ES2867553T3 - Secuencias de HCBI como un marcador temprano para el futuro desarrollo de cáncer y enfermedades del SNC y como una diana para el tratamiento y la prevención del cáncer - Google Patents

Abstract

Un ácido polinucleico de HCBI que comprende: (a) una secuencia de nucleótidos representada en la Figura 5 (SEQ ID. NO: 72); (b) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 90 % de identidad con una secuencia de nucleótidos de (a); (c) una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de (a) o (b); o (d) una secuencia de nucleótidos que es redundante como resultado de la degeneración del código genético en comparación con cualquiera de las secuencias de nucleótidos dadas anteriormente.

Description

DESCRIPCIÓN

Secuencias de HCBI como un marcador temprano para el futuro desarrollo de cáncer y enfermedades del SNC y como una diana para el tratamiento y la prevención del cáncer

La presente invención se refiere a secuencias de nucleótidos de HCBI (Aislado de Sangre de Ganado Vacuno Sano) así como a sondas y cebadores que comprenden parte de dichas secuencias de nucleótidos y anticuerpos contra polipéptidos codificados por dichas secuencias de nucleótidos. Finalmente, la presente invención se refiere al uso de dichos compuestos como un marcador temprano para el desarrollo futuro de enfermedades como el cáncer y las enfermedades del SNC y como una diana para el tratamiento y la prevención del cáncer.

Varios análisis epidemiológicos realizados en las últimas décadas indican que el consumo a largo plazo de carne "roja" procesada de diferentes maneras (incluida la carne ahumada y la carne como componente de las salchichas) puede considerarse un factor de riesgo para el cáncer de colon (Informe Mundial sobre el Cáncer 2013, zur Hausen 2009, zur Hausen 2012). La carne "roja" se considera que comprende carne de vacuno, cerdo, oveja, cordero y cabra, a diferencia de la carne "blanca" (carne/pescado de aves de corral).

Hasta ahora, las sustancias químicas cancerígenas que se producen durante el tostado, la parrilla, las barbacoas, el ahumado y el secado al aire se consideraron factores de riesgo para el cáncer. Sin embargo, a menudo se ignoró el hecho de que también se producen las mismas sustancias en concentraciones comparables durante formas análogas de preparación de carne/pescado de aves de corral. Por consiguiente, esto no respalda la suposición de que estas sustancias químicas desempeñan un papel exclusivo en lo que respecta al desarrollo del cáncer de colon. Debido a que, además, los análisis epidemiológicos actuales sugieren que la carne de vacuno es el principal factor de riesgo, se ha postulado que un factor adicional específico de la especie, presumiblemente infeccioso, contribuye a desencadenar este tipo de cáncer (zur Hausen, 2012). Los resultados de la correlación de los análisis de la propagación global de especies bovinas domesticadas con la incidencia global de cáncer de colon parecen sugerir que el consumo de carne de especies bovinas provenientes de ganado vacuno europeo/asiático (Bos taurus), pero no de razas de cebú, búfalo de agua o yak, puede ser importante como factor de riesgo principal.

Por lo tanto, el problema técnico que subyace en la presente invención es identificar secuencias de nucleótidos específicas que podrían estar asociadas con enfermedades como el cáncer o enfermedades del SNC y, por lo tanto, proporcionar medios para diagnóstico y terapia.

La solución a dicho problema técnico se logra proporcionando las realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones. Durante los experimentos que resultaron en la presente invención, los sueros de ganado vacuno se analizaron en busca de agentes infecciosos, a partir de la suposición de que la presencia en sueros también es indicativa de la presencia de estos agentes en la carne "roja". Se analizaron los sueros de vacas sanas y se pudieron aislar cinco nuevos componentes de ácido nucleico vírico. Las secuencias de ADN y los marcos de lectura abiertos de estos componentes mostraron una relación reconocible con las secuencias que ya se describieron para las encefalopatías espongiformes transmisibles (TSE) para enfermedades de TSE en ganado ovino, ganado vacuno y seres humanos.

También se ha sospechado que los aislados de TSE desempeñan un papel en la inducción del cáncer (Manuelidis, 2011), por lo que, es razonable suponer que las secuencias víricas descritas podrían estar asociadas con el desarrollo de enfermedades como el cáncer y las enfermedades del SNC. Brassard y col., Veterinary Microbiology, Vol. 126, No. 1-3, pp. 271-276 (2007) describen la detección molecular del virus Torque teno bovino y porcino en plasma y heces. Schuurman y col., Biologicals, Vol. 19, pp. 265-270 (1991) describen que el poliomavirus bovino es una contaminación frecuente del suero de ternera. Leary y col., J. of General Virology, Vol. 80, pp. 2115-2120 (1999) describen sistemas mejorados para la detección de virus TT. Fuchs y col., J. of Clinical Microbiology, Vol. 37, No. 8., pp. 2498-2507 (1999) describen la detección del herpesvirus bovino 1 en la sangre de ganado vacuno infectado de forma natural mediante el uso de PCR sensible que discrimina entre virus de tipo silvestre y virus que carecen de la glicoproteína E. Sprardbrow y col., J. of Comparative Pathology, Vol. 97, No. 4, pp. 469-479 (1987) describen una conexión entre el cáncer de piel y los papilomavirus en ganado vacuno. Giovanny y col., Open J. of Medical Microbiology, Vol. 3, pp. 84-90 (2013) describen que se ha detectado un segmento génico del virus de la leucemia bovina en el tejido mamario humano.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: Secuencia de nucleótidos de HCBI1.225 y supuestos marcos de lectura abiertos (Figura comparativa) También se muestran alineamientos con las secuencias de nucleótidos encontradas en las bases de datos y alineamientos de péptidos derivados de marcos de lectura abiertos de HCBI1.225 a las correspondientes secuencias de aminoácidos "Sphinx".

Figura 2: Secuencia de nucleótidos de HCBI2.170 y supuestos marcos de lectura abiertos (Figura comparativa) También se muestran alineamientos con las secuencias de nucleótidos encontradas en las bases de datos y alineamientos de péptidos derivados de marcos de lectura abiertos de HCBI2.170 a las correspondientes secuencias de aminoácidos "Sphinx".

Figura 3: Secuencia de nucleótidos de HCBI3.108 y supuestos marcos de lectura abiertos (Figura comparativa) También se muestran alineamientos con las secuencias de nucleótidos encontradas en las bases de datos y alineamientos de péptidos derivados de marcos de lectura abiertos de HCBI3.108 a las correspondientes secuencias de aminoácidos "Sphinx".

Figura 4: Secuencia de nucleótidos de HCBI4.296 y supuestos marcos de lectura abiertos (Figura comparativa) También se muestran alineamientos con las secuencias de nucleótidos encontradas en las bases de datos y alineamientos de péptidos derivados de marcos de lectura abiertos de HCBI4.296 a las correspondientes secuencias de aminoácidos "Sphinx".

Figura 5: Secuencia de nucleótidos de HCBI5.173 y supuestos marcos de lectura abiertos

También se muestran alineamientos con las secuencias de nucleótidos encontradas en las bases de datos y alineamientos de péptidos derivados de marcos de lectura abiertos de HCBI5.173 a las correspondientes secuencias de aminoácidos "Sphinx".

Por consiguiente, la presente invención se refiere a un ácido polinucleico de HCBI que comprende:

(a) una secuencia de nucleótidos representada en la Figura 5;

(b) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 90 % de identidad con una secuencia de nucleótidos de (a);

(c) un fragmento de una secuencia de nucleótidos de (a) o (b);

(d) una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de (a), (b) o (c); o (e) una secuencia de nucleótidos que es redundante como resultado de la degeneración del código genético en comparación con cualquiera de las secuencias de nucleótidos dadas anteriormente.

El término "ácido polinucleico" se refiere a una secuencia de ácido nucleico monocatenaria o bicatenaria. Un ácido polinucleico puede consistir en desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, análogos de nucleótidos o nucleótidos modificados o puede haber sido adaptado para fines diagnósticos o terapéuticos. Un ácido polinucleico también puede comprender un clon de ADNc bicatenario que se puede usar, por ejemplo, con fines de clonación.

