ES2871624T3 - Transglutaminasas microbianas, sustratos para las mismas y procedimientos para el uso de las mismas - Google Patents

Abstract

Una composición de reactantes y productos de una reacción enzimática para formar un enlace isopeptídico, comprendiendo la composición una transglutaminasa microbiana que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la transglutaminasa microbiana de Kutzneria albida (SEQ ID NO: 6), un primer sustrato que comprende una marca donante de acilo que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la secuencia peptídica (SEQ ID NO: 1) y un segundo sustrato que comprende una marca donante de amina que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la secuencia peptídica (SEQ ID NO: 2), en la que el primer y el segundo sustrato se identifican a partir de una colección de sustratos y en la que la actividad de la transglutaminasa microbiana sobre los sustratos de la colección se puede medir usando un ensayo directo o acoplado.

Description

DESCRIPCIÓN

Transglutaminasas microbianas, sustratos para las mismas y procedimientos para el uso de las mismas

Antecedentes de la invención

La divulgación se refiere, en general, a la identificación de transglutaminasas y sustratos para las mismas, y más en particular al descubrimiento y la caracterización de una transglutaminasa microbiana de Kutzneria albida.

El esclarecimiento de los detalles de la actividad y especificidad enzimáticas es importante para comprender la función fisiológica de las enzimas y para las aplicaciones biotecnológicas de las reacciones catalizadas por enzimas. Por ejemplo, las transglutaminasas pertenecen a una gran familia de enzimas relacionadas que incluyen las transglutaminasas microbianas y de mamíferos. Las transglutaminasas catalizan la reticulación entre dos cadenas polipeptídicas o peptídicas formando un enlace isopeptídico entre un grupo gamma-carboxamida de un residuo de glutamina y un grupo épsilon-amino de un residuo de lisina. El esclarecimiento de los detalles de la actividad y especificidad de las transglutaminasas es importante para aplicaciones biotecnológicas de la reacción de reticulación catalizada por transglutaminasas, por ejemplo, para la modificación de proteínas para añadir marcadores o marcas, formar complejos multiproteicos y similares.

Hasta la fecha, la transglutaminasa microbiana es la enzima transglutaminasa más estudiada debido a su pequeño tamaño, rendimiento sólido, estabilidad y actividad independiente del calcio. Varios estudios han demostrado que una amplia variedad de alquilaminas largas pueden sustituir el sustrato lisina de las transglutaminasas y que el dipéptido sencillo glutamina-glicina puede servir como sustrato glutamina. Estos descubrimientos de los sustratos lisina y glutamina de las transglutaminasas han ayudado a desarrollar una variedad de pruebas para la actividad transglutaminasa y ensayos prácticos para la modificación de proteínas usando transglutaminasas. Sin embargo, todavía pueden surgir varias dificultades en relación con la identificación y caracterización de transglutaminasas conocidas y novedosas. Una dificultad es que la especificidad de una transglutaminasa particular para la formación de enlaces isopeptídicos puede ser demasiado amplia o demasiado estrecha para una aplicación particular. Otra dificultad es que las transglutaminasas que tienen la misma especificidad de sustrato, o una similar, pueden no ser útiles para estrategias de marcaje ortogonal o similares. Aún otra dificultad más es la identificación de sustratos para transglutaminasas no caracterizadas o poco caracterizadas. Pueden surgir aún otras dificultades dependiendo de los factores asociados con una transglutaminasa dada, tales como el origen, la especificidad, la actividad, la estabilidad y similares, y combinaciones de los mismos.

Sumario de la invención

La presente invención supera los inconvenientes mencionados anteriormente proporcionando un sistema y un procedimiento para la identificación y caracterización de transglutaminasas, así como sustratos y usos para las mismas.

De acuerdo con un aspecto de la presente divulgación, una composición de reactantes y productos de una reacción enzimática para formar un enlace isopeptídico comprende una transglutaminasa microbiana que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la transglutaminasa microbiana de Kutzneria albida (SEQ ID NO: 6), un primer sustrato que comprende una marca donante de acilo que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la secuencia peptídica YRYRQ (SEQ ID NO: 1) y un segundo sustrato que comprende una marca donante de amina que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la secuencia peptídica RYESK (SEQ ID NO: 2), en la que el primer y segundo sustrato se identifican a partir de una colección de sustancias y en la que la actividad de la transglutaminasa microbiana sobre los sustratos de la colección se puede medir usando un ensayo directo o acoplado.

En otro aspecto, al menos uno del primer sustrato y el segundo sustrato incluye un marcador detectable.

En otro aspecto, el marcador detectable se selecciona de un resto de biotina, un tinte fluorescente, un marcador de rutenio, un marcador radiactivo y un marcador quimioluminiscente.

En otro aspecto, el sustrato que incluye una marca donante de acilo tiene la secuencia peptídica APRYRQRAA (SEQ ID NO: 24).

De acuerdo con otro aspecto de la presente divulgación, un procedimiento de formación de un enlace isopeptídico en presencia de una transglutaminasa microbiana incluye exponer una transglutaminasa microbiana a un primer sustrato y un segundo sustrato, teniendo la transglutaminasa microbiana al menos un 80 % de identidad de secuencia con la transglutaminasa microbiana de Kutzneria albida (SEQ ID NO: 6), incluyendo el primer sustrato una marca donante de acilo que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la secuencia peptídica YRYRQ (SEQ ID NO: 1) e incluyendo el segundo sustrato una marca donante de amina que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la secuencia peptídica RYESK (SEQ ID NO: 2), y reticular el primer sustrato y el segundo sustrato, formando de este modo un enlace isopeptídico entre la marca donante de acilo y la marca donante de amino.

En otro aspecto, la etapa de reticulación del primer sustrato y el segundo sustrato forma un enlace isopeptídico entre un grupo gamma-carboxamida de la marca donante de acilo y un grupo épsilon-amino de la marca donante de amino.

En otro aspecto, al menos uno del primer sustrato y el segundo sustrato incluye un marcador detectable.

En otro aspecto, el marcador detectable se selecciona de un resto de biotina, un tinte fluorescente, un marcador de rutenio, un marcador radiactivo y un marcador quimioluminiscente.

En otro aspecto, el sustrato que incluye la marca donante de acilo tiene la secuencia peptídica APRYRQRAA (SEQ ID NO: 24).

En otro aspecto, la reticulación del primer sustrato con el segundo sustrato se logra con un rendimiento de al menos aproximadamente un 70 %.

En otro aspecto, el rendimiento se logra dentro de aproximadamente 30 minutos.

De acuerdo con otro aspecto de la presente divulgación, un kit para formar un enlace isopeptídico en presencia de una transglutaminasa microbiana incluye una transglutaminasa microbiana purificada que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la transglutaminasa microbiana de Kutzneria albida (SEQ ID NO: 6).

En un aspecto, el kit incluye además uno de un primer sustrato que incluye una marca donante de acilo que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la secuencia peptídica YRYR.Q (SEQ ID NO: 1) y un segundo sustrato que incluye una marca donante de amina que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la secuencia peptídica RYHSIÍ (SEQ ID NO: 2).

En otro aspecto, al menos uno del primer sustrato y el segundo sustrato incluye un marcador detectable.

En otro aspecto, el marcador detectable se selecciona de un resto de biotina, un tinte fluorescente, un marcador de rutenio, un marcador radiactivo y un marcador quimioluminiscente.

En otro aspecto, el primer sustrato que incluye la marca donante de acilo tiene la secuencia peptídica APRYRQRAA (SEQ ID NO: 24).

En otro aspecto, el kit incluye además el otro del primer sustrato y el segundo sustrato.

De acuerdo con otro aspecto de la presente divulgación, una enzima expresada de forma recombinante para formar un enlace isopeptídico incluye una transglutaminasa microbiana purificada que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la transglutaminasa microbiana de Kutzneria albida (SEQ ID NO: 6).

En un aspecto, la transglutaminasa microbiana aislada se expresa y aísla en presencia de amonio.

En otro aspecto, el amonio está presente en una concentración de al menos aproximadamente 10 pM.

De acuerdo con otro aspecto de la presente divulgación, el uso de una marca como sustrato donante de acilo para una transglutaminasa microbiana de Kutzneria albida (SEQ ID NO: 6) incluye unir la marca a una estructura seleccionada del grupo que consiste en una proteína, un péptido, un marcador detectable, un oligonucleótido y un polímero que no es de aminoácidos o ácido nucleico, en el que la marca es accesible para la transglutaminasa microbiana y comprende una secuencia de aminoácidos que tiene la fórmula Xaai-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5, en la que Xaa es cualquier aminoácido, en la que al menos uno de Xaa3, Xaa4 y Xaas es glutamina, en la que uno de Xaa4 y Xaa5 es arginina, en la que la secuencia de aminoácidos incluye al menos una arginina secuencialmente contigua a una glutamina y en la que el número total de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos seleccionados de arginina, glutamina, fenilalanina, triptófano y tirosina es de al menos cuatro.

En un aspecto, Xaa5 y al menos uno de Xaai, Xaa² y Xaa3 es arginina.

De acuerdo con otro aspecto de la presente divulgación, el uso de una marca como sustrato donante de amina para una transglutaminasa microbiana de Kutzneria albida (SEQ ID NO: 6) incluye unir la marca a una estructura seleccionada del grupo que consiste en una proteína, un péptido, un marcador detectable, un oligonucleótido y un polímero que no es de aminoácidos o ácido nucleico, en el que la marca es accesible para la transglutaminasa microbiana y comprende una secuencia de aminoácidos que tiene la fórmula Xaai-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5, en la que Xaa es cualquier aminoácido, en la que la secuencia de aminoácidos incluye al menos una lisina, en la que uno de Xaai y Xaa² se selecciona de tirosina y arginina y en la que el número total de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos seleccionados de arginina, serina, tirosina y lisina es de al menos tres.

En un aspecto, uno de Xaa4 y Xaa5 es lisina.

En otro aspecto, la secuencia de aminoácidos incluye no más de dos del aminoácido lisina.

De acuerdo con otro aspecto de la presente divulgación, se incluye una estructura, seleccionándose la estructura del grupo que consiste en una proteína, un péptido, un marcador detectable, un oligonucleótido y un polímero que no es de aminoácidos o ácido nucleico, estando la estructura unida a una marca de sustrato que es accesible para una transglutaminasa microbiana que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la transglutaminasa microbiana de Kutzneria albida de SEQ ID NO: 6, comprendiendo la marca de sustrato una marca donante de acilo que tiene la secuencia peptídica APRYRQRAA (SEQ ID NO: 24) y una marca donante de amina que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la secuencia peptídica RYESK (SEQ ID NO: 2), en la que el marcador detectable se selecciona de un resto de biotina, un tinte fluorescente, un marcador de rutenio, un marcador radiactivo y un marcador quimioluminiscente.

Lo anterior y otros aspectos y ventajas de la invención se desprenderán de la siguiente descripción. En la descripción se hace referencia a los dibujos adjuntos que forman parte de la misma y en los que se muestra a modo de ilustración un modo de realización preferente de la invención. Sin embargo, dicho modo de realización no representa necesariamente el alcance completo de la invención y, por lo tanto, se hace referencia a las reivindicaciones y al presente documento para interpretar el alcance de la invención.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 es un diagrama esquemático que ilustra un modo de realización de un procedimiento para la identificación y caracterización de especies de transglutaminasa de acuerdo con la presente divulgación.

La figura 2A es una alineación de múltiples secuencias de la proteína hipotética KALB_7456 de Kutzneria albida (fila superior) y la transglutaminasa microbiana de Streptomyces mobaraensis (fila inferior) obtenida con Clustal Omega versión 1.2.1 (Sievers et al., 2011. Molecular Systems Biology 7:539). Los residuos de aminoácido idénticos están marcados con asteriscos (*), los residuos similares con dos puntos (:). Los residuos conservados de la tríada catalítica de la transglutaminasa microbiana de S. mobaraensis (Cys, Asp, His) están resaltados en gris.

La figura 2B es una secuencia de aminoácidos de la transglutaminasa hipotética KALB_7456 de K. albida que incluye una predicción general del sitio de escisión determinado por ProP 1.0 (Duckert et al., 2004. Protein Engineering, Design and Selection 17:107-112), indicándose tanto la secuencia del péptido señal predicha ("s") como el sitio de escisión del propéptido ("P").

La figura 2C es un gráfico de barras que muestra el potencial de escisión del propéptido en función de la posición de la secuencia de aminoácidos para la transglutaminasa hipotética KALB_7456 de K. albida determinada por ProP 1.0. La línea discontinua indica el umbral del potencial de escisión del propéptido y la línea de puntos indica la posición de aminoácidos predicha para el péptido señal.

La figura 3A es una imagen óptica de un gel de SDS-PAGE que muestra un perfil de expresión para proteínas de fusión de la transglutaminasa de K. albida (KalbTG). Las parejas de fusión aminoterminales se agrupan en carriles contiguos como se indica mediante los pares de carriles numerados del 1 al 7 (1: marca de 8X-His; 2: péptido señal dsbA; 3: péptido señal ompT; 4: SlyD de E. coli (EcSlyD); 5: 2xEcSlyD; 6: FkpA; 7: proteína de unión a maltosa). El carril marcado con "L" se cargó con una escalera de marcadores de peso molecular estándar (valores mostrados en kDa). Los carriles individuales marcados con "P" y "S" indican fracciones insolubles (sedimento) y solubles (sobrenadante) de lisado celular de E. coli, respectivamente. La banda de proteína teñida con azul de Coomassie que representa His-KalbTG está marcada con un asterisco (*) en el par de carriles 1.

La figura 3B es una representación esquemática de la estrategia de expresión y purificación de la proteína de fusión 2xSlyD. La fusión N terminal con dos restos de la proteína D sensible a la lisis (SlyD) confiere solubilidad y es escindible por el factor Xa. La enzima se hace madurar adicionalmente mediante la escisión de una secuencia propeptídica con tripsina.

La figura 3C es una imagen de un gel de SDS-PAGE que muestra la purificación modular de la KalbTG. Los carriles marcados con "L" se cargaron con una escalera de marcadores de peso molecular estándar (valores mostrados en kDa). Carril 1: Fracción que contiene 2xSlyD-KalbTG de la primera elución en gradiente de Ni+-IMAC (imidazol 0-250 mM). Carril 2: Proenzima KalbTG purificada por elución en gradiente de Ni+-IMAC, digestión con el factor Xa en columna y cromatografía de exclusión por tamaño. Carril 3: Fracción de la segunda elución en gradiente de Ni+-IMAC después de digestiones consecutivas en columna con el factor Xa y tripsina (imidazol 0-250 mM). Carril 4: Concentrado del carril 3, filtrado por una membrana con un peso molecular de corte (MWCO) de 50.000.

La figura 4A es una curva de dispersión log-log que muestra la correlación entre los datos de la señal de fluorescencia generados por la KalbTG para rasgos característicos repetidos en una matriz de péptidos pentaméricos en presencia de sustrato donante de amina biotinilado. Cada punto de datos representa un par de péptidos repetidos de una colección de 1,4 millones de péptidos únicos sintetizados por duplicado. Los 22 puntos de datos que muestran las señales de fluorescencia más altas están marcados con su respectiva secuencia de péptido pentamérico.

La figura 4B es una curva de dispersión log-log que muestra la correlación entre los datos de la señal de fluorescencia generados por la KalbTG para rasgos característicos repetidos en una matriz de péptidos pentaméricos en presencia de sustrato donante de glutamina biotinilado (Z-APRYRQRAAGGG-PEG-biotina). Cada punto de datos representa un par de péptidos repetidos de una colección de 1,4 millones de péptidos únicos sintetizados por duplicado. Los 17 puntos de datos que muestran las señales de fluorescencia más altas están marcados por su respectiva secuencia de péptido pentamérico.

La figura 5A es una curva de dispersión log-log que muestra la correlación entre los datos de la señal de fluorescencia generados por la TGM de S. mobaraensis para rasgos característicos repetidos en una matriz de péptidos pentaméricos en presencia de sustrato donante de amina biotinilado. Cada punto de datos representa un par de péptidos repetidos de una colección de 1,4 millones de péptidos únicos sintetizados por duplicado. Los 22 puntos de datos correspondientes a las señales de fluorescencia más altas generadas por la KalbTG de la FIG.

4A están marcados con su respectiva secuencia de péptido pentamérico.

La figura 5B es la curva de los datos de la señal de fluorescencia generados por la TGM de S. mobaraensis de la FIG. 5A omitiendo los puntos de datos marcados de la FIG. 4A. Los 16 puntos de datos correspondientes a las señales de fluorescencia más altas generadas por la TGM están marcados con su respectiva secuencia de péptido pentamérico.

