ES2866896T3 - Procedimiento para incrementar el rendimiento de secuenciación de molécula única concatenando fragmentos de ADN cortos - Google Patents

Procedimiento para incrementar el rendimiento de secuenciación de molécula única concatenando fragmentos de ADN cortos Download PDF

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Abstract

Un procedimiento de preparación de una colección de moléculas de ácido nucleico diana concatenadas de una muestra, comprendiendo el procedimiento: a. fijar un primer adaptador que tiene al menos una región bicatenaria a cada extremo de una molécula diana bicatenaria; b. poner en contacto la muestra con una exonucleasa para generar regiones de adaptador parcialmente monocatenarias en los extremos de la molécula diana; c. unir al menos dos moléculas diana hibridando las regiones de adaptador parcialmente monocatenarias en cada hebra de las moléculas diana para formar las regiones de adaptador bicatenarias y enlazar covalentemente las hebras de las moléculas diana, generando, de este modo, moléculas diana concatenadas; d. fijar un segundo adaptador a las moléculas concatenadas, comprendiendo el adaptador uno o más códigos de barras, sitios de cebado de amplificación universal y sitios de cebado de secuenciación, generando, de este modo, una colección de moléculas de ácido nucleico diana concatenadas.

Description

DESCRIPCIÓN
Procedimiento para incrementar el rendimiento de secuenciación de molécula única concatenando fragmentos de ADN cortos
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La invención se refiere al campo de la secuenciación de ácidos nucleicos. Más específicamente, la invención se refiere al campo de la creación de colecciones de ácidos nucleicos para secuenciación de molécula única.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Las plataformas de secuenciación de molécula única (SMS), tales como las plataformas basadas en nanoporos, posibilitan que las secuencias de bases se lean directamente de hebras individuales de ADN en tiempo real. Aunque aptas para longitudes de lectura larga, actualmente las plataformas de SMS adolecen de un rendimiento bajo en comparación con las plataformas de secuenciación de lectura corta competidoras. Al mismo tiempo, muchas aplicaciones de secuenciación, tales como pruebas de oncología y prenatales, usan inherentemente fragmentos de ácido nucleico cortos, tales como ADN libre de células (ADNlc) o ADN tumoral circulante (ADNtc), presentes en cantidades mínimas en la sangre materna o en la sangre de un paciente de cáncer. (Véase Newman, A., et al., (2014) An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage, Nature Medicine doi:10.1038/nm.3519). El problema se ha abordado en publicaciones previas, tales como los documentos WO 2012/012037A1, WO 2013/040060A2, M. J. FULLWOOD et al.) (GENOME RESEARCH, vol. 19, n.° 4, 1 de abril de 2009 (01-04-2009), páginas 521-532, y SEAN C. SLEIGHT et al.(ACS SYNTHETIC BIOLOGY, vol. 2, n.° 9, 10 (10-07­ 2013), páginas 506-518, "Información complementaria"), pero existe la necesidad de obtener un procedimiento de adaptación de diversas dianas de ácido nucleico para aprovechar las ventajas de las longitudes de lectura larga de las plataformas de SMS.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
En algunos modos de realización, la invención es un procedimiento de preparación de una colección de moléculas de ácido nucleico diana concatenadas de una muestra, comprendiendo el procedimiento: fijar un primer adaptador que tiene al menos una región bicatenaria a cada extremo de una molécula diana bicatenaria; poner en contacto la muestra con una exonucleasa para generar regiones de adaptador parcialmente monocatenarias en los extremos de la molécula diana; unir al menos dos moléculas diana hibridando las regiones de adaptador parcialmente monocatenarias en cada hebra de las moléculas diana para formar las regiones de adaptador bicatenarias y enlazar covalentemente las hebras de las moléculas diana, generando, de este modo, moléculas diana concatenadas; fijar un segundo adaptador a las moléculas concatenadas, comprendiendo el adaptador uno o más códigos de barras, sitios de cebado de amplificación universal y sitios de cebado de secuenciación, generando, de este modo, una colección de moléculas de ácido nucleico diana concatenadas. El primer adaptador se puede fijar amplificando las moléculas de ácido nucleico diana con cebadores que incorporan las secuencias de adaptador, o por ligación a los extremos de las moléculas de ácido nucleico diana. La exonucleasa puede poseer una actividad 5'-3' y carece de actividad 3'-5. La unión de las moléculas diana puede comprender un relleno de polimerasa, en el que la polimerasa puede carecer de actividad exonucleasa 3'-5'. En algunos modos de realización, la unión de las moléculas diana puede comprender una etapa de ligación. En algunos modos de realización, los productos concatenados se pueden purificar antes de la etapa de fijación del segundo adaptador.
En algunos modos de realización, el procedimiento comprende además una etapa de secuenciación de la colección de moléculas de ácido nucleico diana concatenadas. Las moléculas de ácido nucleico diana concatenadas se pueden fraccionar por tamaño antes de la secuenciación. La secuencia se puede obtener por un procedimiento seleccionado de procedimiento basado en nanoporos biológicos, procedimiento basado en nanoporos en estado sólido y procedimiento basado en molécula única en tiempo real (SMRT®).
En algunos modos de realización, el primer adaptador comprende una mezcla de adaptadores que se pueden ligar en ambos extremos y adaptadores que se pueden ligar en solo un extremo. El primer adaptador puede comprender una región resistente a exonucleasa en al menos aproximadamente 15 bases desde el extremo 5'. En algunos modos de realización, la región resistente a exonucleasa comprende al menos un nucleótido fosforotioato. En algunos modos de realización, el segundo adaptador comprende una estructura de tallo-bucle. En algunos modos de realización, el segundo adaptador consiste en al menos una porción bicatenaria y al menos un bucle monocatenario que forman entre sí una estructura de horquilla.
En algunos modos de realización, las moléculas diana se amplifican antes del tratamiento con exonucleasa inicial. En algunos modos de realización, las moléculas concatenadas se amplifican antes de la ligación del segundo adaptador.
En algunos modos de realización, la invención es una colección de moléculas de ácido nucleico diana concatenadas creadas usando el procedimiento como se divulga anteriormente que comprende: fijar un primer adaptador que tiene al menos una región bicatenaria a cada extremo de una molécula diana bicatenaria; poner en contacto las moléculas diana bicatenarias que contienen el adaptador con una exonucleasa para generar regiones de adaptador parcialmente monocatenarias en los extremos de la molécula diana; unir al menos dos moléculas diana hibridando las regiones de adaptador parcialmente monocatenarias en cada hebra de las moléculas diana para formar las regiones de adaptador bicatenarias y enlazar covalentemente las hebras de las moléculas diana, generando, de este modo, moléculas diana concatenadas; fijar un segundo adaptador a las moléculas concatenadas, comprendiendo el adaptador uno o más códigos de barras, sitios de cebado de amplificación universal y sitios de cebado de secuenciación, generando, de este modo, una colección de moléculas de ácido nucleico diana concatenadas.
En algunos modos de realización, la invención es un kit para producir una colección de moléculas de ácido nucleico diana concatenadas de acuerdo con el procedimiento divulgado anteriormente, que comprende: un primer adaptador que tiene al menos una región bicatenaria, un segundo adaptador que comprende uno o más códigos de barras, sitios de cebado de amplificación universal y sitios de cebado de secuenciación, una exonucleasa, una ácido nucleico polimerasa y una ácido nucleico ligasa. El kit puede comprender además cebadores de amplificación complementarios a las secuencias de primer adaptador, una ácido nucleico polimerasa termoestable y una mezcla de al menos cuatro desoxinucleósidos trifosfato.
En algunos modos de realización, la invención es un procedimiento de preparación de una colección de moléculas de ácido nucleico diana concatenadas de una muestra, comprendiendo el procedimiento: fijar una molécula de adaptador a al menos un extremo de una molécula nucleica diana bicatenaria, en la que un adaptador comprende un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción de corte infrecuente para formar una molécula diana ligada a adaptador; digerir la molécula diana ligada a adaptador con la endonucleasa de restricción de corte infrecuente para formar extremos parcialmente monocatenarios; unir al menos dos moléculas diana ligadas a adaptador digeridas con endonucleasa hibridando y uniendo covalentemente los extremos parcialmente monocatenarios, generando, de este modo, moléculas diana concatenadas. En algunos modos de realización, el adaptador se fija amplificando las moléculas de ácido nucleico diana con cebadores que incorporan el sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción de corte infrecuente. En algunos modos de realización, los cebadores comprenden además una secuencia específica de diana y un código de barras molecular o una secuencia aleatoria y un código de barras molecular. El adaptador se puede fijar por ligación a los extremos de las moléculas de ácido nucleico diana. El sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción de corte infrecuente puede tener una longitud de 10 o más bases. La endonucleasa de restricción de corte infrecuente es una endonucleasa de restricción de asentamiento, por ejemplo, Sce I o VDE.
En algunos modos de realización, las moléculas diana ligadas a adaptador digeridas con endonucleasa se purifican antes de la etapa de concatenación.
En algunos modos de realización, el adaptador comprende una secuencia de código de barras.
En algunos modos de realización, el procedimiento comprende además una etapa de fijación de un segundo adaptador a al menos un extremo de las moléculas concatenadas, comprendiendo el adaptador al menos un sitio de unión a cebador de secuenciación. En algunos modos de realización, el procedimiento comprende además una etapa de secuenciación de la colección de moléculas de ácido nucleico diana concatenadas. Las moléculas de ácido nucleico diana concatenadas se pueden fraccionar por tamaño antes de la secuenciación, por ejemplo, por adición de un precipitante.
La secuencia se obtiene por un procedimiento seleccionado de procedimiento basado en nanoporos biológicos, procedimiento basado en nanoporos en estado sólido y procedimiento basado en molécula única en tiempo real (SMRT®).
En algunos modos de realización, la invención es un procedimiento de preparación de moléculas de ácido nucleico diana concatenadas de una muestra, comprendiendo el procedimiento: fijar una molécula de adaptador a al menos un extremo de una molécula nucleica diana bicatenaria, en la que un adaptador comprende un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción de corte infrecuente para formar una molécula diana ligada a adaptador; hibridar un cebador a cada hebra de la molécula diana ligada a adaptador, en el que el cebador comprende un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción de corte infrecuente; extender el cebador para formar, a partir de cada hebra de la molécula diana ligada a adaptador, una nueva molécula que contiene el sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción de corte infrecuente en cada extremo, digerir las nuevas moléculas con la endonucleasa de restricción de corte infrecuente para formar extremos parcialmente monocatenarios; unir al menos dos nuevas moléculas digeridas con endonucleasa hibridando y uniendo covalentemente los extremos parcialmente monocatenarios, generando, de este modo, moléculas diana concatenadas. El cebador puede comprender una secuencia específica de diana y un código de barras molecular. En algunos modos de realización, el procedimiento comprende además una etapa de amplificación de las nuevas moléculas. En algunos modos de realización, el procedimiento comprende además una etapa de fijación de un segundo adaptador a al menos un extremo de las moléculas concatenadas, comprendiendo el adaptador al menos un sitio de unión a cebador de secuenciación, y de secuenciación de las moléculas de ácido nucleico diana concatenadas.
En algunos modos de realización, la invención es una colección de moléculas de ácido nucleico diana concatenadas creadas usando el procedimiento que comprende: fijar una molécula de adaptador a al menos un extremo de una molécula nucleica diana bicatenaria, en la que un adaptador comprende un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción de corte infrecuente para formar una molécula diana ligada a adaptador; digerir la molécula diana ligada a adaptador con la endonucleasa de restricción de corte infrecuente para formar extremos parcialmente monocatenarios; unir al menos dos moléculas diana ligadas a adaptador digeridas con endonucleasa hibridando y uniendo covalentemente los extremos parcialmente monocatenarios, generando, de este modo, moléculas diana concatenadas.
