ES2865268T3

ES2865268T3 - Composiciones y métodos para la edición eficaz de genes en E. coli utilizando sistemas de ARN guía/endonucleasa CAS en combinación con moldes de modificación de polinucleótido circulares

Info

Publication number: ES2865268T3
Application number: ES15816605T
Authority: ES
Inventors: Ryan Frisch; Ethel Jackson
Original assignee: DuPont US Holding LLC
Current assignee: DuPont US Holding LLC
Priority date: 2014-12-17
Filing date: 2015-12-02
Publication date: 2021-10-15
Anticipated expiration: 2035-12-02
Also published as: CA2971391C; CN107250363A; KR20170087959A; MX2017007907A; MX391646B; WO2016099887A1; AU2015363113A1; EP3234117A1; US20170369866A1; JP2017538422A; CN107250363B; EP3234117B1; BR112017012765A2; DK3234117T3; KR102424626B1; AU2015363113B2; CA2971391A1; JP6839082B2

Abstract

Un método para editar una secuencia diana en el genoma de una célula de Escherichia coli, comprendiendo dicho método proporcionar al menos una construcción de ADN recombinante que comprende una secuencia de ADN que codifica un ARN guía y un molde de modificación de polinucleótidos circular a una célula de E. coli que comprende una secuencia de ADN de endonucleasa Cas9 unida operativamente a un promotor inducible, en el que dicha secuencia de ADN de endonucleasa Cas9 codifica una endonucleasa Cas9, en el que el ARN guía y la endonucleasa Cas9 pueden formar un complejo de ARN guía/endonucleasa Cas9 (RGEN) que es capaz de mediar en la ruptura de la secuencia diana para permitir la edición de genes mediada por recombinación homóloga en un sitio diana en el genoma de dicha célula de E. coli, en el que dicho molde de modificación de polinucleótidos comprende al menos una modificación de nucleótidos de dicha secuencia diana.

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones y métodos para la edición eficaz de genes en E. coli utilizando sistemas de ARN guía/endonucleasa CAS en combinación con moldes de modificación de polinucleótido circulares

Campo de la invención

La invención se refiere al campo de la biología molecular bacteriana, en particular, a composiciones y métodos para editar una secuencia de nucleótidos en el genoma de Escherichia coli.

Antecedentes

Una forma de comprender la función de un gen dentro de un organismo es inhibir su expresión. La inhibición de la expresión génica se puede lograr, por ejemplo, interrumpiendo o delecionando la secuencia de ADN del gen, lo que da como resultado un "knock-out" (inactivación) del gen (Austin etal., Nat. Genetics, 36:921-924). La inactivación de genes se ha llevado a cabo principalmente mediante recombinación homóloga (HR), una técnica aplicable a una amplia gama de organismos, desde bacterias hasta mamíferos. Otra forma de estudiar la función de los genes puede ser mediante el "knock-in" genético (reemplazo o desbloqueo), que también suele ser realizado por HR. Se ha demostrado que la HR para la localización de genes mejora cuando el sitio de ADN diana contiene una ruptura bicatenaria (Rudin et al., Genetics, 122:519-534; Smih et al., Nucl. Acids Res., 23:5012-5019). Por lo tanto, se han desarrollado estrategias para introducir rupturas bicatenarias para facilitar la localización de ADN mediada por HR. Por ejemplo, se han modificado nucleasas con dedos de zinc para romper sitios de ADN específicos, lo cual conduce a niveles aumentados de HR en el sitio cuando está presente un ADN molde de modificación de polinucleótidos (Bibikova et al., Science, 300:764; Bibikova et al., Mol. Cell. Biol., 21:289-297). De manera similar, también se han desarrollado meganucleasas artificiales (endonucleasas autodirigidas) y nucleasas efectoras de tipo activador de la transcripción (TALE) para su uso en la localización de ADN mediada por HR (Epinat et al., Nucleic Acids Res., 31:2952-2962; Miller et a l, Nat. Biotech., 29:143-148).

Se han descubierto loci que codifican los sistemas de ruptura del ADN CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas) exclusivamente en aproximadamente 40% de los genomas bacterianos y la mayoría de los genomas de arqueas (Horvath y Barrangou, Science, 327:167-170; Karginov y Hannon, Mol. Cell, 37:7-19). En particular, se ha desarrollado la endonucleasa guiada por ARN (RGEN) asociada a CRISPR (Cas), Cas9, del sistema de CRIPSR de tipo II como un medio para introducir roturas de cadenas de ADN específicas del sitio que estimulan la HR (solicitud provisional de EE.UU. n.° 61/868.706, presentada el 22 de agosto de 2013). La secuencia del componente de ARN de Cas9 se puede diseñar de manera que Cas9 reconozca y rompa el ADN que contiene (i) una secuencia complementaria con una porción del componente de ARN y (ii) una secuencia de motivo adyacente a protoespaciador (PAM).

Los complejos de ARN nativo/Cas9 comprenden dos secuencias de ARN, un ARN de CRISPR (ARNcr) y un ARN de CRISPR transactivador (ARNtracr). Un ARNcr contiene, en la dirección 5' a 3', una secuencia exclusiva complementaria con un sitio de ADN diana y una porción de una secuencia codificada por una región de repetición del locus de CRISPR del que se derivó el ARNcr. Un ARNtracr contiene, en la dirección 5' a 3', una secuencia que se hibrida con la región de repetición del ARNcr y una porción que contiene el bucle de tallo. Un trabajo reciente ha conducido al desarrollo de ARN guía (ARNg), que son secuencias quiméricas que contienen, en la dirección 5' a 3 ', un ARNcr unido a un ARNtracr (solicitud de patente de EE.UU. n.° 14/463.687, presentada el 20 de agosto de 2014).

La tecnología del ADN recombinante ha permitido modificar secuencias de ADN en el genoma de un organismo, alterando así el fenotipo del organismo. Aunque se han desarrollado varias estrategias para dirigirse a un sitio específico para la modificación en el genoma de un organismo, como E. coli, todavía existe la necesidad de métodos más eficientes y eficaces para editar una secuencia de nucleótidos en el genoma de una célula de Escherichia coli.

Sumario

La presente descripción incluye composiciones y métodos para la modificación del genoma de una secuencia diana en el genoma de una célula de Escherichia coli. Los métodos y composiciones emplean un sistema de ARN guía/endonucleasa Cas (también conocido como RGEN) en combinación con un molde de modificación de polinucleótidos circular para proporcionar un sistema eficaz para editar sitios diana dentro del genoma de una célula de Escherichia coli. Los métodos y composiciones también emplean un sistema de endonucleasa de ARN/Cas guía en combinación con un ADN donante circular para proporcionar un sistema eficaz para la modificación “knock-in” de genes en una célula de Escherichia coli.

En una realización de la descripción, el método comprende un método para editar una secuencia diana en el genoma de una célula de Escherichia coli, y el método comprende proporcionar al menos una construcción de ADN recombinante que comprende una secuencia de ADN que codifica un ARN guía y un molde de modificación de polinucleótidos circular a una célula de E. coli que comprende una secuencia de ADN de endonucleasa Cas9 unida operativamente a un promotor inducible, en el que dicha secuencia de ADN de endonucleasa Cas9 codifica una endonucleasa Cas9, en el que el ARN guía y la endonucleasa Cas9 pueden formar un complejo de ARN guía/endonucleasa Cas9 (RGEN) que es capaz de mediar en la ruptura de la secuencia diana para permitir la edición de genes mediada por recombinación homologa en un sitio diana en el genoma de dicha célula de E. coli, en el que dicho molde de modificación de polinucleótidos comprende al menos una modificación de nucleótidos de dicha secuencia diana. La secuencia diana en el genoma de una célula de E. coli se puede seleccionar del grupo que consiste en una secuencia de promotor, una secuencia de terminación, una secuencia de elemento regulador, una secuencia codificadora, un profago, un pseudogén, un gen exógeno, un gen endógeno. La construcción de ADN recombinante que comprende una secuencia de ADN que codifica un ARN guía puede proporcionarse mediante un plásmido circular. La construcción de ADN recombinante y el molde de modificación de polinucleótidos circular se pueden proporcionar cada uno en plásmidos separados. La construcción de ADN recombinante y el molde de modificación de polinucleótidos circular se pueden proporcionar en un solo plásmido. La construcción de ADN recombinante y el molde de polinucleótidos circular se pueden proporcionar mediante un medio seleccionado del grupo que consiste en electroporación, choque térmico, transporte por fagos, apareamiento, conjugación y transducción. El sitio diana en el genoma de la célula de E. coli puede estar flanqueado por una primera región genómica y una segunda región genómica, en el que el molde de polinucleótidos circular comprende además una primera región de homología con dicha primera región genómica y una segunda región de homología con dicha segunda región genómica.

En una realización, la célula de E. coli no expresa una proteína recombinasa exógena, una proteína RecET, una proteína de rojo lambda o un inhibidor de RecBCD.

En una realización de la descripción, el método comprende un método para producir una célula de E. coli mutante galK, comprendiendo el método: a) proporcionar al menos una construcción de ADN recombinante circular que comprende una secuencia de ADN que codifica un ARN guía y al menos un molde de modificación de polinucleótidos circular a una célula de E. coli que comprende una secuencia de ADN de endonucleasa Cas9 unida operativamente a un promotor inducible, en el que dicha secuencia de ADN de endonucleasa Cas9 codifica una endonucleasa Cas que es capaz de introducir una ruptura bicatenaria en un sitio diana dentro de una secuencia genómica galK en el genoma de E. coli, en el que dicho molde de modificación de polinucleótidos circular comprende al menos una modificación de nucleótido de dicha secuencia genómica galK ; b) cultivar las células de la progenie de la célula de E. coli de (a); c) evaluar las células de la progenie de (b) para la presencia de dicha al menos una modificación de nucleótido.

En una realización de la descripción, el método comprende un método para editar una secuencia diana en el genoma de una célula de Escherichia coli, comprendiendo el método proporcionar al menos una primera construcción de ADN recombinante que comprende una secuencia de ADN que codifica un ARN guía, un molde de modificación de polinucleótidos circular y una segunda construcción de ADN recombinante que comprende una secuencia de ADN que codifica la endonucleasa Cas9 unida operativamente a un promotor inducible, a una célula de E. coli, en el que la endonucleasa Cas9 introduce una ruptura bicatenaria en un sitio diana en el genoma de dicha célula de E. coli, en el que dicho molde de modificación de polinucleótidos comprende al menos una modificación de nucleótido de dicha secuencia diana. La primera construcción de ADN recombinante, la segunda construcción de ADN recombinante y el molde de modificación de polinucleótidos circular se pueden proporcionar cada uno en plásmidos separados. La primera construcción de ADN recombinante, la segunda construcción de ADN recombinante y el molde de modificación de polinucleótidos circular se pueden proporcionar en un solo plásmido.

Breve descripción de los dibujos y secuencias

Figura 1. Uso de un plásmido circular (plásmido molde) que comprende un molde de modificación de polinucleótidos para la edición de genes de una diana nativa en células de E. coli que comprenden un plásmido Cas9. El esquema ilustra una célula de E. coli que contiene una diana nativa para ser editada (ubicada en el genoma de E. coli diana) y un plásmido de Cas9 que comprende un módulo de expresión de Cas9 dirigido por un promotor inducible (por ejemplo, Pbad). El molde de modificación de polinucleótidos que contiene la edición deseada (mostrada con una estrella blanca) de la secuencia diana nativa (mostrada como una barra negra) flanqueada por dos regiones homólogas (HR1 y HR2, que permiten la recombinación homóloga) se proporciona a células de E. coli (en las cuales se indujo la expresión de la endonucleasa Cas9) mediante el plásmido molde, junto con un plásmido de ARN guía que comprende el módulo de expresión de ARN guía capaz de expresar un ARN guía (ARNg). Las células de E. coli inducidas son capaces de expresar la endonucleasa Cas9 y formar un complejo de ARN guía/endonucleasa Cas9 (también denominado RGEN) que es capaz de mediar en la ruptura de la secuencia diana nativa, permitiendo la edición de genes mediada por recombinación homóloga.

Figura 2. Uso de un plásmido circular (plásmido molde) que comprende un molde de modificación de polinucleótidos para la edición de genes de una diana nativa en células de E. coli que carecen de un plásmido de Cas9. El esquema ilustra una célula de E. coli que contiene un promotor de una secuencia diana nativa para ser editada (ubicada en el genoma de E. coli diana). El molde de modificación de polinucleótidos que contiene la edición deseada (mostrada con una estrella blanca) de la secuencia diana nativa (mostrada como una barra negra) flanqueada por dos regiones homólogas (HR1 y HR2, que permiten la recombinación homóloga) se proporciona a células de E. coli a través del plásmido molde, junto con un plásmido de ARN guía (que comprende el módulo de expresión del ARN guía) y un plásmido de Cas9 (que comprende un módulo de expresión inducible de Cas9 dirigido por un Pbad). Una vez las células de E. coli son inducidas, las células inducidas son capaces de expresar la endonucleasa Cas9 y formar un complejo de ARN guía/endonucleasa Cas9 (también denominado RGEN) que es capaz de mediar en la ruptura de la secuencia diana nativa, permitiendo la edición de genes mediada por recombinación homóloga.

La Figura 3 muestra un único polinucleótido guía que contiene un dominio de reconocimiento de endonucleasa Cas (CER) (negro) unido al dominio de localización variable (VT) (gris).

La Figura 4 muestra un gel de SDS-PAGE de la expresión de Cas9 de pRF48 en células de E. coli antes y después de una inducción con arabinosa. Los pesos de los marcadores se indican en kilodaltons (kDa). Se indica la banda correspondiente a Cas9 en el gel (Cas9).

La Figura 5 ilustra el gen galKde E. coli (negro). Los cuatro sitios diana nativos en ga lK se indican mediante flechas etiquetadas con el nombre del sitio diana, y la dirección de la flecha indica la cadena directa o inversa del ADN diana.

La Figura 6 muestra un gel de agarosa de ADN de una PCR de colonias del locus galK de E. coli resistente a galactosa después de la edición de genes con el complejo de ARN guía/endonucleasa Cas9 (RGEN). Cada carril corresponde a una colonia individual resistente a la galactosa. Los pesos de los marcadores se dan en kilobases (kb). El tamaño de la edición deseada (deleción) se indica junto a la banda. También se indica el tamaño del alelo sin editar (WT). Se ejecutan dos reacciones de control (WT y pRF113) en el gel para indicar el WT y el alelo editado, respectivamente.

Tabla 1

Descripción detallada

Como se usa en el presente documento, el término "descripción" o "descripción divulgada" no pretende ser limitante, sino que se aplica en general a cualquiera de las descripciones definidas en las reivindicaciones o descritas en el presente documento. Estos términos y expresiones se usan indistintamente en este documento.

Se proporcionan composiciones y métodos para la modificación del genoma de una secuencia diana en el genoma de una célula de Escherichia coli. Los métodos y composiciones emplean un sistema de ARN guía/endonucleasa Cas en combinación con un molde de modificación de polinucleótidos circular para proporcionar un sistema eficaz para editar sitios diana dentro del genoma de una célula de Escherichia coli.

El uso de un plásmido circular (plásmido molde) que comprende un molde de modificación de polinucleótidos para la edición de genes de una diana nativa en las células de E. coli que comprenden un plásmido Cas9 se ilustra en la Figura 1 y se describe en el presente documento. El esquema ilustra una célula de E. coli que contiene una diana nativa para ser editada (ubicada en el genoma de E. coli diana) y un plásmido de Cas9 que comprende un módulo de expresión de Cas9 dirigido por un promotor inducible (por ejemplo, Pbad). El molde de modificación de polinucleótidos que contiene la edición deseada (mostrada con una estrella blanca) de la secuencia diana nativa (mostrada como una barra negra) flanqueada por dos regiones homólogas (HR1 y HR2, que permiten la recombinación homóloga) se proporciona a células de E. coli (en las cuales se indujo la expresión de la endonucleasa Cas9) mediante el plásmido molde, junto con un plásmido de ARN guía que comprende el módulo de expresión de ARN guía capaz de expresar un ARN guía (ARNg). Las células de E. coli inducidas son capaces de expresar la endonucleasa Cas9 y formar un complejo de ARN guía/endonucleasa Cas9 (también denominado RGEN) que es capaz de mediar en la ruptura de la secuencia diana nativa, permitiendo la edición de genes mediada por recombinación homóloga.

El uso de un plásmido circular (plásmido molde) que comprende un molde de modificación de polinucleótidos para la edición de genes de una diana nativa en las células de E. coli que carecen de un plásmido de Cas9 se ilustra en la Figura 2 y se describe en el presente documento. El esquema ilustra una célula de E. coli que contiene una secuencia diana nativa para ser editada (ubicada en el genoma de E. coli diana). El molde de modificación de polinucleótidos que contiene la edición deseada (mostrada con una estrella blanca) de la secuencia diana nativa (mostrada como una barra negra) flanqueada por dos regiones homólogas (HR1 y HR2, que permiten la recombinación homóloga) se proporciona a células de E. coli a través del plásmido molde, junto con un plásmido de ARN guía (que comprende el módulo de expresión de ARN guía) y un plásmido de Cas9 (que comprende un módulo de expresión inducible de Cas9 dirigido por un Pbad). Una vez que las células de E. coli son inducidas, las células inducidas son capaces de expresar la endonucleasa Cas9 y formar un complejo de ARN guía/endonucleasa Cas9 (también denominado RGEN) que es capaz de mediar en la ruptura de la secuencia diana nativa, permitiendo la edición de genes mediada por recombinación homóloga.

También se puede usar un plásmido circular que comprende un ADN donante que comprende un polinucleótido de interés para la modificación “knock-in” de genes en E. coli como se describe en este documento.

El término "CRISPR" (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas) se refiere a ciertos loci genéticos que codifican factores de sistemas de ruptura de ADN de clase I, II o III, por ejemplo, utilizados por células bacterianas y arqueas para destruir ADN extraño (Horvath y Barrangou, Science, 327:167-170). Los componentes de los sistemas CRISPR se aprovechan en este documento, de una manera heteróloga, para la localización de ADN en las células.

