ES2865023T3 - Anticuerpo anti-lipoarabinomanano e inmunoensayo para detectar la infección por bacilos acidorresistentes usando el anticuerpo - Google Patents

Abstract

Anticuerpo monoclonal capaz de unirse a lipoarabinomanano bacilar acidorresistente, comprendiendo dicho anticuerpo monoclonal una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera unidas mediante un ligador, comprendiendo la región variable de cadena pesada las cadenas pesadas CDR1 a CDR3 mostradas en (a) a (c) a continuación y comprendiendo las cadenas ligeras CDR1 a CDR3 mostradas en (d) a (f) a continuación: (a) una CDR1 de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1, (b) una CDR2 de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, (c) una CDR3 de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3, (d) una CDR1 de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 4, (e) una CDR2 de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 5, y (f) una CDR3 de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 6.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpo anti-lipoarabinomanano e inmunoensayo para detectar la infección por bacilos acidorresistentes usando el anticuerpo

Campo técnico

La presente invención se refiere a un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a lipoarabinomanano de bacilos acidorresistentes tales como el bacilo de Koch y, en particular, a un anticuerpo de cadena sencilla (scFv) y a un anticuerpo multivalente del mismo.

La presente invención se refiere además a un método para detectar bacilos acidorresistentes usando el anticuerpo, en particular, a un método para diagnosticar la tuberculosis o a un método de diagnóstico de la tuberculosis; y a un reactivo de detección de bacilos acidorresistentes (por ejemplo, un reactivo de diagnóstico de la tuberculosis) y a un kit de detección de bacilos acidorresistentes (por ejemplo, un kit de diagnóstico de la tuberculosis), que son para su uso en el método anterior.

La presente invención se refiere además a un método para determinar el efecto curativo de la tuberculosis de un medicamento antituberculoso usando el anticuerpo; y a un kit para determinar el efecto curativo de un medicamento antituberculoso, que es para su uso en el método anterior.

Técnica anterior

La tuberculosis es una enfermedad infecciosa que lleva atormentando a las personas desde hace varios miles de años, y se calcula que 1/4 de la población adulta de Europa en el siglo XIX ha muerto de tuberculosis. Gracias a la mejora del nivel de vida y al descubrimiento de antibióticos en el siglo XX, la tuberculosis ha sido prácticamente erradicada en las naciones industrializadas en la década de 1950. Sin embargo, la tuberculosis sigue siendo una enfermedad infecciosa recurrente. En la actualidad, se calcula que una de cada tres personas de la población mundial está infectada por el bacilo de Koch (tuberculosis latente). Se dice que el número total de pacientes con tuberculosis de nueva aparición en el mundo es de 9,4 millones, y se calcula que entre ellos mueren 2 millones de pacientes. En la actualidad, aproximadamente el 95% de los pacientes con tuberculosis activa viven en países en vías de desarrollo y el 99% de las personas que mueren de tuberculosis se concentran en países en vías de desarrollo.

En la década de los 90, el mundo reconoció de nuevo que el número de casos de tuberculosis ha seguido aumentando hasta convertirse en la mayor enfermedad infecciosa centrada en los países en vías de desarrollo, y se ha abordado el tomar medidas integrales. Las medidas correctivas contra la tuberculosis se han llevado a cabo bajo la cooperación mundial, tal como la implantación de la estrategia de tratamiento de observación directa de corta duración (DOTS, Directly Observed Treatment, Short-Course), principalmente por parte de la Organización Mundial de la Salud (OMS), el establecimiento de la asociación “Stop Tuberculosis” para avanzar en las medidas bajo la cooperación de los países directamente afectados, las naciones proveedoras de ayuda y las organizaciones de ayuda, y la fundación de “The Global Fund to Fight AIDS, Tuberculosis and Malaria” como sistema para proporcionar apoyo financiero. Muchas de las tecnologías existentes que se usan como medidas correctivas contra la tuberculosis se han usado generalmente durante varias decenas de años sin ninguna mejora. Por tanto, existe una necesidad urgente de desarrollar nuevas tecnologías que sean eficaces en los países en vías de desarrollo.

Para el diagnóstico de la tuberculosis, lo más importante es descubrir la infección por el bacilo de Koch en una fase temprana para poder iniciar una terapia. En particular, dado que los pacientes que se encuentran en un estado de descarga de bacterias tienen un riesgo extremadamente alto de propagar la infección a las personas de su entorno, es necesario tratar a esos pacientes en un entorno aislado sin ningún contacto con las personas de su entorno. Para ello existe el “diagnóstico bacteriológico de la tuberculosis”, y la prueba de frotis de esputo descrita en el mismo es la usada más habitualmente.

La prueba de frotis de esputo es un método para observar y examinar directamente una muestra de frotis de esputo bajo un microscopio (microscopía directa de la muestra de frotis de esputo), y se estableció por Robert Koch hace más de un siglo. Las micobacterias se identifican en la muestra de prueba clínica mediante la tinción del patógeno de la tuberculosis. El método de diagnóstico de la tuberculosis usado hoy en día se ha establecido usando prácticamente la tecnología usada por Koch. La prueba de frotis del bacilo de Koch es un método convencional de diagnóstico de la tuberculosis en los países en vías de desarrollo, y también se usa como referencia para evaluar el rendimiento de un nuevo método de prueba.

El método de amplificación de genes se ha establecido como un método que tiene mayor sensibilidad que la prueba de frotis de esputo. El método de amplificación de genes es un método de amplificación de un fragmento específico de ADN en forma de reacción en cadena usando la ADN polimerasa. El principio de este método es la amplificación del ADN que se pretende analizar, usando el ADN que se va a amplificar, un par de cebadores de ADN que son complementarios a las secuencias de ambos extremos del ADN y una ADN polimerasa resistente al calor, y la realización de cambios de temperatura repetitivos. Aunque el método de amplificación de genes es satisfactorio en cuanto a sensibilidad, es difícil usar este método en los países en vías de desarrollo debido a la operatividad, el equipo y el coste.

Como tendencia mundial reciente, debido a la propagación de la tuberculosis resistente a múltiples medicamentos, el interés se dirige hacia la necesidad de la prueba de cultivo y la prueba de amplificación de ácidos nucleicos. Sin embargo, entre los diversos métodos de diagnóstico bacteriológico que existen, la prueba de frotis de esputo (microscopía directa del esputo) sigue considerándose el núcleo central de las estrategias de lucha contra la tuberculosis. En particular, en los países en vías de desarrollo con pocos recursos en los que la tuberculosis está propagándose, la prueba de frotis de esputo no sólo es un método de diagnóstico eficaz, sino que también desempeña un papel importante como medio para determinar el efecto terapéutico.

Tal como se describió anteriormente, aunque la prueba de frotis de esputo es el núcleo central de la estrategia básica de control de la tuberculosis, el número de trabajadores que realizan el examen bacteriológico en muchos países en vías de desarrollo es absolutamente insuficiente, y se dice que la calidad de tales trabajadores es problemática. Dado que la eficacia de esta prueba depende de la destreza de los técnicos de laboratorio, la formación diaria y el control de calidad son esenciales, y son motivos de un aumento extremo del coste global. Además, los países en vías de desarrollo tienen muchos problemas en cuanto a la infraestructura social necesaria para mejorar el entorno del laboratorio, los instrumentos de prueba, las tecnologías de prueba y similares. Estos factores se enredan de forma complicada y, como resultado, afectan negativamente a la calidad de la prueba en gran medida.

Además, dado que la prueba de frotis de esputo es una prueba para detectar e identificar bacilos acidorresistentes, pero no un método para detectar bacilos de Koch, es imposible identificar bacilos de Koch con la prueba.

En cuanto a la terapia de la tuberculosis en los países avanzados, la terapia con un agente químico se inicia después de identificar el bacilo de Koch; mientras que en el programa DOTS que se lleva a cabo en los países en vías de desarrollo, la terapia con un agente químico se inicia cuando se detecta un bacilo acidorresistente en la prueba de frotis de esputo sin identificar el bacilo de Koch. En este caso, aunque los agentes químicos usados para una infección por bacilos de Koch y una infección por bacilos acidorresistentes no tuberculosos son diferentes, la terapia se lleva a cabo para los bacilos acidorresistentes no tuberculosos usando básicamente un agente químico para los bacilos de Koch, ya que no se ha desarrollado ningún medicamento de alto efecto terapéutico para los bacilos acidorresistentes no tuberculosos. Por tanto, el paciente tiene que soportar el riesgo de efectos secundarios por el agente químico. Algunos ejemplos representativos de los riesgos que se han señalado incluyen efectos secundarios graves, tales como la disminución de la función hepática y la pérdida de la visión, y la propagación de bacilos acidorresistentes no tuberculosos resistentes al medicamento.

Tal como se describió anteriormente, aunque existen varios problemas en el diagnóstico de la tuberculosis y su terapia hasta ahora conocidos, el método de prueba de frotis de esputo desarrollado por Koch en 1882 se sigue usando actualmente para el diagnóstico de la tuberculosis sin grandes mejoras. Para resolver los problemas de los países en vías de desarrollo y de los nuevos países emergentes en lo que respecta a la infraestructura social necesaria para el entorno de los laboratorios, los instrumentos de prueba, las tecnologías de prueba, etc., son concebibles dos medidas, a saber, “el establecimiento de un método de prueba altamente sensible y de bajo coste que permita el procesamiento de alto rendimiento de las muestras recogidas en lugares limitados completas con suministro de energía e instalaciones” o “el establecimiento de pruebas en el punto de atención (POCT) que sean altamente sensibles, rápidas, fáciles y de bajo coste, y que se realicen sin usar ninguna herramienta que requiera suministro de energía”.

Además, en los países en vías de desarrollo y en los nuevos países emergentes se ponen en marcha suministros de energía e instalaciones si se trata de una zona muy limitada. Además, en esa zona ya existen centros de pruebas que realizan pruebas relativamente avanzadas, y algunos pacientes adinerados pueden usar esos servicios. Usando estos centros de pruebas, pueden resolverse problemas tales como el entorno del laboratorio, los instrumentos de prueba, las tecnologías de prueba y los recursos humanos. En este caso, es necesario transportar a un paciente o una muestra de esputo desde un lugar de examen médico hasta un centro de pruebas. Existen varias restricciones importantes en el transporte de muestras de esputo usadas para una prueba de amplificación de ácidos nucleicos o una prueba de cultivo. Con el fin de evitar la contaminación y el crecimiento de gérmenes no deseados, las muestras tienen que ser refrigeradas inmediatamente después de la recogida de esputo para ser transportadas. Además, dado que para una prueba de cultivo es importante mantener las bacterias en estado de crecimiento, se requiere más precaución en comparación con la prueba genética. Además, dado que ambas pruebas no pueden realizarse cuando se lleva a cabo una operación de esterilización, tal como tratamiento térmico, en una muestra, las muestras tienen que transportarse en un estado estrictamente controlado. Dado que en los países en vías de desarrollo y en los nuevos países emergentes no se ha establecido ningún sistema que pueda manejar tales restricciones en el transporte de muestras, es importante establecer un ensayo capaz de detectar incluso en muestras a las que se les ha aplicado una operación de esterilización.

Cuando se realiza POCT, es importante permitir el ensayo en un entorno clínico en un corto periodo de tiempo sin usar instalaciones e instrumentos especiales. La tecnología más usada para POCT es la prueba inmunocromatográfica (ICT). Por lo general, la ICT se considera inferior a los métodos de inmunoensayo, tales como ELISA, en cuanto a sensibilidad. Por tanto, si se quiere resolver el problema con POCT, sería importante establecer un sistema de ensayo capaz de detectar con alta sensibilidad. Además, en el caso de POCT, dado que es difícil tomar medidas de prevención de infecciones para los trabajadores de las pruebas mediante el uso de cabinas de seguridad y similares usadas en los centros de pruebas, etc., es esencial el tratamiento de esterilización para reducir el riesgo de infección a partir de una muestra.

Por tanto, es necesario establecer un ensayo capaz de detectar con alta sensibilidad en muestras esterilizadas para “el establecimiento de un método de prueba altamente sensible y de bajo coste que permita el procesamiento de alto rendimiento de las muestras recogidas en lugares limitados completas con suministro de energía e instalaciones” y “el establecimiento de una prueba en el punto de atención (POCT) que sea altamente sensible, rápida, fácil y de bajo coste, y que se lleve a cabo sin usar ninguna herramienta que requiera un suministro de energía”. Para ello, es importante la selección del antígeno diana. Como antígenos específicos para los bacilos de Koch, se han notificado antígenos proteicos tales como Ag85. Sin embargo, dado que los antígenos proteicos se degradan y digieren rápidamente in vivo, apenas puede obtenerse una buena sensibilidad con ellos.

Los principales antígenos de los bacilos acidorresistentes incluyen los glicolípidos, que son los principales constituyentes de las membranas celulares y las paredes celulares. Los antígenos glicolipídicos se consideran un tipo de antígenos diana prometedores, ya que son muy estables in vivo. Entre ellos, LAM representa el 15% de los componentes de las células bacterianas, y es un antígeno que está llamando la atención también por su cantidad. Existen varios informes sobre la creación de AcP y AcM con el fin de detectar LAM bacilar acidorresistente en muestras vivas (véanse los documentos no de patentes 1 a 4 (NPL 1 a 4)). En un par de esos informes, se usa ELISA para detectar el lipoarabinomanano de esputo o de orina (a continuación en el presente documento, también denominado “LAM”). Sin embargo, las estructuras básicas de los LAM en los bacilos acidorresistentes son casi las mismas, excepto por una diminuta diferencia observada en la estructura de la caperuza de manosa. En particular, en Mycobacterium avium, que es una bacteria que provoca infecciones por bacilos acidorresistentes con mayor frecuencia, sólo por detrás del bacilo de Koch, la estructura de la caperuza de manosa es casi la misma que la del bacilo de Koch (véase el documento no de patentes 5 (NPL 5)). Por tanto, se desea un anticuerpo monoclonal capaz de detectar específicamente LAM de bacilos de Koch entre los bacilos acidorresistentes.

Lista de referencias

Bibliografía no de patentes

NPL 1: Aharona Glatman-Freedman et al., “Monoclonal antibodies to surface antigens of Mycobacterium tuberculosis and their use in a modified Enzyme-Linked Immunosorbent Spot Assay for detection of Mycobacteria”, Journal of Clinical Microbiology, nov. de 1996, págs. 2795-2802

NPL 2: Lenka M. Pereira Arias-Bouda et al., “Development of antigen detection assay for diagnosis of tuberculosis using sputum samples”, Journal of Clinical Microbiology, junio de 2000, págs. 2278-2283

NPL 3: Beston Hamasur et al., “Rapid diagnosis of tuberculosis by detection of acid-fast bacillary lipoarabinomannan in urine”, Journal of Microbiological Methods, 45, 2001, págs. 41-52

NPL 4: C. Boehme et al., “Detection of acid-fast bacillary lipoarabinomannan with an antigen-capture ELISA in unprocessed urine of Tanzanian patients with suspected tuberculosis”, Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, 99, 2005, págs. 893-900

NPL 5: Lipoarabinomannans: from structure to biosynthesis. Jérome Nigou, Martine Gilleron, Germain Puzo, Biochimie 85 (2003) 153-166

NPL 6: Winter et al., Annu. Rev. Immunol., 12:433, 1994

NPL 7: K. Zuberbühler, Protein Engineering, Design & Selection, 22, 169 (2009)

Sumario de la invención

Problema técnico

Un objeto de la presente invención es proporcionar un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a lipoarabinomanano (a continuación en el presente documento, denominado a veces “LAM”) de bacilos acidorresistentes y, en particular, un anticuerpo de cadena sencilla (scFv) y un anticuerpo multivalente del mismo. Otro objeto de la presente invención es proporcionar un método para detectar bacilos acidorresistentes usando el anticuerpo, o un método de diagnóstico de la tuberculosis, un reactivo de detección de bacilos acidorresistentes (por ejemplo, un reactivo de diagnóstico de la tuberculosis) y un kit de detección de bacilos acidorresistentes (por ejemplo, un kit de diagnóstico de la tuberculosis) usando el método.

Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar un método para determinar el efecto curativo de la tuberculosis de un medicamento antituberculoso usando el anticuerpo, y un kit para determinar el efecto curativo del medicamento antituberculoso, que es para su uso en el método anterior.

Solución al problema

Mediante el desarrollo de la técnica para producir o seleccionar un animal inmune adecuado, un inmunógeno y un AcM, los presentes inventores desarrollaron con éxito un anticuerpo y un método de ensayo que puede distinguir LAM bacilar acidorresistente de LAM de otras bacterias o antígenos de membrana estructuralmente similares a los mismos y detectar específicamente LAM bacilar acidorresistente con una alta sensibilidad que es comparable a la de los métodos de detección por amplificación de genes. Además, los presentes inventores desarrollaron con éxito un anticuerpo que puede distinguir entre LAM de bacilo de Koch y LAM de bacilos acidorresistentes no tuberculosos y detectar específicamente LAM de bacilo de Koch. La presente invención proporciona:

Un anticuerpo monoclonal que es capaz de unirse a lipoarabinomanano bacilar acidorresistente, comprendiendo dicho anticuerpo monoclonal una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera unidas mediante un ligador, comprendiendo la región variable de cadena pesada las cadenas pesadas CDR1 a CDR3 mostradas en (a) a (c) a continuación y comprendiendo las cadenas ligeras CDR1 a CDR3 mostradas en (d) a ( f) a continuación: (a) una CDR1 de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1, (b) una CDR2 de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, (c) una CDR3 de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3, (d) una CDR1 de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 4,

(e) una CDR2 de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 5, y (f) una CDR3 de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 6.

Algunos aspectos adicionales de la presente invención se definen en las reivindicaciones.

La presente divulgación incluye el siguiente contenido.

(I) Anticuerpo monoclonal (I-1) que se une específicamente a lipoarabinomanano (LAM) de bacilos acidorresistentes (I-1) Un anticuerpo monoclonal que es capaz de unirse a LAM bacilar acidorresistente, estando el anticuerpo expuesto en uno cualquiera de los puntos (A) a (C) a continuación:

(A) un anticuerpo monoclonal que comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera unidas mediante un ligador, comprendiendo la región variable de cadena pesada las cadenas pesadas CDR1 a CDR3 mostradas en (a) a (c) a continuación y comprendiendo las cadenas ligeras CDR1 a CDR3 mostradas en (d) a (f) a continuación:

(a) una CDR1 de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1, (b) una CDR2 de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, (c) una CDR3 de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3, (d) una CDR1 de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 4, (e) una CDR2 de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 5, y (f) una CDR3 de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 6;

(B) un anticuerpo monoclonal que comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera unidas mediante un ligador, comprendiendo la región variable de cadena pesada las cadenas pesadas CDR1 a CDR3 mostradas en (g) a (i) a continuación y comprendiendo las cadenas ligeras CDR1 a CDR3 mostradas en (j) a (l) a continuación:

(g) una CDR1 de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 31, (h) una CDR2 de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 32, (i) una CDR3 de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 33, (j) una CDR1 de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 34, (k) una CDR2 de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 35, y (l) una CDR3 de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 36; y (C) un anticuerpo monoclonal que comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera unidas mediante un ligador, comprendiendo la región variable de cadena pesada las cadenas pesadas CDR1 a CDR3 mostradas en (m) a (o) a continuación y comprendiendo las cadenas ligeras CDR1 a CDR3 mostradas en (p) a (r) a continuación:

(m) una CDR1 de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 47, (n) una CDR2 de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 48, (o) una CDR3 de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 49, (p) una CDR1 de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 50, (q) una CDR2 de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 51, y (r) una CDR3 de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 52.

(I-2) El anticuerpo monoclonal según (I-1), en el que la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal de (A) consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 7.

(I-3) El anticuerpo monoclonal según (I-1) o (1-2), en el que la región variable de cadena ligera del anticuerpo monoclonal de (A) consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 8.

(I-4) El anticuerpo monoclonal según uno cualquiera de (I-1) a (I-3), en el que el ligador del anticuerpo monoclonal de (A) tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 11.

(I-5) El anticuerpo monoclonal según uno cualquiera de (I-1) a (I-4), en el que el anticuerpo monoclonal de (A) consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 12.

(I-6) El anticuerpo monoclonal según uno cualquiera de (I-1) a (I-5), en el que el anticuerpo monoclonal de (A) es capaz de unirse específicamente a LAM de bacilo de Koch, preferiblemente al bacilo de Koch humano (M. tuberculosis). (I-7) El anticuerpo monoclonal según (I-1), en el que la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal de (B) consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 37.

(I-8) El anticuerpo monoclonal según (I-1) o (I-7), en el que la región variable de cadena ligera del anticuerpo monoclonal de (B) consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 38.

(I-9) El anticuerpo monoclonal según uno cualquiera de (I-1), (I-7) y (I-8), en el que el ligador del anticuerpo monoclonal de (B) tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 40.

(I-10) El anticuerpo monoclonal según uno cualquiera de (I-1) y (I-7) a (I-9), en el que el anticuerpo monoclonal de (B) consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 39.

(I-11) El anticuerpo monoclonal según (I-1), en el que la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal de (C) consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 53.

(I-12) El anticuerpo monoclonal según (I-1) o (I-11), en el que la región variable de cadena ligera del anticuerpo monoclonal de (C) consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 54.

(I-13) El anticuerpo monoclonal según uno cualquiera de (I-1), (I-11) y (I-12), en el que el ligador del anticuerpo monoclonal de (C) tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 11.

(I-14) El anticuerpo monoclonal según uno cualquiera de (I-1) y (I-11) a (I-13), en el que el anticuerpo monoclonal de (C) consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 30.

(I-15) El anticuerpo monoclonal según uno cualquiera de (I-1) y (I-7) a (I-14), en el que el anticuerpo monoclonal de (B) o (C) es capaz de unirse específicamente a un bacilo acidorresistente no tuberculoso.

(I-16) El anticuerpo monoclonal según uno cualquiera de (I-1) a (I-15), en el que el anticuerpo monoclonal de uno cualquiera de (A) a (C) es un anticuerpo monovalente o bivalente.

(II) Método para inmunizar a un animal no humano para producir un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a lipoarabinomanano (LAM) bacilar acidorresistente, y método para producir el anticuerpo monoclonal

(II-1) Un método para inmunizar a un animal no humano para producir un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a LAM bacilar acidorresistente, comprendiendo el método administrar BCG como inmunógeno al animal no humano para inducir una respuesta inmunitaria humoral al BCG.

(II-2) El método según (II-1), en el que el animal no humano es un conejo o un pollo.

(II-3) El método según (II-1) o (II-2), en el que el bacilo acidorresistente es un bacilo de Koch, preferiblemente bacilo de Koch humano (M. tuberculosis).

(II-4) Un método para producir un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a LAM bacilar acidorresistente, comprendiendo el método las etapas de:

administrar BCG como inmunógeno a un animal no humano para inducir una respuesta inmunitaria humoral al BCG y producir un anticuerpo que se une a LAM bacilar acidorresistente; y

recoger las células que producen el anticuerpo del animal no humano.

(II-5) Un método para producir un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a LAM bacilar acidorresistente, comprendiendo el método las etapas de:

administrar BCG como inmunógeno a un animal no humano para inducir una respuesta inmunitaria humoral al BCG; preparar ARNm que codifica para un anticuerpo que se une a LAM bacilar acidorresistente del animal no humano; preparar ADNc usando el ARNm como molde; y

recoger un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a LAM bacilar acidorresistente mediante un método de visualización de fagos usando el ADNc.

(II-6) El método según (II-4) o (II-5), en el que el animal no humano es un conejo o un pollo.

(II-7) El método según uno cualquiera de (II-4) a (II-6), en el que el bacilo acidorresistente es un bacilo de Koch, preferiblemente bacilo de Koch humano (M. tuberculosis).

(II-8) El método según uno cualquiera de (II-4) a (II-7), en el que el anticuerpo monoclonal que se une específicamente a LAM bacilar acidorresistente es el anticuerpo monoclonal según uno cualquiera de (I-1) a (I-12).

(II-9) El método según uno cualquiera de (II-4) a (II-8), en el que el anticuerpo monoclonal que se une específicamente a LAM de bacilo de Koch, preferiblemente LAM de bacilo de Koch humano (M. tuberculosis), es el anticuerpo monoclonal de (A) según uno cualquiera de (I-1) a (1-6).

(II-10) Un método para producir un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a LAM bacilar acidorresistente, comprendiendo el método las etapas de:

administrar un complejo de LAM y el anticuerpo monoclonal de (A) según uno cualquiera de (I-1) a (I-6) como inmunógeno a un animal no humano para inducir una respuesta inmunitaria humoral al complejo y producir un anticuerpo que se une a LAM bacilar acidorresistente; y

recoger las células que producen el anticuerpo del animal no humano.

(II-11) Un método para producir un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a LAM bacilar acidorresistente, comprendiendo el método las etapas de:

administrar un complejo de LAM y el anticuerpo monoclonal de (A) según uno cualquiera de (I-1) a (1-6) como inmunógeno a un animal no humano para inducir una respuesta inmunitaria humoral al complejo;

preparar ARNm que codifica para un anticuerpo que se une a LAM bacilar acidorresistente del animal no humano; preparar ADNc usando el ARNm como molde; y

recoger un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a LAM bacilar acidorresistente mediante un método de visualización de fagos usando el ADNc.

(II-12) El método según (II-10) o (II-11), en el que el anticuerpo monoclonal que se une específicamente a LAM bacilar acidorresistente es el anticuerpo monoclonal de (B) según uno cualquiera de (I-1) y (I-7) a (I-12).

(III) Método para detectar bacilos acidorresistentes, preferiblemente bacilo de Koch

(III-1) Un método para detectar un bacilo acidorresistente, preferiblemente bacilo de Koch, comprendiendo el método las etapas de:

(1) poner en contacto el anticuerpo monoclonal según uno cualquiera de (I-1) a (I-16) con una muestra biológica del sujeto; y

(2) someter a ensayo el bacilo acidorresistente, preferiblemente bacilo de Koch, que existe en la muestra usando, como índice, una reacción de unión entre el anticuerpo monoclonal y el LAM bacilar acidorresistente, preferiblemente el LAM de bacilo de Koch.

(III-2) El método según (III-1), en el que el método para detectar el bacilo de Koch usa el anticuerpo monoclonal de (A) según uno cualquiera de (I-1) a (I-6).

Entre los métodos de detección anteriores, el método de detección de bacilo de Koch puede parafrasearse como un método para diagnosticar la tuberculosis en pacientes (un método de diagnóstico de la tuberculosis).

(IV) Reactivo de diagnóstico de la tuberculosis y kit de diagnóstico de la tuberculosis

(IV-1) Un reactivo de diagnóstico de la tuberculosis que comprende el anticuerpo monoclonal de (A) según uno cualquiera de (I-1) a (I-6).

(IV-2) Un kit de diagnóstico de la tuberculosis que comprende el anticuerpo monoclonal de (A) según uno cualquiera de (I-1) a (I-6) como reactivo de detección de la tuberculosis.

(V) Método para medir lipoarabinomanano (LAM) bacilar acidorresistente

(V-1) Un método para medir LAM bacilar acidorresistente en una muestra de prueba, que comprende las etapas de: (1) poner en contacto el anticuerpo monoclonal según uno cualquiera de (I-1) a (I-16) con la muestra de prueba que puede contener un bacilo acidorresistente; y

(2) someter a ensayo el LAM bacilar acidorresistente en la muestra de prueba usando una reacción de unión entre el anticuerpo monoclonal y el LAM bacilar acidorresistente como índice.