En algunos modos de realización, la invención es un kit para producir una colección de moléculas de ácido nucleico diana concatenadas que comprende: un adaptador que comprende un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción de corte infrecuente y un código de barras molecular, un segundo adaptador que comprende un sitio de cebado universal, una endonucleasa de restricción de corte infrecuente y una ácido nucleico ligasa. El kit puede comprender además cebadores complementarios a los sitios de cebado universal, una ácido nucleico polimerasa termoestable y una mezcla de al menos cuatro desoxinucleósidos trifosfato.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Las figuras 1(a)-(c) ilustran un procedimiento de unión de amplicones de ADN cortos en concatámeros largos. La figura 1(a) es un diagrama del modo de realización del procedimiento de concatenación de la invención con adaptadores en cebadores de PCR. La figura 1(b) es una imagen de electroforesis en gel que muestra la acumulación de concatenados. La figura 1(c) es un histograma que muestra tamaños de lecturas de secuencias consenso circulares de la muestra concatenada.
Las figuras 2(a)-(e) ilustran que el procedimiento según la invención incrementa el rendimiento de secuenciación en más de cinco veces. La figura 2(a) es un diagrama de una lectura de secuencia ejemplar que representa tipos y orientación de diferentes rasgos característicos de secuencia. La figura 2(b) es un histograma que representa el número de fragmentos y adaptadores en orientación de complemento directo e inverso identificados en todas las lecturas. La figura 2(c) es un histograma que representa la frecuencia de los fragmentos en cada tramo de tamaños. La figura 2(d) es un gráfico de dispersión que representa la relación entre la longitud de lectura y el número de fragmentos identificados en esa lectura. La figura 2(e) es un histograma que representa la frecuencia del número de fragmentos identificados por lectura en todas las lecturas.
Las figuras 3(a)-(d) ilustran que el procedimiento según la invención identifica correctamente variantes mononucleotídicas (SNV) en un panel de amplicones de oncología. La figura 3(a) es un diagrama de un conjunto de comandos de análisis de bioinformática ejemplar usado en la invención. La figura 3(b) es un gráfico de dispersión que muestra la comparación de las frecuencias alélicas (FA) de variantes mononucleotídicas conocidas en el ADN de entrada identificadas en réplicas de muestras de concatenación representadas con respecto a las frecuencias esperadas. La figura 3(c) es un gráfico de dispersión que muestra una comparación de las FA identificadas en réplicas de muestras de concatenación representadas con respecto a las frecuencias encontradas en la muestra de no concatenación. La figura 3(d) es un gráfico de barras que compara la cobertura de amplicones en muestra no concatenada y tres réplicas de muestras de concatenación.
Las figuras 4(a)-(c) ilustran la adaptación del procedimiento según la invención a un flujo de trabajo de enriquecimiento de dianas alternativo. La figura 4(a) es un diagrama del modo de realización del procedimiento de concatenación de la invención donde se preparan moléculas diana para su ligación al adaptador por reparación de extremos y adición de A (ERAT). La figura 4(b) es una imagen de electroforesis en gel que muestra la acumulación de concatenados. La figura 4(c) es un histograma que representa frecuencias de longitudes de fragmentos después de la desconcatenación de las lecturas de concatámeros.
Las figuras 5(a)-(c) ilustran cómo se ensamblan los adaptadores y secuencias diana durante la concatenación. La figura 5(a) muestra una orientación de la combinación diana-adaptador. La figura 5(b) muestra otra orientación de la combinación diana-adaptador. La figura 5(c) muestra que las 'unidades de concatenación' mostradas en 5(a) y 5(b) se pueden ensamblar en dos maneras diferentes.
Las figuras 6(a)-(c) ilustran la secuenciación de secuencias diana concatenadas. La figura 6(a) es una imagen de electroforesis en gel que muestra la acumulación de concatenados. La figura 6(b) es un electroferograma de una escalera de ADN de bajo peso molecular. La figura 6(c) es un electroferograma después de la ligación al adaptador y amplificación selectiva de fragmentos ligados a adaptador. La figura 6(d) es un gráfico de dispersión que compara el número de fragmentos secuenciados de la serie de secuenciación de concatámeros de BPM y una serie con el BPM relativo a la ligación al adaptador y amplificación por PCR.
La figura 7 ilustra la variación del procedimiento con ligación al adaptador.
La figura 8 ilustra la variación del procedimiento con extensión del cebador.
La figura 9 ilustra la variación del procedimiento con ligación seguida de extensión del cebador.
La figura 10 muestra los resultados de un experimento de concatenación de tamaño controlado.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
En un primer aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento de preparación de una colección de moléculas de ácido nucleico diana concatenadas de una muestra, comprendiendo el procedimiento:
a. fijar un primer adaptador que tiene al menos una región bicatenaria a cada extremo de una molécula diana bicatenaria;
b. poner en contacto la muestra con una exonucleasa para generar regiones de adaptador parcialmente monocatenarias en los extremos de la molécula diana;
c. unir al menos dos moléculas diana hibridando las regiones de adaptador parcialmente monocatenarias en cada hebra de las moléculas diana para formar las regiones de adaptador bicatenarias y enlazar covalentemente las hebras de las moléculas diana, generando, de este modo, moléculas diana concatenadas; y
d. fijar un segundo adaptador a las moléculas concatenadas, comprendiendo el adaptador uno o más códigos de barras, sitios de cebado de amplificación universal y sitios de cebado de secuenciación, generando, de este modo, una colección de moléculas de ácido nucleico diana concatenadas.
El primer adaptador se puede fijar amplificando las moléculas de ácido nucleico diana con cebadores que incorporan la secuencia de adaptador o por ligación a los extremos de las moléculas de ácido nucleico diana.
La exonucleasa en la etapa b puede poseer una actividad 5'-3' y carece de actividad 3'-5. La unión de las moléculas diana en la etapa c comprende un relleno de polimerasa. Entonces, la polimerasa puede carecer de la actividad exonucleasa 3'-5'.
La unión de las moléculas diana en la etapa c puede comprender una etapa de ligación. Los productos concatenados se purifican antes de la etapa de fijación del segundo adaptador. El procedimiento según la invención puede comprender además una etapa de secuenciación de la colección de moléculas de ácido nucleico diana concatenadas. En este caso, las moléculas de ácido nucleico diana concatenadas se pueden fraccionar por tamaño antes de la secuenciación. La secuencia se puede obtener por un procedimiento seleccionado de procedimiento basado en nanoporos biológicos, procedimiento basado en nanoporos en estado sólido y procedimiento basado en molécula única en tiempo real (SMRT®).
El primer adaptador puede comprender una mezcla de adaptadores que se pueden ligar en ambos extremos y adaptadores que se pueden ligar en solo un extremo. El primer adaptador también puede comprender una región resistente a exonucleasa en al menos aproximadamente 15 bases desde el extremo 5', que puede comprender al menos un nucleótido fosforotioato. El segundo adaptador puede comprender una estructura de tallo-bucle o puede consistir en al menos una porción bicatenaria y al menos un bucle monocatenario que formen entre sí una estructura de horquilla. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que las moléculas diana se pueden amplificar antes del tratamiento con exonucleasa en la etapa b. Las moléculas concatenadas se amplifican antes de la ligación del segundo adaptador en la etapa d.
En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una colección de moléculas de ácido nucleico diana concatenadas creadas usando el procedimiento que comprende:
a. fijar un primer adaptador que tiene al menos una región bicatenaria a cada extremo de una molécula diana bicatenaria;
b. poner en contacto las moléculas diana bicatenarias que contienen el adaptador con una exonucleasa para generar regiones de adaptador parcialmente monocatenarias en los extremos de la molécula diana;
c. unir al menos dos moléculas diana hibridando las regiones de adaptador parcialmente monocatenarias en cada hebra de las moléculas diana para formar las regiones de adaptador bicatenarias y enlazar covalentemente las hebras de las moléculas diana, generando, de este modo, moléculas diana concatenadas;
d. fijar un segundo adaptador a las moléculas concatenadas, comprendiendo el adaptador uno o más códigos de barras, sitios de cebado de amplificación universal y sitios de cebado de secuenciación, generando, de este modo, una colección de moléculas de ácido nucleico diana concatenadas.
En un tercer aspecto, la presente invención proporciona un kit para producir una colección de moléculas de ácido nucleico diana concatenadas que comprende: un primer adaptador que tiene al menos una región bicatenaria, un segundo adaptador que comprende uno o más códigos de barras, sitios de cebado de amplificación universal y sitios de cebado de secuenciación, una exonucleasa, una ácido nucleico polimerasa y una ácido nucleico ligasa. El kit puede comprender además cebadores de amplificación complementarios a las secuencias de primer adaptador, una ácido nucleico polimerasa termoestable y una mezcla de al menos cuatro desoxinucleósidos trifosfato.
En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento de preparación de una colección de moléculas de ácido nucleico diana concatenadas de una muestra, comprendiendo el procedimiento:
a. fijar una molécula de adaptador a al menos un extremo de una molécula nucleica diana bicatenaria, en la que un adaptador comprende un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción de corte infrecuente para formar una molécula diana ligada a adaptador;
b. digerir la molécula diana ligada a adaptador con la endonucleasa de restricción de corte infrecuente para formar extremos parcialmente monocatenarios;
c. unir al menos dos moléculas diana ligadas a adaptador digeridas con endonucleasa hibridando y uniendo covalentemente los extremos parcialmente monocatenarios, generando, de este modo, moléculas diana concatenadas.
El adaptador se puede fijar amplificando las moléculas de ácido nucleico diana con cebadores que incorporan el sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción de corte infrecuente. Los cebadores pueden comprender además una secuencia específica de diana y un código de barras molecular. Dicho sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción de corte infrecuente puede tener una longitud de al menos 10 bases. La endonucleasa de restricción de corte infrecuente puede ser una endonucleasa de restricción de asentamiento o se puede seleccionar de Sce I y VDE. Las moléculas diana ligadas a adaptador digeridas con endonucleasas se purifican antes de la etapa de concatenación. El adaptador también puede comprender una secuencia de código de barras.
Dicho procedimiento puede comprender además una etapa de fijación de un segundo adaptador a al menos un extremo de las moléculas concatenadas, comprendiendo el adaptador al menos un sitio de unión a cebador de secuenciación. A continuación, se puede ejecutar otra etapa de secuenciación de la colección de moléculas de ácido nucleico diana concatenadas. Si este es el caso, las moléculas de ácido nucleico diana concatenadas se pueden fraccionar por tamaño antes de la secuenciación por adición de un precipitante polimérico.
En un quinto aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento de preparación de moléculas de ácido nucleico diana concatenadas de una muestra, comprendiendo el procedimiento:
a. fijar una molécula de adaptador a al menos un extremo de una molécula nucleica diana bicatenaria, en la que un adaptador comprende un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción de corte infrecuente para formar una molécula diana ligada a adaptador;
b. hibridar un cebador a cada hebra de la molécula diana ligada a adaptador, en el que el cebador comprende un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción de corte infrecuente;
c. extender el cebador para formar, a partir de cada hebra de la molécula diana ligada a adaptador, una nueva molécula que contiene el sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción de corte infrecuente en cada extremo;
d. digerir las nuevas moléculas con la endonucleasa de restricción de corte infrecuente para formar extremos parcialmente monocatenarios;
e. unir al menos dos nuevas moléculas digeridas con endonucleasa hibridando y uniendo covalentemente los extremos parcialmente monocatenarios, generando, de este modo, moléculas diana concatenadas.
