ES2871861T3

ES2871861T3 - Sistema de amplificación por reacción en cadena de la polimerasa mediada por luz y de detección de productos y métodos de uso

Info

Publication number: ES2871861T3
Application number: ES17712360T
Authority: ES
Inventors: Ronald L Biro; Beau Hunt
Original assignee: Pioneer Hi Bred International Inc
Current assignee: Pioneer Hi Bred International Inc
Priority date: 2016-03-10
Filing date: 2017-03-08
Publication date: 2021-11-02
Anticipated expiration: 2037-03-08
Also published as: SG11201805166PA; US11369965B2; WO2017156126A1; BR112018068139A2; EP3426399A1; MX2018010108A; CN108778511A; BR112018068139B1; CA3009080A1; US20180361379A1; EP3426399B1; CA3009080C

Abstract

Un sistema de amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y de detección de productos, que comprende: a) un subsistema de ensamblaje que comprende: i) una pluralidad de recipientes (101, 404); ii) uno o más miembros de distribución de líquidos (801, 802, 803, 804) configurados para ensamblar un conjunto de matrices acuosas de aceite, comprendiendo cada matriz acuosa de aceite: 1) una mezcla de reacción acuosa (104) que comprende un volumen de muestra polinucleotídica y reactivos, comprendiendo los reactivos un primer agente con capacidad de excitación por una luz de extracción de fluorescencia que tiene una longitud de onda espectral cuando el primer reactivo hibrida con la muestra polinucleotídica; y 2) uno o dos aceites inmiscibles seleccionados del grupo que consiste en un aceite de encapsulación (103), un aceite transportador (102) y tanto un aceite de encapsulación (103) como un aceite transportador (102); donde los componentes de la mezcla de reacción acuosa (104) no se mezclan con el uno o los dos aceites inmiscibles; donde cada matriz acuosa de aceite está configurada para distribuirse mediante el uno o más miembros de distribución de líquidos en un recipiente para la amplificación por PCR y la detección de productos de la pluralidad de recipientes (101, 404); b) una pluralidad de posiciones de calentamiento, posiciones de control de la temperatura y posiciones de detección de productos de PCR que definen una pluralidad de primeros puestos de recipientes y segundos puestos de recipientes alternos, donde la pluralidad de recipientes (101, 404) se pueden estacionar, y donde: cada uno de los primeros puestos de recipientes comprende una de las posiciones de calentamiento y una de las posiciones de control de la temperatura, y cada uno de los segundos puestos de recipientes comprende una de las posiciones de detección de productos de PCR, o cada uno de los primeros puestos de recipientes comprende una de las posiciones de calentamiento, y cada uno de los segundos puestos de recipientes comprende una de las posiciones de detección de productos de PCR y una de las posiciones de control de la temperatura; c) un subsistema de calentamiento fotónico accionado por luz, de reacción en reacción, que comprende una pluralidad de fuentes de radiación electromagnética (201, 309, 501, 602), donde, cuando la pluralidad de vasos están en las posiciones de calentamiento, cada recipiente está en comunicación óptica con una fuente de radiación electromagnética (201, 309, 501, 602) de la pluralidad de fuentes de radiación electromagnética, y la fuente de radiación electromagnética (201, 309, 501, 602) emite radiación electromagnética a ese recipiente; d) un subsistema de control de la temperatura, de reacción en reacción, que comprende una pluralidad de dispositivos de detección térmica (202, 307, 502, 704), donde, cuando la pluralidad de vasos están en las posiciones de control de la temperatura, cada recipiente corresponde a un dispositivo de detección térmica de la pluralidad de dispositivos de detección térmica (202, 307, 502, 704) y el dispositivo de detección térmica (202, 307, 502, 704) está configurado para proporcionar una señal de medición que depende de la temperatura de la matriz acuosa de aceite contenida en el recipiente; e) un subsistema de retroalimentación de la temperatura del microcontrolador y de control de la fuente de luz conectado de forma comunicativa tanto al subsistema de calentamiento fotónico como al subsistema de control de la temperatura, donde el subsistema de retroalimentación de la temperatura del microcontrolador y de control de la fuente de luz está configurado para regular una entrada de energía requerida para controlar una salida y una duración de una energía electromagnética emitida por cada fuente de radiación electromagnética a través de un ciclo de temperaturas de la reacción; f) un subsistema de detección de fluorescencia que comprende: i) una o más fuentes de luz de excitación de fluorescencia (705, 707); ii) uno o más dispositivos de detección de luz de emisión de fluorescencia (706, 710); iii) una pluralidad de primeros miembros ópticos (715, 716) en comunicación óptica con la una o más fuentes de luz de excitación de fluorescencia (705, 707), donde, cuando los recipientes están en las posiciones de detección de productos de PCR, cada primer miembro óptico (715, 716) está configurado para proporcionar una trayectoria óptica para la luz de excitación de fluorescencia que tiene la primera longitud de onda espectral desde la una o más fuentes de luz de excitación de fluorescencia hasta uno de dichos recipientes que contienen la matriz acuosa de aceite, y donde cada primer miembro óptico (715, 716) está configurado además para proporcionar una trayectoria óptica para la luz de emisión de fluorescencia desde la mezcla de reacción acuosa hasta el uno o más dispositivos de detección de luz de emisión de fluorescencia (706, 710); y iv) un mecanismo de refrigeración activa o pasiva (403) en las posiciones de detección de productos de PCR por el que cada uno de los recipientes en la posición de detección de productos de PCR se refrigera; g) un dispositivo de colocación; y h) un sistema de control mecánico y electrónico conectado de forma comunicativa al dispositivo de colocación y al subsistema de ensamblaje, donde el sistema de control mecánico y electrónico está configurado para causar que el subsistema de ensamblaje ensamble las matrices acuosas de aceite en la pluralidad de recipientes, y donde el sistema de control mecánico y electrónico está configurado además para causar que el dispositivo de colocación mueva la pluralidad de recipientes con la matriz acuosa de aceite desde el subsistema de ensamblaje hasta cada una de las posiciones de calentamiento, posiciones de control de la temperatura y posiciones de detección de productos de PCR.

Description

DESCRIPCIÓN

Sistema de amplificación por reacción en cadena de la polimerasa mediada por luz y de detección de productos y métodos de uso

Campo

Esta divulgación se refiere a un sistema de alto rendimiento de amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) mediada por luz y de detección de productos y a métodos de uso de los mismos. El sistema permite el calentamiento fotónico rápido y uniforme, de reacción en reacción, de una matriz acuosa de aceite y combina el control de la temperatura y la detección de productos de PCR en un sistema integrado de alto rendimiento.

Antecedentes

La amplificación del ADN por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica fundamental para biología molecular. El análisis de ácidos nucleicos por PCR requiere la preparación de las muestras, su amplificación y el análisis de productos. Aunque estas etapas habitualmente se realizan secuencialmente, la amplificación y el análisis pueden producirse simultáneamente. Pueden añadirse tintes de ADN o sondas fluorescentes a la mezcla de PCR antes de la amplificación y usarse para analizar los productos de PCR durante la amplificación. El análisis de muestras se produce simultáneamente con la amplificación en el mismo tubo dentro del mismo instrumento. Esta estrategia combinada disminuye la manipulación de las muestras, ahorra tiempo y reduce enormemente el riesgo de contaminación de los productos para las posteriores reacciones, ya que no hay necesidad de retirar las muestras de sus recipientes cerrados para análisis adicional. El concepto de combinar la amplificación con el análisis de productos se ha llegado a conocer como PCR "en tiempo real". Véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos n.° 6174670.

Simultáneamente, el procesamiento de las muestras polinucleotídicas en ensayos de PCR de alto rendimiento tiene varios inconvenientes clave. Estos incluyen el tamaño de volumen que provoca altos costes de reactivo, altos costes de consumibles y protocolos muy laboriosos y procesos que son muy susceptibles a contaminación. Algunos de estos problemas pueden resolverse encapsulando una gota acuosa, que contiene los reactivos de reacción de PCR, la muestra polinucleotídica, los cebadores y las sondas, en uno o más aceites inmiscibles. La generación de estas matrices acuosas de aceite disminuye el tamaño de volumen y el riesgo de contaminación. La formación de matrices acuosas de aceite se ha descrito en la bibliografía de patentes, por ejemplo, en la patente de Estados Unidos n.° 8465707.

Los sistemas disponibles que emplean zonas de temperatura constante para someter las matrices acuosas de aceite a termociclado de PCR han mostrado problemas significativos a la hora de proporcionar temperaturas de calentamiento uniforme y puede verse afectados por una lenta transferencia de calor desde una fuente de calentamiento relativamente remota hasta las muestras. Otros sistemas que usan corrientes fluidas de aceite transportador para transportar las matrices acuosas de aceite a través del sistema muestran problemas significativos con el control del caudal y la profundidad del aceite transportador. Otros métodos usan chips de PCR en miniatura de alto rendimiento que incorporan un calentador y/o un detector de temperatura dentro del sustrato. Sin embargo, esta técnica requiere un diseño y fabricación complejos de los chips.

Por tanto, sigue habiendo una necesidad de sistemas y métodos para amplificar por PCR muestras que sean de alto rendimiento, reduzcan los costes, proporcionen mayor flexibilidad de análisis, reduzcan el tiempo de recuperación y mejoren la calidad de los datos.

Los documentos EP 1541237, EP1964610, US7081226 y WO 96/41864 divulgan antecedentes técnicos: el documento EP 1541237 se refiere a un sistema de PCR múltiple que comprende uno o más módulos de PCR, y un ordenador central que controla los módulos de PCR, donde cada módulo de PCR comprende un calentador conectado eléctricamente a un detector de la temperatura, un tubo de PCR conectado térmicamente con el calentador y que comprende una cámara de PCR que contiene una solución de PCR, y una unidad de detección que detecta una señal del producto de PCR. El documento EP 19646610 se refiere a un amplificador de ácido nucleico para realizar una reacción de amplificación de ácidos nucleicos, comprendiendo el amplificador una pluralidad de pocillos; una unidad de calentamiento; un medio óptico que puede irradiar luz de excitación de una longitud de onda especificada a todos los pocillos; y una unidad de detección de fluorescencia. El documento WO 96/41864 se refiere a un microinstrumento de PCR para el calentamiento rápido y uniforme y la detección en tiempo real, comprendiendo el instrumento, como fuente de calentamiento, medios tales como una fuente de ultravioleta o una fuente de infrarrojos.

Breve sumario

Un aspecto de la divulgación plasma un sistema de amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y de detección de productos de acuerdo con la reivindicación 1.

En otro aspecto, en este documento se proporciona un método para la amplificación por PCR mediada por luz y la detección de productos de acuerdo con la reivindicación 15.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 representa una vista en sección transversal de una realización de una matriz acuosa de aceite de dos aceites. La figura 2 representa una vista en sección transversal que ilustra una configuración ejemplar donde la fuente de radiación electromagnética y al menos un detector están ubicados en la misma posición en la parte superior de un recipiente. La figura 3 representa una vista en sección transversal que ilustra una configuración ejemplar donde la fuente de radiación electromagnética y al menos un detector están ubicados en la misma posición, donde la fuente de radiación electromagnética está ubicada en el fondo de un recipiente y al menos un detector está ubicado en la parte superior del recipiente.

La figura 4A representa una vista lateral de un dispositivo de cinta ejemplar.

La figura 4B representa una vista superior de un dispositivo de cinta ejemplar.

La figura 5 representa una vista en sección transversal de una realización ejemplar que ilustra una configuración, donde la fuente de radiación electromagnética y al menos un detector están en diferentes ubicaciones.

La figura 6A representa una vista frontal de un subsistema de calentamiento fotónico ejemplar.

La figura 6B representa una vista lateral de un subsistema de calentamiento fotónico ejemplar.

La figura 6C representa una vista superior de un subsistema de calentamiento fotónico ejemplar.

La figura 7 representa una vista lateral de una realización de un subsistema de calentamiento fotónico y una cinta transportadora.

La figura 8 representa una vista lateral de una realización del sistema de amplificación por PCR y de detección de productos. La figura 9 representa una vista lateral de una realización del sistema de amplificación por PCR y de detección de productos. La figura 10 representa una vista lateral de una realización del sistema de amplificación por PCR y de detección de productos.

La figura 11 representa un diagrama de bloques del sistema de control mecánico, electrónico e informático.

La figura 12 muestra la energía de salida y la temperatura registrada de una matriz acuosa de aceite calentada por luz. El gráfico superior muestra la temperatura a lo largo del tiempo. El eje de ordenadas representa grados Celsius, y el eje de abscisas representa el tiempo en segundos. El gráfico inferior muestra la energía de LED a lo largo del tiempo. El eje de ordenadas representa la energía de LED en modulación de la anchura de impulso (PWM) porcentual, y el eje de abscisas representa el tiempo en segundos. La PWM es una medida del porcentaje de tiempo por segundo que la energía está activada, que se produce por una serie de impulsos de energía durante el segundo. La frecuencia de impulsos puede ser ajustable, mientras que la longitud del impulso es ajustable dependiendo de la energía total necesaria por segundo. La figura 13 muestra los componentes de un pocillo en una realización de la invención.

La figura 14 muestra la estructura de una placa de múltiples pocillos y LED montados en superficie en una realización de la invención.

La figura 15 muestra un circuito electrónico para accionar los LED en una realización de la invención.

La figura 16 muestra un esquema para una placa de circuito impreso para el control independiente de 96 LED en una realización de la invención.

La figura 17 muestra la fluorescencia observada desde 16 pocilios de reacción después de 40 ciclos de PCR usando una realización de la invención.

Descripción detallada

Las divulgaciones de este documento se describirán de manera más completa a continuación con referencia a los dibujos adjuntos en los que se muestran algunas realizaciones posibles, pero no todas. De hecho, las divulgaciones pueden realizarse en muchas formas diferentes y no deben interpretarse como limitadas a las realizaciones expuestas en este documento; en su lugar, estas realizaciones se proporcionan de manera que esta divulgación satisfaga los requisitos legales aplicables.

Muchas modificaciones y otras realizaciones divulgadas en este documento se les ocurrirán a los expertos en la materia a la que pertenecen los dispositivos, sistemas y métodos divulgados, que tienen el beneficio de los contenidos presentados en las descripciones anteriores y los dibujos asociados. Por lo tanto, debe entenderse que las divulgaciones no tienen que limitarse a las realizaciones específicas divulgadas y que se pretende que las modificaciones y otras realizaciones estén incluidas dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. Aunque en este documento se emplean términos específicos, se usan en un sentido genérico y descriptivo únicamente y no con fines limitantes.

Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en la memoria descriptiva son indicativas del nivel de los expertos en la materia a la que pertenece esta invención.

También debe entenderse que la terminología usada en este documento es con el fin de describir aspectos particulares únicamente y no se pretende que sea limitante. Como se usa en la memoria descriptiva y en las reivindicaciones, la expresión "que comprende" debe interpretarse especificando la presencia de los elementos, números enteros, etapas o componentes indicados como mencionados, pero no excluye la presencia o adición de uno o más elementos, números enteros, etapas o componentes, o grupos de los mismos. Por tanto, por ejemplo, el volumen de la mezcla de reacción acuosa que comprende un par de cebadores de ácido nucleico puede tener dos o más pares de cebadores de ácido nucleico. Además, se pretende que la expresión "que comprende" incluya las realizaciones abarcadas por las expresiones "que consiste esencialmente en" y "que consiste en". Asimismo, se pretende que la expresión "que consiste esencialmente en" incluya las realizaciones abarcadas por la expresión "que consiste en".

Salvo que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que el normalmente entendido por un experto en la materia a la que pertenecen las composiciones y métodos divulgados. En esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones posteriores, se hará referencia a varios términos que se definirán en este documento.

El término "aproximadamente" se refiere a la variación en el valor numérico de una medición, por ejemplo, temperatura, longitud, anchura, altura, longitud de onda, etc., debido a las tasas de error típico del dispositivo usado para obtener esa medida. En una realización, el término "aproximadamente" significa en un 5 % del valor numérico presentado.

En este documento se proporcionan sistemas y métodos para la amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) mediada por luz y la detección de productos en que se aplica calentamiento directo y uniforme a un volumen de mezcla de reacción acuosa que comprende una muestra polinucleotídica y reactivos de PCR, cebadores y sondas. Preferiblemente, el volumen de mezcla de reacción acuosa se coloca dentro (es decir, se encapsula) un aceite inmiscible y, en algunas realizaciones, se coloca adicionalmente en una superficie libre de un segundo aceite inmiscible. En realizaciones particulares, el volumen de mezcla de reacción acuosa no se mezcla con los aceites inmiscibles, y la combinación del volumen de mezcla de reacción acuosa con un aceite inmiscible o dos aceites inmiscibles formará una disposición mencionada en este documento como una "matriz acuosa de aceite ensamblada" o "matriz acuosa de aceite" (véase la figura 1). La matriz acuosa de aceite posibilita un calentamiento eficaz de volúmenes muy pequeños de mezcla de reacción acuosa sin causar evaporación de agua. Los volúmenes de mezcla de reacción acuosa adecuados para su uso con los presentes métodos y sistemas pueden ser tan pequeños como de 10 gl o menos, y en algunos casos, puede usarse un volumen de mezcla de reacción acuosa tan pequeño como de 5 nl. Lo que es más, la adición de uno o dos aceites inmiscibles proporciona una barrera contra la contaminación que permite la reutilización de las placas de microvaloración y otros recipientes de depósito con poco riesgo de contaminación cruzada por polinucleótidos entre los experimentos.

En aspectos particulares, el calentamiento mediado por luz se aplica directamente al volumen de mezcla de reacción acuosa, la matriz acuosa de aceite o el recipiente que contiene la matriz acuosa de aceite, usando una pluralidad de fuentes de energía que emiten radiación electromagnética en un proceso a veces mencionado en este documento como "calentamiento fotónico". Las fuentes de energía adecuadas incluyen lámparas halógenas, láseres y otros dispositivos emisores de luz. En una realización particular, se aplica calentamiento uniforme directamente al volumen de mezcla de reacción acuosa usando una pluralidad de fuentes de energía que emiten luz infrarroja que tiene una longitud de onda espectral de aproximadamente 1300 nm a aproximadamente 2200 nm. La luz infrarroja sobre este intervalo de longitudes de onda se absorbe mucho por las moléculas de agua en el volumen de mezcla de reacción acuosa y causa que la temperatura del volumen de reacción de mezcla de reacción acuosa se eleve rápidamente. En otra realización, el calentamiento directo y uniforme se consigue usando conversión fototérmica plasmónica de luz en calor mediante acoplamiento de fotón-electrón-fotón (véase, Ho Son et al., 2015, Light: Science Appl. 4:e280). En dicha realización, luz ultravioleta o visible que tiene una longitud de onda espectral de aproximadamente 100 nm a aproximadamente 500 nm se aplica directamente a un metal excitable plasmónico, tal como una película delgada de oro que, a su vez, conduce calor hasta la matriz acuosa de aceite y/o el volumen de mezcla de reacción acuosa. Por tanto, los presentes sistemas y métodos permiten un calentamiento eficaz y uniforme de grandes cantidades de reacciones de PCR con volúmenes acuosos muy pequeños, conservando de ese modo la energía, el material biológico y los reactivos de PCR.

En este documento se proporciona un sistema parcial o completamente automatizado y controlado, y métodos para usar el mismo. En un aspecto particular, el sistema comprende múltiples subsistemas integrados que realizan una o más funciones para realizar la amplificación por PCR de muestras de ADN y la detección de los productos de PCR resultantes. En dichos aspectos, el sistema comprende un subsistema de ensamblaje para distribuir las matrices acuosas de aceite en recipientes o receptáculos adecuados para el procesamiento por PCR; un subsistema de calentamiento accionado por luz o fotónico, de reacción en reacción que comprende múltiples fuentes de luz configuradas para emitir radiación electromagnética a recipientes individuales; un subsistema de control de la temperatura, de reacción en reacción configurado para controlar la temperatura de la matriz acuosa de aceite y/o el volumen de mezcla de reacción acuosa en cada recipiente; un subsistema de retroalimentación de la temperatura (por ejemplo, mediante microcontrolador) que controla la salida de energía de cada fuente de calentamiento accionado por luz individual en respuesta a las lecturas de temperatura de cada recipiente individual; un subsistema de detección de fluorescencia configurado para detectar la emisión de luz de fluorescencia producida por los productos de PCR; y un sistema de control mecánico, eléctrico e informático configurado para controlar el sistema de ensamblaje y mover los recipientes que contienen las matrices acuosas de aceite a través de los diversos subsistemas y puestos de los recipientes del sistema mediante un dispositivo de colocación, tal como una cinta transportadora compuesta de hendiduras o pocillos que sirven como recipientes. El subsistema de retroalimentación de la temperatura y el sistema de control mecánico, eléctrico e informático a veces se menciona de forma conjunta en este documento como "sistema de control". En algunas realizaciones, el presente sistema puede incluir un sistema de tratamiento de información de laboratorio (LIMS) para rastrear los recipientes, los datos de muestra polinucleotídica, los datos de reactivos de PCR y para convertir los datos de fluorescencia en información genética.

Ensamblaje de las matrices acuosas de aceite

En determinados aspectos, el presente sistema incluye un subsistema de ensamblaje o puesto de tratamiento de líquidos para distribuir los volúmenes de mezcla de reacción acuosa y los aceites inmiscibles en los recipientes que se moverán desde el subsistema de ensamblaje hasta los subsistemas de calentamiento fotónico, de control de la temperatura y de detección de fluorescencia. En una realización, una muestra biológica que comprende ácidos nucleicos aislados (por ejemplo, ADN genómico, ADNc y ARNm) se analiza en el presentes sistema y métodos. En algunas realizaciones, la muestra comprende ADN genómico aislado extraído de, por ejemplo, tejido biológico, usando cualquier técnica de extracción adecuada conocida en la técnica y se mezcla con reactivos de PCR que incluyen una o más sondas de ácido nucleico diseñadas para hibridar específicamente con una secuencia de ADN diana. Por ejemplo, puede desearse determinar la presencia de un alelo polimórfico particular. En dichos aspectos, pueden usarse sondas específicas de alelo para detectar la presencia del alelo particular del polimorfismo, donde cada sonda específica de alelo hibrida específicamente con uno de los alelos polimórficos en condiciones rigurosas de hibridación. Típicamente, este método de detección puede comprender el aislamiento del ADN genómico, la amplificación del ADN genómico que abarca el locus polimórfico y la detección del alelo polimórfico amplificado. La PCR, la RT-PCR y la LCR son métodos habituales de amplificación y detección de amplificación para amplificar los ácidos nucleicos de interés. Los detalles respecto a estos usos de estos y otros métodos de amplificación son bien conocidos en la técnica y pueden encontrarse en una diversidad de textos convencionales y numerosas referencias, tales como Mullis et al. (1987) patente de Estados Unidos n.° 4683202; Arnheim y Levinson (1990) C&EN 36-47; Kwoh et al. (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86:1173; Guatelli et al. (1990) Proc Natl Acad Sci USA 87:1874; Lomell et al. (1989) J Clin Chem 35:1826; Landegren et al. (1988) Science 241:1077-1080; Van Brunt (1990) Biotechnology 8:291-294; Wu y Wallace (1989) Gene 4:560; Barringer et al. (1990) Gene 89:117; y Sooknanan y Malek (1995) Biotechnology 13:563-564.

En determinadas realizaciones, cada volumen de mezcla de reacción acuosa incluye una muestra polinucleotídica y una mezcla de reactivos de PCR. En dichas realizaciones, los reactivos de PCR incluirán una o más sondas de ácido nucleico y uno o más cebadores de ácido nucleico. En una realización preferida, la mezcla de reactivos de PCR incluye al menos dos sondas de ácido nucleico diferentes diseñadas que hibridan específicamente con diferentes alelos polimórficos, es decir, sondas diseñadas para hibridar específicamente con secuencias que contienen diferentes alelos. Además, las sondas de ácido nucleico específicas de alelo pueden conjugarse o unirse covalentemente a diferentes marcadores detectables que pueden distinguirse usando técnicas de detección disponibles en la técnica. Los marcadores detectables adecuados para su uso con sondas de ácido nucleico incluyen, por ejemplo, cualquier composición detectable por dispositivos de detección de luz de emisión de fluorescencia. Las estrategias de marcaje para marcar ácidos nucleicos y sus estrategias correspondientes de detección pueden encontrarse, por ejemplo, en Haugland (1996) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, sexta edición, de Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR); o Haugland (2001) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, octava edición, de Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR). En una realización preferida, se proporcionan reactivos (por ejemplo, sondas de ácido nucleico), donde cada reactivo se une covalentemente a un fluoróforo.

En realizaciones preferidas, el marcador detectable puede incluir también pares de indicador-desactivador, tales como las que se emplean en balizas moleculares y sondas TAQMAN®. El indicador puede ser un tinte orgánico fluorescente modificado con un grupo conector adecuado para el acoplamiento al oligonucleótido, tal como al carbono del extremo 3' o al carbono del extremo 5'. El desactivador también puede ser un tinte orgánico, que puede ser fluorescente o no. Por lo general, tanto si el desactivador es fluorescente como si simplemente libera la energía transferida desde el indicador mediante desintegración no radiactiva, la banda de absorción del desactivador debería al menos solaparse sustancialmente con la banda de emisión fluorescente del indicador para optimizar la desactivación. Los desactivadores no fluorescentes o desactivadores oscuros habitualmente funcionan absorbiendo energía de indicadores excitados, pero no liberan la energía de forma radiactiva.