Los ácidos polinucleicos de HCBI5.173 de la invención se pueden preparar de acuerdo con procedimientos de rutina bien conocidos, por ejemplo, (a) aislando el ADN o ARN completo de una muestra, (b) detectando la secuencia de HCBI mediante hibridación o PCR y (c) clonando la secuencia de HCBI en un vector.

También se incluyen dentro de la presente invención variantes de secuencia del ácido polinucleico de la invención que contiene deleciones y/o inserciones de uno o más nucleótidos, especialmente inserciones o deleciones de uno o más codones, principalmente en los extremos de los oligonucleótidos (ya sean 3 'o 5 ') y que muestran al menos un 90 %, 95 % o 98 % de identidad con dichas secuencias de ácido polinucleico de la invención. Las secuencias de ácido polinucleico de acuerdo con la presente invención que son similares a la secuencia que se muestra en la Figura 5 se pueden caracterizar y aislar de acuerdo con cualquiera de las técnicas conocidas en la técnica, como la amplificación por medio de cebadores específicos de secuencia, hibridación con sondas específicas de secuencia en condiciones más o menos rigurosas, determinación de la secuencia de la información genética de HCBI, etc.

La presente invención también proporciona fragmentos de las secuencias de nucleótidos de la presente invención descritas anteriormente que son, preferentemente, capaces de replicarse de manera autónoma como se describe en el Ejemplo 1. Una secuencia de nucleótidos de replicación autónoma comprende una secuencia de nucleótidos del gen de replicación o un fragmento del mismo que es capaz de inducir una replicación autónoma. La proteína de replicación representa una endonucleasa que se une al ADN monocatenario que induce un corte en una sola cadena en o cerca del origen de replicación (Wolds, 1997). El experto puede obtener tales fragmentos capaces de inducir una replicación autónoma sin excesiva experimentación. Dichos fragmentos pueden tener una longitud de al menos 45, al menos 55 o al menos 65 nt.

El experto en la materia puede determinar fácilmente qué secuencias de ácidos nucleicos están relacionadas con una secuencia de nucleótidos de la Figura 5 o qué fragmentos son todavía capaces de replicarse de forma autónoma mediante el uso de ensayos convencionales.

La presente invención también proporciona secuencias de ácidos polinucleicos que son redundantes como resultado de la degeneración del código genético en comparación con cualquiera de las secuencias de nucleótidos dadas anteriormente. Estas secuencias de ácidos polinucleicos variantes codificarán así la misma secuencia de aminoácidos que los ácidos polinucleicos de los que derivan.

El ácido polinucleico de HCBI5.173 de la invención podría estar presente como un episoma extracromosómico, podría integrarse en el genoma del hospedador y/o podría estar vinculado a un ADN de una célula hospedadora.

La presente invención también se refiere a un cebador de oligonucleótidos que comprende o consiste en parte de un ácido polinucleico como se define anteriormente, pudiendo dicho cebador actuar como cebador para secuenciar específicamente o amplificar específicamente el ácido polinucleico de HCBI5.173 de la invención.

El término "cebador" se refiere a una secuencia de oligonucleótidos de ADN monocatenario capaz de actuar como un punto de inicio para la síntesis de un producto de extensión de cebador que es complementario de la cadena de ácido nucleico que se va a copiar. La longitud y la secuencia del cebador deben ser tales que permitan cebar la síntesis de los productos de extensión. Preferentemente, el cebador es de aproximadamente 5-50 nucleótidos. La longitud y la secuencia específicas dependerán de la complejidad de las dianas de ADN o ARN necesarias, así como de las condiciones de uso del cebador, tales como la temperatura y la fuerza iónica.

El hecho de que los cebadores de amplificación no tengan que coincidir exactamente con la secuencia molde correspondiente para garantizar una amplificación adecuada está ampliamente documentado en la literatura. El procedimiento de amplificación utilizado puede ser, por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa (PCR), reacción en cadena de la ligasa (LCR), amplificación basada en la secuencia del ácido nucleico (NASBA), sistema de amplificación basada en la transcripción (TAS), amplificación por desplazamiento de cadena (SDA) o Amplificación por medio de la Qp replicasa o cualquier otro procedimiento adecuado para amplificar moléculas de ácido nucleico utilizando la extensión del cebador. Durante la amplificación, los productos amplificados pueden marcarse convenientemente usando cebadores marcados o incorporando nucleótidos marcados.

Las etiquetas pueden ser isotópicas (32P, 35S, etc.) o no isotópicas (biotina, digoxigenina, etc.). La reacción de amplificación se repite entre 20 y 70 veces, ventajosamente entre 25 y 45 veces.

Se puede usar cualquiera de una variedad de reacciones de secuenciación conocidas en la técnica para secuenciar directamente la información genética viral y determinar el orf traduciendo la secuencia de la muestra en la secuencia de aminoácidos correspondiente. Las reacciones de secuenciación ejemplares incluyen aquellas basadas en técnicas desarrolladas por Sanger o Maxam y Gilbert. También se contempla que se puede utilizar una variedad de procedimientos de secuenciación automatizados cuando se realizan los ensayos de sujetos, incluida la secuenciación por espectrometría de masas (véase, por ejemplo: la publicación PCT WO 94/16101). Será evidente para un experto en la materia que, por ejemplo, debe determinarse la aparición de solo dos o tres bases nucleicas en la reacción de secuenciación.

Preferentemente, estos cebadores tienen una longitud de aproximadamente 5 a 50 nucleótidos, más preferentemente de aproximadamente 10 a aproximadamente 25 nucleótidos. Los cebadores más preferidos son los que tienen una longitud de al menos 13 bases.

La presente invención también se refiere a una sonda de oligonucleótidos que comprende o consiste en parte de un ácido polinucleico de HCBI5.173 como se define anteriormente, siendo dicha sonda capaz de actuar como una sonda de hibridación para la detección específica de un ácido polinucleico de HCBI5.173 de acuerdo con la invención.

La sonda se puede etiquetar o unir a un soporte sólido.

El término "sonda" se refiere a oligonucleótidos específicos de secuencia monocatenarios que tienen una secuencia que es complementaria a la secuencia diana de un ácido polinucleico de HCBI5.173 a detectar.

Preferentemente, estas sondas tienen una longitud de aproximadamente 5 a 50 nucleótidos, más preferentemente de aproximadamente 10 a aproximadamente 25 nucleótidos. Las sondas más preferidas son los que tienen una longitud de al menos 13 bases.

La expresión "soporte sólido" puede referirse a cualquier sustrato al que se pueda acoplar una sonda de oligonucleótidos, siempre que mantenga sus características de hibridación y siempre que el nivel de fondo de la hibridación se mantenga bajo. Generalmente, el sustrato sólido será una placa de microtitulación, una membrana (por ejemplo, nailon o nitrocelulosa) o una microesfera (perla). Antes de la aplicación a la membrana o fijación, puede ser conveniente modificar la sonda de ácido nucleico para facilitar la fijación o mejorar la eficiencia de la hibridación. Dichas modificaciones pueden abarcar la eliminación de la cola de homopolímeros, el acoplamiento con diferentes grupos reactivos, tales como grupos alifáticos, grupos NH2, grupos SH, grupos carboxílicos, o el acoplamiento con biotina o haptenos.

Los oligonucleótidos de acuerdo con la presente invención, usados como cebadores o sondas también pueden contener o consistir en análogos de nucleótidos tales como fosforotioatos, alquilfosforatos o ácidos nucleicos peptídicos o pueden contener agentes intercalantes. Estas modificaciones requerirán adaptaciones con respecto a las condiciones en las cuales se debe usar el oligonucleótido para obtener la especificidad y sensibilidad requeridas. Sin embargo, los resultados finales serán esencialmente los mismos que los obtenidos con los oligonucleótidos no modificados.

La introducción de estas modificaciones puede ser ventajosa para influir positivamente en características tales como la cinética de hibridación, la reversibilidad de la formación de híbridos, la estabilidad biológica de las moléculas de oligonucleótidos, etc.

