ES2870776T3

ES2870776T3 - Prevención y tratamiento de daños o enfermedades de los huesos y cartílagos

Info

Publication number: ES2870776T3
Application number: ES18703531T
Authority: ES
Inventors: Åkerlund Evy Lundgren; Christina Uvebrant; Jan Talts
Original assignee: Xintela AB
Current assignee: Xintela AB
Priority date: 2017-01-27
Filing date: 2018-01-29
Publication date: 2021-10-27
Anticipated expiration: 2038-01-29
Also published as: EP3919064A1; EP3573630A1; DK3573630T3; LT3573630T; US20200038449A1; US11517593B2; JP2020505916A; KR20190107686A; MX388960B; IL266772A; EP3573630B1; MX2019008872A; PL3573630T3; BR112019013508A2; JP7210829B2; CN110234329A; SG11201904535VA; CA3050099C; PT3573630T; AU2018211504B2

Abstract

Una población de células madre mesenquimatosas (CMM) enriquecida con integrina α10alta para su uso en la prevención y/o tratamiento de la esclerosis ósea subcondral, las lesiones articulares traumáticas y/o las artrosis; o para promover o inducir la cicatrización de fracturas, don</span>de al menos el 60 % de las células de la población de CMM expresan la subunidad α10 de la integrina, donde las</span> CMM son negativas para MHCII y negativas para CD45, y donde dichas CMM se seleccionan de entre el grupo que consiste en una célula madre mesenquimatosa, una célula progenitora mesenquimatosa y una célula estromal mesenquimatosa.

Description

DESCRIPCIÓN

Prevención y tratamiento de daños o enfermedades de los huesos y cartílagos

Campo técnico

La presente descripción se refiere a composiciones para su uso en la prevención y/o el tratamiento de trastornos que impliquen enfermedades o daños en cartílagos y huesos de mamíferos, usando células madre mesenquimatosas aisladas con anticuerpos antiintegrina a10.

Antecedentes

El cartílago articular es altamente propenso a la lesión y la degeneración patológica. Una vez dañado, el cartílago articular generalmente no se cura o solo se cura parcialmente bajo ciertas condiciones biológicas. El daño conduce a una mayor degradación del cartílago, y los productos de degradación del cartílago inician la inflamación, lo que resulta en una mayor degradación del cartílago que a su vez impulsa la inflamación, lo que crea un círculo vicioso1. Existe un vínculo bien conocido entre los primeros traumatismos del cartílago, por ejemplo, por lesiones deportivas, y el desarrollo posterior de osteoartritis (OA)2.

La terapia celular es un procedimiento prometedor para la regeneración de tejidos. Una serie de estudios en animales y humanos han demostrado seguridad y eficacia para el tratamiento de distintas enfermedades, incluido el daño del cartílago, usando células estromales mesenquimatosas multipotentes (CMM)67. Se cree que los efectos terapéuticos de las CMM son multifactoriales. Las CMM pueden diferenciarse directamente en el tipo celular específico del tejido a regenerar, pero también modificar el microambiente al producir matriz extracelular, citocinas y factores de crecimiento, reclutar y estimular células madre endógenas y tener efectos inmunosupresores8. El trasplante de CMM para la reparación y regeneración del cartílago es, por tanto, una estrategia prometedora dado el potencial de estas células para diferenciarse en condrocitos6. Normalmente, las preparaciones de células madre son mezclas complejas de tipos celulares o células con distintas capacidades de diferenciación. Debido a su plasticidad y gran potencial de diferenciación, es importante que los estudios preclínicos y clínicos se realicen con células bien definidas. La caracterización de las CMM mediante biomarcadores de calidad controlada es crucial para una buena eficacia, pero también para el uso seguro de las células como agentes terapéuticos. La sociedad internacional de terapia celular propuso que los fenotipos celulares de adherencia plástica, potencial de diferenciación trilinaje, así como la expresión o ausencia de los marcadores de superficie CD73, CD90, CD105 respectivos CD45, CD34, Cd 14 o CD11b, CD79a o CD19, HLA-DR sean criterios mínimos para que las células humanas se definan como CMM9.

En los pacientes veterinarios, actualmente se utilizan tres estrategias basadas en las CMM para el tratamiento de lesiones en tendones, ligamentos o de cartílago/articulación en caballos y perros10. Los tres tipos celulares utilizados son: una población de células expandida en cultivo derivada del aspirado de médula ósea (MO) (la mayoría de los estudios clínicos han utilizado esta población de células), una población de células mixtas concentrada derivada del aspirado de MO y una población de células nucleadas mixtas derivadas del tejido adiposo (TA). Los tres tipos celulares pueden ser de origen autólogo (propio) o alogénico (donante). Ninguno de ellos ha sido muy bien definido.

A fin de mejorar la reparación del cartílago con CMM, se cree que son importantes dos variables para obtener resultados satisfactorios; la calidad y el número de CMM a inyectar y el procedimiento de administración. Ahora es evidente que las células seleccionadas por la sociedad internacional por criterios de terapia celular, aún son una población heterogénea. Una solución al problema de la calidad de CMM podría ser el uso de una población definida de CMM con expresión de marcadores de potencia candidatos específicos11.

La integrina alfa10 beta1 (a10p1) se identificó originalmente como un receptor de unión de colágeno tipo II en condrocitos y se ha demostrado que tiene un papel fundamental en el desarrollo esquelético12. Se expresa abundantemente en condrocitos y está presente en una subpoblación de CMM humanas. Los anticuerpos que se dirigen a la integrina a10p1 se pueden usar para identificar, diferenciar y aislar las CMM de una población celular mixta (véase WO03/106492 y WO 2007/099337). El cultivo extendido de condrocitos o el tratamiento con factor de crecimiento transformante (TGF) p1 conduce a la desdiferenciación acompañada de una disminución en el nivel de integrina a10 específica de condrocitos. Por el contrario, la administración de proteína morfogenética ósea (BMP)-2 al medio de cultivo estabiliza el fenotipo condrogénico e induce altos niveles de expresión de la integrina a1013. En cultivo en suspensión, la formación de agregados de condrocitos con matriz pericelular distinta requiere interacción a10p1 integrina-colágeno tipo II14. Además, se ha demostrado que la expresión de la integrina a10p1 se correlaciona con la mejora del potencial de diferenciación condrogénica de las CMM derivadas de MO humana15.

Se sabe que la lesión articular aumenta sustancialmente el riesgo de osteoartritis (OA), un fenómeno denominado osteoartritis postraumática (OAPT). Sin embargo, no hay tratamientos preventivos o modificadores de la enfermedad disponibles para el tratamiento de OA u OAPT, y los tratamientos actuales alivian los síntomas sin prevenir la aparición de la enfermedad y/o la progresión o empeoramiento de la enfermedad. Por tanto, existe una necesidad sustancial de medios para prevenir el desarrollo de OA después de una lesión o traumatismo.

Resumen

Los presentes inventores han demostrado por primera vez in vivo que las poblaciones de CMM enriquecidas con integrina a10 administradas a los mamíferos que sufren lesiones óseas o cartilaginosas se pueden utilizar para prevenir y tratar los trastornos asociados con las mismos o derivados de ellas.

Por lo tanto, en un aspecto, la presente descripción está dirigida a una población de CMM enriquecida con integrina a10alta para su uso en un procedimiento de prevención o tratamiento de la esclerosis ósea subcondral, las lesiones articulares traumáticas y/o discopatía degenerativa; o para promover o inducir la cicatrización de fracturas, donde al menos el 60 % de las células de la población de CMM expresan la subunidad de la integrina a10, donde las CMM son negativas para MHCII y negativas para CD45, y donde dicha CMM se selecciona de entre el grupo que consiste en una célula madre mesenquimatosa, una célula progenitora mesenquimatosa y una célula estromal mesenquimatosa.

Un aspecto adicional de la presente descripción está dirigido a una población de CMM enriquecida con integrina a10alta para promover o inducir la cicatrización de fracturas, donde al menos el 60 % de las células de la población de CMM expresan la subunidad integrina a10, donde las CMM son MHCII negativas y CD45 negativas, y donde dicha CMM se selecciona de entre el grupo que consiste en una célula madre mesenquimatosa, una célula progenitora mesenquimatosa y una célula estromal mesenquimatosa.

Un aspecto de la presente descripción está dirigido al uso de una población de CMM enriquecida con integrina a10alta donde al menos el 60 % de las células de la población de CMM expresan la subunidad de la integrina a10, donde las CMM son MHCII negativas y CD45 negativas, y donde dicha CMM se selecciona de entre el grupo que consiste en una célula madre mesenquimatosa, una célula progenitora mesenquimatosa y una célula estromal mesenquimatosa, para la preparación de un medicamento para la prevención o el tratamiento de la esclerosis ósea subcondral, las lesiones articulares traumáticas y/o discopatía degenerativa.

Un aspecto adicional de la presente descripción está dirigido a un procedimiento para tratar y/o prevenir esclerosis ósea subcondral, las lesiones articulares traumáticas y/o discopatía degenerativa en un sujeto que comprende la administración de una población de CMM enriquecida con integrina a10 alta a una sujeto en riesgo de, o que padece, esclerosis ósea subcondral, donde al menos el 60 % de las células de la población de CMM expresan la subunidad de la integrina a10, donde las CMM son MHCII negativas y CD45 negativas, y donde dicha CMM se selecciona de entre el grupo que consiste en una célula madre mesenquimatosa, una célula progenitora mesenquimatosa y una célula estromal mesenquimatosa, de modo que traten y/o prevengan la esclerosis ósea subcondral y/o el daño osteocondral.

Un aspecto de la presente descripción está dirigido a un procedimiento de fabricación de una población de CMM enriquecida con integrina a10alta como se describe en esta invención, donde el procedimiento comprende:

a. aislar una población de células madre de tejido adiposo, médula ósea, membrana sinovial, sangre del cordón, gelatina de Wharton o líquido amniótico;

b. cultivar las células aisladas en un recipiente de cultivo de plástico;

c. descartar las células no adheridas;

d. inducir la expresión de integrina a10 mediante la adición de medio de cultivo, donde el medio de cultivo es un medio sin suero o un medio que comprende suero de mamífero, y donde el medio de cultivo comprende lisado plaquetario;

e. seleccionar las células que expresen integrina a10, y

f. expandir las células seleccionadas, lo que produce una población de CMM enriquecida con integrina a10alta.

Descripción de los dibujos

La figura 1 proporciona perfiles típicos de FACS de células estromales mesenquimatosas (CMM) derivadas de médula ósea (MO) y tejido adiposo (TA). Las células se marcaron con anticuerpos que reconocen los marcadores de superficie celular CD44, CD45, CD90, CD105 y MHC de clase II. El panel izquierdo muestra CMM derivadas de MO y el panel derecho muestra CMM derivadas de TA. Se muestran las células marcadas con anticuerpo y las células de control negativo (no marcadas con anticuerpo).

Las figuras 2A-B muestran perfiles de expresión típicos de la integrina a10p1 en CMM equinas cultivadas derivadas de MO (A) y TA (B). La intensidad de marcado de integrina a10 se representó frente a la dispersión lateral. Ambos tipos de CMM expresaron integrina a10p1, pero una mayor proporción de CMM derivadas de MO fueron positivas para la expresión de integrina a10.

Las figuras 3A-B muestran CMM derivadas de TA clasificadas en dos poblaciones de células distintas mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACSAria) usando un mAb antiintegrina a10 específico. La intensidad de marcado de integrina a10 se representó frente a la dispersión lateral. Las CMM seleccionadas como integrina a10alta se indican con color azul (a la derecha) y las CMM seleccionadas como integrina a10baja se indican con color amarillo (a la izquierda) (A). Posteriormente, se permitió que las células seleccionadas como integrina a10alta se adhirieran al plástico y se tiñeron con un anticuerpo dirigido contra la integrina a10. Los núcleos celulares se tiñeron con DAPI (B).