La figura 5C es la curva de los datos de la señal de fluorescencia generados por la KalbTG de la FIG. 4A omitiendo los puntos de datos marcados de la FIG. 4A. Los 16 puntos de datos correspondientes a las señales de fluorescencia más altas generadas por la TGM de S. mobaraensis de la FIG. 5B están marcados con su respectiva secuencia de péptido pentamérico.

La figura 5D es una curva de actividad de la TGM de S. mobaraensis y la KalbTG obtenida midiendo las tasas de oxidación de NADH a 340 nm y 37 °C para concentraciones variables de los sustratos donantes de glutamina Z-GGGDYALQGGGG (de 0 a 1 mM) y Z-GGGYRYRQGGGG (de 0 a 1 mM) en presencia de cadaverina como sustrato donante de amina (1 mM) en un ensayo acoplado a GLDH.

La figura 6A es una serie de imágenes de geles de SDS-PAGE que muestran tanto un curso temporal del experimento (izquierda: campo claro; derecha: fluorescencia de Cy3) como datos de control (izquierda: campo claro; derecha: fluorescencia de Cy3) para el marcaje con Cy3 de un resto de SlyD de Thermus thermophilus marcado con Q. El éxito del monomarcaje se observa por el cambio en la movilidad electroforética correspondiente al peso molecular de 6 kDa del marcador y por la señal fluorescente de la especie marcada. Los datos se muestran para un curso temporal de 60 minutos realizado con un exceso de marcador de 10 veces y para una incubación de 18 horas con un exceso de marcador de 50 veces. Los carriles marcados con "L" se cargaron con una escalera de marcadores de peso molecular estándar (valores mostrados en kDa). Los carriles marcados con y "+" indican reacciones de control con SlyD que contiene la TGM de S. mobaraensis marcada con Q (DYALQ (SEQ ID NO: 22)) y la KalbTG (-) o la TGM de S. mobaraensis (+).

La figura 6B es una serie de imágenes de un gel de SDS-PAGE que muestra un perfil de pH de la eficacia del marcaje de la KalbTG para valores de pH entre 6,2 y 9,0 (izquierda: campo claro; derecha: fluorescencia de Cy3). El rendimiento de marcaje más alto después de un tiempo de reacción de 15 minutos se observó a pH 7,4. El carril marcado con "L" se cargó con una escalera de marcadores de peso molecular estándar (valores mostrados en kDa).

La figura 6C es una serie de imágenes de geles de SDS-PAGE que muestran la funcionalización específica de dos sitios de la construcción YRYRQ-PEG27-(sitio de escisión para el factor Xa)-PEG27-PEG27- DYALQ con los marcadores fluorescentes Cy3 y Cy5. Cada grupo (marcado con 1, 2 y 3) incluye tres imágenes del mismo carril del gel dispuestas en el siguiente orden, de izquierda a derecha: i) campo claro; ii) fluorescencia de Cy3; y iii) fluorescencia de Cy5. Grupo 1: Una mezcla de una construcción peptídica y un exceso de 10 veces de marcador Cy3. Grupo 2: Una mezcla de una construcción peptídica y un exceso de 10 veces de marcador Cy3 después de la incubación con la enzima KalbTG durante 30 min. Grupo 3: La enzima TGM de S. mobaraensis y el marcador Cy5 se añaden a la composición del grupo 2 y se incuban durante 15 min sin etapas intermedias de bloqueo o purificación; la construcción doblemente marcada se logró con un rendimiento casi cuantitativo.

La figura 7A es una alineación tridimensional de las estructuras enzimáticas activas de KalbTG (gris oscuro) y TGM de S. mobaraensis (gris claro) que revela una alta conservación en la región del núcleo y del sitio activo y una alta variabilidad en las regiones de bucle periféricas.

La figura 7B es una superposición de superficie tridimensional de las estructuras enzimáticas activas de KalbTG (gris oscuro) y TGM de S. mobaraensis (gris claro) que ilustra que el bolsillo de unión tanto de la TGM de S. mobaraensis como de la KalbTG más compacta puede estar ocupado de manera similar por un propéptido (estructura de cintas).

La figura 7C es una estructura tridimensional de cintas que ilustra los elementos que contribuyen a la formación de la cavidad activa de KalbTG, incluyendo dos bucles hidrófilos altamente cargados que se cree que median el reclutamiento del sustrato, actúan como imitador del sustrato o una combinación de los mismos. Los dos bucles hidrófilos están marcados con sus secuencias correspondientes (es decir, NHFEPR (SEQ ID NO: 3) y YRYRAR (SEQ ID NO: 4)).

Descripción detallada

Como se analiza anteriormente, puede ser útil en diversas situaciones esclarecer los detalles de la actividad y la especificidad enzimáticas para proporcionar una comprensión básica de esas enzimas, así como para el desarrollo de aplicaciones biotecnológicas que incluyen esas enzimas. Por ejemplo, las estrategias químicas convencionales para la modificación de proteínas terapéuticas y de diagnóstico a menudo carecen de especificidad de sitio, estabilidad de enlace, control estequiométrico o una combinación de los mismos, dando lugar a conjugados heterogéneos que pueden causar interferencias (por ejemplo, con la inmunorreactividad o la estabilidad de un agente terapéutico). En un aspecto, se prevé que el desarrollo industrial de reactivos terapéuticos y de diagnóstico de los próximos años vea un incremento masivo de formatos sofisticados que requieren una conjugación estable y realmente específica de sitio. Por lo tanto, existe la necesidad de nuevos procedimientos enzimáticos que ofrezcan una alternativa atractiva y rentable a las estrategias químicas establecidas.

La transglutaminasa microbiana (TGM) es una proteína-glutamina Y-glutamiltransferasa (EC 2.3.2.13) que la describieron por primera vez investigadores de Ajinomoto Co., Inc. en 1989, y es uno de los grupos de enzimas más ampliamente usados para la reticulación de proteínas y péptidos en muchas aplicaciones alimentarias y biotecnológicas. La TGM se descubrió por primera vez en el organismo Streptomyces mobaraensis y posteriormente se extrajo de este. La TGM cataliza la formación de un enlace isopeptídico estable entre un grupo acilo (por ejemplo, una cadena lateral de glutamina; donante de acilo) y una alquilamina (por ejemplo, una cadena lateral de lisina; donante de amina). En ausencia de grupos amina reactivos, la reacción enzimática con agua da lugar a la desaminación de las cadenas laterales de la glutamina. La enzima bacteriana funciona sin la adición de cofactores tales como Ca2+ o GTP y en una amplia gama de condiciones de pH, tampón y temperatura.

A diferencia de la sortasa A, cuya especificidad por el sustrato natural es muy rigurosa, las TGM conocidas (por ejemplo, de S. mobaraensis) son en general enzimas promiscuas con respecto a las moléculas de sustrato y las especificidades de las variantes de transglutaminasa siguen siendo en gran parte desconocidas. Si bien se han realizado importantes esfuerzos científicos para establecer la TGM como la enzima de elección en el desarrollo de conjugados de fármaco-anticuerpo terapéuticos, la producción a gran escala de dichos inmunoconjugados mediados por la TGM se ve obstaculizada por la baja especificidad de la enzima.

Las especies de TGM conocidas son principalmente representantes de las familias Streptomyces o Bacillus. Estas especies de TGM presentan estructuras primarias de aminoácidos y especificidades de sustrato muy similares. Todas las especies activas de TGM conocidas presentan pesos moleculares de al menos aproximadamente 38 kDa. Al ser una enzima de reticulación por naturaleza, la TGM conocida muestra en general una amplia especificidad de sustrato por sustratos donantes de amina y una especificidad relativamente baja por sustratos donantes de acilo. Los enfoques para el cribado de alto rendimiento de sustratos mejorados para la TGM se han limitado previamente a la selección de fagos o la presentación de ARNm. Si bien los enfoques de cribado de alto rendimiento basados en matrices, iniciados recientemente, han identificado con éxito sustratos para la TGM de S. mobaraensis (solicitud de patente provisional de EE. UU., número de serie 62/094.495 de Albert et al., presentada el 19 de diciembre de 2014), solo son conocidas las especificidades de sustrato de esta enzima y de enzimas homólogas, de modo que queda excluido cualquier enfoque de conjugación bioortogonal (por ejemplo, marcaje simultáneo de una biomolécula usando dos o más sustratos marcados diferentes y dos o más especies de transglutaminasa). En consecuencia, existe la necesidad de enfoques de alto rendimiento para la identificación y caracterización de nuevas especies de transglutaminasas. Asimismo, existe la necesidad de transglutaminasas mejoradas con mayor actividad, especificidad o una combinación de las mismas. Además, existe la necesidad de marcas donantes de acilo (por ejemplo, marcas de glutamina o Q) y marcas donantes de amina (por ejemplo, marcas de lisina o K) que sean sustratos específicos y únicos para una transglutaminasa de interés.

Estas y otras dificultades se pueden superar con un sistema y procedimiento para la identificación y caracterización de especies de transglutaminasas. Con este fin, la presente divulgación proporciona la caracterización de la estructura y la bioquímica de especies de transglutaminasas candidatas conocidas y desconocidas. La divulgación proporciona además la caracterización de la producción recombinante de transglutaminasas candidatas, el cribado de alto rendimiento de sustratos de transglutaminasas potenciales por medio de una matriz de péptidos de alta densidad y la conjugación semiortogonal de biomoléculas usando las especies de transglutaminasas recientemente caracterizadas. Aún en otro aspecto, la presente divulgación proporciona las marcas donantes de acilo (por ejemplo, marcas de glutamina o Q) y marcas donantes de amina (por ejemplo, marcas de lisina o K) que sean sustratos específicos y únicos para una transglutaminasa de interés. Aquí, el término "marca"' se refiere a una secuencia que incluye uno o más aminoácidos u otras moléculas similares que se pueden injertar, fusionar, conjugar o unir de otro modo a otra estructura, tal como una proteína, un péptido, una molécula pequeña, un marcador detectable (por ejemplo, un tinte fluorescente), un oligonucleótido, un polímero que no es de aminoácidos o ácido nucleico (por ejemplo, polietilenglicol) o similares. En un aspecto, la naturaleza de la unión deberá permitir el acceso a la marca por parte de una enzima para la que la marca es un sustrato.

En un aspecto de la presente divulgación, se identificó una especie de transglutaminasa previamente desconocida en el organismo Kutzneria albida, se expresó de forma recombinante, se purificó y se caracterizó usando un enfoque de cribado de alto rendimiento basado en matrices. Se determinó que la transglutaminasa de K. albida presenta una alta selectividad y especificidad de sustrato por sus secuencias de sustrato determinadas con la ayuda de la matriz, pero reacciona solo de manera deficiente o no reacciona en absoluto con las secuencias de sustrato de la enzima de S. mobaraensis. En consecuencia, se puede decir que la transglutaminasa de K. albida es bioortogonal con respecto a la enzima de S. mobaraensis. En otro aspecto, la transglutaminasa de K. albida presentaba un peso molecular sorprendentemente menor (aproximadamente 30 kDa) al de todas las especies de TGM descritas previamente (por ejemplo, la TGM de S. mobaraensis es de aproximadamente 38 kDa), lo que significa una ventaja para los propósitos de producción y marcaje enzimático. Además, la transglutaminasa de K. albida tenía una estructura primaria de aminoácidos claramente diferente en comparación con todas las proteínas conocidas actualmente. En general, estas propiedades hacen que la transglutaminasa de K. albida sea altamente atractiva para una amplia gama de aplicaciones, que incluyen, pero sin limitarse a, la conjugación versátil, rentable y específica de sitio de biomoléculas con diversas moléculas marcadoras. Aplicaciones adicionales o alternativas donde puede ser eficaz la transglutaminasa de K. albida incluyen la producción de conjugados de fármacoanticuerpo terapéuticos o anticuerpos quimioluminiscentes para usos de diagnóstico in vitro.

En un aspecto, varias dificultades planteadas en la producción recombinante de transglutaminasas se pueden superar a través de la implementación de los modos de realización de la presente divulgación. Con referencia a la FIG. 1, un procedimiento 100 de identificación y caracterización de una transglutaminasa incluye una etapa 102 de identificación de transglutaminasas candidatas. La etapa 102 puede incluir una búsqueda de homólogos de especies de transglutaminasas conocidas o presuntas para identificar transglutaminasas candidatas para otros estudios. En un modo de realización ilustrativo, la transglutaminasa puede ser una transglutaminasa microbiana (por ejemplo, una transglutaminasa de Streptoverticillium sp., una transglutaminasa de Kutzneria sp., Streptomyces sp. o similares) o una transglutaminasa de mamífero. En ejemplos donde la enzima es una transglutaminasa de mamífero, la transglutaminasa de mamífero se puede seleccionar, por ejemplo, del grupo que consiste en transglutaminasa del factor XIII A humano, transglutaminasa del factor XIII B humano, una transglutaminasa del factor XIII, una transglutaminasa de queratinocitos, una transglutaminasa de tipo tisular, una transglutaminasa epidérmica, una transglutaminasa de próstata, una transglutaminasa neuronal, una transglutaminasa 5 humana y una transglutaminasa 7 humana.

Una búsqueda de homólogos de transglutaminasas candidatas conocidas o presuntas puede incluir el uso de una o más herramientas de búsqueda o bases de datos. Una herramienta adecuada incluye la herramienta de búsqueda Protein Basic Local Alignment Search Tool (Protein BLAST) del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI). A la herramienta Protein BLAST se le puede facilitar la secuencia de especies de transglutaminasa conocidas o presuntas, cuyas secuencias se pueden obtener de diversas bases de datos. Un ejemplo de una base de datos es el catálogo universal de proteínas (UniProt). Sin embargo, se pueden usar otras bases de datos además de o como alternativa a UniProt. En un aspecto, cuando se usa Protein BLAST, se puede seleccionar un valor umbral esperado (valor E) para limitar los resultados de la búsqueda. En un ejemplo, puede ser útil seleccionar un valor E inferior a aproximadamente 10-8. En otro ejemplo, puede ser útil seleccionar un valor E inferior a aproximadamente 10-10. En aún otro ejemplo, puede ser útil seleccionar un valor E inferior a aproximadamente 10-12.

La etapa 102 puede incluir además la realización de una alineación de secuencias de una secuencia de transglutaminasa con una herramienta de alineación. Un ejemplo de una herramienta de alineación incluye la herramienta Clustal Omega 1.2.1 (Sievers et al. 2011, Molecular Systems Biology 7: 539). Una herramienta de alineación puede proporcionar un valor en la matriz de porcentajes de identidad, identificar la conservación potencial de los residuos catalíticamente activos (si se conocen) o una combinación de los mismos. Otras herramientas que se pueden usar en la etapa 102 incluyen el servidor ProP 1.0 de la Universidad Técnica de Dinamarca (Duckert et al. 2004, Protein Engineering, Design & Selection 17(1): 107-112) para predecir secuencias de propéptidos y de señal de una transglutaminasa. En un aspecto, una transglutaminasa candidata puede tener una similitud de al menos aproximadamente un 20 %, al menos aproximadamente un 25 %, al menos aproximadamente un 30 %, al menos aproximadamente un 35 % o más con respecto a una transglutaminasa conocida. Además, una transglutaminasa candidata se puede caracterizar por la conservación de al menos uno o más residuos del sitio activo con respecto a una transglutaminasa conocida o presunta, lo que indica que la estructura y función enzimáticas pueden estar conservadas.

La información obtenida en la etapa 102 a través del uso de una o más de las herramientas mencionadas anteriormente se puede usar para seleccionar transglutaminasas candidatas a partir de secuencias de transglutaminasa predichas o conocidas para la expresión y purificación en una etapa 104. En un aspecto, la etapa 104 puede incluir el cribado rápido de las condiciones de expresión para una especie de transglutaminasa candidata. Un procedimiento adecuado para el cribado incluye la inserción del inserto genético para la transglutaminasa candidata en uno o más vectores de expresión diseñados para la expresión citosólica o periplásmica soluble en un organismo huésped usando un sistema de intercambio de fragmentos (Geertsma, et al.

2011. Biochemistry 50(15): 3272-3278). También se pueden emplear otros procedimientos de cribado.

La etapa 104 puede incluir además un cribado inicial para identificar pruebas de la expresión de proteínas de longitud completa con la movilidad electroforética esperada. En el caso de que se observe una expresión escasa o nula de la proteína transglutaminasa candidata activa de longitud completa, se puede fusionar una secuencia de la transglutaminasa candidata con una chaperona (por ejemplo, SlyD) para mejorar la probabilidad de que se exprese la enzima funcional. La expresión de una transglutaminasa candidata se puede optimizar aún más mediante el cribado de diferentes tiempos de incubación, temperaturas de incubación, concentraciones de inductores, tiempos de inducción, tipos de medios, volúmenes de medios, similares y combinaciones de los mismos.