Los ácidos polinucleicos de la invención pueden estar comprendidos en una composición de cualquier tipo. Dicha composición puede ser para uso diagnóstico, terapéutico o profiláctico.

La presente invención también se refiere a un vector de expresión recombinante que comprende un ácido polinucleico de HCBI5.173 de la invención como se define anteriormente unido operativamente a elementos de control de transcripción y traducción procariotas, eucariotas o virales, así como a células hospedadoras que contienen dicho vector.

El término "vector" puede comprender un plásmido, un cósmido, un cromosoma artificial, un fago o un virus o un animal transgénico no humano. Pueden ser particularmente útiles para el desarrollo de vacunas, moléculas recombinantes de HCBI5.173, BCG o vectores adenovirales, así como virus recombinantes avipox.

La expresión "expresión recombinante" utilizada en el contexto de la presente invención se refiere al hecho de que los polipéptidos de la presente invención se producen mediante procedimientos de expresión recombinante, ya sea en procariotas o eucariotas inferiores o superiores, como se describe en detalle a continuación.

La expresión "célula hospedadora" se refiere a las células que pueden ser o han sido, utilizadas como receptores de un vector recombinante u otro polinucleótido de transferencia, e incluyen la progenie de la célula original que ha sido transfectada.

Se entiende que la progenie de una única célula parental puede no ser necesariamente completamente idéntica en morfología o en el complemento de ADN genómico o total como el progenitor original, debido a una mutación o recombinación natural, accidental o deliberada.

La expresión "eucariota inferior" se refiere a células hospedadoras tales como levaduras, hongos y similares. Los eucariotas inferiores son generalmente (pero no necesariamente) unicelulares. Los eucariotas inferiores preferidos son levaduras, particularmente especies dentro de Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluiveromyces, Pichia (p.ej. Pichia pastoris), Hansenula (p.ej. Hansenula polymorph), Schwaniomyces, Schizosaccharomyces, Yarowia, Zygosaccharomyces y similares. Saccharomyces cerevisiae, S. carlsbergensis y K. lactis son los hospedadores de levadura más comúnmente utilizados, y son hospedadores fúngicos convenientes.

La expresión "eucariota superior" se refiere a células hospedadoras derivadas de animales superiores, tales como mamíferos, reptiles, insectos y similares. Las células hospedadoras de eucariotas superiores actualmente preferidas derivan de células de hámster chino (por ejemplo, CHO), de mono (por ejemplo, células COS y Vero), de riñón de hámster recién nacido(BHK), de riñón de cerdo (PK15), de riñón de conejo 13 (RK13), de la línea celular 143 B de osteosarcoma humano, de la línea celular humana HeLa y de líneas celulares de hepatoma humano como Hep G2, la línea celular 293TT (Buck y col., 2004) y de líneas de células de insecto (por ejemplo, Spodoptera frugiperda). Las células hospedadoras pueden proporcionarse en cultivos en suspensión o en matraz, cultivos de tejidos, cultivos de órganos y similares. Alternativamente, las células hospedadoras también pueden ser animales transgénicos no humanos.

El término "procariotas" se refiere a hospedadores tales como E. coli, Lactobacillus, Lactococcus, Salmonella, Streptococcus, Bacillus subtilis o Streptomyces. También se contemplan estos hospedadores dentro de la presente invención.

El segmento del ADN de HCBI5.173 que codifica la secuencia deseada insertada en la secuencia del vector puede unirse a una secuencia señal. Dicha secuencia señal puede ser de una fuente que no es HCBI5.173, pero las construcciones particularmente preferidas de acuerdo con la presente invención contienen secuencias señal que aparecen en el genoma de HCBI antes de los respectivos puntos de inicio de las proteínas.

Los eucariotas superiores se pueden transformar con vectores, o se pueden infectar con un virus recombinante, por ejemplo, un vaccinia virus recombinante. Las técnicas y vectores para la inserción de ADN extraño en el vaccinia virus son bien conocidos en la técnica y utilizan, por ejemplo, recombinación homóloga. Una amplia variedad de secuencias promotoras virales está disponible en la técnica, posiblemente secuencias de terminación y secuencias de adición de poli (A), posiblemente secuencias potenciadoras y posiblemente secuencias de amplificación, requeridas todas para la expresión en mamíferos. Vaccinia es particularmente preferido ya que vaccinia detiene la expresión de proteínas de la célula hospedadora. Para la vacunación de humanos, los virus avipox y Ankara Modificado (AMV) son vectores particularmente útiles.

También se conocen los vectores de transferencia de expresión de insectos derivados del virus baculovirus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV), que es un vector de expresión viral independiente del auxiliar. Los vectores de expresión derivados de este sistema usualmente usan el promotor del gen de la polihedrina viral fuerte para dirigir la expresión de genes heterólogos. El experto en la materia dispone de diferentes vectores, así como procedimientos para la introducción de ADN heterólogo en el sitio deseado de baculovirus para la expresión de baculovirus. También se conocen en la técnica diferentes señales para la modificación postraduccional reconocidas por células de insecto.

La presente invención también se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por un ácido polinucleico de HBCI como se define anteriormente, o una parte o un análogo del mismo que es sustancialmente similar y biológicamente equivalente.

El término "polipéptido" se refiere a un polímero de aminoácidos y no se refiere a una longitud específica del producto.

Por lo tanto, están incluidos dentro de la definición de polipéptido, péptidos, oligopéptidos y proteínas. Este término tampoco hace referencia o excluye modificaciones posteriores a la expresión del polipéptido, por ejemplo, glucosilaciones, acetilaciones, fosforilaciones y similares. Dentro de la definición se incluyen, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluidos, por ejemplo, aminoácidos no naturales, ácido nucleico peptídico (PNA), etc.), polipéptidos con enlaces sustituidos, así como otras modificaciones conocidas en la técnica, tanto naturales como no naturales.

Los polipéptidos de acuerdo con la presente invención contienen preferentemente al menos 3, preferentemente 4 o 5 aminoácidos de HCBI5.173 contiguos, preferentemente 6 o 7, sin embargo, al menos 8 aminoácidos de HCBI5.173 contiguos, al menos 10 o al menos 15.

Los polipéptidos de la invención, y particularmente los fragmentos, pueden prepararse mediante síntesis química clásica. La síntesis puede llevarse a cabo en solución homogénea o en fase sólida. Los polipéptidos de acuerdo con la presente invención también pueden prepararse por medio de técnicas de ADN recombinante. La presente invención también se refiere a un procedimiento para la producción de un polipéptido recombinante como se define anteriormente, que comprende: (a) transformación de un hospedador celular apropiado con un vector recombinante, en el que un ácido polinucleico o una parte del mismo, como se define anteriormente, se ha insertado bajo el control de los elementos reguladores apropiados, (b) cultivo de dicho hospedador celular transformado en condiciones que permitan la expresión de dicho inserto, y (c) recolección de dicho polipéptido.

La presente invención también se refiere a un anticuerpo generado tras la inmunización con al menos un polipéptido como se define anteriormente, siendo dicho anticuerpo específicamente reactivo con cualquiera de dichos polipéptidos, y siendo dicho anticuerpo preferentemente, un anticuerpo monoclonal. El término "anticuerpo", preferentemente, se refiere a anticuerpos que consisten esencialmente en anticuerpos monoclonales combinados con diferentes especificidades epitópicas, así como a distintas preparaciones de anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales se fabrican a partir de un antígeno que contiene, por ejemplo, un polipéptido codificado por un ácido polinucleico de HCBI5.173 de la invención o un fragmento del mismo por procedimientos bien conocidos por los expertos en la materia. Como se utiliza en el presente documento, el término "anticuerpo" (Ab) o "anticuerpo monoclonal" (Mab) pretende incluir moléculas intactas, así como fragmentos de anticuerpos (tales como, por ejemplo, fragmentos Fab y F (ab')2) que son capaces de unirse específicamente a la proteína. Los fragmentos Fab y F (ab') 2 carecen del fragmento Fc del anticuerpo intacto, se eliminan más rápidamente de la circulación y pueden tener menos unión a tejidos no específicos que un anticuerpo intacto. Por lo tanto, se prefieren estos fragmentos, así como los productos de un FAB u otra biblioteca de expresión de inmunoglobulinas. Además, los anticuerpos útiles para los fines de la presente invención incluyen anticuerpos quiméricos, de cadena única y humanizados.

