ES2870962T3

ES2870962T3 - Sistema de expresión para organismos eucarióticos

Info

Publication number: ES2870962T3
Application number: ES17712530T
Authority: ES
Inventors: Dominik Mojzita; Anssi Rantasalo; Jussi Jäntti; Christopher Landowski; Joosu Kuivanen
Original assignee: VTT Technical Research Centre of Finland Ltd
Current assignee: VTT Technical Research Centre of Finland Ltd
Priority date: 2016-02-22
Filing date: 2017-02-21
Publication date: 2021-10-28
Anticipated expiration: 2037-02-21
Also published as: FI20165137A7; JP2019505230A; DK3405580T3; CN109477115B; HUE054884T2; US20180371468A1; CN109477115A; MX2018010055A; AU2017224865B2; CA3015440A1; EP3405580B1; US11332750B2; FI127283B; CA3015440C; KR20180117147A; PT3405580T; JP6953667B2; EP3405580A1; LT3405580T; WO2017144777A1

Abstract

Un sistema de expresión para un hospedador eucariótico, caracterizado porque comprende: (a) un casete de expresión que comprende: un promotor de núcleo, el promotor de núcleo es la única secuencia reguladora para controlar la expresión de una secuencia de ADN que codifica para factor de transcripción sintético (sTF), y una secuencia de ADN que codifica para factor de transcripción sintético (sTF), y (b) uno o más casetes de expresión, cada uno comprende una secuencia de ADN que codifica para un producto deseado enlazado operablemente a un promotor sintético, el promotor sintético comprende un promotor de núcleo idéntico al promotor de núcleo de (a) otro promotor de núcleo, y sitios de unión específicos para sTF hacia el extremo 5' del promotor de núcleo.

Description

DESCRIPCIÓN

Sistema de expresión para organismos eucarióticos

Campo de la invención

La presente invención se relaciona con un sistema de expresión para un hospedador eucariótico (como por ejemplo un microorganismo hospedador), un hospedador que comprende al sistema de expresión, un método para producir un producto de proteína deseada mediante el uso del hospedador. Además, la presente invención se relaciona con un método para identificar un promotor de núcleo universal, un promotor de núcleo universal que se puede obtener por el método y un sistema de expresión, un organismo hospedador eucariótico no humano (por ejemplo, un microorganismo hospedador) y un método para producir un producto de proteína mediante el uso del promotor de núcleo universal.

Antecedentes de la invención

La expresión de genes de manera controlada y predecible es muy difícil de llevar a cabo incluso en hospedadores bien establecidos, especialmente en términos de expresión estable en diversas condiciones de cultivo o etapas de crecimiento. Además, para muchos hospedadores industriales y potencialmente interesantes, existe un espectro muy limitado (o incluso ausente) de herramientas y/o métodos para llevar a cabo la expresión de genes heterólogos. En muchas instancias, esto prohíbe el uso de estos (hospedadores con frecuencia muy promisorios) en aplicaciones industriales. En algunos hospedadores, las condiciones de inducción específicas necesitan ser puestas en el lugar para obtener expresión deseable de genes objetivo. Esto resulta en requerimientos específicos para medio de cultivo o procesamiento posterior que finalmente incrementa los costos de producción. Otro problema en hospedadores industriales es el establecimiento de programas de expresión complejos en donde se desea tener niveles de expresión específicos de genes múltiples de manera simultánea. Esto es importante, por ejemplo, para la manipulación de la vía metabólica, en donde los genes individuales que codifican para enzimas en las vías de producción necesitan ser expresados (y las enzimas correspondientes, producidas) en una relación equilibrada para asegura flujo metabólico óptimo hacia los productos deseados.

Con el fin de obtener patrones de expresión predecibles y/o estables de los genes objetivo en un organismo hospedador (en condiciones variables), es importante que la expresión de estos genes sea alterada de manera mínima por mecanismos reguladores intrínsecos del hospedador. Esto se puede llevar a cabo mediante el uso de componentes no nativos (heterólogos) (promotores, factores de transcripción y agentes inductores) en los sistemas de expresión de genes objetivo manipulados. Estos sistemas de expresión se denominan ortogonales, si no son alterados por el huésped y también si no son alterados por hospedador de otras maneras a las que se pretenden. No obstante, los sistemas de expresión ortogonales aún se basan en las funciones celulares endógenas del hospedador, como por ejemplo transcripción y traducción, de manera que satisfacen ciertos criterios que permiten su funcionalidad en el hospedador. Estos criterios en alguna medida son específicos de especie (hospedador), lo que dificulta diseñar un sistema ortogonal funcional a través de una amplia variedad de especies muy diferentes.

Típicamente, las estrategias actuales para la expresión de genes heterólogos emplea el uso de promotores endógenos (específicos del hospedador) en hospedadores específicos (Hubmann et al. 2014 y Blumhoff et al. 2012). Estos promotores pueden ser ya sea inducibles, o los denominados constitutivos, pero en ningún caso son ortogonales debido a que su función depende de factores específicos que existen en el organismo hospedador. Además, el uso de promotores específicos de hospedador evita la transferencia entre especies de estos sistemas de expresión, lo que resulta en la necesidad de desarrollar sistemas de expresión adaptados para cada hospedador. Los ejemplos existentes de sistemas de expresión transferibles entre especies, basados en los promotores hospedadores nativos, se limitan a un espectro estrecho de organismos relacionados estrechamente en los cuales funcionan los promotores. Estos incluyen algunos promotores de levadura como por ejemplo URA3 y LEU2 de Kluyveromyces lactis o HIS5 de Schizosaccharomyces pombe funcionales en Saccharomyces cerevisiae. En hongos filamentosos, por ejemplo el promotor gpdA de Aspergillus nidulans se ha usado con éxito en Aspergillus niger, Aspergillus fumigatus y Trichoderma reesei. No obstante, estos promotores se usan principalmente para la expresión de genes marcadores de selección en estos organismos. No son adecuados para expresión de gen objetivo (que codifique para una proteína deseada) y especialmente no para expresión simultánea de genes múltiples (que codifican para una vía metabólica), debido a que su actividad está influida fuertemente por condiciones de crecimiento o les confieren un espectro insuficiente de actividades transcripcionales.

Diversas investigaciones han reportado la caracterización y manipulación de sistemas de expresión de genes que usan factores de transcripción sintéticos (sTF, por sus siglas en inglés) (ortogonales) y promotores, dependientes de sTF, manipulados para controlar la expresión de genes objetivo. Los promotores dependientes de sTF están constituidos de un número variable de sitios que unen sTF enlazados a un promotor de núcleo. El número de sitios de unión en combinación con un promotor de núcleo específico definen el nivel de expresión del gen objetivo y representan una mejoría significativa en el control del nivel de expresión en comparación con los sistemas los cuales usan promotores específicos de hospedador para la expresión del gen objetivo. Los sTF usados en estos sistemas de expresión, no obstante, se expresan a partir de promotores nativos (específicos de hospedador) o promotores nativos modificados, lo cual vuelve a estos sistemas ortogonales sólo de manera parcial, y lo cual impide su uso en diversas especies. Los ejemplos de sistemas de expresión parcialmente ortogonales incluyen:

1) Sistema de expresión desarrollado para S. cerevisiae, en donde el sTF se expresa desde el promotor TDH3 de S. cerevisiae o a partir del promotor que combina la UAS de TDH3 y el promotor de núcleo CYC1 de S. cerevisiae, y los genes objetivo se expresan a partir de promotores sintéticos que contienen un número diverso de sitios de unión de sTF y los promotores de núcleo TDH3 o CYC1 (Ito et al., 2015).

2) Sistema de expresión desarrollado para A. nidulans y A. niger, en donde el sTF se expresa a partir del promotor gpdA de A. nidulans, y el gen objetivo se expresa a partir de un promotor sintético que contiene tres sitios de unión para el sTF, promotor de núcleo URA3 de S. cerevisiae y una secuencia aleatoria de 94 bp (siglas en inglés para pares de bases) derivados de E. coli (Pachlinger et al., 2005).

3) Sistema de expresión desarrollado para Arabidopsis thaliana, en donde el sTF se expresa a partir del promotor 35S de A. thaliana, u otro promotor de A. thaliana, o a partir de un promotor sintético que contiene cuatro sitios de unión para el sTF y el promotor mínimo 35S de A. thaliana. El promotor mínimo probablemente se refiere a un promotor de núcleo en la publicación mencionada. El gen objetivo se expresa a partir del promotor sintético que contiene cuatro sitios de unión para el sTF y el promotor mínimo 35S de A. thaliana (US2002081667).

Aunque se han descrito en la técnica anterior varios sistemas de expresión de genes, aún existe la necesidad por sistemas de expresión de genes para hospedadores organismos eucarióticos (por ejemplo, microorganismos hospedadores eucarióticos) que puedan proporcionar una expresión robusta y estable, un espectro amplio de niveles de expresión y que puedan ser usadas en varios especies y géneros de organismos eucarióticos diferentes tal como en varias especies y géneros de microorganismos eucarióticos diferentes. Esto habilitaría, por ejemplo, una transferencia eficiente hacia y pruebas de vías metabólicas manipuladas simultáneamente en varios hospedadores de producción potenciales para evaluación de funcionalidad. Además, un sistema de expresión verdaderamente ortogonal proporcionaría beneficios a la comunidad científica quien estudia a los organismos eucarióticos.

Sumario de la invención

Un objetivo de la presente invención es proporcionar sistemas de expresión ortogonales los cuales sean funcionales (transferibles) en un gran espectro de organismos eucarióticos, como por ejemplo microorganismos eucarióticos. Estos sistemas de expresión podrían subsanar las necesidades de usar secuencias de ADN nativos para el hospedador al construir los sistemas de expresión y, por lo tanto, establecer sistemas de expresión que no dependen de la regulación transcripcional intrínseca del hospedador de expresión.

Un objetivo adicional de la invención es proporcionar sistemas de expresión los cuales permiten niveles de expresión robustos, estables y predecibles de genes objetivo, y los cuales no son alterados por las condiciones de cultivo o el desarrollo o etapas de crecimiento del organismo hospedador.

La motivación para la presente invención se basa en el hallazgo de que: 1) el uso de promotores específicos de hospedador, o sus partes, para expresar los sTF, y 2) el uso de promotores de núcleo específicos de especie en los promotores, dependientes de sTF, que controlan la expresión de los genes objetivo son los motivos principales por los cuales los sistemas de expresión actuales basados en los sTF no pueden ser transferidos entre diversas especies sin pérdida de su función.

La presente invención muestra que es ventajoso usar un promotor de núcleo único para la expresión de un sTF. Esto permite la expresión constitutiva baja del sTF en el hospedador (por ejemplo, microorganismo hospedador).

Además, la presente invención muestra que es posible desarrollar un método para identificar promotores de núcleo que son funcionales en especies distantes.

Además, la presente invención muestra que es posible construir sistemas de expresión en base en estos promotores de núcleo funcionales en diversas especies, lo que permite niveles de expresión ajustables de los genes objetivo a través de un gran espectro de organismos eucarióticos (por ejemplo, microorganismos eucarióticos).

De esta manera, la presente divulgación proporciona un sistema de expresión para un hospedador eucariótico (por ejemplo, un microorganismo hospedador), el cual comprende:

(a) un casete de expresión que comprende un promotor de núcleo,

el promotor de núcleo es el único “promotor” que controla la expresión de una secuencia de ADN que codifica para el factor de transcripción sintético (sTF), y

(b) uno o más casetes de expresión, cada uno comprende una secuencia de ADN que codifica para un producto de proteína deseado enlazado operablemente a un promotor sintético,

el promotor sintético comprende un promotor de núcleo idéntico a (a) u otro promotor de núcleo, y sitios de unión específicos de sTF hacia el extremo cinco prima del promotor de núcleo.

El sistema de expresión de la presente invención se define en la reivindicación 1.

La presente invención proporciona también un hospedador eucariótico no humano, como por ejemplo un microorganismo hospedador eucariótico, que comprende el sistema de expresión. El hospedador eucariótico no humano de la presente invención se define en la reivindicación 6.

Además, la presente invención proporciona un método para producir un producto de proteína deseado (o múltiples productos de proteína deseados simultáneamente) en un hospedador eucariótico no humano que comprende cultivar el hospedador eucariótico bajo condiciones de cultivo adecuadas. El método de la presente invención para producir un producto de proteína deseado se define en la reivindicación 9.

Además, en una modalidad la presente invención proporciona un método para producir un producto de proteína deseado (o productos de proteínas deseados múltiples simultáneamente) en un microorganismo hospedador eucariótico que comprende cultivar el microorganismo hospedador eucariótico bajo condiciones de cultivo adecuadas. La presente divulgación proporciona también un método para identificar promotores de núcleo universales para hospedadores eucarióticos.

El método de identificación comprende las siguientes etapas:

- expresar constitutivamente un factor de transcripción sintético, sTF, en Saccharomyces cerevisiae,

- en el mismo hospedador co-expresar un gen indicador enlazado operablemente al promotor de prueba dependiente de sTF, el promotor de prueba dependiente de sTF comprende un promotor de núcleo que se va a probar y sitios de unión a sTF hacia el extremo cinco prima al mismo,

- permitir que el gen indicador sea expresado bajo el promotor de prueba en presencia de activación por el sTF, - determinar el nivel de expresión del gen indicador, y

- seleccionar a partir de los promotores de núcleo probados, promotores de núcleo que muestren por lo menos 40% como expresión alta del gen indicador como se obtiene con el promotor de núcleo PGK1 de S. cerevisiae probado en el mismo sistema indicador;

- En casos específicos también seleccionar promotores de núcleo que muestren menos de 40% de expresión del gen indicador en comparación con la expresión de gen indicador que se obtiene con el promotor de núcleo PGK1 de S. cerevisiae probados en el mismo sistema indicador.

Además, la presente divulgación proporciona un promotor de núcleo universal (UCP, por sus siglas en inglés). El promotor de núcleo universal se puede obtener por el método de identificación que se describe.

Un promotor de núcleo universal (UCP) típicamente comprende una secuencia de ADN que contiene una región 5' de un gen eucariótico, comenzando 10 a 50 bp hacia el extremo cinco prima de una caja TATA y finalizando 9 bp hacia el extremo cinco prima del codón de inicio ATG. La distancia entre la caja TATA y el codón de inicio preferiblemente es no mayor de 180 bp y no menor de 80 bp. El UCP típicamente también comprende una secuencia de ADN que comprende 1 a 20 bp aleatorios en su extremo 3'. En una modalidad, un UCP típicamente comprende una secuencia de ADN que tiene por lo menos 90% de identidad de secuencia con la región 5' de un gen eucariótico, y una secuencia de ADN que comprende 1 a 20 bp aleatorios en su extremo 3'.

Además, la presente divulgación proporciona un sistema de expresión para un hospedador eucariótico el cual comprende:

(a) un casete de expresión que comprende un UCP,

el UCP controla la expresión de una secuencia de ADN que codifica para el factor de transcripción sintético (sTF), y

el promotor sintético comprende un UCP idéntico a (a) u otro UCP, y los sitios de unión específicos de sTF hacia el extremo cinco prima del UCP.

Además, en una modalidad la presente invención proporciona un hospedador eucariótico no humano (por ejemplo, un microorganismo hospedador eucariótico) que comprende un sistema de expresión de la presente invención usando promotores de núcleo universales.

En una modalidad la presente invención proporciona también un método para producir un producto de proteína deseado (o múltiples productos de proteína deseados simultáneamente) en hospedadores eucarióticos (por ejemplo, un microorganismo hospedador eucariótico) usando un sistema de expresión de la presente invención con promotores de núcleo universales.

