condensador de reflujo, el espacio vacío se purga con nitrógeno y la mezcla se calienta a 90 °C durante 48 horas. Se añaden más clorhidrato de 3-fluoroazetidina (1,39 g, 12,5 mmol), yoduro de cobre (I) (166 mg, 0,871 mmol), DMPAO (344 mg, 1,78 mmol) y fosfato de potasio (5,56 g, 26,2 mmol) y se continúa agitando a 90 °C durante 24 horas más. La mezcla de reacción se enfría a temperatura ambiente y se agrega lentamente a agua (1000 ml) con agitación vigorosa. Los sólidos precipitados se aíslan mediante filtración al vacío y el filtrado acuoso se extrae con metanol al 10% en cloruro de metileno (3 x 250 ml). Los extractos orgánicos se combinan con los sólidos aislados de la filtración acuosa inicial, se secan sobre sulfato de sodio y se concentran a presión reducida. Los sólidos en bruto aislados (6,46 g) se preabsorben en gel de sílice (40 g) y se purifican mediante cromatografía en gel de sílice usando un gradiente de acetato de etilo del 0 al 20% en cloruro de metileno seguido de un gradiente de metanol del 0 al 10% en cloruro de metileno. Las fracciones reunidas se concentran y los sólidos de color amarillo oscuro resultantes (5,43 g) se suspenden y se someten a sonicación en cloruro de metileno (40 ml). Se añade éter dietílico (800 ml) y el sólido amarillo brillante se aísla por filtración, se lava con más éter dietílico (400 ml) y se seca a alto vacío. Una solución del producto aislado (4,62 g) en metanol al 10%/cloruro de metileno (200 ml) se trata con resina Quadrasil MP (1,60 g) y la suspensión se agita durante 2 horas a temperatura ambiente. La suspensión se filtra y los sólidos se enjuagan con metanol/cloruro de metileno (100 ml). Los compuestos orgánicos combinados se concentran a presión reducida y el sólido resultante se suspende en cloruro de metileno, se somete a sonicación y se tritura en éter dietílico (750 ml). Los sólidos precipitados se recogen mediante filtración al vacío, se enjuagan con éter dietílico y se secan al vacío para obtenerr el compuesto del título como un polvo amarillo (4,44 g, 17,4 mmol, rendimiento del 70% en 2 etapas): 1H NMR (400,13 MHz, CDCh) 8 ppm: 8,11 (dd, J=0,7, 7,5Hz, 1H), 7,63 (d, J=8,3Hz, 1H), 7,47-7,48 (m, 1H), 7,23 (ddd, J=0,5, 1,5, 8,3Hz, 1H), 6,26 (d, 2,1Hz, 1H), 6,13 (dd, J=2,5, 7,3Hz, 1H), 5,35-5,54 (m, 1H), 4,24-4,34 (m, 2H), 4,07­ 4,17 (m, 2H), 2,53 (s, 3H); 13C NMR (100,62 MHz, CDCla) 8 ppm: 150,7, 150,3 (d, J=1,5Hz), 143,7, 129,5, 129,0, 126,5, 125,5, 118,1, 109,4, 101,0, 91,6, 82,2 (d, J=206,9Hz), 59,1 (d, J=24,9Hz), 21,8; 19F NMR (376,44 MHz, CDCh) 8 ppm: -180,4; HRMS (m/z): encontrado: 256,1244 (M+H), calculado para C15H15N3F: 256,1250, Err = -2,3 ppm; análisis elemental (procedimiento GLI ME-14): calculado para C15H14FN3 C 70,57 H 5,53 N 16,46, encontrado C 70,17 H 5,68 N 16,43, diferencia máxima = 0,41.

Preparación 1

Síntesis de 1-(8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridin-3-il) azetidin-3-il 4-metilbencenosulfonato (Compuesto 6).

Etapa 1: Síntesis de 1-(8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridin-3-il) azetidin-3-ol (Compuesto 5).

A una mezcla sólida de 3-bromo-8-metilbenzo [4,5] imidazo [1,2-a] piridina (6,57 g, 25,2 mmol), clorhidrato de azetidin-3-ol (5,52 g, 50,4 mmol), yoduro de cobre (I) (480 mg, 2,52 mmol), ácido [(2,6-dimetilfenil) amino] (oxo) acético (DMPAO, 972 mg, 5,04 mmol) y fosfato de potasio (21,4 g, 101 mmol) se añade dimetilsulfóxido (110 ml). Se inicia la agitación y se burbujea nitrógeno a través de la suspensión durante 15 minutos. El sistema está equipado con un condensador de reflujo, el espacio vacío se purga con nitrógeno y la mezcla se calienta a 90 °C durante 24 horas. La mezcla de reacción se enfría a temperatura ambiente y se agrega lentamente a agua (1000 ml) con agitación vigorosa. Los sólidos precipitados se aíslan mediante filtración al vacío y se disuelven en metanol al 10% en cloruro de metileno (500 ml). El filtrado acuoso se extrae con metanol al 10% en cloruro de metileno (3 x 250 ml). Los extractos orgánicos se combinan con la solución de sólidos aislados de la filtración acuosa inicial y la mezcla se seca sobre sulfato de sodio, se filtra y se concentra a presión reducida. El sólido resultante se disuelve en cloruro de metileno, se preabsorbe en gel de sílice y se purifica por cromatografía en gel de sílice usando un gradiente de metanol en cloruro del 0 al 30% de metileno para obtener el producto del título como un sólido verde grisáceo (3,18 g, 50%): 1HNMR (400,13 MHz, DMSO-d6 con TFA-d) 8 ppm: 8,95 (d, J=7,6Hz, 1H), 8,06 (s, 1H), 7,51 (d, J=8,2Hz, 1H), 7,36 (dd, J=0.9, 8,3Hz, 1H), 6,76 (dd, J=2.3, 7,5Hz, 1H), 6,27 (d, J=2.1Hz, 1H), 4,66-4,71 (m, 1H), 4,38-4,41 (m, 2H), 3,92-3,95 (m, 2H), 2,48 (s, 3H); 13C NMR (100,62 MHz, DMSO-d6 con TFA-d) 8 ppm: 153,6, 144,6, 132,4, 129,5, 128,6, 128,1, 126,9, 112,0, 111,9, 104,3, 83,3, 61,0, 60,16, 21,0; HRMS (m/z): encontrado: 254,1296 (M+H), calculado por C-iaH ^ O : 254,1293, Err = 1,2 ppm.

