ES2873097T3

ES2873097T3 - Método para producir una estructura de tipo zona marginal ciliar

Info

Publication number: ES2873097T3
Application number: ES13800106T
Authority: ES
Inventors: Tokushige Nakano; Satoshi Ando; Yoshiki Sasai; Mototsugu Eiraku
Original assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd; RIKEN
Current assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd; RIKEN
Priority date: 2012-06-08
Filing date: 2013-06-07
Publication date: 2021-11-03
Anticipated expiration: 2033-06-07
Also published as: EP2860245B1; KR102210180B1; US20180371409A1; JP6393614B2; CA2876047C; WO2013183774A1; AU2019229463A1; US10077425B2; CA3134317A1; AU2013272548B2; CN104508125A; CA3134317C; CA2876047A1; KR20150021567A; AU2013272548A1; JPWO2013183774A1; US11542471B2; AU2019229463B2; CN111607557A; EP2860245A1

Abstract

Un método para producir un agregado celular que comprende una estructura de tipo zona marginal ciliar, que comprende una etapa de cultivo de un agregado celular que comprende un tejido retiniano en el que las células positivas para Chx10 están presentes en una proporción de 20% o más del tejido en un medio carente de suero que contiene una sustancia que actúa sobre la vía de la señal de Wnt que puede mejorar la transducción de la señal mediada por Wnt solo durante un período antes de la aparición de una célula que expresa el gen RPE65, seguido del cultivo del "agregado celular en el que no aparece la célula que expresa el gen RPE65" así obtenido en un medio carente de suero que contiene un sustituto de suero o un medio que contiene suero, cada uno de los cuales no contiene una sustancia que actúa sobre la vía de la señal de Wnt, en donde la sustancia que actúa sobre la vía de la señal de Wnt que puede mejorar la transducción de señal mediada por Wnt se selecciona entre un proteína que pertenece a la familia Wnt, receptor de Wnt, agonista del receptor de Wnt e inhibidor de GSK3β; y en donde que el agregado celular que comprende un tejido retiniano en el que están presentes células positivas para Chx10 en una proporción de 20% o más del tejido es un agregado celular que se puede preparar mediante un método que comprende las siguientes etapas (1) a (3): (1) una primera etapa para someter las células madre pluripotentes a un cultivo en suspensión en un medio carente de suero que contiene una sustancia que inhibe la vía de la señal de Wnt para formar un agregado de células madre pluripotentes, (2) una segunda etapa para someter el agregado formado en la primera etapa a cultivo en suspensión en un medio carente de suero que contiene una preparación de membrana basal, y (3) una tercera etapa para someter el agregado cultivado en la segunda etapa a cultivo en suspensión en un medio que contiene suero.

Description

DESCRIPCIÓN

Método para producir una estructura de tipo zona marginal ciliar

Campo técnico

La presente invención se refiere a un método para producir una estructura de tipo zona marginal ciliar, y demás.

Antecedentes de la técnica

Se sabe que la zona marginal ciliar de la retina in vivo desempeña funciones importantes para la formación estructural y el mantenimiento de los tejidos de la retina (véase, por ejemplo, el documento no relacionado con patentes 1) y, por ejemplo, se conocen el gen Rdh10 (documento no relacionado con patentes 2) y el gen Otx1 (documento no relacionado con patentes 1) como marcadores genéticos de la zona marginal ciliar. Sin embargo, no existe un método conocido para producir tal estructura de tipo zona marginal ciliar a partir de células madre pluripotentes con alta eficiencia.

[Lista de documentos]

[Documentos no relacionados con patentes]

Documento no relacionado con patentes 1: W. Zac Stephens, Megan Senecal, Minhtu Nguyen y Tatjana Piotrowski (2010) Loss of adenomatous polyposis coli (apc) results in an expanded Ciliary Maginal Zone in the Zebrafish eye. DEVELOPMENTAL DYNAMICS Volumen: 239, Páginas: 2066-2077 documento no relacionado con patentes 2: Fumi Kubo y Shinichi Nakagawa (2009) Hairy1 acts as node dowstream of Wnt signaling to maintain retinal stem cell-lik progenitor cells in the chick ciliary marginal zone. Development Volumen: 136, páginas: 1823-1833

Compendio de la invención

Problemas que debe resolver la invención

Ha habido un deseo de desarrollar un método para producir una estructura de tipo zona marginal ciliar con alta eficiencia.

Medios para resolver los problemas

Los autores de la presente invención han realizado estudios intensivos en vista de tal situación y han llegado a la presente invención.

Específicamente, la presente invención proporciona:

1. un método para producir un agregado celular que comprende una estructura de tipo zona marginal ciliar, que comprende una etapa de cultivo de un agregado celular que comprende un tejido retiniano en el que las células positivas para Chx10 están presentes en una proporción de 20% o más del tejido en un medio carente de suero que contiene una sustancia que actúa sobre la vía de la señal de Wnt que puede mejorar la transducción de la señal mediada por Wnt solo durante un período antes de la aparición de una célula que expresa el gen RPE65, seguido del cultivo del "agregado celular en el que no aparece la célula que expresa el gen RPE65" así obtenido en un medio carente de suero que contiene sustituto de suero o medio que contiene suero, cada uno de los cuales no contiene una sustancia que actúa sobre la vía de la señal de Wnt, en donde la sustancia que actúa sobre la vía de la señal la Wnt que puede mejorar la transducción de la señal mediada por Wnt se selecciona entre una proteína que pertenece a la familia de Wnt, receptor de Wnt, agonista del receptor de Wnt e inhibidor de GSK3p; y

en donde el agregado celular que comprende un tejido retiniano en el que están presentes células positivas para Chx10 en una proporción de 20% o más del tejido es un agregado celular que se puede preparar mediante un método que comprende las siguientes etapas (1) a (3):

(1) una primera etapa para someter las células madre pluripotentes a un cultivo en suspensión en un medio carente de suero que contiene una sustancia que inhibe la vía de la señal de Wnt para formar un agregado de células madre pluripotentes,

(2) una segunda etapa para someter el agregado formado en la primera etapa a cultivo en suspensión en un medio carente de suero que contiene una preparación de membrana basal, y

(3) una tercera etapa para someter el agregado cultivado en la segunda etapa a cultivo en suspensión en un medio que contiene suero;

2. el método de producción del apartado 1 mencionado anteriormente, en donde el período antes de la aparición de una célula que expresa el gen RPE65 es un período durante el cual las células positivas para Chx10 están presentes en el tejido retiniano en una proporción comprendida entre 50% y 1% del tejido, y el agregado celular en el que no aparece una célula que expresa el gen RPE65 es un agregado celular en el que las células positivas para Chx10 están presentes en el tejido retiniano en una proporción comprendida entre 50% y 1% del tejido.

3. el método de producción del apartado 2 mencionado anteriormente, en donde el "agregado celular en el que no aparece una célula que expresa el gen RPE65" así obtenido se cultiva en un medio carente de suero que contiene un sustituto de suero o un medio que contiene suero, cada uno de los cuales no contiene un sustancia que actúa sobre la vía de la señal de Wnt hasta que la proporción de células positivas para Chx10 presentes en el tejido retiniano alcanza 50% o más del tejido;

4. el método de producción de cualquiera de los apartados 1 a 3 mencionados anteriormente, en donde el tejido retiniano se obtiene a partir de una célula madre pluripotente humana;

5. el método de producción según cualquiera de los apartados 1 a 4 mencionados anteriormente, en donde la sustancia que actúa sobre la vía de la señal de Wnt que puede mejorar la transducción de la señal mediada por Wnt es CHIR99021;

6. un método para producir una retina neural que comprende:

producir un agregado celular que comprende una estructura de tipo zona marginal ciliar mediante el método de producción según uno cualquiera de los apartados 1 a 5 mencionados anteriormente,

obtener un agregado celular que comprende una estructura de tipo zona marginal ciliar en la que un epitelio pigmentario retiniano y un tejido retiniano están presentes adyacentes a la estructura de tipo zona marginal ciliar, y

cortar el tejido retiniano del agregado celular que comprende una estructura de tipo zona marginal ciliar, obteniendo de ese modo un tejido retiniano purificado.

Efecto de la invención

De acuerdo con el método de producción de la presente invención, se puede producir una estructura de tipo zona marginal ciliar con alta eficiencia. En un agregado celular que comprende una estructura de tipo zona marginal ciliar producida por el método de producción de la presente invención, la estructura de tipo zona marginal ciliar funciona como una zona de progreso, y se puede formar con alta frecuencia una retina neural continua que tiene una estructura en capas adyacente a la estructura de tipo zona marginal ciliar.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 es una vista que muestra una imagen de fluorescencia de GFP de células que expresan el gen Rax en una criosección de agregado celular antes del cultivo en suspensión en un medio carente de suero que contiene una sustancia que actúa sobre la vía de la señal de Wnt.