La presente invención de esta manera proporciona un sistema de expresión ortogonal el cual es funcional (transferible) en un espectro amplio de organismos eucarióticos o microorganismos eucarióticos, lo cual permite la expresión robusta, estable y predecible de los niveles de expresión de los genes objetivo, y no es influido por condiciones de cultivo o etapas de desarrollo o de crecimiento del organismo hospedador.

El sistema de expresión que se proporciona por esta invención simplifica y enfoca las herramientas genéticas necesarias para construir hospedadores de expresión nuevos. Actualmente existe un arreglo amplio de sistemas de expresión que son altamente específicos para organismo y para especie. Con la presente invención, la industria y la comunidad científica más amplia que trabaje con organismos eucarióticos puede adoptar un conjunto común, más pequeño, de herramientas de expresión ortogonales. Esto beneficiará a la comunidad y dará impulso a innovaciones nuevas en el campo.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 muestra un esquema de un sistema de expresión para la expresión de un gen único en un organismo eucariótico (por ejemplo, un microorganismo eucariótico).

Las figuras 2A - 2C muestran un esquema de un método de cribado para seleccionar los UCP a partir de los promotores de núcleo candidatos.

La figura 3 muestra un esquema de un sistema de expresión usando los UCP para regulación simultánea de la expresión de múltiples genes en un organismo eucariótico como por ejemplo un microorganismo eucariótico. La figura 4 muestra ejemplos de los sistemas de expresión funcionales/transferibles en diversos organismos o microorganismos.

Las figuras 5A y 5B muestran pruebas de diferentes versiones de los sTF y determinación de modulación del funcionamiento de los sistemas de expresión en Saccharomyces cerevisiae por fluorometría.

Las figuras 6A y 6B muestran el análisis de los sistemas de expresión en diversos hospedadores micóticos. El análisis cuantitativo de la expresión del gen indicador determinada por citometría de flujo de fluorescencia (fig. 6A) y por fluorometría (fig. 6B).

Las figuras 7A - 7D muestran el análisis de los niveles de expresión ajustables en diferentes hospedadores (Pichia kudriavzevii, Aspergillus niger y Trichoderma reesei) por citometría de flujo de fluorescencia y Western blot. Las figuras 8A y 8B muestran el esquema del sistema de expresión (fig. 8A) y el análisis de la expresión de un gen indicador en Kazachstanis exigua (fig. 8B) por PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR, por sus siglas en inglés). Las figuras 9A - 9D muestran el análisis de la producción de proteína en diversos hospedadores de expresión (Trichoderma reesei y Pichia pastoris) que contienen el sistema de expresión.

Descripción detallada de la invención

Definiciones

A menos que se defina en otro sentido, todos los términos técnicos y científicos que se usan en la presente tienen el mismo significado al entendido habitualmente por una persona experta en el ámbito al cual pertenece la invención. ADN se refiere al ácido desoxirribonucleico.

Codón es una unidad de tres nucleótidos la cual se codifica para un aminoácido único en los genes que codifican para las proteínas. Los codones que codifican para un aminoácido pueden diferir en cualquiera de sus tres nucleótidos. Diferentes organismos tienen diferente frecuencia de los codones en sus genomas, lo cual tiene implicaciones para la eficiencia de traducción de ARNm y producción de proteína.

Secuencia codificante se refiere a una secuencia de ADN que codifica para un ARN o polipéptido específico (es decir, una secuencia específica de aminoácidos). En algunas instancias, la secuencia codificante puede contener intrones (es decir, secuencias adicionales que interrumpen el marco de lectura, las cuales son removidas durante la maduración de la molécula de ARN en un proceso que se denomina empalmado de ARN). Si la secuencia codificante codifica para un polipéptido, esta secuencia contiene un marco de lectura.

Marco de lectura se define por un codón de inicio (AUG en ARN; que corresponde a ATG en una secuencia de ADN) y es una secuencia de codones consecutivos que codifican para un polipéptido (proteína). El marco de lectura finaliza con un codón de detención (uno de los siguientes tres: UAG, UGA y UAA en ARN; que corresponden a TAG, TGA y TAA en una secuencia de ADN). Una persona experta en el ámbito puede predecir la ubicación de los marcos de lectura abiertos mediante el uso de programas y bases de datos de computadora disponibles de manera general.

Un promotor eucariótico es una región de ADN necesaria para el inicio de transcripción de un gen. Se encuentra hacia el extremo cinco prima (corriente arriba) de una secuencia de ADN que codifica para un ARN o polipéptido específicos (secuencia codificante). Contiene una secuencia de activación hacia el extremo cinco prima (UAS, por sus siglas en inglés) y un promotor de núcleo. Una persona experta en el ámbito puede predecir la ubicación de un promotor usando programas de computadora y base de datos disponibles de manera general.

Promotor de núcleo (CP, por sus siglas en inglés) es una parte de un promotor eucariótico y es una región del ADN inmediatamente hacia el extremo cinco prima (región corriente arriba o 5') de una secuencia codificante la cual codifica para un polipéptido, como se define por el codón de inicio. El promotor de núcleo comprende la totalidad de los motivos reguladores de transcripción generales necesarios para el inicio de transcripción, como por ejemplo, la caja TATA, pero no comprende motivo regulador específico alguno, como por ejemplo las secuencias de UAS (sitios de unión para activadores nativos y represores).

El promotor de núcleo se define con el propósito de la presente invención como una secuencia de ADN que contiene: 1) una región 5' de un gen altamente expresado que comienza 10 a 50 bp (siglas en inglés para pares de bases) hacia el extremo 5' de la caja TATA y que finaliza 9 bp hacia el extremo 5' del codón de inicio, en donde la distancia entre la caja TATA y el codón de inicio es no mayor de 180 bp y es no menor de 80 bp, 2) 1 a 20 bp aleatorios, típicamente 5 a 15 o 6 a 10, los cuales se localizan en lugar de los 9 bp de la región de ADN (1) inmediatamente hacia el extremo cinco prima del codón de inicio; o como una secuencia de ADN que contiene: 1) una secuencia de ADN que tiene por lo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con la región 5', y 2) 1 a 20 bp aleatorias, típicamente 5 a 15 o 6 a 10, las cuales se localizan en lugar de las 9 bp de la región de ADN (1) inmediatamente hacia el extremo cinco prima del codón de inicio. Un gen altamente expresado en un organismo en el contexto de esta invención es un gen el cual se ha demostrado en ese organismo que se expresa entre un máximo de 3% o 5% de todos los genes en cualquier condición estudiada, determinado por análisis transcriptómico o un gen, en un organismo en donde el análisis transcriptómico no se ha realizado, el cual es el homólogo de secuencia más cercano para el gen altamente expresado.

La caja TATA se define con el propósito de la presente invención como una secuencia de ADN (TATA) hacia el extremo cinco prima del codón de inicio, en donde la distancia de la secuencia TATA y el codón de inicio es no mayor de 180 bp y no menor de 80 bp. En caso de secuencias múltiples que satisfagan la descripción, la caja TATA se define como la secuencia TATA con la distancia más pequeña desde el codón de inicio.

Factor de transcripción se refiere a una proteína que se une a secuencias de ADN específicas presentes en la UAS y de esta manera controlan la velocidad de transmisión, la cual se realiza por la a Rn II polimerasa. Los factores de transcripción realizan su función solos o con otras proteínas en un complejo, al promover (como un activador), o al bloquear (como un represor) el reclutamiento de ARN polimerasa a promotores de núcleo de los genes. El factor de transcripción sintético (sTF) se refiere a una proteína la cual funciona como un factor de transcripción pero no es una proteína nativa de un organismo hospedador. En el contexto de esta invención, el sTF es una proteína artificial la cual típicamente contiene una proteína de unión a ADN de origen procariótico, una señal de localización nuclear y un dominio de activación de transcripción de origen viral.

Un promotor sintético se refiere a una región de ADN la cual funciona como un promotor eucariótico pero no es un promotor que se encuentre de modo natural en un organismo hospedador. Contiene una secuencia de activación hacia el extremo cinco prima (UAS) y un promotor de núcleo, en donde la UAS o el promotor de núcleo, o ambos elementos, no son nativos para el organismo hospedador. En el contexto de esta invención, el promotor sintético comprende (habitualmente 1 a 10, típicamente 1, 2, 4, u 8) sitios de unión específicos para sTF (UAS sintética -sUAS, por sus siglas en inglés) enlazada a un promotor de núcleo.

El dominio de unión a ADN, o DBD (por sus siglas en inglés) se refiere a la región de una proteína, típicamente un dominio de proteína específico el cual es responsable para interacción (unión) de la proteína con una secuencia de ADN específica.

Un promotor de núcleo universal (UCP) es un promotor de núcleo el cual confiere suficiente (de manera habitual pero no necesariamente por lo menos 40% de) expresión de indicador o nivel de actividad, como por ejemplo nivel de fluorescencia, obtenido con el promotor de núcleo PKG1 de Saccharomyces cerevisiae en un sistema de cribado de CP, como se describe en la presente invención. Un promotor de núcleo seleccionado mediante el uso de este sistema típicamente proporciona suficiente expresión de un factor de transcripción en diversas especies y géneros de organismos eucarióticos.

Un sistema de expresión ortogonal significa aquí un sistema de expresión que consiste de promotores de núcleo heterólogos (no nativos), uno o varios factores de transcripción y sitios de unión específicos para factor de transcripción. Típicamente, el sistema de expresión ortogonal es funcional (transferible) en diversos organismos eucarióticos como por ejemplo microorganismos eucarióticos.

Un sistema de cribado de CP se construye en Saccharomyces cerevisiae y comprende una cepa de Saccharomyces cerevisiae que de manera constitutiva expresa un sTF y preferiblemente un plásmido indicador de tipo centromérico ensamblado con el promotor de núcleo que se va a probar. El plásmido indicador típicamente contiene sitios de unión específicos para el sTF, un gen indicador, como por ejemplo el gen mCherry y un terminador, como por ejemplo el terminador ADH1 para el gen mCherry. El promotor de núcleo probado se inserta entre los sitios de unión de sTF y el gen indicador. El promotor de núcleo probado típicamente comprende, en su extremo 3', una secuencia que comprende 1 a 20 nucleótidos aleatorios, como por ejemplo la secuencia TTAATTAAA, y típicamente incluye sitios de restricción. La función del promotor de núcleo se determina por una medición de indicador, como por ejemplo medición de fluorescencia de la cepa resultante y se compara con una cepa control en donde el promotor de núcleo es el promotor de núcleo PKG1 de Saccharomyces cerevisiae. Un plásmido centromérico se refiere aquí a un número de copias único o bajo de plásmido usado en S. cerevisiae. Este plásmido contiene regiones de ADN funcionales como un centrómero (secuencia de CEN, por sus siglas en inglés) y como una secuencia que se replica de manear autónoma (ARS, por sus siglas en inglés) en S. cerevisiae. La secuencia ARS proporciona origen de replicación y la secuencia CEN regula la replicación y distribución de los plásmidos durante la división celular lo que vuelve al plásmido centromérico análogo a un cromosoma.

Expresión suficiente de un factor de transmisión se define como un nivel de expresión de un factor de transcripción que da como resultado la activación de transcripción de un gen o genes los cuales están bajo el control de uno o varios promotores dependientes del factor de transcripción.

Un organismo eucariótico se define, en el contexto de esta invención, como un organismo que pertenece a: 1) el reino de los hongos que incluye levaduras, como las clases Saccharomycetales, que incluye pero que no se limita a especies Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, Candida krusei (Pichia kudriavzevii), Pichia pastoris, (Komagataella pastoris), Eremothecium gossypii, Kazachstania exigua, Yarrowia lipolytica y otras; o Schizosaccharomycetes como por ejemplo Schizosaccharomyces pombe, hongos filamentosos tales como las clases Eurotiomycetes, que incluye pero que no se limita a las especies Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Penicillium chrysogenum y otros; Sordariomycetes, que incluyen pero que no se limitan a las especies Trichoderma reesei, Myceliophthora thermophile y otros; o Mucorales como por ejemplo Mucor indicus y otros. 2) reino vegetal, que incluye plantas con flores tales como los órdenes Solanales, que incluye pero que no se limita al género Nicotiana (N. benthamiana), Solanum (S. tuberosum), Lycopersicon (L. esculentum), Capsicum (C, anuum) y otros; Brassicales que incluyen pero que no se limitan a los géneros Arabidopsis (A. thaliana), Brassica (B. napus) y otros; Poales que incluyen pero que no se limitan a especies Avena sativa, Secale cereale, Zea mays, Triticum spp., Oryza sativa, Hordeum vulgare, Sorghum bicolor, Saccharum officinarum y otros; Fabales que incluyen pero que no se limitan a especies Phaseolus spp., Vigna spp., Glycine max, Pisum sativum, Lens culinaris, Cicer arietinum y otros; Malpighiales, que incluyen pero que no se limitan al género Populus y otros; Pinales, que incluyen pero que no se limitan al género Pinus y otros; o Arecales que incluyen pero que no se limitan a especies Elaeis guineensis, Cocos nucifera y otros; y algas verdes tales como las clases Chlorophyceae que incluyen pero que no se limitan al género Chlamydomonas (C. reinhardtii); o Trebouxiophyceae, que incluyen pero que no se limitan a la especie Chlorella spp., y otros. 3) reino animal, que incluye mamíferos (Mammalia), que incluye pero que no se limitan a la especie Mus musculus (ratón), Cricetulus griseus (hámster), Homo sapiens (humano) y otros; insectos que incluyen pero que no se limitan a las especies Mamestra brassicae, Spodoptera frugiperda, Trichoplusia ni, Drosophila melanogaster y otros.

Microorganismo eucariótico se define en el contexto de la invención como un microorganismo que incluye levaduras, tales como las clases Saccharomycetales, que incluye pero que no se limita a las especies Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, Candida krusei (Pichia kudriavzevii), Pichia pastoris, (Komagataella pastoris), Eremothecium gossypii, Kazachstania exigua, Yarrowia lipolytica y otras; o Schizosaccharomycetes como por ejemplo Schizosaccharomyces pombe; y hongos filamentosos como por ejemplo las clases Eurotiomycetes, que incluye pero que no se limita a las especies Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Penicillium chrysogenum y otros; Sordariomycetes, que incluyen pero que no se limitan a las especies Trichoderma reesei, Myceliophthora thermophile y otros; o Mucorales como por ejemplo Mucor indicus y otros. La presente divulgación proporciona un sistema de expresión para un hospedador eucariótico, el cual comprende: (a) un casete de expresión que comprende un promotor de núcleo;

el promotor de núcleo es el único promotor para controlar la expresión de una secuencia de ADN que codifica para el factor de transcripción sintético (sTF), y

(b) uno o más casetes de expresión, cada uno comprende una secuencia de ADN que codifica para un producto de proteína deseado enlazado operablemente a un promotor sintético;

el promotor sintético comprende un promotor de núcleo, el cual es idéntico al promotor de núcleo en (a) u otro promotor de núcleo, y uno o más sitios de unión específicos para sTF hacia el extremo cinco prima del promotor de núcleo.

La presente invención proporciona un sistema de expresión definido en las reivindicaciones 1 - 5.

El promotor de núcleo típicamente comprende una secuencia de ADN que contiene la región 5' de un gen eucariótico, partiendo de 10 a 50 bp hacia el extremo cinco prima de una caja TATA y finalizando 9 bp hacia el extremo cinco prima de un codón de inicio ATG. La distancia entre la caja TATA y el codón de inicio es no mayor de 180 bp y no menor de 80 bp. El promotor de núcleo típicamente comprende también una secuencia de ADN que comprende 1 a 20 bp aleatorios en su extremo 3'. En una modalidad, el promotor de núcleo típicamente comprende una secuencia de ADN que tiene por lo menos 90% de identidad de secuencia con la región 5' del gen eucariótico y una secuencia de ADN que comprende 1 a 20 bp aleatorio en su extremo 3'.