(V-2) El método según (V-1), que es un método de calificación de LAM bacilar acidorresistente que comprende detectar LAM bacilar acidorresistente como etapa (2), o un método de cuantificación de LAM bacilar acidorresistente que comprende cuantificar el LAM bacilar acidorresistente como etapa (2).

(V-3) El método según (V-1) o (V-2), en el que el bacilo acidorresistente es un bacilo de Koch, preferiblemente bacilo de Koch humano (M. tuberculosis).

(V-4) El método según (V-3), en el que el anticuerpo monoclonal es el anticuerpo monoclonal de (A) según uno cualquiera de (I-1) a (1-6).

(VI) Reactivo de detección o kit de detección de lipoarabinomanano (LAM) bacilar acidorresistente

(VI-1) Un reactivo de detección de LAM bacilar acidorresistente que comprende el anticuerpo monoclonal según uno cualquiera de (I-1) a (I-16).

(VI-2) Un reactivo de detección de LAM bacilar acidorresistente que comprende el anticuerpo monoclonal de (A) según uno cualquiera de (I-1) a (I-6).

(VI-3) El reactivo según (VI-2), en el que el bacilo acidorresistente es un bacilo de Koch, preferiblemente bacilo de Koch humano (M. tuberculosis).

(VI-4) Un kit de detección de LAM bacilar acidorresistente que comprende el anticuerpo monoclonal según uno cualquiera de (I-1) a (I-16) como reactivo de detección de LAM bacilar acidorresistente.

(VI-5) El kit de detección de LAM bacilar acidorresistente según (VI-4), en el que el anticuerpo monoclonal es el anticuerpo monoclonal de (A) según uno cualquiera de (I-1) a (I-6).

(VI-6) El kit de detección de LAM bacilar acidorresistente según (VI-5), en el que el bacilo acidorresistente es un bacilo de Koch, preferiblemente bacilo de Koch humano (M. tuberculosis).

(VII) Ensayo que usa una muestra esterilizada

(VII-1) Un método para determinar la presencia o ausencia de infección por bacilos acidorresistentes en una muestra de prueba, que comprende las etapas de:

(1) esterilizar la muestra de prueba mediante ebullición, preferiblemente mediante esterilización en autoclave;

(2) poner en contacto el anticuerpo monoclonal según uno cualquiera de (I-1) a (I-16), preferiblemente el anticuerpo monoclonal de (A) o (B) según uno cualquiera de (I-1) a (I-6) y (I-7) a (I-10), con la muestra esterilizada;

(3) someter a ensayo el LAM bacilar acidorresistente en la muestra de prueba usando una reacción de unión entre el anticuerpo monoclonal y el LAM bacilar acidorresistente como índice; y

(4) determinar que la muestra de prueba está infectada por un bacilo acidorresistente cuando se detecta LAM bacilar acidorresistente en la muestra de prueba.

(VII-2) El método según (VII-1), en el que el anticuerpo monoclonal es el anticuerpo monoclonal de (A) o (B) según uno cualquiera de (I-1) a (I-6) y (I-7) a (1-10), y el bacilo acidorresistente es bacilo de Koch.

(VIII) Método para determinar el efecto curativo de la tuberculosis de un medicamento antituberculoso (VIII-1) Un método para determinar el efecto curativo de la tuberculosis de un medicamento antituberculoso, que comprende las etapas de:

(1) poner en contacto el anticuerpo monoclonal de (A) según uno cualquiera de (I-1) a (I-6) con ambas de las muestras de prueba antes y después de la administración del medicamento antituberculoso;

(2) someter a ensayo el LAM de bacilo de Koch en las muestras de prueba antes y después de la administración del medicamento antituberculoso usando una reacción de unión entre el anticuerpo monoclonal y el LAM de bacilo de Koch como índice; y

(3) determinar que el medicamento antituberculoso tiene efecto curativo de la tuberculosis cuando se detecta LAM de bacilo de Koch en la muestra de prueba antes de la administración del medicamento antituberculoso y cuando no se detecta LAM de bacilo de Koch en la muestra de prueba después de la administración del medicamento antituberculoso.

(VIII-2) Un método para determinar el efecto curativo de la tuberculosis de un medicamento antituberculoso, que comprende las etapas de:

(1) poner en contacto el anticuerpo monoclonal de (A) según uno cualquiera de (I-1) a (I-6) con ambas de las muestras de prueba antes y después de la administración del medicamento antituberculoso;

(2) cuantificar el LAM de bacilo de Koch en las muestras de prueba antes y después de la administración del medicamento antituberculoso usando una reacción de unión entre el anticuerpo monoclonal y el LAM de bacilo de Koch como índice; y

(3) comparar la cantidad de LAM de bacilo de Koch en la muestra de prueba después de la administración del medicamento antituberculoso (medición posterior a la administración) con la cantidad de LAM de bacilo de Koch en la muestra de prueba antes de la administración del medicamento antituberculoso (medición previa a la administración); y determinar que el medicamento antituberculoso tiene efecto curativo de la tuberculosis cuando la medición posterior a la administración es inferior a la medición previa a la administración, y determinar que el medicamento antituberculoso no tiene efecto curativo de la tuberculosis cuando la medición posterior a la administración no es inferior a la medición previa a la administración.

(IX) Kit para determinar el efecto curativo de la tuberculosis de un medicamento antituberculoso

(IX) Un kit para determinar el efecto curativo de la tuberculosis de un medicamento antituberculoso, que comprende el anticuerpo monoclonal de (A) según uno cualquiera de (I-1) a (I-6).

(X) Herramienta de detección de bacilos acidorresistentes (bacilo de Koch)

(X-1) Una herramienta de detección de bacilos acidorresistentes, preferiblemente bacilo de Koch, que comprende una pieza de absorción de disolución formada a partir de un material capaz de transferir una muestra de prueba a través de acción capilar, comprendiendo la pieza de absorción de disolución:

(1) una parte de recogida de muestra para absorber y recoger una muestra de prueba;

(2) una parte de anticuerpo marcado que soporta un anticuerpo monoclonal marcado según uno cualquiera de (I-1) a (I-16) que reacciona específicamente con LAM bacilar acidorresistente;

(3) una parte de determinación que incluye una parte de visualización del resultado de la prueba (a) que tiene inmovilizado sobre la misma un anticuerpo monoclonal no marcado según uno cualquiera de (I-1) a (I-16) que reacciona específicamente con LAM bacilar acidorresistente; y

(4) una parte de absorción de disolución para absorber la disolución restante de la muestra de prueba que se ha movido a través de la parte de recogida de muestra, la parte de anticuerpo marcado y la parte de determinación.

(X-2) La herramienta de detección de bacilos acidorresistentes, preferiblemente bacilo de Koch, según (X-1), en la que la parte de determinación (3) comprende además una parte de visualización de control (b) que tiene inmovilizado sobre la misma un anticuerpo no marcado que reacciona con el anticuerpo monoclonal marcado según uno cualquiera de (I-1) a (I-16), estando la parte de visualización de control dispuesta aparte de la parte de visualización del resultado de la prueba (a).

(X-3) La herramienta de detección de bacilos acidorresistentes según (X-1) o (X-2), en la que el anticuerpo monoclonal es el anticuerpo monoclonal de (A) según uno cualquiera de (I-1) a (I-6) y el bacilo acidorresistente es un bacilo de Koch, preferiblemente bacilo de Koch humano (M. tuberculosis).

Efectos ventajosos de la invención

Según la presente invención, los bacilos acidorresistentes que existen en la muestra biológica de un sujeto (esputo, saliva, sangre, líquido de lavado pulmonar, jugo gástrico, orina, heces, piel o jugo pancreático) pueden distinguirse de otras bacterias y detectarse específicamente. El método para detectar bacilos acidorresistentes según la presente invención tiene una sensibilidad y especificidad comparables a las de los métodos de detección por amplificación de genes. Debido a que el método para detectar bacilos acidorresistentes según la presente invención puede determinar la cantidad de bacilos acidorresistentes en un organismo vivo, puede monitorizarse el efecto curativo sobre los bacilos acidorresistentes, en particular la tuberculosis. Además, el método para detectar bacilos acidorresistentes según la presente invención puede detectar de forma fiable y precisa bacilos acidorresistentes incluso a partir de muestras objetivo esterilizadas durante al menos una semana después de la esterilización. Por tanto, incluso en una zona que no tenga un sistema especial de transporte de muestras para prevenir la infección, pueden transportarse las muestras, si están esterilizadas, mediante sistemas de transporte generales, tales como, por ejemplo, por correo.

Según una realización preferida de la presente invención, el bacilo de Koch que existe en la muestra biológica de un paciente con tuberculosis puede distinguirse de los bacilos acidorresistentes no tuberculosos y detectarse específicamente. Por tanto, la presente invención puede diagnosticar la infección por bacilo de Koch con gran precisión. Además, pueden determinarse con gran precisión los efectos curativos de los medicamentos antituberculosos en pacientes con tuberculosis.

Breve descripción de los dibujos

[FIG. 1] En la figura 1, (A) y (B) son ambos diagramas que muestran modos (en vista lateral) de una herramienta de detección de bacilo de Koch (herramienta de detección de LAM de bacilo de Koch) de la presente invención. El diagrama (A) muestra un modo en el que una parte de determinación (3) tiene únicamente una parte de visualización del resultado de la prueba (a), y el diagrama (B) muestra un modo en el que la parte de determinación (3) tiene tanto la parte de visualización del resultado de la prueba (a) como una parte de visualización de control (b). Los caracteres de referencia en la figura indican lo siguiente. 10: cuerpo de soporte, 21: lámina que forma la parte de recogida de muestra (1), 22: lámina que forma la parte de anticuerpo marcado (2), 23: lámina que forma la parte de determinación (3), 24: lámina que forma la parte de absorción de disolución (4), (a): parte de visualización del resultado de la prueba, (b): parte de visualización de control, (1): parte de recogida de muestra, (2): parte de anticuerpo marcado, (3): parte de determinación, (4): parte de absorción de disolución, P: flecha que muestra la dirección del flujo de la muestra de prueba. (Lo mismo se aplica a la figura 2).

[FIG. 2] La figura 2 muestra un modo (en vista en perspectiva) de la herramienta de detección de bacilo de Koch (herramienta de detección de LAM de bacilo de Koch) de la presente invención.

[FIG. 3] La figura 3 muestra un resultado de la medición del título de anticuerpos en la sangre de conejos inmunizados por vía subcutánea con la vacuna BCG o con células bacterianas muertas de H37Ra, mediante el método ELISA usando placas de antígenos que tienen inmovilizados sobre las mismas LAM de M. tuberculosis (-■-) y LAM de M. avium (-•-) (ejemplo de referencia 1 (2)). (A) muestra un resultado de conejos inmunizados con la vacuna BCG y (B) muestra un resultado de conejos inmunizados con células bacterianas muertas de H37Ra.

[FIG. 4] La figura 4 muestra secuencias de aminoácidos de scFv que tienen reactividad frente a LAM. Más específicamente, se hace una comparación entre la fila superior que muestra una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 30) de scFv (Myco-scFv) producida a partir de células del bazo de un conejo inmunizado con células bacterianas muertas de H37Ra y la fila inferior que muestra una secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 12) del scFv (TB-scFv) producido a partir de células del bazo de un conejo inmunizado con la vacuna BCG, junto con las posiciones respectivas de las regiones de CDR1 a CDR3 en las regiones variables de cadena pesada, un ligador y las regiones de CDR1 a CDR3 en las regiones variables de cadena ligera. Cabe señalar que, con respecto a una secuencia de ligador que tiene cuatro residuos de serina unidos en su extremo N-terminal, una región de aminoácidos en el lado N-terminal muestra la región VH y una región en el lado C-terminal muestra la región VL.

[FIG. 5] La figura 5 muestra un resultado de la evaluación de la reactividad frente a LAM de TB-scFv. La reactividad frente a LAM del TB-scFv producido a partir de un conejo inmunizado con la vacuna BCG se evaluó con ELISA usando placas que tenían LAM de M. tuberculosis y LAM de M. avium inmovilizados sobre las mismas. En la figura 5, “■” indica la reactividad frente a LAM de M. tuberculosis y “• ” indica la reactividad frente a M. avium.

[FIG. 6] La figura 6 muestra un resultado de la evaluación de un ELISA de detección de LAM bacilar acidorresistente y un ELISA de detección de LAM de bacilo de Koch. Se evaluó la reactividad frente a LAM en el ELISA de detección de LAM bacilar acidorresistente y en el ELISA de detección de LAM de bacilo de Koch usando LAM de M. tuberculosis y LAM de M. avium purificados. En la figura 6, “• ” indica la reactividad frente a LAM de M. tuberculosis en el ELISA de detección de LAM bacilar acidorresistente, “■” indica la reactividad frente a LAM de M. avium en el ELISA de detección de LAM bacilar acidorresistente, “o” indica la reactividad frente a LAM de M. tuberculosis en el ELISA de detección de LAM de bacilo de Koch y “□” indica la reactividad frente a LAM de M. avium en el ELISA de detección de LAM de bacilo de Koch.

[FIG. 7] La figura 7 muestra un resultado de la evaluación de la combinación de anticuerpos. La evaluación de la combinación de anticuerpos se llevó a cabo con el ELISA de detección de LAM bacilar acidorresistente y el ELISA de detección de LAM de bacilo de Koch usando aislados clínicos bacilares acidorresistentes. La reactividad frente a cada una de las cepas se muestra con densidad de color. En la figura 7, myco indica los resultados del ELISA de detección de LAM bacilar acidorresistente y TB indica los resultados del ELISA de detección de LAM de bacilo de Koch.

[FIG. 8] La figura 8 muestra los resultados de la evaluación de una prueba de inmunocromatografía de detección de LAM bacilar acidorresistente y de una prueba de inmunocromatografía de detección de LAM de bacilo de Koch. La reactividad frente a LAM en la inmunocromatografía de detección de LAM bacilar acidorresistente y en la inmunocromatografía de detección de LAM de bacilo de Koch se evaluó usando LAM de M. tuberculosis (A y B) y LAM de M. avium (C y D) purificados. En cada una de las figuras, “myco” indica un resultado de la prueba de inmunocromatografía de detección de LAM bacilar acidorresistente y “TB” indica un resultado de la prueba de inmunocromatografía de detección de LAM de bacilo de Koch.

[FIG. 9] La figura 9 muestra el título de anticuerpos del antisuero de pollo contra LAM (ejemplo 5). En la figura 9, “- • - ” indica la reactividad frente a LAM purificado de la cepa Aoyama B del bacilo de Koch (M. tuberculosis) y “ -■-” indica la reactividad frente a LAM purificado de M. avium.

[FIG. 10] La figura 10 muestra una secuencia de aminoácidos de un anticuerpo de cadena sencilla G3-scFv aislado de una biblioteca de scFv de pollo, junto con las posiciones de las regiones de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena pesada, una región de ligador GS y regiones de CDR1, CDR2 y CDR3 en la región variable de cadena ligera.

[FIG. 11] La figura 11 muestra la reactividad del ELISA de detección de LAM usando un anticuerpo bivalente (ejemplo 7). En la figura 11, “- • - ” indica la reactividad frente a BCG en el ELISA de detección de LAM de bacilo de Koch y “-■-” indica la reactividad frente a BCG en el ELISA de detección de LAM bacilar acidorresistente.

[FIG. 12] La figura 12 muestra la sensibilidad de detección del ELISA de detección de LAM bacilar acidorresistente usando un anticuerpo bivalente (ejemplo 8). En la figura, la tabla es una comparación de la sensibilidad de detección entre la prueba de amplificación de ácidos nucleicos (NAAT) y el ELISA de detección de LAM bacilar acidorresistente.

[FIG. 13] La figura 13 muestra un resultado de una prueba de reactividad cruzada para el ELISA de detección de LAM bacilar acidorresistente con respecto a las bacterias bucales (ejemplo 9). En la figura, “Na” significa células bacterianas de N. asteroides, “Nf” significa células bacterianas de N. farcinica, “Sg” significa células bacterianas de Streptomyces, “Ca” significa células bacterianas de C. albicans, “Ai” significa células bacterianas de Actinomycete y “Tp” significa células bacterianas de T. paurometabolum. En este caso se muestran los resultados del ELISA de detección de LAM bacilar acidorresistente realizado con LAM extraído de cada una de estas células bacterianas cultivadas y de células bacterianas de BCG cultivadas.

[FIG. 14] La figura 14 muestra la reactividad frente a aislados clínicos bacilares acidorresistentes en el ELISA de detección de LAM usando un anticuerpo bivalente (ejemplo 10). En la figura, “A” muestra los resultados de ensayo de 38 aislados clínicos de bacilo de Koch y “B” muestra los resultados de ensayo de 29 cepas de bacilos acidorresistentes no tuberculosos (23 cepas de M. avium, 6 cepas de M. intracellulare). Tanto en A como en B en la figura, las barras negras representan los resultados de ensayo del ELISA de detección de LAM bacilar acidorresistente, y las barras blancas representan los resultados de ensayo del ELISA de detección de LAM de bacilo Koch. De las 29 cepas de bacilos acidorresistentes no tuberculosos en B, los números 1 a 23 son los resultados de las 23 cepas de M. avium y los números 24 a 29 son los resultados de las 6 cepas de M. intracellulare.

[FIG. 15] La figura 15 muestra las razones (valor del ELISA de detección de LAM bacilar acidorresistente / valor del ELISA de detección de LAM de bacilo de Koch) de reactividad en el ELISA de detección de LAM bacilar acidorresistente y en el ELISA de detección de LAM de bacilo de Koch.

[FIG. 16] La figura 16 muestra la reactividad frente a muestras clínicas de esputo en el ELISA de detección de LAM de bacilo de Koch (figura izquierda) y en el ELISA de detección de LAM bacilar acidorresistente usando un anticuerpo bivalente (figura derecha) (ejemplo 11). En la figura, “I” muestra los resultados de un grupo de muestras que resultaron negativas en la prueba de frotis (prueba de frotis directa) y negativas en la prueba de amplificación de ácidos nucleicos, “ II” muestra los resultados de muestras que resultaron “escasas” en la prueba de frotis y negativas en la prueba de amplificación de ácidos nucleicos, “ III” muestra los resultados de un grupo de muestras que resultaron negativas en la prueba de frotis y positivas en la prueba de amplificación de ácidos nucleicos, “ IV” muestra los resultados de un grupo de muestras que resultaron “escasas” en la prueba de frotis y positivas en la prueba de amplificación de ácidos nucleicos, “V” muestra los resultados de un grupo de muestras que obtuvieron una puntuación de 1+ en la prueba de frotis, “VI” muestra los resultados de un grupo de muestras que obtuvieron una puntuación de 2+ en la prueba de frotis y “VII” muestra los resultados de un grupo de muestras que obtuvieron una puntuación de 3+ en la prueba de frotis. Cabe señalar que los muestras que obtuvieron una puntuación igual o superior a 1+ en la prueba de frotis son todas positivas en la prueba de amplificación de ácidos nucleicos. Además, las líneas discontinuas muestran los valores de punto de corte provisionales.

[FIG. 17] La figura 17 muestra la correlación entre el número de células bacterianas y la concentración de LAM detectado en el ELISA de detección de LAM (ejemplo 11). En la figura, “I” muestra los resultados de un grupo de muestras que resultaron negativas en la prueba de frotis y negativas en la prueba de amplificación de ácidos nucleicos, “ II” muestra los resultados de un grupo de muestras que resultaron negativas en la prueba de frotis y positivas en la prueba de amplificación de ácidos nucleicos, “ III” muestra los resultados de un grupo de muestras que resultaron “escasas” en la prueba de frotis y positivas en la prueba de amplificación de ácidos nucleicos, “ IV” muestra los resultados de un grupo de muestras que obtuvieron una puntuación de 1+ en la prueba de frotis, “V” muestra los resultados de un grupo de muestras que obtuvieron una puntuación de 2+ en la prueba de frotis y “VI” muestra los resultados de un grupo de muestras que obtuvieron una puntuación de 3+ en la prueba de frotis. Cabe señalar que los muestras que obtuvieron una puntuación igual o superior a 1+ en la prueba de frotis son todas positivas en la prueba de amplificación de ácidos nucleicos. Además, una línea en cada uno de los grupos de muestras indica un valor promedio de la concentración de LAM.

[FIG. 18] La figura 18 muestra la estabilidad de LAM bacilar acidorresistente frente al tratamiento de esterilización. Las barras blancas muestran los resultados de ensayo de las células bacterianas que no se han esterilizado, las barras negras muestran los resultados de ensayo de las células bacterianas que se han sometido a ebullición a 100°C durante 30 minutos y las barras grises muestran los resultados de ensayo de las células bacterianas que se han esterilizado en vapor a alta presión (sometidas a esterilización en autoclave a 121°C durante 15 minutos) (ejemplo 12).

[FIG. 19] La figura 19 muestra la estabilidad en almacenamiento de LAM después del tratamiento de esterilización por vapor a alta presión (esterilización en autoclave). Las barras blancas muestran los resultados de ensayo de las células bacterianas inmediatamente después del tratamiento de esterilización por vapor a alta presión y las barras negras muestran los resultados de ensayo de las células bacterianas que se han dejado a 25°C durante 7 días después del tratamiento de esterilización por vapor a alta presión (ejemplo 12).

Descripción de las realizaciones

(I) Anticuerpo monoclonal que se une específicamente a LAM bacilar acidorresistente

Los bacilos de Koch pertenecen al género Mycobacterium de la familia Mycobacteriaceae, y son un tipo de grupo bacteriano denominado, junto con otras bacterias pertenecientes al género Mycobacterium, bacilos acidorresistentes. Sin embargo, los bacilos de Koch se distinguen de otros bacilos acidorresistentes (bacilos acidorresistentes no tuberculosos) por el hecho de que pueden crecer a 37°C pero no a 28°C y por el hecho de que tienen una catalasa resistente al calor. Se conocen cuatro tipos de bacilos de Koch, a saber, el bacilo de Koch (Mycobacterium tuberculosis, bacilo de Koch humano), el bacilo de Koch bovino (M. bovis, bacilo de Koch bovino, bacilo bovino), Mycobacterium africanum (M. africanum) y el bacilo de Koch de los topillos (M. microti). Entre estos, el bacilo de Koch humano (M. tuberculosis) es patógeno para los humanos como bacteria que provoca tuberculosis, y M. bovis y M. africanum infectan a los humanos en raras ocasiones. M. microti no es patógena para los humanos. Además, el BCG se obtiene mediante la atenuación de M. bovis a través de sucesivos subcultivos a largo plazo, y se usa como vacuna (vacuna de bacterias vivas atenuadas) para la prevención de la tuberculosis.

Un anticuerpo monoclonal (a continuación en el presente documento, también denominado “AcM”) que es objeto de la presente invención es un anticuerpo que distingue y reconoce específicamente un bacilo acidorresistente de otras bacterias existentes in vivo. Más específicamente, es un anticuerpo que distingue el lipoarabinomanano (LAM) de bacilos acidorresistentes de otros antígenos similares al LAM de las bacterias y se une específicamente a LAM de bacilos acidorresistentes. El LAM descrito en este caso es uno de los principales lipoglicanos que forman las membranas celulares y paredes celulares de las bacterias del género Mycobacterium (bacilos acidorresistentes), incluyendo los bacilos de Koch. Normalmente, el LAM incluye un anclaje de manosil fosfatidilinositol (MPI), una estructura principal de azúcar que incluye un núcleo de D-manano y un dominio de D-arabinano, y un motivo de recubrimiento. Sin embargo, dependiendo del tipo de bacterias, existen diferencias en el número de residuos de azúcar (por ejemplo, manosa) incluidos dentro de una molécula, la estructura ramificada de una cadena de azúcar, el número de grupos acilo y el tipo de ácidos grasos que forman los grupos acilo.

Específicamente, el AcM de la presente invención incluye un anticuerpo con una estructura en la que una región variable de cadena pesada que incluye las CDR1 a CDR3 de cadena pesada de los siguientes puntos (a) a (c) y una región variable de cadena ligera que incluye las CDR1 a CDR3 de cadena ligera de los siguientes puntos (d) a (f) están conectadas mediante un ligador. Por comodidad, este AcM también se denomina “AcM1”.

(a) CDR1 de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1.

(b) CDR2 de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2.

(c) CDR3 de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3.

(d) CDR1 de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 4.

(e) CDR2 de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 5.

(f) CDR3 de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 6.

Un AcM de la presente divulgación incluye un anticuerpo con una estructura en la que una región variable de cadena pesada que incluye las CDR1 a CDR3 de cadena pesada de los siguientes puntos (g) a (i) y una región variable de cadena ligera que incluye las CDR1 a CDR3 de cadena ligera de los siguientes puntos (j) a (l) están conectadas mediante un ligador. Por comodidad, este AcM también se denomina “AcM2”.

(g) CDR1 de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 31.

(h) CDR2 de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 32.

(i) CDR3 de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 33.

(j) CDR1 de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 34.

(k) CDR2 de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 35.

(l) CDR3 de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 36.

Un AcM adicional de la presente divulgación incluye un anticuerpo con una estructura en la que una región variable de cadena pesada que incluye las CDR1 a CDR3 de cadena pesada de los siguientes puntos (m) a (o) y una región variable de cadena ligera que incluye las CDR1 a CDR3 de cadena ligera de los siguientes puntos (p) a (r) están conectadas mediante un ligador. Por comodidad, este AcM también se denomina “AcM3”.

(m) CDR1 de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 47.

(n) CDR2 de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 48.

(o) CDR3 de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 49.

(p) CDR1 de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 50.

(q) CDR2 de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 51.

(r) CDR3 de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 52.

En este caso, “CDR” es una abreviatura de “región determinante de complementariedad”, también denominada región que determina la complementariedad. Las CDR son regiones que existen en una región variable de inmunoglobulina, y son regiones profundamente implicadas en la unión específica de un anticuerpo a un antígeno. Entre estas, “una CDR de cadena pesada” se refiere a una CDR que existe en una región variable de una cadena pesada de inmunoglobulina y “una CDR de cadena ligera” se refiere a una CDR que existe en una región variable de una cadena ligera de inmunoglobulina.

La región variable de cadena pesada es una región que incluye las CDR1 a CDR3 de cadena pesada y la región variable de cadena ligera es una región que incluye las CDR1 a CDR3 de cadena ligera. Aunque no hay ninguna limitación particular en el orden de disposición de estas CDR1 a CDR3, preferiblemente, tanto en la región variable de cadena pesada como en la región variable de cadena ligera, las CDR1, CDR2 y CDR3 están dispuestas en este orden en una dirección desde el lado N-terminal hasta el lado C-terminal de forma continua o a través de otras secuencias de aminoácidos.

La región variable de cadena pesada y/o la región variable de cadena ligera del AcM de la presente invención puede tener, como otras secuencias de aminoácidos, una secuencia de aminoácidos denominada región de entramado (a continuación en el presente documento, simplemente denominada “FR”) en una región de las regiones variables descritas anteriormente, excluyendo las CDR1 a CDR3 descritas anteriormente. La secuencia de aminoácidos de la FR puede ser una secuencia de aminoácidos derivada de una región de entramado (FR) de una región variable de cadena pesada o de una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina, una variante de las mismas o una modificación parcial de las mismas obtenida mediante la introducción de un sitio de reconocimiento de enzimas de restricción en una parte de la secuencia de aminoácidos derivada de la FR.