En general, se apreciará que las muchas estrategias de purificación y expresión viables se pueden emplear en la etapa 104 del procedimiento 100. Por ejemplo, una secuencia de transglutaminasa candidata se puede incorporar en una construcción de expresión modular. Ejemplos de construcciones de expresión para su uso en la etapa 104 pueden incluir módulos de chaperona, módulos del sitio de escisión para proteasas, módulos de la marca de purificación, módulos de detección, similares y combinaciones de los mismos. Por ejemplo, una construcción de expresión puede incluir uno o más módulos de chaperona SlyD dispuestos para proporcionar una proteína de fusión transglutaminasa-chaperona, uno o más módulos del sitio de escisión para proteasas que flanquean la secuencia de la transglutaminasa para la separación de los diversos módulos después de la expresión y una o más marcas de 8X-histidina u otros módulos de purificación para la recuperación de uno o más segmentos de la proteína expresada. En las construcciones de expresión que incluyen un módulo del sitio de escisión para proteasas, la proteína expresada se puede tratar con una o más proteasas para proporcionar la proteína activada. Por ejemplo, la proteína expresada se puede tratar con una proteasa de tipo factor Xa, una proteasa de tipo tripsina, una proteasa de tipo trombina u otra proteasa similar para escindir cualquier proteína chaperona, secuencias propeptídicas, marcas de purificación o similares de la transglutaminasa candidata expresada.

Para la producción de una proteína transglutaminasa seleccionada, la secuencia génica que codifica la transglutaminasa candidata, incluyendo algunas, ninguna o todas las secuencias señal y propeptídicas predichas, se pueden optimizar en cuanto a codones y sintetizar químicamente para su expresión en un organismo huésped particular (por ejemplo, E. coli). La expresión se puede realizar de acuerdo con protocolos de biología molecular estándar como se describe, por ejemplo, en Green, et al., 2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

En una etapa 106 siguiente del procedimiento 100, las transglutaminasas candidatas expresadas y purificadas en la etapa 104 se criban frente a una colección de sustratos para identificar sustratos potenciales que incluyan secuencias donantes de acilo, secuencias donantes de amina o ambas. En un aspecto, la colección de sustratos puede incluir una pluralidad de péptidos característicos sintetizados en una matriz mediante síntesis en matriz sin máscara (publicación de patente de EE. UU. n.° 2015/0185216 de Albert et al., presentada el 19 de diciembre de 2014). Los péptidos característicos se pueden preparar a partir de aminoácidos naturales, aminoácidos no naturales, otros componentes básicos moleculares, similares y combinaciones de los mismos. Además, los péptidos pueden tener una forma lineal, cíclica o restringida (macrocíclica).

Como se usa en el presente documento, los términos "péptido", "oligopéptido" o "aglutinante peptídico" se refieren a compuestos orgánicos compuestos por aminoácidos que pueden estar dispuestos en una cadena lineal (unidos entre sí mediante enlaces peptídicos entre los grupos carboxilo y amino de residuos de aminoácidos contiguos), en forma cíclica o restringida (por ejemplo, en forma de "macrociclo"). Los términos "péptido" u "oligopéptido" también se refieren a polipéptidos más cortos, es decir, compuestos orgánicos compuestos por menos de 50 residuos de aminoácido. Un macrociclo (o péptido restringido), como se usa en el presente documento, se usa en su significado habitual para describir una molécula pequeña cíclica tal como un péptido de aproximadamente 500 daltons a aproximadamente 2.000 daltons.

El término "aminoácido natural" se refiere a uno de los 20 aminoácidos que se encuentran típicamente en proteínas y se usan para la biosíntesis de proteínas, así como a otros aminoácidos que se pueden incorporar en las proteínas durante la traducción (incluyendo pirrolisina y selenocisteína). Los 20 aminoácidos naturales incluyen histidina, alanina, valina, glicina, leucina, isoleucina, ácido aspártico, ácido glutámico, serina, glutamina, asparagina, treonina, arginina, prolina, fenilalanina, tirosina, triptófano, cisteína, metionina y lisina.

El término "aminoácido no natural" se refiere a un compuesto orgánico que no está entre los codificados por el código genético estándar o se incorpora en las proteínas durante la traducción. Por lo tanto, los aminoácidos no naturales incluyen aminoácidos o análogos de aminoácidos, pero no se limitan a, los estereoisómeros D de aminoácidos, los análogos beta-amino de aminoácidos, homocitrulina, homoarginina, hidroxiprolina, homoprolina, ornitina, 4-amino-fenilalanina, ciclohexilalanina, ácido a-aminoisobutírico, N-metil-alanina, N-metil-glicina, norleucina, ácido N-metil glutámico, terc-butilglicina, ácido a-aminobutírico, terc-butilalanina, ácido 2-aminoisobutírico, ácido a-aminoisobutírico, ácido 2-aminoindano-2-carboxílico, selenometionina, deshidroalanina, lantionina, ácido Y-aminobutírico y derivados de los mismos en los que el nitrógeno amínico está mono o dialquilado.

Haciendo todavía referencia a la FIG. 1, una etapa 108 del procedimiento 100 incluye identificar, a partir de la colección de sustratos, las mejores secuencias de sustratos donantes de amina, secuencias de sustratos donantes de acilo, o ambas. En un aspecto, la actividad de las transglutaminasas candidatas sobre los sustratos de la colección se puede medir usando uno o más ensayos directos o acoplados. En general, un ensayo directo incluye la medición de los reactantes (por ejemplo, sustratos, cofactores, etc.) y productos (por ejemplo, enlaces isopeptídicos, sustratos desamidados, etc.) de la reacción enzimática. Por ejemplo, se puede usar espectrofotometría para rastrear el curso de la reacción enzimática midiendo un cambio en la absorbancia de luz asociada con un reactante o producto a lo largo del tiempo. En el caso de que la reacción enzimática no sea adecuada para someterla a una o más mediciones de ensayo directas, se puede emplear, además de o como alternativa a un ensayo directo, un ensayo acoplado. En el caso de un ensayo acoplado, el producto de la reacción enzimática de interés se puede usar como sustrato de otra reacción secundaria que se mida más fácilmente. Los ejemplos de ensayos acoplados incluyen la medición de reacciones redox que involucran cofactores tales como NADP(H) y NAD(H) que están involucrados como productos o reactantes en la reacción enzimática de interés. En el caso de la reacción catalizada por una transglutaminasa, se puede aplicar un ensayo acoplado de oxidación dependiente de la glutamato deshidrogenasa (GLDH). Un ejemplo de un ensayo de GLDH incluye p-caseína como sustrato de reticulación y la detección de la desamidación por oxidación de NADPH por la g Ld H. En particular, puede ser útil seleccionar un ensayo que sea compatible con un formato de cribado de alto rendimiento para investigar un gran número de sustratos (por ejemplo, mayor que 1 millón) en paralelo.

Usando uno de los ensayos directos o indirectos mencionados anteriormente, la etapa 108 puede incluir el uso de matrices de sustratos peptídicos para identificar secuencias o motivos específicos reconocidos por las transglutaminasas candidatas. Por ejemplo, la reacción de transamidación entre millones de péptidos únicos y un donante de amina biotinilado se puede cuantificar en una o más matrices en paralelo y se pueden determinar las secuencias de los péptidos que produzcan la señal más alta (es decir, los mejores sustratos). Después de esto, en una etapa 110 siguiente del procedimiento 100, los mejores sustratos se pueden volver a sintetizar y someter a prueba para determinar la actividad transglutaminasa en un ensayo independiente (en matriz o en solución). En consecuencia, la etapa 110 incluye la caracterización de las transglutaminasas candidatas en presencia de los mejores sustratos identificados en la etapa 108.

La caracterización de las transglutaminasas candidatas puede incluir la determinación de parámetros tales como especificidad, selectividad, afinidad, actividad y similares. Además, se pueden caracterizar dos o más transglutaminasas candidatas en cuanto a su ortogonalidad. Aquí, se puede identificar la capacidad de las transglutaminasas candidatas para actuar sobre los mismos sustratos. En el caso de que dos transglutaminasas diferentes no puedan actuar sobre el mismo sustrato o los mismos sustratos, se puede decir que las dos transglutaminasas diferentes son ortogonales. Sin embargo, en el caso de que las dos transglutaminasas diferentes puedan actuar sobre uno o más de los mismos sustratos, pero con diferentes grados de actividad, se puede decir que las dos transglutaminasas diferentes son semiortogonales. En un aspecto, una matriz de sustratos peptídicos puede proporcionar una lectura de todas las secuencias peptídicas pentaméricas viables a la vez. Por lo tanto, los datos recopilados de las colecciones de sustratos se pueden usar para identificar para cada transglutaminasa candidata diferencias en la especificidad de sustrato para la identificación de transglutaminasas ortogonales, semiortogonales y no ortogonales.

La etapa 110 del procedimiento 100 puede incluir además la caracterización de la capacidad de las transglutaminasas candidatas para realizar un marcaje específico de sitio en sustratos proteicos. En un aspecto del ensayo, las mejores secuencias de sustrato identificadas en la etapa 108 se pueden analizar adicionalmente en la etapa 110 tanto en matriz como en solución. También se pueden realizar experimentos para cuantificar la reactividad cruzada de las transglutaminasas candidatas con diversos sustratos. En un aspecto, un armazón proteico puede ser útil para enfoques de marcaje ya que los bucles que contienen epítopos (es decir, secuencias de sustrato) se pueden injertar en el armazón para su presentación a aglutinantes o enzimas. Un enfoque que incluye el uso de armazones se describe en la publicación de solicitud PCT n.° WO 2012/150321 de Andres et al., presentada el 4 de mayo de 2012. Los ejemplos de armazones pueden incluir de forma ventajosa uno o más dominios de la proteína de unión a FK506 (FKBP) como sitio para injertar bucles que contienen epítopos.

El marcaje de la proteína de armazón con transglutaminasas candidatas se puede lograr en una variedad de condiciones. Los factores que se pueden variar para los experimentos de marcaje incluyen la proporción entre sustrato y enzima transglutaminasa, la proporción entre un sustrato y otro sustrato, el tiempo de marcaje, el pH o similares. En particular, un sustrato se refiere a cualquier péptido, proteína u otra estructura que incluya una o más secuencias de sustrato donantes de amina o donantes de acilo. Los ejemplos de sustratos incluyen proteínas de armazón que tienen una secuencia de sustrato donante de acilo o donante de amina injertada en las mismas, un marcador detectable conjugado o asociado de otro modo con una secuencia de sustrato donante de acilo o donante de amina, una secuencia de sustrato donante de acilo o donante de amina aislada, similares y combinaciones de los mismos. El rendimiento del marcaje se puede medir a lo largo del tiempo usando técnicas estándar, tales como electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) en combinación con una detección óptica (por ejemplo, campo claro, fluorescencia). Por ejemplo, un primer sustrato puede incluir uno o más marcadores detectables. La reticulación del primer sustrato con un segundo sustrato (por ejemplo, el armazón proteico) se puede analizar identificando un desplazamiento del peso molecular en un gel SDS-PAGE seguido de la detección del marcador dentro del gel.

Los marcadores para su uso con modos de realización de la presente divulgación incluyen cualquier marcador adecuado que se pueda combinar con un sustrato de transglutaminasa. Los ejemplos de marcadores adecuados incluyen marcadores fluorescentes, marcadores quimioluminiscentes, marcadores radiactivos, marcadores químicos (por ejemplo, que incorporan química de "clic"), haptenos, una toxina, similares y combinaciones de los mismos. De forma más general, un marcador adecuado es compatible con al menos un sustrato de la transglutaminasa (por ejemplo, un sustrato donante de acilo o un sustrato donante de amina) en cuanto a que el marcador no elimina la capacidad de la transglutaminasa para actuar sobre el sustrato marcado. Además, un marcador adecuado puede producir una señal que es detectable en relación con un sustrato no marcado de la transglutaminasa. Ejemplos específicos de marcadores detectables para su uso en cualquier modo de realización apropiado en el presente documento pueden comprender fluoresceína, rodamina, Texas Red, ficoeritrina, Oregon Green (por ejemplo, Oregon Green 488, Oregon Green 514 y similares), AlexaFluor 488, AlexaFluor 647 (Molecular Probes, Eugene, Oregon), Cy3, Cy5, Cy7, biotina, rutenio, agentes fluorescentes DyLight que incluyen, pero sin limitarse a, DyLight 680, CW 800, trans-cicloocteno, tetrazina, metiltetrazina y similares. Los ejemplos de haptenos incluyen biotina, digoxigenina, dinitrofenilo y similares. Los ejemplos de toxinas incluyen amatoxinas (por ejemplo, amanitina), maitansinoides y similares.

En algunos ejemplos, la etapa 110 puede incluir además la identificación y caracterización de la estructura cristalina tridimensional (3d ) de la transglutaminasa para proporcionar más información sobre la naturaleza de la transglutaminasa. La estructura cristalina de la transglutaminasa se puede obtener en presencia o ausencia de uno o más sustratos, cofactores o similares. El análisis de la estructura cristalina puede proporcionar información sobre posibles localizaciones para mutagénesis específica de sitio para mejorar las propiedades de la transglutaminasa. La cristalización de una transglutaminasa candidata con una secuencia de sustrato particular puede revelar además interacciones entre la transglutaminasa y la secuencia de sustrato para fundamentar las modificaciones en la transglutaminasa o la secuencia de sustrato, o en ambas, para adaptar las propiedades de la transglutaminasa a una aplicación particular. Además, el análisis de la estructura cristalina puede servir como confirmación independiente de la veracidad del descubrimiento de sustratos basado en matrices (véase el ejemplo 5).

En una etapa 112 del procedimiento 100, las secuencias de sustrato identificadas en la etapa 108 y caracterizadas en la etapa 110 se seleccionan para su uso en la aplicación posterior de una transglutaminasa candidata seleccionada. En general, una secuencia de sustrato donante de acilo o donante de amina particular puede ser única para una transglutaminasa dada. En consecuencia, para una aplicación dada, puede ser útil seleccionar en primer lugar una transglutaminasa y seleccionar a continuación una o más secuencias de sustrato. Para aplicaciones donde la especificidad y la selectividad son importantes (por ejemplo, marcaje ortogonal con dos o más transglutaminasas), la etapa 112 puede incluir la selección de secuencias de sustrato que estén marcadas específica y selectivamente por la transglutaminasa seleccionada. Sin embargo, otras aplicaciones se pueden beneficiar de la selección de secuencias de sustrato sobre las que pueda actuar más de una transglutaminasa. Los sustratos pueden volver a la etapa 106 para ciclos de cribado adicionales. En este caso, los sustratos seleccionados se pueden extender, madurar o similares en ciclos de cribado posteriores en la matriz de péptidos. Ejemplos de procedimientos para la extensión y maduración de secuencias peptídicas se describen en la publicación de patente de EE. UU. n.° 2015/0185216 de Albert et al., presentada el 19 de diciembre de 2014.

En aún otros ejemplos, puede ser útil proporcionar un marcaje específico de sitio con actividad transglutaminasa promiscua. Una transglutaminasa promiscua puede ser útil si el sustrato no se produce de forma recombinante, si el sitio de marcaje y la proporción de marcadores se pueden controlar o no son de importancia crítica para la aplicación disponible o similares. Un ejemplo de marcaje con una transglutaminasa promiscua es la conjugación de cargas útiles con IgG desglucosilada o glucosilada. Sin embargo, las transglutaminasas que tienen actividad inespecífica pueden estar limitadas a una estrecha gama de aplicaciones posibles. En consecuencia, en otras situaciones puede ser útil proporcionar una transglutaminasa que tenga actividad específica solo para un sustrato particular o grupo de sustratos similares.

En resumen, el procedimiento 100 se puede usar para identificar y caracterizar una o más transglutaminasas candidatas junto con uno o más sustratos correspondientes. Las transglutaminasas hipotéticas o conocidas se pueden expresar y cribar en colecciones de sustratos para identificar secuencias de sustrato preliminares que provoquen la actividad transglutaminasa deseada. A continuación, los mejores sustratos se pueden seleccionar y, opcionalmente, refinar de manera iterativa, dando como resultado de este modo una combinación de transglutaminasa-sustrato que se puede implementar en una variedad de aplicaciones.