Las figuras 4A-D muestran el análisis inmunohistoquímico de cultivos en masa de sedimento hechos en criosecciones de AT-CMM sin clasificar y clasificadas (integrina a10alta o integrina a10baja). Las criosecciones de cinco experimentos de diferenciación se marcaron con anticuerpos de colágeno anti-tipo II y se cuantificó la reacción de color inmunohistoquímica utilizando el software ImageJ 1.50i (A). Los patrones y niveles de expresión de colágeno tipo II típicos se muestran para criosecciones de regiones centrales de cultivos en masa de sedimento utilizando células no clasificadas (B), células clasificadas de integrina a10alta (C) o células clasificadas de integrina a10baja (D). El etiquetado de colágeno tipo II mostró un etiquetado intermedio del colágeno tipo II en el sedimento sin clasificar y un marcado considerable del colágeno tipo II en el sedimento clasificado de integrina a10alta, mientras que el colágeno tipo II fue menor en el sedimento de integrina a10baja, lo que indica un efecto positivo de la integrina a10 sobre la diferenciación.

La figura 5 muestra el análisis de expresión génica de cultivos en masa de el sedimento hechos con ARN de AT-CMM sin clasificar y clasificadas (integrina a10alta o integrina a10baja). Se usó GAPDH como control endógeno y se usaron células no clasificadas como muestra de referencia para el cálculo de AACt. Los resultados muestran una menor expresión de colágeno de tipo I y una mayor expresión de colágeno tipo II y agrecano en el sedimento de integrina a10alta en comparación con el sedimento de integrina a10baja, lo que indica una mejor diferenciación condrogénica en el sedimento de las células clasificadas de integrina a10alta. Las barras muestran la media ± DE.

La figura 6A-D muestra la capacidad de localización de células no clasificadas y clasificadas con integrina a10 al cartílago intacto o dañado. Las células que expresan niveles más altos de integrina a10 (células a10alta) son mejores para dirigirse a la región de interés para la reparación del cartílago. Las barras representan media ± DS.

La figura 7 muestra que la puntuación del componente de esclerosis ósea subcondral en las extremidades de control a los 6 meses fue considerablemente más alta que la de las extremidades tratadas a los 6 meses y considerablemente más alta que la del grupo tratado o control a las 6 semanas y al inicio del estudio (0 días). Las barras representan la media ± DE. Los grupos que no comparten una letra común son considerablemente distintos entre sí en p < 0,05.

La figura 8 muestra que los niveles de prostaglandina E2 (PGE-2) fueron mayores en las extremidades tratadas en comparación con las extremidades de control en los momentos del 9/11 y considerablemente mayores en las extremidades tratadas a los 28 días del posoperatorio en comparación con las extremidades de control en el momento 0, 4, 42, 56, 126 y 154 días. Los datos se presentan como media ± DE. Los grupos que no comparten una letra común son considerablemente distintos en p < 0,05.

La figura 9 muestra que los niveles de propéptido C de procolágeno II (CPII), que indican una mayor síntesis de colágeno tipo II, fueron más altos en las extremidades tratadas en comparación con las de control en varios puntos de tiempo y considerablemente mayores en las extremidades tratadas y de control a los 7 y 14 días en comparación con el momento 0 y al final del estudio (día 154). Los datos se presentan como media ± DE. Los grupos que no comparten una letra común son considerablemente distintos en p < 0,05.

La figura 10 muestra los resultados del ELISA C2C. El ELISA C2C mide el neoepítopo en el extremo C-terminal del péptido 3/4 que se genera mediante la escisión del colágeno tipo II por las colagenasas. Tanto en los grupos tratados como en los de control, C2C aumentó considerablemente desde la cirugía de impacto hasta el día 14, y a continuación disminuyó a lo largo del estudio a valores no distintos del momento 0. Los datos se presentan como media ± DE. Los grupos que no comparten una letra común son considerablemente distintos en p < 0,05.

Las figuras 11A-B muestran la histología de las secciones osteocondrales. Se prepararon articulaciones talocrurales (corvejones) para histología y las secciones se tiñeron con safranina-O / verde rápido (A). Se pudieron observar niveles normales de proteoglicanos en áreas no impactadas del cartílago tanto en el tratamiento como en las extremidades de control. En las áreas impactadas, se pudieron observar diferencias en el contenido de proteoglicanos y la organización de los condrocitos en algunos caballos. Las secciones adyacentes se marcaron con anticuerpos dirigidos contra el colágeno tipo II (B). Se pudieron observar niveles normales de colágeno tipo II en áreas no impactadas del cartílago tanto en el tratamiento como en las extremidades de control. En las áreas impactadas se pudieron observar diferencias en el contenido de colágeno tipo II y el patrón de expresión en algunos caballos.

La figura 12 muestra que la fibrilación del cartílago fue considerablemente menor (mejor) en las extremidades tratadas al final del estudio (6 meses) en comparación con las extremidades de control. Las barras representan la media ± DE, p < 0,039, prueba de la t para datos emparejados, unilateral.

La figura 13 muestra la tinción con tinta china. Postmortem, se aplicó tinta china a la superficie articular y se obtuvieron fotografías digitales. La tinta china contiene partículas de carbón y se adhiere a la zona de la superficie articular donde la integridad del cartílago se ve comprometida. Las flechas señalan las zonas de impacto donde la adhesión de la tinta china puede verse como una mancha negra en el cartílago dañado. Se adhirió más tinta china a las superficies del cartílago de las extremidades de control que a las superficies del cartílago de las extremidades del tratamiento, lo que indica un efecto beneficioso del tratamiento.

La figura 14 muestra un ensayo de inmunosupresión que muestra que las CMM seleccionadas de integrina a10 equina aisladas de tejido adiposo tienen una capacidad inmunomoduladora en las células T, demostrada como una disminución en la proliferación de linfocitos con proporciones crecientes de CMM a CMSP. El mayor efecto inmunosupresor se generó en una proporción de una CMM a una CMSP.

Descripción detallada

La invención se define por las reivindicaciones adjuntas. Cualquier realización que no se encuentre dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas no forma parte de la invención.

Definiciones

«Anticuerpo antiintegrina a10» o «anticuerpo antisubunidad de integrina a10» se utiliza en esta invención de forma intercambiable para referirse a un anticuerpo capaz de reconocer y unirse a al menos la subunidad de integrina a10 de la proteína heterodimérica integrina a10p1 . Estos anticuerpos pueden ser anticuerpos que reconocen un epítopo de la proteína heterodimérica integrina a10p1, donde el epítopo comprende residuos de aminoácidos tanto de la subunidad de integrina a10 como de la subunidad de integrina p1.

El término «rotura», como se usa en esta invención en relación con una lesión o daño óseo, se refiere a una fractura ósea, que es un trastorno médico donde hay un daño en la continuidad del hueso. Una rotura puede ser el resultado de un impacto de alta fuerza o estrés, pero también de una lesión por traumatismo mínimo como resultado de ciertos trastornos médicos que debilitan los huesos, como la osteoporosis, el cáncer de huesos o la osteogénesis imperfecta, donde la rotura o fractura también puede llamarse fractura patológica.

El término «hematoma» como se usa en esta invención en relación con una lesión o daño óseo se refiere a una lesión por traumatismo en un tejido fibroso de un hueso que es menos grave que una fractura ósea. Un hematoma óseo puede provocarlo una lesión por traumatismo en un hueso o articulación, así como una artritis. El término «identificar» como se usa en esta invención se refiere a la acción de reconocer una célula como un cierto tipo celular, por ejemplo, una CMM o un condrocito. Un término alternativo a la identificación es «detectar», que se utiliza en esta invención con el mismo significado.

«Integrina a10» o «integrina alfa-10» como se usa en esta invención, se refiere a la subunidad a10 de la proteína heterodimérica integrina a10p1. Esta denotación no excluye la presencia de la subunidad de la integrina p1 unida a la subunidad de la integrina a10, lo que forma la estructura cuaternaria del heterodímero de la integrina a10p1. La secuencia de la cadena de la integrina a10 humana es conocida y está disponible públicamente en GenBank™/EBI Data Bank, número de acceso AF074015 y se ha descrito en Camper et al J. Bio. chem. 273:20383-20389 (1998).

El término «desviación de un hueso», como se usa en esta invención, se refiere a un desplazamiento de un hueso fuera de la línea en relación con las articulaciones.

Los términos «aislar», «clasificar» y «seleccionar» como se usan en esta invención se refieren a la acción de identificar una célula como un cierto tipo celular y separarla de las células que no pertenecen al mismo tipo celular o pertenecen a otro estado de diferenciación. Normalmente, el aislamiento se refiere a una primera etapa de separación, mientras que la «selección» es más específica y, por ejemplo, se realiza con la ayuda de un anticuerpo.

«Células madre mesenquimatosas» o «CMM» tal como se utiliza en esta invención se refiere a células estromales multipotentes como se define por el Comité de células madre tisulares y mesenquimatosas de la Sociedad Internacional de Terapia Celular (véase Dominici M et al., Cytotherapy. 8(4):3l5-7 (2006)). Las CMM deberán ser adherentes al plástico cuando se mantenga en condiciones de cultivo estándar, y deberán expresar CD105, CD73 y CD90, y carecer de expresión de moléculas de superficie CD45, CD34, CD14 o CD11b, CD79alpha o CD19 y HLA-DR. Las CMM deberán tener la capacidad de diferenciarse en osteoblastos, adipocitos o condroblastos in vitro.

«Osteoartritis» u «OA», como se usa en esta invención, se refiere a una enfermedad articular caracterizada por la rotura del cartílago articular. La OA también puede denominarse artritis por desgaste, artrosis y artropatía degenerativa. Los síntomas de la OA incluyen hinchazón de las articulaciones, dolor y disminución del intervalo de movimiento. Las articulaciones comúnmente afectadas por la OA incluyen la mano, el dedo gordo del pie, la muñeca, el cuello, la espalda, la rodilla y la cadera. En la OA, el cartílago puede volverse rígido y perder su elasticidad, o el cartílago puede desgastarse en algunas áreas. En casos avanzados de OA, los huesos de una articulación pueden rozarse entre sí a medida que se pierde el cartílago de la superficie de la articulación.

«Artritis postlesión», «artritis postraumática» o «OAPT», como se usa en esta invención, se refiere a OA provocada por una lesión, daño o traumatismo anterior. Este trastorno puede producirse en cualquier articulación. La lesión puede dañar el cartílago y/o el hueso de una articulación y esto puede hacer que el cartílago se desgaste más rápidamente. Condiciones como lesiones continuas o exceso de peso corporal pueden provocar o acelerar el desarrollo de OAPT.

El término «lesión deportiva» como se define en esta invención se refiere a una lesión que se produce durante el ejercicio. Las lesiones deportivas pueden ser tanto de naturaleza traumática como debido al uso excesivo y al estrés repetitivo.

El término «esguince» como se usa en esta invención en relación con una lesión o daño óseo se refiere a un estiramiento y/o desgarro de un ligamento. Un esguince generalmente se produce por una lesión que tensiona una articulación y estira demasiado o incluso rompe los ligamentos de soporte, por ejemplo, una torsión.

El término «desgarro» como se usa en esta invención en relación con una lesión o daño óseo se refiere a la ruptura de una o más de las tiras de fibrocartílago de una articulación. El desgarro puede ser el resultado de una lesión traumática, como un giro, pero también de tensiones leves y prolongadas, en cuyo caso también se puede llamar desgarro degenerativo. Los desgarros también se conocen como roturas de ligamentos.