La secuencia de ADN que codifica para el factor de transcripción sintético (sTF) típicamente comprende un regulador de transcripción procariótico, una señal de localización nuclear y un dominio de activación de transcripción.

Los CP usados en el sistema de expresión pueden ser diferentes, o el primero, CP1, puede ser idéntico al segundo, CP2 (o al tercer, CP3 o al cuarto, c P4). Esto se ilustra de la figura 1 - 3.

Los dos casetes de expresión ((a) y (b)) se pueden introducir en un hospedador eucariótico (típicamente integrado en un genoma) como dos moléculas de ADN individuales, o como una molécula de ADN en la cual los dos (o más) casetes de expresión están conectados (fusionados) para formar un ADN único.

En aplicaciones específicas, en donde el gen objetivo es un gen nativo (homólogo) de un organismo hospedador, el promotor sintético también se puede insertar inmediatamente hacia el extremo cinco prima de la región codificante del gen objetivo en el genoma del organismo hospedador, posiblemente sustituyendo al promotor original (nativo) del gen objetivo.

De manera más específica, el sistema de expresión de este modo comprende dos partes de ADN, las cuales están ensambladas en el sistema de expresión que comprende por lo menos dos casetes de expresión individuales:

(a) un casete de sTF - factor de transcripción sintético - el cual comprende un CP que controla la expresión de un gen que codifica para una proteína de fusión (sTF), el sTF mismo y un terminador. El sTF comprende una proteína que une ADN derivada de origen procariótico, típicamente reguladores de transcripción bacterianos, como por ejemplo a partir de la familia TetR; señal de localización nuclear, como por ejemplo NLS de SV40; y un dominio de activación de transcripción como por ejemplo el dominio de activación VP16 o VP64; y

(b) un casete de expresión de gen objetivo, el cual comprende un promotor sintético, el cual comprende un número variable de sitios de unión sTF, habitualmente 1 a 10, típicamente 1, 2, 4 u 8, separados por 0 a 20, típicamente 5 a 15 nucleótidos aleatorios, un CP, un gen objetivo y un terminador.

La composición del sistema de expresión ejemplar se ilustra en la figura 1.

La presente invención se basa en la idea de usar un promotor de núcleo (CP), en vez de un promotor completo, para la expresión de un factor de transcripción sintético (sTF). Algunos CP pueden sostener un nivel bajo de transcripción cuando se colocan frente a un gen. Debido a la ausencia de secuencias reguladoras específicas necesarias para control de transcripción condicional las cuales están presentes en promotores completos (típicamente en la secuencia de activación hacia el extremo cinco prima - UAS, por sus siglas en inglés), esta transcripción es constitutiva - esto es, constante en todas las condiciones de crecimiento o metabólicas. Debido a que la maquinaria de transcripción general está conservada evolutivamente, algunos de los CP pueden funcionar en especies muy diversas. Estos rasgos se usan en la invención para la construcción de sistemas de expresión transferibles entre especies.

La expresión baja constitutiva del gen de sTF se facilita por un CP que proporcione una cantidad suficiente de un factor de transcripción sintético, el cual se una a sitios de unión específicos sobre el promotor sintético del gen objetivo y que active su expresión. El número de sitios de unión es proporcional al nivel de expresión de uno o varios de los genes objetivo, en donde más sitios de unión resultan en una expresión superior. El promotor sintético comprende, además de los sitios de unión a sTF, también un CP. La elección de CP en el promotor sintético que controla la expresión de uno o varios de los genes objetivo también es importante para el nivel de expresión de uno o varios de los genes objetivo. La combinación de los sitios de unión de sTF y el CP puede resultar en una gama de niveles de expresión los cuales se pueden modular desde muy bajo hasta muy alto. En el extremo alto, la expresión obtenida por este sistema excede los niveles de expresión de los genes nativos expresados de manera más elevada en un organismo hospedador.

La figura 1 ilustra un ejemplo de un esquema de un sistema de expresión para la expresión de un gen único en un organismo o microorganismo eucariótico. El casete de expresión del factor de transcripción sintético (sTF) contiene un CP (CP1), una secuencia codificante de sTF y un terminador. El CP1 proporciona expresión baja constitutiva del sTF. Por lo tanto, el sTF está presente en una célula hospedadora en un nivel constante en todo momento, en todas las condiciones de crecimiento y en todas las etapas de desarrollo y de crecimiento. El casete de expresión del gen objetivo contiene un promotor sintético, una secuencia codificante de gen objetivo y un terminador. El promotor sintético comprende múltiples sitios de unión específicos para sTF (habitualmente 1 a 10, típicamente 1, 2, 4 u 8; que forman una secuencia de activación hacia el extremo cinco prima sintética - sUAS), y un CP (CP2). El gen objetivo codifica para un producto de proteína de interés.

La actividad de transcripción del CP1, la “señal” es “amplificada” por el sTF unido a la sUAS. Esto da como resultado la activación de transcripción sobre el CP2, lo que resulte la expresión del gen objetivo. Como se describe en lo anterior, los dos casetes de expresión se pueden introducir en un hospedador eucariótico (típicamente integrado en un genoma) como dos moléculas de ADN individuales, o como una molécula de ADN en la cual los dos casetes están conectados (fusionado) en un ADN único. En aplicaciones específicas, cuando el gen objetivo es un gen nativo (homólogo) de un organismo hospedador, el promotor sintético también se puede incrementar inmediatamente corriente arriba de la región codificante del gen objetivo en el genoma del organismo hospedador. Los CP usados en el sistema de expresión pueden ser diferentes, o el CP1 puede ser idéntico al CP2.

La presente invención también proporciona un hospedador eucariótico (por ejemplo, un microorganismo hospedador eucariótico) el cual comprende el sistema de expresión como se describe en la presente.

Un organismo eucariótico se refiere en particular a: 1) especies de hongos que incluye levaduras, como por ejemplo especies de las clases Saccharomycetales, que incluye pero que no se limita a especies Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, Candida krusei (Pichia kudriavzevii), Pichia pastoris, (Komagataella pastoris), Eremothecium gossypii, Kazachstania exigua, Yarrowia lipolytica y otras; Schizosaccharomycetes como por ejemplo Schizosaccharomyces pombe, y especies de hongos filamentosos, como por ejemplo aquellos de las clases Eurotiomycetes, que incluyen pero que no se limitan a las especies Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Penicillium chrysogenum y otros; Sordariomycetes, que incluyen pero que no se limitan a Trichoderma reesei, Myceliophthora thermophile y otros; Mucorales como por ejemplo Mucorindicus y otros; 2) especies vegetales que incluye plantas con flores tales como las especies de los órdenes Solanales, que incluyen pero que no se limitan a Nicotiana benthamiana, Solanum tuberosum, Lycopersicon esculentum, Capsicum anuum) y otros; Brassicales que incluyen pero que no se limitan a Arabidopsis thaliana, Brassica napus y otros; Poales que incluyen pero que no se limitan a especies Avena sativa, Secale cereale, Zea mays, Triticum spp., Oryza sativa, Hordeum vulgare, Sorghum bicolor, Saccharum officinarum y otros; Fabales que incluyen pero que no se limitan a especies Phaseolus spp., Vigna spp., Glycine max, Pisum sativum, Lens culinaris, Cicer arietinum y otros; Malpighiales, que incluyen pero que no se limitan a Populus sp., y otros; Pinales, que incluyen pero que no se limitan al género Pinus sp., y otros; o Arecales que incluyen pero que no se limitan a Elaeis guineensis, Cocos nucifera y otros; y especies de algas verdes, que incluyen pero que no se limitan a Chlamydomonas reinhardtii, Chlorella spp., y otros; 3) especies animales que incluyen pero que no se limitan a mamíferos (Mammalia), que incluyen pero que no se limitan a especies Mus musculus (ratón), Cricetulus griseus (hámster), Homo sapiens (humano) y otros; especies de insectos, que incluyen pero que no se limitan a las especies Mamestra brassicae, Spodoptera frugiperda, Trichoplusia ni, Drosophila melanogaster y otros.

La presente invención también proporciona un método para producir un producto de proteína deseado en un hospedador eucariótico (por ejemplo, un microorganismo hospedador) que comprende cultivar el hospedador bajo condiciones de cultivo adecuadas.

Mediante condiciones de cultivo adecuadas se quiere indicar cualquier condición que permita la supervivencia o crecimiento del organismo hospedador y/o la producción del producto deseado en el organismo hospedador. El producto deseado puede ser un producto del gen o los genes objetivo (proteína o proteínas), o un compuesto producido por una proteína (enzima) o por una vía metabólica. En el presente contexto el producto deseado típicamente es un producto de proteína (enzima).

La presente invención también proporciona un sistema de expresión de gen el cual es funcional en varias especies y géneros eucarióticos diferentes. El elemento clave en el sistema es un promotor de núcleo que facilite la expresión en varias especies. Este promotor de núcleo se denomina en la presente como promotor de núcleo universal - UCP. Esta propiedad, denominada actividad de transcripción basal, se basa en el eficiente reclutamiento del complejo de ARN polimerasa II al promotor de núcleo; y resulta en un nivel de expresión bajo pero estable en todas las condiciones de cultivo y de crecimiento (de desarrollo). Esta señal constitutiva baja se amplifica por un factor de transcripción sintético (sTF), cuya expresión es controlada por el UCP, a un nivel de expresión ajustable de los genes objetivo (nativos o heterólogos). Cada gen objetivo está bajo el control de un promotor manipulado y comprende un número seleccionado de sitios de unión específicos para sTF y un UCP. La combinación de los sitios de unión específicos para sTF y el UCP definen el nivel de expresión del gen objetivo.

Esto proporciona medios para controlar la expresión en diversos hospedadores, que incluyen aquellos con la forma de funcionar no desarrollada. Las aplicaciones del uso de los UCP son producción de proteínas, manipulación metabólica y redes reguladoras genéticas artificiales.

Además, el sistema puede ser usado como una plataforma para identificar UCP nuevos con propiedades novedosas. La presente divulgación proporciona un método para identificar un promotor de núcleo universal para hospedadores eucarióticos. El método comprende:

- expresar de manera constitutiva un factor de transcripción sintético, sTF en Saccharomyces cerevisiae, - co-expresar en el mismo hospedador un gen indicador enlazado operablemente a un promotor de prueba dependiente de sTF, el promotor de prueba dependiente de sTF comprende un promotor de núcleo que se va a probar, y sitios de unión a sTF hacia el extremo cinco prima de manera que

- permitan que el gen indicador sea expresado bajo el promotor de prueba en presencia de activación por el sTF, - determinar el nivel de expresión del gen indicador, y

- seleccionar a partir de los promotores de núcleo probados, promotores de núcleo que muestren por lo menos 40% como expresión alta del gen indicador como se obtiene con el promotor de núcleo PGK1 de S. cerevisiae probado en el mismo sistema indicador,

- en casos específicos, también seleccionar promotores de núcleo que muestren menos de 40% de nivel de expresión indicador.

De manera más específica, el método comprende de modo óptimo el uso de un plásmido centromérico circular que comprende los sitios de uniones específicos para sTF enlazados operablemente al promotor de núcleo probado, y un gen indicador.

La secuencia de ADN que codifica para el factor de transcripción sintético (sTF) típicamente comprende una secuencia de ADN que codifica para una proteína de unión a ADN de origen procariótico, una señal de localización nuclear y un dominio de activación de transcripción. El sTF comprende una proteína de unión a ADN derivada de origen procariótico, típicamente bacteriano, reguladores de transcripción como por ejemplo una proteína de la familia TetR; una señal de localización nuclear como por ejemplo NLS de SV40; y un dominio de activación de transcripción como por ejemplo un dominio de activación VP16 o VP64.

El promotor que se va a probar se selecciona de los promotores de genes eucarióticos expresados en el nivel de 3% o 5% más altos de todos los genes, en cualquier condición en el organismo eucariótico dado.

La presente divulgación proporciona un promotor de núcleo universal (UCP) en el cual el promotor de núcleo se puede obtener por el método de identificación como se describe en la presente.

Típicamente, un promotor de núcleo universal comprende una secuencia de ADN que contiene: 1) la región 5' de un gen eucariótico, comenzando 10 a 50 bp hacia el extremo cinco prima de una caja TATA y finalizando 9 bp hacia el extremo cinco prima del codón de inicio ATG; y 2) una secuencia aleatoria de 1 a 20 bp de ADN la cual se localiza en lugar de los 9 bp de la región de ADN (1) inmediatamente hacia el extremo cinco prima del codón de inicio. La distancia entre la caja TATA y el codón de inicio del gen eucariótico original es no mayor de 180 bp y no menor de 80 bp. En una modalidad, el promotor de núcleo comprende una secuencia de ADN que tiene por lo menos 90% de identidad de secuencia con la región 5' corriente arriba y una secuencia de ADN aleatoria de 1 a 20 bp la cual se localiza en lugar de los 9 bp de la región de ADN (1) inmediatamente corriente arriba del codón de inicio.

La selección de los CP funcionales en organismos distantes se lleva a cabo en Saccharomyces cerevisiae, y las fuentes de los CP candidatos preferiblemente son (aunque no de manera necesaria) organismos industrialmente relevantes, de manera preferible (pero no necesariamente) distante en términos de divergencia evolutiva o en otros rasgos, como por ejemplo arquitectura del genoma o contenido de GC.

La selección de los CP candidatos se basa en el nivel de expresión de los genes en los organismos fuente seleccionados, que contienen el CP candidato en sus promotores.

Otro criterio de selección es la presencia de una caja TATA en el CP candidato (figura 2A).

En una modalidad, el cribado por los CP funcionales ventajosamente se realiza mediante ensamblado in vivo del CP candidato con el casete indicador, dependiente de sTF, expresado en una cepa de S. cerevisiae que expresa de manera constitutiva el sTF (figura 2B). Las cepas resultantes se prueban para un nivel de un indicador, preferiblemente fluorescencia, y estos niveles se comparan con una cepa control en donde el promotor del núcleo PGK1 de S. cerevisiae se usa en la construcción de indicador. Los CP candidatos, los cuales facilitan niveles suficientes de indicador, preferiblemente fluorescencia (habitualmente, pero de manera necesaria mayor de 40% de) la cepa control (figura 2C) y por lo tanto satisfacen los criterios de cribado se denominan promotores de núcleo universales, los UCP. Los CP y los UCP seleccionados se usan para la construcción de los sistemas de expresión.

Los sistemas de expresión resultantes son funcionales en hospedadores eucarióticos. Estos hospedadores incluyen todos los organismos eucarióticos, en particular: 1) microorganismos micóticos que incluyen hongos filamentosos y levaduras, en particular organismos de los siguientes taxa: A) Saccharomycetales, que incluyen pero que no se limitan a las especies Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis, Candida krusei (Pichia kudriavzevii), Pichia pastoris, (Komagataella pastoris), Eremothecium gossypii, Kazachstania exigua, Yarrowia lipolytica y otros; Schizosaccharomycetes como por ejemplo Schizosaccharomyces pombe; B) Eurotiomycetes, que incluyen pero que no se limitan a especies Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Penicillium chrysogenum y otros; C) Sordariomycetes, que incluyen pero que no se limitan a las especies Trichoderma reesei, Myceliophthora thermophile y otros; D) Mucorales como por ejemplo Mucorindicus y otros. 2) organismos vegetales, que incluyen plantas de floración y algas verdes, en particular organismos de los siguientes taxa: E) Solanales, que incluyen pero que no se limitan a especies Nicotiana benthamiana, Solanum tuberosum, Lycopersicon esculentum, Capsicum anuum, y otros; F) Brassicales que incluyen pero que no se limitan a especies Arabidopsis thaliana, Brassica napus y otros; G) Poales que incluyen pero que no se limitan a especies Avena sativa, Secale cereale, Zea mays, Triticum spp., Oryza sativa, Hordeum vulgare, Sorghum bicolor, Saccharum officinarum y otros; H) Fabales que incluyen pero que no se limitan a especies Phaseolus spp., Vigna spp., Glycine max, Pisum sativum, Lens culinaris, Cicer arietinum y otros; I) Malpighiales, que incluyen pero que no se limitan a Populus sp., y otros; J) Pinales, que incluyen pero que no se limitan a especies Pinus sp., y otros; K) Arecales que incluye pero que no se limita a Elaeis guineensis, Cocos nucifera y otros; L) Chlorophyceae, que incluye pero que no se limita a especies Chlamydomonas reinhardtii y otros; M) Trebouxiophyceae, que incluye pero que no se limita a las especies Chlorella spp., y otros; 3) organismos animales, en particular organismos de los siguientes taxa: N) mamíferos (Mammalia), que incluyen pero que no se limitan a especies Mus musculus (ratón), Cricetulus griseus (hámster), Homo sapiens (humano) y otros; O) insectos (Insecta), que incluyen pero que no se limitan a las especies Mamestra brassicae, Spodoptera frugiperda, Trichoplusia ni, Drosophila melanogaster y otros.