Ejemplos

Ejemplo 1: Identificación de la transglutaminasa microbiana de K. albida

El establecimiento de un procedimiento enzimático viable y sólido a escala industrial para enfoques de conjugación específica de sitio, como los conjugados de anticuerpo-fármaco, impone grandes exigencias a la enzima de acoplamiento. Entre otros factores, puede ser útil que dichos enfoques tengan una alta velocidad de reacción, eficacia de conjugación y especificidad de sustrato. Además, puede ser útil que dichos enfoques sean económicos en cuanto a la producción, incluyan una enzima con un peso molecular bajo, una enzima que sea independiente de cofactores, similares y combinaciones de los mismos. Para el descubrimiento de nuevas transglutaminasas microbianas se realizó una búsqueda de homólogos de esta enzima que pudieran cumplir todos los criterios mencionados usando la secuencia de aminoácidos de la proteína-glutamina gamma-glutamiltransferasa de S. mobaraensis como consulta. Esto proporcionó el producto génico hipotético KALB_7456 de la bacteria K. albida DSM43870, una bacteria grampositiva formadora de esporas que se secuenció en 2014 (Rebets et al., 2014. BMC genomics 15: 885).

Se usó la interfaz internética de la herramienta Protein BLAST del NCBI para buscar secuencias similares a la TGM de Streptomyces mobaraensis. Como consulta se introdujo la secuencia de aminoácidos de la proteínaglutamina gamma-glutamiltransferasa de S. mobaraensis (número de acceso de UniProt P81453). La secuencia de aminoácidos de la proteína-glutamina gamma-glutamiltransferasa de S. mobaraensis es la siguiente:

MRIRRRALVFATMSAVLCTAGFMPSAGEAAADNGAGEETKSYAETYRLTADDVANINALNESAP

AAS S AGPS FRAPDSDDRVTP PAE PLDRMPD P YR PS YGRAETWNNYI RKWQQVYSHRDGRKQQM

TEEQREWLSYGCVGVTWVNSGQYPTNRLAFASFDEDRFKNELKNGRPRSGETRAEFEGRVAKES

FDEEKGFQRAREVASVMNRALENAHDESAYLDNLKKELANGNDALRNEDARSPFYSALRNTPSF

KERNGGNHDPSRMKAVIYSKHFWSGQDRSSSADKRKYGDPDAFRPAPGTGLVDMSRDRNIPRSP

TSPGEGFVNFDYGWFGAQTEADADKTVWTHGNHYHAPNGSLGAMHVYESKFRNWSEGYSDFDRG AYVITFIPKSWNTAPDKVKQGWP (SEQ ID NO: 5)

El cribado manual de los resultados para valores E inferiores a 10'10 y secuencias polipeptídicas más cortas que la de la TGM de S. mobaraensis proporcionó el producto génico hipotético KALB_7456 de la cepa bacteriana Kutzneria albida DSM43870 (número de acceso de GenBank AHI00814.1; número de acceso de UniProt W5WHY8). La secuencia de aminoácidos del producto génico KALB_7456 es la siguiente:

MHKWFLRAAWAAVGFGLPTLIATTAQAAAVAAPTPRAPLAPPLAEDRSYRTWRVEDYVEAWER

YHGREMTEDERENLARGCIGVTWNLNREDLSNPPLNLSFGSLRTAEAVQAALNKIVDTHPSPA

QYEAAVAKDPILKRLKNWKALPSWIDSAKLKASIFSKRFYSWQNPDWSEERAHTTYRPDRETD

QVDMSTYRYRARPGYVNFDYGWFDQDTNTWWHANHEEPRMWYQSTLRHYSRPLQDFDEQVFTV

AFAKKD (SEQ ID NO: 6)

La alineación de secuencias de las secuencias de S. mobaraensis y K. albida con Clustal Omega 1.2.1 proporcionó un valor de un 32 % en la matriz de porcentajes de identidad e identificó la conservación de los residuos catalíticamente activos de la TGM de S. mobaraensis (C140, R331 y H350 basado en la numeración de P81453 (SEQ ID NO: 5)). Se usó el servidor ProP 1.0 de la Universidad Técnica de Dinamarca para predecir las secuencias propeptídica y señal de la hipotética transglutaminasa microbiana de K. albida. El único sitio de escisión predicho en el propéptido fue VAAPTPR/AP, con una puntuación (0,513) por encima del umbral, donde la barra entre los aminoácidos R y A indica el sitio de escisión predicho.

La comparación de las estructuras primarias de los productos génicos de S. mobaraensis (SEQ ID NO: 5) y K. albida (SEQ ID NO: 6) mostró una similitud de un 30 % con una clara conservación de los residuos del sitio activo (figura 2A), lo que indica que pueden estar conservadas la estructura y función enzimáticas. El producto génico completo de K. albida es significativamente más pequeño que el de la TGM de S. mobaraensis, ascendiendo el peso molecular calculado del producto génico de K. albida a 30,1 kDa. Puesto que la TGM de S. mobaraensis se produce como proenzima inactiva y se procesa mediante proteasas extracelulares para proporcionar la forma activa de 38 kDa, se predijo un mecanismo de activación similar para la TGM hipotética de K. albida y se usó el servidor ProP 1.0 para analizar la probabilidad de las secuencias señal y propeptídica en la región N terminal de la proteína (figuras 2B y 2C). La secuencia VAAPTPR/AP fue el único sitio de escisión predicho para el propéptido, donde la escisión se produce entre los aminoácidos arginina y prolina, como se indica mediante la barra. La secuencia VAAPTPR/Ap se corresponde con el sitio de dispasa SAGPSFR/AP en la TGM de S. mobaraensis, pero supuestamente no tiene reactividad dispasa ya que la fenilalanina es un residuo necesario en el motivo de reconocimiento de las enzimas. Adicionalmente, el servidor ProP 1.0 predijo un péptido señal con un sitio de escisión GLPTLIA/TT de alta probabilidad. Sin embargo, el sitio de escisión predicho del péptido señal no tiene semejanza de secuencia con la presecuencia de la TGM de S. mobaraensis, significativamente más larga, u otros péptidos señal conocidos. En base al sitio de escisión predicho del péptido señal y del propéptido, se calculó que los pesos moleculares de la transglutaminasa madura de K. albida, la proenzima y la preproenzima eran 26,4 kDa, 27,7 kDa y 30,1 kDa, respectivamente.

Ejemplo 2: Evaluación de construcciones paralelas para la producción recombinante de KalbTG

Para cribar rápidamente las condiciones de expresión de la transglutaminasa hipotética de K. albida (KalbTG), insertamos el inserto genético sintético en múltiples vectores de expresión diseñados para la expresión citosólica o periplásmica soluble en E. coli usando un sistema de intercambio de fragmentos (Geertsma, et al. 2011. Biochemistry 50(15): 3272-3278).

El cribado inicial a escala de 5 ml proporcionó pruebas claras de la expresión de proteínas con la movilidad electroforética esperada de las fusiones de KalbTG de longitud completa y de que una fusión con chaperonas SlyD en tándem (Scholz, et al. 2005. Journal of Molecular Biology 345 (5): 1229-1241) proporcionó la mayor cantidad de proteína soluble entre todas las construcciones sometidas a prueba (FIG. 3A). La expresión de esta construcción se optimizó aún más cribando diferentes tiempos y temperaturas de incubación, concentraciones del inductor de isopropil-p-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) y tiempos de inducción, tipos de medios y volúmenes. Con referencia a las FlGS. 3B y 3C, la naturaleza modular de la construcción de fusión elegida proporcionó la proteína de fusión con SlyD, la proenzima y la enzima activada mediante una combinación de etapas sucesivas de purificación y escisión proteolítica. La construcción de expresión 200 incluía, comenzando a partir del extremo N, dos chaperonas SlyD 202 sucesivas, un sitio de escisión para la proteasa factor Xa (C¹), el propéptido 204 de KalbTG, un sitio de escisión para la proteasa tripsina (C²), la enzima KalbTG 206 y una marca de 8X-histidina 208. Las chaperonas SlyD 202 se escinden de la construcción de expresión 200 con una proteasa factor Xa 210. Además, el propéptido 204 se escinde de la enzima KalbTG 206 con una proteasa tripsina 212, dando como resultado una forma activada de la construcción KalbTG 200. La enzima purificada y activada permaneció estable a 4 °C y durante múltiples ciclos de congelación-descongelación. El punto de fusión de la enzima purificada y activada se determinó en 48,9 °C usando calorimetría diferencial de barrido (DSC). Se apreciará que el procedimiento descrito en el presente documento representa una de las muchas estrategias de purificación viables. Además, el enfoque de clonación paralela descrito permite la nueva evaluación de diferentes construcciones y procedimientos de producción a escala de laboratorio de una manera eficiente y económica.

Para la producción de la KalbTG, las secuencias génicas que codifican la transglutaminasa microbiana hipotética de K. albida, incluyendo tanto la señal como el propéptido predichos (KalbTGpp), incluyendo solo el propéptido predicho (kalbTGt3), excluyendo la señal y el propéptido predichos (kalbTGt1) o excluyendo la señal predicha e insertando un sitio de escisión para el factor Xa adicional detrás del propéptido (kalbTGtZ), se optimizaron en cuanto a codones para la expresión en E. coli (interfaz internética de análisis de secuencias de Roche), se sintetizaron químicamente (GeneArt, ThermoFisher, Regensburg) y se clonaron por medio de clonación por intercambio de fragmentos (Fx) (Geertsma, et al. 2011, Biochemistry 50(15): 3272-3278) en un vector que confería dos restos N terminales de chaperonas D sensibles a la lisis (SlyD, entrada P0A9K9 en UniProt), truncadas detrás de la Asp165 (Scholz et al. 2005, Journal Of Molecular Biology 345(5): 1229-1241), seguido del sitio de escisión para la proteasa factor Xa y que confería una marca de 8X-His C terminal. La secuencia de aminoácidos de las SlyD truncadas detrás de la Asp165 es la siguiente:

MKVAKDLWSLAYQVRTEDGVLVDESPVSAPLDYLHGHGSLISGLETALEGHEVGDKFDVAVGA

NDAYGQYDENLVQRVPKDVFMGVDELQVGMRFLAETDQGPVPVEITAVEDDHWVDGNHMLAGQ

NLKFNVEWAIREATEEELAHGHVHGAHDHHHDHDHD (SEQ ID NO: 7)

El vector se basa en la serie pQE-80 de Qiagen, que comprende la expresión de proteínas inducible por IPTG mediante el promotor de T5 y que confiere resistencia a ampicilina. La construcción de expresión usada para todos los experimentos descritos en este trabajo se denominó EcSlyD2-Xa-KalbTGt3-8xHis. Adicionalmente, se realizó como cribado de expresión inicial la clonación por intercambio de fragmentos en vectores que conferían fusiones N terminales con la marca de 8X-His, los péptidos señal dsbA y ompT, los restos de chaperonas SlyD o FkpA individuales y la proteína de unión a maltosa (MBP). La preparación del plásmido y la transformación de células de E. coli Bl21 Tuner químicamente competentes con el plásmido de expresión se realizó de acuerdo con protocolos estándar de biología molecular (Green, et al., 2012. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press).

Para preparar la enzima KalbTG activa se inocularon entre 0,4 litros y 1 litro de medio Terrific Broth (TB) con un cultivo de EcSlyD2-Xa-KalbTGt3-marca 8xHis en E. coli Bl21 Tuner obtenido durante la noche en una proporción de 1:50. La secuencia de aminoácidos de la construcción de expresión EcSlyD2-Xa-KalbTGt3-marca 8xHis fue la siguiente:

MKVAKDLWSLAYQVRTEDGVLVDESPVSAPLDYLHGHGSLISGLETALEGHEVGDKFDVAVGA NDAYGQYDENLVQRVPKDVFMGVDELQVGMRFLAETDQGPVPVEITAVEDDHVWDGNHMLAGQ NLKFNVEVVAIREATEEELAHGHVHGAHDHHHDHDHDGGGS GGGSGGGSGGGSGGGSGGGMKVA KDLWSLAYQVRTEDGVLVDESPVSAPLDYLHGHGSLISGLETALEGHEVGDKFDVAVGANDAY GQYDENLVQRVPKDVFMGVDELQVGMRFLAETDQGPVPVEITAVEDDHVWDGNHMLAGQNLKF NVEWAIREATEEELAHGHVHGAHDHHHDHDHDGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGIEGRMGGG STTAQAAAVAAPTPRAPLAPPLAEDRSYRTWRVEDYVEAWERYHGREMTEDERENLARGCIGVT WNLNREDLSNPPLNLSFGSLRTAEAVQAALNKIVDTHPSPAQYEAAVAKDPILKRLKNWKAL PSWIDSAKLKASIFSKRFYSWQNPDWSEERAHTTYRPDRETDQVDMSTYRYRARPGYVNFDYGW FDQDTNTWWHANHEEPRMWYQSTLRHYSRPLQDFDEQVFTVAFAKKDGGGSGHHHHHHHH

(SEQ ID NO: 8)

Las células se incubaron a 37 °C, 180 rpm en matraces agitados con deflectores y se indujo la expresión de proteínas con IPTG 1 mM después de que la densidad celular alcanzara una DO⁶⁰⁰nm de 0,8-1,2. Las células se recogieron por centrifugación (7878 x g durante 30 a 4 °C). Los sobrenadantes se desecharon y los sedimentos celulares se almacenaron a -80 °C o se procesaron de inmediato para la cromatografía de afinidad por metales inmovilizados con níquel (Ni+-IMAC).

Para la posterior purificación de EcSlyD2-Xa-KalbTGt3-8xHis mediante Ni+-IMAC, los sedimentos celulares se resuspendieron en 30-50 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) en presencia de lisozima y DNasa I. Las células se rompieron mediante homogeneización a alta presión a 2 kbar. La suspensión se centrifugó para eliminar los restos celulares (17.210 x g durante 30 min a 4 °C).

Los sobrenadantes obtenidos mediante la rotura de las células se filtraron a través de una membrana de polietersulfona (PES) de 0,45 pm y se cargaron en una columna His Trap de 5 ml, se lavaron con al menos 5 volúmenes de columna de PBS y la proteína marcada con His se eluyó con un gradiente lineal de imidazol de 0 a 250 mM en PBS (30 ml, 5 ml min-1). Las fracciones de 3 ml que contenían proteína, identificadas por Abs²⁸⁰nm, se recogieron, se diluyeron en PBS y se concentraron por medio de concentradores AmiconUltra (10.000 MWCO; 5000 x g durante 15-30 min). La concentración de proteína de las fracciones se determinó mediante el ensayo Bradford (BioRad, de acuerdo con las instrucciones del fabricante). Se analizaron entre 5 y 10 pg de proteína por muestra mediante SDS-PAGE (ThermoFisher Novex, de acuerdo con las instrucciones del fabricante). La proteína purificada se dividió en alícuotas de 200 pl, se congeló a través de una breve incubación en nitrógeno líquido y se almacenó a -80 °C.

Para escindir las chaperonas SlyD y el propéptido de EcSlyD2-Xa-KalbTGt3-marca 8xHis, la proteína se inmovilizó en una columna His Trap de 5 ml y se realizó una digestión en columna con factor Xa seguido de tripsina. Se aplicó un microgramo de factor Xa por 50 pg de proteína total y se incubó en columna durante 1,5 horas. La proteasa y las SlyD escindidas se eliminaron de la columna por lavado con PBS.

La secuencia de aminoácidos de la construcción de expresión EcSlyD2-Xa-KalbTGt3-marca 8xHis después de la digestión con el factor Xa fue la siguiente:

MGGGSTTAQAAAVAAPTPRAPLAPPLAEDRSYRTWRVEDYVEAWERYHGREMTEDERENLARGC IGVTWNLNREDLSNPPLNLSFGSLRTAEAVQAALNKIVDTHPSPAQYEAAVAKDPILKRLKNV VKALPSWIDSAKLKASIFSKRFYSWQNPDWSEERAHTTYRPDRETDQVDMSTYRYRARPGYVNF DYGWFDQDTNTWWHANHEEPRMWYQSTLRHYSRPLQDFDEQVFTVAFAKKDGGGSGHHHHHHH H

(SEQ ID NO: 9)

Después de la digestión con tripsina, la secuencia de aminoácidos de la enzima KalbTG (KalbTGt3) fue la siguiente:

APLAPPLAEDRSYRTWRVEDYVEAWERYHGREMTEDERENLARGCIGVTWNLNREDLSNPPLN

LSFGSLRTAEAVQAALNKIVDTHPSPAQYEAAVAKDPILKRLKNW KALPSW IDSAKLKASIFS

KRFYSWQNPDWSEERAHTTYRPDRETDQVDMSTYRYRARPGYVNFDYGWFDQDTNTWWHANHEE

PRMWYQSTLRHYSRPLQDFDEQVFTVAFAKKDGGGSGHHHHHHHH (SEQ ID NO: 10)

Para el análisis de la estructura cristalina de KalbTG, se eluyó la proteína marcada con His después de la digestión con factor Xa con un gradiente lineal de imidazol 0-250 mM y se realizó una etapa de pulido usando cromatografía de exclusión por tamaño (GE Superdex 200 pg 16/60, PBS). De forma alternativa, para obtener una preparación enzimática pura y activa, la activación se realizó añadiendo 200 pg ml-1 de tripsina en la columna His Trap e incubando durante 15-30 min. La proteasa y el propéptido escindido se eliminaron de la columna por lavado con PBS y la KalbTG digerida se recogió como se describe anteriormente. Para eliminar las impurezas de alto peso molecular de la KalbTG activa, la preparación enzimática se filtró a través de concentradores AmiconUltra (50.000 MWCO). La actividad del filtrado se sometió a prueba por medio de un ensayo acoplado a GLDH y la pureza se analizó mediante SDS-PAGE como se muestra en la FIG. 3C. El filtrado restante se dividió en alícuotas de 200 pl, se congeló en nitrógeno líquido y se almacenó a -80 °C.