La Fig. 2 es una vista que muestra una imagen de inmunotinción de fluorescencia, utilizando un anticuerpo anti-Chx10, de una criosección de agregado celular antes del cultivo en suspensión en un medio carente de suero que contiene una sustancia que actúa sobre la vía de la señal de Wnt. La comparación de la Fig. 1 (que muestra la presencia de tejidos retinianos completos) y la Fig. 2 (que muestra la presencia de células positivas para Chx10) confirma la presencia de células positivas para Chx10 en aproximadamente 40% del total antes de la adición de una sustancia que actúa sobre la vía de la señal de Wnt.

La Fig. 3 es una vista que muestra una imagen de fluorescencia de GFP de células que expresan el gen Rax en una criosección de agregado celular el día 3 después del cultivo en suspensión en un medio carente de suero que contiene una sustancia que actúa sobre la vía de la señal de Wnt.

La Fig. 4 es una vista que muestra una imagen de inmunotinción de fluorescencia, utilizando un anticuerpo anti-Chx10, de una criosección de agregado celular el día 3 después del cultivo en suspensión en un medio carente de suero que contiene una sustancia que actúa sobre la vía de la señal de Wnt. La comparación de la Fig.3 (que muestra la presencia de tejidos retinianos completos) y la Fig.4 (que muestra la presencia de células positivas para Chx10) revela la presencia de células positivas para Chx10 solo en aproximadamente 3% del total en 3 días después de la adición de una sustancia que actúa sobre el vía de la señal de Wnt al medio, por medio de lo cual se puede confirmar una clara disminución.

La Fig. 5 es una vista que muestra una imagen de fluorescencia de GFP de células que expresan el gen Rax en una criosección de agregado celular después del cultivo en suspensión durante 3 días en un medio carente de suero que contiene una sustancia que actúa sobre la vía de la señal de Wnt seguida de cultivo en suspensión durante 39 días en un medio que contiene suero que no contiene una sustancia que actúe sobre la vía de la señal de Wnt.

La Fig. 6 es una vista que muestra una imagen de inmunotinción de fluorescencia, utilizando un anticuerpo anti-Rdh10, de una criosección de agregado celular después del cultivo en suspensión durante 3 días en un medio carente de suero que contiene una sustancia que actúa sobre la vía de la señal de Wnt seguido de cultivo en suspensión durante 39 días en un medio que contiene suero que no contiene una sustancia que actúa sobre la vía de la señal de Wnt. La comparación de la Fig. 5 (que muestra la presencia de tejidos retinianos completos) y la Fig. 6 (que muestra la presencia de células positivas para Rdh10) confirma la presencia de células positivas para Rdh10 resultantes del cultivo durante 3 días con la adición de una sustancia que actúa sobre la vía de la señal de Wnt seguida del cultivo en un medio que contiene suero que no contiene una sustancia que actúa sobre la vía de la señal de Wnt.

La Fig. 7 es una vista que muestra una imagen de fluorescencia de GFP de células que expresan el gen Rax en una criosección de agregado celular después del cultivo en suspensión durante 3 días en un medio carente de suero que contiene una sustancia que actúa sobre la vía de la señal de Wnt seguido de cultivo en suspensión durante 50 días en un medio que contiene suero que no contiene una sustancia que actúa sobre la vía de la señal de Wnt.

La Fig. 8 es una vista que muestra una imagen de inmunotinción de fluorescencia, utilizando un anticuerpo anti-Rdh10, de una criosección de agregado celular después del cultivo en suspensión durante 3 días en un medio carente de suero que contiene una sustancia que actúa sobre la vía de la señal de Wnt seguido de cultivo en suspensión durante 50 días en un medio que contiene suero que no contiene una sustancia que actúa sobre la vía de la señal de Wnt.

La Fig. 9 es una vista que muestra una imagen de inmunotinción de fluorescencia, utilizando un anticuerpo anti-Otx1, de una criosección de agregado celular después del cultivo en suspensión durante 3 días en un medio carente de suero que contiene una sustancia que actúa sobre la vía de la señal de Wnt seguido de cultivo en suspensión durante 50 días en un medio que contiene suero que no contiene una sustancia que actúa sobre la vía de la señal de Wnt. La comparación de la Fig. 7 (que muestra la presencia de tejidos retinianos completos), la Fig. 8 (que muestra la presencia de células positivas para Rdh10) y la Fig. 9 (que muestra la presencia de células positivas para Otx1) confirma la presencia de células positivas para Rdh10 y células positivas para Otx1 resultantes del cultivo durante 3 días con la adición de una sustancia que actúa sobre la vía de la señal de Wnt seguida de cultivo en un medio que contiene suero que no contiene una sustancia que actúa sobre la vía de la señal de Wnt.

La Fig. 10 muestra una imagen de tinción de una criosección de una región que contiene una estructura de tipo zona marginal ciliar contenida en un agregado celular preparado como se muestra a continuación. Un agregado celular el día 18 después del inicio del cultivo en suspensión se cultivó en suspensión durante 3 días en un medio carente de suero que contenía una sustancia que actuaba sobre la vía de la señal de Wnt y se cultivó en suspensión durante 46 días en un medio que contenía suero que no contenía una sustancia que actuaba sobre la vía de la señal de Wnt, a continuación se cultivó durante 1 día en presencia de BrdU, a continuación, se cultivó durante 13 días en ausencia de BrdU y se cultivó durante 1 día en presencia de EdU (Invitrogen). Se prepararon criosecciones del agregado celular obtenido y se sometieron a inmunotinción de fluorescencia con un anticuerpo anti-Ki67 (Figura izquierda) o un anticuerpo anti-BrdU (Figura derecha), o una reacción de desarrollo de color con EdU (Figura central).

La Fig. 11 muestra una imagen de tinción de una criosección de una región que contiene una estructura de tipo zona marginal ciliar contenida en un agregado celular preparado como se muestra a continuación. Un agregado celular el día 18 después del inicio del cultivo en suspensión se cultivó en suspensión durante 3 días en un medio carente de suero que contenía una sustancia que actuaba sobre la vía de la señal de Wnt y se cultivó en suspensión durante 46 días en un medio que contenía suero que no contenía una sustancia que actuaba sobre la vía de la señal de Wnt, a continuación, se cultivó durante 1 día en presencia de BrdU, a continuación, se cultivó durante 13 días en ausencia de BrdU, se cultivó durante 1 día en presencia de EdU (Invitrogen) y se cultivó adicionalmente durante 13 días en ausencia de EdU. Se prepararon criosecciones del agregado celular obtenido y se sometieron a inmunotinción de fluorescencia con un anticuerpo anti-Ki67 (Figura izquierda) o un anticuerpo anti-BrdU (Figura derecha) o un anticuerpo anti-Rdh10 (Figura inferior), o reacción de desarrollo de color con EdU (Figura central).

La Fig. 12 es una vista que muestra el análisis de un agregado celular obtenido al someter un agregado celular el día 18 después del inicio del cultivo en suspensión a cultivo en suspensión durante 3 días en un medio carente de suero que contiene una sustancia que actúa sobre la vía de la señal de Wnt y cultivo en suspensión durante 75 días en un medio que contiene suero que no contiene una sustancia que actúa sobre la vía de la señal de Wnt.

La Fig. 12A es un ejemplo de un agregado celular en dichas condiciones, y muestra una imagen de contraste de fase de un agregado celular sin una estructura de tipo zona marginal ciliar (CMZ) (A, fila izquierda, panel superior), una imagen de fluorescencia de GFP de células que expresan el gen Crx en un agregado celular sin una estructura de tipo zona marginal ciliar (A, fila izquierda, panel inferior), una imagen de contraste de fase de un agregado celular que contiene una estructura de tipo zona marginal ciliar (A, fila derecha, panel superior ) y una imagen de fluorescencia de GFP de una célula que expresa el gen Crx en un agregado celular que contiene una estructura de tipo zona marginal ciliar (A, fila derecha, panel inferior).

La Fig. 12B es un gráfico relativo a los agregados celulares sin una estructura de tipo zona marginal ciliar (CMZ-) y agregados celulares con una estructura de tipo zona marginal ciliar (CMZ+), que muestra los resultados de la medición de la proporción de agregados celulares que contienen retina neural estratificada, continua en no menos de 10% de la circunferencia del agregado celular, utilizando la forma de la célula que expresa el gen Crx como índice.

Modos de llevar a cabo la invención

Los modos para llevar a cabo la presente invención se explican en detalle a continuación.

En la presente invención, los ejemplos de "célula madre" incluyen una célula que mantiene la misma capacidad de diferenciación incluso después de la división celular y puede regenerar un tejido cuando se lesiona. Aquí, la "célula madre" puede ser una célula madre embrionaria (célula ES) o una célula madre tisular (también llamada célula madre tisular, célula madre específica de tejido o célula madre somática), o una célula madre pluripotente artificial (célula iPS: célula madre pluripotente inducida) pero no se limita a ellas. Como se aprecia por el hecho de que la célula de tejido derivada de células madre puede regenerar un tejido, se sabe que la célula madre puede diferenciarse a una célula normal cercana a una en un organismo vivo.