Las figuras 2A - 2C ilustran un ejemplo de un esquema del método de cribado usado para seleccionar los UCP a partir de promotores de núcleo candidatos.

La figura 2A ilustra un esquema de selección de un promotor de núcleo candidato en un organismo eucariótico. La región de ADN inmediatamente hacia el extremo cinco prima del gen de cualquier organismos eucariótico, el cual pertenece a un grupo de máximo 3% o 5% de los genes expresados con el nivel más alto en cualquier condición, se analiza para determinar la presencia de la secuencia TATA (caja TATA) dentro de -180 bp y - 80 bp hacia el extremo cinco prima de un codón de inicio (ATG). Si más de una secuencia TATA aparece en esta región, la más cercana a ATG (codón de inicio) se selecciona como la caja TATA. La secuencia que empieza 10 a 50 bp hacia el extremo cinco prima de la caja TATA y que finaliza 9 bp hacia el extremo cinco prima de ATG (codón de inicio) se selecciona para la criba de promotor de núcleo.

La figura 2B ilustra una cepa de Saccharomyces cerevisiae que expresa de manera constitutiva un sTF. Es co-transformada típicamente con un plásmido centromérico linealizado (número de copias único o bajo) y una biblioteca, de versiones individuales, de los promotores de núcleo que se van a probar. El plásmido centromérico típicamente contiene, por ejemplo, 4 sitios de unión a sTF, el gen indicador, como por ejemplo el gen mCherry y es linealizado entre estos dos rasgos, como se muestra en la figura. Cada fragmento de ADN promotor de núcleo comprende la secuencia de ADN seleccionada (figura 2A) seguida por una secuencia que comprende nucleótidos aleatorios, que típicamente contienen sitios de restricción, aquí una secuencia útil es, por ejemplo, TTAATTAAA, y está flanqueada por secuencias de ADN de 20 a 50 bp de longitud sobre cada extremo. Estas secuencias flanqueantes son homólogas a cada extremo del plásmido linealizado, la secuencia flanqueante 5' es homóloga a una región que parcialmente cubre los sitios de unión de sTF en el plásmido linealizado, y la secuencia flanqueante 3' es homóloga al extremo 5' del gen indicador, como por ejemplo el gen mCherry, marco de lectura abierto. Después de la transformación, el plásmido se ensambla in vivo por medio de maquinaria de recombinación homóloga intrínseca de la levadura Saccharomyces cerevisiae lo que resulta en un plásmido centromérico circular que comprende los sitios de unión a sTF, seguido por un promotor de núcleo que incluye una secuencia como por ejemplo TTAATTAAA y el gen indicador, como por ejemplo el gen mCherry. Las cepas resultantes son analizadas para el indicador, como por ejemplo una fluorescencia roja causada por la proteína mCherry producida. El nivel de intensidad del indicador, como por ejemplo la fluorescencia, es correspondiente al nivel de expresión del gen indicador, como por ejemplo el gen mCherry, lo cual corresponde a la función del promotor de núcleo probado.

En la figura 2C se seleccionan cepas transformadas, las cuales confieren suficiente nivel de indicador, tal como fluorescencia, el cual típicamente es 40% mayor que el indicador, por ejemplo fluorescencia de la cepa que contiene el promotor del núcleo PGK1 ensamblado en el mismo plásmido centromérico (resaltado por la flecha en la figura 2C). Los plásmidos centroméricos se aíslan de las cepas seleccionadas, el ADN plásmido es purificado y secuenciado, y los promotores de núcleo seleccionados se usan para construcciones subsecuentes de casetes de expresión para pruebas en otros organismos eucarióticos. En casos específicos, también los promotores de núcleo los cuales no confieren 40% o nivel superior de expresión de indicador se usan para construcciones de casetes de expresión para organismos eucarióticos. En caso de que el promotor de núcleo sea funcional en el hospedador de donador de promotor de núcleo y también en por lo menos otro hospedador el cual es en una especie diferente del hospedador de donador de promotor de núcleo, entonces el promotor de núcleo se asigna como promotor de núcleo universal, UCP.

La presente invención proporciona un promotor de núcleo universal (UCP) el cual se puede obtener por el método que se describe. Típicamente, el UCP comprende una secuencia de ADN que contiene: 1) la región 5' de un gen eucariótico, comenzando 10 a 50 bp hacia el extremo cinco prima de una caja TATA y finalizando 9 bp hacia el extremo cinco prima del codón de inicio ATG, y en donde la distancia entre la caja TATA y el codón de inicio es no mayor de 180 bp y no menor de 80 bp. 2) y una secuencia de ADN que comprende 1 a 20 bp aleatorios los cuales se localizan en el extremo 3' de la secuencia de ADN (1). En una modalidad, el promotor de núcleo universal comprende 1) una secuencia de ADN que tiene por lo menos 90% de identidad de secuencia con la región 5', y 2) una secuencia de ADN que comprende 1 a 20 bp aleatorios los cuales se localizan en el extremo 3' de la secuencia de ADN.

La presente divulgación proporciona también un sistema de expresión para un hospedador eucariótico, el cual comprende:

(a) un casete de expresión que comprende un UCP,

el UCP que controla la expresión de una secuencia de ADN que codifica para el factor de transcripción sintético (sTF), y

el promotor sintético comprende un UCP de (a) u otro UCP, y sitios de unión específicos para sTF hacia el extremo cinco prima del UCP.

Es posible construir múltiples promotores sintéticos con diferentes números de sitios de unión (habitualmente 1 a 10, típicamente 1, 2, 4 u 8 separados por 0 a 20, típicamente 5 a 15 nucleótidos aleatorios) que controlan diferentes genes objetivo simultáneamente por un sTF. Esto resultaría, por ejemplo en un conjunto de genes expresados de manera diferente que forman una vía metabólica.

La figura 3 ilustra un ejemplo de un esquema de un sistema de expresión usando los UCP para una regulación simultánea de la expresión de múltiples genes en un organismo eucariótico (por ejemplo, microorganismo). El esquema muestra una vía metabólica hipotética, pero el enfoque también se puede usar para otros sistemas de expresión de genes múltiples (señalización, transporte o vías de glucosilación, producción simultánea de proteínas, etc.) o sus combinaciones.

El casete de expresión (A) del factor de transcripción sintético (sTF) en la figura 3 es análogo al que se muestra en la figura 1, cumpliendo con el mismo propósito. Los casetes de expresión de gen objetivo pueden estar presentes en un número variable que varía de 1 a 20. Cada casete de expresión de gen objetivo contiene un promotor sintético el cual puede tener una arquitectura clásica (monodireccional) (B) o un diseño bidireccional (C). El promotor sintético (monodireccional o bidireccional) consiste de múltiples sitios de unión específicos para sTF (habitualmente 1 a 10, típicamente 1, 2, 4 u 8) y un UCP. Los genes objetivo (gen A, B, C, D) codifican para proteínas de interés las cuales pueden formar una vía metabólica o su parte, o pueden codificar para cualquier combinación de proteínas dependiendo de la aplicación.

La función del sistema de expresión que se ilustra en la figura 3 es análogo al que se presenta en la figura 1, actividad de transcripción del UCP1 es “modulada” por el sTF unido a las sUAS de los genes objetivo. La ocupación de cada sUAS en combinación con los UCP da como resultado niveles de expresión específicos de cada gen individual, lo que resulta en niveles específicos de las proteínas objetivo. Los casetes de expresión pueden ser introducidos a un hospedador eucariótico (típicamente integrado en un genoma) como moléculas de ADN individuales o como moléculas de ADN más grandes en donde los casetes de expresión individuales se fusionan juntos. En aplicaciones específicas, en donde los genes objetivo son genes nativos (homólogos) de un organismo hospedador - los promotores sintéticos también pueden ser insertados inmediatamente hacia el extremo cinco prima de cada región codificante de gen objetivo en el genoma del organismo hospedador. Los UCP usados en el sistema de expresión pueden ser diferentes, o parte o la totalidad de los UCP también pueden ser idénticos.

La presente invención proporciona un hospedador eucariótico no humano que comprende el sistema de expresión descrito. Estos hospedadores incluyen todos los organismos eucarióticos, en particular microorganismos micóticos, que incluyen hongos filamentosos y levaduras, hospedadores vegetales, que incluyen plantas con flores y algas, y hospedadores animales, que incluyen mamíferos, e insectos.

El ajuste del sistema de expresión para diferentes niveles de expresión se puede llevar a cabo en S. cerevisiae en donde se pueden probar con rapidez una multitud de opciones, que incluye selecciones de los UCP, los sTF, números diferentes de BS y genes objetivo. El conjunto óptimo establecido de los genes expresados de manera diferente puede ser transferido directamente al hospedador de destino, en donde retiene su función. El alto nivel de expresión que se obtiene por este sistema también puede ser usado en hospedadores de producción de proteína (enzima). La ventaja de usar S. cerevisiae es la capacidad de métodos bien establecidos y rápidos para modificaciones genéticas, transformación de ADN, cribado, análisis, cultivos y generación de modelos in silico. Esto acelerará el proceso del desarrollo de hospedadores industriales y permitirá el uso de hospedadores novedosos los cuales tengan un alto potencial para propósitos específicos, pero espectro muy limitado de herramientas para manipulación genética.

La figura 4 ilustra ejemplos de los sistemas de expresión funcionales/transferibles en organismos eucarióticos diversos. Los sistemas de expresión ensamblados en una molécula de ADN única comprende dos casetes de expresión: 1) el casete de expresión para sTF, el cual comprende diferentes UCP ejemplificados aquí con 533cp o 008cp (véase tabla 1 y 2), la versión sTF con la proteína de unión a ADN, ejemplificada aquí por BM3R1, y un terminador, ejemplificado aquí por el terminador TEF1 de Trichoderma reesei y 2) el casete de expresión del gen objetivo comprende un número de sitios de unión específicos de sTF, ejemplificados aquí por ocho sitios de unión específicos para BM3R1, diferentes UCP, ejemplificados aquí por ya sea 114cp o 201cp (véase tabla 1 y 2), la región codificante del gen indicador, ejemplificadas por la región codificante de mCherry (proteína fluorescente roja) y un terminador, ejemplificado aquí por el terminador ADH1 de S. cerevisiae. La región codificante de la proteína de unión de ADN, aquí BM3R1 es optimizada por codón para ajustar el uso de codón de Aspergillus niger. En el ejemplo 3, la versión del sistema de expresión que contiene 201cp y 008cp se denomina como “versión A” y la versión del sistema de expresión que contiene 114cp y 533cp se denomina como “versión B”.

Las figuras 5A y 5B ilustran un ejemplo de una prueba de diferentes versiones de los sTF y determinación de modulación del funcionamiento de los sistemas de expresión en Saccharomyces cerevisiae.

La figura 5A muestra sistemas de expresión análogos a los que se presentan en la figura 4 que se construyeron con las siguientes modificaciones al sistema descrito antes: 1) se usaron diferentes proteínas de unión a ADN como partes de los sTF (LexA, SrpR, PhlF, TetR, BM3R1, y TarA, véase ejemplo 1); 2) se usaron diferentes números de sitios de unión específicos para sTF en los promotores sintéticos de los casetes de expresión de gen objetivo (la versión con 8 sitios de unión se muestra en la figura 5A); 3) los casetes individuales (el casete de expresión para sTF y el casete indicador) se integraron cada uno en una copia única dentro del genoma de Saccharomyces cerevisiae en dos loci genómicos separados (ejemplificados aquí por URA3 y LEU2); 4) los sTF se expresaron a partir del promotor de núcleo de S. cerevisiae, aquí ejemplificados por el promotor de núcleo TDH3; 5) el promotor de núcleo usado en el casete de expresión indicador aquí se ejemplifica por ENO1cp de S. cerevisiae.

La figura 5B muestra las cepas con ambos casetes de expresión integrados y que se probaron para el nivel de fluorescencia. Se probaron sistemas de expresión control los cuales tienen ocho sitios de unión específicos para sTF y los cuales carecen de los casetes de expresión de sTF (mostrados como “WO sTF” en la figura 5B). Las proteínas de unión a ADN, SrpR, PhlF, TetR, BM3R1 y TarA se optimizaron en cuanto a codones para el uso de codones de Saccharomyces cerevisiae. En la mayor parte de los casos se demostró una modulación clara del nivel de expresión del gen objetivo, lo cual refleja el número de sitios de unión específicos para sTF (0 a 8, como se especifica en la figura) en los promotores sintéticos de los casetes de expresión del gen.

Las figuras 6A y 6B muestran ejemplos del análisis de los sistemas de expresión en diversos hospedadores micóticos. El análisis cuantitativo de la expresión del gen indicador determinada por citometría de flujo de fluorescencia (fig. 6A) y por fluorometría (fig. 6B). Los sistemas de expresión construidos (tabla 2) se integraron en una copia única dentro de los genomas de: Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus niger, Trichoderma reesei, Yarrowia lipolytica, Candida krusei (Pichia kudriavzevii), y Pichia pastoris (Komagataella pastoris). La funcionalidad del sistema en todos estos organismos se confirmó por análisis fluorescente de las cepas transformadas. Los sistemas de expresión usados para cada organismo son idénticos a aquellos que se presentan en la figura 4. Los identificadores de cepa en las figuras (6A y 6B) significan lo siguiente: “WT” representa una cepa de fondo de cada hospedador de expresión a la cual los sistemas de expresión no fueron transformados; “A” representa cepas con una versión del sistema (integrado en el genoma en una copia única) que se muestra en la figura 4 que contiene 201cp y 008cp; “A*” representa cepas en la versión A del sistema de expresión en donde la parte de unión a ADN del sTF es optimizado en cuanto a codón para coincidir con los codones frecuentes en Saccharomyces cerevisiae; “B” representa cepas con una versión del sistema de expresión (integrado en el genoma en una copia única) que se muestra en la figura 4 que contiene 114cp y 533cp; “B*” representa cepas con la versión B del sistema de expresión en donde la parte de unión a ADN de sTF se optimizó en cuanto a codones para coincidir con los codones frecuentes en Saccharomyces cerevisiae; “A_NC” y “B_NC” representan cepas con las versiones de control negativo de los sistemas de expresión (A o B) (integrados en el genoma en una copia única), en donde el casete de expresión de sTF está ausente (ha sido suprimido), dejando únicamente el casete de expresión del gen objetivo (ejemplificado aquí con 8 BS 201/114cp mCherry terminador Sc-ADH1).