La selección de los pares de indicador-desactivador apropiados para sondas particulares se puede efectuar de acuerdo con técnicas conocidas. Algunos desactivadores fluorescentes y oscuros y sus propiedades ópticas pertinentes, a partir de las cuales se pueden seleccionar pares de indicador-desactivador ilustrativos se enumeran y describen, por ejemplo, en Berlman, Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules, 2.a ed., Academic Press, Nueva York, 1971. Pueden encontrarse ejemplos de modificación de indicadores y desactivadores para el acoplamiento covalente mediante grupos reactivos comunes que se pueden incorporar a un oligonucleótido en la presente invención, por ejemplo, en Haugland (2001) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, octava edición, de Molecular Probes, Inc. (Eugene, Or ).

Ejemplos adecuados de indicadores, tales como fluoróforos, pueden seleccionarse de tintes tales como SYBR green, 5-carboxifluoresceína (5-FAM™ disponible en Applied Biosystems de Foster City, Calif.), 6-carboxifluoresceína (6-FAM), tetracloro-6-carboxifluoresceína (TET), 2,7-dimetoxi-4,5-dicloro-6-carboxifluoresceína, hexacloro-6-carboxifluoresceína (HEX), 6-carboxi-2',4,7,7'-tetraclorofluoresceína (6-TET™ disponible en Applied Biosystems), carboxi-X-rodamina (ROX), 6-carboxi-4',5'-dicloro-2',7'-dimetoxifluoresceína (6-JOE™ disponible en Applied Biosystems), productos de tinte VIC™ disponibles en Molecular Probes, Inc., productos de tinte NED™ disponibles en Applied Biosystems, y similares. Ejemplos adecuados de desactivadores se pueden seleccionar de 6-carboxitetrametilrodamina, ácido 4-(4-dimetilaminofenilazo)benzoico (DABYL), tetrametilrodamina (TAMRA), BHQ-0™, BHQ-1™, BHQ-2™ y BHQ-3™, cada uno de los cuales está disponible en Biosearch Technologies, Inc. de Novato, Calif., QSY-7™, QSY-9™, QsY-21 ™ y QSY-35™, cada uno de los cuales está disponible en Molecular Probes, Inc. y similares.

En determinados aspectos, la mezcla de reacción acuosa se coloca dentro de un aceite inmiscible, tal como un aceite de encapsulación o aceite transportador. Se entiende que el volumen de reacción acuosa tendrá una densidad que es diferente de la del aceite de encapsulación y/o el aceite transportador. En una realización, la mezcla de reacción acuosa y un aceite de encapsulación se distribuyen dentro de un recipiente, donde la mezcla de reacción acuosa tendrá un intervalo de densidad dentro de los valores de aproximadamente 900 kg/m3 a aproximadamente 1200 kg/m3 (por ejemplo, una solución de base acuosa de muestra de ADN aislado y reactivos de PCR que tienen una densidad total de aproximadamente 1000 kg/m3), mientras que el aceite de encapsulación tendrá un intervalo de densidad dentro de los valores de aproximadamente 700 kg/m3 a aproximadamente 990 kg/m3, con la condición de que la densidades de la mezcla de reacción acuosa y el líquido de encapsulación no solapen. Un líquido de encapsulación adecuado incluye, pero sin limitación, fenilmetilpolisiloxano (aceite de silicona) que tiene una densidad de aproximadamente 920 kg/m3. En otra realización, el volumen de mezcla de reacción acuosa y un aceite transportador se distribuyen dentro de un recipiente, donde el volumen de mezcla de reacción acuosa tendrá un intervalo de densidad dentro de los valores de aproximadamente 900 kg/m3 a aproximadamente 1200 kg/m3 (por ejemplo, una solución de base acuosa de muestra de ADN aislado y reactivos de PCR que tienen una densidad total de aproximadamente 1000 kg/m3), mientras que el aceite transportador tendrá un intervalo de densidad dentro de los valores de aproximadamente 1300 kg/m3 a aproximadamente 2000 kg/m3. En algunas realizaciones, el aceite transportador es un aceite fluorocarbonado (por ejemplo, Fluorinert™ FC-40) que tiene una densidad de aproximadamente 1900 kg/m3 o un aceite de amina perfluorada. En otra realización más, la mezcla de reacción acuosa se coloca dentro de un aceite de encapsulación inmiscible (por ejemplo, un aceite de silicona con una densidad ligeramente mayor que o igual al agua, pero menor que el aceite transportador) y se coloca adicionalmente en una superficie libre de un aceite transportador mutuamente inmiscible (por ejemplo, Fluorinert™ FC-40). En una realización preferida, la mezcla de reacción acuosa comprende una solución acuosa de polinucleótidos de muestra y reactivos de PCR que tienen una densidad entre la del aceite transportador y el aceite de encapsulación. Las densidades adecuadas para los líquidos varían dentro de los valores de aproximadamente 1300 kg/m3 a aproximadamente 2000 kg/m3 para el aceite transportador, de aproximadamente 700 kg/m3 a aproximadamente 990 kg/m3 para el aceite de encapsulación y de aproximadamente 900 kg/m3 a aproximadamente 1200 kg/m3 para la mezcla de reacción acuosa. Los aceites transportadores adecuados incluyen, pero sin limitación, FLUORINERT FC-40™, FLUORINERT FC-70™, FLUORIDROP 40™, FLUORIDROP 7500™, KRYTOX GLP-100™, KRYTOX GLP-104™ Y KRYTOX GLP-105™. Las densidades de los aceites transportadores adecuados para su uso con los presentes sistemas y métodos pueden variar dependiendo de la formulación y la temperatura, pero están generalmente entre 1700 kg/m3 y 1900 kg/m3. Los aceites de encapsulación adecuados a menudos son aceites de silicona puros (polidimetilsiloxano [PDMS]) e incluyen, pero sin limitación, aceite de silicona de SigmaAldrich (5, 10, 100 o 1000 cSt), c LeARCO PSF-20c St ™, DOW CORNING 200™, XIAMETER PMX-200™, GE SF96™, SHIN-ETSU KF-96™, MICROLUBROL MLT8™ Y SUPERLUBE 56104™. Las densidades de los aceites de encapsulación adecuados para su uso con los presentes sistemas y métodos pueden variar dependiendo de la formulación y la temperatura, pero están generalmente entre 700 kg/m3 y 1100 kg/m3.

En determinadas realizaciones, la muestra y el aceite de encapsulación y/o el aceite transportador se distribuirán en un recipiente o pocillo de volumen adecuado (por ejemplo, que tiene un diámetro de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 mm o más), tal como en un tubo de PCR o tira de tubos, placa de microvaloración convencional (por ejemplo, placa de microvaloración de 96, 192 y 384 pocillos), o tiras poliméricas continuas Array Tape® y similares hechas de vidrio o plástico. En dicha disposición, pueden calentarse volúmenes muy pequeños de mezcla de reacción acuosa sin evaporación significativa de las moléculas de agua y sin la necesidad de una tapa, cubreobjetos u otro material para cubrir la abertura del recipiente o pocillo. Con volúmenes más pequeños de mezcla de reacción acuosa, puede disminuirse la energía requerida para aplicar la cantidad de calor necesaria para realizar la amplificación por PCR de la muestra polinucleotídica. Aunque pueden usarse volúmenes de mezcla de reacción acuosa mayores de 10 pl con los presentes sistemas y métodos, los volúmenes acuosos adecuados para su uso con los presentes sistemas y métodos pueden ser tan pequeños como de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0,9, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5, 0,4, 0,3, 0,2, 0,1 pl o menos. Dichos volúmenes pequeños de mezcla de reacción acuosa pueden distribuirse dentro de los recipientes de la presente divulgación mediante dispositivos convencionales de micropipeteo. Además, pueden distribuirse volúmenes de mezcla de reacción acuosa tan pequeños como de 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 9, 8, 7, 6 y 5 nl dentro de los recipientes de la presente divulgación usando inyección acústica de gotas, tal como la descrita en Ellson etal. (2003) JALA 8:29-34.

Como se muestra en la figura 1, las diferentes densidades de los líquidos posibilitarán la formación de una matriz acuosa de aceite ejemplar. En la figura 1, un recipiente 101 contiene una matriz acuosa de aceite que incluye un aceite transportador (por ejemplo, un aceite fluorocarbonado) 102, un aceite de encapsulación (por ejemplo, un aceite de silicona) y un volumen de mezcla de reacción acuosa 104 (por ejemplo, un volumen acuoso que contiene polinucleótidos aislados, cebadores, sondas y otros reactivos de PCR). Como se muestra en la misma, el volumen de mezcla de reacción acuosa 104 se coloca dentro del aceite de encapsulación 103. Además, la mezcla de reacción acuosa en aceite de encapsulación se coloca sobre una superficie libre de aceite transportador 102. Como resultado de la formación de la matriz acuosa de aceite, el volumen de mezcla de reacción acuosa 104 queda centrado en el recipiente 101. El aceite transportador 102 y el aceite de encapsulación 103 evitan la evaporación de moléculas de agua en el volumen de mezcla de reacción acuosa 104, incluso cuando un pequeño volumen de mezcla de reacción acuosa (por ejemplo, menos de o igual a 10 pl) se somete a calentamiento directo. La configuración de matriz acuosa de aceite también evita la contaminación del recipiente 101 ya que la mezcla de reacción acuosa que contiene, por ejemplo, ácidos nucleicos, es poco probable que entre alguna vez en contacto con las paredes del recipiente 101 debido a las propiedades del aceite transportador 102 y el aceite de encapsulación 103 y las tensiones superficiales implicadas. En una realización preferida, la matriz acuosa de aceite completa puede aspirarse del recipiente 101, permitiendo de ese modo reutilizar el recipiente 101 con poco riesgo de contaminación cruzada. Como la matriz acuosa de aceite centra el volumen de mezcla de reacción acuosa 104, se mejora enormemente la capacidad de facilitar las manipulaciones físicas y de observar el volumen de mezcla de reacción acuosa 104 con fines tales como la detección de fluorescencia.

En otra realización, se añade un aditivo de polisorbato al aceite de encapsulación. En dicha realización, el aditivo de polisorbato tiene un número de equilibrio hidrófilo-lipófilo en el intervalo de 2 a 8. Los aditivos de polisorbato ejemplares adecuados para su uso en los presentes sistemas y métodos incluyen, pero sin limitación, SPAn® 80, SPAn® 65 y TWEEN® 20 (polisorbato-20). Estos aditivos dentro del aceite de encapsulación varían de aproximadamente un 0,001 % a aproximadamente un 10 % de la mezcla.

Como se indica anteriormente, el aceite de encapsulación y/o el aceite transportador de la presente divulgación permiten el uso de volúmenes muy pequeños de mezcla de reacción acuosa (por ejemplo, menos de o igual a 10 pl). Como resultado, puede aplicarse calor en forma de radiación electromagnética para elevar rápida y uniformemente la temperatura del volumen de mezcla de reacción acuosa son requerir grandes aportes de energía. Por ejemplo, la energía necesaria para elevar la temperatura de un volumen de 1 pl de agua requiere únicamente milivatios (mW) de emisión láser.

También se proporcionan en este documento miembros de descarga de líquidos (por ejemplo, micropipetas, inyectores acústicos de gota) configurados para descargar o distribuir el volumen de mezcla de reacción acuosa y el uno o los dos aceites inmiscibles en un recipiente o pocillo para amplificación por PCR. En una realización preferida, se proporciona un subsistema de ensamblaje, donde uno o más miembros de descarga de líquidos están completamente automatizados y programados para distribuir el volumen deseado de líquidos. El pipeteo automatizado y otros sistemas de tratamiento de líquidos similares son bien conocidos en la técnica y realizan transferencias programadas de líquido entre conjuntos preseleccionados de receptáculos o recipientes. En algunas realizaciones, el subsistema de ensamblaje comprende uno o más miembros de descarga de líquidos para distribuir uno o más del volumen de mezcla de reacción acuosa, el aceite de encapsulación y el aceite transportador en los recipientes. En una realización, un conjunto de matrices acuosas de aceite varía de 2-1000 matrices acuosas de aceite, o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 108, 120, 132, 144, 156, 168, 180, 192, 204, 216, 228, 240, 252, 264, 276, 288, 300, 312, 324, 336, 348, 260, 372, 384, 396, 408, 420, 432, 444, 456, 458, 460, 472, 484, 496, 508, 520, 532, etc.) que se ensamblan en recipientes para amplificación por PCR y detección. Para el tratamiento de líquidos de alto rendimiento, puede ser deseable configurar el sistema para ensamblar y procesar los recipientes usando normas internacionales de configuración que comprende la carga y el procesamiento de los recipientes que contienen las matrices acuosas de aceite en filas de 12, sin embargo, los presentes sistemas y métodos pueden adaptarse fácilmente para acomodar otras configuraciones deseadas (por ejemplo, filas de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 19, 10, 11, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más recipientes). En algunas realizaciones, uno o más de los miembros de descarga de líquidos comprenden un cabezal de pipeteo (por ejemplo, un cabezal de pipeteo multicanal o de un solo canal) para la transferencia de líquidos. En algunas realizaciones, se coloca uno o más cabezales de pipeteo en un sistema de eje automatizado basado en servomotores o motores paso a paso, donde el uno o más cabezales de pipeteo pueden ubicarse sobre recipientes que contienen líquidos introducidos para aspirar los líquidos y después ubicarse sobre recipientes para distribuir los líquidos introducidos que se han extraído en los recipientes. Los miembros de descarga de líquidos pueden configurarse para distribuir en masa los líquidos o ajustarlos con puntas desechables para la distribución de un solo canal o multicanal de líquidos.

En una realización particular, un conjunto de miembros de descarga de líquidos se configura para aspirar un aceite de encapsulación de un recipiente de entrada de encapsulación y después se coloca automáticamente sobre una fila de recipientes, donde el conjunto de miembros de descarga de líquidos distribuye el aceite de encapsulación en los recipientes. En otra realización, un conjunto de miembros de descarga de líquidos se configura para aspirar un aceite transportador de un recipiente de entrada de transportador y después se coloca automáticamente sobre una fila de recipientes, donde el conjunto de miembros de descarga de líquidos distribuye el aceite transportador en los recipientes. En otra realización más, un conjunto de miembros de descarga de líquidos se configura para aspirar una muestra polinucleotídica (por ejemplo, muestra de ADN de interés) de un recipiente de entrada de muestra y después se coloca automáticamente sobre una fila de recipientes, donde el conjunto de miembros de descarga de líquidos distribuye la muestra polinucleotídica en los recipientes. En otras realizaciones más, un conjunto de miembros de descarga de líquidos se configura para aspirar un volumen de reactivos de PCR (por ejemplo, sales, tampones, enzimas, dNTP) de un recipiente de entrada de reactivos de PCR y después se coloca automáticamente sobre una fila de recipientes para distribuir los reactivos en los pocillos. En dichas realizaciones, los cebadores de amplificación adecuados y las sondas de ácido nucleico específicas de alelo también pueden incluirse en la entrada de reactivos de PCR. En otras, otro conjunto de miembros de descarga de líquidos se configura para aspirar y distribuir los cebadores y las sondas. Se entiende que los componentes del volumen de mezcla de reacción acuosa (es decir, la muestra polinucleotídica, los cebadores, las sondas y los reactivos de PCR) pueden premezclarse, aspirarse y distribuirse por los mismos o diferentes miembros de descarga de líquidos y en cualquier orden. Además, la muestra polinucleotídica puede premezclarse con los cebadores, las sondas y el reactivo de PCR y después aspirarse por los miembros de descarga de líquidos para distribuirlos en uno o más recipientes. Como alternativa, los miembros de descarga de líquidos pueden configurarse para distribuir las muestras polinucleotídicas y los cebadores/sondas/reactivos de PCR por separado. El subsistema de ensamblaje de la presente divulgación puede programarse para ensamblar las matrices acuosas de aceite en cualquier orden y para cualquier combinación de muestras polinucleotídicas y cebadores/sondas/reactivos de PCR, por ejemplo, para amplificación por PCR y detección en una o más muestras polinucleotídicas usando uno o más conjuntos distintos de combinaciones de cebador/sonda. Adaptar los sistemas automatizados de pipeteo y otros sistemas de tratamiento de líquidos a un espacio de trabajo para incontables operaciones programables de ensamblaje de líquidos pertenece a las habilidades habituales de los expertos, y dichos sistemas de tratamiento de líquidos están disponibles del fabricante original del equipo (OEM), del producto comercial y de proveedores de automatización/integración incluyendo, pero sin limitación, 3Dispense, Accel Biotech, Inc., Agilent Technologies, Inc., Apricot Designs, AsysTek, Aurora Biomed, Beckman Coulter, Biohit (Sartorius), BioNex Solutions, BioTek, CyBio (Analytic Jena), Dispendix, Dynamic Devices, FluidX, Formulatrix, Gilson, Hamilton, HTZ, Hudson Robotics, Integra Biosciences, Kawator Labcyte, Nanoscreen, Perkin Elmer, Rainin, Scineon, Seyonic, Synchron, Tecan, Xantus, Xiril (SIAS) y Zinsser North America.

En una realización particular, los cebadores, las sondas y los reactivos de PCR se optimizan para la detección de un marcador polimórfico particular y se combinan en una única entrada. En dicha realización, se disponen cuatro conjuntos de miembros de descarga de líquidos de tal manera que el aceite transportador y el aceite de encapsulación se distribuyen en masa en una fila de recipientes, seguido de la distribución de las muestras polinucleotídicas y después los reactivos de PCR requeridos para la detección de un marcador particular (véase, por ejemplo, la figura 9). Aunque puede distribuirse uno o dos aceites inmiscibles, el volumen de muestra polinucleotídica, los cebadores, las sondas y los reactivos de PCR en los recipientes en cualquier orden, es preferible distribuir el uno o más aceites inmiscibles en los recipientes antes de distribuir los polinucleótidos para evitar la contaminación de los recipientes. En algunas realizaciones, se configuran múltiples conjuntos de miembros de descarga para emparejar el número de recipientes en una fila, por ejemplo, los miembros de descarga de líquidos configurados con 12 puntas de pipeta en un espaciado igual al de los recipientes en cada fila.

Los recipientes adecuados usados para que contengan las matrices acuosas de aceite incluyen, pero sin limitación, placas de microvaloración de 96 pocillos con volúmenes factibles que varían de aproximadamente 15 gl a aproximadamente 100 gl y diámetros de aproximadamente 3 mm a aproximadamente 6 mm, placas de microvaloración de 384 pocillos con volúmenes que varían de aproximadamente 2 gl a aproximadamente 40 gl y diámetros de aproximadamente 2 mm a aproximadamente 4 mm, Array Tape® de 384 pocillos o 1536 pocillos con volúmenes de recipiente que varían de aproximadamente 0,5 gl a aproximadamente 2 gl y diámetros de aproximadamente 0,5 mm a aproximadamente 3 mm, o una cinta o cadena con hendiduras de pocillo en un ensamblaje de seguimiento con volúmenes de recipiente que varían de aproximadamente 1 gl a aproximadamente 20 gl y diámetros de aproximadamente 0,5 mm a aproximadamente 4 mm (véanse las figuras 4A y 4B), y similares. Se prefiere que los recipientes para el uso de este documento sean transparentes y estén hechos de plástico o vidrio.

Subsistema de calentamiento fotónico

En determinados aspectos de la divulgación, se aplica calentamiento mediado por luz o calentamiento fotónico de reacción en reacción, a cada recipientes y/o directamente a cada volumen de mezcla de reacción acuosa para elevar la temperatura del volumen de mezcla de reacción acuosa de acuerdo con la cronología y las temperaturas requeridas para un ciclo de temperatura de PCR particular, entendiéndose que la expresión "de reacción en reacción" se refiere a la aplicación de radiación electromagnética (y medición de temperatura) a cada volumen de mezcla de reacción acuosa y/o matriz acuosa de aceite individual al contrario que un sistema que utiliza zonas de temperatura constante o calentamiento fotónico de múltiples reacciones simultáneamente por una única fuente de luz bajo un solo control. Es bien sabido en la técnica que la amplificación por PCR de ADN bicatenario requiere una desnaturalización inicial del ADN ("inicio caliente") seguida por múltiples ciclos de hibridación, elongación y desnaturalización. Las temperaturas adecuadas para la etapa de desnaturalización están en el intervalo de temperaturas de aproximadamente 90 °C a aproximadamente 99 °C, por ejemplo, aproximadamente 90 °C, 91 °C, 92 °C, 93 °C, 94 °C, 95 °C, 96 °C, 97 °C, 98 °C o 99 °C. Preferiblemente, la temperatura de desnaturalización es de aproximadamente 95 °C. Después de la desnaturalización del ADN, se reduce la temperatura, por ejemplo, mediante un pozo de calor o la aplicación de aire de refrigeración, hasta una temperatura de hibridación optimizada para le hibridación de los cebadores y las sondas marcadas con la hebra del polinucleótido diana. En una realización preferida, las sondas de unen covalentemente a un fluoróforo con capacidad de excitación por radiación electromagnética que tiene una determinada longitud de onda espectral. La temperatura de hibridación se optimiza típicamente basándose en la longitud y composición de ácido nucleico de los cebadores y/o sondas usando técnicas bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, puede hacerse una aproximación del punto de fusión térmica (Tm) a partir de la ecuación de Meinkoth et a l, Anal. Biochem. 138:267-284 (1984): Tm = 81,5 °C 16,6 (log M) 4-0,41 (% GC) - 0,61 (% form) - 500/L; donde M es la molaridad de los cationes monovalentes, % GC es el porcentaje de nucleótidos de guanosina y citosina en el ADN, % form es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación, y L es la longitud del híbrido en pares de bases. La Tm es la temperatura (en condiciones de fuerza iónica y pH definidas) a la que un 50 % de una secuencia diana complementaria hibrida con una sonda perfectamente emparejada. La Tm se reduce en aproximadamente 1 °C por cada 1 % de emparejamiento incorrecto; por tanto, la Tm y las condiciones de hibridación pueden ajustarse para hibridación con secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si se buscan secuencias con S90 % de identidad, la Tm can puede disminuirse 10 °C. Generalmente, se seleccionan condiciones rigurosas para que sean 5 °C inferiores a la Tm para la secuencia específica y su complemento a una fuerza iónica y pH definidos.

Las temperaturas adecuadas para la etapa de hibridación están en el intervalo de temperatura de aproximadamente 50 °C a aproximadamente 70 °C, por ejemplo, aproximadamente 50 °C, 51 °C, 52 °C, 53 °C, 54 °C, 55 °C, 56 °C, 57 °C, 58 °C, 59 °C, 60 °C, 61 °C, 62 °C, 63 °C, 64 °C, 65 °C, 66 °C, 67 °C, 68 °C, 69 °C o 70 °C. Preferiblemente, la temperatura de hibridación está en el intervalo de aproximadamente 50 °C a aproximadamente 65 °C. Más preferiblemente, la temperatura de hibridación está en el intervalo de aproximadamente 55 °C a aproximadamente 65 °C. Después de que los cebadores y las sondas hayan hibridado con su secuencia polinucleotídica diana, la temperatura se eleva para permitir la elongación de las nuevas hebras del polinucleótido a partir de los cebadores hibridados. Las temperaturas adecuadas para la etapa de elongación están en el intervalo de aproximadamente 65 °C a aproximadamente 75 °C, por ejemplo, 65 °C, 66 °C, 67 °C, 68 °C, 69 °C, 70 °C, 71 °C, 72 °C, 73 °C, 74 °C o 75 °C. Preferiblemente, la etapa de elongación se realiza a aproximadamente 70 °C. Después de una etapa de desnaturalización inicial (es decir, un "inicio caliente"), los sistemas y métodos de la presente divulgación comprenden una pluralidad de ciclos de temperatura de PCR, que varían de 2 a 60, o más, por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 o más ciclos, donde cada ciclo de temperatura de PCR comprende una etapa de hibridación, una etapa de elongación y una etapa de desnaturalización. Después de cada ciclo de temperatura de PCR, la temperatura de cada matriz acuosa de aceite se enfría hasta un intervalo de temperatura de aproximadamente 55 °C a aproximadamente 65 °C, por ejemplo, 55 °C, 56 °C, 57 °C, 58 °C, 59 °C, 60 °C, 61 °C, 62 °C, 63 °C, 64 °C o 65 °C, antes de empezar la siguiente etapa de hibridación. Las matrices acuosas de aceite pueden refrigerarse por un mecanismo de refrigeración activa o pasiva, tal como un pozo de calor de metal pasivo, corrientes de aire de circulación activa, corrientes de aire de circulación pasiva, un dispositivo Peltier, un líquido circulante o cualquier combinación de los mismos.

Un aspecto de esta divulgación es proporcionar volúmenes de mezcla de reacción acuosa suficientemente pequeños (por ejemplo, 10 gl o menos) para permitir un calentamiento eficaz y directo mediante una fuente de radiación electromagnética de modo que se requieran únicamente unos pocos segundos para conseguir las temperaturas de hibridación, elongación y desnaturalización para cada ciclo. En algunas realizaciones, un ciclo de PCR requiere la aplicación de radiación electromagnética durante un periodo de 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 segundo o menos.