Etapa 2: 4-metilbencenosulfonato de 1 -(8-Metilbenzo[4,5]imidazol[1,2-a]piridin-3-il)azetidin-3-ilo (Compuesto 6).

Una suspensión de 1-(8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridin-3-il)azetidin-3-ol (Compuesto 5) (3,18 g, 12,6 mmol) en diclorometano (135 ml) se trata con trietilamina (17,5 ml, 126 mmol), se agita durante 10 minutos y luego se añade anhídrido p-toluenosulfónico (12,31 g, 37,7 mmol). La reacción se agita a temperatura ambiente durante 22 horas. Se añade más anhídrido p-toluenosulfónico (1,84 g, 5,6 mmol) y la reacción se agita durante 6 horas. La mezcla de reacción se concentra, se resuspende en cloruro de metileno (175 ml) y se trata con una solución acuosa de hidróxido de sodio 1 N (150 ml). La mezcla se agita vigorosamente durante 1,5 horas, se transfiere a un embudo de decantación y se separan las capas. La capa orgánica se agita vigorosamente con una solución acuosa de hidróxido de sodio de 1 N (2 x 100 ml, 1 x 150 ml). La capa orgánica se seca sobre sulfato de magnesio, se filtra, se concentra y se seca a alto vacío. Se concentra una solución del sólido marrón aislado en metanol al 10% en cloruro de metileno sobre gel de sílice (24 g) a presión reducida. El compuesto del título se purifica mediante cromatografía sobre gel de sílice usando un gradiente de 0 a 10% de metanol en cloruro de metileno. El sólido resultante se suspende en cloruro de metileno (aproximadamente 50 ml), se expone a sonicación y se tritura con éter dietílico (750 ml). Los sólidos precipitados se recogen por filtración, se enjuagan con éter dietílico y se secan al vacío para obtener 4-metilbencenosulfonato de 1-(8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridin-3-il)azetidin-3-ilo en forma de un sólido beige (3,21 g, 7,89 mmol, rendimiento del 63%): 1H NMR (400,13 MHz, DMSO-da con TFA-d) 5 ppm: 9,01 (d, J=7,7Hz, 1H), 8,11 (bs, 1H), 7,85-7,88 (m, 2H), 7,52-7,55 (m, 3H), 7,39 (dd, J=1,0, 8,3Hz, 1H), 6,82 (dd, J=2,2, 7,5Hz, 1H), 6,38 (d, J=2,3Hz, 1H), 5,32-5,37 (m, 1H), 4,94-4,54 (m, 2H), 4,21-4,25 (m, 2H), 2,46 (s, 3H); 13C NMR (100,62 MHz, DMSO-da con TFA-d) 5 ppm: 153,3, 145,6, 144,3, 132,6, 132,2, 130,4, 129,5, 128,7, 128,3, 127,7, 126,9, 112,2, 112,0, 104,4, 84,4, 68,5, 58,4, 21,1, 21,0; HRMS (m/z): encontrado: 408,1401 (M+H), calculado para C15H16N3O: 408,1382, Err = 4,7 ppm; análisis elemental (procedimiento GLI ME-14): calculado para C22H21N3O3S C 64,85 H 5,19 N 10,31, encontrado C 64,38 H 5,27 N 10,27, diferencia máxima = 0,48,

Ejemplo 2

Síntesis de 3-(3-[18F]-Fluroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridine (Compuesto 8).

La síntesis de 3-(3-[18F]-Fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina se realiza usando un radiosintetizador automatizado GE TRACERlab FXf-n automatizado con una actividad inicial de 1-2 Ci. Un tiempo de síntesis típico es ~ 60 ± 5 minutos y el intervalo de rendimiento corregido por desintegración es 22-44%. La actividad de [18F] fluoruro se retiene en un cartucho de Sep-Pak Accell Plus QMA Carbonate Plus Light (46 mg de absorbente por cartucho, tamaño de partícula de 40 pm, Waters parte número 186004540) y se eluye al recipiente de reacción usando 0,8 ml de solución acuosa de Cryptand 2.2.2-K2CO3 [Cryptand 2.2.2 (7 mg) y carbonato de potasio (0,75 mg) en acetonitrilo (0,4 ml) y WFI (agua para inyección, 0,4 ml), respectivamente]. La actividad eluida se seca calentando a 70 °C bajo un flujo de nitrógeno y al vacío durante 4,5 minutos. A continuación, se eleva la temperatura a 100 °C al vacío durante 5 minutos para producir [18F] fluoruro anhidro de Cryptand 2.2.2-K2CO3,

Se añade una solución de 4-metilbencenosulfonato de 1-(8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridin-3-il)azetidin-3-ilo [1 mg en dimetilsulfóxido anhidro (2 ml)] al recipiente de reacción que contiene el [18F]fluoruro anhidro de Cryptand 2.2.2-K2CO3 y la mezcla resultante se mantiene a 140°C durante 10 minutos seguido de hidrólisis con 1 ml de hidróxido de sodio de 1N a 65°C durante 3 minutos. Después de enfriar a 60°C, la mezcla de reacción bruta se neutraliza con 2 ml de ácido clorhídrico (HCl) de 0,5 N (1 ml de HCl de 1N 1 ml WFI). A continuación, el crudo de reacción se carga en una columna de HPLC semipreparativa para su purificación usando elución isocrática (véase la Figura 1 para un cromatograma representativo). Columna semipreparativa: Agilent ZORBAX Eclipse Plus fenil-hexilo, Custom PN, 5 pm, 9,4 mm x 250 mm, velocidad de flujo = 4 ml/min; 280 nm; tiempo de retención ~ 12-13 minutos. Composición de la fase móvil: 76% de HCl de 9 mM en WFI (3 ml de HCl de 3N en 1 L de WFI), 24% de acetonitrilo (grado HPLC).