El cebador puede comprender una secuencia específica de diana y puede comprender además un código de barras molecular. El procedimiento puede comprender además una etapa de amplificación de las nuevas moléculas después de la etapa c. El procedimiento también puede comprender una etapa de fijación de un segundo adaptador a al menos un extremo de las moléculas concatenadas, comprendiendo el adaptador al menos un sitio de unión a cebador de secuenciación. Si este es el caso, se puede añadir una etapa de secuenciación de las moléculas de ácido nucleico diana concatenadas.
En un sexto aspecto, la presente invención proporciona una colección de moléculas de ácido nucleico diana concatenadas creadas usando el procedimiento que comprende:
a. fijar una molécula de adaptador a al menos un extremo de una molécula nucleica diana bicatenaria, en la que un adaptador comprende un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción de corte infrecuente para formar una molécula diana ligada a adaptador;
b. digerir la molécula diana ligada a adaptador con la endonucleasa de restricción de corte infrecuente para formar extremos parcialmente monocatenarios;
c. unir al menos dos moléculas diana ligadas a adaptador digeridas con endonucleasa hibridando y uniendo covalentemente los extremos parcialmente monocatenarios, generando, de este modo, moléculas diana concatenadas.
En un séptimo aspecto, la presente invención proporciona un kit para producir una colección de moléculas de ácido nucleico diana concatenadas que comprende: un adaptador que comprende un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción de corte infrecuente y un código de barras molecular, un segundo adaptador que comprende un sitio de cebado universal, una endonucleasa de restricción de corte infrecuente y una ácido nucleico ligasa.
Definiciones
Las siguientes definiciones ayudan a entender la presente divulgación.
El término "muestra" se refiere a cualquier composición que contiene o se supone que contiene ácido nucleico diana. Esto incluye una muestra de tejido o líquido aislado de un individuo, por ejemplo, piel, plasma, suero, líquido cefalorraquídeo, líquido linfático, líquido sinovial, orina, lágrimas, glóbulos sanguíneos, órganos y tumores, y también muestras de cultivos in vitro establecidos de células tomadas de un paciente individual o de un organismo modelo, incluyendo los tejidos fijados con formol incluidos en parafina (FFPET) y ácidos nucleicos aislados de los mismos. Una muestra también puede incluir material libre de células, tal como una fracción sanguínea libre de células que contenga ADN libre de células (ADNlc) o ADN tumoral circulante (ADNtc).
Un término "ácido nucleico" se refiere a polímeros de nucleótidos (por ejemplo, ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos, tanto naturales como no naturales), incluyendo ADN, ARN y sus subcategorías, tales como ADNc, ARNm, etc. Un ácido nucleico puede ser monocatenario o bicatenario y, en general, contendrá enlaces fosfodiéster 5'-3', aunque, en algunos casos, los análogos nucleotídicos pueden tener otros enlaces. Los ácidos nucleicos pueden incluir bases naturales (adenosina, guanosina, citosina, uracilo y timidina), así como bases no naturales. Algunos ejemplos de bases no naturales incluyen las descritas, por ejemplo, en Seela et al., (1999) Helv. Chim. Acta 82:1640. Las bases no naturales pueden tener una función particular, por ejemplo, incrementar la estabilidad del dúplex de ácido nucleico, inhibir la digestión con nucleasas o bloquear la extensión del cebador o la polimerización de la hebra.
Los términos "concatámero" y "concatenado" se usan de manera intercambiable y se refieren a una molécula de ácido nucleico larga y continua que se generó enlazando covalentemente ácidos nucleicos más cortos.
Los términos "polinucleótido" y "oligonucleótido" se usan de manera intercambiable. Polinucleótido es un ácido nucleico monocatenario o uno bicatenario. "Oligonucleótido" es un término usado a veces para describir un polinucleótido más corto. Un oligonucleótido puede estar compuesto por al menos 6 nucleótidos o aproximadamente 15-30 nucleótidos. Los oligonucleótidos se preparan por cualquier procedimiento adecuado conocido en la técnica, por ejemplo, por un procedimiento que implique síntesis química directa como se describe en Narang et al. (1979) Meth. Enzymol. 68:90-99; Brown et al. (1979) Meth. Enzymol. 68:109-151; Beaucage et al. (1981) Tetrahedron Lett.
22:1859-1862; Matteucci et al. (1981) J. Am. Chem. Soc. 103:3185-3191.
El término "cebador" se refiere a un oligonucleótido monocatenario que se hibrida con una secuencia en un ácido nucleico diana ("sitio de unión a cebador") y puede actuar como punto de inicio de síntesis a lo largo de una hebra complementaria de ácido nucleico en condiciones adecuadas para dicha síntesis. El sitio de unión a cebador puede ser exclusivo para cada diana o se puede añadir a todas las dianas ("sitio de cebado universal" o "sitio de unión a cebador universal").
Los términos "adaptador" o "adaptadores" se usan de manera intercambiable y significan una secuencia de nucleótidos que se puede añadir a otra secuencia para importar propiedades adicionales a esa secuencia. Un adaptador típicamente es un oligonucleótido que puede ser monocatenario o bicatenario, o puede tener tanto una porción monocatenaria como una porción bicatenaria. Un adaptador puede contener secuencias tales como códigos de barras y sitios de cebador universal o de sonda.
El término "ligación" se refiere a una reacción de condensación que une dos hebras de ácido nucleico en la que un grupo 5'-fosfato de una molécula reacciona con el grupo 3'-hidroxilo de otra molécula. La ligación típicamente es una reacción enzimática catalizada por una ligasa o una topoisomerasa. La ligación puede unir dos hebras únicas para crear una molécula monocatenaria. La ligación también puede unir dos hebras, perteneciendo cada una a una molécula bicatenaria, uniendo así dos moléculas bicatenarias. La ligación también puede unir ambas hebras de una molécula bicatenaria a ambas hebras de otra molécula bicatenaria, uniendo así dos moléculas bicatenarias. La ligación también puede unir dos extremos de una hebra dentro de una molécula bicatenaria, reparando así una muesca en la molécula bicatenaria.
El término "código de barras" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que se puede detectar e identificar. Los códigos de barras se pueden incorporar en diversos ácidos nucleicos. Los códigos de barras son lo suficientemente largos, por ejemplo, 2, 5, 10 nucleótidos, de modo que en una muestra los ácidos nucleicos que incorporan los códigos de barras se puedan distinguir o agrupar de acuerdo con los códigos de barras.
Los términos "identificador múltiple" y "MID" se refieren a un código de barras que identifica una fuente de ácidos nucleicos diana (por ejemplo, una muestra de la que se deriva el ácido nucleico, que se necesita cuando se combinan ácidos nucleicos de múltiples muestras). Todos o sustancialmente todos los ácidos nucleicos diana de la misma muestra compartirán el mismo MID. Los ácidos nucleicos diana de diferentes fuentes o muestras se pueden mezclar y secuenciar simultáneamente. Usando los MID, las lecturas de secuencia se pueden asignar a muestras individuales de las que se originaron los ácidos nucleicos diana.
Los términos "identificador molecular único" y "UID" se refieren a un código de barras que identifica un ácido nucleico al que está fijado. Todos o sustancialmente todos los ácidos nucleicos diana de la misma muestra tendrán diferentes UID. Toda o sustancialmente toda la descendencia (por ejemplo, amplicones) derivada del mismo ácido nucleico diana original compartirá el mismo UID.
Los términos "cebador universal" y "sitio de unión de cebado universal" o "sitio de cebado universal" se refieren a un cebador y sitio de unión a cebador presentes en (típicamente, añadidos in vitro a) diferentes ácidos nucleicos diana. Por ejemplo, el sitio de cebado universal se puede incluir en un adaptador ligado a la pluralidad de ácidos nucleicos diana. El sitio de cebado universal también puede ser parte de cebadores específicos de diana (no universales), por ejemplo, al añadirse al extremo 5' de un cebador específico de diana. El cebador universal se puede unir a y dirigir la extensión del cebador desde el sitio de cebado universal.
Como se usa en el presente documento, los términos "secuencia diana", "ácido nucleico diana" o "diana" se refieren a una porción de la secuencia de ácido nucleico en la muestra que se va a detectar o analizar. El término diana incluye todas las variantes de la secuencia diana, por ejemplo, una o más variantes mutantes y la variante natural.
El término "secuenciación" se refiere a cualquier procedimiento de determinación de la secuencia de nucleótidos en el ácido nucleico diana.
El coste para la secuenciación de ADN ha disminuido drásticamente en el transcurso de los últimos diez años a un ritmo que supera la ley de Moore. Aunque nos acercamos rápidamente a una era en la que secuenciar un genoma humano completo cuesta menos de 1000 $, todavía no es factible descifrar grandes números de genomas complejos debido a los costes de los reactivos, la infraestructura informática, el tiempo para la preparación de muestras y la secuenciación. Con este fin, en los últimos años se han desarrollado múltiples procedimientos de "enriquecimiento de dianas", que enriquecen selectivamente partes del genoma que contienen la información de interés. Estas estrategias ofrecen maneras eficaces de reducir el coste de secuenciación, incrementar la profundidad de secuenciación, acortar el tiempo de secuenciación y simplificar el análisis de datos, y se adoptan ampliamente para la detección de variantes genómicas que puedan provocar enfermedades humanas. Entre los procedimientos de enriquecimiento más populares están la PCR múltiple, las sondas moleculares de inversión y la captura de híbridos. Estos enfoques de enriquecimiento de dianas típicamente generan colecciones de secuenciación que contienen moléculas de ADN cortas (100 - 300 pb) idealmente adecuadas para plataformas de secuenciación de lectura corta, tales como el procedimiento de generación de agrupaciones basado en matrices con lecturas de extremo emparejado ejemplificadas por los sistemas MiSeq e HiSeq (Illumina, San Diego, Cal.). Sin embargo, las plataformas de secuenciación alternativas, tales como la secuenciación basada en molécula única en tiempo real (SMRT®) y en nanoporos están ganando terreno.
Por ejemplo, la tecnología de molécula única en tiempo real (SMRT®) (Pacific BioSciences, Menlo Park, Cal.) usa moldes circulares que contienen ambas hebras del ácido nucleico diana donde la ADN polimerasa puede generar lecturas más largas que múltiples kilobases por medio de múltiples pasadas a lo largo de ambas hebras. La información a partir de estas múltiples pasadas mitiga la tasa de error relativamente alta por pasada única y se usa para generar lecturas de secuencias consenso circulares (CCS) con alta exactitud. La secuenciación basada en nanoporos implica una ADN polimerasa única acoplada a una proteína de nanoporos incluida en membrana por un conector corto. Se añaden un molde y cuatro nucleótidos marcados de forma exclusiva para iniciar la síntesis de ADN. Durante la formación del complejo ternario, una polimerasa se une a un nucleótido marcado complementario; la marca específica para ese nucleótido se captura, a continuación, en el poro. Cada marca se diseña para que tenga un tamaño, masa o carga diferente, de modo que generen firmas de bloqueo de corriente características, lo que identifica de forma exclusiva la base añadida. Véase Stranges, et al., (2016) Design and characterization of a nanopore-coupled polymerase for single-molecule DNA sequencing by synthesis on an electrode array. PNAS 113(44):E6749.
Las tecnologías de lectura larga, tales como los procedimientos basados en SMRT® y en nanoporos abordan las limitaciones actuales de los secuenciadores de lectura corta para el ensamblaje genómico de novo, la detección de variaciones estructurales complejas y la caracterización de regiones repetitivas extendidas en el genoma.