Dependiendo del tipo de radiación electromagnética emitida, la radiación calienta el volumen de mezcla de reacción acuosa por absorción de calor de las moléculas de agua en el volumen de mezcla de reacción acuosa o por la absorción de calor de pigmentos que absorben calor, tintes termocrómicos, materiales excitables por plasmones o una combinación de los mismos. Se entiende que los pigmentos que absorben calor, los tintes termocrómicos y/o los materiales excitables por plasmones pueden disponerse sobre las paredes del recipiente o distribuirse dentro del recipiente y/o dentro del volumen de mezcla de reacción acuosa. Las fuentes de radiación electromagnética ejemplares adecuadas para su uso con los presentes sistemas y métodos incluyen láseres, lámparas halógenas, diodos láser y diodos emisores de luz. La posición del recipiente que contiene la matriz acuosa de aceite, donde se aplica radiación electromagnética por una fuente de radiación electromagnética, a veces se menciona en este documento como "posición de calentamiento". En algunas realizaciones, la fuente de radiación electromagnética emite radiación ultravioleta que tiene una longitud de onda espectral en el intervalo de aproximadamente 100 nm a aproximadamente 350 nm. En otras realizaciones, la fuente de radiación electromagnética emite luz visible que tiene una longitud de onda espectral en el intervalo de aproximadamente 380 nm a aproximadamente 700 nm. En una realización preferida, la fuente de radiación electromagnética emite luz azul que tiene una longitud de onda espectral en el intervalo de aproximadamente 350 nm a aproximadamente 500 nm. En una realización más preferida, la fuente de radiación electromagnética emite luz azul que tiene una longitud de onda espectral en el intervalo de aproximadamente 350 nm a aproximadamente 450 nm. En una realización incluso más preferida, la fuente de radiación electromagnética emite luz azul que tiene una longitud de onda espectral de aproximadamente 450 nm. En otra realización más, la fuente de radiación electromagnética emite radiación infrarroja que tiene una longitud de onda espectral en el intervalo de aproximadamente 1200 nm a aproximadamente 2200 nm. En un aspecto preferido, la fuente de radiación electromagnética emite radiación infrarroja que tiene una longitud de onda espectral en el intervalo de aproximadamente 1450 nm a aproximadamente 1600 nm (por ejemplo, aproximadamente 1550 nm). Por tanto, una fuente de radiación electromagnética adecuada para su uso en los presentes sistemas y métodos tendrá una longitud de onda espectral que varía de aproximadamente 100 nm a aproximadamente 2200 nm.

En algunas realizaciones, las fuentes de radiación electromagnética son diodos láser. Los diodos láser son relativamente baratos, pequeños y fiables con una vida útil muy larga. Los diodos láser en estado sólido adecuados para su uso con los presentes sistemas y métodos son similares a los encontrados en muchos dispositivos electrónicos habituales tales como lectores de discos compactos y discos versátiles digitales o en comunicación por fibra óptica. La energía producida por dicho diodo láser puede concentrarse en un área muy pequeña (por ejemplo, mediante una lente colimadora), y los diodos láser están disponibles en el mercado en una amplia diversidad de longitudes de onda de salida espectrales y vatiajes. Además, la energía necesaria para elevar la temperatura de una mezcla de reacción acuosa que tiene un volumen muy pequeño, por ejemplo, aproximadamente 5 gl, 1 gl o menos, es muy pequeña. Por lo tanto, la energía producida necesaria para los diodos láser adecuados para su uso con el presentes sistema es muy pequeña, por ejemplo, de aproximadamente 10 mW a aproximadamente 500 mW, dependiendo de la masa térmica del recipiente y el volumen de la matriz de aceite. En un aspecto, se proporciona una fuente de radiación electromagnética, por ejemplo, un diodo láser, para que emita radiación infrarroja que tiene una longitud de onda espectral en el intervalo de aproximadamente 1200 nm a aproximadamente 2200 nm a un recipiente que contiene una matriz acuosa de aceite, donde un volumen de la mezcla de reacción acuosa comprende una muestra polinucleotídica a analizar por genotipado por PCR (por ejemplo, para la detección de productos de PCR de fase final o detección de productos de PCR en tiempo real). Seleccionando una longitud de onda espectral que se absorbe preferentemente por las moléculas de agua en el volumen de mezcla de reacción acuosa en lugar de por el aceite de encapsulación y/o transportador y/o el material del recipiente (por ejemplo, vidrio o plástico), la energía producida puede concentrarse en el volumen de mezcla de reacción acuosa en la matriz acuosa de aceite.

En una realización preferida, el volumen de mezcla de reacción acuosa se centra dentro de una matriz acuosa de aceite, y la longitud de onda espectral de la radiación infrarroja es de aproximadamente 1550 nm. En dichos aspectos, un diodo láser para emitir la radiación infrarroja puede colocar por encima del recipiente o por debajo del recipiente. Se sabe en la técnica que la radiación infrarroja se absorbed fácilmente por las moléculas de agua. Por lo tanto, la radiación infrarroja puede concentrarse directamente en el volumen de mezcla de reacción acuosa donde el calor se absorbe fácilmente por las moléculas de agua dentro para calentar directamente la mezcla de reacción acuosa. Debe apreciarse que el diodo láser se coloca en cercana proximidad al recipiente a una distancia que puede variar dependiendo de la manera en que se concentra la luz infrarroja. Un diodo láser ejemplar configurado para la emisión de radiación infrarroja comprenderá una fuente de energía y una lente opcional o un colimador opcional para ajustar el centro del haz infrarrojo. En algunas realizaciones, el diodo láser puede comprender una o más fibras ópticas o tubos de luz para proporcionar una trayectoria óptica para la radiación infrarroja y permitir la flexibilidad al colocar el diodo láser en relación con el recipiente. Para el calentamiento directo del volumen de mezcla de reacción acuosa, el diodo láser puede colocarse a una distancia de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 cm o más desde la parte superior del recipiente o la parte inferior del recipiente, y la lente o el colimador puede usarse para concentrar la radiación infrarroja en el volumen de mezcla de reacción acuosa. Para un calentamiento uniforme y eficaz de la mezcla de reacción acuosa, el haz infrarrojo se concentrará de tal manera que el tamaño del haz sea aproximadamente equivalente al tamaño del volumen de mezcla de reacción acuosa.

La cantidad de tiempo necesario para calentar la muestra para cada ciclo de PCR puede calcularse basándose en el calor específico del agua (es decir, 4,184 J/g°C) y la energía producida usada para el láser y la tasa de disipación del calor de los materiales y recipientes. Por ejemplo, dependiendo de la masa térmica total específica y las propiedades de disipación del calor, un diodo láser de 1550 nm alimentado por 50 mW puede concentrarse en la mezcla de reacción acuosa que tiene un volumen de aproximadamente 1 pl. Por tanto, la temperatura de la mezcla de reacción acuosa puede calentarse desde ambiental, o temperatura ambiente, hasta aproximadamente 60 °C en aproximadamente 1 segundo, y después hasta aproximadamente 70 °C en otros 0,8 segundos, y después hasta aproximadamente 95 °C en tan poco como 2 segundos. Por lo tanto, puede usarse un diodo láser para que emita radiación infrarroja para calentar el volumen de la mezcla de reacción acuosa a través de un ciclo de temperatura de PCR en aproximadamente 3,3 segundos. Cada ciclo de temperatura de PCR individual puede realizarse en un volumen de mezcla de reacción acuosa con un diodo láser. Sin embargo, con volúmenes más grandes de mezcla de reacción acuosa (por ejemplo, 5 pl) y un diodo láser emisor de luz infrarroja usando una baja introducción de energía (por ejemplo, de aproximadamente 80 a aproximadamente 200 mW), se producen deficiencias en la absorción de luz infrarroja por el agua y el calor conducido al líquido de encapsulación circundante y/o el líquido transportador e incluso a las paredes del recipiente. En este punto, el calor que se conduce al aceite y el vidrio desde el volumen de mezcla de reacción acuosa puede equilibrar la energía que se aplica al volumen de mezcla de reacción acuosa por el diodo láser y provoca la inhibición de la elevación de la temperatura. Sin embargo, se entiende que pertenece a las habilidades habituales de los expertos la optimización del sistema para su uso dependiendo de los materiales seleccionados para el líquido de encapsulación o el líquido transportador, el volumen de la mezcla de reacción acuosa y la energía producida del láser. Por ejemplo, el volumen de la mezcla de reacción acuosa puede reducirse en aproximadamente 2 veces a aproximadamente 100 veces, o más (por ejemplo, 1000 veces mediante una transferencia acústica), la energía del diodo láser puede aumentarse para transferir energía al recipiente a una tasa mayor de la tasa de pérdida, y/o la absorción de energía lumínica disponible para la conversión en calor puede mejorarse de modo que se conduzca al volumen de mezcla de reacción acuosa a una tasa aumentada en comparación con la tasa de pérdida de calor. En una realización, la absorción de calor se mejora usando tintes y partículas que absorben calor, y/o se usan matrices acuosas de aceite para posibilitar el uso de volúmenes más pequeños de mezcla de reacción acuosa (por ejemplo, menos de 5 pl).

En la figura 2 se representa una configuración ejemplar del presente sistema. En esta realización, la fuente de radiación electromagnética 201, por ejemplo, un diodo láser que emite radiación infrarroja, se coloca en la parte superior del recipiente 101. Se realiza radiación electromagnética, o se conduce, a lo largo de una trayectoria óptica mediante una fibra óptica o tubo de luz 203 y se concentra en el volumen de mezcla de reacción acuosa 104 mediante una lente colimadora 204.

En una realización alternativa, se proporciona una fuente de radiación electromagnética, por ejemplo, diodo emisor de luz (LED), para que emita luz azul que tiene una longitud de onda espectral en el intervalo de aproximadamente 350 nm a aproximadamente 450 nm (o luz ultravioleta o violeta que tiene una longitud de onda espectral de aproximadamente 100 nm a aproximadamente 350 nm) a un recipiente que contiene una matriz acuosa de aceite, donde el volumen de mezcla de reacción acuosa comprende una muestra polinucleotídica a analizar por genotipado por PCR. En una realización preferida, el volumen de mezcla de reacción acuosa se coloca dentro de dos aceites inmiscibles, tal como la matriz acuosa de aceite ejemplar representada en la figura 1. En dicha realización, un LED se coloca en comunicación óptica con el recipiente y emite radiación electromagnética que tiene una longitud de onda espectral de aproximadamente 450 nm (es decir, luz azul). En dichos aspectos, puede colocarse un LED para que emita la luz azul por encima del recipiente o por debajo del recipiente. Aunque las moléculas de agua no absorben fácilmente radiación de luz azul, el volumen de mezcla de reacción acuosa puede calentarse uniformemente por la fuente de luz LED usando partículas excitables por plasmones en el volumen de mezcla de reacción acuosa. Los materiales excitables por plasmones que absorben fácilmente luz azul pueden emitir calor mediante un proceso conocido en la técnica como conversión de luz fototérmica a calor mediante acoplamiento de fotón-electrón-fotón. Las partículas excitables por plasmones adecuadas para absorber radiación de luz azul son conocidas en la técnica e incluyen, pero sin limitación, partículas que comprenden oro, plata, níquel, platino o una combinación de los mismos. Preferiblemente, el material excitable por plasmones es oro. El uso de oro en PCR fotónica se describe con detalle en Ho Son et al. (2015). Como alternativa, paredes seleccionadas de los recipientes pueden recubrirse de material excitable por plasmones (por ejemplo, partículas de oro) por electrólisis o deposición de vapor. En una realización preferida, se dispersa una fina película o capa que comprende material excitable por plasmones en el recipiente en o cerca de la parte inferior del recipiente de modo que la fina película o capa está dentro de la matriz acuosa de aceite, pero dentro o por debajo de la mezcla de reacción acuosa (véase, por ejemplo, la figura 3). En una realización más preferida, se coloca una delgada película o capa de oro dentro del recipiente y en el fondo del recipiente de modo que la delgada película o capa esté en íntimo contacto con la matriz acuosa de aceite y entre la mezcla de reacción acuosa y el fondo del recipiente. En algunos aspectos, se coloca un disco de Mylar que comprende la delgada capa de oro en el recipiente y en el fondo del recipiente. En otros aspectos, se coloca un disco de papel de aluminio recubierto de oro en el recipiente en el fondo del recipiente. El groso de la delgada película o capa de material excitable por plasmones está en el intervalo de aproximadamente 10 nm a aproximadamente 100 nm, por ejemplo, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 5 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71,72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81,8 84, 85, 86, 87, 88, 89, 91, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 nm. En otras realizaciones, el grosor de la delgada película o capa de material excitable por plasmones está en el intervalo de aproximadamente 50 nm a aproximadamente

500 nm, por ejemplo, 50 nm, 60 nm, 70 nm, 80 nm, 90 nm, 100 nm, 200 nm, 300 nm, 400 nm o 500 nm. Películas o capas más gruesas de material metálico, de hasta aproximadamente 1 mm de grosor o más, pueden absorber luz y convertir la energía lumínica en calor, pero se reduce la resonancia de plasmones superficiales, lo que ralentiza el calentamiento. En otras realizaciones, el material recubierto con la delgada capa de oro (por ejemplo, Mylar, vidrio, papel de aluminio o diversos plásticos diferentes) puede constituir el fondo del recipiente o puede colocarse en el fondo de la pared del recipiente. En algunas realizaciones, el LED se coloca en la parte superior o la parte inferior del recipiente y se concentra

(por ejemplo, mediante una lente o colimador) para que emita radiación de luz azul sobre la capa de oro para la conducción de calor a la gota acuosa.

Debe apreciarse que el LED se coloca en cercana proximidad al recipiente a una distancia que puede variar dependiendo de la manera en que se concentra la luz azul. Un LED ejemplar configurado para la emisión de radiación de luz azul comprenderá una fuente de energía y una lente o un colimador para ajustar el centro del haz de luz. En algunas realizaciones, el LED puede comprender una o más fibras ópticas o tubos de luz para proporcionar una trayectoria óptica para el LED y permitir la flexibilidad al colocar el láser en relación con el recipiente que contiene la muestra. En otras realizaciones, el alojamiento del LED tiene un diámetro físico menor que la distancia entre los recipientes de reacción y se coloca directamente por debajo del recipiente. En dichas realizaciones, el LED pequeño se conectará a la fuente de energía usando circuitería convencional, y el LED comprenderá un colimador para permitir la concentración del haz. Para el calentamiento uniforme de la gota acuosa, los l Ed de la presente divulgación puede colocarse a una distancia de 1,2, 3,

4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 mm o más desde la parte superior del recipiente o la parte inferior del recipiente, y la lente o colimador opcional puede usarse para concentrar el haz de luz sobre la delgada capa de material excitable por plasmones, tal como oro. Para el calentamiento uniforme y eficaz del volumen de reacción acuosa, el haz de luz azul se concentrará en el material excitable por plasmones de modo que el tamaño del haz sea aproximadamente equivalente al área superficial del material excitable por plasmones. En una realización preferida, se coloca un disco de Mylar que comprende una delgada capa de oro (por ejemplo, entre aproximadamente 10 nm y 0,2 mm de grosor) en el recipiente, y la radiación de luz azul emitida desde el LED se concentra de tal manera que el tamaño del haz es aproximadamente equivalente al tamaño del disco de Mylar o papel de aluminio y la delgada capa de oro.

En la figura 3 se representa una realización de la divulgación que comprende una fuente de radiación electromagnética para la emisión de luz visible (por ejemplo, un LED que emite luz azul). Una matriz acuosa de aceite que comprende un volumen de mezcla de reacción acuosa 304 se coloca dentro de un aceite de encapsulación 303 y un aceite transportador

302. En esta realización ejemplar, la fuente de radiación electromagnética 309 (por ejemplo, un LED que emite luz azul) se coloca en comunicación óptica con el fondo del recipiente 301 (por ejemplo, un recipiente de plástico transparente). Se dispersa una delgada capa de material excitable por plasmones 306 en el recipiente 301 de modo que el material excitable por plasmones se coloque en el fondo del recipiente 301 dentro o en contacto con el aceite transportador 302, pero por debajo del aceite de encapsulación 303 y el volumen de mezcla de reacción acuosa 304. Como se analiza en este documento, el material excitable por plasmones puede ser oro. Opcionalmente, una capa de estabilización 305 hecha de cualquier material adecuado usado en la técnica (por ejemplo, plástico, dimetilsiloxano o dióxido de silicio) se sitúa sobre el material excitable por plasmones 306 para evitar que los componentes de la reacción de PCR en el volumen de mezcla de reacción acuosa 304 reaccionen con el material excitable por plasmones 306. Sin embargo, la matriz acuosa de aceite

crea una separación entre el volumen de mezcla de reacción acuosa 304 y el material excitable por plasmones 306 y disminuye la probabilidad de que los componentes de la reacción de PCR reaccionen con el material excitable por plasmones. Dependiendo del tamaño y la proximidad del LED a los plasmones superficiales, una lente colimadora opcional 308 posibilita concentrar el haz de luz (línea de puntos) sobre el material excitable por plasmones 306, que después convierte la energía lumínica en calor, que se conduce de forma uniforme al volumen de mezcla de reacción acuosa 304. En algunas realizaciones, se coloca un detector 307 en comunicación óptica con la parte superior del recipiente 301. El detector 307 puede comprender cualquier dispositivo de detección adecuado para la detección de radiación térmica (por ejemplo, radiación infrarroja de cuerpo negro) y/o fluorescencia emitida desde el volumen de mezcla de reacción acuosa (línea de puntos), como se analizará en mayor detalle en otra parte en este documento.

El dispositivo de colocación de cinta

En determinados aspectos, los presentes sistemas y métodos comprenden un dispositivo de colocación para mover individualmente los recipientes (por ejemplo, etapa a etapa, al contrario que el movimiento continuo) que contienen las matrices acuosas de aceite a través de los diversos subsistemas y puestos de los recipientes del sistema. En una realización, el dispositivo de colocación es una cinta transportadora compuesta de una pluralidad de recipientes (por ejemplo, pocillos o hendiduras), donde los recipientes contendrán las matrices acuosas de aceite ensambladas. La cinta puede construirse de plástico flexible, polímeros termoplásticos (por ejemplo, polipropileno, poliestireno o policarbonato) u otros materiales similares a los usados para Array Tape®. En algunas realizaciones, los recipientes se estampan en el material de la cinta para formar hendiduras. El volumen de cada pocillo varía de 0,2 pl a aproximadamente 20 pl con un diámetro de cada recipiente que varía de aproximadamente 0,5 mm a aproximadamente 4 mm dependiendo de los parámetros de diseño deseados. La cinta, y los recipientes dentro de la cinta, pueden fabricarse a partir de un material continuo o puede fabricarse en segmentos pequeños, donde cada segmento comprende un conjunto configurado de recipientes de reacción, y donde los segmentos se adhieren, o engarzan juntos, por cualquier técnica adecuada en la técnica, para que constituyan la cinta. En dicha realización, los segmentos pueden intercambiarse o remplazarse según lo necesario para simplificar la creación de configuraciones óptimas para diversos volúmenes de recipiente y/o para sustentar el mantenimiento y/o la reparación. En una realización preferida, las cintas se unirán extremo a extremo para formar una estructura de lazo y funcionará mediante un riel motorizado que conecta de forma comunicativa con un sistema de control mecánico y electrónico, que accionará la cinta para mover los recipientes en etapas concretas desde el subsistema de ensamblaje a través de cada una de las posiciones de calentamiento, posiciones de control de la temperatura, posiciones de detección de productos de PCR. En algunas realizaciones, la cinta moverá los recipientes hasta un subsistema de eliminación de desechos después de completarse los ciclos de amplificación por pCr y detección de PCR. Cada accionamiento de la cinta está seguido de una parada (por ejemplo, movimiento etapa a etapa) para colocar cada fila de recipientes al puesto de recipientes apropiado. La expresión "puesto de recipientes", como se usa en este documento se refiere a una ubicación física particular de una fila o matriz de recipientes en el sistema.

En algunas realizaciones, los puestos de recipientes comprenden: 1) ensamblaje de las matrices acuosas de aceite mediante el subsistema de ensamblaje; 2) una posición de calentamiento mediante el subsistema de calentamiento fotónico; 3) una posición de control de la temperatura mediante el subsistema de control de la temperatura; 4) una posición de detección de productos de PCR mediante el subsistema de detección de fluorescencia; y 5) opcionalmente, eliminación de desechos mediante el subsistema de eliminación de desechos. En otras realizaciones, los puestos de recipientes comprenden: 1) ensamblaje de las matrices acuosas de aceite mediante el subsistema de ensamblaje; 2) una posición de calentamiento mediante el subsistema de calentamiento fotónico, una posición de control de la temperatura mediante el subsistema de control de la temperatura, y una posición de detección de productos de PCR mediante el subsistema de detección de fluorescencia; y 3) opcionalmente, eliminación de desechos mediante el subsistema de eliminación de desechos. En otras realizaciones más, los puestos de recipientes comprenden: 1) ensamblaje de las matrices acuosas de aceite mediante el subsistema de ensamblaje; 2) una posición de calentamiento mediante el subsistema de calentamiento fotónico; 3) una posición de control de la temperatura mediante el subsistema de control de la temperatura, y una posición de detección de productos de PCR mediante el subsistema de detección de fluorescencia; y 4) opcionalmente, eliminación de desechos mediante el subsistema de eliminación de desechos. En una realización preferida, los puestos de recipientes comprenden: 1) ensamblaje de las matrices acuosas de aceite mediante el subsistema de ensamblaje; 2) una posición de calentamiento mediante el subsistema de calentamiento fotónico, y una posición de control de la temperatura mediante el subsistema de control de la temperatura; 3) una posición de detección de productos de PCR mediante el subsistema de detección de fluorescencia; y 4) opcionalmente, eliminación de desechos mediante el subsistema de eliminación de desechos. En otras realizaciones más, pueden incluirse puestos de recipientes adicionales en el sistema, tales como puestos de recipientes que comprenden una posición de refrigeración mediante un pozo de calor activo o pasivo y una posición o posiciones de inicio caliente mediante calentamiento fotónico.

En las figuras 4A y 4B son realizaciones ejemplares de un diseño de cinta adecuado para su uso con el presente sistema y métodos. En esta realización, una cinta 402 se sitúa en engranajes transmisores 401 en cada extremo. En esta realización, el sistema de control mecánico y electrónico causará la rotación de los engranajes transmisores 401 (indicados por flecha) para posibilitar que la cinta mueva cada fila de recipientes en etapas concretas a través de cada puesto de recipientes. La cinta 402 comprende una pluralidad de recipientes 404 adecuados para que contenga una matriz acuosa de aceite. Puede utilizarse cualquier variación de espaciado de los recipientes. En una realización preferida, el espaciado de los recipientes puede ser de aproximadamente 1 mm a aproximadamente 10 mm o más, por ejemplo, 1 mm, 1,5 mm, 2 mm, 2,5 mm, 3 mm, 3,5 mm, 4 mm, 4,5 mm, 5 mm, 5,5 mm, 6 mm, 6,5 mm, 7 mm, 7,5 mm, 8 mm, 8,5 mm, 9 mm, 9,5 mm, 10 mm o más. En una realización más preferida, el espaciado de los recipientes está en un intervalo de aproximadamente 8 mm a aproximadamente 10 mm. En una realización mucho más preferida, el espaciado de los recipientes es de aproximadamente 9 mm para que se ajuste a las normas internacionales para el espaciado de pocillos en placas de microvaloración y el espaciado convencional de puntas en pipetas de múltiples puntas. En determinados aspectos, la cinta comprenderá filas de recipientes, donde cada fila incluirá incontables recipientes que varían de 2 a 100 recipientes, o más en cada fila. Más preferiblemente, la cantidad de recipientes en cada fila es de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 19, 10, 11, 13, 12, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 o más recipientes. En la figura 4B se muestra la realización más preferida, donde cada fila de recipientes en la cinta 402 comprende 12 recipientes. El tamaño y la forma de cada recipiente pueden diseñarse basándose en el volumen del aceite de encapsulación de modo que el aceite de encapsulación esté sustancialmente fijo cuando se coloca dentro del aceite transportador, manteniendo, por tanto, el volumen de mezcla de reacción acuosa sustancialmente centrado en el pocillo. En esta realización, una cinta flexible 402 se sitúa en engranajes transmisores 401 en cada extremo. En esta realización, el sistema de control mecánico y electrónico causará la rotación de los engranajes transmisores 401 en la dirección de la flecha para posibilitar que la cinta mueva cada fila de recipientes en etapas concretas a través de cada puesto de recipientes.

En algunas realizaciones, los recipientes de la cinta pueden recubrirse (por ejemplo, mediante electrólisis, deposición de vapor o aplicación en emulsión) con un material excitable por plasmones, tal como oro. En algunas realizaciones, el material excitable por plasmones se inserta en cada recipiente como un disco recubierto de Mylar, papel de aluminio u otro soporte de material delgado adecuado. En la figura 4A también se muestra una pluralidad de metales de pozo de calor pasivo 403 para refrigerar cada fila de recipientes cuando un puesto de recipientes está en cercana proximidad a un metal de pozo de calor pasivo 403.

Subsistema de control de la temperatura

Aunque muchos sistemas de PCR tradicionales comprenden zonas de temperatura constante para el termociclado de PCR, los presentes sistemas y métodos proporcionan calentamiento directo y control de la temperatura de cada recipiente, que posibilitan la optimización y regulación de las condiciones de termociclado de PCR para cada recipiente. Además, los presentes sistemas y métodos pueden programarse para ejecutar una pluralidad de diferentes condiciones de termociclado de PCR para amplificar y detectar productos de PCR usando una pluralidad de diferentes muestras polinucleotídicas con diferentes cebadores, sondas y reactivos de PCR. Como las temperaturas de las matrices acuosas de aceite en los recipientes deben controlarse para posibilitar que el presente sistema regule la cantidad de energía a proporcionar desde lo láseres para cambiar la temperatura del recipiente hasta los valores deseados para un termociclado de PCR eficaz, en este documento se proporciona un subsistema de control de la temperatura. En algunas realizaciones, el subsistema de control de la temperatura recoge datos de temperatura de cada uno de los recipientes durante, simultáneamente con o después de cada ciclo de temperatura de PCR, que pueden usarse para ayudar a controlar la calidad. En otras realizaciones, el subsistema de control de la temperatura recoge datos de temperatura de cada uno de los recipientes durante cada ciclo de temperatura de PCR, que pueden usarse para determinar una temperatura inicial para la optimización del siguiente ciclo de calentamiento o, como alternativa, para la normalización de los fluoróforos sensibles a la temperatura. Las matrices acuosas de aceite (o volúmenes de mezcla de reacción acuosa) que no cambiar de temperatura según lo esperado, pueden indicar una distribución de volumen incorrecto del subsistema de ensamblaje o avería del instrumento. En determinadas realizaciones, la información de medición de temperatura está disponible cada 15 segundos o menos, según funciona el sistema. Además, algunas realizaciones del sistema incorporar funcionalidades informáticas que alertan al personal del laboratorio de cualquier imprecisión de la temperatura. Dicha funcionalidad puede incluir, pero sin limitación, alertas basadas en temperaturas fuera de los límites establecidos, fallos en la detección de los cambios de temperatura esperados dentro de los intervalos de tiempo esperados durante el calentamiento fotónico o cambios en la temperatura que son erráticos o varía de maneras inesperadas. El programa informático que proporciona dicha funcionalidad puede ser de cifrado personalizado o puede utilizar algoritmos disponibles al público o en el mercado. La posición del recipiente que contiene la matriz acuosa de aceite donde se recoge y controla la información de temperatura o térmica a veces se menciona en este documento como "posición de control de la temperatura".