Los ejemplos de la "célula madre pluripotente" en la presente invención incluyen una célula madre que se puede cultivar in vitro y tiene la capacidad de diferenciarse a cualquier célula (tejido derivado de triploblastos (ectodermo, mesodermo, endodermo)) que constituye un organismo vivo excepto placenta (pluripotencia), incluida una célula madre embrionaria (célula ES). También incluye una célula que tiene una pluripotencia artificial similar a la de las células madre embrionarias, después de introducir varios tipos de genes en una célula somática (también llamada célula madre pluripotente artificial). La célula madre pluripotente se puede producir mediante un método conocido per se. Los ejemplos del método de producción incluyen los métodos descritos en Cell 131 (5) pág. 861-872 (2007), Cell 126 (4) pág. 663-676 (2006), etc.

Los ejemplos de "célula madre embrionaria (célula ES)" en la presente invención incluyen una célula madre que tiene capacidad de autorreplicación y multipotencia (es decir, "pluripotencia"), que es una célula madre pluripotente derivada de un embrión temprano. La célula madre embrionaria se estableció por primera vez en 1981 y también se ha aplicado a la generación de ratones con una modificación genética para inactivar la expresión de un gen “knockout” desde 1989. En 1998, se estableció una célula madre embrionaria humana, divulgada solo como referencia, que también se utiliza para la medicina regenerativa.

Los ejemplos de la "célula madre pluripotente artificial" en la presente invención incluyen una célula inducida para que tenga multipotencia reprogramando directamente una célula diferenciada tal como fibroblasto, etc. mediante la expresión de varias clases de genes tales como Oct3/4, Sox2, Klf4 y Myc, que fue establecida por Yamanaka et al. en la célula de ratón en 2006 (Takahashi K, Yamanaka S. Cell. 2006, 126(4), pág. 663-676). En 2007, la célula madre pluripotente artificial también se estableció en fibroblasto humano y tiene una multipotencia similar a la de las células madre embrionarias (Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, Narita M, Ichisaka T, Tomoda K, Yamanaka S. Cell. 2007, 131(5), pág. 861-872; Yu J, Vodyanik MA, Smuga-Otto K, Antosiewicz-Bourget J, Frane j L, Tian S, Nie J, Jonsdottir GA, Ruotti V, Stewart R, Slukvin II, Thomson JA., Science. 2007, 318(5858), pág. 1917-1920; Nakagawa M, Koyanagi M, Tanabe K, Takahashi K, Ichisaka T, Aoi T, Okita K, Mochiduki Y, Takizawa N, Yamanaka S. Nat Biotechnol., 2008, 26(1), pág. 101-106).

Las células madre pluripotentes están disponibles en determinadas organizaciones, o se puede adquirir un producto disponible comercialmente. Por ejemplo, las células madre embrionarias humanas, KhES-1, KhES-2 y KhES-3, descritas solo como referencia, están disponibles en el Instituto de Ciencias Médicas Fronterizas de la Universidad de Kyoto. La célula EB5, que es una célula madre embrionaria de ratón, está disponible en RIKEN, y la línea celular D3 está disponible en ATCC, respectivamente.

Las células madre pluripotentes se pueden mantener cultivando según un método conocido per se. Por ejemplo, las células madre humanas se pueden mantener cultivando utilizando Knockout Serum Replacement (KSR). Por ejemplo, las células madre de ratón se pueden mantener cultivando con la adición de suero bovino fetal (FCS) y LIF, y sin células alimentadoras.

Los ejemplos del "tejido" en la presente invención incluyen una estructura de una población celular, que tiene una conformación en donde más de un tipo de célula con diferentes formas y propiedades está configurado estéricamente en un patrón dado.

En la presente invención, los ejemplos del "tejido retiniano" incluyen un tejido retiniano, etc. en donde al menos dos o más tipos de células tales como fotorreceptores, células horizontales, células bipolares, células amacrinas, células ganglionares retinianas, sus células precursoras, células progenitoras retinianas de las mismas, etc., que constituyen las respectivas capas retinianas en la retina in vivo, están dispuestas estéricamente en capas. Con respecto a cada célula, qué célula constituye qué capa retiniana se puede confirmar mediante un método conocido, por ejemplo, la presencia o ausencia de la expresión de un marcador celular o su nivel, etc.

Los ejemplos del marcador de células de la retina incluyen Rax (célula progenitora de la retina), PAX6 (célula progenitora), Chx10 (célula progenitora de la retina neural), nestina (expresada en la célula progenitora de la neurona del hipotálamo pero no expresada en la célula progenitora de la retina), Sox1 (expresada en el neuroepitelio del hipotálamo pero no expresada en la retina), Crx (célula precursora del fotorreceptor), etc. Los ejemplos del marcador de la neurona específica de la capa retiniana mencionada anteriormente incluyen Chx10 (célula precursora neural de la retina o célula bipolar), L7 (célula bipolar), Tuj1 (célula ganglionar), Brn3 (célula ganglionar), calretinina (célula amacrina), Calbindina (célula horizontal), Rodopsina (fotorreceptor), Recoverina (fotorreceptor), RPE65 (epitelio pigmentario), Mitf (epitelio pigmentario), Nrl (célula de bastón), Rxr-gamma (célula de cono), y así sucesivamente.

La "capa retiniana" en la presente invención representa cada capa que constituye la retina. Los ejemplos específicos de las mismas incluyen capa epitelial pigmentaria retiniana, capa de fotorreceptores, membrana limitante externa, capa nuclear externa, capa plexiforme externa, capa nuclear interna, capa plexiforme interna, capa de células ganglionares, capa de fibras nerviosas y membrana limitante interna.

Los ejemplos de la "zona marginal ciliar (CMZ)" en la presente invención incluyen un tejido presente en la región límite del tejido retiniano (específicamente, la retina neural) y el epitelio pigmentario retiniano en la retina in vivo, que es una región que incluye una célula madre tisular de la retina (célula madre retiniana). Los ejemplos del gen marcador de la zona marginal ciliar incluyen el gen Rdh10 (positivo), el gen Otx1 (positivo), y así sucesivamente. Se sabe que la zona marginal ciliar juega un papel importante en el suministro de células progenitoras retinianas y células diferenciadas a los tejidos retinianos, mantenimiento de la estructura del tejido retiniano, y así sucesivamente.

Los ejemplos de la "zona de progreso" en la presente invención incluyen una población de células indiferenciadas localizadas en una parte de un tejido, y los ejemplos de las mismas incluyen una población de células que tienen propiedades para crecer continuamente en el proceso de desarrollo y regeneración para contribuir al crecimiento de un tejido como un todo y/o propiedades para contribuir al crecimiento de los tejidos circundantes mediante la secreción de un factor de crecimiento, etc. Los ejemplos específicos de la zona de progreso incluyen una población de células indiferenciadas en la punta de la yema de una extremidad.

Los ejemplos del "agregado" en la presente invención incluyen una masa de células dispersas en el medio, pero reunidas para formar el mismo. El "agregado" en la presente invención incluye un agregado formado por las células dispersas al comienzo del cultivo en suspensión y un agregado ya formado al comienzo del cultivo en suspensión.

Cuando las células se juntan para formar agregados celulares y los agregados se someten a cultivo en suspensión, "formar agregado" significa "agregar rápidamente un número dado de células madre dispersas" para formar agregados celulares cualitativamente uniformes.

Los ejemplos de la operación experimental para formar un agregado incluyen un método que implica mantener las células en un espacio pequeño mediante el uso de una placa con pocillos pequeños (placa de 96 pocillos), microporos, etc., un método que implica la agregación de células mediante centrifugación durante un corto tiempo utilizando un pequeño tubo de centrifugación, y así sucesivamente.

El "medio" que se utilizará en la presente invención se puede preparar a partir de un medio utilizado para el cultivo de células animales como medio basal. Los ejemplos del medio basal incluyen medios que se pueden utilizar para cultivar células animales tales como medio BME, medio BGJb, medio CMRL1066, medio MEM de Glasgow, medio MEM Zinc Option mejorado, medio IMDM, medio Medium199, medio MEM de Eagle, medio aMEM, medio DMEM, medio de Ham, medio RPMI1640, medio de Fischer y medio mixto de los mismos, etc.

Los ejemplos del "medio carente de suero" en la presente invención incluyen un medio carente de suero no ajustado o sin purificar. En la presente invención, un medio que contiene componentes derivados de sangre purificados y componentes derivados de tejido animal (p. ej., factor de crecimiento) también se incluye en un medio carente de suero, a menos que contenga suero sin ajustar o sin purificar.

Para evitar una preparación complicada, se puede mencionar preferiblemente un medio carente de suero (GMEM o DMEM, 2-mercaptoetanol 0,1 mM, mezcla de aminoácidos no esenciales 0,1 mM, piruvato sódico 1 mM) al que se ha añadido una cantidad adecuada (p. ej., 1-20%) de KSR disponible comercialmente como medio carente de suero.