En las regiones variables de cadena pesada de inmunoglobulina, por ejemplo, una región entre el extremo N-terminal de la región variable de cadena pesada y la CDR1 descrita anteriormente se define como “FR1”, una región entre la CDR1 y la CDR2 se define como “FR2”, una región entre la CDR2 y la CDR3 se define como “FR3” y una región entre la CDR3 y el extremo C-terminal de la región variable de cadena pesada se define como “FR4”. De manera similar, en la región variable de cadena ligera de inmunoglobulina, por ejemplo, una región entre el extremo N-terminal de la región variable de cadena ligera y la CDR1 se define como “FR1”, una región entre la CDR1 y la CDR2 se define como “FR2”, una región entre la CDR2 y la CDR3 se define como “FR3” y una región entre la “CDR3” y el extremo C-terminal de la región variable se define como “FR4”.

Estas FR tienen una función como ligador que conecta cada una de las CDR1, CDR2 y CDR3 descritas anteriormente, que son importantes como secuencias de reconocimiento de antígenos, y son regiones que contribuyen a la formación de la conformación tridimensional de las regiones variables.

En el AcM1 de la presente invención, la región variable de cadena pesada tiene preferiblemente una secuencia de aminoácidos de 119 residuos de aminoácido expuesta en SEQ ID NO: 7 y la región variable de cadena ligera tiene preferiblemente una secuencia de aminoácidos de 112 residuos de aminoácido expuesta en SEQ ID NO: 8. En SEQ ID NO: 7, que muestra la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada, una región desde el extremo N-terminal hasta el aminoácido 30 corresponde a “FR1” de la región variable de cadena pesada, una región de aminoácidos desde el aminoácido 31 hasta el aminoácido 35 corresponde a “CDR1” (SEQ ID NO: 1) de la región variable de cadena pesada, una región de aminoácidos desde el aminoácido 36 hasta el aminoácido 49 corresponde a “FR2”, una región de aminoácidos desde el aminoácido 50 hasta el aminoácido 65 corresponde a “CDR2” (SEQ ID NO: 2), una región de aminoácidos desde el aminoácido 66 hasta el aminoácido 96 corresponde a “FR3”, una región de aminoácidos desde el aminoácido 97 hasta el aminoácido 106 corresponde a “CDR3” (SEQ ID NO: 3) y una región de aminoácidos desde el aminoácido 107 hasta el aminoácido 119 corresponde a “FR4”.

Además, en SEQ ID NO: 8, que muestra la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera del AcM1 de la presente invención, una región desde el extremo N-terminal hasta el aminoácido 23 corresponde a “FR1” de la región variable de cadena ligera, una región de aminoácidos desde el aminoácido 24 hasta el aminoácido 36 corresponde a “CDR1” (SEQ ID NO: 4) de la región variable de cadena ligera, una región de aminoácidos desde el aminoácido 37 hasta el aminoácido 51 corresponde a “FR2”, una región de aminoácidos desde el aminoácido 52 hasta el aminoácido 58 corresponde a “CDR2” (SEQ ID NO: 5), una región de aminoácidos desde el aminoácido 59 hasta el aminoácido 89 corresponde a “FR3”, una región de aminoácidos desde el aminoácido 90 hasta el aminoácido 102 corresponde a “CDR3” (SEQ ID NO: 6) y una región de aminoácidos desde el aminoácido 103 hasta el aminoácido 112 corresponde a “FR4”.

En el AcM2 de la presente divulgación, la región variable de cadena pesada tiene preferiblemente una secuencia de aminoácidos de 130 residuos de aminoácido expuesta en SEQ ID NO: 37 y la región variable de cadena ligera tiene preferiblemente una secuencia de aminoácidos de 116 residuos de aminoácido expuesta en SEQ ID NO: 38. En SEQ ID NO: 37, que muestra la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada, una región desde el extremo N-terminal hasta el aminoácido 35 corresponde a “FR1” de la región variable de cadena pesada, una región de aminoácidos desde el aminoácido 36 hasta el aminoácido 40 corresponde a “CDR1” (SEQ ID NO: 31) de la región variable de cadena pesada, una región de aminoácidos desde el aminoácido 41 hasta el aminoácido 54 corresponde a “FR2”, una región de aminoácidos desde el aminoácido 55 hasta el aminoácido 74 corresponde a “CDR2” (SEQ ID NO: 32), una región de aminoácidos desde el aminoácido 75 hasta el aminoácido 106 corresponde a “FR3”, una región de aminoácidos desde el aminoácido 107 hasta el aminoácido 119 corresponde a “CDR3” (SEQ ID NO: 33) y una región de aminoácidos desde el aminoácido 120 hasta el aminoácido 130 corresponde a “FR4”.

Además, en SEQ ID NO: 38, que muestra la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera del AcM2 de la presente divulgación, una región desde el extremo N-terminal hasta el aminoácido 20 corresponde a “FR1” de la región variable de cadena ligera, una región de aminoácidos desde el aminoácido 21 hasta el aminoácido 28 corresponde a “CDR1” (SEQ ID NO: 34) de la región variable de cadena ligera, una región de aminoácidos desde el aminoácido 29 hasta el aminoácido 44 corresponde a “FR2”, una región de aminoácidos desde el aminoácido 45 hasta el aminoácido 51 corresponde a “CDR2” (SEQ ID NO: 35), una región de aminoácidos desde el aminoácido 52 hasta el aminoácido 83 corresponde a “FR3”, una región de aminoácidos desde el aminoácido 84 hasta el aminoácido 95 corresponde a “CDR3” (SEQ ID NO: 36) y una región de aminoácidos desde el aminoácido 96 hasta el aminoácido 116 corresponde a “FR4”.

En el AcM3 de la presente divulgación, la región variable de cadena pesada tiene preferiblemente una secuencia de aminoácidos de 121 residuos de aminoácido expuesta en SEQ ID NO: 53 y la región variable de cadena ligera tiene preferiblemente una secuencia de aminoácidos de 110 residuos de aminoácido expuesta en SEQ ID NO: 54. En SEQ ID NO: 53, que muestra la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada, una región desde el extremo N-terminal hasta el aminoácido 30 corresponde a “FR1” de la región variable de cadena pesada, una región de aminoácidos desde el aminoácido 31 hasta el aminoácido 35 corresponde a “CDR1” (SEQ ID NO: 47) de la región variable de cadena pesada, una región de aminoácidos desde el aminoácido 36 hasta el aminoácido 49 corresponde a “FR2”, una región de aminoácidos desde el aminoácido 50 hasta el aminoácido 65 corresponde a “CDR2” (SEQ ID NO: 48), una región de aminoácidos desde el aminoácido 66 hasta el aminoácido 96 corresponde a “FR3”, una región de aminoácidos desde el aminoácido 97 hasta el aminoácido 108 corresponde a “CDR3” (s Eq ID NO: 49) y una región de aminoácidos desde el aminoácido 109 hasta el aminoácido 121 corresponde a “FR4”.

Además, en SEQ ID NO: 54, que muestra la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera del AcM3 de la presente divulgación, una región desde el extremo N-terminal hasta el aminoácido 23 corresponde a “FR1” de la región variable de cadena ligera, una región de aminoácidos desde el aminoácido 24 hasta el aminoácido 34 corresponde a “CDR1” (SEQ ID NO: 50) de la región variable de cadena ligera, una región de aminoácidos desde el aminoácido 35 hasta el aminoácido 49 corresponde a “FR2”, una región de aminoácidos desde el aminoácido 50 hasta el aminoácido 56 corresponde a “CDR2” (SEQ ID NO: 51), una región de aminoácidos desde el aminoácido 57 hasta el aminoácido 87 corresponde a “FR3”, una región de aminoácidos desde el aminoácido 88 hasta el aminoácido 100 corresponde a “CDR3” (SEQ ID NO: 52) y una región de aminoácidos desde el aminoácido 101 hasta el aminoácido 110 corresponde a “FR4”.

Siempre que no se comprometan los efectos ventajosos del AcM1 de la presente invención y del AcM2 de la presente divulgación, es posible introducir una mutación en cualquiera de las secuencias de aminoácidos correspondientes a FR1 a FR4 de la región variable de cadena pesada expuestas en las SEQ ID NO: 7, 37 y 53 y las secuencias de aminoácidos correspondientes a FR1 a FR4 de la región variable de cadena ligera expuestas en las SEQ ID NO: 8, 38 y 54. En este caso, a menos que se mencione lo contrario en particular, “ los efectos ventajosos del AcM1 de la presente invención, del AcM2 y del AcM3 de la presente divulgación” significa la unión a LAM bacilar acidorresistente y preferiblemente significa la unión específica a LAM bacilar acidorresistente. En particular, “el efecto ventajoso del AcM1 de la presente invención” significa la unión a LAM de bacilo de Koch y preferiblemente significa la unión específica a LAM de bacilo de Koch. Aunque tampoco hay ninguna limitación particular en el número de mutaciones que pueden introducirse, el número de mutaciones introducidas puede establecerse de manera que la identidad de la secuencia de aminoácidos con la anterior a la mutación sea del 85% o superior, preferiblemente del 90% o superior, más preferiblemente del 95% o superior y de manera particularmente preferible del 98% o superior. Cabe señalar que la introducción de la mutación descrita en este caso puede incluir la sustitución, la deleción y la inserción de un aminoácido. Además, puede introducirse un sitio de reconocimiento de enzimas de restricción en la FR1 de la región variable de cadena pesada y/o en la FR4 de las regiones variables de cadena ligera/pesada.

Además, las FR1 a FR4 de la región variable de cadena pesada y las FR1 a FR4 de la región variable de cadena ligera indicadas en el AcM1 y el AcM3 son todas secuencias de aminoácidos derivadas de conejo, mientras que las FR1 a FR4 de la región variable de cadena pesada y las FR1 a FR4 de la región variable de cadena ligera indicadas en el AcM2 son todas secuencias de aminoácidos derivadas de pollo. Sin embargo, siempre que no se comprometa el efecto ventajoso del AcM de la presente invención, puede usarse una región de entramado derivada de cualquier especie animal. Los ejemplos de tales especies animales pueden incluir, pero sin limitarse particularmente a, humano, conejo, pollo, caballo, vaca, cabra, oveja, perro, ratón, hámster y rata. Las secuencias de aminoácidos se derivan preferiblemente de conejo, pollo o humano, y más preferiblemente de humano. Cabe señalar que las secuencias de aminoácidos de las FR1 a FR4 derivadas de humano se conocen en la técnica (Kabat, et al. US Department of Health AND human Services, NIH (1991), EE.UU.) y se describen, por ejemplo, en un sitio web del NCBI.

El AcM de la presente invención tiene una estructura en la que una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera que tienen la configuración descrita anteriormente están conectadas mediante un ligador.

Con respecto al “ ligador” en este caso, no hay ninguna limitación particular siempre que no se comprometa el efecto ventajoso del AcM de la presente invención, y los ejemplos del mismo pueden incluir un péptido que tiene una secuencia de ligador formada por una secuencia de aminoácidos cuyo número de residuos de aminoácido es normalmente de aproximadamente 8 a 30, preferiblemente de aproximadamente 8 a 20 y más preferiblemente de aproximadamente 8 a 15. Los ejemplos de secuencias de ligador preferibles incluyen, pero no se limitan a, una secuencia de ligador GS [(Gly-Gly-Gly-Ser: SEQ ID NO: 9)n, (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser: s Eq ID NO: 10)n n es el número de repeticiones] o similares. Preferiblemente, se usa como ligador un péptido que tiene una secuencia con de 1 a 3 (n es un número entero de 1 a 3) repeticiones de una secuencia de ligador GS de este tipo. En los ejemplos descritos más adelante, se usan como ligador un péptido (ejemplo 1) que tiene una secuencia (GGGGSGGGGSGGGGS: SEQ ID NO: 11) con tres repeticiones de la secuencia de ligador GS y un péptido (ejemplo 6) que tiene otra secuencia (GGGGSGGDGSGGGS: SEQ ID NO: 40).

Un modo preferible del AcM1 de la presente invención puede ser un anticuerpo de cadena sencilla que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 12. Además, un modo preferible del AcM2 puede ser un anticuerpo de cadena sencilla que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 39. Además, un modo preferible del AcM3 puede ser un anticuerpo de cadena sencilla que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 30.

Tales anticuerpos monoclonales de la presente invención incluyen un anticuerpo que distingue y reconoce específicamente el bacilo de Koch de los bacilos acidorresistentes no tuberculosos. Más específicamente, incluyen un anticuerpo que distingue el lipoarabinomanano (LAM) de bacilo de Koch del LAM de bacilos acidorresistentes no tuberculosos y se une específicamente a LAM de bacilo de Koch. Los ejemplos de los anticuerpos monoclonales pueden incluir el AcM1 descrito anteriormente. El bacilo de Koch que se distingue de los bacilos acidorresistentes no tuberculosos y es reconocido específicamente por el AcM de la presente invención es preferiblemente bacilo de Koch humano (M. tuberculosis) y bacilo de Koch bovino (M. bovis), y más preferiblemente es bacilo de Koch humano (M. tuberculosis).

Cuando se compara la reacción contra LAM de bacilo de Koch mediante un método de competición, puede decirse que se produce una unión específica con respecto a LAM de bacilo de Koch cuando la cantidad requerida de LAM de bacilos acidorresistentes no tuberculosos es 10 veces o más que la de LAM de bacilo de Koch. Además, cuando se detecta LAM mediante ensayo en sándwich con un anticuerpo inmovilizado y un anticuerpo de detección, puede determinarse que el AcM de la presente invención tiene una especificidad de unión más preferible con respecto a LAM de bacilo de Koch si la reactividad frente a LAM de bacilos acidorresistentes no tuberculosos se ha reducido a 1/100 de la de LAM de bacilo de Koch.

La afinidad de un anticuerpo puede medirse fácilmente con una tecnología hasta ahora conocida, por ejemplo, mediante la medición de una isoterma de unión por saturación de IgG marcada con 125I o su fragmento, o mediante un análisis de regresión no lineal usando la sustitución homóloga de 125IgG por IgG no marcada, tal como describe Motilsky en Analyzing Data with GraphPad Prizm (1999), GraphPad Software Inc., San Diego, CA. Pueden usarse otros métodos conocidos en la técnica para la medición, y el método puede ser, por ejemplo, un método descrito en Scatchard et al. Ann. NY Acd. Sci., 51,660 (1949).

El AcM de la presente invención puede producirse según, pero sin limitarse a, el método de visualización de fagos (G. Smith, Science, 228, 1315 (1985)) usando el bacilo de Koch como antígeno. En este caso, los ejemplos de bacilos de Koch pueden incluir el bacilo de Koch descrito anteriormente (Mycobacterium tuberculosis, bacilo de Koch humano), bacilo de Koch bovino (M. bovis, bacilo de Koch bovino, bacilo bovino), Mycobacterium africanum y bacilo de Koch de los topillos. Son preferibles el bacilo de Koch (Mycobacterium tuberculosis, bacilo de Koch humano), el bacilo de Koch bovino (M. bovis, bacilo de Koch bovino, bacilo bovino) y Mycobacterium africanum, y es más preferible el bacilo de Koch bovino. Tal como se describió anteriormente, el BCG se obtiene atenuando el bacilo de Koch bovino (M. bovis) mediante sucesivos subcultivos a largo plazo.

En los ejemplos se describe un método para producir el AcM de la presente invención con visualización de fagos usando BCG como antígeno. Tal como se describió anteriormente, una característica del AcM de la presente invención es que distingue y reconoce específicamente los bacilos acidorresistentes de otras bacterias, tales como las bacterias bucales, y, más específicamente, que distingue el LAM bacilar acidorresistente de los antígenos similares a LAM de otras bacterias y se une específicamente a LAM bacilar acidorresistente. La característica es preferiblemente que distingue el bacilo de Koch de los bacilos acidorresistentes no tuberculosos y reconoce específicamente el bacilo de Koch y, más específicamente, que distingue el LAM de bacilo de Koch del LAM de bacilos acidorresistentes no tuberculosos y se une específicamente a LAM de bacilo de Koch. Tal AcM puede producirse usando BCG como inmunógeno.

Cabe señalar que, tal como se describió anteriormente, el BCG es una cepa atenuada producida a partir del bacilo de Koch bovino (M. bovis), y se refiere a bacterias que tienen antigenicidad pero no tienen toxicidad o tienen toxicidad reducida contra los humanos. Sin embargo, en la presente invención, no sólo eso, sino que una vacuna BCG producida usando la bacteria también se denomina “BCG”.

Además, el anticuerpo monoclonal de la presente invención incluye un anticuerpo multivalente que es un anticuerpo de cadena sencilla descrito anteriormente. Aunque los anticuerpos multivalentes incluyen anticuerpos bivalentes, anticuerpos trivalentes y anticuerpos tetravalentes, son preferibles los anticuerpos bivalentes. Estos anticuerpos multivalentes pueden producirse según un método conocido hasta ahora (documento no de patentes 7: K. Zuberbuhler, Protein Engineering, Design & Selection, 22, 169 (2009)). Específicamente, un anticuerpo multivalente puede producirse, por ejemplo, en el caso de un anticuerpo bivalente, conectando los genes de una cadena pesada y una cadena ligera de un anticuerpo de cadena sencilla usando un gen de una región constante, clonando los genes conectados en un vector capaz de expresarlo en células de mamífero, transformando las células de mamífero con el vector que incluye los genes y cultivando las células.

(II) Método para inmunizar a un animal no humano para producir un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a LAM bacilar acidorresistente, preferiblemente a LAM de bacilo de Koch, y un método para producir el anticuerpo monoclonal

La presente divulgación también se refiere a un método para inmunizar a un animal no humano para producir un AcM que se une específicamente a LAM bacilar acidorresistente y a un método para producir el AcM usando el método de inmunización. Más preferiblemente, la presente divulgación se refiere a un método para inmunizar a un animal no humano para producir un AcM que se une específicamente a LAM de bacilo de Koch y a un método para producir el AcM usando el método de inmunización.

(II-1) Método de inmunización

Las estructuras básicas de los LAM bacilares acidorresistentes son casi las mismas, excepto por las diminutas diferencias reconocidas en la estructura de la caperuza de manosa. Cuando se produce un anticuerpo contra tal LAM bacilar acidorresistente, es habitual inmunizar a un animal no humano usando un bacilo de Koch humano de cepa convencional, tal como H37Rv, como inmunógeno. De este modo, puede producirse un anticuerpo que reacciona ampliamente contra el LAM bacilar acidorresistente.

Por otro lado, cuando se inmuniza a un animal no humano usando, como inmunógeno, BCG, es decir, una cepa atenuada producida a partir de bacilo de Koch bovino (M. bovis) o una vacuna producida a partir del mismo, es posible obtener un anticuerpo altamente específico que se une específicamente a lA m de bacilo de Koch, preferiblemente LAM de bacilo de Koch humano, distinguiéndolo de los LAM de bacilos acidorresistentes no tuberculosos. La presente divulgación proporciona, como modo preferible, un método para inmunizar a un animal no humano usando b Cg como inmunógeno (antígeno inmunizante), como método de inmunización para producir un AcM que se une específicamente a LAM de bacilo de Koch humano.

En este caso, un animal no humano puede ser un animal distinto del humano, y los ejemplos del mismo incluyen mamíferos tales como ratón, rata, hámster, cobaya, conejo, mono, perro, cabra, oveja, cerdo, caballo y vaca, y aves tales como pollo, pato, pavo y codorniz. Los mamíferos (animales pequeños) tales como ratón, rata, hámster, cobaya y conejo son preferibles, y el conejo es más preferible.

El método de inmunización de la presente divulgación para producir un AcM que se une específicamente a LAM de bacilo de Koch se caracteriza por inmunizar a un animal no humano usando BCG como inmunógeno (antígeno inmunizante); y la técnica para la inmunización no está particularmente limitada y puede seleccionarse adecuadamente un método conocido en la técnica para su uso.

Los ejemplos del mismo incluyen un método de administración mediante inyección subcutánea, intravenosa o intraabdominal de BCG junto con, si es necesario, un adyuvante. Es preferible la administración subcutánea. Los ejemplos del adyuvante pueden incluir, pero no se limitan a, adyuvante de Freund completo y adyuvante de Freund incompleto. Cabe señalar que la administración de BCG se realiza preferiblemente de aproximadamente 2 a 5 veces con un intervalo de aproximadamente 2 semanas después de la primera administración (primera inmunización).

Las células del bazo de un animal no humano inmunizado de esta manera son útiles como células para producir un anticuerpo que es altamente específico para LAM de bacilo de Koch, preferiblemente LAM de bacilo de Koch humano. El bazo se extrae del animal no humano inmunizado entre diez días y varios meses después de la primera inmunización de BCG y se usa para producir y obtener el anticuerpo que es altamente específico para LAM de bacilo de Koch, preferiblemente LAM de bacilo de Koch humano.

Específicamente, por ejemplo, las células (células productoras de anticuerpos) preparadas a partir de un bazo extraído de un animal no humano inmunizado se fusionan con células de mieloma según un método hasta ahora conocido usando el método de polietilenglicol o estimulación eléctrica y cultivando las células en medio de selección HAT para obtener hibridomas. A continuación, mediante cribado, de entre los hibridomas, puede obtenerse un hibridoma que produce un anticuerpo que se une a LAM de bacilo de Koch usando un método hasta ahora conocido, tal como el análisis de dilución limitante, un hibridoma que produce un AcM que es altamente específico para LAM de bacilo de Koch. Cultivando, con un método hasta ahora conocido, el hibridoma clonado de tal manera, es posible preparar y obtener un AcM que es altamente específico para el LAM de un bacilo de Koch deseado, preferiblemente LAM de bacilo de Koch humano.

Independientemente de que sea un bacilo de Koch o bacilos acidorresistentes no tuberculosos, los ejemplos del método para preparar y obtener un AcM que se une selectivamente a los LAM de una amplia gama de bacilos acidorresistentes pueden incluir un método de selección de un anticuerpo usando un complejo de LAM y el anticuerpo obtenido anteriormente que es altamente específico para LAM de bacilo de Koch, preferiblemente LAM de bacilo de Koch humano. En este caso, la técnica de inmunización no está particularmente limitada y puede seleccionarse de manera adecuada un método conocido en la técnica para su uso. Cabe señalar que, “un complejo”, tal como se describe en el presente documento, se refiere a la formación de un complejo de antígeno-anticuerpo de LAM y un anticuerpo que es altamente específico para LAM de bacilo de Koch, y la generación del complejo puede confirmarse mediante un análisis con ELISA.

(II-2) Método para producir un AcM que se une específicamente a LAM bacilar acidorresistente, preferiblemente LAM de bacilo de Koch

Un AcM que se une específicamente a LAM de bacilos acidorresistentes, preferiblemente bacilo de Koch, puede producirse usando un animal no humano (animal no humano inmunizado) que se haya inmunizado con el método de inmunización descrito anteriormente.

Los ejemplos de tales métodos pueden incluir un método para extraer un bazo de un animal no humano inmunizado tal como se describió anteriormente, preparar células (células productoras de anticuerpos) para el bazo extraído, fusionar las células con células de mieloma según un método conocido hasta ahora usando polietilenglicol o estimulación eléctrica para obtener hibridomas, seleccionar, a partir de los hibridomas obtenidos, un hibridoma que produce un AcM que se une específicamente a LAM de bacilos acidorresistentes, preferiblemente bacilo de Koch, y cultivar el hibridoma. De esta manera, es posible preparar y obtener un AcM que es altamente específico para LAM de bacilos acidorresistentes, preferiblemente bacilo de Koch, más preferiblemente LAM de bacilo de Koch humano. En este caso, el cultivo del hibridoma puede llevarse a cabo por vía intraabdominal en un animal no humano, tal como un ratón o un conejo, o puede llevarse a cabo in vitro usando una placa o similar. En el primer método, es decir, el cultivo del hibridoma por vía intraabdominal en un animal no humano, se recoge ascitis del animal no humano después del cultivo y se aísla y purifica un AcM deseado de la ascitis. En el último método, es decir, el cultivo del hibridoma in vitro, se aísla y purifica un AcM deseado a partir del medio de cultivo líquido obtenido después del cultivo. Los ejemplos del método para purificar un anticuerpo monoclonal pueden incluir un método de cromatografía de afinidad, cuando la subclase del anticuerpo es IgG, usando proteína A.

Además, el AcM que se une específicamente a LAM de bacilos acidorresistentes, preferiblemente bacilo de Koch, también puede producirse usando un método de visualización de fagos desarrollado en los últimos años (documento no de patentes 6: Winter et al., Annu. Rev. Immunol., 12: 433, 1994). Específicamente, se extrae el bazo de un animal no humano inmunizado mediante el método descrito anteriormente, se prepara ARN total o ARNm a partir del bazo extraído, se prepara ADNc usando el ARN como molde y se preparan genes de anticuerpos de cadena sencilla (scFv: fragmento de cadena sencilla de región variable) que codifican para regiones variables de anticuerpos. En este caso, con respecto a las regiones variables de anticuerpos, siempre que cada una de ellas incluya dos regiones de una región variable de cadena pesada (región VH) y una región variable de cadena ligera (región LH), puede incluirse cualquier ligador peptídico entre la región VH y la región LH. El ligador peptídico puede ser, por ejemplo, tal como se describe en el punto (I), un péptido que tiene una secuencia de ligador formada por una secuencia de aminoácidos de aproximadamente 8 a 30 residuos de aminoácido, y los ejemplos de una secuencia de ligador de este tipo incluyen una secuencia de ligador GS.

Los genes se clonan en un vector fagémido y se introducen en Escherichia coli, que luego se infecta con un fago para permitir la expresión de anticuerpos scFv en cápsulas de fago (preparación de la biblioteca de fagos de visualización de scFv).

Cuando se usa BCG como inmunógeno (antígeno inmunizante) en un método de inmunización de un animal no humano, es posible obtener y producir un anticuerpo monoclonal (anticuerpo scFv) que se une específicamente a LAM de bacilo de Koch, preferiblemente LAM de bacilo de Koch humano, mediante la realización de bioselección con la biblioteca de fagos de visualización de scFv que expresa anticuerpos scFv, usando BCG que se ha usado como antígeno inmunizante, y posteriormente realizando bioselección usando una placa de antígenos que tiene una fase sólida de LAM de bacilo de Koch, preferiblemente LAM de bacilo de Koch humano.

Además, como método de selección de un AcM (anticuerpo de cadena sencilla) altamente específico para LAM de micobacterias, es posible obtener y producir un anticuerpo de cadena sencilla (anticuerpo scFv) que se une selectivamente a los LAM de una amplia gama de bacilos acidorresistentes, independientemente de si se es un bacilo de Koch o bacilos acidorresistentes no tuberculosos, realizando bioselección con la biblioteca de fagos de visualización de scFv que expresa anticuerpos scFv, usando un complejo de anticuerpo-antígeno en el que el LAM es capturado por un portador que tiene un anticuerpo anti-LAM como fase sólida.

Cabe señalar que, en lo que respecta a la preparación de ARN total o ARNm, la preparación del ADNc, la subclonación en un fagémido, la introducción en Escherichia coli, la infección por un fago y el método para el cribado (bioselección) de un anticuerpo monoclonal (anticuerpo scFv) que se une específicamente a LAM bacilar acidorresistente, preferiblemente LAM de bacilo de Koch, y más preferiblemente LAM de bacilo de Koch humano, pueden usarse métodos conocidos en la técnica, y más específicamente, las etapas descritas anteriormente pueden llevarse a cabo usando como referencia los ejemplos descritos más adelante.