La figura 6A muestra el análisis por citometría de flujo (instrumento DB FACSAria III) de la expresión mCherry en los hospedadores. Se realiza sobre células (para hongos unicelulares - Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica, Pichia kudriavzevii, Pichia pastoris) o esporas (para los hongos filamentosos - Aspergillus niger, Trichoderma reesei). Las gráficas muestran la intensidad de fluorescencia (mCherry) normalizada por el tamaño de partículas (célula/espora) (FSC - exploración directa) para 10,0000 células/esporas de cada cepa. La línea horizontal (dentro de la caja gris) representa la mediana de valor, la caja gris representa el intervalo intercuartil (intervalo IQ), la parte inferior de la caja gris representa el valor percentil 25%, la parte superior de la caja gris representa el valor percentil 75%, y los brazos en la gráfica de caja representan valores que se extienden de 25%/75% de los valores percentiles respecto a los valores más alto y más bajo los cuales son no mayores de 1,5 veces el intervalo IQ, lo cual, junto con el intervalo IQ representa aproximadamente 99% de todas las instancias medidas (células/esporas) en estos experimentos.

La figura 6B muestra un ejemplo del análisis de la expresión mCherry en los hospedadores. Se realiza por medición de fluorometría usando el instrumento Varioskan (Thermo Electrón Corporation), sobre suspensiones de células/micelios después de crecer 18 horas en medio SCD. Las gráficas muestran intensidad de fluorescencia (mCherry) normalizado por la densidad óptica de suspensiones de células/micelios usadas para el análisis fluorométrico. Las columnas representan promedios de valores y las barras de error desviaciones estándar de por lo menos tres duplicados experimentales.

Las figuras 7A - 7D muestran ejemplos del análisis de los niveles de expresión ajustables en diferentes hospedadores (Pichia kudriavzevii, Aspergillus niger y Trichoderma reesei).

La figura 7A muestra un ejemplo (mostrado como un esquema) del sistema de expresión con un número variable de sitios de unión a sTF usados para modulación de la expresión del gen indicador en Pichia kudriavzevii y Aspergillus niger. El sistema de expresión ensamblado en una molécula de ADN única comprende dos casetes de expresión (análogos a los que se muestran en la figura 4): 1) casete de expresión de sTF, el cual comprende un UCP, ejemplificado aquí con 008cp (véase tabla 1), la versión sTF con la proteína de unión a ADN, ejemplificado aquí por BM3R1, y el dominio de activación, ejemplificado aquí por VP16), y un terminador, ejemplificado aquí por el terminador TEF1 de Trichoderma reesei. Y 2) los casetes de expresión de gen objetivo, el cual comprende diferentes números de sitios de unión específicos de sTF, ejemplificados aquí por 0, 1, 2, 4 y 8 sitios de unión específicos para BM3R1, diferente UCP, ejemplificado aquí por 201cp (véase tabla 1), la región codificante del gen indicador, ejemplificada aquí por la región codificante de mCherry (proteína fluorescente roja) y un terminador, ejemplificado aquí por el terminador ADH1 de S. cerevisiae. La región codificante de la proteína de unión a ADN, aquí BM3R1, se optimiza en cuanto a codones para ajustarse al uso de codones de Aspergillus niger.

La figura 7B muestra el análisis por citometría de flujo (instrumento DB FACSAria III) de la expresión de mCherry en Pichia kudriavzevii y Aspergillus niger que contiene los sistemas de expresión con número variable de sitios de unión a sTF (0, 1, 2, 4 y 8). Se realiza sobre células obtenidas a partir de cultivo de 18 horas en medio SCD (para Pichia kudriavzevii) o sobre esporas obtenidas después de 4 días de cultivo sobre placas de agar PDA (Aspergillus niger). Las gráficas muestran la intensidad de fluorescencia (mCherry) normalizado por tamaño de partícula (célula/espora) (FSC - dispersión directa) de 10000 células de cada cepa. La línea horizontal (dentro de la caja gris) representa la mediana de valor, la caja gris representa el intervalo intercuartil (intervalo IQ), la parte inferior de la caja gris representa el valor percentil 25%, la parte superior de la caja gris representa el valor percentil 75%, y los brazos en la gráfica de caja representan valores que se extienden desde 25%/75% valores percentiles con respecto a los valores más alto y más bajo los cuales son no mayores de 1,5 veces el intervalo IQ, el cual, junto con el intervalo IQ, representan aproximadamente 99% de todas las instancias medidas (células/esporas) en estos experimentos.

La figura 7C muestra un ejemplo (que se presenta como un esquema) del sistema de expresión con un número variable de sitios de unión a sTF usados para modulación de la producción de proteína CBH1 en Trichoderma reesei. El sistema de expresión ensamblado en una molécula de ADN única comprende dos casetes de expresión (análogos a los de las figuras 4 y 7A): 1 casete de expresión de sTF, el cual comprende un UCP, ejemplificado aquí con 533cp (véase tabla 1), la versión sTF con la proteína de unión a ADN, ejemplificada aquí por BM3R1, y el dominio de activación, ejemplificado aquí por VP16, y un terminador, ejemplificado aquí por el terminador TEF1 de Trichoderma reesei. Y 2) los casetes de expresión del gen objetivo, los cuales comprende un número diferente de sitios de unión específicos a sTF, ejemplificados aquí por 0, 1, 2, 4 y 8 sitios de unión específicos para BM3R1, diferente UCP, ejemplificado aquí por 201cp (véase la tabla 1), la región codificante del gen objetivo, ejemplificada aquí por la región codificante CBH1 de Trichoderma reesei (que incluye intrones que se presentan en el gen CBH1 de Trichoderma reesei nativo), y un terminador, ejemplificado aquí por el terminador ADH1 de S. cerevisiae. La región codificante de la proteína de unión de ADN, aquí BM3R1, se optimizan en cuanto a codones para ajustarse al uso de codones de Aspergillus niger.

La figura 7D muestra un análisis de Western blot de la proteína CBH1 producida por Trichoderma reesei a diferentes niveles con el uso de sistemas de expresión con un número variable de sitios de unión a sTF (0, 1, 2, 4 y 8). Se usaron dos condiciones de cultivo diferentes, 1) un medio con extracto de grano agotado y lactosa (“SGE-lactosa), lo que genera una regulación por aumento fuerte de la expresión del gen CBH1 nativo (en la cepa de fondo - WT), y 2) SCD (“SCD”), el cual tiene un fuerte efecto inhibidor sobre la expresión del gen CBH1 nativo (en la cepa de fondo - WT). Equivalente a 15 |il del sobrenadante de cultivo de 3 días a partir de cada cultivo se carga en un gel (gradiente de 4 a 20%). El gel se transfiere sobre una membrana de nitrocelulosa y la proteína CDH1 se detecta con anticuerpo primario anti-CBH1 específico (de ratón) (y anticuerpo secundario anti-IR680 de ratón conjugado), y la visualización de la señal se realiza en un equipo Odyssey CLx Imaging System instrument (LI-COR Biosciences).

Las figuras 8A y 8B muestran el esquema del sistema de expresión (fig. 8A) y el análisis de la expresión del gen indicador en Kazachstania exigua (fig. 8B).

La figura 8A muestra un ejemplo (mostrado como un esquema) del sistema de expresión usado para Kazachstania exigua. El sistema de expresión ensamblado en una molécula única de ADN comprende dos casetes de expresión (tabla 3): 1) casete de expresión de sTF, el cual comprende una UCP, ejemplificada aquí con Sc-TDH3cp (véase tabla 1), la versión sTF con la proteína de unión a ADN ejemplificada aquí por TetR, y el dominio de activación, ejemplificado aquí por VP16, y el terminador, ejemplificado aquí por el terminador g706 de Kazachstania exigua. 2) el casete de expresión del gen objetivo que comprende un número de sitios de unión específicos para sTF, ejemplificados aquí por ocho sitios de unión específicos para TetR, un UCP diferente, ejemplificado aquí por Sc-ENO1cp (véase la tabla 1), la región codificante del gen indicador, ejemplificada aquí por la región codificante para Venus (proteína fluorescente amarilla), y el terminador ejemplificado aquí por el terminador PDC1 de S. cerevisiae. La región codificante de la proteína de unión a ADN, en este caso TetR, y la región codificante del gen objetivo, en este caso el indicador Venus, se optimizan en cuanto a codones para ajustarse al uso de codones de Saccharomyces cerevisiae.

La figura 8B muestra un ejemplo de un análisis de la expresión de Venus en Kazachstania exigua que contiene el sistema de expresión (descrito en la figura 8A, tabla 3). El casete de expresión se integra en el genoma de la cepa de fondo de Kazachstania exigua ("WT” en la figura 8B), sustituyendo a la región codificante g706 nativa, para obtener la cepa aprobada ("SES” en la figura 8B). Las dos cepas (WT y SES) se cultivan en el medio SCD durante 10 horas, y la cepa SES durante 22 horas para alcanzar la fase estacionaria ("SES_stat” en la figura 8B). La transcripción de los genes Venus y ADH1 se analizó por qPCR, y el gen ALG9 es el control de normalización para la cuantificación de expresión. Las columnas representan el promedio de valores y las barras de error las desviaciones estándar de 3 duplicados experimentales.

Las figuras 9A - 9D muestran el análisis de la producción de proteínas en diversos hospedadores de expresión (Trichoderma reesei y Pichia pastoris) que contienen el sistema de expresión.

La figura 9A muestra un ejemplo (mostrado como un esquema) del sistema de expresión de la producción a la proteína CBH1 en Trichoderma reesei. El sistema de expresión ensamblado en una molécula de ADN única comprende dos casetes de expresión (análogos a aquellos en la figura 4 y en la figura 7C): 1) casete de expresión de sTF, el cual comprende un UCP, ejemplificado aquí con el 533cp (véase la tabla 1), la versión sTF con la proteína de unión a ADN, ejemplificada aquí por BM3R1, y el dominio de activación, ejemplificado aquí por VP16, y un terminador, ejemplificado aquí por el terminador TEF1 de Trichoderma reesei. Y 2) los casetes de expresión de gen objetivo, los cuales comprenden un número de sitios de unión específicos para sTF, ejemplificados aquí por ocho sitios de unión específicos para BM3R1, UCP diferente, ejemplificado aquí por 114cp (véase la tabla 1), la región codificante del gen objetivo, ejemplificada aquí por la región codificante de CBH1 de Trichoderma reesei (que incluye los intrones que se presentan en la región codificante de CBH1 de Trichoderma reesei nativa), y un terminador, ejemplificado aquí por el terminador PDC1 de Trichoderma reesei. La región codificante de la proteína de unión a ADN, en este caso BM3R1, se optimiza en cuanto a codones para ajustarse al uso de codones de Aspergillus niger.

La figura 9B muestra un ejemplo de un análisis de la producción de CBH1 en Trichoderma reesei que contiene el sistema de expresión (descrito en la figura 9A). La cepa de fondo de Trichoderma reesei ("WT” en la figura B) es una cepa mutante que alberga múltiples supresiones de los genes que codifican para 8 proteasas diversas. El casete de expresión se integra en el genoma de la cepa de fondo para obtener la cepa probada ("SES” en la figura 9B). Las dos cepas (WT y SES) se cultivan en el biorreactor (fermentador) en dos condiciones diferentes: 1) en un medio que contiene grano agotado, extracto de grano agotado y lactosa ("SGM” en la figura 9B) lo que genera una regulación por aumento fuerte de la expresión del gen CBH1 nativo (en la cepa de fondo - WT) y otra expresión de genes celulolíticos (en ambas cepas), y 2) en un medio que contiene extracto de levadura y glucosa ("glucosa” en la figura) el cual tiene un fuerte efecto inhibidor sobre la expresión del gen CBH1 nativo (en la cepa de fondo - WT) y la expresión de otros genes celulolíticos (en ambas cepas). Los sobrenadantes de estos cultivos se analizan por el análisis SDS-PAGE (SDS-electroforesis en gel de poliacrilamida) para contenido de proteína total (Coomassie) y para el contenido específico de CBH1 (Western blot). Para el análisis de contenido de proteína total, el equivalente de 1,5 |il de sobrenadantes de cultivo en diferentes puntos de tiempo, y el intervalo de proteína CBH1 purificada (control de carga) se cargan en un gel (gradiente 4 a 20%) y gel se tiñe con coomassie coloidal (solución de tinción de proteína PageBlue; Thermo Fisher Scientific). Para el análisis específico de CBH1, el equivalente de 0,075 |il de sobrenadantes de cultivo en diferentes puntos del tiempo, y el intervalo de proteína CBH1 purificada (control cargado) se cargan sobre un gel (gradiente, 4 a 20%) y la proteína CBH1 (después de transferencia sobre una membrana de nitrocelulosa) se detecta con anticuerpo específico (de ratón) primario anti-CBH1 (y anticuerpo secundario conjugado anti-IR680 de ratón). Para ambos análisis, la visualización de la señal se realiza en un equipo Odyssey CLx Imaging System instrument (Li-COR Biosciences). La concentración de proteína (en los sobrenadantes de cultivo) se calcula a partir del intervalo de CBH1 purificado cargado en cada gel, y los valores se muestran en la figura 9B.

La figura 9C muestra un ejemplo (mostrado como un esquema) del sistema de expresión usado para Pichia pastoris para la producción de un producto de proteína. El sistema de expresión ensamblado en una molécula de ADN única comprende dos casetes de expresión (análogos a aquellos en la figura 4): 1) casete de expresión sTF, el cual comprende un UCP, ejemplificado aquí con el 008cp (véase tabla 1), la versión sTF con la proteína de unión a ADN, ejemplificada aquí por BM3R1, y el dominio de activación, ejemplificado aquí por VP16, y un terminador ejemplificado aquí por el terminador de Trichoderma reesei TEF1. Y 2) el casete de expresión de gen objetivo comprende un número de sitios de unión específicos para sTF, ejemplificados aquí por ocho sitios de unión específicos para BM3R1, UCP diferente, ejemplificado aquí por 201cp (véase tabla 1), la región codificante del gen objetivo, ejemplificada aquí por la región codificante de la proteína de fusión que comprende la señal de secreción (factor a) de S. cerevisiae, sitio de escisión de proteasa KEX/spe13, módulo de unión a carbohidratos (CBM, por sus siglas en inglés), proteína similar a elastina (ELP5, por sus siglas en inglés) y otro CBM, y un terminador ejemplificado aquí por el terminador ADH1 de S. cerevisiae. La región codificante de la proteína de unión a ADN, en este caso BM3R1, se optimiza en cuanto a codones para ajustarse al uso de codones de Saccharomyces cerevisiae.

La figura 9D muestra un análisis de la producción de CBM-ELP5-CBM en Pichia pastoris que contiene el sistema de expresión (descrito en la figura 9C). La cepa se cultiva en condiciones diversas, y los sobrenadantes a partir de estos cultivos se analizan mediante Western blot. Un equivalente de 22,5 |il de los sobrenadantes de cultivo se carga sobre un gel (gradiente de 4 a 20%) y la proteína CBM-ELP5-CBM (después de transferencia sobre una membrana de microcelulosa) se detecta con anticuerpo específico (de ratón) anti-CBM primario (y anticuerpo secundario conjugado anti-IR680 de ratón). La visualización de la señal se realiza en un equipo Odyssey CLx Imaging System instrument (LI-COR Biosciences).

TABLA 1

Selección de los promotores de núcleo probados en Saccharomyces cerevisiae y otros organismos. Las secuencias sombreadas son las regiones flanqueantes 3' agregadas a las secuencias promotoras de núcleo para propósitos de cribado o clonación. El ATG (codón de inicio) está subrayado. Sc - origen de Saccharomyces cerevisiae; An - origen de Aspergillus niger, Tr - origen de Trichoderma reesei; At - origen de Arabidopsis thaliana; Cr - origen de Chlamydomonas reinhardtii; Mm - origen de Mus musculus

n

continuación

n

continuación

TABLA 2

Secuencias de ADN de algunos de los sistemas de expresión transferibles entre especies probados. Las partes de ADN funcional están indicadas: sitio de unión a 8xBM3R1 (texto blanco, fondo negro); promotores de núcleo (subrayado); región codificante de mCherry (texto blanco, resaltado en gris); terminadores (cursivas, resaltado en gris); BM3R1-stF (resaltado en gris).