Sin embargo, actualmente estas tecnologías de lectura larga adolecen de un rendimiento de secuenciación bajo. En algunos sistemas disponibles actualmente, el número de lecturas generadas por serie típicamente es de decenas de miles. Se prevé que una nueva generación de instrumentos incremente el rendimiento de secuenciación en aproximadamente siete veces, lo que todavía estará en un rendimiento considerablemente menor en comparación con los secuenciadores de lectura corta. Esto presenta un desafío considerando las aplicaciones de secuenciación que implican moléculas de ADN cortas, tales como ADN libre de células (ADNlc), incluyendo ADN tumoral circulante (ADNtc) o ADN extraído de tejidos fijados con formol incluidos en parafina (FFPET). Las novedosas estrategias de preparación de muestras en las que se concatenan fragmentos de ADN cortos en moldes de ADN largos podrían incrementar el rendimiento de los secuenciadores de molécula única. Además, dichos procedimientos incrementarían la versatilidad de estas plataformas para secuenciar tanto moléculas de ADN largas como cortas de una manera rentable.
En los últimos años, la comunidad de biología sintética ha desarrollado diversos procedimientos de biología molecular para concatenar fragmentos de ADN en genes o agrupaciones de genes con el propósito de genomanipular el genoma y producir biomoléculas de alto valor añadido, tales como productos farmacéuticos y biocombustibles. Por ejemplo, el ensamblaje Gibson es un procedimiento que utiliza tres enzimas: una exonucleasa 5', una ADN polimerasa y una ADN ligasa para enlazar covalentemente fragmentos de ADN con extremos complementarios en una reacción isotérmica simple en un solo recipiente (véase la patente de EE. UU. n.° 8.968.999). En la mayoría de las aplicaciones de ensamblaje Gibson, los fragmentos concatenados se clonan en un vector y posteriormente se pasan a través de bacterias para verificar la secuencia de la construcción deseada.
En un modo de realización, la invención es un procedimiento de generación de una colección de ácidos nucleicos concatenados para su secuenciación. La figura 1 (a) y la figura 4(a) representan ejemplos del procedimiento de acuerdo con la invención.
La presente invención comprende generar una colección de ácidos nucleicos diana de una muestra para la secuenciación de ácidos nucleicos. Múltiples ácidos nucleicos, incluyendo todos los ácidos nucleicos en una muestra, se pueden convertir en moléculas de la colección usando el procedimiento y las composiciones descritos en el presente documento. En algunos modos de realización, la muestra se deriva de un sujeto o un paciente. En algunos modos de realización, la muestra puede comprender un fragmento de un tejido sólido o un tumor sólido derivado del sujeto o del paciente, por ejemplo, por biopsia. La muestra también puede comprender líquidos corporales (por ejemplo, orina, esputo, suero, plasma o linfa, saliva, esputo, sudor, lágrima, líquido cefalorraquídeo, líquido amniótico, líquido sinovial, líquido pericárdico, líquido peritoneal, líquido pleural, líquido quístico, bilis, líquido gástrico, líquido intestinal o muestras fecales). La muestra puede comprender sangre completa o fracciones sanguíneas donde pueden estar presentes células normales o tumorales. En algunos modos de realización, la muestra, especialmente una muestra líquida, puede comprender material libre de células, tal como ADN o ARN libre de células, incluyendo ADN tumoral o ARN tumoral libre de células. En algunos modos de realización, la muestra es una muestra libre de células, por ejemplo, muestra derivada de sangre libre de células donde están presentes ADN tumoral o ARN tumoral libre de células. En otros modos de realización, la muestra es una muestra cultivada, por ejemplo, un cultivo o sobrenadante de cultivo que contiene o se sospecha que contiene ácidos nucleicos derivados de las células en el cultivo o de un agente infeccioso presente en el cultivo. En algunos modos de realización, el agente infeccioso es una bacteria, un protozoo, un virus o un micoplasma. La muestra también puede ser una muestra ambiental que contenga o se sospeche que contiene ácidos nucleicos de organismos.
Un ácido nucleico diana es el ácido nucleico de interés que puede estar presente en la muestra. En algunos modos de realización, el ácido nucleico diana es un gen o un fragmento génico. En algunos modos de realización, todos los genes, fragmentos génicos y regiones intergénicas (genoma completo) constituyen ácidos nucleicos diana. En algunos modos de realización, solo una porción del genoma, por ejemplo, solo las regiones codificantes del genoma (exoma) constituyen ácidos nucleicos diana. En algunos modos de realización, el ácido nucleico diana contiene un locus de una variante genética, por ejemplo, un polimorfismo, incluyendo un polimorfismo o variante mononucleotídica (SNP o SNV), o un reordenamiento genético que da como resultado, por ejemplo, una fusión génica. En algunos modos de realización, el ácido nucleico diana comprende un biomarcador, es decir, un gen en el que sus variantes se asocian con una enfermedad o afección. En otros modos de realización, el ácido nucleico diana es característico de un organismo particular y ayuda a la identificación del organismo o una característica del organismo patógeno, tal como sensibilidad a fármacos o resistencia a fármacos. Aún en otros modos de realización, el ácido nucleico diana es característico de un sujeto humano, por ejemplo, la secuencia HLA o KIR que define el genotipo HLA o KIR exclusivo del sujeto.
En un modo de realización de la invención, uno o una pluralidad de ácidos nucleicos diana se convierte en la configuración de molde de la invención. En algunos modos de realización, el ácido nucleico diana se produce en la naturaleza en una forma monocatenaria (por ejemplo, ARN, incluyendo ARNm, microARN, ARN vírico; o ADN vírico monocatenario). En otros modos de realización, el ácido nucleico diana se produce en la naturaleza en una forma bicatenaria. Un experto en la técnica reconocería que el procedimiento de la invención tiene múltiples modos de realización. Un ácido nucleico diana monocatenario se puede convertir en una forma bicatenaria y, a continuación, someter a las etapas mostradas en la figura 1. Los ácidos nucleicos diana más largos se pueden fragmentar por procedimientos específicos de secuencia (enzimas de restricción) o procedimientos no específicos (sonicación), aunque en algunas aplicaciones se pueden desear ácidos nucleicos diana más largos para lograr una lectura más larga. En algunos modos de realización, el ácido nucleico diana está fragmentado de forma natural, por ejemplo, ADN libre de células (ADNIc) circulante o ADN químicamente degradado, tal como el encontrado en muestras químicamente conservadas o archivadas.
En la primera etapa, se proporciona una pluralidad de moléculas de ADN bicatenarias. En algunos modos de realización, las moléculas de ADN bicatenarias pueden ser ADN genómico aislado o ADN genómico de complejidad reducida (por ejemplo, regiones seleccionadas amplificadas del genoma o regiones seleccionadas capturadas del genoma, tal como exoma). En algunos modos de realización, el ADN bicatenario es el resultado de la retrotranscripción de ARN u otras maneras de copiar un ácido nucleico monocatenario en un ácido nucleico bicatenario.
En la siguiente etapa, las moléculas de ADN bicatenarias se fijan a los primeros adaptadores en cada extremo.
En un modo de realización, los adaptadores contienen una secuencia de reconocimiento de enzima de restricción. Es preferente que los adaptadores contengan una secuencia de reconocimiento de corte infrecuente que se produzca de forma infrecuente en el genoma. En algunos modos de realización, la secuencia de reconocimiento tiene una longitud de 10 o más bases. En algunos modos de realización, la secuencia de reconocimiento no es palindrómica, lo que asegura una unión direccional de fragmentos de digestión con restricción. Son conocidas en la técnica una serie de enzimas de este tipo. Véase Bhagwat, A., (1992) Restriction enzymes: Properties and use, Methods in Enzymology 216:199. En algunos modos de realización, la endonucleasa de restricción es una endonucleasa codificada por intrón de asentamiento, tal como Sce I o VDE. Estas endonucleasas tienen secuencias de reconocimiento extremadamente largas (hasta de 18 pares de bases), que es improbable que se produzcan más de una vez en el genoma de un mamífero y, además, estas endonucleasas generan cortes asimétricos que garantizan la unión direccional de fragmentos, véase, Jasin, M. (1996) Genetic manipulation of genomes with rare-cutting endonucleases, Trends in Genetics 12:224.
En algunos modos de realización, la molécula de ADN molde se liga a un adaptador en cada extremo y tiene una secuencia de reconocimiento de enzima de restricción en ambos lados. Tras la digestión con enzimas de restricción, se pueden unir entre sí múltiples moléculas de ADN molde. (Figura 1). Los adaptadores pueden comprender secuencias adicionales que incluyen códigos de barras moleculares y sitios de cebador universal. En algunos modos de realización, los adaptadores se diseñan para que tengan la longitud y el contenido de GC óptimos. En algunos modos de realización, se usan adaptadores de aproximadamente 10, 15, 20, 30 o 40 pb de longitud. En algunos modos de realización, el contenido de GC de la secuencia de adaptador es de aproximadamente un 30 %, 40 % o 50 %.
En algunos modos de realización, los adaptadores se fijan por medio de cebadores de extensión que comprenden una porción específica de diana y una porción de adaptador. En algunos modos de realización, se usan los cebadores para realizar la extensión del cebador o amplificación de ADN (por ejemplo, PCR) donde el producto de extensión del cebador o el amplicón contiene la secuencia de adaptador. En algunos modos de realización, se realiza una única tanda de extensión del cebador o amplificación. En otros modos de realización, la primera tanda de extensión del cebador o amplificación usa cebadores que comprenden una porción específica de diana y un sitio de unión a cebador universal. La segunda tanda de extensión del cebador o amplificación usa cebadores universales que comprenden una secuencia de adaptador.
En algunos modos de realización, los adaptadores se ligan al ácido nucleico diana bicatenario. Los adaptadores comprenden al menos una porción bicatenaria que se puede ligar. El ácido nucleico diana comprende extremos adecuados para su ligación o se trata enzimáticamente para que adquiera dichos extremos. En algunos modos de realización, los extremos de los ácidos nucleicos diana se "pulen", es decir, se extienden con una ácido nucleico polimerasa para garantizar extremos bicatenarios. En algunos modos de realización, los extremos 5' de los ácidos nucleicos diana se fosforilan. En algunos modos de realización, la ligación es una ligación de extremos romos. En algunos modos de realización, la ligación es una ligación de extremos cohesivos. Los extremos 3' del ácido nucleico diana se extienden con un mononucleótido (por ejemplo, A) y el adaptador se genomanipula para que contenga una protuberancia complementaria (por ejemplo, T) en los extremos 3'.
En algunos modos de realización, las secuencias de reconocimiento de enzima de restricción se fijan por medio de cebadores de extensión que comprenden una porción específica de diana y la secuencia de reconocimiento de enzima de restricción. (Figura 8). En algunos modos de realización, se usa un enfoque híbrido. Los adaptadores bicatenarios se diseñan para que alberguen la secuencia de reconocimiento de enzima de restricción en la orientación deseada. Los adaptadores se ligan a ambos extremos del fragmento de ADN (figura 9). Tras la ligación al adaptador, se usa un cebador de extensión específico de diana para cada hebra (hebra (+) o (-)) y que alberga tanto un ID específico de hebra (SID) como la secuencia de reconocimiento de enzima de restricción en la orientación deseada. El cebador se hibrida a una hebra o dos cebadores se hibridan por separado a cada hebra de la molécula diana ligada a adaptador. Los cebadores específicos de diana y el cebador que se hibridan a un sitio de unión a cebador presente en el adaptador posibilitan la amplificación, por ejemplo, por PCR de solo las moléculas diana deseadas de la muestra. Los productos de amplificación comprenden fragmentos de ADN diana en la orientación deseada en relación con la secuencia de reconocimiento de enzima de restricción.