(III) Método para detectar bacilos acidorresistentes, en particular bacilo de Koch, y herramienta de detección de bacilos acidorresistentes (en particular bacilo de Koch) usada en el mismo

El AcM de la presente invención descrito anteriormente puede usarse para detectar bacilos acidorresistentes, preferiblemente bacilo de Koch. En otras palabras, usando el AcM de la presente invención, es posible determinar si un sujeto es o no portador de bacilos acidorresistentes, en particular bacilo de Koch. En otras palabras, es posible diagnosticar/someter a prueba si un sujeto está o no infectado con bacilos acidorresistentes, en particular bacilo de Koch.

La detección (diagnóstico/prueba) de los bacilos acidorresistentes, en particular bacilo de Koch, de la presente invención puede llevarse a cabo mediante las siguientes etapas de (1) y (2).

(1) Una etapa de poner en contacto el AcM de la presente invención con una muestra biológica (muestra de prueba) de un sujeto, y

(2) una etapa de someter a ensayo los bacilos de Koch que existen en la muestra de prueba usando, como índice, una reacción de unión entre el AcM de la presente invención y el LAM de bacilos acidorresistentes, en particular LAM de bacilo de Koch.

La muestra biológica del sujeto (muestra de prueba) que se pone en contacto con el AcM de la presente invención en la etapa de (1) puede ser una muestra biológica en la que existen bacilos acidorresistentes, en particular bacilo de Koch, y los ejemplos de la muestra biológica pueden incluir esputo, saliva, sangre (suero, plasma), líquido de lavado pulmonar, jugo gástrico, orina, heces, piel y jugo pancreático, etc. La muestra biológica es preferiblemente esputo, saliva o sangre, y es más preferiblemente esputo o saliva.

En este caso, el sujeto que se somete al ensayo es preferiblemente humano, sin embargo, aparte de los humanos, también pueden usarse como sujetos animales tales como el caballo, la vaca, la cabra, la oveja, el perro, el pollo, el ratón, el hámster y la rata.

La condición a la que el AcM de la presente invención y la muestra biológica se ponen en contacto entre sí no está particularmente limitada siempre que sea una condición a la que la reacción de unión entre el AcM de la presente invención y LAM bacilar acidorresistente, preferiblemente bacilo de Koch, no se vea comprometida, y se usa una condición general para una reacción inmunitaria. Los ejemplos de un método del mismo pueden incluir hacer que coexistan el AcM de la presente invención y una muestra biológica que contiene bacilos acidorresistentes, preferiblemente bacilo de Koch, bajo una condición de temperatura de generalmente 45°C o inferior, preferiblemente de aproximadamente 4 a 40°C y más preferiblemente de aproximadamente 25 a 40°C; y dejar o incubar la mezcla durante de aproximadamente 0,5 a 40 horas y preferiblemente de 1 a 20 horas. Además, tampoco hay ninguna limitación particular en cuanto a un disolvente usado en la reacción de unión ni el pH del mismo, siempre que no haya ningún efecto adverso sobre la reacción; y, según o conforme a un método conocido hasta ahora, puede usarse un tampón (por ejemplo, tampón citrato, tampón fosfato, tampón de sal de tris, tampón acetato, etc.) de manera que el pH sea de aproximadamente 5 a 9.

La etapa de (1) puede llevarse a cabo en un estado en el que el AcM de la presente invención está inmovilizado (en fase sólida) (un estado en el que el AcM está unido a un portador sólido). Tal inmovilización incluye ambos de los casos en los que el AcM de la presente invención está unido al portador sólido de manera separable y de manera no separable.

Como portador sólido usado para inmovilizar el AcM, pueden usarse diversos portadores habitualmente usados en la técnica, y los ejemplos de los mismos pueden incluir una amplia gama de artículos tales como barras, perlas, placas (incluyendo microplacas), tubos de ensayo y similares formados a partir de diversos materiales tales como vidrio, polvo de celulosa, Sephadex, Sepharose, poliestireno, papeles de filtro, carboximetilcelulosa, nitrocelulosa, resinas de intercambio iónico, dextrano, películas de plástico, tubos de plástico, nailon, perlas de vidrio, seda, copolímeros de poliamina-metil vinil éter-ácido maleico, copolímeros de aminoácidos, copolímeros de etileno-ácido maleico, etc.

No hay ninguna limitación particular en el método de inmovilización, y puede usarse tanto una unión física como una unión química dependiendo de los diversos portadores sólidos. Los ejemplos de los mismos pueden incluir: reacciones químicas tales como un método diazo como método de unión covalente, métodos de péptidos (método de derivado de ácido-amida, método de resina de cloruro de carboxilo, método de resina de carbodiimida, método de derivado de anhídrido maleico, método de derivado de isocianato, método de polisacárido activado por bromuro de cianógeno, método de derivado de carbonato de celulosa y un método que usa un reactivo de condensación), método de alquilación, métodos de unión de portadores que usan un reactivo de reticulación (por ejemplo, que usan glutaraldehído, isocianato de hexametileno o similares como reactivo de reticulación) y un método de unión de portadores que usa la reacción de Ugi; métodos de unión iónica que usan un portador tal como resinas de intercambio iónico; y métodos de adsorción física que usan, como portador, vidrio poroso, tal como perlas de vidrio.

En la etapa (2), el AcM de la presente invención puede usarse en un estado marcado usando cualquier sustancia de marcaje. En este caso, los ejemplos de la sustancia de marcaje pueden incluir enzimas tales como peroxidasa de rábano picante (HRP) y fosfatasa alcalina; sustancias fluorescentes tales como isocianato de fluoresceína y rodamina; sustancias radiactivas tales como 32P y 125I; sustancias colorantes (sustancia de coloración) tales como látex, incluyendo látex de caucho natural y látex sintético, tal como látex de poliestireno coloreado con coloides metálicos tales como un coloide de oro y un coloide blanco o pigmentos de color rojo, azul o similares; y sustancias quimioluminiscentes. El marcaje del AcM con estas sustancias de marcaje puede llevarse a cabo según un método conocido hasta ahora en función de las diversas sustancias de marcaje.

La etapa de (2) es una etapa de detectar/someter a ensayo un inmunocomplejo (sustancia unida a antígenoanticuerpo) obtenido a través de una reacción de unión entre el AcM de la presente invención y el LAM de bacilos acidorresistentes, preferiblemente bacilo de Koch. En este caso, la etapa de detectar/someter a ensayo el inmunocomplejo (sustancia unida a antígeno-anticuerpo) y las condiciones para ello no están particularmente limitadas, y pueden usarse un método y unas condiciones idénticas o conformes a un método de inmunoensayo habitual. Específicamente, dependiendo del tipo de sustancia de marcaje usada para marcar el AcM, pueden usarse diversos métodos que se usan generalmente para el ensayo inmunoquímico, tales como, por ejemplo, inmunoensayo radioisotópico (método RIA), método ELISA, método de anticuerpos fluorescentes, método de placas, método de manchas, método de aglutinación, método de Ouchterlony, etc., (por ejemplo, véanse las páginas 30-53 en “Hybridoma Method and monoclonal antibody”, publicado por R&D planning K.K., el 5 de marzo de 1982). Desde el punto de vista de la sensibilidad y la sencillez, la etapa (2) se lleva a cabo preferiblemente según el método ELISA, y más preferiblemente el método de sándwich.

Por ejemplo, cuando se usa un método de sándwich en fase sólida, una diana de ensayo que es un bacilo acidorresistente, preferiblemente bacilo de Koch, en una muestra de prueba puede someterse a ensayo, por ejemplo, de la siguiente manera.

En primer lugar, se añade una muestra biológica (por ejemplo, esputo, saliva o sangre, etc.) como muestra de prueba que contiene una diana de ensayo que es un bacilo acidorresistente, preferiblemente bacilo de Koch, a un anticuerpo en fase sólida obtenido mediante la inmovilización (incluyendo inmovilización de manera separable) de un anticuerpo que provoca una reacción específica de antígeno-anticuerpo con LAM de los bacilos acidorresistentes de la diana de ensayo, preferiblemente bacilo de Koch, para permitir que se produzca una reacción de antígeno-anticuerpo. A continuación, se retiran las sustancias no unidas, por ejemplo, mediante lavado; se añade un anticuerpo que provoca una reacción específica de antígeno-anticuerpo con LAM de los bacilos acidorresistentes de la diana de ensayo, preferiblemente bacilo de Koch, para permitir la reacción con las bacterias de la diana de ensayo en la sustancia unida al antígeno-anticuerpo generada anteriormente; y se detecta una sustancia unida al antígeno-anticuerpo (un complejo de “anticuerpo - bacilo acidorresistente - anticuerpo”, y preferiblemente un complejo de “anticuerpo - bacilo de Koch -anticuerpo”), generada en la reacción (medición cualitativa) o se mide una cantidad de la misma (medición cuantitativa). Para este método, en la presente invención, el AcM, preferiblemente AcM1, de la presente invención se usa como anticuerpo que provoca una reacción específica de antígeno-anticuerpo con LAM de bacilos acidorresistentes, preferiblemente bacilo de Koch.

El ensayo de la sustancia unida al antígeno-anticuerpo (el complejo de “anticuerpo - bacilo acidorresistente -anticuerpo”, y preferiblemente el complejo de “anticuerpo - bacilo de Koch - anticuerpo”) puede realizarse fácilmente usando un anticuerpo (anticuerpo marcado) que esté marcado con cualquiera de las sustancias de marcaje descritas anteriormente como uno de los anticuerpos (AcM, preferiblemente AcM1 de la presente invención) usado para llevar a cabo la reacción de antígeno-anticuerpo con LAM de bacilos acidorresistentes, preferiblemente bacilo de Koch. Para permitir que el ensayo se lleve a cabo más fácilmente, por ejemplo, es posible usar una inmunocromatografía usando un anticuerpo marcado con una partícula de látex coloreada o similar, tal como un coloide de oro, etc. Un experto en la técnica conocerá bien la selección de diversos medios para estas técnicas de ensayo y sus modificaciones, y la presente invención puede realizarse con cualquiera de tales técnicas (véase el “Clinical Test Method Manual” Kanehara Shuppan, 1995, etc.).

El método puede llevarse a cabo usando, por ejemplo, una herramienta de detección de bacilos acidorresistentes, preferiblemente bacilo de Koch (a continuación en el presente documento, también denominada “herramienta de detección”), que tiene la siguiente estructura. La herramienta de detección es una herramienta para determinar la existencia de bacilos acidorresistentes, preferiblemente bacilo de Koch, en líquidos corporales (incluyendo esputo, saliva y orina) de un humano o un animal, es decir, para determinar la presencia o ausencia de infección por bacilos acidorresistentes, preferiblemente bacilo de Koch, e incluye una pieza de absorción de disolución formada a partir de un material capaz de transferir una muestra de prueba a través de acción capilar.

La pieza de absorción de disolución incluye:

(i) una parte de recogida de muestra para absorber y recoger una muestra de prueba;

(ii) una parte de anticuerpo marcado que soporta un anticuerpo anti-LAM de bacilo de Koch marcado (AcM de la presente invención) que reacciona específicamente con LAM de bacilos acidorresistentes, preferiblemente bacilo de Koch, en la muestra de prueba;

(iii) una parte de determinación que incluye una parte de visualización del resultado de la prueba descrita en lo siguiente,

(a) la parte de visualización del resultado de la prueba que tiene inmovilizado sobre la misma un anticuerpo anti-LAM de bacilo de Koch no marcado (AcM de la presente invención) que reacciona específicamente con LAM de bacilos acidorresistentes, preferiblemente bacilo de Koch; y

(iv) una parte de absorción de disolución para absorber la disolución restante de la muestra de prueba que se ha movido a través de la parte de recogida de muestra, la parte de anticuerpo marcado y la parte de determinación.

Cabe señalar que la parte de determinación (iii) incluye, además de la parte de visualización del resultado de la prueba (a) , una parte de visualización de control dispuesta aparte de la misma que se describe a continuación:

(b) la parte de visualización de control que tiene inmovilizado sobre la misma un anticuerpo anti-LAM bacilar acidorresistente no marcado (AcM de la presente invención), preferiblemente un anticuerpo anti-LAM de bacilo de Koch no marcado (AcM1 de la presente invención), que reacciona con un anticuerpo anti-LAM bacilar acidorresistente marcado (AcM de la presente invención), preferiblemente un anticuerpo anti-LAM de bacilo de Koch marcado (AcM1 de la presente invención).

Con la herramienta de detección, es posible determinar la existencia de bacilos acidorresistentes, preferiblemente bacilo de Koch, en la muestra de prueba mediante la presencia o ausencia de coloración de (a) la parte de visualización del resultado de la prueba.

La herramienta de detección de la presente invención incluye la pieza de absorción de disolución formada a partir de un material capaz de transferir la muestra de prueba a través de acción capilar o acción cromatográfica (en la presente invención, estas se denominan “acción capilar” como conjunto). La pieza de absorción de disolución puede ser un fragmento similar a una lámina (a continuación en el presente documento, denominado “fragmento similar a una lámina”), y el fragmento similar a una lámina puede estar formado por una sola lámina o puede estar formado por una pluralidad de capas de láminas apiladas o conectadas entre sí. Alternativamente, la pieza de absorción de disolución puede adoptar diversas formas capaces de absorber y transferir el líquido a través de acción capilar, tal como un fragmento largo y delgado en forma de barra o similar. Cabe señalar que la herramienta de detección de la presente invención puede incluir además un cuerpo de soporte para apoyar la pieza de absorción de disolución.

Un material para la pieza de absorción de disolución no está particularmente limitado siempre que: el material tenga una estructura porosa o una estructura capilar que permita la permeación de un disolvente (agua, suero, orina y otras muestras biológicas), un componente de prueba (bacilos acidorresistentes tales como bacilo de Koch) y un complejo (por ejemplo, un complejo [anticuerpo marcado-bacilo de Koch] de un anticuerpo anti-LAM de bacilo de Koch marcado (AcM1 de la presente invención) y bacilo de Koch, o un complejo [anticuerpo marcado-bacilo de Koch-anticuerpo] de dicho complejo y un anticuerpo anti-LAM de bacilo de Koch no marcado (AcM1 de la presente invención)) que incluye el componente de prueba; y el material permite que, cuando se aplica (se recoge, se hace gotear, se añade) una muestra de prueba que contiene el componente de prueba a (1) la parte de recogida de muestra, la muestra de prueba se transfiera (se extienda) dentro de la estructura porosa o la estructura capilar incluso cuando la muestra de prueba obtiene en la misma el anticuerpo anti-LAM de bacilo de Koch (AcM1 de la presente invención) y el complejo (anticuerpo marcado - bacilo de Koch) durante la transferencia. Los ejemplos de los mismos pueden incluir el portador sólido descrito anteriormente. De los descritos anteriormente, es preferible un cuerpo poroso orgánico. Cabe señalar que los ejemplos del cuerpo poroso orgánico pueden incluir fibras naturales tales como celulosa, derivados de celulosa tales como nitrocelulosa y fibras semisintéticas tales como acetato de celulosa, agregados de fibras formados a partir de fibras sintéticas tales como polietileno, polipropileno, nailon y poliéster, polipropileno poroso, poliestireno poroso, poli(metacrilato de metilo) poroso, nailon poroso, polisulfona porosa, resinas fluoradas porosas y resinas sintéticas porosas tales como poli(fluoruro de vinilideno) en las que se ha introducido un grupo hidrófilo. Son preferibles las fibras naturales, tales como la celulosa, y los derivados de celulosa, tales como la nitrocelulosa y las fibras semisintéticas tales como el acetato de celulosa.

No hay ninguna limitación particular en el tamaño de la pieza de absorción de disolución; y un tamaño preferible de la misma es un ancho (longitud de un lado corto) de aproximadamente 2 a 20 mm, preferiblemente en un intervalo de aproximadamente 4 a 10 mm, y una longitud (longitud de un lado largo) de 20 a 200 mm, preferiblemente en un intervalo de 30 a 150 mm.

A continuación, se describirá la herramienta de detección según una realización de la presente invención con referencia a los dibujos.

(A) y (B) en la figura 1 muestran un modo de la herramienta de detección de la presente invención. (A) y (B) en la figura 1 son diagramas vistos desde un lado de la herramienta de detección de la presente invención. En la herramienta de detección, una pieza de absorción de disolución incluye una parte de recogida de muestra (1) para recoger (añadir) una muestra de prueba, una parte de anticuerpo marcado (2), una parte de determinación (3), que tiene una parte de visualización del resultado de la prueba (a), y una parte de absorción de disolución (4) para absorber la disolución restante de la muestra de prueba que se ha movido a través de la parte de recogida de muestra, la parte de anticuerpo marcado y la parte de determinación. (B) en la figura 1 muestra la herramienta de detección que incluye, en la parte de determinación (3), una parte de visualización de control (b) además de la parte de visualización del resultado de la prueba (a).

Aunque, en el ejemplo mostrado en la figura 1, la pieza de absorción de disolución es un fragmento similar a una lámina formado a partir de múltiples piezas de láminas, el fragmento similar a una lámina puede estar formado a partir de una única lámina de un material uniforme, o puede estar formado como una única lámina como conjunto pero a partir de una pluralidad de piezas de lámina del mismo o de diferentes materiales. Cabe señalar que la lámina completa puede estar formada por una pluralidad de láminas, o puede tener una porción parcialmente formada por una pluralidad de láminas.

En el ejemplo mostrado en la figura 1, el fragmento similar a una lámina está adherido a un cuerpo 10 de soporte. El fragmento similar a una lámina incluye, secuencialmente desde un lado de extremo al otro lado de extremo en la dirección del lado largo, una lámina 21 que forma la parte de recogida de muestra (1), una lámina 22 que forma la parte de anticuerpo marcado (2), una lámina 23 que forma la parte de determinación (3) y una lámina 24 que forma la parte de absorción de disolución (4). Además, tal como se muestra en la figura 2, es posible tener una configuración en la que una porción de extremo de la lámina 21 se superpone con una porción de extremo de la lámina 22, una porción de extremo de la lámina 22 se superpone con una porción de extremo de la lámina 23 y una porción de extremo de la lámina 23 se superpone con una porción de extremo de la lámina 24. Al tener una configuración de este tipo, el movimiento de una disolución puede hacerse suavemente.

La parte de recogida de muestra (1) es una parte (parte de alimentación de muestra de prueba) para absorber y recoger una muestra de prueba que es una diana de ensayo. Los ejemplos de la muestra de prueba pueden incluir la muestra biológica de un sujeto que es una diana de ensayo de la presente invención.

Tal como se muestra en la figura 1 y en la figura 2, la parte de recogida de muestra (1) puede situarse en una porción de extremo (extremo de entrada) del fragmento similar a una lámina.

La parte de anticuerpo marcado (2) está formada en contacto con un extremo de salida de la parte de recogida de muestra (1) tal como se describió anteriormente (figura 1), o está formada en un estado de superposición parcial con la parte de recogida de muestra (1) (figura 2). La parte de anticuerpo marcado (2) incluye, de manera separable, un anticuerpo que reacciona y se une específicamente a LAM bacilar acidorresistente, preferiblemente LAM de bacilo de Koch, contenido en la muestra de prueba. Específicamente, la herramienta de detección de la presente invención incluye, en la lámina 22 que forma la parte de anticuerpo marcado (2), de manera separable, un anticuerpo anti-LAM bacilar acidorresistente (AcM de la presente invención), preferiblemente un anticuerpo anti-LAM de bacilo de Koch (AcM1 de la presente invención), que se une específicamente, mediante una reacción de antígeno-anticuerpo, a LAM bacilar acidorresistente, preferiblemente LAM de bacilo de Koch. En este caso, el AcM de la presente invención se usa en un estado marcado con cualquiera de las sustancias de marcaje descritas anteriormente, es decir, como un anticuerpo anti-LAM bacilar acidorresistente marcado (AcM marcado de la presente invención), y el AcM1 se usa como un anticuerpo anti-LAM de bacilo de Koch marcado (AcM1 marcado de la presente invención).

Entre los materiales adoptados en el fragmento similar a una lámina, la parte de anticuerpo marcado (2) está formada preferiblemente por un material hidrófilo y absorbente de agua que incluye el anticuerpo anti-LAM bacilar acidorresistente marcado (AcM marcado de la presente invención), preferiblemente el anticuerpo anti-LAM de bacilo de Koch marcado (AcM1 marcado de la presente invención), de manera separable, que reacciona con un componente de prueba (bacilos acidorresistentes, preferiblemente bacilo de Koch) en la muestra de prueba que se ha movido desde la parte de recogida de muestra (1) para formar un complejo de antígeno-anticuerpo (un complejo de LAM bacilar acidorresistente y el anticuerpo anti-LAM bacilar acidorresistente marcado (AcM marcado de la presente invención), preferiblemente un complejo de LAM de bacilo de Koch y el anticuerpo anti-LAM de bacilo de Koch marcado (AcM1 marcado de la presente invención)). El material tiene una propiedad que permite el movimiento del complejo en la dirección mostrada con una flecha P en la figura 1, en asociación con el movimiento de la muestra de prueba hasta la parte de determinación (3).

Cabe señalar que no hay ninguna limitación en el método para hacer que la parte de anticuerpo marcado (2) soporte, de manera separable, el anticuerpo anti-LAM bacilar acidorresistente marcado (AcM marcado de la presente invención), preferiblemente el anticuerpo anti-LAM de bacilo de Koch marcado (AcM1 marcado de la presente invención); y los ejemplos del mismo incluyen un método para impregnar la parte de anticuerpo marcado (2) con una disolución que contiene el AcM marcado de la presente invención, preferiblemente el AcM1 marcado de la presente invención, y un método para adherir dicha solución a la parte de anticuerpo marcado (2). Además, con el fin de permitir que el componente de prueba (bacilos acidorresistentes, preferiblemente bacilo de Koch) contenido en la muestra de prueba se una completamente a la parte de anticuerpo marcado (2), es preferible hacer que la parte de anticuerpo marcado (2) soporte una cantidad en exceso del AcM marcado de la presente invención, preferiblemente el AcM1 marcado de la presente invención.

La parte de determinación (3) es una parte para transferir adicionalmente, a la parte de absorción de disolución (4), la muestra de prueba que se ha movido desde la parte de recogida de muestra (1) a través de la parte de anticuerpo marcado (2). La parte de determinación (3) incluye, en una región de transferencia de la misma, una parte (la parte de visualización del resultado de la prueba (a)) para captar un componente específico (un complejo de LAM bacilar acidorresistente y el anticuerpo anti-LAM bacilar acidorresistente marcado (AcM marcado de la presente invención), preferiblemente un complejo de LAM de bacilo de Koch y el anticuerpo anti-LAM de bacilo de Koch marcado (AcM1 marcado de la presente invención)) contenido en la muestra de prueba que se ha transferido, y visualizar el resultado de la captura. Dado que es posible determinar la existencia o inexistencia de micobacterias, preferiblemente bacilo de Koch, basándose en el resultado visualizado en la parte de visualización del resultado de la prueba (a) en la muestra de prueba, la región que incluye la parte de visualización (a) se denomina “ la parte de determinación (3)”.

Además de la parte de visualización del resultado de la prueba (a), la herramienta de detección de la presente invención puede incluir la parte de visualización de control (b) en la parte de determinación (3). Cabe señalar que la parte de visualización del resultado de la prueba (a) y la parte de visualización de control (b) están dispuestas secuencialmente con un intervalo establecido entre las mismas.

En la parte de visualización del resultado de la prueba (a) está inmovilizado, en una cantidad en exceso, un anticuerpo no marcado (anticuerpo anti-LAM bacilar acidorresistente no marcado) que reacciona específicamente con LAM bacilar acidorresistente, preferiblemente un anticuerpo no marcado (anticuerpo anti-LAM de bacilo de Koch no marcado) que reacciona específicamente con LAM de bacilo de Koch. Por tanto, los bacilos acidorresistentes que se han unido con el AcM marcado de la presente invención, preferiblemente bacilo de Koch que se ha unido con el AcM1 marcado de la presente invención, a través de una reacción de antígeno-anticuerpo en la parte de anticuerpo marcado (2) se capturan en la parte de visualización del resultado de la prueba (a) en un estado de un complejo con el AcM marcado de la presente invención, preferiblemente el AcM1 marcado de la presente invención, y la coloración atribuida a la sustancia de marcaje aparece con una intensidad que depende de la cantidad capturada.

Cabe señalar que, como anticuerpo anti-LAM bacilar acidorresistente que forma el anticuerpo anti-LAM bacilar acidorresistente no marcado, puede usarse de manera similar el AcM de la presente invención que se une específicamente a LAM de bacilos acidorresistentes (AcM de la presente invención). Además, como anticuerpo anti-LAM de bacilo de Koch que forma el anticuerpo anti-LAM de bacilo de Koch no marcado, puede usarse de manera similar el AcM1 de la presente invención que se une específicamente a LAM de bacilo de Koch (AcM1 de la presente invención).

En la parte de visualización de control (b) está inmovilizada una cantidad predeterminada del anticuerpo no marcado (segundo anticuerpo) que reacciona con el anticuerpo anti-LAM bacilar acidorresistente marcado (AcM marcado de la presente invención), preferiblemente el anticuerpo anti-LAM de bacilo de Koch marcado (AcM1 marcado de la presente invención), incluido en la parte de anticuerpo marcado (2). La parte de visualización de control (b) puede estar dispuesta aparte de la parte de visualización del resultado de la prueba (a) en la dirección de movimiento (dirección de p en la figura 1) de la muestra de prueba en un orden de la parte de visualización del resultado de la prueba (a) y la parte de visualización de control (b). En la parte de visualización de control (b) está inmovilizado, en una cantidad en exceso, el anticuerpo no marcado (segundo anticuerpo) que reacciona con el anticuerpo anti-LAM bacilar acidorresistente marcado (AcM marcado de la presente invención), preferiblemente el anticuerpo anti-LAM de bacilo de Koch (AcM1 marcado de la presente invención), contenido en la muestra de prueba que se ha movido por la pieza de lámina precedente.

Por tanto, en la parte de visualización de control (b), se captura el anticuerpo anti-LAM bacilar acidorresistente marcado (AcM marcado de la presente invención), preferiblemente el anticuerpo anti-LAM de bacilo de Koch (AcM1 marcado de la presente invención), que se ha desprendido de la parte de anticuerpo marcado (2) y se ha liberado en la muestra de prueba, y la coloración atribuida a la sustancia de marcaje del anticuerpo anti-LAM bacilar acidorresistente marcado (AcM marcado de la presente invención), el anticuerpo anti-LAM de bacilo de Koch (AcM1 marcado de la presente invención), aparece con una intensidad que depende de la cantidad del segundo anticuerpo inmovilizado sobre la parte de visualización de control (b).

En este caso, el anticuerpo no marcado (segundo anticuerpo) es suficiente si es uno que se une al anticuerpo anti-LAM bacilar acidorresistente marcado (AcM marcado de la presente invención), preferiblemente el anticuerpo anti-LAM de bacilo de Koch (AcM1 marcado de la presente invención). Aunque un anticuerpo no marcado (segundo anticuerpo) de este tipo no está limitado, por ejemplo, pueden usarse la proteína de unión a LAM de bacilos acidorresistentes, partículas aniónicas y similares.