Las expresiones "sistema CRISPR de tipo II" y "sistema CRISPR-Cas de tipo II" se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a un sistema de ruptura de ADN que utiliza una endonucleasa Cas9 en un complejo con al menos un componente de ARN. Por ejemplo, una Cas9 puede estar en complejo con un ARN de CRISPR (ARNcr) y un ARN de CRISPR transactivador (ARNtracr). En otro ejemplo, una Cas9 puede estar en complejo con un ARN guía. Por tanto, ARNcr, ARNtracr y ARN guía son ejemplos no limitantes de componentes de ARN en este documento.

La expresión endonucleasa asociada a CRISPR ("Cas") en este documento se refiere a una proteína Cas codificada por un gen Cas. Una endonucleasa Cas, cuando forma un complejo con un componente de ARN adecuado, es capaz de romper la totalidad o parte de una secuencia diana de ADN específica. Por ejemplo, es capaz de introducir una ruptura bicatenaria en una secuencia diana de ADN específica; como alternativa, se puede caracterizar por ser capaz de romper una o ambas cadenas de una secuencia diana de ADN específica. Una endonucleasa Cas puede desenrollar el dúplex de ADN en la secuencia diana y romper al menos una cadena de ADN, mediada por el reconocimiento de la secuencia diana por un ARNcr o a Rn guía que forma un complejo con Cas. Tal reconocimiento y corte de una secuencia diana por una endonucleasa Cas ocurre típicamente si el motivo adyacente al protoespaciador (PAM) correcto se localiza en el extremo 3' de la secuencia diana de ADN, o adyacente a este. Como alternativa, una proteína Cas de la presente puede carecer de actividad de corte o mella del ADN, pero aún puede unirse específicamente a una secuencia diana de ADN cuando forma un complejo con un componente de ARN adecuado. Una proteína Cas preferida en la presente es Cas9.

"Cas9" (anteriormente denominada Cas5, Csn1 o Csx12) en este documento se refiere a una endonucleasa Cas de un sistema CRISPR de tipo II que forma un complejo con ARNcr y ARNtracr, o con un ARN guía, para reconocer y romper específicamente toda o parte de una secuencia diana de ADN. La proteína Cas9 comprende un dominio de nucleasa RuvC y un dominio de nucleasa HNH (H-N-H), cada uno de los cuales rompe una sola cadena de ADN en una secuencia diana (la acción concertada de ambos dominios conduce a la ruptura de la doble cadena del ADN, mientras que la actividad de un dominio conduce a una mella). En general, el dominio RuvC comprende los subdominios I, II y III, en el que el dominio I está ubicado cerca del extremo N-terminal de Cas9 y los subdominios II y III están ubicados en el medio de la proteína, flanqueando el dominio HNH (Hsu et al., Cell, 157:1262-1278). "Apo-Cas9" se refiere a Cas9 que no forma complejo con un componente de ARN. Apo-Cas9 puede unirse al ADN, pero lo hace de manera no específica y no puede romper el ADN (Sternberg et al., Nature, 507:62-67).

El término ARN de CRISPR (ARNcr) en el presente documento se refiere a una secuencia de ARN que puede formar un complejo con una o más proteínas Cas (por ejemplo, Cas9) y proporciona especificidad de unión al ADN al complejo. Un ARNcr proporciona especificidad de unión al ADN ya que contiene un "dominio de localización variable" (VT) que es complementario con una cadena de una secuencia diana de ADN. Un ARNcr comprende además una "secuencia de repetición" ("secuencia de apareamiento de ARNtracr") codificada por una región de repetición del locus CRISPR del que se derivó el ARNcr. Una secuencia de repetición de un ARNcr puede asociarse con la secuencia en el extremo 5' de un ARNtracr. El ARNcr en sistemas CRISPR nativos se deriva de un "pre-ARNcr" transcrito a partir de un locus de CRISPR. Un pre-ARNcr comprende regiones espaciadoras y regiones de repetición; las regiones espaciadoras contienen una secuencia exclusiva complementaria con una secuencia de sitio diana de ADN. El pre-ARNcr en sistemas nativos se procesa en múltiples ARNcr diferentes, cada uno con una secuencia guía junto con una porción de secuencia de repetición. Los sistemas CRISPR utilizan ARNcr, por ejemplo, para la especificidad de la localización del ADN.

El término "ARN de CRISPR transactivador" (ARNtracr) en este documento se refiere a un ARN no codificador utilizado en sistemas CRISPR de tipo II, y contiene, en la dirección 5' a 3', (i) una secuencia que se asocia a la región de repetición de ARNcr de CRISPR tipo II y (ii) una porción que contiene una estructura de tallo-bucle (Deltcheva et al., Nature 471: 602-607).

Opcionalmente, se puede utilizar un "ADN de CRISPR" (ADNcr) en lugar de un componente de ARN. Un ADNcr tiene una secuencia de ADN que corresponde a la secuencia de un ARNcr como se describe en este documento. Un ADNcr se puede utilizar con un ARNtracr en un complejo de ADNcr/ARNtracr, que a su vez se puede asociar con un componente de proteína RGEN. La solicitud de EE. UU. n.° 61/953.090 describe el ADNcr y los métodos de su uso en la localización de ADN mediado por RGEN. Se contempla que cualquier descripción en este documento con respecto a un ARNcr puede aplicarse de manera similar al uso de un ADNcr, en consecuencia. Por tanto, en las realizaciones de la presente que incorporan un ADNcr, una "endonucleasa guiada por ARN" (RGEN) podría denominarse en su lugar un complejo que comprende al menos una proteína Cas y al menos un ADNcr.

Como se usa en el presente documento, el término "polinucleótido guía" se refiere a una secuencia de polinucleótido que puede formar un complejo con una endonucleasa Cas y que permite que la endonucleasa Cas reconozca y, opcionalmente, rompa un sitio diana de ADN. El polinucleótido guía puede ser una molécula simple o una molécula doble. La secuencia del polinucleótido guía puede ser una secuencia de ARN, una secuencia de ADN o una combinación de las mismas (una secuencia de combinación de ARN-ADN). Opcionalmente, el polinucleótido guía puede comprender al menos una modificación de nucleótido, de enlace fosfodiéster o de unión, tal como, entre otros, ácido nucleico bloqueado (LNA), 5-metil dC, 2,6-diaminopurina, 2'-fluoro A, 2'-Fluoro U, 2'-O-metil ARN, enlace fosforotioato, unión a una molécula de colesterol, unión a una molécula de polietilenglicol, unión a una molécula espaciadora 18 (cadena de hexaetilenglicol) o enlace covalente 5' a 3' que produce una circularización.

Un polinucleótido guía que comprende únicamente ácidos ribonucleicos también se denomina "ARN guía". El ARN guía puede formar un complejo con una endonucleasa Cas, denominado complejo de ARN guía/endonucleasa Cas (también conocido como RGEN). Las expresiones "ARN guía" (ARNg) y "ARN guía único" (ARNgu) se utilizan indistintamente en el presente documento. Un ARNg en este documento puede referirse a una secuencia quimérica que contiene un ARNcr operativamente unido a un ARNtracr. Como alternativa, un ARNg puede referirse a una fusión sintética de un ARNcr y un ARNtracr, por ejemplo. Un ARNg también se puede caracterizar en términos de tener un dominio de localización variable seguido de un dominio de reconocimiento de endonucleasa Cas (CER). Un dominio CER puede comprender una secuencia de apareamiento de ARNtracr seguida de una secuencia de ARNtracr.

El polinucleótido guía puede ser una molécula doble (también denominada polinucleótido guía dúplex) que comprende un primer dominio de secuencia de nucleótidos (denominado dominio de localización variable o dominio VT, “Variable Targeting domain”) que es complementario con una secuencia de nucleótidos en un ADN diana, y un segundo dominio de secuencia de nucleótidos (denominado dominio de reconocimiento de endonucleasa Cas o dominio CER) que interactúa con un polipéptido de endonucleasa Cas. El dominio CER del polinucleótido guía de molécula doble comprende dos moléculas separadas que se hibridan a lo largo de una región de complementariedad. Las dos moléculas separadas pueden ser ARN, ADN y/o secuencias de combinación de ARN-ADN. En algunas realizaciones, la primera molécula del polinucleótido guía dúplex que comprende un dominio VT unido a un dominio CER ("nucleótido cr") se denomina "ADNcr" (cuando está compuesto por un tramo contiguo de nucleótidos de ADN) o "ARNcr" (cuando está compuesto por un tramo contiguo de nucleótidos de ARN), o "ADN-ARNcr" (cuando está compuesto por una combinación de nucleótidos de ADN y ARN). En algunas realizaciones, la segunda molécula del polinucleótido guía dúplex que comprende un dominio c Er se denomina "ARNtracr" (cuando está compuesto por un tramo contiguo de nucleótidos de ARN) o "ADNtracr" (cuando está compuesto por un tramo contiguo de nucleótidos de ADN) o "ADN-ARNtracr" (cuando está compuesto por una combinación de nucleótidos de ADN y ARN).

El polinucleótido guía también puede ser una molécula única que comprende un primer dominio de secuencia de nucleótidos (denominado dominio de localización variable o dominio VT, Figura 3) que es complementario con una secuencia de nucleótidos en un ADN diana, y un segundo dominio de nucleótidos (denominado dominio de reconocimiento de endonucleasa Cas o dominio CER, Figura 3) que interactúa con un polipéptido de endonucleasa Cas. Por "dominio" se entiende un tramo contiguo de nucleótidos que puede ser ARN, ADN y/o una secuencia de combinación de ARN-ADN. El dominio VT y/o el dominio CER de un polinucleótido guía único puede comprender una secuencia de ARN, una secuencia de ADN o una secuencia de combinación de ARN-ADN. En algunas realizaciones, el polinucleótido guía único comprende un nucleótido cr (que comprende un dominio VT unido a un dominio CER) unido a un nucleótido tracr (que comprende un dominio CER), en el que el enlace es una secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia de ARN, una secuencia de ADN o una secuencia de combinación de ARN-ADN. El polinucleótido guía único que está compuesto por secuencias de nucleótido cr y nucleótido tracr puede denominarse "ARN guía único" (cuando está compuesto por un tramo contiguo de nucleótidos de ARN) o "ADN guía único" (cuando está compuesto por un tramo contiguo de nucleótidos de ADN) o "ADN-ARN guía único" (cuando está compuesto por una combinación de nucleótidos de ARN y ADN).

Por tanto, un polinucleótido guía y una endonucleasa Cas de tipo II en determinadas realizaciones pueden formar un complejo entre sí (denominado "complejo de polinucleótido guía/endonucleasa Cas" o también denominado "sistema de polinucleótido guía/endonucleasa Cas"), en el que el complejo de polinucleótido guía/endonucleasa Cas puede dirigir la endonucleasa Cas para que se dirija a un sitio diana genómico en una célula (por ejemplo, célula vegetal), permitiendo opcionalmente que la endonucleasa Cas introduzca una ruptura de monocatenaria o bicatenaria en el sitio diana genómico. Un complejo de polinucleótido guía/endonucleasa Cas se puede unir al menos a un CPP, en el que dicho complejo es capaz de unirse y, opcionalmente, crear una ruptura monocatenaria o bicatenaria en un sitio diana de una célula (por ejemplo, una célula vegetal).

La expresión "dominio de localización variable" o "dominio VT" se usa indistintamente en este documento y se refiere a una secuencia de nucleótidos que es complementaria con una cadena (secuencia de nucleótidos) de un sitio diana de ADN bicatenario. El porcentaje de complementación entre el primer dominio de secuencia de nucleótidos (dominio VT) y la secuencia diana puede ser al menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59% , 60%, 61%, 62%, 63%, 63%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%. El dominio diana variable puede tener al menos 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleótidos de longitud. En algunas realizaciones, el dominio de localización variable comprende un tramo contiguo de 12 a 30 nucleótidos. El dominio de localización variable puede estar compuesto por una secuencia de ADN, una secuencia de ARN, una secuencia de ADN modificada, una secuencia de ARN modificada (véanse, por ejemplo, las modificaciones descritas en el presente documento) o cualquier combinación de las mismas.

Las expresiones "dominio de reconocimiento de endonucleasa Cas" o "dominio CER" de un polinucleótido guía se usan indistintamente en este documento y se refieren a una secuencia de nucleótidos (tal como un segundo dominio de secuencia de nucleótidos de un polinucleótido guía) que interacciona con un polipéptido de endonucleasa Cas. Un dominio CER puede estar compuesto por una secuencia de ADN, una secuencia de ARN, una secuencia de ADN modificada, una secuencia de ARN modificada (véanse, por ejemplo, las modificaciones descritas en el presente documento) o cualquier combinación de las mismas.

Las expresiones "endonucleasa guiada por ARN", "RGEN", "complejo de ARN guía/endonucleasa Cas", "sistema de ARN guía/endonucleasa Cas" se pueden usar indistintamente en este documento y se refieren a un complejo que comprende al menos una proteína (Cas) asociada a CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas) y al menos un componente de ARN. Las expresiones "componente de proteína de un RGEN" y "componente de proteína de RGEN" se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a una proteína Cas, que es, o que forma parte, del componente de endonucleasa de un RGEN. Un componente de proteína en determinadas realizaciones puede ser una endonucleasa completa (por ejemplo, Cas9); dicho componente de proteína se puede denominar, como alternativa, "el componente de endonucleasa" de un RGEN. Un RGEN en el presente documento típicamente tiene actividad de localización de ADN específica, dada su asociación con al menos un componente de ARN.

La expresión "componente de ARN" en este documento se refiere a un componente de ARN de un RGEN que contiene una secuencia de ácido ribonucleico que es complementaria con una cadena de una secuencia diana de ADN. Esta secuencia complementaria se denomina en el presente documento una "secuencia guía" o una secuencia de "dominio de localización variable" (figura 3). Los ejemplos de componentes de ARN adecuados en la presente incluyen ARNcr y ARN guía. Los componentes de ARN en determinadas realizaciones (por ejemplo, ARN guía solo, ARNcr ARNtracr) pueden hacer que un RGEN sea competente para dirigirse al ADN específico.

Brevemente, un componente de ARN de un RGEN contiene una secuencia que es complementaria con una secuencia de ADN en una secuencia de sitio diana. Sobre la base de esta complementariedad, un RGEN puede reconocer y romper específicamente una secuencia de sitio diana de ADN particular. Un RGEN de la presente puede comprender una o más proteínas Cas y uno o más componentes de ARN adecuados de cualquiera de los cuatro sistemas CRISPR conocidos (Horvath y Barrangou, Science, 327:167-170), tal como un sistema CRISPR de tipo I, II o III. Un RGEN en realizaciones preferidas comprende una endonucleasa Cas9 (sistema CRISPR II) y al menos un componente de ARN (por ejemplo, un ARNcr y ARNtracr, o un ARNg).

Un componente de proteína RGEN puede referirse a una proteína Cas, tal como Cas9. Los ejemplos de proteínas Cas adecuadas incluyen una o más endonucleasas Cas de sistemas CRISPR de tipo I, II o III (Bhaya et al., Annu. Rev. Genet., 45: 273-297). Una proteína Cas de CRISPR de tipo I puede ser una proteína Cas3 o Cas4, por ejemplo. Una proteína Cas de CRISPR de tipo II puede ser una proteína Cas9, por ejemplo. Una proteína Cas de CRISPR de tipo III puede ser una proteína Cas10, por ejemplo. Se usa una proteína Cas9 en ciertas realizaciones preferidas. Una proteína Cas en determinadas realizaciones puede ser una proteína bacteriana o de arquea. Las proteínas Cas de CRISPR de tipo I-III de la presente invención son típicamente de origen procariótico; las proteínas Cas de tipo I y III pueden derivarse de especies bacterianas o de arqueas, mientras que las proteínas Cas de tipo II (es decir, una Cas9) pueden derivarse de especies bacterianas, por ejemplo. En otras realizaciones, las proteínas Cas adecuadas incluyen una o más de Casi, CaslB, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9, Cas10, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, sus homólogos o versiones modificadas.

En otros aspectos de la descripción descrita, una proteína Cas en este documento puede ser de cualquiera de los siguientes géneros: Aeropyrum, Pyrobaculum, Sulfolobus, Archaeoglobus, Haloarcula, Methanobacteriumn, Methanococcus, Methanosarcina, Methanopyrus, Pyrococcus, Picrophilus, Thernioplasnia, Corynebacterium, Mycobacterium, Streptomyces, Aquifromusphymus, Thermaclorium, Porbacterium, Termocopias, Termocopias, Termocopias, Thermocisterium, Porflobario Fusobacterium, Azarcus, Chromobacterium, Neisseria, Nitrosomonas, Desulfovibrio, Geobacter, Myrococcus, Campylobacter, Wolinella, Acinetobacter, Erwinia, Escherichia, Legionella, Methylococcus, Pastecurella, Photobacterium, Salmonella, Ycoanthomonas o Thermotoga. Como alternativa, una proteína Cas de la presente puede estar codificada, por ejemplo, por cualquiera de las SEQ ID NO:462-465, 467-472, 474-477, 479-487, 489-492, 494-497, 499-503, 505-508, 510-516 o 517-521, como se describe en la solicitud de EE.UU. publicada n.22010/0093617.

Un componente de proteína de RGEN puede comprender una secuencia de aminoácidos de Cas9, por ejemplo. Un RGEN que comprende este tipo de componente de proteína típicamente se puede caracterizar por tener Cas9 como componente de endonucleasa del RGEN. La secuencia de aminoácidos de una proteína Cas9 en este documento, así como algunas otras proteínas Cas en este documento, pueden derivarse de una especie de Streptococcus (por ejemplo, S. pyogenes, S. pneumoniae, S. thermophilus, S. agalactiae, S. parasanguinis, S. oralis, S. salivarius, S. macacae, S. dysgalactiae, S. anginosus, S. constellatus, S. pseudoporcinus, S. mutans), Listeria (por ejemplo, L. innocua), Spiroplasma (por ejemplo, S. apis, S. syrphidicola), Peptostreptococcaceae, Atopobium, Porphyromonas (por ejemplo, P. catoniae), Prevotella (por ejemplo, P. intermedia), Veillonella, Treponema (por ejemplo, T. socranskii, T. denticola), Capnocytophaga, Finegoldia (por ejemplo, F. magna), Coriobacteriaceae (por ejemplo, C. bacteria), Olsenella (por ejemplo, O. profusa), Haemophilus (por ejemplo, H. sputorum, H. pittmaniae), Pasteurella (por ejemplo, P. bettyae), Olivibacter (por ejemplo, O. sitiensis), Epilithonimonas (por ejemplo, E. tenax), Mesonia (por ejemplo, M. mobilis), Lactobacillus, Bacillus (por ejemplo, B. cereus), Aquimarina (por ejemplo, A. muelleri), Chryseobacterium (por ejemplo, C. palustre), Bacteroides (por ejemplo, B. graminisolvens), Neisseria (por ejemplo, N. meningitidis), Francisella (por ejemplo, F. novicida), o Flavobacterium (por ejemplo, F. frigidarium, F. soli), por ejemplo. Se prefiere una Cas9 de S. pyogenes en ciertos aspectos de la presente. Como otro ejemplo, una proteína Cas9 puede ser cualquiera de las proteínas Cas9 descritas en Chylinski etal. (RNA Biology, 10:726-737).

