ES2869181T3 - Métodos y preparaciones de beta-glucano opsonizado - Google Patents

Abstract

Una composición que comprende: β-glucano soluble de PGG opsonizado aislado que comprende una opsonina acoplada covalentemente al β-glucano; en donde el β-glucano se obtiene a partir de levadura.

Description

DESCRIPCIÓN

Métodos y preparaciones de p-glucano opsonizado

REFERENCIA CRUZADA A LA SOLICITUD RELACIONADA

La presente solicitud reivindica la prioridad del documento de solicitud de patente provisional de Estados Unidos N.° 61/493.101, presentado el 3 de junio de 2011.

ANTECEDENTES

Los p-glucanos son polímeros de glucosa obtenidos a partir de una diversidad de fuentes microbiológicas y vegetales que incluyen, por ejemplo, levaduras, bacterias, algas, algas marinas, hongos, avena y cebada. De estos, los p-glucanos de levadura se han evaluado ampliamente por sus propiedades inmunomoduladoras. Los p-glucanos de levadura están representados en diversas formas tales como levadura intacta, cimosano, partículas de glucano entero purificado, polisacárido cimosano solubilizado o p-glucanos solubles altamente purificados de diferentes pesos moleculares (1-11). Estructuralmente, los p-glucanos de levadura están formados por monómeros de glucosa organizados como una estructura de glucopiranosa unida en p-(1,3) con ramificaciones periódicas de p-(1,3) glucopiranosa unidas a la estructura mediante enlaces glicosídicos p-(1,6). Las diferentes formas de los p-glucanos de levadura pueden funcionar de manera diferente entre sí. El mecanismo a través del cual los p-glucanos de levadura ejercen sus efectos inmunomoduladores puede verse influido por las diferencias estructurales entre las diferentes formas de los p-glucanos tales como, por ejemplo, su naturaleza particulada o soluble, conformación terciaria, longitud de la cadena principal, longitud de la cadena lateral y frecuencia de las cadenas laterales. Las funciones inmunoestimuladoras de los p-glucanos de levadura también dependen de los receptores implicados en diferentes tipos celulares en diferentes especies, lo que nuevamente depende de las propiedades estructurales de los p-glucanos.

Las proteínas del complemento en el suero, específicamente C3 y C1q, son receptores de reconocimiento de patrones (PRR) en suero que reconocen los patógenos y posteriormente se activan mediante las rutas clásica, alternativa o de lectina (Brown GD 2006). Las tres comparten la etapa inicial de activación y degradación de C3 en proteínas C3a y C3b, y la etapa final de formación del complejo de ataque a la membrana (MAC) citolítica que consiste en las proteínas del complemento C5b, C6, C7, C8 y C9 (C5b-9). Después de la degradación inicial de C3, C3b se asocia covalentemente a los carbohidratos o proteínas presentes en la superficie de los patógenos. Este proceso inicial de unión de C3b a los patógenos va seguido por una degradación adicional de C3b unida en fragmentos iC3b, C3c y C3dg que por último conduce a la opsonización completa del patógeno (revisado en Walport 2001). La opsonización del complemento de los patógenos puede conducir a la destrucción directa del patógeno mediante la formación del MAC o puede conducir al reconocimiento indirecto y destrucción del patógeno por los receptores opsónicos, tales como los receptores del complemento en los leucocitos. El cimosano, un p-glucano particulado en estado natural obtenido a partir de las paredes celulares de Saccharomyces cerevisiae, se conoce bien desde hace años como el estimulador de la ruta alternativa independiente de anticuerpos de la activación del complemento (Czop JK 1985, Fearon DT 1977, Pillemer 1954, Pillemer 1956).

El documento US2004/014715 desvela p-glucano de PGG como inmunomodulador para prevenir o tratar infecciones por organismos patógenos.

SUMARIO

La invención se define por las reivindicaciones. Cualquier materia objeto que quede fuera del alcance de las reivindicaciones se proporciona únicamente con fines informativos. En la descripción, cualquier referencia a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método de tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia.

En un aspecto, la invención proporciona una composición que generalmente incluye p-glucano soluble opsonizado aislado. El p-glucano soluble se obtiene a partir de levadura, tal como por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae. En algunas realizaciones, el p-glucano soluble puede incluir p(1,6)-[poli-1,3)-D-glucopiranosil]-poli-b(1,3)-D-glucopiranosa. El p-glucano soluble opsonizado incluye una opsonina acoplada al p-glucano. En algunas realizaciones, la opsonina puede incluir C3, C3a, C3b, iC3b, C3bB, C3bBb, C3d, C3dg, C4, C5, C5a, C5b, C6, C7, C8, C9, o cualquier combinación de dos o más de las mismas.

En algunas realizaciones, la composición puede incluir además un agente activo acoplado al p-glucano soluble opsonizado.

En algunas realizaciones, la composición puede incluir además suero.

En otro aspecto, la invención proporciona un método que generalmente incluye poner en contacto p-glucano soluble con una composición en condiciones eficaces para que al menos un componente de la composición opsonice el p glucano soluble, formando de ese modo una mezcla de opsonización, en donde la composición comprende suficientes componentes del sistema del complemento para opsonizar el p-glucano soluble. En algunas realizaciones, la composición con la que se pone en contacto el p-glucano soluble puede incluir suero. En algunas realizaciones, las condiciones pueden incluir incubar la composición y el p-glucano soluble juntos a una temperatura de aproximadamente 25 °C a aproximadamente 45 °C. En algunas realizaciones, las condiciones pueden incluir incubar la composición y el p-glucano soluble, juntos, durante al menos 15 minutos. En algunas realizaciones, las condiciones pueden incluir proporcionar no más de 1,25 pg de p-glucano por 1 pl de composición tal como, por ejemplo, proporcionando al menos un exceso de volumen de 10 veces de la composición en comparación con el volumen de p-glucano. En algunas realizaciones, el método puede incluir además aislar al menos una parte del pglucano soluble opsonizado de la mezcla de opsonización.

En otro aspecto, la invención proporciona un p-glucano soluble opsonizado para su uso en un método que generalmente incluye la administración de p-glucano soluble opsonizado a un individuo en una cantidad eficaz para aumentar al menos uno de los siguientes en comparación con el p-glucano no opsonizado: unión del p-glucano soluble opsonizado a linfocitos B, monocitos o neutrófilos; migración de neutrófilos hacia el p-glucano soluble opsonizado; y la función inmunomoduladora del individuo. En algunas realizaciones, el p-glucano soluble opsonizado puede incluir un agente activo acoplado al p-glucano soluble opsonizado. El p-glucano soluble se obtiene a partir de levadura, tal como por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae. En algunas realizaciones, el p-glucano soluble puede incluir p(1,6)-[poli-1,3)-D-glucopiranosil]-poli-b(1,3)-D-glucopiranosa.

La descripción que sigue a continuación ejemplifica más particularmente realizaciones ilustrativas. En varios lugares de la solicitud, se proporciona orientación a través de listados de ejemplos, ejemplos que se pueden usar en diversas combinaciones.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Unión dependiente de la concentración de p-glucano de PGG a neutrófilos y monocitos humanos

La unión de p-glucano de PGG a diversas concentraciones a neutrófilos, monocitos y linfocitos T humanos aislados identificados dentro de la población de PBMC se midió como se describe en Material y métodos. A) pglucano de PGG unido después de la incubación con las células (1 x 106 células/ml) en medio completo (RPMI suero autólogo al 10 %) a concentraciones de 100 pg/ml, 200 pg/ml, o 400 pg/ml a 37 °C durante dos horas se detectó mediante tinción con anticuerpo monoclonal de ratón específico de p-glucano BfD IV como anticuerpo primario e IgM de cabra anti-ratón marcada con FITC como anticuerpo secundario. La intensidad media de fluorescencia (MFI) y el porcentaje de neutrófilos, monocitos y linfocitos T positivos para BfD IV tratados con p-glucano en comparación con los del grupo tratado con vehículo se indican en los gráficos que combinan representaciones de contorno y densidad (cebra). B) Tinción de DTAF dependiente de la concentración observada en neutrófilos incubados durante una hora a 37 °C con 25 pg/ml (línea punteada), 100 pg/ml (línea discontinua), o 400 pg/ml (línea sólida) de p-glucano marcado con DTAF en comparación con la del grupo de control tratado con vehículo (relleno de color gris). C) Los neutrófilos en medio completo se incubaron con 10 mg/ml de p-glucano de PGG o dextrano sin marcar durante 30 minutos a 37 °C antes de la incubación con 25 pg/ml de p-glucano marcado con DTAF durante 30 minutos a 37 °C. El histograma muestra la tinción con DTAF de neutrófilos tratados con p-glucano marcado con DTAF en presencia (línea punteada) o ausencia (línea sólida) de un exceso de p-glucano o dextrano sin marcar en comparación con la de los neutrófilos tratados con vehículo (relleno de color gris). Los datos que se muestran aquí son representativos de al menos tres experimentos realizados con células obtenidas de tres donantes diferentes.

Figura 2. Papel del receptor CR3 en la unión de p-glucano de PGG a neutrófilos y monocitos humanos La unión de 200 pg/ml de p-glucano de PGG a neutrófilos humanos aislados y 100 pg/ml a monocitos dentro de PBMC se midió con o sin anticuerpos bloqueadores de los receptores CR3 o dectina-1 como se describe en Material y métodos. A) La unión se midió después de bloquear solo la cadena CD11b del receptor CR3 (LM2/1: 10 pg/106 células) y VIM12: 10 pg/106 células), o cadena CD11a de una integrina irrelevante, receptor LFA-1 (HI11: 10 pg/106 células), o las cadenas tanto CD11b como CD18 de CR3 (LM2/1 y VIM12 e IB4: 10 pg de cada una/106 células), o receptor dectina-1 (GE2: 10 pg/106 células). Las células se preincubaron durante 30 minutos en hielo con los diferentes anticuerpos de bloqueo o con la misma concentración de controles de isotipo relevantes antes de añadir p-glucano. La MFI y el porcentaje de células positivas para BfD IV tratadas con pglucano en presencia de control de isotipo o anticuerpos de bloqueo se indican en los gráficos que combinan representaciones de contorno y densidad (cebra). El histograma muestra la unión de p-glucanos en presencia de controles de isotipo (línea sólida) y anticuerpos de bloqueo (línea punteada) y se compara con el control del vehículo (relleno de color gris). La inhibición de la unión fue muy eficaz cuando se bloqueó CR3 usando la combinación de anticuerpos frente a ambas cadenas CD11b y CD18. Los datos mostrados son representativos de tres experimentos independientes realizados en tres donantes diferentes. La representación gráfica de la media de MFI ± SEM del grupo de control tratado con vehículo, grupo tratado con p-glucano en presencia de anticuerpos de bloqueo de c R3 o anticuerpos de control de isotipo de cinco donantes muestra que la unión en presencia de anticuerpos anti-CR3 fue significativamente menor que en presencia de anticuerpos de control de isotipo. La MFI promedio y el porcentaje de inhibición calculados mediante la fórmula descrita en Material y métodos (entre paréntesis) se indican en el gráfico. **, p < 0,05 en comparación con el grupo tratado con pglucano en presencia de controles de isotipo.

Figura 3. Tiempo, temperatura y unión dependiente del suero de p-glucano de PGG a neutrófilos y monocitos humanos

Las condiciones óptimas para la unión de 200 pg/ml y 100 pg/ml de p-glucano de PGG a neutrófilos y monocitos dentro de PBMC (1 x 106 células/ml) se investigaron como se describe en Material y métodos. A) La influencia del suero se estudió midiendo la unión de p-glucano a neutrófilos y monocitos dentro de PBMC en medios que contenían suero autólogo al 2 %, 5 %, o al 10 %. B) En el estudio de la evolución temporal, la unión se midió después de incubar el p-glucano con neutrófilos y PBMC en medio completo a 37 °C durante 10 minutos, 30 minutos, 60 minutos, o 120 minutos. Para el estudio de temperatura, la unión se midió después de que incubar las células con el p-glucano durante 2 horas a 4 °C, temperatura ambiente o 37 °C. Los gráficos que combinan representaciones de contorno y densidad (cebra) que muestran las MFI y el porcentaje de células positivas para BfD IV, y los histogramas que muestran la intensidad de fluorescencia de las células tratadas con p-glucano (línea sólida) en comparación con la del grupo de control tratado con vehículo (relleno de color gris) indican que la unión óptima del p-glucano tanto a monocitos como a neutrófilos requirió la presencia de suero autólogo al 10 % en el medio, un periodo de incubación de 1-2 horas y una temperatura de incubación de 37 °C con las células. Los datos que se muestran aquí son representativos de al menos tres experimentos realizados con células obtenidas de tres donantes diferentes.