«Tratar» o «tratamiento», como se usa en esta invención, incluye cualquier administración o aplicación de un agente terapéutico para las enfermedades, trastornos y afecciones descritos en el sujeto, e incluye inhibir la progresión de la enfermedad, ralentizar la enfermedad o su progresión, detener su desarrollo, aliviar parcial o totalmente la enfermedad y aliviar parcial o totalmente uno o más síntomas de una enfermedad.

«Prevenir» o «prevención», como se usa en esta invención, incluye retrasar o detener la aparición de una enfermedad, trastorno o afección.

Composiciones

La descripción comprende células madre mesenquimatosas (CMM) aisladas de poblaciones de células mixtas con anticuerpos antiintegrina a10. Pueden administrarse cantidades terapéuticamente efectivas de CMM aisladas para tratar enfermedades/trastornos como la osteoartritis, daño del cartílago que incluya fisuras y la esclerosis ósea subcondral.

La descripción comprende una población de CMM enriquecida con a10alta, donde las células son inducidas a expresar la subunidad a10 de la integrina y donde la población de CMM enriquecida con a10alta es una población donde el porcentaje de CMM que expresan una subunidad a10 de integrina es al menos 60 % de las células de la población.

En algunas realizaciones de la presente descripción, al menos el 65 %, tal como al menos el 70 %, tal como al menos el 75 %, tal como al menos el 80 %, tal como al menos el 85 %, tal como al menos el 90 %, tal como al menos el 95 %, tal como al menos el 98 %, tal como al menos el 99 %, tal como al menos el 100 % de las células totales comprendidas en la población de CMM enriquecida con a10alta expresa la subunidad a10 de la integrina.

En algunas realizaciones de la presente descripción, se induce a las células de la población de CMM para que expresen la subunidad a10 de la integrina.

En algunas realizaciones de la presente descripción, la integrina a10 se expresa como un heterodímero en combinación con una subunidad p1 de la integrina.

En algunas realizaciones de la presente descripción, la población de CMM se deriva de tejido adiposo, médula ósea, membrana sinovial, sangre periférica, sangre de cordón umbilical, gelatina de Wharton o líquido amniótico. Preferentemente, en algunas realizaciones de la presente descripción, la población de CMM se deriva de tejido adiposo. Preferentemente, en algunas realizaciones de la presente descripción, la población de CMM se deriva de tejido médula ósea.

En algunos casos de la presente descripción, la población de CMM enriquecida con a10alta se cultiva en una placa de cultivo de plástico y se indujo a expresar la integrina a10.

En algunas realizaciones de la presente descripción, las células se cultivan en un medio de cultivo que comprende suero de mamífero y FGF-2. En algunas realizaciones de la presente descripción, las células se cultivan en un medio de cultivo que comprende lisado plaquetario. El término «componentes de lisado plaquetario» se refiere a una composición que comprende solo algunos de los elementos que se encuentran habitualmente en el lisado plaquetario. Por ejemplo, el factor de crecimiento específico puede seleccionarse o deseleccionarse. En algunas realizaciones de la presente descripción, las células se cultivan en un medio de cultivo que comprende FGF-2 y lisado plaquetario. En algunas realizaciones de la presente descripción, las células se cultivan en un medio de cultivo que comprende suero de mamífero y lisado plaquetario. En algunas realizaciones de la presente descripción, las células se cultivan en un medio de cultivo que comprende TGFp. En algunas realizaciones de la presente descripción, las células se cultivan en un medio de cultivo sin suero. En algunas realizaciones de la presente descripción, las células se cultivan en un medio de cultivo sin suero que comprende lisado plaquetario. En algunas realizaciones de la presente descripción, las células se cultivan en un medio de cultivo sin suero que comprende factores de crecimiento, por ejemplo, FGF-2 y/o TGFp. En algunas realizaciones de la presente descripción, las células se cultivan en un medio de cultivo que comprende suero de mamífero, y el suero de mamífero es suero bovino fetal. Los ejemplos de medios de cultivo en esta invención anteriores son todos adecuados para inducir a las células a expresar la integrina a10. Sin embargo, existen otros medios de cultivo adecuados para inducir a las células a expresar integrina a10 y son conocidos por el experto en la materia.

En algunas realizaciones de la presente descripción, la población de CMM enriquecida con a10alta es un cultivo de células in vitro.

En algunas realizaciones de la presente descripción, las células se cultivan en un medio de cultivo que además comprende ácido ascórbico.

En algunas realizaciones de la presente descripción, las células se almacenan en un medio de cultivo que además comprende dimetilsulfóxido (DMSO). El DMSo puede estar presente en el medio de cultivo con fines de almacenamiento en un volumen comprendido entre el 0 y el 12% del volumen de cultivo total, preferentemente al menos el 1 %, tal como al menos el 2 %, por ejemplo, al menos el 3 %, preferentemente al menos el 4 % , tal como al menos el 5 %, por ejemplo, al menos el 6 %, preferentemente al menos el 7 %, tal como al menos el 8 %, por ejemplo, al menos el 9 %, preferentemente al menos el 10 % del volumen total de cultivo. El DMSO es beneficioso para el almacenamiento de células porque facilita la congelación y descongelación del cultivo celular para que las células puedan administrarse directamente al sujeto que lo necesite después de la descongelación. El DMSo también se puede eliminar después de la descongelación mediante el lavado de las células.

En algunas realizaciones de la presente descripción, el DMSO facilita la acción preventiva o de tratamiento de las CMM al reducir la hinchazón, la inflamación y el edema de los tejidos blandos secundarios a un traumatismo agudo, aumenta el flujo sanguíneo y promueve la dilatación vascular. En algunas realizaciones de la presente descripción, esta comprende una CMM que expresa integrina a10, CD44, CD90 y CD105, y carece de MHCII y CD45.

En algunas realizaciones de la presente descripción, la población de CMM se deriva de CMM fetales, neonatales, juveniles o adultas y/o células progenitoras.

En algunas realizaciones de la presente descripción, la descripción comprende un cultivo celular in vitro que comprende CMM indiferenciadas que expresan una subunidad a10 de integrina.

En algunas realizaciones de la presente descripción, las células se derivan de tejido adiposo o de médula ósea. En algunas realizaciones de la presente descripción, las células del cultivo tienen la capacidad de diferenciarse en condrocitos. En algunas realizaciones, el cultivo celular comprende al menos el 1 %, al menos un 2 %, al menos un 3 %, al menos un 4 %, al menos un 5 %, al menos un 6 %, al menos un 7 %, al menos un 8 %, al menos un 9 %, al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 % o al menos un 90 % de condrocitos después de la diferenciación. En algunas realizaciones de la presente descripción, las células se dividen en un medio de cultivo que contiene suero y al menos un factor de crecimiento inductor de la proliferación. En algunas realizaciones de la presente descripción, las células del cultivo se diferencian en condrocitos tras la retirada tanto del suero como del factor de crecimiento inductor de la proliferación. En algunas realizaciones de la presente descripción, el al menos un factor de crecimiento que induce la proliferación se selecciona de entre un grupo que consiste en factor de crecimiento de fibroblastos (FGF)-2 o lisado plaquetario o combinaciones de los mismos.

En algunas realizaciones de la presente descripción, la descripción comprende una población de CMM en una placa de cultivo, donde las células han o previamente han tenido contacto con medios que contienen un ingrediente que induce la expresión de la integrina a10, y donde el porcentaje de integrina a10 de las células positivas comprenden al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 % o al menos el 95 % del total de células. El porcentaje de células positivas para integrina a10 comprendidas en la población de CMM enriquecida con a10alta comprende al menos el 60 %, al menos el 65 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 % , al menos el 95 %, al menos el 98 % o el 100 % del total de células.

En algunas realizaciones de la presente descripción, la descripción comprende CMM en un cultivo en suspensión, donde las células expresan una subunidad a10 de integrina o un polipéptido de integrina a10.

En algunas realizaciones de la presente descripción, las células en suspensión se forman sustancialmente en agregados celulares. Por ejemplo, los agregados pueden estar en forma de microesferas o esferoides. En algunas realizaciones de la presente descripción, los agregados celulares se mantienen en un medio de cultivo que contiene un factor de crecimiento inductor de la proliferación.

En algunas realizaciones de la presente descripción, la población de CMM enriquecida con a10alta expresa además al menos uno de entre CD44, CD90 o CD105. En algunas realizaciones de la presente descripción, la población de CMM enriquecida con a10alta expresa además tanto CD44 como CD90 y/o CD105. En algunas realizaciones de la presente descripción, la población de CMM enriquecida con a10alta no expresa MHCII o CD45.

En algunas realizaciones de la presente descripción, las células en el cultivo son humanas, murinas, caninas o equinas.

En algunas realizaciones de la presente descripción, las células del cultivo son humanas. En algunas realizaciones de la presente descripción, las células del cultivo son equinas. En algunas realizaciones de la presente descripción, las células del cultivo son caninas.

En algunas realizaciones de la presente descripción, las células de la población de CMM enriquecida con a10alta se seleccionan de entre el grupo que consiste de una célula madre mesenquimatosa, una célula progenitoras mesenquimatosas, y una célula estromal mesenquimatosa.

En algunas realizaciones de la presente descripción, las células de la población de CMM enriquecida con a10alta derivan de CMM adultas humanas o juveniles, neonatales, o fetales humanas.

Según la presente descripción, las CMM se cultivan para expandirse en número e inducir la expresión de la integrina a10.

En algunas realizaciones de la presente descripción, las CMM se adhieren a la placa de cultivo de plástico. En algunas realizaciones de la presente descripción, se descartan las células que no se adhieran.

En algunas realizaciones de la presente descripción se induce la expresión de la integrina a10 mediante la adición de medios definidos. En algunas realizaciones de la presente descripción, este medio definido es DMEM suplementado con suero bovino fetal y FGF-2 o DMEM suplementado con lisado plaquetario. En algunas realizaciones de la presente descripción la población de CMM enriquecida con a10alta se cultiva en un medio de cultivo que comprende DMEM/F12, PRIME-XV®CMM Expansion SFM o STEMMACS.

En algunas realizaciones de la presente descripción, las células que expresan la integrina a10 se aíslan con un anticuerpo antiintegrina a10. Por ejemplo, el anticuerpo antiintegrina a10 puede ser un anticuerpo monoclonal. En algunas realizaciones de la presente descripción, el anticuerpo se produce inmunizando ratones con un polipéptido de integrina a10 humana. En algunas realizaciones de la presente descripción, se descartan las células que no expresen la integrina a10.

En algunas realizaciones de la presente descripción, el cultivo celular in vitro enriquecido con CMM que expresan integrina a10 o las CMM que expresan integrina a10 aisladas del cultivo celular in vitro se congelan y almacenan en viales de plástico cerrados hechos de, por ejemplo, copolímero de olefina cíclica (COC) o cualquier material equivalente. Antes de la administración a un sujeto que lo necesite, las células congeladas se descongelan y se pueden administrar sin tratamiento adicional o después del lavado.

En algunas realizaciones de la presente descripción, la población de CMM se formula en un agregado celular antes de la administración, normalmente incluso antes de la congelación. El agregado celular puede tener la forma de un esferoide o de una microesfera. Es ventajoso administrar las células en forma agregada porque tendrán una mejor capacidad de asentamiento e imitarán mejor al cartílago.

En algunas realizaciones de la presente descripción, el cultivo celular in vitro enriquecido con CMM que expresan integrina a10 o las CMM que expresan integrina a10 aisladas del cultivo celular in vitro se utilizan como un medicamento de terapia celular somática o como un producto artificial de tejido.