En determinados aspectos, el subsistema de control de la temperatura comprende una pluralidad de dispositivos de detección térmica, cada uno de los cuales correspondes a un recipiente que contiene una matriz acuosa de aceite. Los dispositivos de detección térmica adecuados son conocidos en la técnica e incluyen, pero sin limitación, termistores de contacto directo y/o termopares, reproductores de imágenes sin contacto, detectores de termopila individuales, matrices de termopilas, otros detectores de infrarrojos o fibras ópticas y/o matrices ópticas de fibra en comunicación óptica con un dispositivo sin contacto de detección térmica de infrarrojos. En algunas realizaciones, el subsistema de control de la temperatura comprende una pluralidad de dispositivos de detección térmica, por ejemplo, termistores o termopares, dispuestos dentro de cada uno de los recipientes que contienen una matriz acuosa de aceite y configurados para recoger y enviar datos de temperatura al subsistema de control de la temperatura mediante circuitería convencional o comunicación inalámbrica. En una realización preferida, el subsistema de control de la temperatura comprende una pluralidad de dispositivos de detección térmica (por ejemplo, fibras ópticas o tubos de luz) en comunicación óptica con un dispositivo de detección térmica de infrarrojos (por ejemplo, cámara de imágenes térmicas o detector de infrarrojos). En dicha realización, cada dispositivo de detección térmica está en comunicación óptica con cada recipiente que contiene una matriz acuosa de aceite cuando el recipiente está en una posición de control de la temperatura, y donde cada dispositivo de detección térmica está configurado para proporcionar una señal de medición que depende de la intensidad de la radiación infrarroja de cuerpo negro emitida por la matriz acuosa de aceite como una indicación de la temperatura. Además, cada dispositivo de detección térmica puede estar configurado para proporcionar una trayectoria de radiación térmica desde el volumen de la matriz acuosa de aceite (o el volumen de mezcla de reacción acuosa) hasta el dispositivo de detección térmica de infrarrojos para la recogida de datos de temperatura. En una realización preferida, los dispositivos de detección térmica son fibras ópticas o tubos de luz que no se dispersan en los recipientes y no hacen contacto físico con las matrices acuosas de aceite. En algunas realizaciones, los dispositivos de detección térmica, por ejemplo, una o más fibras ópticas, detectan la radiación infrarroja de cuerpo negro emitida desde cada matriz acuosa de aceite (o volumen de mezcla de reacción acuosa), que después se transporta mediante una matriz óptica de fibra hasta un dispositivo de detección térmica de infrarrojos, tal como una cámara sensible a infrarrojos o reproductor de imágenes térmicas. El dispositivo de detección térmica de infrarrojos entonces mide la intensidad de la señal de radiación infrarroja de cuerpo negro desde cada recipiente y convierte la intensidad en temperatura. En una realización más preferida, la radiación de cuerpo negro desde cada matriz acuosa de aceite se detecta directamente por una cámara sensible a infrarrojos o reproductor de imágenes térmicas colocado en proximidad a los volúmenes de reacción de modo que la radiación infrarroja de uno o más volúmenes de reacción se capture simultáneamente en una única imagen de la cámara o el reproductor de imágenes.

En determinados aspectos de la presente divulgación, se toma una medición de temperatura de cada recipiente que contiene una matriz acuosa de aceite cuando ese recipiente está en una posición de control de la temperatura. En algunas realizaciones, la posición de control de la temperatura es la misma posición que la posición de calentamiento. En otras palabras, los dispositivos de detección térmica se colocan en la misma ubicación (por ejemplo, el mismo puesto de recipientes) que las fuentes de radiación electromagnética. En dichas realizaciones, las fuentes de radiación electromagnética y los dispositivos de detección térmica pueden colocarse en varias disposiciones adecuadas. En algunas realizaciones, las fuentes de radiación electromagnética y los dispositivos de detección térmica pueden colocarse en proximidad a la parte superior de los recipientes que contienen las matrices acuosas de aceite. En la figura 2 se representa una realización del presente sistema donde una fuente de radiación electromagnética 201 (por ejemplo, diodo láser o LED) y un detector 202 se colocan por encima del recipiente 101. El detector 202 puede ser un dispositivo de detección térmica de infrarrojos y/o un dispositivo de detección de fluorescencia. En algunas realizaciones, el detector 202 es una combinación del dispositivo de detección térmica de infrarrojos y el subsistema de detección de fluorescencia. Se emite radiación electromagnética desde la fuente de radiación electromagnética 201 hasta el volumen de mezcla de reacción acuosa 104 (línea de puntos) colocado dentro de una matriz acuosa de aceite que comprende un aceite de encapsulación 103 y un aceite transportador 102. En esta realización, la radiación electromagnética, tal como radiación infrarroja, se transporta o conduce a lo largo de una trayectoria óptica por una fibra óptica o tubo de luz 203 y se concentra en el volumen de mezcla de reacción acuosa 104 mediante una lente colimadora 204. Según se eleva la temperatura, el volumen de mezcla de reacción acuosa 104 emite radiación infrarroja de cuerpo negro (línea de puntos) que se transporta hasta un dispositivo de detección térmica de infrarrojos del detector 202 por una fibra óptica 205. En otras realizaciones, la radiación infrarroja de cuerpo negro se transporta hasta un dispositivo de detección térmica de infrarrojos del detector 202 mediante un grupo de fibras ópticas y/o una matriz de fibras ópticas. Sin embargo, si la fuente de radiación electromagnética 201 emite radiación infrarroja, entonces la fuente de radiación electromagnética 201 y el dispositivo de detección térmica de infrarrojos del detector 202 no pueden funcionar simultáneamente sin interferencia de detección térmica. En dicha disposición, la fuente de radiación electromagnética 201 debe inactivarse mientras el dispositivo de detección térmica de infrarrojos del detector 202 está activado. Aún pueden conseguirse mediciones de temperatura casi en tiempo real si el sistema está programado para "hacer oscilar" la fuente de radiación electromagnética 104 y el dispositivo de imágenes térmicas del detector 202. La oscilación es bien conocida en la técnica y comprende una serie rápida y alterna de cortos impulsos de radiación infrarroja seguidos de detección térmica.

En algunas realizaciones, la posición de control de la temperatura es la misma posición, por ejemplo, del puesto de recipientes, que la posición de calentamiento, y las fuentes de radiación electromagnética se colocan en proximidad a la parte inferior del recipiente que contiene las matrices acuosas de aceite mientras los dispositivos de detección térmica están colocados en la parte superior del recipiente que contiene las matrices acuosas de aceite. En la figura 3 se muestra una configuración donde la fuente de radiación electromagnética 309 está colocada en la parte inferior del recipiente, y el detector 307 está colocado en la parte superior del recipiente. Para el control de la temperatura, el detector 307 puede ser, por ejemplo, un detector de infrarrojos o una o más fibras ópticas para proporcionar una trayectoria de radiación térmica hasta un dispositivo de imágenes térmicas de infrarrojos.

En otras realizaciones, la posición de control de la temperatura está en una posición diferente, por ejemplo, del puesto de recipientes, que la posición de calentamiento. En la figura 5 se muestra una configuración donde una fuente de radiación electromagnética 501 está colocada en la parte superior del recipiente 101 cuando está en la posición de calentamiento. En esta configuración, el recipiente 101 se mueve hasta una segunda ubicación del recipiente donde el detector 502 está colocado en la parte superior del recipiente cuando está en la posición de control de la temperatura. El detector 502 puede ser un dispositivo de detección térmica de infrarrojos o un dispositivo de detección de fluorescencia. En algunas realizaciones, el detector 502 es una combinación de un dispositivo de detección térmica de infrarrojos y el subsistema de detección de fluorescencia. Se emite radiación electromagnética desde la fuente de radiación electromagnética 501 hasta el volumen de mezcla de reacción acuosa 104 (línea de puntos) colocado dentro de una matriz acuosa de aceite que comprende un aceite de encapsulación 103 y un aceite transportador 102. En esta realización, la radiación electromagnética, tal como radiación infrarroja, se transporta a lo largo de una trayectoria óptica por una fibra óptica o tubo de luz 503 y se concentra en el volumen de mezcla de reacción acuosa 104 mediante una lente colimadora 504. Después de la etapa de calentamiento, el recipiente 101 se mueve por un dispositivo de colocación, por ejemplo, una cinta motorizada en un dispositivo de seguimiento, hasta el siguiente puesto de recipientes donde un dispositivo de detección térmica de infrarrojos del detector 502 mide la emisión de radiación infrarroja de cuerpo negro desde el volumen de mezcla de reacción acuosa 104. En algunas realizaciones, la radiación infrarroja de cuerpo negro se transporta hasta el sensor térmico de infrarrojos del detector 502 mediante una fibra óptica y/o matriz óptica de fibra 505. En otras realizaciones, la radiación infrarroja de cuerpo negro se transporta hasta el sensor térmico de infrarrojos del detector 502 mediante un grupo de fibras ópticas y/o una matriz óptica de fibra. En otras realizaciones más, la radiación infrarroja de cuerpo negro se detecta directamente por un detector de infrarrojos sin contacto o cámara de imágenes térmicas. En estas disposiciones, las mediciones de temperatura no pueden recogerse simultáneamente con la aplicación de calentamiento fotónico, pero pueden usarse para determinar la temperatura inicial de las matrices acuosas de aceite entre los ciclos de PCR, de modo que el sistema pueda ajustar la cantidad de energía producida necesaria para calentar el volumen de mezcla de reacción acuosa para el siguiente ciclo de PCR, por ejemplo, un microcontrolador. Como alternativa, las mediciones de temperatura pueden usarse para normalizar la emisión de fluorescencia de los fluoróforos sensibles a la temperatura.

Subsistema de detección de fluorescencia

En determinados aspectos, los presentes sistemas y métodos comprenden un subsistema de detección de fluorescencia configurado para emitir y detectar luz de fluorescencia para la detección de una o más sondas marcadas con fluoróforo que han hibridado con una muestra polinucleotídica diana. En algunas realizaciones, el subsistema de detección de fluorescencia comprende una o más fuentes de luz de excitación de fluorescencia, uno o más dispositivos de detección de luz de emisión de fluorescencia y una pluralidad de uno o más miembros ópticos configurados para proporcionar una trayectoria óptica para conducir la luz de excitación de fluorescencia hasta cada recipiente en la posición de detección de productos de PCR y para conducir la luz de emisión de fluorescencia desde cada recipiente hasta el uno o más dispositivos de detección de emisión de luz de fluorescencia. La trayectoria óptica, o la conexión óptica, entre la una o más fuentes de luz de excitación de fluorescencia y el correspondiente recipiente puede comprender una cualquiera de una diversidad de disposiciones ópticas y pueden incluyen una diversidad de ópticas de construcción convencional. Los ejemplos no limitantes de dispositivos de detección de luz de emisión de fluorescencia adecuados para su uso con los presentes sistemas y métodos incluyen, por ejemplo, cámaras de dispositivo acoplado por carga (CCD), cámaras de semiconductor de óxido de metal complementario (CMOS), fotomultiplicadores y matrices detectoras. Además, puede usarse cualquier fuente de luz de excitación de fluorescencia adecuada en el subsistema de detección de fluorescencia e incluyen, pero sin limitación, LED, diodos láser, láseres de iones de argón, lámparas de xenón y similares. La fuente de luz de excitación de fluorescencia puede configurarse para que emita luz de fluorescencia que tiene una longitud de onda espectral adecuada en el intervalo de aproximadamente 300 nm a aproximadamente 1200 nm dependiendo del fluoróforo o fluoróforos particulares usados en la reacción de PCR. Los fluoróforos y otras especies excitables por fluorescencia que tienen una longitud de onda de excitación/emisión particular son bien conocidos y están disponibles en el mercado. Los fluoróforos y tintes y fluorescentes ejemplares adecuados para su uso con el presentes sistema y métodos se proporcionan en la tabla 1.

Tabla 1. Lista no limitante de fluoróforos habitualmente usados.

La disposición particular de las ópticas a lo largo de cada trayectoria óptica puede ajustarse para proporcionar cualquier relación razonable de espaciado deseado para adecuar las consideraciones del diseño. Las ópticas adecuadas para guiar la luz pueden incluir al menos una de las siguientes: una o más fibras ópticas, una matriz óptica de fibra o tubos de luz; una lente, incluyendo una lente condensadora, una lente opuesta, una lente de Fresnel, una lente fotográfica, una lente positiva, una lente de campo o una lente colimadora; un reflector, tal como un espejo o un divisor de haz; un filtro de excitación, tal como un filtro dicroico; y un filtro de emisión. Estas ópticas y otras ópticas útiles son bien conocidas en la técnica y están disponibles en el mercado. Los métodos de montaje de dichas ópticas también son bien conocidos en la técnica. En determinadas realizaciones, la flexibilidad del uso de fibras ópticas permite muchas disposiciones diferentes del presente sistema. El subsistema de detección de fluorescencia proporcionado en este documento está configurado para el control y medición continuo o periódico de la fluorescencia generada por la reacción durante y/o después de los ciclos de temperatura de PCR realizados en cada recipiente que contiene una matriz acuosa de aceite. La posición del recipiente que contiene la matriz acuosa de aceite donde se controla y mide la detección de productos de PCR por el subsistema de detección de productos de PCR a veces se menciona en este documento como "posición de detección de productos de PCR".

En algunas realizaciones, la detección de fluorescencia se produce al final de los ciclos de temperatura de PCR. En una realización preferida, la detección de productos de PCR se produce en tiempo real, donde la fluorescencia se mide después de cada ciclo de temperatura de PCR. En algunas realizaciones, el subsistema de detección de fluorescencia está configurado para detectar la fluorescencia desde cada mezcla de reacción acuosa individual después de cada ciclo de temperatura de PCR individual, y los datos recogidos de las mediciones de PCR pueden analizarse y valorarse por algoritmos informáticos automatizados mediante un sistema de tratamiento de la información del laboratorio (LIMS).

Muchas configuraciones adecuadas para el subsistema de detección de fluorescencia son adecuadas para su uso con el presentes sistema y métodos. En una realización preferidas, la mezcla de reacción acuosa comprende dos sondas de ácido nucleico distintas conjugadas con o unidas covalentemente a un fluoróforo con capacidad de excitación por luz de excitación de fluorescencia que tiene una longitud de onda espectral o intervalo de longitudes de onda espectrales particular, donde cada sonda de ácido nucleico está diseñada para hibridar específicamente con una secuencia de ácido nucleico diana (por ejemplo, polimorfismo) de una muestra polinucleotídica. En dichas realizaciones, una primera sonda de ácido nucleico comprende un primer fluoróforo con capacidad de excitación por luz de excitación de fluorescencia que tiene una primera longitud de onda espectral, y una segunda sonda de ácido nucleico comprende un segundo fluoróforo con capacidad de excitación por luz de excitación de fluorescencia que tiene una segunda longitud de onda espectral. Se entiende que la primera longitud de onda espectral es una longitud de onda diferente a la segunda longitud de onda espectral de modo que la presencia de la primera sonda de ácido nucleico puede distinguirse de la presencia de la segunda sonda de ácido nucleico.

En realizaciones particulares, cada miembro óptico comprende una o más fibras ópticas que pueden proporcionar una trayectoria óptica para luz de excitación de fluorescencia y/o luz de emisión de fluorescencia entre el subsistema de detección de fluorescencia y el volumen de mezcla de reacción acuosa en cada uno de los recipientes cuando el recipiente está en la posición de detección de productos de PCR. En algunas realizaciones, cada miembro óptico comprende un grupo de fibras ópticas. En otras realizaciones, cada miembro óptico comprende una única fibra óptica que puede transportar toda la luz entre cada recipiente y el subsistema de detección de fluorescencia. Por ejemplo, la luz de excitación de fluorescencia y de emisión de fluorescencia podría apilarse sobre una única matriz de fibras ópticas a través de filtros de excitación y filtros de emisión secuenciales (por ejemplo, bloques de filtros dicroicos) con alimentaciones ópticas diagonales para dirigir la emisión de fluorescencias a los dispositivos de detección de luz de emisión de fluorescencia.

En determinadas realizaciones, cada miembro óptico comprende una matriz óptica de fibra diferente para cada longitud de onda de luz de fluorescencia usada en el sistema. En dichas realizaciones, cada matriz óptica de fibra para la detección de fluorescencia contiene una fibra óptica individual en comunicación óptica con cada recipiente que contiene una matriz acuosa de aceite cuando el recipiente está en la posición de detección de productos de PCR, donde cada fibra óptica individual comprende un extremo en cercana proximidad con un recipiente que contiene una matriz acuosa de aceite y el otro extremo en una matriz fuertemente agrupada ordenada con una cara plana presentada a una fuente de luz de excitación de fluorescencia y un dispositivo detector de emisión de luz de fluorescencia. Puede colocarse un filtro de excitación (por ejemplo, filtro dicroico similar a los usados en microscopios de epifluorescencia) en la trayectoria óptica entre la cara de la matriz y la fuente de luz de excitación de fluorescencia, y puede colocarse un filtro de emisión en la trayectoria óptica entre la cara de la matriz y el dispositivo detector de luz de emisión de fluorescencia. En algunas realizaciones, un filtro dicroico o cubo portafiltros comprende tanto el filtro de excitación como el filtro de emisión y se coloca en la trayectoria óptica entre la cara de la matriz óptica de fibra y la fuente de luz de excitación de fluorescencia y el dispositivo detector de luz de emisión de fluorescencia (véase, por ejemplo, la figura 8). En una realización particular, el dispositivo detector de luz de emisión de fluorescencia está configurado para recogerse una imagen en la cara de la matriz óptica de fibra y medir la intensidad de la señal de cada fibra individual.

En otra realización, el subsistema de detección de fluorescencia puede emplear una fuente de luz de excitación de fluorescencia que se proporciona por un láser (por ejemplo, un láser de iones de argón) para que emita luz de excitación de fluorescencia que tiene una longitud de onda espectral que varía de aproximadamente 350 nm a aproximadamente 1100 nm. En esta realización, se usa una pluralidad de miembros ópticos, tales como fibras ópticas, en que cada fibra óptica está en comunicación óptica con el láser y se inserta a través de una lente colocada sobre cada recipiente que contiene una matriz acuosa de aceite cuando está en la posición de detección de productos de PCR para proporcionar una trayectoria óptica para la conducción de luz hasta y desde el recipiente. La luz de excitación de fluorescencia se dirige a través de las fibras ópticas para excitar los fluoróforos en el volumen de mezcla de reacción acuosa. Las emisiones desde el volumen de mezcla de reacción acuosa se envían de vuelta a través de las fibras ópticas hasta un dispositivo detector de luz de emisión de fluorescencia. Sistemas de detección de fluorescencia similares están disponibles en el mercado, tales como los sistemas de detección ABI PRISM® (Applied Biosystems). En esta realización, el láser puede emitir luz de excitación de fluorescencia que tiene una o más longitudes de onda espectrales para la detección de una o más sondas marcadas conjugadas o unidas covalentemente a diferentes fluoróforos que tiene diferentes longitudes de onda de excitación/emisión. Como alternativa, pueden usarse láseres diferentes, que emite cada uno una luz de excitación de fluorescencia que tiene una diferente longitud de onda espectral. En algunas realizaciones, puede usarse una única fibra óptica correspondiente a cada recipiente para dirigir toda la luz de fluorescencia hasta y desde cada recipiente cuando está en la posición de detección de productos de PCR (es decir, se apila luz de fluorescencia de excitación y emisión sobre la única fibra). En dichas realizaciones, pueden usarse filtros de luz de excitación secuenciales (por ejemplo, bloques de filtros dicroicos) con alimentaciones ópticas diagonales para dirigir las emisiones de fluorescencia hasta los dispositivos de detección de luz de emisión de fluorescencia. En otras realizaciones, se usan fibras ópticas diferentes, que pueden estar configuradas como una matriz óptica de fibra, para proporcionar una trayectoria óptica para cada longitud de onda de excitación de fluorescencia usada para la detección.

En una realización, el subsistema de detección de fluorescencia puede emplear una pluralidad de LED o diodos láser para la emisión de luz de excitación de fluorescencia. Como el espacio ocupado de un LED o diodo láser es muy pequeño, podrían integrarse múltiples LED o diodos láser de diferentes longitudes de onda en un único paquete o podrían colocarse muy cercanamente múltiples LED/diodos láser empaquetados para excitar un único recipiente que contiene una matriz acuosa de aceite cuando está en la posición de detección de productos de PCR. En dicha realización, los LED/diodos láser puede colocarse en uno o más puestos de recipientes directamente por debajo de los recipientes cuando los recipientes están en la posición de detección de productos de PCR. Los sistemas de detección de fluorescencia que tienen dicha configuración también se encuentran en la bibliografía de patentes, por ejemplo, patente de Estados Unidos n.° 7 122799. En otras realizaciones, la luz de excitación de fluorescencia generada por los LED/diodos láser puede dirigirse a los recipientes por una pluralidad de fibras ópticas, donde cada fibra óptica se inserta a través de una lente (por ejemplo, lente colimadora) y se coloca en la parte superior o inferior de un recipiente cuando el recipiente está en la posición de detección de PCR.

En otra realización, un subsistema de detección de fluorescencia puede emplear una pluralidad de LED o diodos láser para la generación de luz de excitación de fluorescencia, donde una o más matrices ópticas de fibra para la detección de fluorescencia proporcionan una trayectoria óptica para la luz de fluorescencia de excitación y emisión. En una realización particular, el subsistema de detección de fluorescencia está configurado para controlar y medir la fluorescencia de dos sondas de ácido nucleico, cada una de las cuales está unida covalentemente a un fluoróforo diferente (por ejemplo, VIC o FAM). En algunas realizaciones, la luz de fluorescencia de excitación y emisión adecuada para la excitación de ambas sondas de ácido nucleico se apila sobre una única matriz de fibras a través de filtros secuenciales de excitación/emisión, por ejemplo, bloques de filtros dicroicos, con alimentaciones óptica diagonales para los dispositivos de detección de luz de emisión de fluorescencia, por ejemplo, detectores de imágenes de emisión o cámaras CCD. Como alternativa, se usan dos matrices ópticas de fibra, en que cada matriz óptica de fibra proporciona una trayectoria óptica para luz de fluorescencia de excitación y emisión adecuada para la excitación de una de las sondas de ácido nucleico (véase, por ejemplo, la figura 8). En dicha realización, cada matriz óptica de fibra comprende una pluralidad de fibras ópticas, donde cada fibra óptica está en comunicación óptica con un recipiente que contiene una matriz acuosa de aceite cuando el recipiente está en la posición de detección de productos de PCR. Un extremo de cada fibra óptica individual puede colocarse sobre la parte superior del recipiente o la parte inferior del recipiente dependiendo del diseño particular y las necesidades de espacio. El otro extremo de cada fibra óptica individual se dispone dentro de una matriz óptica de fibras fuertemente agrupadas y ordenadas con una cara plana en comunicación óptica tanto con una fuente de luz de excitación de fluorescencia (por ejemplo, un LED o diodo láser) como con un dispositivo detector de emisión de fluorescencia (por ejemplo, una cámara CCD de un solo color). Puede colocarse un filtro de excitación y/o emisión, tal como un filtro dicroico, dentro de la trayectoria óptica y en comunicación óptica con la cara de la matriz óptica de fibra y la fuente apropiada de luz de excitación de fluorescencia y/o el dispositivo detector de emisión de fluorescencia (véase, por ejemplo, la figura 8). El dispositivo detector de emisión de fluorescencia recoge la imagen de la cara de la matriz óptica de fibra y mide la intensidad de la señal de cada fibra individual examinando las regiones de interés en la imagen.

En algunas realizaciones, se proporciona un subsistema de detección que comprende tanto un dispositivo de imágenes térmicas de infrarrojos y el subsistema de detección de fluorescencia. Dicha disposición puede utilizar una única fibra óptica para transportar toda la luz, es decir, la radiación infrarroja de cuerpo negro y la luz de excitación y emisión de fluorescencia entre todos los detectores (es decir, el dispositivo de detección térmica de infrarrojos y el uno o más detectores de luz de emisión de fluorescencia) y un recipiente que contiene una matriz acuosa de aceite. En otras realizaciones, se usan matrices ópticas de fibra diferentes para la detección térmica y cada longitud de onda de luz de excitación de fluorescencia.

