ES2873324T3

ES2873324T3 - Método y sistema para determinar la concentración de un analito en una muestra de fluido

Info

Publication number: ES2873324T3
Application number: ES15850361T
Authority: ES
Inventors: Richard N Ellson; Richard G Stearns; Joseph D Olechno; Ian Sinclair; Jonathan Wingfield
Original assignee: Labcyte Inc
Current assignee: Labcyte Inc
Priority date: 2014-10-17
Filing date: 2015-10-19
Publication date: 2021-11-03
Anticipated expiration: 2035-10-19
Also published as: EP3207374B1; JP2017532558A; EP3207374A4; US9939352B2; WO2016061592A1; US20160109336A1; JP6916734B2; EP3207374A1; DK3207374T3; US20180231442A1

Abstract

Un método para determinar la concentración de un analito en una muestra de fluido que además comprende una sal tampón para mantener el pH o la fuerza iónica, comprendiendo el método volatilizar e ionizar la muestra de fluido e introducir la muestra ionizada y volatilizada en un dispositivo de detección de analito iónico que proporciona una señal proporcional en intensidad a la cantidad de analito ionizado detectado, en donde el método comprende: emplear un sal tampón que: (a) (i) es más volátil que el analito, o (ii) tras volatilizar la muestra de fluido, sufre una reacción para producir al menos un producto de reacción que es más volátil que el analito; y (b) da como resultado un aumento en la intensidad de la señal y/o una relación señal/ruido mayor que la intensidad de la señal o la relación señal/ruido obtenida en presencia de un sal tampón menos volátil, en donde el método comprende además generar gotitas del tamaño de nanolitros de muestra de fluido antes de la volatilización e ionización, de modo que la muestra de fluido se introduce en el dispositivo de detección de analito iónico en forma de gotitas del tamaño de nanolitros que tienen un área superficial eficaz para facilitar la extracción en fase gaseosa de la sal tampón de las gotitas tras la volatilización de las gotitas.

Description

DESCRIPCIÓN

Método y sistema para determinar la concentración de un analito en una muestra de fluido

Campo técnico

La presente invención se refiere en general a métodos mejorados para detectar la presencia o cantidad de un analito en una muestra de fluido, y más particularmente se refiere a mejoras en dichos métodos donde se generan gotitas de fluido del tamaño de nanolitros y la muestra se analiza con precisión. La invención encuentra utilidad en los campos de la química analítica, la investigación biológica, los productos farmacéuticos y la medicina.

Antecedentes

La determinación exacta de la presencia, la identidad, la concentración y/o la cantidad de una especie ionizada en una muestra tiene una importancia fundamental en muchos campos. La mayoría de las técnicas utilizadas en tales análisis implican la ionización de especies en una muestra de fluido antes de su introducción en el equipo analítico empleado. Un ejemplo bien conocido de tal método implica el uso de un sistema combinado en el que la electroforesis se acopla con espectrometría de masas, mediante el cual los analitos que están ionizados o asociados con especies iónicas se separan electroforéticamente y luego se analizan en el espectrómetro de masas. Véase, por ejemplo, la publicación de patente de los Estados Unidos N.° 2011/0005930 A1 de Weber et al., que describe la separación electroforética de flujo libre de analitos ionizados para análisis espectrométrico de masas en etapas posteriores y la publicación de patente de los Estados Unidos N.° 2006/0024660 A1 de Jouin et al., que también pertenece a un análisis de separación electroforética/espectrometría de masas combinado. Un sistema algo análogo, en el cual se acopla la cromatografía en columna con el análisis de espectrometría de masas, se describe en la Publicación de patente de los Estados Unidos N.° 2010/0024527 Al de LaMarr et al. La Publicación de patente de los Estados Unidos N.° 2002/0109084 Al de Ellson et al. (ahora Patente de los Estados Unidos N.° 6.603.118) describe un sistema que genera acústicamente gotitas muy pequeñas que contienen analito para análisis espectrométrico de masas. La elección del método de ionización dependerá de la naturaleza de la muestra y la técnica analítica utilizada, existiendo muchos métodos de ionización disponibles, incluyendo, sin limitación, ionización química, ionización por impacto de electrones, ionización química por desorción e ionización a presión atmosférica, incluida la ionización por electronebulización y la ionización química a presión atmosférica.