Procedimientos de tratamiento

La presente descripción proporciona procedimientos para prevenir y/o tratar la esclerosis ósea subcondral y/o daños osteocondrales que comprenden administrar al sujeto que lo necesite una población de CMM enriquecida con a10alta. La presente descripción proporciona procedimientos para prevenir y/o tratar la artrosis, lesiones articulares traumáticas y/o discopatías degenerativas que comprenden administrar al sujeto que lo necesite una población de CMM enriquecida con a10alta.

En algunas realizaciones de la presente descripción, la artrosis se selecciona de entre un grupo que consiste en esclerosis ósea subcondral, osteopatía subcondral, degeneración del cartílago, osteoartritis postraumática, artritis inflamatoria y deformación y/o malformación congénita del aparato locomotor.

En algunas realizaciones de la presente descripción, la lesión articular traumática comprende lesiones deportivas. En algunas realizaciones de la presente descripción, la lesión articular traumática se selecciona de entre un grupo que consiste en daño osteocondral, daño tendinoso, daño ligamentoso y daño muscular.

En algunas realizaciones de la presente descripción, el daño osteocondral comprende daño del cartílago articular y/o daño óseo.

En algunas realizaciones de la presente descripción, los procedimientos de la presente descripción pueden usarse para el tratamiento o la prevención de la artritis.

La población de CMM enriquecida con a10alta utilizada en los procedimientos dados a conocer en esta invención se describe en detalle en la sección anterior «composiciones».

Una de las ventajas de los procedimientos descritos en esta invención es que la población de CMM enriquecida con a10alta, gracias a la expresión de la integrina a10, puede efectivamente como alta adherencia y puede unirse fácilmente al cartílago o hueso dañados.

En algunas realizaciones de la presente descripción, los procedimientos de prevención de la esclerosis ósea subcondral y/o daño osteocondral, como se describe en esta invención, comprenden administrar las CMM inducidas para expresar la integrina a10 poco después de que se haya producido una lesión en una articulación, por ejemplo, el misma día o en un plazo de una semana, de dos semanas, de tres semanas, de un mes, de dos meses, de 3 meses o de menos de un año desde el día de la lesión. Las CMM administradas pueden, por ejemplo, reparar el daño inicial en el hueso y el cartílago, lo que previene o reduce el desarrollo de la esclerosis ósea subcondral y la degradación progresiva del cartílago, que de otro modo podría convertirse en osteoartritis. De hecho, como trastorno articular degenerativo progresivo, la osteoartritis se caracteriza por daño del cartílago, cambios en el hueso subcondral, formación de osteofitos, debilidad muscular e inflamación del tejido sinovial y del tendón. Aunque la osteoartritis se ha considerado durante mucho tiempo como un trastorno primario del cartílago articular, el hueso subcondral está atrayendo cada vez más atención. Se informa habitualmente de que desempeña una función vital en la patogenia de la osteoartritis. La esclerosis ósea subcondral, junto con la degradación progresiva del cartílago se considera ampliamente como un sello distintivo de la osteoartritis (Guangyi Li, Jimin Yin, Junjie Gao, Tak S Cheng, Nathan J Pavlos, Changqing Zhang, and Ming H Zheng; Subchondral bone in osteoarthritis: insight into risk factors and microstructural changes; Arthritis Res Ther. 2013; 15(6): 223; y Castañeda S, Roman-Blas JA, Largo R, Herrero-Beaumont G; Subchondral bone as a key target for osteoarthritis treatment; Biochem Pharmacol. 2012 Feb 1;83(3):315-23). Además, las lesiones osteocondrales o la osteocondritis desecante pueden aparecer en cualquier articulación, pero son más frecuentes en la rodilla y el tobillo. Tales lesiones son un desgarro o fractura en el cartílago que cubre uno de los huesos de una articulación. El cartílago puede romperse, aplastarse o dañarse y, en casos raros, se puede formar un quiste en el mismo. La presente descripción proporciona procedimientos para tratar la esclerosis ósea subcondral, por lo que pueden usarse los mismos procedimientos para prevenir satisfactoriamente la aparición de osteoartritis.

En algunas realizaciones de la presente descripción, los procedimientos de tratamiento de la esclerosis ósea subcondral y/o daño osteocondral como se describe en esta invención comprenden la administración de las células CMM inducidas para expresar integrina a10 a un sujeto diagnosticado con esclerosis ósea subcondral y/o daño osteocondral. Las células CMM administradas inducidas para expresar integrina a10 pueden reducir un engrosamiento en la capa subcondral de una articulación y/o reducir un aumento de la densidad ósea en una articulación, lo que trata la esclerosis ósea subcondral y/o el daño osteocondral.

Un «daño o lesión osteocondral» como se usa en esta invención es una lesión en la superficie lisa en el extremo de los huesos, llamada cartílago articular (condro), y también en el hueso (osteo) debajo de él. El grado de lesión varía desde una pequeña grieta hasta la rotura de un trozo de hueso dentro de la articulación. Estos fragmentos pueden ser de muchos tamaños y profundidades y pueden permanecer adheridos (estables) al área lesionada o aflojarse (inestables) dentro de la articulación. Esta lesión es más común en adolescentes y adultos jóvenes y generalmente ocurre en la rodilla, el tobillo o el codo. En particular, los sitios reconocidos de defectos osteocondrales son: cóndilo femoral (el más común); cabeza humeral; astrágalo y cóndilo humeral. Es un término que abarca la osteocondritis disecante y se usa como sinónimo de daño o lesión osteocondral.

En algunas realizaciones de la presente descripción, los procedimientos comprende el tratamiento de la osteoartritis en un sujeto que comprende la administración de una población de CMM enriquecida con a10alta o una CMM que se ha aislado de una población de CMM usando un anticuerpo antiintegrina a10 en un sujeto que padece, o tiene riesgo de padecer, osteoartritis, lo que trata la osteoartritis.

En algunas realizaciones de la presente descripción, los procedimientos comprenden retrasar o impedir la progresión de la osteoartritis en un sujeto, que comprenden la administración de una población de CMM enriquecida con a10alta que se ha aislado de una población de CMM usando un anticuerpo antiintegrina a10 en un sujeto que padece osteoartritis, donde la progresión de la osteoartritis se retrasa en comparación con un control al que no se le administra la CMM.

En algunas realizaciones de la presente descripción, el procedimiento comprende el tratamiento de esclerosis ósea subcondral que comprende administrar una población de CMM enriquecida con a10alta o una CMM aislada que se ha aislado de una población de CMM usando un anticuerpo antiintegrina a10, por lo que se trata la esclerosis ósea subcondral.

En algunas realizaciones de la presente descripción, el tratamiento de la esclerosis ósea subcondral comprende prevenir o revertir el aumento de la formación de hueso alrededor de una articulación. En algunas realizaciones de la presente descripción, el tratamiento de la esclerosis ósea subcondral comprende impedir o disminuir un engrosamiento en la capa subcondral de una articulación o impedir o disminuir un aumento de la densidad ósea de una articulación.

En algunas realizaciones de la presente descripción, los procedimientos comprenden el tratamiento de una artrosis y osteopatía degenerativa que comprende administrar una población de CMM enriquecida con a10alta o una CMM aislada que se ha aislado de una población de CMM usando un anticuerpo antiintegrina a10, lo que trata una artrosis y osteopatía degenerativa.

En algunas realizaciones de la presente descripción, el procedimiento comprenden la prevención de una artrosis y osteopatía degenerativa que comprende administrar una población de CMM enriquecida con a10alta o una CMM aislada que se ha aislado de una población de CMM usando un anticuerpo antiintegrina a10, lo que previene una artrosis y osteopatía degenerativa.

En algunas realizaciones de la presente descripción, la esclerosis ósea subcondral o el daño osteocondral es una artrosis o una malformación congénita y/o una deformación del aparato locomotor.

En algunas realizaciones de la presente descripción, la esclerosis ósea subcondral o daño osteocondral es una artrosis seleccionada de entre un grupo que consiste en osteoartritis, artritis inflamatoria, discopatía degenerativa, lesiones deportivas, lesiones articulares por traumatismo.

En algunas realizaciones de la presente descripción, el procedimiento comprende el tratamiento de una lesión deportiva que comprende administrar una población de CMM enriquecida con a10alta o una CMM aislada que se ha aislado de una población de CMM usando un anticuerpo antiintegrina a10, por lo que se trata una lesión deportiva.

En algunas realizaciones de la presente descripción, el procedimiento comprende el tratamiento de una osteoartritis postraumática (OAPT) que comprende administrar una población de CMM enriquecida con a10alta o una CMM aislada que se ha aislado de una población de CMM usando un anticuerpo antiintegrina a10, por lo que se trata una OAPT.

En algunas realizaciones de la presente descripción, la administración de las composiciones de CMM descritas en esta invención da como resultado una mayor producción de colágeno en el lugar de administración. En algunas realizaciones de la presente descripción, la administración de la composición da como resultado un aumento de la síntesis de colágeno tipo II. En algunas realizaciones de la presente descripción, el aumento de la síntesis de colágeno tipo II se mide usando un ensayo ProCollagen II C-Propeptide Assay que mide el carboxipropéptido liberado en la formación de colágeno y, por lo tanto, refleja cambios en la velocidad de síntesis de colágeno tipo II. CPII tendió a ser mayor en el líquido sinovial de las extremidades tratadas en comparación con las extremidades de control. En algunas realizaciones de la presente descripción, la administración de la composición da como resultado un aumento de la producción de proteoglicanos y/o lubricina.

En algunas realizaciones de la presente descripción, un procedimiento de tratamiento de fisuras del cartílago en un sujeto comprende administrar una población de CMM enriquecida con a10alta o una CMM que se haya aislado de una población de CMM usando un anticuerpo antiintegrina a10, lo que trata la fisura del cartílago. En algunas realizaciones de la presente descripción, la fisura del cartílago comprende la fibrilación del cartílago. En algunas realizaciones de la presente descripción, la fisura del cartílago está en el cartílago articular o en el cartílago en el extremo de los huesos. En algunas realizaciones de la presente descripción, la fisura del cartílago se produce cuando hay una escisión dentro de las capas de cartílago que provoca una separación entre las capas. La fisura del cartílago puede ser un daño osteocondral, una lesión o daño del cartílago.

En algunas realizaciones de la presente descripción, el tratamiento de la fisura del cartílago comprende una reducción del daño estructural en la zona de la lesión. En algunas realizaciones de la presente descripción, el tratamiento de la fisura del cartílago comprende prevenir el daño del cartílago.

En algunas realizaciones de la presente descripción, las CMM se administran en la forma de agregados de células. En algunas realizaciones de la presente descripción, las CMM se administran como un gránulo. Los expertos en la materia conocen los medios para administrar las CMM como gránulos (véase Bartz et al J. Transl Med. 14:317 (2016)). En algunas realizaciones de la presente descripción, las CMM se pueden administrar después de la diferenciación a condrocitos como esferoides o como implantes de condrocitos asociados a la matriz. Estas formas de administración dan como resultado una asentamiento más fácil de las células al sitio dañado.

En algunas realizaciones de la presente descripción, la población de CMM enriquecida con a10alta se administra como una suspensión celular. Se administran cantidades farmacéuticamente eficaces de CMM. Las CMM se pueden administrar junto con un excipiente farmacéuticamente aceptable.

En algunas realizaciones de la presente descripción, la población de CMM enriquecida con a10alta se administra a un sujeto que padece, o ha padecido, daño osteocondral, daño del cartílago o una lesión en una articulación o hueso. En algunas realizaciones de la presente descripción, el daño osteocondral, el daño del cartílago o la lesión es una rotura, esguince, hematoma o desgarro. Por ejemplo, el daño puede ser una fisura del cartílago o una fibrilación del ligamento. En algunas realizaciones de la presente descripción, el daño osteocondral, el daño del cartílago o la lesión es una microfractura del cartílago. En algunas realizaciones de la presente descripción, el daño osteocondral, el daño del cartílago o la lesión es un defecto condral. En algunas realizaciones de la presente descripción, el daño osteocondral, el daño del cartílago o la lesión es el resultado de llevar una prótesis. Por ejemplo, el daño osteocondral, el daño del cartílago o la lesión articular se produce en un músculo, tendón, hueso, ligamento, cartílago o menisco.