Figura 4. Papel de las proteínas del complemento en la unión de p-glucano de PGG a neutrófilos y monocitos humanos

La importancia de las proteínas del complemento en la unión de 200 pg/ml de p-glucano de PGG a neutrófilos y 100 pg/ml a monocitos dentro de PBM^c (1 x 106 células/ml) se investigó evaluando los efectos del calor inactivando el suero y bloqueando específicamente la proteína del complemento C3 como se describe en Materiales y Métodos. A) El suero se inactivó por calor (HI) calentando el suero a 56 °C durante 30 minutos. La unión de p-glucano en medio que contenía suero autólogo normal se comparó con el que contenía suero HI. La unión en presencia de albúmina de suero humano al 10 % se determinó para ver el efecto de una proteína de suero no específica. La MFI reducida y el porcentaje de células positivas para BfD IV en presencia de suero HI y albúmina de suero humano indicaron una disminución de la unión. Para las diversas condiciones de unión, el histograma muestra la intensidad de fluorescencia de las células tratadas con p-glucano (línea sólida) en comparación con la del grupo de control tratado con vehículo (relleno de color gris). Los datos mostrados en forma de gráficos que combinan representaciones de contorno y densidad (cebra) e histogramas son representativos de tres experimentos independientes realizados en tres donantes diferentes. La MFI promedio de unión en el grupo tratado con p-glucano de PGG en presencia de suero HI se redujo significativamente en comparación con la del grupo con suero regular. El gráfico de la FMI representa gráficamente la media de cinco donantes ± SEM. **, p < 0,05 en comparación con la unión en suero regular. B) El suero se incubó con compstatina 20 pM, compstatina 100 pM o control peptídico durante 10 minutos a temperatura ambiente y a continuación se usó para estudios de unión. La m Fi y el porcentaje de células positivas para BfD IV en los gráficos que combinan representaciones de contorno y densidad (cebra) muestran una inhibición completa de la unión en presencia de compstatina 100 pM. El histograma muestra la intensidad de fluorescencia de las células tratadas con p-glucano en presencia de control peptídico (línea sólida) o compstatina (línea punteada) en comparación con el grupo de control tratado con vehículo (relleno de color gris). La representación gráfica de la MFI promedio del grupo de control tratado con vehículo, el grupo tratado con p-glucano de PGG en presencia de control peptídico o compstatina 100 pM de tres donantes muestra que la compstatina en comparación con el control peptídico inhibió significativamente la unión. La FMI representa gráficamente la media de tres donantes ± SEM. En ambos gráficos, la MFI promedio y el porcentaje de inhibición calculado mediante la fórmula descrita en Materiales y Métodos (entre paréntesis) se indican en el gráfico **, p < 0,05 en comparación con la unión en presencia del péptido de control.

Figura 5. Requisito de porcentaje óptimo de suero, tiempo de incubación y temperatura de incubación a nivel de ligando con respecto al nivel celular

La unión de p-glucano de PGG a células en condiciones de unión no permisivas, incluyendo células resuspendidas en suero HI, periodo corto de incubación de p-glucano con células, o temperatura de incubación baja se midió después de añadir p-glucano tratado previamente con suero. Para el tratamiento previo sérico de p-glucano, el p-glucano se incubó a una concentración de 60 mg/ml con suero al 90 % a 37 °C durante 30 minutos para obtener una proporción óptima de glucano con respecto a suero y para mantener el porcentaje de suero arrastrado por debajo de un 3 %. A) p-glucano tratado con PBS (PGG), o p-glucano y suero añadidos por separado (PGG suero), o p-glucano tratado previamente en suero (SueroPGG) se añadieron a una concentración de 200 pg/ml a neutrófilos o a 100 pg/ml to PBMC, a PBMC, y se incubó durante dos horas a 37 °C en medio que contenía suero regular al 10 % o suero HI al 10 %, y a continuación se midió la unión como se describe en Material y métodos. La unión de SueroPGG a células en suero HI fue comparable a la observada en suero regular, mientras que se observó un rescate mínimo de unión con p-glucano que no fue tratado con suero (PGG y PGG suero). B) La unión se midió después de incubar PGG o SueroPGG con las células durante 10 minutos o dos horas a 37 °C en un medio que contenía suero regular al 10 % o suero HI al 10 %. El SueroPGG unido dentro de los 10 minutos de incubación con células en suero HI en lugar de la unión medible observada solo después de una hora de incubación de PGG con células en suero regular. C) La unión se midió después de incubar PGG o SueroPGG con células durante dos horas a 37 °C o 4 °C con células en un medio que contenía suero regular al 10 % o suero HI al 10 %. A diferencia de la unión mínima de PGG a células en suero regular a 4 °C, el SueroPGG mostró una unión eficaz a células en suero HI a 4 °C. Los datos indicados que se muestran en forma de gráficos que combinan representaciones de contorno y densidad (cebra) con MFI y el porcentaje de la población positiva para BfD IV son representativos de tres experimentos realizados con células obtenidas de tres donantes diferentes.

Figura 6. Detección de opsonina del complemento, iC3b en la superficie de células unidas a p-glucano de PGG

Para investigar si el p-glucano de PGG estaba siendo opsonizado por complemento, se determinó la presencia de iC3b en células unidas a p-glucano y también directamente a p-glucano en un sistema exento de células. A) Se muestra la tinción de neutrófilos y monocitos para p-glucano por BfD IV e iC3b mediante un anticuerpo monoclonal específico para el neoepítopo de iC3b. Los neutrófilos o PBMC humanos se incubaron con 200 pg/ml y 100 pg/ml de p-glucano de PGG respectivamente a 37 °C durante dos horas, se tiñeron para BfD IV y anti-iC3b y se analizaron mediante citometría de flujo como se describe en Material y métodos. Los histogramas muestran la intensidad de fluorescencia de las células teñidas con BfD IV y anti-iC3b tratadas con p-glucano de PGG (línea sólida) en comparación con la del grupo de control tratado con vehículo (relleno de color gris). Aquí se muestran datos representativos de tres experimentos independientes de tres donantes diferentes. B) A continuación se evaluó la colocalización de p-glucano de PGG e iC3b en neutrófilos mediante microscopía confocal. Los neutrófilos tratados con p-glucano de PGG (panel superior) y tratados con vehículo (panel inferior) se tiñeron doblemente con BfD IV y el anticuerpo monoclonal anti-iC3b. El neutrófilo individual se identificó con la tinción de núcleos DAPI (azul), el anticuerpo BfD IV unido al glucano se detectó mediante el anticuerpo secundario anti-IgM marcado con Cy5 (pseudocoloreado en verde) y el anticuerpo monoclonal anti-iC3b unido a iC3b en las células se detectó mediante el anticuerpo secundario anti-IgG marcado con Cy3 (rojo). Las tinciones combinadas de BfD IV y tinciones anti-iC3b (amarillo) demuestran la colocalización de ic3b y p-glucano de PGG en la superficie de los neutrófilos. El aumento original para todas las imágenes es 100x . Los datos de microscopía son representativos de dos experimentos independientes de dos donantes diferentes. C) La interacción directa de iC3b y glucano también se evaluó en un sistema exento de células usando ELISA. Se inmovilizó p-glucano de PGG o dextrano a una concentración de 300 pg/ml en una placa y se incubó con suero regular o HI durante 30 minutos a 37 °C. A continuación la placa se sondeó para detectar iC3b unido a p-glucano usando el anticuerpo monoclonal anti-iC3b como se describe en Material y métodos. El factor de cambio se calculó como densidades ópticas de los pocillos tratados con p-glucano dividido entre el de los pocillos de blanco sin glucano inmovilizado. El gráfico representado con los factores medios de cambio ± SEM de tres experimentos separados indica la deposición de iC3b en p-glucano de PGG tratado con un grupo de suero regular con respecto al iC3b significativamente menor detectado en p-glucano tratado con suero HI o dextrano tratado con grupos de suero regular. ** p < 0,05 en comparación con el grupo de suero regular tratado con p-glucano de PGG. D) Para los experimentos de captura (pull-down), el p-glucano de PGG se trató con suero como se describe para la Figura 5, y a continuación se incubó con BfD IV a temperatura ambiente durante 30 minutos. El p-glucano inmunoprecipitó de la mezcla de p-glucano-suero-BfD IV usando perlas anti-IgM anti-ratón de rata. A continuación, las perlas con el material inmunoprecipitado se sometieron a citometría de flujo para detectar iC3b usando Ab anti-iC3b marcado con FITC. El histograma muestra la comparación de iC3b detectado en varios grupos tratados con pglucano (línea sólida) en comparación con el grupo tratado con vehículo (relleno de color gris). Los datos muestran la presencia de iC3b en p-glucano de PGG inmunoprecipitado a partir de suero regular, pero no cuando inmunoprecipita a partir de suero HI. El dextrano, que no tiene reactividad con BfD IV, no capturó el iC3b. Los datos que se muestran aquí son representativos de dos experimentos independientes de dos donantes diferentes. E) La implicación de la interacción covalente del complemento con p-glucano de PGG se evaluó inhibiendo la deposición de iC3b y la unión a las células después de la inhibición de la capacidad de unión covalente de las proteínas del complemento mediante el tratamiento con metilamina (MA) al 0,67 % del suero. Como se muestra en el gráfico, el tratamiento con MA de suero anuló completamente la deposición de iC3b en glucano inmovilizado. Los histogramas demuestran que en comparación con la unión en presencia de sueros que han pasado por el proceso idéntico al tratamiento con MA (línea sólida), la unión en presencia de suero tratado con MA (línea punteada) se inhibió completamente hasta el nivel obtenido en el grupo tratado con vehículo (relleno de color gris). Los datos, representativos de dos experimentos, demuestran (a) que la interacción covalente del complemento con p-glucano de PGG es fundamental para la opsonización de iC3b y (b) la unión de p-glucano tanto a neutrófilos como a monocitos.

Figura 7. Papel de la ruta clásica y la ruta alternativa en la unión de p-glucano de PGG a neutrófilos y monocitos

El papel de las rutas clásica y alternativa (CP y AP) de la activación del complemento en la opsonización y la unión de p-glucano de PGG se evaluó mediante el uso de suero en presencia de cationes que se usan de forma diferencial por ambas rutas o en presencia de anticuerpo que bloqueo específico de la ruta. A) La capacidad del suero tratado con EGTA (10 mM) para bloquear tanto la CP activada por eritrocitos de oveja sensibilizados (SRBC) como la AP activada por el factor de veneno de cobra (CVF) y el suero tratado con MgEGTA (EGTA 10 mM MgCl² 10 mM) para bloquear la CP mientras se permite que la AP funcione se evaluó midiendo la formación del complejo sC5b-9 en el suero de diversos grupos de tratamiento de acuerdo con el método descrito en la sección Material y métodos. Los datos se expresan como media ± SEM de dos experimentos separados. B) La deposición de iC3b en el p-glucano de PGG inmovilizado y la unión de p-glucano de PGG a neutrófilos y monocitos en presencia de suero sin tratar, tratado con EGTA o tratado con MgEGTA se midió como se ha descrito anteriormente. En presencia de suero tratado con EGTA y MgEGTA, se detectó un mínimo de iC3b en el glucano. Los histogramas muestran la unión de p-glucano de PGG a neutrófilos y monocitos en presencia de medios que contienen suero sin tratar al 10 % (línea sólida), tratado con EGTA (línea discontinua) o tratado con MgEGTA (línea punteada). La unión se inhibió completamente en el suero tratado con EGTA, mientras que el suero tratado con MgEGTA no la rescató. C) Antes de evaluar el efecto de inhibir específicamente la ruta alternativa bloqueando el Factor D usando un anticuerpo monoclonal anti-Factor D, la validez del anticuerpo se evaluó midiendo su capacidad para bloquear la AP activada por CVF, pero no la CP activada por SRBC usando el kit sC5b-9 de acuerdo con el método que se ha descrito en A. D) La unión de p-glucano de PGG a neutrófilos y monocitos se midió usando suero con anticuerpo monoclonal anti-Factor D o con anticuerpo de control de isotipo. El histograma muestra la unión parcialmente inhibida en medios que contienen suero al 10 % tratado con 20 pg/ml de anti-Factor D en comparación con la unión en presencia de suero tratado con la misma concentración de control de isotipo. Estos datos sugieren que tanto la ruta clásica como la alternativa desempeñan un papel en la opsonización del complemento y en la unión de p-glucano de PGG a neutrófilos y monocitos humanos.

La Figura 8 es un diagrama esquemático que ilustra una ruta a modo de ejemplo de la opsonización de pglucano soluble (p-glucano de PGG) y una interacción a modo de ejemplo del p-glucano soluble opsonizado con receptores de células inmunitarias.

La Figura 9 es un gráfico de barras que muestra un aumento de la migración de neutrófilos humanos a pglucano soluble opsonizado.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE REALIZACIONES ILUSTRATIVAS

Imprime PGG (p(1,6)-[poli-1,3)-D-glucopiranosil]-poli-p(1,3)-D-glucopiranosa) es una forma soluble altamente purificada y bien caracterizada de p-glucano obtenido a partir de levadura. Recientemente se investigó la capacidad de opsonización de Imprime PGG por proteínas del complemento en suero. También investigaron la consecuencia funcional de opsonizar Imprime ^pG^g tal como, por ejemplo, la unión a células inmunitarias humanas. Esta es la primera vez que se ha demostrado que un glucano de levadura soluble se opsoniza con el complemento antes de unirse a un receptor del complemento.

Por lo tanto, en un aspecto, la invención proporciona una composición que generalmente incluye p-glucano soluble opsonizado aislado. En algunos casos, el p-glucano soluble opsonizado se puede preparar mediante incubación in vitro del p-glucano soluble con suficientes componentes del sistema del complemento para dar como resultado la opsonización del p-glucano soluble. En otros casos, el p-glucano soluble opsonizado se puede preparar derivatizando covalentemente el p-glucano soluble con una o más proteínas del complemento o proteínas similares al complemento para imitar el complejo de P-glucano natural/complemento que se puede formar cuando el pglucano soluble se ponen en contacto con suero, ya sea in vivo o cuando se incuba in vitro.

El p-glucano soluble opsonizado puede presentar una unión mejorada a las células inmunitarias humanas en comparación con el p-glucano soluble sin opsonizar. In vitro, el p-glucano sin opsonizar se puede unir escasamente a células inmunitarias humanas tales como, por ejemplo, linfocitos B, monocitos y neutrófilos. Cuando se administra a un sujeto, el p-glucano soluble se puede opsonizar. De hecho, los investigadores muestran que la unión de pglucano soluble opsonizado a linfocitos B, monocitos y neutrófilos aumenta significativamente con concentraciones crecientes de suero. El p-glucano soluble opsonizado previamente, cuando se añade a células en suero inactivado por calor (por ejemplo, condiciones de unión no permisivas), rescata completamente la unión en los tres tipos de células. Por lo tanto, el p-glucano soluble opsonizado se puede administrar a un sujeto y proporcionar una actividad de p-glucano inmunomoduladora más rápida que la administración de p-glucano soluble sin opsonizar porque (a) el p-glucano soluble opsonizado previamente se puede unir e influir en las células más fácilmente del sistema inmunitario en comparación con el p-glucano soluble sin opsonizar, y (b) el p-glucano soluble opsonizado previamente no requiere opsonización in vivo para presentar la actividad inmunomoduladora opsonizada. El pglucano soluble opsonizado también se puede administrar a sujetos con deficiencia de las actividades opsónicas del sistema del complemento (por ejemplo, infecciones bacterianas piogénicas y glomerulonefritis membranoproliferativa).