(continuación)

TABLA 3

Secuencia de ADN del sistema de expresión probado en Kazachstania exigua y Saccharomyces cerevisiae. Las partes de ADN funcional están indicadas: sitios de unión a 8xTetR (texto blanco, resaltado en negro); promotores de núcleo (subrayado); región codificante de Venus (texto blanco, resaltado en gris); terminadores (cursivas, resaltados en gris); TetR-sTF (resaltado en gris).

TABLA 4:

Secuencia de ADN de los sistemas de expresión probados en Nicotina benthamiana. Las partes de ADN funcionales están indicadas: sitios de unión 8xsTF (texto blanco, resaltado en negro); promotores de núcleo (subrayado): región codificante de mCherry (texto blanco, resaltado en gris); terminadores (cursivas, resaltados en gris); sTF (resaltado en gris).

continuación

TABLA 5:

Secuencias de ADN de los sistemas de expresión probados en Chlamydomonas reinhardtii. Las partes de ADN funcional están indicadas: sitios de unión 8xsTF (texto blanco, resaltado en negro); promotores de núcleo (subrayado): región codificante mCherry (texto blanco, resaltado en gris); terminadores (cursivas, resaltado en gris); los sTF (resaltado en gris).

continuación

TABLA 6

Secuencia de ADN de los sistemas de expresión probados en células de ovario de hámster chino (células CHO -Cricetulus griseus). Las partes de ADN funcionales están indicadas: sitios de unión 8xsTF (texto blanco, resaltado en negro); promotores de núcleo (subrayado); región codificante mCherry (texto blanco, resaltado en gris); terminadores (cursiv r l n ri l TF r l n ri .

Ejemplos

Ejemplo 1

Proteínas de unión a ADN bacteriano y sus sitios de unión usados en los sistemas de expresión:

- LexA (represor de transcripción de Escherichia coli; GenBank: EDV67321.1) sitios de unión LexA (sin importar la cadena de ADN):

CTGTATATAAACACAG (SEC ID NO: 76);

CTGTATATATACCCAG (SEC ID NO. 77);

CTGTATATAAAACCAG (SEC ID NO: 78);

GTGGTTATATATACAG (SEC ID NO: 79)

- SrpR (regulador transcripcional de Pseudomonas putida; secuencia de referencia NCBI: WP_019437727.1)

sitios de unión de SrpR (sin importar la cadena de ADN):

ATATACATACATGCTTGTTTGTTTGTAAAC (SEC ID NO: 80);

ATTTACATACATTCTTGTTTGTTTGTAAAC (SEC ID NO: 81)

- PhlF (regulador transcripcional de Pseudomonas protegens; GenBank: AAF20928.1)

sitios de unión de PhlF (sin importar la cadena de ADN):

ATGATACGAAACGTACCGTATCGTTAAGGT (SEC ID NO: 82);

ATGATACGGAACGTTACGTATCGTTAAGCT (SEC ID NO: 83);

ATGATACGGAAGCTACCGTATCGTAAAGGT (SEC ID NO: 84);

ATGATACGTAACGTACCGTATCGTAAAGGT (SEC ID NO: 85)

- TetR (regulador transcripcional de Escherichia coli, GenBank: EFK45326.1) sitio de unión de TetR (sin importar la cadena de ADN):

ACTCCCTATCAGTGATAGAGA (SEC ID NO: 86)

- BM3R1 (regulador transcripcional de Bacillus megaterium; secuencia de referencia NCBI: WP_013083972.1)

sitios de unión de BM3R1 (sin importar la cadena de ADN):

CGGAATGAAGGTTCATTCCG (SEC ID NO: 87);

CGGAATGAACTTTCATTCCG (SEC ID NO: 88);

CGGAATGAACATTCATTCCG (SEC ID NO: 89);

CGGAATGAACGTTCATTCCG (SEC ID NO: 90)

- TarA (regulador transcripcional de Streptomyces lavenduligriseus; secuencia de referencia NCBI:

WP_030788560.1)

sitios de unión TarA (sin importar la cadena de ADN):

AACATACCGTGTGGTATGTT (SEC ID NO: 91);

AACATACCGAGTGGTATGTT (SEC ID NO: 92);

AACATACCGTGAGGTATGTT (SEC ID NO: 93);

AAACATACCGTGTGGTATGTTC (SEC ID NO: 94)

- Lacl (represor lac de Escherichia coli; secuencia de referencia NCBI: WP_048339836.1)

sitio de unión LacI (sin importar la cadena de ADN):

AATTGTGAGCGGCTCACAATT (SEC ID NO: 95)

Ejemplo 2

Prueba de diferentes versiones de los sTF y determinación de modulación del funcionamiento de sistema de expresión en Saccharomyces cerevisiae (figuras 5A-5B).

Los sistemas de expresión (casetes de expresión individuales para los sTF y para los indicadores) se construyeron como dos moléculas de ADN separadas (plásmidos) (figura 5A). Los plásmidos con los casetes de expresión para cada sTF contienen: 1) la región codificante optimizada para codón de Saccharomyces cerevisiae de la proteína de unión a ADN (LexA, PhIF, SrpR, TetR, BM3R1 y TarA; ejemplo 1) en cada región codificante de sTF, 2) NLS y el dominio de activación VP16 en cada región codificante de sTF, 3) el Sc-TDH3cp (tabla 1) que controla la expresión de cada sTF, 4) el gen marcador de selección URA3 (de origen de Kluyveromyces lactis), 5) los flancos para integración en el genoma por recombinación homóloga dentro del locus ura-3-52 (para sustituir la región codificante mutada del locus), 6) regiones necesarias para la propagación del plásmido en E. co li. Los plásmidos con los casetes indicadores contienen: 1) la región codificante, optimizada para codón de Saccharomyces cerevisiae de la proteína Venus (amarillo fluorescente), 2) el Sc-ENO1cp (tabla 1) que controla la expresión de Venus junto con 3) sitios de unión específicos para sTF colocados hacia el extremo cinco prima (0, 1, 2, 4 u 8) (ejemplo 1), 4) el gen marcador de selección LEU2 (de origen de Kluyveromyces lactis), 5) los flancos para integración en el genoma por recombinación homóloga en el locus leu2-3_112 (sustituyendo la región codificante mutada del locus), y 6) regiones necesarias para propagación del plásmido en E. coli.

Se usó CEN_PK de Saccharomyces cerevisiae (MATa, ura3-52 leu2-3_112 his3A1 MAL2-8C SUC2) como la cepa de origen. Los casetes de expresión (figura 5A) se introdujeron en las células mediante transformación de los plásmidos integrantes linearizados, el sTF y los casetes de expresión indicadores correspondientes se transformaron en una cepa única. Cada casete de integración se liberó por endonucleasa de restricción Notl a partir del plásmido antes de la transformación. Las transformaciones se realizaron usando el protocolo estándar con acetato de litio. Las integraciones de copia única se conformaron por qPCR, en donde la señal de qPCR del gen Venus se compara con la señal qPCR de una secuencia nativa única en cada cepa.

Para todos los cultivos, se usaron 6,7 g/l de base de nitrógeno y levadura (YNB, por sus siglas en inglés, Becton, Dickinson and Company), una mezcla de aminoácidos sintética completa que carece de uracilo y leucina, suplementada con D-glucosa 20 g/l (SCD-LU, por sus siglas en inglés). En caso de cultivos en placa de agar, se usaron 20 g/l de agar además de los componentes mencionados en lo anterior.

Los cultivos previos de las cepas probadas se hacen crecer durante 24 a 48 horas en placas de agar SCD-LU antes de la incubación de 4 ml de SCD-LU en placas de cultivo de 24 pozos hasta una DO⁶⁰⁰= 0,2. Los cultivos se hacen crecer durante 18 horas a 800 rpm (Infors HT Microtron) y 28°C por triplicado, se centrifugan, se lavan y se resuspenden en 0,2 ml de agua estéril. Se analizaron 200 |il de suspensión celular en placas de 96 pozos negros (Black Cliniplate; Thermo Scientific) usando un fluorímetro Varioskan (Thermo Electron Corporation). Los ajustes para Venus fueron 510 nm (excitación) y 530 nm (emisión), respectivamente. Para normalización de los resultados de fluorescencia, las suspensiones de células analizadas se diluyeron 100x y se midió DO⁶⁰⁰en placas de microtitulación de 96 pozos transparentes (NUNC) usando Varioskan (Thermo Electron Corporation).

Los resultados de los análisis fluorescentes se muestran en la figura 5B.

Ejemplo 3

Análisis cuantitativo del funcionamiento de sistema de expresión en diversos hospedadores micóticos (figuras 6A-6B)

Los sistemas de expresión (tabla 2, figura 4) y sus versiones de control negativo (los sistemas de expresión con regiones suprimidas que abarcan el promotor de núcleo que controla al sTF y el sTF mismo) se clonaron en plásmidos que introducen marcadores de selección y flancos de integración de genoma para 6 especies diferentes. 1) se usó la cepa CEN-PK de Saccharomyces cerevisiae como la cepa de origen. Los sistemas de expresión (que incluyen las versiones con la región codificante optimizada para codón de Saccharomyces cerevisiae de la proteína de unión a ADN, BM3R1), que incluye el gen marcador de selección LEU2 (de origen Kluyveromyces lactis), se integró en el locus leu2-3_112 (sustituyendo la región codificante mutada del locus) usando las regiones flanqueantes correspondientes para recombinación homóloga. Las transformaciones se realizaron por el protocolo estándar de acetato de litio. 2) la cepa ATCC1015 de Aspergillus niger se usó como la cepa de origen. Los sistemas de expresión, que incluyen un gen marcador de selección resistente a higromicina con un promotor y terminador adecuados, se integraron en el locus gaaC (sustituyendo la región codificante nativa) usando las regiones flanqueantes correspondientes para recombinación homóloga. Las transformaciones se llevaron a cabo mediante el uso del protocolo de transformación CRISPR (véase más adelante) que incluye: protoplastos de la cepa de A. niger, ADN donador lineal (casete de expresión con el marcador de selección y los flancos de integración), proteína Cas9 (IDT) y mezcla de ARNcr sintético y ARNtracr (IDT). Cas9, ARNcr y ARNtracr que forman un complejo de ribonucleoprotéina (RNP, por sus siglas en inglés) que genera un freno de cadena doble en locus genómico objetivo el cual después se repara con el ADN donador lineal por recombinación homóloga. 3) se usa Trichoderma reesei cepa M124 (recolección de cultivo VTT) como la cepa de origen. Los sistemas de expresión, que incluyen un gen marcador de selección con resistencia a higromicina, con un promotor y terminador adecuados, se integran en el locus pep4 (sustituyendo la región codificante nativa) usando las regiones flanqueantes correspondientes para recombinación homóloga. Las transformaciones se realizaron mediante el uso del protocolo de transformación CRISPR (véase más adelante), que incluye: protoplastos de la cepa de T. reesei, ADN donador lineal (casete de expresión con el marcador de selección y las regiones flanqueantes) y complejo RNP que genera un freno de cadena doble en el locus genómico objetivo el cual después se repara con el ADN donador lineal. 4) se usó Pichia kudriavzevii, cepa ATCC 32196 como la cepa de origen. Los sistemas de expresión, que incluyen un gen marcador de selección con resistencia a higromicina con un promotor adecuado y un terminador se integraron en el locus de PDC1 (sustituyendo la región codificante nativa) usando las regiones flanqueantes correspondientes para recombinación homóloga. Las transformaciones se realizaron mediante el uso del protocolo estándar con acetato de litio. 5) se utilizó Pichia pastoris, cepa X-33 (Invitrogen) como la cepa de origen. Los sistemas de expresión (con la región codificante de la proteína que une ADN, BM3R1, que fue optimizada en cuanto a codones para ajustarse al uso de codones de Saccharomyces cerevisiae), que incluye el gen marcador de selección con resistencia a zeocina con un promotor y terminador adecuados, se integró en el locus AOX1 (integración en la región promotora AOX1) usando las regiones flanqueantes correspondientes para recombinación homóloga. Las transformaciones se realizaron mediante el uso del protocolo estándar con acetato de litio. 6) se usó Yarrowia lipolytica C-00365 (colección de cultivo VTT) como la cepa de origen. Los sistemas de expresión, que incluyen un gen marcador de selección con resistencia a nourseotricina con un promotor y terminador adecuados, se integraron el locus ANT1 (sustituyendo a la región codificante nativa) usando las regiones flanqueantes correspondientes para recombinación homóloga. Las transformaciones se realizaron usando el protocolo estándar con acetato de litio.

Protocolo de transformación con CRISPR: se suspenden protoplastos aislados en 200 |il de solución STC (sorbitol 1,33 M, Tris-HCl 10 mM, CaCh 50 mM, pH 8,0). Se mezclan cien |il de suspensión de protoplastos con 3,5 |ig de ADN donador y 20 |il de solución RNP (proteína Cas) 1 |iM (IDT), ARNcr sintético 1 |iM (IDT) y ARNTracr 1 |iM (IDT)) y 100 |il de la solución de transformación (PEG 600025%, CaCh 50 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 7,5). La mezcla se incuba en hielo durante 20 min. Se agregan dos ml de solución de transformación y la mezcla se incuba a 5 min a temperatura ambiente. Se agregan cuatro ml de STC seguido por la adición de 7 ml de agar superior fundido (50°C) (D-sorbitol 200 g/l, base de levadura en nitrógeno 6,7 g/l (YNB, Becton, Dickinson and Company), aminoácidos completos sintéticos, D-glucosa 20 g/l, 400 mg/l (para A. niger) o 100 mg/l (para T. reesei) de higromicina B, y agar 20 g/l). La mezcla se vierte sobre una placa de selección de higromicina (D-sorbitol 200 g/l), base de levadura en nitrógeno 6,7 g/l (YNB, Becton, Dickinson and Company), aminoácido completo sintético, D-glucosa 20 g/l, 400 mg/l (para A. niger) o 100 mg/l (para T. reesei) de higromicina B, y agar 20 g/l). El cultivo se realiza a 28°C durante cinco a siete días, las colonias se toman y se vuelven a cultivar sobre placas YPD que contienen 400 mg/l (para A. niger) o 100 mg/l (para T. reesei) de higromicina B.

Las integraciones correctas se confirmaron por PCR del ADN genómico de cada cepa transformada, en donde el amplicón (región de ADN amplificada) abarca la construcción integrada y el ADN genómico fuera de los flancos de integración. Las integraciones de copia única se conformaron por qPCR, en donde la señal de qPCR del gen mCherry se compara con una señal qPCR de una secuencia nativa única en cada hospedador.

Para los cultivos líquidos, se usaron 6,7 g/l de base de levadura nitrógeno (YNB, Becton, Dickinson and Company), aminoácidos completos sintéticos suplementados con D-glucosa 20 g/l (SCD). En el caso de cultivo en placa de agar, el medio solidificado contiene agar 20 g/l, bacto peptona 20 g/l (Becton Dickinson), extracto de levadura 10 g/l y D-glucosa 20 g/l (placas YPD). Para obtener esporas de los hongos filamentosos, se usaron placas de agar PDA para esporulación (39 g/l de agar de papa dextrosa BD-Difco).