En algunas realizaciones de la presente descripción, la población de CMM enriquecida con a10alta se administra a un sujeto que padece desviación ósea.

La población de CMM enriquecida con a10alta se puede administrar después de una lesión para prevenir la aparición de la enfermedad. La población de CMM enriquecida con a10alta se puede administrar después de una lesión durante una reparación quirúrgica de la articulación lesionada y/o el sitio del hueso. En alguna realización de la presente descripción, la población de CMM enriquecida con a10alta se administra al mismo tiempo que se fija un hueso después de una rotura, por ejemplo, cuando se repara un hueso fracturado.

En algunas realizaciones de la presente descripción, la población de CMM enriquecida con a10alta tiene efecto antiinflamatorio. No obstante, la población de CMM enriquecida con a10alta se puede administrar al mismo tiempo, antes o después de la administración de otro tratamiento, tal como, por ejemplo, un agente antiinflamatorio.

En alguna realización de la presente descripción, la población de CMM enriquecida con a10alta se puede administrar en una cavidad de la articulación. La población de CMM enriquecida con a10alta se puede administrar mediante inyección.

En alguna realización de la presente descripción, la población de CMM enriquecida con a10alta se administra a un sujeto, donde el sujeto es un humano, caballo, potro, buey, burro, mula, camélido, gato, perro, cerdo o vaca. En una realización preferida de la presente descripción, el sujeto es humano. En otra realización preferida de la presente descripción, el sujeto es un caballo. En realizaciones preferidas adicionales de la presente descripción, el sujeto es un perro.

En algunas realizaciones de la presente descripción, la población de CMM enriquecida con a10alta es alogénica o autóloga. En alguna realización de la presente descripción, la población de CMM enriquecida con a10alta y el sujeto son de la misma especie o género. En alguna realización de la presente descripción, la población de CMM enriquecida con a10altay el sujeto son de distinta especie o género.

En algunas realizaciones de la presente descripción, el cultivo celular in vitro enriquecido con CMM que expresan integrina a10 o las CMM que expresan integrina a10 aisladas del cultivo celular in vitro se administran como un medicamento de terapia celular somática o como un producto artificial de tejido.

Procedimientos de fabricación

Un aspecto de la presente descripción se refiere a un procedimiento de fabricación de la población de CMM enriquecida con integrina a10alta como se describe en esta invención, donde el procedimiento comprende:

b. cultivar las células aisladas en un recipiente de cultivo de plástico;

c. descartar las células no adheridas;

e. seleccionar las células que expresen integrina a10, y

En algunas realizaciones de la presente descripción, las células durante la inducción de la expresión de integrina a10 se cultivan en un medio de cultivo como se describe en la sección anterior «Composición».

En algunas realizaciones de la presente descripción, las células que expresan la integrina a10 se seleccionan en la etapa e. usando un anticuerpo antiintegrina a10, como se describe anteriormente en esta invención.

En algunas realizaciones de la presente descripción, la población de CMM enriquecida con a10alta obtenida se como se describe en la sección anterior «Composición».

En algunas realizaciones de la presente descripción, las células se cultivan en medios que no comprenden suero de mamífero. Por ejemplo, en algunas realizaciones de la presente descripción, las células se cultivan en un medio que comprende o consiste en lisado plaquetario.

Ejemplos

Los ejemplos que no se encuentren dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas no forman parte de la invención.

Ejemplo 1. Caracterización de CMM equinas

Se aislaron CMM equinas de médula ósea (MO) y tejido adiposo (TA). Los aspirados de MO y el tejido adiposo cervical se obtuvieron de cadáveres equinos sanos con el permiso de la Junta de Agricultura de Suecia.

Los aspirados de MO se lavaron en solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se sembraron en matraces de cultivo celular para la adherencia plástica en medio de cultivo DMEM-F12 (Gibco) complementado con suero bovino fetal al 10 % (FBS) (Biological Industries), 50 pg/l de factor de crecimiento de fibroblastos (FGF)-2 (Miltenyi) y 100 U/ml de antibiótico-antimicótico (Gibco) y se incubaron a 37 °C en una incubadora humidificada con 4 % de O2 y 5 % de CO2. Después de 24 h, se descartaron las células no adherentes y se añadió más medio de cultivo. Aproximadamente al 80 % de confluencia, las células se pasaron usando Accutase (Gibco) y se volvieron a sembrar para expansión a una densidad de 104 células/cm2 en medio de cultivo DMEM F-12 con un contenido de un 5 % de lisado plaquetario (LP) humanas de Cook Regentec, 50 pg/l de FGF-2 y antibiótico-antimicótico.

El TA del cuello equino se trituró asépticamente en trozos más pequeños y se lavó antes de la digestión con colagenasa tipo 1 al 0,1 % (Sigma-Aldrich) a 37 °C con agitación suave durante 1,5 h. Las muestras se centrifugaron durante 5 min a 300xg, después de lo cual se aspiraron la capa de adipocitos y el sobrenadante de colagenasa. La fracción vascular del estroma restante se lavó con medio DMEm F-12, se filtró a través de un colador de células de 100 pm y se sembró en matraces de cultivo celular que contenían DMEM F-12 suplementado con FBS al 10 % y antibiótico-antimicótico a una densidad de placa de aproximadamente 35 ml de tejido adiposo por 200 cm2. Las células se incubaron a 37 °C en una incubadora humidificada con un 4 % de O2 y un 5 % de CO2 y después de 24 h las células no adherentes se descartaron y se agregaron medios de cultivo que contenían DMEM F-12, un 5 % de LP y antibióticoantimicótico. El medio se reemplazó cada 2-3 días y las células se recogieron al 80 % de confluencia usando Accutase y se volvieron a sembrar para la expansión a una densidad celular de 5000 células/cm2 en medio de cultivo DMEM F-12 con un contenido de un 5 % de LP, 50 pg/l de FGF-2 y antibiótico-antimicótico.

En cada pase, las CMM se inmunofenotiparon mediante análisis de citometría de flujo utilizando un panel de marcadores de superficie celular: integrina a10p1 (Xintela), CD90 (BD Pharmingen), CD44, CD105, CD45 y MHC de clase II (AdB Serotec ). En resumen, se lavaron 100.000 células en PBS suplementado con FBS al 1 % y acida sódica al 0,1 % seguido de incubación con anticuerpo selectivo. Después de la incubación, las células se lavaron dos veces en tampón y se adquirieron usando un citómetro de flujo BD Accuri C6. Se adquirieron y analizaron al menos 20.000 células. Los resultados se expresan como porcentaje de células positivas.

Las células se cultivaron en condiciones de hipoxia con LP y FGF-2. Las CMM a menudo se propagan de forma rutinaria en un medio que contiene FGF-2 para preservar un fenotipo similar al de las células madre. Sin embargo, FGF-2 regula al alza m Hc II en CMM en cultivo21. Por lo tanto, los cultivos se suplementaron inicialmente solo con LP. Las CMM aisladas de MO o TA y cultivadas en medios que contienen lisado plaquetario mostraron buenas características de crecimiento con tiempos de duplicación de 1,9 días (46 horas) y 1,6 días (38 horas) respectivamente. Tanto las células derivadas de TA como las de Mo mostraron una morfología típica de las CMM.

Las células se controlaron continuamente para determinar la expresión de la integrina a10, CD44, CD45, CD90 y CD105 mediante citometría de flujo. Las c Mm expresaron altos niveles de los marcadores CD44, CD90 y CD105 y carecían del marcador de células hematopoyéticas CD45 y MHC de clase II (HLA-DR) (figura 1).

En el caso de CMM humanas, los fenotipos celulares adherencia al plástico y expresión de los marcadores de superficie CD73, CD90, y CD105, así como ausencia de moléculas de superficie CD45, CD34, CD14 o CD11b, CD79a o CD19 y HLA-DR cumplen con el criterio de antígeno de superficie mínimo para la definición de CMM9. Debido a la falta de anticuerpos validados que reaccionen con marcadores de superficie de células equinas, no se evaluó la expresión de CD73, CD34, CD14 o CD11b, CD79a o CD19. Sin embargo, tanto las células derivadas de TA como las de MO se adhirieron al plástico, expresaron los marcadores de CMM evaluados, no expresaron CD45 o MHC de clase II y se diferenciaron en condrocitos.

Conclusión: las células derivadas de TA y MO que expresan integrina a10 se adhirieron al plástico, expresaron los marcadores CMM evaluados (CD44, CD90 y CD105), no expresaron CD45 o MHC clase Ii y se diferenciaron en condrocitos.

Ejemplo 2. Diferenciación de CMM en condrocitos

Según la bibliografía, las CMM equinas tienen dificultades para diferenciarse en condrocitos 16'18. Sin embargo, los estudios con CMM de TA humano muestran que esto podría deberse a la falta de receptores de TGFp y, por lo tanto, a la falta de respuesta a la señal de inducción condrogénica TGFp19. Esta deficiencia puede superarse mediante la adición de MOP-6, que estimulará la expresión del receptor de TGFp en CMM derivadas de TA humano20. La expresión de integrina a10 está regulada positivamente en las CMM humanas tratadas con FGF-2 con un potencial de diferenciación condrogénica mejorada posterior15. Se cebaron las CMM derivadas de TA equino para la diferenciación condrogénica en cultivo de células normales en medio de cultivo que contenía suero bovino fetal y en un medio de cultivo que contenía FGF-2. La diferenciación condrogénica también se comparó mediante la expresión de colágeno tipo II en cultivos en masa de sedimento después de 28 días de incubación en medios que no contenían factores de crecimiento añadidos, TGFp3 solo o TGFp3 y MOP-6 en dos concentraciones distintas. Para la comparación se utilizó la diferenciación condrogénica de las CMM derivadas de MO equina.

Las CMM derivadas de TA equino se cultivaron y expandieron hasta el pase 3 antes de someterlas a clasificación de células activadas por fluorescencia de integrina a10 mediante FACSAria (BD). Las células se tiñeron usando un antiintegrina a10 monoclonal (Xintela) y las células vivas se clasificaron en dos poblaciones: células positivas para integrina a10 y negativas para integrina a10. La discriminación de células vivas/muertas se acompañó de tinción con 7-AAD (BioLegend). Las células clasificadas se lavaron en medio de cultivo y se volvieron a sembrar para su recuperación y la expansión de un pase antes de que se realizaran los experimentos de diferenciación condrogénica.

Para determinar la capacidad de diferenciación condrogénica de las células no clasificadas y clasificadas con integrina a10, se sedimentaron 200.000 CMM de la etapa 4 de TA en tubos de polipropileno de 15 ml con medio condrogénico que consiste en DMEM con 4,5 g de glucosa/l (Gibco) suplementado con 20 pg/l de TGFp3, 20 pg/l de MOP-6, 50 mg/l de ácido L-ascórbico-2-fosfato, 1 % de insulina-transferrina-selenio (ITS) y 100 nM de dexametasona (Sigma Aldrich). Se probaron varias concentraciones de factor de crecimiento y combinaciones de estos para optimizar las condiciones de diferenciación condrogénica de CMM derivadas de TA equino. El medio se cambió tres veces por semana y generalmente se mantuvo durante 28 días o como se indica en el estudio del tiempo condrogénico. Los sedimentos se incrustaron en un compuesto de temperatura de corte óptima (HistoLab) para criosección o se congelaron rápidamente y se almacenaron a -80 °C para la extracción de ARN. Se utilizaron cultivos en masa de sedimento condrogénico no inducido como controles negativos en las tinciones de inmunohistología posteriores y en los experimentos de PCR.