El p-glucano soluble opsonizado también puede actuar como un estímulo quimioatrayente para las células inmunitarias humanas innatas tales como, por ejemplo, los neutrófilos. Los investigadores muestran un aumento de la migración de neutrófilos a p-glucano soluble opsonizado previamente en comparación con la migración de neutrófilos hacia p-glucano soluble sin opsonizar. Aquí, de nuevo, la administración de un p-glucano soluble opsonizado a un sujeto puede proporcionar el estímulo quimioatrayente más rápidamente que administrando pglucano soluble sin opsonizar.

El p-glucano soluble opsonizado también puede ser capaz de activar receptores del complemento en células inmunitarias humanas, que incluyen, por ejemplo, el receptor CR2 en linfocitos B y el receptor CR3 en monocitos y neutrófilos. Al unirse a los receptores del complemento en las células inmunitarias humanas, el p-glucano soluble opsonizado puede provocar diversas funciones inmunomoduladoras tales como, por ejemplo, proliferación de linfocitos B, migración de neutrófilos, etc.

Como se usa en el presente documento, el término "aislado" y variaciones del mismo se refieren a p-glucano soluble opsonizado que se ha eliminado, en cualquier grado, de su entorno de origen natural. Por ejemplo, el p-glucano soluble opsonizado aislado incluye el p-glucano soluble opsonizado que se ha eliminado del suero de modo que, por ejemplo, al menos una parte de las proteínas nativas del suero ya no está presente. El término "aislado" no expresa ningún grado específico al que se eliminan los otros componentes celulares.

"Opsonizado" y sus variaciones se refieren a moléculas de p-glucano solubles que incluyen al menos una opsonina. Una "opsonina" se refiere, por ejemplo, a una proteína asociada al complemento o fragmento de la misma que incluye, por ejemplo, C3, C3a, C3b, iC3b, C3bB, C3bBb, C3d, C3dg, C4, C5, C5a, C5b, C6, C7, C8, C9, o cualquier combinación de dos o más de las mismas. En algunas realizaciones, la opsonina se puede acoplar directa o indirectamente al p-glucano soluble. El p-glucano y la opsonina se pueden acoplar covalentemente o, en algunas realizaciones, pueden incluir al menos un enlace iónico o de afinidad. Como se usa en el presente documento, "acoplado covalentemente" se refiere al acoplamiento directo o indirecto de dos componentes exclusivamente mediante enlaces covalentes. El acoplamiento covalente directo puede implicar la unión covalente directa entre un átomo del p-glucano y un átomo de la opsonina. Alternativamente, el acoplamiento covalente se puede producir mediante un grupo de unión unido covalentemente al resto de p-glucano, la opsonina, o ambos, lo que facilita el acoplamiento covalente del p-glucano y la opsonina. El acoplamiento covalente indirecto puede incluir un tercer componente tal como, por ejemplo, un soporte sólido al que el p-glucano y la opsonina se unen covalentemente por separado.

Cuando está presente, el grupo de enlace puede ser cualquier grupo de enlace orgánico adecuado que permita que el p-glucano se acople covalentemente a la opsonina mientras se conserva al menos una parte de la actividad inmunomoduladora del complejo P-glucano/opsonina. El grupo de enlace puede incluir un grupo reactivo capaz de reaccionar con la opsonina para formar un enlace covalente. Los grupos reactivos adecuados incluyen, por ejemplo, los que se discuten en Hermanson, G. (1996), Bioconjugate Techniques, Academic Press, Capítulo 2 "The Chemistry of Reactive Functional Groups", 137-166. Por ejemplo, el grupo de enlace puede reaccionar con una amina primaria (por ejemplo, un éster de N-hidroxisuccinimidilo o un éster de N-hidroxisulfosuccinimidilo); puede reaccionar con un grupo sulfhidrilo (por ejemplo, una maleimida o un yodoacetilo), o puede ser un grupo fotorreactivo (por ejemplo, una fenilazida que incluye 4-azidofenilo, 2-hidroxi-4-azidofenilo, 2-nitro-4-azidofenilo, y 2-nitro-3-azidofenilo).

Un grupo químicamente activo accesible para el acoplamiento covalente al grupo de enlace puede incluir un grupo que se puede usar directamente para el acoplamiento covalente al grupo de enlace o, alternativamente, un grupo que se puede modificar para estar disponible para el acoplamiento covalente al grupo de enlace. Por ejemplo, los grupos químicamente activos adecuados incluyen, pero no se limitan a, grupos amino primario y sulfhidrilo. Dado que ciertos restos activos, por ejemplo, proteínas y otros péptidos, pueden incluir una pluralidad de grupos químicamente activos, es posible que un p-glucano soluble opsonizado pueda incluir una pluralidad de moléculas de p-glucano solubles acopladas a una opsonina, una pluralidad de opsoninas acopladas a un p-glucano soluble, o una pluralidad de opsoninas y una pluralidad de p-glucanos.

Ciertos p-glucanos solubles opsonizados pueden contener asociaciones químicas entre un p-glucano y una opsonina distintas del acoplamiento covalente. La asociación química solo necesita ser lo suficientemente fuerte para mantener el acoplamiento de la opsonina y el p-glucano para su uso previsto tal como, por ejemplo, administración a un sujeto, administración a un tejido u órgano diana, o para realizar un ensayo (por ejemplo, un ensayo de detección). Por lo tanto, es posible una amplia diversidad de acoplamientos no covalentes y se pueden identificar como adecuados dependiendo de las condiciones a las que se expondrá el p-glucano soluble opsonizado, tales como, por ejemplo, pH, temperatura, duración del acoplamiento requerido para el uso previsto, etc. Por ejemplo, un p-glucano soluble opsonizado puede incluir una interacción de afinidad entre el p-glucano y la opsonina. La afinidad avidina-biotina representa un ejemplo de interacción no covalente que se puede usar para acoplar una opsonina y un p-glucano. Por ejemplo, una molécula de biotina se puede unir covalentemente a una opsonina mediante uno de varios grupos funcionales presentes en los aminoácidos (por ejemplo, grupos amino primario o sulfhidrilo), un p-glucano se puede acoplar a una molécula de avidina mediante la derivatización apropiada del pglucano y la opsonina y el p-glucano se pueden acoplar entre sí de forma no covalente mediante la interacción de afinidad avidina-biotina. Los expertos en la materia conocen bien algunos métodos para biotinilar proteínas y unir grupos químicos a avidina. Las interacciones de afinidad alternativas que pueden ser útiles para preparar compuestos de p-glucano incluyen, por ejemplo, interacciones antígeno/anticuerpo e interacciones glicoproteína/lectina.

El p-glucano soluble puede ser cualquier forma de p-glucano que sea soluble en agua. Los p-glucanos solubles adecuados y la preparación de p-glucanos solubles adecuados a partir de sus fuentes naturales se describen, por ejemplo, en el documento de publicación de solicitud de patente de Estados Unidos N.° US2008/0103112 A1. El pglucano soluble se obtiene a partir de levadura tal como, por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae. En ciertas realizaciones específicas, el p-glucano soluble puede ser, o se puede obtener a partir de p(1,6)-[poli-1,3)-D-glucopiranosil]-poli-p(1,3)-D-glucopiranosa, también denominada PGG en el presente documento. Por lo tanto, el pglucano soluble puede incluir, por ejemplo, p-glucanos solubles modificados y/o derivatizados tales como los que se describen en el documento de solicitud de patente internacional N.° PCT/US12/36795. En otras realizaciones, el pglucano soluble puede incluir, por ejemplo, un p-glucano soluble particulado o una preparación de p-glucano soluble particulado, cada uno de los cuales se describe, por ejemplo, en el documento de patente de Estados Unidos N.° 7.981.447.

Por lo tanto, en otro aspecto, la invención proporciona un método para producir p-glucano soluble opsonizado. Generalmente, el método incluye poner en contacto p-glucano soluble con una composición en condiciones eficaces para que al menos un componente de la composición opsonice el p-glucano soluble. La composición incluye generalmente suficientes componentes del sistema del complemento para opsonizar el p-glucano soluble. En algunas realizaciones, la composición con la que se pone en contacto el p-glucano soluble puede incluir un producto sanguíneo tal como, por ejemplo, suero. Como se usa en el presente documento, "producto sanguíneo" se refiere a sangre completa o parte de la misma (por ejemplo, suero) con suficientes componentes del sistema del complemento para opsonizar una diana de opsonización tal como, por ejemplo, un antígeno o un p-glucano soluble.

En algunas realizaciones, las condiciones pueden incluir incubar la composición y el p-glucano soluble juntos a una temperatura de aproximadamente 25 °C a aproximadamente 45 °C, aunque es factible que el método se pueda realizar incubando la composición y el p-glucano a una temperatura fuera de este intervalo. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la composición y el p-glucano se pueden incubar a una temperatura mínima de, por ejemplo, al menos 25 °C, al menos 27 °C, al menos 30 °C, al menos 35 °C, al menos 37 °C, o al menos 40 °C. En algunas realizaciones, la composición y el p-glucano se pueden incubar a una temperatura máxima de, por ejemplo, no superior a 45 °C, no superior a 40 °C, no superior a 37 °C, no superior a 35 °C, o no superior a 30 °C. En algunas realizaciones, la temperatura a la que la composición y el p-glucano se pueden incubar puede entrar dentro de un intervalo dentro de un intervalo que tiene puntos finales definidos por cualquier temperatura mínima y cualquier temperatura máxima apropiada que se describe en el presente documento. En una realización particular, la composición y el p-glucano se pueden incubar a una temperatura de 37 °C.

En algunas realizaciones, las condiciones pueden incluir incubar la composición y el p-glucano juntos durante un periodo de aproximadamente 15 minutos a aproximadamente 120 minutos, aunque es factible que el método se pueda realizar incubando la composición y el p-glucano juntos durante un periodo fuera de este intervalo. Por lo tanto, la composición y el p-glucano se pueden incubar juntos durante un periodo mínimo de al menos 15 minutos tal como, por ejemplo, al menos 20 minutos, al menos 30 minutos, al menos 45 minutos, al menos 60 minutos, al menos 75 minutos, o al menos 90 minutos. En algunas realizaciones, la composición y el p-glucano se pueden incubar juntos durante un periodo máximo no superior a 120 minutos tal como, por ejemplo, no superior a 75 minutos, no superior a 60 minutos, o no superior a 45 minutos. En algunas realizaciones, el periodo de tiempo en el que la composición y el p-glucano se pueden incubar juntos puede entrar dentro de un intervalo que tiene puntos finales definidos por cualquier periodo de tiempo mínimo y cualquier periodo de tiempo máximo apropiado. En una realización particular, la composición y el p-glucano se pueden incubar juntos durante aproximadamente 30 minutos.

En algunas realizaciones, las condiciones pueden incluir proporcionar la composición y el p-glucano en una relación especificada tal como, por ejemplo, proporcionar no más de 1,25 pg de p-glucano por 1 pl de composición. En algunas realizaciones, las condiciones incluyen proporcionar un exceso de volumen:masa (por ejemplo, pl:pg) de la composición en comparación con la cantidad de p-glucano tal como, por ejemplo, un exceso de al menos dos veces (por ejemplo, 2 pl de composición por 1 pg de p-glucano), un exceso de al menos tres veces, un exceso de al menos cuatro veces, un exceso de al menos cinco veces, un exceso de al menos seis veces, un exceso de al menos siete veces, un exceso de al menos ocho veces, un exceso de al menos nueve veces, un exceso de al menos 10 veces, un exceso de al menos 15 veces, un exceso de al menos 20 veces, o un exceso de al menos 25 veces de composición en comparación con la cantidad de p-glucano. Por lo tanto, en una realización particular, las condiciones incluyen proporcionar un exceso de volumen:masa de al menos 10 veces de la composición en comparación con la cantidad de p-glucano.

En algunas realizaciones, el método puede incluir además aislar al menos una parte del p-glucano soluble opsonizado de la mezcla de opsonización. El p-glucano soluble opsonizado se puede aislar usando cualquier método adecuado para separar componentes de una mezcla biológica o química tal como, por ejemplo, capturar suero de p-glucano opsonizado usando una resina de afinidad apropiada acoplada a un anticuerpo monoclonal para p-glucano. Las estrategias de aislamiento adecuadas pueden incluir, por ejemplo, cromatografía de afinidad usando una o más proteínas de unión a carbohidratos como ligando, cromatografía de afinidad usando uno o más anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a p-glucano como ligando, o cromatografía de afinidad usando uno o más anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a una o más proteínas del complemento. A continuación el p-glucano soluble opsonizado aislado se puede formular para su administración a un individuo.

El p-glucano soluble opsonizado aislado se puede formular en una composición junto con un "vehículo". Como se usa en el presente documento, "vehículo" incluye cualquier disolvente, medio de dispersión, vehículo, revestimiento, diluyente, agente antibacteriano y/o antifúngico, agente isotónico, agente retardador de la absorción, tampón, solución de vehículo, suspensión, coloide y similares. El uso de tales medios y/o agentes para principios activos farmacéuticos se conoce bien en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el p-glucano soluble opsonizado aislado, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas. En las composiciones también se pueden incorporar principios activos suplementarios.

Por "farmacéuticamente aceptable" se hace referencia a un material que no es biológicamente o de otro modo indeseable, es decir, el material se puede administrar a un individuo junto con p-glucano soluble opsonizado aislado sin causar ningún efecto biológico indeseable o interactuar de manera perjudicial con cualquiera de los demás componentes de la composición farmacéutica en los que está contenido.