Para el análisis de citometría de flujo de la producción de mCherry en las cepas probadas (figura 6A), cultivos previos de las cepas de levadura probadas se hacen crecer durante 24 a 48 horas sobre placas de agar YPD y los hongos filamentosos (cepas de A. niger y T. reesei) se esporulan sobre placas PDA (7 días), se recolectan las esporas y se diluyen en PBS 1x antes del análisis. En caso de cepas de levadura, 4 ml de medio SCD en placas de cultivo de 24 pozos se inoculan a partir de cultivos previos hasta DO⁶⁰⁰= 0,2 por cada cepa de levadura probada. Los cultivos se hacen crecer durante 18 horas a 800 rpm (Infors HT Microtron) y 28°C. Se combinan cien |il del cultivo con 1,5 ml de PBS 1x antes del análisis. Las mediciones se realizaron con FACSAria III (BD) en donde se registraron 10,000 eventos y los resultados se normalizaron al dividir los valores de fluorescencia de mCherry entre el tamaño de células (exploración directa, FSC-A). Los resultados del análisis fluorescente por citometría de flujo se muestran en la figura 6A.

Para el análisis de fluorometría cuantitativo (figura 6B), los cultivos previos de las cepas de levadura probados se hacen crecer durante 24 a 48 horas en placas de agar YPD y los cultivos previos (inoculados por esporas) de cepas de Trichoderma reesei se hacen crecer durante 24 horas en medio YPG (bacto peptona 20 g/l, extracto de levadura 10 g/l y gelatina 30 g/l). Se inoculan cuatro ml del medio SCD en placas de cultivo de 24 pozos hasta DO⁶⁰⁰= 0,2 por cada cepa de levadura probada (DO⁶⁰⁰= 0,5 en caso de T. reesei). Los cultivos se hacen crecer durante 18 horas a 800 rpm (Infors HT Microtron) y 28°C por triplicado, se centrifugan, se lavan y se resuspenden en 0,2 ml de agua estéril. Se analizan doscientos |il de cada suspensión celular en placas de 96 pozos negras (Black Cliniplate; Thermo Scientific) usando el fluorímetro Varioskan (Thermo Electron Corporation). Los ajustes para mCherry son 587 nm (excitación) y 610 nm (emisión) respectivamente. Para normalización de los resultados de fluorescencia, las suspensiones celulares analizadas se diluyeron 100x y se midió la DO⁶⁰⁰en placas de microtitulación de 96 pozos transparentes (NUNC) usando Varioskan (Thermo Electron Corporation). Los resultados del análisis se muestran en la figura 6B.

Ejemplo 4

Análisis de los niveles de expresión ajustables en diferentes hospedadores (Pichia kudriavzevii, Aspergillus niger y Trichoderma reesei) (figuras 7A-7D)

Los sistemas de expresión para Pichia kudriavzevii y Aspergillus niger con diversos números de sitios de unión específicos para sTF (0, 1,2, 4, u 8) (figura 7A) se construyen de manera análoga al ejemplo 3 (la versión del sistema de expresión A - que se muestra en la figura 4 - es el que se usó). En el caso de Pichia kudriavzevii, se usó la cepa ATCC 32196 como la cepa de origen. Los sistemas de expresión, que incluyen el gen marcador de selección de resistencia a higromicina con un promotor y terminador adecuados, se integra en el locus PDC1 (sustituyendo la región codificante nativa) usando las regiones flanqueantes correspondientes para recombinación homóloga. Las transformaciones se realizaron usando el protocolo estándar de acetato de litio. En el caso de Aspergillus niger, se utilizó la cepa ATCC1015 como la cepa de origen. Los sistemas de expresión, que incluyen un gen marcador de selección de resistencia a higromicina con un promotor y terminador adecuados, se integraron en el locus gaaC (sustituyendo la región codificante nativa) usando las regiones flanqueantes correspondientes para recombinación homóloga. Las transformaciones se realizaron usando el protocolo de transformación CRISPR, que incluye: protoplastos de la cepa de A. niger, ADN donador lineal (casete de expresión con el marcador de selección y los flancos de integración) y complejo RNP que genera un freno de cadena doble en el locus genómico objetivo el cual después se repara con el ADN donador lineal.

La molécula de ADN, que contiene los sistemas de expresión para Trichoderma reesei para expresión ajustable del gen CBH1 (figura 7C), contienen el 201cp (tabla 1) junto con los sitios de unión específicos para BM3R1 colocados corriente arriba (0, 1, 2,4 u 8) que controlen la expresión de la región codificante CBH1, el terminador PDC1 de T. reesei, 533cp (tabla 1) que controla la expresión de la región codificante sTF, la región codificante sTF, el terminador TEF1 de Trichoderma reesei, el gen marcador de selección de resistencia a higromicina con el promotor y terminador adecuados, y los flancos para integración en el genoma por recombinación homóloga dentro del locus CBH1 (que sustituye la región codificante nativa). Se usa la T. reesei cepa M124 (colección de cultivo VTT) como la cepa de origen. Las transformaciones se realizan por el protocolo de transformación de protoplastos (véase más adelante), que incluye: protoplastos de la cepa de T. reesei y ADN donador lineal (casete de expresión con el marcador de selección y los flancos de integración).

Protocolo de transformación de protoplasto: los protoplastos aislados se suspenden en 200 |il de solución STC (sorbitol 1,33 M, Tris-HCl 10 mM, CaCh 50 mM, pH 8,0). Se mezclan cien |il de suspensión de protoplastos con 10 |ig de ADN donador y 100 |il de la solución de transformación (PEG 600025%, CaCh 50 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 7,5). La mezcla se incuba en hielo durante 20 min. Se agregan dos ml de solución de transformación y la mezcla se incuba a 5 min a temperatura ambiente. Se agregan cuatro ml de STC seguido por adición de 7 ml de agar superior fundido (D-sorbitol 200 g/l, 6,7 g/l de base de levadura y nitrógeno (YNB, Becton, Dickinson and Company), aminoácidos completos sintéticos, D-glucosa 20 g/l, higromicina B 100 mg/l y agar 20 g/l). La mezcla se vierte en una placa de selección (D-sorbitol 200 g/l, base de levadura y nitrógeno 6,7 g/l (YNB, Becton, Dickinson and Company), aminoácidos completos sintéticos, D-glucosa 20 g/l, higromicina B 100 mg/l, y agar 20 g/l). El cultivo se realiza a 28°C durante cinco días; las colonias se toman y se vuelven a cultivar sobre las placas YPD que contienen 100 mg/l de higromicina B.

Las integraciones correctas se confirmaron por PCR del ADN genómico de cada cepa transformada, en donde el amplicón (región de ADN amplificada) abarca la construcción integrada y el ADN genómico fuera de los flancos de integración. Las integraciones de copia única se confirmaron por qPCR, en donde la señal de qPCR del gen mCherry (para las cepas Pichia kudriavzevii y Aspergillus niger) de la región codificante BM3R1 (para cepas des Trichoderma reesei) se comparan con una señal qPCR de una secuencia nativa única en cada hospedador.

Para cultivos líquidos, se usaron 6,7 g/l de base de levadura y nitrógeno (YNB, Becton, Dickinson and Company), aminoácidos completos sintéticos suplementados con D-glucosa 20 g/l (SCD, por sus siglas en inglés). En caso de cultivos de placa de agar, se usó medio solidificado que contiene agar 20 g/l, bacto peptona 20 g/l (Becton Dickinson), extracto de levadura 10 g/l y D-glucosa 20 g/l (placas YPD). Para obtener esporas de los hongos filamentosos, se usaron placas de agar PDA para esporulación (agar papa dextrosa BD-Difco 39 g/l).

Para el análisis de citometría de flujo de producción de mCherry en las cepas probadas (figura 7B), cultivos previos de las cepas de Pichia kudriavzevii se hacen crecer durante 24 a 48 horas en placas de agar YPD y las cepas de Aspergillus niger se esporulan sobre placas PDA (durante 7 días), las esporas se recolectan y se diluyen en PBS 1x antes del análisis. En el caso de las cepas de Pichia kudriavzevii, se inoculan 4 ml de medio SCD en placas de cultivo de 24 pozos a partir del cultivo previo hasta DO⁶⁰⁰= 0,2. Los cultivos se hacen crecer durante 18 horas a 800 rpm (Infors HT Microtron) y 28°C. Se combinan cien |il del cultivo con 1,5 ml de PBS 1x antes del análisis. Las mediciones se realizan con FACSAria III (BD), en donde se registran 10000 eventos y los resultados se normalizan al dividir los valores de fluorescencia de mCherry entre el tamaño de células (dispersión directa, FSC-A). Los resultados del análisis fluorescente por citometría de flujo se muestran en la figura 7B.

Para el análisis de Western blot de la producción de CBH1 en cepas de Trichoderma reesei, se hacen crecer cultivos previos (inoculados por esporas) durante 24 horas en medio YPG (bacto peptona 20 g/l, extracto de levadura 10 g/l y gelatina 30 g/l). UN volumen de cuatro ml de ya sea SGE-lactosa (KH²PO⁴15 g/l, Na²SO⁴5,4 g/l, elementos en traza 1 ml/l (CoCl²3,7 mg/l, FeSO4.7H2O 5 mg/l, ZnSO4.4H2O 1,4 mg/l, MnSO4.7H2O 1,6 mg/ml), lactosa 40 g/l, extracto de grano agotado 333,25 g/l, (NH⁴)²-citrato 8,6 g/l, PIPPS 100 mM, MgSO⁴2,4 mM y CaCh 4,1 mM, pH ajustado a 4,8 con KOH) o el medio SCD en placas de cultivo de 24 pozos se inoculan hasta DO⁶⁰⁰= 0,5 para cada cepa probada. Los cultivos se hacen crecer durante 3 días a 800 rpm (Infors HT Microtron) y 28°C, se centrifugan y el sobrenadante se transfiere a un tubo limpio. Quince |il de cada sobrenadante se mezclan con 4 |il de amortiguador de carga SDS 4x (glicerol 400 ml/l, p-mercaptoetanol 100 ml/l, tinte OrangeG 2 g/l (Sigma), SDS 40 g/l, Tris-HCl 125 mM, pH 6,8), se somete a ebullición y se carga en un gel en gradiente SDS-PAGE 4 a 20%. El gel se transfiere sobre una membrana de nitrocelulosa y la proteína CBH1 se detecta con un anticuerpo primario específico (ratón) anti-CBH1 (y un anticuerpo secundario anti-ratón-IR680-conjugado) y la visualización de la señal se realiza en un instrumento Odyssey CLx Imaging System (LI-COR Biosciences). Los resultados del análisis se muestran en la figura 7D.

Ejemplo 5

Prueba del sistema de expresión en Kazachstania exigua (figuras 8A-8B)

El sistema de expresión usado para Kazachstania exigua (tabla 3, figura 8A) se clona en un plásmido que contiene regiones flanqueantes para el gen g706 de K. exigua que codifica para un homólogo de ALD2 de S. cerevisiae. En la construcción resultante, la región flanqueante 3'-UTR de g706 de K. exigua forma una secuencia terminadora para el sTF en el sistema de expresión. El sistema de expresión, que incluye regiones flanqueantes para recombinación homóloga, se integra en el locus g706 (sustituyendo la región codificante nativa).

La cepa C-02458 de Kazachstania exigua (colección de cultivo VTT) se modifica por sustitución de ambos loci KU70 con el casete de expresión Cas9 (que contiene un promotor y terminador adecuados). La cepa resultante (MAT a/a ura 3A/ura 3A ku70A::Cas9/ku70::Cas9) se usa como la cepa de origen (WT en la figura 8B). La transformación del sistema de expresión (ADN donador) en la cepa de fondo se lleva a cabo junto con un plásmido centromérico que contiene un marcador de selección URA3 y un casete de expresión para un ARNsg que tiene como objetivo Cas9 en el locus g706 (el ARNsg se expresa bajo el control del promotor de ARN polimerasa III de S. cerevisiae, SNR52 y el terminador SUP4). La cepa resultante se muestra como “SES” en la figura 8B.

La transformación se realiza por el protocolo de electroporación: se inoculan células en medio YPD y se cultivan durante la noche a 250 rpm y 30°C. El cultivo durante la noche se diluye hasta una DO⁶⁰⁰= 0,2 y se hacen crecer hasta DO⁶⁰⁰= 1,3. Las células cosechadas y lavadas se resuspenden en 10 ml de Tri-EDTA (pH 7,5) que contiene ditiotreitol 10 mM y se incuban a 30°C durante 30 minutos. Se agregan a las células cuarenta ml de agua enfriada con hielo, seguido por centrifugación. Esto es seguido con dos etapas de lavado, la primera con 50 ml de agua estéril enfriada con hielo, y después con 10 ml de sorbitol 1M enfriado con hielo. Finalmente, las células se resuspenden en 125 |il de sorbitol 1 M enfriado con hielo. Se combinan cincuenta |il de suspensión celular con 15 |il de una mezcla de ADN (que contiene 5 |ig del ADN donador y 5 |ig del plásmido ARNg). La electroporación se realiza en cubetas de 2 mm a 1,25 kV, 200 Q y 25 |iF. Se agregan inmediatamente después de la electroporación ciento cincuenta |il de solución de recuperación (extracto de levadura 10 g/l, bacto peptona 10 g/l, glucosa 20 g/l, sorbitol 1 M). Las células se recuperan durante 30 minutos a 250 rpm y 30°C antes de sembrar en placas, sobre medio SCD que carece de uracilo.

Para análisis de expresión, las dos cepas (WT y SES) se cultivan por triplicado en medio SCD durante 10 horas y la cepa SES también durante 22 horas para alcanzar una fase estacionaria en donde toda la glucosa ha sido consumida (“SES_stat” en la figura 8B). El ARN total se aísla de las cepas (RNeasy Kit - QIAGEN), se produce el ADNc (Transcriptor First Strand cDNA Synthesis kit - Roche), y la transcripción de los genes Venus y ADH1 (un gen glucolítico altamente expresado en fase de crecimiento exponencial y regulada por disminución en ausencia de glucosa) se analizan por qPCR con cebadores específicos para cada gen. Se usa el gen ALG9 como control de normalización para cuantificación de expresión. Los resultados del análisis se muestran en la figura 8B.

Ejemplo 6

Sistema de expresión usado para la producción de una proteína secretada en hongos (Trichoderma reesei y Pichia pastoris) (figuras 9A-9D)

La molécula de ADN, que contiene el sistema de expresión para Trichoderma reesei (figura 9A) que contiene el 114cp (tabla 1) junto con ocho sitios de unión específicos para BM3R1 colocados hacia el extremo cinco prima que controla la expresión de la región codificante para CBH1, la región codificante para el gen CBH1, el terminador PDC1 de Trichoderma reesei, 533cp (tabla 1) que controla la expresión de la región codificante sTF, la región codificante sTF, el terminador TEF1 de Trichoderma reesei, el gen marcador de selección de resistencia a higromicina con un promotor y terminador adecuados, y regiones flanqueantes para integración genómica en el locus CBH1 (que sustituye a la región codificante nativa) por recombinación homóloga. Se usa T. reesei cepa M1763 (colección de cultivo VTT) como la cepa de origen (“WT” en la figura 9B). Las transformaciones se realizan por protocolo de transformación de protoplastos (ejemplo 4) usando protoplastos de la cepa de T. reesei y ADN donador lineal (casete de expresión con el marcador de selección y flancos de integración).

Las integraciones correctas se confirman usando PCR a partir de ADN genómico, en donde el amplicón (región de ADN amplificado) abarca la construcción integrada y el ADN genómico fuera de los flancos de integración. La integración de copia única se prueba usando qPCR, en donde la señal de qPCR a partir de la región codificante BM3R1 se compara con la señal de una secuencia nativa única en el hospedador. La cepa que contiene el casete de expresión (“SES” en la figura 9B) se analiza para la producción de CBH1 y se compara con la cepa de fondo en condiciones de inducción por celulasa y represión.