El ensayo del bacilo de Koch usando la herramienta de detección de la presente invención se realiza usando, como índice, la presencia o ausencia de coloración en la parte de visualización del resultado de la prueba (a) de la parte de determinación (3). En este momento, si es necesario, es posible usar, para la determinación, la presencia o ausencia de coloración en la parte de visualización de control (b) de la parte de determinación (3). Incluso cuando la coloración no es reconocible en la parte de visualización del resultado de la prueba (a), si la coloración puede reconocerse en la parte de visualización de control (b), el ensayo se ha realizado correctamente y el resultado del ensayo puede determinarse como negativo. Sin embargo, cuando la coloración no es reconocible en la parte de visualización de control (b), indica que el ensayo no se ha realizado correctamente y el resultado de la parte de visualización del resultado de la prueba (a) no puede usarse para determinarlo como negativo.

Entre los materiales adoptados en el fragmento similar a una lámina, la parte de determinación (3) está formada preferiblemente por un material hidrófilo y absorbente de agua que puede mover la muestra de prueba que contiene diversos componentes hasta la parte de absorción de disolución (4) a través de acción capilar, y tiene la propiedad de inmovilizar de manera estable el anticuerpo anti-LAM bacilar acidorresistente no marcado (AcM marcado de la presente invención), preferiblemente el anticuerpo anti-LAM de bacilo de Koch (AcM1 marcado de la presente invención), sobre la parte de visualización del resultado de la prueba (a), o inmovilizar el anticuerpo no marcado (segundo anticuerpo) sobre la parte de visualización de control (b).

La parte de absorción de disolución (4) es una parte para absorber la disolución restante de la muestra de prueba que se ha movido en la dirección de la flecha P desde la parte de recogida de muestra (1) a través de la parte de anticuerpo marcado (2) y la parte de determinación (3) (la parte de visualización del resultado de la prueba (a), o la parte de visualización del resultado de la prueba (a) y la parte de visualización de control (b)). Por tanto, entre los materiales adoptados en el fragmento similar a una lámina, la parte de absorción de disolución (4) está formada preferiblemente por un material hidrófilo y absorbente, y más preferiblemente por un material que tiene la propiedad de no repeler una disolución absorbida o un material elástico. Específicamente, los ejemplos de tal material pueden incluir materiales no tejidos tales como papeles de filtro y fibras hidrófilas, y también pueden usarse cuerpos laminados de papeles de filtro y materiales no tejidos.

Aunque la herramienta de detección de la presente invención incluye básicamente el fragmento similar a una lámina que tiene la configuración descrita anteriormente, también es posible incluir el cuerpo 10 de soporte además del fragmento similar a una lámina. No hay ninguna limitación particular en el cuerpo 10 de soporte, siempre que tenga la configuración y el material sea capaz de conservar el fragmento similar a una lámina. Por ejemplo, puede ser un cuerpo de soporte similar a una lámina laminado en la superficie posterior (superficie de la capa inferior) del fragmento similar a una lámina que va a usarse, o un cuerpo de soporte con forma de carcasa para albergar el fragmento similar a una lámina.

Los ejemplos del cuerpo de soporte similar a una lámina pueden incluir láminas fabricadas de diversos plásticos (láminas de plástico), papeles duros, láminas fabricadas a partir de metales (incluyendo una aleación) tales como el aluminio, papeles de múltiples capas obtenidos pegando (adhiriendo) múltiples láminas de, por ejemplo, papel heterogéneo o de la misma calidad, artículos obtenidos pegando (adhiriendo) una lámina de plástico y un papel, artículos obtenidos pegando (adhiriendo) un papel y una lámina de metal, artículos obtenidos pegando (adhiriendo) una lámina de plástico, un papel y una lámina de metal, y papeles que tienen proporcionados en el mismo un recubrimiento, tal como impermeabilidad y similares. Preferiblemente, el cuerpo de soporte tiene una función impermeable.

El cuerpo de soporte con forma de carcasa es preferiblemente un material impermeable a la humedad, tal como poli(cloruro de vinilo), polipropileno, polietileno, poliestireno, polímeros de ácido acrílico y similares; pero también puede usarse un artículo fabricado de papel si se realiza un tratamiento hidrófugo en el mismo. La carcasa tiene formada preferiblemente en la misma al menos “una ventana de recogida de disolución” correspondiente a la parte de recogida de muestra (1) del fragmento similar a una lámina alojado en la carcasa, “una ventana de visualización de determinación” correspondiente a la parte de visualización del resultado de la prueba (a) de la parte de determinación (3) y “una ventana de visualización de control” correspondiente a la parte de visualización de control (b). Cabe señalar que “ la ventana de visualización de determinación” y “ la ventana de visualización de control” pueden estar formadas individualmente, o pueden estar formadas como una sola ventana.

Para usar la herramienta de detección de la presente invención que incluye el fragmento similar a una lámina descrito anteriormente, en primer lugar, la parte de recogida de muestra (1) se impregna con la muestra de prueba. Al hacerlo, la muestra de prueba absorbida por la parte de recogida de muestra (1) impregna el fragmento similar a una lámina mediante acción capilar, y llega primero a la parte de anticuerpo marcado (2) que soporta, de manera separable, el anticuerpo anti-LAM bacilar acidorresistente marcado (AcM marcado de la presente invención), preferiblemente el anticuerpo anti-LAM de bacilo de Koch (AcM1 marcado de la presente invención). En este caso, mediante una reacción de antígeno-anticuerpo, el componente de prueba (bacilo de Koch) en la muestra de prueba se une específicamente al anticuerpo anti-LAM bacilar acidorresistente marcado (AcM marcado de la presente invención), preferiblemente el anticuerpo anti-LAM de bacilo de Koch (AcM1 marcado de la presente invención). A continuación, la muestra de prueba llega a la parte de visualización del resultado de la prueba (a) de la parte de determinación (3) mientras está acompañada por “un complejo de bacilos acidorresistentes y el anticuerpo anti-LAM bacilar acidorresistente marcado (AcM marcado de la presente invención)” (“un complejo de bacilo de Koch y el anticuerpo anti-LAM de bacilo de Koch marcado (AcM1 marcado de la presente invención)”) y “anticuerpo anti-LAM de bacilo de Koch marcado en exceso (AcM marcado de la presente invención) que no se unió al bacilo de Koch” (“anticuerpo anti-LAM de bacilo de Koch marcado en exceso (AcM1 marcado de la presente invención) que no se unió al bacilo de Koch”). Dado que el anticuerpo anti-LAM bacilar acidorresistente no marcado (AcM de la presente invención) que se une específicamente a los bacilos acidorresistentes, preferiblemente el anticuerpo anti-LAM de bacilo de Koch no marcado (AcM1 de la presente invención) que se une específicamente al bacilo de Koch, se inmoviliza de manera estable sobre la parte de visualización del resultado de la prueba (a), se captura y acumula “el anticuerpo anti-LAM bacilar acidorresistente marcado (AcM marcado de la presente invención) que se ha unido específicamente con los bacilos acidorresistentes”, preferiblemente “el anticuerpo anti-LAM de bacilo de Koch marcado (AcM1 marcado de la presente invención) que se ha unido específicamente con el bacilo de Koch”, en la muestra de prueba. Como resultado, la parte de visualización del resultado de la prueba (a) presenta una coloración con una intensidad que depende de la cantidad de bacilos acidorresistentes, preferiblemente bacilos de Koch, contenidos en la muestra de prueba, basándose en una sustancia de marcaje en el anticuerpo anti-LAM bacilar acidorresistente marcado capturado (AcM marcado de la presente invención), preferiblemente en el anticuerpo anti-LAM de bacilo de Koch marcado capturado (AcM1 marcado de la presente invención). Con esto, puede detectarse la presencia o ausencia y la proporción cuantitativa de bacilos acidorresistentes, preferiblemente bacilos de Koch, en la muestra de prueba.

A continuación, la muestra de prueba llega a la parte de visualización de control (b) de la parte de determinación (3) mientras está acompañada por un “anticuerpo anti-LAM bacilar acidorresistente marcado en exceso (AcM marcado de la presente invención) que no se unió a los bacilos acidorresistentes”, preferiblemente un “anticuerpo anti-LAM de bacilo de Koch marcado en exceso (AcM1 marcado de la presente invención) que no se unió al bacilo de Koch”. Dado que el segundo anticuerpo (anticuerpo no marcado) que se une al anticuerpo anti-LAM bacilar acidorresistente marcado (AcM1 marcado de la presente invención), preferiblemente el segundo anticuerpo (anticuerpo no marcado) que se une al anticuerpo anti-LAM de bacilo de Koch marcado (AcM1 marcado de la presente invención), se inmoviliza de manera estable sobre la parte de visualización de control (b) en una determinada cantidad, se captura y acumula el anticuerpo anti-LAM bacilar acidorresistente marcado (AcM marcado de la presente invención), preferiblemente el anticuerpo anti-LAM de bacilo de Koch marcado (AcM1 marcado de la presente invención), que está incluido en exceso en la muestra de prueba. Como resultado, la parte de visualización de control (b) muestra una coloración con una intensidad que depende de la cantidad del segundo anticuerpo (o la cantidad de anticuerpo marcado que se ha unido al segundo anticuerpo) inmovilizado sobre la parte de visualización de control (b).

Aparte de las descritas anteriormente, pueden hacerse diversas modificaciones a la herramienta de detección de la presente invención sin apartarse del alcance de la presente invención. A la herramienta de detección de la presente invención se le puede adjuntar un documento de especificaciones que describa cómo usar la herramienta de detección y un método de determinación, por lo que la presente invención proporciona un kit de determinación que es un conjunto que incluye el documento de especificaciones y la herramienta de detección.

(IV) Agente de diagnóstico o kit de diagnóstico de la tuberculosis

El método de detección de bacilos acidorresistentes y la herramienta de detección de bacilos acidorresistentes descritos anteriormente se usan para detectar la existencia de bacilos acidorresistentes en una muestra biológica de un sujeto. En particular, cuando el AcM1 de la presente invención se usa como anticuerpo monoclonal, el bacilo de Koch puede ilustrarse como un ejemplo preferible de bacilos acidorresistentes. Por tanto, el método de detección de bacilos acidorresistentes y la herramienta de detección de bacilos acidorresistentes descritos anteriormente se usan para diagnosticar la presencia o ausencia de infección por bacilos acidorresistentes, en particular bacilo de Koch.

Por tanto, el AcM, preferiblemente el AcM1, de la presente invención descrito anteriormente es útil como agente de diagnóstico de la tuberculosis, y la presente invención proporciona un agente de diagnóstico de la tuberculosis que contiene el AcM, preferiblemente el AcM1, de la presente invención. El AcM de la presente invención puede estar inmovilizado de manera separable o no separable sobre cualquier portador sólido, o puede estar marcado con cualquier sustancia de marcaje.

Además, cuando va a llevarse a cabo el método para detectar bacilos acidorresistentes, en particular el bacilo de Koch, de la presente invención, el método puede llevarse a cabo fácilmente usando un kit de diagnóstico de la tuberculosis que incluye, como reactivo de detección de bacilo de Koch, el AcM, preferiblemente el AcM1, de la presente invención. Por tanto, la presente invención proporciona un kit de diagnóstico de la tuberculosis para llevar a cabo el método de detección de la tuberculosis. El kit de diagnóstico de la tuberculosis es un kit de reactivos para el ensayo de detección del bacilo de Koch existente en una muestra de prueba mediante una reacción de antígenoanticuerpo. Es suficiente cuando el kit incluye el AcM, preferiblemente el AcM1, de la presente invención; y el kit puede incluir la herramienta de detección de bacilo de Koch descrita anteriormente, el segundo anticuerpo que reacciona con el AcM, preferiblemente el AcM1, de la presente invención, un reactivo de detección de anticuerpos y similares. Además, para facilitar la realización del ensayo, el kit de diagnóstico puede incluir además una disolución de reacción, una disolución de dilución, una disolución de aclarado, una disolución de parada de la reacción, un reactivo de medición de la actividad marcado adecuados y similares.

(V) Ensayo para la detección de LAM bacilar acidorresistente (en particular LAM de bacilo de Koch) y agente de detección o kit de detección de LAM bacilar acidorresistente (en particular LAM de bacilo de Koch)

El AcM de la presente invención es un anticuerpo que reconoce y se une específicamente a lipoarabinomanano (LAM) de bacilos acidorresistentes. Por tanto, el método de detección de bacilos acidorresistentes de la presente invención descrito anteriormente también puede aplicarse para someter a ensayo el LAM bacilar acidorresistente.

Específicamente, el ensayo para detectar LAM bacilar acidorresistente de la presente invención puede llevarse a cabo mediante las siguientes etapas:

(1) una etapa de poner en contacto el AcM de la presente invención con una muestra de prueba que puede contener bacilos acidorresistentes; y

(2) una etapa de someter a ensayo el LAM bacilar acidorresistente que existe en la muestra de prueba usando, como índice, una reacción de unión entre el AcM de la presente invención y el LAM bacilar acidorresistente.

Estas etapas de (1) y (2) son etapas que corresponden respectivamente a las etapas de (1) y (2) expuestas en “(III) Método para detectar bacilos acidorresistentes, en particular bacilo de Koch, y una herramienta de detección de bacilo acidorresistente (en particular, bacilo de Koch)” descrito anteriormente, y la descripción proporcionada anteriormente en el punto (IIl) también puede usarse en este caso como referencia. Además, el ensayo para detectar LAM bacilar acidorresistente puede realizarse de manera similar usando la herramienta de detección de bacilos acidorresistentes expuesta en el punto (III) descrito anteriormente (cabe señalar que, en este caso, es posible parafrasearlo como “herramienta de detección de LAM bacilar acidorresistente”).

Cabe señalar que, en lo que respecta al AcM de la presente invención, dado que el AcM1 es un anticuerpo que reconoce y se une específicamente a lipoarabinomanano (LAM) de bacilo de Koch, el método de detección de bacilos acidorresistentes de la presente invención descrito anteriormente también puede aplicarse como método de detección de bacilo de Koch para someter a ensayo el LAM de bacilo de Koch.

En este caso, el ensayo para detectar LAM bacilar acidorresistente, preferiblemente LAM de bacilo de Koch, incluye la medición cualitativa para detectar LAM bacilar acidorresistente, preferiblemente LAM de bacilo de Koch, y la medición cuantitativa para medir la cantidad de LAM bacilar acidorresistente, preferiblemente LAM de bacilo de Koch. Los ejemplos de la medición cuantitativa pueden incluir, pero no se limitan a, un método de creación por adelantado de una curva de calibración a partir de una reacción entre el AcM de la presente invención y una cantidad conocida de LAM bacilar acidorresistente, preferiblemente LAM de bacilo de Koch, y el cálculo de una cantidad no identificada de LAM bacilar acidorresistente, preferiblemente LAM de bacilo de Koch, contenida en una muestra de prueba a partir de la curva de calibración.

En un ensayo de este tipo, el AcM de la presente invención es útil como reactivo de detección de LAM bacilar acidorresistente, y la presente invención proporciona un agente de detección de LAM bacilar acidorresistente que contiene el AcM de la presente invención como reactivo de detección de LAM bacilar acidorresistente. En particular, el AcM1 de la presente invención es útil como reactivo de detección de LAM de bacilo de Koch, y la presente invención proporciona un agente de detección de LAM de bacilo de Koch que contiene el AcM1 de la presente invención como reactivo de detección de LAM de bacilo de Koch. Estos AcM de la presente invención pueden inmovilizarse de manera separable o no separable sobre cualquier portador sólido, o pueden marcarse con cualquier sustancia de marcaje.

Cuando va a llevarse a cabo el ensayo de LAM bacilar acidorresistente de la presente invención, el ensayo puede llevarse a cabo fácilmente usando un kit de detección de LAM bacilar acidorresistente que incluye el AcM de la presente invención como reactivo de detección de LAM bacilar acidorresistente. Además, cuando va a llevarse a cabo el ensayo de LAM de bacilo de Koch de la presente invención, el ensayo puede llevarse a cabo fácilmente usando un kit de detección de LAM de bacilo de Koch que incluye, entre los AcM de la presente invención, el AcM1 como reactivo de detección de LAM de bacilo de Koch.

Por tanto, la presente invención proporciona un kit de detección de LAM bacilar acidorresistente para llevar a cabo el ensayo de lA m bacilar acidorresistente, en particular un kit de detección de LAM de bacilo de Koch para llevar a cabo el ensayo de LAM de bacilo de Koch. El kit de detección de LAM bacilar acidorresistente, en particular el kit de detección de LAM de bacilo de Koch, es un kit de reactivos para el ensayo de detección de LAM de bacilos acidorresistentes, en particular bacilo de Koch, existente en una muestra de prueba, usando una reacción de antígenoanticuerpo. El kit de detección de LAM bacilar acidorresistente incluye el AcM de la presente invención. Es suficiente cuando el kit de detección de LAM de bacilo de Koch incluye el AcMl de la presente invención, y el kit puede incluir la herramienta de detección de LAM bacilar acidorresistente (o la herramienta de detección de LAM de bacilo de Koch), un segundo anticuerpo que reacciona con el AcM (o el AcM1) de la presente invención, un reactivo de detección de anticuerpos y similares. Además, para facilitar la realización del ensayo, el kit de diagnóstico puede incluir además una disolución de reacción, una disolución de dilución, una disolución de lavado, una disolución de parada de la reacción, un reactivo de medición de la actividad marcado adecuados y similares.

(VI) Ensayo de una muestra esterilizada

El método para detectar bacilos acidorresistentes o el bacilo de Koch de la presente invención descrito anteriormente en el punto (III) puede aplicarse como un ensayo sin riesgo biológico. Específicamente, el ensayo sin riesgo biológico de la presente invención puede llevarse a cabo mediante las siguientes etapas.

(1) Esterilización mediante ebullición, preferiblemente por vapor a alta presión, de una muestra.

(2) Una etapa de poner en contacto el AcM, preferiblemente el AcM1, de la presente invención con la muestra de prueba esterilizada;

(3) una etapa de someter a ensayo el LAM de bacilo de Koch en la muestra de prueba usando, como índice, una reacción de unión entre el AcM, preferiblemente el AcM1, de la presente invención y el LAM de bacilo de Koch; y

(4) una etapa para determinar que la muestra de prueba está infectada por el bacilo de Koch cuando se ha detectado el LAM de bacilo de Koch en la muestra de prueba.

(VII) Método para determinar el efecto curativo de la tuberculosis de un medicamento antituberculoso

El método para detectar bacilos acidorresistentes, en particular el bacilo de Koch, de la presente invención descrito anteriormente en el punto (III) puede aplicarse para determinar el efecto curativo de la tuberculosis de un medicamento antituberculoso.

Específicamente, el método para determinar el efecto curativo de la tuberculosis de un medicamento antituberculoso de la presente invención puede llevarse a cabo mediante las siguientes etapas.

(1) Una etapa de poner en contacto el AcM, preferiblemente el AcM1, de la presente invención con ambas de las muestras de prueba antes y después de la administración de un medicamento antituberculoso;

(2) una etapa de someter a ensayo el LAM de bacilo de Koch en las muestras de prueba antes y después de la administración del medicamento antituberculoso usando, como índice, una reacción de unión entre el AcM, preferiblemente el AcM1, de la presente invención y el LAM de bacilo de Koch; y

(3) una etapa para determinar que el medicamento antituberculoso tiene efecto curativo de la tuberculosis cuando se detecta LAM de bacilo de Koch en la muestra de prueba antes de la administración del medicamento antituberculoso y cuando no se detecta LAM bacilar en la muestra de prueba después de la administración del medicamento antituberculoso.

Estas etapas de (1) y (2) son etapas que corresponden respectivamente a las etapas de (1) y (2) expuestas en “(III) Método para detectar micobacterias, en particular bacilo de Koch” descrito anteriormente, y el método descrito en el punto (III) puede realizarse de manera similar, salvo que la muestra de prueba sea una muestra de prueba de un paciente con tuberculosis que ha contraído la tuberculosis (infectado con el bacilo de Koch) y que las muestras de prueba sometidas al método sean una muestra de prueba antes de la administración de un medicamento antituberculoso (antes de una terapia antituberculosa) y una muestra de prueba después de la administración del medicamento antituberculoso (después de la terapia antituberculosa). Además, el ensayo para detectar LAM de bacilo de Koch realizado en (2) puede llevarse a cabo de manera similar usando la herramienta de detección de bacilo de Koch expuesta en “(III) Método de detección de bacilos acidorresistentes, en particular bacilo de Koch” descrito anteriormente (cabe señalar que, en este caso, es posible parafrasearlo como “herramienta de detección de LAM de bacilo de Koch”).

Como medicamento antituberculoso descrito en este caso, pueden usarse los conocidos hasta ahora en la técnica, tales como rifampicina, isoniazida (hidrazida de ácido isonicotínico), pirazinamida, estreptomicina y una sal de la misma y etambutol y una sal del mismo. Sin embargo, el medicamento antituberculoso no se limita a los mismos, e incluye medicamentos aprobados o no aprobados que presentan una acción bactericida (actividad antituberculosa) contra los bacilos de Koch.

Como resultado de la etapa (2) descrita anteriormente, cuando se detecta LAM de bacilo de Koch, es decir, bacilo de Koch, en una muestra de prueba antes de la administración de un medicamento antituberculoso y cuando no se detecta LAM de bacilo de Koch (bacilo de Koch) en una muestra de prueba después de la administración del medicamento antituberculoso, puede determinarse la eficacia del medicamento antituberculoso ya que el medicamento antituberculoso tuvo un efecto curativo de la tuberculosis en un paciente con tuberculosis objeto.

Por otra parte, como resultado de la etapa (2) descrita anteriormente, cuando se detecta LAM de bacilo de Koch, es decir, bacilo de Koch, en una muestra de prueba antes de la administración de un medicamento antituberculoso y cuando también se detecta LAM de bacilo de Koch (bacilo de Koch) en una muestra de prueba después de la administración del medicamento antituberculoso, puede compararse la cantidad de bacilo de Koch detectado antes y después de la administración del medicamento antituberculoso. En este caso, cuando se observa una reducción de la cantidad de bacilo de Koch antes y después de la administración del medicamento antituberculoso, se sugiere un posible efecto curativo de la tuberculosis del medicamento antituberculoso en un paciente con tuberculosis objeto, y puede proporcionarse a un trabajador médico una opción terapéutica de continuar el uso del medicamento antituberculoso. Por otro lado, cuando no se observa una reducción de la cantidad de bacilo de Koch antes y después de la administración del medicamento antituberculoso, esto indica que el medicamento antituberculoso no tiene efecto curativo de la tuberculosis en un paciente con tuberculosis objeto. Por tanto, el trabajador médico puede optar por dejar de usar el medicamento antituberculoso y cambiar a otra terapia.

En el método descrito anteriormente, el AcM, en particular el AcM1, de la presente invención es útil como reactivo de determinación del efecto curativo de la tuberculosis de un medicamento antituberculoso, y la presente invención proporciona un agente de determinación del efecto curativo de la tuberculosis que contiene el AcM, en particular el AcM1, de la presente invención como reactivo de determinación del efecto curativo de la tuberculosis. El AcM, en particular el AcM1, de la presente invención puede estar inmovilizado de manera separable o no separable sobre cualquier portador sólido, o puede estar marcado con cualquier sustancia de marcaje.

Además, cuando va a llevarse a cabo el método de determinación de la presente invención descrito anteriormente, el método puede llevarse a cabo fácilmente usando un kit de determinación del efecto curativo de la tuberculosis que incluye, como reactivo de determinación del efecto curativo de la tuberculosis en un medicamento antituberculoso, el AcM, preferiblemente el AcM1, de la presente invención. Por tanto, la presente invención proporciona un kit de determinación del efecto curativo de la tuberculosis para llevar a cabo el método de determinación del efecto curativo de la tuberculosis para un medicamento antituberculoso. El kit de determinación del efecto curativo de la tuberculosis es un kit de reactivos para determinar el efecto terapéutico de un agente antituberculoso en un paciente con tuberculosis a través de un ensayo de detección del LAM de bacilo de Koch existente en las muestras de prueba antes y después de la terapia usando una reacción de antígeno-anticuerpo. Es suficiente cuando el kit incluye el AcM, preferiblemente el AcM1, de la presente invención; y el kit puede incluir la herramienta de detección de LAM de bacilo de Koch descrita anteriormente, el segundo anticuerpo que reacciona con el AcM de la presente invención, un reactivo de detección de anticuerpos y similares. Además, para facilitar la realización del ensayo, el kit de diagnóstico puede incluir además una disolución de reacción, una disolución de dilución, una disolución de aclarado, una disolución de parada de la reacción, un reactivo de medición de la actividad marcado adecuados y similares.

La terapia para la tuberculosis activa se lleva a cabo generalmente mediante la administración de cuatro o más tipos de agentes terapéuticos durante seis meses. Cuando se sospecha de una infección de tuberculosis, en primer lugar se realiza una prueba de frotis con tinción de Ziehl-Neelsen o tinción de fluorescencia. Si existen bacterias en un número de 10.000 o más en 1 ml de una muestra de esputo, se considera “frotis positivo”. Un paciente con frotis de esputo positivo es particularmente importante como fuente de infección, tanto desde el punto de vista clínico como de la salud pública. Por tanto, un paciente con frotis de esputo positivo requiere tratamiento hospitalario en una sala de tuberculosis. Un índice de cambio a tratamiento ambulatorio es tener resultados negativos de la prueba de frotis durante tres días consecutivos. El método de detección de LAM de bacilo de Koch de la presente invención puede cuantificar la concentración de LAM en una muestra biológica tal como esputo, saliva y sangre. Por tanto, sometiendo a ensayo el LAM en una muestra biológica tal como esputo, saliva y sangre, es posible monitorizar la eficacia del agente terapéutico, y la presente invención también es aplicable a la determinación de ser negativo a la infección para un estado de descarga de bacterias.

Ejemplos

La presente invención y los efectos de la misma se describen a continuación con referencia a los ejemplos. Sin embargo, el alcance de la invención no se limita a estos ejemplos.

Ejemplos 1 a 4

1. Preparación de materiales

(1-1) Preparación de oligo-LAM y preparación del inmunógeno

Se dializó LAM de bacilo de Koch humano M. tuberculosis (3 mg) (derivado de la cepa Aoyama B, Nacalai Tesque) contra un tampón acetato 50 mM (pH 4,5) y se ajustó a una concentración de 1 mg/ml. Posteriormente, se añadieron al mismo 150 |il de una disolución acuosa de ácido peryódico 200 mM y se agitó la mezcla a 4°C durante 7 minutos mientras se protegía de la luz. Después de agitar, se añadieron al mismo 35 |il de etilenglicol y se sometió la mezcla a filtración en gel (bicarbonato de sodio 0,1 M, pH 8,3) usando una pequeña columna PD-10 (producida por GE Company) y se fraccionó en porciones de 1 ml. Se analizaron las muestras fraccionadas para detectar azúcar mediante un método de fenol-ácido sulfúrico; y se dializaron las fracciones en las que se detectó azúcar contra agua pura y luego se liofilizaron.