El p-glucano soluble opsonizado aislado se puede formular en una composición farmacéutica. La composición farmacéutica se puede formular en una diversidad de formas adaptadas para una vía de administración preferente. Por lo tanto, una composición se puede administrar mediante vías conocidas que incluyen, por ejemplo, oral, parenteral (por ejemplo, intradérmica, transcutánea, subcutánea, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, etc.) o tópica (por ejemplo, intranasal, intrapulmonar, intramamaria, intravaginal, intrauterina, intradérmica, transcutánea, rectal, etc.). Se prevé que una composición se pueda administrar a una superficie mucosa, tal como mediante la administración a, por ejemplo, la mucosa nasal o respiratoria (por ejemplo, mediante pulverización o aerosol). Una composición también se puede administrar mediante una liberación sostenida o retardada.

Una formulación se puede presentar convenientemente en forma de dosificación unitaria y se puede preparar mediante métodos bien conocidos en la técnica farmacéutica. Los métodos para preparar una composición con un vehículo farmacéuticamente aceptable incluyen la etapa de asociar el p-glucano soluble opsonizado aislado con un vehículo que constituye uno o más ingredientes auxiliares. En general, una formulación se puede preparar asociando uniforme y/o íntimamente el compuesto activo con un vehículo líquido, un vehículo sólido finamente dividido, o ambos, y a continuación, si fuera necesario, se da forma al producto en las formulaciones deseadas.

El p-glucano soluble opsonizado aislado se puede proporcionar en cualquier forma adecuada que incluye, pero no se limita a, una solución, una suspensión, una emulsión, una pulverización, un aerosol o cualquier forma de mezcla. La composición se puede administrar en formulación con cualquier excipiente, portador o vehículo farmacéuticamente aceptable. Por ejemplo, la formulación se puede administrar en una forma de dosificación tópica convencional tal como, por ejemplo, una crema, una pomada, una formulación en aerosol, una pulverización sin aerosol, un gel, una loción y similares. La formulación puede incluir además uno o más aditivos que incluyen, por ejemplo, un adyuvante, un potenciador de penetración de la piel, un colorante, una fragancia, un aromatizante, un humectante, un espesante y similares.

En otro aspecto, la invención proporciona p-glucano soluble opsonizado para su uso en métodos que generalmente implican administrar a un individuo una cantidad eficaz de p-glucano soluble opsonizado. Como se usa en el presente documento, "una cantidad eficaz" se refiere a la cantidad de p-glucano soluble opsonizado aislado eficaz para aumentar al menos uno de los siguientes: unión del p-glucano soluble opsonizado aislado a linfocitos B, monocitos o neutrófilos; migración de neutrófilos hacia el p-glucano soluble opsonizado; y las funciones inmunomoduladoras del individuo que incluyen, por ejemplo, fagocitosis, estallido oxidativo, producción de citoquinas y/o quimioquinas, y/o iniciar una respuesta inmunitaria adaptativa.

Por lo tanto, la cantidad de p-glucano soluble opsonizado aislado eficaz para inducir uno o más de los efectos deseados puede variar dependiendo de diversos factores que incluyen, entre otros, el peso, condición física y/o edad del sujeto, y/o la vía de administración. Por lo tanto, el peso absoluto del p-glucano soluble opsonizado aislado incluido en una forma de dosificación unitaria determinada puede variar ampliamente y depende de factores tales como la especie, edad, peso y condición física del sujeto, así como el método de administración. Por consiguiente, no es práctico establecer generalmente la cantidad que constituye una cantidad del p-glucano soluble opsonizado aislado eficaz para todas las aplicaciones posibles. Los expertos en la materia, sin embargo, pueden determinar fácilmente la cantidad apropiada con la debida consideración de tales factores.

En algunas realizaciones, el método puede incluir administrar suficiente p-glucano soluble opsonizado aislado para proporcionar una dosis, por ejemplo, de aproximadamente 100 ng/kg a aproximadamente 50 mg/kg al sujeto, aunque en algunas realizaciones, los métodos se pueden realizar administrando el p-glucano soluble opsonizado aislado en una dosis fuera de este intervalo. En algunas realizaciones, el método incluye administrar suficiente p-glucano soluble opsonizado aislado para proporcionar una dosis de aproximadamente l0 pg/kg a aproximadamente 5 mg/kg al sujeto, por ejemplo, una dosis de aproximadamente 100 pg/kg a aproximadamente 1 mg/kg.

Alternativamente, la dosis se puede calcular usando el peso corporal real obtenido justo antes del comienzo de un ciclo de tratamiento. Para las dosificaciones calculadas de esta manera, el área de superficie corporal (m2) se calcula antes del inicio del ciclo de tratamiento usando el método de Dubois: m2 = (peso en kg0425 x altura en cm1725) x 0,007184. Por lo tanto, en algunas realizaciones, el método puede incluir la administración de suficiente pglucano soluble opsonizado aislado para proporcionar una dosis, por ejemplo, de aproximadamente 0,01 mg/m2 a aproximadamente 10 mg/m2.

En algunas realizaciones, el p-glucano soluble opsonizado aislado se puede administrar, por ejemplo, desde una dosis única, hasta múltiples dosis a la semana, aunque en algunas realizaciones el método se puede realizar administrando el p-glucano soluble opsonizado aislado con una frecuencia externa este intervalo. En determinadas realizaciones, el p-glucano soluble opsonizado aislado se puede administrar desde aproximadamente una vez al mes hasta aproximadamente cinco veces a la semana.

En algunas realizaciones, el p-glucano soluble opsonizado se puede acoplar a un agente activo. Un p-glucano soluble y un agente activo se pueden acoplar mediante, por ejemplo, cualquiera de los métodos de acoplamiento covalente y/o asociaciones químicas no covalentes que se han descrito anteriormente con respecto a las realizaciones en las que el p-glucano y la opsonina están acoplados. Generalmente, un agente activo puede ser un agente que puede potenciar la opsonización, la administración dirigida y/o la actividad de un p-glucano soluble opsonizado. En otros casos, un agente activo puede incluir agentes cuya actividad se ve potenciada por el p-glucano soluble opsonizado.

Ciertos anticuerpos pueden potenciar la opsonización de un p-glucano soluble al que están acoplados. Por lo tanto, en algunas realizaciones, el agente activo puede incluir uno o más de tales anticuerpos acoplados al p-glucano soluble. Los anticuerpos a modo de ejemplo que pueden potenciar la opsonización incluyen, por ejemplo, anticuerpos anti-glucano (por ejemplo, anti-p-glucano) endógenos o de origen natural. Otros anticuerpos a modo de ejemplo que pueden potenciar la opsonización incluyen, por ejemplo, BfD I, BfD II, BfD III y/o BfD IV, cada uno de los cuales se describe en el documento de Patente de Estados Unidos N.° 6.294.321.

Las quimioquinas tales como, por ejemplo, IL-8, C5a y MCP-1 (proteína 1 quimioatrayente de monocitos) pueden ayudar a dirigir un p-glucano soluble opsonizado acoplado a células inmunitarias tales como, por ejemplo, neutrófilos y/o monocitos. Alternativamente, ciertos anticuerpos (por ejemplo, cetuximab o bevacizumab) y/o antígenos específicos del tumor pueden ayudar a dirigir un p-glucano soluble opsonizado acoplado a un sitio tumoral.

Alternativamente, el p-glucano soluble opsonizado puede presentar un aumento de la unión a los receptores del complemento en, por ejemplo, los linfocitos B. Por lo tanto, un agente activo acoplado a p-glucano soluble opsonizado se puede dirigir a los linfocitos B. Los agentes activos a modo de ejemplo en esta categoría pueden incluir, por ejemplo, un inmunomodulador (por ejemplo, agonistas de receptores de tipo Toll (agonistas de TLR), ciertos anticuerpos (por ejemplo, anti-CD40 o anti-CD137), ciertos antígenos, un agente citotóxico y/o un agente inmunosupresor.

Los antígenos a modo de ejemplo pueden incluir, por ejemplo, un antígeno viral (por ejemplo, un antígeno del virus de la gripe, hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, adenovirus, herpes simple, etc.), un antígeno tumoral (por ejemplo, MUC-1, CA-125, EGFR, telomerasa/hTERT, PSA, MY-ESO-1, MAGE, AML1 (incluyendo las fusiones AML-1), HER2/neu, gp100, WT1, CEA, etc.), un antígeno bacteriano (por ejemplo, toxoide tetánico, toxoide diftérico, antígenos de estafilococos, antígenos de neumococos, antígenos de Klebsiella, etc.) y/o un antígeno parasitario. Algunos ejemplos de agentes citotóxicos pueden incluir, por ejemplo, un agente quimioterapéutico (por ejemplo, cisplatino, ciclofosfamida, etc.), una toxina (por ejemplo, cadena A de ricina, toxina diftérica, etc.), un isótopo radiactivo (por ejemplo, Itrio-90, Yodo-131, etc.) y/o una citoquina (por ejemplo, IL-10).

Algunos ejemplos de agentes inmunosupresores pueden incluir, por ejemplo, un corticosteroide, tacrolimus, metotrexato, etc.

El p-glucano soluble opsonizado también puede presentar un aumento de la unión a los receptores del complemento en monocitos. Por lo tanto, un agente activo acoplado a p-glucano soluble opsonizado se puede dirigir a monocitos. Algunos ejemplos de agentes activos en esta categoría pueden incluir, por ejemplo, ciertos agonistas de TLR (por ejemplo, agonistas de TLR4, TLR7, y/o TLR8) y/o agentes quimioterapéuticos usados para tratar, por ejemplo, leucemia mieloide aguda (AML, por ejemplo, una antraciclina).

El p-glucano soluble opsonizado también puede presentar un aumento de la unión a los receptores del complemento ubicados en, por ejemplo, neutrófilos o glóbulos rojos. Por lo tanto, un agente activo acoplado a p-glucano soluble opsonizado se puede dirigir para su administración a neutrófilos o glóbulos rojos.

Las propiedades inmunomoduladoras de los p-1,3/1,6 glucanos de levadura están mediadas principalmente por su capacidad para ser reconocidas por las células inmunitarias innatas humanas. Aunque varios estudios han investigado la unión de p-glucanos particulados opsonizados y sin opsonizar a células inmunitarias humanas, principalmente mediante el receptor 3 del complemento (CR3) o dectina-1, pocos se han centrado en la comprensión de las características de unión de los p-glucanos solubles usando un fuente coherente, pura y analíticamente caracterizada. Este estudio evaluó las condiciones de unión del p-glucano soluble obtenido a partir de levadura a neutrófilos y monocitos humanos. Los resultados demostraron que el p-glucano soluble se unía tanto a los neutrófilos como a los monocitos humanos de una manera dependiente de la concentración y específica del receptor. Los anticuerpos que bloquean las cadenas CD11b y CD18 de CR3 inhibieron significativamente la unión a ambos tipos de células, estableciendo a CR3 como el receptor fundamental que reconoce el p-glucano soluble. Se demostró que la presencia de suero y el tiempo y la temperatura óptimos eran los requisitos previos para la unión del glucano soluble. La inhibición de la unión en presencia de suero inactivado por calor y/o el inhibidor específico de C3, compstatina, demostró la participación de las proteínas del complemento en la unión. El p-glucano soluble opsonizado se demostró mediante la detección de iC3b, la opsonina del complemento en las células unidas a pglucano, así como la interacción con el p-glucano directamente tanto en la fase sólida como en la fase fluida. La interacción entre iC3b y p-glucano fue indicada por una reducción significativa del iC3b detectado en p-glucano, así como la unión a las células por inactivación del suero mediada por metilamina. Por último, la ruta clásica y la ruta alternativa de activación del complemento son necesarias para opsonizar el p-glucano soluble y la unión del pglucano soluble a las células inmunitarias humanas.

Se ha informado que el receptor 3 del complemento, (CR3, CD11b/CD18, a^Mp²-integrina, Mac-1) y dectina-1 son los PRR de superficie celular predominantes para p-glucanos de levadura particulados en células inmunitarias innatas tales como, por ejemplo, monocitos, macrófagos, células dendríticas y neutrófilos (1-9). CR3 es un heterodímero de integrina que consta de las subunidades CD11b y CD18 (Sanchez, 1983). El dominio (I) insertado en CD11b se une a diversos ligandos tales como, ejemplo, fibrinógeno, ICAM-1 e iC3b, mientras que el dominio de tipo lectina se une a p-glucano (Ross G. D., 1987; Xia Y., 1999; Vetvicka 1996; Ross G. D. 1985). La dectina-1 es una lectina de tipo C monomérica con un dominio similar a lectina de unión a p-glucano, de tipo C extracelular único, y una cola citoplasmática corta que contiene un motivo de activación basado en tirosina inmunorreceptora (Brown G. D. 2006). Los estudios iniciales han mostrado que ambos p-glucanos particulados tanto opsonizado como sin opsonizar del complemento se unen a CR3 y dectina-1 (Cain 1987; Ross G. D. 1987; Brown G. D. 2002; Willment 2001; Willment 2005; Ujita M. 2009).

Se han usado diversas formas de p-glucanos obtenidos a partir de levadura solubles para demostrar la unión a CR3 y dectina-1. Se ha mostrado que el polisacárido cimosano soluble (SZP) rico en manano o p-glucano (~10 kDa), el glucano soluble neutro y un p-glucano de levadura soluble químicamente modificado, fosfato de 1,3 P-D-glucano (~127 kDa, fosfato de glucano) se unen a CR3 en neutrófilos aislados de sangre periférica humana (Thornton B. P., 1996; Xia Y., 1999). Se demostró que la dectina-1 soluble y asociada a la membrana se une a p-glucano inmovilizado soluble unido a placa (24). Se ha mostrado que el fosfato de glucano y los oligosacáridos de 1,3 p-D-glucano sintéticos se unen a la dectina-1 murina recombinante). (Adams, 2008).

No se ha mostrado que ningún p-glucano de levadura soluble se una a un receptor específico. Para aumentar la confusión, existen resultados discordantes con respecto al efecto de cualquier p-glucano en particular sobre cualquier receptor dado en cualquier tipo de célula dada. Los estudios recientes en neutrófilos humanos demostraron que el principal receptor del cimosano sin opsonizar es CR3 y no dectina-1 (Kennedy A. D. 2007, van Bruggen R.