La presencia de contaminantes en muestras biológicas sometidas a análisis es obviamente problemática por varias razones. Los contaminantes pueden causar interferencia con el procedimiento analítico, alterando química o físicamente la muestra o el analito en sí. Los contaminantes también pueden confundirse con el analito o viceversa, de modo que la concentración medida del analito puede ser significativamente mayor o menor que la concentración real. El mismo problema puede ser causado por componentes necesarios de la muestra de fluido, tales como sales tampón, tensioactivos y otras especies que pueden ser esenciales para las etapas bioquímicas que preceden al análisis.

La espectrometría de masas es una técnica bien establecida que implica la detección de un analito en forma ionizada. En esta técnica, las moléculas de la muestra se ionizan y los iones resultantes se clasifican por relación masa-carga. Para los analitos contenidos en una muestra de fluido, la muestra se convierte normalmente en un aerosol que sufre desolvatación, vaporización e ionización con el fin de formar iones fluidos.

La presencia de especies que no son analitos puede ser particularmente problemática en la espectrometría de masas, donde la concentración de analito puede ser muy baja y el número y concentración de contaminantes y componentes interferentes puede ser relativamente alto. Un estudio ha documentado más de 650 contaminantes y componentes interferentes que se encuentran con frecuencia en muestras biológicas sometidas a análisis espectrométrico de masas. B.O. Keller et al. (2008), "Interferences and contaminants encountered in modem mass spectrometry", Anal. Chim. Acta 627(1): 71-81. Estos incluyen sales, agentes tamponantes, compuestos endógenos, tensioactivos, fármacos, metabolitos y proteínas. Cuando estas especies reducen la sensibilidad de detección al disminuir la relación señal/ruido y dan lugar a un análisis erróneo, el problema se ha caracterizado como "supresión de iones". Véase Weaver et al. (2006) Rapid Communications in Mass Spectrometry 20:2559-64.

Se ha postulado que "la causa principal de la supresión de iones es un cambio en las propiedades de la solución de gotitas de pulverización causado por la presencia de solutos no volátiles o menos volátiles", es decir, solutos que son no volátiles o menos volátiles que el analito; véase Annesley (2003) "Ion Suppression in Mass Spectrometry", en Clinical Chemistry 49(7): 1041-1044, que cita a King et al. (2000) J. Am. Soc. Mass Spectrom. 11: 942-50. La referencia explica que los componentes y contaminantes no volátiles o menos volátiles cambian la eficiencia de la formación o volatilización de las gotitas, lo que a su vez afecta a la cantidad de analito cargado en la fase gaseosa que finalmente llega al detector. Annesley cita estudios que muestran que las moléculas de mayor masa tienden a suprimir la señal de moléculas más pequeñas y que los analitos más polares son susceptibles a la supresión de iones. Annesley en 1042, que cita a Sterner et al. (2000) J. Mass Spectrom. 35:385-91 y Bonfiglio et al. (1999) Rapid Commun. Mass Spectrom. 13: 1175-85. Weaver et al. cita varios posibles mecanismos subyacentes a la supresión de iones: (1) competencia por la carga entre el analito y el agente supresor de iones, lo que conduce a una ionización reducida del analito; 2) grandes concentraciones de agentes supresores de iones que provocan un aumento de la tensión superficial así como un aumento de la viscosidad de las gotitas, lo que a su vez da como resultado una disminución de la eficacia de evaporación; y (3) reacciones en fase gaseosa entre el analito ionizado y otras especies de la muestra, lo que da como resultado una pérdida total de carga de los iones del analito. Weaver et al. at 2562.