En determinados aspectos de la presente divulgación, se toma una medición de fluorescencia de cada recipiente que contiene una matriz acuosa de aceite cuando ese recipiente está en una posición de detección de productos de PCR. En algunas realizaciones, la posición de detección de productos de PCR está en las mismas ubicaciones, por ejemplo, mismos puestos de recipientes, que la posición de calentamiento y la posición de control de la temperatura. En algunas realizaciones, las fuentes de radiación electromagnética y los dispositivos de detección térmica pueden colocarse en y/o en comunicación óptica con la parte superior de los recipientes que contienen las matrices acuosas de aceite. En la figura 2 se representa una realización del presente sistema donde una fuente de radiación electromagnética 201 (por ejemplo, diodo láser o LED) y un detector 202 se colocan en y/o en comunicación óptica con la parte superior del recipiente 101.

En una realización, el detector 202 es una combinación del dispositivo de detección térmica de infrarrojos y el subsistema de detección de fluorescencia. Se emite radiación electromagnética desde la fuente de radiación electromagnética 201 hasta el volumen de mezcla de reacción acuosa 104 (línea de puntos) colocado dentro de una matriz acuosa de aceite que comprende un aceite de encapsulación 103 y un aceite transportador 102. En esta realización, la radiación electromagnética, tal como radiación infrarroja, se transporta a lo largo de una trayectoria óptica por una fibra óptica o tubo de luz 203 y se concentra en el volumen de mezcla de reacción acuosa 104 mediante una lente colimadora 204. Según se eleva la temperatura, el volumen de mezcla de reacción acuosa 104 emite radiación infrarroja de cuerpo negro (línea de puntos) que se transporta hasta el dispositivo de detección térmica de infrarrojos del detector 202 por una o más fibras ópticas 205. Después de completarse las etapas de calentamiento y de control de la temperatura, tanto la fuente de radiación electromagnética 201 como el dispositivo de detección térmica de infrarrojos del detector 202 se desconectan para permitir la detección de fluorescencia. La luz de excitación de fluorescencia se transporta desde el subsistema de detección de fluorescencia del detector 202 a lo largo de la una o más fibras ópticas 205 y se concentra por la lente 204 sobre el volumen de mezcla de reacción acuosa 104. T ras la absorción de la luz de fluorescencia que tiene la longitud de onda apropiada, un fluoróforo unido covalentemente a una sonda de ácido nucleico emite fluorescencia que se recoge y conduce por la una o más fibras ópticas 205 hasta un dispositivo detector de luz de emisión de fluorescencia del detector 202. En algunas realizaciones, la luz de excitación de fluorescencia que tiene dos longitudes de onda diferentes se transporta entre el subsistema de detección de fluorescencia y el volumen de reacción acuosa 104 por una única fibra óptica 205. En otras realizaciones, la luz de excitación de fluorescencia que tiene dos longitudes de onda diferentes se transporta entre el subsistema de detección de fluorescencia y el volumen de reacción acuosa 104 mediante un grupo de fibras ópticas y/o una o dos matrices de fibra óptica.

En otras realizaciones, la posición de detección de productos de PCR está en una ubicación diferente, por ejemplo, del puesto de recipientes, que la posición de calentamiento. En la figura 5 se muestra una configuración donde una fuente de radiación electromagnética 501 está colocada en la parte superior del recipiente 101 cuando está en la posición de calentamiento. Después de la etapa de calentamiento, el recipiente 101 se mueve por el dispositivo de colocación hasta el siguiente puesto de recipientes donde el detector 502 está colocado en la parte superior del recipiente 101 cuando está en la posición de detección de PCR. La luz de excitación de fluorescencia se transporta desde el subsistema de detección de fluorescencia del detector 502 a lo largo de la una o más fibras ópticas 505 y se concentra por la lente 506 sobre el volumen de mezcla de reacción acuosa 104. Tras la absorción de la luz de fluorescencia que tiene la longitud de onda apropiada, un fluoróforo unido covalentemente a una sonda de ácido nucleico emite fluorescencia (línea de puntos) que se recoge y conduce por la una o más fibras ópticas 505 hasta un dispositivo detector de luz de emisión de fluorescencia del detector 502. En algunas realizaciones, la luz de excitación de fluorescencia que tiene dos longitudes de onda diferentes se transporta entre el subsistema de detección de fluorescencia y el volumen de reacción acuosa 104 por una única fibra óptica 505. En otras realizaciones, la luz de excitación de fluorescencia que tiene dos longitudes de onda diferentes se transporta entre el subsistema de detección de fluorescencia y el volumen de reacción acuosa 104 mediante un grupo de fibras ópticas y/o una o dos matrices de fibra óptica.

Realizaciones que comprenden subsistemas integrados con una configuración de cinta transportadora

En algunas realizaciones, los presentes sistemas y métodos comprenden una combinación de subsistemas para proporcionar calentamiento fotónico accionado por luz, de reacción en reacción; control de la temperatura de reacción en reacción; y detección de fluorescencia de productos de PCR para amplificación por PCR y detección de productos. En algunos aspectos, los presentes sistemas y métodos comprenden además un dispositivo de colocación configurado para mover un conjunto de matrices acuosas de aceite en etapas individuales a través de una pluralidad de puestos de recipientes, donde los puestos de recipientes pueden incluir uno o más de los subsistemas. En una realización preferida, el dispositivo de colocación comprende una cinta flexible, tal como la cinta 402 representada en las figuras 4A y 4B. En esta realización, la cinta 402 comprende un material flexible (por ejemplo, un polímero termoplástico) que forma una estructura de lazo alrededor de dos o más engranajes transmisores 401, y donde una pluralidad de recipientes 404 está incrustada en la cinta 402. Los engranajes transmisores 401 rotan y causan que la cinta 402 mueva los recipientes 404 desde un puesto de recipientes hasta otro puesto de recipientes. Los sistemas mecánicos, electrónicos e informáticos que controlan el movimiento del engranaje transmisor se describen en detalle en otra parte de este documento.

En las figuras 6A-6C se representa una realización de un subsistema de calentamiento fotónico 600 que comprende una pluralidad de fuentes de radiación electromagnética 602 y una cinta 402 como dispositivo de colocación para mover los recipientes 404 desde un puesto de recipientes hasta otro puesto de recipientes. La cantidad de fuentes de radiación electromagnética 602 puede variar dependiendo del espaciado y los parámetros del diseño. Además, el tamaño de las fuentes de radiación electromagnética y la circuitería asociada y/o cableado determinarán la configuración espacial particular. Aunque sin intención de limitación alguna, el subsistema de calentamiento fotónico 600 incluye 504 fuentes independientes de radiación electromagnética 602 y una cinta 402, donde los recipientes 404 están dispuestos en filas de 12 recipientes por fila a un espaciado de 9 mm para adecuarse a las normas internacionales para el espaciado de pocillos.

Para reducir el espacio ocupado del subsistema de calentamiento fotónico 600, las fuentes de radiación electromagnética 602 se apilan de forma vertical en 42 módulos 601 colocados a un lado de la cinta 402, con 12 fuentes de radiación electromagnética 602 en cada apilamiento vertical (véanse las figuras 6A y 6B). Para proporcionar calor fotónico directamente a cada recipiente 404 que contiene una matriz acuosa de aceite, el subsistema de calentamiento fotónico 600 está configurado además de modo que la disposición de las fuentes de radiación electromagnética 602 corresponde con la configuración de los recipientes 404 en la cinta 402. Por tanto, cada fuente de radiación electromagnética 602 está en comunicación óptica con una fibra óptica o tubo de luz 602, proporcionando cada fibra óptica o tubo de luz 603 una trayectoria óptica para guiar la radiación electromagnética emitida hasta un recipiente correspondiente 404 cuando ese recipiente está en la posición de calentamiento. Esta configuración facilita conexiones fáciles a la circuitería y otro tipo de cableado.

El extremo de cada fibra óptica o tubo de luz 603 que está proximal al recipiente correspondiente 404 termina en una lente configurada para concentrar el haz de radiación electromagnética sobre el volumen de mezcla de reacción acuosa o material excitable por plasmones dependiendo de la longitud de onda particular de la radiación electromagnética que se está usando. Por ejemplo, cuando se usa radiación infrarroja, el haz se concentra sobre el volumen de mezcla de reacción acuosa y se absorbe por las moléculas de agua para calentar la mezcla de reacción acuosa. Como alternativa, si se usa luz visible, tal como luz azul, luz violeta o luz ultravioleta, el haz se concentra sobre un material excitable por plasmones, tal como disco de Mylar o de papel de aluminio con capa de oro, para convertir la energía lumínica en energía calórica. Con esta configuración, hay 42 apilamientos de fuentes de radiación electromagnética 602 para proporcionar 42 posiciones de calentamiento por ciclo de temperatura de PCR o, como alternativa, dos posiciones de calentamiento por "inicio caliente" seguido de 40 posiciones de calentamiento por ciclo de temperatura de PCR. Como se muestra en la figura 6B, cada módulo 601 está colocado adyacente a todas las otras filas de recipientes 404 para acomodar una posición de refrigeración y de detección de fluorescencia entre cada ciclo de temperatura de PCR. Los recipientes 404 se refrigeran por un miembro de refrigeración activa o pasiva 403, tal como un metal de pozo de calor pasivo, colocado bajo el lado inferior del lazo de cinta 402.

En algunas realizaciones, cada fuente de radiación electromagnética 602 funciona a una potencia en vatios fija y constante, donde cada fuente de radiación electromagnética 602 puede activarse durante un periodo de tiempo específico, bajo control programable por ordenador, para proporcionar la cantidad deseada de energía necesaria para calentar cada mezcla de reacción acuosa a través de un ciclo de temperatura de PCR. En otras realizaciones, la potencia en vatios de las fuentes de radiación electromagnética 602 puede variarse.

La figura 6A representa una vista frontal del subsistema de calentamiento fotónico 600 y la cinta 402, donde las fuentes de radiación electromagnética 602 se apilan de forma vertical en el módulo 601, con 12 fuentes de radiación electromagnética 602 en cada apilamiento vertical. Cada fibra óptica y tubo de luz 603 se extiende desde la correspondiente fuente de radiación electromagnética 602 hasta la parte superior del correspondiente recipiente 404 de la cinta 402.

La figura 6C representa una vista superior del subsistema de calentamiento fotónico 600 y la cinta 402. Cada fuente de radiación electromagnética 602 está conectada electrónicamente a la bahía electrónica 604.

En algunas realizaciones, los recipientes 404 se recubren con un material excitable por plasmones tal como oro para maximizar la conversión de luz (por ejemplo, luz ultravioleta, violeta o azul) en calor. En otras realizaciones, se dispone un disco de Mylar o de papel aluminio con capa de oro dentro de cada recipiente 404 para maximizar la conversión de luz (por ejemplo, luz ultravioleta, violeta o azul) en calor.

Un aspecto de esta divulgación es proporcionar datos de PCR cuantitativa en tiempo real midiendo la fluorescencia después de cada ciclo de temperatura de PCR. La figura 7 representa una vista lateral que ilustra una realización del sistema de amplificación por PCR y de detección de productos. En esta configuración, las matrices ópticas de fibra 701 trasladan la luz entre los recipientes de la cinta 402 y un conjunto de detectores de luz 708, que incluyen detectores de luz de emisión de fluorescencia y un dispositivo de detección térmica de infrarrojos. El uso de matrices ópticas de fibra 701 permite la comunicación óptica entre los detectores y los recipientes propagados sobre un área amplia. Por ejemplo, el uso de matrices ópticas de fibra 701 proporciona el traslado de luz entre recipientes propagados sobre un área de 100 mm por 900 mm y un pequeño conjunto ordenado de puntas de fibra que ocupa un área de únicamente 10 mm por 15 mm, o más pequeña. Las matrices ópticas de fibra están disponibles en el mercado y a menudo se usan para condensar señales ópticas desde pocillos de placas de microvaloración para una formación eficaz de imágenes por cámaras CCD, tal como se describe en FiberGuide Industries, "White Paper: 2D Arrays" (disponible en el sitio web de FiberGuide Industries).

Como se ilustra en la realización ejemplar de la figura 7, hay 42 apilamientos de fuentes de radiación electromagnética 602 para proporcionar dos posiciones de calentamiento de "inicio caliente" (indicadas por "D") seguidas de 40 posiciones de calentamiento por ciclo de temperatura de PCR. Como se muestra en la figura 7, cada módulo 601 está colocado adyacente a todas las otras filas de recipientes en la cinta 402 para acomodar una posición de control de la temperatura y/o una posición de refrigeración y de detección de fluorescencia entre cada ciclo de temperatura de PCR. Los recipientes se refrigeran por un miembro de refrigeración activa o pasiva 403, tal como un metal de pozo de calor pasivo, colocado bajo el lado inferior del lazo de la cinta 402. Como se ilustra en la figura 7, las matrices ópticas de fibra 701 proporcionan una trayectoria óptica hasta los detectores de luz 708 desde cada recipiente de la cinta 402 cuando ese recipiente está en la posición de detección de productos de PCR y la posición de control de la temperatura. En esta realización, los detectores de luz 708 incluyen dos cámaras CCD 706, 710 como detectores de luz de emisión de fluorescencia y un reproductor de imágenes térmicas 704 como dispositivo de detección térmica de infrarrojos. Con fines ilustrativos únicamente, se incluyen dos fuentes de luz de excitación de fluorescencia 705, 707 de diferentes longitudes de onda espectrales.

Las matrices ópticas de fibra 701 incluyen tres matrices ópticas de fibra diferentes 714, 715, 716, cada una en un grupo fuertemente ordenado en un extremo conectado a las placas de matriz óptica de fibra 713, 712, 709, respectivamente. Dos de las matrices ópticas de fibra 715, 716 conducen luz de excitación/emisión de fluorescencia para la detección de fluorescencia, mientras que la tercera matriz óptica de fibra 714 conduce radiación infrarroja de cuerpo negro para el control de la temperatura. Además, cada matriz óptica de fibra 715, 716 para la detección de fluorescencia en esta realización ejemplar comprende 480 fibras ópticas individual con un extremo de cada fibra colocado sobre un recipiente cuando ese recipiente está en la posición de detección de productos de PCR. La matriz óptica de fibra 714 para el control de la temperatura en esta realización ejemplar comprende 504 fibras ópticas individual con un extremo de cada fibra óptica colocado sobre un recipiente cuando ese recipiente está en la posición de control de la temperatura. La primera posición de control de la temperatura proporciona una lectura de temperatura inicial para una fila de recipientes (indicada como "I") antes de que empiece el proceso de calentamiento. Las dos siguientes posiciones de control de la temperatura proporcionan lecturas de temperatura durante el proceso de inicio caliente. Las posiciones de control de la temperatura restantes están en los mismos puestos de recipientes que los metales de pozo de calor pasivos 403 y las posiciones de detección de PCR.

Para la detección de fluorescencia, la fuente de luz de excitación 707 emite luz de excitación de fluorescencia a través de un cubo portafiltros dicroicos 702 hasta una placa de matriz óptica de fibra 709 conectada de forma óptica a una matriz agrupada fuertemente ordenada configurada para proporcionar una trayectoria óptica a lo largo de la matriz óptica de fibra 716 hasta cada recipiente cuando ese recipiente está en la posición de detección de productos de PCR. Además, la luz de emisión de fluorescencia desde el volumen de mezcla de reacción acuosa se conduce desde el recipiente a lo largo de la matriz óptica de fibra 716 hasta la placa de matriz óptica de fibra 709. La placa de matriz óptica de fibra 709 produce una serie de imágenes en su frente por condensación de las señales ópticas de la luz de emisión de fluorescencia, y la cámara CCD 706 recoge la imagen y mide la intensidad de la señal de cada fibra individual en la imagen. Además, la fuente de luz de excitación 705 emite luz de excitación de fluorescencia a través de un cubo portafiltros dicroicos 711 hasta una placa de matriz óptica de fibra 712 conectada de forma óptica a una matriz agrupada fuertemente ordenada configurada para proporcionar una trayectoria óptica a lo largo de la matriz óptica de fibra 715 hasta cada recipiente cuando ese recipiente está en la posición de detección de productos de PCR. Además, la luz de emisión de fluorescencia desde el volumen de mezcla de reacción acuosa se conduce desde el recipiente a lo largo de la matriz óptica de fibra 715 hasta la placa de matriz óptica de fibra 712. La placa de matriz óptica de fibra 712 produce una serie de imágenes en su frente por condensación de las señales ópticas de la luz de emisión de fluorescencia, y la cámara CCD 710 recoge la imagen y mide la intensidad de la señal de cada fibra individual en la imagen.

Para el control de la temperatura, la radiación infrarroja de cuerpo negro emitida desde cada matriz acuosa de aceite en la fase de inicio "I", después de cada "inicio caliente" "D", y durante cada etapa de detección de productos de PCR se conduce a lo largo de la matriz óptica de fibra 714 hasta una placa óptica de fibra 713. La imagen de infrarrojos en el frente de la placa óptica de fibra 713 se mide por el reproductor de imágenes térmicas 704, que mide la intensidad de la señal para cada recipiente y convierte la intensidad en temperatura. En algunas realizaciones, se coloca un filtro de radiación infrarroja 703 entre el frente de la placa óptica de fibra 713 y el reproductor de imágenes térmicas 704.

En otra realización, el sistema de amplificación por PCR y de detección de productos comprende además un subsistema de ensamblaje configurado para el ensamblaje programable y automatizado de conjuntos de matrices acuosas de aceite. En la figura 8 se representa una vista lateral de una realización del sistema de amplificación por PCR y de detección de productos. En esta realización, se proporciona un subsistema de ensamblaje que comprende miembros de descarga de líquidos 801,802, 803, 804. En algunas realizaciones, el miembro de descarga de líquidos 801 es un dispensador en masa de 12 puntas configurado para distribuir aceite transportador, el miembro de descarga de líquidos 802 es un dispensador en masa de 12 puntas configurado para distribuir aceite de encapsulación, el miembro de descarga de líquidos 803 es una pipeta automatizada (por ejemplo, un cabeza de pipeteo fijo con 12 puntas) configurada para distribuir un volumen acuoso que comprende muestras polinucleotídicas, y el miembro de descarga de líquidos 804 es una pipeta automatizada (por ejemplo, un cabezal de pipeteo sin contacto de una sola punta) configurada para distribuir un volumen acuoso que comprende reactivos de PCR, cebadores y/o sondas.

En la figura 9 se representa una vista lateral de una realización del sistema de amplificación por PCR y de detección de productos. En el subsistema de ensamblaje de la figura 9, un control del sistema causa que la cinta 402 mueva una fila de 12 recipientes a una posición de ensamblaje. Basándose en las señales desde cada módulo operativo y el tiempo necesario para completar la etapa de calentamiento de PCR más lenta en la cinta 402, la cinta 402 avanza una etapa (9 mm) cuando se completan todas las operaciones que se producen simultáneamente en todos los puestos de recipientes en la cinta 402. Por ejemplo, en una realización, el ciclo de temperatura de PCR con la duración más larga es de aproximadamente 15 segundos. Por lo tanto, los procesos que se producen no tardan más de aproximadamente 15 segundos en completar cada proceso antes de que la cinta se programe para moverse a la siguiente etapa. En la primera posición de ensamblaje, una pipeta en masa de 12 puntas 801 aspira aceite transportador desde una entrada de aceite transportador y distribuye el aceite transportador en la fila de recipientes. La cinta 402 mueve la fila de recipientes a la siguiente posición de ensamblaje donde una pipeta en masa de 12 puntas 802 aspira aceite de encapsulación de una entrada de aceite de encapsulación y distribuye el aceite de encapsulación en la fila de recipientes. La cinta 402 mueve la fila de recipientes a la siguiente posición de ensamblaje, donde cabezales de pipeteo fijos 803 aspiran un volumen acuoso que contiene la muestra polinucleotídica apropiada de, por ejemplo, una placa de entrada que comprende un código de barras. El puesto de ensamblaje puede comprender un lector de código de barras configurado para leer el código de barras y acceder a, por ejemplo, el programa informático LIMS para identificar la muestra polinucleotídica y para determinar los cebadores y sondas apropiados para su uso con cada muestra polinucleotídica particular. El sistema de control entonces causa que los cabezales de pipeteo fijos 803 distribuyan la muestra polinucleotídica en tantos recipientes como sea necesario para acomodar la cantidad de reacciones de cebador/sonsa a ejecutar. En algunos casos, la cantidad de ejecuciones requerirá múltiples filas de recipientes. Los cabezales de pipeteo fijos 803 tardan aproximadamente 15 segundos, o menos, dependiendo de la cronología de los ciclos de temperatura de PCR, en realizar la etapa de distribución para cada fila. Además, los cabezales de pipeteo fijos 803 pueden estar configurados para cambios de punta automatizados o manuales para evitar la contaminación o, como alternativa, los cabezales de pipeteo fijos 803 pueden estar configurados para un lavado de puntas automatizado.

La cinta 402 entonces mueve la fila de recipientes hasta la posición de ensamblaje final, donde un cabezal de pipeteo sin contacto 804, de una sola punta, aspira un volumen acuoso que contiene la mezcla de reacción de PCR, los cebadores y las sondas apropiados en una cantidad suficiente para ensayar todas las muestras polinucleotídicas con esa mezcla de reacción de Pc R, cebadores y sondas particulares. El subpuesto de ensamblaje entonces causa que el cabezal de pipeteo sin contacto 804, de una sola punta, distribuya la mezcla de reacción de PCR, los cebadores y las sondas a la fila de recipientes que contienen la muestra polinucleotídica apropiada. La información necesaria para identificar la mezcla de reacción de PCR, los cebadores y las sondas apropiados para una reacción de genotipado por PCR particular puede proporcionarse desde un LIMS. En dicho caso, las listas cargadas de consultas simples podrían proporcionar al programa informático de ensamblaje la información necesaria desde el LIMS. En la técnica se conocen configuraciones similares de soportes físicos y programas informáticos adecuadas para su uso con el presente sistema. Como con todos los demás procesos que se producen en un puesto de recipientes dado, la etapa de distribución de la mezcla de reacción de PCR, los cebadores y las sondas tarda aproximadamente 15 segundos en completarse.

Después del ensamblaje de las reacciones en la fila de recipientes, la cinta 402 mueve la fila al siguiente puesto de recipientes donde, opcionalmente, puede tomarse una medición de temperatura inicial "I" para proporcionar esta información al programa informático de control del sistema para determinar la cantidad de energía producida requerida para la desnaturalización de inicio caliente de las muestras polinucleotídicas en cada mezcla de reacción acuosa. En esta posición de recipientes, se coloca una fibra óptica desde la matriz óptica de fibra 714 por encima de cada pocillo y conduce la radiación infrarroja de cuerpo negro emitida por cada matriz acuosa de aceite en este puesto de recipientes hasta la placa de matriz óptica de fibra 713, que condensa las señales ópticas para la formación de imágenes por el reproductor de imágenes térmicas 704. El reproductor de imágenes térmicas 704 convierte la intensidad de la señal en información de temperatura que se usa por el programa informático de control del sistema para ajustar la duración de los impulsos de las fuentes de radiación electromagnética 602 cuando los recipientes se mueven hacia delante hasta la primera posición de calentamiento de inicio caliente "D". En esta realización, dos posiciones de inicio caliente están cada una seguidos de una posición de control de la temperatura. El programa informático de control del sistema causa que la cinta 402 mueva la fila de recipientes al siguiente puesto de recipientes, que es la primera posición de calentamiento de inicio caliente "D". En esta realización, cada fuente de radiación electromagnética 602 es un diodo láser que emite radiación infrarroja. Por tanto, los diodos láser 602 emiten radiación infrarroja a través de tubos de luz 603, donde el extremo de cada tubo de luz 603 está colocado en la parte superior de cada recipiente en la fila para aplicar radiación infrarroja al volumen de mezcla de reacción acuosa contenido en el mismo. Preferiblemente, la temperatura de cada volumen de mezcla de reacción acuosa se eleva hasta aproximadamente 90 °C a aproximadamente 99 °C, mucho más preferiblemente hasta aproximadamente 95 °C, para desnaturalizar las muestras polinucleotídicas en cada volumen de mezcla de reacción acuosa. Después de la primera etapa de calentamiento de inicio caliente, el programa informático de control causa que la cinta mueva la fila de recipientes hasta el siguiente puesto de recipientes, que es una posición de control de la temperatura. Una posición de calentamiento de inicio caliente inicial "D" se incluye en caso de que la desnaturalización de inicio caliente necesaria requiera más de 15 segundos.

Después de la segunda etapa de calentamiento de inicio caliente, la cinta 404 mueve la fila de recipientes hasta el siguiente puesto de recipientes, que es una posición de refrigeración y una posición de control de la temperatura. La posición de refrigeración comprende metal de pozo de calor pasivo 403 colocado de forma próxima por debajo del lado superior de la cinta 404 como se muestra en la figura 9. Según los bloques de metal de pozo de calor pasivo 403 entran en contacto con el fondo de los recipientes, el calor se transfiere desde la matriz acuosa de aceite a través de los recipientes y a los bloques de metal de pozo de calor 403 para refrigerar las matrices acuosas de aceite en la fila. Preferiblemente, la temperatura de las matrices acuosas de aceite se disminuye hasta aproximadamente 60 °C. En este puesto de recipientes, la temperatura de cada matriz acuosa de aceite se mide mediante el reproductor de imágenes térmicas 704.