2009). Aún no hay consenso sobre el receptor de glucanos solubles en células inmunitarias humanas. Además, los p-glucanos solubles usados para los estudios de unión se caracterizaron mínimamente o se modificaron químicamente. Además, hasta la fecha ningún estudio ha mostrado la capacidad de los p-glucanos solubles para activar el complemento y el papel de la opsonización del complemento en la unión del p-glucano a un receptor del complemento.

En este estudio, se investigó la unión de p-glucano soluble bien caracterizado, altamente purificado, obtenido a partir de Saccharomyces cerevisiae, p-glucano de PGG (p. m., aproximadamente 120-205 kDa) a monocitos y neutrófilos humanos, las células inmunitarias innatas que expresan los receptores de p-glucano informados. Los resultados demuestran que CR3 es el principal receptor para la unión del p-glucano soluble tanto en neutrófilos como en monocitos humanos. Además, los investigadores demuestran que la opsonización del complemento del p-glucano de levadura soluble está implicada en la unión del p-glucano soluble a CR3.

El p-glucano de PGG se une a neutrófilos y monocitos humanos de manera dependiente de la concentración

La unión de p-glucano de PGG a neutrófilos y monocitos humanos se evaluó incubando varias concentraciones de p-glucano soluble o vehículo con las células resuspendidas en medio con suero autólogo al 10 %, y a continuación se hizo la tinción de las células con anticuerpo BfD IV monoclonal de ratón específico de p -glucano, a continuación marcado con fluoróforo con un anticuerpo secundario. El p-glucano unido a la superficie celular se analizó mediante citometría de flujo. Se evaluó la capacidad de las células para unirse al p-glucano soluble comparando la intensidad media de fluorescencia (MFI) de las células teñidas con BfD IV y el porcentaje de células positivas para BfD IV con respecto a la del grupo de control tratado con vehículo. Como se muestra en la Figura 1a, p-glucano de PGG a 100 pg/ml, 200 pg/ml y 400 pg/ml se unió tanto a neutrófilos como a monocitos, pero no a linfocitos T de una manera dependiente de la concentración. Aunque el porcentaje de células positivas para BfD IV alcanzó una meseta en 200 pg/ml, los valores de MFI aumentaron con concentraciones crecientes de p-glucano. La unión también se evaluó por la capacidad de p-glucano de PGG marcado con DTAF para teñir neutrófilos y monocitos a concentraciones de 25 pg/ml, 100 pg/ml y 400 pg/ml. La Figura 1b muestra la unión dependiente de la concentración de p-glucano marcado con DTAF en neutrófilos; la unión observada era específica del receptor ya que la tinción se bloqueó mediante el exceso de p-glucano sin marcar, mientras que el exceso de dextrano sin marcar, un a-1,4/1,6 glucano no bloqueó la unión del p-glucano marcado con DTAF a las células (Figura 1c).

La unión de p-glucano de PGG a neutrófilos y monocitos humanos depende de CR3

Para determinar el papel de CR3 o dectina-1 en la unión de p-glucano de PGG a neutrófilos y monocitos humanos, estos receptores se bloquearon con los anticuerpos de bloqueo específicos del receptor o anticuerpos de control relevantes antes de añadir el p-glucano soluble y medir la unión. Se usaron combinaciones de anticuerpos frente al dominio I y al dominio de lectina de la cadena CD11b (LM2/1 VIM12), o frente a las cadenas CD11b y CD18 (LM2/1 VIM12 IB4) para bloquear el receptor CR3 receptor. La dectina-1 se bloqueó usando el anticuerpo GE2; la capacidad de GE2 para bloquear la función mediada por dectina-1 se sometió a ensayo evaluando su capacidad para bloquear el estallido oxidativo inducido por p-glucano particulado en células mononucleares de sangre periférica humana. Los datos presentados en la Figura 2 muestran que el bloqueo de la cadena CD11b (LM2/1 VIM 12) inhibe parcialmente la unión del p-glucano tanto a neutrófilos como a monocitos, mientras que el bloqueo de las cadenas tanto CD11b como CD18 (LM2/1 VIM12 IB4) inhibe adicionalmente la unión de p-glucano. Por el contrario, el bloqueo de la cadena a de una integrina no específica, por ejemplo, la cadena CD11a de LFA-1, no afectó a la unión de p-glucano. Además, el bloqueo del otro receptor principal de p-glucano, dectina-1 (GE2), no inhibió la unión de p-glucano a neutrófilos o monocitos.

La MFI promedio de las células positivas para BfD IV tratadas con anticuerpos de bloqueo de CR3 (LM2/1 VIM12 IB4) de cinco donantes fue significativamente menor que la de las células tratadas con el control de isotipo. Basándose en los valores de MFI, se calculó un porcentaje de inhibición de la unión por anticuerpos de bloqueo de CR3 en relación con el de los anticuerpos de control de isotipo en estos cinco donantes. El intervalo de porcentaje de inhibición de la unión mediante el bloqueo de ambas cadenas CR3 en neutrófilos fue de un 69-100 % con una inhibición promedio de un 80 %, mientras que el intervalo fue de un 42-95 % para los monocitos con un promedio de un 70 %. En general, los resultados demuestran que CR3 desempeña un papel importante como receptor implicado en la unión de p-glucano de PGG a neutrófilos y monocitos humanos.

La unión de p-glucano de PGG a neutrófilos y monocitos humanos depende del suero, el tiempo y la temperatura

Para determinar las condiciones requeridas para que el p-glucano de PGG se una a neutrófilos y monocitos humanos, se evaluaron la influencia del suero, el tiempo y la temperatura.

El papel del suero en la unión de p-glucano a las células se evaluó después de incubar las células a 37 °C durante dos horas en medio con suero autólogo al 2 %, al 5 %, o al 10 %. Los datos de la Figura 3a demuestran que la unión de p-glucano soluble, tal como se determina mediante MFI y el porcentaje de células marcadas positivas para BfD IV, aumentó proporcionalmente con el aumento del porcentaje de suero presente en el medio. La unión del pglucano a las células requirió la presencia de suero: la unión mínima se produjo usando suero al 2 % y la unión máxima se produjo usando suero al 10 %.

La cinética de la unión de p-glucano se evaluó en condiciones usando medios que contenían suero al 10 % a 37 °C. La unión se midió a los 10 minutos, 30 minutos, 60 minutos y 120 minutos. Los resultados presentados en la Figura 3b demuestran que la unión de p-glucano aumenta con el tiempo de incubación. Para los neutrófilos, la unión máxima se produjo a los 30-60 minutos, mientras que se requirieron 60-120 minutos para la unión del p-glucano a los monocitos.

El efecto de la temperatura se evaluó midiendo la unión después de incubar las células con el p -glucano soluble durante dos horas a 4 °C, temperatura ambiente o 37 °C. La temperatura también influyó en la unión de p-glucano a las células: la unión máxima se produjo cuando el p-glucano se incubó con células a 37 °C en comparación con 4 °C y temperatura ambiente (Figura 3c). Estos datos demuestran que la unión del p-glucano de PGG soluble a las células inmunitarias humanas es dependiente del suero, dependiente del tiempo y dependiente de la temperatura.

La unión de p-glucano de PGG soluble a neutrófilos y monocitos humanos depende de las proteínas del complemento en el suero

Después de evaluar la importancia de las proteínas séricas en la unión de p-glucano de PGG a las células inmunitarias, a continuación se investigó el papel que desempeñan las proteínas del complemento en la unión mediante a) suero inactivador por calor, que inactiva de forma no específica las proteínas del complemento junto con otras proteínas termolábiles y b) bloqueo específicamente de C3, la proteína del complemento que está implicada en cada una de las rutas, es decir, las rutas clásica, alternativa y de lectina, de la activación del complemento.

La inactivación térmica del suero se realizó incubando el suero a 56 °C durante 30 minutos. También se sometió a ensayo la unión en presencia de albúmina de suero humano al 10 %, la proteína sérica más abundante, para determinar si la mera presencia de una proteína sérica permitirá que se produzca la unión de p-glucano. Para los estudios de bloqueo de C3, la unión de p-glucano se midió en presencia de compstatina, un péptido sintético que se une a C3 que inhibe las tres rutas de activación del complemento se comparó con la presencia de un péptido de control (28).

Como se muestra en la Figura 4, la unión de p-glucano de PGG a neutrófilos y monocitos se anuló en presencia de suero inactivado por calor (HI). Además, la suplementación del medio de cultivo con albúmina de suero humano (HSA) no restauró la unión de p-glucano soluble a las células. La comparación estadística entre la MFI promedio de las células unidas a glucano en suero regular y en suero HI para cinco donantes se muestra en la presentación gráfica. El porcentaje de inhibición de la unión en suero HI se calculó basándose en que la MFI de neutrófilos positivos para BfD IV en estos cinco donantes fue de un 71-100 % con una inhibición promedio de un 89 %, mientras que fue de un 81-100 % para los monocitos con un promedio de un 90 %. Los datos de la Figura 4b muestran además que el bloqueo específico de C3 usando concentraciones variables de compstatina inhibió la unión de pglucano de una manera dependiente de la concentración, observándose una inhibición máxima a 100 pM. Por el contrario, el péptido de control no tuvo ningún efecto en la unión. La MFI promedio de los neutrófilos y monocitos tratados con compstatina unidos a p-glucano se comparó estadísticamente con la de las células tratadas con péptido de control en los donantes: el intervalo de porcentaje de inhibición fue de un 90-98 % con un 95 % como el promedio para los neutrófilos y un 62-92 % con un promedio de un 80 % para los monocitos. Tomados en conjunto, estos datos muestran de manera concluyente que la proteína del complemento, específicamente C3, desempeña un papel fundamental en la unión de p-glucano de PGG soluble a neutrófilos y monocitos humanos.

El requisito de suero, tiempo y temperatura para la unión de p-glucano de PGG a neutrófilos y monocitos humanos es principalmente al nivel del ligando y no al nivel del receptor.

Los hallazgos del contenido sérico y el tiempo y la temperatura de incubación óptimos junto con el requisito fundamental de la proteína del complemento para la unión de p-glucano de PGG condujeron a los investigadores a la hipótesis de que el p-glucano probablemente sea opsonizado por proteínas del complemento. Para someter a ensayo la hipótesis, primero se investigó si la dependencia del tiempo, la temperatura y el suero está realmente al nivel del ligando (p-glucano) o al nivel del receptor (CR3). Para discernir la influencia del suero, el tiempo y la temperatura en el ligando con respecto al receptor, los investigadores diseñaron una configuración experimental en la que el p-glucano se trato previamente con suero, se añadió a las células que se resuspendieron en suero HI y A continuación se midió posteriormente el rescate de la unión a las células. Véase que las condiciones que usan suero HI se muestran en la Figura 3a para que no permitan la unión. En estos experimentos de tratamiento previo de pglucano, se consideró cuidadosamente la relación de p-glucano:suero para mantener la relación en el mismo intervalo encontrado óptimo en el escenario de unión, donde p-glucano, células y el suero se mezclaron juntos al mismo tiempo. Además, el porcentaje de suero regular arrastrado junto con el glucano tratado previamente se mantuvo por debajo de un 3 %.

Los resultados en la Figura 5a muestran que una vez que el p-glucano soluble se trató previamente con suero a 37 °C durante 30 minutos y a continuación se añadió a las células, la unión se rescataba por completo. Aunque el alcance de la unión rescatada medida por MFI y el porcentaje de células positivas para la tinción con BfD IV fue mínima para el p-glucano (PGG) sin tratar y el p-glucano más suero añadidos por separado a las células (PGG suero), la unión obtenida mediante el uso de PGG tratado previamente con suero (SueroPGG) fue comparable a la observada para las células cultivadas con p-glucano en suero regular al 10 %. El p-glucano tratado previamente presentaba unión a neutrófilos y monocitos en suero HI a los 10 minutos de incubación, lo que en la Figura 3b se mostró de otro modo que se producía en 30-60 minutos para neutrófilos y 60-120 minutos para monocitos (Figura 5b). Además, el p-glucano tratado previamente con suero podría incluso recuperar la unión en células incubadas a 4 °C en suero HI, lo que de nuevo se demostró en la Figura 3c como una condición que permite una unión mínima (Figura 5c).

Estos resultados demuestran que el suero, el tiempo y la temperatura son factores fundamentales para la unión del p-glucano a las células desde la perspectiva del ligando (p-glucano de PGG), y no parece que sean factores relevantes para la modulación de CR3.

La opsonización del p-glucano de PGG soluble se produce por interacción covalente de las proteínas del complemento con el p-glucano

Después de demostrar el requisito previo de que la interacción del suero con el p-glucano de PGG para que las células se unan al p-glucano, se investigó adicionalmente la opsonización del complemento del p-glucano mediante la determinación de la interacción real entre el p-glucano y una de las principales opsoninas del complemento, iC3b, que también es un ligando del receptor CR3.

En primer lugar, los investigadores evaluaron si iC3b se puede detectar en neutrófilos y monocitos unidos a pglucano. Los resultados mostrados en la Figura 6a demuestran un aumento de la tinción de iC3b en monocitos y neutrófilos incubados con p-glucano en suero al 10 % en comparación con los niveles de tinción de iC3b en células incubadas en suero al 10 % solo sin p-glucano.

A continuación, los investigadores determinaron si el p-glucano e iC3b se colocalizan en células unidas a p-glucano mediante microscopía confocal. Los resultados presentados en la Figura 6b muestran la detección de p-glucano e iC3b en neutrófilos usando BfD IV y anticuerpo monoclonal frente a iC3b, respectivamente. Ambos fluoróforos son visualmente más brillantes en la célula tratada con p-glucano con respecto a la célula tratada con vehículo. La fusión de las imágenes de anticuerpos monoclonales de BfD IV e iC3b indica que el glucano y la proteína iC3b unidos se colocalizan en neutrófilos.