Se disolvió el oligo-LAM liofilizado (3 mg) en 0,5 ml de agua pura. Después se añadieron 12 |il de tetrafluoroborato de 1-ciano-4-dimetilaminopiridinio 100 mg/ml disuelto en acetonitrilo y se agitó la mezcla durante aproximadamente 1 minuto, se añadieron a la misma 12 |il de trietilamina 0,2 M y se agitó la mezcla durante 2 minutos. A continuación, se añadieron 0,53 ml de dihidrazida de ácido adípico 0,6 M disuelta en un tampón bicarbonato de sodio 0,5 M (pH 8,5) y se agitó la mezcla a 4°C durante 10 horas, y luego se dializó contra agua pura durante aproximadamente 1 hora.

A la disolución obtenida después de la diálisis se le añadieron 300 |ig de hemocianina de lapa californiana (KLH), 30 |il de un tampón fosfato 200 mM (pH 5,0) y 45 |il de N-hidroxisulfosuccinimida de sodio 100 mM. Posteriormente, se añadieron 65 |il de dicloruro de etileno 1 M y se agitó la mezcla a 4°C durante 3 horas o más. Finalmente, se dializó la mezcla resultante contra un tampón fosfato para obtener oligo-LAM-KLH para un inmunógeno. Se mezcló el oligo-LAM-KLH con un adyuvante (adyuvante de Freund completo o incompleto, producido por Difco) a una razón de 1:1 (oligo-LAM-KLH:adyuvante (razón en peso)) y se usó como inmunógeno.

(1-2) Preparación de la vacuna BCG y del inmunógeno

Como vacuna BCG, se usó una vacuna BCG liofilizada (número de autorización: 20300AMZ00767000) producida por Japan BCG Laboratory. Para la inmunización, se usó una mezcla de 100 mg (peso húmedo) de la vacuna BCG liofilizada y 1 ml de solución salina fisiológica.

(1-3) Preparación de células bacterianas muertas de H37Ra e inmunógeno

Como células bacterianas muertas de H37Ra, se usó M. tuberculosis H37Ra (producto liofilizado) producido por Difco. Para la inmunización, se usó una mezcla de 100 mg (peso seco) de las células bacterianas muertas liofilizadas de H37Ra y 1 ml de solución salina fisiológica.

(1-4) Preparación de cebadores para producir fragmentos de scFv

La tabla 1 muestra los nombres, las secuencias de bases y el uso de los cebadores empleados para preparar anticuerpos de cadena sencilla (scFv). Se sintetizaron los siguientes cebadores: cuatro cebadores sentido y un cebador antisentido como cebadores para la amplificación de la región VH, cuatro cebadores sentido y cuatro cebadores antisentido como cebadores para la amplificación de la región VL, un cebador sentido y un cebador antisentido como cebadores para la amplificación de un ligador (ligador GS) que une un fragmento de la región variable de cadena pesada y un fragmento de la región variable de cadena ligera y dos cebadores para la amplificación de las regiones de reconocimiento de las enzimas de restricción (Sfil, Notl). Las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NO: 13 a 29 del listado de secuencias corresponden a las secuencias de aminoácidos de los cebadores enumerados en la tabla 1, en orden de arriba a abajo.

Tabla 1

RS-Not

5'-acctgcggccgc-3'

Cebador del sitio Not-I

SEQ ID NO:29

(1-5) Preparación de la biblioteca de fagos de scFv

Se inmunizó a un conejo usando la vacuna BCG o células bacterianas muertas de H37Ra como inmunógeno (véanse los puntos (1-2) y (1-3) anteriores y el ejemplo de referencia 1 (2)). Después de finalizar la inmunización, se recogió el bazo del conejo, se disolvió el tejido en un medio RPMI (sin suero), se extrajo el ARN total y se sintetizó el ADNc a partir del ARN total obtenido. El ARN total se extrajo usando un kit de extracción de ARN (Qiagen) según el manual de instrucciones. El ADNc se sintetizó a partir del ARN total usando un kit de síntesis de ADNc (Invitrogen) según el manual de instrucciones.

Se usó el ADNc sintetizado como molde, y la amplificación del fragmento del gen VH y la amplificación del fragmento del gen VL se realizaron usando los cebadores específicos descritos en la tabla 1. Específicamente, la amplificación del fragmento del gen VH se llevó a cabo usando cuatro conjuntos de cebadores: RabVH-F1 y RabVH-R, RabVH-F2 y RabVH-R, RabVH-F3 y RabVH-R y RabVH-F4 y RabVH-R. La amplificación del fragmento del gen VL se realizó usando 10 conjuntos de cebadores: RabVK-F1 y RabVK-R1, RabVK-F1 y RabVK-R2, RabVK-F1 y RabVK-R3, RabVK-F2 y RabVK-R1, RabVK-F2 y RabVK-R2, RabVK-F2 y RabVK-R3, RabVK-F3 y RabVK-R1, RabVK-F3 y RabVK-R2, RabVK-F3 y RabVK-R3 y RabVX-F y RabVX-R. Los productos de amplificación de genes obtenidos se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,5%. Los productos de amplificación de genes de peso molecular deseado se extrajeron del gel y se purificaron.

El producto de amplificación del gen VH y el producto de amplificación del gen VL purificados se unieron usando un ligador GS (GGGGSGGGGSGGGGS: SEQ ID NO: 11). El RS1 que tiene secuencia homóloga al extremo 3' del producto de amplificación del gen VH se mezcló con el gen VH y se realizó la PCR durante 5 ciclos para añadir el ligador GS al extremo 3' del producto de amplificación del gen VH. Del mismo modo, el RS2 que tiene secuencia homóloga al extremo 5' del producto de amplificación del gen VL se mezcló con el gen VL y se realizó la PCR durante 5 ciclos para añadir el ligador GS al extremo 5' del producto de amplificación del gen VL. Se mezclaron el producto de amplificación del gen VH con el ligador GS añadido y el producto de amplificación del gen VL con el ligador añadido y se realizó la PCR durante 10 ciclos para producir un gen scFv (gen VH/ligador GS/gen VL) en el que el gen VH y el gen VL se unieron mediante el ligador GS. El gen scFv así preparado se usó como molde, se amplificó realizando la PCR durante 30 ciclos usando cebadores en los que se añadió una secuencia de la enzima de restricción (véase “RS-Sfi” y “RS-Not” en la tabla 1) y finalmente se escindió con las enzimas de restricción SfiI y NotI.

A continuación, el gen scFv tratado con las enzimas de restricción se insertó en los sitios SfiI y NotI del vector fagémido de visualización de anticuerpos pCANTAB5E (producido por GE) y se transformó en E. coli JM109 mediante electroporación. Posteriormente, el transformante se cultivó durante la noche a 37°C en un medio de agar LB-Amp/Glu (medio LB que contiene ampicilina 150 |ig/ml, glucosa al 1% y agar al 1,5%) y se recogieron todas las colonias resultantes.

Después de que la E. coli transformada se ajustara en medio LB para tener una absorbancia a la longitud de onda de 600 nm (DO⁶⁰⁰) de 0,2, se mezcló el transformante con un fago auxiliar M13K07 (producido por Invitrogen) (1012ufc), luego se cultivó estáticamente durante 30 minutos a 37°C y se siguió cultivando durante la noche a 37°C en 1 l de un medio líquido LB-Amp/Kan (medio LB que contiene ampicilina 150 |ig/ml y kanamicina 100 |ig/ml) para producir una biblioteca de fagos de visualización de scFv.

Por último, la biblioteca de fagos de visualización de scFv se concentró en una disolución de PEG/NaCl y se ajustó con PBS a una concentración de aproximadamente 1 x 1012 ufc/ml, y se usó la biblioteca resultante para la bioselección.

(1-6) Preparación de scFv (anticuerpo de cadena sencilla) soluble

Se preparó un scFv soluble usando el vector de expresión de E. coli pET22b(+) (producido por Novagen). El gen scFv diana se amplificó con cebadores sentido y antisentido, añadiendo así la secuencia de la enzima de restricción NotI al extremo 5' y la secuencia de la enzima de restricción NcoI al extremo 3'.

El gen scFv tratado con NotI y NcoI se insertó en el vector de expresión de E. coli pET22b(+) y luego se transformó en el huésped E. coli Rosseta (Novagen). La E. coli transformada se cultivó durante la noche a 37°C en un medio de agar LB-Amp/Glu y las colonias se cultivaron durante 8 horas a 25°C en 2 ml de un medio líquido LB-Amp. El cultivo (2 ml) se añadió a 200 ml de un medio líquido LB-Amp y se cultivó durante 16 horas a 30°C para secretar un scFv (anticuerpo de cadena sencilla) soluble en el sobrenadante del cultivo.

La purificación del scFv soluble a partir del sobrenadante del cultivo se realizó mediante purificación por afinidad usando una columna empaquetada con Ni Sepharose (columna de Ni) (producida por GE). Se añadió una cantidad triple de un tampón fosfato 100 mM al sobrenadante del cultivo y se añadió la mezcla a una columna de Ni para permitir que se uniera el scFv soluble. La columna se lavó con un tampón fosfato 100 mM que contenía imidazol 10 mM y luego se eluyó el scFv soluble con un tampón fosfato 100 mM que contenía imidazol 500 mM.

El eluido se dializó posteriormente contra un tampón fosfato durante la noche para retirar el imidazol y se obtuvo un scFv (anticuerpo de cadena sencilla) soluble.

(1-7) Marcaje de anticuerpos con biotina

El marcaje con biotina del anticuerpo policlonal (AcP) y del anticuerpo de cadena sencilla (scFv) preparado anteriormente se realizó usando un kit de marcaje con Sulfo-NHS-LC-biotina de Pierce, según el procedimiento operativo del kit recomendado.

2. Ensayo

(2-1) Medición del título de anticuerpos en sangre (ELISA)

Usando sueros recogidos de conejos y ratones inmunizados con cada antígeno, se confirmó el título de anticuerpos en sangre mediante el ELISA descrito a continuación.

El LAM purificado de bacilo de Koch humano M. tuberculosis (derivado de la cepa Aoyama B, Nacalai Tesque) y el LAM purificado de bacilo acidorresistente no tuberculoso M. avium (derivado de la cepa del serotipo B, Nacalai Tesque) se ajustaron individualmente con PBS a una concentración de 100 |il/ml. Cada una de las disoluciones de LAM se añadió individualmente a cada pocillo de microplacas de 96 pocillos separadas en una cantidad de 100 ^l/pocillo y se dejó reaccionar durante la noche a 4°C, y luego se realizó el bloqueo en un tampón fosfato que contenía leche desnatada al 1% para preparar las placas de antígenos.

La reacción primaria se llevó a cabo añadiendo 100 |il de suero de conejo o de ratón diluido con un tampón de reacción (tampón Tris de pH 7,8 que contenía BSA al 1% (albúmina bovina fetal), leche desnatada al 1%, NaCl 0,14 M y Tween 20 al 0,1%) a cada pocillo de las placas de antígenos mencionadas y dejando que la reacción avanzara a 25°C durante 1 hora. Los anticuerpos que no reaccionaron se retiraron entonces lavando 3 veces. La reacción secundaria se llevó a cabo añadiendo a la disolución de reacción primaria anterior 100 |il de anticuerpo anti-IgG de conejo marcado con HRP (producido por Epitomics) o anticuerpo anti-IgG de ratón marcado con HRP (producido por Zymed) diluido 5.000 veces con el tampón de reacción y dejando que la reacción avanzara a 25°C durante 1 hora. Los anticuerpos que no reaccionaron se eliminaron lavando 3 veces.

Se realizó una reacción de desarrollo de color añadiendo 100 |il de una disolución de TMB (3,3',5,5'-tetrametilbencidina) al producto de la reacción secundaria y dejando la mezcla a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después del desarrollo de color, la reacción se detuvo añadiendo 100 |il de una disolución de ácido sulfúrico 1 N. La detección se realizó midiendo la absorbancia a longitudes de onda de 450-650 nm (DO ^450-650 nm).

(2-2) Bioselección

La bioselección se realizó en cuatro etapas, que consisten en las etapas 1 a 4.

En las etapas 1 a 3, se concentraron los clones de fagos unidos a un inmunógeno (vacuna BCG o células bacterianas muertas de H37Ra). La biblioteca de fagos de visualización de scFv (véase el punto (1-5) de “1. Preparación de materiales”) ajustada a una concentración de 1 x 1011 ufc/500 |il con un tampón de reacción (tampón Tris de pH 7,8 que contiene BSA al 1%, leche desnatada al 1%, NaCl 0,14 M y Tween 20 al 0,1%) se mezcló con 1 mg de vacuna BCG o células bacterianas muertas de H37Ra y se dejó reaccionar a 25°C durante 2 horas. Después de la reacción, se recogieron las células mediante centrifugación (a 10.000 rpm durante 10 minutos) y se retiró el sobrenadante del cultivo. Después de añadir PBS a las células recogidas y mezclar, las células se recogieron de nuevo mediante centrifugación para lavar las células. La operación de lavado se realizó 5 veces. Los fagos unidos a las células se eluyeron con 500 |il de eluyente (disolución de HCl 0,1 N que contenía BSA 0,1% y ajustada para tener un pH de 2,2 con una disolución de glicina 1 M) y se neutralizaron añadiendo 500 |il de un líquido de neutralización (tampón Tris 1 M, pH 9,1). El conjunto de fagos neutralizados se infectó con E. coli JM109 y se cultivó a 37°C en medio de agar LB-Amp/Glu durante la noche; y se recogieron las colonias. Después de cultivar estáticamente la E. coli transformada ajustada en un medio LB para tener una DO ⁶⁰⁰ nm = 0,2 y un fago auxiliar M13K07 (producido por Invitrogen) (1012 ufc) a 37°C durante 30 minutos, se añadieron 100 ml de un medio líquido LB-Amp/Kan y se cultivaron las células durante la noche a 37°C. El cultivo de fagos se concentró en una disolución de PEG/NaCl y se ajustó a una concentración de aproximadamente 1 x 1012 ufc/ml con un tampón fosfato. La bioselección de las células se realizó 3 veces.

En la etapa 4, se realizó la bioselección usando una placa de antígenos en la que se había inmovilizado LAM purificado de M. tuberculosis o LAM purificado de M. avium (placa de microtitulación inmovilizada con LAM purificado). Específicamente, el conjunto de fagos unidos a las células obtenido en la etapa 3 se añadió a una placa de microtitulación inmovilizada con LAM purificado y se dejó que la reacción se produjera a 25°C durante 2 horas. Posteriormente, los fagos que no reaccionaron se retiraron lavando 10 veces con el tampón de reacción. Los fagos unidos al LAM se eluyeron con 100 |il de eluyente y luego se neutralizaron añadiendo 100 |il de un líquido de neutralización (tampón Tris 1 M, pH 9,1). El conjunto de fagos neutralizados se infectó con E. coli JM109 y se cultivó a 37°C en un medio de agar LB-Amp/Glu durante la noche.

Ejemplo de referencia 1. Preparación de antisuero contra LAM

(1) Para preparar un anticuerpo policlonal (AcP) contra LAM, se inmunizó a los conejos con oligo-LAM. Como oligo-LAM, específicamente, se usó oligo-LAM-KLH preparado como inmunógeno mediante el método descrito en el punto (1-1) mencionado anteriormente de “1. Preparación de materiales”. El oligo-LAM-KLH se mezcló con un adyuvante (adyuvante de Freund incompleto) a una razón de 1:1 (oligo-LAM-KLH:adyuvante (razón en peso)) y se administraron 100 |ig de la mezcla por vía subcutánea a conejos (dos conejos: Rab-1 y 2). A continuación, se realizó la inmunización 4 veces a intervalos de 14 días. Una vez finalizada la quinta inmunización, se extrajo sangre y se midieron los títulos de anticuerpos en sangre contra el LAM de bacilo de Koch humano (M. tuberculosis) y el LAM de bacilo acidorresistente no tuberculoso (M. Avium) según el método ELISA descrito en el punto (2-1) mencionado anteriormente de “2. Ensayo”.

Como resultado de la evaluación usando una placa de antígenos en la que se había inmovilizado LAM de M. tuberculosis, se confirmó un aumento suficiente de los títulos de anticuerpos en sueros diluidos 384.000 veces en los dos conejos inmunizados por vía subcutánea (Rab-1 y 2). Los antisueros de estos conejos (Rab-1 y 2) también mostraron una reacción de unión a una placa de antígenos en la que se había inmovilizado LAM de M. avium, por lo que se confirmó que los antisueros de los conejos (Rab-1 y 2) mostraron una reactividad similar tanto frente a LAM de M. tuberculosis como frente a LAM de M. avium. Específicamente, los antisueros de conejo (anticuerpo policlonal) preparados usando el oligo-LAM (oligo-LAM-KLH) como inmunógeno tenían reactividad frente al LAM bacilar acidorresistente en general, y no se observó especificidad hacia el LAM de bacilo de Koch.

(2) A continuación, se inmunizó a un conejo usando la vacuna BCG como inmunógeno y se inmunizó a otro conejo usando células bacterianas muertas de H37Ra como inmunógeno. Cada conejo se inmunizó por vía subcutánea 4 veces a intervalos de 14 días de la misma manera que anteriormente. Específicamente, cada conejo se inmunizó por vía subcutánea con un total, por inmunización, de 1 ml de solución salina fisiológica que contenía 100 mg de vacuna BCG o células bacterianas muertas de H37Ra preparadas mediante el método descrito en los puntos (1-2) o (1-3) mencionados anteriormente de “1. Preparación de materiales”.

El título de anticuerpos en la sangre de cada conejo después de la segunda inmunización se midió de la misma manera que anteriormente mediante el método ELISA descrito en el punto (2-1) mencionado anteriormente de “2. Ensayo”. Específicamente, los títulos de anticuerpos de los sueros preparados a partir del conejo inmunizado con la vacuna BCG y del conejo inmunizado con las células bacterianas muertas de H37Ra se evaluaron usando una placa de antígenos en la que se había inmovilizado LAM de M. tuberculosis purificado y una placa de antígenos en la que se había inmovilizado LAM de M. avium purificado. La figura 3 (A) muestra los resultados cuando se usó la vacuna BCG como inmunógeno y la figura 3 (B) muestra los resultados cuando se usaron las células bacterianas muertas de H37Ra. En las figuras, “-■-” indica la reactividad frente a LAM de M. tuberculosis y “- • - ” indica la reactividad frente a LAM de M. avium.

Tal como se muestra en la figura 3, tanto en el caso de usar la vacuna BCG como en el caso de usar las células bacterianas muertas de H37Ra, se confirmó que los títulos de anticuerpos contra los LAM aumentaron significativamente de manera dependiente de la concentración. Además, se mostró una reactividad similar tanto frente a LAM de M. tuberculosis como frente a LAM de M. avium.

Tal como se describió anteriormente, cuando se usaron individualmente como inmunógenos el oligo-LAM, la vacuna BCG y las células bacterianas muertas de H37Ra, todos los antisueros (anticuerpos policlonales) contra estos antígenos tuvieron reactividad frente a LAM bacilar acidorresistente en general, y no se observó especificidad hacia el LAM de bacilo de Koch.

Ejemplo 1. Preparación de anticuerpos de cadena sencilla (scFv) contra LAM

(1) Preparación de scFv contra LAM

Se aislaron anticuerpos de cadena sencilla scFv de las células del bazo de los conejos inmunizados con el oligo-LAM, la vacuna BCG y las células bacterianas muertas de H37Ra en el ejemplo de referencia 1.

Específicamente, según el método descrito en el punto (1-5) de “1. Preparación de materiales”, se preparó ARN total a partir del bazo de cada conejo y se realizó la p Cr usando el ADNc sintetizado a partir del ARN total como molde y usando los distintos cebadores descritos en la tabla 1 para preparar los productos de amplificación de los genes VH y VL.

Posteriormente, se prepararon genes scFV que tenían cada uno el gen VH y el gen VL unidos mediante un ligador GS (GGGGSGGGGSGGGGS: SEQ ID NO: 11) (gen VH/ligador GS/gen VL) y luego se prepararon bibliotecas de fagos de visualización de scFv a partir de los mismos según el método descrito en el punto (1-5) de “1. Preparación de materiales”. El título de cada biblioteca era de aproximadamente 106 ufc, por lo que se supone que cada biblioteca tenía una diversidad de 106

Para la biblioteca de fagos de visualización de scFv preparada a partir de las células del bazo del conejo inmunizado con la vacuna BCG, se realizó la bioselección 3 veces usando la vacuna BCG como antígeno (véase el punto (2-2) de “2. Ensayo”) y luego se realizó la cuarta bioselección usando una microplaca en la que se había inmovilizado LAM de M. tuberculosis.

De manera similar, para la biblioteca de fagos de visualización de scFv preparada a partir de las células del bazo del conejo inmunizado con las células bacterianas muertas de H37Ra, se realizó la bioselección 3 veces usando las células bacterianas muertas de H37Ra como antígeno y luego se realizó la cuarta bioselección usando una microplaca en la que se había inmovilizado LAM de M. tuberculosis.

Finalmente, se seleccionaron al azar 200 clones de cada conjunto de selección obtenido y se cribaron los clones reactivos frente a LAM. Como resultado, se obtuvieron aproximadamente 10 clones reactivos frente a LAM de cada biblioteca.

Como resultado del análisis de las secuencias de bases, se confirmó que las secuencias de bases de los clones obtenidos de cada biblioteca eran casi idénticas.

Mediante las operaciones mencionadas, se aisló con éxito un único clon de scFv (anticuerpo de cadena sencilla) de cada una de las bibliotecas de fagos de visualización de scFv preparadas a partir de las células del bazo del conejo inmunizado con la vacuna BCG y de la biblioteca de fagos de visualización de scFv preparada a partir de las células del bazo del conejo inmunizado con las células bacterianas muertas de H37Ra.

La figura 4 muestra la secuencia de aminoácidos del anticuerpo de cadena sencilla scFv (Myco-scFv) preparado a partir de las células del bazo del conejo inmunizado con las células bacterianas muertas de H37Ra (SEQ ID NO: 30) y la secuencia de aminoácidos del anticuerpo de cadena sencilla scFv (TB-scFv) preparado a partir de las células del bazo del conejo inmunizado con la vacuna BCG (SEQ ID NO: 12) junto con las posiciones de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena pesada; el ligador GS; y las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena ligera.

(2) Reactividad frente a LAM de scFv

Se evaluó la reactividad frente a LAM en el anticuerpo de cadena sencilla scFv (TB-scFv) obtenido de la biblioteca de fagos de visualización de scFv preparada a partir de las células del bazo del conejo inmunizado con la vacuna BCG y el anticuerpo de cadena sencilla scFv (Myco-scFv) obtenido de la biblioteca de fagos de visualización de scFv preparada a partir de las células del bazo del conejo inmunizado con las células bacterianas muertas de H37Ra.

Específicamente, cada uno de los anticuerpos de cadena sencilla scFv (TB-scFv y Myco-scFv) se solubilizó según el método descrito en el punto (1-6) de “1. Preparación de materiales” para preparar un scFv soluble. A continuación, el scFv soluble se marcó con biotina según el método descrito en el punto (1-7) del mismo; y se evaluó la reactividad frente a las placas de antígenos (placas de microtitulación inmovilizadas con LAM purificado), es decir, una placa en la que se había inmovilizado LAM de M. tuberculosis purificado y una placa en la que se había inmovilizado LAM de M. avium purificado, mediante el método ELISA descrito en el punto (2-1) de “2. Ensayo”.

La figura 5 muestra la reactividad del anticuerpo de cadena sencilla TB-scFv frente a LAM de M. tuberculosis (-■-) y frente a LAM de M. avium (-•-). Tal como se muestra en la figura 5, los resultados obtenidos al hacer reaccionar TB-scFv a concentraciones de 1000 ng/ml, 500 ng/ml, 250 ng/ml, 125 ng/ml, 62,5 ng/ml, 31,25 ng/ml, 15,625 ng/ml y 7,8125 ng/ml con LAM de M. tuberculosis y LAM de M. avium en las placas de antígenos con LAM inmovilizado confirmaron que la reactividad de TB-scFv frente a LAM de M. tuberculosis (-■-) alcanzó un valor máximo a una concentración de 250 ng/ml con un valor de DO (450 nm) de más de 3, mientras que la reactividad de TB-scFv frente a LAM de M. avium LAM (-•-) no alcanzó un valor máximo ni siquiera a una concentración de 1000 ng/ml con un valor de DO (450 nm) de aproximadamente 2. Aunque los resultados no se muestran, Myco-scFv mostró casi la misma reactividad tanto frente a LAM de M. tuberculosis como frente a LAM de M. avium.

A partir de los resultados anteriores, se confirmó que el anticuerpo de cadena sencilla TB-scFv preparado usando la vacuna BCG como inmunógeno es un anticuerpo específico que tiene una reactividad frente a LAM de bacilo de Koch humano M. tuberculosis más fuerte que frente a LAM de bacilo acidorresistente no tuberculoso M. avium.

Ejemplo 2

Construcción de ELISA de detección de LAM

Las características de los tres tipos de anticuerpos preparados en el ejemplo de referencia 1 y en el ejemplo 1 (anticuerpo policlonal de conejo inmunizado con oligo-LAM (a continuación en el presente documento, denominado “Myco-Poly”) (ejemplo de referencia 1) y anticuerpo monoclonal de conejo inmunizado con células bacterianas muertas de H37Ra (Myco-svFv) y anticuerpo monoclonal de conejo inmunizado con la vacuna BCG (TB-scFv) (ejemplo 1)) se resumieron en la tabla 2.

Tabla 2

Basándose en la especificidad de reacción de estos anticuerpos, se combinaron los anticuerpos para construir dos tipos de ELISA: ELISA de detección de LAM bacilar acidorresistente y ELISA de detección de LAM de bacilo de Koch.

(1) Preparación de ELISA de detección de LAM bacilar acidorresistente

Para la construcción del ELISA de detección de LAM bacilar acidorresistente, se inmovilizó Myco-Poly como anticuerpo de captura en una placa, y se marcó Myco-scFv con biotina y se usó como anticuerpo de detección.

Se ajustó Myco-Poly a una concentración de 10 |ig/ml con un tampón fosfato. Se añadió Myco-Poly a una microplaca de 96 pocillos en una cantidad de 100 ^l/pocillo y se dejó reaccionar durante la noche a 4°C; después, se realizó el bloqueo en un tampón fosfato que contenía leche desnatada al 1% para preparar una placa de anticuerpos.

La reacción primaria se realizó de la siguiente manera. Se usó una muestra de prueba que pudiera contener bacilos acidorresistentes, y se añadieron 100 |il de la muestra de prueba diluida con un tampón de reacción (tampón Tris de pH 7,8 que contenía BSA al 1%, leche desnatada al 1%, NaCl 0,14 M y Tween 20 al 0,1%) a cada pocillo de la placa de anticuerpos anterior. Se dejó que la reacción avanzara a 25°C durante 1 hora y, a continuación, se lavó la placa 3 veces. La reacción secundaria se realizó añadiendo a cada pocillo de la placa de anticuerpos 100 |il de anticuerpo anti-Myco-scFv marcado con biotina y diluido 5.000 veces con el tampón de reacción, dejando que la reacción avanzara a 25°C durante 1 hora y retirando los anticuerpos que no reaccionaron lavando 3 veces. La reacción terciaria se llevó a cabo añadiendo 100 |il de HRP marcada con avidina (producida por Millipore) diluida 10.000 veces con el tampón de reacción, dejando que la reacción avanzara a 25°C durante 1 hora y retirando la HRP marcada con avidina que no reaccionó lavando 3 veces.