La fracción de HPLC que contiene la 3-(3-[18F]-fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina purificada se diluye con 0,5% (p/v) de ascorbato de sodio en WFI (40 ml). A continuación, la solución diluida se pasa a través de un cartucho ligero Sep-Pak® C18 Plus (130 mg de sorbente por cartucho, tamaño de partícula de 55-105 pm, Waters parte número WAT023501; acondicionado con etanol (5 ml) y luego WFI (5 ml) antes de usar) y la 3-(3-[18F]-fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina retenida se lava con 0,5% (p/v) de ascorbato de sodio en agua para solución inyectable (10 ml). 3-(3-[18F]-fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina se eluye del cartucho C18 usando alcohol deshidratado, USP (1 ml) en un matraz que contiene 7 ml de ascorbato de sodio al 0,5% (p/v) en cloruro de sodio al 0,9% para inyección, USP. A continuación, el cartucho C18 se enjuaga con 2 ml adicionales de ascorbato de sodio al 0,5% (p/v) en cloruro de sodio al 0,9% para inyección, USP. La solución resultante (10 ml en total) se filtra de forma estéril a través de un filtro de 0,22 pm PVDF Millex GV (Millipore SLGV013SL) en el vial de producto a granel (BPV; Vial vacío estéril de 30 ml de Allergy Laboratories con un tapón de clorobutilo de 20 mm). Se extrae una muestra del BPV para el control de calidad (véase la Figura 2 para ver el cromatograma representativo) mediante HPLC utilizando el método de gradiente detallado en la Tabla 1 a continuación.

Tabla 1. Procedimiento de HPLC analítica* para 3-(3-[18F]-fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina.

Minuto 0.1% (v /v j T F A en H 20 Acetonitrilo

A. Condiciones de columna analítica como siguen: Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C184,6 mm x 150 mm, Parte No. 993967-902, velocidad de flujo = 1ml/min; UV = 320nm.

Se evalúa la estabilidad preliminar de las formulaciones de 3-(3-[18F]-fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina (Compuesto 8). Se toman muestras de lotes (tamaño que varía de 235 mCi a 471 mCi) y se analizan mediante HPLC para determinar la pureza radioquímica durante un período de tiempo de 6 horas. Los lotes formulados con ascorbato de sodio retienen un 96-97% de pureza hasta 6 horas, mientras que el lote formulado sin ascorbato de sodio se deteriora con el tiempo y se degrada en 5 horas. Véase la Tabla 2 para obtener más detalles.

Tabla 2. Resultados de estabilidad de 3-(3-[18F]-fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina

Ejemplo de ensayo 3:

Determinación de Ki de 3-(3-fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina versus [18F]AV-1451, y Kd de 3-(3-[18F]-fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina, utilizando tau de donantes con enfermedad de Alzheimer.

Preparacion de PHF:

El PHF soluble purificado se aísla del tejido cerebral con EA usando un protocolo modificado del procedimiento descrito por Jicha, et al. (G. A. Jicha, A. O'Donnell, C. Weaver (1999) "Hierarchical phosphorilation of recombinant tau by the paired-helical filament-associated protein kinase is dependent on cyclic AMP-dependent protein kinase" J Neurochem 72(1):214). Brevemente, la corteza de EA se homogeneiza usando un Kinematica Polytron de mano, seguido por lote a alta presión - expansión de gas usando una bomba de perturbación de células Parr. El homogeneizado crudo se centrifuga a 28 kg para sedimentar los desechos celulares. El PHF soluble se aísla del sobrenadante mediante cromatografía de afinidad sobre una columna Affigel-10 en la que se ha inmovilizado el anticuerpo tau MC1, que reconoce una conformación patológica de tau (G. A. Jicha, R. Bowser, I. G. Kazam (1997), "Alz-50 and MC-1, a new monoclonal antibody raised to paired helical filaments, recognize conformational epitopes on recombinant tau" J Neurosci Res. 48(2): 12.)

Determinación de Ki de 3-(3-Fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina:

La IC50 (es decir, la concentración molar de ligando competidor que reduce la unión específica de un radioligando en un 50%) para el compuesto no etiquetado se determina mediante la unión de radioligando de competencia, en la que la unión de [18F]AV-1451 con PHF compite con compuesto no etiquetado en diversas concentraciones. La mezcla de reacción (2O0 pl) contiene PHF (0,12 ug), [18F]AV-1451 a 0,1-0,5 nM y compuesto frío diluido en serie desde 316 nM hasta 0,01 nM; los ensayos se realizan en PBS, pH 7,4 que contiene albúmina de suero bovino al 0,01% en microplacas de polipropileno de 96 cavidades. La unión no específica se define como la unión del radioligando en presencia de T808/AV-680 (5 pM), un ligando de PHF conocido (Zhang, J. (2012), "A highly selective and specific PET tracer for imaging of tau pathologies" J Alzheimers Dis., 31(3):601). Después de la incubación durante 1,5 h a 37°C, la radioactividad vinculada se recoge en placas de filtro FB de fibra de vidrio Millipore MultiScreenHTS de 96 pozos utilizando un colector de vacío Millipore MultiScreenHTS, seguido de cinco lavados con PBS, pH 7,4. Los filtros que contienen [18F]AV-1451 unido se analizan para determinar la radiactividad en un contador gamma automático Wizard 2480 [Perkin Elmer]. Usando estas condiciones de ensayo, la fracción enlazada total es típicamente menos del 10% del radioligando añadido. El IC50 se determina utilizando un ActivityBase o XLfit modelo 205 (o un modelo comparable) en el que:

y= A (B-A)/(1 ((C/x)AD)

Y =% de inhibición

X = concentración del ligando de competencia frío (nM)

A = Y mínimo (0%)

B = Y máximo (100%)

C = IC50

D = factor de pendiente

La Ki (es decir, la constante de disociación de equilibrio para el enlace del compuesto no etiquetado) se calcula a partir del valor de IC50 utilizando la ecuación de Cheng-Prusoff equation (Cheng Y., Prusoff W.H. (1973), "Relationship between the inhibition constant (KI) and the concentration of inhibitor which causes 50 percent inhibition (I50) of an enzymatic reaction" Biochem Pharmacol 22 (23):3099-3108):

Ki = IC50/(1 [L]/Kd)

[L] = la concentración de [18F]AV-1451 (típicamente ~ 0,5 nM)

Kd = la constante de disociación para [18F]AV-1451 (0,57 nM).