Los resultados de la microscopía confocal se corroboraron adicionalmente mediante la evaluación de la interacción física de p-glucano de PGG con iC3b de dos maneras. En primer lugar, se usó un sistema de inmunoensayo en fase sólida donde el p-glucano se inmovilizó en una fase sólida, se incubó con suero, y a continuación se detectó mediante ELISA la iC3b que fue capturado por el p-glucano. En segundo lugar, también se usó inmunoprecipitación en la que el p-glucano se inmunoprecipitó en fase fluida a partir de una mezcla de p-glucano incubado con suero, utilizando el BfD IV como anticuerpo de inmunoprecipitación, y posteriormente sometiendo la reacción inmunoprecipitada a detección por citometría de flujo de proteína iC3b coinmunoprecipitada.

Los resultados obtenidos a partir del ELISA mostraron que el aumento de iC3b detectado en los pocilios con pglucano inmovilizado en comparación con el fondo fue significativamente mayor que el aumento en los pocillos unidos a dextrano o los pocilios con p-glucano inmovilizado incubados en suero HI (Figura 6c). En los estudios de inmunoprecipitación, la proteína iC3b se capturó (pull-down) junto con el p-glucano precipitado con BfD IV, mientras que no se detectó iC3b cuando el p-glucano se inmunoprecipitó en suero HI. La ausencia de iC3b en el inmunoprecipitado de la mezcla de dextrano-suero indicaba que la interacción con iC3b era específica para pglucano de PGG (Figura 6d).

También se examinó la naturaleza de la interacción física entre p-glucano de PGG y la proteína del complemento iC3b. La metilamina se ha usado tradicionalmente para investigar la capacidad de unión covalente de las proteínas del complemento; la metilamina es una amina que se une covalentemente al sitio reactivo del tioéster de C3b e inhibe la formación de un enlace covalente entre C3b y la superficie reactiva de los patógenos (Howard JB 1980). Los investigadores plantearon la hipótesis de que iC3b interactúa covalentemente con los grupos hidroxilo del pglucano de PGG y, por lo tanto, que el tratamiento con metilamina del suero debería anular la interacción de iC3b con el p-glucano, que por último debería inhibir la unión del glucano en células inmunitarias humanas. La Figura 6e muestra la inhibición completa de la deposición de iC3b sobre el p-glucano inmovilizado incubado con suero tratado con metilamina. El suero tratado con metilamina también anuló la capacidad de p-glucano de PGG para unirse a las células en comparación con las condiciones del suero regular. Por lo tanto, estos datos proporcionan evidencias de que el p-glucano de PGG soluble se opsoniza cuando se incuba con suero formando un enlace covalente con una de las opsoninas del complemento, iC3b, y que la opsonización está implicada en la unión del p-glucano a neutrófilos y monocitos.

La ruta clásica y la ruta alternativa de activación del complemento están implicadas en la opsonización del (¡-glucano de PGG soluble

Para evaluar el papel de la ruta clásica o la ruta alternativa en la opsonización del p-glucano de PGG, los investigadores usaron la quelación diferencial de cationes divalentes que se sabe que están implicados en una o ambas rutas. Para etapas específicas en la activación del complemento se requieren cationes divalentes: ensamblaje del complejo C1 dependiente de calcio para iniciar la ruta clásica, y formación dependiente de magnesio de C3 convertasa, la enzima necesaria para amplificar la ruta alternativa (Lepow IH 1963, Gotze O 1971, Pillemer L 1954). Aunque el tratamiento del suero con EGTA bloquea completamente la activación de la ruta clásica mediante la quelación de los iones calcio, permite la activación subóptima de la ruta alternativa al provocar el agotamiento de los iones magnesio. La adición de iones magnesio en una concentración equimolar para EGTA (suero de MgEGTA) permite la activación óptima del complemento mediante la ruta alternativa mientras inhibe completamente la ruta clásica (DesPrez RM 1975).

Antes de evaluar el suero tratado con EGTA y MgEGTA en estudios de unión con p-glucano de PGG, se evaluaron los efectos del suero tratado en la ruta clásica y la ruta alternativa. Se usaron eritrocitos de oveja sensibilizados (SRBC) y factor de veneno de cobra (CVF), los activadores prototípicos de las rutas del complemento clásica y alternativa, respectivamente, para activar suero sin tratar, tratado con EGTA y tratado con MgEGTA. La formación de MAC en fase fluida (complejo sC5b-9) se evaluó usando un kit disponible en el mercado. El tratamiento del suero con EGTA bloqueó completamente la ruta clásica y la ruta alternativa hasta los niveles de fondo, mientras que en el suero tratado con MgEGTA, la ruta clásica permaneció inhibida y la ruta alternativa funcionó de manera comparable a la del suero sin tratar (Figura 7a).

A continuación se midió la deposición de iC3b en p-glucano inmovilizado y la unión a células usando los sueros sin tratar, tratados con EGTA o tratados con MgEGTA. Como se muestra en la Figura 7b, la deposición de iC3b en el pglucano unido a la placa se inhibió completamente tanto en el suero tratado con EGTA como en el tratado con MgEGTA. También se evaluó la capacidad de unión de p-glucano de PGG opsonizado previamente con suero sin tratar, tratado con EGTA o tratado con MgEGTA a células en suero HI. Dado que EGTA podría tener el potencial de bloquear los iones necesarios para la función del receptor CR3, también se evaluó la capacidad de EGTA arrastrado para bloquear la unión a células en medios con suero regular. Cualquier inhibición de la unión en suero regular por EGTA transferido desde el tratamiento previo se atribuyó a un probable bloqueo del receptor CR3. La opsonización previa de p-glucano de PGG en suero sin tratar permitió que Produjera la unión en el suero HI, mientras que el rescate de la unión disminuyó tanto en el suero tratado con EGTA como con MgEGTA. El EGTA transportado no influyó en la unión del p-glucano en células en suero regular, lo que indica que el efecto de inhibición se debió específicamente a la actividad del complemento suprimida y no se debió al bloqueo de la función de CR3.

A continuación se investigó el efecto de la ruta alternativa en el contexto de una ruta clásica intacta en la unión mediante el bloqueo específico del Factor D, una proteasa implicada en la ruta alternativa. La eficacia y especificidad de 166-32, el anticuerpo monoclonal anti-Factor D, se evaluó primero evaluando su capacidad para bloquear la ruta alternativa activada por CVF pero no la ruta clásica activada por SRBC (Figura 7c). A continuación se evaluó la unión de p-glucano de PGG a neutrófilos y monocitos usando suero tratado con anticuerpo anti-Factor D o de control de isotipo. De forma interesante, como se muestra en la Figura 7d, el bloqueo de la ruta alternativa inhibió la unión del p-glucano tanto a neutrófilos como a monocitos. Estos datos, tomados en conjunto, sugieren que la ruta clásica es esencial, y la ruta alternativa es necesaria pero no suficiente para la opsonización y la unión de PGG.

Dado que todas las formas de p-glucanos obtenidos a partir de levadura son PAMP fúngicos, comprender la interacción de los p-glucanos de levadura particulados y los p-glucanos de levadura solubles con las células inmunitarias innatas humanas es fundamental para el uso de los p-glucanos para cualquier fin terapéutico. En este estudio, se investigaron las características de unión de p-glucano de PGG soluble obtenido a partir de Saccharomyces cerevisiae, puro, y analíticamente bien caracterizado a neutrófilos y monocitos humanos. Esta investigación demostró que CR3 es el principal receptor en las células inmunitarias innatas humanas para p-glucano de PGG y que la unión de p-glucano soluble a CR3 depende del complemento.

La unión dependiente de la concentración de p-glucano en neutrófilos y en monocitos se detectó indirectamente usando BfD IV, un anticuerpo monoclonal específico para p-glucano, o directamente usando p-glucano marcado con DTAF (Figura 1). Previamente se ha demostrado que BfD IV es específico para glucanos unidos en p-(1,3) y glucanos unidos en p-(1,6) y también se ha usado para detectar p-glucano dentro de levaduras intactas vivas (Milton 2001 y Lavigne LM 2006). La concentración mínima de p-glucano detectada en las células por el sistema de detección de BfD IV es de 100 pg/ml, mientras que se detectó una concentración tan baja como 25 pg/ml mediante marcado con DTAF (Figura 1 b). A pesar de que la detección de p-glucano unido usando marcado con DTAF fue algo más sensible, el sistema de detección de BfD IV se usó para todos los estudios de unión con el fin de evitar inconsistencias en el marcado de un lote a otro. Se demostró que el p-glucano marcado con DTAF se une a las células de una manera saturable que se bloqueó mediante un exceso de p-glucano de PGG sin marcar (Figura 1c).

El papel de las proteínas del complemento en la unión de p-glucano de PGG a neutrófilos y monocitos humanos se dilucidó de varias formas diferentes. La dependencia de la unión en el contenido de suero en los medios (Figura 3a) y la inhibición de la unión en presencia de suero inactivado por calor (Figura 4a) fueron los primeros indicadores de que las proteínas lábiles al calor del suero pueden estar implicadas en la unión. La inhibición significativa de la unión de p-glucano en presencia de suero tratado con compstatina ayudó además a confirmar la participación de proteínas del complemento de suero específicas (Figura 4b). La compstatina, al unirse selectivamente a C3, puede inhibir todas las rutas de activación del complemento al inhibir la escisión de C3 mediada por convertasa C3 en su forma activada C3b, que a continuación inhibe la activación de las etapas posteriores de las rutas del complemento (Ricklin D, 2008). Estos resultados indicaron que la degradación de C3 en componentes del complemento activos era necesaria para la unión de p-glucano. La unión de PGG aumentó en función del tiempo y/o temperatura de incubación con células (Figuras 3b y 3c). El p-glucano de PGG de opsonización previa permitió que se produjera la unión en las células en suero HI a 4 °C en 10-30 minutos, que son condiciones habituales para la unión del ligando (Figura 5). También se descubrió que la propia PGG de opsonización previa dependía del tiempo y/o la temperatura del suero, lo que significa que la unión a las células aumentaba a medida que el contenido de suero, el tiempo de incubación y/o la temperatura de incubación de la mezcla de opsonización previa de PGG-suero aumentaba.

La opsonización mediada por complemento implica la deposición de fragmentos C3 en la superficie de los microorganismos. Se ha demostrado que la química real involucrada en la opsonización mediada por complemento implica un éster covalente o un enlace amido entre el grupo acilo de un sitio tioéster activo en C3b y sus productos de degradación, incluyendo iC3b, con grupos hidroxilo de carbohidratos o grupos amino de proteínas presentes en la superficie de patógenos (Law SK 1980, Gadjeva M 1998). Los fragmentos del complemento, específicamente C3b e ic3b, unidos a p-glucano se han detectado en cimosano y levadura intacta (Cain JA 1987, Boxx GM 2010, Ezkowitz RA, 1985). El p-glucano de PGG opsonizado se identificó detectando la proteína del complemento iC3b unida a una célula unida a p-glucano y/o unida al propio p-glucano usando un anticuerpo monoclonal específico para iC3b (Figuras 6a-d). La interrupción del enlace tioéster en C3 mediante el tratamiento con MA hizo que el suero fuera incapaz de permitir la deposición de iC3b en el p-glucano inmovilizado y la unión de p-glucano de PGG en las células, destacando la naturaleza covalente de la interacción entre las proteínas del complemento y los grupos hidroxilo de PGG (Figura 6e).

Se mostró que las respuestas inmunitarias inducidas por levaduras en monocitos y neutrófilos humanos se inhibieron por uno de los ligandos del dominio I de CR3, iC3b en fase fluida. Esto indicó que el bloqueo del dominio I puede bloquear estéricamente el sitio de lectina implicado en la unión de p-glucano. Se demostró que la interacción entre la levadura opsonizada y CR3 en neutrófilos humanos implicaba la unión de iC3b fijada al dominio I y la unión de pglucano al dominio de lectina de CR3. Este estudio también mostró que el bloqueo, tanto del dominio I como del dominio lectina de CR3, no inhibió significativamente la unión de la levadura opsonizada, pero consiguió inhibir las respuestas funcionales. A diferencia de la unión de p-glucano particulado opsonizado, la unión de p-glucano de polisacárido cimosano soluble de bajo peso molecular (SZP) a células que expresan fragmentos recombinantes de CR3 se inhibió significativamente en presencia de FBS al 10 % usando anticuerpos monoclonales para el dominio de lectina o el dominio I. La unión del p-glucano de SZP al fragmento CR3 que contiene el dominio de lectina no requirió heterodimerización con la cadena CD18. En el estudio de los investigadores, cuando se bloquearon tanto el dominio I como el dominio de lectina de CR3, no hubo una inhibición significativa de la unión de p-glucano opsonizado soluble a neutrófilos y/o monocitos humanos (Figura 2). Sin embargo, la inhibición máxima de la unión se consiguió de manera consistente bloqueando la cadena CD18 junto con la cadena CD11b. Estos datos reflejan la implicación de la cadena de CD18 en permitir que la cadena de CD11b logre una conformación que conduzca a la unión de cualquiera o ambos del componente iC3b y el componente p-glucano del p-glucano de PGG opsonizado.

Los resultados de los investigadores proporcionan datos que respaldan el requisito tanto de la ruta clásica como de la ruta alternativa de activación del complemento para la opsonización y la posterior unión del p-glucano soluble a células inmunitarias humanas (Figura 7). La activación de la ruta clásica por p-glucano soluble puede ser dependiente de anticuerpos o independiente de anticuerpos. Dado que la activación y amplificación de la ruta alternativa puede implicar al factor D, y dado que el factor D de bloqueo redujo eficazmente la unión del p-glucano, el p-glucano puede activar inicialmente la ruta clásica, y a continuación el C3b naciente puede introducirse en la ruta alternativa para amplificar adicionalmente la activación del complemento. Se investigó el grado de amplificación de la activación del complemento midiendo el complejo MAC en fase fluida en suero tratado con p-glucano de PGG. El pglucano de PGG soluble no activó la formación de complejos del complemento terminal, mientras que el p-glucano particulado claramente lo hizo. Estos resultados son coherentes con p-glucano de PGG unido a células o p-glucano de PGG libre que proporciona una superficie en la que se produce la activación del complemento hasta cierto punto, pero a continuación se vuelve accesible para los reguladores del complemento tales como, por ejemplo, Factor I, Factor H, CR1, o proteína reguladora del complemento de membrana que evita que la ruta de activación se complete (observaciones no publicadas). Esta observación es coherente con los hallazgos en entornos clínicos donde la administración intravenosa de p-glucanos solubles se ha asociado a pocos efectos secundarios, mientras que la administración de p-glucanos particulados puede inducir respuestas inflamatorias (Deimann W 1980, Kilgore KS 1997, Cleary JA 1999).