Después, el sistema de control causa que la cinta 402 mueva la fila de recipientes hasta el siguiente puesto de recipientes para empezar el termociclado de PCR. Los diodos láser 602 emiten radiación infrarroja al volumen de mezcla de reacción acuosa en cada recipiente en la fila, elevando de ese modo la temperatura del volumen de mezcla de reacción acuosa. Además, el programa informático de control del sistema posibilita condiciones de PCR específicas de marcador causando que los diodos láser emitan energía de radiación infrarroja y con duración de impulso apropiados para elevar la temperatura del volumen de mezcla de reacción acuosa hasta la temperatura de hibridación y la temperatura de elongación apropiadas. Después de completarse la etapa de calentamiento, el sistema de control causa que la cinta 402 mueva la fila de recipientes a la posición de refrigeración, la posición de detección de productos de PCR y la posición de control de la temperatura en el siguiente puesto de recipientes. En la posición de refrigeración, la posición de detección de productos de PCR y la posición de control de la temperatura en el siguiente puesto de recipientes. En la posición de refrigeración, se transfiere calor desde cada matriz acuosa de aceite en la fila hasta el pozo de calor de metal pasivo 403, reduciendo de ese modo la temperatura de la matriz acuosa de aceite. Se emite luz de excitación de fluorescencia que tiene longitudes de onda espectrales adecuadas para la excitación de los fluoróforos presentes en la mezcla de reacción de PCR (por ejemplo, VIC y FAM) desde las fuentes de luz de excitación de fluorescencia 705, 707 a través de las matrices ópticas de fibra 715, 716 y hasta la mezcla de reacción acuosa de cada recipiente en la fila. La luz de emisión de fluorescencia de los recipientes se conduce de vuelta a través de las matrices ópticas de fibra 715, 716 hasta las cámaras CCD 710, 706, que convierten la intensidad de la señal óptica en señales de fluorescencia sin procesar para su procesamiento por el programa informático de control del sistema. En esta posición de recipientes, se coloca una fibra óptica desde la matriz óptica de fibra 714 por encima de cada pocillo y conduce la radiación infrarroja de cuerpo negro emitida por cada matriz acuosa de aceite en este puesto de recipientes hasta la placa de matriz óptica de fibra 713, que condensa las señales ópticas para la formación de imágenes por el reproductor de imágenes térmicas 704. El reproductor de imágenes térmicas 704 convierte la intensidad de la señal en información de temperatura que se usa por el programa informático de control del sistema para ajustar la duración de los impulsos de las fuentes de radiación electromagnética cuando los recipientes se mueven hacia delante hasta la posición de calentamiento. Este proceso se repite hasta 40 o más ciclos de temperatura de PCR.

En algunas realizaciones, los cubos portafiltros dicroicos 702, 711 y el filtro de emisión de infrarrojos 703 posibilita que las mediciones de temperatura y las mediciones de fluorescencia se produzcan simultáneamente evitando la interferencia por las diferentes longitudes de onda espectrales. En otras realizaciones, las mediciones de temperatura y las mediciones de fluorescencia se realizan secuencialmente dentro del periodo disponible. El control de la temperatura después de la etapa de calentamiento es útil para proporcionar al programa informático de control del sistema la información de temperatura necesaria para determinar la energía producida apropiada requerida para la siguiente etapa de calentamiento. En algunas realizaciones que comprenden una etapa de control de la temperatura después de la etapa de calentamiento fotónico, la retroalimentación dinámica de la temperatura durante las etapas de calentamiento no es posible debido a la rápida disipación del calor. Por ejemplo, en algunas realizaciones, los volúmenes de mezcla de reacción acuosa disipan el calor rápidamente y muestran una disminución en la temperatura de aproximadamente 20 °C por segundo cuando se retira la fuente de calentamiento. Por lo tanto, en algunas realizaciones, las posiciones de calentamiento comprenden aislamiento para disminuir la pérdida de calor. En otras realizaciones, el control de la temperatura en la posición de detección de productos de PCR se usa por el programa informático de control del sistema para normalizar los datos de fluorescencia sin procesar, porque se sabe en la técnica que la luz de fluorescencia que tiene determinadas longitudes de onda espectrales puede verse afectada por la temperatura. Sin embargo, realizaciones que comprenden un mecanismo de refrigeración en la posición de detección de productos de PCR disminuyen la temperatura de la mezcla de reacción acuosa para permitir que se tomen todas las mediciones de fluorescencia a aproximadamente la misma temperatura.

Como alternativa, la retroalimentación dinámica de la temperatura durante las etapas de calentamiento fotónico puede realizarse colocando los diodos láser y los detectores térmicos en la misma posición. Sin embargo, como se analiza anteriormente, las imágenes térmicas no pueden realizarse simultáneamente con el calentamiento si las fuentes de radiación electromagnética emiten radiación infrarroja significativa en la misma banda de infrarrojos usada para calentar los volúmenes de mezcla de reacción acuosa salvo que se use un proceso de "oscilación" (es decir, alternancia rápida de la emisión de la fuente de calentamiento infrarrojo y la detección de la emisión infrarroja de cuerpo negro). En algunas realizaciones, se usa un termopar o un termistor en lugar de imágenes térmicas, lo que posibilita que el control de la temperatura se realice simultáneamente con la radiación infrarroja, posibilitando la retroalimentación dinámica de la temperatura durante el calentamiento fotónico.

En la figura 9 también se representa un subsistema de eliminación de desechos que comprende los aspiradores 901,903, un dispensador en masa 902, un separador de aceite 905 y una lámpara ultravioleta 904. Después de que las matrices acuosas de aceite se hayan movido a través de todas las posiciones de calentamiento, las posiciones de control de la temperatura y las posiciones de detección de productos de PCR, las matrices acuosas de aceite pueden recitarse de los recipientes y descartarse. El sistema de control causa que la cinta 402 mueva la fila de recipientes desde el puesto de recipientes que comprende la posición final de detección de productos de PCR hasta el aspirador 901. En una realización preferida, el aspirador 901 es un cabezal de pipeteo de 12 posiciones. El aspirador 901 aspira toda la matriz acuosa de aceite de cada recipiente de la fila y pasa la matriz acuosa de aceite a los desechos. En algunas realizaciones, la matriz acuosa de aceite se pasa a través de un sistema de tubos que eliminaría la necesidad de mover los aspiradores 901 hasta la ubicación de desechos. El sistema de control entonces causa que la cinta 402 mueva la fila de recipientes hasta el dispensador en masa 902, que distribuye agua o aceite limpio en cada recipiente de la fila. A continuación, el sistema de control causa que la cinta 402 mueva la fila de recipientes hasta los aspiradores 903, que aspira el aceite o el agua de cada recipiente de la fila. Como se muestra en la figura 9, una realización puede comprender un separador de aceite 905 en que el aceite transportador y de encapsulación se retiran y reutilizan en el subsistema de ensamblaje. Después de la segunda aspiración, el sistema de control causa que la cinta 402 mueva los pocillos al lado inferior del lazo de cinta, donde una lámpara ultravioleta 904 emite radiación ultravioleta para destruir cualquier polinucleótido restante en los recipientes para evitar la contaminación de polinucleótidos de las posteriores reacciones de PCR.

En la figura 10 se representa una disposición preferida de la posición de calentamiento fotónico, la posición de control de la temperatura y la posición de detección de productos de PCR del sistema de amplificación por PCR y de detección de productos. En esta realización, la cinta, el subsistema de ensamblaje y el subsistema de eliminación de desechos se disponen como se muestra en la figura 9. En la realización mostrada en la figura 10, sin embargo, el sistema comprende posiciones de calentamiento y posiciones de control de la temperatura en los mismos puestos de recipientes en una configuración alterna con los puestos de recipientes que comprenden las posiciones de detección de productos de PCR (y las posiciones de refrigeración). La cinta mueve una fila de recipientes a una posición de calentamiento, donde las fuentes de radiación electromagnética están colocadas por debajo de los recipientes. En esta realización, las fuentes de radiación electromagnética, por ejemplo, LED, están colocadas en la parte inferior de cada recipiente cuando el recipiente está en una posición de calentamiento, donde los LED emiten radiación electromagnética que tiene una longitud de onda espectral en el intervalo de aproximadamente 100 nm a aproximadamente 500 nm (es decir, longitudes de onda de luz ultravioleta, violeta y azul) (véase, por ejemplo, la figura 3). En una realización preferida, los LED emiten luz azul. La radiación electromagnética se concentra mediante una lente colimadora sobre una película de Mylar recubierta de oro dispuesta entre el fondo del recipiente y el aceite de encapsulación. La energía lumínica se convierte en energía calórica (como se describe en otra parte en este documento) y eleva la temperatura del volumen de mezcla de reacción acuosa. En esta realización, se realiza control de la temperatura simultáneo mediante un detector de imágenes térmicas en comunicación óptica con la matriz acuosa de aceite. En una realización preferida, se coloca una fibra óptica en la parte superior de cada uno de los recipientes cuando ese recipiente está en una posición de control de la temperatura y conduce la radiación infrarroja de cuerpo negro emitida desde la matriz acuosa de aceite hasta el detector de imágenes térmicas (véase, por ejemplo, la figura 3). En algunas realizaciones, se coloca un filtro de emisión de infrarrojos en la trayectoria óptica de la radiación infrarroja de cuerpo negro y se coloca entre el detector de imágenes térmicas y una cara plana de una placa óptica de fibra (véase, por ejemplo, la figura 9). En esta realización, cada ciclo de temperatura de PCR se completa en aproximadamente diez segundos o menos.

Después de completarse el primer ciclo de temperatura de PCR, el sistema de control causa que la cinta mueva la fila de recipientes hasta el siguiente puesto de recipientes, que comprende una posición de detección de productos de PCR. Como se ilustra en la figura 10, se genera luz de excitación de fluorescencia que tiene dos diferentes longitudes de onda espectrales por las fuentes de luz de excitación de fluorescencia del detector de excitación y emisión de fluorescencia y se transporta, por ejemplo, por una o más fibras ópticas colocadas por encima de cada recipiente cuando ese recipiente está en la posición de detección de productos de PCR, y se transmite hasta el volumen de mezcla de reacción acuosa (mostrado por flechas de puntos). En respuesta a ello, los fluoróforos en el volumen de mezcla de reacción acuosa emiten luz de emisión de fluorescencia que se transporta de vuelta al detector de excitación y emisión de fluorescencia por, por ejemplo, la una o más fibras ópticas (mostradas por flechas de puntos). La intensidad de la luz de emisión de fluorescencia se mide entonces por el detector de luz de emisión de fluorescencia (por ejemplo, cámara CCD) del detector de excitación y emisión de fluorescencia. En algunas realizaciones, la trayectoria óptica de cada luz de excitación de fluorescencia comprende una fuente de luz de excitación de fluorescencia, un cubo portafiltros dicroicos, una placa de matriz óptica de fibra, una cámara CCD y una matriz óptica de fibra (véase, por ejemplo, la figura 9). En algunas realizaciones, la trayectoria óptica de cada luz de excitación de fluorescencia está compuesta de únicamente una fuente de luz (LED o láser) y la detección de la emisión de fluorescencia está compuesta únicamente de un filtro de emisión y una cámara CCD o CMOS. Además, puede disponerse un pozo de calor pasivo debajo del lado superior de la cinta y colocarse por debajo de cada recipiente cuando está en la posición de detección de PCR (véase, por ejemplo, la figura 9). Después de completarse la etapa de detección de productos de PCR, el sistema de control causa que la cinta mueva la fila de recipientes hasta el siguiente puesto de recipientes donde el proceso se repite para una cantidad predeterminada de ciclos de temperatura de PCR que varía de 1 a 40.

Sistemas de control mecánico, electrónico e informático

En este documento se proporcionan sistemas mecánicos, sistemas electrónicos y funcionalidades informáticas adecuados para el control del sistema de amplificación por PCR y de detección de productos. Una amplia diversidad de posibles configuraciones electrónicas e informáticas está disponible para su uso en proporcionar un sistema de control mecánico y electrónico que pueda incorporarse en el presente sistema y pertenecen al ámbito de los expertos en la materia. En la figura 11 se representa un diagrama de bloques funcional de una realización preferida que comprende funciones de control para una realización completa de dispositivo único de inicio a fin (tal como las realizaciones de cinta transportadora mostradas en las Figuras 9 y 10). En algunas realizaciones, el presente sistema comprende ensamblar las reacciones en placas de pocillos desconectadas y/o moviendo manualmente una matriz de recipientes hasta un dispositivo configurado de tal manera que el calentamiento de PCR y la detección de fluorescencia se consiga son mover los recipientes (es decir, sin la necesidad de una cinta transportadora u otro dispositivo de colocación automatizado). Dichas realizaciones se hacen posibles coubicando los componentes de calentamiento y de detección de fluorescencia en trayectorias de luz comunes asociadas con cada recipiente. En dicho caso, no se necesita ensamblaje de la reacción y/o colocación del recipiente. Las operaciones de calentamiento y detección en el dispositivo se producirían secuencialmente, en lugar de simultáneamente en ubicaciones diferentes. Realizando el calentamiento del ciclo de PCR seguido, secuencialmente, por la detección de fluorescencia, se eliminan las complicaciones impuestas por la posible interferencia de la detección de fluorescencia con la fuente de luz de calentamiento y el cambio rápido de temperaturas. Sin embargo, la carga, procesamiento y descarga continuos no son posibles y el rendimiento está más limitado.

En la figura 11 se representa un diagrama de bloques funcional de una realización preferida que comprende funciones de control para una realización completa de dispositivo único de inicio a fin. Como se muestra en la figura 11, el sistema comprende un controlador de flujo del proceso del instrumento (PLC o microcontrolador electrónico) que está programado para proporcionar funciones para iniciar y controlar cada acción implicada en el flujo del proceso de una "ejecución" que se produce en el instrumento. Una "ejecución" se define en este documento como las operaciones sobre un conjunto de reacciones ensambladas, procesadas y controladas para la fluorescencia de productos de PCR donde el sistema de amplificación por PCR y de detección de productos se ejecuta de forma autónoma sin ninguna entrada significativa de instrucciones durante el flujo del proceso y el sistema de amplificación por PCR y de detección de productos no se detiene o reanuda durante el flujo del proceso para ninguna operación de carga en masa, descarga o mantenimiento. Por tanto, toda la información de ensamblaje de la reacción y parámetros de PCR necesaria por el sistema para dar soporte a una ejecución se predefine y comunica al sistema antes de que empiece la ejecución. Una realización que usa dicho sistema de control es el sistema basado en placa de microvaloración. Como alternativa, la información necesaria para iniciar el ensamblaje y el procesamiento de las muestras y reacciones disponibles se comunica al sistema de amplificación por PCR y de detección de productos para empezar las operaciones, y la información adicional se comunica posteriormente al sistema de amplificación por PCR y de detección de productos para ampliar sus instrucciones y dar soporte al ensamblaje y procesamiento continuados de muestras adicionales que se proporcionan, de tal manera que los aparatos del sistema no se detienen completamente en ningún momento durante la ejecución y se mantiene un flujo del proceso.

Bajo el control del controlador de flujo del proceso del instrumento principal, los subsistemas individuales pueden tener sus propios microcontroladores electrónicos o pueden controlarse por subrutinas, múltiples procesadores y módulos electrónicos del controlador de flujo del proceso del instrumento principal. En cualquier caso, los subsistemas realizan sus funciones individuales en cooperación y coordinación de manera que la cronología de las operaciones asegura el apropiado ensamblaje y procesamiento de todas las reacciones. Por ejemplo, el tiempo exacto requerido para realizar una operación de calentamiento y refrigeración de termociclado de PCR particular para cualquier volumen de ensamblaje de reacción dado se desconoce por anticipado y se determina, de forma dinámica, a través de control de la temperatura por retroalimentación del volumen de ensamblaje de la reacción particular durante el proceso de calentamiento. Por lo tanto, el controlador de flujo del proceso del instrumento principal recoge y recopila información del estado de la señal de retroalimentación para cada recipiente que experimenta procesamiento y evita que se produzca la siguiente etapa de procesamiento para cualquier recipiente hasta que se haya completado la etapa previa para todos los recipientes. La detección de fluorescencia no se inicia hasta que se completa el calentamiento de termociclado. Asimismo, en un sistema de cinta, los pocillos no se hacen avanzar en la cinta por los controladores del motor de colocación de la matriz de recipientes hasta que se confirma por el controlador de flujo del proceso del instrumento principal que el ensamblaje de la reacción se ha completado y/o las lecturas de detección de fluorescencia se han completado para todos los pocillos. Una vez que el ensamblaje de la reacción, el calentamiento fotónico y/o las lecturas de detección de fluorescencia se han completado para todos los pocillos, el controlador de flujo del proceso del instrumento principal informa a los controladores del proceso de colocación de la matriz de recipientes que transmita la información colocación del motor a los controladores del motor de colocación de la matriz de recipientes para que cause que el dispositivo de colocación (por ejemplo, cinta transportadora) mueva los recipientes hasta el siguiente puesto de recipientes. Por lo tanto, los volúmenes de reacción particulares que requieren el tiempo más largo para una etapa de procesamiento dada determinan la tasa de progreso del sistema completo.

A. Control del subsistema de ensamblaje.

Como ya se ha indicado, algunas realizaciones del sistema integran el ensamblaje de la reacción en línea. En dichos casos, el controlador de flujo del proceso del instrumento principal pasa comandos e información necesaria, tal como información de identificación y volumen de la muestra, a los controladores del proceso de pipeteo del ensamblaje de la reacción para obtener de ahí muestras, reactivos y aceites. Los controladores del proceso de pipeteo envían información de la posición del motor a los controladores del motor de la posición de pipeteo y los controladores del motor de aspiración/distribución de pipeteo que mueven líquidos a recipientes de reacción e informan al controlador de flujo del proceso del instrumento principal de la disposición de las reacciones que se han ensamblado en los recipientes. El controlador de flujo del proceso del instrumento principal puede ordenar, como alternativa, una disposición predefinida particular de reacciones, pero el sistema trabaja de forma más eficaz si los controladores del proceso de pipeteo informan al controlador de flujo del proceso del instrumento principal de la disposición de las reacciones que puede crear rápidamente. El controlador de flujo del proceso del instrumento principal entonces puede registrar la disposición en una base de datos de almacenamiento local de modo que cuando se recogen los datos de fluorescencia, el sistema pueda determinar la mezcla de reacción particular que generó esa fluorescencia.

B. Control del subsistema de calentamiento fotónico y el subsistema de retroalimentación de la temperatura del microcontrolador y de control de la fuente de luz.

El subsistema de calentamiento fotónico emplea soporte físico o informático de controlador de derivada proporcional integral (PID) en combinación con conjuntos de normas de control del calentamiento desarrolladas a medida para determinar la energía necesaria para accionar las fuentes de luz. Los parámetros y las normas de PID se afinan para proporcionar el calentamiento más rápido posible sin sobrepasar significativamente las temperaturas deseadas del punto de ajuste.

Como se muestra en la figura 11, el controlador de flujo del proceso del instrumento principal envía información de perfil de calentamiento, incluyendo los puntos establecidos de temperatura a conseguir y el tiempo que mantener el volumen de reacción a cada temperatura, a los controladores de calentamiento y activa los controladores de calentamiento para enviar la información del punto de ajuste de temperatura al regulador de energía de calentamiento PID. En respuesta, el regulador de energía de calentamiento PID transmite la información del nivel de energía a los suministros de energía de fuente de luz de calentamiento, que proporcionan la energía producida apropiada a las fuentes de luz de calentamiento (es decir, las fuentes de radiación electromagnética). Las fuentes de luz de calentamiento entonces emiten radiación electromagnética a los recipientes. Como se analiza en otra parte en este documento, el presente sistema comprende una pluralidad de detectores de temperatura (es decir, dispositivos de detección térmica, tales como fibras ópticas en comunicación óptica con un dispositivo de detección térmica de infrarrojos, termistores o termopares) que, en algunas realizaciones, proporcionan información del ciclo de temperatura de PCR en tiempo real. Los subsistemas electrónicos e informáticos individuales reducen la carga en algunos controladores del instrumento principal, especialmente si la velocidad del procesador del controlador de flujo del proceso del instrumento principal está limitada. Por ejemplo, el calentamiento se produce muy rápido en reacciones de pequeño volumen. Para controlar de forma precisa y rápida el proceso de calentamiento, se proporcionan valores de retroalimentación de la temperatura aproximadamente cada 100 a 200 milisegundos. Empleando un sistema de procesador de control del calentamiento diferente, el procesador no se implica en las tareas de control que no sean de calentamiento y puede manejar la retroalimentación rápida y el tiempo de respuesta de control necesario para evitar el sobrecalentamiento potencial. Por tanto, se proporciona un subsistema de retroalimentación de la temperatura y de control de la fuente de luz donde la información del voltaje, la corriente o las imágenes infrarrojas generada por los detectores de temperatura se envían a un procesador de señales de los detectores de temperatura que proporciona información de temperatura de retroalimentación al regulador de energía de calentamiento PID que, en respuesta a ello, envían la información del nivel de energía actualizado a los suministros de energía de fuente de luz de calentamiento para ajustar la energía producida para las fuentes de luz de calentamiento.

Una vez alcanzado el punto de ajuste de temperatura, el regulador de energía de calentamiento PID transmite esta información a los controladores de calentamiento. En este punto, los controladores de calentamiento ordenarán al regulador de energía de calentamiento PID proporcionar energía de salida adicional a las fuentes de luz de calentamiento para elevar la temperatura de la reacción hasta el siguiente punto de ajuste de temperatura o, si el ciclo de temperatura de PCR está completo, el controlador de calentamiento ordenará al regulador de energía de calentamiento PID terminar la energía producida desactivando de ese modo las fuentes de luz de calentamiento. Una vez el subsistema de calentamiento fotónico ha completado un ciclo de temperatura de PCR, los controladores de calentamiento informan al controlador de flujo del proceso del instrumento principal, por ejemplo, por protocolos de comunicación de datos o por estados de línea digital, que la reacción está completa y espera instrucciones adicionales.

C. Control del subsistema de detección de fluorescencia.

Los controladores de detección de fluorescencia proporcionan funcionalidad para activar y desactivar las fuentes de luz de excitación de fluorescencia cuando se inician por comandos desde el controlador de flujo del proceso del instrumento principal. Asimismo, el inicio de la detección de luz de emisión por los detectores de emisión de fluorescencia se gestiona por el subsistema de detección de fluorescencia. Como se muestra en la figura 11, el controlador de flujo del proceso del instrumento principal activa los controladores de detección de fluorescencia que acciona los apropiados suministros de energía de excitación de fluorescencia que provocan la emisión de luz de excitación de fluorescencia desde una o más fuentes de luz de excitación de fluorescencia. Como se describe en otra parte de este documento, la luz de excitación de fluorescencia puede conducirse a cada recipiente que contiene una matriz acuosa de aceite cuando ese recipiente está en la posición de detección de productos de PCR. Los fluoróforos en el volumen de mezcla de reacción acuosa responden a la luz de excitación de fluorescencia que tiene la longitud de onda espectral apropiada y emiten luz de emisión de fluorescencia que se transporta hasta un detector de luz de emisión de fluorescencia. El detector de luz de emisión de fluorescencia envía información de señales sin procesar hasta los procesadores de señales de fluorescencia, que recogen, procesan y comunican los datos como unidades relativas de fluorescencia al registrador de datos de fluorescencia. El registrador de datos de fluorescencia pasa la información de unidades relativas de fluorescencia a una base de datos de almacenamiento local y/o un procesador de análisis genético configurado para ejecutar el programa informático de análisis de datos de PCR, que determina el aviso de alelo genético que informar basándose en los datos de fluorescencia y la información proporcionada por la muestra y la información del plan de ensamblaje de la reacción.

En una realización preferida, los datos de fluorescencia se recogen después de cada ciclo de temperatura de PCR. En algunos aspectos, la calidad y características de las reacciones de PCR son tales que el programa informático de análisis de datos de PCR informa al controlador de flujo del proceso del instrumento principal que se han producido un aviso genético fiable basándose en información disponible, y el controlador de flujo del proceso del instrumento principal entonces puede dar instrucciones a los controladores de calentamiento y los controladores de detección de fluorescencia para terminar el posterior procesamiento del volumen de mezcla de reacción acuosa particular correspondiente a los datos del aviso genético. Este control de retroalimentación adicional ahorra energía y tiempo.

D. Interfaces del usuario y sistemas externos.

En la realización representada en la figura 11, el sistema emplea una pantalla LCD o de imágenes de vídeo para proporcionar la información de estado acerca del instrumento (es decir, la pantalla LCD de estado del instrumento). También hay una interfaz de control manual que permite funciones, tales como operaciones manuales de inicio, pausa o interrupción del instrumento. También se muestra en la figura 11 una interfaz del usuario basada en PC que puede ser una aplicación basada en PC diferente o interfaz de usuario de un sitio web. Dicha interfaz permitiría que múltiples usuarios pudieran enviar información a un instrumento para configurar y comenzar una ejecución o para cargar reacciones adicionales en una ejecución que ya ha comenzado.

Los servicios de tratamiento de información de laboratorio (LIMS) son bien conocidos en la técnica y son sistemas de tratamiento de laboratorios e información basados en programa informático con características, tales como flujo de trabajo y soporte de seguimiento de datos, arquitectura flexible e interfaces de intercambio de datos, que dan soporte a las operaciones de un laboratorio. Por tanto, en algunas realizaciones, el presente sistema comprende un programa LIMS. En la figura 11 se muestran sistemas externos que incluyen servicios de intercambio de datos LIMS conectados de forma comunicativa a la base de datos LIMS y la base de datos de almacenamiento local y configurados para enviar el "programa de ejecución" y la información de plan a la interfaz del usuario basada en PC y la información de plan de los "componentes de ejecución" al controlador de flujo del proceso del instrumento principal.

Pueden usarse varias variaciones de los componentes del sistema de la invención, como se ejemplifica a continuación.