La Ki versus [18F] AV-1451 para 3-(3-fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina es 0,6 nM en tau que se obtiene de donantes con enfermedad de Alzheimer que indica que este compuesto se une a tau. Por tanto, la obtención de imágenes por PET con el compuesto 8 y el examen del patrón de obtención de imágenes sería útil para detectar la presencia de tau en pacientes y podría confirmar un diagnóstico de tauopatías con o sin EA.

Determinación de Kd de 3-(3-[18F]-Fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina:

La constante de disociación [Kd] para el compuesto 3-(3-[18F]-fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina etiquetado radioactivamente se determina mediante unión por saturación, en donde la unión total e inespecífica del radioligando se mide a diversas concentraciones de radioligando. La mezcla de reacción (250 j l) contiene PHF (1500,15 jg ) y 3-(3-[18F]-fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina, diluida en serie de 25 nM a 0,3 nM en PBS; los ensayos se realizan en PBS que contiene albúmina de suero bovino al 0,01% en microplacas de polipropileno de 96 cavidades. La unión no específica se define como la unión del radioligando en presencia de T808/AV-680 (10 jM ). Después de la incubación durante 1,5 h a 37°C, la radiactividad vinculada se recolecta mediante filtración al vacío sobre placas de filtro FB de fibra de vidrio de 96 cavidades Millipore MultiScreenHTS, utilizando un colector de vacío Millipore MultiScreenHTS, seguido de cinco lavados con PBS. Los filtros que contienen 3-(3-[18F]-fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina unida se analizan para determinar la radiactividad en un contador gamma automático Wizard 2480 [Perkin Elmer]. Usando estas condiciones de ensayo, la fracción total unida es típicamente menos del 10% del radioligando añadido. Los datos de unión total y unión no específica se analizan mediante análisis de regresión no lineal utilizando Graphpad Prism para determinar la Kd del radioligando.

La Kd de 3-(3-[18F]-fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina es 0,85 ± 0,02 nM en tau que se obtiene de donantes con enfermedad de Alzheimer, lo que indica que este compuesto se une a tau con alta afinidad. Por tanto, la obtención de imágenes por PET con el compuesto 8 y el examen del patrón de obtención de imágenes sería útil para detectar la presencia de tau en pacientes y podría confirmar un diagnóstico de tauopatías con o sin EA.

Ejemplo de ensayo 4

Determinación de Kd para la unión de 3-(3-[18F]-Fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina a agregados de tau nativos en el tejido cerebral de EA humana

Se emplea la autorradiografía en la determinación de Kd de la unión de 3-(3-[18F]-fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina a agregados de tau nativos en el cerebro humano con secciones de EA que han sido caracterizadas usando inmunotinción anti-tau y anti-amiloide de acuerdo con procedimientos conocidos por el experto en la materia (véase, por ejemplo, [(18)F]t 807, a novel tau positron emission tomography imaging agent for Alzheimer's disease. Xia CF, et al., Alzheimer's Dement. 2013 Nov; 9(6):666-76), (Zhang, J. (2012), "A highly selective and specific PET tracer for imaging of tau pathologies" J Alzheimers Dis., 31(3): 601). El experimento utiliza 15 secciones adyacentes del lóbulo frontal de cada uno de dos cerebros de AD: un cerebro rico en tau y rico en amiloide (Tau+ Ap+), así como un cerebro pobre en tau y rico en amiloide (Tau-Ap+) para definir la unión no especifica. Las secciones se cubren con 0,5 ml de 3-(3-[18F]-fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina, diluido en serie de ~ 250 nM en regulador de pH de unión (2,5% de dimetilsulfóxido 2,5% de etanol en PBS, pH 7,4). Después de 60 min de incubación a temperatura ambiente, el ligando no unido se elimina mediante sucesivos ciclos de lavado (2 minutos en PBS, 2 minutos en etanol al 30%/PBS, 2 minutos en etanol al 70%/PBS, 2 minutos en PBS). Después de secar bajo la campana, las secciones se exponen durante la noche a una pantalla de obtención de imágenes de fósforo. La señal de autorradiografía registrada en la pantalla de obtención de imágenes de fósforo se lee utilizando un GE Healthcare Life Sciences Typhoon FLA 7000 Phosphorimager. La intensidad de la señal en la materia gris se mide con el software Fujifilm Multi Gauge. La Kd del compuesto se determina mediante análisis de regresión no lineal de la concentración unida de 3-(3-fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina frente a la concentración de compuesto libre.

La autorradiografía de 3-(3-[18F]-fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina en secciones de cerebro con EA para la determinación de Kd se muestra en la Figura 3. La Kd para los agregados de tau nativos de tejido cerebral con EA para 3-(3-[18F]-fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina, determinada por el análisis de regresión lineal es 2,4 nM, lo que indica que este compuesto se une a tau. Por tanto, la obtención de imágenes por PET con el compuesto 8 y el examen del patrón de obtención de imágenes sería útil para detectar la presencia de tau en los pacientes y podría confirmar un diagnóstico de tauopatías de EA o no EA.

Ejemplo de ensayo 5

Selectividad de 3-(3-[18F]-Fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina hacia Tau frente a p amiloide en tejido cerebral humano con EA.