En resumen, el estudio de los investigadores es el primero en demostrar el papel del complemento en la unión del pglucano de levadura soluble a las células inmunitarias innatas humanas. El descubrimiento de la capacidad del p -glucano soluble de levadura para activar las rutas del complemento y opsonizarse expande el horizonte para sus actividades inmunomoduladoras, ya que el p-glucano soluble puede ser reconocido por varios receptores del complemento en el repertorio de células inmunitarias innatas y adaptativas humanas (Figura 8). Los resultados de esta investigación podrían tener implicaciones en el diseño de la investigación básica, así como en los estudios de investigación clínica, incluyendo estudios para profundizar en la comprensión del mecanismo de acción, la identificación de biomarcadores y, lo que es más importante, la aplicación clínica del p-glucano de levadura soluble en poblaciones de pacientes con deficiencia genética o con receptor CR3 o sistema del complemento defectuoso.

En la descripción precedente, se pueden describir realizaciones particulares de forma aislada para mayor claridad. A menos que se especifique expresamente de otro modo que las características de una realización En particular son incompatibles con las características de otra realización, ciertas realizaciones pueden incluir una combinación de características compatibles que se describen en el presente documento en relación con una o más realizaciones. Para cualquier método desvelado en el presente documento que incluya etapas separadas, las etapas Se pueden realizar en cualquier orden factible. Y, si fuera apropiado, cualquier combinación de dos o más etapas Se puede realizar de forma simultánea.

Como se usa en el presente documento, el término "y/o" se refiere a uno o todos los elementos enumerados o una combinación de cualesquiera dos o más de los elementos enumerados; el término "comprende" y variaciones del mismo no tiene un significado limitante cuando este término aparece en la descripción y en las reivindicaciones; a menos que se indique expresamente de otro modo, "un", "uno", "el" y "al menos uno" se usan indistintamente y se refieren a uno o más de uno; y las descripciones de intervalos numéricos mediante extremos incluyen todos los números incluidos dentro de ese intervalo (por ejemplo, de 1 a 5 incluye 1, 1,5, 2, 2,75, 3, 3,80, 4, 5, etc.).

La presente invención se ilustra mediante los siguientes ejemplos.

Ejemplos

Ejemplo 1

Material y métodos

Anticuerpos (Abs) y reactivos

IgG1 de ratón, IgG2a, Abs de control de isotipo, anti-CD3, anti-CD11a (HI111), y Ab anti-CD11b (LM2/1) se adquirieron en eBioscience (San Diego, CA). La IgG de cabra anti-ratón conjugada con Cy3, anti-CD 14, y los Abs CD15 fueron de BioLegend (San Diego, CA). Dynabeads de Ab anti-CD11b (VIM12) e IgM de rata anti-ratón fueron de Invitrogen (Camarillo, CA). Los Abs anti-CD 18 (IB4) fueron de Abcam (Cambridge, MA) y Ancell (Bayport, MN), respectivamente. El Ab anti-dectina-1 (GE2) fue de AbD Serotec (Raleigh, NC). La generación y especificidad del anticuerpo monoclonal BfD IV (clon 10C6) específico de p-1,3/1,6-glucano propiedad de Biothera se han descrito anteriormente (30). El Ab específico del factor D (fD) del complemento (166-32) fue de ATCC (Manassas, VA). Los Abs de IgM de cabra F(ab')2 anti-ratón conjugada con FITC y de IgM de cabra anti-ratón conjugada con Cy5 se adquirieron en Jackson ImmunoResearch Lab (West Grove, PA). El Ab de C3 del complemento de de cabra anti­ humano conjugado con FITC fue de MP Biomedicals (Solon, OH). El Ab anti-iC3b (neoantígeno), factor de veneno de cobra (CVF), el kit CH50 Eq EIA y el kit SC5b-9 Plus EIA fueron de Quidel (San Diego, CA). La compstatina (ICVVQDWGHHRCT (SEQ ID NO: 1)) y el péptido de control (IAVVQDWGHHRAT (SEQ ID NO: 2)) fueron de Tocris Bioscience (Bristol, Reino Unido). Dextrano, laminarina, EGTA, MgCh, metilamina, albúmina de suero humano (HSA), albúmina de suero bovino (BSA) y DAPI fueron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).

Preparación y caracterización de ¡5-giucano de PGG

El p-glucano de PGG de calidad farmacéutica, el (3-1,3/1,6 glucano soluble se fabrica como se describe en el documento de publicación de solicitud de patente de Estados Unidos N.° US2008/ 0103112 AI. La caracterización analítica de PGG incluyó espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN), espectroscopia de infrarrojos por transformada de Fourier (FTIR), cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), dispersión de luz de múltiples ángulos (MALLS) y detección del índice de refracción diferencial (DRI). Por último el p-glucano de PGG se preparó para su uso realizando un intercambio de tampón en solución salina tamponada con fosfato (PBS) usando unidades de filtración centrífuga Amicon de corte de peso molecular 3K (MWCO) (Millipore, Billerica, MA). Se prepararon dextrano y laminarina disolviendo la cantidad requerida en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS).

Para el marcado con 5-(4,6-diclorotriazinil)aminofluoresceína (DTAF) del p-glucano de PGG, se marcaron 100 moles de glucosa con aproximadamente 1 mol de fluoresceína. El grado de marcado se determinó usando un £ de 68.000 M'1 cirr1 a 494 nm M junto con la concentración de p-glucano. El marcado se realizó tratando una solución de aproximadamente 5 mg/ml de p-glucano en carbonato sódico acuoso 0,02 M con DTAF (Invitrogen, Camarillo, CA) como una solución de 5 mg/ml de DMSO en una relación de 0,1 mg de DTAF por miligramo de p-glucano durante 18 horas. Las mezclas de reacción se concentraron y a continuación se volvieron a diluir con PBS cuatro veces usando unidades de filtración centrífuga MWCO 3K. El marcador sin unir se eliminó mediante el tratamiento de soluciones de 5 mg/ml de p-glucano con etanolamina (aproximadamente 3 mg de etanolamina por mg de p-glucano) durante 18 horas seguido de cuatro intercambios de PBS adicionales (como se mencionó anteriormente). Todos los p-glucanos marcados y sin marcar se esterilizaron por filtración usando un filtro de 0,2 pm y se analizaron para detectar endotoxinas (PYROGENE de Lonza Group Ltd, Basilea, Suiza). Los niveles de endotoxina medidos fueron inferiores a 0,05 EU/ml. La concentración de hexosa de las preparaciones de p-glucano se determinó mediante el método de antrona (Bailey RW, 1958).

Aislamiento de PBMC y neutrófiios humanos

La sangre venosa heparinizada se obtuvo de individuos sanos con consentimiento informado de acuerdo con lo aprobado por la Institutional Review Board. En resumen, las PBMC se aislaron mediante centrifugación en gradiente de densidad Ficoll-Paque (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Posteriormente, los neutrófilos se enriquecieron mediante sedimentación con dextrano al 3 %, seguido de lisis hipotónica de eritrocitos residuales. La pureza y viabilidad de los neutrófilos y las PBMC obtenidas fueron coherentemente superiores a un 95 %.

Preparación de suero autóiogo humano

El suero humano se preparó de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Se añadieron 10 ml de sangre completa sin heparinizar a un tubo VACUTAINER SSTTM (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). El tubo se incubó a temperatura ambiente con rotación constante durante 30 minutos, se centrifugó a 2000 rpm (aproximadamente 1150 x g) durante 10 minutos y el suero aclarado se recogió.

Estudios de unión usando ¡5-giucano de PGG

Unión de p-glucano de PGG a diversas concentraciones

Los neutrófilos enriquecidos o PBMC se resuspendieron a 1 x 106 células/ml en RPMI 1640 suplementado con suero al 10 %. Se añadió p-glucano de PGG a concentraciones de hexosa de 100 pg/ml, 200 pg/ml, o 400 pg/ml a neutrófilos o PBMC y se incubaron en una incubadora humidificada con CO² al 5 %, a 37 °C, durante dos horas. Después de la incubación, las células se lavaron dos veces con tampón FACS (HBSS suplementado con FBS al 1 % y azida sódica al 0,1 %) para eliminar cualquier p-glucano sin unir y, posteriormente, se trataron con bloqueo de Fc (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Después de la etapa de bloqueo de Fc, las células se tiñeron con Ab de BfD IV durante 30 minutos a 4 °C y se lavaron dos veces con tampón FACS frío. A continuación, las células se incubaron con IgM de cabra anti-ratón F(ab')² conjugada con FITC durante 30 minutos a 4 °C y se lavaron una vez con tampón FACS frío antes de fijarlas con paraformaldehído al 1 %.

En los primeros experimentos de optimización, neutrófilos, monocitos y linfocitos T se identificaron mediante tinción con Abs anti-CD15, anti-CD14 o anti-CD3 marcados con fluorescencia, respectivamente. Los sucesos se recogieron en un citómetro de flujo LSRII (BD Biosciences, San Jose, CA) y el análisis se realizó usando FLOWJO (Tree Star, Ashland, OR). Para evaluar la unión de p-glucano de PGG marcado con DTAF a neutrófilos humanos, se añadieron 25 pg/ml, 100 pg/ml, o 400 pg/ml de p-glucano marcado a neutrófilos resuspendidos en RPMI/suero al 10 %, se incubó en una incubadora unificada con CO² al 5 %, a 37 °C, durante una hora, se lavó dos veces con tampón FACS frío y se fijó con paraformaldehído al 1 %. La unión a la superficie del p-glucano conjugado con DTAF se evaluó posteriormente mediante análisis de citometría de flujo. Para determinar la unión específica del receptor, se evaluó la unión de 25 pg/ml de p-glucano de PGG marcado con DTAF incubando el p-glucano marcado con las células en presencia de 10 mg/ml de p-glucano o dextrano de PGG sin marcar.

Unión de p-glucano de PGG después del bloqueo del receptor

Para los experimentos que implicaban el bloqueo del receptor CR3 o del receptor dectina-1, las células se incubaron previamente con anticuerpos de bloqueo de receptor específicos o el control de isotipo relevante a 4 °C durante 30­ 45 minutos. Se añadió p-glucano de PGG (200 pg/ml a neutrófilos y 100 pg/ml a PBMC) y se midió la unión como se ha descrito anteriormente. Para bloquear la unión a CR3, los investigadores usaron LM2/1 (un anticuerpo monoclonal IgG1 de ratón anti-humano frente al dominio I de la cadena CD11b de CR3), VIM12 (un anticuerpo anti­ humano IgG1 monoclonal de ratón frente al dominio de lectina de la cadena CD11b de CR3) e IB4 (un anticuerpo anti-humano IgG2a monoclonal de ratón frente a la cadena CD18 de CR3), cada uno usado a 10 pg/ml/1 x 106 células. Las combinaciones de anticuerpos de bloqueo de CR3 usadas fueron cualquiera de LM2/1 VIM12 para bloquear tanto el dominio I como los dominios de lectina de la subunidad CD11b o LM2/1+ VIM12 IB4 para bloquear las cadenas tanto CD11b como CD18 de CR3. HI111, el anticuerpo anti-humano IgG1 monoclonal de ratón frente a la cadena CD11a se usó a 10 pg/ml como control negativo en algunos de los experimentos de bloqueo. Para bloquear el receptor dectina-1, el clon GE2, se usó un anticuerpo anti-humano IgG1 monoclonal de ratón a 10 pg/ml (AbD Serotec, Raleigh, NC). Todos los controles de isotipo se usaron a la misma concentración que los anticuerpos el bloqueo.

Estudios de unión para determinar la dependencia del suero, el tiempo y la temperatura

Los experimentos para determinar la unión de p-glucano de PGG a 200 pg/ml para neutrófilos o a 100 pg/ml para PBMC se realizaron como se ha descrito anteriormente con los siguientes cambios. Para determinar la dependencia del suero, el p-glucano de PGG se incubó con neutrófilos o PBMC resuspendidos en RPMI 1640 que contenía suero autólogo al 2 %, 5 %, o al 10 % a 37 °C durante dos horas. Para los experimentos de la evolución temporal, el pglucano de PGG se incubó a las concentraciones indicadas con células resuspendidas en suero autólogo al 10 % a 37 °C Durante 10 minutos, 20 minutos, 60 minutos, o 120 minutos. Para los experimentos de dependencia de la temperatura, el p-glucano de PGG se incubó a las concentraciones indicadas con células resuspendidas en suero autólogo al 10 % durante dos horas a 4 °C, temperatura ambiente, o 37 °C.

Unión de p-glucano de PGG después del tratamiento previo del suero

El p-glucano de PGG a una concentración de 60-80 mg/ml se incubó con suero humano en una relación de volumen de 1:10 durante 30 minutos en un baño de agua a 37 °C. El p-glucano de PGG tratado previamente con suero se añadió a neutrófilos a 200 pg/ml o a PBMC a 100 pg/ml resuspendidos en RPM1 que contenía suero autólogo normal al 10 % o suero HI al 10 % en el tiempo y la temperatura de incubación que se han indicado. A continuación la unión se determinó como se ha descrito previamente.