Además, el medio carente de suero puede contener un sustituto de suero. Los ejemplos del sustituto de suero incluyen albúmina, transferrina, ácido graso, precursor de colágeno, oligoelemento, 2-mercaptoetanol o 3'-tiolglicerol, uno que contenga apropiadamente equivalentes de estos, etc., y así sucesivamente. Tal sustituto de suero se puede preparar, por ejemplo, mediante el método descrito en el documento WO98/30679 y así sucesivamente. Además, el sustituto de suero puede ser un producto disponible comercialmente. Los ejemplos de tal sustituto de suero disponible comercialmente incluyen Lípido concentrado Químicamente definido (fabricado por Gibco), Glutamax (fabricado por Gibco) y así sucesivamente.

El "medio carente de suero" que se utilizará para el cultivo en suspensión puede contener ácidos grasos, lípidos, aminoácidos (p. ej., aminoácidos no esenciales), vitaminas, factores de crecimiento, citocinas, antioxidantes, 2-mercaptoetanol, ácido pirúvico, agente tamponador, sales inorgánicas y así sucesivamente.

Los ejemplos del "medio que contiene suero" en la presente invención incluyen un medio que contiene suero no ajustado o no purificado. El medio puede contener ácidos grasos, lípidos, aminoácidos (p. ej., aminoácidos no esenciales), vitaminas, factores de crecimiento, citocinas, antioxidantes, 2-mercaptoetanol, ácido pirúvico, agentes tamponadores, sales inorgánicas, y así sucesivamente.

Los ejemplos del "cultivo en suspensión" en la presente invención incluyen el cultivo de agregados celulares en un medio en condiciones no adherentes a un recipiente de cultivo celular, y así sucesivamente.

El recipiente de cultivo celular que se utilizará en el cultivo en suspensión no está particularmente limitado siempre que permita el cultivo en suspensión de las células. Los ejemplos de tal recipiente de cultivo celular incluyen matraz, matraz de cultivo de tejidos, placa, placa de Petri, placa de cultivo de tejidos, placa múltiple, microplaca, placa de micropocillos, microporo, placa múltiple, placa de múltiples pocilios, portaobjetos con cámara, cuenco, tubo, bandeja, bolsa de cultivo, botella rodante y así sucesivamente. Un recipiente preferible es un recipiente no adhesivo a las células.

Como recipiente no adhesivo a las células, se puede utilizar uno que tenga su superficie no tratada artificialmente para mejorar la adhesividad celular (p. ej., tratamiento de recubrimiento con matriz extracelular, etc.), y así sucesivamente.

Los ejemplos del "suero" que se añadirá al medio en la presente invención incluyen sueros de mamíferos tales como suero bovino, suero de ternera, suero bovino fetal, suero de caballo, suero de potro, suero de caballo fetal, suero de conejo, suero de lebrato, suero de conejo fetal y suero humano, y así sucesivamente.

El método de producción de la presente invención incluye característicamente una etapa de cultivo de un agregado celular que comprende un tejido retiniano en el que las células positivas para Chx10 están presentes en una proporción de 20% o más del tejido en un medio carente de suero o medio que contiene suero que contienen cada uno una sustancia que actúa sobre la vía de la señal de Wnt solo durante un período antes de la aparición de una célula que expresa el gen RPE65, seguido del cultivo del "agregado celular en el que no aparece una célula que expresa el gen RPE65", así obtenido en un medio carente de suero o medio que contiene suero, cada uno de los cuales no contiene una sustancia que actúa sobre la vía de la señal de Wnt. El "agregado celular que comprende una estructura de tipo zona marginal ciliar" producido por el método de producción de la presente invención es útil como reactivo para su uso para la evaluación de la toxicidad o eficacia farmacológica de sustancias químicas, etc., o un material para su uso para las pruebas o tratamientos destinados a la terapia celular, y así sucesivamente.

El "agregado celular que comprende un tejido retiniano" que se utilizará como material de partida en el método de producción de la presente invención es un agregado celular en el que las células positivas para Chx10 están presentes en el tejido retiniano en una proporción de 20% o más del tejido. La "proporción de células positivas para Chx10" antes mencionada es, por ejemplo, preferiblemente no menos de 40%, más preferiblemente no menos de 60%, particularmente preferiblemente no menos de 80%.

El "agregado celular que comprende un tejido retiniano" que se utilizará como material de partida en el método de producción de la presente invención se puede preparar, por ejemplo, a partir de una célula madre pluripotente (preferiblemente célula madre pluripotente humana). Específicamente, por ejemplo, se puede preparar mediante un método que incluye las siguientes etapas (1) a (3).

(3) una tercera etapa para someter el agregado cultivado en la segunda etapa a cultivo en suspensión en un medio que contiene suero.

Una sustancia que inhibe la vía de la señal de Wnt que se utilizará en la primera etapa no está particularmente limitada siempre que pueda suprimir la transducción de la señal mediada por Wnt. Los ejemplos de la sustancia que inhibe la vía de la señal de Wnt incluyen Dkk1, proteína Cerberus, inhibidor del receptor de Wnt, receptor de Wnt de tipo soluble, anticuerpo contra Wnt, inhibidor de caseína quinasa, proteína Wnt negativa dominante, CKI-7 (N-(2-aminoetil)-5-cloroisoquinolina-8-sulfonamida), D4476 (4-{4-(2,3-dihidrobenzo[1,4]dioxin-6-il)-5-piridin-2-il-1 H-imidazol-2-il}benzamida), IWR-1 -endo (IWR1e), IWP-2 y así sucesivamente. Solo es necesario que la concentración de la sustancia que inhibe la vía de la señal de Wnt sea una concentración a la que se forman agregados de células madre pluripotentes. Por ejemplo, se añade una sustancia común que inhibe la vía de la señal de Wnt tal como IWR1 e a una concentración de aproximadamente 0,1 pM a 100 pM, preferiblemente de aproximadamente 1 pM a 10 pM, más preferiblemente de aproximadamente 3 pM.

Se puede añadir una sustancia que inhibe la vía de la señal de Wnt al medio carente de suero antes del inicio del cultivo en suspensión, o se puede añadir a un medio carente de suero en el plazo de varios días desde el inicio del cultivo en suspensión (p. ej., en el plazo de 5 días). Preferiblemente, se añade una sustancia que inhibe la vía de la señal de Wnt a un medio carente de suero en el plazo de 5 días, más preferiblemente en el plazo de 3 días, desde el inicio del cultivo en suspensión, lo más preferiblemente simultáneamente con el inicio del cultivo en suspensión. Además, el cultivo en suspensión se realiza hasta el día 18, más preferiblemente el día 12, desde el inicio del cultivo en suspensión con la adición de una sustancia que inhibe la vía de la señal de Wnt.

Las condiciones de cultivo tales como la temperatura de cultivo y la concentración de CO²en la primera etapa se pueden determinar de manera apropiada. Aunque la temperatura de cultivo no está particularmente limitada, es, por ejemplo, de aproximadamente 30 a 40°C, preferiblemente de aproximadamente 37°C. La concentración de CO²es, por ejemplo, de aproximadamente 1 a 10%, preferiblemente de alrededor de 5%.

La concentración de las células madre pluripotentes en la primera etapa puede ser determinada según sea apropiado por los expertos en la técnica para formar agregados de células madre pluripotentes de manera más uniforme y eficiente. La concentración de las células madre pluripotentes cuando se forman agregados no está particularmente limitada siempre que permita la formación de agregados uniformes de células madre. Por ejemplo, cuando las células ES humanas se someten a cultivo en suspensión utilizando una placa de micropocillos de 96 pocillos, se prepara un líquido a aproximadamente 1 x 103 a aproximadamente 5 x 104 células, preferiblemente aproximadamente 3 x 103 a aproximadamente 3 x 104 células, más preferiblemente aproximadamente 5 x 103 a aproximadamente 2 x 104 células, lo más preferiblemente se añaden alrededor de 9 x 103 células por pocillo, y la placa se deja en reposo para formar agregados.

El tiempo de cultivo en suspensión necesario para formar agregados se puede determinar según sea apropiado según la célula madre pluripotente que se va a utilizar, siempre que las células puedan agregarse rápidamente. Para formar agregados uniformes, es deseable que sea lo más corto posible. Por ejemplo, en el caso de las células madre embrionarias humanas, es deseable que los agregados se formen preferiblemente en el plazo de 24 horas, más preferiblemente en el plazo de 12 horas. Los expertos en la técnica pueden ajustar apropiadamente el tiempo para la formación de agregados controlando las herramientas para agregar las células, las condiciones de centrifugación, y así sucesivamente.