Por consiguiente, la secuencia de una proteína Cas9 en este documento puede comprender, por ejemplo, cualquiera de las secuencias de aminoácidos de Cas9 descritas en GenBank n.os de registro G3ECR1 (S. thermophilus), WP_026709422, WP_027202655, WP_027318179, WP_027347504, WP_027376815, WP_027414302, WP_027821588, WP_027886314, WP_027963583, WP_028123848, WP_028298935, Q03JI6 (S. thermophilus), EGP66723, EGS38969, EGV05092, EHI65578 (S. pseudoporcinus), EIC75614 (S. oralis), EID22027 (S. constellatus), EIJ69711, EJP22331 (S. oralis), EJP26004 (S. anginosus), EJP30321, EPZ44001 (S. pyogenes), EPZ46028 (S. pyogenes), EQL78043 (S. pyogenes), EQL78548 (S. pyogenes), ERL10511, ERL12345, ERL19088 (S. pyogenes), ESA57807 (S. pyogenes), ESA59254 (S. pyogenes), ESU85303 (S. pyogenes), ETS96804, UC75522, EGR87316 (S. dysgalactiae), EGS33732, EGV01468 (S. oralis), EHJ52063 (S. macacae), EID26207 (S. oralis), EID33364, EIG27013 (S. parasanguinis), EJF37476, EJO19166 (Streptococcus sp. BS35b), EJU16049, EJU32481, YP_006298249, ERF61304, ERK04546, ETJ95568 (S. agalactiae), TS89875, ETS90967 (Streptococcus sp. SR4), ETS92439, EUB27844 (Streptococcus sp. BS21), AFJ08616, EUC82735 (Streptococcus sp. CM6), EWC92088, EWC94390, EJP25691, YP_008027038, YP_008868573, AGM26527, AHK22391, AHB36273, Q927P4, G3ECR1 o Q99ZW2 (S. pyogenes). Puede usarse una variante de cualquiera de estas secuencias de la proteína Cas9, pero debe tener actividad de unión específica y, opcionalmente, actividad de ruptura o mella hacia el ADN cuando se asocia con un componente de ARN de la presente. Tal variante puede comprender una secuencia de aminoácidos que sea al menos aproximadamente 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de la Cas9 de referencia.

Como alternativa, una proteína Cas9 de la presente puede estar codificada por las SEQ ID NO:1-2, por ejemplo. Como alternativa también, una proteína Cas9 puede comprender una secuencia de aminoácidos que sea al menos aproximadamente 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a cualquiera de las secuencias de aminoácidos anteriores, por ejemplo. Tal proteína Cas9 variante debería tener actividad de unión específica y, opcionalmente, actividad de ruptura o mella, hacia el ADN cuando se asocia con un componente de ARN de la presente.

El origen de una proteína Cas utilizada en este documento (por ejemplo, Cas9) puede ser de la misma especie de la que se derivan los componentes de ARN, o puede ser de una especie diferente. Por ejemplo, un RGEN que comprende una proteína Cas9 derivada de una especie de Streptococcus (por ejemplo, S. pyogenes o S. thermophilus) puede formar complejos con al menos un componente de ARN que tiene una secuencia (por ejemplo, secuencia de repetición de ARNcr, una secuencia de ARNtracr) derivada de la misma especie de Streptococcus. Como alternativa, el origen de una proteína Cas usada en este documento (por ejemplo, Cas9) puede ser de una especie diferente de la que se derivan los componentes de ARN (la proteína Cas y los componentes de ARN pueden ser heterólogos entre sí); tales RGEN de Cas/componentes de ARN heterólogos deben tener actividad de localización de ADN.

La determinación de la actividad de unión y/o la actividad endonucleolítica de una proteína Cas en este documento hacia una secuencia de ADN diana específica puede evaluarse mediante cualquier ensayo adecuado conocido en la técnica, tal como se describe en la patente de EE. UU. n.° 8697359. Se puede hacer una determinación, por ejemplo, expresando una proteína Cas y un componente de ARN adecuado en una célula, y luego examinando el sitio diana de ADN predicho para detectar la presencia de un indel (una proteína Cas, en este ensayo en particular, normalmente tendría una actividad endonucleolítica completa [actividad de ruptura bicatenaria]). El examen de la presencia de una alteración/modificación (por ejemplo, un indel) en el sitio diana predicho podría realizarse mediante un método de secuenciación de ADN o infiriendo la formación de una alteración/modificación ensayando la pérdida de función de la secuencia diana, por ejemplo.

En otro ejemplo más, la actividad de la proteína Cas se puede determinar usando un ensayo in vitro en el que se mezclan una proteína Cas y un componente de ARN adecuado junto con un polinucleótido de ADN que contiene una secuencia diana adecuada. Este ensayo puede usarse para detectar la unión (por ejemplo, desplazamiento de gel) por proteínas Cas que carecen de actividad de ruptura, o la ruptura por proteínas Cas que son endonucleolíticamente competentes.

Una proteína Cas de la presente, tal como Cas9, puede comprender además una secuencia de localización nuclear (NLS) heteróloga en ciertos aspectos. Una secuencia de aminoácidos de NLS heteróloga en el presente documento puede tener una potencia suficiente para dirigir la acumulación de una proteína Cas, o un complejo de proteína Cas-CPP, en una cantidad detectable en el núcleo de una célula en el presente documento, por ejemplo. Una NLS puede comprender una secuencia corta (monopartita) o más (por ejemplo, bipartita) (por ejemplo, de 2 a 20 residuos) de restos básicos cargados positivamente (por ejemplo, lisina y/o arginina), y puede ubicarse en cualquier parte de una secuencia de aminoácidos de Cas, pero de manera que quede expuesta en la superficie de la proteína. Una NLS puede estar unida operativamente al N-terminal o al C-terminal de una proteína Cas en la presente, por ejemplo. Se pueden unir dos o más secuencias NLS a una proteína Cas, por ejemplo, tal como en los extremos N- y C-terminales de una proteína Cas. Los ejemplos no limitantes de secuencias NLS adecuadas en este documento incluyen las descritas en las patentes de EE. UU. n.os 6660830 y 7309576 (por ejemplo, la tabla 1 en estas). Una proteína Cas como se describe en el presente documento se puede fusionar con un CPP (un ejemplo de una proteína Cas unida covalentemente a un CPP), por ejemplo. Se entenderá que dicha proteína de fusión de Cas-CPP también puede comprender una NLS como se describió anteriormente. También se entenderá que, en realizaciones en las que una proteína Cas se fusiona con una secuencia de aminoácidos dirigida a un orgánulo diferente (por ejemplo, mitocondrias), dicha proteína Cas normalmente no contendría una NLS.

Una proteína Cas puede ser parte de una proteína de fusión que comprende uno o más dominios de proteína heterólogos (por ejemplo, 1,2, 3 o más dominios además de la proteína Cas). Por ejemplo, una proteína Cas se puede unir covalentemente a un CPP y/o una o más secuencias de aminoácidos heterólogas adicionales (ver la solicitud de patente provisional de EE. UU. n.° 62/036652, presentada el 13 de agosto de 2014). Una proteína Cas también se puede unir covalentemente a una o más secuencias de aminoácidos heterólogas adicionales que no incluyen un CPP, por ejemplo (un CPP estaría unido no covalentemente a una proteína de fusión de Cas en tales realizaciones). Una proteína de fusión que comprende una proteína Cas puede comprender cualquier secuencia de proteína adicional y, opcionalmente, una secuencia de conector entre dos dominios cualesquiera, tal como entre Cas y un primer dominio heterólogo. Los ejemplos de dominios de proteína que pueden fusionarse con una proteína Cas en este documento incluyen, sin limitación, marcadores de epítopo (por ejemplo, histidina [His, polihistidina], V5, FLAG, hemaglutinina [HA] de la gripe, myc, VSV-G, tiorredoxina [Trx]), indicadores (por ejemplo, glutatión-5-transferasa [GST], peroxidasa de rábano picante [HRP], cloranfenicol acetiltransferasa [CAT], beta-galactosidasa, beta-glucuronidasa [GUS], luciferasa, proteína fluorescente verde [GFP], HcRed , DsRed, proteína fluorescente cian [CFP], proteína fluorescente amarilla [YFP], proteína fluorescente azul [BFP]) y dominios que tienen una o más de las siguientes actividades: actividad metilasa, actividad desmetilasa, actividad de activación de la transcripción (por ejemplo, VP16 o VP64), actividad de represión de la transcripción, actividad del factor de liberación de la transcripción, actividad de modificación de histonas, actividad de ruptura del ARN y actividad de unión de ácidos nucleicos. Una proteína Cas en otras realizaciones puede estar en fusión con una proteína que se une a moléculas de ADN u otras moléculas, como la proteína de unión a maltosa (MBP), S-tag, el dominio de unión al ADN Lex A (DBD), el dominio de unión a ADN GAL4A y VP16 del virus del herpes simplex (HSV). Los dominios adicionales que pueden ser parte de una proteína de fusión que comprende una proteína Cas en este documento se describen en la publicación de solicitud de patente de EE.UU. n.° 2011/0059502. En determinadas realizaciones en las que una proteína Cas se fusiona con una proteína heteróloga (por ejemplo, un factor de transcripción), la proteína Cas tiene actividad de unión y reconocimiento de ADN (cuando está en complejo con un componente de ARN adecuado en este documento), pero no tiene actividad de mella o ruptura de ADN.

Otros ejemplos de dominios heterólogos que pueden unirse a una proteína Cas en este documento incluyen secuencias de aminoácidos que dirigen la proteína a un orgánulo particular (es decir, señal de localización). Los ejemplos de orgánulos que pueden dirigirse incluyen mitocondrias y cloroplastos. Normalmente, estos dominios de transporte dirigido se utilizan en lugar de una NLS cuando se dirigen a sitios de ADN extranucleares. Una secuencia de localización mitocondrial (MTS) puede estar situada en el extremo N de una proteína Cas, o cerca de este, por ejemplo. Los ejemplos de MTS se describen en las solicitudes de patente de EE. UU. publicadas n.os 2007/0011759 y 2014/0135275. Una secuencia de transporte dirigido a cloroplastos puede ser como se describe en la solicitud de patente de EE.UU. publicada n.° 2010/0192262 o 2012/0042412, por ejemplo.

El componente de proteína de un RGEN se puede asociar con al menos un componente de ARN (constituyendo así un RGEN completo) que comprende una secuencia complementaria con una secuencia de sitio diana en un cromosoma o episoma en una célula, por ejemplo. El RGEN en tales realizaciones puede unirse a la secuencia del sitio diana y romper una o ambas cadenas de ADN en la secuencia del sitio diana. Un RGEN puede romper una o ambas cadenas de una secuencia diana de ADN, por ejemplo. Un RGEN puede romper ambas cadenas de una secuencia diana de ADN en otro ejemplo. Se entenderá que, en todas estas realizaciones, un componente de proteína de RGEN puede unirse covalente o no covalentemente al menos a un CPP en un complejo de proteína de RGEN-CPP. La asociación de un complejo de proteína de RGEN-CPP con un componente de ARN de la presente puede caracterizarse por formar un complejo de RGEN-CPP. Cualquier descripción en el presente documento con respecto a un RGEN puede aplicarse igualmente al componente de RGEN de un complejo de RGEN-CPP, a menos que se indique lo contrario.

Un RGEN en el presente documento que puede romper ambas cadenas de una secuencia diana de ADN típicamente comprende una proteína Cas que tiene todos sus dominios de endonucleasa en un estado funcional (por ejemplo, dominios de endonucleasa de tipo salvaje o variantes de los mismos que conservan parte o toda la actividad en cada dominio de endonucleasa). Por lo tanto, una proteína Cas de tipo salvaje (por ejemplo, una proteína Cas9 descrita en este documento), o una variante de la misma que conserva parte o toda la actividad en cada dominio de endonucleasa de la proteína Cas es un ejemplo adecuado de un RGEN que puede romper ambas cadenas de una secuencia diana de ADN. Una proteína Cas9 que comprende los dominios de nucleasa funcionales RuvC y HNH es un ejemplo de una proteína Cas que puede romper ambas cadenas de una secuencia diana de ADN. Un RGEN de la presente invención que puede romper ambas cadenas de una secuencia diana de ADN corta típicamente ambas cadenas en la misma posición de modo que se formen extremos romos (es decir, sin proyecciones de nucleótidos) en el sitio de corte.

Un RGEN en el presente documento que puede romper una cadena de una secuencia diana de ADN se puede caracterizar en el presente documento por tener actividad nickasa (por ejemplo, capacidad de ruptura parcial). Una nickasa Cas (por ejemplo, Cas9 nickasa) en el presente documento comprende típicamente un dominio de endonucleasa funcional que permite que Cas rompa solo una cadena (es decir, hacer una mella) de una secuencia diana de ADN. Por ejemplo, una nickasa Cas9 puede comprender (i) un dominio RuvC disfuncional mutante y (ii) un dominio HNH funcional (por ejemplo, un dominio HNH de tipo salvaje). Como otro ejemplo, una nickasa Cas9 puede comprender (i) un dominio RuvC funcional (por ejemplo, un dominio RuvC de tipo salvaje) y (ii) un dominio HNH disfuncional mutante.

Los ejemplos no limitantes de nickasas Cas9 adecuadas para su uso en este documento se describen por Gasiunas et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 109:E2579-E2586), Jinek et al. (Science, 337:816-821), Sapranauskas et al. (Nucleic Acids Res., 39:9275-9282) y en la solicitud de patente de EE. Uu . publicada n.° 2014/0189896. Por ejemplo, una nickasa Cas9 de la presente puede comprender una Cas9 de S. thermophilus que tiene una sustitución en Asp-31 (por ejemplo, Asp-31-Ala) (un ejemplo de un dominio RuvC mutante), o una sustitución de His-865 (por ejemplo, His-865-Ala), una sustitución en Asn-882 (por ejemplo, Asn-882-Ala) o una sustitución en Asn-891 (por ejemplo, Asn-891-Ala) (ejemplos de dominios HNH mutantes). También, por ejemplo, una nickasa Cas9 de la presente puede comprender una Cas9 de S. pyogenes que tiene una sustitución en Asp-10 (por ejemplo, Asp-10-Ala), una sustitución en Glu-762 (por ejemplo, Glu-762-Ala) o una sustitución en Asp-986 (por ejemplo, Asp-986-Ala) (ejemplos de dominios RuvC mutantes), o una sustitución en His-840 (por ejemplo, His-840-Ala), una sustitución en Asn-854 (por ejemplo, Asn-854-Ala) o una sustitución en Asn-863 (por ejemplo, Asn-863-Ala) (ejemplos de dominios HNH mutantes). Con respecto a Cas9 de S. pyogenes, los tres subdominios de RuvC generalmente se encuentran en los restos aminoácidos 1-59, 718-769 y 909-1098, respectivamente, y el dominio HNH se encuentra en los restos aminoácidos 775-908 (Nishimasu et al., Cell, 156: 935-949).

Si se desea, se puede usar una nickasa Cas9 de la presente para diversos fines en las células. Por ejemplo, se puede usar una nickasa Cas9 para estimular la HR en una secuencia de sitio diana de ADN, o cerca de esta, con un molde de modificación de polinucleótidos adecuado. Dado que el ADN con mella no es un sustrato para los procesos de NHEJ, pero es reconocido por los procesos de HR, mellar el ADN en un sitio diana específico debería hacer que el sitio sea más receptivo a HR con un molde de modificación de polinucleótidos adecuado.

Como otro ejemplo, se puede usar un par de nickasas Cas9 para aumentar la especificidad de la localización del ADN. En general, esto se puede hacer proporcionando dos nickasas Cas9 que, en virtud de estar asociadas con componentes de ARN con diferentes secuencias de guía, localizan y cortan secuencias de ADN cercanas en cadenas opuestas en la región para la localización deseada. Tal ruptura cercana de cada cadena de ADN crea una DSB (es decir, una DSB con proyecciones monocatenarias), que luego se reconoce como un sustrato para NHEJ (que conduce a la formación de un indel) o HR (que conduce a la recombinación con un molde de modificación de polinucleótidos adecuado, si se proporciona). Cada mella en estas realizaciones puede tener al menos aproximadamente 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 (o cualquier número entero entre 5 y 100) bases separadas entre sí, por ejemplo. Se pueden usar una o dos proteínas de nickasas Cas9 en este documento en una pareja de nickasas Cas9 como se describió anteriormente. Por ejemplo, podría utilizarse una nickasa Cas9 con un dominio RuvC mutante, pero con un dominio HNH funcional (es decir, Cas9 HNH+/RuvC-) (por ejemplo, Cas9 HNH+/RuvC- de S. pyogenes). Cada nickasa Cas9 (por ejemplo, Cas9 HNH+/RuvC-) se dirigiría a sitios de ADN específicos cercanos entre sí (separados por hasta 100 pares de bases) mediante el uso de componentes de ARN adecuados en este documento con secuencias de ARN guía que dirigen cada nickasa a cada sitio de ADN específico.

Un RGEN de la presente puede unirse a una secuencia de sitio diana y romper una o ambas cadenas de la secuencia de sitio diana, en un cromosoma, episoma o cualquier otra molécula de ADN en el genoma de una célula. Este reconocimiento y unión de una secuencia diana es específico, dado que un componente de ARN del RGEN comprende una secuencia (secuencia guía) que es complementaria con una cadena de la secuencia diana.