La producción de CBH1 en cepas de Trichoderma reesei se lleva a cabo en biorreactores de 1 l. Cultivos previos (inoculados con esporas) para los cultivos de las condiciones que inducen celulasas se hacen crecer durante 24 horas en un medio de SGE-lactosa (ejemplo 4) para producir una cantidad suficiente de micelio para inoculaciones en el biorreactor. Los cultivos previos (inoculados con esporas) para cultivos en condiciones que reprimen celulasa se hacen crecer durante 24 horas en medio YE-glucosa-A (glucosa 20 g/l, extracto de levadura 10 g/l, KH²PO⁴15 g/l, (N H ^S O ⁴5 g/l, 1 ml/l de elementos en traza (CoCh 3,7 mg/l, FeSO4.7H2O 5 mg/l, ZnSO4.4H2O 1,4 mg/l, MnSO4.7H2O 1,6 mg/ml), MgSO⁴2,4 mM y CaCh 4,1 mM, pH ajustado a 4,8). Los cultivos en el biorreactor que induce celulasa se inoculan en medio SGM (“s Gm ” en la figura 9B) (extracto de grano agotado 20 g/l, grano agotado vendido 20 g/l, lactosa 60 g/l, KH²PO⁴5 g/l, NH⁴SO⁴5 g/l, elementos en traza 1 ml/l, MgSO⁴2,4 mM y CaCh 4,1 mM, Antifoam J647 1 ml/l, pH 4,8), flujo de aire a 0,5 slpm (0,4-0,6 vvm) y agitación a 600 rpm. Los cultivos de biorreactor que reprimen celulosa se inoculan en el medio YE-glucosa-B (“glucosa” en la figura 9B) (glucosa 10 g/l, extracto de levadura 20 g/l, KH²PO⁴5 g/l, NH⁴SO⁴5 g/l, elementos en traza 1 ml/l, MgSO⁴2,4 mM y CaCh 4,1 mM, Antifoam J647 1 ml/l, pH 4,8) y estos cultivos son alimentados continuamente con glucosa (glucosa, 300 g/l con un caudal a 4,4 g/h), un flujo de aire de 0,5 slpm (0,4-0,6 vvm) y agitación a 900 rpm. El cultivo se lleva a cabo durante 150 horas, las muestras se toman en momentos diversos, los subconjuntos se muestran en la figura 9B.

Para el análisis de tinción de coomassie (figura 9B - panel izquierdo superior), 1,5 |il de cada sobrenadante de cultivo (punto de tiempo) se mezcla con 15 |il de amortiguador de carga SDS 1x (glicerol 100 ml/l, p-mercaptoetanol 25 ml/l, tinte OrangeG 0,5 g/l (Sigma), SDS 10 g/l, Tris-HCl 31,2 mM, pH 6,8), se somete a ebullición y se carga en un gel de gradiente SDS-PAGE 4 a 20% junto con diluciones de proteína CBH1 purificadas como un estándar. El gel se tiñe con tinción de coomassie coloidal (PageBlue Protein Staining Solution; Thermo Fisher Scientific) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La visualización del gen teñido se realiza en un equipo Odyssey CLx Imaging System instrument (LI-COR Biosciences). La concentración de proteína en el sobrenadante de cultivo se calcula a partir del estándar CBH1 en el mismo gel (figura 9B - tabla derecha superior). Para el análisis Western (figura 9B - panel izquierdo inferior), 0,075 |il de sobrenadante de cada cultivo (punto de tiempo) se mezcla con 15 |il de amortiguador de carga SDS 1x, se somete a ebullición y se carga en un gel de gradiente SDS-PAGE 4 a 20% junto con diluciones de proteína CBH1 purificada. El gel se transfiere sobre una membrana de nitrocelulosa y la proteína CBH1 se detecta con anticuerpo primario anti-CBH1 específico (ratón) (y anticuerpo secundario conjugado a IR680 anti-ratón), y la visualización de la señal se realiza en un instrumento Odyssey CLx Imaging System (LI-COR Biosciences). La concentración de CBH1 en el sobrenadante de cultivo se calcula (figura 9B - tabla derecha inferior).

La molécula de ADN, que contiene el sistema de expresión para Pichia pastoris (figura 9C), consiste de 201cp (tabla 1) junto con ocho sitios de unión específicos para BM3R1 colocados hacia el extremo cinco prima que controlan la expresión de la región codificante de proteína de fusión, la región codificante para la proteína de fusión (que consiste de la señal de secreción Saccharomyces cerevisiae N-terminal (factor a), el sitio de escisión de proteasa KEX/spe 13, el módulo de unión a carbohidrato (CBM), la proteína similar a elastina (ELP5) y otro CBM), seguido por un terminador ADH1 de S. cerevisiae, 008cp (tabla 1) que controla la expresión de la región codificante sTF, la región codificante sTF (la región codificante de la proteína de unión a ADN, BM3R1, de sTF se optimiza en cuanto a codón para ajustarse al uso de codón de Saccharomyces cerevisiae), el terminador TEF1 de Trichoderma reesei, el gen marcador de selección de resistencia azeocina con el promotor y terminador adecuados, y los flancos por integración en el genoma por recombinación homóloga dentro del locus AOX1 (integración en la región promotora AOX1). Las transformaciones se realizan mediante el uso del protocolo estándar de acetato de litio. La cepa que contiene una copia única del casete de expresión se prueba para producción de la proteína en condiciones diversas (figura 9D).

La producción de CBM-ELP5-CBM en Pichia pastoris se lleva a cabo en matraces Erlenmeyer. El cultivo previo se realiza durante 24 horas en medio YPP (extracto de levadura 10 g/l, peptona 20 g/l, base de levadura y nitrógeno 13,4 g/l, biotina 0,4 mg/l, glicerol 20 g/l, K²HPO⁴13,2 mM y KH²PO⁴86,8 mM, pH = 6,0) con glicerol 20 g/l (YPP-Gly). Para probar el efecto de diferentes fuentes de carbono, el glicerol se sustituye ya sea por glucosa 20 g/l (“YPP-Glc” en la figura 9D) o por etanol 20 g/l (“YPP-EtOH” en la figura 9D). Las células del cultivo previo se inoculan (hasta DO⁶⁰⁰= 1,0) en YPP-Gly, YPP-Glc o YPP-EtOH y se cultivan durante 2 días, también se prueba la adición de inhibidores de proteasa (quimostatina y pepstatina). El cultivo previo también se cultiva durante dos días adicionales (tres días en total).

Para el análisis Western (figura 9D), 22,5 |il de cada sobrenadante de cultivo se mezclan con 7,5 |il de amortiguador de carga SDS 4x, se someten a ebullición y se carga en un gel en gradiente SDS-PAGE 4 a 20%. El gel se transfiere sobre una membrana de nitrocelulosa y la proteína CBM-ELP5-CBM se detecta con anticuerpo primario anti-CBM específico (ratón) (y anticuerpo secundario conjugado a IR680 anti-ratón), y la visualización de la señal se realiza en un instrumento Odyssey CLx Imaging System (LI-COR Biosciences) (figura 9D).

Ejemplo 7

Prueba del funcionamiento de sistema de expresión en un organismo vegetal (Nicotiana benthamiana)

Se prueban dos sistemas de expresión en Nicotiana Benthamiana (tabla 4): los sistemas de expresión ensamblados en moléculas de ADN sencillas que comprenden dos casetes de expresión: 1) casete de expresión sTF, el cual comprende un promotor de núcleo usado para control de expresión de sTF, ejemplificado aquí con At-RPL41D_cp (tabla 1); la versión sTF con la proteína que une ADN, ejemplificada aquí por, ya sea, BM3R1 o TetR y con el dominio de activación, ejemplificado aquí ya sea por VP16AD o VP64AD; y un terminador, ejemplificado aquí por el terminador MT3 de Arabidopsis thaliana. Y 2) el casete de expresión del gen objetivo, el cual constituye un número de sitios de unión específicos sTF, ejemplificados aquí por, ya sea, ocho sitios de unión específicos para BM3R1 o por ocho sitios de unión específicos para TetR; otro promotor de núcleo, ejemplificado aquí por At-ATTI7_cp (véase tabla 1), la región codificante del gen objetivo, ejemplificada aquí por la región codificante para mCherry (indicador de proteína fluorescente roja); y un terminador, ejemplificado aquí por el terminador PSBX de Arabidopsis thaliana. Las regiones codificantes del sTF y mCherry son optimizadas en cuanto a codones para ajustarse al uso de codones de Nicotiana benthamiana. Además, las versiones de control negativas (los sistemas de expresión con regiones suprimidas que abarcan a At-RPL41D_cp, el sTF y el terminador MT3) se construyeron.

Los sistemas de expresión (y las versiones de control negativo) se clonan en un plásmido que contiene la región codificante del marcador seleccionable vegetal (NptII) con promotor y terminador adecuados, y las secuencias para propagación en Agrobacterium tumefaciens, que incluye el marcador de selección a canamicina. Los plásmidos se transforman en Agrobacterium tumefaciens (cepa EHA105) por electroporación (cubetas de 2 mm; con ajustes: 1,25 kV, 200 Q y 25 |iF) y los transformantes se hacen crecer en presencia de canamicina y rifampicina antes de la infección de las hojas de Nicotiana benthamiana. Las hojas de plantas de 6 semanas de edad se infiltran con la mezcla 1:1 de cultivos de Agrobacterium tumefaciens, uno con la cepa que presente el sistema de expresión y la otra con una cepa que presenta un vector de expresión de un inhibidor bloqueador de la expresión de un gen post-transcripcional, p19 (Silhavy et al., 2002) (ambos cultivos diluidos hasta DO⁶⁰⁰= 0,7 con MgCh 10 mM MES 10 mM - pH = 5,8). Los discos de hojas infiltrados (que corresponden al área infiltrada) se cosechan después de 6 días de incubación en un invernadero, se muelen en PBS 1x y los extractos crudos se analizan para determinar fluorescencia de mCherry usando el instrumento Varioskan (Thermo Electron Corporation).

Ejemplo 8

Prueba del funcionamiento del sistema de expresión en algas verdes (Chlamydomonas reinhardtii)

Se prueban dos sistemas de expresión en Chlamydomonas reinhardtii (tabla 5): los sistemas de expresión ensamblados en moléculas de ADN únicas comprenden dos casetes de expresión: 1) casete de expresión de sTF, el cual comprende un promotor de núcleo usado para el control de la expresión de sTF, ejemplificado aquí con Cr-elF-5A_cp (tabla 1); la versión sTF con la proteína de unión a ADN, ejemplificada aquí por ya sea BM3R1 o TetR, y con el dominio de activación, ejemplificado aquí por ya sea VP16AD o VP64AD; y un terminador, ejemplificado aquí por el terminador RPS27A de Chlamydomonas reinhardtii. y 2) el casete de expresión de gen objetivo, el cual comprende un número de sitios de unión específicos para sTF, ejemplificados aquí por ya sea ocho sitios de unión específicos para BM3R1 o por ocho sitios de unión específicos para TetR; otro promotor de núcleo, ejemplificado aquí por Cr-RPS3A_cp (tabla 1), la región codificante de gen objetivo, ejemplificado aquí por la región codificante de mCherry (indicador de proteína fluorescente roja) y un terminador, ejemplificado aquí por el terminador RBCS2 de Chlamydomonas reinhardtii.

Las regiones codificantes de los sTF y mCherry se optimizan en cuanto a codones para ajustarse al uso de codones de Chlamydomonas reinhardtii. Además, se construyeron a versiones de control negativo (los sistemas de expresión con regiones suprimidas que abarcan a Cr-elF-5A_cp, el sTF y el terminador RPS27A).

Los sistemas de expresión (y las versiones de control negativo) se clonan en el sitio NcoI del plásmido pChlamy_4_ (Invitrogen). Los plásmidos resultantes (que incluyen el plásmido pChlamy_4 no modificado), después de linealización, son transformados en Chlamydomonas reinhardtii (cepa 137c; Invitrogen). Las transformaciones se realizan de acuerdo con el protocolo en el manual GeneArt Chlamydomonas Protein Expression Kit (Invitrogen). Los transformantes se hacen crecer en un medio Gibco Tap Growth en presencia de zeocina y se analizan para fluorescencia de mCherry usando el instrumento Varioskan (Thermo Electron Corporation).

Ejemplo 9

Prueba de funcionamiento de sistema de expresión en células CHO (Cricetulus griseus)

El sistema de expresión para Cricetulus griseus (tabla 6) ensamblado en moléculas de ADN únicas comprende dos casetes de expresión: 1) casete de expresión sTF, el cual comprende un promotor de núcleo usado para el control de expresión de sTF, ejemplificado aquí con Mm-Atp5b_cp (tabla 1); la versión sTF con proteína de unión a ADN, ejemplificada aquí por BM3R1, y con el dominio de activación, ejemplificado aquí por VP64AD; y un terminador, ejemplificado aquí por el terminador INHA de Mus musculus. Y 2) el casete de expresión de gen objetivo, el cual comprende un número de sitios de unión específicos para sTF, ejemplificados aquí por ya sea ocho sitios de unión específicos para BM3R1; otro promotor de núcleo, ejemplificado aquí por Mm-Eef2_cp (tabla 1), la región codificante

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un sistema de expresión para un hospedador eucariótico, caracterizado porque comprende:

(a) un casete de expresión que comprende:

un promotor de núcleo, el promotor de núcleo es la única secuencia reguladora para controlar la expresión de una secuencia de ADN que codifica para factor de transcripción sintético (sTF), y

una secuencia de ADN que codifica para factor de transcripción sintético (sTF), y

(b) uno o más casetes de expresión, cada uno comprende una secuencia de ADN que codifica para un producto deseado enlazado operablemente a un promotor sintético,

el promotor sintético comprende un promotor de núcleo idéntico al promotor de núcleo de (a) otro promotor de núcleo, y sitios de unión específicos para sTF hacia el extremo 5' del promotor de núcleo.

2. El sistema de expresión de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el promotor de núcleo comprende una secuencia de ADN que contiene la región 5' de un gen eucariótico, partiendo de 10 a 50 pares de bases hacia el extremo cinco prima de una caja TATA y finalizando 9 pares de bases hacia el extremo cinco prima del codón de inicio ATG y en donde la distancia entre la caja TATA y el codón de inicio es no mayor de 180 pares de bases y no menor de 80 pares de bases, y una secuencia de ADN en su extremo 3' que comprende 1 a 20 pares de bases aleatorios.

3. El sistema de expresión de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el promotor de núcleo es un promotor de núcleo universal (UCP) funcional en diversos organismos eucarióticos.

4. El sistema de expresión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el factor de transcripción sintético (sTF) comprende un regulador de transcripción procariótico, una señal de localización nuclear y un dominio de activación de transcripción.

5. El sistema de expresión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el hospedador eucariótico se selecciona del grupo que consiste de especies micóticas que incluyen levaduras y hongos filamentosos, especies vegetales, que incluyen plantas con flores y especies de algas verdes y especies animales.

6. Un hospedador eucariótico no humano caracterizado porque comprende el sistema de expresión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. El hospedador eucariótico de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el promotor de núcleo es un promotor de núcleo universal (UCP) funcional en diversos organismos eucarióticos y que se origina a partir de otras especies de hospedadores eucarióticos de Saccharomyces cerevisiae.

8. El hospedador eucariótico de conformidad con la reivindicación 6 o 7, caracterizado porque el hospedador eucariótico se selecciona del grupo que consiste de especies de hongos que incluyen levaduras y hongos filamentosos, especies de plantas, que incluyen plantas con flores y especies de algas verdes y especies de animales.

9. Un método para producir un producto de proteína deseado en un hospedador eucariótico caracterizado porque comprende cultivar el hospedador de conformidad con la reivindicación 6 o 7 bajo condiciones de cultivo adecuadas.