Preferentemente, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo lleva una etiqueta detectable. El anticuerpo/fragmento puede estar marcado directa o indirectamente de forma detectable, por ejemplo, con un radioisótopo, un compuesto fluorescente, un compuesto bioluminiscente, un compuesto quimioluminiscente, un quelante de metal o una enzima. Los expertos en la materia conocerán otros marcadores adecuados para unirse al anticuerpo, o podrán determinarlos, utilizando experimentación rutinaria.

La presente invención también se refiere a un kit de diagnóstico para su uso en la determinación de la presencia de un ácido polinucleico o polipéptido de HCBI5.173 de la invención, comprendiendo dicho kit un cebador, una sonda y/o un anticuerpo de la invención.

La presente invención también se refiere a un procedimiento para la detección de un ácido polinucleico de HCBI5.173 de acuerdo con la invención presente en una muestra biológica, que comprende: (a) extraer, opcionalmente, el ácido polinucleico de la muestra, (b) amplificar el ácido polinucleico como se describe anteriormente con al menos un cebador como se define anteriormente, opcionalmente un cebador marcado, y (c) detectar los ácidos polinucleicos amplificados.

El término "ácido polinucleico" también puede referirse a la cadena de analito y corresponde a una molécula de ácido polinucleico mono o bicatenaria.

El término "marcado" se refiere al uso de ácidos nucleicos marcados. Esto puede incluir el uso de nucleótidos marcados incorporados durante la etapa de amplificación de la polimerasa o de cebadores marcados, o por cualquier otro procedimiento conocido por el experto en la materia.

La presente invención también se refiere a un procedimiento para la detección de un ácido polinucleico de HCBI5.173 de acuerdo con la invención presente en una muestra biológica, que comprende: (a) extraer, opcionalmente, el ácido polinucleico de la muestra, (b) hibridar el ácido polinucleico como se describe anteriormente con al menos una sonda como se define anteriormente y (c) detectar los ácidos polinucleicos hibridados.

Las condiciones de hibridación y lavado deben entenderse como rigurosas y son generalmente conocidas en la técnica. Sin embargo, de acuerdo con la solución de hibridación (SSC, SSPE, etc.), estas sondas deben hibridarse a su temperatura apropiada para alcanzar una especificidad suficiente.

De acuerdo con la solución de hibridación (SSC, SSPE, etc.), estas sondas deben hibridarse rigurosamente a su temperatura apropiada para alcanzar suficiente especificidad. Sin embargo, modificando ligeramente las sondas de ADN, ya sea agregando o eliminando uno o unos pocos nucleótidos en sus extremos (ya sean 3 'o 5'), o sustituyendo algunos nucleótidos no esenciales (es decir, nucleótidos no esenciales para discriminar entre tipos) por otros (incluidos los nucleótidos modificados o inosina) se puede hacer que estas sondas o variantes de las mismas se hibriden específicamente en las mismas condiciones de hibridación (es decir, la misma temperatura y la misma solución de hibridación). También puede ser beneficioso cambiar la cantidad (concentración) de la sonda utilizada para obtener resultados de hibridación más específicos. Cabe señalar en este contexto, que las sondas de la misma longitud, independientemente de su contenido en GC, se hibridarán específicamente a aproximadamente la misma temperatura en soluciones TMACI.

Los procedimientos de ensayo adecuados para los fines de la presente invención para detectar híbridos formados entre las sondas oligonucleotídicas y las secuencias de ácidos polinucleicos de HCBI5.173 en una muestra pueden comprender cualquiera de los formatos de ensayo conocidos en la técnica, tales como el formato convencional de transferencia de puntos, hibridación tipo sándwich o hibridación inversa. Por ejemplo, la detección se puede realizar utilizando un formato de transferencia de puntos, la muestra amplificada sin marcar se une a una membrana, la membrana se incorpora con al menos una sonda marcada en condiciones de hibridación y lavado adecuadas y se controla la presencia de la sonda unida.

Un procedimiento alternativo y preferido es un formato de transferencia de puntos “inverso”, en el que la secuencia amplificada contiene una etiqueta. En este formato, las sondas de oligonucleótidos no marcadas se unen a un soporte sólido y se exponen a la muestra marcada en condiciones de hibridación rigurosa y de lavado posterior apropiadas. Debe entenderse que también puede usarse cualquier otro procedimiento de ensayo que se base en la formación de un híbrido entre los ácidos polinucleicos de la muestra y las sondas de oligonucleótidos de acuerdo con la presente invención.

La presente invención también se refiere a un procedimiento para detectar un polipéptido codificado por un ácido polinucleico de HCBI5.173 de la presente invención o un anticuerpo contra dicho polipéptido presente en una muestra biológica, que comprende: (a) poner en contacto la muestra biológica para detectar la presencia de dicho polipéptido o anticuerpo como se define anteriormente, y (b) detectar el complejo inmunológico formado entre dicho anticuerpo y dicho polipéptido.

Los procedimientos de inmunoensayo según la presente invención pueden utilizar antígenos de diferentes dominios de las secuencias de polipéptidos nuevas y únicas de la presente invención. Está dentro del ámbito de la invención usar, por ejemplo, antígenos oligoméricos individuales o específicos, antígenos diméricos, así como combinaciones de antígenos oligoméricos individuales o específicos. El antígeno de HCBI de la presente invención se puede emplear en prácticamente cualquier formato de ensayo que emplee un antígeno conocido para detectar anticuerpos. Por supuesto, se debe evitar o adaptar un formato que desnaturalice el epítopo conformacional de HCBI. Una característica común de todos estos ensayos es que el antígeno se pone en contacto con el componente del cuerpo que se sospecha que contiene anticuerpos de HCBi en condiciones que permiten que el antígeno se una a cualquiera de tales anticuerpos presentes en el componente. Tales condiciones serán normalmente la temperatura fisiológica, el pH y la fuerza iónica utilizando un exceso de antígeno. La incubación del antígeno con la muestra es seguida por la detección de complejos inmunitarios comprendidos por el antígeno.

El diseño de los inmunoensayos está sujeto a una gran variación, y muchos formatos son conocidos en la técnica. Los protocolos pueden, por ejemplo, usar soportes sólidos o inmunoprecipitación. La mayoría de los ensayos involucran el uso de un anticuerpo o polipéptido marcado; las etiquetas pueden ser, por ejemplo, moléculas enzimáticas, fluorescentes, quimioluminiscentes, radioactivas o colorantes. También son conocidos ensayos que amplifican las señales del complejo inmunitario; ejemplos de los cuales son los ensayos que utilizan biotina y avidina o estreptavidina, e inmunoensayos marcados y mediado por enzimas, como los ensayos ELISA.

El inmunoensayo puede ser en un formato heterogéneo u homogéneo, y de un tipo convencional o competitivo. En un formato heterogéneo, el polipéptido se une normalmente a una matriz sólida o soporte para facilitar la separación de la muestra del polipéptido después de la incubación. Ejemplos de soportes sólidos que se pueden usar son nitrocelulosa (por ejemplo, en forma de membrana o pocillo de microtitulación), cloruro de polivinilo (por ejemplo, en láminas o pocillos de microtitulación), látex de poliestireno (por ejemplo, en perlas o placas de microtitulación), fluoruro de polivinilidina (conocido como Immunolon), papel diazotizado, membranas de nailon, perlas activadas y perlas de proteína A. El soporte sólido que contiene los polipéptidos antigénicos se lava normalmente después de separarlo de la muestra de prueba y antes de la detección de anticuerpos unidos. Tanto los formatos convencionales como los competitivos son conocidos en la técnica.