Los sedimentos se crioseccionaron y se tiñeron con Azul Alcian para la detección de proteoglicanos o se sometieron a análisis inmunohistoquímico usando anticuerpos dirigidos a la proteína colágeno tipo II específica del cartílago (Ab3092, Abcam) e integrina a10 (Xintela).

Conclusión: las CMM equinas derivadas de TA y MO se diferencian en condrocitos.

Ejemplo 3. Los niveles de expresión de integrina a10 se correlacionan con el potencial de diferenciación condrogénica

Se examinó la expresión de la integrina a10p1 en las CMM equinas derivadas de TA y MO. Las CMM derivadas de TA equino se cultivaron y expandieron hasta el pase 3 antes de someterlas a clasificación de células activadas por fluorescencia de integrina a10 mediante FACSAria (BD). Las células se tiñeron usando un antiintegrina al0p1 monoclonal (Xintela) y las células vivas se clasificaron en dos poblaciones: células positivas para integrina a10 y negativas para integrina a10. La discriminación de células vivas/muertas se acompañó de tinción con 7-AAD (BioLegend). Las células clasificadas se lavaron en medio de cultivo y se volvieron a sembrar para su recuperación y la expansión de un pase antes de que se realizaran los experimentos de diferenciación condrogénica.

El análisis de citometría de flujo de la expresión de la integrina a10 reveló que la expresión de la integrina a10 era considerablemente mayor en las CMM derivadas de MO que en las CMM derivadas de TA. Casi el 100 % de las CMM derivadas de MO eran positivas para la integrina a10, en comparación con aproximadamente el 30 % de las CMM derivadas de TA (figura 2A-B).

Para examinar la importancia de la integrina a10 en la diferenciación condrogénica, las CMM derivadas de TA se clasificaron en dos poblaciones celulares distintas mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACSAria) utilizando anticuerpos monoclonales específicos (mAbs) (figura 3A). Todas las CMM con integrina a10alta expresaron integrina a10p1 y la expresión se localizó en la superficie celular como se muestra mediante tinción por inmunofluorescencia (figura 3B). Las dos poblaciones de células, enriquecidas con integrina a10 (a10alta) y con reducción de a10 (a10baja), a continuación se expandieron y se usaron en cultivos en masa de sedimento, donde se compararon con células no clasificadas. Se utilizaron células de cuatro donantes equinos. Las células clasificadas se transfirieron a cultivos en masa de sedimento, se diferenciaron durante 28 días, se seccionaron y se analizaron por inmunohistoquímica. El análisis inmunohistoquímico de las criosecciones de sedimento mostró un marcado considerable de colágeno tipo II en el sedimento preparado con células con integrina a10alta, mientras que el colágeno tipo II fue menor en el sedimento con integrina a10baja (figuras 4A-D).

El análisis de la expresión génica de los cultivos en masa de sedimento se realizó con ARN de CMM no clasificadas y clasificadas ((a10alta) o (a10baja)) derivadas de TA. Se usó GAPDH como control endógeno y se usaron células no clasificadas como muestra de referencia para el cálculo de AACt. El ARN total se extrajo mediante homogeneización de sedimentos en QIAzol usando perlas del kit de lisado Precellys y «homogeneizador» seguido de aislamiento de ARN según el kit RNeasy Lipid Tissue Mini Kit (QIAGEN). El ARN se transcribió de forma inversa en ADNc usando un kit SuperScript VILO (Invitrogen). La PCR en tiempo real se realizó utilizando ensayos TaqMan para las transcripciones de genes equinos siguientes: a Ca N, COL1A1, c Ol2A1, GAPDH, RUNX2 y SOX9 junto con TaqMan Universal Master Mix II según el protocolo en un dispositivo StepOne Plus Real Time PCR System (Applied Biosystems). La expresión relativa de ARNm se calculó utilizando el procedimiento 2-ññCt, donde GAPDH era el control endógeno (ACt) y se normalizó hacia células no clasificadas (AACt).

Conclusión: Los resultados de la expresión génica muestran una mayor expresión de colágeno de tipo II y agrecano en el sedimento de integrina a10alta en comparación con el sedimento de integrina a10baja, lo que indica una mejor diferenciación condrogénica en el sedimento de las células clasificadas de integrina a10alta (figura 5).

Ejemplo 4. Los niveles de expresión de integrina a10 se correlacionan con el potencial de asentamiento

Para determinar la capacidad de asentamiento de las células clasificadas por integrina a10 y no clasificadas en cartílago intacto o dañado, las CMM se incubaron durante 1 h en tubos de plástico giratorios con explantes osteocondrales bovinos. Estos explantes se hirieron en dos lugares. Uno exposición de hueso subcondral y otro con una herida menos profunda con exposición solo de cartílago. Después de 1 h, se contaron las células adherentes (con el complemento de células de recuento de ImageJ) por separado para las regiones no dañadas, los defectos condrales y los defectos subcondrales. Los resultados de dos experimentos independientes se muestran en la figura 6. Las con integrina a10alta se unieron mejor en general (figura 6A) y se unieron mejor al cartílago intacto (figura 6B), los defectos condrales (figura 6C) y los defectos subcondrales (figura 6D) que las células sin clasificar o con integrina a10baja.

Conclusión: Esto muestra que las células que expresan niveles más altos de integrina a10 (células a10alta) podrían ser mejores para asentarse en la región de interés para la reparación del cartílago.

Ejemplo 5. Investigación de CMM positivas para integrina a io p i en caballos con osteoartritis postraumática (OAPT)

Este estudio evaluó la seguridad y eficacia de las CMM positivas para integrina a10p1 en un modelo de OAPT equino.

A. Animales y cirugías

Los caballos se seleccionaron para su inclusión en el estudio en función de la edad (intervalo, 2-5 años). Antes de la inclusión, cada caballo se sometió a una exploración física general de rutina y una evaluación de la cojera para descartar anomalías del sistema corporal, en particular anomalías neurológicas y osteomusculares, que pudiesen afectar el estudio. Solo se incluyeron en el estudio caballos con extremidades traseras sanas y con buena salud general.

A su llegada se confinó a los caballos en los establos. Los parámetros clínicos se evaluaron una vez antes de la operación, dos veces al día durante 3 días después de la operación, a continuación una vez al día durante 10 días después de la operación. Los exámenes físicos diarios incluyeron parámetros vitales, color de las membranas mucosas, tiempo de llenado capilar, motilidad gastrointestinal, pulsos digitales, producción de heces y orina, apetito e ingesta de agua. Los valores del examen físico se registraron en la historia clínica individual de cada caballo. Anestesiólogos veterinarios certificados por la junta indujeron, mantuvieron y monitorizaron la anestesia. Se sedó a los caballos y a continuación se indujo y mantuvo la anestesia general según el criterio del anestesiólogo y según los protocolos del estudio y el IACUC. Se administró medicación o fluidoterapia adicional cuando fue necesario, a discreción del anestesiólogo responsable. Una vez finalizado el procedimiento quirúrgico, los caballos se colocaron en decúbito lateral en un box de recuperación acolchada. A los caballos se les administró sedación adicional para que se recuperaran. El tubo endotraqueal se retiró una vez que el caballo respiraba espontáneamente. Los caballos fueron monitorizados continuamente durante la recuperación de la anestesia y regresaron a su establo una vez que se mantuvieron firmes y cargaron todas las extremidades. No se encontraron complicaciones importantes durante la inducción, la anestesia general o la recuperación anestésica. Los caballos anestesiados se colocaron en decúbito dorsal y se recortaron las articulaciones del corvejón izquierdo y derecho. A continuación, se realizó la preparación aséptica de la piel y el cubrimiento estéril de rutina. Se realizó un abordaje dorsal estándar en la articulación del corvejón (talocrural). Se colocó una aguja de calibre 18 en la articulación y se recogió líquido sinovial para su análisis, como se describe a continuación. La articulación se distendió con solución salina. Se realizó una incisión punzante de 5 mm lateral al tendón extensor y se insertó el artroscopio. Se exploró la articulación y se utilizaron agujas para determinar la posición de entrada para la introducción del impactador. El impactador se colocó dentro de la articulación de modo que la punta fuera perpendicular a la superficie axial de la cresta troclear medial del astrágalo. Se aplicaron tres impactos, espaciados aproximadamente a 1 cm de distancia, a la cara axial de la cresta troclear medial del astrágalo. La fuerza de impacto se registró durante el impacto mediante una celda de carga dentro del impactador. Se obtuvo biopsia de membrana sinovial para análisis histológico. Este procedimiento se repitió en la extremidad opuesta. Se obtuvo video artroscópico de todas las cirugías. Las incisiones de la piel se cerraron con material de sutura no absorbible en patrón simple interrumpido, se vendaron las articulaciones y se transportó al caballo a la recuperación.

B. Preparación e inyección de CMM seleccionadas con integrina alfa10 equinas

Se utilizaron en estos estudios células preparadas según los Ejemplos 1-3, denominadas CMM seleccionadas con integrina alfa10 equinas, en lo sucesivo «células Eq12a10+.1».

Las células Eq12a10+.1 se almacenaron en nitrógeno líquido hasta su uso (cirugía posimpacto a los cuatro días). Se descongelaron los viales, se contaron las células y se evaluó la viabilidad utilizando azul tripán. A continuación, las células se centrifugaron y se resuspendieron en p Bs a una concentración de aproximadamente 6x106 células/ml. Las células se transfirieron inmediatamente al área de tratamiento para su inyección.

Se extrajeron de forma estéril alícuotas de tres ml de la suspensión celular y del PBS de control en jeringas de 6 ml a través de agujas de calibre 18 de 3 pulgadas. Las células se aspiraron lentamente, durante 20-30 segundos. Para preparar al caballo para la inyección se le controló química y físicamente según fue necesario, y la bolsa dorsomedial de la articulación talocrural se preparó asépticamente de forma bilateral. La extremidad aleatorizada que recibió el artículo de prueba se inyectó primero; se insertó una aguja de calibre 19 en el compartimento dorsomedial de la articulación talocrural, se aspiró líquido sinovial en una jeringa de 3 ml, y a continuación se colocó la jeringa cargada y se vació la solución a un ritmo lento y constante (al rededor de 3-5 segundos) para administrar más de 1 millón de células en la cavidad articular. Se siguió el mismo procedimiento para la inyección de PBS de control en la extremidad opuesta.

La preparación preoperatoria y la anestesia se llevaron a cabo como se describió anteriormente para las cirugías iniciales. Los caballos anestesiados se colocaron en decúbito dorsal y las articulaciones del corvejón izquierdo y derecho se recortaron, prepararon y entallaron rutinariamente. Se realizó un abordaje lateral dorsal estándar en la articulación del corvejón. Se colocó una aguja de calibre 18 en la articulación talocrural y se recogió líquido sinovial para su análisis, como se describe a continuación. La articulación se distendió con solución salina. Se realizó una incisión punzante de 5 mm lateral a los tendones extensores para el manguito artroscópico. La articulación se exploró y puntuó utilizando el procedimiento de puntuación de la ICRS. Se obtuvo biopsia de membrana sinovial para análisis histológico. Este procedimiento se repitió en la extremidad opuesta. Las incisiones de la piel se cerraron con material de sutura no absorbible en patrón simple interrumpido, se vendaron las articulaciones del corvejón y se transportó al caballo a la recuperación. La recuperación postoperatoria fue como se describió anteriormente.