Las expresiones "sitio diana", "secuencia diana", "ADN diana", "secuencia diana de ADN", "locus diana", "protoespaciador" y similares se usan indistintamente en el presente documento. Una secuencia de sitio diana se refiere a una secuencia polinucleotídica en un cromosoma, episoma o cualquier otra molécula de ADN en el genoma de una célula que un RGEN de la presente puede reconocer, unirse a ella y, opcionalmente, mellar o romper. Un sitio diana puede ser (i) un sitio endógeno/nativo en la célula, (ii) heterólogo a la célula y, por lo tanto, no estar presente de forma natural en el genoma, o (iii) encontrarse en una ubicación genómica heteróloga en comparación con el lugar donde aparece de forma nativa

Una secuencia de sitio diana en este documento tiene al menos 13 nucleótidos de longitud y tiene una cadena con suficiente complementariedad con un dominio de localización variable (de un ARNcr o ARNg) para ser capaz de hibridar con la secuencia guía y dirigir la unión específica de secuencia directa de una proteína Cas o un complejo de proteína Cas con la secuencia diana (si un PAM adecuado está adyacente a la secuencia diana en ciertas realizaciones). Un sitio de ruptura/mella (aplicable con una Cas9 endonucleolítica o de mella) puede estar dentro de la secuencia diana (por ejemplo, usando un Cas9) o un sitio de ruptura/mella puede estar fuera de la secuencia diana (por ejemplo, usando una Cas9 fusionada a un dominio de endonucleasa heterólogo, tal como un dominio derivado de una enzima Fok1). También es posible que una secuencia de sitio diana se una a un RGEN que carece de actividad de ruptura o mella.

Un "sitio diana artificial" o "secuencia diana artificial" en el presente documento se refiere a una secuencia diana que se ha introducido en el genoma de una célula. Una secuencia diana artificial en algunas realizaciones puede ser idéntica en secuencia a una secuencia diana nativa en el genoma de la célula, pero estar ubicada en una posición diferente (una posición heteróloga) en el genoma, o puede ser diferente de la secuencia diana nativa si ubicado en la misma posición en el genoma de la célula.

La longitud de una secuencia diana en este documento puede ser de al menos 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 nucleótidos; entre 13-30 nucleótidos; entre 17-25 nucleótidos; o entre 17-20 nucleótidos, por ejemplo. Esta longitud puede incluir o excluir una secuencia PAM (motivo adyacente al protoespaciador). Además, una cadena de una secuencia diana en este documento tiene suficiente complementariedad con un dominio de localización variable (de un ARNcr o ARNg) para hibridarse con la secuencia guía y dirigir la unión específica de secuencia de una proteína Cas o complejo de proteína Cas con la secuencia diana (si un PAM adecuado está adyacente a la secuencia diana, ver más abajo). El grado de complementariedad entre una secuencia guía y una cadena de su secuencia diana de ADN correspondiente es de al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%, por ejemplo. Un sitio diana en el presente documento puede estar ubicado en una secuencia que codifica un producto génico (por ejemplo, una proteína o un ARN) o una secuencia no codificadora (por ejemplo, una secuencia reguladora o una secuencia "basura"), por ejemplo.

Un "motivo adyacente protoespaciador" (PAM) en el presente documento se refiere a una secuencia corta que es reconocida por un RGEN en el presente documento. La secuencia y longitud de una PAM en la presente pueden diferir dependiendo de la proteína Cas o del complejo de proteína Cas usado, pero típicamente tienen una longitud de 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 nucleótidos, por ejemplo.

Una secuencia de PAM (motivo adyacente al protoespaciador) puede estar adyacente a la secuencia del sitio diana. Una secuencia de PAM es una secuencia de ADN corta reconocida por un RGEN en este documento. El PAM asociado y los primeros 11 nucleótidos de una secuencia diana de ADN probablemente sean importantes para el localización y ruptura de Cas9/ARNg (Jiang et al., Nat. Biotech., 31:233-239). La longitud de una secuencia de PAM en este documento puede variar dependiendo de la proteína Cas o del complejo de proteína Cas utilizado, pero normalmente tiene una longitud de 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 nucleótidos, por ejemplo. Una secuencia de PAM se encuentra inmediatamente cadena abajo de una secuencia del sitio diana aguas abajo, o dentro de 2, o 3 nucleótidos cadena debajo de esta, que es complementaria con la cadena en el sitio diana que, a su vez, es complementaria con una secuencia guía del componente de ARN, por ejemplo. En las realizaciones del presente documento en las que un RGEN es una proteína Cas9 endonucleolíticamente activa que forma un complejo con un componente de ARN, Cas9 se une a la secuencia diana según es dirigida por el componente de ARN y rompe ambas cadenas inmediatamente 5' de la posición del tercer nucleótido cadena arriba de la secuencia de PAM. Considérese el siguiente ejemplo de un sitio de destino:

Secuencia de PAM:

5'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNXGG-3' (SEQ ID NO:52).

N puede ser A, C, T o G, y X puede ser A, C, T o G en esta secuencia de ejemplo (X también puede denominarse N^pam). La secuencia de PAM en este ejemplo es XGG (subrayada). Un complejo de Cas9/componente de ARN adecuado rompería esta diana inmediatamente 5' de la N con subrayado doble. La cadena de N en SEQ ID NO:52 representa la secuencia diana que es al menos aproximadamente 90%, 91 %, 92%, 93% , 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% idéntica, por ejemplo, a una secuencia guía en un componente de ARN de la presente (en la que cualquier T de la secuencia diana de ADN se alinearía con cualquier U de la secuencia guía de ARN). Una secuencia guía de un componente de ARN de un complejo Cas9, al reconocer y unirse a esta secuencia diana (que es representativa de los sitios diana en este documento), se asociaría con la secuencia complementaria de la cadena de N; el porcentaje de complementariedad entre una secuencia guía y el complemento del sitio diana es al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%, por ejemplo. Si se usa una nickasa Cas9 para dirigirse a SEQ ID NO:52 en un genoma, la nickasa cortaría inmediatamente 5' de la N con subrayado doble o en la misma posición de la cadena complementaria, dependiendo de qué dominio de endonucleasa en la nickasa sea disfuncional. Si se usa un Cas9 que no tiene actividad nucleolítica (ambos dominios RuvC y HNH son disfuncionales) para dirigirse a la SEQ ID NO:52 en un genoma, aquella reconocería y se uniría a la secuencia diana, pero no haría ningún corte en la secuencia.

Un PAM en la presente se selecciona típicamente en vista del tipo de RGEN que se está empleando. Una secuencia de PAM en el presente documento puede ser una secuencia reconocida por un RGEN que comprende una Cas, tal como Cas9, derivada de cualquiera de las especies descritas en el presente documento de las que se puede derivar una Cas, por ejemplo. En determinadas realizaciones, la secuencia de PAM puede ser una reconocida por un RGEN que comprende una Cas9 derivada de S. pyogenes, S. thermophilus, S. agalactiae, N. meningitidis, T. denticola, o F. novicida. Por ejemplo, una Cas9 adecuada derivada de S. pyogenes podría usarse para dirigirse a secuencias genómicas que tienen una secuencia de PAM de NGG (N puede ser A, C, T o G). Como otros ejemplos, una Cas9 adecuada podría derivarse de cualquiera de las siguientes especies cuando se dirige a secuencias de ADN que tengan las siguientes secuencias de Pa M: S. thermophilus (NNAGAA), S. agalactiae (NGG, NNAGAAW [W es A o T], NGGNG, N. meningitidis (NNNNGATT), T. denticola (NAAAAC), o F. novicida (Ng ) (en las que N en todas estas secuencias de PAM concretas son A, C, T o G). Otros ejemplos de Cas9/PAM útiles en este documento incluyen los descritos en Shah et al. (RNA Biology, 10:891-899) y Esvelt et al. (Nature Methods, 10:1116-1121). Los ejemplos de las secuencias diana en el presente documento siguen a la SEQ ID NO:43, pero con el PAM "XGG" reemplazado por cualquiera de los PAM anteriores.

Un componente de ARN de la presente puede comprender una secuencia complementaria con una secuencia de sitio diana en un cromosoma o episoma en una célula. Un RGEN puede unirse específicamente a una secuencia del sitio diana y, opcionalmente, romper una o ambas cadenas de la secuencia del sitio diana, basándose en esta secuencia complementaria. Por tanto, la secuencia complementaria de un componente de ARN en determinadas realizaciones de la descripción descrita también puede denominarse secuencia guía o dominio de localización variable.

La secuencia guía de un componente de ARN (por ejemplo, ARNcr o ARNg) en este documento puede tener al menos 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28. , 29 o 30 ribonucleótidos de longitud; entre 13-30 ribonucleótidos de longitud; entre 17-25 ribonucleótidos de longitud; o entre 17-20 ribonucleótidos de longitud, por ejemplo. En general, una secuencia guía en este documento tiene suficiente complementariedad con una cadena de una secuencia de ADN diana para hibridarse con la secuencia diana y dirigir la unión específica de secuencia de una proteína Cas o complejo de proteína Cas con la secuencia diana (si un PAM adecuado está adyacente a la secuencia diana). El grado de complementariedad entre una secuencia guía y su secuencia diana de ADN correspondiente es de al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%, por ejemplo. La secuencia guía se puede diseñar en consecuencia para dirigir un RGEN a una secuencia diana de ADN en una célula.

Un componente de ARN de la presente puede comprender un ARNcr, por ejemplo, que comprende una secuencia guía y una secuencia de repetición (de apareamiento de ARNtracr). La secuencia guía se encuentra típicamente en el extremo 5' del ARNcr (dentro de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más bases), o cerca de este. Cadena abajo de la secuencia guía de un ARNcr hay una secuencia "de repetición" o "de apareamiento de ARNtracr" que es complementaria y puede hibridarse con la secuencia en el extremo 5' de un ARNtracr. Las secuencias de guía y de apareamiento de ARNtracr pueden estar inmediatamente adyacentes o estar separadas por 1, 2, 3, 4 o más bases, por ejemplo. Una secuencia de apareamiento de ARNtracr tiene, por ejemplo, al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de complementariedad de secuencia con el extremo 5' final de un ARNtracr. En general, el grado de complementariedad puede ser con referencia al alineamiento óptimo de la secuencia de apareamiento de ARNtracr y el extremo 5' de la secuencia de ARNtracr, a lo largo de la longitud de la más corta de las dos secuencias. La longitud de una secuencia de apareamiento de ARNtracr en la presente puede ser de al menos 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o 18 ribonucleótidos de longitud, por ejemplo, y se hibrida con una secuencia de la misma o similar longitud (por ejemplo, más o menos 1, 2, 3, 4 o 5 bases) en el extremo 5' de un ARNtracr. La longitud de un ARNr de la presente puede ser de al menos aproximadamente 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 o 48 ribonucleótidos; o aproximadamente 18-48 ribonucleótidos; o aproximadamente de 25-50 ribonucleótidos, por ejemplo.

Un ARNtracr puede incluirse junto con un ARNcr en realizaciones en las que una proteína Cas9 de un sistema CRISPR de tipo II está comprendida en el RGEN. Un ARNtracr en el presente documento comprende, en la dirección 5' a 3' (i) una secuencia que se hibrida con la región de repetición (secuencia de apareamiento de ARNtracr) del ARNcr y (ii) una porción que contiene la estructura de tallo-bucle. La longitud de una secuencia de (i) puede ser la misma o similar (por ejemplo, más o menos 1, 2, 3, 4 o 5 bases) a cualquiera de las longitudes de la secuencia de apareamiento de ARNtracr descritas anteriormente, por ejemplo. La longitud total de un ARNtracr en este documento (es decir, los componentes de secuencia [i] y [ii]) puede ser de al menos aproximadamente 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 o 90 (o cualquier número entero entre 30 y 90) ribonucleótidos, por ejemplo. Un ARNtracr puede incluir además 1,2, 3, 4, 5 o más restos uracilo en el extremo 3', que pueden estar presentes en virtud de la expresión del ARNtracr con una secuencia de terminación de la transcripción.

Un ARNtracr en este documento puede derivarse de especies bacterianas, tales como, entre otras, especies de Streptococcus (por ejemplo, S. pyogenes, S. thermophilus) o puede incluir las descritas en la patente de EE. UU. n.° 8697359 y Chylinski et al. (ARN Biology, 10:726-737).

Los términos y expresiones "ribozima", "enzima de ácido ribonucleico" y "ribozima autorrompible" se usan indistintamente en el presente documento. Una ribozima se refiere a una o más secuencias de ARN que forman estructuras secundarias, terciarias y/o cuaternarias que pueden romper el ARN en un sitio específico, particularmente en un sitio cis con relación a la secuencia de ribozima (es decir, autocatalítico o autorrompible). Se ha descrito la naturaleza general de la actividad nucleolítica de las ribozimas (por ejemplo, Lilley, Biochem. Soc. Trans., 39:641-646). Una "ribozima de cabeza de martillo" (HHR) en la presente puede comprender un pequeño motivo de ARN catalítico formado por tres tallos con bases apareadas y un núcleo de nucleótidos no complementarios altamente conservados que están implicados en la catálisis. Pley et al. (Nature, 372:68-74) y Hammann et al. (RNA, 18:871-885), describen la estructura y actividad de las ribozimas de cabeza de martillo. Una ribozima de cabeza de martillo en la presente puede comprender una secuencia de "cabeza de martillo mínima" como se describe en Scott et al. (Cell, 81:991 -1002), por ejemplo.

Los términos y expresiones "localización", "localización de genes", "localización de ADN", "edición", "edición de genes" y "edición de ADN" se usan indistintamente en el presente documento. La localización del ADN en la presente puede ser la introducción específica de un indel, “knock-out” o “knock-in” en una secuencia de ADN particular, tal como en un cromosoma o episoma de una célula. En general, la localización del ADN se puede realizar en la presente rompiendo una o ambas cadenas en una secuencia de ADN específica en una célula con una proteína Cas asociada con un componente de ARN adecuado. Tal ruptura del ADN, si se produce una ruptura bicatenaria (DSB), puede provocar procesos de NHEJ que pueden conducir a la formación de indel en el sitio diana. Además, independientemente de si la ruptura es una ruptura monocatenaria (SSB) o DSB, se pueden incitar procesos de HR si se proporciona un molde de modificación de polinucleótidos adecuado o un ADN donante en el sitio de ruptura o mella del ADN. Dicho proceso de HR puede usarse para introducir una modificación “knock-out” o “knock-in” en el sitio diana, dependiendo de la secuencia del molde de modificación de polinucleótidos. Como alternativa, la localización del ADN en este documento puede referirse a la asociación específica de un complejo de Cas/componente de ARN en este documento con una secuencia de ADN diana, en la que la proteína Cas corta o no corta una cadena de ADN (dependiendo del estado de los dominios endonucleolíticos de la proteína Cas).

El término "indel" en este documento se refiere a una inserción o deleción de una base o bases de nucleótidos en una secuencia de ADN diana en un cromosoma o episoma. Tal inserción o deleción puede ser de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más bases, por ejemplo. Un indel en ciertas realizaciones puede ser incluso mayor, al menos aproximadamente 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 bases. Si se introduce un indel dentro de un marco de lectura abierto (ORF) de un gen, a menudo el indel interrumpe la expresión de tipo salvaje de la proteína codificada por el ORF creando una mutación de desplazamiento de marco.

Los términos y expresiones "knock-out", "inactivación de genes" e "inactivación genética" se usan indistintamente en el presente documento. Un “knock-out” representa una secuencia de ADN de una célula en este documento que se ha vuelto parcial o completamente inoperante cuando es la diana de una proteína Cas; una secuencia de ADN de este tipo antes de la inactivación podría haber codificado una secuencia de aminoácidos o podría haber tenido una función reguladora (por ejemplo, un promotor), por ejemplo. Se puede producir un “knock-out” mediante un indel (mediante NHEJ, provocado por la ruptura mediada por Cas), o por la eliminación específica de la secuencia (mediante HR, provocada por una ruptura o mellado mediado por Cas, cuando también se usa un molde de modificación de polinucleótidos adecuado), que reduce o destruye por completo la función de la secuencia en el sitio diana, junto a este o cerca de este. Una secuencia polinucleotídica de ADN inactivada de la presente invención puede caracterizarse, como alternativa, por estar parcial o totalmente alterada o regulada negativamente, por ejemplo.

Los términos "knock-in", "knock-in de genes" y "knock-in genético" se usan indistintamente en el presente documento. Un “knock-in” representa el reemplazo o inserción de una secuencia de ADN en una secuencia de ADN específica en una célula cuando es la diana de una proteína Cas (mediante HR, provocado por ruptura o mella mediada por Cas, cuando también se usa un ADN donante adecuado). Los ejemplos de “knock-in” son una inserción específica de un polinucleótido de interés, una secuencia codificadora de aminoácidos heteróloga en una región codificadora de un gen o una inserción específica de un elemento regulador de la transcripción en un locus genético.

Los términos y expresiones "molécula de ADN recombinante", "construcción recombinante", "construcción de expresión", "construcción" y "construcción de ADN recombinante" se usan indistintamente en el presente documento. Una construcción recombinante comprende una combinación artificial de fragmentos de ácido nucleico, por ejemplo, secuencias reguladoras y codificadoras que no se encuentran todas juntas en la naturaleza. Por ejemplo, una construcción puede comprender secuencias reguladoras y secuencias codificadoras que se derivan de diferentes fuentes, o secuencias reguladoras y secuencias codificadoras derivadas de la misma fuente, pero dispuestas de una manera diferente a la que se encuentra en la naturaleza. Tal construcción puede usarse por sí misma o puede usarse junto con un vector o plásmido. Los expertos en la técnica también reconocerán que diferentes acontecimientos de edición de genes independientes pueden resultar en diferentes niveles y patrones de expresión (Jones et al. (1985), EMBO J., 4:2411-2418; De Almeida et al. (1989), Mol. Gen. Genetics, 218:78-86), y, por lo tanto, típicamente se seleccionan múltiples acontecimientos para obtener líneas que muestren el nivel y patrón de expresión deseados. Dicha selección se puede realizar con ensayos biológicos moleculares, bioquímicos y de otro tipo, incluidos el análisis Southern de ADN, el análisis Northern de expresión de ARNm, PCR, PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR), PCR de transcripción inversa (RT-PCR), análisis de inmunotransferencia de la expresión de proteínas, ensayos enzimáticos o de actividad y/o análisis fenotípicos.