En un formato heterogéneo, la muestra de prueba se incuba con la combinación de antígenos en solución. Por ejemplo, puede estar en condiciones que precipiten cualquier complejo antígeno-anticuerpo que se forme. Tanto los formatos convencionales como los competitivos para estos ensayos son conocidos en la técnica.

En un formato convencional, la cantidad de anticuerpos de HCBI en los complejos antígeno-anticuerpo se controla directamente. Esto puede lograrse determinando si los anticuerpos anti-xenogénicos (marcados) (por ejemplo, anti­ humanos), que reconocen un epítopo en los anticuerpos anti-HCBI, se unirán debido a la formación del complejo. En un formato competitivo, la cantidad de anticuerpos HCBI en la muestra se deduce al controlar el efecto competitivo en la unión de una cantidad conocida de anticuerpo marcado (u otro ligando competitivo) en el complejo.

Los complejos formados que comprenden anticuerpos anti-HCBI (o en el caso de ensayos competitivos, la cantidad de anticuerpos competidores) se detectan mediante una serie de técnicas conocidas, según el formato. Por ejemplo, los anticuerpos de HCBI no marcados en el complejo pueden detectarse utilizando un conjugado de Ig anti-xenogénica complejada con una etiqueta (por ejemplo, una etiqueta de enzima).

En un formato de ensayo de inmunoprecipitación o aglutinación, la reacción entre los antígenos de HCBI y el anticuerpo forma una red que precipita de la solución o suspensión y forma una capa o película visible de precipitado. Si no hay un anticuerpo anti-HCBI en la muestra de ensayo, no se forma un precipitado visible.

Actualmente existen tres tipos específicos de ensayos de aglutinación de partículas (PA). Estos ensayos se utilizan para la detección de anticuerpos contra diversos antígenos cuando recubren un soporte. Un tipo de este ensayo es el ensayo de hemaglutinación que utiliza glóbulos rojos (RBC) que se sensibilizan al adsorber pasivamente antígeno (o anticuerpo) a los RBC. La adición de antígeno/anticuerpos específicos presentes en el componente del cuerpo, en caso de haberla, hace que se aglutinen los glóbulos rojos recubiertos con el antígeno purificado.

Para eliminar posibles reacciones no específicas en el ensayo de hemaglutinación, se pueden usar dos portadores artificiales en lugar de RBC en el AP. Los más comunes de estos son partículas de látex.

La fase sólida seleccionada puede incluir perlas poliméricas o de vidrio, nitrocelulosa, micropartículas, micropocillos de una bandeja de reacción, tubos de ensayo y perlas magnéticas. El compuesto generador de señal puede incluir una enzima, un compuesto luminiscente, un cromógeno, un elemento radiactivo y un compuesto quimioluminiscente. Ejemplos de enzimas incluyen fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante y beta-galactosidasa. Ejemplos de compuestos potenciadores incluyen biotina, anti-biotina y avidina. Ejemplos de miembros de unión a compuestos potenciadores incluyen biotina, anti-biotina y avidina.

Los procedimientos anteriores son útiles para evaluar el riesgo de desarrollar enfermedades como el cáncer o una enfermedad autoinmunitaria debido a los efectos nocivos de la presencia de una secuencia de polinucleótido de HCBI subgenómica por sí misma o unida a un gen o fragmento de gen hospedador particular dentro de las células del paciente y permite tomar las medidas adecuadas.

Por lo tanto, la presente invención también se refiere a un oligonucleótido antisentido o ARNi específico para el ácido polinucleico del virus de HCBI5.173 de la invención.

La generación de oligonucleótidos o ARNi antisentido adecuados incluye la determinación de un sitio o sitios dentro del ácido polinucleico de HCBI5.173 para que se produzca la interacción antisentido de manera que dé como resultado el efecto deseado, por ejemplo, la inhibición de la expresión del polipéptido. Un sitio intragénico preferido es (a) la región que abarca el codón de iniciación o terminación de la traducción del marco de lectura abierto (ORF) del gen o (b) una región del ARNm que es un "bucle" o "abombamiento", es decir, no forma parte de una estructura secundaria. Una vez que se han identificado uno o más sitios diana, se eligen oligonucleótidos que son suficientemente complementarios a la diana, es decir, que hibridan lo suficientemente bien y con suficiente especificidad, para producir el efecto deseado. En el contexto de la presente invención, "hibridación" significa enlaces de hidrógeno, que pueden ser enlaces de hidrógeno de Watson-Crick, Hoogsteen o Hoogsteen invertidos, entre bases de nucleósidos o nucleótidos complementarias. “Complementario” como se utiliza en el presente documento, se refiere a la capacidad de emparejamiento preciso entre dos nucleótidos. Por ejemplo, si un nucleótido en una cierta posición de un oligonucleótido es capaz de formar enlaces de hidrógeno con un nucleótido en la misma posición de una molécula de ADN o ARN, entonces el oligonucleótido y el ADN o ARN se consideran complementarios entre sí en esa posición. El oligonucleótido y el ADN o ARN son complementarios entre sí cuando un número suficiente de posiciones correspondientes en cada molécula están ocupadas por nucleótidos que pueden unirse por enlaces de hidrógeno entre sí. Por lo tanto, "específicamente hibridable" y "complementario" son expresiones que se usan para indicar un grado suficiente de complementariedad o un emparejamiento preciso de modo que se produzca una unión estable y específica entre el oligonucleótido y la diana de ADN o ARN. Se entiende en la técnica que la secuencia de un compuesto antisentido no necesita ser 100 % complementaria a la de su ácido nucleico diana para ser específicamente hibridable. Un compuesto antisentido se puede hibridar específicamente cuando la unión del compuesto a la molécula de ADN o ARN diana interfiere con la función normal del ADN o ARN diana para causar una pérdida de utilidad, y existe un grado suficiente de complementariedad para evitar la unión no específica del compuesto antisentido a secuencias no diana en condiciones en las que se desea una unión específica, es decir, en el caso de tratamiento terapéutico.

"Oligonucleótido" (en particular en el contexto de compuestos antisentido) se refiere a un oligómero o polímero de ácido ribonucleico (ARN) o ácido desoxirribonucleico (ADN) o miméticos de los mismos. Este término incluye oligonucleótidos compuestos de nucleobases naturales, azúcares y enlaces internucleosídicos covalentes (cadena principal), así como oligonucleótidos que tienen porciones no naturales que funcionan de manera similar. Dichos oligonucleótidos modificados o sustituidos son a menudo preferidos sobre formas naturales debido a propiedades deseables tales como, por ejemplo, captación celular mejorada, afinidad aumentada por la diana de ácido nucleico y estabilidad aumentada en presencia de nucleasas. Aunque los oligonucleótidos antisentido son una forma preferida del compuesto antisentido, la presente invención comprende otros compuestos antisentido oligoméricos, que incluyen, pero sin limitación, miméticos oligonucleotídicos, como se describen a continuación. Los compuestos antisentido de acuerdo con la presente invención comprenden de aproximadamente 8 a aproximadamente 50 nucleobases (es decir, de aproximadamente 8 a aproximadamente 50 nucleósidos unidos). Los compuestos antisentido particularmente preferidos son oligonucleótidos antisentido, incluso más preferentemente aquellos que comprenden de aproximadamente 15 a aproximadamente 25 nucleobases.

Los compuestos antisentido incluyen ribozimas, secuencias de guía externa (EGS), oligonucleótidos (oligozimas) y otros ARN catalíticos cortos u oligonucleótidos catalíticos que hibridan con el ácido nucleico diana e inhiben su expresión. Los compuestos antisentido también incluyen un ARNi que comprende una secuencia codificante y una secuencia no codificante, en el que las secuencias codificante y no codificante forman un dúplex de ARN y en el que la secuencia no codificante comprende una secuencia de nucleótidos suficientemente complementaria a la secuencia de nucleótidos de un ácido polinucleico de HCBI5.173 de la presente invención.