En otro ejemplo de un enfoque para la preparación de la enzima KalbTG activa se inoculó E. coli BL21, que albergaba el plásmido pQE-EcSlyD2-Xa-KalbTGt1-8H (origen ColE1; promotor de T5 inducible por IPTG), en 10 l de medio de fermentación estándar de E. coli similar a Terrific Broth (extracto de levadura, K²HPO⁴ , NH4Cl, glicerina, antiespumante, MgSO4^7H2O, H³PO⁴ , NaOH) y que contenía 1 g adicional de NH4Cl por litro. La secuencia de la construcción EcSlyD2-Xa-KalbTGt1-8xHis fue la siguiente:

MKVAKDLWSLAYQVRTEDGVLVDESPVSAPLDYLHGHGSLISGLETALEGHEVGDKFDVAVGA

NDAYGQYDENLVQRVPKDVFMGVDELQVGMRFLAETDQGPVPVEITAVEDDHVWDGNHMLAGQ

NLKFNVEWAIREATEEELAHGHVHGAHDHHHDHDHDGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGMKVA

KDLWSLAYQVRTEDGVLVDESPVSAPLDYLHGHGSLISGLETALEGHEVGDKFDVAVGANDAY

GQYDENLVQRVPKDVFMGVDELQVGMRFLAETDQGPVPVEITAVEDDHVWDGNHMLAGQNLKF

NVEWAIREATEEELAHGHVHGAHDHHHDHDHDGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGIEGRMLAP

PLAEDRSYRTWRVEDYVEAWERYHGREMTEDERENLARGCIGVTWNLNREDLSNPPLNLSFGS

LRTAEAVQAALNKIVDTHPSPAQYEAAVAKDPILKRLKNWKALPSWIDSAKLKASIFSKRFYS

WQNPDWSEERAHTTYRPDRETDQVDMSTYRYRARPGYVNFDYGWFDQDTNTWWHANHEEPRMW

YQSTLRHYSRPLQDFDEQVFTVAFAKKDGHHHHHHHH (SEQ ID NO: 11)

La construcción EcSlyD2-Xa-KalbTGt1-8xHis tenía una composición modular similar (pero no idéntica) a la construcción ilustrada en la FIG. 3B, con la notable diferencia de que la construcción EcSlyD2-Xa-KalbTGt1-8xHis carecía del propéptido 204 de KalbTG y el sitio de escisión para la proteasa tripsina (C²).

La fermentación se llevó a cabo a 35 °C durante 26 h hasta alcanzar una DO⁶⁰⁰ de 44. Las células se recogieron y se resuspendieron en tampón que contenía Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM, DTT 1 mM y (NH4)2SO410 mM. Las células se rompieron mediante un homogeneizador de alta presión a 800 bar. El extracto celular resultante se pretrató con Polymin-G20 al 1-3 % y a continuación se cargó en una columna Q-Sepharose XL (matriz de intercambio aniónico fuerte; GE Healthcare Life Sciences) a una concentración de proteína de aproximadamente 30 mg/ml. La proteína unida se lavó con Tris-HCl 20 mM pH 8,0, EDTA 1 mM, d Tt 1 mM, (n H4)2SO4 10 mM y NaCl 150 mM y a continuación se eluyó con un gradiente de 30 volúmenes de columna de NaCl 150-500 mM. El eluido se dializó (peso molecular de corte 10 kDa) frente a Tris-HCl 20 mM pH 8,0, EDTA 0,1 mM, DTT 0,1 mM, (NH4)2SO410 mM, NaCl 500 mM, se concentró y se cargó en una columna de Ni-NTA. La proteína marcada con His unida se lavó con Tris-HCl 20 mM pH 8,0, EDTA 0,1 mM, DTT 0,1 mM, (NH4)2SO4 10 mM, NaCl 500 mM, imidazol 25 mM y se eluyó con un gradiente de 20 volúmenes de columna de imidazol 25-200 mM. La proteína purificada se dializó (peso molecular de corte 10 kDa) frente a Tris-HCl 20 mM, EDTA 1 mM, DTT 1 mM y (NH4)2SO410 mM, pH 8,0, se concentró a 1,77 mg/ml, se analizó mediante SDS-PAGE y el ensayo de actividad de la GLDH y se congeló a -80 °C en alícuotas de 10 mg. Antes de su uso, el (NH4)2SO4 se eliminó mediante diálisis con un filtro con un peso molecular de corte de 10 kDa. La digestión con el factor Xa se realizó como se describe en el presente documento para eliminar la parte 2xSlyD de la construcción KalbTG, produciendo de este modo la enzima KalbTG (KalbTGtl) que tenía la siguiente secuencia:

MLAPPLAEDRSYRTWRVEDYVEAWERYHGREMTEDERENLARGCIGVTWNLNREDLSNPPLNL

SFGSLRTAEAVQAALNKIVDTHPSPAQYEAAVAKDPILKRLKNW KALPSW IDSAKLKASIFSK

RFYSWQNPDWSEERAHTTYRPDRETDQVDMSTYRYRARPGYVNFDYGWFDQDTNTWWHANHEEP RMWYQSTLRHYSRPLQDFDEQVFTVAFAKKDGHHHHHHHH (SEQ ID NO: 12)

Un aspecto del enfoque adoptado para expresar la enzima KalbTG derivada de la construcción EcSlyD2-Xa-KalbTGt1-8xHis incluye la adición de una fuente de iones amonio (es decir, (NH4)2SO4 o NH4Cl), que es un inhibidor natural de la enzima KalbTG, tanto al caldo de fermentación como a los tampones de purificación. El uso de amonio (o amoniaco) permite la producción de la proteína de fusión KalbTG sin la necesidad de expresión o escisión posterior de la secuencia propeptídica. La actividad autocatalítica de la enzima KalbTG se es inhibe de forma reversible por la presencia del ion amonio (del cloruro de amonio en solución) hasta la diálisis final usada para eliminar el ion amonio antes de la aplicación de la enzima KalbTG. Sorprendentemente, el procedimiento de purificación que incluye el uso de cloruro de amonio da lugar a un aumento de la actividad enzimática de la KalbTG de hasta aproximadamente 9 veces según lo medido en el ensayo de la GLDH, lo que hace que la enzima KalbTG sea altamente competitiva en comparación con la TGM disponible comercialmente en la actualidad (véase ejemplo 3, tabla 4). En consecuencia, puede ser útil expresar, purificar o aislar de otro modo una transglutaminasa en presencia de cloruro de amonio, otra sal de amonio u otra fuente de amoniaco.

En algunos ejemplos, puede resultar útil seleccionar una fuente de amonio donde el contraión tenga un efecto neutro en el procedimiento global. Por ejemplo, en experimentos donde el contraión de amonio fue sulfato, se observó un impacto negativo en la expresión en comparación con el uso de cloruro como contraión. Sin embargo, el uso de sulfato como contraión puede tener poco o ningún efecto negativo con respecto a las etapas de purificación. En consecuencia, puede ser útil determinar en primer lugar los efectos del contraión sobre la expresión y la purificación de una transglutaminasa determinada. Además, se puede variar la concentración de ion amonio presente durante la expresión o la purificación de una transglutaminasa determinada.

En un modo de realización, el amonio puede estar presente en una concentración de al menos aproximadamente 10 |jM. En un ejemplo, el amonio está presente en una concentración de al menos aproximadamente 100 j M. En aún otro ejemplo, el amonio está presente en una concentración de al menos aproximadamente 1 mM. En todavía otro ejemplo, el amonio puede estar presente en una concentración de al menos aproximadamente 10 mM.

Ejemplo 3: Uso de matrices de péptidos para el descubrimiento de sustratos para la transglutaminasa

Para identificar sustratos donantes de acilo y donantes de amina potenciales para la transglutaminasa de K. albida se realizó un cribado de alto rendimiento en matrices de péptidos pentaméricos (FIGS. 4A y 4B). Se confirmó una actividad de al menos 1,65 U/mg para las enzimas KalbTG fusionada con SlyD y madura mediante un ensayo comercial (Zedira TGM-ANiTA-KIT; en comparación con 4,3 U mg-1 de la TGM suministrada con el kit y un valor de blanco de 0,07 U/mg con BSA). En el ensayo se usó p-caseína como sustrato de reticulación y se detectó desamidación mediante una oxidación de NADPH dependiente de glutamato deshidrogenasa. Los motivos de reconocimiento específicos se identificaron ensayando la KalbTG con matrices de péptidos preparadas mediante síntesis de matrices sin máscara (publicación de patente de EE. UU. n.° 2015/0185216 de Albert et al., presentada el 19 de diciembre de 2014). La eficacia de la reacción de transamidación entre 1,4 millones de péptidos pentaméricos únicos y un donante de amina biotinilado se cuantificó en dos matrices en paralelo y se determinaron las secuencias de los péptidos con los mayores recambios (FIG. 4A). Los nueve mejores péptidos se volvieron a sintetizar y se sometieron a prueba para determinar la actividad de la KalbTG en un ensayo independiente acoplado a GLDH. Los resultados del ensayo acoplado a GLDH junto con los datos de las matrices correspondientes se muestran en la tabla 1. Cabe señalar que la señal de la matriz para la secuencia MLAQG (SEQ ID NO: 13) está marcada como no aplicable (n. a.) ya que esta secuencia no se incluyó en la matriz. De forma similar, la medición de una señal de fondo solo era aplicable a los experimentos realizados en la matriz.

Tabla 1:

Secuencia SEQ ID NO Señal de matriz (log ² ) Velocidad de reacción en solución (pmol/s)

YRYRQ (SEQ ID NO: 1) 8,99 3,52 ± 0,08

RYRQR (SEQ ID NO: 14) 8,96 3,60 ± 0,12

RYSQR (SEQ ID NO: 15) 8,93 3,22 ± 0,10

FRQRQ (SEQ ID NO: 16) 8,93 3,07 ± 0,17

RQRQR (SEQ ID NO: 17) 8,84 2,06 ± 0,08

FRQRG (SEQ ID NO: 18) 8,82 2,11 ± 0,13

QRQRQ (SEQ ID NO: 19) 8,77 2,98 ± 0,01

YKYRQ (SEQ ID NO: 20) 8.70 4,00 ± 0,18

QYRQR (SEQ ID NO: 21) 8.70 1,92 ± 0,07

DYALQ (SEQ ID NO: 22) 7,22 -0,05 ± 0,09

MLAQG (SEQ ID NO: 13) n. a. -0,11 ± 0,10

Fondo 7,27 n. a.

La actividad de la KalbTG se obtuvo midiendo la incorporación de un donante de amina biotinilado en la matriz de péptidos y las tasas de oxidación de NADH a 340 nm y 37 °C en presencia de un sustrato donante de amina (500 |jM) en el ensayo acoplado a GLDH usando cada uno de los nueve sustratos que contenían glutamina seleccionados mediante la matriz con el mejor rendimiento y dos sustratos que contenían glutamina de la TGM de S. mobaraensis a 100 j M. Se observó una fuerte correlación entre los mejores sustratos seleccionados mediante la matriz y su rendimiento en el ensayo acoplado a GLDH, mientras que la KalbTG no presentó actividad con los sustratos preferentes de la TGM de S. mobaraensis DYALQ (SEQ ID NO: 22) y MLAQG (SEQ ID NO: 13). Las pruebas de las mejores secuencias de la tabla 1 confirmaron que YKYRQ (SEQ ID NO: 1) y RYRQR (SEQ ID NO: 14) eran los sustratos pentaméricos con mejor rendimiento, con tasas de recambio de 3,52 ± 0,08 pmol NADH s 1 y 3,60 ±0,12 pmol NADH s 1, respectivamente. El sustrato que contenía Usina YKYRQ (SEQ ID NO: 20) presentó las tasas más altas en el ensayo de GLDH (4,00 ± 0,18 pmol s-1), que, sin estar limitado por la teoría, puede ser un artefacto causado por la reactividad cruzada de la lisina y, por tanto, se omitió en otros análisis. Sorprendentemente, no se pudo detectar actividad con el motivo de reconocimiento conocido de la TGM de S. mobaraensis MLAQGS (SEQ ID NO: 23), representado por la secuencia pentamérica MLAQG (SEQ ID NO: 13), o el sustrato de la TGM de S. mobaraensis DYALQ (SEQ ID NO: 22).

Un segundo ciclo de maduración en la matriz de péptidos proporcionó APRYRQRAA (SEQ ID NO: 24) como el sustrato nonamérico de mayor rendimiento, que a continuación se volvió a sintetizar en forma de péptido biotinilado para que actuara como donante de acilo para el descubrimiento posterior de motivos de reconocimiento de lisina optimizados en la matriz de péptidos pentaméricos (FIG. 4B). Nuevamente, seis de los mejores péptidos que contenían lisina se sintetizaron de nuevo y se sometieron a prueba en el ensayo de actividad de la KalbTG en solución usando un péptido que contenía la secuencia de reconocimiento de glutamina optimizada YRYRQ (SEQ ID NO: 1) como donante de acilo (tabla 2). Se apreciará que el cálculo de una señal de matriz para cadaverina no fue aplicable debido a la omisión de cadaverina de la matriz.

Tabla 2:

Secuencia SEQ ID NO Señal de matriz Velocidad de reacción en solución (log2) (pmol s-1)

JíYSKY (SEQ ID NO: 25) 12,75 3,89 ± 0,04

RYESK (SEQ ID NO: 2) 12,65 4,47 ± 0,16

AYRTK (SEQ ID NO: 26) 12,57 3,65 ± 0,17

RYRSK (SEQ ID NO: 27) 12,45 3,26 ± 0,10

RYGKS (SEQ ID NO: 28) 12,38 2,66 ± 0,11

YKGRG (SEQ ID NO: 29) 12,25 3,01 ± 0,09

Cadaverina n. a. n. a. 3,51 ± 0,12

ARSKL (SEQ ID NO: 30) 12,0 3,87 ± 0,31

Con referencia a la tabla 2, la actividad de la KalbTG se obtuvo midiendo la incorporación de un donante de glutamina biotinilado y las tasas de oxidación de NADH a 340 nm y 37 °C en presencia de un sustrato donante de glutamina (200 pM) en el ensayo acoplado a GLDH usando cada uno de i) seis de los sustratos de lisina de mayor rendimiento seleccionados mediante la matriz, ii) cadaverina y iii) sustrato de lisina preferente de la TGM ARSKL (SEQ ID NO: 30) a 100 pM. El mayor recambio (4,47 ± 0,16 pmol NADH s 1) en el ensayo de la GLDH se observó con la secuencia RYESK (SEQ ID NO: 2). Se trata de un incremento pequeño pero significativo con respecto a la cadaverina (3,51 ± 0,12 pmol s 1) o ARSKL (SEQ ID NO: 30) (3,87 ± 0,31 pmol s 1), un péptido establecido previamente como un motivo donante de lisina preferente de la TGM en la matriz de péptidos. Detalles adicionales sobre el sustrato peptídico ARSKL (SEQ ID NO: 30) de la TGM de S. mobaraensis se pueden encontrar en la solicitud de patente provisional de EE. UU. con el n.° de serie 62/094.495 de Albert et al., presentada el 19 de diciembre de 2014.

Para la construcción de la matriz de péptidos se diseñó una colección de 1.360.732 péptidos pentaméricos únicos usando todas las combinaciones de 18 aminoácidos naturales exceptuando cisteína y metionina, así como cualquier dímero o repetición más larga del mismo aminoácido y cualquier péptido que contuviera un dipéptido seleccionado de las secuencias HR, RH, HK, KH, RK, KR, HP y PQ. La colección se sintetizó por duplicado en la misma matriz usando una síntesis en matriz de péptidos dirigida por luz sin máscara. Cada péptido pentamérico estaba flanqueado tanto en el extremo N como en el extremo C por conectores de 3 aminoácidos de longitud sintetizados usando una mezcla de glicina y serina en una proporción de 3:1.