Los expertos en la técnica pueden determinar si se han formado agregados de células madre pluripotentes, basándose en el tamaño y número de células de los agregados, morfología macroscópica, morfología microscópica mediante análisis de tinción de tejidos y uniformidad de los mismos, expresión de marcadores de diferenciación e indiferenciación y uniformidad de los mismos, control de la expresión del marcador de diferenciación y sincronismo del mismo, reproducibilidad de la eficiencia de diferenciación entre agregados, y así sucesivamente.

La preparación de la membrana basal que se utilizará en la segunda etapa se refiere a aquella que contiene componentes que constituyen la membrana basal que tienen la función de controlar la morfología celular, la diferenciación, el crecimiento, la motilidad, la expresión de la función, y así sucesivamente, que son similares a los de las células epiteliales, cuando las células previstas capaces de formar una membrana basal se siembran en placa y se cultivan. Aquí, el "componente que constituye la membrana basal" se refiere a una molécula de matriz extracelular en la morfología de una membrana delgada presente entre la capa de células epiteliales y la capa de células intersticiales, y así sucesivamente, en tejidos animales. Se puede producir una preparación de membrana basal, por ejemplo, eliminando células capaces de formar una membrana basal, que se adhieren a un soporte a través de una membrana basal, con una solución capaz de disolver el lípido de las células, una solución alcalina, y así sucesivamente. Los ejemplos de preparación preferible de la membrana basal incluyen productos disponibles comercialmente como componentes de la membrana basal (p. ej., Matrigel (en adelante, a veces denominado Matrigel)) y moléculas de matriz extracelular conocidas como componentes de la membrana basal (p. ej., laminina, colágeno de tipo IV, proteoglicano heparán sulfato, entactina y así sucesivamente).

Matrigel es un producto preparado a partir de una membrana basal derivada del sarcoma de ratón Engelbreth Holm Swarn (EHS). El componente principal de Matrigel es colágeno tipo IV, laminina, proteoglicano heparán sulfato y entactina. Además de estos, están contenidos TGF-p, factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), activador del plasminógeno tisular y un factor de crecimiento producido naturalmente por el tumor EHS. El "producto de factor de crecimiento reducido (GFR)" de Matrigel tiene una concentración de factor de crecimiento más baja que el Matrigel común. En la presente invención, se utiliza preferiblemente el producto GFR.

Si bien la concentración de la preparación de la membrana basal que se va a añadir a un medio carente de suero para el cultivo en suspensión en la segunda etapa no está particularmente limitada siempre que la estructura epitelial del tejido neural (p. ej., tejido retiniano) se mantenga establemente, por ejemplo, es preferiblemente de 1/20 a 1/200 de volumen, más preferiblemente alrededor de 1/100 de volumen, del medio de cultivo cuando se utiliza Matrigel. Si bien la preparación de la membrana basal ya puede haberse añadido al medio cuando se inicia el cultivo de células madre, preferiblemente se añade al medio carente de suero en el plazo de 5 días, más preferiblemente en el plazo de 2 días, desde el inicio del cultivo en suspensión.

Como medio carente de suero que se utilizará en la segunda etapa, se puede utilizar directamente el medio carente de suero utilizado en la primera etapa o se puede sustituir por un medio carente de suero de nueva aportación.

Cuando el medio carente de suero utilizado en la primera etapa se utiliza directamente para esta etapa, se puede añadir al medio la "preparación de la membrana basal".

Las condiciones de cultivo tales como la temperatura de cultivo y la concentración de CO²en la segunda etapa se pueden determinar de manera apropiada. Aunque la temperatura de cultivo no está particularmente limitada, es, por ejemplo, de aproximadamente 30 a 40°C, preferiblemente de alrededor de 37°C. La concentración de CO²es, por ejemplo, de aproximadamente 1 a 10%, preferiblemente de alrededor de 5%.

Como medio que contiene suero que se utilizará en la tercera etapa, se puede utilizar el medio carente de suero utilizado en el cultivo de la segunda etapa al que se añade un suero directamente, o se sustituye por un medio que contiene suero de nueva aportación.

El suero se añade el día 7 o después, más preferiblemente el día 9 o después, lo más preferiblemente el día 12, desde el inicio del cultivo en suspensión. La concentración del suero que se añadirá es de aproximadamente 1 a 30%, preferiblemente de aproximadamente 3 a 20%, más preferiblemente de alrededor de 10%.

En la tercera etapa, la eficiencia de producción de tejido retiniano se puede aumentar añadiendo una sustancia que actúa sobre la vía de la señal de Shh además del suero.

La sustancia que actúa sobre la vía de la señal de Shh no está particularmente limitada siempre que pueda mejorar la transducción de la señal mediada por Shh. Los ejemplos de la sustancia que actúa sobre la vía de la señal de Shh incluyen proteínas que pertenecen a la familia Hedgehog (p. ej., Shh), receptor de Shh, agonista del receptor de Shh, Purmorfamina, SAG, y así sucesivamente.

La concentración de la sustancia que actúa sobre la vía de la señal de Shh utilizada en esta etapa es, por ejemplo, en el caso de una sustancia común que actúa sobre la vía de la señal de Shh, tal como SAG, de aproximadamente 0,1 nM a 10 pM, preferiblemente de aproximadamente 10 nM a 1 pM, más preferiblemente alrededor de 100 nM.

El tejido retiniano así producido está presente para cubrir la superficie del agregado. Si se produce tejido retiniano se puede confirmar mediante un método de inmunotinción, etc.

Por ejemplo, el agregado cultivado en la tercera etapa se somete a cultivo en suspensión en un medio que contiene suero. Los ejemplos del recipiente de cultivo celular que se utilizará para el cultivo en suspensión incluyen los mencionados anteriormente. Las condiciones de cultivo tales como la temperatura de cultivo, la concentración de CO², y la concentración de O²del cultivo en suspensión se pueden determinar de forma apropiada. Aunque la temperatura de cultivo no está particularmente limitada, es, por ejemplo, de aproximadamente 30 a 40°C, preferiblemente de aproximadamente 37°C. La concentración de CO²es, por ejemplo, de aproximadamente 1 al 10%, preferiblemente de aproximadamente 5%. La concentración de O²es, por ejemplo, de 20 al 70%, preferiblemente de 20 al 60%, más preferiblemente de 30 al 50%. Aunque el período de cultivo no está particularmente limitado, generalmente no es menos de 48 horas, preferiblemente no menos de 7 días.

Una vez completado el cultivo en suspensión, los agregados se fijan con un fijador tal como una solución de paraformaldehído, etc., y se prepara una criosección. La criosección obtenida se somete a inmunotinción y se confirma la formación de una estructura de capas de tejido retiniano. Dado que las capas respectivas de un tejido retiniano están compuestas por diferentes células progenitoras de la retina (fotorreceptor, célula horizontal, célula bipolar, célula amacrina, célula ganglionar de la retina), la formación de una estructura de capas se puede confirmar mediante inmunotinción utilizando anticuerpos contra los marcadores antes mencionados expresados en estas células.

La "proporción de células positivas para Chx10" en un tejido retiniano contenido en un agregado celular producido como se mencionó anteriormente se puede examinar, por ejemplo, mediante el siguiente método.

(1) Primero, se prepara una criosección de "un agregado celular que comprende un tejido retiniano".

(2) A continuación, se utiliza la inmunotinción de la proteína Rax o, cuando se utiliza una célula que ha experimentado recombinación genética obtenida al alterar una célula que expresa el gen Rax para expresar una proteína de fluorescencia tal como GFP, se observa la expresión de la proteína de fluorescencia mencionada anteriormente utilizando un microscopio de fluorescencia, y así sucesivamente, por medio de lo cual se especifica una región de tejido retiniano que expresa el gen Rax.

(3) Utilizando la misma sección que la criosección en donde se ha especificado la región de tejido retiniano que expresa el gen Rax o una sección adyacente como muestra, el núcleo se tiñe con un reactivo de tinción nuclear tal como Dapi. A continuación, se cuenta el número de núcleos teñidos en la región de tejido retiniano especificada anteriormente que expresa el gen Rax, por medio de lo cual se mide el número de células en la región de tejido retiniano.

(4) Utilizando la misma sección que la criosección en donde se ha especificado la región de tejido retiniano que expresa el gen Rax o una sección adyacente como muestra, se somete a inmunotinción la proteína Chx10. Se cuenta el número de células positivas para Chx10 en la región de tejido retiniano especificada anteriormente.

(5) Según cada número de núcleos medidos en los apartados (3) y (4) mencionados anteriormente, el número de núcleos en las células positivas para Chx10 se divide por el número de núcleos en las células positivas para Chx10 en la región de tejido retiniano especificada anteriormente, por medio de lo cual se calcula la "proporción de células positivas para Chx10".

En el método de producción de la presente invención, en primer lugar, se cultiva un agregado celular que comprende un tejido retiniano en el que están presentes células positivas para Chx10 en una proporción de 20% o más del tejido en un medio carente de suero o en un medio que contiene suero, que contienen cada uno una sustancia que actúa sobre la vía de la señal de Wnt solo durante un período antes de la aparición de una célula que expresa el gen RPE65.