Como la ionización por electronebulización (ESI) tiene un mecanismo de ionización relativamente complejo, que depende en gran medida del exceso de carga de las gotitas, hay factores adicionales a considerar al explorar la causa de la supresión de iones y las posibles soluciones. Se ha observado en muchas ocasiones que para muchos analitos, a elevadas concentraciones, la ESI presenta una pérdida de linealidad de respuesta del detector, tal vez debido a la reducción del exceso de carga causada por la saturación del analito en la superficie de la gotita, lo que inhibe la posterior eyección de iones en fase gaseosa desde una zona más interna de la gota. Por tanto, la competencia por el espacio y/o la carga puede considerarse como una fuente de supresión de iones en la ESI. Tanto las propiedades físicas como químicas de los analitos (por ejemplo, basicidad y actividad superficial) determinan su eficacia de ionización inherente. Las matrices de muestras biológicas tienden de forma natural a contener muchas especies endógenas con alta basicidad y actividad superficial, y la concentración total de estas especies en la muestra alcanzará rápidamente niveles en los que se puede esperar la supresión de iones.

Otra explicación de la supresión de iones en la ESI considera las propiedades físicas de la propia gotita en lugar de las especies presentes. Como se ha indicado anteriormente, las concentraciones elevadas de componentes interferentes dan lugar a un aumento de la tensión superficial y la viscosidad, lo que a su vez reduce la eficacia de la evaporación, y se sabe que esto tiene un efecto considerable sobre la eficacia de la ionización.

Una teoría adicional para explicar la supresión de iones en la ESI se refiere a la presencia de especies no volátiles que pueden causar la coprecipitación del analito en la gotita (evitando así la ionización) o prevenir la contracción del tamaño de la gotita al radio crítico requerido para la evaporación de iones. y/o mecanismos de restos de carga para formar iones en fase gaseosa de manera eficiente. También debe señalarse que el grado de supresión de iones puede depender de la concentración del analito que se está controlando, y con la demanda cada vez mayor de un umbral de detección más bajo, la supresión de iones puede convertirse en un problema cada vez más grave.

La supresión de iones se ha abordado principalmente mediante la desalación de la muestra de fluido mediante diálisis, cromatografía líquida, extracción en fase sólida o intercambio iónico. Estos procesos requieren tiempo, materiales y equipo, y pueden reducir la cantidad disponible de una muestra ya pequeña. Además, puede ser esencial mantener ciertas especies iónicas o ionizables en la muestra, tal como los sistemas tampón.

Un método ideal para abordar la supresión de iones sería:

Eliminar la necesidad de etapas de proceso y materiales adicionales, incluida la limpieza y el desalado;

Eliminar la necesidad de tiempo de procesamiento adicional;

Ser adaptable para usar con tamaños de muestra muy pequeños, consumir una pequeña porción del tamaño de muestra pequeño, permitir la detección de concentraciones bajas de analitos y estar compuesto por gotitas muy pequeñas; y

Ser capaz de implementarse en un sistema analítico de alta velocidad, tal como la espectrometría de masas de alto rendimiento, lo que permite de forma óptima el análisis de hasta al menos 50.000 muestras al día o más; y Eliminar la necesidad de una "limpieza" previa al análisis de la muestra para eliminar los contaminantes y los componentes interferentes.

Sumario de la invención

Por consiguiente, la presente invención aborda la necesidad en la técnica antes mencionada proporcionando un método mejorado para determinar con precisión la concentración de un analito en una muestra de fluido, como se define en las reivindicaciones.

En lo sucesivo, las realizaciones pertenecerán únicamente a la invención, si todas se encuentran dentro del alcance de las reivindicaciones. Si no, pertenecen únicamente a la divulgación general.

En una realización, se proporciona un método mejorado para determinar la concentración de un analito en una muestra de fluido que también contiene un componente no analito necesario, donde el método comprende volatilizar e ionizar la muestra de fluido e introducir la muestra ionizada y volatilizada en un dispositivo de detección de analito iónico que proporciona una señal de analito proporcional en intensidad a la cantidad de analito detectado, por ejemplo, un espectrómetro de masas, en donde la mejora comprende reemplazar el componente original no analito necesario con un componente sustituto que (a) funciona como el componente no analito necesario en la muestra de fluido, es decir, tiene el mismo propósito con respecto a la muestra de fluido, (b) es más volátil que el componente original y/o el analito, y/o sufre una reacción química para producir al menos un producto de reacción que es más volátil que el componente original y/o el analito, y (c) da como resultado un aumento en la intensidad de la señal del analito y/o una relación señal-ruido mayor que la intensidad de la señal o la relación señal-ruido obtenida usando el componente original.