Se aspiraron muestras de líquido sinovial de cada articulación talocrural de todos los caballos inmediatamente antes de la cirugía de impacto y en los días 4, 7, 14, 28, 42, 70, 98, 126, 154 después de las intervenciones y en el sacrificio. En momentos distintos a los de la cirugía de impacto, la inyección del artículo de prueba y la cirugía de revisión de 6 semanas, los caballos fueron controlados química y físicamente según fue necesario y las bolsas dorsomediales de las articulaciones talocrurales se prepararon asépticamente bilateralmente. Se insertó una aguja de calibre 19 en el compartimento dorsomedial de la articulación talocrural y se aspiró líquido sinovial en una jeringa de 3 ml. Aproximadamente 1 ml del aspirado se envió al Laboratorio de Anatomía Patológica Clínica de la Universidad de Cornell para una evaluación completa del líquido sinovial (frotis y recuentos diferenciales). Las muestras de líquido sinovial restantes se centrifugaron para eliminar el sedimento celular, se transfirieron a tubos de microcentrífuga y se almacenaron en un congelador a -80 °C.

A los 6 meses, los caballos fueron sedados y sacrificados humanitariamente según las directrices de la AVMA con una sobredosis intravenosa de barbitúrico (pentobarbital). El líquido articular se recogió mediante procedimientos estériles y un anatomopatólogo veterinario certificado por la junta realizó un examen de necropsia estándar. Se recogieron muestras de tejido de los órganos principales para examen histológico. Se recogieron articulaciones talocrurales, se etiquetaron para su identificación y se empacaron para su transporte en una nevera. Los formularios de cadena de custodia permanecieron con las articulaciones en todo momento.

C. Análisis

Después de la exploración por resonancia magnética, se disecaron y examinaron las articulaciones talocrurales. Se recogieron muestras de la membrana sinovial y se fijaron para su procesamiento histológico. Se aplicó tinta china a la superficie articular y se obtuvieron fotografías digitales. La tinta china contiene partículas de carbón y se adhiere a la zona de la superficie articular donde la integridad del cartílago se ve comprometida. Se recogieron bloques osteocondrales que contenían los sitios de impacto, así como el cartílago de control no impactado, y se fijaron para su procesamiento histológico.

Para cada medida de resultado de salud articular con más de un momento de muestreo (cojera, análisis de líquido sinovial, ELISA de líquido sinovial, puntuaciones artroscópicas, histología de la membrana sinovial) se ajustó un modelo de efectos mixtos a los datos con caballo como un efecto aleatorio, y tratamiento (control o tratamiento) y tiempo como efectos fijos y un término de interacción para tratamiento*tiempo. Los contrastes lineales y a posteriori de Tukey se utilizaron según fue apropiado para evaluar las diferencias entre grupos de interés específico. Se realizó una prueba de la t para datos emparejados sobre la histología del cartílago y las puntuaciones de resonancia magnética. El análisis estadístico se realizó mediante el uso de JMP 12 (SAS Institute, Cary, North Carolina, USA). La significancia se estableció en p < 0,05.

El ajuste del modelo para la mayoría de los análisis fue normal (R2 ajustado = 0,25 - 0,50) o bueno (R2 = 0,50 - 0,75), que se consideran aceptables para estudios en animales in vivo. El ajuste del modelo fue malo (R2 ajustado = <0,25) en algunos casos.

D. Resultados radiográficos

Los datos radiográficos resumidos se presentan en la Tabla 5.

Hallazgos basales (preoperatorios): en las radiografías preoperatorias, todos los caballos menos uno tenían articulaciones del corvejón radiográficamente normales; sin esclerosis, osteofitos periarticulares, estrechamiento del espacio articular o agrandamiento articular. Un caballo tenía un osteofito periarticular leve en la superficie dorsomedial del hueso tarsal central proximal. Esto se documentó y se determinó que no tenía consecuencias para los criterios de inclusión del estudio.

Esclerosis ósea subcondral: al final del estudio de 6 meses, el grupo de control presentaba considerablemente más esclerosis que el grupo de tratamiento (figura 7; p = 0,004; R2 ajustado = 0,03). La esclerosis es un aumento de la densidad ósea que hace que el hueso sea más duro y menos capaz de absorber y transmitir fuerzas desde el cartílago articular. La esclerosis es un sello distintivo de la osteoartritis y puede ser una causa o un resultado del deterioro del cartílago. Dado que este estudio es un sistema modelo para la osteoartritis postraumática, se deduce que el aumento de la esclerosis ósea subcondral es el resultado de un traumatismo articular, lo que verifica que este modelo induce osteoartritis. El aumento de la esclerosis en el grupo de control al final del estudio sugiere que el cartílago en el grupo de control continuaría deteriorándose con el tiempo debido al aumento de la absorción de las fuerzas transmitidas durante la carga de peso.

Conclusión: en el momento final del estudio de 6 meses, se encontró menos esclerosis ósea subcondral radiográfica en las extremidades tratadas en comparación con los controles. La esclerosis ósea subcondral probablemente resultaría en un deterioro continuo del cartílago y en la progresión de la artritis, y se esperaría que este efecto se magnificara frente al ejercicio.

E. Resultados de los ELISA de líquido sinovial

Se realizaron seis ELISA en muestras de líquido sinovial que se obtuvieron de las articulaciones talocrurales izquierda y derecha en los momentos 0, 4, 7, 14, 28, 42, 70, 98, 126, 154 y 169 días después de la intervención. Las muestras se centrifugaron para eliminar los restos celulares y se almacenaron a -80 °C hasta el análisis. Los datos resumidos se presentan a continuación en la Tabla 9.

Prostaglandina E2 (PGE-2): se cree que las CMM son inmunomoduladoras, parcialmente se piensa que regulan al alza las PGE-2. La concentración de PGE-2 aumentó tanto en los grupos de tratamiento como en los de control desde el momento 0 hasta el día 28. A continuación disminuyó drásticamente y permaneció baja, pero más alta que los valores de referencia durante todo el estudio. La concentración de PGE-2 fue mayor en el tratamiento en comparación con las extremidades de control en 9 de los 11 momentos. A los 28 días, la concentración de PGE-2 aumentó considerablemente en las extremidades tratadas en comparación con el control en los momentos 0, 4, 42, 56, 126 y 154 días (figura 8), lo que sugiere una modulación mejorada del ambiente articular posoperatorio en los pacientes tratados en comparación con las extremidades de control.

Colágeno CPII: Este ensayo también se conoce como Ensayo de ProCollagen II C-Propeptide. El ensayo CPII mide el carboxipéptido liberado en la formación de colágeno y, por lo tanto, refleja cambios en la velocidad de síntesis de colágeno tipo II. CPII tendió a ser mayor en el líquido sinovial de las extremidades tratadas en comparación con las extremidades de control (figura 9), lo que sugiere una mayor síntesis de colágeno tipo II en las extremidades tratadas. La concentración de CPII aumentó tanto en las extremidades tratadas como en las de control en los días 7 y 14 después de la intervención en comparación con el momento cero y el final del estudio.

Colágeno C2C: este ensayo mide el neoepítopo (en el extremo C-terminal de 3/4 de péptido) generado a través de la escisión del colágeno tipo II por colagenasas. Las concentraciones de C2C aumentaron considerablemente en las articulaciones tratadas y de control en los días 4-14 después de la intervención (figura 10), y a continuación disminuyeron a lo largo del estudio a valores no considerablemente distintos del momento 0. Al igual que el TNF-a, esto respalda el modelo como uno de osteoartritis postraumática leve.

F. Resultados de la histología del cartílago

Todos los portaobjetos osteocondrales teñidos con verde rápido de safranina-O y hematoxilina y eosina se puntuaron por consenso de los investigadores, a los que se les ocultó el grupo de tratamiento mientras puntuaban. Los datos se presentan en la figura 11 con datos resumidos en la Tabla 11. Para todos los caballos, se examinaron dos zonas de cartílago no impactadas en cada articulación; la cresta troclear lateral del astrágalo y la cresta intermedia distal de la tibia, que es la superficie articular opuesta que se articula con la región impactada en la cresta troclear medial. Se examinaron ambas muestras, a continuación se asignó una única puntuación para el cartílago no impactado. Para todos los caballos, se examinaron las regiones focales de la cresta troclear medial que contiene cada uno de los tres impactos, a continuación se asignó una única puntuación para el cartílago impactado para cada articulación.

Observaciones generales - Cartílago impactado: como se esperaba, todas las zonas de cartílago impactadas tenían puntuaciones de cartílago de moderada a gravemente anómalas.

Puntuaciones articulares totales: los resultados muestran que el tratamiento con CMM condujo a una puntuación considerablemente mejor en cuanto a fisuras/fibrilación. Todas las puntuaciones de los demás componentes, así como la puntuación total, también fueron mejores en el grupo tratado (Tabla 11) en comparación con el control.

Fisura/fibrilación del cartílago: las articulaciones tratadas tienen una puntuación considerablemente más baja (mejor) para la fibrilación/fisura (figura 12, p = 0,039, prueba de la t unilateral) y para la fibrilación/fisura delta (p = 0,030, prueba de la t unilateral). Este hallazgo demuestra que las articulaciones tratadas tenían menos daño estructural en las zonas de lesión que los controles.

Observaciones adicionales: se notó que las hendiduras del cartílago cicatrizaron en varios portaobjetos, subjetivamente más a menudo en las extremidades tratadas. Esta respuesta de tipo cicatrizante no se ha observado previamente en este modelo animal de osteoartritis postraumática. La esclerosis ósea subcondral también se puede observar en numerosos portaobjetos.

Tabla 11. Componente de histolo ía osteocondral puntuaciones totales. Las barras representan la media ± DE.

F. Resultados de la inmunohistoquímica osteocondral (colágeno tipo I y II)

Se realizó inmunohistoquímica para colágenos de tipo I y II en secciones osteocondrales (figura 11). También se realizó la tinción con tinta china (figura 13). No se realizó una evaluación cuantitativa de las secciones inmunohistoquímicas debido a la inherentemente alta variabilidad en el ensayo.

Colágeno tipo I - Cartílago no impactado (remoto): la inmunohistoquímica para el colágeno tipo I fue en gran parte normal en las muestras de control remoto en las extremidades de control tratadas y no tratadas sin tinción de colágeno tipo I del cartílago articular.

Colágeno tipo I - Cartílago impactado: la tinción para el colágeno tipo I se limitó a las regiones de impacto y generalmente se extendió % - A en la superficie del cartílago articular. Hubo muy pocos cambios y no se observaron diferencias entre el tratamiento y las extremidades de control. En regiones de tejido de reparación (indicadas anteriormente en «Observaciones subjetivas adicionales», la tinción solo se observó en la mitad más profunda del tejido de reparación).

Colágeno tipo II - Cartílago no impactado (remoto): la inmunohistoquímica para el colágeno tipo II fue en gran parte normal en las muestras de control con una distribución uniforme del colágeno tipo II por todo el cartílago.

Colágeno tipo II - Cartílago impactado: hubo pocas zonas de pérdida de colágeno tipo II en las articulaciones de control o tratadas. En la región inmediata de los impactos, hubo una tinción ligeramente reducida para el colágeno tipo II. Al igual que el colágeno tipo I, las áreas de reparación fibrosa solo se tiñen para el colágeno tipo II en las capas más profundas del tejido de reparación.

Quimiocinas inmunomoduladoras: el hallazgo más específico de las CMM en el estudio fue el aumento de la concentración de PGE-2 en las articulaciones tratadas con CMM Eq12a10+.1 en comparación con los controles. La PGE-2 modula las quimiocinas y la quimiotaxis de las células proinflamatorias y, por lo tanto, es un mediador clave de la inmunopatología. Todas las células son capaces de producir PGE-2, y se sabe que las CMM aumentan la expresión de PGE-2 por las células mieloides y estromales. En este estudio, la concentración de PGE-2 en el líquido sinovial alcanzó su punto máximo el día 28 y a continuación disminuyó durante el resto del estudio.