Se realizó una reacción de desarrollo de color añadiendo 100 |il de una disolución de TMB a cada pocillo y dejando la mezcla a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después del desarrollo de color, la reacción se detuvo añadiendo 100 |il de una disolución de ácido sulfúrico 1 N. La intensidad del desarrollo de color se detectó midiendo la absorbancia a longitudes de onda de 450-650 nm.

(2) Preparación de ELISA de detección de LAM de bacilo de Koch

Se construyó el ELISA de detección de LAM de bacilo de Koch usando TB-scFv como anticuerpo de captura y anticuerpo de detección. Se preparó el ELISA de detección de LAM de bacilo de Koch de la misma manera que en el punto (1) anterior, excepto que se usó TB-scFv como anticuerpo de captura y anticuerpo de detección.

(3) Evaluación de cada ELISA de detección de LAM

Se evaluó la reactividad frente a LAM del ELISA de detección de LAM bacilar acidorresistente y del ELISA de detección de LAM de bacilo de Koch preparados en los puntos (1) y (2), respectivamente, usando LAM purificado de bacilo de Koch humano (M. tuberculosis) y LAM purificado de bacilo acidorresistente (M. avium).

La figura 6 muestra los resultados. En la figura, • indica la reactividad frente a LAM de M. tuberculosis en el ELISA de detección de LAM bacilar acidorresistente, ■ indica la reactividad frente a M. avium en el ELISA de detección de LAM bacilar acidorresistente, o indica la reactividad frente a LAM de M. tuberculosis en el ELISA de detección de LAM de bacilo de Koch y □ indica la reactividad frente a LAM de M. avium en el ELISA de detección de LAM de bacilo de Koch.

Tal como resulta evidente a partir de la figura 6, en el ELISA de detección de LAM bacilar acidorresistente pudo detectarse de manera equivalente LAM de M. tuberculosis (-■-) y LAM de M. avium (-•-). Por otra parte, en el ELISA de detección de LAM de bacilo de Koch, se confirmó que la reactividad frente a LAM de bacilo de Koch M. tuberculosis casi alcanzó un valor máximo a una concentración de 100 ng/ml con un valor de DO (450 nm) de 3 o más, mientras que casi no se mostró reactividad frente a LAM de bacilo acidorresistente M. avium ni siquiera a una concentración de 100 ng/ml.

Ejemplo 3

Evaluación de la reactividad de anticuerpos frente a LAM bacilar acidorresistente y LAM de bacilo de Koch en el ELISA de detección de LAM bacilar acidorresistente y el ELISA de detección de LAM de bacilo de Koch (uso de aislados clínicos bacilares acidorresistentes)

Se usaron el ELISA de detección de LAM bacilar acidorresistente y el ELISA de detección de LAM de bacilo de Koch construidos en el ejemplo 2 y se evaluó la reactividad de anticuerpos frente a LAM bacilar acidorresistente y LAM de bacilo de Koch usando los diversos aislados clínicos bacilares acidorresistentes mostrados en la figura 7.

Específicamente, como aislados clínicos bacilares acidorresistentes se usaron cultivos de 38 cepas de M. tuberculosis (véanse las tablas A y B de la figura 7), cultivos de 23 cepas de M. avium y cultivos de 6 cepas de M. intracellulare (véanse las tablas C y D de la figura 7). Las cepas de M. avium y las cepas de M. intracellulare son bacterias patógenas de la enfermedad por MAC. Cada aislado clínico bacilar acidorresistente se cultivó hasta la confluencia a 37°C en un medio líquido (caldo 7H9 producido por BD, que contenía enriquecimiento ADC al 10% producido por BD) y se congeló el cultivo a -80°C.

Se descongeló el cultivo congelado y luego se mezcló con una cantidad equivalente de Y-PER (reactivo de extracción de proteínas producido por Thermo), y posteriormente se calentó la mezcla durante 10 minutos a 95°C. Después de recoger las células mediante centrifugación (10.000 rpm, 10 minutos), se recogió el sobrenadante. Al sobrenadante recogido se le añadió una cantidad cuádruple de un tampón de reacción (tampón fosfato que contenía leche desnatada al 1%, BSA al 0,5%, Tween 20 al 0,05% y XL-II al 0,1%), se sometieron 100 |il de la mezcla al ELISA de detección de LAM bacilar acidorresistente y al ELISA de detección de LAM de bacilo de Koch construidos en el ejemplo 2 y se midió la reactividad de anticuerpos frente a LAM.

Los resultados de las mediciones obtenidos mediante cada ELISA se evaluaron por comparación con la reactividad de anticuerpos frente a LAM de M. tuberculosis purificado usado como patrón. La figura 7 muestra los resultados.

Tal como se muestra en la figura 7, en el ELISA de detección de LAM bacilar acidorresistente (véanse las columnas “myco” en cada tabla de la figura 7), se mostró reactividad frente a todas de las 38 cepas de M. tuberculosis, las 23 cepas de M. avium y las 6 cepas de M. intracellulare. Por otro lado, en el ELISA de detección de LAM de bacilo de Koch (véanse las columnas “TB” en cada tabla de la figura 7), se observó una elevada reactividad frente a 34 de las 38 cepas de M. tuberculosis, pero no se mostró reactividad frente a las 23 cepas de M. avium ni frente a las 6 cepas de M. intracellulare.

Tal como se mostró anteriormente, se reveló que el ELISA de detección de LAM bacilar acidorresistente construido en el ejemplo 2 tenía una alta reactividad frente a LAM bacilar acidorresistente y era capaz de detectar ampliamente LAM bacilar acidorresistente. Por otro lado, en el ELISA de detección de LAM de bacilo de Koch construido en el ejemplo 2, había una diferencia de reactividad entre las cepas y la reacción era específica en comparación con el ELISA de detección de LAM bacilar acidorresistente. Específicamente, el ELISA de detección de LAM de bacilo de Koch construido en el ejemplo 2 detectó específicamente LAM de bacilo de Koch y mostró buenos resultados con una sensibilidad del 90% y una especificidad del 100%.

A partir de los resultados anteriores, se confirmó que el ELISA de detección de LAM bacilar acidorresistente construido en el ejemplo 2 (anticuerpo de captura: Myco-Poly y anticuerpo de detección: Myco-scFv) puede detectar ampliamente LAM bacilar acidorresistente y que el ELISA de detección de LAM de bacilo de Koch construido en el ejemplo 2 (anticuerpo de captura: TB-scFv y anticuerpo de detección: TB-scFv) puede detectar específicamente LAM de bacilo de Koch de manera distintiva de LAM bacilar acidorresistente no tuberculoso.

Ejemplo 4. Construcción de métodos de inmunocromatografía de detección de LAM

Se construyeron pruebas inmunocromatográficas para la detección de LAM bacilar acidorresistente y para la detección de LAM de bacilo de Koch usando pares de anticuerpos evaluados mediante ELISA.

(1) Método de inmunocromatografía para la detección de LAM bacilar acidorresistente

Para construir una prueba inmunocromatográfica para la detección de LAM bacilar acidorresistente, se usó Myco-Poly inmovilizado sobre una membrana de nitrocelulosa como anticuerpo de captura y Myco-scFv marcado con coloide de oro como anticuerpo de detección.

Se aplicó Myco-Poly (anticuerpo de captura) a una membrana de nitrocelulosa (producida por Millipore, tiempo de flujo capilar: 240) a una concentración de 3,0 mg/ml (tampón fosfato) y se secó a 50°C durante 20 horas. Se preparó una tira inmunocromatográfica que comprendía un sustrato de nitrocelulosa y una almohadilla de absorción adherida al mismo. Se le adhirió un sello laminar y se cortó la tira resultante en una tira de 4 mm de ancho, y se usó para una prueba.

Para preparar Myco-scFv marcado con coloide de oro, se usó coloide de oro con un tamaño de 40 nm. Se añadió Myco-scFv al coloide de oro (DO = 1) a una concentración de 2,0 |ig/ml y se dejó reaccionar a temperatura ambiente durante 20 minutos. Como tampón para la unión del anticuerpo, se usó TES (ácido N-tris(hidroximetil)metil-2-aminoetanosulfónico) 2 mM (pH 7,5). Después del marcaje con coloide de oro, se realizó el bloqueo dejando que se produjera una reacción en un tampón que contenía bórax (tetraborato de sodio decahidratado) 2 mM y BSA al 1,5% (pH 9,0) a 300 rpm a temperatura ambiente durante 5 minutos. Después del bloqueo, se centrifugó a 4620 x g durante 20 minutos a 4°C y se retiró el sobrenadante del cultivo. El precipitado resultante se suspendió en una disolución de dilución de anticuerpo marcado con coloide de oro (bórax 10 mM, sacarosa al 5% y BSA al 1% (pH 9,0)) y luego se filtró a través de un filtro de 0,1 |im.

El ensayo se realizó de la siguiente manera. Después de que se diluyera una muestra de prueba que podía contener bacilos acidorresistentes con un tampón de extracción (dihidrogenofosfato de sodio dihidratado 72 mM, albúmina sérica bovina al 4,5%, caseína al 0,9%, Triton X-305 al 0,09%, azida de sodio al 0,1%, Y-PER al 10%, una cantidad adecuada de hidróxido de sodio y una cantidad adecuada de ácido clorhídrico, pH 7,0), se añadió una cantidad adecuada de disolución de anticuerpo marcado con coloide de oro. La tira preparada anteriormente se sumergió en este líquido para desarrollar la muestra de prueba. Siete minutos después del inicio del desarrollo, se retiró la tira y se lavó con un tampón fosfato que contenía un tensioactivo (Tween 20 al 0,1%) durante 8 minutos, después de lo cual se realizó la evaluación a simple vista para determinar si la muestra era positiva o negativa.

(2) Método de inmunocromatografía para la detección de LAM de bacilo de Koch

Se construyó una prueba inmunocromatográfica para la detección de LAM bacilar de la misma manera que en el método de construcción y el método de ensayo descritos anteriormente en el punto (1), excepto que se usó TB-scFv como anticuerpo de captura y anticuerpo de detección.

(3) Evaluación de cada método de inmunocromatografía para la detección de LAM

Se evaluó la reactividad frente a LAM de las pruebas inmunocromatográficas para la detección de LAM bacilar acidorresistente y para la detección de LAM de bacilo de Koch construidas en los puntos (1) y (2) usando LAM de M. tuberculosis y LAM de M. avium purificados.

La figura 8 muestra los resultados.

Se midió LAM de M. tuberculosis mediante métodos de inmunocromatografía para la detección de LAM bacilar acidorresistente y para la detección de LAM de bacilo de Koch. Se confirmó una línea a simple vista en ambas pruebas de inmunocromatografía (myco: para la detección de LAM bacilar acidorresistente; y TB: para la detección de LAM de bacilo de Koch) (figuras 8A y 8B). De la misma manera, se midió LAM de M. avium usando ambos sistemas de ensayo. Tal como se muestra en las figuras 8C y 8D, en el ensayo de inmunocromatografía para la detección de LAM bacilar acidorresistente, se confirmó a simple vista una línea comparable a la observada en el ensayo de LAM de M. tuberculosis. En cambio, en la prueba de inmunocromatografía para la detección de LAM de bacilo de Koch (TB) no se detectó ninguna línea, ni siquiera a una concentración tan alta como 1000 ng/ml (figura 8D).

Los resultados anteriores indican que el anticuerpo de cadena sencilla TB-scFv preparado usando la vacuna BCG como inmunógeno puede detectar específicamente bacilo de Koch humano (M. tuberculosis) en las pruebas de inmunocromatografía.

Tal como se muestra en los ejemplos 1 a 4, los presentes inventores han aislado con éxito un anticuerpo de cadena sencilla (scFv (TB-scFv)) que reacciona específicamente con LAM de bacilo de Koch y han establecido un sistema de inmunoensayo que puede detectar específicamente LAM de bacilo de Koch midiendo LAM con TB-scFv. El sistema de ensayo que usa TB-scFv es aplicable a ELISA y a las pruebas inmunocromatográficas, y permite un diagnóstico rápido y sencillo de la infección de tuberculosis.

[Ejemplos 5 a 121

3. Preparación de materiales

(3-1) Preparación de la vacuna BCG y del inmunógeno

Se usó una vacuna BCG liofilizada (número de autorización: 20300AMZ00767000) producida por el Japan BCG Laboratory como vacuna BCG. Para la inmunización, se usó una mezcla de 100 mg (peso húmedo) de la vacuna BCG liofilizada y 1 ml de solución salina fisiológica.

(3-2) Preparación de la biblioteca de fagos de scFv de pollo

Se inmunizó a un pollo con la vacuna BCG como inmunógeno (véase el punto (3-1) anterior y el ejemplo 6). Después de finalizar la inmunización, se extrajo el bazo del pollo y se disolvió el tejido en un medio RPMI (sin suero). Se extrajo el ARN total usando un kit de extracción de ARN (producido por Qiagen) según el manual de instrucciones. Se sintetizó el ADNc a partir del ARN total usando un kit de síntesis de ADNc (producido por Invitrogen) según el manual de instrucciones.

Los fragmentos de los genes VH y VL se amplificaron usando el ADNc sintetizado como molde y empleando los cebadores indicados en la tabla 3. Específicamente, el fragmento del gen VH se amplificó con un conjunto de cebadores Sfi1-C^K VH F y GSL-C^k VH R, mientras que el fragmento del gen VL se amplificó con un conjunto de cebadores GSL-C^k VL F y Not1-C^K VL R.

Tabla 3

Los productos de amplificación de genes obtenidos se separaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,5%. Los productos de amplificación de genes de peso molecular deseado se extrajeron del gel y se purificaron.

El producto del gen VH purificado y el producto del gen VL purificado se unieron mediante un ligadorGS (SEQ ID NO: 40). C^k VL-GSL-VH R (SEQ ID NO: 46) que tiene una secuencia homóloga al extremo 3' del producto del gen VH se mezcló con el gen VH y se realizó la PCR durante 5 ciclos para añadir el ligador GS al extremo 3' del gen VH. Del mismo modo, C^k VH-GSL-VL F (SEQ ID NO: 45) que tiene una secuencia homóloga al extremo 5' del producto del gen VL se mezcló con el gen VL y se realizó la PCR durante 5 ciclos para añadir el ligador GS al extremo 5' del gen VL. Se mezclaron el gen VH con el ligador GS añadido y el gen VL con el ligador GS añadido y se realizó la PCR durante 10 ciclos para producir un gen scFv (gen scFv de pollo) que tenía el gen VH, el gen ligador GS y el gen VL unidos. Por último, se escindió el gen scFv con las enzimas de restricción SfiI y NotI.

Posteriormente, el gen scFv tratado con las enzimas de restricción se insertó en los sitios SfiI y NotI de un vector fagémido de visualización de anticuerpos pCANTAB5E y se transformó en E. coli JM109 mediante electroporación. Se cultivó el transformante durante la noche a 37°C en medio de agar LB-Amp/Glu (medio LB con ampicilina 150 |ig/ml, glucosa al 1% y agar al 1,5%) y se recogieron todas las colonias generadas.

Después de preparar E. coli transformada en medio LB para que tuviera una absorbancia a 600 nm (DO⁶⁰⁰ nm) de 0,2, se mezcló el transformante con un fago auxiliar M13K07 (1012 ufc) y se cultivó estáticamente a 37°C durante 30 minutos, y se siguió cultivando durante la noche a 37°C en 1 l de un medio líquido LB-Amp/Kan (medio LB que contiene ampicilina 150 |ig/ml y kanamicina 100 |ig/ml) para producir una biblioteca de fagos de visualización de scFv de pollo.

Por último, la biblioteca de fagos de visualización de scFv se concentró en una disolución de PEG/NaCl y se ajustó a una concentración de aproximadamente 1 x 1012 ufc/ml con PBS, y se usó la biblioteca resultante para la bioselección. (3-3) Bioselección de antígenos usando la biblioteca de scFv de pollo

La bioselección de antígenos se realizó en cuatro etapas, que consisten en las etapas 1 a 4.

En las etapas 1 a 3, se concentraron los clones de fagos unidos a un inmunógeno (vacuna BCG). La biblioteca de fagos de visualización de scFv de pollo ajustada a una concentración de 1 x 1011 ufc/500 |il con un tampón de reacción (tampón Tris de pH 7,8 que contiene BSA al 1%, leche desnatada al 1%, NaCl 0,14 M y Tween 20 al 0,1%) (véase el punto (3-2) de “3. Preparación de materiales”) se mezcló con 1 mg de vacuna BCG y se dejó reaccionar a 25°C durante 2 horas. Después de la reacción, se recogieron las células mediante centrifugación (a 10.000 rpm durante 10 minutos) y se retiró el sobrenadante del cultivo. Después de añadir PBS a las células recogidas y mezclar, las células se recogieron de nuevo mediante centrifugación para lavar las células. La operación de lavado se realizó 5 veces. Los fagos unidos a las células se eluyeron con 500 |il de eluyente (disolución de HCl 0,1 N que contenía BSA al 0,1% y ajustada para tener un pH de 2,2 con una disolución de glicina 1 M) y se neutralizó añadiendo 500 |il de un líquido de neutralización (tampón Tris 1 M, pH 9,1). El conjunto de fagos neutralizados se infectó con E. coli JM109 y se cultivó a 37°C en medio de agar LB-Amp/Glu durante la noche; y se recogieron las colonias. Después de cultivar estáticamente E. coli transformada preparada en medio LB para que tuviera una DO ⁶⁰⁰ nm = 0,2 y un fago auxiliar M13K07 (1012 ufc) durante 30 minutos, se añadieron 100 ml de medio líquido LB-Amp/Kan y se cultivaron las células a 37°C durante la noche. El cultivo de fagos se concentró en una disolución de PEG/NaCl y se ajustó a una concentración de aproximadamente 1 x 1012 ufc/ml con un tampón fosfato. La bioselección de las células se realizó 3 veces.

En la etapa 4, se hizo reaccionar LAM de M. tuberculosis purificado con una placa con TB-scFv inmovilizado y se realizó la bioselección usando un complejo de TB-scFV y LAM. Específicamente, se añadieron 10 |ig de LAM de M. tuberculosis purificado a una microplaca que tenía TB-scFv inmovilizado sobre la misma a una concentración de 5 |ig/ml y se dejó que la reacción tuviera lugar a 25°C durante 1 hora. Después del lavado, se añadió un conjunto de fagos unidos a las células obtenidas en la etapa 3 y se dejó que la reacción avanzara a 25°C durante 2 horas. Posteriormente, se retiraron los fagos que no reaccionaron lavando 10 veces con el tampón de reacción. El fago unido al complejo de TB-scFv y LAM se eluyó con 100 |il de eluyente y luego se neutralizó añadiendo 100 |il de líquido de neutralización (tampón Tris 1 M, pH 9,1). El conjunto de fagos neutralizados se infectó con E. coli JM109 y luego se cultivó a 37°C en medio de agar LB-Amp/Glu durante la noche.

(3-4) Selección del clon de scFv de pollo de unión a LAM

Para scFv de unión a LAM, se seleccionaron clones de fagos que reaccionaron específicamente con LAM mediante ELISA de fagos. El conjunto de fagos obtenido en la etapa 4 de la bioselección de antígenos usando la biblioteca de scFv de pollo explicada en el punto (3-3) anterior se cultivó como una única colonia, y se cultivó la única colonia obtenida en 50 |il de medio LB-Amp a 37°C durante 8 horas. Después de infectar las células con 50 |il de una disolución de fago auxiliar M13K07 (1012 ufc/ml), se añadieron 400 |il de medio líquido LB-Amp/Kan y se cultivó a 37°C durante la noche para preparar un cultivo de clones de fago únicos.

Se realizó ELISA de fagos añadiendo 10 |ig de LAM de M. tuberculosis purificado a una microplaca que tenía TB-scFv inmovilizado sobre la misma a una concentración de 5 |ig/ml, dejando que se produjera una reacción a 25°C durante 1 hora para preparar un complejo de TB-scFv y LAM, y cribando los clones capaces de reaccionar con el complejo. La reacción primaria se llevó a cabo añadiendo a una placa inmovilizada con LAM 90 |il de un tampón de reacción (un tampón fosfato que contenía BSA al 1%, leche desnatada al 1% y Tween 20 al 0,05%) y 10 |il de un cultivo de fagos de visualización de scFv y dejando que la reacción avanzara a 25°C durante 1 hora. Posteriormente, los fagos que no reaccionaron se retiraron lavando 3 veces. La reacción secundaria se llevó a cabo añadiendo a la disolución de reacción primaria 100 |il de un anticuerpo de proteína p8 de fago M13 marcado con HRP y diluido 5.000 veces con el mismo tampón de reacción anterior y dejando que la reacción avanzara a 25°C durante 1 hora. Posteriormente, los anticuerpos que no reaccionaron se retiraron lavando 3 veces. Se realizó una reacción de desarrollo de color añadiendo 100 |il de una disolución de TMB a la disolución de reacción secundaria y dejando que la reacción avanzara a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después del desarrollo de color, se añadieron a la misma 100 |il de una disolución de ácido sulfúrico 1 N para detener la reacción. La detección se realizó midiendo la absorbancia (DO⁴⁵⁰-⁶⁵⁰ nm) a longitudes de onda de 450-650 nm.

El clon reactivo frente a LAM se sometió a PCR para amplificar el gen scFv y la secuencia del gen se determinó mediante el método de secuenciación directa.

(3-5) Muestras para evaluar el ELISA usando anticuerpos bivalentes

El ELISA para la detección de LAM bacilar acidorresistente y el ELISA para la detección de LAM de bacilo de Koch usando anticuerpos bivalentes se evaluaron usando aislados clínicos bacilares acidorresistentes (38 cepas de M. tuberculosis, 23 cepas de M. avium y 6 cepas de M. intracellulare), BCG, seis tipos de bacterias bucales (N. asteroides, N. farcinica, S. globisporus, C. albicans, A. israelii y T. paurometabolum) y muestras de esputo (54 muestras). La extracción de LAM de las células bacterianas cultivadas y de las muestras de esputo se realizó en las mismas condiciones. Después de añadir NaOH a cada muestra hasta una concentración final de 0,4 M y mezclar, se sometió a ebullición la mezcla durante 30 minutos. Después de la ebullición, se neutralizó la mezcla mediante la adición de un tampón fosfato.

4. E nsa yo

(4-1) Preparación del anticuerpo bivalente

El anticuerpo de cadena sencilla scFvA se modificó para convertirlo en un anticuerpo bivalente mediante un método general. Se clonaron los genes de las regiones VH y VL de Myco-scFv (SEQ ID NO: 30), TB-scFv (SEQ ID NO: 12) y G3-scFv (SEQ ID NO: 39) en vectores de expresión de células de mamífero que tenían una región constante de conejo (nombres comerciales: pFUSEss-CHIg-rG*03 y pFUSE2ss-CLIg-rk1, producidos por InvivoGen) para preparar vectores de expresión VH y VL. Los vectores de expresión VH y VL se mezclaron y transfectaron en células CHO. Después de cultivar las células transfectadas con el vector durante 4 días, se aislaron los anticuerpos bivalentes (Myco-scFv bivalente, TB-scFv bivalente y G3-scFv bivalente) y se purificaron a partir de los sobrenadantes usando proteína A (producida por Bio-Rad).

(4-2) Marcaje del anticuerpo bivalente con biotina

El marcaje con biotina de cada anticuerpo bivalente se realizó usando un kit de marcaje con Sulfo-NHS-LC-biotina de Pierce, según el manual de instrucciones que acompaña al kit. El anticuerpo marcado con biotina se usó para construir un sistema de ELISA.

(4-3) Construcción de ELISA para la detección de LAM bacilar acidorresistente usando un anticuerpo bivalente

Se construyó un ELISA para la detección de LAM bacilar acidorresistente usando anticuerpos bivalentes usando TB-scFv bivalente, G3-scFv bivalente y Myco-scFv bivalente (véase el punto (4-1) “Preparación del anticuerpo bivalente”).

El TB-scFv bivalente y el G3-scFv bivalente se mezclaron en cantidades iguales y se ajustaron a una concentración de 5 |ig/ml con un tampón fosfato. La mezcla resultante se añadió a una microplaca de 96 pocillos en una proporción de 100 |il/pocillo y se dejó que se produjera una reacción a 4°C durante la noche, tras lo cual se realizó un bloqueo en un tampón fosfato que contenía leche desnatada al 1%, produciendo así una placa de anticuerpos que tenía los anticuerpos bivalentes inmovilizados sobre la misma.

Se llevó a cabo la reacción primaria añadiendo 100 |il de una muestra diluida con un tampón de reacción (tampón Tris con BSA al 1%, leche desnatada al 1%, NaCl 0,14 M y Tween 20 al 0,1%) a los pocillos de la placa de anticuerpos mencionada anteriormente y dejando que la reacción avanzara a 25°C durante 1 hora y 30 minutos. Posteriormente, se lavó la placa 3 veces. La reacción secundaria se llevó a cabo añadiendo a la disolución de reacción primaria 100 |il de Myco-scFv bivalente marcado con biotina y diluido 5.000 veces con el mismo tampón de reacción anterior y dejando que la reacción avanzara a 25°C durante 1 hora y 30 minutos. Posteriormente, se retiraron los anticuerpos sin reaccionar lavando 3 veces. La reacción terciaria se realizó añadiendo a la disolución de reacción secundaria 100 |il de HRP marcada con avidina diluida 10.000 veces con el mismo tampón de reacción anterior y dejando que la reacción avanzara a 25°C durante 1 hora y 30 minutos. Posteriormente, se retiró la HRP marcada con avidina que no había reaccionado lavando 3 veces. Se llevó a cabo una reacción de desarrollo de color añadiendo 100 |il de una disolución de TMB a la disolución de reacción terciaria y dejando que la reacción avanzara a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después del desarrollo de color, se añadieron 100 |il de una disolución de ácido sulfúrico 1 N para detener la reacción. La detección se realizó midiendo la absorbancia (DO^450-650 nm) a longitudes de onda de 450­ 650 nm.

(4-4) Construcción de ELISA para la detección de LAM de bacilo de Koch usando anticuerpos bivalentes

Se construyó un ELISA para la detección de LAM de bacilo de Koch usando anticuerpos bivalentes de la misma manera que el ELISA para la detección de LAM bacilar acidorresistente descrito en el punto (4-3), excepto que se usó TB-scFv bivalente como anticuerpo de captura y Myco-scFv bivalente marcado con biotina como anticuerpo de detección.

Ejemplo 5. Inmunización de pollos y evaluación del título de anticuerpos de antisuero de pollo contra LAM

Se llevó a cabo la inmunización de pollos mediante la inmunización subcutánea de una cantidad completa de una vacuna BCG (100 mg de peso húmedo / 1 ml de solución salina fisiológica) preparada mediante el método descrito en el punto (3-1) de “3. Preparación de materiales”. La inmunización se realizó 4 veces a intervalos de 14 días y el título de anticuerpos en la sangre de pollo se evaluó mediante ELISA.

Se ajustó LAM purificado de bacilo de Koch humano M. tuberculosis (derivado de la cepa Aoyama B, Nacalai Tesque) o LAM purificado de M. avium (derivado de la cepa del serotipo B, Nacalai Tesque) con PBS a una concentración de 100 |il/ml. Se añadió a una microplaca de 96 pocillos en una cantidad de 100 ^l/pocillo y se dejó reaccionar a 4°C durante la noche, y se realizó el bloqueo en un tampón fosfato que contenía leche desnatada al 1% para preparar una placa de antígenos.