Procedimientos

Basándose en los resultados de inmunotinción anti-tau y anti-amiloide de las secciones de cerebro, se seleccionan tres grupos de secciones de cerebro humano para experimentos de autorradiografía para determinar la selectividad de unión a tau nativa de 3-(3-[18F]-fluoroazetidin-1-ilo )-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina. El grupo A son cortes de cerebro con EA ricos en tau (etiquetados como Tau+Ap+), el grupo B son cortes de cerebro con eA pobres en tau (etiquetados como Tau-Ap+) y el grupo C son cortes de cerebro normal Tau-Ap-. Como se muestra en la Figura 4, las secciones de cerebro con eA humana del Grupo A utilizadas son #0185, #28770, #30121, #30311, y #30461. Las secciones del cerebro humano con EA en el Grupo B son #33562, #32656, #33998, #35682, y #33563. Las secciones normales del cerebro humano en el grupo C son # 29092 y # 32566. Se utilizan cortes de tejido de los mismos donantes para calcular la selectividad para todos los tres compuestos para el ensayo de acuerdo con el ejemplo de ensayo 5. Se realiza autorradiografía para cada uno de estos tres grupos de cerebros en secciones adyacentes de 10 pm con el trazador de amiloide [18F]W372 para cuantificar la carga de p-amiloide. [18F]W372 es un trazador selectivo de unión de amiloide descubierto por Siemens y evaluado según IND 105173. Las secciones se cubren con 0,5 ml de 3-(3-[18F]-fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina (en 2,5:2,5:95 de DMSO:EtOH:1xPBS, aproximadamente 20 pCi/portaobjetos) y se incuban durante 1,5 horas. A continuación, se emplean ciclos de lavado sucesivos (1 min de pBS, 2 min de EtOH al 30%/PBS, 2 min de EtOH al 70%/PBS, 1 min de PBS) para eliminar cualquier trazador no unido. Las secciones se secan al aire, se colocan en una placa de obtención de imágenes de fósforo (placa Fuji IP) y se exponen durante la noche. La placa IP se lee con un GE Healthcare Life Sciences Typhoon FLA 7000 Phosphorimager. La intensidad de la señal de la materia gris se mide con el software Fujifilm Multi Gauge. Después de restar la señal de fondo (señal en la región de la corteza del grupo C), la señal de las secciones individuales del grupo A y B se normaliza con la señal correspondiente de autorradiografía de las respectivas secciones adyacentes con [18f ]w 372. Los cálculos se basan en las secciones de cerebro del grupo B # 32656 y # 33998, que tienen patología tau indetectable por inmunohistoquímica. La señal normalizada para 3-(3-[18F]-fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina en las secciones del cerebro del grupo B es el nivel de señal relativo de 3-(3-[18F]-fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina a [F-18]W372 resultante de la unión a agregados de p-amiloide nativos. El nivel de unión de 3-(3-[18F]-fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina a los agregados de tau nativos en las secciones del grupo A se estima restando la cantidad de la señal total atribuible a la unión a p-amiloide (calculada multiplicando la señal total de la unión de [18F]W372 a p-amiloide en la sección adyacente por la señal relativa de 3-(3-[18F]-fluoroazetidina-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina a [18F]W372 determinada a partir de las secciones del grupo B). La diferencia resultante se divide luego por la señal atribuible a la unión al p-amiloide para estimar la selectividad de 3-(3-[18F]-fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2 -a]piridina.

La autorradiografía de 3-(3-[18F]-fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina en los tres grupos de secciones de cerebro humano se muestra en la Figura 4, Se observa una señal fuerte en la materia gris (región de la corteza) de las secciones del grupo A (Tau+Ap+), mientras que en el grupo B (Tau-Ap+), se detecta una señal débil o nula en las regiones de la corteza de las secciones. No se ve ninguna señal de autorradiografía en las secciones de los cerebros normales del grupo C (Tau-Ap-). Estos resultados indican que la 3-(3-[18F]-fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina se une específicamente a los agregados de tau nativos del cerebro humano con EA, y tiene interacción débil o nula con agregados de p-amiloide nativos.

Debido a que los resultados de IHC muestran que las secciones de cerebro del grupo B # 32656 y # 33998 están desprovistas de agregados de proteína tau, la señal de autorradiografía normalizada en la región de la corteza de estas secciones de cerebro con EA se deriva de la unión de 3-(3-[18F]-fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina a agregados nativos de p-amiloide. La selectividad de la unión de 3-(3-[18F]-fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina a agregados de tau nativos frente a la unión de agregados de p-amiloide nativos es reflejada por la relación entre la señal del grupo A (Tau+Ap+) y la señal de las secciones del cerebro # 32656 y # 33998.

En experimentos como se describen en el ejemplo de ensayo 5 y se muestran en la Figura 4, el compuesto 3-(3-[18F]-fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina (Compuesto 8) presenta una relación de selectividad para Tau:Ap de aproximadamente 26,6 4,5, basada en 5 muestras de cerebro Tau+ A+ y 2 muestras de cerebro Tau-Ap+. Tal como se utiliza en esta sección, la muestra se refiere a muestras de tejido de diferentes donantes. Como se describe en el Ejemplo de ensayo 5 y se muestra en la Figura 4, el compuesto 3-(3-[18F]-fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina (Compuesto 8) presenta una relación de señal de sustancia gris a sustancia blanca (GM/WM) de aproximadamente 17,3 ± 1,7. La señal de autorradiografía de 3-(3-[18F]-fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina (Compuesto 8) en secciones de cerebro normales es débil y uniforme, lo que muestra poca diferencia entre la sustancia gris y la sustancia blanca y que indica una unión no específica baja. A partir de los experimentos de acuerdo con el ejemplo de ensayo 5, se observa que la relación de selectividad de la unión de 3-(3-[18F]-fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina (Compuesto 8) a los agregados de tau nativos, en comparación con la unión de agregados de p-amiloide nativos en la región de materia gris de los cerebros humanos con EA, es de aproximadamente 27 veces.

Los resultados de selectividad de autorradiografía con 3-(3-[18F]-fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina (Compuesto 8) demuestran una selectividad sorprendentemente ventajosa en estos experimentos, cuando se considera en comparación con 3-(4-(2-[18F]-fluoroetil)piperidin-1-il)-8-metoxibenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina (también conocido como T821 y se muestra más adelante) y 3-(4-[18F]-fluoropiperidin-1-il)-8-metoxibenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina (también conocida como T798 y mostrada más adelante), que se enuncian como agentes de obtención de imágenes de tau PET en el documento US2011/0182812.