Para someter a prueba la especificidad de la KalbTG por el sustrato que contiene glutamina, se usó N-(biotinil)cadaverina como sustituto de un sustrato de lisina para biotinilar péptidos de glutamina en una matriz de péptidos. La reacción de marcaje de la KalbTG se realizó en 1200 pl de Tris-HCl 100 mM, pH 8, DTT 1 mM, N-(biotinil)cadaverina 50 pM, 0,2 ng pl-1 de KalbTG en una cámara SecureSeal™ (Grace Bio-Labs) a 37 °C durante 45 minutos. Después de la incubación, se retiró la cámara y se lavó la matriz en Tris-HCl 20 mM, pH 7,8, NaCl 0,2 M, SDS al 1 % durante 1 minuto, seguido de un lavado de 1 minuto en Tris-HCl 20 mM. La biotina unida a la matriz se tiñó con 0,3 pg ml-1 de Cy5-estreptavidina en Tris-HCl 10 mM, pH 7,4, caseína soluble en álcali al 1 %, Tween-20 al 0,05 % a temperatura ambiente durante 1 hora. La intensidad de fluorescencia de Cy5 se midió con un escáner de fluorescencia a una resolución de 2 pm y una longitud de onda de 635 nm.

Para someter a prueba la especificidad de la KalbTG por sustratos de lisina, se usó el péptido Z-APRYRQRAAGGG-PEG-biotina sintetizado químicamente, que incluía la secuencia APRYRQRAAGGG (SEQ ID NO: 31), como sustrato que contiene glutamina para biotinilar péptidos que contienen lisina. La biotinilación en la matriz se realizó como se describe anteriormente con 0,1 ng pl-1 de KalbTG, péptido 0,8 pM a 37 °C durante 15 minutos. Nótese que la "Z-" delante de un péptido u otra construcción similar se usa en el presente documento para representar un grupo carboxibencilo a menos que se establezca de otro modo.

Las reacciones de la TGM de S. mobaraensis en la matriz de péptidos se realizaron en Tris-HCl 100 mM, pH 8, DTT 1 mM con N-(biotinil)cadaverina 10 pM y 0,1 ng pl-1 de TGM de S. mobaraensis a 37 °C durante 15 minutos. Como se muestra en la FIG. 4A, los 22 mejores sustratos donantes de glutamina identificados en la matriz de péptidos pentaméricos con la KalbTG fueron (sin ningún orden en particular) FRQRG (SEQ ID NO:18), YRYRQ (SEQ ID NO:1), QRQRQ (SEQ ID NO:19), FRQRQ (SEQ ID NO:16), RYRQR (SEQ ID NO:14), RQRQR (SEQ ID NO:17), QRQRQ (SEQ ID NO:32), YKYRQ (SEQ ID NO:20), LRYRQ (SEQ ID NO:33), YRQRA (SEQ ID NO:34), VRYRQ (SEQ ID NO:35), QRQTR (SEQ ID NO:36), YRQTR (SEQ ID NO:37), PRYRQ (SEQ ID NO:38), RFSQR (SEQ ID NO:39), WQRQR (SEQ ID NO:40), QYRQR (SEQ ID NO:21), VRQRQ (SEQ ID NO:41), RYTQR (SEQ ID NO:42), AYRQR (SEQ ID NO:43), yqrqr (SEQ ID NO:44) y RYSQR (SEQ ID NO:15). Como se muestra en la FIG. 4B, los 17 mejores sustratos donantes de Usina identificados en la matriz de péptidos pentaméricos con la KalbTG fueron (sin ningún orden en particular) NYRFK (SEQ !D NO: 45), YQKWK (SEQ ID NO: 46), YKYKY (SEQ ID NO: 47), RWKFK (SEQ ID NO: 48), FfFYSK (SEQ ID NO: 49), YKYAK (SEQ ID NO: 50), YRYAK (SEQ ID NO: 51), RYSYK (SEQ ID NO: 52), YKSFK (SEQ ID NO: 53), YKSWK (SEQ ID NO: 54), KYRYK (SEQ ID NO: 55), YKYNK (SEO ID NO: 56), RYSKY (SEO ID NO: 25), RYESK (SEO ID NO: 2), PYKYK (SEO ID NO: 57), FYKYK (SEQ ID NO: 58) y FYESK (SEQ ID NO: 59). Los 16 sustratos donantes de glutamina identificados con la TGM y mostrados en las FIGS. 5B y 5C fueron (sin ningún orden en particular) EWVAQ (SEQ ID NO: 60), EWALQ (SEQ ID NO: 61), DYFLQ (SEQ ID NO: 62), DYALQ (SEQ ID NO: 22), EYWLQ (SEQ ID NO: 63), DWALQ (SEQ ID NO: 64), DWYLQ (SEQ ID NO: 65), DYWLQ (SEQ ID NO: 66), EYVAQ (SEQ ID NO: 67), DYVAQ (SEQ |D NO: 68), DWVAQ (SEQ ID NO: 69), EYVLQ (SEQ ID NO: 70), EWIAQ (SEQ ID NO: 71), WYALQ (SEQ ID NO: 72), EYALQ (SEQ ID NO: 73) y EYFLQ (SEQ ID NO: 74).

Ejemplo 4: Especificidad de la KalbTG por sustratos de glutamina madurados y aplicación a la conjugación semiortogonal

Puesto que la matriz de péptidos puede proporcionar una lectura de todos los péptidos pentaméricos viables a la vez, un único conjunto de datos es suficiente para evaluar cómo las enzimas difieren en la especificidad por el sustrato. Los mejores sustratos de glutamina para la KalbTG (FIG. 4A) se encontraron en el campo medio de la distribución de señales en la matriz realizada con la TGM (FIG. 5A). En comparación, los sustratos de mayor rendimiento que contienen glutamina para la TGM de S. mobaraensis (FIG. 5B) presentaron una señal relativamente más baja en la matriz con KalbTG (FIG. 5C). Para confirmar que las dos enzimas transglutaminasa tienen preferencias ortogonales por los sustratos que contienen glutamina y para cuantificar la cantidad de reactividad cruzada, se determinó la cinética de ambas enzimas en presencia de concentraciones variables de los sustratos peptídicos Z-GGGYRYRQGGGG y Z-GGGDYALQGGGG (FIG. 5D). En particular, los sustratos conjugados con Z incluían las secuencias peptídicas GGGYRYRQGGGG (SEQ ID NO: 75) y GGGDYALQGGGG (SEQ ID NO: 76). La TGM de S. mobaraensis presentó valores de Km similares en el intervalo de 0,6-0,9 mM para ambos sustratos, mientras que el recambio kcat fue significativamente mayor con el sustrato Z-GGGDYALQGGGG , que incluía la secuencia DYALQ (SEQ ID NO: 22) preferente (1,39 s'1 frente a 0,93 s'1 con YRYRQ (SEQ ID NO: 1)), lo que dio como resultado eficiencias catalíticas (kcat K^m'1) de 1,64x 103 [M'1 s'1] y 1,44x 103 [M'1 s'1], respectivamente (tabla 3). En comparación con la enzima TGM de S. mobaraensis modificada, la KalbTG parece tener una menor eficiencia de unión al sustrato (K^m de 2 mM) pero un mayor recambio (kcat de 1,92 s_1), lo que da lugar a una kcat Km'1 de 0,89 x 103 [M 1 s'1]. La KalbTG parecía no reaccionar en absoluto con el sustrato Z-GGGDYALQGGGG de la TGM de S. mobaraensis, portanto, los parámetros cinéticos no se pudieron determinar, como se indica mediante "n. d." en la tabla 3.

Tabla 3:

Propiedad Valor

Enzima TGM TGM KalbTG KalbTG Sustrato D Y A L Q Y R Y R Q DYALQ Y R Y R Q (SEQ ID NO: 22) (SEQ ID NO: 1) (SEQ ID NO: 22) (SEQ ID NO: 1) Vmáx [pmol/s] 36,66 ± 3,33 21,50 ± 1,00 n. d. 73,18 ± 7,27 Km [pM] 846,96 ± 137,75 643,63 ± 58,38 n. d. 2151,09 ± 290,94 kcat [s-1] 1,39 0,93 n. d. 1,92 kcat/KM [M 'V ] 1,64 x 103 1,44 x 103 n. d. 0,89 x 103

A continuación, se aplicaron los datos de la matriz y en solución para realizar un marcaje específico de sitio en los sustratos proteicos. La chaperona molecular SlyD es un armazón útil para enfoques de marcaje, ya que los bucles que contienen epítopos se pueden injertar en el dominio FKBP para su presentación a aglutinantes o enzimas (publicación de solicitud PCT n.° WO 2012/150321 A1 de Andrés et al.). Se produjo una proteína quimérica que consistía en el dominio FKBP de Thermus thermophilus y la secuencia de reconocimiento RYRQR (SEQ ID NO: 14) de la KalbTG. El marcaje con un exceso de diez veces de KalbTG marca K-Cy3 y una proporción entre sustrato y enzima de 72:1 proporcionó un rendimiento de aproximadamente un 70 % de una especie proteica marcada después de 15 minutos (FIG. 6A). Este rendimiento permaneció constante durante un período de tiempo de 60 minutos. La incubación con un exceso de marcador de 50 veces solo incrementó ligeramente el rendimiento de la especie marcada. En el gel SDS-PAG se observó el desplazamiento del peso molecular de 13 kDa a 19 kDa, que correspondía exactamente a la incorporación de una única molécula marcadora de 6 kDa. Un dominio FKBP construido de forma idéntica y que contenía la secuencia DYALQ (SEQ ID NO: 22) de la TGM de S. mobaraensis en lugar de RYRQR (SEQ ID NO: 14), no mostró incorporación de marcador cuando se incubó con la KalbTG (FIG.

6A), lo que significa que la reacción está limitada al sitio del motivo de reconocimiento de la KalbTG y que no se reconoce ninguna de las otras 5 glutaminas intrínsecas al dominio FKBP. Además, analizamos la dependencia del pH de la reacción de marcaje a pH 6,2, 6,8, 7,4, 8,0, 8,5 y 9 (FIG. 6B). La mayor eficacia de marcaje después de 15 minutos se observó a pH 7,4, disminuyendo la actividad a pH 8,5 y superior. Estos hallazgos se corresponden bien con las preferencias de pH publicadas para la TGM de S. mobaraensis.

Pasando a la FIG. 6C, la alta especificidad de secuencia de la KalbTG se usó para conjugar un marcador Cy3 de 6 kDa al sitio YRYRQ (SEQ ID NO: 1) de un sustrato peptídico de 7 kDa que comprendía los motivos que contienen glutamina tanto de la KalbTG como de la TGM de S. mobaraensis. La reacción se efectuó durante 30 minutos para saturar el sitio YRYRQ (SEQ ID NO: 1). El análisis porSDS-PAGE confirmó que el marcador estaba integrado en un solo sitio. El sustrato peptídico se incubó posteriormente durante 15 minutos con la TGM de S. mobaraensis y un marcador Cy5 de 6 kDa. Esto dio como resultado la formación de un conjugado doblemente marcado específico de sitio, habiéndose convertido visiblemente todas las especies monomarcadas en las especies doblemente marcadas. Estos resultados confirman que la KalbTG y la TGM de S. mobaraensis constituyen un sistema de marcaje semiortogonal con una facilidad de uso, rendimiento y eficiencia incomparables. En consecuencia, la KalbTG puede ser útil para la síntesis a escala industrial de conjugados proteicos complejos de interés en aplicaciones terapéuticas o de diagnóstico.

Para el ensayo acoplado a GLDH, para determinar si los péptidos de KalbTG seleccionados en el ensayo de matriz también eran sustratos preferentes en una reacción en solución y para cuantificar la reactividad cruzada de la KalbTG y la TGM de S. mobaraensis con diversos sustratos, se aplicó un ensayo continuo acoplado a la glutamato deshidrogenasa (GLDH) para la actividad de la TGM de S. mobaraensis (véase Oteng-Pabi, et al., 2013. Analytical biochemistry 441(2): 169-173).

Para la evaluación del sustrato de glutamina, el ensayo se realizó en una placa de microvaloración transparente de 96 pocilios en presencia de a-cetoglutarato 500 pM, cadaverina 500 pM o 1 mM como donante de amina en sustitución de un péptido que contiene lisina, 2 U mi'1 de glutamato deshidrogenasa (GLDH), NADH 500 pM y sustrato peptídico que contiene glutamina ( Z- GGGQRWRQGGGG Z-GGGWRYRQGGGG Z-GGGYRYRQGGGG Z-GGGRYRQRGGGG Z- GGGRYSQRGGGG Z-GGGWRYRQGGGG Z-GGGRQRQRGGGG Z-GGGFRQRGGGGG Z-GGGQRQRQGGGG Z-GGGYKYRQGGGG Z-GGGQYRQRGGGG Z-GGGDYALQGGGG 0 Z- GGGMLAQGSGGG) en concentraciones que varían entre 0 y 1 mM en MOPS 200 mM, EDTA 1 mM pH 7,2 (volumen total por pocilio 200 pl). En particular, los péptidos conjugados con Z incluían las secuencias GGGQRWRQGGGG iq NO: 77), GGGWRYRQGGGG (SEQ ID NO: 78), GGGYRYRQGGGG (SEQ ID NO: 75), GGGRYRQRGGGG (SEQ ID NO: 79), GGGRYSQRGGGG (SEQ ID NO: 80), GGGFRQRQGGGG (SEQ ID NO: 81), GGGRQRQRGGGG (SEQ ID NO: 82), GGGFRQRGGGGG (SEQID NO: 83), GGGQRQRQGGGG (SEQ ID NO: 84), GGGYKYRQGGGG (SEQ ID NO: 85), GGGQYRQRGGGG (SEQ ID NO: 86), GGGDYALQGGGG (SEQ ID NO: 76) y GGGMLAQGSGGG (SEQ ID NO: 87).

Para la evaluación del sustrato de amina, las condiciones del ensayo fueron las mismas que para la evaluación del sustrato de glutamina, con la excepción de que se usaron cada uno de los sustratos de amina ( Z- GGGRYSKYGGGG i Z-GGGAYRTKGGGG., Z-GGGRYRSKGGGG. Z-GGGYKGRGGGGG, Z- GGGRYGKSGGGG, Z-GGGRYESKGGGG, Z-GGGPGRYKGGGG, Z-GGGARSKLGGGG o cadaverina) a 100 pM y el donante de glutamina (Z-GGGYRYROGGGG o Z-GGGDYALQGGGG) a 200 pM. En particular, los sustratos de amina incluían las secuencias GGGRYSKYGGGG (SEQ ID NO: 88), GGGAYRTKGGGG (SEQ ID NO: 89), GGGRYRSKGGGG (SEQ ID NO: 90), GGGYKGRGGGGG (SEQ ID NO: 91), GGGRYGKSGGGG (SEQ ID NO: 92), GGGRYESKGGGG (SEQ ID NO: 93), GGGPGRYKGGGG (SEQ ID NO: 94) y GGGARSKLGGGG (SEQ ID NO: 95).

Las reacciones se iniciaron mediante la adición de 5 pg ml-1 de TGM de S. mobaraensis o KalbTG y la oxidación de NADH se registró continuamente a 340 nm durante 60 minutos usando un lector de microplacas Biotek Synergy H4, a una temperatura controlada de 37 °C y con cortos intervalos de agitación antes de cada medición. Después de una corta fase de latencia, en la que la GLDH se saturó mediante la liberación de amoniaco mediada por transglutaminasa, se observaron tasas lineales de absorbancia frente al tiempo correspondientes al recambio de la transglutaminasa y se sometieron a un análisis cinético de Michaelis-Menten. Las tasas de absorbancia, en unidades de densidad miliópticas por minuto (mOD min-1), se convirtieron en tasas molares de recambio de NADH (pmol s-1) usando la fórmula de la ecuación 1 (previamente determinada mediante una curva estándar de NADH):

Tasa de recambio = | Tasa de absorbancia| * 1,111 (ec. 1)

Para los ensayos de marcaje se usó la chaperona SlyD de Thermus thermophilus (Universal Protein Resource (UniProt) número Q5SLE7) como armazón de marcaje para la KalbTG. La secuencia de la SlyD es:

MKVGQDKWTIRYTLQVEGEVLDQGELSYLHGHRNLIPGLEEALEGREEGEAFQAHVPAEKAYG

PHDPEGVQWPLSAFPEDAEWPGAQFYAQDMEGNPMPLTWAVEGEEVTVDFNHPLAGKDLDF QVEWKVREATPEELLHGHAH (SEQ ID NO: 96)

Una secuencia donante de glutamina de la KalbTG (marca Q) se injertó de forma recombinante en el dominio FKBP de la SlyD, proporcionando la siguiente secuencia polipeptídica:

MKVGQDKWTIRYTLQVEGEVLDQGELSYLHGHRNLIPGLEEALEGREEGEAFQAHVPAEKAYG AGSGGGGRYRQRGGGGGSSGKDLDFQVEWKVREATPEELLHGHAHHHHHHHH (SEQ ID NO: 97)

La proteína marcada con 8X-histidina se produjo en E. coli Bl21 Tuner y se purificó mediante cromatografía de afinidad estándar con iones metálicos inmovilizados basada en Ni Sepharose y exclusión por tamaño (HisTrap, Superdex 200; GE Healthcare).