Como cultivo preferible aquí, se puede mencionar el cultivo en suspensión. Como medio preferible, se puede mencionar un medio carente de suero.

Las condiciones de cultivo tales como la temperatura de cultivo y la concentración de CO², se pueden ajustar de forma adecuada. La temperatura de cultivo está, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 30°C a aproximadamente 40°C, preferiblemente, por ejemplo, alrededor de 37°C. La concentración de CO²está, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 1% a aproximadamente 10%, preferiblemente, por ejemplo, alrededor de 5%.

La sustancia que actúa sobre la vía de la señal de Wnt que debe estar contenida en un medio carente de suero o en un medio que contiene suero cuando el "agregado celular que comprende un tejido retiniano" mencionado anteriormente se cultiva en el medio no está particularmente limitada siempre que pueda mejorar la transducción de la señal mediada por Wnt. Los ejemplos específicos de la sustancia que actúa sobre la vía de la señal de Wnt incluyen proteína que pertenece a la familia Wnt, receptor de Wnt, agonista del receptor de Wnt, inhibidor de GSK3p (p. ej., 6-bromoindirrubina-3'-oxima (BIO), CHIR99021, Kenpaullone) y así sucesivamente.

La concentración de la sustancia que actúa sobre la vía de la señal de Wnt que debe estar contenida en un medio carente de suero o en un medio que contiene suero en el caso de una sustancia común que actúa sobre la vía de la señal de Wnt, tal como CHIR99021, está, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 0,1 pM a 100 pM, preferiblemente, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 1 pM a 30 pM, más preferiblemente, por ejemplo, alrededor de 3 pM.

"Cultivar solo durante un período antes de la aparición de una célula que expresa el gen RPE65" en el método de producción de la presente invención significa cultivar en la totalidad o una parte del período antes de la aparición de una célula que expresa el gen RPE65. Es decir, el cultivo en la totalidad o parte del período (cualquier período) durante el cual el "agregado celular que comprende un tejido retiniano" en el sistema de cultivo está constituido por células que no expresan sustancialmente el gen RPE65 es suficiente. Empleando tal cultivo, se puede obtener un agregado celular en el que no aparece una célula que exprese el gen RPE65.

Para determinar tal período particular, el "agregado celular que comprende un tejido retiniano" se utiliza como muestra, y la presencia o ausencia de expresión del gen RPE65 contenido en la muestra solo necesita medirse mediante un método de ingeniería genética general. Específicamente, por ejemplo, como se describe en los ejemplos que se mencionan a continuación, la presencia o ausencia de expresión del gen RPE65 o el nivel del mismo pueden examinarse sometiendo una criosección del "agregado celular que comprende un tejido retiniano" mencionado anteriormente a un método de inmunotinción utilizando un anticuerpo contra la proteína RPE65.

Un "período antes de la aparición de una célula que expresa el gen RPE65" preferible es, por ejemplo, un período durante el cual las células positivas para Chx10 están presentes en el tejido retiniano en una proporción comprendida entre 50% y 1% del tejido. En este caso, el "agregado celular en el que no aparece una célula que expresa el gen RPE65" obtenido, es un agregado celular en el que las células positivas para Chx10 están presentes en el tejido retiniano en una proporción comprendida entre 50% y 1% del tejido.

Si bien el número de días del "período antes de la aparición de una célula que expresa el gen RPE65" varía según el tipo de sustancia que actúa sobre la vía de la señal de Wnt, la clase de medio carente de suero o medio que contiene suero, otras condiciones cultivo y así sucesivamente, está, por ejemplo, dentro del plazo de 5 días. El período antes mencionado es preferiblemente, por ejemplo, dentro del plazo de 4 días, más preferiblemente, por ejemplo, de 2 días a 3 días.

A continuación, el "agregado celular en el que no aparece una célula que expresa el gen RPE65" obtenido mediante el cultivo como se mencionó anteriormente se cultiva en un medio carente de suero o en un medio que contiene suero que no contiene una sustancia que actúa sobre la vía de la señal de Wnt.

Un cultivo preferible aquí es, por ejemplo, el cultivo en suspensión.

Los ejemplos de un tiempo de cultivo preferible incluyen un tiempo para cultivar hasta que la proporción de células positivas para Chx10 presentes en el tejido retiniano alcance 50% o más del tejido.

Las condiciones de cultivo tales como la temperatura de cultivo, la concentración de CO²se pueden ajustar de forma adecuada. La temperatura de cultivo está, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 30°C a aproximadamente 40°C, preferiblemente, por ejemplo, alrededor de 37°C. Además, la concentración de CO²está, por ejemplo, en el intervalo de aproximadamente 1% a aproximadamente 10%, preferiblemente, por ejemplo, alrededor de 5%.

Mientras que el número de días de cultivo antes mencionados hasta que se obtiene "un agregado celular que comprende una estructura de tipo zona marginal ciliar" varía dependiendo de la clase de medio carente de suero o medio que contiene suero, otras condiciones de cultivo, etc. está, por ejemplo, dentro del plazo de 100 días. El número de días de cultivo antes mencionado es preferiblemente, por ejemplo, de 20 días a 70 días, más preferiblemente, por ejemplo, de 30 días a 60 días.

En el "agregado celular que comprende una estructura de tipo zona marginal ciliar" así producido, el epitelio pigmentario retiniano y el tejido retiniano (específicamente, la retina neural) están presentes adyacentes a la estructura de tipo zona marginal ciliar en el mismo agregado celular. La estructura se puede confirmar fácilmente mediante observación microscópica, y así sucesivamente.

Se puede preparar un tejido retiniano altamente puro (específicamente, retina neural) cortando físicamente un tejido retiniano (específicamente, retina neural) del "agregado celular que comprende una estructura de tipo zona marginal ciliar" antes mencionado con pinzas, etc. El tejido (específicamente, la retina neural) se puede cultivar adicionalmente de forma continua (específicamente, cultivo a largo plazo durante, por ejemplo, 60 días o más) mientras se mantiene la buena estructura tisular que tiene. Las condiciones de cultivo tales como la temperatura de cultivo, concentración de CO², concentración de O²pueden ser las utilizadas generalmente para cultivo de tejidos. En este caso, el cultivo se puede realizar en presencia de un suero, un factor de crecimiento conocido, un aditivo y una sustancia química que promueva el crecimiento, y así sucesivamente. Los ejemplos del factor de crecimiento conocido incluyen EGF, fGf , y así sucesivamente. Los ejemplos del aditivo que promueve el crecimiento incluyen el suplemento N2 (Invitrogen), el suplemento B27 (Invitrogen), y así sucesivamente.

La presente invención también incluye el uso de un agregado celular que comprende una estructura de tipo zona marginal ciliar producida por el método de producción de la presente invención como reactivo para la evaluación de la toxicidad o eficacia del fármaco, el uso de un agregado celular que comprende una estructura de tipo zona marginal ciliar producida mediante el método de producción de la presente invención como material biológico para trasplante, y así sucesivamente.

El agregado celular que comprende una estructura de tipo zona marginal ciliar producido por el método de producción de la presente invención se puede utilizar para el escrutinio de un fármaco terapéutico para una enfermedad causada por un trastorno de las células retinianas, un material para el estudio de enfermedades o un material de descubrimiento de fármacos. También es utilizable para la evaluación de la toxicidad o eficacia farmacológica de una sustancia química, y así sucesivamente, así como para el estudio de toxicidad, tal como fototoxicidad, neurotoxicidad, y así sucesivamente, prueba de toxicidad, y así sucesivamente.

El agregado celular que comprende una estructura de tipo zona marginal ciliar producida por el método de producción de la presente invención se puede utilizar como material biológico para trasplante utilizado para complementar un tejido desorganizado en sí mismo en un estado de daño celular (p. ej., utilizado para operación de trasplante) y así sucesivamente.

Ejemplos

La presente invención se explica con más detalle a continuación haciendo referencia a Ejemplos, que no deben interpretarse como limitantes.