En experimentos como se describen en el ejemplo de ensayo 5 y se muestran en la Figura 5, el compuesto 3-(4-(2-[18F]-fluoroetil)piperidin-1-il)-8-metoxibenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina (T821) exhibe una relación de selectividad para Tau:Ap de aproximadamente 2,22+0,45, basado en 5 muestras de cerebro Tau+Ap+ y 2 muestras de cerebro Tau-Ap+. Como se describe en el Ejemplo de ensayo 5 y se muestra en la Figura 5, el compuesto 3-(4-(2-[18F]-fluoroetil)piperidin-1-il)-8-metoxibenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina (T821) presenta una relación de señal de sustancia gris a sustancia blanca (GM/WM) de aproximadamente 11,7+1,2. Por tanto, el compuesto 3-(4-(2-[18F]-fluoroetil)piperidin-1-il)-8-metoxibenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina (T821) se une a tau, amiloide y sitios de unión no identificados en el cerebro humano normal. Esta falta de selectividad representa una desventaja para T821 para su uso en imágenes tau.

En experimentos como se describen en el Ejemplo de ensayo 5 y se muestran en la Figura 6, el compuesto 3-(4-[18F]-fluoropiperidin-1-il)-8-metoxibenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina (T798) presenta una relación de selectividad para Tau:Ap de aproximadamente 8,4 1,7, basada en 5 muestras de cerebro Tau+Ap+ y 2 muestras de cerebro Tau-Ap+. Como se describe en el Ejemplo de ensayo 5 y se muestra en la Figura 6, el compuesto 3-(4-[18F]-fluoropiperidin-1-il)-8-metoxibenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina (T798) exhibe una relación de señal de materia gris a materia blanca (GM / WM) de aproximadamente 18,0 3,2, basada en 5 muestras de cerebro Tau+Ap+. Así, el compuesto 3-(4-[18F]-fluoropiperidin-1-il)-8-metoxibenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina (T798) se une a tau, amiloide y sitios de unión no identificados en un cerebro humano normal. Esta falta de selectividad representa una desventaja para T798 para su uso en la obtención de imágenes tau.

Por lo tanto, T821 y T798 muestran, en relación con el Compuesto 8, una mala selectividad, no solo entre tau y A-beta amiloide, sino también entre tau y sitios de unión no identificados observados en tejido cerebral humano normal relativamente desprovisto de tau y A-beta amiloide (véase Figura 4 para el Compuesto 8, Figura 5 para T821 y Figura 6 para T798). 3-(4-(2-[18F]-fluoroetil)piperidin-1-il)-8-metoxibenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina y 3-(4-[18F]-fluoropiperidin-1-il)-8-metoxibenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina no serían agentes de obtención de imágenes de tau con PET útiles debido a esto falta de selectividad. En contraste, la selectividad de la unión de 3-(3-[18F]-fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina (Compuesto 8) a agregados de tau nativos, como en comparación con la unión de agregados de p-amiloide nativos en la región de materia gris de los cerebros humanos con EA, se observa que es aproximadamente de 27 veces. Esta propiedad de unión sorprendentemente selectiva del compuesto 8 sería particularmente ventajosa para la obtención de imágenes de tau y podría proporcionar imágenes de tau mejoradas, en comparación con agentes conocidos, produciendo imágenes con mejor claridad debido a señales de tau fuertes y señales disminuidas sin tau. Los expertos en la materia sabrían cómo usar preparaciones radiofarmacéuticas de 3-(3-[18F]-fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina (Compuesto 8), ya sea solo, o en comparación con los agentes de obtención de imágenes de beta amiloide existentes, para evaluar la acumulación y distribución de tau en la obtención de imágenes de pacientes clínicos.

Ejemplo de ensayo 6

Falta de unión de 3-(3-[18F]-Fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina a cortes de cerebro humano normal.

Para mostrar la ausencia de unión sin tau, se obtienen barridos de autorradiografía a partir de 3-(3-[18F]-fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina en el tejido cerebral humano normal. El procedimiento experimental es el mismo que el proporcionado en el Ejemplo 5, excepto que sólo se aplican 20 uCi de ligando 18F a los cortes de tejido y las condiciones de lavado son menos estrictas. La Figura 7 muestra que la señal de radiactividad en el tejido normal es considerablemente más baja que en el tejido cerebral con EA cuando se usan ciclos de lavado sucesivos (2 minutos en PBS, 2 minutos en etanol al 10%/PBS, 2 minutos en etanol al 30%/PBS, 2 minutos en PBS). La señal en el tejido cerebral con EA (AD30121, corteza frontal) puede bloquearse con un compuesto no etiquetado radiactivamente o con el conocido marcador de tau con PET T807 (también conocido como AV-1451), como sería de esperar para bloquear la unión específica de tau. La autorradiografía se lleva a cabo además sin etanol en las soluciones de lavado. La Figura 8 muestra que, en comparación con [18F]T807 (también conocido como AV-1451), el marcador de tau 3-(3-[18F]-fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina tiene una señal de autorradiografía mucho más baja en el tejido cortical o de sustancia blanca normal. Esta unión no tau muy reducida para el Compuesto 8 en tejido normal representa una mejora sorprendentemente ventajosa en comparación con [18F] T807/AV-1451.

Ejemplo de ensayo 7

Barrido de PET/TC de ratón obtenido con 3-(3-[18F]-Fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina

Las imágenes de la tomografía dinámica por emisión de micropositrones (mPET) se obtienen de ratones CD-1 de tipo silvestre utilizando 3-(3-[18F]-fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina. La tomografía microcomputada (mCT) de cada sujeto se utiliza como referencia anatómica para el análisis de imágenes. La biodistribución del marcador en cerebro, músculo, hueso, hígado y riñón se evalúa generando curvas de actividad de tiempo (TAC) usando las imágenes fusionadas de mPET/mCT. Se utiliza un escáner multimodal INVEON (Siemens, Alemania) para mPET/mCT. Todo el trabajo con animales se realiza de acuerdo con los procedimientos aprobados por el Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad de Ciencias.