Los péptidos marcados se sintetizaron químicamente para tener (del extremo N al extremo C) un grupo "Z-" (es decir, un grupo carboxibencilo), una secuencia donante de lisina de la transglutaminasa (marca K), ácido 8-amino-3,6-dioxaoctanoico (020c), péptido y un tinte fluorescente Cy3 o Cy5. Las estructuras químicas primarias de los péptidos marcados fueron:

KalbTG marca K-Cy3:

Z-RYESKG-020c-EUEUEUEUEUEUEUEUEUEUEUEUEUEUEUEUEUEUEUEU-C(sCy3-MH> OH

(5863,9 g/mol), y

TGM marca K-Cy5:

Z-RSKLG-020c-EUEUEUEUEUEUEUEUEUEUEUEUEUEUEUEUEUEUEUEU-C(Cy5-MH)-0H (5723,9 g/mol),

donde E es glutamato, U es p-alanina y C(sCy3-MH) y C(Cy5-MH) representan una cisteína C terminal modificada después de la síntesis por sulfo-Cy3-maleimida o Cy5-maleimida, respectivamente.

Para el experimento de marcaje ortogonal se sintetizó químicamente una molécula que contenía marcas Q de la KalbTG y TGM de forma que tuviera la estructura química primaria: Z-GGGYRYRQGGG-PEG27-GIEGRG-PEG27-PEG27-GGGDYALQGG-OH (6620,6 g/mol).

Todos los péptidos se sintetizaron por medio de una síntesis de péptidos estándar en fase sólida basada en fluorenilmetiloxicarbonilo (FMOC) a una escala de 0,25 mmol usando componentes básicos disponibles comercialmente. Después de la síntesis en fase sólida, los péptidos se escindieron con una solución de TFA al 95 %, triisopropilsilano al 2,5 % y agua al 2,5 %. A continuación, los péptidos se precipitaron con diisopropiléter y se purificaron por medio de cromatografía de líquidos de alto rendimiento de fase inversa basada en C18 (RP18-HPLC) usando un gradiente de agua/TFA acetonitrilo. El marcaje con tinte se logró mediante la reacción de los péptidos con sulfo-Cy3-maleimida (Lumiprobe) y Cy5-maleimida (GE Healthcare), respectivamente. La purificación de los péptidos marcados con tinte se logró mediante RP18-HPLC usando un gradiente de agua/TFA acetonitrilo. La identidad de los péptidos se confirmó mediante cromatografía de líquidos-espectrometría de masas (CL-EM) (sistema Thermo Scientific RSLC-MSQplus) usando una columna Kinetex C18 de 2,6 pm, 50 x 3 mm (Phenomenex).

Si no se indica de otro modo, las reacciones de marcaje se realizaron durante 15 minutos a 37 °C en presencia de sustrato proteico 72 pM, péptido marcador 720 pM y transglutaminasa 1 pM en MOPS 200 mM pH 7,2 y EDTA 1 mM. Para el perfil de marcaje dependiente del pH se realizaron experimentos en MOPS 200 mM para pH 6,2, 6,8 o 7,4, o en Tris 200 mM para pH 8,0, 8,5 o 9,0. Para el experimento de marcaje ortogonal se añadió EcSlyD2-Xa-KalbTGt3-8xHis 1,5 pM a un volumen de 20 pl que contenía sustrato peptídico 100 pM y KalbTG marca K-Cy3 1 mM. Después de la incubación durante 30 minutos a 37 °C, se añadieron TGM marca K-Cy5 1 mM y TGM de S. mobaraensis 1,5 pM y se incubaron durante 15 minutos adicionales a 37 °C. La reacción se detuvo mediante la adición de TCA 50 mM. Se tomaron muestras entre las etapas de incubación y se analizaron mediante SDS-PAGE con fluorescencia en gel (sistema de documentación en gel BioRad ChemiDoc, LED Cy3 y Cy5 y conjuntos de filtros). En otro experimento de marcaje ortogonal se añadió EcSlyD2-Xa-KalbTGt3-8xHis 4,65 pM a un volumen de 50 pl que contenía sustrato peptídico 302 pM y KalbTG marca K-Cy3 3,02 mM (es decir, sustrato de lisina marcado con Cy3 para la KalbTG). Después de la incubación durante 30 minutos a 37 °C, la mezcla se diluyó mediante la adición de 400 pl de tampón y posteriormente se concentró a 50 pl (filtro de centrifugadora con un peso molecular de corte de 10 kDa). A continuación, se añadieron TGM marca K-Cy53,02 mM (es decir, sustrato de lisina marcado con Cy5 para la TGM de S. mobaraensis) y TGM de S. mobaraensis 4,65 pM y se incubaron durante 15 minutos adicionales a 37 °C. La reacción se detuvo mediante la adición de (NH4)2SO4 50 pM. A continuación, se añadieron 2 pg de factor Xa y la mezcla se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente. La reacción se detuvo mediante la adición de TCA 50 mM. La mezcla se filtró (filtro de centrifugadora de 0,2 pm) y se analizó mediante CL-EM con detección UV a 214 nm y 305 nm.

Se realizó otro experimento para determinar la actividad de las enzimas KalbTG preparadas a partir de dos construcciones diferentes y almacenadas a dos temperaturas diferentes. Las enzimas KalbTGt3 (SEQ ID NO: 10) y KalbTGt1 (SEQ ID NO: 12) sometidas a prueba se obtuvieron respectivamente a partir de la construcción EcSlyD2-Xa-KalbTGt3-marca 8xHis (SEQ ID NO: 8) y la construcción EcSlyD2-Xa-KalbTGt1-marca 8xHis (SEQ ID NO: 11) descritas en el ejemplo 3. La actividad de las dos enzimas KalbTG se sometió a prueba después del almacenamiento a 4 °C o -20 °C y se comparó con la actividad de la TGM de S. mobaraensis disponible comercialmente de acuerdo con un protocolo publicado (Oteng-Pabi, et al., 2013. Analytical biochemistry 441(2): 169-173). En particular, los ensayos se realizaron a 37 °C en un volumen total de 200 pl. La mezcla de ensayo incluía MOPS 200 mM, EDTA 1 mM y DTT 1 mM a pH 7,4. Además, se añadieron a-cetoglutarato y NADH a una concentración de 500 pM, junto con 2 U/ml de GLDH, y entre 0,1 pg y 1,0 pg de una de las enzimas transglutaminasa. El sustrato de glutamina fue Z-GGGYRYRQGGGG-OH 200 pM y el donante de amina fue cadaverina 10 mM, donde Z representa un grupo carboxibencilo. Todos los datos se recogieron por triplicado (promedio de 3 pocillos en una placa de microvaloración) y se les restó la actividad de referencia (tampón sin enzima). Los datos resultantes se muestran en la tabla 4.

Tabla 4:

Enzima Almacenamiento Actividad (pmol NH3/min/mg de enzima)

(°C)

TGM de S. mobaraensis -20 1,1348 ± 0,0059

KalbTGt3 (SEQ ID NO: 10) 4 0,1501 ± 0,0011

KalbTGt3 (SEQ ID NO: 10) -20 0,1528 ± 0,0400

KalbTGt1 (SEQ ID NO: 12) 4 1,4099 ± 0,1806

KalbTGt1 (SEQ ID NO: 12) -20 0,8630 ± 0,0259

Ejemplo 5: Identificación y caracterización de la estructura cristalina 3D de la KalbTG

Como se muestra en las FIGS. 7A-7C, la alineación de la estructura completa de la TGM de K. albida con la TGM de S. mobaraensis proporcionó información sobre la naturaleza de la KalbTG. En un aspecto, los primeros diecinueve aminoácidos N terminales y la marca C terminal artificial GGGSG-8X-His están desordenados y, por lo tanto, no se resolvieron en la estructura. La estructura general de la KalbTG se asemeja a la estructura de la TGM de S. mobaraensis como se describe previamente (Kashiwagi, et al. 2002, J Bio Chem 277(46): 44252-44260), formando una conformación de disco de la clase de láminas plegadas a p, formando dos protuberancias de múltiples bucles la hendidura del sitio activo. Sin embargo, las estructuras difieren en dos hélices a (a4 y a5 según la numeración de Kashiwagi) que no están presentes en la estructura de la KalbTG, y dos hebras p pequeñas (p² y p4) que comprenden menos residuos hidrófobos en la KalbTG (SF en lugar de AF y QV en lugar de LV, respectivamente), de modo que el total de elementos en la KalbTG asciende tan solo a nueve hélices a y seis hebras p. La tríada catalítica (Cys64, Asp255, His274) se conserva estructuralmente (Cys82, Asp211, His224, numeración desde el comienzo del marco abierto de lectura de la KalbTG). Sin embargo, la cadena lateral tiol de la Cys82 de KalbTG está embutida en la hendidura activa a una profundidad de 2,6 A mayor que su TGM homóloga de S. mobaraensis. La estructura cristalina del zimógeno de la TGM de S. mobaraensis (Yang, et al. 2011, J Bio Chem 286(9): 7301-7307) muestra que la hendidura activa está completamente ocupada por el propéptido en la conformación L. El bolsillo de unión de la KalbTG se puede alinear con el propéptido de la TGM de S. mobaraensis sin impedimento estérico, lo que indica que puede estar presente un mecanismo zimogénico similar en la KalbTG (FIG. 7B). Sorprendentemente, uno de los bucles que forman la hendidura activa cerca de Cys82 presenta la secuencia de aminoácidos YRYRAR (SEQ ID NO: 4), que es, excepto por la cadena lateral de glutamina, idéntica al sustrato preferente de la KalbTG descubierto en la matriz de péptidos (es decir, los dos mejores péptidos pentaméricos fueron YRYRQ (SEQ ID NO: 1) y RYRQR (SEQ ID NO: 14); FIG. 7C). En consecuencia, el análisis de la estructura cristalina sirvió como confirmación independiente de la fiabilidad de las matrices de péptidos con respecto a la identificación de secuencias de sustrato.

Para la cristalización y la caracterización estructural de la KalbTG, se cristalizó la KalbTG en PBS a 22 °C usando el procedimiento de difusión de vapor de gota sedente (200 nl) mezclando 1:18 mg/ml de proteína con un depósito no tamponado que consistía en tartrato de amonio 0,2 M, PEG3350 al 20 %. Los cristales se crioprotegieron en una solución de depósito que contenía etilenglicol al 20 % antes del enfriamiento rápido en nitrógeno líquido. Los datos se recopilaron a 100 K en la línea de haz SLS PX-II usando un detector Pilatus 6M y se integraron y cambiaron de escala en el grupo espacial P3 con XDS (PMID20124692). Las reflexiones 1 = 3n presentan I/a d >9, lo que hace poco probable la presencia de un eje helicoidal. Los análisis de Self-Patterson y de similitud no revelaron datos patológicos sospechosos. El volumen de celda es consecuente con dos o tres moléculas de KalbTG en la unidad asimétrica con parámetros de Matthews de 3,5 A3/Da y 2,3 A3/Da, respectivamente. La estadística de la colección de datos se resume en la tabla 5.

La estructura de la KalbTG (226 residuos) se determinó mediante reemplazo molecular usando la transglutaminasa de S. mobaraensis (354 residuos, RCSB Protein Data Band (PDB) ID n.° 3iu0) como modelo de búsqueda. Los primeros intentos usando la TG completa de S. mobaraensis fueron en general infructuosos ya que, sin estar limitados por la teoría, las enzimas presentan tamaños muy diferentes. Las dos transglutaminasas comparten un 28,2 % de identidad de secuencia y un 38,9 % de similitud de secuencia en toda la longitud de la KalbTG. Una variante de la TG de S. mobaraensis desprovista de regiones de bucle y truncada hasta el núcleo hidrófobo dio como resultado una solución potencial con el programa informático cristalográfico Phaser (McCoy et al., 2007. J Appl Crystallogr. 1 de agosto; 40(Pt 4): 658-674) cuando se buscan dos moléculas en la unidad asimétrica en el grupo espacial P3 con un aumento de probabilidad logarítmica (LLG) de 213. Los grupos espaciales trigonales P31 y P32 no proporcionaron soluciones, lo que concuerda con las altas intensidades de las reflexiones 1 = 3n. El modelo se refinó con el programa informático cristalográfico BUSTER (Blanc et al., 2004. Acta Cryst. D60, 2210­ 2221) a un Rlibre de un 46 %. Algunos elementos de la estructura secundaria eran visibles en los mapas de densidad electrónica y se incluyeron en el modelo, que a continuación se sometió a diez ciclos de construcción y refinamiento automáticos del modelo en CBUCCANEER y REFMAC5 (Winn et al., 2011. Acta Cryst. D67, 235-242). El modelo resultante contenía todos los residuos de la proteína y tenía un Rlibre de un 30 %. La estructura se completó en COOT (Emsley et al., 2010. Acta Cryst. D66, 486-501) y se refinó con PHENIX (Adams et al., 2010. Acta Cryst. D66, 213-221). La estadística de refinamiento del modelo se recopila en la tabla 5.

Tabla 5:

Estadística de datos

Longitud de onda (A) 1,0

Intervalo de resolución (A) 38,69 - 1,98 (2,051 - 1,98)

Grupo espacial P 3

Celda unitaria (A, °) A = 106,9 c = 56,1

Reflexiones totales 244642 (23235)

Reflexiones únicas 49846 (4993)

Multiplicidad 4,9 (4,7)

Completitud (%) 1,00 (1,00)

Media \/o (I) 7,41 (1,10)

Factor B de Wilson (A2) 29,12

R comb 0,1793 (1,484)

R med 0.2013 (1.679)

CC1/2 0.993 (0.327)

CC* 0,998 (0,702)

<I2>/<I>2 2,0

<|E2-1|> 0,731

Refinamiento del modelo

Reflexiones usadas en el refinamiento 49846 (4984)

Reflexiones usadas para R libre 2419 (318)

R trabajo 0,1827 (0,3131)

R libre 0,2296 (0,3498)

CC(trabajo) 0,967 (0,612)

CC(libre) 0,941 (0,575)

Número de átomos distintos de hidrógeno 4262

Macromoléculas 3765

Ligandos 75

Residuos proteicos 450

RMS (enlaces) (A) 0,007

RMS (ángulos) (°) 1,08

Ramachandran favorecido (%) 99

Ramachandran permitido (%) 1,3

Valores atípicos de Ramachandran (%) 0

Valores atípicos de rotámeros (%) 0,5

Clashscore 2,94

Factor B promedio (A2) 33,35

Macromoléculas 32,42

Ligandos 51,75

Disolvente 38,41

Con referencia a la tabla 5, la estadística para la envolvente de mayor resolución se muestra entre paréntesis.

Se realizaron mediciones de calorimetría de barrido dinámico (DSC) en el intervalo de temperatura de 20 °C a 90 °C en un instrumento de DSC VP-Capillary (MicroCal/GE Healthcare) y a una velocidad de barrido de 90 °C Ir 1, usando PBS como referencia.

Ejemplo 6: Análisis de las características de los sustratos peptídicos identificados para la KalbTG

Con referencia a las tablas 6 y 7, el análisis de los sustratos peptídicos para la KalbTG identificados en el presente documento reveló un conjunto de características compartidas por esos sustratos.