La endonucleasa de restricción se introduce para digerir los extremos de las moléculas ligadas a adaptador o los productos de la extensión del cebador. La digestión genera moléculas asimétricas con extremos parcialmente monocatenarios que solo se pueden unir en una determinada orientación.
En la siguiente etapa, las moléculas diana ligadas a adaptador se unen para formar concatenados. En algunos modos de realización, al menos dos, al menos tres y hasta cinco, diez o más moléculas diana se unen en un concatenado. Esta estrategia posibilita la creación de concatenados dentro de los que cada unidad tiene una orientación deseada, lo que facilita la identificación en dirección 3' y la descircunvolución de la información de secuencia en cada molécula diana dentro del concatenado. Por ejemplo, el uso de UID permite identificar moléculas derivadas de la misma secuencia original de modo que se pueda obtener consenso para las moléculas. Un enfoque de este tipo tiene aplicaciones más amplias en la obtención de información a partir de fragmentos de ADN cortos que tipifican el material derivado clínico para la detección de variantes asociadas con el cáncer.
En algunos modos de realización, el agrupamiento de los ácidos nucleicos más cortos (que se enlazan entre sí) consiste en solo una especie particular y, por lo tanto, los "concatámeros" o "concatenados" que se generan contienen múltiples copias de las mismas moléculas de ácido nucleico cortas. En algunos modos de realización, el agrupamiento de los ácidos nucleicos más cortos (que se enlazan entre sí) consiste en múltiples especies de ácidos nucleicos diferentes y, por lo tanto, los "concatámeros" o "concatenados" que se generan consisten en diferentes moléculas de ácido nucleico cortas (que, en algunos casos, se pueden producir en múltiples copias). En algunos modos de realización, el agrupamiento de ácidos nucleicos más cortos se ha preseleccionado por enfoques de enriquecimiento de dianas (tales como, pero sin limitarse a, captura de híbridos, p Cr múltiple, tecnología de sondas moleculares de inversión (MIP)) antes de enlazarlos entre sí en concatámeros. En algunos modos de realización, el agrupamiento de ácidos nucleicos cortos no se enriquece para regiones diana específicas y representa la población completa de moléculas de ácido nucleico en una muestra (por ejemplo, ADN genómico o ADN libre de células).
En algunos modos de realización, la concatenación se produce de forma aleatoria; se pueden añadir nuevas unidades a ambos extremos de un concatámero creciente. Los monómeros se agotan de forma incremental y se generan concatámeros de mayores grados (tales como dímeros, trímeros, tetrámeros, etc., denominados conjuntamente nmeros). En un modo de realización ilustrado en la figura 1(b), las longitudes observadas de los n-meros son casi exactamente de los tamaños esperados.
En algunos modos de realización, la etapa de unión implica la generación e hibridación de extremos monocatenarios complementarios o al menos parcialmente complementarios de las moléculas separadas. En algunos modos de realización, los extremos monocatenarios complementarios o al menos parcialmente complementarios se generan poniendo en contacto moléculas de ácido nucleico diana ligadas a adaptador con una exonucleasa que tiene actividad 5'-3'. En algunos modos de realización, la exonucleasa carece de actividad 3'-5' detectable. En algunos modos de realización, la exonucleasa se selecciona de exonucleasa T5, exonucleasa T7, exonucleasa lambda, exonucleasa VIII truncada y una mezcla de las mismas.
En algunos modos de realización, la etapa de unión utiliza una ADN polimerasa para rellenar los huecos en las estructuras formadas por hibridación de extremos monocatenarios complementarios o al menos parcialmente complementarios de las moléculas separadas. En algunos modos de realización, la ADN polimerasa carece de actividad exonucleasa 3' detectable. En algunos modos de realización, la ADN polimerasa es termoestable. En algunos modos de realización, la ADN polimerasa se selecciona de polimerasa Taq, polimerasa AmpliTaq y polimerasa AmpliTaq Gold®.
En algunos modos de realización, la etapa de unión utiliza una ADN ligasa para sellar las hebras extendidas por la ADN polimerasa. En algunos modos de realización, la ADN ligasa es termoestable. En algunos modos de realización, la ADN ligasa se selecciona de ADN ligasa T4, ADN ligasa T3 y una mezcla de las mismas.
En algunos modos de realización, las moléculas diana concatenadas se fraccionan por tamaño y se selecciona el tamaño preferente para su análisis adicional. En algunos modos de realización, el fraccionamiento para enriquecer fragmentos más grandes (concatenados de mayor orden) es por captura por microesferas magnéticas, tal como captura por microesferas magnéticas en presencia de un agente de aglomeración (tecnología de inmovilización reversible en fase sólida (SPRI)), electroforesis en gel preparativa, incluyendo electroforesis en gel de campo pulsado.
En algunos modos de realización, la invención incluye un medio de control de la longitud máxima de concatámeros generados durante la reacción de concatenación. En algunos modos de realización, la concatenación se limita usando la mezcla de adaptadores que se pueden ligar en ambos extremos y adaptadores "tóxicos" que se pueden ligar en solo un extremo. La agregación de una concentración adecuada (típicamente mucho más pequeña) de adaptadores "tóxicos", dará como resultado concatenados protegidos que ya no se podrían extender por otra ligación. En algunos modos de realización, el adaptador "tóxico" comprende un extremo bicatenario que se puede ligar y un extremo de horquilla en bucle cerrado que no se puede ligar. En algunos modos de realización, el adaptador "tóxico" comprende un extremo fosforilado que se puede ligar y un extremo no fosforilado que no se puede ligar. En algunos modos de realización, el adaptador "tóxico" es el segundo adaptador (descrito con más detalle a continuación) que se usa para la etapa de secuenciación del procedimiento. Aún en otro modo de realización, la longitud de los concatámeros se controla introduciendo una enzima con actividad fosfatasa alcalina en la reacción para limitar el número de extremos fosforilados de adaptadores disponibles para su ligación.
Aún en otros modos de realización, el tamaño de los concatenados se controla por precipitación dependiente del tamaño. Por ejemplo, incubación de la reacción de ligación en presencia de un precipitante polimérico. En algunos modos de realización, el precipitante es polietilenglicol (PEG), por ejemplo, PEG 2000, 4000, 6000 u 8000 a una concentración conocida para sedimentar ADN que exceda un tamaño deseado. En algunos modos de realización, la precipitación se produce en un soporte sólido y se puede controlar o potenciar por aditivos, por ejemplo, cationes tales como Mg2+. En algunos modos de realización, la adición de MgCh (por ejemplo, a concentraciones de 5 mM, 10 mM, 20 mM o mayores) estimula la sedimentación de concatenados sobre el soporte sólido cuando un concatenado alcanza un determinado tamaño.
En la siguiente etapa, las moléculas diana concatenadas se unen con el segundo adaptador. En algunos modos de realización, el segundo adaptador posibilita la secuenciación de las moléculas diana concatenadas ligadas a adaptador. En algunos modos de realización, el segundo adaptador contiene elementos requeridos para una plataforma de secuenciación particular, por ejemplo, sitios de unión a cebador de secuenciación. En algunos modos de realización, el adaptador es un adaptador de horquilla que comprende una porción de tallo bicatenaria y una porción de bucle monocatenaria, tal como se describe, por ejemplo, en la patente de EE. UU. n.° 8455193.
En algunos modos de realización, el adaptador comprende uno o más códigos de barras. Un código de barras puede ser un ID de muestra múltiple (MID) usado para identificar la fuente de la muestra donde se mezclan (multiplexan) las muestras. El código de barras también puede servir como un ID molecular único (UID) usado para identificar cada molécula original y su descendencia. El código de barras también puede ser una combinación de un UID y un MID. En algunos modos de realización, se usa un código de barras único, tanto UID como MID. Otro tipo de código de barras es un código de barras de hebra (SID) diseñado para que marque cada hebra de la molécula diana, por ejemplo, una hebra (+) y una (-).
En algunos modos de realización, cada código de barras comprende una secuencia predefinida. En otros modos de realización, el código de barras comprende una secuencia aleatoria. Los códigos de barras pueden tener una longitud de 1-20 nucleótidos.
En algunos modos de realización, el adaptador comprende además un sitio de unión a cebador para al menos un cebador universal. Un sitio de unión a cebador es una secuencia complementaria al cebador al que se puede unir el cebador y facilitar el alargamiento de la hebra.
En algunos modos de realización, el adaptador tiene más de un sitio de unión a cebador, por ejemplo, dos. En algunos modos de realización, se usa un cebador para la amplificación, por ejemplo, por PCR (incluyendo PCR asimétrica), amplificación lineal o replicación por círculo rodante (RCA).
Se puede secuenciar la colección de ácidos nucleicos diana concatenados ligados a adaptador. Las colecciones de moldes creadas por el procedimiento de la presente invención son especialmente ventajosas en tecnologías de secuenciación de molécula única (SMS) aptas para lecturas largas. Los ejemplos de dichas tecnologías incluyen la plataforma de Pacific Biosciences que utiliza la tecnología de SMRT® (Pacific Biosciences, Menlo Park, Cal.) o una plataforma que utiliza la tecnología de nanoporos, tal como instrumentos basados en nanoporos biológicos fabricados por Oxford Nanopore Technologies (Oxford, Reino Unido) o Roche Genia (Santa Clara, Cal.) o instrumentos basados en nanoporos en estado sólido descritos, por ejemplo, en la pub. de solicitud internacional. n.° WO2016/142925 y en Stranges, et al, (2016) Design and characterization of a nanopore-coupled polymerase for single-molecule DNA sequencing by synthesis on an electrode array. PNAS 113(44):E6749, y cualquier otra tecnología de secuenciación de molécula única que exista actualmente o futura que sea adecuada para lecturas largas.
En algunos modos de realización, la etapa de secuenciación implica el análisis de secuencia. El análisis de secuencia puede comprender análisis primario y secundario. En algunos modos de realización, el análisis primario comprende el análisis realizado por el programa informático que se conecta con el instrumento de secuenciación y convierte las señales obtenidas por el instrumento (por ejemplo, fluorescentes o eléctricas) en identificaciones de bases. En algunos modos de realización, el análisis secundario se realiza en la secuencia primaria y comprende la alineación de secuencias. En algunos modos de realización, el análisis secundario comprende además la desconcatenación.
En algunos modos de realización, la desconcatenación incluye etapas discretas. En algunos modos de realización, el procedimiento comprende una etapa en la que una ventana de barrido se desplaza a lo largo de cada lectura y realiza un emparejamiento aproximado con la secuencia de adaptador esperada. En algunos modos de realización, se toleran 1, 2, 3, 4 o más emparejamientos erróneos, incluyendo deleciones e inserciones durante el emparejamiento de la secuencia de adaptador, dependiendo de la longitud del adaptador usado. En algunos modos de realización, la posición de los adaptadores en cada lectura se localiza por procedimientos computacionales, tales como BLAST. Estos procedimientos comprenden además una etapa de generación de una lista de posiciones de adaptadores y fragmentos en cada lectura. En algunos modos de realización, después de la desconcatenación, los fragmentos se alinean con el genoma o fracción subgenómica, tal como una lista de secuencias de las regiones genómicas diana.
En algunos modos de realización, la muestra contiene ácidos nucleicos diana de tamaños similares. Por ejemplo, en algunos modos de realización, el ácido nucleico diana es un gen único o región génica aislada y amplificada a partir de la muestra. En otros modos de realización, el ácido nucleico diana es una colección de secuencias de la misma longitud, por ejemplo, ADN libre de células encontrado en la sangre humana, incluyendo ADN fetal libre de células encontrado en la sangre de la madre. Dicho ADN tiene una longitud promedio de 150 pb. En algunos modos de realización, se puede calcular el número o porcentaje de lecturas de tamaño esperado. En otros modos de realización, se puede calcular la longitud promedio de un concatenado. Por ejemplo, el cálculo ilustrado en la tabla 1 demuestra que, en promedio, cada lectura contenía 5,68 fragmentos.