Como alternativa, la invención proporciona un vector que permite transcribir un oligonucleótido antisentido de la invención, por ejemplo, en un hospedador mamífero. Preferentemente, dicho vector es un vector útil para terapia génica. Los vectores preferidos útiles para terapia génica son vectores virales, p. ej. adenovirus, virus adenoasociados, virus del herpes simple, vaccinia o, más preferentemente, un virus de ARN tal como un retrovirus. Incluso más preferentemente, el vector retroviral es un derivado de un retrovirus murino o aviar. Ejemplos de tales vectores retrovirales que pueden usarse en la presente invención son: Virus de la leucemia murina de Moloney (MoMuLV), Virus del sarcoma murino de Harvey (HaMuSV), virus de tumor mamario murino (MuMTV) y virus del sarcoma de Rous (RSV). Más preferentemente, se emplea un vector retroviral de primates no humanos, como el virus de la leucemia del mono gibón (GaLV), que proporciona un rango de hospedador más amplio en comparación con los vectores murinos. Debido a que los retrovirus recombinantes son defectuosos, se requiere asistencia para producir partículas infecciosas. Dicha asistencia se puede proporcionar, por ejemplo, mediante el uso de líneas celulares auxiliares que contienen plásmidos que codifican todos los genes estructurales del retrovirus con el control de secuencias reguladoras dentro de la LTR. Las líneas celulares auxiliares adecuadas son bien conocidas por los expertos en la técnica. Dichos vectores pueden contener adicionalmente un gen que codifica un marcador seleccionable para que las células transducidas se puedan identificar. Además, los vectores retrovirales pueden modificarse de tal manera que se vuelvan específicos de diana. Esto se puede lograr, por ejemplo, insertando un polinucleótido que codifica un azúcar, un glucolípido o una proteína, preferentemente un anticuerpo. Los expertos en la materia conocen procedimientos adicionales para generar vectores específicos de diana. Otros vectores y procedimientos adecuados para la terapia génica in vitro o in vivo se describen en la referencia y son conocidos por los expertos en la materia; véase, por ejemplo, el documento WO 94/29469 o el documento WO 97/00957. Las secuencias de polinucleótidos de HCBI de la invención también pueden servir como un vector adecuado en sí mismo, ya sea compuesto únicamente de secuencias de HCBI reorganizadas o de secuencias de ADN de células hospedadoras de HCBI quiméricas. Además, las secuencias de nucleótidos de la invención se pueden usar para la construcción de cromosomas artificiales.

Para lograr la expresión solo en el órgano diana, las secuencias de ADN para la transcripción de los oligonucleótidos antisentido se pueden vincular a un promotor específico de tejido y se pueden usar para terapia génica. Tales promotores son bien conocidos por los expertos en la materia.

Dentro de una estructura de oligonucleótido, los grupos fosfato tienen comúnmente relación con la formación de la cadena principal de internucleósidos del oligonucleótido. El enlace o cadena principal normal de ARN y ADN es un enlace fosfodiéster de 3 'a 5'. Los ejemplos específicos de compuestos antisentido preferidos útiles en la presente invención incluyen oligonucleótidos que contienen cadenas principales modificadas o enlaces internucleosídicos no naturales. Los oligonucleótidos que tienen cadenas principales modificadas incluyen aquellos que retienen un átomo de fósforo en la cadena principal y aquellos que no tienen un átomo de fósforo en la cadena principal. Las cadenas principales de oligonucleótidos modificados que pueden dar como resultado una mayor estabilidad, son conocidos por los expertos en la materia, preferentemente dicha modificación es un enlace fosforotioato.

Un mimético oligonucleotídico preferido es un mimético oligonucleotídico que se ha demostrado que tiene excelentes propiedades de hibridación, y se denomina ácido nucleico peptídico (PNA). En compuestos de PNA, la cadena principal de azúcar de un oligonucleótido se reemplaza con una cadena principal que contiene amida, en particular una cadena principal de aminoetilglicina. Las nucleobases se retienen y se unen directa o indirectamente a átomos de nitrógeno aza de la porción amida de la cadena principal.

Los oligonucleótidos modificados también pueden contener uno o más restos de azúcar sustituidos o modificados. Los oligonucleótidos preferidos comprenden uno de los siguientes en la posición 2': OH; F; 0-, S-, o N-alquilo; 0-, S-, o N-alquenilo; 0-, S- o N-alquinilo; o 0-alquilo-O-alquilo, en el que el alquilo, alquenilo y alquinilo pueden ser alquilo C1 a C10 o alquenilo y alquinilo C2 a C10 sustituido o no sustituido. Un resto de azúcar modificado particularmente preferido es un resto de azúcar 2'-O-metoxietilo.

Los oligonucleótidos antisentido de la invención también pueden incluir modificaciones o sustituciones de nucleobases. Las nucleobases modificadas incluyen otras nucleobases sintéticas y naturales como la 5-metilcitosina (5-me-C), 5hidroximetil citosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metil y otros derivados alquilo de adenina y guanina, 2-propil y otros derivados alquilo de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina etc., prefiriéndose las sustituciones de 5-metilcitosina, ya que se ha demostrado que estas modificaciones aumentan la estabilidad de ácido nucleico de doble hélice.

Otra modificación de los oligonucleótidos de la invención implica unir químicamente al oligonucleótido uno o más restos o conjugados que mejoran la actividad, la distribución celular o la captación celular del oligonucleótido. Tales restos incluyen restos lipídicos tales como un resto de colesterol, ácido cólico, un tioéter, un tiocolesterol, una cadena alifática, por ejemplo, dodecandiol o restos undecilo, un fosfolípido, una poliamina o una cadena de polietilenglicol, o ácido acético de adamantano, un radical de palmitilo, o un radical de octadecilamina o un radical de hexilamino-carboniloxicolesterol.

La presente invención también incluye compuestos antisentido que son compuestos quiméricos. Los compuestos antisentido "quiméricos" o "quimeras", en el contexto de la presente invención, son compuestos antisentido, particularmente oligonucleótidos, que contienen dos o más regiones químicamente distintas, cada una compuesta de al menos una unidad monomérica, es decir, un nucleótido en el caso de un compuesto de oligonucleótidos. Estos oligonucleótidos contienen normalmente al menos una región en la que el oligonucleótido se modifica para conferir al oligonucleótido una mayor resistencia a la degradación de las nucleasas, una mayor captación celular y/o una mayor afinidad de unión por el ácido nucleico diana. Una región adicional del oligonucleótido puede servir como un sustrato para enzimas capaces de escindir los híbridos de ARN:ADN o ARN:ARN. A modo de ejemplo, la RNasa H es una endonucleasa celular que escinde la cadena de ARN de un dúplex de ARN:ADN. La activación de la RNasa H, por lo tanto, da como resultado la escisión de la diana del ARN, lo que mejora enormemente la eficacia de la inhibición de la expresión génica de oligonucleótidos. En consecuencia, a menudo se pueden obtener resultados comparables con oligonucleótidos más cortos cuando se usan oligonucleótidos quiméricos, en comparación con desoxioligonucleótidos fosforotioato que hibridan con la misma región diana. Los compuestos antisentido quiméricos de la invención pueden formarse como estructuras compuestas de dos o más oligonucleótidos, oligonucleótidos modificados, oligonucleósidos y/o miméticos de oligonucleótidos como se describe anteriormente. Tales compuestos también se han denominado en la técnica híbridos u oligómeros con huecos.

La presente invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo u oligonucleótido antisentido de la invención y un excipiente, diluyente o vehículo adecuado. Preferentemente, en una composición farmacéutica, el compuesto tal como se describe anteriormente se combina con un vehículo farmacéuticamente aceptable. “Farmacéuticamente aceptable” pretende abarcar cualquier vehículo, que no interfiere con la eficacia de la actividad biológica del principio activo y que no es tóxico para el hospedador al que se administra. Ejemplos de vehículos farmacéuticos adecuados son bien conocidos en la técnica e incluyen soluciones salinas tamponadas con fosfato, agua, emulsiones, tales como emulsiones de aceite/agua, varios tipos de agentes humectantes, soluciones estériles etc. Dichos vehículos pueden formularse por procedimientos convencionales y el principio activo puede administrarse al sujeto en una dosis eficaz.