En otra realización, se usa la eyección acústica para generar gotitas de tamaño de nanolitros que luego se volatilizan, ionizan y analizan, en donde las gotitas de "tamaño de nanolitros" se definen en el presente documento como gotitas de 5 nl o menos. En la eyección acústica, un eyector acústico dirige energía acústica enfocada a un depósito que contiene la muestra de fluido de una manera que da como resultado la eyección de gotitas de fluido desde la superficie de la muestra de fluido. La eyección acústica ofrece muchas ventajas sobre otras metodologías de generación de gotitas; por ejemplo, los dispositivos de eyección acústica de fluidos no están sujetos a obstrucciones, fluidos mal dirigidos o gotitas de tamaño inadecuado, y la tecnología acústica no requiere el uso de tubos ni ninguna acción mecánica invasiva. La tecnología de expulsión acústica como se describe, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos N.° 6.802.593 de Ellson et al., permite el procesamiento rápido de muestras y la generación de gotitas en el intervalo de nanolitros o incluso picolitros. Además, la eyección acústica permite controlar el tamaño de las gotitas, así como la generación repetida de gotitas de tamaño constante. Véase la Patente de los Estados Unidos N.° 6.416.164 B1 de Stearns et al. Como se explica en esta patente, el tamaño de las gotitas eyectadas acústicamente desde la superficie de un fluido se puede controlar cuidadosamente variando la potencia acústica, la frecuencia acústica, la duración de la ráfaga de tono y/o el número F de la lente de enfoque.

En una realización adicional, en el método de la invención se usa un compuesto bipolar como no analito sustituto (es decir, sal tampón). Tras la volatilización, el compuesto bipolar sufre una reacción química para producir al menos un producto de reacción que es más volátil que el componente no analito original y/o el analito.

En otra realización, se proporciona un método mejorado para determinar la concentración de un analito en una muestra de fluido que también contiene un componente no analito necesario, donde el método comprende volatilizar e ionizar la muestra de fluido e introducir la muestra ionizada y volatilizada en un dispositivo de detección de analito iónico que proporciona una señal de analito proporcional en intensidad a la cantidad de analito detectado, donde se selecciona un componente sustituto para reemplazar el componente no analito necesario y, tras volatilizar la muestra de fluido, sufre una reacción para producir al menos un producto de reacción que es más volátil que el componente original necesario y/o el analito.

En otra realización, se proporciona un método como el anterior en donde la reacción antes mencionada es una reacción de descomposición.

En una realización adicional, se proporciona un método como el anterior en donde la reacción implica la escisión química, fotolítica o térmica de un enlace en el componente sustituto que proporciona productos de reacción de menor peso molecular que no causan ninguna supresión de iones significativa y/o son más volátiles que el componente original.

En una realización adicional más, se proporciona un sistema mejorado para determinar la concentración de un analito en una muestra de fluido que comprende un espectrómetro de masas, un eyector acústico para generar gotitas de muestra de fluido y un medio para volatilizar e ionizar las gotitas antes de su introducción en el espectrómetro de masas, cuya mejora comprende reemplazar al menos un componente necesario en la muestra de fluido con un componente sustituto que cumple la misma función que el componente original pero da como resultado un aumento en la intensidad de la señal del analito y/o un aumento en la relación señal-ruido respecto a la intensidad de la señal del analito y/o la relación señal/ruido, respectivamente, obtenida utilizando el componente original.

En otra realización, el componente sustituto del sistema contiene un enlace que se puede escindir química, térmica o fotolíticamente para proporcionar productos de reacción de menor peso molecular que no causan ninguna supresión de iones significativa y/o son más volátiles que el componente original. Cuando el componente sustituto contiene un enlace escindible fotolíticamente, el sistema incluye además una fuente de radiación eficaz para escindir el enlace.

El método de la invención generalmente proporciona un aumento en la intensidad de la señal del analito y/o una mayor relación señal-ruido que es al menos el 10 % y preferentemente al menos el 25 % con respecto a la intensidad de la señal del analito y la relación señal-ruido.