El término "expresión", como se usa en este documento, se refiere a la producción de un producto final funcional (por ejemplo, un ARNm, ARN guía o una proteína) en forma de precursor o madura.

El término "proporcionar" en el presente documento se refiere a proporcionar (introducir) un ácido nucleico (por ejemplo, construcción de expresión, plásmido) o proteína en una célula. Proporcionar incluye la referencia a la incorporación de un ácido nucleico en una célula eucariota o procariota, en donde el ácido nucleico puede incorporarse al genoma de la célula, e incluye la referencia a la provisión transitoria de un ácido nucleico o proteína a la célula. Proporcionar incluye la referencia a la electroporación (Green M.R., Sambrook J., 2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, cuarta edición, ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY), tratamientos de choque térmico (Green M.R., Sambrook J., 2012. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, cuarta edición, ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY), tratamientos químicos (Green M.R., Sambrook J., 2012. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, cuarta edición, ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY), transporte con fagos (Tyler B.M., Goldberg R.B., 1976, Transduction of chromosomal genes between enteric bacteria by bacteriophage P1, Journal of bacteriology, 125:1105-1111), apareamiento, conjugación y transducción (Methods for General and Molecular Bacteriology, 1994, ASM Press, Washington D.C.). En el contexto de la inserción de un fragmento de ácido nucleico (por ejemplo, una construcción de ADN recombinante/construcción de expresión) en una célula, proporcionar incluye "transfección" o "transformación" o "transducción" e incluye la referencia a la incorporación de un fragmento de ácido nucleico en una célula procariota en la que el fragmento de ácido nucleico puede incorporarse al genoma de la célula (por ejemplo, genoma circular grande, plásmido), convertirse en un replicón autónomo o expresarse transitoriamente.

Una molécula de ácido nucleico que se ha proporcionado a un organismo/célula puede ser una molécula que se replica de forma autónoma en el organismo/célula, o que se integra en el genoma del organismo/célula, o que existe transitoriamente en la célula sin replicarse o integrarse. En el presente documento se describen ejemplos no limitantes de moléculas de ácido nucleico que se pueden proporcionar a una célula, tales como plásmidos y moléculas de ADN lineal.

Como se describe en el presente documento, el sistema de ARN guía/endonucleasa Cas se puede usar en combinación con un molde de modificación de polinucleótidos coadministrado para permitir la edición de una secuencia de nucleótidos genómica de interés. Además, como se describe en el presente documento, para cada realización que utiliza un sistema de ARN guía/endonucleasa Cas, se puede desplegar un sistema de polinucleótido guía/endonucleasa Cas cuando el polinucleótido guía no comprende únicamente ácidos ribonucleicos sino que el polinucleótido guía comprende una combinación de moléculas de ARN-ADN o comprende únicamente moléculas de ADN.

Un "nucleótido modificado" o "nucleótido editado" se refiere a una secuencia de nucleótidos de interés que comprende al menos una alteración en comparación con su secuencia de nucleótidos no modificada. Tales "alteraciones" incluyen, por ejemplo: (i) reemplazo de al menos un nucleótido, (ii) una deleción de al menos un nucleótido, (iii) una inserción de al menos un nucleótido, o (iv) cualquier combinación de (i )-(iii).

La expresión "molde de modificación de polinucleótidos" se refiere a un polinucleótido que comprende al menos una modificación de nucleótidos en comparación con la secuencia de nucleótidos que se va a editar. Una modificación de nucleótidos puede incluir, por ejemplo: (i) un reemplazo de al menos un nucleótido, (ii) una deleción de al menos un nucleótido, (iii) una inserción de al menos un nucleótido, o (iv) cualquier combinación de (i)-(iii). Opcionalmente, el molde de modificación de polinucleótidos puede comprender además secuencias de nucleótidos homólogas que flanquean al menos una modificación de nucleótidos, en el que las secuencias de nucleótidos homólogas flanqueantes proporcionan suficiente homología con la secuencia de nucleótidos deseada que se va a editar.

Como se usa en el presente documento, "ADN donante" es una construcción de ADN que comprende un polinucleótido de interés para insertarse en el sitio diana de una endonucleasa Cas. La construcción de ADN donante puede comprender además una primera y una segunda región de homología que flanquean el polinucleótido de interés. La primera y segunda regiones de homología del ADN donante comparten homología con una primera y una segunda región genómica, respectivamente, presentes el sitio diana, o flanqueando a este, del genoma de la planta.

Un molde de modificación de polinucleótidos o ADN donante puede experimentar recombinación homóloga (HR) con un sitio diana de ADN. Una "secuencia homóloga" dentro de un molde de modificación de polinucleótidos o ADN donante en este documento puede, por ejemplo, comprender o consistir en una secuencia de al menos aproximadamente 25 nucleótidos, por ejemplo, que tiene 100% de identidad con una secuencia en un sitio diana, o cerca de este, o al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con una secuencia en un sitio diana, o cerca de este.

Un molde de modificación de polinucleótidos o ADN donante puede tener dos secuencias homólogas separadas por una secuencia (o par de bases) que sea heteróloga con la secuencia en un sitio diana. Estas dos secuencias homólogas de tal molde de modificación de polinucleótidos o ADN donante pueden denominarse "brazos de homología", que flanquean a la secuencia heteróloga. La HR entre un sitio diana y un molde de modificación de polinucleótidos o ADN donante con dos brazos de homología normalmente da como resultado la edición de una secuencia en el sitio diana.

Una región de homología puede tener cualquier longitud que sea suficiente para promover la recombinación homóloga en el sitio diana roto. Por ejemplo, la región de homología puede comprender al menos 5-10, 5-15, 5-20, 5-25, 5-30, 5-35, 5-40, 5-45, 5-50, 5-55,5-60, 5-65, 5-70, 5-75, 5-80, 5-85, 5-90, 5-95, 5-100, 5-200, 5-300, 5-400, 5-500, 5-600, 5-700, 5-800, 5-900, 5-1000, 5-1100, 5-1200, 5-1300, 5-1400, 5-1500, 5-1600, 5-1700 , 5-1800, 5-1900, 5-2000, 5 2100, 5-2200, 5-2300, 5-2400, 5-2500, 5-2600, 5-2700, 5-2800, 5-2900, 5-3000, 5-3100 o más bases de longitud de manera que la región de homología tenga suficiente homología para experimentar una recombinación homóloga con la región genómica correspondiente. "Suficiente homología" indica que dos secuencias polinucleotídicas tienen suficiente similitud estructural para actuar como sustratos para una reacción de recombinación homóloga. La similitud estructural incluye la longitud total de cada fragmento de polinucleótido, así como la similitud de secuencia de los polinucleótidos. La similitud de secuencia se puede describir mediante el porcentaje de identidad de secuencia en toda la longitud de las secuencias y/o mediante las regiones conservadas que comprenden similitudes localizadas, tales como nucleótidos contiguos que tienen 100% de identidad de secuencia y un porcentaje de identidad de secuencia en una parte de la longitud de las secuencias.

La cantidad de homología o identidad de secuencia compartida por una diana y un molde de modificación de polinucleótidos o un ADN donante puede variar e incluye longitudes totales y/o regiones que tienen valores de unidades integrales en los intervalos de aproximadamente 1-20 pb, 20-50 pb, 50-100 pb, 75-150 pb, 100-250 pb, 150-300 pb, 200-400 pb, 250-500 pb, 300-600 pb, 350-750 pb, 400-800 pb, 450-900 pb, 500-1000 pb, 600-1250 pb, 700-1500 pb, 800-1750 pb, 900-2000 pb, 1-2,5 kb, 1,5-3 kb, 2-4 kb, 2,5-5 kb, 3-6 kb, 3,5-7 kb, 4-8 kb, 5-10 kb o hasta la longitud total del sitio diana e incluyendo este. Estos intervalos incluyen todos los números enteros dentro del intervalo, por ejemplo, el intervalo de 1 -20 pb incluye 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20 pb. La cantidad de homología también se puede describir mediante el porcentaje de identidad de secuencia a lo largo de la longitud alineada completa de los dos polinucleótidos que incluye un porcentaje de identidad de secuencia de aproximadamente al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%. La homología suficiente incluye cualquier combinación de longitud de polinucleótido, porcentaje de identidad de secuencia global y regiones opcionalmente conservadas de nucleótidos contiguos o porcentaje de identidad de secuencia local, por ejemplo, se puede describir una homología suficiente como una región de 75-150 pb que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con una región del locus diana. También se puede describir una homología suficiente por la capacidad predicha de dos polinucleótidos para hibridarse específicamente en condiciones de alta rigurosidad, ver, por ejemplo, Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY); Current Protocol in Molecular Biology, Ausubel et al. eds. (1994) Current Protocols (Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc.); y Tijssen (1993), Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes (Elsevier, Nueva York).

En una realización, la descripción describe un método para editar una secuencia diana en el genoma de una célula de Escherichia coli, y el método comprende proporcionar al menos una construcción de ADN recombinante que comprende una secuencia de ADN que codifica un ARN guía y un molde de modificación de polinucleótidos circular a una célula de E. coli que comprende una secuencia de ADN de endonucleasa Cas9 unida operativamente a un promotor inducible, en el que dicha secuencia de ADN de endonucleasa Cas9 codifica una endonucleasa Cas9 en la que el ARN guía y la endonucleasa Cas9 pueden formar un complejo de ARN guía/endonucleasa Cas9 (RGEN) que es capaz de mediar en la ruptura de la secuencia diana para permitir la edición de genes mediada por recombinación homóloga en un sitio diana del genoma. de dicha célula de E. coli, en el que dicho molde de modificación de polinucleótidos comprende al menos una modificación de nucleótidos de dicha secuencia diana. La secuencia de nucleótidos en el genoma de la célula de E. coli se puede seleccionar del grupo que consiste en una secuencia promotora, una secuencia terminadora, una secuencia de elementos reguladores, una secuencia codificadora, un profago, un pseudogén, un gen exógeno, un gen endógeno. La construcción de ADN recombinante que comprende una secuencia de ADN que codifica un ARN guía puede proporcionarse mediante un plásmido circular. La construcción de ADN recombinante y el molde de modificación de polinucleótidos circular se pueden proporcionar en plásmidos separados o se pueden proporcionar en un solo plásmido. La construcción de ADN recombinante y el molde de polinucleótidos circular se pueden proporcionar mediante un medio seleccionado del grupo que consiste en electroporación, choque térmico, transporte por fagos, apareamiento, conjugación y transducción, o cualquier combinación de los mismos.

La secuencia de nucleótidos que se va a editar puede ser una secuencia endógena, artificial, preexistente o transgénica para la célula que se está editando. Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos en el genoma de una célula puede ser un gen nativo, un gen mutado, un gen no nativo, un gen extraño o un transgén que se incorpora de manera estable en el genoma de una célula. La edición de tal nucleótido puede resultar en un fenotipo o genotipo deseado adicional.

En una realización, la descripción describe un método para editar una secuencia diana en el genoma de una célula de Escherichia coli, comprendiendo el método proporcionar al menos una primera construcción de ADN recombinante que comprende una secuencia de ADN que codifica un ARN guía, un molde circular de modificación de polinucleótidos, y una segunda construcción de ADN recombinante que comprende una secuencia de ADN que codifica la endonucleasa Cas9 unida operativamente a un promotor inducible, a una célula de E. coli, en el que la endonucleasa Cas9 introduce una ruptura bicatenaria en un sitio diana en el genoma de dicha célula de E. coli, en el que dicho molde de modificación de polinucleótidos comprende al menos una modificación de nucleótidos de dicha secuencia diana.

En una realización de la descripción, el método comprende un método para insertar una secuencia polinucleotídica de interés en el genoma de una célula de Escherichia coli, el método comprende proporcionar al menos una construcción de ADN recombinante que comprende una secuencia de ADN que codifica un ARN guía y un ADN donante circular a una célula de E. coli que comprende una secuencia de ADN de endonucleasa Cas9 unida operativamente a un promotor inducible, en el que dicha secuencia de ADN de endonucleasa Cas9 codifica una endonucleasa Cas9 que es capaz de introducir una ruptura bicatenaria en un sitio diana en el genoma de dicha célula de E. coli, en el que dicho ADN donante comprende un polinucleótido.

Los ejemplos de sitios diana en E. coli incluyen genes de utilización de azúcares (por ejemplo, galactoquinasa, galK), genes metabólicos (por ejemplo, isocitrato deshidrogenasa, icd (Kabir M.M., Shimizu K., 2004, Applied microbiology and biotechnology, 65:84-96), genes biosintéticos (por ejemplo, timidilato sintasa, thyA (Belfort M., Maley G., Pedersen-Lane J., Maley F., PNAS, 1983, 80 (16):4914-4918), reguladores transcripcionales (por ejemplo, el regulador general de respuesta al estrés, rpoS (Notley-McRobb L., King T., Ferenci T. (2002), J. Bacteriol., 184 (3), 806-811, PMID: 11790751), proteínas de señalización (por ejemplo, sensor para control redox anóxico, arcB (luchi S., Matsuda Z., Fujiwara T., Lin E.C. (1990), Mol. Microbiol., 1990, 4 (5), 715-727, PMID: 2201868), ARNt (por ejemplo, ARNt de alanina, alaU (Siekevitz P., Zamecnik P.C. (1981), Cell Biol., 91 (3, pt. 2), 53s-65s, PMID: 7033244)), proteínas de respuesta al estrés (por ejemplo, proteína A de choque de fagos, pspA (Adams H., Teertstra W., Demmers J., Boesten R., Tommassen J. (2003), J. Bacteriol., 2003, 185 (4), 1174-1180, PMID: 12562786), componentes ribosómicos (por ejemplo, proteína ribosómica S12, rpsL (Funatsu G., Yaguchi M., Wittmann-Liebold B. (1977), "Primary structure of protein S12 from the small Escherichia coli ribosomal subunit", FEBS Lett., 73 (1), 12-7, PMID: 320034) y ARN ribosómico 23s, rrlD (Arkov A.L., Hedenstierna K.O., Murgola E.J. (2002), "Mutational evidence for a functional connection between two domains of 23S rRNA in traslation termination", J. Bacteriol., 184 (18), 5052-5057, PMID: 12193621)), replicación del ADN (por ejemplo, ADN polimerasa II, polB (Chen H., Bryan S.K., Moses R.E. (1989), "Cloning the polB gen of Escherichia coli and identification of its product", J. Biol. Chem., 264 (34), 20591-20595, PMID: 2684981)), maquinaria transcripcional (por ejemplo, la subunidad p' de la ARN polimerasa, rpoC (Squires C., Krainer A., Barry G., Shen W.F., Squires C.L. (1981), "Nucleotide sequence at the end of the gene for the RNA polymerase beta' subunit (rpoC)", Nucleic Acids Res., 1981, 9 (24), 6827-6840, PMID: 6278450), transportadores (por ejemplo, lactosa permeasa, lacY (Buchel D.E., Gronenborn B., Muller-Hill B. (1980), "Sequence of the lactose permease gen", Nature, 1980, 283 (5747), 541-545, PMID: 6444453)), sitios de unión de fagos (por ejemplo, sitio de unión de A, attB (Landy A., Ross W. (1977), "Viral integration and excision: structure of the lambda att sites", Science, 197 (4309), 1147-1160, PMID: 331474)), genes de profagos (por ejemplo, inhibidor de la división celular del profago rac, kilR (Conter A., Bouche J.P., Dassain M. (1996), "Identification of a new inhibitor of essential division gene ftsZ as the kil gene of defective prophage Rac", J. Bacteriol., 178 (17), 5100-5104, PMID: 8752325)), o división celular (por ejemplo, anillo de división celular, ftsZ (Robinson A.C., Kenan D.J., Hatfull G.F., Sullivan N.F., Spiegelberg R., Donachie W.D. (1984), "DNA sequence and transcriptional organization of essential cell division genes ftsQ and ftsA of Escherichia coli: evidence for overlapping transcriptional units", J. Bacteriol., 160 (2), 546-555. PMID: 6094474),). Se han definido genes adicionales adecuados para los sitios diana (Karp P.D., Weaver D., Paley S., Fulcher C., Kubo A.., Kothari A., Krummenacker M., Subhraveti P., Weerasinghe D., Gama-Castro S., Huerta A.M., Muniz-Rascado L., Bonavides-Martinez C., Weiss V., Peralta-Gil M., Santos-Zavaleta A., Schroder I., Mackie A., Gunsalus R., Collado-Vides J., Keseler I.M., Paulsen I., 2014, The EcoCyc Database, EcoSal Plus 2014; Keseler I.M., Collado-Vides J., Santos-Zavaleta A., Peralta-Gil M., Gama-Castro S., Muniz-Rascado L., Bonavides-Martinez C., Paley S., Krummenacker M., Altman T., Kaipa P., Spaulding A., Pacheco J ., Latendresse M., Fulcher C., Sarker M., Shearer A.G., Mackie A., Paulsen I., Gunsalus R.P., Karp P.D., 2011, EcoCyc: a comprehensive database of Escherichia coli biology, Nucleic acidos research, 39: D583-590; Keseler I.M., Bonavides-Martinez C., Collado-Vides J., Gama-Castro S., Gunsalus R.P., Johnson D.A., Krummenacker M., Nolan L.M., Paley S., Paulsen I.T., Peralta-Gil M., Santos-Zavaleta A., Shearer A.G., Karp P.D., 2009, EcoCyc: a comprehensive database of Escherichia coli biology, Nucleic acidos research, 37: D464-470; Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cellular an Molecular Biology, 1987, primera ed., Sociedad Estadounidense de Microbiología, Washington, DC.