Recipientes

Se examinaron muchas placas de microvaloración, tubos, viales y dispositivos de retención de líquidos de múltiples cámaras disponibles en el mercado en un intento por encontrar un recipiente adecuado para mantener el volumen de líquido mientras se proporciona el calentamiento mediado por luz. El volumen de líquido es flexible dependiendo de las necesidades específicas, y volúmenes más pequeños por lo general pueden calentarse más rápidamente con menos introducción de energía lumínica. Sin embargo, por motivos de conveniencia y simplicidad en los sistemas de prototipo, se usó de forma rutinaria una gota acuosa de 3 microlitros en 5 microlitros de aceite. El tamaño, la forma y el grosor de las paredes fueron todos factores que hicieron que los recipientes disponibles en el mercado examinados fueran las peores elecciones para dar soporte al calentamiento rápido y controlado mediado por luz del volumen de líquido seleccionado. Algunos recipientes no tenían el fondo adecuado para un área suficiente de metal de oro. Muchos otros tenían un grosor de pared que creaba una masa térmica y tasa de disipación de calor que era demasiado grande para que fuera práctica con las fuentes de luz deseadas. A menudo se requerían láseres de alto vatiaje para proporcionar suficiente energía lumínica para calentar incluso volúmenes pequeños de líquido en algunos recipientes. Algunas formas y tamaños de recipiente producían calentamiento desigual del líquido que provocaba un mal termociclado. Algunos recipientes se fundían, se deslaminaban o se deformaban con el calor generado por el oro. Finalmente, se fabricaron recipientes de plástico formados por vacío, de paredes delgadas y estos demostraron funcionar muy bien. Dichas matrices de pocillos formadas por vacío son relativamente baratas, potencialmente desechables si se desea y son adaptable a todas las realizaciones examinadas del sistema. Se construyeron moldes de formación por vacío, utilizando clavijas de acero inoxidable, que producen matrices de recipientes de paredes delgadas uniformes en cualquier disposición y configuración deseadas de uno o más pocillos.

Pueden producirse fácilmente recipientes de un solo pocillo, tiras de pocillos y matrices de filas y columnas de pocillos. La mayoría de las matrices de múltiples pocillos se fabrican con un espaciado de centro a centro de 9 milímetros de los pocillos para sustentar las tecnologías de pipeteo de múltiples puntas de laboratorio convencionales en la industria. Sin embargo, es factible cualquier espaciado o disposición deseada. Se ensayaron varios materiales de lámina de plástico disponibles para formación por vacío/termoformación para este fin. Varias fueron funcionales. Sin embargo, se seleccionó la lámina de PETG (tereftlato de polietilenglicol-modificado) transparente y clara con un grosor de 1,016 mm (0,04 pulgadas) y se empleó para la mayoría de matrices de recipientes. Como se ilustra en la figura 14, para la mayoría de sistemas de prototipo y de ensayo, se fabricaron matrices de pocillos de fondo plano (a) con un diámetro interno de 3 milímetros y una profundidad de 5,5 milímetros. Como estas matrices de pocillos de paredes delgadas carecían de la rigidez de muchos recipientes de paredes más gruesas, las matrices grandes de pocillos requerían una estructura de soporte (b) para evitar el combado, cimbreo y alabeo de la matriz. El soporte se proporcionó por una lámina acrílica de 4 milímetros (0,125 pulgadas) de grosor que se cortó por láser para que tuviera una disposición de orificios correspondiente a las posiciones y diámetros de los pocillos de la matriz de pocillos formada por vacío de PETG. Los recipientes de pocillos formados por vacío se insertaron en los orificios en la placa de soporte. Esto produjo un dispositivo con matrices de pocillos que sobresalen aproximadamente 1,5 mm por debajo de la placa de soporte. La placa de soporte no solamente proporciona soporte a la matriz de pocillos, sino que también proporciona una alineación precisa de los pocillos sobre las fuentes de luz.

Materiales de conversión de luz/calor

Para absorber la luz de longitud de onda azul empleada de forma rutinaria y convertirla en calor para accionar el termociclado, se necesita una película de metal de oro sobre el fondo del pocillo de reacción (figura 13). De forma ideal, podría usarse oro depositado por vapor o revestido por electrólisis, aplicado directamente al fondo del pocillo. Sin embargo, los procesos de deposición por vapor y revestimiento por electrólisis son inconvenientes e inviables para la mayoría de ensayos de prototipo. Una alternativa es emplear discos de lámina o película recubiertos de oro (e en la figura 13) insertados en el fondo de los pocillos. Estos discos se perforan de existencias de láminas disponibles en el mercado de película de Mylar recubierta de oro o papel de aluminio recubierto de oro. La mayoría de los primeros ensayos de prototipo se realizó con película de Mylar recubierta de oro. Sin embargo, se descubrió que el Mylar podía fundirse, encogerse o perder su recubrimiento de oro en determinadas circunstancias. Además, fue difícil mantener la película de Mylar flotando en algunos líquidos, especialmente cuando la temperatura del líquido se cambia rápidamente y son posibles burbujas de gas en el volumen de líquido. El papel de aluminio disponible en el mercado demostró ser demasiado grueso para funcionar de forma eficaz. Sin embargo, se descubrió que un papel de aluminio recubierto de oro, muy delgado, normalmente usado como envoltorio de caramelos (CK Products/Oasis Supply envoltorios de caramelo de papel de oro 89-44G de 10,16 x 10,16 cm (4 x 4 pulgadas)) funcionaba muy bien. Se modeló una perforación a partir de un rodillo de acero filado y placas de acero con un orificio de diámetro correspondiente que permitía generar discos de lámina de 3 mm. Estos discos se insertaron con una pluma de recoger de punta de vacío de diámetro pequeño, con el oro hacia abajo, en los pocillos de los recipientes formados por vacío. Los discos se hicieron del tamaño adecuado para ajustar ajustadamente en el fondo de los pocillos.

Matrices de aceite

Como se menciona previamente, pueden usarse dos aceites para dar soporte a la gota acuosa, un aceite de encapsulación de silicona y un aceite transportador de perfluorocarbono, y esto tiene determinadas ventajas para el centrado y el control de la contaminación. Sin embargo, se descubrió que el uso de dos aceites podía provocar, en algunas circunstancias, un efecto de "lámpara de lava" cuando los líquidos se calientan y refrigeran rápidamente por la luz. Las observaciones realizadas con una pequeña videocámara colocada en el lateral de un recipiente de un solo pocillo demostraron que el empleo de algunos aceites de perfluorocarbono causaba que el volumen completo de líquido se revolviera, perturbara y dividiera en gotas más pequeñas durante el rápido calentamiento y refrigeración. Retirando el aceite de perfluorocarbono y usando únicamente un aceite de silicona (c en la figura 13) se eliminaba este efecto de revuelto. Aún quedan corrientes termoi nducidas establecidas en el aceite, como se indica por los estudios de los vídeos de pequeñas partículas que pueden añadirse al aceite. Sin embargo, estas corrientes no movían significativamente la gota acuosa (d en la figura 13) que tendía a descansar en el centro del aceite justo por encima del papel de oro en el fondo del pocilio. De hecho, estas pequeñas corrientes promueven una temperatura más uniforme por todo el volumen de líquido total que hace que el seguimiento y el control de la temperatura sean más fáciles. Los volúmenes elegidos de la gota acuosa y el volumen del aceite se determinaron por el tamaño y la forma del recipiente y proporcionaron una capa de aceite sobre la gota acuosa de aproximadamente 0,5 a 1 milímetros de profundidad. Esta cobertura de aceite evitaba la evaporación de la gota acuosa.

Recubrimiento hidrófobo

Para proporcionar el centrado y el control de la contaminación ofrecidos por el aceite transportador de perfluorocarbono, se encontró una alternativa simple que no requiere el aceite transportador en el volumen de líquido. La mitad inferior de cada pocillo en las matrices de pocillos formadas por vacío se tratan con un recubrimiento superhidrófobo (HydroFoe™ de LotusLeaf Coatings, Inc.) (b en la figura 13). Muchas realizaciones del sistema de prototipo incorporan este recubrimiento. El recubrimiento potencia enormemente el centrado de la gota acuosa en el aceite de silicona y repele cualquier contacto entre las paredes del pocillo y la mezcla de reacción acuosa. En los sistemas de prototipo, cada pocillo se trata durante 5 minutos con 20 microlitros de HydroFoe™. Sin el recubrimiento hidrófobo, las gotas acuosas a veces podrían pegarse a las paredes del pocillo, que ha demostrado ser perjudicial para las imágenes térmicas de IR y la detección de fluorescencia y permite los problemas potenciales de contaminación cruzada si el pocillo se usa de nuevo para posteriores reacciones de PCR. El recubrimiento superhidrófobo es bastante duradero y el pocillo puede usarse múltiples veces después de un tratamiento, soportando varias reacciones de PCR. El reemplazo del aceite de perfluorocarbono con un recubrimiento hidrófobo simplifica el ensamblaje de los volúmenes de reacción, reduce los costes y elimina los líquidos residuales de perfluorocarbono potencialmente peligrosos. Aunque HydroFoe™ se usa actualmente en los sistemas de prototipo, hay muchos otros recubrimientos de tratamiento hidrófobo disponibles en el mercado que funcionarían igual de bien.

Fuente de luz

Se han examinado muchas fuentes de luz láser y LED como posibles fuentes de energía para accionar el calentamiento. Muchos LED azules habitualmente disponibles no proporcionaban la energía producida necesaria para calentar rápidamente los volúmenes de líquido de reacción deseados. Algunos láseres y LED eran relativamente caros. Algunos eran grandes y voluminosos y no muy adecuados para colocarse bajo los pocillos porque podrían estar demasiado juntos en una matriz de pocillos. Algunos requerían sistemas de lentes caros y complicados para concentrar la luz. Algunos láseres producían una fuente de luz intensa y colimada, de diámetro pequeño que podrían colocarse fácilmente para iluminar únicamente la superficie metálica de oro en el fondo del pocillo de reacción. Estos láseres podían usarse para calentar muy rápidamente la mayoría de volúmenes de líquido ensayados. Sin embargo, estos láseres generalmente se consideran potencialmente peligrosos para la vista, por lo que se consideraron indeseables. Se descubrió que los LED son pequeños, baratos y proporcionaban la intensidad de luz necesaria. Además, los LED seleccionados podían colocarse muy cerca de los fondos de los pocillos en los recipientes formados por vacío de paredes delgadas (figura 14) de modo que la mayor parte de la luz emitida por los LED interceptaría la capa metálica de oro en el fondo de los pocillos. Esto hace que estos LED seleccionados sean energéticamente eficientes y eliminan la necesidad de una lente de concentración. Los LED azul marino Luxeon Rebel ES 1W 700mA (Lumileds Holding B.V.) funcionaban bien si se retira la bóveda del LED. Los LED Luxeon Z Series ES 700mA también funcionaron bien y son dispositivos LED "de matriz descubierta" sin una bóveda protectora. La eliminación de la bóveda permite que la matriz se coloque muy cerca (en 1 milímetro) del fondo del pocillo formado por vacío, mejorando la eficacia de transferencia energética. Estos l Ed están disponibles como dispositivos de montaje en superficie en pequeñas almohadillas con contactos que les permiten montarse fácilmente en una placa de circuito impreso.

Colocación de la fuente de luz

Para un dispositivo de prototipo se diseñó una placa de circuito impreso que permitía el control independiente de 96 LED colocados con un espaciado de 9 milímetros (figura 16). Este diseño particular da soporte a una realización habitualmente usada del sistema que utiliza tecnologías de pipeteo de múltiples puntas diseñadas para el trazado y espacio ocupado convencionales internacionales de los pocillos en una placa de microvaloración de 96 pocillos. Son factibles placas de circuito impreso similares para cualquier otra disposición de LED.

No toda la energía eléctrica introducida se convierte en luz. Una cantidad significativa de calor se genera por un LED. Para mantener la estabilidad y prolongar la vida del LED, el LED puede montarse en un pozo de calor para permitir que este calor se disipe. En los sistemas de prototipo, se colocan ventiladores para transportar este calor lejos de los lEd y los pocillos por encima de los LED. Se colocan ventiladores adicionales para proporcionar un flujo de aire a través de los fondos hasta los pocillos. Estos ventiladores se activan y desactivan automáticamente por el programa informático del microcontrolador para promover una refrigeración más rápida de los pocillos cuando se desea.

Controladores de la fuente de luz

Para dar soporte al sistema de prototipo, se ha ensamblado un sistema controlador de LED que proporciona control de la energía de modulación de anchura de impulso (PWM) de cada LED sobre un único bus I2C desde un microcontrolador. El sistema controlador de LED emplea una serie de módulos PCA9685, disponibles en múltiples fuentes de componentes electrónicos. Cada módulo PCA9685 puede proporcionar señales PWM de 12-bit para hasta 16 LED accesible. Los módulos contienen su propio reloj interno que elimina la necesidad de recargar continuamente los ajustes de PWM. Los módulos PCA9685 pueden ensamblarse en una serie que permite controlar varios cientos de LED en un bus I2C por un único microcontrolador. Se requieren 6 módulos para accionar 96 LED. Para acomodar la corriente necesaria para accionar los LED de 1 W individuales, la señal PWM de salida para cada LED desde un PCA9685 se guía hasta un controlador de energía RapidLED Meanwell LDD-700H montado en una placa de controlador cuádruple RapidLED LDD-H-4 (Rapid LED). Se requiere un LDD-700H para cada LED. Cada placa de controlador se conecta a un suministro de energía y tiene conexiones para cada salida de LED. La figura 15 muestra la disposición básica de los componentes necesarios para accionar los LED. Se muestran únicamente 32 LED en el diagrama, pero se diseñó un ensamblaje para ensayo que acciona 96 LED. Este diseño se amplía fácilmente para una cantidad incluso más grande de LED y es una manera simple, barata y flexible de accionar múltiples LED en sistemas de prototipo. También son posibles circuitos de control de LED de funcionalidad similar personalizados.

Detectores de temperatura sin contacto

Para controlar y modular la intensidad de los LED, regulando de ese modo las temperaturas, es ideal usar retroalimentación desde los detectores de temperatura que pueden controlar de forma continua las temperaturas de cada volumen de líquido. Diferencias sutiles en el tamaño y la composición de las reacciones pueden causar una variabilidad significativa en la cronología y los niveles de energía requeridos durante el calentamiento. Pueden insertarse termistores o termopares simples en cada reacción para proporcionar esta información de temperatura de retroalimentación. Para muchos sistemas de prototipo y ensayo, se pueden insertar termopares de 0,1 mm (0,005 pulgadas) (Omega Engineering Inc.) en pocillos individuales. Sin embargo, esto presenta múltiples problemas con el control de la contaminación, la reutilización de recipientes y el movimiento fácil de las matrices de pocillos para algunas realizaciones del sistema. El método preferido de control de la temperatura para la mayoría de realizaciones es el uso de detectores de IR sin contacto. Se han realizado ensayos de múltiples detectores de IR sin contacto. El tamaño, forma, posición/alineación, coste, precisión y campo de visión de muchos detectores de temperatura de IR son contacto, de una sola medición, individuales disponibles fueron inapropiados para el uso satisfactorio de estos detectores en nuestros sistemas de prototipo. Los mejores resultados, hasta la fecha, se han conseguido con tecnologías de imágenes de IR sin contacto que pueden informar de las temperaturas simultáneamente desde múltiples píxeles en una imagen térmica adquirida. Esto supera la necesidad de muchos detectores individuales y da soporte a una adquisición y manipulación más rápida y fácil de los datos de temperatura para múltiples pocillos. Además, analizando las imágenes térmicas de áreas completas ocupadas por pocillos de reacción, no se necesita una alineación precisa de detectores de temperatura concretos individuales. Aunque pueden emplearse muchas cámaras de imágenes de IR disponibles, el control de la temperatura se ha realizado en sistemas de prototipo con el detector radiométrico FLIR Lepton® y la cámara de imágenes térmicas FLIR Ax5-Series (FLIR Systems, Inc.). Ambos dispositivos de imágenes térmicas pueden interconectarse a un microcontrolador u ordenador y pueden informar de las temperaturas desde imágenes de objetos observados. Colocando estos sistemas de imágenes por encima de una matriz de volúmenes de reacción, las temperaturas pueden controlarse muestras se produce el calentamiento mediado por luz. En sistemas de prototipo, el píxel con la temperatura más alta informada correspondiente a una ubicación de pocillo se usó como la temperatura del pocillo. Las temperaturas presentadas son temperaturas superficiales y pueden ser unos pocos grados más bajas que las temperaturas informadas simultáneamente por termopares incrustados más cerca de la capa de oro. Sin embargo, ha sido posible calibrar y compensar estas diferencias de temperatura siempre que los tamaños del recipiente, las configuraciones y los volúmenes de líquido se mantengan constantes.

Detectores de fluorescencia

El sistema de prototipo típico de ensayo de mezclas de reacción de PCR es una reacción de PCR de dos sondas (bialélica) Taqman™ que emplean sondas fluorescentes FAM y VIC. Algunas reacciones también contienen un tinte ROX no unido usado para evaluar volúmenes y concentraciones de componentes de reacción. Un barrido completo de excitación y emisión espectral de estas reacciones de PCR mostró estrechas ventanas de excitación y emisión donde se produjo interferencia de emisión mínima entre los 2 tintes de sonda. Para nuestras mezclas de reacción de PCR de ensayo específicas, la ventana de excitación de FAM óptima fue de 475 - 500 nm con una ventana de emisión óptima entre 510 - 525 nm. La ventana de excitación óptima de fluorescencia de VIC fue de 525 - 535 nm con una ventana de emisión óptima de 555 - 565 nm. Estas ventanas de excitación y emisión se usaron para seleccionar fuentes de luz de excitación y filtros ópticos de excitación y emisión en los sistemas de prototipo.

Muchos detectores concretos de fluorescencia óptica de reacción y tecnologías de detección de fluorescencia de barrido pueden medir la fluorescencia generada de volúmenes de reacción individuales, uno a uno. Sin embargo, para proporcionar la rápida recogida de datos de fluorescencia necesaria para las mediciones de fluorescencia en tiempo real (ciclo a ciclo) y para hacer que la velocidad global de los sistemas de prototipo sea lo más rápida posible, es deseable medir simultáneamente la fluorescencia de múltiples pocillos. Esto puede conseguirse mediante el uso de matrices ópticas de fibra y/o mediante el uso paralelo de múltiples detectores de fluorescencia. Sin embargo, se han adoptado tecnologías de cámara de imágenes de fluorescencia en la mayoría de los sistemas de prototipo. Las cámaras de imágenes de luz ultrabaja sensibles usadas con filtros apropiados de fluorescencia de excitación y emisión pueden recoger los datos del producto de PCR Taqman de fluorescencia FAM y VIC a partir de múltiples reacciones simultáneamente en un sistema de prototipo. La sensibilidad de las cámaras no ha sido un gran problema. Los avances tecnológicos en esta área en los últimos años han hecho que sea relativamente simple encontrar cámaras con las capacidades adecuadas. Se han examinado varias cámaras de microscopia de fluorescencia de astronomía de fluorescencia de coste relativamente bajo. Los ejemplos de cámaras factibles incluyen la Sony A7s II (Sony Corporation), Tucsen ISH1000 (Tucsen Photonics), ToupTek E3CMOS (ToupTek Photonics), AmScope MT5000 y AmScope MF603C (United Scope LLC).

Fuentes de luz de excitación

Se diseñaron filtros de excitación y emisión y fuentes de luz de excitación. Para dispositivos donde se observa solamente un pocillo, que ocupa un área muy pequeña, son posibles numerosas fuentes de luz y filtros ópticos de banda estrecha. Sin embargo, para la excitación de fluorescencia, con iluminación de un área relativamente grande ocupada por una matriz de pocillos de líquidos de reacción de PCR, se necesita una luz de excitación intensa y uniforme. Las fuentes de luz LED disponibles tienen un rendimiento espectral muy amplio y deben filtrarse excesivamente para proporcionar los anchos de banda estrechos necesarios que se necesitan para mantener una separación limpia de las emisiones de fluorescencia de FAM y VIC. Pueden colocarse filtros de interferencia de paso de banda estrecha convencionales sobre los LED para proporcionar la ventana espectral deseada, pero el ángulo de incidencia de la luz que choca con un filtro de interferencia debe controlarse de forma precisa para eliminar los desplazamientos espectrales indeseables. Para un ensamblaje físico con dicha disposición, cubrir uniformemente un área grande ocupada por una matriz de pocillos es un reto de ingeniería significativo. Para proporcionar la intensidad de luz necesaria y longitudes de onda de excitación estrechas, los láseres han proporcionado una solución más factible. Los dispositivos de línea de láser relativamente seguros pueden proyectar una línea intensa de luz a través de varios pocillos de PCR simultáneamente. Por naturaleza, el ancho de banda de la luz producida por un láser es muy estrecho. Esta línea láser puede moverse rápidamente para cubrir pocillos adicionales o los pocillos pueden moverse bajo la línea láser para capturar la fluorescencia de múltiples filas de pocillos. Dos láseres, uno para cada longitud de onda de excitación deseada puede irradiar secuencialmente todos los volúmenes de reacción y aún tardar únicamente unos pocos segundos. Otra alternativa es usar un lector de espejo de cabezal galvánico para desviar un haz de puntero láser secuencialmente a cada una de las ubicaciones de pocillo deseadas. Dichos dispositivos se usan habitualmente en la proyección de patrones láser para espectáculos y demostraciones de gran audiencia. Un lector de espejo de cabezal galvánico barato puede mover hasta más de 20 miles de puntos por segundo. Para la excitación de fluorescencia para la línea láser y también para los láseres de barrido de cabezal galvánico, la luz de fluorescencia emitida por las sondas FAM y VIC puede detectarse secuencialmente por una cámara que puede integrar el tiempo requerido para explorar una cantidad deseada de pocillos. Puede emplearse una única cámara con un filtro de paso de banda de 2 longitudes de onda adecuado o pueden usarse dos cámaras, cada una con un filtro de paso de banda estrecho de una única longitud de onda menos caro.

La presente divulgación se ilustra mediante los siguientes ejemplos. No se pretende que la descripción anterior y siguiente y los ejemplos sean limitantes, sino que en su lugar son ilustrativos de las realizaciones descritas. Por tanto, se entenderá que la presente divulgación no está limitada a los detalles específicos de los ejemplos.

Ejemplo 1

La figura 17 ilustra la fluorescencia observada de 16 pocillos de reacción después de 40 ciclos de PCR extraída de una única imagen (200 ms de exposición) capturada por una cámara ToupTek E3CMOS. La luz de emisión de fluorescencia se filtró a través de un filtro de interferencia de paso de banda estrecho de 565 nm /- 5 nm antes de entrar en la lente de la cámara. Los pocillos se iluminaron por una línea láser de 20 mW de 532 nm barata (Laserlands, Inc.) para proporcionar la luz de excitación de VIC. La colección de 16 muestras fue una diversidad de genotipos con muestras homocigóticas para VIC, heterocigóticas para VIC y negativas para VIC. Esta variación en los genotipos contribuye a la variación en la altura de los picos. La fluorescencia de VIC se demuestra en esta ocasión ya que es más difícil medir de forma limpia la fluorescencia de VIC que la fluorescencia de FAM en reacciones de PCR típicas. La información de intensidad de píxel se extrajo de la imagen adquirida usando el programa informático de análisis de imágenes ImageJ disponible al público (imageJ.nih.gov).

Cuando se automatiza completamente, usando el sistema de cámara anterior, la adquisición de imágenes de fluorescencia y la extracción de la intensidad de fluorescencia de los píxeles en las imágenes tarda únicamente unos pocos segundos. Son factibles múltiples realizaciones de sistema para utilizar esta estrategia. Un conjunto de pocillos de reacción podría moverse desde una ubicación donde se realiza calentamiento hasta una cámara adyacente donde las cámaras pueden medir la fluorescencia. Como alternativa, la cámara o cámaras de detección de fluorescencia pueden colocarse cerca de una cámara de imágenes de IR o detectores de IR individuales sobre la misma ubicación donde se calientan los pocillos. Los LED de 450 nm de 1 W usados para proporcionar actualmente la energía lumínica de calentamiento en los sistemas de prototipo producen un resultado espectral muy brillante y ancho que complica la detección de fluorescencia incluso con los mejores filtros de bloqueo de emisión disponibles. Por lo tanto, en estas realizaciones de dispositivo de prototipo, la luz de calentamiento no puede estar activa mientras se están haciendo las mediciones de fluorescencia. Esto provoca unos pocos segundos de refrigeración adicional de los volúmenes de reacción después de cada ciclo térmico durante las mediciones de fluorescencia antes de que pueda empezar el siguiente ciclo de calentamiento. Aunque las temperaturas de los volúmenes de reacción caen inicialmente muy rápidas (generalmente de 6 a 10 grados por segundo) desde la temperatura de desnaturalización de 95 °C cuando la luz de calentamiento se extingue, la tasa de baja de temperatura se ralentiza después de los primeros segundos ya que la diferencia entre la temperatura ambiente y la temperatura de reacción se reduce. Incluso con dicho retardo en el inicio del siguiente ciclo de calentamiento, el tiempo adicional requerido para llevar el volumen de reacción de vuelta a la temperatura de hibridación deseada para empezar el siguiente ciclo es de únicamente 1 o 2 segundos en los sistemas de prototipo con los volúmenes de reacción especificados.

Ejemplo 2

Detección de productos de PCR de reacciones de matriz acuosa de aceite mediadas por luz

Se ensayaron dos sondas TAQMAN® y pares de cebadores personalizados que forman un punto de consulta bialélica de un locus diana de ADN con un termociclado mediado por luz en una matriz acuosa de aceite. Las sondas y cebadores se combinaron con enzimas y reactivos de PCR TAQMAN® típicos en pocillos precintados y se ejecutaron a través de como mucho 40 ciclos de temperatura de PCR en un termociclador en baño de agua. Después del termociclado, los productos de PCR se midieron entonces en un lector de fluorescencia comercial a longitudes de onda de emisión para los tintes FAM y VIC que se asocian con las dos sondas para los alelos del locus particular. Una fluorescencia elevada de FAM y/o VIC indica la presencia de productos de PCR amplificados para los alelos de ADN para los que se diseñaron las sondas y cebadores.