Ejemplo de Referencia 1 (Ejemplo de Producción de un agregado celular que contiene tejido retiniano utilizando células ES humanas - 1)

Se cultivaron células ES humanas modificadas para activar la expresión del gen RAX::GFP (derivadas de KhES-1; Nakano, T. et al. Cell Stem Cell 2012, 10 (6), 771-785) según los métodos descritos por "Ueno, M. et al. en PNAS 2006, 103(25), 9554-9559" y "Watanabe, K. et al. Nat Biotech 2007, 25, 681-686. Como medio, se utilizó medio DMEM/F12 (Invitrogen) al que se había añadido KSR (Knockout Serum Replacement; Invitrogen), al 20%, 2-mercaptoetanol 0,1 mM, ácido pirúvico 1 mM y de 5 a 10 ng/ml de bFGF. Las células ES cultivadas como se ha mencionado anteriormente se dispersaron individualmente en tripsina-EDTA (Invitrogen) al 0,25%, y las células ES dispersadas individualmente se pusieron a flotar en 100 pl de un medio carente de suero a 9 x 103 células por pocillo de una placa de cultivo de 96 pocillos no adhesiva a las células (placa esferoide SUMILON, SUMITOMO Ba KELITE CO., LTD.), y se cultivaron en suspensión a 37°C, 5% de CO². El medio carente de suero utilizado fue un medio carente de suero obtenido mediante la adición de KSR al 20%, 2-mercaptoetanol 0,1 mM, ácido pirúvico 1 mM, Y27632 20 pM y sustancia inhibidora de la vía de la señal de Wnt (IWR1e 3 pM) al medio G-MEM. Durante el cultivo en suspensión, se añadió GFR Matrigel (Invitrogen) en una cantidad de 1/100 por volumen desde el día 2 desde el inicio del cultivo en suspensión. Se añadieron un suero fetal bovino en una cantidad de 1/10 por volumen y una sustancia que actúa sobre la vía de la señal de Shh (SAG 100 nM) el día 12 desde el inicio del cultivo en suspensión, y el cultivo en suspensión se realizó durante un total de 18 días.

El agregado celular así producido se fijó con paraformaldehído al 4% para producir una criosección. La criosección preparada se sometió a observación de microscopio de fluorescencia de una imagen de fluorescencia de GFP (Fig. 1) e inmunotinción con Chx10, que es uno de los marcadores de células progenitoras de la retina neural (Fig. 2). En el tejido retiniano contenido en el agregado celular producido como se mencionó anteriormente, se encontraron células positivas para Chx10 en aproximadamente el 40% del tejido (véase la Fig. 2).

Ejemplo de Referencia 2 (Ejemplo de Producción de un agregado celular que contiene tejido retiniano utilizando células ES humanas - 2)

Mediante un método similar al del Ejemplo 1, se realizó un cultivo en suspensión durante más tiempo. Como resultado, el día 25 desde el inicio del cultivo en suspensión, también se obtuvo un agregado celular que contenía un tejido retiniano en el que se encontraron células positivas para Chx10 en aproximadamente 80% o aproximadamente 90% del tejido.

Ejemplo de Referencia 3 (cultivo de agregado celular que contiene tejido retiniano en medio carente de suero que contiene una sustancia que actúa sobre la vía de la señal de Wnt)

Se cultivó en suspensión un agregado celular que contenía tejido retiniano el día 18 desde el inicio del cultivo en suspensión, que se había producido mediante el método descrito en el Ejemplo 1, en un medio carente de suero que contenía una sustancia que actuaba sobre la vía de la señal de Wnt (CHIR99021 3 pM) durante 3 días.

El agregado celular obtenido se fijó con paraformaldehído al 4% para preparar una criosección. La criosección preparada se sometió a observación microscópica de fluorescencia de una imagen de fluorescencia de GFP (Fig. 3) e inmunotinción con Chx10, que es uno de los marcadores de células progenitoras de la retina neural (Fig. 4). En el tejido retiniano contenido en el agregado celular mencionado anteriormente, que se había cultivado en suspensión en un medio carente de suero que contenía una sustancia que actuaba sobre la vía de la señal de Wnt durante 3 días, se encontraron células positivas para Chx10 en solo aproximadamente el 3% del tejido y se observó una clara disminución en la proporción de células positivas para Chx10 (véase la Fig. 4). En ese momento, no apareció una célula que expresara el gen RPE65 en el agregado celular mencionado anteriormente.

Ejemplo de Referencia 4 (cultivo en suspensión de "agregado celular en el que no aparece una célula que expresa el gen RPE65" en medio que contiene suero que no contiene una sustancia que actúa sobre la vía de la señal de Wnt - 1)

Se cultivó en suspensión adicionalmente el agregado celular (la proporción de células positivas para Chx10: aproximadamente 3%) el día 21 desde el inicio del cultivo en suspensión (días totales del "día 18" y el "día 3" mencionados anteriormente), que se produjo mediante los métodos descritos en el Ejemplo 1 y el Ejemplo 3, en un medio que contenía suero (que contenía DMEM/F12, suero bovino fetal al 10%, suplemento de N2, ácido retinoico 0,5 pM, etc.) que no contenía una sustancia que actuaba sobre la vía de la señal de Wnt en condiciones de O²por debajo de 40% durante 39 días.

El agregado celular obtenido se fijó con paraformaldehído al 4% para preparar una criosección. La criosección preparada se sometió a observación microscópica de fluorescencia de una imagen de fluorescencia de GFP (Fig. 5) e inmunotinción con Rdh10, que es uno de los marcadores de la zona marginal ciliar (Fig. 6). De la manera mencionada anteriormente, podría confirmarse en el agregado celular después del cultivo en suspensión durante 39 días en un medio que contenía suero que no contenía una sustancia que actuaba sobre la vía de la señal de Wnt que las células positivas para Rdh10 (es decir, las células que expresan el gen Rdh10 que es un gen marcador de estructura de tipo zona marginal ciliar) estaban presentes como una región de grupo casi uniforme en el tejido presente en la región límite del tejido retiniano (específicamente, la retina neural) y el epitelio pigmentario retiniano, y se producía un agregado celular que contenía una estructura de tipo zona marginal ciliar con alta eficiencia (véase la Fig. 6).

Ejemplo de Referencia 5 (cultivo en suspensión de "agregado celular en el que no aparece una célula que expresa el gen RPE65" en medio que contiene suero que no contiene una sustancia que actúe sobre la vía de la señal de Wnt - 2)

Se cultivó en suspensión adicionalmente el agregado celular (razón de existencia de células positivas para Chx10: aproximadamente 3%) el día 21 desde el inicio del cultivo en suspensión (días totales del "día 18" y el "día 3" mencionados anteriormente), que se produjo mediante los métodos descrito en el Ejemplo 1 y el Ejemplo 3, de la misma manera que en el Ejemplo 4 en un medio que contenía suero (que contenía DMEM/F12, suero bovino fetal al 10%, suplemento de N2, ácido retinoico 0,5 pM, etc.) que no contenía una sustancia que actuaba sobre la vía de la señal de Wnt en condiciones de O²por debajo de 40% durante otros 50 días.

El agregado celular obtenido se fijó con paraformaldehído al 4% para preparar una criosección. La criosección preparada se sometió a observación microscópica de fluorescencia de una imagen de fluorescencia de GFP (Fig. 7) e inmunotinción con Rdh10 (Fig. 8) u Otx1 (Fig. 9) que es uno de los marcadores de la zona marginal ciliar. De la manera mencionada anteriormente, en el agregado celular después de un cultivo en suspensión durante 50 días en un medio que contenía suero que no contenía una sustancia que actuaba sobre la vía de la señal de Wnt, las células positivas Rdh10 (es decir, las células que expresan el gen Rdh10, que es un gen marcador de estructura de tipo zona marginal ciliar) estaban presentes como una región de grupo casi uniforme en el tejido presente en la región límite del tejido retiniano (específicamente, la retina neural) y el epitelio pigmentario retiniano (véase la Fig.8), y las células positivas para Otx1 (es decir, las células que expresan el gen Otx1, que es un gen marcador de estructura de tipo zona marginal ciliar) también estaban presentes de manera similar (véase la Fig. 9). A partir de estos resultados, se pudo confirmar que se producía un agregado celular que contenía una estructura de tipo zona marginal ciliar con alta eficiencia mediante el método de producción.

Ejemplo de Referencia 6 (Análisis de la capacidad proliferativa del agregado celular que contiene una estructura de tipo zona marginal ciliar - 1)

Se cultivó en suspensión el agregado celular el día 18 desde el inicio del cultivo en suspensión, que se produjo mediante el método descrito en el Ejemplo 1, durante 3 días en un medio carente de suero que contenía una sustancia que actuaba sobre la vía de la señal de Wnt, y a continuación, se cultivó en suspensión de la misma manera que en el Ejemplo 4 y el Ejemplo 5 durante 46 días en un medio que contenía suero que no contenía una sustancia que actuaba sobre la vía de la señal de Wnt. Después de eso, el agregado celular se cultivó en presencia de BrdU durante 1 día para marcar las células cultivadas, a continuación, en ausencia de BrdU durante 13 días y en presencia de EdU (Invitrogen) durante 1 día. El agregado celular obtenido se fijó con paraformaldehído al 4% para preparar una criosección. La criosección preparada se sometió a tinción por inmunofluorescencia con anticuerpo anti-Ki67 (Fig. 10, Figura izquierda) o anticuerpo anti-BrdU (Fig. 10, Figura derecha), o reacción de desarrollo de color EdU (Fig. 10, Figura central).