Los animales se anestesian con isoflurano al 3% / oxígeno al 97% y se colocan en la cama del escáner. Primero se realiza una CT (tomografía computada) breve de alta resolución para el registro anatómico, seguida de un barrido PET de 120 minutos. Durante el barrido por PET, se coloca un sistema de calentamiento de agua debajo de la cama para ayudar a mantener la temperatura corporal. Dentro de los 3 minutos posteriores al comienzo de la adquisición de PET, el compuesto etiquetado con [18F]3-(3-[18F]-fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina se administra a los animales mediante inyección en la vena de la cola (250 uCi en un volumen total de 200 uL de solución salina). Se genera una imagen PET por cada minuto del tiempo de adquisición. La captación del marcador se obtiene dibujando visualmente las regiones de interés basadas en las imágenes de PET/CT fusionadas, y los valores de actividad correspondientes se determinan utilizando el software INVEON Research Workplace (Siemens, Alemania). Todos los valores se representan como porcentaje de dosis inyectada por gramo (% ID/g).

Las curvas de actividad en el tiempo obtenidas a partir de 3-(3-[18F]-fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina se comparan con las obtenidas del marcador de tau con PET conocido T807/AV-1451. La 3-(3-[18F]-Fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina ingresa al cerebro con un % ID/g más alto que [18F] AV-1451, se elimina rápidamente y no presenta una captación significativa de radiactividad en el tejido óseo. Estas propiedades son ventajosas para un agente de obtención de imágenes cerebrales mejorado.

Ejemplo de ensayo 8

Curvas de actividad de tiempo de PET/CT de ratón de 3-(4-(2-[18F]-Fluoroetil)piperidin-1-il)-8-metoxibenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina (T821) y 3-(4-[18F]-Fluoropiperidin-1-il)-8-metoxibenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina, (T798) versus 3-(3-[18F]-fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina (Compuesto 8).

Las curvas de actividad de tiempo de PET/CT de ratón de 3-(4-(2-[18F]-fluoroetil)piperidin-1-il)-8-metoxibenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina (T821) (véase Figura 9) y de 3-(4-[18F]-fluoropiperidin-1-il)-8-metoxibenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina (T798) (véase Figura 10) se obtienen como se describe en el Ejemplo de ensayo 7 (T821 y T798 se enuncian en US2011/0182812). Las Figuras 9 y 10 ilustran que la absorción ósea de radiactividad aumenta con el tiempo para T821 y T798, lo que indica la probable liberación de ion fluoruro radiactivo que puede marcar el hueso. Por lo tanto, cuando se obtienen imágenes con T821 y/o T798, las señales indeseables de PET no tau de los huesos del cráneo podrían interferir con las señales tau deseadas de la corteza cerebral. Por lo tanto, además de la falta de selectividad para T821 y T798, estos compuestos también representarían además malos candidatos para marcadores de tau PET de cerebro humano debido a la interferencia de la señal de radioactividad del hueso. En comparación, 3-(3-[18F]-fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina (Compuesto 8) causa una señal de radiactividad insignificante en el hueso, y tiene absorción cerebral superior y sorprendente en comparación con la de T821 y T798. La 3-(3-[18F]-Fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina tiene propiedades sorprendentemente ventajosas que son necesarias para un agente de obtención de imágenes de tau con PET mejorado que incluye una distribución tisular favorable, propiedades PK favorables y un perfil de selectividad tau robusto. Las propiedades ventajosas del Compuesto 8 son útiles para proporcionar imágenes mejoradas de tau con PET en humanos. Esta combinación de propiedades críticas no se conocía y no podría haberse predicho a partir de compuestos de obtención de imágenes de tau existentes.

Ejemplo de ensayo 9

Biodistribución de 3-(3-[18F]-Fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina (Compuesto 8) en ratones normales

Para determinar la distribución de órgano, la penetración cerebral y la eliminación en ratones normales, se utiliza 3-(3-[18F]-fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina inyectado en ratones normales seguido de eutanasia y disección a los 2, 60, 120 y 180 minutos después de la inyección. Mientras está bajo anestesia, se inyectan 0,2 ml de solución salina que contiene 20 |jCi de 3-(3-[18F]-fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina directamente en la vena de la cola. Se utilizan tres ratones por punto de tiempo y se sacrifican de forma escalonada. Se recolectan los siguientes órganos y líquidos: sangre, bazo, tiroides, testículos, corazón, hígado, páncreas, riñones, músculo, piel, estómago, hueso, pulmones, cerebro, intestinos, sistema urogenital. Los órganos se pesan y la radiactividad de cada órgano se cuenta en un contador gamma automático (Perkin Elmer). Para la piel, los huesos, los músculos y la sangre, se cuenta una muestra y se estima el peso total del órgano o líquido. Una muestra de la dosis inyectada se cuenta como referencia. El porcentaje de dosis inyectada por gramo de tejido (% ID/g) se calcula para cada órgano.

Se obtiene un nivel de dosis/g de 9,53% de 3-(3-[18F]-fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina en el cerebro en el punto de tiempo de 2 minutos. La eliminación del cerebro a menos del 10% del pico ocurrió antes del punto de 30 minutos y continuó durante 2 horas. La radiactividad se distribuye principalmente al hígado, los intestinos y los riñones en los primeros dos minutos y persiste en los intestinos durante el período de estudio de dos horas (tablas 4 y 5).

Los niveles de radiactividad en el hígado y los intestinos junto con una presencia moderada en el sistema urogenital que incluye la vejiga sugieren que el compuesto y sus metabolitos se eliminan a través de los sistemas hepático y digestivo. La ausencia de un aumento de la radiactividad en el tejido óseo muestra que el compuesto y sus metabolitos no sufren desfluoración en las dos primeras horas. La captación por el músculo permanece por debajo del 2% de ID/g, lo que es favorable para las relaciones de señal humana proyectada a ruido para obtención de imágenes por PET. Estos resultados indican que el Compuesto 8 demuestra una distribución tisular, una farmacocinética y una estabilidad metabólica in vivo sorprendentemente ventajosas. Estas propiedades son particularmente ventajosas para un agente de obtención de imágenes de tau cerebral mejorado.

Tabla 4: Biodistribución de 3-(3-[18F]-Fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina en ratones

(continuación)

Tabla 5 : Biodistribución de [18F] 3-(3-Fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina en ratones normales or ór ano.