Para la detección de productos de PCR mediada por luz en una matriz acuosa de aceite, las muestras de ADN previamente extraídas se adquirieron de un proceso de producción de genotipado de rutina. Estas muestras constituían genotipos conocidos. Se sabía que la muestra 1 producía un producto de PCR para la sonda FAM seleccionada. Se sabía que la muestra 2 producía un producto de PCR para la sonda VIC seleccionada. Se sabía que la muestra 3 producía un producto de PCR para ambas sondas FAM y VIC para el locus de ADN específico seleccionado.

Se preparó una placa de fondo plano transparente, de 384 pocillos con el fondo interior de los pocillos recubierto con una delgada capa de pintura en emulsión de oro. Se insertó un termopar de 0,1 mm (0,005 pulgadas) y se colocó en el pocillo pintado de modo que el lecho del termopar estuviera ubicado aproximadamente 0,5 mm por encima de la pintura de oro. Se ensamblaron reacciones de PCR en matriz acuosa de aceite para cada una de las muestras y para un control sin molde (sin ADN añadido a la reacción) en los pocillos preparados. Cada matriz acuosa de aceite estaba compuesta de 2 gl de una mezcla de reacción de PCR acuosa, idéntica en composición al proceso de genotipado de producción, en 4 gl de un aceite de encapsulación de silicona en 4 gl de un aceite transportador de perfluorocarbono.

Una a una, las reacciones en matriz acuosa de aceite en la placa de 384 pocillos se colocaron sobre un diodo láser de 200 mW de 405 nm enfocado para irradiar un área de la pintura de oro de aproximadamente 1,5 mm de diámetro. Se empleó un microcontrolador Arduino, tal como los descritos en profundidad en el sitio web Arduino, y un suministro de energía regulado para accionar la fuente de luz de modo que la luz pudiera activarse y desactivarse tanto como 500 veces por segundo con modulación de anchura de impulso de la energía dependiente de la temperatura detectada por el termopar en el pocillo. El microcontrolador se programó para proporcionar dos segundos a una temperatura conseguida de 62 °C, seguido de cinco segundos a una temperatura conseguida de 72 °C, seguido de dos segundos a una temperatura conseguida de 95 °C. El microcontrolador se programó para repetir este perfil de temperatura 40 veces para conseguir la amplificación por PCR. Los datos del perfil de temperatura de los diez primeros ciclos de temperatura de PCR se proporciona en la figura 12.

Antes y después del termociclado de PCR mediado por luz, la placa se movió hasta un lecto de placa de fluorescencia comercial donde se midió la fluorescencia de FAM y VIC para cada pocillo de reacción. Se observó fluorescencia elevada para ambas sondas FAM y VIC para las muestras, como se esperaba. Los resultados del ensayo se muestran en la tabla 2:

Tabla 2: Fluorescencia relativa de muestras de genotipo conocido antes

y después de 40 ciclos de PCR mediada por luz

NTC = control sin molde

Ejemplo 3

Extracción de ADN por choque térmico

Un requisito de un sistema de amplificación por PCR es una fuente de muestras de ADN que puedan incorporarse en las reacciones de PCR. Se ha observado que pueden encontrarse suficientes cantidades de material orgánico que contiene ADN sobre o en diversos sustratos que entran en contacto con diversas plantas o partes de plantas. El líquido de frotis tomados de superficies de las plantas, pequeños volúmenes de medio de cultivo o líquidos aclarados de diversas partes de plantas pueden contener cantidades significativas de ADN. Dicho material que contiene ADN recogido proporciona un medio de muestreo no destructivo de ADN de las plantas. Este material que contiene ADN "desprendido" a veces puede usarse directamente, sin purificación adicional, como fuente de ADN para PCR si se expone a un "choque térmico" para liberar, desenredar y/o descompartimentar el ADN contenido dentro del líquido y/o desnaturalizar o destruir las enzimas y otros materiales que son perjudiciales para la amplificación por PCR. Sea cual sea el modo exacto de acción, un único tratamiento de calentamiento y refrigeración muy rápido puede hacer que el ADN esté disponible y sea adecuado para PCR. Dos o más ciclos rápidos de calentamiento y refrigeración podrían potenciar potencialmente este efecto para algunas fuentes de plantas. Basándose en las observaciones, un único volumen de 3 microlitros de líquido acuoso del medio que rodea un embrión de planta o tejido vegetal cultivado puede contener suficiente ADN para muchas reacciones de PCR.

En una realización, se usa choque térmico para obtener ADN de material desprendido en un aparato de la invención usando la misma fuente de calor usada en las posteriores etapas de amplificación por PCR como se describe anteriormente. En otra realización, se usa una posición o ubicación diferente que emplea un aparato de calentamiento fotónico para calentar rápidamente pequeñas cantidades de líquido que contiene este material vegetal desprendido. Lo más rápidamente posible, elevar la temperatura del líquido desde la temperatura ambiente hasta 90 a 98 °C e inmediatamente disminuirla de nuevo hasta la temperatura ambiente proporciona el choque térmico necesario. Este proceso puede potenciar adicionalmente en algunas realizaciones reduciendo la temperatura del líquido hasta temperaturas por debajo de cero ( 20 °C se usa frecuentemente) usando refrigeración de Peltier o inmersión en un baño frío antes del tratamiento con calor. Este proceso puede potenciarse adicionalmente incorporando una agitación o vibración suave del líquido durante o después del choque térmico. Esta agitación mezcla el líquido uniformemente y/o potencia la liberación del ADN. Dicho aparato de calentamiento (y refrigeración opcional) podría simplificar la configuración de las reacciones de PCR en dispositivos manuales o portátiles y/o podría usarse para acelerar un tratamiento de choque térmico de una o múltiples muestras de ADN reduciendo también al mismo tiempo los costes de energía.

En otras realizaciones, son posibles muchos otros procesos de extracción y purificación de ADN para proporcionar ADN para reacciones fotónicas de PCR. Por ejemplo, el ADN puede obtenerse incubando material vegetal con una enzima; la enzima puede ser VISCOZYME® L, un complejo multienzimático que contiene una amplia gama de carbohidrasas, incluyendo arabanasa, celulasa, p-glucanasa, hemicelulasa y xilanasa. (Véase el catálogo de productos de Sigma Aldrich). Una vez digerido el material vegetal por las enzimas, podría usarse choque térmico para preparar el ADN liberado para PCR. Como alternativa, el ADN puede obtenerse usando técnicas más tradicionales de extracción de ADN, tales como, pero sin limitación, el uso de partículas magnéticas que se unen al material genético o cualquier método conocido para los expertos en la materia.

Se hace constar que, con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un sistema de amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y de detección de productos, que comprende:

a) un subsistema de ensamblaje que comprende:

i) una pluralidad de recipientes (101,404);

ii) uno o más miembros de distribución de líquidos (801,802, 803, 804) configurados para ensamblar un conjunto de matrices acuosas de aceite, comprendiendo cada matriz acuosa de aceite:

1) una mezcla de reacción acuosa (104) que comprende un volumen de muestra polinucleotídica y reactivos, comprendiendo los reactivos un primer agente con capacidad de excitación por una luz de extracción de fluorescencia que tiene una longitud de onda espectral cuando el primer reactivo hibrida con la muestra polinucleotídica; y

2) uno o dos aceites inmiscibles seleccionados del grupo que consiste en un aceite de encapsulación (103), un aceite transportador (102) y tanto un aceite de encapsulación (103) como un aceite transportador (102);

donde los componentes de la mezcla de reacción acuosa (104) no se mezclan con el uno o los dos aceites inmiscibles; donde cada matriz acuosa de aceite está configurada para distribuirse mediante el uno o más miembros de distribución de líquidos en un recipiente para la amplificación por pCr y la detección de productos de la pluralidad de recipientes (101, 404);

b) una pluralidad de posiciones de calentamiento, posiciones de control de la temperatura y posiciones de detección de productos de PCR que definen una pluralidad de primeros puestos de recipientes y segundos puestos de recipientes alternos, donde la pluralidad de recipientes (101,404) se pueden estacionar, y donde:

cada uno de los primeros puestos de recipientes comprende una de las posiciones de calentamiento y una de las posiciones de control de la temperatura, y cada uno de los segundos puestos de recipientes comprende una de las posiciones de detección de productos de PCR, o cada uno de los primeros puestos de recipientes comprende una de las posiciones de calentamiento, y cada uno de los segundos puestos de recipientes comprende una de las posiciones de detección de productos de PCR y una de las posiciones de control de la temperatura;

c) un subsistema de calentamiento fotónico accionado por luz, de reacción en reacción, que comprende una pluralidad de fuentes de radiación electromagnética (201,309, 501,602), donde, cuando la pluralidad de vasos están en las posiciones de calentamiento, cada recipiente está en comunicación óptica con una fuente de radiación electromagnética (201,309, 501, 602) de la pluralidad de fuentes de radiación electromagnética, y la fuente de radiación electromagnética (201,309, 501, 602) emite radiación electromagnética a ese recipiente;

d) un subsistema de control de la temperatura, de reacción en reacción, que comprende una pluralidad de dispositivos de detección térmica (202, 307, 502, 704), donde, cuando la pluralidad de vasos están en las posiciones de control de la temperatura, cada recipiente corresponde a un dispositivo de detección térmica de la pluralidad de dispositivos de detección térmica (202, 307, 502, 704) y el dispositivo de detección térmica (202, 307, 502, 704) está configurado para proporcionar una señal de medición que depende de la temperatura de la matriz acuosa de aceite contenida en el recipiente; e) un subsistema de retroalimentación de la temperatura del microcontrolador y de control de la fuente de luz conectado de forma comunicativa tanto al subsistema de calentamiento fotónico como al subsistema de control de la temperatura, donde el subsistema de retroalimentación de la temperatura del microcontrolador y de control de la fuente de luz está configurado para regular una entrada de energía requerida para controlar una salida y una duración de una energía electromagnética emitida por cada fuente de radiación electromagnética a través de un ciclo de temperaturas de la reacción; f) un subsistema de detección de fluorescencia que comprende:

i) una o más fuentes de luz de excitación de fluorescencia (705, 707);

ii) uno o más dispositivos de detección de luz de emisión de fluorescencia (706, 710);

iii) una pluralidad de primeros miembros ópticos (715, 716) en comunicación óptica con la una o más fuentes de luz de excitación de fluorescencia (705, 707), donde, cuando los recipientes están en las posiciones de detección de productos de PCR, cada primer miembro óptico (715, 716) está configurado para proporcionar una trayectoria óptica para la luz de excitación de fluorescencia que tiene la primera longitud de onda espectral desde la una o más fuentes de luz de excitación de fluorescencia hasta uno de dichos recipientes que contienen la matriz acuosa de aceite, y donde cada primer miembro óptico (715, 716) está configurado además para proporcionar una trayectoria óptica para la luz de emisión de fluorescencia desde la mezcla de reacción acuosa hasta el uno o más dispositivos de detección de luz de emisión de fluorescencia (706, 710); y

iv) un mecanismo de refrigeración activa o pasiva (403) en las posiciones de detección de productos de PCR por el que cada uno de los recipientes en la posición de detección de productos de PCR se refrigera;

g) un dispositivo de colocación; y

h) un sistema de control mecánico y electrónico conectado de forma comunicativa al dispositivo de colocación y al subsistema de ensamblaje, donde el sistema de control mecánico y electrónico está configurado para causar que el subsistema de ensamblaje ensamble las matrices acuosas de aceite en la pluralidad de recipientes, y donde el sistema de control mecánico y electrónico está configurado además para causar que el dispositivo de colocación mueva la pluralidad de recipientes con la matriz acuosa de aceite desde el subsistema de ensamblaje hasta cada una de las posiciones de calentamiento, posiciones de control de la temperatura y posiciones de detección de productos de PCR.

2. El sistema de la reivindicación 1, que comprende además una pluralidad de puestos de recipientes, donde las posiciones de calentamiento, posiciones de control de la temperatura y posiciones de detección de productos de PCR están en los mismos puestos de recipientes.

3. El sistema de la reivindicación 1, donde:

i) el mecanismo de refrigeración activa o pasiva es: (a) un metal de pozo de calor pasivo que comprende aluminio o cobre; (b) corrientes de aire de circulación activa; (c) corrientes de aire de circulación pasiva; (d) un dispositivo Peltier; (e) un líquido circulante; o (f) cualquier combinación de (a), (b), (c), (d) o (e); o

ii) cada uno de la mezcla de reacción acuosa, el aceite transportador y el aceite de encapsulación se distribuye en cada uno de los recipientes, donde el aceite transportador no es miscible con el aceite de encapsulación ni con los componentes de la mezcla de reacción acuosa, opcionalmente donde el aceite transportador tiene una densidad que varía de 1200 kg/m3 a 2000 kg/m3, el aceite de encapsulación tiene una densidad de que varía de 700 kg/m3 a 990 kg/m3, y la mezcla de reacción acuosa tiene una densidad que varía de 900 kg/m3 a 1200 kg/m3; o

iii) las fuentes de radiación electromagnética se seleccionan del grupo que consiste en diodos láser y diodos emisores de luz, opcionalmente donde las fuentes de radiación electromagnética son diodos láser que emiten luz infrarroja que tiene una longitud de onda espectral en el intervalo de 1300 nm a 2200 nm, o preferiblemente en el intervalo de 1300 nm a 1500 nm.

4. El sistema de la reivindicación 1, donde cada fuente de radiación electromagnética está configurada para calentar de forma uniforme el volumen de la mezcla de reacción acuosa en cada recipiente correspondiente cuando el recipiente está en la posición de calentamiento a través del ciclo de temperaturas de la reacción, que comprende: (i) una temperatura de hibridación en el intervalo de 50 °C a 65 °C; (ii) una temperatura de elongación en el intervalo de 65 °C a 75 °C; y (iii) una temperatura de desnaturalización en el intervalo de 90 °C a 99 °C; y donde el mecanismo de refrigeración activa o pasiva está configurado para refrigerar cada uno de los recipientes hasta un intervalo de temperatura de 55 °C a 65 °C cuando el recipiente está en la posición de detección de productos de PCR.

5. El sistema de la reivindicación 4, donde el volumen de la mezcla de reacción acuosa es de menos de o igual a 10 gl y donde la mezcla de reacción acuosa se calienta a través del ciclo de temperaturas (i), (ii) y (iii), en menos de o igual a 20 segundos, en menos de o igual a 15 segundos, o en menos de o igual a 10 segundos, opcionalmente donde el ciclo de temperaturas de reacción en (i), (ii) y (iii) se repite para 1 a 60 ciclos adicionales.

6. El sistema de la reivindicación 1, donde el subsistema de detección de fluorescencia comprende además:

v) un primer filtro de excitación que recibe luz de la una o más fuentes de luz de excitación de fluorescencia y permite el paso de la luz de excitación de fluorescencia que tiene la primera longitud de onda espectral;

vi) un primer filtro de emisión para permitir la transmisión de luz de emisión de fluorescencia a través del mismo hasta el uno o más dispositivos de detección de luz de emisión de fluorescencia desde la mezcla de reacción acuosa en respuesta a la luz de excitación de fluorescencia que tiene la primera longitud de onda espectral y para bloquear sustancialmente la transmisión de longitudes de onda diferentes de las longitudes de onda de la luz emitida; o

vii) tanto v) como vi).

7. El sistema de la reivindicación 1, donde cada primer miembro óptico está configurado además para proporcionar una trayectoria óptica para la luz de excitación de fluorescencia que tiene una segunda longitud de onda espectral desde la una o más fuentes de luz de excitación de fluorescencia hasta uno de dichos recipientes que contienen la matriz acuosa de aceite cuando el recipiente está en la posición de detección de productos de PCR, donde el volumen de la mezcla de reacción acuosa comprende un segundo reactivo con capacidad de excitación por la luz de excitación de fluorescencia que tiene la segunda longitud de onda espectral cuando el segundo reactivo hibrida con la muestra de ADN, y donde cada primer miembro óptico está configurado además para proporcionar una trayectoria óptica para la luz de emisión de fluorescencia desde la mezcla de reacción acuosa hasta el uno o más dispositivos detectores de luz de emisión de fluorescencia.

8. El sistema de la reivindicación 1, donde el subsistema de detección de fluorescencia comprende además una pluralidad de segundos miembros ópticos en comunicación óptica con la una o más fuentes de luz de excitación de fluorescencia, donde cada segundo miembro óptico está configurado para proporcionar una trayectoria óptica para luz de excitación de fluorescencia que tiene una segunda longitud de onda espectral desde la una o más fuentes de luz de excitación de fluorescencia hasta uno de dichos recipientes que contienen la matriz acuosa de aceite cuando el recipiente está en una posición de detección de productos de PCR, donde el volumen de la mezcla de reacción acuosa comprende un segundo reactivo con capacidad de excitación por la luz de excitación de fluorescencia que tiene la segunda longitud de onda espectral cuando el segundo reactivo hibrida con la muestra de ADN, y donde cada segundo miembro óptico está configurado además para proporcionar una trayectoria óptica para luz de emisión de fluorescencia desde la mezcla de reacción acuosa hasta el uno o más dispositivos de detección de luz de emisión de fluorescencia.

9. El sistema de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -8, donde el uno o más dispositivos de detección de luz de emisión de fluorescencia es una cámara de dispositivo acoplado por carga (CCD), cámara de semiconductor de óxido de metal complementario (CMOS), matriz detectora o una combinación de los mismos.

10. El sistema de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, donde cada primer miembro óptico comprende una o más fibras ópticas y uno o más diodos emisores de luz.

11. El sistema de la reivindicación 8, donde cada primer miembro óptico comprende una o más fibras ópticas y uno o más diodos emisores de luz, y donde cada segundo miembro óptico comprende una o más fibras ópticas y uno o más diodos emisores de luz.

12. El sistema de la reivindicación 7 o reivindicación 8, donde:

a) el primer reactivo, el segundo reactivo o tanto el primer reactivo como el segundo reactivo comprenden una sonda de ácido nucleico unida covalentemente a un fluoróforo; o

b) el subsistema de detección de fluorescencia comprende además:

v) un primer filtro de excitación que recibe luz de la una o más fuentes de luz de excitación de fluorescencia y permite el paso de la luz de excitación de fluorescencia que tiene la primera longitud de onda espectral; y

vi) un segundo filtro de excitación que recibe luz de la una o más fuentes de luz de excitación de fluorescencia y permite el paso de la luz de excitación de fluorescencia que tiene la segunda longitud de onda espectral, y donde la segunda longitud de onda espectral es diferente de la primera longitud de onda espectral; y opcionalmente

el subsistema de detección de fluorescencia comprende además:

vii) un primer filtro de emisión para permitir la transmisión de luz de emisión de fluorescencia a través del mismo hasta el uno o más dispositivos de detección de luz de emisión de fluorescencia desde la mezcla de reacción acuosa en respuesta a la luz de excitación de fluorescencia que tiene la primera longitud de onda espectral y para bloquear sustancialmente la transmisión de longitudes de onda diferentes de las longitudes de onda de la luz emitida; y

viii) un segundo filtro de emisión para permitir la transmisión de luz de emisión de fluorescencia a través del mismo hasta el uno o más dispositivos de detección de luz de emisión de fluorescencia desde la mezcla de reacción acuosa en respuesta a la luz de excitación de fluorescencia que tiene la segunda longitud de onda espectral y para bloquear sustancialmente la transmisión de longitudes de onda diferentes de las longitudes de onda de la luz emitida; y opcionalmente

donde el uno o más dispositivos de detección de luz de emisión de fluorescencia es una cámara CCD, cámara CMOS, matriz detectora o una combinación de los mismos.

13. El sistema de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, donde:

a) el subsistema de control de la temperatura comprende además un dispositivo de detección térmica de infrarrojos en comunicación óptica con cada dispositivo de detección térmica;

b) cada dispositivo de detección térmica proporciona una señal de medición que depende de la intensidad de una radiación infrarroja de cuerpo negro recibida; y

c) cada dispositivo de detección térmica está configurado para proporcionar una trayectoria de radiación térmica desde el volumen de la mezcla de reacción acuosa hasta el dispositivo de detección térmica de infrarrojos, opcionalmente donde:

i) el dispositivo de detección térmica de infrarrojos es un reproductor de imágenes térmicas o un detector de infrarrojos, y donde la pluralidad de dispositivos de detección térmica no entra en contacto físico con la matriz acuosa de aceite;

ii) el dispositivo de colocación es una cinta que comprende la pluralidad de recipientes, comprendiendo cada recipiente un lado superior y un lado inferior, donde cada dispositivo de detección térmica corresponde al lado inferior de uno de los recipientes cuando el recipiente está en la posición de calentamiento, y donde cada fuente de radiación electromagnética corresponde al lado superior de uno de los recipientes cuando el recipiente está en la posición de calentamiento, por lo que se produce simultáneamente la emisión de radiación electromagnética a cada recipiente y la detección de radiación infrarroja de cuerpo negro emitida desde el volumen de cada mezcla de reacción acuosa; o

iii) el dispositivo de colocación es una cinta que comprende la pluralidad de recipientes, comprendiendo cada recipiente un lado superior y un lado inferior, donde cada dispositivo de detección térmica corresponde al lado superior de uno de los recipientes cuando el recipiente está en la posición de calentamiento, y donde cada fuente de radiación electromagnética corresponde al lado inferior de uno de los recipientes cuando el recipiente está en la posición de calentamiento, por lo que se produce simultáneamente la emisión de radiación electromagnética a cada recipiente y la detección de radiación infrarroja de cuerpo negro emitida desde el volumen de cada mezcla de reacción acuosa, opcionalmente donde las fuentes de radiación electromagnética son diodos emisores de luz que tienen una longitud de onda espectral en el intervalo de 380 nm a 500 nm y los recipientes comprenden además una delgada capa que comprende un metal de transición seleccionado del grupo que consiste en oro, plata, níquel y platino, preferiblemente donde el metal de transición es oro.

14. El sistema de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde el primer reactivo comprende una sonda de ácido nucleico unida covalentemente a un fluoróforo.

15. Un método para la amplificación por PCR mediada por luz y la detección de productos, comprendiendo el método:

a) proporcionar el sistema de amplificación por PCR y de detección de productos de la reivindicación 1;

b) ensamblar un conjunto de matrices acuosas de aceite por:

1) aspirar el uno o más aceites inmiscibles, comprendiendo la etapa de aspiración:

(i) aspirar el aceite de encapsulación de una entrada de aceite de encapsulación;

(ii) aspirar el aceite transportador de una entrada de aceite transportador; o

(iii) aspirar el aceite de encapsulación de una entrada de aceite de encapsulación y aspirar el aceite transportador de una entrada de aceite transportador;

2) aspirar un volumen de muestra polinucleotídica de una entrada de muestra polinucleotídica;

3) aspirar un volumen de reactivos de una entrada de mezcla de reactivos de PCR;

4) distribuir el volumen de muestra polinucleotídica, el volumen de reactivos y el uno o más aceites inmiscibles en la pluralidad de recipientes, donde el volumen de muestra polinucleotídica y el volumen de reactivos forman una mezcla de reacción acuosa, y donde los componentes de la mezcla de reacción acuosa no se mezclan con el uno o más aceites inmiscibles;

donde las etapas 1), 2) y 3) se realizan en cualquier orden o simultáneamente, y donde las etapas 1), 2) y 3) se realizan antes de la etapa 40);

c) calentar de forma uniforme cada volumen de la matriz acuosa de aceite, donde el calentamiento comprende:

1) colocar la fuente de radiación electromagnética en comunicación óptica con cada recipiente que contiene la matriz acuosa de aceite;

2) calentar el volumen de la matriz acuosa de aceite hasta que alcance una temperatura en el intervalo de 50 °C a 65 °C;

3) calentar adicionalmente el volumen de la matriz acuosa de aceite hasta que alcance una temperatura en el intervalo de 65 °C a 75 °C; y

4) calentar adicionalmente el volumen de la matriz acuosa de aceite hasta que alcance una temperatura en el intervalo de 90 °C a 99 °C;

d) refrigerar cada matriz acuosa de aceite colocando cada uno de los recipientes en cercana proximidad al mecanismo de refrigeración hasta que la matriz acuosa de aceite alcance una temperatura en el intervalo de 55 °C a 65 °C;

e) medir la emisión de fluorescencia desde cada recipiente que contiene la matriz acuosa de aceite, donde la medición comprende:

1) colocar un primer miembro óptico en comunicación óptica con cada recipiente que contiene la matriz acuosa de aceite, donde cada primer miembro óptico está configurado para proporcionar una trayectoria óptica para la luz de excitación de fluorescencia que tiene una primera longitud de onda espectral desde la una o más fuentes de luz de excitación de fluorescencia hasta uno de dichos recipientes que contienen la matriz acuosa de aceite cuando el recipiente está en una posición de detección de productos de PCR, donde el volumen de la mezcla de reacción acuosa comprende un primer reactivo con capacidad de excitación por la luz de excitación de fluorescencia que tiene la primera longitud de onda espectral cuando el primer reactivo hibrida con la muestra polinucleotídica, y donde cada primer miembro óptico está configurado además para proporcionar una trayectoria óptica para la luz de emisión de fluorescencia desde la mezcla de reacción acuosa hasta el uno o más dispositivos de detección de luz de emisión de fluorescencia; y

2) medir la señal producida por el uno o más dispositivos de detección de luz de emisión de fluorescencia desde al menos una mezcla de reacción acuosa; y

f) repetir de c) a e) para una cantidad predeterminada de ciclos adicionales.