Como resultado, se encontró que la estructura de tipo zona marginal ciliar era una célula en crecimiento positiva para Ki67 en el agregado celular después de un cultivo en suspensión durante 46 días en un medio que contenía suero que no contenía una sustancia que actuaba sobre la vía de la señal de Wnt de la manera mencionada anteriormente (Fig. 10, Figura izquierda, mostrada por una flecha). Se encontró que 90% o más de las células en crecimiento se pueden marcar mediante la captación de EdU durante 1 día, ya que 90% o más de las células positivas para Ki67 son positivas para EdU (Fig. 10, Figura central, flecha). Por otro lado, dado que las células positivas para Ki67 en la estructura similar a la zona marginal ciliar mostraron una señal de BrdU débil (Fig.10, Figura derecha, flecha), se supone que las células positivas para Ki67 antes mencionadas continuaron creciendo durante 14 días después del marcaje con BrdU y BrdU diluido absorbido en el ADN. A partir de estos resultados, se encontró que la estructura de tipo zona marginal ciliar en el agregado celular cultivado como se mencionó anteriormente es la zona de progreso.

Ejemplo de Referencia 7 (Análisis de la capacidad proliferativa del agregado celular que contiene una estructura de tipo zona marginal ciliar - 2)

Se cultivó en suspensión el agregado celular el día 18 desde el inicio del cultivo en suspensión, que se produjo mediante el método descrito en el Ejemplo 1, durante 3 días en un medio carente de suero que contenía una sustancia que actuaba sobre la vía de la señal de Wnt, y a continuación, se cultivó en suspensión de la misma manera que en el Ejemplo 4, Ejemplo 5 y Ejemplo 6 durante 46 días en un medio que contenía suero que no contenía una sustancia que actuaba sobre la vía de la señal de Wnt. Después de eso, el agregado celular se cultivó en presencia de BrdU durante 1 día para marcar las células cultivadas, a continuación, en ausencia de BrdU durante 13 días, en presencia de EdU (Invitrogen) durante 1 día, y adicionalmente, en ausencia de EdU durante 13 días. Se produjo una criosección del agregado celular obtenido y se sometió a tinción de inmunofluorescencia con anticuerpo anti-Ki67 (Fig. 11, Figura izquierda), anticuerpo anti-BrdU (Fig. 11, Figura derecha) o anticuerpo anti-Rdh10 (Fig. 11, Figura inferior), o reacción de desarrollo de color EdU (Fig. 11, Figura central).

Como resultado, se encontró que la estructura de tipo zona marginal ciliar positiva para Rdh10 (Figura 11, Figura inferior, mostrada por una flecha) era positiva para Ki67 (Fig. 11, Figura izquierda) en el agregado celular después del cultivo en suspensión durante 46 días en un medio que contenía suero que no contenía una sustancia que actuaba sobre la vía de la señal de Wnt de la manera mencionada anteriormente. Se encontró que la célula positiva para Ki67 antes mencionada en la estructura de tipo zona marginal ciliar mostraba señales débiles de EdU (Fig. 11, Figura central) y BrdU (Fig. 11, Figura derecha). Por lo tanto, se supuso que la célula positiva para Ki67 mencionada anteriormente en la estructura de tipo zona marginal ciliar mencionada anteriormente continuó creciendo durante 27 días y absorbió EdU y BrdU diluidos en el ADN. A partir de estos resultados, se encontró que la estructura de tipo zona marginal ciliar en el agregado celular cultivado como se mencionó anteriormente es la zona de progreso.

Ejemplo de Referencia 8 (Análisis de la morfología de la retina neural en un agregado celular que contiene una estructura de tipo zona marginal ciliar)

Se cultivó en suspensión el agregado celular el día 18 desde el inicio del cultivo en suspensión, que se produjo mediante el método descrito en el Ejemplo 1, durante 3 días en un medio carente de suero que contenía una sustancia que actuaba sobre la vía de la señal de Wnt y, de la misma manera que en el Ejemplo 4, Ejemplo 5, Ejemplo 6 y Ejemplo 7, se cultivó en suspensión durante 75 días en un medio que contenía suero que no contenía una sustancia que actuaba sobre la vía de la señal de Wnt, y se analizó el agregado celular obtenido. Como una realización del agregado celular, se muestran una imagen de contraste de fase del agregado celular sin una estructura de tipo zona marginal ciliar (CMZ) (A, línea izquierda, panel superior), una imagen de fluorescencia FP de células que expresan el gen Crx del agregado celular sin una estructura de tipo zona marginal ciliar (A, fila izquierda, panel inferior), una imagen de contraste de fase del agregado celular que contiene una estructura de tipo zona marginal ciliar (A, fila derecha, panel superior) y una imagen de fluorescencia de GFP de las células que expresan el gen Crx del agregado celular que contiene una estructura ciliar similar a una zona marginal (A, fila derecha, panel inferior). En la imagen de fluorescencia de GFP de la célula que expresa el gen Crx en un agregado celular que contiene una estructura de tipo zona marginal ciliar (A, fila derecha, panel inferior), se encontró que existe una retina neural continua que tiene una estructura de capas adyacente a la estructura de tipo zona marginal ciliar en la porción inferior derecha (mostrada por una flecha).

La proporción de agregados celulares que contienen una retina neural continua que tiene una estructura de capas en no menos de 10% de la circunferencia del agregado celular, en los agregados celulares sin una estructura de tipo zona marginal ciliar (CMZ-) y los agregados celulares con una estructura de tipo zona marginal ciliar (CMZ ) se midió utilizando la morfología de la célula que expresaba el gen Crx como índice (Fig. 12B). Como resultado, se encontró que el agregado celular con una estructura de tipo zona marginal ciliar (CMZ+) tiene una mayor proporción de agregados celulares que contienen una retina neural continua que tiene una estructura de capas, en comparación con los agregados celulares sin una estructura de tipo zona marginal ciliar (CMZ-).

Aplicabilidad industrial

De acuerdo con el método de producción de la presente invención, se puede producir una estructura de tipo zona marginal ciliar con alta eficiencia. En un agregado celular que comprende una estructura de tipo zona marginal ciliar, que se produce mediante el método de producción de la presente invención, la estructura de tipo zona marginal ciliar funciona como una zona de progreso, y se puede formar una retina neural continua que tiene una estructura de capas adyacente a la estructura de tipo zona marginal ciliar con alta frecuencia.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para producir un agregado celular que comprende una estructura de tipo zona marginal ciliar, que comprende una etapa de cultivo de un agregado celular que comprende un tejido retiniano en el que las células positivas para Chx10 están presentes en una proporción de 20% o más del tejido en un medio carente de suero que contiene una sustancia que actúa sobre la vía de la señal de Wnt que puede mejorar la transducción de la señal mediada por Wnt solo durante un período antes de la aparición de una célula que expresa el gen RPE65, seguido del cultivo del "agregado celular en el que no aparece la célula que expresa el gen RPE65" así obtenido en un medio carente de suero que contiene un sustituto de suero o un medio que contiene suero, cada uno de los cuales no contiene una sustancia que actúa sobre la vía de la señal de Wnt, en donde la sustancia que actúa sobre la vía de la señal de Wnt que puede mejorar la transducción de señal mediada por Wnt se selecciona entre un proteína que pertenece a la familia Wnt, receptor de Wnt, agonista del receptor de Wnt e inhibidor de GSK3p; y

en donde que el agregado celular que comprende un tejido retiniano en el que están presentes células positivas para Chx10 en una proporción de 20% o más del tejido es un agregado celular que se puede preparar mediante un método que comprende las siguientes etapas (1) a (3):

2. El método de producción según la reivindicación 1, en donde el período antes de la aparición de una célula que expresa el gen RPE65 es un período durante el cual las células positivas para Chx10 están presentes en una proporción comprendida entre 50% y 1% del tejido, y el agregado celular en el que una célula que expresa el gen RPE65 no aparece es un agregado celular en el que las células positivas para Chx10 están presentes en el tejido retiniano en una proporción comprendida entre 50% y 1% del tejido.

3. El método de producción según la reivindicación 2, en donde el "agregado celular en el que no aparece una célula que expresa el gen RPE65" así obtenido se cultiva en un medio carente de suero que contiene un sustituto de suero o un medio que contiene suero, cada uno de los cuales no contiene una sustancia que actúa sobre la vía de la señal de Wnt hasta que la proporción de células positivas para Chx10 presentes en el tejido retiniano alcanza 50% o más del tejido.

4. El método de producción según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el tejido retiniano se obtiene a partir de una célula madre pluripotente humana.

5. El método de producción según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la sustancia que actúa sobre la vía de la señal de Wnt que puede mejorar la transducción de la señal mediada por Wnt es CHIR99021.

6. Un método para producir una retina neural que comprende:

producir un agregado celular que comprende una estructura de tipo zona marginal ciliar mediante el método de producción según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde un epitelio pigmentario retiniano y un tejido retiniano están presentes adyacentes a la estructura de tipo zona marginal ciliar, y

cortar el tejido retiniano del agregado celular que comprende una estructura de tipo zona marginal ciliar, obteniendo así un tejido retiniano purificado.