Ejemplo de ensayo 10

3-(3-[18F]-Fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina (Compuesto 8) Obtención de imágenes por PET de la proteína tau en el cerebro de pacientes con la enfermedad de Alzheimer

La evaluación clínica de 3-(3-[18F]-Fluoroazetidin-1-il)-8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridina (Compuesto 8) como un radioligando PET para la obtención de imágenes de la deposición de proteína tau en pacientes con EA u otros trastornos neurodegenerativos se realiza en voluntarios sanos, pacientes con EA o sujetos con encefalopatía traumática crónica (CTE), mediante la realización de una o más barridos por PET con el compuesto 8. La obtención de imágenes de PET dinámica se logra en un Siemens ECAT EXACT HR+ durante 150 minutos después de la inyección del compuesto 8 o [18F]AV-1451 (segmentos de imágenes de 0-60 y 90-150 minutos). Los barridos del compuesto 8 o [18F]AV-1451 se adquieren de forma similar en dos sesiones de obtención de imágenes. También se obtiene una resonancia magnética del cerebro. Las imágenes de PET y MRI se alinean y normalizan, y los volúmenes de interés (VOI) basados en ATLAS se aplican a la serie PET dinámica. El compuesto 8 o [18F]AV-1451 se evalúa en términos de perfil cinético, así como la relación entre la región diana y el valor de captación estandarizado del cerebelo (SUVr entre 100-120 min) entre voluntarios sanos y sujetos con EA o CTE.

La distribución en controles sanos y sujetos con EA es similar dentro de los sujetos entre el Compuesto 8 y [18F]AV-1451. El compuesto 8 y [18F]AV-1451 muestran una distribución intraindividual similar para la captación de tau a través del cerebro para los sujetos con EA. Se observa una mayor captación en las regiones corticales del cerebro para los sujetos con EA en comparación con los controles sanos tanto para el Compuesto 8 como para [18F]AV-1451. El compuesto 8 muestra una captación cerebral máxima más alta a ~ 8 SUV, en comparación con ~ 6 SUV para [18F]AV-1451. El Compuesto 8 y [18F]AV-1451 muestran un lavado similar del cerebro. El metabolismo del compuesto 8 es rápido, quedando un 5 ± 3% (n = 7) del progenitor intacto restante a 60 min después de la inyección.

Las curvas de SUVr del compuesto 8 se equilibran rápidamente en sujetos voluntarios sanos en regiones corticales, con valores alrededor de 1,0-1,1, mientras que en regiones subcorticales (putamen, tálamo), la captación parece reducida en comparación con [18F]AV-1451. En sujetos con EA, de manera similar a [18F]AV-1451, las curvas de SUVr del Compuesto 8 no alcanzan el equilibrio dentro del marco de tiempo del estudio (150 min), mientras que el Compuesto 8 muestra valores de SUVr ligeramente más altos en comparación con [18F]AV-1451. Las imágenes con el compuesto 8 son más claras y se interpretan como una señal de fondo inespecífica más baja. Los gráficos de SUVr del compuesto 8 muestran una buena separación entre voluntarios sanos y sujetos con EA, donde el SUVr medio es ~ 1,1 para sujetos voluntarios sanos y ~ 1,6 para sujetos con EA, como promedio en todas las regiones. El compuesto 8 muestra una captación cerebral más alta en comparación con [18F]AV-1451 tanto en voluntarios sanos como en sujetos con EA, con un SUV máximo del compuesto 8 ~50% más alto que el de [18F]AV-1451.

La distribución del compuesto 8 en un sujeto con CTE muestra pequeñas áreas focales de captación elevada. Para el sujeto con CTE, los volúmenes de interés más pequeños se delinean manualmente en áreas focales con alta captación (subregiones de la corteza parietal lateral inferior, corteza parietal superior y corteza temporal posterior). Las curvas de SUVr del compuesto 8 en estas subregiones muestran una señal elevada, que alcanza valores de ~ 1,5, mientras que otras regiones corticales permanecen cerca de 1,0, similar a los sujetos voluntarios sanos.

Los resultados como los descritos en el Ejemplo de ensayo 10 y otros Ejemplos de ensayo anteriores soportan el uso del Compuesto 8 como una sonda de obtención de imágenes de PET mejorada y ventajosa para detectar niveles de proteína tau agregada en pacientes con EA y/u otros trastornos neurodegenerativos, tales como CTE.

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto de fórmula:

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

2. Un compuesto de fórmula:

3. Un compuesto de fórmula:

4. Un procedimiento de preparación de un compuesto de la reivindicación 1, que comprende hacer reaccionar un compuesto de la reivindicación 2 con una fuente de fluoruro [18F].

5. Un procedimiento de preparación de un compuesto de la reivindicación 1, que comprende hacer reaccionar un compuesto de la reivindicación 3 con una fuente de fluoruro [18F].

6. Una composición que comprende el compuesto de la reivindicación 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.

7. La composición de la reivindicación 6 que comprende EtOH al 10% (v / v), ascorbato de sodio al 0,45% (p/v) en cloruro de sodio al 0,9%.

8. El compuesto de la reivindicación 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en un procedimiento de obtención de imágenes de tau agregada que comprende:

a. introducir en un mamífero una cantidad detectable del compuesto de la reivindicación 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo;

b. permitir un tiempo suficiente para que dicho compuesto se asocie con tau; y

c. detectar dicho compuesto.

9. El compuesto de la reivindicación 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el mamífero es un ser humano sospechoso de tener la enfermedad de Alzheimer.

10. El compuesto de la reivindicación 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso en un procedimiento según la reivindicación 8, en el que el mamífero es un ser humano sospechoso de tener encefalopatía traumática crónica.

11. Uso de un compuesto de la reivindicación 1 o una mezcla de un compuesto de la reivindicación 1 y un compuesto de fórmula:

para la preparación de agentes de obtención de imágenes de tau.

12. Un intermedio de preparación de un compuesto de la reivindicación 2, en el que el producto intermedio es 1-(8-metilbenzo[4,5]imidazo[1,2-a]piridin-3-il)azetidin-3-ol.