Las expresiones "péptido que penetra en las células" (CPP) y "dominio de transducción de proteínas" (PTD) se usan indistintamente en el presente documento. Un CPP se refiere a un péptido, típicamente de aproximadamente 5-60 restos aminoácidos de longitud, que puede facilitar la captación celular de una carga de proteínas, particularmente uno o más componentes de proteína de RGEN descritos en este documento (por ejemplo, proteína Cas9). Tal carga de proteínas se puede asociar con uno o más CPP a través de un enlace covalente o no covalente. Un CPP también se puede caracterizar en ciertas realizaciones por ser capaz de facilitar el movimiento o hacer atravesar la carga de proteínas a través de una o más de una bicapa lipídica, micela, membrana celular, membrana de orgánulos, membrana de vesícula o pared celular. Un CPP de la presente invención puede ser catiónico, antipático o hidrófobo en determinadas realizaciones. (ver, por ejemplo, la solicitud de patente provisional de EE. UU. n.° 62/036652, presentada el 13 de agosto de 2014).

Las expresiones "porcentaje en volumen", "porcentaje en volumen", "% en volumen" y "% en v/v" se utilizan indistintamente en el presente documento. El porcentaje en volumen de un soluto en una solución se puede determinar usando la fórmula: [(volumen de soluto)/(volumen de disolución)] x 100%.

Las expresiones "porcentaje en peso", "porcentaje en peso (% en peso)" y "porcentaje en peso-peso (% en p/p)" se usan indistintamente en este documento. El porcentaje en peso se refiere al porcentaje de un material en masa, tal como está comprendido en una composición, mezcla o disolución.

Los términos y expresiones "polinucleótido", "secuencia polinucleotídica" y "secuencia de ácido nucleico" se usan indistintamente en el presente documento. Estos términos y expresiones abarcan secuencias de nucleótidos y similares. Un polinucleótido puede ser un polímero de ADN o ARN que es monocatenario o bicatenario, que opcionalmente contiene bases nucleotídicas sintéticas, no naturales o alteradas. Un polinucleótido puede estar compuesto por uno o más segmentos de ADNc, ADN genómico, ADN sintético o mezclas de los mismos. Los nucleótidos (ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos) pueden denominarse mediante una designación de una sola letra de la siguiente manera: "A" para adenilato o desoxiadenilato (para ARN o ADN, respectivamente), "C" para citidilato o desoxicitidilato (para ARN o ADN, respectivamente), "G" para guanilato o desoxiguanilato (para ARN o ADN, respectivamente), "U" para uridilato (para ARN), "T" para desoxitimidilato (para ADN), "R" para purinas (A o G), "Y" para pirimidinas (C o T), "K" para G o T, "H" para A o C o T, "I" para inosina, "W" para A o T, y "N" para cualquier nucleótido (por ejemplo, N puede ser A, C, T o G, si se refiere a una secuencia de ADN; N puede ser A, C, U o G, si se refiere a una secuencia de ARN). Cualquier secuencia de ARN (por ejemplo, ARNcr, ARNtracr, ARNg) descrita en el presente documento puede estar codificada por una secuencia de ADN adecuada.

El término "aislado" se refiere a una molécula de polinucleótido o de polipéptido que se ha purificado total o parcialmente a partir de su fuente nativa. En algunos casos, la molécula de polinucleótido o de polipéptido aislada es parte de una composición, sistema tampón o mezcla de reactivos mayor. Por ejemplo, la molécula de polinucleótido o polipéptido aislada puede estar comprendida dentro de una célula u organismo de una manera heteróloga.

El término "gen" se refiere a una secuencia polinucleotídica de ADN que expresa un ARN (el ARN se transcribe a partir de la secuencia polinucleotídica de ADN) de una región codificadora, cuyo ARN puede ser un ARN mensajero (que codifica una proteína) o un ARN que no codifica una proteína. (por ejemplo, un ARNcr, ARNtracr o ARNg en este documento). Un gen puede referirse a la región codificadora sola, o puede incluir secuencias reguladoras cadena arriba y/o cadena abajo de la región codificadora (por ejemplo, promotores, regiones 5' no traducidas, regiones terminadoras de la transcripción 3'). Una región codificadora que codifica una proteína puede denominarse como alternativa en el presente documento "marco de lectura abierto" (ORF). Un gen que es "nativo" o "endógeno" se refiere a un gen que se encuentra en la naturaleza con sus propias secuencias reguladoras; dicho gen se encuentra en su ubicación natural en el genoma de una célula huésped. Un gen "quimérico" se refiere a cualquier gen que no es un gen nativo, que comprende secuencias reguladoras y codificadoras que no se encuentran juntas en la naturaleza (es decir, las regiones reguladoras y codificadoras son heterólogas entre sí). Por consiguiente, un gen quimérico puede comprender secuencias reguladoras y secuencias codificadoras que se derivan de diferentes fuentes, o secuencias reguladoras y secuencias codificadoras derivadas de la misma fuente, pero dispuestas de una manera diferente a la que se encuentra en la naturaleza. Un gen "extraño" o "heterólogo" se refiere a un gen que se introduce en el organismo huésped mediante transferencia génica. Los genes extraños/heterólogos pueden comprender genes nativos insertados en un organismo no nativo, genes nativos introducidos en una nueva ubicación dentro del huésped nativo o genes quiméricos. Las secuencias polinucleotídicas en ciertas realizaciones descritas en este documento son heterólogas. Un marco de lectura abierto "con codones optimizados" tiene su frecuencia de uso de codones diseñada para imitar la frecuencia de uso de codones preferido de la célula huésped.

Un "gen modificado" o "gen editado" se refiere a un gen de interés que comprende al menos una alteración en comparación con su secuencia génica no modificada. Tales "alteraciones" incluyen, por ejemplo: (i) reemplazo de al menos un nucleótido, (ii) una deleción de al menos un nucleótido, (iii) una inserción de al menos un nucleótido, o (iv) cualquier combinación de (i)-(iii).

"Secuencias reguladoras", como se usa en este documento, se refiere a secuencias de nucleótidos ubicadas cadena arriba del sitio de inicio de la transcripción de un gen (por ejemplo, promotor), regiones 5' no traducidas y regiones 3' no codificadoras, y que pueden influir en la transcripción, el procesamiento o la estabilidad, o la traducción de un ARN transcrito a partir del gen. Las secuencias reguladoras de la presente pueden incluir promotores, potenciadores, silenciadores, secuencias conductoras no traducidas 5', intrones, secuencias de reconocimiento de poliadenilación, sitios de procesamiento de ARN, sitios de unión de efectores, estructuras de tallo-bucle y otros elementos involucrados en la regulación de la expresión génica. Uno o más elementos reguladores de la presente pueden ser heterólogos con respecto a una región codificadora de la presente.

Un "promotor", como se usa en este documento, se refiere a una secuencia de ADN capaz de controlar la transcripción de ARN de un gen. En general, una secuencia de promotor está cadena arriba del sitio de inicio de la transcripción de un gen. Los promotores pueden derivarse en su totalidad de un gen nativo, o estar compuestos de diferentes elementos derivados de diferentes promotores que se encuentran en la naturaleza, o incluso comprender segmentos de ADN sintéticos. Los promotores que hacen que un gen se exprese en una célula en la mayoría de los casos y en todas las circunstancias se denominan comúnmente "promotores constitutivos". Uno o más promotores de la presente pueden ser heterólogos con respecto a una región codificadora de la presente.

Un "promotor fuerte" como se usa en este documento se refiere a un promotor que puede dirigir un número relativamente grande de iniciaciones productivas por unidad de tiempo y/o es un promotor que dirige un nivel más alto de transcripción de genes que el nivel de transcripción promedio de los genes en una célula.

Los promotores constitutivos de E. coli son bien conocidos en la técnica e incluyen promotores que carecen de regulación por un factor de transcripción y que son reconocidos solo por la ARN polimerasa (Shimada T., Yamazaki Y., Tanaka K., Ishihama A., The Whole Set of Constitutive Promoters Recognized by RNA Polymerase RpoD Holoenzyme of Escherichia coli, PLos One, 2014, 6 de marzo, 9 (3): e90447; Scienci, 2002, Stochastic Gene Expression in a Single Cell, vol. 297, n.° 5584, pp. 1183-1186).

Los términos "secuencia no codificadora 3'", "terminador de la transcripción" y "terminador", como se usan en el presente documento, se refieren a secuencias de ADN ubicadas cadena abajo de una secuencia codificadora. Esto incluye secuencias de reconocimiento de poliadenilación y otras secuencias que codifican señales reguladoras capaces de afectar el procesamiento del ARNm o la expresión génica.

El término "módulo", como se usa en el presente documento, se refiere a un promotor operativamente unido a una secuencia de ADN que codifica un ARN que codifica una proteína o un ARN que no codifica una proteína. Opcionalmente, un módulo puede estar unido operativamente a una secuencia no codificadora 3'.

Los términos "cadena arriba" y "cadena abajo" como se usan en este documento con respecto a polinucleótidos se refieren a "5' de" y "3' de", respectivamente.

El término "expresión", como se usa en este documento, se refiere a (i) transcripción del ARN (por ejemplo, ARNm o un ARN que no codifica una proteína, como ARNcr, ARN tracr o ARNg) desde una región codificadora, o (ii) traducción de un polipéptido a partir de ARNm.

Cuando se usan para describir la expresión de un gen o secuencia polinucleotídica, los términos y expresiones "regulación negativa", "disrupción", "inhibición", "inactivación" y "silenciamiento" se usan indistintamente en el presente documento para referirse a casos en los que la transcripción de la secuencia polinucleotídica se reduce o se elimina. Esto da como resultado la reducción o eliminación de los transcritos de ARN de la secuencia polinucleotídica, lo que da como resultado una reducción o eliminación de la expresión de proteínas derivada de la secuencia polinucleotídica (si el gen comprendía un ORF). Como alternativa, la infrarregulación puede referirse a casos en los que se reduce o elimina la traducción de proteínas desde los transcritos producidos por la secuencia polinucleotídica. Como alternativa además, la infrarregulación puede referirse a casos en los que una proteína expresada por la secuencia polinucleotídica tiene actividad reducida. La reducción de cualquiera de los procesos anteriores (transcripción, traducción, actividad de proteínas) en una célula puede ser de aproximadamente un 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, o el 100% con respecto a la transcripción, traducción o actividad de proteínas de una célula de control adecuada. La infrarregulación puede ser el resultado de un acontecimiento de localización como se describe en este documento (por ejemplo, indel, knock-out), por ejemplo.

Las expresiones "célula de control" y "célula de control adecuada" se utilizan indistintamente en el presente documento y pueden referirse a una célula en la que se ha realizado una modificación particular (por ejemplo, sobreexpresión de un polinucleótido, infrarregulación de un polinucleótido) (es decir, una "célula experimental"). Una célula de control puede ser cualquier célula que no tenga o no exprese la modificación particular de la célula experimental. Por ejemplo, una célula de control puede ser un progenitor directo de la célula experimental, y dicha célula progenitora directo no tiene la modificación particular que se encuentra en la célula experimental. Como alternativa, una célula de control puede ser un progenitor de la célula experimental que se elimina en una o más generaciones. Como alternativa además, una célula de control puede ser una hermana de la célula experimental, y dicha hermana que no comprende la modificación particular que está presente en la célula experimental.

El término "aumentado" como se usa en este documento puede referirse a una cantidad o actividad que es al menos aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 50%, 100% o 200% mayor que la cantidad o actividad para la cual la cantidad o la actividad aumentada se está comparando. Los términos y expresiones "aumentado", "elevado", "potenciado", "mayor que" y "mejorado" se usan indistintamente en el presente documento. El término "aumentado" puede usarse para caracterizar la expresión de un polinucleótido que codifica una proteína, por ejemplo, cuando una "expresión aumentada" también puede significar "sobreexpresión".

La expresión "unido operativamente" como se usa en este documento se refiere a la asociación de dos o más secuencias de ácido nucleico de manera que la función de una se ve afectada por la otra. Por ejemplo, un promotor está unido operativamente con una secuencia codificadora cuando es capaz de afectar la expresión de esa secuencia codificadora. Es decir, la secuencia codificadora está bajo el control transcripcional del promotor. Las secuencias codificadoras pueden unirse operativamente a secuencias reguladoras, por ejemplo. Además, por ejemplo, un ARNcr se puede unir (fusionar) operativamente a un ARNtracr en el presente documento de manera que la secuencia de apareamiento de ARNtracr del ARNcr se hibrida con la secuencia 5' del ARNtracr.

El término "recombinante", como se usa en el presente documento, se refiere a una combinación artificial de dos segmentos de secuencia separados de otro modo, por ejemplo, mediante síntesis química o mediante la manipulación de segmentos aislados de ácidos nucleicos mediante técnicas de ingeniería genética.

Los métodos para preparar construcciones/vectores recombinantes en este documento (por ejemplo, un polinucleótido de ADN que codifica un módulo de componente de ARN en este documento, o un polinucleótido de ADN que codifica una proteína Cas o una proteína de fusión de Cas-CPP en este documento) pueden utilizar las técnicas convencionales de clonación molecular y de ADN recombinante como se describe en J. Sambrook y D. Russell (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001); T.J. Silhavy et al. (Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, n Y, 1984); y F.M. Ausubel et al. (Short Protocols in Molecular Biology, 5a edición, Current Protocols, John Wiley and Sons, Inc., NY, 2002), por ejemplo.

Un "marcador fenotípico" es un marcador seleccionable que incluye marcadores visuales y marcadores seleccionables, ya sea un marcador seleccionable positivo o negativo. Puede utilizarse cualquier marcador fenotípico. Específicamente, un marcador seleccionable comprende un segmento de ADN que permite identificar, o seleccionar a favor o en contra una molécula o una célula que lo contiene, a menudo bajo condiciones particulares. Estos marcadores pueden codificar una actividad, tal como, pero sin limitarse a la producción de ARN, péptidos o proteínas, o pueden proporcionar un sitio de unión para ARN, péptidos, proteínas, compuestos o composiciones inorgánicos y orgánicos y similares.

Los ejemplos de marcadores seleccionables para E. coli incluyen resistencia a antibióticos (ampicilina, carbenicilina, penicilina, cloranfenicol, kanamicina, tetraciclina, eritromicina, espectinomicina, estreptomicina) y marcadores auxotróficos (biosíntesis de aminoácidos, utilización de azúcares y biosíntesis de vitaminas) (Methods for General and Molecular Biology, 1994, ASM Press, Washington D.C.).

Los marcadores detectables en E. coli incluyen proteínas fluorescentes (GFP, RFP, CFP, YFP), utilización de azúcares (lactosa, ribosa, glucosa, sacarosa, galactosa, glicerol) (Methods for General and Molecular Biology, 1994, ASM Press, Washington D.C .). y la generación de sitios de unión a cebadores exclusivos.

La expresión y el término "identidad de secuencia" o "identidad" como se usa en este documento con respecto a secuencias polinucleotídicas o polipeptídicas se refieren a los restos de ácido nucleico o restos aminoácidos en dos secuencias que son iguales cuando se alinean para una correspondencia máxima en una ventana de comparación especificada. Por lo tanto, "porcentaje de identidad de secuencia" o "porcentaje de identidad" se refiere al valor determinado comparando dos secuencias alineadas de manera óptima en una ventana de comparación, en las que la porción de la secuencia polinucleotídica o polipeptídica en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, huecos) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones ni deleciones) para un alineamiento óptimo de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones en las que aparece la base de ácido nucleico o el resto aminoácido idéntico en ambas secuencias para obtener el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes entre el número total de posiciones en la ventana de comparación. y multiplicar los resultados por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia. Se entenderá que, al calcular la identidad de secuencia entre una secuencia de ADN y una secuencia de ARN, los restos T de la secuencia de ADN se alinean y pueden considerarse "idénticos" a los restos U de la secuencia de ARN. Para determinar el porcentaje de complementariedad del primer y segundo polinucleótido, este se puede obtener determinando (i) el porcentaje de identidad entre el primer polinucleótido y la secuencia del complemento del segundo polinucleótido (o viceversa), por ejemplo, y/o (ii) ) el porcentaje de bases entre el primer y el segundo polinucleótido que crearía pares de bases canónicas de Watson y Crick.

El algoritmo Basic Local Alignment Search Tool (BLAST), que está disponible en línea en el sitio web del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI), se puede utilizar, por ejemplo, para medir el porcentaje de identidad entre dos o más de las secuencias polinucleotídicas (algoritmo BLASTN) o secuencias polipeptídicas (algoritmo BLASTP) descritas en el presente documento. Como alternativa, el porcentaje de identidad entre secuencias se puede obtener usando un algoritmo Clustal (por ejemplo, ClustalW o ClustalV). Para alineaciones múltiples usando un método de alineamiento Clustal, los valores predeterminados pueden corresponder a PENALIZACIÓN DE HUECO = 10 y PENALIZACIÓN DE LONGITUD DE HUECO = 10. Los parámetros predeterminados para alineamientos apareados y el cálculo del porcentaje de identidad de secuencias de proteínas usando un método Clustal pueden ser KTUPLE = 1, PENALIZACIÓN DE HUECO = 3, VENTANA = 5 y DIAGONALES GUARDADAS = 5. Para los ácidos nucleicos, estos parámetros pueden ser KTUPLE = 2, PENALIZACIÓN DE HUECO = 5, VENTANA = 4 y DIAGONALES GUARDADAS = 4. Como alternativa además, el porcentaje de identidad entre secuencias se puede obtener usando un algoritmo EMBOSS (por ejemplo, aguja) con parámetros como APERTURA DE HUECO = 10, EXTENSIÓN DE HUECO = 0,5, PENALIZACIÓN DE HUECO FINAL = falso, APERTURA DE HUECO FINAL = 10, EXTENSIÓN DE HUECO FINAL = 0,5 utilizando una matriz BLOSUM (por ejemplo, BLOSUM62).

En este documento, una primera secuencia que es "complementaria" con una segunda secuencia puede denominarse, como alternativa, como que está en la orientación "antisentido" con la segunda secuencia.

En el presente documento se describen diversas secuencias de aminoácidos de polipéptidos y secuencias polinucleotídicas características de ciertas realizaciones de la descripción descrita. Pueden usarse variantes de estas secuencias que son al menos aproximadamente 70-85%, 85-90% o 90%-95% idénticas a las secuencias descritas en este documento. Como alternativa, una secuencia de aminoácidos o secuencia polinucleotídica variante puede tener al menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad con una secuencia descrita en este documento. La secuencia de aminoácidos o secuencia polinucleotídica variante tiene la misma función/actividad que la secuencia descrita, o al menos aproximadamente 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de la función/actividad de la secuencia descrita.