Estudios de unión para determinar el papel de las proteínas del complemento en suero

Para determinar el papel de las proteínas del complemento en la unión, se realizaron experimentos como se ha descrito anteriormente, excepto por el uso de suero que contenía HI al 10 %, suero tratado con compstatina o tratado con metilamina (MA), tratado con EGTA o EGTA MgCh (MgEGTA), o bloqueado con factor D. El suero inactivado por calor (HI) se preparó incubando el suero en un baño de agua a 56 °C durante 30 minutos. Para el suero tratado con compstatina y péptido de control, se añadió compstatina o el péptido de control al suero humano a 20 pM o 100 pM y se incubó a temperatura ambiente durante 10 minutos. El tratamiento del suero con metilamina (MA) se realizó incubando el suero con 0,67 % de metilamina durante 2,5 horas a 37 °C, seguido de tres lavados con DPBS usando una unidad de filtro centrífugo Amicon con un valor de corte de 3K MW (Millipore, Billerica, MA). El suero tratado con DPBS se preparó de la misma manera y se usó como suero de control para suero tratado con MA. Para el bloqueo del factor D en el suero, 166-32 a una concentración de 20 pg/ml se incubó con suero en hielo durante 30 minutos y a continuación se usó para estudios de unión. Para los experimentos de unión en presencia de EGTA o MgEGTA, el suero se incubó con EGTA 10 mM con o sin MgCh 10 mM durante 10 minutos a temperatura ambiente. El suero sin tratar y tratado con EGTA/MgEGTA se usó a continuación para tratar previamente la PGG y realizar estudios de unión como se ha descrito anteriormente.

Tinción con iC3b en células unidas a p-glucano de PGG

La unión de p-glucano de PGG a neutrófilos y PBMC se realizó como se ha mencionado anteriormente. La deposición de iC3b en estas células se detectó mediante tinción con un Ab anti-iC3b específico de neoepítopo e IgG de cabra anti-ratón conjugada con PE y analizando mediante citometría de flujo.

ELISA para la deposición de iC3b en p-glucano de PGG inmovilizado

El p-glucano de PGG o el dextrano se inmovilizó en pocilios de una placa de poliestireno de 96 pocilios (COSTAR, Corning, Inc., Lowell, MA) secando los glucanos a 50 °C seguido de reticulación con UV. La placa recubierta de glucano se bloqueó primero con BSA al 1 % antes de la incubación con suero sin tratar o el suero se sometió a varios tratamientos como se describe en los estudios de unión, diluido a 1:2 con tampón de lavado (PBS/Tween-20 al 0,05 %) durante 30 minutos a 37 °C. Después de lavar el suero de la placa, el iC3b unido se sondeó usando el anticuerpo monoclonal anti-iC3b seguido de Ab de IgG de cabra anti-ratón marcado con biotina. La cantidad de anticuerpo marcado con biotina inmovilizado se determinó usando estreptavidina peroxidasa y solución de sustrato TMB (KPL, Gaithersburg, MD). La OD⁴⁵⁰ de cada pocillo se midió con el espectrofotómetro SpectraMAX 250 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). El factor de cambio se calculó como la OD⁴⁵⁰ de los pocilios que contenían pglucano inmovilizado dividido entre la OD⁴⁵⁰ de los pocilios que no contenían p-glucano, ambos incubados en presencia de suero tratado o sin tratar.

Inmunoprecipitación de p-glucano de PGG

Se incubó p-glucano de PGG o dextrano a una concentración de 60-80 mg/ml con suero regular o HI a una relación de volumen de 1:10 durante 30 minutos en un baño de agua a 37 °C. Se añadió Ab de BfD IV a la mezcla de suero/p-glucano y se incubó a temperatura ambiente durante un periodo adicional de 30 minutos. Las perlas magnéticas conjugadas con IgM de rata anti-ratón (DYNABEADS, Invitrogen, Camarillo, CA) se lavaron tres veces con DPBS y se incubaron con la mezcla suero-p-glucano de PGG-BfD IV durante otros 30 minutos a temperatura ambiente. Las perlas se separaron magnéticamente e iC3b capturado (pull-down) junto con PGG inmunoprecipitada Se sondeó usando Ab de complemento C3 conjugado con FITC mediante citometría de flujo.

Medición de la formación del complejo SC5b-9 en fase fluida en el suero

El kit EIA MicroVue SC5b-9 se usó para medir la activación de la ruta clásica y la ruta alternativa del complemento de acuerdo con las instrucciones del proveedor (Quidel Corp., San Diego, CA). En resumen, el suero, sin tratar o tratado, se mezcló con PBS, RBC de oveja sensibilizado con Ab (SRBC) o 20 unidades de CVF y se añadió a los pocillos de la placa recubiertos previamente con anticuerpo monoclonal anti-sC5b-9. La placa se incubó a 37 °C durante 60 minutos, seguido de cinco lavados con el tampón de lavado proporcionado. A continuación, la placa se incubó con el conjugado SC5b-9 Plus proporcionado, que contenía Ab conjugado con peroxidasa de rábano picante específico para sC5b-9 a temperatura ambiente durante 30 minutos. La placa se lavó cinco veces, se incubó con el sustrato durante 15 minutos a temperatura ambiente para iniciar la reacción enzimática y posteriormente se inactivó con la solución de parada. La OD⁴⁵⁰ se midió usando el espectrofotómetro SpectraMAX 250. La concentración de sC5b-9 en fase fluida presente en las muestras se determinó a partir de la curva estándar generada con los patrones de sC5b-9 proporcionados.

Microscopía con focal

Los neutrófilos enriquecidos, resuspendidos a 1 x 10⁶ células/ml en RPMI suplementado con suero al 20 % o suero inactivado por calor, se mezclaron con p-glucano de PGG antes de su aplicación a un cubreobjetos de vidrio de 10 mm colocado en el pocillo de una placa de 24 pocillos. La placa se incubó en una incubadora de CO² al 5 % humidificada, a 37 °C durante una hora. Las células no unidas y el p-glucano de PGG se eliminaron lavando con PBS calentado, y las células unidas se fijaron posteriormente en paraformaldehído al 1 % a temperatura ambiente durante 15 minutos. Las células se bloquearon con un agente de bloqueo de FCR antes de la tinción con BFD IV y anticuerpo monoclonal anti-iC3b durante 30 minutos a 4 °C, seguido de los anticuerpos de tinción secundarios, IgM de cabra anti-ratón conjugada con Cy5 con e IgG de cabra anti-ratón conjugada con Cy3 a 4 °C durante 30 minutos. Las células se permeabilizaron con TritonX-100 enfriado en hielo al 0,1 % durante tres minutos en hielo, se tiñeron con DAPI en hielo durante cinco minutos antes de montarlas en los portaobjetos. Las imágenes se analizaron y Se adquirieron con el microscopio confocal invertido FluoView 1000 IX2 de Olympus. Las imágenes se ajustaron igualmente en Adobe Photoshop (Adobe Systems Inc., San Jose, CA).

Ejemplo 2

La sangre periférica heparinizada se obtuvo de voluntarios sanos y los neutrófilos se aislaron mediante centrifugación en gradiente de densidad con Ficoll-Paque seguido de sedimentación con dextrosa al 3 %. Los eritrocitos residuales se eliminaron mediante lisis hipotónica. Los neutrófilos se resuspendieron a 200.000 células/ml en RPMI con suero autólogo al 3 %. Imprime PPG; 3,3 mg/ml y control de PBS se mezclaron con el suero autólogo en una relación de 1:1 y se colocaron en un baño de agua a 37 °C durante 30 minutos. Después de la incubación, Imprime PGG se diluyó en RPMI para conseguir concentraciones de 200 pg/ml con una concentración final de suero de Un 3 %. El control de PBS se diluyó de manera similar. Se añadieron 31 pl de Imprime PGG o control de PBS diluido a tres pocillos en el fondo de las placas de quimiotaxis (Neuro Probe, Inc., Gaithersburg, MD). Los quimioatrayentes, C5a e IL-8 a 50 ng/ml sirvieron como controles positivos (datos no mostrados). La membrana de quimiotaxis de 8 pm se aplicó a la placa y se añadieron 6 x 10³ neutrófilos en un volumen de 30 pl sobre cada pocillo que contenía quimioatrayentes. La placa se colocó en una incubadora a 37 °C durante una hora, se sometió a lisis con 10 pl de CELLTITEROGLO (Promega Corp., Madison, WI) y la lectura de la luminiscencia se hizo en un lector de placas M5 (Molecular Devices, Inc., Sunnyvale, CA). El aumento de la migración con respecto al medio de control se calculó dividiendo las RLU (unidades de luminiscencia relativa) para los grupos de tratamiento con respecto a la migración a los medios (quimioquinesis). Los resultados se muestran en la Figura 9.

A menos que se indique de otro modo, todos los números que expresan cantidades de componentes, pesos moleculares, etc., usados en la memoria descriptiva y las reivindicaciones se deben entender como modificados en todos los casos por el término "aproximadamente". Por lo tanto, a menos que se indique de otro modo, los parámetros numéricos establecidos en la memoria descriptiva y las reivindicaciones son aproximaciones que pueden variar dependiendo de las propiedades deseadas que se pretenden obtener mediante la presente invención. Como mínimo, cada parámetro numérico debería interpretarse al menos teniendo en cuenta el número de dígitos significativos informados y aplicando técnicas de redondeo habituales.

A pesar de que los intervalos numéricos y los parámetros que establecen el amplio alcance de la invención son aproximaciones, los valores numéricos establecidos en los ejemplos específicos se informan con la mayor precisión posible. Sin embargo, todos los valores numéricos contienen inherentemente un intervalo que resulta necesariamente de la desviación estándar encontrada en sus respectivas mediciones de ensayo.

Todos los títulos son para que sean provechosos para el lector.

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Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende:

p-glucano soluble de PGG opsonizado aislado que comprende una opsonina acoplada covalentemente al p-glucano; en donde el p-glucano se obtiene a partir de levadura.

2. La composición de la reivindicación 1 en donde la opsonina comprende C3, C3a, C3b, iC3b, C3bB, C3bBb, C3d, C3dg, C4, C5, C5a, C5b, C6, C7, C8, C9, o cualquier combinación de dos o más de las mismas.

3. La composición de la reivindicación 1 o 2 en donde la opsonina está acoplada covalentemente al p-glucano mediante un conector de conjugación.

4. La composición de cualquier reivindicación precedente que además comprende un agente activo acoplado al pglucano soluble de PGG opsonizado; opcionalmente, en donde el agente activo comprende una quimioquina, un anticuerpo específico de tumor, un anticuerpo que puede aumentar la opsonización de un p-glucano soluble, un agonista de receptor de tipo Toll (TLR), un inmunomodulador, un anticuerpo anti-linfocitos B, un antígeno viral, un antígeno tumoral, un agente citotóxico, un agente inmunosupresor, o un fármaco quimioterapéutico.

5. Un método que comprende:

poner en contacto p-glucano soluble acoplado a un agente activo con una composición en condiciones eficaces para que al menos un componente de la composición opsonice el p-glucano soluble acoplado al agente activo, formando de ese modo una mezcla de opsonización, en donde la composición comprende suficientes componentes del sistema del complemento para opsonizar el p-glucano soluble acoplado al agente activo, en donde el p-glucano se obtiene a partir de levadura; y

en donde el agente activo comprende una quimioquina, un anticuerpo específico de tumor, un anticuerpo que puede aumentar la opsonización de un p-glucano soluble, un agonista de receptor de tipo Toll (TLR), un inmunomodulador, un anticuerpo anti-linfocitos B, un antígeno viral, un antígeno tumoral, un agente citotóxico, un agente inmunosupresor o un fármaco quimioterapéutico.

6. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 o el método de la reivindicación 5 en donde la composición comprende suero.

7. El método de la reivindicación 5 o la reivindicación 6 en donde las condiciones comprenden incubar la composición y el p-glucano soluble acoplado al agente activo juntos a una temperatura de aproximadamente 25 °C a aproximadamente 45 °C.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 5-7 en donde las condiciones comprenden incubar la composición y el p-glucano soluble acoplado al agente activo juntos durante al menos 15 minutos.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 5-8 en donde las condiciones comprenden proporcionar no más de 1,25 pg de 3-glucano por 1 pl de composición; opcionalmente, en donde las condiciones comprenden proporcionar un exceso de volumen de al menos 10 veces de la composición en comparación con el volumen de pglucano.

10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 5-9 que además comprende aislar al menos una parte del pglucano soluble opsonizado de la mezcla de opsonización.

11. Un p-glucano soluble opsonizado para su uso para aumentar al menos uno de los siguientes:

(1) la unión del 3-glucano soluble opsonizado a linfocitos B, monocitos, o neutrófilos;

(2) la migración de los neutrófilos hacia el p-glucano soluble opsonizado; y

(3) la función inmunomoduladora del individuo;

en donde el p-glucano opsonizado comprende un agente activo acoplado al p-glucano soluble opsonizado, y/o en donde el p-glucano está acoplado covalentemente a la opsonina;

en donde el p-glucano soluble opsonizado se administra a un individuo en una cantidad eficaz para aumentar al menos uno de (1)-(3) en comparación con el p-glucano sin opsonizar;

en donde el p-glucano se obtiene a partir de levadura; y

en donde el agente activo comprende una quimioquina, un anticuerpo específico de tumor, un anticuerpo que puede aumentar la opsonización de un p-glucano soluble, un agonista de receptor de tipo Toll (TLR), un inmunomodulador, un anticuerpo anti-linfocitos B, un antígeno viral, un antígeno tumoral, un agente citotóxico, un agente inmunosupresor o un fármaco quimioterapéutico.

12. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 o el método de una cualquiera de la reivindicaciones 5-10 o el p-glucano soluble opsonizado para su uso de acuerdo con la reivindicación 11 en donde la levadura comprende Saccharomyces cerevisiae, y/o en donde el p-glucano soluble comprende (3(1,6)-[poli-1,3)-D-glucopiranosil]-poli-p(1,3)-D-glucopiranosa.

13. Una composición que comprende:

p-glucano soluble opsonizado aislado; y

un agente activo acoplado al p-glucano soluble opsonizado; en donde el agente activo comprende una quimioquina, un anticuerpo específico de tumor, un anticuerpo que puede mejorar la opsonización de un pglucano soluble, un agonista de receptor de tipo Toll (TLR), un inmunomodulador, un anticuerpo anti-linfocitos B, un antígeno viral, un antígeno tumoral, un agente citotóxico, un agente inmunosupresor, o un fármaco quimioterapéutico; y en donde el p-glucano se obtiene a partir de levadura.