Una "dosis eficaz" se refiere a una cantidad del principio activo que es suficiente para prevenir la enfermedad o para afectar el curso y la gravedad de la enfermedad, lo que lleva a la reducción o remisión de dicha patología. Una "dosis eficaz" útil para tratar y/o prevenir estas enfermedades o trastornos puede determinarse usando procedimientos conocidos por los expertos en la materia.

La administración de las composiciones adecuadas puede efectuarse de diferentes maneras, p.ej. por administración intravenosa, intraperitoneal, oral, subcutánea, intramuscular, tópica o intradérmica. La vía de administración, por supuesto, depende del tipo de terapia y del tipo de compuesto contenido en la composición farmacéutica. El régimen de dosificación será determinado por el médico a cargo y otros factores clínicos. Como es bien sabido en las técnicas médicas, las dosis para cualquier paciente dependen de muchos factores, incluido la talla del paciente, área superficial del cuerpo, la edad, el sexo, el compuesto particular a administrar, hora y vía de administración, el tipo de terapia, la salud general y otros fármacos que se administran simultáneamente.

En una realización preferida de la presente invención, la enfermedad que se puede prevenir/tratar es cáncer, preferentemente cáncer colorrectal, de mama, de próstata y pancreático, o una enfermedad del SNC, preferentemente enfermedad de Alzheimer o esclerosis múltiple (EM). Los términos "cáncer" y "enfermedad del SNC" también comprenden las etapas iniciales de dichas enfermedades.

Debido a una recopilación de datos epidemiológicos globales publicados por el inventor (zur Hausen, 2012), se acumularon pruebas de supuestos factores infecciosos, que desempeñan un papel en el cáncer, en particular en el colon, y posiblemente también en otros cánceres humanos, transmitidos desde el ganado vacuno a los humanos ya sea por consumo de carne o de productos lácteos. Por estas razones, los inventores iniciaron el análisis de 130 sueros de vacas sanas para detectar la presencia de agentes infecciosos aún desconocidos. Después de aislar en una serie inicial los cinco nuevos ADN mostrados en la Fig. 1-5, los inventores comenzaron a buscar la presencia de su ADN en células derivadas de cáncer, en particular de cáncer de colon. Simultáneamente se analizaron materiales de pacientes con esclerosis múltiple. Debido a que la esclerosis múltiple representa una enfermedad humana importante con consecuencias a menudo desastrosas para los pacientes afectados, se ha evaluado el papel de los aislados de acuerdo con la presente invención en los trastornos neurológicos, específicamente de forma intensiva en la MS. Los resultados muestran que las secuencias solo se encuentran en pacientes enfermos, pero, hasta ahora, no se han encontrado en sujetos sanos. Esto se aplica tanto a los pacientes con cáncer como a aquellos que padecen enfermedades del SNC.

La presente invención también se refiere a una vacuna para inmunizar a un mamífero contra una infección por HCBI, que comprende al menos un polipéptido o ácido polinucleico de HCBI como se define anteriormente, en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Una "vacuna" es una composición inmunogénica capaz de provocar protección contra HCBI, ya sea parcial o completa. Una vacuna también puede ser útil para el tratamiento de un individuo, en cuyo caso se llama vacuna terapéutica.

El término "terapéutico" se refiere a una composición capaz de tratar una infección por HCBI o enfermedades relacionadas con esta infección. La expresión "cantidad eficaz" se refiere a una cantidad de polipéptido portador de epítopo suficiente para inducir una respuesta inmunogénica en el individuo al que se administra, o para inmunorreaccionar de otra manera detectable en su sistema deseado (por ejemplo, inmunoensayo). Preferentemente, la cantidad efectiva es suficiente para efectuar el tratamiento, como se define anteriormente. La cantidad exacta necesaria variará según la aplicación. Para aplicaciones de vacunas o para la generación de antisuero/anticuerpos policlonales, por ejemplo, la cantidad eficaz puede variar dependiendo de la especie, la edad y el estado general del individuo, la gravedad de la afección que se está tratando, el polipéptido particular seleccionado y su modo de administración, etc. Las cantidades eficaces se encontrarán dentro de un rango relativamente grande, no crítico. Una cantidad eficaz apropiada se puede determinar fácilmente usando solo la experimentación de rutina. Los rangos preferidos de proteínas para la profilaxis de enfermedades causadas por HCBI son de 0,01 a 100 pg/dosis, preferentemente de 0,1 a 50 pg/dosis. Se pueden necesitar varias dosis por individuo para lograr una respuesta inmunitaria suficiente y una protección posterior contra una infección por HCBI y una enfermedad relacionada con HCBI, respectivamente.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen cualquier vehículo que no induzca la producción de anticuerpos dañinos para el individuo que recibe la vacuna. Los vehículos adecuados suelen ser macromoléculas grandes y de metabolismo lento, tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos y copolímeros de aminoácidos. Tales vehículos son bien conocidos por los expertos en la materia.

Los adyuvantes preferidos para mejorar la eficacia de la composición incluyen, pero sin limitación: hidróxido de aluminio (alumbre), N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP) como se encuentra en la Patente de EE. UU. N. ° 4.606.918, N -acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil sn-glicero-3- hidroxifosforiloxi) etilamina (MTP-PE) y RIBI, que contiene tres componentes extraídos de bacterias, monofosforil lípido A, dimicolato de trehalosa y esqueleto de la pared celular (MPL TDM CWS) en una emulsión al 2 % de escualeno/Tween 80. Cualquiera de los 3 componentes MPL, TDM o CWS también se puede usar solo o combinados 2 a 2. Además, se pueden usar adyuvantes como Stimulon (Cambridge Bioscience, Worcester, MA) o SAF-1 (Syntex). Además, se pueden utilizar el adyuvante completo de Freund (CFA) y el adyuvante incompleto de Freund (IFA) para aplicaciones y fines de investigación no humanas.

Las composiciones inmunogénicas normalmente contendrán vehículos farmacéuticamente aceptables, tales como agua, solución salina, glicerol, etanol, etc. Además, pueden incluirse en tales vehículos sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias tamponadoras de pH, conservantes y similares.

Habitualmente, las composiciones inmunogénicas se preparan como inyectables, ya sea como soluciones líquidas o suspensiones. También se pueden preparar formas sólidas adecuadas para solución o suspensión en vehículos líquidos antes de la inyección. La preparación también se puede emulsionar o encapsular en liposomas para mejorar el efecto adyuvante. Las proteínas también pueden incorporarse en Complejos Estimulantes Inmunitarios junto con saponinas, por ejemplo, Quil A (ISCOMS).

Las composiciones inmunogénicas usadas como vacunas comprenden una "cantidad suficiente" o "una cantidad inmunológicamente eficaz" de las proteínas de la presente invención, así como cualquier otro de los componentes mencionados anteriormente, según sea necesario. "Cantidad inmunológicamente eficaz" significa que la administración de esa cantidad a un individuo, ya sea en una dosis única o como parte de una serie, es eficaz para el tratamiento, como se define anteriormente. Esta cantidad varía según la salud y la condición física del individuo que se va a tratar, la capacidad del sistema inmunitario del individuo para sintetizar los anticuerpos, el grado de protección deseado, la formulación de la vacuna, la evaluación de la situación médica por parte del médico tratante y otros factores relevantes. Se espera que la cantidad esté dentro de un rango relativamente amplio que pueda determinarse a través de pruebas de rutina. Normalmente, la cantidad variará de 0,01 a 1000 pg/dosis, más particularmente de O, 1 -100 pg/dosis.

Ejemplo 1

Material y Procedimientos

(A) Fraccionamiento de sueros bovinos en gradientes de densidad-sedimentación con clonación posterior

Los sueros bovinos se separaron en gradientes de etapas Optiprep (iodixanol) como se describe anteriormente (Buck y col., 2004). Se recogieron las fracciones y se extrajo el ADN. Se realizó una amplificación por círculo rodante (de Villiers y col., 2011) en cada fracción antes de la digestión con las enzimas de restricción BamH1 y EcoR1. Los fragmentos resultantes se clonaron en pUC18 o pUC19 antes de la secuenciación.