Todos los restos aminoácidos descritos en el presente documento en cada posición de aminoácido de las proteínas Cas9 en este documento son ejemplos. Dado que ciertos aminoácidos comparten características estructurales y/o de carga similares entre sí (es decir, conservados), el aminoácido en cada posición en una Cas9 puede ser el que se proporciona en las secuencias descritas o puede sustituirse por un resto aminoácido conservado ("sustitución de aminoácidos conservativa") de la siguiente manera:

1. Los siguientes restos alifáticos, no polares o ligeramente polares pequeños pueden sustituirse entre sí: Ala (A), Ser (S), Thr (T), Pro (P), Gly (G);

2. Los siguientes restos polares cargados negativamente y sus amidas pueden sustituirse entre sí: Asp (D), Asn (N), Glu (E), Gln (Q);

3. Los siguientes restos polares cargados positivamente pueden sustituirse entre sí: His (H), Arg (R), Lys (K);

4. Los siguientes restos alifáticos no polares pueden sustituirse entre sí: Ala (A), Leu (L), Ile (I), Val (V), Cys (C), Met (M); y

5. Los siguientes restos aromáticos grandes pueden sustituirse entre sí: Phe (F), Tyr (Y), Trp (W).

Un genoma de una célula bacteriana, como una célula de E. coli, en este documento se refiere a una molécula de ADN que puede existir en una célula de forma autónoma (puede replicarse y pasar a las células hijas). El ADN genómico puede ser nativo o heterólogo con una célula. Los ejemplos de ADN genómico en E. coli incluyen el ADN ubicado en una gran molécula de ADN circular, así como el ADN plasmídico.

El término "célula" en el presente documento se refiere a cualquier tipo de célula, como una célula procariota o eucariota. Una célula eucariota tiene un núcleo y otras estructuras rodeadas de membrana (orgánulos), mientras que una célula procariota carece de núcleo. Una célula en determinadas realizaciones puede ser una célula de mamífero o una célula que no es de mamífero. Las células que no son de mamífero pueden ser eucariotas o procariotas. Por ejemplo, una célula que no es de mamífero en el presente documento puede referirse a una célula microbiana o una célula de un organismo multicelular que no es un mamífero, tal como una planta, insecto, nematodo, especies de aves, anfibios, reptiles o peces. Una célula microbiana en el presente documento puede referirse a una célula fúngica (por ejemplo, célula de levadura), célula procariota, célula protista (por ejemplo, célula de alga), célula euglenoide, célula de estramenopilo o célula de oomiceto, por ejemplo. Una célula procariota en el presente documento puede referirse a una célula bacteriana o una célula arquea, por ejemplo.

Una célula bacteriana puede ser una bacteria en forma de cocos, bacilos, espiroquetas, esferoplastos, protoplastos, etc. Otros ejemplos no limitantes de bacterias incluyen bacterias que son Gram negativas y Gram positivas. Otros ejemplos no limitantes de bacterias incluyen los del género Salmonela (por ejemplo, S. typhi, S. enteritidis), Shigella (por ejemplo, S. dysenteriae), Escherichia (por ejemplo, E. coli), Enterobacter, Serratia, Proteus, Yersinia, Citrobacter, Edwardsiella, Providencia, Klebsiella, Hafnia, Ewingella, Kluyvera, Morganella, Planococcus, Stomatococcus, Micrococcus, Staphylococcus (por ejemplo, S. aureus, S. epidermidis), Vibrio (por ejemplo, V. cholerae), Aeromonas, Plessiomonas, Haemophilus (por ejemplo, H. influenzae), Actinobacillus, Pasteurella, Mycoplasma (por ejemplo, M. pneumonía), Ureaplasma, Rickettsia, Coxiella, Rochalimaea, Ehrlichia, Streptococcus (por ejemplo, S. pyogenes, S. mutans, S. pneumoniae), Enterococcus (por ejemplo, E. faecalis), Aerococcus, Gemella, Lactococcus (por ejemplo, L. lactis), Leuconostoc (por ejemplo, L. mesenteroides), Pedicoccus, Bacillus (por ejemplo, B. cereus, B. subtilis, B. thuringiensis), Corynebacterium (por ejemplo, C. diphtheriae), Arcanobacterium, Actinomyces, Rhodococcus, Listeria (por ejemplo, L. monocytogenes), Erysipelothrix, Gardnerella, Neisseria (por ejemplo, N. meningitidis, N. gonorrhoeae), Campylobacter, Arcobacter, Wolinella, Helicobacter (por ejemplo, H. pylori), Achromobacter, Acinetobacter, Agrobacterium (por ejemplo, A. tumefaciens), Alcaligenes, Chryseomonas, Comamonas, Eikenella, Flavimonas, Flavobacterium, Moraxella, Oligella, Pseudomonas (por ejemplo, P. aeruginosa), Shewanella, Weeksella, Xanthomonas, Bordetella, Franciesella, Brucella, Legionella, Afipia, Bartonella, Calymmatobacterium, Cardiobacterium, Streptobacillus, Spirillum, Peptostreptococcus, Peptococcus, Sarcinia, Cobactinococcus, Lacacteria, Cobacterium, Cobacterium, Cobacterium, Bumprococium, (por ejemplo, L. lactis, L. acidophilus), Rothia, Clostridium (por ejemplo, C. botulinum, C. perfringens), Bacteroides, Porphyromonas, Prevotella, Fusobacterium, Bilophila, Leptotrichia, Wolinella, Acidaminococcus, Megasphaera, Veilonella, Norcardia, Actinomadura, Norcardiopsis, Streptomyces, Micropolysporascetes, Thermoactomyces (por ejemplo, M. tuberculosis, M. bovis, M. leprae), Treponema, Borrelia (por ejemplo, B. burgdorferi), Leptospira y Chlamydiae. Una bacteria puede caracterizarse opcionalmente como una plaga/patógeno de una planta o animal (por ejemplo, un ser humano) en ciertas realizaciones. Las bacterias pueden estar comprendidas en una población microbiana mixta (por ejemplo, que contenga otras bacterias o que contenga levaduras y/u otras bacterias) en determinadas realizaciones.

Una célula de arquea en ciertas realizaciones puede ser de cualquier filo de Archaeal, tal como Euryarchaeota, Crenarchaeota, Nanoarchaeota, Korarchaeota, Aigarchaeota o Thaumarchaeota. Las células de arqueas de la presente pueden ser extremófilas (por ejemplo, capaces de crecer y/o prosperar en condiciones física o geoquímicamente extremas que son perjudiciales para la mayoría de la vida), por ejemplo. Algunos ejemplos de arqueas extremófilas incluyen aquellas que son termófilas (por ejemplo, pueden crecer a temperaturas entre 45-122 °C), hipertermófilas (por ejemplo, pueden crecer a temperaturas entre 80-122 °C), acidófilas (por ejemplo, pueden crecer a niveles de pH de 3 o menos), alcalíficas (por ejemplo, puede crecer a niveles de pH de 9 o superiores) y/o halófilas (por ejemplo, puede crecer en altas concentraciones de sal [por ejemplo, 20-30% de NaCl]). Los ejemplos de especies de arqueas incluyen las pertenecientes a los géneros Halobacterium (por ejemplo, H. volcanii), Sulfolobus (por ejemplo, S. solfataricus, S. acidocaldarius), Thermococcus (por ejemplo, T. alcaliphilus, T. celer, T. chitonophagus, T. gammatolerans, T. hydrothermalis, T. kodakarensis, T. litoralis, T. peptonophilus, T. profundus, T. stetteri), Methanocaldococcus (por ejemplo, M. thermolithotrophicus, M. jannaschii), Methanococcus (por ejemplo, M. maripaludis), Methanothermobacter (por ejemplo, M. marburgensis, M. thermautotrophicus), Archaeoglobus (por ejemplo, A. fulgidus), Nitrosopumilus (por ejemplo, N. maritimus), Metallosphaera (por ejemplo, M. sedula), Ferroplasma, Thermoplasma, Methanobrevibacter (por ejemplo, M. smithii), y Methanosphaera (por ejemplo, M. stadtmanae).

La recombinación permite la edición de ADN bacteriano utilizando moldes de edición de polinucleótidos lineales bicatenarios y monocatenarios (Datsenko K.A., Wanner B.L., 2000, One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 97:6640-6645; Thomason L.C., Sawitzke J.A., Li X., Costantino N., Court D.L., 2014. Recombineering: genetic engineering in bacteria using homologous recombination, Current protocols in molecular biology, editado por Frederick M. Ausubel et al., 106: 11611-11 1639). Para utilizar un molde de edición lineal o monocatenario, se requiere la expresión de proteínas recombinasas de fagos exógenos (Datsenko K.A., Wanner B.L., 2000, One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 97:6640-6645; patente de EE. UU. 7.736.851, Método de clonación de ADN, publicada el 15 de enero de 2010). Normalmente, se pueden generar pequeños cambios, tales como mutaciones puntuales o deleciones, utilizando moldes de edición de oligonucleótidos monocatenarios cortos. Sin embargo, para cambios más grandes o inserciones de genes, se requiere la presencia de un marcador seleccionable en el molde de edición de polinucleótidos para aislar las colonias que contienen la edición deseada debido a la baja frecuencia de recombinación (aproximadamente 10-5 a 10-7). Una vez que se realiza la edición, se debe eliminar el marcador seleccionable, lo que a menudo deja cicatrices en el genoma (Datsenko K.A., Wanner B.L., 2000, One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 97:6640-6645).

La recombinasa o recombinasas exógenas incluyen proteínas de sistemas de recombinación homóloga proporcionados además de la maquinaria de recombinación homóloga nativa de las células (es decir, expresada por medios no naturales).

Una proteína RecET incluye proteínas de la vía de recombinación homóloga independiente de recA e independiente de ATP del profago Rac (Kuzminov A., 1999, Recombinational repair of DNA damage in Escherichia coli and bacteriophage lambda, Microbiology and molecular biology reviews: MMBR, 63:751-813).

Una proteína rojo lambda incluye proteínas rojo, rojop y rojoY del fago lambda (Smith G.R., 1988, Homologous recombination in procaryotes, Microbiological reviews, 52:1-28).

Un inhibidor de RecBCD incluye una proteína que se une e inhibe la función de RecBCD (por ejemplo, proteína Gam de lambda) (Murphy K.C., 2007, The gamma Gam Protein Inhibits RecBCD Binding to dsDNA Ends, Journal of molecular biology, 371:19-24).

Una secuencia polinucleotídica de ADN que comprende (i) un promotor operativamente unido a (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica un ARN guía o una endonucleasa Cas puede usarse típicamente para la expresión estable y/o transitoria del ARN guía o la endonucleasa cas descrita en este documento. Dicha secuencia polinucleotídica puede estar comprendida dentro de un plásmido, cósmido, fágmido, cromosoma artificial bacteriano (BAC), virus o ADN lineal (por ejemplo, producto de PCR lineal), por ejemplo, o cualquier otro tipo de vector o construcción útil para suministrar una secuencia polinucleotídica a una célula.

Los promotores bacterianos incluyen el promotor del bacteriófago A izquierdo (PL) (Menart V., Jevsevar S., Vilar M., Trobis A., Pavko A., 2003, Constitutive versus thermoinducible expression of heterologous proteins in Escherichia coli based on strong PR,PL promoters from phage lambda, Biotechnology and bioengineering, 83:181-190), promotor del bacteriófago A derecho (PR) (Menart V., Jevsevar S., Vilar M., Trobis A., Pavko A., 2003, Constitutive versus thermoinducible expression of heterologous proteins in Escherichia coli based on strong PR,PL promoters from phage lambda, Biotechnology and bioengineering, 83:181-190), el promotor del operón de utilización de arabinosa (PBAD) (Guzmán L.M., Belin D., Carson M.J., Beckwith J., 1995, Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose PBAD promoter, Journal of bacteriology, 177:4121-4130), promotores controlados por ARN polimerasa del fago T7 (PT7) (Ikeda R.A., Ligman C.M., Warshamana S., 1992, T7 promoter contacts essential for promoter activity in vivo, Nuclei Acids Research, 20:2517-2524), el promotor del operón de utilización de lactosa de E. coli (Plac) (Gronenborn B., 1976, Overproduction of phage Lambda repressor under control of the lac promotor of Escherichia coli, Molecular & general genetics: MGG, 148: 243-250), promotores híbridos trp y lac (Ptac) (de Boer H.A., Comstock L.J., Vasser M., 1983, The Tac Promoter: A Functiona1Hybrid Derived from the Trp and Lac Promoters, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 80:21-25) y el promotor del fago T5 (PT5) (Bujard H., Gentz R., Lanzer M., Stueber D., Mueller M., Ibrahimi I., Haeuptle M.T., Dobberstein B., 1987, A T5 promoter-based transcription-translation system for the analysis of proteins in vitro and in vivo, Methods in enzymology, 155:416-433). Se han descrito otros promotores adecuados para la expresión en bacterias (Green M.R., Sambrook J., 2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, cuarta edición, ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Karp P.D. et al., 2014, The EcoCyc Database, EcoSal Plus 2014; Keseler I.M. et al., 2011, EcoCyc: a comprehensive database of Escherichia coli biology, Nucleic acidos research, 39: D583-590).

En determinadas realizaciones, un polinucleótido de ADN que comprende un módulo para expresar un componente de ARN comprende una secuencia de terminación de la transcripción adecuada cadena abajo de la secuencia del componente de ARN. Se describen ejemplos de secuencias de terminación de la transcripción útiles en la presente en la publicación de solicitud de patente de EE.UU. n.° 2014/0186906. Tales realizaciones típicamente comprenden 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más restos después del final de la secuencia del componente de ARN, dependiendo de la elección de la secuencia de terminación. Estos restos adicionales pueden ser todos restos U, o al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de restos U, por ejemplo, dependiendo de la elección de la secuencia del terminador. Como alternativa, una secuencia de ribozima (por ejemplo, cabeza de martillo o ribozima HDV) puede estar 3' (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más nucleótidos cadena abajo) de la secuencia del componente de ARN, por ejemplo. Una secuencia de ribozima 3' se puede colocar en consecuencia de modo que se escinda ella misma de la secuencia del componente de ARN; esta escisión daría lugar a una transcripción que termina exactamente al final de la secuencia del componente de ARN, o con 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más restos después del final de la secuencia del componente de ARN, por ejemplo.

Un método de localización en el presente documento se puede realizar de tal manera que, por ejemplo, se localizan dos o más sitios de ADN diana en el método. Un método de este tipo se puede caracterizar opcionalmente como un método multiplex. Dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más sitios diana se pueden ser localizados al mismo tiempo en determinadas realizaciones. Un método multiplex se realiza típicamente mediante un método de localización en el presente documento en el que se proporcionan múltiples componentes de ARN diferentes, cada uno diseñado para guiar un RGEN a un sitio diana de ADN exclusivo. Por ejemplo, se pueden usar dos o más componentes de ARN diferentes para preparar una mezcla de complejos de RGEN-CPP in vitro (por ejemplo, siguiendo un procedimiento descrito en este documento para asociar un componente de ARN con un complejo de proteína RGEN-CPP), mezcla que luego se pone en contacto con una célula.

Otro aspecto de la localización multiplex de la presente invención puede comprender proporcionar dos o más componentes de ARN diferentes en una célula que se asocian con los componentes de la proteína RGEN de los complejos de proteína RGEN-CPP que se han introducido en la célula. Dicho método puede comprender, por ejemplo, proporcionar a la célula (i) polinucleótidos de ADN individuales, cada uno de los cuales expresa un componente de ARN particular y/o (ii) al menos un polinucleótido de ADN que codifica dos o más componentes de ARN (por ejemplo, véase más adelante la descripción sobre módulos de componente de ARN-ribozima en tándem).

Un método multiplex opcionalmente puede localizar sitios de ADN diana muy cercanos a la misma secuencia (por ejemplo, un promotor o marco de lectura abierto y/o sitios que están distantes entre sí (por ejemplo, en diferentes genes y/o cromosomas). Un método multiplex, en otras realizaciones, se puede realizar con (para HR) o sin (para NHEJ que conduce a indel y/o sustitución de bases) moldes de modificación de polinucleótidos adecuados dependiendo del resultado deseado de la localización (si se usa un RGEN competente para endonucleasas o nickasas). En otras realizaciones, se puede realizar un método multiplex con un RGEN de represión o activación como se describe en este documento. Por ejemplo, se pueden proporcionar RGEN de represión múltiple que infrarregulen un conjunto de genes, tales como genes implicados en una vía metabólica particular.

Ejemplos

La descripción descrita se define adicionalmente en los siguientes ejemplos. Debe entenderse que estos ejemplos, aunque indican ciertos aspectos preferidos de la descripción, se ofrecen únicamente a modo de ilustración. A partir del análisis anterior y de estos ejemplos, los expertos en la técnica pueden determinar las características esenciales de esta descripción y pueden realizar varios cambios y modificaciones de la descripción para adaptarla a diversos usos y condiciones.

Ejemplo 1

Construcción de un vector de expresión de endonucleasa Cas9 para su uso en Escherichia coli

En este ejemplo, un vector de expresión de Cas9 inducible para la edición del genoma en Escherichia coli fue construido. Se confirmó la expresión de Cas9 en respuesta a un inductor.

El gen Cas9 de Streptococcus pyogenes M1 GAS SF370 (SEQ ID NO:1) se sometió a una optimización de codones para Yarrowia según técnicas convencionales conocidas en la técnica (SEQ ID NO:2). Para localizar la proteína Cas9 al núcleo de las células, se incorporó la señal de localización nuclear monopartita (MAPKKKRKV, SEQ ID NO:3) del virus de simio 40 (SV40) en el extremo carboxi del marco de lectura abierto de Cas9. El gen Cas9 optimizado para codones de Yarrowia se condensó con un promotor constitutivo de Yarrowia, FBA1 (SEQ ID NO:4), mediante técnicas convencionales de biología molecular. Un ejemplo de un módulo de expresión de Cas9 optimizado para codones de Yarrowia (SEQ ID NO:5) contiene el promotor FBA constitutivo, Cas9 optimizado para codones de Yarrowia y la señal de localización nuclear de SV40. El módulo de expresión de Cas9 se clonó en el plásmido pZuf y la nueva construcción denominada pZufCas9 (SEQ ID NO:6).