En algunos modos de realización, el procedimiento de la presente invención en virtud de la concatenación incrementa el rendimiento de secuenciación en comparación con la secuenciación de un agrupamiento de fragmentos no concatenados. Por ejemplo, dependiendo del grado de concatenación, el rendimiento se puede incrementar 2, 3, 4, 5 o más veces.
Tabla 1. Visión general de las series de secuenciación de PacBio
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'n.° de' representa 'número de'; esto excluye todos los fragmentos que solo tienen 1 pb de longitud; esta es la proporción de n.° de fragmentos y n.° de lecturas totales; esta es la fracción de lecturas alineadas de n.° de lecturas totales;
NC: agrupamiento no concatenado; C-1, 2, 3: agrupamiento concatenado, réplicas 1, 2, 3;
La presente invención es un novedoso procedimiento de preparación de una colección de secuenciación "ConcatSeq y un procedimiento relacionado que utiliza enzimas de restricción cortadoras infrecuentes. "ConcatSeq". El procedimiento puede incrementar el rendimiento de secuenciación de las plataformas de secuenciación de molécula única (SMS) en más de cinco veces por serie en comparación con una muestra no concatenada. En algunos modos de realización, el número promedio de fragmentos detectados en todas las lecturas de secuenciación se puede observar como de aproximadamente cinco. En algunos modos de realización, se han detectado concatámeros mucho más largos que consisten en hasta 50 fragmentos. En algunos modos de realización, el potencial para incrementar el rendimiento de secuenciación mucho más allá de cinco veces se logra aplicando selección de tamaño a la colección antes de la secuenciación.
En algunos modos de realización, la exactitud de la determinación de la secuencia depende de la secuencia consenso obtenida a partir de la lectura de varias copias de la secuencia diana. Por ejemplo, la exactitud de la tecnología de SMRT® de PacBio depende de las lecturas de secuencias consenso circulares (CCS) determinadas a partir de múltiples pasadas a lo largo de ambas hebras del molde. Por tanto, existe un límite superior inherente con respecto a la longitud de los concatámeros que proporcionan información de secuenciación útil. Por ejemplo, las estadísticas actuales muestran que la exactitud de PacBio alcanza un 99 % con 5 pasadas completas y la longitud promedio de las lecturas de polimerasa está entre 10 - 15 kb, lo que hace que la longitud ideal de una colección de secuenciación concatenada esté entre dos y cuatro kb. Suponiendo que los fragmentos cortos generados por los flujos de trabajo de enriquecimiento de dianas sean típicamente de alrededor de 200 pb, se estima que el procedimiento se puede optimizar además para incrementar el rendimiento de secuenciación de PacBio en 10 - 20 veces.
Para controlar la longitud máxima de concatámeros generados durante la reacción de concatenación, se contempló (además de las estrategias enumeradas anteriormente para la selección de tamaño) un enfoque que usa agregados de adaptadores que protegerán una molécula en uno o ambos extremos. Un ejemplo no limitante de dichos adaptadores son los adaptadores de horquilla específicos de PacBio. El adaptador tóxico evitaría que el concatenado creciera adicionalmente. La concentración de partida de dichos adaptadores "tóxicos" se podría usar para controlar la distribución de tamaño de la colección final.
Los ejemplos descritos en el presente documento ilustran la validación del procedimiento de la invención al detectar correctamente SNV conocidas en una muestra de ADN bien caracterizado. Una comparación con frecuencias alélicas conocidas y la representación de moléculas en el agrupamiento original mostró una concordancia muy alta con la muestra no concatenada, lo que demuestra que el ensamblaje Gibson no incrementa significativamente la tasa de error o el sesgo de muestreo y lo que corrobora la validez de ConcatSeq (véanse las fig. 3(c) y fig. 3(d)). La exactitud de la determinación de la secuencia usando los procedimientos descritos en el presente documento se podría mejorar además solo incluyendo lecturas de 'alta calidad', por ejemplo, lecturas de CCS con al menos 5 pasadas, y/o equilibrando las reacciones de PCR para garantizar la representación equimolar de cada amplicón. Aunque los ejemplos descritos en el presente documento se centraron en un panel de dianas de oncología con fragmentos muy cortos (entre 80 - 220 pb de longitud), los experimentos que usan la escalera de BPM (fig. 5 (a)-(c)) demuestran que ConcatSeq es aplicable a la concatenación de fragmentos mucho más largos y, por lo tanto, se puede aplicar en otras áreas de investigación.
El procedimiento de la invención se puede aplicar fácilmente a diversos flujos de trabajo de enriquecimiento de dianas, como se demuestra por PCR múltiple, y flujos de trabajo donde se incorporen adaptadores de secuenciación a través de ligación, tales como la captura de híbridos. Se pueden aplicar similares soluciones a otros ensayos, tales como HEAT-Seq basado en sondas moleculares de inversión (Roche Sequencing Solutions, Madison, Wisc.). En este caso, la única modificación del protocolo original es el uso de cebadores que contienen adaptadores de ConcatSeq o adaptadores con sitios de enzimas de restricción cortadoras infrecuentes durante la amplificación de la molécula diana circularizada.
Debido a la facilidad con la que el procedimiento descrito aquí se puede adaptar a diferentes esquemas de enriquecimiento de dianas, mientras se modifica mínimamente su flujo de trabajo original, los procedimientos de concatenación instantánea y sus variaciones proporcionan una nueva herramienta de preparación de muestras potente y versátil para tecnologías de secuenciación de lectura larga, incluyendo, pero sin limitarse a plataformas de PacBio y plataformas basadas en nanoporos.
En algunos modos de realización, la invención es una colección de secuencias de ácidos nucleicos concatenados adecuadas para su secuenciación. La colección comprende ácidos nucleicos diana ligados a primer adaptador concatenados que están flanqueados además por el segundo adaptador. La colección se genera por un procedimiento que comprende las etapas de fijar una molécula de adaptador a al menos un extremo de una molécula nucleica diana bicatenaria, en la que un adaptador comprende un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción de corte infrecuente para formar una molécula diana ligada a adaptador; digerir la molécula diana ligada a adaptador con la endonucleasa de restricción de corte infrecuente para formar extremos parcialmente monocatenarios; unir al menos dos moléculas diana ligadas a adaptador digeridas con endonucleasa hibridando y uniendo covalentemente los extremos parcialmente monocatenarios, generando, de este modo, moléculas diana concatenadas.
En algunos modos de realización, la invención es otra colección de secuencias de ácidos nucleicos concatenados adecuadas para su secuenciación. La colección comprende ácidos nucleicos diana ligados a primer adaptador concatenados que están flanqueados además por el segundo adaptador. La colección se genera por un procedimiento que comprende las etapas de fijar un primer adaptador que tiene al menos una región bicatenaria a cada extremo de una molécula diana bicatenaria; poner en contacto las moléculas diana bicatenarias que contienen el adaptador con una exonucleasa para generar regiones de adaptador parcialmente monocatenarias en los extremos de la molécula diana; unir al menos dos moléculas diana hibridando las regiones de adaptador parcialmente monocatenarias en cada hebra de las moléculas diana para formar las regiones de adaptador bicatenarias y enlazar covalentemente las hebras de las moléculas diana, generando, de este modo, moléculas diana concatenadas; y fijar un segundo adaptador a las moléculas concatenadas, comprendiendo el adaptador uno o más códigos de barras, sitios de cebado de amplificación universal y sitios de cebado de secuenciación, generando, de este modo, una colección de moléculas de ácido nucleico diana concatenadas.
En algunos modos de realización, la invención es un kit para producir una colección de moléculas de ácido nucleico diana concatenadas que comprende: un adaptador que comprende un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción de corte infrecuente y un código de barras molecular, un segundo adaptador que comprende un sitio de cebado universal, una endonucleasa de restricción de corte infrecuente y una ácido nucleico ligasa y, opcionalmente, cebadores complementarios a los sitios de cebado universal, una ácido nucleico polimerasa termoestable y una mezcla de al menos cuatro desoxinucleósidos trifosfato.
En algunos modos de realización, la invención es otro kit para producir una colección de moléculas de ácido nucleico diana concatenadas que comprende: un primer adaptador que tiene al menos una región bicatenaria, un segundo adaptador que comprende uno o más códigos de barras, sitios de cebado de amplificación universal y sitios de cebado de secuenciación, una exonucleasa, una ácido nucleico polimerasa y una ácido nucleico ligasa, y, opcionalmente, también cebadores de amplificación complementarios a las secuencias de primer adaptador, una ácido nucleico polimerasa termoestable y una mezcla de al menos cuatro desoxinucleótidos trifosfato.
EJEMPLOS
Ejemplo 1 Creación de una colección de moléculas diana concatenadas
ADN, oligonucleótidos, reactivos y kits. En este ejemplo, se adquirió ADN genómico disponible comercialmente de una línea celular humana con KRAS mutante de Horizon Discovery (HD701) y Promega (G1471). Se adquirió la escalera de ADN de bajo peso molecular de New England BioLabs (N3233). Se adquirieron los oligonucleótidos y el tampón doble libre de nucleasa de Integrated DNA Technologies. Un oligonucleótido se modificó internamente por la incorporación de un grupo amino en la citosina. La mezcla maestra de ensamblaje de ADN de alta fidelidad NEBuilder y la ADN polimerasa de alta fidelidad Phusion se adquirieron de New England BioLabs (E2621). La exonucleasa III (M0379) y la exonucleasa VII (M0206) se adquirieron de New England BioLabs. Se adquirieron ADN polimerasa AmpliTaq Gold con tampón II y MgCb (N8080241), agua libre de nucleasa (AM9937) y reactivos para ensayos con Qubit dsDNA (Q32850 y Q32851) de Thermo Fisher Scientific. Se adquirieron Ka PA Hyper Prep Kit (KK8503) y microesferas Ka PA Pure (KK8002) de KAPA BioSystems. Los kits DNA 7500 de Agilent (5067-1504) para el sistema bioanalizador 2100 de Agilent se adquirieron de Agilent Technologies.
Amplificación por PCR y concatenación de moléculas diana. Para los experimentos descritos en las figs. 1-3, en primer lugar, se amplificaron regiones diana del genoma usando cebadores específicos de gen y 30 ng de HD701 de ADN genómico usando ADN polimerasa AmpliTaq Gold. Esta primera tanda de PCR amplificó las regiones diana conjuntamente con espaciadores flanqueantes en ambos extremos de cada amplicón. Para los experimentos descritos en las figs. 1 (a)-(c) y 2 (a)-(e), el producto de PCR resultante se amplificó, a continuación, con dos pares de cebadores que ceban las secuencias de espaciador e incorporan adaptadores de ConcatSeq complementarios en ambos extremos en dos reacciones de PCR separadas. Para los experimentos descritos en la fig. 3 (a)-(d), en primer lugar, se amplificaron las 20 regiones diana en dos reacciones de PCR separadas (11 y 9 amplicones, respectivamente) debido a incompatibilidades de los cebadores. Los dos productos de PCR se amplificaron posteriormente para incorporar adaptadores de ConcatSeq complementarios a sus extremos. A continuación, los productos de PCR resultantes se limpiaron usando microesferas KAPA Pure y se cuantificaron usando el kit de ensayo Qubit dsDNA BR. A continuación, se mezclaron 200-300 ng de cada uno de los dos productos de PCR y el volumen final se llevó a 40 pl con agua de calidad para PCR. Se añadió un volumen igual (40 pl) de mezcla maestra de ensamblaje de ADN de alta fidelidad NEBuilder y se incubó durante 1 h a 50 °C. El ensamblaje Gibson se siguió de una etapa de limpieza usando microesferas KAPA Pure seguido de cuantificación con Qubit (típicamente la concentración fue de ~ 10 ng/pl) y análisis de intervalos de tamaños usando el ensayo con DNA7500 de Agilent.