(B) Replicación in vitro (de Villiers y col., 2011) de HCBI1.225 (Ejemplo comparativo)

Se transfectó HCBI1.225 de longitud completa lineal en células 293TT (Lipofectamina). Los cultivos se pasaron cada 2-3 días. El ADN y el ARN se extrajeron de una fracción de las células al pasar. El ADN de entrada se eliminó mediante digestión con Dpn1. El ADN y el ARN de HCBI1.225 se expresaron hasta el día 17 en cultivo celular.

Ejemplo 2

Caracterización de las secuencias de HCBI

Se analizaron 120 sueros de vacas sanas obtenidas del "Veterinarinstitut der Universitat Leipzig" (Profesor Muller) y después de la purificación de partículas virales, se aislaron la extracción de ADN y la amplificación del "círculo rodante" (de Villiers y col., 2011) que posiblemente interactúan con moléculas circulares de ADN viral que difieren en tamaño. Las cinco secuencias de ADN y los marcos de lectura abiertos de estos componentes mostraron una relación reconocible con las secuencias que ya se describieron para las encefalopatías espongiformes transmisibles (TSE) para enfermedades de TSE en ganado ovino, ganado vacuno y seres humanos (Manuelidis, 2011). Estos agentes no se caracterizaron más y se designaron "Sphinx virus". Dado que las secuencias de ADN (y los marcos de lectura abiertos) obtenidos en la presente invención de vacas sanas muestran homologías con las secuencias correspondientes descritas por Manuelidis, pero no son idénticas, se propone la designación HCBI (Healthy Cattle Blood jsolate).

En este contexto, las enfermedades del SNC (por ejemplo, la esclerosis múltiple, la enfermedad de Alzheimer) también son muy interesantes ya que las secuencias similares descritas por Manuelidis se encuentran principalmente en el SNC.

Las secuencias "Sphinx" (Manuelidis, 2011) muestran altas homologías con las secuencias plasmídicas de la bacteria Acinetobacter (Vallenet y col., 2008; Longkummer y col., 2013). Las secuencias obtenidas en la presente invención también muestran homologías sorprendentes con las secuencias de los plásmidos correspondientes. Por lo tanto, a primera vista, es tentador especular que los resultados se deben a la contaminación de las muestras con los virus Acinetobacter. Aunque entretanto se ha secuenciado una plétora de plásmidos de Acinetobacter, ninguna de estas secuencias corresponde a las secuencias de ADN de la presente invención que se obtuvieron de tres lotes diferentes de sueros. Debido a que inicialmente el aislamiento de estos ADN se logró mediante la purificación de los virus a través de la centrifugación en gradiente de densidad, la presencia aparentemente común de estos virus en la sangre de sueros de vaca no es necesariamente atribuible a la contaminación viral derivada de bacterias. Además, la presencia de secuencias de ADN de estos virus en células cancerosas humanas es incompatible con dicha interpretación.

De forma interesante, un grupo de científicos en el Reino Unido publicó datos serológicos durante un período de años que apuntan a una mayor formación selectiva de anticuerpos contra las proteínas Acinetobacter, pero no contra otros antígenos bacterianos obtenidos de pacientes que padecen esclerosis múltiple (véase artículo de revisión: Ebringer y col., 2012). Estos resultados no pudieron ser confirmados por el grupo de Chapman (Chapman y col., 2005). Sin embargo, hay que subrayar que el grupo de Chapman utilizó una cepa diferente de Acinetobacter (Acinetobacter calcoaceticus). Los resultados inequívocos se obtuvieron por el grupo de Ebringer para tres cepas de Acinetobacter (Acinetobacter Iwoffii, A. radioesistens y un aislado específico, A. 11171). Sin embargo, Los resultados obtenidos para A. junii 17908 fueron menos impresionantes y la reactividad significativa fue difícilmente detectable (Hughes y col., 2001). Estos resultados sugieren que estamos tratando con reactividades específicas de la cepa en las que esta reactividad serológica se debe a plásmidos específicos de la cepa que muestran homologías con las secuencias de ADN obtenidas en la presente invención.

Referencias

Buck CB, Pastrana DV, Lowy DR, Schiller JT. Efficient intracellular assembly of papillomaviral vectors. J. Virol.

2004; 78:751-757.

Chapman MD, Hughes LE, Wilson CD, Namnyak S, Thompson EJ, Giovannoni G. No evidence for production of intrathecal immunoglobulin G against Acinetobacter or Pseudomonas in multiple sclerosis. Eur Neurol. 2005; 53(1):27-31.

de Villiers EM, Borkosky SS, Kimmel R, Gunst K y Fei JW. (2011) The diversity of Torque teno viruses: In vitro replication leads to the formation of additional replication-competent subviral Molecules. J Virol 2011; 85(14):7284-7295

Ebringer A, Hughes LE, Rashid T, Wilson C. Acinetobacter Immune Responses in Multiple Sclerosis:

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Un ácido polinucleico de HCBI que comprende:

(a) una secuencia de nucleótidos representada en la Figura 5 (SEQ ID. NO: 72);

(b) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un 90 % de identidad con una secuencia de nucleótidos de (a);

(c) una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una secuencia de nucleótidos de (a) o (b); o (d) una secuencia de nucleótidos que es redundante como resultado de la degeneración del código genético en comparación con cualquiera de las secuencias de nucleótidos dadas anteriormente.

2. Un cebador de oligonucleótido que comprende parte de un ácido polinucleico de HCBI de la reivindicación 1, siendo dicho cebador capaz de actuar como cebador para secuenciar específicamente o amplificar específicamente el ácido nucleico de un determinado aislado de HCBI que contiene una secuencia de nucleótidos de la reivindicación 1.

3. Una sonda de oligonucleótido que comprende parte de un ácido polinucleico de HCBI de la reivindicación 1, siendo dicha sonda capaz de actuar como una sonda de hibridación para la detección específica del ácido nucleico de un determinado aislado de HCBI que contiene una secuencia de nucleótidos de la reivindicación 1.

4. Un vector de expresión que comprende un ácido polinucleico de HCBI de la reivindicación 1 unido operativamente a elementos de control de transcripción y traducción procariotas, eucariotas o virales.

5. Una célula hospedadora transformada con un vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 4.

6. Un polipéptido que está codificado por un ácido polinucleico de HCBI de la reivindicación 1.

7. Un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a un polipéptido de la reivindicación 6.

8. Un procedimiento para la detección de un ácido polinucleico de HCBI de acuerdo con la reivindicación 1 en una muestra biológica, que comprende: (a) extraer, opcionalmente, el ácido polinucleico de la muestra, (b) amplificar el ácido polinucleico como se describe anteriormente con al menos un cebador de acuerdo con la reivindicación 2, opcionalmente un cebador marcado, y (c) detectar el ácido polinucleico amplificado.

9. Un procedimiento para la detección de un ácido polinucleico de HCBI de acuerdo con la reivindicación 1 en una muestra biológica, que comprende: (a) extraer, opcionalmente, el ácido polinucleico de la muestra, (b) hibridar el ácido polinucleico como se describe anteriormente con al menos una sonda de acuerdo con la reivindicación 3, opcionalmente una sonda marcada, y (c) detectar el ácido polinucleico hibridado.

10. Un procedimiento para detectar un polipéptido de la reivindicación 6 o un anticuerpo de la reivindicación 7 presente en una muestra biológica, que comprende: (a) poner en contacto la muestra biológica para detectar la presencia de dicho polipéptido o anticuerpo como se define anteriormente, y (b) detectar el complejo inmunológico formado entre dicho anticuerpo y dicho polipéptido.

11. Un oligonucleótido antisentido que reduce o inhibe la expresión de un ácido polinucleico de HCBI de la reivindicación 1 o un vector que contiene dicho oligonucleótido antisentido.