El gen de fusión SV40-Cas9 optimizado para codones de Yarrowia (SEQ ID NO:7) se amplificó a partir de pZufCas9 usando técnicas convencionales de biología molecular. Los cebadores para la reacción fueron GGGGGAATTCGACAAGAAATACTCCATCGGCCTGG (directo, SEQ ID NO:8) y CCCCAAGCTTAGCGGCCGCTTAGACCTTTCG (inverso, SEQ ID NO:9) añadiendo un sitio EcoRI 5' y un sitio HindIII 3' a la fusión. El producto de PCR (SEQ ID NO:10) se purificó usando técnicas convencionales. El fragmento purificado se clonó en los sitios EcoRI y HindIII de pBAD/HisB de Life Technologies (SEQ ID NO:11) para crear pRF48 (SEQ ID NO:12).

Se transformaron células de E. coli Top10 (Life Technologies) con pRF48. Las células transformadas se mantuvieron en caldo de cultivo L (triptona al 1% (en p/v), extracto de levadura al 0,5% (en p/v), NaCl al 1% (en p/v) ampicilina 100 pg/ml glucosa al 0,4% (en p/v) para reprimir la expresión de la proteína Cas9. Las células se cultivaron a 37 °C durante la noche a 220 rpm en caldo de cultivo L ampicilina 100 pg/ml glucosa al 0,4% (en p/v). Las células se diluyeron 1:100 en 1 l de medio 2x YT (triptona al 1,6%, extracto de levadura al 1,0% (en p/v), NaCl al 0,5% (en p/v)) en un matraz Fernbach de 2,8 l. El cultivo se hizo crecer a 37 °C, 220 RPM, hasta que la DO600 alcanzó 0,438. Se sedimentó 1 ml de cultivo y se resuspendió en 43,8 pl de 1x tampón Laemmli y se congeló a -20 °C. Se añadió L-arabinosa a una concentración final del 0,2% (en p/v) para inducir al promotor P^badque dirige al gen Cas9 optimizado para Yarrowia. El cultivo se cambió a 18 °C, 180 RPM, durante 20 horas.

Después de la inducción con L-arabinosa, la DO600 fue de 3,01. Se sedimentó una parte alícuota de 0,332 ml de cultivo. Las células se resuspendieron en 100 pl de 1X tampón Laemmeli. Tanto las muestras de preinducción como las de posinducción se calentaron a 95 °C durante 5 minutos y se cargaron 10 pl en un gel de poliacrilamida-SDS de trisglicina al 12,5%. Se aplicaron 200 voltios al gel durante 30 minutos. El gel se tiñó usando tinción azul simple para resolver las bandas de proteínas. La expresión de la proteína Cas9 optimizada para Yarrowia en E. coli bajo el control de un promotor inducible por arabinosa fue robusta (figura 4).

Ejemplo 2

Construcción de plásmidos de expresión circular que codifican ARN guía individuales que se dirigen al gen galK de E. coli

Para modificar (editar) el gen galK endógeno de E. coli, se identificaron cuatro (4) sitios diana de endonucleasa Cas9 dentro del gen galK de E. coli (figura 5): galK-1 (SEQ ID NO:13, tabla 1), galK-2 (SEQ ID NO:14, tabla 1), galK-3 (SEQ ID NO:15, tabla 1), y galK-4 (SEQ ID NO:16, tabla 1).

Tabla 1. Secuencias de localización para la edición del gen galK en E. coli.

Los fragmentos de ADN correspondientes a las secuencias diana genómicas de galK1 que carecen del dominio PAM (definido en la Tabla 1) se condensaron con el dominio de reconocimiento de Cas de Streptococcus pyogenes (SEQ ID NO:17), obteniendo moldes de ADN completo para ARN guía individuales. Los fragmentos de ADN que codifican los ARN guía se muestran en SEQ ID NO:18-21. Los ARNgu para gal 1K-1 a gal1-K4 se muestran en las SEQ ID NO:22-25.

Para expresar los ARNgu en células de E. coli se construyeron cuatro módulos de expresión de ARNgu (SEQ ID NO:28-31). Los ARNgu se pusieron bajo control del promotor P^ldel bacteriófago lambda (SEQ ID NO:26). Para inducir la terminación transcripcional del ARNgu, el extremo 3' del dominio CR se condensó con el terminador del bacteriófago lambda fuerte (SEQ iD NO:27). El módulo de expresión de ARNgu de GalK-1 (SEQ ID NO:28) se diseñó para dirigirse al sitio diana genómico de galK-1 (SEQ ID NO:13). El módulo de expresión de ARNgu de GalK-2 (SEQ ID NO:29) se diseñó para dirigirse al sitio diana genómico de galK-1 (SEQ ID NO:14). El módulo de expresión de ARNgu de GalK-3 (SEQ ID NO:30) se diseñó para dirigirse al sitio diana genómico de galK-3 (SEQ ID NO:15). El módulo de expresión de ARNgu de GalK-4 (SEQ ID NO:31) se diseñó para dirigirse al sitio diana genómico de galK-4 (SEQ ID NO:16).

Cada módulo de expresión de ARNgu contenía un sitio de restricción 5' HinDIII (AAGCTT) y un sitio de restricción 3' BamHI (GGATCC). Cada módulo de expresión de ARNgu se clonó en los sitios HinDIII/BamHI de pACYC184 (SEQ ID NO:32) para generar los plásmidos circulares (ver el plásmido de ARN guía, Figura 1 y Figura 2), pRF50 (dirigido a galK-1, SEQ ID NO:33 ), pRF51 (dirigido a galK-2, SEQ ID NO:34), pRF53 (dirigido a galK-3, SEQ iD NO: 35) y pRF55 (dirigido a galK-4, SEQ iD NO: 36).

Ejemplo 3

Construcción de plásmidos circulares que contienen el molde de modificación de polinucleótidos para la edición de genes en E. coli

Para habilitar la edición (modificación) de genes en E. coli utilizando, por ejemplo, la deleción del gen galK), se preparó un molde de modificación de polinucleótidos que carecía de una porción del gen galK (denominado molde de deleción de galK) de la siguiente manera:

El fragmento de 454 pb directamente 5' del sitio de inicio de la traducción del gen galK de E. coli (SEQ ID NO:37) se amplificó utilizando técnicas de PCR estándar utilizando un cebador directo (GGGaagcttggattatgttcagcgcgagc, SEQ ID NO:38) añadiendo un sitio de restricción 5' HinDIII para la clonación, y un cebador inverso (tgccagtgcgggagtttcgtTTCTTACACTCCGGATTCGC, SEQ ID NO:39) que añade 20 pb de la secuenciación directamente 3' del codón de fin del gen galK para producir el producto de extensión de solapamiento cadena arriba (SEQ ID NO:40). Los 376 pb directamente 3' del sitio de fin de la traducción del gen galK de E. coli (SEQ ID NO:41) se amplificó usando técnicas de PCR convencionales usando el cebador directo (GCGAATCCGGAGTGTAAGAAacgaaactcccgcactggca, SEQ ID NO:42) que añade 20 pb de la secuencia directamente 5' del codón de inicio del gen galK y un cebador inverso (GGGaagcttGCAAACAGCACCTGACGATCG, SEQ ID NO:43) que añade un sitio de restricción 3' HinDIII que produce el producto de extensión de solapamiento cadena abajo (SEQ ID NO:44). Los productos de PCR se purificaron usando columnas Zymo de limpieza y concentración. Se usaron 10 ng de cada producto de PCR para extender los 20 nt solapantes usando el cebador directo para el fragmento 5' (GGGaagcttggattatgttcagcgcgagc, SEQ ID NO:38) y el cebador inverso del fragmento 3' (GGGaagcttGCAAACAGCACCTGACGATCG, SEQ ID NO:43). El molde de deleción de galK de longitud completa (SEQ ID NO:45) se clonó en los sitios HinDIII del plásmido de replicación condicional pKD3 (SEQ ID NO:46) para crear un plásmido molde de deleción de galK circular pRF113 (SEQ ID NO:47). El plásmido molde de deleción de galK pRF113 (denominado plásmido molde en la Figura 1 y la Figura 2) carece de un módulo de expresión para una proteína Pi (Inuzuka M., 1985, Plasmid-encoded initiation protein is required for activity at all three origins of plasmid R6K DNA replication in vitro, FEBS letters, 181:236-240), lo que le hace incapaz de replicarse de forma autónoma. Por lo tanto, una vez que se proporciona este molde circular a una célula de E. coli, este puede funcionar como molde para la edición de genes mediada por RGEN, pero no se replicará y, por lo tanto, estará ausente en cualquier progenie que se cultive a partir de dicha célula de E. coli.

Ejemplo 4

Edición eficiente del genoma del gen galk en E. coli utilizando un sistema de ARN guía/endonucleasa Cas en combinación con un plásmido circular que contiene un molde de modificación de polinucleótidos

La cepa EF44 que contiene una deleción del gen galE de E. coli es sensible a la presencia de galactosa en el medio de crecimiento debido a la acumulación del producto tóxico fósforo-galactosa (Incorporate E. coli and S. typhimurium: Cellular and Molecular Biology, autores: Frederick C. Neidhardt, John L. Ingraham, Roy Curtiss III, ASM Press Washington D.C., 1987)). En esta cepa, las mutaciones que provocan una pérdida de función en el gen que codifica la galactosa quinasa (galK) rescatan la sensibilidad a la galactosa permitiendo que la cepa crezca en presencia de galactosa.

Para crear una cepa de E. coli que contiene un plásmido de Cas9 que comprende un módulo de expresión Cas9 (como se muestra en la Figura 1), el plásmido pRF48 se introdujo en la cepa de E. coli EF44 como sigue. La cepa EF44 se transformó con pRF48 (SEQ ID NO:12) y las colonias se seleccionaron en placas de agar caldo de cultivo L que contenían 100 pg/ml de ampicilina y glucosa al 0,4% (en p/v) para reprimir la expresión del gen Cas9 del promotor pBAD y crear la cepa de E. coli EF56 (AgalE pRF48) que contiene el plásmido Cas9.

Se inoculó una única colonia de EF56 en caldo de cultivo L que contenía ampicilina 100 pg/ml y glucosa al 0,4% (en p/v) y se cultivó durante 18 horas a 37 °C a 230 rpm. A continuación, la cepa se diluyó en caldo de cultivo L fresco que contenía 100 pg/ml de ampicilina y se cultivó a 37 °C y 230 rpm durante 2 horas. Se añadió L-arabinosa a una concentración final del 0,2% (en p/v) para inducir la expresión de Cas9 a partir del promotor P^bady las células se cultivaron durante 1 hora más. Las células se hicieron electrocompetentes mediante protocolos convencionales. Se transformaron 100 pl de células EF56 electrocompetentes inducidas con 200 ng de pACYC184 (SEQ ID NO:32), pRF50 (SEQ ID NO:33), pRF51 (SEQ ID NO:34), pRF53 (SEQ ID NO:35) o pRF55 (SEQ ID NO:36) y 1 pg de pRF113 (SEQ ID NO:47), 1 pg de molde de modificación de polinucleótidos lineales (SEQ ID NO:44) o ADN plasmídico sin molde de modificación de polinucleótidos. Las células se sometieron a electroporación en una cubeta de espacio de 1 mM a 1750 voltios. Se añadió 1 ml de medio SOC y se dejó que las células se recuperaran durante 3 horas a 37 °C y 230 rpm. Las células se sembraron en placas de caldo de cultivo L solidificadas con agar al 1,5% (en p/v) que contenía 100 pg/ml de ampicilina y 25 pg/ml de cloranfenicol para seleccionar las células que contenían tanto pRF48 (SEQ ID NO:12) como el correspondiente pACYC184 (SEQ ID NO:32), pRF50 (SEQ ID NO:33), pRF51 (SEQ ID NO:34), pRF53 (SEQ ID NO:35) o pRF55 (SEQ ID NO:36). Las placas se incubaron durante 20 horas a 37 °C.

Las colonias se transfirieron de las placas de caldo de cultivo L de 100 pg/ml de ampicilina/25 pg/ml de cloranfenicol a un medio mínimo A solidificado con agar al 1,5% (en p/v) que contenía glicerol al 0,2% (en p/v) y galactosa al 0,2% (en p/v) usando placas duplicadas para detectar los aislados resistentes a la galactosa. Para cada transformación, se calculó la frecuencia de resistencia a la galactosa dividiendo el número de colonias resistentes a la galactosa entre el número total de colonias en la placa original (tabla 2).

Tabla 2: Frecuencia de colonias resistentes a galactosa.

Las frecuencias dependían del sitio diana. Para determinar la frecuencia de recombinación homóloga, se usaron técnica de PCER convencionales en el locus de galK (SEQ ID NO:48) empleando un cebador directo (ggcgaagagaatcaacactgg, SEQ ID NO:49) y un cebador inverso (GCAAACAGCACCTGACGATCG, SEQ ID NO:50). En una cepa WT, el locus de galK completo se amplificó (SEQ ID NO:48) dando lugar a un producto de PCR que tenía una longitud de 1717 pb. En las células en las que se ha producido una recombinación entre el locus de galK y el molde de modificación del polinucleótidos de HR pRF113, el producto de PCR tiene una longitud de 569 pb (SEQ ID NO:50). La Figura 6 muestra un gel de la amplificación de colonias de un experimento de edición de pRF50/pRF113 con una frecuencia de HR del 75%. La frecuencia de HR se determinó dividiendo el número de colonias en las que el alelo de deleción de galK fue amplificado, lo que indica una edición precisa, entre el número total de colonias ensayadas por PCR de colonias. Las colonias que son GalR en ausencia del molde de modificación de polinucleótidos no permiten la amplificación del locus de galK.

Este ejemplo demuestra que la edición eficiente del genoma del gen galK en E. coli se logró con éxito utilizando un sistema de ARN guía/endonucleasa Cas en combinación con un plásmido circular que contiene un molde de modificación de polinucleótidos.

Claims

REIVINDICACIONES

1 Un método para editar una secuencia diana en el genoma de una célula de Escherichia coli, comprendiendo dicho

método proporcionar al menos una construcción de ADN recombinante que comprende una secuencia de ADN que

codifica un ARN guía y un molde de modificación de polinucleótidos circular a una célula de E. coli que comprende

una secuencia de ADN de endonucleasa Cas9 unida operativamente a un promotor inducible, en el que dicha secuencia de ADN de endonucleasa Cas9 codifica una endonucleasa Cas9, en el que el ARN guía y la endonucleasa

Cas9 pueden formar un complejo de ARN guía/endonucleasa Cas9 (RGEN) que es capaz de mediar en la ruptura de

la secuencia diana para permitir la edición de genes mediada por recombinación homóloga en un sitio diana en el genoma de dicha célula de E. coli, en el que dicho molde de modificación de polinucleótidos comprende al menos una modificación de nucleótidos de dicha secuencia diana.
2. - El método de la reivindicación 1, en el que la secuencia diana en el genoma de una célula de E. coli se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de promotor, una secuencia terminadora, una secuencia de elemento regulador, una secuencia codificadora, un profago, un pseudogén y un gen exógeno.
3. - El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que dicha construcción de ADN recombinante que comprende una secuencia de ADN que codifica un ARN guía se proporciona mediante un plásmido circular.
4. - El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la construcción de ADN recombinante y el molde de modificación de polinucleótidos circular se proporcionan cada una en plásmidos separados o se proporcionan

en un solo plásmido.
5. - El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la construcción de ADN recombinante y el molde de polinucleótidos circular se proporcionan mediante un medio seleccionado del grupo que consiste en electroporación, choque térmico, transporte por fagos, apareamiento, conjugación y transducción.
6. - El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho sitio diana está flanqueado por una primera región genómica y una segunda región genómica, en el que el molde de polinucleótidos circular comprende

además una primera región de homología con dicha primera región genómica y una segunda región de homología con

dicha segunda región genómica.
7. - El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la célula de E. coli no expresa una proteína recombinasa exógena.
8. - El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la célula de E. coli no expresa una proteína seleccionada del grupo que comprende una proteína RecET, una proteína rojo lambda y un inhibidor de RecBCD.
9. - El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende además cultivar las células de la progenie de dicha célula de E. coli, en el que las células de la progenie comprenden dicha al menos una modificación

de nucleótidos de dicha secuencia diana.
10. - El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el sitio diana está ubicado en un gen galK de

E. coli.
11. - El método de la reivindicación 1, que es un método para producir una célula de E. coli mutante de galK, comprendiendo dicho método:

a) proporcionar al menos una construcción de ADN recombinante circular que comprende una secuencia de ADN que

codifica un ARN guía y al menos un molde de modificación de polinucleótidos circular a una célula de E. coli que comprende una secuencia de ADN de endonucleasa Cas9 unida operativamente a un promotor inducible, en el que

dicha secuencia de ADN de endonucleasa Cas9 codifica una endonucleasa Cas que es capaz de introducir una ruptura bicatenaria en un sitio diana dentro de una secuencia genómica de galK en el genoma de E. coli, en el que dicho

molde de modificación de polinucleótidos circular comprende al menos una modificación de nucleótidos de dicha secuencia genómica de galK;

b) cultivar las células de la progenie de la célula de E. coli de (a); y,

c) evaluar las células de la progenie de (b) para la presencia de dicha al menos una modificación de nucleótidos.
12. - El método de la reivindicación 1, que es un método para editar una secuencia diana en el genoma de una célula de Escherichia coli, comprendiendo dicho método proporcionar al menos una primera construcción de ADN recombinante que comprende una secuencia de ADN que codifica un ARN guía, un molde de modificación de polinucleótidos circular y una segunda construcción de ADN recombinante que comprende una secuencia de ADN que

codifica una endonucleasa Cas9 unida operativamente a un promotor inducible, a una célula de E. coli, en el que la endonucleasa Cas9 introduce una ruptura bicatenaria en un sitio diana en el genoma de dicha célula de E. coli, en e que dicho molde de modificación de polinucleótidos comprende al menos una modificación de nucleótidos de dicha secuencia diana.
13.- El método de la reivindicación 12, en el que la primera construcción de ADN recombinante, la segunda construcción de ADN recombinante y el molde de modificación de polinucleótidos circular se proporcionan cada una en plásmidos separados o se proporcionan en un solo plásmido.