Conclusión: este estudio preclínico respalda el uso de las CMM Eq12a10+.1 para el tratamiento de la osteoartritis postraumática. El tratamiento es seguro y existen pruebas sólidas que sugieren que puede ser eficaz para mitigar los efectos del traumatismo articular. Por ejemplo, se notó que las hendiduras del cartílago cicatrizaron en varios portaobjetos, subjetivamente más a menudo en las extremidades tratadas. Esta respuesta de tipo cicatrizante no se ha observado previamente en este modelo animal de osteoartritis.

Ejemplo 6. Inmunosupresión

También se evaluó la capacidad de inmunosupresión de las CMM seleccionadas con integrina a10 equinas aisladas de tejido adiposo. El ensayo de inmunosupresión se realizó mediante la estimulación de células mononucleares de sangre periférica (CMSP) con Concanavalina A durante 72 horas en cocultivos con CMM alogénicas en distintas proporciones. La proliferación de linfocitos se midió añadiendo bromodesoxiuridina (BrdU) 24 horas antes del análisis de citometría de flujo de la incorporación de BrdU para medir la proliferación de linfocitos. En la figura 14 se muestra la frecuencia de células T que expresan CD4 positivas para BrdU.

Conclusión: las CMM seleccionadas de integrina a10 equina aisladas de tejido adiposo tienen una capacidad inmunomoduladora en las células T, demostrada como una disminución en la proliferación de linfocitos con proporciones crecientes de CMM a CMSP. El mayor efecto inmunosupresor se generó en una proporción de una CMM a una CMSP.

Bibliografía

1. Houard X, Goldring MB, Berenbaum F. Homeostatic Mechanisms in Articular Cartilage and Role of Inflammation in Osteoarthritis. Current rheumatology reports. 2013;15(11):375. doi:10.1007/s11926-013-0375-6.

2. Gelber AC, Hochberg MC, Mead lA, Wang NY, Wigley FM, Klag MJ. (2000). Joint injury in young adults and risk for subsequent knee and hip osteoarthritis. Ann Intern Med. 133, 321-328.

3. Kidd, J. A., Fuller, C. and Barr, A. R. S. (2001). Osteoarthritis in the horse. Equine Veterinary Education, 13: 160-168. doi: 10.1111/j.2042-3292.2001.tb00082.x

4. Mcllwraith CW, Fortier LA, Frisbie DD, Nixon AJ. (2011). Equine Models of Articular Cartilage Repair. Cartilage 2,317-326. doi: 10.1177/1947603511406531.

5. Goodrich LR, Nixon AJ. (2006). Medical treatment of osteoarthritis in the horse - a review. Vet J. 171, 51-69. doi: 10.1016/j.tvjl.2004.07.008

6. Bornes TD, Adesida AB, and Jomha NM (2014). Mesenchymal stem cells in the treatment of traumatic articular cartilage defects: a comprehensive review. Arthritis Research & Therapy 16, 432-451.

7. Mundra V et al. (2013). Mesenchymal stem cell-based therapy. Mol Pharm 2013, 10, 77-89.

8. Raynaud CM and Rafij A. (2013). The Necessity of a Systematic Approach for the Use of MSCs in the Clinical Setting. Stem Cells International 2013, 1-10.

9. Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, Slaper-Cortenbach I, Marini F, Krause D et al. (2006). Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8, 315-317.

10. Fortier La , Travis AJ (2011). Stem cells in veterinary medicine. Stem Cell Res Ther. 2011 Feb 23;2(1):9. doi: 10.1186/scrt50.

11. Samsonraj, R. M., Rai, B., Sathiyanathan, P., Puan, K. J., Rotzschke, O., Hui, J. H., Raghunath, M., Stanton, L. W., Nurcombe, V. and Cool, S. M. (2015), Establishing Criteria for Human Mesenchymal Stem Cell Potency. Stem Cells, 33: 1878-1891. doi:10.1002/stem.1982

12. Lundgren-Akerlund E, Aszódi A (2014). Integrin a10b1: a collagen receptor critical in skeletal development. Adv Exp Med Biol 819, 61-71.

13. Gouttenoire J, Bougault C, Aubert-Foucher E, Perrier E, Ronziere MC, Sandell L, et al. (2010). BMP-2 and TGF-beta1 differentially control expression of type II procollagen and a10 and alpha11 integrins in mouse chondrocytes. Eur J Cell Biol 89, 307-314.

14. Gigout A, Jolicoeur M, Nelea M, Raynal N, Farndale R, Buschmann MD (2008). Chondrocyte aggregation in suspension culture is GFOGER-GPP- and beta1 integrin-dependent. J Biol Chem 283, 31522-31530.

15. Varas L, Ohlsson LB, Honeth G, Olsson A, Bengtsson T, Wiberg C, Bockermann R, Jarnum S, Richter J, Pennington D, Johnstone B, Lundgren-Akerlund E, Kjellman C (2007). A10 integrin expression is up-regulated on fibroblast growth factor-2-treated mesenchymal stem cells with improved chondrogenic differentiation potential. Stem Cells Dev 16, 965-978.

16. Vidal MA, Robinson SO, Lopez MJ, et al. (2008) Comparison of Chondrogenic Potential in Equine Mesenchymal Stromal Cells Derived from Adipose Tissue and Bone Marrow. Veterinary surgery 37, 713-724. doi:10.1111/j.1532-950X.2008.00462.x.

17. Kisiday, J. D., Kopesky, P. W., Evans, C. H., Grodzinsky, A. J., Mcllwraith, C. W. and Frisbie, D. D. (2008), Evaluation of adult equine bone marrow- and adipose-derived progenitor cell chondrogenesis in hydrogel cultures. J. Orthop. Res., 26, 322-331. doi:10.1002/jor.20508

18. Burk J, Ribitsch I, Gittel C, Juelke H, Kasper C, Staszyk C, Brehm W. (2013). Growth and differentiation characteristics of equine mesenchymal stromal cells derived from different sources. Vet J. 195, 98-106. doi: 10.1016/j.tvjl.2012.06.004. Epub 2012 Jul 26.

19. Hennig T, Lorenz H, Thiel A, Goetzke K, Dickhut A, Geiger F, Richter W (2007). Reduced chondrogenic potential of adipose tissue derived stromal cells correlates with an altered TGFbeta preceptor and BMP profile and is overcome by BMP-6. J Cell Physiol. 211,682-691.

20. Estes BT, Wu AW, Guilak F (2006). Potent induction of chondrocytic differentiation of human adipose-derived adult stem cells by bone morphogenetic protein 6. Arthritis Rheum.54, 1222-1232.

21. Bocelli-Tyndall C., Zaiac P., Di Maggio N., Trella E., Benvenuto F., lezzi G., et al. (2010). Fibroblast growth factor 2 and platelet-derived growth factor, but not platelet lysate, induce proliferation-dependent, functional class II major histocompatibility complex antigen in human mesenchymal stem cells. Arthritis Rheum. 62, 3815-3825.

22. Su X, Zuo W, Wu Z, Chen J, Wu N, Ma P, et al. (2015). CD146 as a new marker for an increased chondroprogenitor cell sub-population in the later stages of osteoarthritis. J Orthop Res. 33, 84-91.

23. Schrobback K, Wrobel J, Hutmacher DW, Woodfield TB, Klein TJ. (2013). Stage-specific embryonic antigen-4 is not a marker for chondrogenic and osteogenic potential in cultured chondrocytes and mesenchymal progenitor cells. Tissue Eng Part A. 19,1316-1326.

24. Tallone T, Realini C, Bohmler A, Kornfeld C, Vassalli G, Moccetti T et al. (2011). Adult human adipose tissue contains several types of multipotent cells. J Cardiovasc T ransl Res. 4, 200-210.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una población de células madre mesenquimatosas (CMM) enriquecida con integrina a10alta para su uso en la prevención y/o tratamiento de la esclerosis ósea subcondral, las lesiones articulares traumáticas y/o las artrosis; o para promover o inducir la cicatrización de fracturas,

donde al menos el 60 % de las células de la población de CMM expresan la subunidad a10 de la integrina, donde las CMM son negativas para MHCII y negativas para CD45, y

donde dichas CMM se seleccionan de entre el grupo que consiste en una célula madre mesenquimatosa, una célula progenitora mesenquimatosa y una célula estromal mesenquimatosa.

2. La población de CMM enriquecida con integrina a10alta para su uso según la reivindicación 1,

donde la artrosis se selecciona de entre un grupo que consiste en osteopatía subcondral, la degeneración del cartílago, osteoartritis postraumática, artritis inflamatoria y malformación congénita y/o deformación del aparato locomotor; y donde la lesión articular traumática se selecciona de entre un grupo que consiste en daño osteocondral, daño tendinoso, daño ligamentoso y daño muscular.

3. La población de CMM enriquecida con integrina a10alta para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el daño osteocondral comprende el daño del cartílago articular y/o daño en el hueso.

4. La población de CMM enriquecida con integrina a10alta para su uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde al menos el 65 %, tal como al menos el 70 %, tal como al menos el 75 %, tal como al menos el 80 %, tal como al menos el 85 %, tal como al menos el 90 %, tal como al menos el 95 %, tal como al menos el 96 %, tal como al menos el 97 %, tal como al menos el 98 %, tal como al menos el 99 %, tal como el 100 % del total de células comprendidas en la población expresa la subunidad a10 de la integrina.

5. La población de CMM enriquecida con integrina a10alta para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde dicha población es un cultivo celular in vitro.

6. La población de CMM enriquecida con integrina a10alta para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde las células que expresan la integrina a10 se aíslan con un anticuerpo antiintegrina a10.

7. La población de CMM enriquecida con integrina a10alta para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde las células se derivan de tejido adiposo, médula ósea, membrana sinovial, sangre periférica, sangre del cordón umbilical, gelatina de Wharton o líquido amniótico.

8. La población de CMM enriquecida con integrina a10alta para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el daño osteocondral, la lesión o el daño del cartílago son una rotura, esguince, contusión, desgarro, fractura o ruptura, una fisura del cartílago, una microfractura del cartílago, un defecto condral, una rotura de tendón, una rotura de ligamento o una fractura de hueso, y/o donde el daño osteocondral, la lesión o el daño del cartílago de la articulación está en un músculo, tendón, hueso, ligamento, cartílago o menisco.

9. La población de CMM enriquecida con integrina a10alta para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde las CMM son alogénicas o autólogas.

10. La población de CMM enriquecida con integrina a10alta para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde la población de las CMM se formula en un agregado celular antes de la administración.

11. La población de CMM enriquecida con integrina a10alta para su uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el sujeto es un humano, caballo, potro, buey, burro, mula, camélido, gato, perro, cerdo o vaca.

12. Una población de células madres mesenquimatosas (CMM) enriquecida con integrina a10alta, donde al menos el 60 % de las células de la población de CMM expresa la subunidad a10 de la integrina;

donde las CMM son negativas para MHCII y negativas para CD45; y

donde las CMM se seleccionan de entre el grupo que consiste en células madre mesenquimatosas, células progenitoras mesenquimatosas y células estromales mesenquimatosas.

13. Un procedimiento para fabricar una población de CMM enriquecida con integrina a10alta,

donde al menos el 60 % de las células de la población de CMM expresan la subunidad a10 de la integrina, donde el procedimiento comprende:

b. cultivar las células aisladas en un recipiente de cultivo de plástico;

c. descartar las células no adheridas;

e. seleccionar las células que expresen integrina a10, y

14. Una población de células madres mesenquimatosas (CMM) enriquecida con integrina a10alta que se puede obtener mediante el procedimiento de la reivindicación 13.