Tabla 6:

Tabla 7:

SEQ ID NO: posición de aminoácidos recuento de aminoácidos

1 2 3 4 Y R s K+Y+R+S (SEQ ID NO:2 Y E S 1 1 1 4 (SEQ ID NO:2 Y S K 2 1 1 5 (SEQ ID NO:2 Y R T 1 1 0 3 (SEQ ID NO:2 Y R S 1 2 1 5 (SEQ ID NO:2 Y G K 1 1 1 4 (SEQ ID NO:2 K G R 1 1 0 3 (SEQ ID NO:3 R S K 0 1 1 3 (SEQ ID NO:4 Y R F 1 1 0 3 (SEQ ID NO:4 Q K W 1 0 0 3 (SEQ ID NO:4 K Y K 3 0 0 5 (SEQ ID NO:4 W K F 0 1 0 3 (SEQ ID NO:4 F Y S 1 1 1 4 (SEQ ID NO:5

K Y A

2 0 0 4

Pasando en primer lugar a la tabla 6, se enumeran veintidós secuencias peptídicas pentaméricas identificadas como sustratos donantes de acilo para la KalbTG usando el código de aminoácidos de una letra junto con información que incluye la posición de los aminoácidos (numerados desde el extremo N al extremo C) y los recuentos de aminoácidos tanto para los aminoácidos individuales (R y Q) como para los grupos de aminoácidos (R+Q, F+W+Y y R+Q+F+W+Y). En un aspecto, los datos para la KalbTG revelaron que un sustrato donante de acilo que incluye una secuencia de aminoácidos pentamérica que tiene la fórmula Xaa¹-Xaa²-Xaa³-Xaa⁴-Xaa⁵ , donde Xaa es cualquier aminoácido, cumplió en general con varias reglas de diseño. En primer lugar, cada secuencia pentamérica incluía al menos una glutamina (Q). Más en particular, al menos una de las posiciones tercera, cuarta y quinta de la secuencia pentamérica (es decir, Xaa3, Xaa4 y Xaa5) era una glutamina. En particular, no se observaron en general secuencias que tuvieran dos o más glutaminas contiguas. Sin embargo, se observaron varias secuencias que incluían una glutamina en cada una de las posiciones tercera y quinta. En otro aspecto, se hizo la observación de que cada secuencia pentamérica incluía al menos una arginina (R). Más en particular, al menos una de las posiciones cuarta y quinta de la secuencia pentamérica (es decir, Xaa4 y Xaa5) era una arginina. Por ejemplo, para cada una de las veintidós secuencias analizadas, se encontró una arginina en una de las posiciones cuarta o quinta (pero no en ambas). Además, se hizo la observación de que, cuando la quinta posición era una arginina, se localizaba al menos una arginina adicional en una de las posiciones primera, segunda y tercera de la secuencia pentamérica (es decir, Xaa¹, Xaa² y Xaa3).

Aún en otro aspecto, las secuencias pentaméricas incluían cada una al menos una arginina secuencialmente contigua a una glutamina. Por ejemplo, la secuencia pentamérica FRQRC (SEQ ID NO: 8) incluye una glutamina en la tercera posición que está flanqueada por argininas localizadas tanto en la segunda como en la cuarta posición, mientras que la secuencia pentamérica YRYRQ (SEQ ID NO: 1) incluye una arginina en la cuarta posición seguida secuencialmente por una glutamina en la quinta posición. Además de la presencia de al menos una arginina y al menos una glutamina en cada una de las secuencias pentaméricas, se descubrió la presencia de un aminoácido que tenía una cadena lateral aromática (es decir, fenilalanina, triptófano y tirosina) en muchas de las secuencias pentaméricas. En particular, se hizo la observación de que el número total de posiciones ocupadas por una arginina, glutamina, fenilalanina, triptófano o tirosina en cada una de las secuencias pentaméricas fue de al menos cuatro (véase la última columna en la tabla 6: Recuento de aminoácidos para R+Q+F+W+Y). Por ejemplo, la secuencia pentamérica FRQRG (SEQ ID NO: 8) incluye una glutamina, dos argininas y una fenilalanina para un total de cuatro posiciones ocupadas por un aminoácido seleccionado de arginina, glutamina, fenilalanina, triptófano y tirosina. En otro ejemplo, la secuencia pentamérica YRYRQ (SEQ ID NO: 1) incluye dos argininas, dos fenilalaninas y una glutamina para un total de cinco posiciones ocupadas por un aminoácido seleccionado de arginina, glutamina, fenilalanina, triptófano y tirosina. En particular, las secuencias pentaméricas que carecen de un aminoácido aromático incluyen al menos cuatro aminoácidos totales seleccionados de arginina y glutamina (por ejemplo, QRQRQ (SEQ ID NO: 19), QRQTR (SEQ ID NO: 36)).

Con referencia a la tabla 7, se enumeran veintidós secuencias peptídicas pentaméricas identificadas como sustratos donantes de amina para la KalbTG usando el código de aminoácidos de una letra junto con información que incluye la posición de los aminoácidos (numerados desde el extremo N al extremo C) y los recuentos de aminoácidos tanto para los aminoácidos individuales (K, Y, R, S) como para un grupo de aminoácidos (K+Y+R+S). De forma similar a los datos obtenidos para las secuencias donantes de acilo en la tabla 6, un sustrato donante de acilo para la KalbTG que incluye una secuencia de aminoácidos pentamérica que tiene la fórmula Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5, donde Xaa es cualquier aminoácido, cumplió en general con varias reglas de diseño. En primer lugar, cada secuencia pentamérica incluía al menos una lisina (K). Más en particular, al menos una de las posiciones cuarta y quinta de cada secuencia pentamérica era una Usina, siendo la única excepción la secuencia pentamérica YKGRG (SEQ ID NO: 29). En particular, no se observaron en general secuencias que tuvieran dos o más Usinas contiguas. Aunque se observaron varias secuencias pentaméricas que incluían dos Usinas en total, no se encontraron entre las secuencias pentaméricas analizadas secuencias pentaméricas que tuvieran más de dos lisinas. En otro aspecto, se hizo la observación de que la mayoría de las secuencias pentaméricas incluían al menos una tirosina (Y), siendo las únicas dos excepciones de las veintidós secuencias mostradas en la tabla 7 RWKFK (SEQ ID NO: 48) y ARSKL (SEQ ID NO: 30).

Después de los aminoácidos lisina y tirosina, los siguientes aminoácidos que aparecían con mayor frecuencia en las secuencias pentaméricas de la tabla 7 fueron arginina y serina, con al menos una arginina o serina presente en muchas de las secuencias pentaméricas. En particular, se hizo la observación de que el número total de posiciones ocupadas por una lisina, tirosina, arginina o serina en cada una de las secuencias pentaméricas fue de al menos tres (véase la última columna en la tabla 7: Recuento de aminoácidos para K+Y+R+S). Por ejemplo, la secuencia pentamérica NYRFK (SEQ ID NO: 45) incluye una tirosina, una arginina y una lisina para un total de tres posiciones ocupadas por un aminoácido seleccionado de lisina, tirosina, arginina y serina. En otro ejemplo, la secuencia pentamérica RYRSK (SEQ ID NO: 27) incluye dos argininas, una tirosina, una serina y una lisina para un total de cinco posiciones ocupadas por un aminoácido seleccionado de lisina, tirosina, arginina y serina.

En particular, todas las secuencias pentaméricas incluían en total al menos dos aminoácidos seleccionados de lisina, tirosina y arginina o serina. Por ejemplo, ARSKL (SEQ ID NO: 30) incluye una lisina, una arginina, una serina y ninguna tirosina. En consecuencia, el número total de aminoácidos seleccionados de lisina, tirosina y arginina es dos, y el número total de aminoácidos seleccionados de lisina, tirosina y serina también es dos. Por supuesto, el número total de posiciones ocupadas por una lisina, tirosina, arginina o serina en las secuencias pentaméricas ARSKL (SEQ ID NO: 30) es al menos tres, como se analiza anteriormente. En un aspecto relacionado, las secuencias pentaméricas que tienen tanto una lisina como al menos uno de los aminoácidos tirosina y arginina incluyen en total al menos dos aminoácidos seleccionados de lisina, tirosina y arginina (por ejemplo, ARSKL (SEQ ID NO: 30), FYFSK (SEQ ID NO: 59)). Además, cada una de las secuencias pentaméricas incluía al menos una tirosina o arginina en una de las posiciones uno y dos (es decir, Xaai y Xaa²).

Los diagramas de flujo esquemáticos que se muestran en las figuras se establecen en general como diagramas de flujo lógico. Como tales, el orden y las etapas marcadas representados son indicativos de un modo de realización del procedimiento presentado. Se pueden concebir otras etapas y procedimientos que sean equivalentes en su función, lógica o efecto a una o más etapas, o a partes de las mismas, del procedimiento ilustrado. Adicionalmente, el formato y los símbolos empleados en las figuras se proporcionan para exponer las etapas lógicas del procedimiento y se entiende que no limitan el alcance del procedimiento. Aunque se pueden emplear diversos tipos de flechas y tipos de líneas, se entiende que no limitan el alcance del procedimiento correspondiente. De hecho, se pueden usar algunas flechas u otros conectores para indicar solo el flujo lógico del procedimiento. Por ejemplo, una flecha puede indicar un período de espera o monitorización de duración no especificada entre las etapas enumeradas del procedimiento descrito. Adicionalmente, el orden en el que se produce un procedimiento particular puede o no adherirse estrictamente al orden de las etapas correspondientes mostradas.

La presente invención se presenta en varios modos de realización diferentes en la siguiente descripción con referencia a las figuras, en las que números iguales representan elementos iguales o similares. La referencia a lo largo de esta memoria descriptiva a "un modo de realización" o una terminología similar significa que un rasgo característico, estructura o característica particular descrito en relación con el modo de realización se incluye en al menos un modo de realización de la presente invención. Por tanto, las apariciones de la frase "en un modo de realización" y una terminología similar a lo largo de esta memoria descriptiva pueden, pero no necesariamente, hacer referencia al mismo modo de realización.

Los rasgos característicos, estructuras o características descritos de la invención se pueden combinar de cualquier manera adecuada en uno o más modos de realización. En la siguiente descripción se enumeran numerosos detalles específicos con el fin de proporcionar una comprensión completa de los modos de realización del sistema. Un experto en la técnica relevante reconocerá, sin embargo, que el sistema y procedimiento se pueden practicar sin uno o más de los detalles específicos, o con otros procedimientos, componentes, materiales, etc. En otros casos, las estructuras, materiales u operaciones bien conocidos no se muestran o describen en detalle para evitar empañar aspectos de la invención. En consecuencia, la descripción anterior pretende ser ejemplar y no limita el alcance de los presentes conceptos según la invención.

Claims (26)

REIVINDICACIONES

1. Una composición de reactantes y productos de una reacción enzimática para formar un enlace isopeptídico, comprendiendo la composición una transglutaminasa microbiana que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la transglutaminasa microbiana de Kutzneria albida (SEQ ID NO: 6), un primer sustrato que comprende una marca donante de acilo que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la secuencia peptídica YRYRQ (SEQ ID NO: 1) y un segundo sustrato que comprende una marca donante de amina que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la secuencia peptídica RYF.SK (SEQ ID NO: 2), en la que el primer y el segundo sustrato se identifican a partir de una colección de sustratos y en la que la actividad de la transglutaminasa microbiana sobre los sustratos de la colección se puede medir usando un ensayo directo o acoplado.

2. La composición de la reivindicación 1, en la que al menos uno del primer sustrato y el segundo sustrato incluye un marcador detectable.

3. La composición de la reivindicación 2, en la que el marcador detectable se selecciona de un resto de biotina, un tinte fluorescente, un marcador de rutenio, un marcador radiactivo y un marcador quimioluminiscente.

4. La composición de la reivindicación 1, incluyendo el sustrato una marca donante de acilo que tiene la secuencia peptídica APRYRQRAA (SEQ ID NO: 24).

5. Un procedimiento de formación de un enlace isopeptídico en presencia de una transglutaminasa microbiana, comprendiendo el procedimiento:

exponer una transglutaminasa microbiana a un primer sustrato y un segundo sustrato,

teniendo la transglutaminasa microbiana al menos un 80 % de identidad de secuencia con la transglutaminasa microbiana de Kutzneria albida (SEQ ID NO: 6),

incluyendo el primer sustrato una marca donante de acilo que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la secuencia peptídica YRYRQ (SEQ ID NO: 1) e incluyendo el segundo sustrato una marca donante de amina que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la secuencia peptídica RYF.SK (SEQ ID NO: 2), y

reticular el primer sustrato y el segundo sustrato, formando de este modo un enlace isopeptídico entre la marca donante de acilo y la marca donante de amino.

6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que la etapa de reticular el primer sustrato y el segundo sustrato forma un enlace isopeptídico entre un grupo gamma-carboxamida de la marca donante de acilo y un grupo épsilon-amino de la marca donante de amino.

7. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que al menos uno del primer sustrato y el segundo sustrato incluye un marcador detectable.

8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que el marcador detectable se selecciona de un resto de biotina, un tinte fluorescente, un marcador de rutenio, un marcador radiactivo y un marcador quimioluminiscente.

9. El procedimiento de la reivindicación 5, incluyendo el sustrato la marca donante de acilo que tiene la secuencia peptídica APRYRQRAA (SEQ ID NO: 24).

10. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que la reticulación del primer sustrato con el segundo sustrato se logra con un rendimiento de al menos aproximadamente un 70 %.

11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que el rendimiento se logra dentro de aproximadamente 30 minutos.

12. Un kit para formar un enlace isopeptídico en presencia de una transglutaminasa microbiana, comprendiendo el kit una transglutaminasa microbiana purificada que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la transglutaminasa microbiana de Kutzneria albida (SEQ ID NO: 6).

13. El kit de la reivindicación 12, que comprende además uno de un primer sustrato que incluye una marca donante de acilo que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la secuencia peptídica YRYRQ (SEQ ID NO: 1) y un segundo sustrato que incluye una marca donante de amina que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la secuencia peptídica RYF.SK (SEQ ID NO: 2).

14. El kit de la reivindicación 13, en el que al menos uno del primer sustrato y el segundo sustrato incluye un marcador detectable.

15. El kit de la reivindicación 14, en el que el marcador detectable se selecciona de un resto de biotina, un tinte fluorescente, un marcador de rutenio, un marcador radiactivo y un marcador quimioluminiscente.

16. El kit de la reivindicación 13, incluyendo el primer sustrato la marca donante de acilo que tiene la secuencia peptídica APRYRQRAA (SEQ ID NO: 24).

17. El kit de la reivindicación 13, que comprende además el otro del primer sustrato y el segundo sustrato.

18. Una enzima expresada de forma recombinante para formar un enlace isopeptídico, que comprende una transglutaminasa microbiana aislada que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la transglutaminasa microbiana de Kutzneria albida (SEQ ID NO: 6).

19. La enzima de la reivindicación 18, en la que la transglutaminasa microbiana aislada se expresa y aísla en presencia de amonio.

20. La enzima de la reivindicación 19, en la que el amonio está presente en una concentración de al menos aproximadamente 10 pM.

21. Uso de una marca como sustrato donante de acilo para una transglutaminasa microbiana de Kutzneria albida de SEQ ID NO: 6,

en el que la marca está unida a una estructura seleccionada del grupo que consiste en una proteína, un péptido, un marcador detectable, un oligonucleótido y un polímero que no es de aminoácidos o ácido nucleico, en el que la marca es accesible para la transglutaminasa microbiana y comprende una secuencia de aminoácidos que tiene la fórmula Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5,

en la que Xaa es cualquier aminoácido, en la que al menos uno de Xaa3, Xaa4 y Xaas es glutamina, en la que uno de Xaa4 y Xaas es arginina, en la que la secuencia de aminoácidos incluye al menos una arginina secuencialmente contigua a una glutamina y en la que el número total de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos seleccionados de arginina, glutamina, fenilalanina, triptófano y tirosina es al menos cuatro.

22. El uso de acuerdo con la reivindicación 21, en el que Xaas y al menos uno de Xaa¹, Xaa² y Xaa3 es arginina.

23. Uso de una marca como sustrato donante de amina para una transglutaminasa microbiana de Kutzneria albida de SEQ ID NO: 6,

en el que la marca está unida a una estructura seleccionada del grupo que consiste en una proteína, un péptido, un marcador detectable, un oligonucleótido y un polímero que no es de aminoácidos o ácido nucleico, en el que la marca es accesible para la transglutaminasa microbiana y comprende una secuencia de aminoácidos que tiene la fórmula Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5,

en la que Xaa es cualquier aminoácido, en la que la secuencia de aminoácidos incluye al menos una lisina, en la que uno de Xaa¹ y Xaa² se selecciona de tirosina y arginina y en la que el número total de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos seleccionados de arginina, serina, tirosina y lisina es al menos tres.

24. El uso de acuerdo con la reivindicación 23, en el que uno de Xaa4 y Xaa5 es lisina.

25. El uso de acuerdo con la reivindicación 23, en el que la secuencia de aminoácidos incluye no más de dos del aminoácido lisina.

26. Una estructura seleccionada del grupo que consiste en una proteína, un péptido, un marcador detectable, un oligonucleótido y un polímero que no es de aminoácidos o ácido nucleico,

estando la estructura unida a una marca de sustrato que es accesible para una transglutaminasa microbiana que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la transglutaminasa microbiana de Kutzneria albida de SEQ ID NO: 6,

comprendiendo la marca de sustrato una marca donante de acilo que tiene la secuencia peptídica APRYRQRAA (SEQ ID NO: 24) y una marca donante de amina que tiene al menos un 80 % de identidad de secuencia con la secuencia peptídica RYF.SK (SEQ ID NO: 2),

en la que el marcador detectable se selecciona de un resto de biotina, un tinte fluorescente, un marcador de rutenio, un marcador radiactivo y un marcador quimioluminiscente.