Ligación de adaptadores de ConcatSeq a moléculas diana antes de la concatenación. Para los experimentos descritos en la fig. 4 (a)-(c), se generaron dos adaptadores de ConcatSeq de cola T complementarios diferentes hibridando secuencias de cebadores de PCR a una concentración final de 20 pM. Para el experimento descrito en la figura 4a, se amplificaron cuatro regiones diferentes del locus de EGFR a partir de ADN genómico humano (masculino). La concentración de los productos de PCR se determinó usando el ensayo con Qubit dsDNA BR y, a continuación, se agrupó a una concentración equimolar (~73 nM). Para el experimento descrito en la fig. 4b, se diluyó la escalera de ADN de BPM de NEB a 10 ng/pl y se usó como material de entrada. Para ambos, fig.4(a) y 4(b), las muestras de ADN se dividieron en dos reacciones (comprendiendo 25 pl de cada una una cantidad de ~ 250 ng de ADN total) y se sometieron al ensayo con KAPA Hyper Prep: reparación de extremos, adición de A y ligación a los dos adaptadores de ConcatSeq de cola T. A continuación, los agrupamientos de fragmentos ligados a adaptador resultantes se amplificaron por PCR para enriquecer los fragmentos que se habían ligado satisfactoriamente a los adaptadores en ambos extremos. Las concentraciones de ADN se cuantificaron usando el kit de ensayo Qubit dsDNA BR. A continuación, se mezclaron 200-300 ng de cada uno de los dos productos de PCR y se llenaron hasta 40 pl con agua de calidad para PCR. Se añadió un volumen igual de mezcla maestra de ensamblaje de ADN de alta fidelidad NEBuilder y se incubó durante 30, 60, 100 y 120 min a 50 °C. El ensamblaje Gibson se siguió de una etapa de limpieza usando microesferas KAPA Pure (proporción de 0,8x), seguido de cuantificación con Qubit y análisis de intervalos de tamaños de intervalo de tamaños usando el ensayo con DNA7500 de Agilent.
Un adaptador bicatenario, que alberga tanto un UID como el sitio de restricción de Sce I en la orientación deseada, se liga a ambos extremos del fragmento de ADN (figura 1). Los productos de ligación se digieren por Sce I y unen por ADN ligasa.
Preparación de la colección de PacBio. Se usaron aproximadamente 100 ng del agrupamiento concatenado para preparar colecciones de secuenciación de PacBio usando el KAPA Hyper Prep Kit. En primer lugar, se creó un adaptador de horquilla de cola T adecuado por la autohibridación de un oligonucleótido adaptador (20 pM) usando tampón doble y calentando durante 5 min a 80 °C seguido de una reducción lenta (0,2 °C por segundo) a 25 °C. A continuación, los concatámeros de ADN bicatenario se sometieron a reparación de extremos y adición de A, y se ligaron a los adaptadores de horquilla (en aproximadamente una proporción 250:1 de adaptadores con respecto a concatámeros) durante 30 min a 20 °C. Los adaptadores de horquilla de cola T y las moléculas de ADN concatenadas sin reaccionar se retiraron añadiendo exonucleasa III y exonucleasa VII (1 pl de cada una) a la muestra e incubando durante 30 min a 37 °C. Las moléculas de la colección resultante se limpiaron con microesferas KAPA Pure en una proporción de 0,8x, y, a continuación, se cuantificaron usando el ensayo con Qubit dsDNA HS. En promedio, la concentración final de las colecciones de secuenciación estuvo entre 0,5 y 2 ng/pl.
Ejemplo 2. Secuenciación de la colección de moléculas diana concatenadas
Secuenciación de PacBio. Se usó el Binding Calculator (versión 2.3.1) para preparar la colección para la secuenciación de PacBio usando el protocolo MagBead de una célula por pocillo (OCPW), y se usó el kit de unión P6v2 con una concentración en placa de 0,05 nM. El acondicionamiento e hibridación del cebador, así como la unión de la polimerasa a los moldes, y la unión de complejos a las microesferas magnéticas se realizaron exactamente como se indica por el protocolo de Binding Calculator. Los complejos de moldes se incubaron con MagBeads durante 2 horas a 4 °C antes de cargar una celda de SMRT. Se grabaron filmaciones de cuatro horas y se realizó el análisis de secuencia primario en el instrumento RSII de PacBio.
Ejemplo 3. Procedimiento alternativo de preparación de una colección de ácidos nucleicos diana concatenados
Procedimiento alternativo de fijación de adaptadores. La figura 4(a) representa una adaptación para el procedimiento SeqCap (Roche Sequencing Solutions, Madison, Wisc.), donde solo existen dos cambios en el flujo de trabajo. En primer lugar, los adaptadores en Y, que se ligan a fragmentos de ADN al comienzo del protocolo, se reemplazan por adaptadores de ConcatSeq (fig. 4(a), etapa de ligación al adaptador). En segundo lugar, se introduce una nueva etapa en la que las moléculas diana capturadas y amplificadas por PCR se incuban con la mezcla maestra enzimática durante 1 hora para que tenga lugar la concatenación.
Para someter a prueba si ConcatSeq funciona en una situación donde los adaptadores de ConcatSeq se ligan a fragmentos de ADN, en lugar de incorporarse por amplificación por PCR, en primer lugar, se generó un agrupamiento que consistía en cuatro productos de PCR del locus de EGFR humano. Todos los amplicones tenían un tamaño de 220 pb y se amplificaron usando ADN genómico humano masculino (G1471, Promega) como molde (fig. 4(b)). El ADN agrupado se dividió en dos alícuotas y se fijaron dos tipos de adaptadores solapantes por medio de ligación de cola A. Se realizó una etapa de PCR para el enriquecimiento antes de la concatenación como se describe antes en la fig.
1(a). Obsérvese que esta reacción de PCR imita a la etapa de PCR en el flujo de trabajo actual en el que la colección enriquecida de dianas se amplifica por la presecuenciación. Los números promedio de fragmentos por lectura se redujeron ligeramente en comparación con series previas. Sin embargo, la tasa de acierto fue excelente, lo que confirma que el enfoque basado en ligación es válido. La gran mayoría de los fragmentos desconcatenados tuvieron el tamaño esperado de 220 pb (fig. 4(c)). Para una segunda prueba, se usó una escalera de ADN de bajo peso molecular (BPM) que contenía 11 ADN bicatenarios de longitudes variables como material de partida para su ligación al adaptador. En este experimento de concatenación, el número promedio de fragmentos por lectura fue solo de 3,8 veces (tabla 1), lo que se espera debido a la presencia de moléculas mucho más grandes (hasta de 766 pb) en la mezcla. Se advirtió que la representación de los fragmentos de BPM estaba fuertemente influenciada por la ligación al adaptador y/o la posterior amplificación por PCR (fig. 6(a)-(d)). Se descubrió una alta correlación (r de Pearson = 0,971) entre las frecuencias de los fragmentos de BPM alineados y las concentraciones de fragmentos después de la ligación al adaptador (fig. 5(d)), lo que confirma que el procedimiento submuestrea las moléculas con bajo sesgo durante el ensamblaje.
Ejemplo 4. Análisis de datos de secuenciación
Análisis de datos secundario y terciario. Se determinaron las lecturas de las inserciones usando la configuración predeterminada en el SMRT Portal: solo se incluyeron las lecturas con más de una pasada completa y una exactitud mínima prevista de un 90 % para la generación de lecturas de CCS. Las lecturas de secuencias consenso circulares se desconcatenaron usando un enfoque de barrido de adaptadores, que se implementó en R. En resumen, una ventana de 30 pb (que corresponde a la longitud del adaptador de ConcatSeq) se desplaza a lo largo de cada lectura y realiza un emparejamiento aproximado con la secuencia de adaptador de ConcatSeq (en orientación de complemento directo e inverso) usando la función agrep y permitiendo hasta 4 emparejamientos erróneos, inserciones y/o deleciones. Los adaptadores identificados de esta manera se retiran de las lecturas, dejando atrás los fragmentos desconcatenados. Se crean nuevos archivos fastq que enumeran todos los adaptadores y fragmentos identificados por este procedimiento. Antes de la alineación de los fragmentos con las referencias, se retiraron todos los fragmentos de 1 pb de longitud. Las secuencias de espaciador (introducidas durante la primera amplificación por PCR en los experimentos descritos en las figs. 1(a)-(c)-3(a)-(d)) siguieron siendo parte de cada fragmento después de la desconcatenación y no se retiraron específicamente antes de la alineación usando bwa mem. Las secuencias de espaciador que flanquean cada fragmento se dejaron sin alinear en extremo durante la alineación. Solo las alineaciones que tenían un samflag de 0 o bien 16, lo que indicaba una alineación correcta en orientación de complemento directo o inverso, respectivamente, se conservaron para su análisis adicional. Para la fig. 3(a)-(d), se generaron apilamientos de los fragmentos alineados usando la función mpileup en samtools. Se usó una secuencia de órdenes en Perl para transformar los apilamientos en tablas de contingencia que informaran de la frecuencia de cada base identificada en cada posición. Se extrajeron las frecuencias alélicas en las posiciones pertinentes (es decir, las variantes mononucleotídicas conocidas en HD701) de estas tablas y se representaron como la fracción del número total de lecturas alineadas en esa posición.
Ejemplo 5. Evaluación del procedimiento de la invención
Evaluación de la secuenciación de ConcatSeq. Para confirmar que este enfoque de concatenación era satisfactorio, se eligió (aleatoriamente) una lectura que consistía en 1719 pb de ZMW93 para una inspección detallada. En base a su longitud, se sospechó que es un 8-mero. Se identificaron tres rasgos característicos recurrentes en esta lectura: los adaptadores de ConcatSeq de 30 pb, la secuencia diana y los espaciadores (fig. 2(a)). (Para simplificar, se hará referencia a la diana más las secuencias de espaciador flanqueantes como 'dianas' o 'fragmentos' de aquí en adelante). Como se esperaba a partir del diseño usado en el enfoque, los adaptadores alternan entre orientación de complemento directo e inverso a lo largo de la lectura. La orientación de las dianas es aleatoria, pero ambas orientaciones están presentes en aproximadamente la misma frecuencia (es decir, cinco en complemento directo y tres en inverso).
Para extender este tipo de análisis a las 14.739 lecturas de secuenciación, se implementó un procedimiento de bioinformática para automatizar la desconcatenación. Este procedimiento se basa en un algoritmo donde una ventana de barrido se desplaza a lo largo de cada lectura y realiza un emparejamiento aproximado (con hasta 4 emparejamientos erróneos tolerados, incluyendo deleciones e inserciones) con la secuencia de adaptador esperada, y genera listas de posiciones de adaptadores y fragmentos en cada lectura. Como se esperaba, el número de todos los fragmentos en orientación de complemento directo e inverso fue casi exactamente igual (fig. 2(b)). Lo mismo fue cierto para los adaptadores en ambas orientaciones. También se observó un número más pequeño de adaptadores en comparación con los fragmentos, lo que se hipotetizó que se debía a que los adaptadores que se localizaban en los extremos de los concatámeros a veces estaban truncados y, por lo tanto, no identificados por el enfoque de barrido de adaptadores. Otra inspección de los extremos de las lecturas confirmó esta hipótesis.