Breve descripción de los dibujos

La FIG. 1 es una gráfica de señal normalizada en m/z = 195 frente a la concentración de acetato de amonio (♦) o cloruro de sodio (■) (mM), como se describe en relación con la detección espectrofotométrica de masas de la cafeína descrita en el Ejemplo 1.

La FIG. 2 es un gráfico de la intensidad de la señal para el analito de cafeína detectado frente a la concentración de sal para seis sales tampón diferentes, como se describe en el Ejemplo 2.

La FIG. 3 es un gráfico de luminiscencia frente al tiempo para el ensayo de quinasa realizado en el Ejemplo 3, realizado usando una sal de magnesio volátil (acetato de magnesio) y, con fines comparativos, una sal de magnesio no volátil (cloruro de magnesio).

La FIG. 4 ilustra esquemáticamente la síntesis del compuesto tampón escindible (30).

La FIG. 5 ilustra esquemáticamente la síntesis del compuesto tampón escindible (31), usando dos rutas alternativas.

Descripción detallada de la invención

A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto en la materia a la que pertenece la invención. La terminología específica de particular importancia para la descripción de la presente invención se define a continuación.

En la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "una" y "el/la" incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por tanto, por ejemplo, "un analito" se refiere no solo a un solo analito sino también a una combinación de dos o más analitos diferentes, "un componente sustituto" se refiere a un solo componente de este tipo o a una pluralidad (por ejemplo, una mezcla) de componentes y similares.

El término "ionizable" como se usa en el presente documento se refiere a una especie que es capaz de sufrir ionización. Como tal, una especie "ionizable" en el presente documento puede estar en forma electrónicamente neutra o en forma ionizada (o "iónica"), como un ion individual o como un componente de una sal. Las especies ionizables también pueden estar presentes tanto en formas eléctricamente neutras como ionizadas, tal como será el caso en un sistema tampón. Como un ejemplo, el ácido acético (CH³COOH) es un compuesto ionizable que puede estar presente en forma electrónicamente neutra, con un grupo carboxilo protonado, o puede estar presente en forma ionizada, con el protón eliminado para dar el ion acetato (CH³COO), o puede estar presente como una combinación de las formas electrónicamente neutra e ionizada. Como otro ejemplo, un ion bipolar que contiene un grupo ácido carboxílico y un grupo amino puede estar en forma eléctricamente neutra o en forma ionizada en la que el grupo ácido carboxílico se ioniza para carboxilarse y el grupo amino se protona para dar un sustituyente catiónico que contiene nitrógeno.

El término "volátil" se usa en el presente documento para referirse a la tendencia relativa de un ion, sal o compuesto a salir de la superficie de una gotita de fluido y entrar en la fase de vapor en las condiciones de vaporización y usando los métodos de vaporización descritos en el presente documento. El término se usa en el presente documento en un sentido comparativo, de modo que la especie sustituta es "volátil" en la medida en que es más probable que el componente original no analito o el analito se volatilice en las condiciones de volatilización empleadas junto con el método descrito.

Los términos "contaminante" y "componente" se utilizan para referirse a especies en la muestra de fluido que causan supresión de iones. El término "contaminante", sin embargo, se refiere a una especie que se introduce accidental o involuntariamente en la muestra y puede haber estado presente en un disolvente, reactivo, tensioactivo o similares, mientras que el término "componente" se refiere a una especie que sirve a un propósito necesario y previsto, tal como las especies que se requieren para el procesamiento bioquímico antes del análisis y/o las especies que son necesarias para mantener un parámetro químico o físico de la muestra de fluido, por ejemplo, sistemas tampón para mantener el pH.

Las expresiones "radiación acústica" y "energía acústica" se usan indistintamente en el presente documento y se refieren a la emisión y propagación de energía en forma de ondas sonoras. Al igual que con otras formas de onda, la radiación acústica se puede enfocar usando un medio de enfoque, como se describe a continuación.