La reacción primaria se realizó añadiendo 100 |il de suero de pollo diluido con un tampón de reacción (tampón Tris de pH 7,8 que contenía BSA al 1%, leche desnatada al 1%, NaCI 0,14 M y Tween 20 al 0,1%) a cada pocilio de la placa de antígenos y dejando que la reacción avanzara a 25°C durante 1 hora. Posteriormente, los anticuerpos que no reaccionaron se retiraron lavando 3 veces. La reacción secundaria se realizó añadiendo a la disolución de reacción primaria 100 |il de anticuerpo anti-IgY de pollo marcada con HRP y diluida 5.000 veces con el mismo tampón de reacción y dejando que la reacción avanzara a 25°C durante 1 hora. Posteriormente, se retiraron los anticuerpos que no habían reaccionado lavando 3 veces. Se realizó una reacción de desarrollo de color añadiendo 100 |il de disolución de TMB y dejando que la reacción avanzara a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después del desarrollo de color, la reacción se detuvo añadiendo 100 |il de disolución de ácido sulfúrico 1 N. La detección se realizó midiendo la absorbancia a longitudes de onda de 450-650 nm (DO^450-650 nm).

Los resultados se muestran en la figura 9. En la figura, “-■-” representa la reactividad del antisuero de pollo frente a LAM de M. tuberculosis purificado y “- • - ” representa la reactividad del antisuero de pollo frente a LAM de M. avium purificado. Tal como se muestra en la figura 9, se confirmó que la inmunización de los pollos con la vacuna BCG había aumentado suficientemente el título de anticuerpos contra LAM. Además, se observó una reactividad similar tanto frente a LAM de bacilo de Koch como frente a lAm bacilar acidorresistente.

Ejemplo 6. Preparación de scFv (anticuerpo de cadena sencilla) de pollo contra LAM

(1) Preparación de scFv (anticuerpo de cadena sencilla) de pollo contra LAM

Se aisló un anticuerpo de cadena sencilla scFv de las células del bazo de un pollo inmunizado con la vacuna BCG. Específicamente, según el método descrito en el punto (3-2) de “3. Preparación de materiales”, se preparó ARN total a partir del bazo de un pollo y se realizó la PCR usando ADNc sintetizado a partir del mismo como molde y los diversos cebadores descritos en la tabla 3 para preparar productos de amplificación del gen VH y productos de amplificación del gen VL. A continuación, se prepararon anticuerpos de cadena sencilla de pollo (gen VH/ligador GS/gen VL), cada uno de los cuales tenía el gen VH y el gen VL unidos mediante un ligador GS (SEQ ID NO: 40), y se produjeron bibliotecas de fagos de visualización de scFv a partir de los mismos. Como el título de cada biblioteca era de aproximadamente 106 ufc, se supone que cada biblioteca tenía una diversidad de 106.

Usando las bibliotecas de fagos de visualización de scFv preparadas, se realizó la bioselección 3 veces con la vacuna BCG. Con el fin de aislar un anticuerpo de cadena sencilla scFv que reconoce un epítopo diferente al de TB-scFv, para la cuarta selección se usó un complejo formado a través de una reacción de LAM de M. tuberculosis (derivado de la cepa Aoyama B) con TB-scFv que se ha inmovilizado sobre una microplaca. Se dejó reaccionar una disolución de LAM de M. tuberculosis en una microplaca que tenía TB-scFv inmovilizado sobre la misma, se lavó la microplaca 3 veces, se añadió a la misma un conjunto de fagos de selección de BCG y se dejó que la reacción avanzara a 25°C durante 2 horas. Después de la reacción, se lavó la microplaca 3 veces y se eluyeron los fagos de unión a LAM. Finalmente, se seleccionaron al azar 200 clones de cada grupo de selección y se realizó el cribado de clones reactivos frente a LAM usando un complejo de TB-scFv y LAM. Se obtuvieron aproximadamente 10 clones reactivos frente a LAM de cada una de las bibliotecas. Como resultado del análisis de las secuencias de bases, se confirmó que las secuencias de los clones obtenidos de cada biblioteca eran casi idénticas.

Como resultado, se aisló con éxito un único clon de anticuerpo de cadena sencilla scFv (G3-scFv) de una biblioteca de fagos de visualización de scFv preparada a partir del bazo del pollo inmunizado con la vacuna BCG. La figura 10 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 39) del anticuerpo de cadena sencilla G3-scFv aislado de una biblioteca de bazo de pollo, junto con las posiciones de las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena pesada, el ligador GS y las regiones CDR1, CDR2 y CDR3 de la región variable de cadena ligera.

(2) Reactividad frente a LAM de scFv (anticuerpo de cadena sencilla) de pollo

Se evaluó la reactividad del G3-scFv producido tal como se describió anteriormente usando una placa sobre la que se había inmovilizado LAM purificado de M. tuberculosis y una placa sobre la que se había inmovilizado LAM purificado de M. avium. Específicamente, se solubilizó G3-scFv según el método descrito en el punto (1-6) de “1. Preparación de materiales” para preparar G3-scFv solubilizado. A continuación, se llevó a cabo el marcaje con biotina según el método descrito en el mismo punto (1-7) y se evaluó la reactividad frente a las placas de antígenos (placas de microtitulación inmovilizadas con LAM purificado), es decir, una placa que tenía LAM purificado de M. tuberculosis inmovilizado sobre la misma y una placa que tenía LAM purificado de M. avium inmovilizado sobre la misma, mediante un ensayo con el método ELISA.

Como resultado, G3-scFv mostró una reactividad similar tanto frente a LAM de bacilo de Koch como frente a LAM bacilar acidorresistente. A partir de este resultado, se consideró que el anticuerpo de cadena sencilla G3-scFv de pollo es un anticuerpo que tiene reactividad frente a LAM bacilar acidorresistente en general, incluyendo LAM de bacilo de Koch.

Ejemplo 7. Construcción de ELISA de detección de LAM usando anticuerpos bivalentes

Con la intención de poner la presente invención en uso práctico, se modificaron tres tipos de anticuerpos de cadena sencilla scFv (Myco-svFv, TB-scFv y G3-scFv) producidos en los ejemplos 1 y 6 para dar anticuerpos bivalentes según el método descrito en el punto (4-1) de “Preparación de anticuerpos bivalentes”, y se construyeron dos tipos de ELISA, ELISA de detección de LAM bacilar acidorresistente y ELISA de detección de LAM de bacilo de Koch, basados en la especificidad de reacción de los anticuerpos bivalentes. Específicamente, para el ELISA de detección de LAM bacilar acidorresistente, se mezclaron TB-scFv bivalente y G3-scFv bivalente y se inmovilizaron sobre una placa como anticuerpos de captura, y se usó Myco-scFv bivalente que se había marcado con biotina como anticuerpo de detección. Para el ELISA de detección de LAM de bacilo de Koch, se inmovilizó TB-scFv bivalente sobre una placa como anticuerpo de captura y se usó Myco-scFv bivalente marcado con biotina como anticuerpo de detección. Los detalles se describen en los puntos (4-3) y (4-4) de “4. Ensayo”.

La evaluación del ELISA de detección de LAM bacilar acidorresistente y del ELISA de detección de LAM de bacilo de Koch construidos se llevó a cabo sometiendo a ensayo el LAM extraído de células bacterianas de BCG cultivadas (figura 11). Como resultado, tal como se muestra en la figura 11, tanto en el ELISA de detección de LAM bacilar acidorresistente (-■-) como en el ELISA de detección de LAM de bacilo de Koch (-•-), fue posible detectar LAM de BCG con una sensibilidad equivalente.

Ejemplo 8. Evaluación de la sensibilidad de detección del ELISA de detección de LAM usando anticuerpos bivalentes

Con el fin de llevar a cabo la evaluación de la sensibilidad del ELISA usando anticuerpos bivalentes, se diluyeron las células bacterianas de BCG cultivadas en una serie de desde 106 ufc/ml hasta 61 ufc/ml, y se usó una porción de cada una de las disoluciones de dilución para extraer ADN genómico para realizar una prueba de amplificación de ácidos nucleicos (NAAT) y se usó otra porción de la misma para extraer LAM para realizar el ELISA de detección de LAM bacilar acidorresistente.

El resultado del ELISA de detección de LAM bacilar acidorresistente se muestra en la figura 12. Tal como se muestra en la tabla de la figura 12, la sensibilidad de detección de la prueba de amplificación de ácidos nucleicos (NAAT) fue de aproximadamente 500 ufc/ml, mientras que la sensibilidad de detección del ELISA de detección de LAM bacilar acidorresistente fue de aproximadamente 250 ufc/ml. Una secuencia repetitiva que es una diana de la prueba de amplificación de ácidos nucleicos es diferente según la cepa bacteriana en cuanto al número de repeticiones, y se dice que la sensibilidad de detección puede ser diferente según la cepa bacteriana. Aunque la sensibilidad de la prueba genética era baja, ya que la secuencia repetitiva en el BCG es pequeña, se dice que una cepa bacteriana que tiene una secuencia repetitiva grande generalmente da lugar a una sensibilidad de detección de 100 ufc/ml.

Con el resultado descrito anteriormente, se ha demostrado que el ELISA de detección de LAM bacilar acidorresistente de la presente invención usando anticuerpos bivalentes es un método de inmunoensayo de muy alta sensibilidad con una sensibilidad de detección que es equivalente o superior a la de la prueba de amplificación de ácidos nucleicos.

Ejemplo 9. Prueba de reactividad cruzada del ELISA de detección de LAM usando anticuerpos bivalentes

En las bacterias bucales, hay especies que tienen un antígeno de membrana con una estructura similar al componente de LAM. Cuando va a detectarse LAM bacilar acidorresistente y LAM de bacilo de Koch en una muestra de esputo, la reactividad cruzada con estas bacterias bucales resulta muy problemática, y éste es uno de los obstáculos para establecer un inmunoensayo de detección de bacilos acidorresistentes y bacilos de Koch usando esputo.

En este caso, con el fin de examinar la reactividad cruzada con las bacterias bucales en el ELISA de detección de LAM, se prepararon cultivos líquidos de cada una de las bacterias N. asteroides (abreviada como “Na”), N. farcinica (abreviada como “Nf”), S. globisporus (abreviada como “Sg”), C. albicans (abreviada como “Ca”), A. israelii (abreviada como “Ai”) y T. paurometabolum (abreviada como “Tp”). Los cultivos líquidos se ajustaron a 106 ufc/ml y 108 ufc/ml (107 ufc/ml sólo en el caso de Ca) y de ellos se extrajeron LAM como en las células bacterianas de BCG cultivadas para someterse a ensayo en el ELISA de detección de LAM. La figura 13 muestra el resultado del ELISA de detección de LAM bacilar acidorresistente.

Tal como puede entenderse a partir de la figura 13, aunque la reactividad del BCG usado como control había alcanzado un valor máximo a una concentración de 105 ufc/ml, cada una de las bacterias bucales no mostraba ninguna reactividad a niveles de alta concentración de células bacterianas de 108 ufc/ml. Se observó un resultado completamente idéntico con el ELISA de detección de LAM de bacilo de Koch.

Los resultados descritos anteriormente han demostrado que los anticuerpos de cadena sencilla scFv (Myco-svFv, TB-scFv y G3-scFv) que se han obtenido tienen una alta afinidad por LAM bacilar acidorresistente y LAM de bacilo de Koch, y que es posible detectar bacilos acidorresistentes (incluyendo bacilo de Koch) a una sensibilidad tan alta como la de una prueba de amplificación de ácidos nucleicos combinando estos anticuerpos como un anticuerpo bivalente, y que se han proporcionado un ensayo y anticuerpos que son muy selectivos y específicos sin ninguna reactividad cruzada con las bacterias bucales.

Ejemplo 10. Evaluación del ELISA de detección de LAM usando anticuerpos bivalentes con aislados clínicos Con el uso de aislados clínicos bacilares acidorresistentes, se evaluó el ELISA de detección de LAM bacilar acidorresistente y el ELISA de detección de LAM de bacilo de Koch usando anticuerpos bivalentes.

Como aislados clínicos, se usaron 38 cepas de M. tuberculosis, 23 cepas de M. avium y 6 cepas de M. intracellulare. Las cepas de M. avium y las cepas de M. intracellulare son bacterias patógenas para la enfermedad por MAC. Se extrajeron LAM de las células bacterianas cultivadas de éstas y se realizó un ELISA de detección de LAM bacilar acidorresistente y un ELISA de detección de LAM de bacilo de Koch usando anticuerpos bivalentes. Los resultados se muestran en la figura 14.

En la figura 14, “A” muestra los resultados del ELISA de detección de LAM bacilar acidorresistente (barra negra) y del ELISA de detección de LAM de bacilo de Koch (barra blanca) realizados en las 38 cepas de aislados clínicos de bacilos de Koch (M. tuberculosis). “B” muestra los resultados del ELISA de detección de lA m bacilar acidorresistente (barra negra) y del ELISA de detección de LAM de bacilo de Koch (barra blanca) realizados en las 29 cepas de bacilos acidorresistentes no tuberculosos (23 cepas de M. avium y 6 cepas de M. intracellulare).

Tanto en el ELISA de detección de LAM bacilar acidorresistente como en el ELISA de detección de LAM de bacilo de Koch, se observó reactividad en todas de las 38 cepas de M. tuberculosis, las 23 cepas de M. avium y las 6 cepas de M. intracellulare. Aunque el ELISA de detección de LAM bacilar acidorresistente mostró una reacción equivalente para los bacilos de Koch y los bacilos acidorresistentes no tuberculosos, el ELISA de detección de LAM de bacilo de Koch mostró una baja reactividad frente a los bacilos acidorresistentes no tuberculosos.

Con el fin de diferenciar los bacilos de Koch de los bacilos acidorresistentes no tuberculosos únicamente a partir del resultado del ELISA de detección de LAM, se calculó una razón (valor del ELISA de detección de LAM bacilar acidorresistente / valor del ELISA de detección de LAM de bacilo de Koch) del valor del ELISA de detección de LAM bacilar acidorresistente y el valor del ELISA de detección de LAM de bacilo de Koch (figura 15). Como resultado, con el bacilo de Koch, de las 38 cepas, sólo hubo 1 cepa que tenía una razón de los dos valores de medición superior a 3 veces. Por otro lado, con los bacilos acidorresistentes no tuberculosos, 23 de las 29 cepas tuvieron una razón de 3 veces o superior.

El resultado descrito anteriormente indica que el ELISA de detección de LAM puede detectar LAM casi sin verse afectado por las diferencias entre cepas. Además, se ha demostrado que, calculando la razón (valor del ELISA de detección de LAM bacilar acidorresistente / valor del ELISA de detección de LAM de bacilo de Koch) de ambos sistemas de ensayo, es posible diferenciar (distinguir) los bacilos de Koch de los bacilos acidorresistentes no tuberculosos con una excelente puntuación del 97% de sensibilidad y el 80% de especificidad, y que el método de la presente invención es el primer sistema de inmunoensayo del mundo como ELISA de detección de LAM “capaz de detectar bacilos acidorresistentes en general y también distinguir bacilos de Koch de bacilos acidorresistentes no tuberculosos”.

Ejemplo 11. Evaluación del ELISA de detección de LAM usando anticuerpos bivalentes con muestras clínicas de esputo

Con el fin de evaluar la capacidad del ELISA de detección de LAM usando anticuerpos bivalentes construidos en el ejemplo 7, la evaluación se realizó usando muestras clínicas de esputo de 54 casos. La evaluación se llevó a cabo mediante una prueba de frotis directa (Frotis) y la prueba de amplificación de ácidos nucleicos (NAAT). Los resultados de la prueba de frotis directa y de la prueba de amplificación de ácidos nucleicos se resumen en la tabla 4.

Tabla 4

Frotis NAAT Número de muestras

3+ 11

2+ 4

1+ 18

Escaso 9

Escaso - 1

- 3

- - 8

De la prueba de frotis directa, hubo 43 casos positivos (3+, 2+, 1+, escaso); y de la prueba de amplificación de ácidos nucleicos, hubo 45 casos positivos (+). De estos casos, 42 casos fueron positivos en ambas pruebas, 8 casos fueron negativos en ambas pruebas y 3 casos fueron positivos sólo en la prueba de amplificación de ácidos nucleicos.

Se extrajeron LAM de las muestras clínicas de esputo y se analizaron con el ELISA de detección de LAM bacilar acidorresistente y el ELISA de detección de LAM de bacilo de Koch, y los resultados de cada uno de ellos se muestran en la tabla 5 y la figura 16. La tabla 5 muestra las tasas de detección del ELISA de detección de LAM bacilar acidorresistente y del ELISA de detección de LAM de bacilo de Koch juntas.

Tabla 5

ELISA de LAM (n)

NAAT Frotis Número de muestras

Bacilos acidorresistentes Bacilos de Koch

3+ 11 100% (11/11) 100% (11/11)

2+ 4 100% (4/4) 100% (4/4)

1+ 18 100% (18/18) 100% (18/18)

Escaso 9 100% (9/9) 89% (8/9)

- 3 100% (3/3) 100% (3/3)

- Escaso 1 0% (0/1) 0% (0/1)

- - 8 0% (0/8) 0% (0/8)

Tal como se muestra en la tabla 5, los resultados del ELISA de detección de LAM bacilar acidorresistente y del ELISA de detección de bacilo de Koch fueron casi idénticos. En los grupos en los que se confirmó una puntuación de 1+ o superior en cuanto al número de células bacterianas en la prueba de frotis, la reactividad en el ELISA había alcanzado el valor máximo en la mayoría de los muestras. Incluso en el caso de “escaso”, en el que el número de células bacterianas era pequeño, la reactividad en el ELISA había alcanzado el valor máximo en el 50% de los muestras. Además, incluso en 3 casos que tenían un número de células bacterianas muy pequeño y se determinaron como positivos sólo en la prueba de amplificación de ácidos nucleicos, se obtuvieron valores más altos en todos ellos que en las muestras que se determinaron como negativas en la prueba de amplificación de ácidos nucleicos. Con el ELISA de detección de LAM bacilar acidorresistente, aunque se detectó LAM en todas las muestras que se determinaron positivas en la prueba de amplificación de ácidos nucleicos, no puedo detectarse LAM ni siquiera en un solo caso de las muestras que se determinaron negativas en la prueba de amplificación de ácidos nucleicos. Por tanto, la sensibilidad y la especificidad del ELISA de detección de bacilos acidorresistentes coincidieron en el 100% en comparación con la prueba de amplificación de ácidos nucleicos. Todos los casos coincidieron con el de la prueba de amplificación de ácidos nucleicos también en el ELISA de detección de LAM de bacilo de Koch, salvo que un caso determinado como positivo en la prueba de amplificación de ácidos nucleicos y “escaso” en la prueba de frotis no coincidió con el resultado de la prueba de amplificación de ácidos nucleicos. Además, el único caso que no coincidió estaba sólo ligeramente por debajo de un valor de punto de corte.

Los resultados descritos anteriormente indican que el ELISA de detección de LAM de la presente invención es una prueba capaz de cribar y seleccionar pacientes infectados por bacilos acidorresistentes con una sensibilidad y especificidad equivalentes a la prueba de amplificación de ácidos nucleicos.

A continuación, con el fin de confirmar que existe una correlación entre el valor del ELISA de detección de LAM y la cantidad de bacterias, se llevó a cabo una medición por dilución.

Las disoluciones de extracción de las muestras de esputo se diluyeron 5 veces, 25 veces y 125 veces, las disoluciones diluidas se sometieron a ensayo junto con LAM purificado, que se usó como preparación convencional, y se calcularon las concentraciones de LAM en las mismas. El resultado se muestra en la figura 17.

Las muestras se dividieron en grupos (I: negativo tanto en la prueba de amplificación de ácidos nucleicos como en la prueba de frotis, II: positivo en la prueba de amplificación de ácidos nucleicos y negativo en la prueba de frotis, III: positivo en la prueba de amplificación de ácidos nucleicos y “escaso” en la prueba de frotis, IV: 1+ en la prueba de frotis, V: 2+ en la prueba de frotis, VI: 3+ en la prueba de frotis) usando la prueba de amplificación de ácidos nucleicos y la cantidad de bacterias basada en la de frotis, y se compararon con la concentración de LAM (pg/ml). Como resultado, tal como se muestra en la figura 17, dado que el valor promedio de la concentración de LAM aumenta desde el grupo con una pequeña cantidad de bacterias hacia el grupo con una gran cantidad de bacterias (I a VI), se muestra que existe una correlación positiva entre la cantidad de bacterias y la concentración de LAM. A partir del resultado descrito anteriormente, se demostró que la cantidad de bacterias puede predecirse mediante la cuantificación de la concentración de LAM.

Estos resultados han demostrado que el método de la presente invención tiene una sensibilidad y especificidad equivalentes a las de la prueba de amplificación de ácidos nucleicos y que es una prueba capaz de determinar adicionalmente la cantidad de bacterias, y se ha comprobado que el método es aplicable para el seguimiento terapéutico, etc., de la tuberculosis.

Ejemplo 12. Evaluación de la estabilidad de LAM

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Anticuerpo monoclonal capaz de unirse a lipoarabinomanano bacilar acidorresistente, comprendiendo dicho anticuerpo monoclonal una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera unidas mediante un ligador, comprendiendo la región variable de cadena pesada las cadenas pesadas CDR1 a CDR3 mostradas en (a) a (c) a continuación y comprendiendo las cadenas ligeras CDR1 a CDR3 mostradas en (d) a (f) a continuación:

(a) una CDR1 de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1, (b) una CDR2 de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, (c) una CDR3 de cadena pesada que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3, (d) una CDR1 de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 4, (e) una CDR2 de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 5, y (f) una CDR3 de cadena ligera que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 6.

2. Anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo monoclonal consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 12.

3. Anticuerpo monoclonal según la reivindicación 1, que es un anticuerpo monovalente o bivalente.

4. Método para determinar el efecto curativo de la tuberculosis de un medicamento antituberculoso, que comprende las etapas de:

(1) poner en contacto el anticuerpo monoclonal según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 con ambas de las muestras de prueba antes y después de la administración del medicamento antituberculoso;

(2) someter a ensayo el lipoarabinomanano de bacilo de Koch en las muestras de prueba antes y después de la administración del medicamento antituberculoso usando una reacción de unión entre el anticuerpo monoclonal y el lipoarabinomanano de bacilo de Koch como índice; y

(3) determinar que el medicamento antituberculoso tiene efecto curativo de la tuberculosis cuando se detecta lipoarabinomanano de bacilo de Koch en la muestra de prueba antes de la administración del medicamento antituberculoso y cuando no se detecta lipoarabinomanano de bacilo de Koch en la muestra de prueba después de la administración del medicamento antituberculoso.

5. Método para determinar el efecto curativo de la tuberculosis de un medicamento antituberculoso, que comprende las etapas de:

(1) poner en contacto el anticuerpo monoclonal según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 con ambas de las muestras de prueba antes y después de la administración del medicamento antituberculoso;

(2) cuantificar el lipoarabinomanano de bacilo de Koch en las muestras de prueba antes y después de la administración del medicamento antituberculoso usando una reacción de unión entre el anticuerpo monoclonal y el lipoarabinomanano de bacilo de Koch como índice; y

(3) comparar la cantidad de lipoarabinomanano de bacilo de Koch en la muestra de prueba después de la administración del medicamento antituberculoso (medición posterior a la administración) con la cantidad de lipoarabinomanano de bacilo de Koch en la muestra de prueba antes de la administración del medicamento antituberculoso (medición previa a la administración); y

determinar que el medicamento antituberculoso tiene efecto curativo de la tuberculosis cuando la medición posterior a la administración es inferior a la medición previa a la administración, y determinar que el medicamento antituberculoso no tiene efecto curativo de la tuberculosis cuando la medición posterior a la administración no es inferior a la medición previa a la administración.

6. Kit que comprende el anticuerpo monoclonal según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el kit es adecuado para:

- determinar el efecto curativo de la tuberculosis de un medicamento antituberculoso,

- detectar el lipoarabinomanano bacilar acidorresistente, en el que el anticuerpo monoclonal según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 actúa como reactivo de detección de lipoarabinomanano bacilar acidorresistente, o

- diagnosticar la tuberculosis, en el que el anticuerpo monoclonal según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 actúa como reactivo de detección de la tuberculosis.

7. Método para detectar un bacilo acidorresistente, que comprende las siguientes etapas:

(1) poner en contacto el anticuerpo monoclonal según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en un estado inmovilizado con una muestra biológica del sujeto; y

(2) retirar las sustancias no unidas; añadir el anticuerpo monoclonal según una cualquiera de 1 a 3 para permitir la reacción con las bacterias en la sustancia generada en la etapa (1); y someter a ensayo el bacilo acidorresistente en la muestra biológica usando una reacción de unión entre el anticuerpo monoclonal y el lipoarabinomanano bacilar acidorresistente como índice, en el que se detecta un complejo de anticuerpo monoclonal - bacilo acidorresistente - anticuerpo monoclonal generado en la reacción.

8. Método según la reivindicación 7, que detecta específicamente el bacilo de Koch entre los bacilos acidorresistentes.

9. Método según la reivindicación 8, que es un método para distinguir un bacilo de Koch de un bacilo acidorresistente no tuberculoso.

10. Reactivo de detección de lipoarabinomanano bacilar acidorresistente que comprende el anticuerpo monoclonal según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

11. Reactivo de diagnóstico de la tuberculosis que comprende el anticuerpo monoclonal según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

12. Método para medir el lipoarabinomanano de bacilo de Koch en una muestra de prueba, que comprende las etapas de:

(1) poner en contacto el anticuerpo monoclonal según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 con la muestra de prueba que puede contener un bacilo acidorresistente; y

(2) someter a ensayo el lipoarabinomanano de bacilo de Koch en la muestra de prueba usando una reacción de unión entre el anticuerpo monoclonal y el lipoarabinomanano bacilar acidorresistente como índice.

13. Método según la reivindicación 12, que es un método de calificación de lipoarabinomanano bacilar acidorresistente que comprende detectar el lipoarabinomanano de bacilo de Koch como etapa (2), o es un método de cuantificación de lipoarabinomanano de bacilo de Koch que comprende cuantificar el lipoarabinomanano bacilar acidorresistente como etapa (2).

14. Herramienta de detección de bacilo de Koch, que comprende una pieza de absorción de disolución formada a partir de un material capaz de transferir una muestra de prueba a través de acción capilar, comprendiendo la pieza de absorción de disolución:

(1) una parte de recogida de muestra para absorber y recoger la muestra de prueba,

(2) una parte de anticuerpo marcado que soporta un anticuerpo monoclonal marcado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que reacciona específicamente con el lipoarabinomanano bacilar acidorresistente,

(3) una parte de determinación que incluye una parte de visualización del resultado de la prueba (a) que tiene inmovilizado sobre la misma un anticuerpo monoclonal no marcado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que reacciona específicamente con el lipoarabinomanano bacilar acidorresistente, y

(4) una parte de absorción de disolución para absorber la disolución restante de la muestra de prueba que se ha movido a través de la parte de recogida de muestra, la parte de anticuerpo marcado y la parte de determinación.

15. Herramienta de detección de bacilo de Koch según la reivindicación 14, en la que la parte de determinación (3) comprende además una parte de visualización de control (b) que tiene inmovilizado sobre la misma un anticuerpo no marcado que reacciona con el anticuerpo monoclonal marcado según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, estando la parte de visualización de control dispuesta aparte de la parte de visualización del resultado de la prueba (a).