En resumen, se identificaron 89.496 fragmentos y 75.312 adaptadores en las 14.739 lecturas. La gran mayoría de las dianas (n=62.093, 74,2 %) tenía exactamente el tamaño esperado de 187 pb o estaba muy cerca (181-190 pb) del tamaño esperado (fig. 2(c)). En particular, existió una segunda población de fragmentos que consistía en una sola base (n=5818, 6,5 %). Todos estos fragmentos se localizaron al comienzo o al final de las lecturas y la mayoría de estos eran una adenina o bien una timidina (85 %). Es muy probable que estos fragmentos de base única sean restos de los adaptadores de horquilla fijados a los n-meros por medio de la ligación de cola A durante la preparación de la colección (fig. 1(a)). Una tercera población (n= 12.783, 15,3 %) consistió en fragmentos que eran ligeramente más largos que el tamaño esperado (> 190 pb). De nuevo, la mayoría de estos fragmentos se localizaron en los extremos de las lecturas y contenían la diana junto con secuencias de adaptador truncado.
Se excluyeron los 5818 fragmentos mononucleotídicos de un análisis adicional, dejando 83.678 fragmentos después de la desconcatenación (tabla 1). En promedio, cada lectura contenía 5,68 fragmentos, lo que indica que el enfoque incrementó el rendimiento de secuenciación en al menos cinco veces en comparación con la secuenciación de un agrupamiento de fragmentos no concatenados. La alineación de las dianas con la secuencia de referencia mostró una magnífica tasa de acierto (98,0 %), lo que sugiere que la concatenación no interfirió con la fidelidad de las secuencias diana. Esto corrobora además la validez de ConcatSeq.
Debido a que todos los fragmentos que se concatenaron en este experimento eran del mismo tamaño (fig. 1b, carril [N]), se espera una relación lineal entre la longitud de la lectura y el número de fragmentos en esa lectura. Esta relación lineal se observó para la gran mayoría de las lecturas (fig. 2(d)). En las 22 lecturas restantes, algunas secuencias de adaptador no se identificaron por el algoritmo debido a que tenían más de 4 emparejamientos erróneos con la secuencia de referencia. Sorprendentemente, mientras que la mayoría de las lecturas (70,5 %) contenían entre tres y siete fragmentos (fig. 2(e)) y tenían entre 600 y 1500 pb de longitud, se descubrió una amplia extensión de longitudes de lectura, teniendo la más larga más de más de 10 kb de tamaño y conteniendo más de 50 fragmentos (fig. 2(d)). Esto sugiere que ConcatSeq tiene el potencial para incrementar además el rendimiento de secuenciación seleccionando el tamaño para concatámeros más largos antes de la secuenciación. Validación de ConcatSeq detectando variantes mononucleotídicas (SNV) en un panel de amplicones de oncología. Luego, se examinó si ConcatSeq se puede usar para identificar correctamente SNV conocidas y sus frecuencias alélicas en una muestra biológica. Con este fin, se amplificó un conjunto de dianas de oncología por PCR usando una referencia de ADN bien caracterizado (HD701, Horizon Discovery) como molde. HD701 es una línea celular isogénica genomanipulada disponible comercialmente en la que las frecuencias alélicas precisas para las principales dianas de oncología se han determinado por PCR digital. Las frecuencias alélicas (FA) de las variantes verificadas en esta muestra de ADN están entre un 1 % y un 24,5 %, lo que permite la evaluación de la exactitud y sensibilidad del ensayo. Se generaron veinte amplicones que abarcaban 5 genes (EGFR, KRAS, NRAS, BRAF y PIK3CA) en dos PCR múltiples separadas (que contenían 11 y 9 dianas, respectivamente), y, a continuación, se flanquearon por adaptadores de ConcatSeq complementarios (fig. 1(a)). Se mezclaron cantidades equimolares de estos dos agrupamientos de amplicones y se concatenaron en tres reacciones independientes, seguido de secuenciación de PacBio, sirviendo de muestras por triplicado para evaluar la reproducibilidad del ensayo. Como antes, en promedio, se observaron más de 5 fragmentos por lectura en estas muestras (tabla 1). También se secuenció el agrupamiento de amplicones no concatenado como control. A continuación, se estableció un conjunto de comandos de bioinformática (fig. 3(a)) que alinea los fragmentos desconcatenados y no concatenados con las 20 secuencias de referencia, genera apilamientos de cada alineación y, posteriormente, extrae las FA de las variantes conocidas en el ADN de la línea celular HD701. Las tasas de acierto en las tres muestras concatenadas y el control no concatenado fueron, de nuevo, muy altas (> 96,1 %). Las frecuencias alélicas identificadas con ConcatSeq estaban altamente correlacionadas (r de Pearson = 0,959) entre las tres réplicas de muestras concatenadas y las frecuencias esperadas (fig. 3(b)), lo que indica la capacidad de ConcatSeq para recuperar esta información con gran exactitud y sensibilidad. Una comparación de las fA en el control concatenado y el no concatenado mostró una concordancia incluso mayor (r de Pearson = 0,987), lo que indica que las desviaciones de las frecuencias esperadas probablemente se introdujeron durante la generación de amplicones y no durante la concatenación o secuenciación de PacBio. Para garantizar que el enfoque no introduce un sesgo significativo en la frecuencia de los amplicones representados en el agolpamiento antes de la concatenación, se comparó el porcentaje de cobertura de cada uno de los 20 amplicones en las tres muestras concatenadas y la muestra no concatenada (fig.
3(d)). Se descubrió una correlación muy alta (r de Pearson > 0,944) entre estos grupos, lo que indica que ConcatSeq submuestrea los amplicones del agrupamiento original con un bajo sesgo.
Ejemplo 6. Creación de una colección de moléculas diana concatenadas por medio de ligación al adaptador
Un adaptador bicatenario, que alberga tanto un UID como el sitio de restricción de Sce I en la orientación deseada, se liga a ambos extremos del fragmento de ADN (figura 1). Los productos de ligación se digieren por Sce I y unen por ADN ligasa.
Ejemplo 7. Creación de una colección de moléculas diana concatenadas por medio de extensión del cebador
Los cebadores directo e inverso se diseñan para que alberguen el sitio de restricción de Sce I en la orientación deseada, así como un UID (figura 2). Estos cebadores se usan para seleccionar regiones de interés dentro de una muestra por medio de PCR. Tras la amplificación por PCR, los productos de amplificación se digieren por Sce I y unen por ADN ligasa.
Ejemplo 8. Creación de una colección de moléculas concatenadas por medio de ligación y extensión del cebador
Un adaptador bicatenario, que alberga tanto un UID como el sitio de restricción de Sce I en la orientación deseada, se liga a ambos extremos del fragmento de ADN (figura 3). Un cebador de extensión diseñado con respecto a la hebra (+) o (-) y que alberga tanto un ID específico de hebra (SID) como el sitio de restricción de Sce I en la orientación deseada se hibrida por separado a cada hebra de la molécula diana. Tras la PCR, se generan moléculas de fragmentos adaptados con una orientación de inserción deseada. De forma alternativa, los cebadores de extensión para ambas hebras se hibridan simultáneamente a la molécula diana. Tras la PCR, se generan moléculas de fragmentos adaptados con una orientación de inserción aleatoria. A continuación, los productos de PCR purificados de ambas reacciones se pueden procesar como se describe anteriormente.
Ejemplo 9. Creación de concatenados de intervalos de tamaños deseados
Los fragmentos de ADN diana se amplifican por PCR con cebadores biotinilados para crear amplicones biotinilados. Estos se someten a digestión con una enzima de restricción Sce I para exponer las protuberancias no palindrómicas para la concatenación. Todas las especies biotiniladas se retiran por incubación con un soporte sólido unido a estreptavidina para dejar solo el producto completamente digerido. (Figura 10, A) Se realizan reacciones de ligación estándar usando ADN ligasa T4 en presencia de SeraMag Speedbeads carboxiladas (GE Healthcare Bio-Sciences, Pittsburgh, Penn.) y cantidades crecientes de PEG-8000. Después de 30 min, las microesferas se magnetizan, se retira el sobrenadante y las microesferas se lavan con etanol al 70 %. A continuación, los concatámeros se eluyen en tampón TE. Los resultados se muestran en la figura 10, B: los carriles 1-5 muestran la electroforesis de mezclas de ligación con concentraciones crecientes de PEG 8000 (6 %-14 % p/v). El carril 6 es sin control de precipitación.

Claims (6)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento de preparación de una colección de moléculas de ácido nucleico diana concatenadas de una muestra, comprendiendo el procedimiento:
a. fijar un primer adaptador que tiene al menos una región bicatenaria a cada extremo de una molécula diana bicatenaria;
b. poner en contacto la muestra con una exonucleasa para generar regiones de adaptador parcialmente monocatenarias en los extremos de la molécula diana;
c. unir al menos dos moléculas diana hibridando las regiones de adaptador parcialmente monocatenarias en cada hebra de las moléculas diana para formar las regiones de adaptador bicatenarias y enlazar covalentemente las hebras de las moléculas diana, generando, de este modo, moléculas diana concatenadas;
d. fijar un segundo adaptador a las moléculas concatenadas, comprendiendo el adaptador uno o más códigos de barras, sitios de cebado de amplificación universal y sitios de cebado de secuenciación, generando, de este modo, una colección de moléculas de ácido nucleico diana concatenadas.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el primer adaptador se fija amplificando las moléculas de ácido nucleico diana con cebadores que incorporan las secuencias de adaptador, o el primer adaptador se fija por ligación a los extremos de las moléculas de ácido nucleico diana.
3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el primer adaptador comprende una mezcla de adaptadores que se pueden ligar en ambos extremos y adaptadores que se pueden ligar en solo un extremo.
4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el primer adaptador comprende una región resistente a exonucleasa en al menos aproximadamente 15 bases desde el extremo 5'.
5. Una colección de moléculas de ácido nucleico diana concatenadas creadas usando el procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1-4, comprendiendo dicho procedimiento:
a. fijar un primer adaptador que tiene al menos una región bicatenaria a cada extremo de una molécula diana bicatenaria;
b. poner en contacto las moléculas diana bicatenarias que contienen el adaptador con una exonucleasa para generar regiones de adaptador parcialmente monocatenarias en los extremos de la molécula diana;
c. unir al menos dos moléculas diana hibridando las regiones de adaptador parcialmente monocatenarias en cada hebra de las moléculas diana para formar las regiones de adaptador bicatenarias y enlazar covalentemente las hebras de las moléculas diana, generando, de este modo, moléculas diana concatenadas;
d. fijar un segundo adaptador a las moléculas concatenadas, comprendiendo el adaptador uno o más códigos de barras, sitios de cebado de amplificación universal y sitios de cebado de secuenciación, generando, de este modo, una colección de moléculas de ácido nucleico diana concatenadas.
6. Uso de un kit para producir una colección de moléculas de ácido nucleico diana concatenadas para un procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 -4, comprendiendo dicho kit: un primer adaptador que tiene al menos una región bicatenaria, un segundo adaptador que comprende uno o más códigos de barras, sitios de cebado de amplificación universal y sitios de cebado de secuenciación, una exonucleasa, una ácido nucleico polimerasa y una ácido nucleico ligasa y, opcionalmente comprendiendo además cebadores de amplificación complementarios a las secuencias de primer adaptador, una ácido nucleico polimerasa termoestable y una mezcla de al menos cuatro desoxinucleósidos trifosfato.
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