Las expresiones "medios de enfoque" y "medios de enfoque acústico" se refieren a un medio para hacer que las ondas acústicas converjan en un punto focal, ya sea por un dispositivo separado de la fuente de energía acústica que actúa como una lente, o por la disposición espacial de las fuentes de energía acústica para efectuar la convergencia de la energía acústica en un punto focal mediante interferencia constructiva y destructiva. Un medio de enfoque puede ser tan simple como un miembro sólido que tenga una superficie curva, o puede incluir estructuras complejas tales como las que se encuentran en las lentes de Fresnel, que emplean difracción para dirigir la radiación acústica. Los medios de enfoque adecuados también incluyen métodos de matriz en fase como se conocen en la técnica y se describen, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos N.° 5.798.779 de Nakayasu et al. y Amemiya et al. (1997) Proceedings of the 1997 IS&T NIP13 International Conference on Digital Printing Technologies, págs. 698-702.

Las expresiones "acoplamiento acústico" y "acoplado acústicamente" utilizadas en el presente documento se refieren a un estado en donde un objeto se coloca en contacto directo o indirecto con otro objeto para permitir que la radiación acústica se transfiera entre los objetos sin una pérdida sustancial de energía acústica. Cuando dos elementos están acoplados acústicamente indirectamente, se necesita un "medio de acoplamiento acústico" para proporcionar un intermediario a través del cual se pueda transmitir la radiación acústica. Por tanto, un eyector puede acoplarse acústicamente a un fluido, por ejemplo, sumergiendo el eyector en el fluido o interponiendo un medio de acoplamiento acústico entre el eyector y el fluido para transferir la radiación acústica generada por el eyector a través del medio de acoplamiento acústico y dentro del fluido.

El término "depósito" como se usa en el presente documento se refiere a un receptáculo o cámara para alojar o contener un fluido. Por tanto, un fluido en un depósito necesariamente tiene una superficie libre, es decir, una superficie que permite que una gotita sea expulsada de la misma. En una de sus formas más simples, un depósito consiste en una superficie sólida que tiene suficientes propiedades humectantes para alojar un fluido simplemente debido al contacto entre el fluido y la superficie.

El término "fluido" como se usa en el presente documento se refiere a materia que no es sólida o al menos parcialmente gaseosa y/o líquida. Un fluido puede contener un sólido que esté mínima, parcial o totalmente solvatado, dispersado o suspendido. Los ejemplos de fluidos incluyen, sin limitación, líquidos acuosos (incluida agua per se y agua salada) y líquidos no acuosos tales como disolventes orgánicos y similares.

La invención proporciona por tanto un método mejorado para determinar la concentración de un analito en una muestra de fluido como se define en las reivindicaciones, donde la muestra de fluido contiene, además del analito, un componente no analito necesario; es decir, un sistema tampón que incluye una sal tampón para mantener el pH o una sal para mantener la fuerza iónica, y en donde el método implica volatilizar e ionizar la muestra de fluido e introducir la muestra ionizada y volatilizada en un dispositivo de detección de analito iónico, tal como un espectrómetro de masas, que genera una señal de analito proporcional en intensidad a la cantidad de analito ionizado detectado. La mejora proporcionada por la invención implica el empleo de una sal tampón como componente sustituto del componente no analito original que servirá para el mismo propósito que el componente original pero es más volátil que el componente original y/o el analito o sufre una reacción química tras la volatilización para producir un producto de reacción que sea más volátil que el componente original y/o el analito. El componente sustituto da como resultado una señal de analito más fuerte y/o una relación señal-ruido aumentada respecto a la señal del analito y la relación señal-ruido obtenida con el componente no analito original. Los componentes sustitutos preferidos, al menos en parte debido a consideraciones de volatilidad, aumentan la relación señal-ruido en al menos un 20 %, y dichos componentes particularmente preferidos aumentan la relación señal-ruido en un 50 % o más. El propósito del componente no analito necesario puede ser, según se indica, mantener un pH predeterminado o una fuerza iónica requerida.

El analito en la muestra de fluido puede ser cualquier analito de interés. Los ejemplos de analitos incluyen, sin limitación, fármacos, metabolitos, inhibidores, ligandos, receptores, catalizadores, polímeros sintéticos y efectores alostéricos. Frecuentemente, el analito es una "biomolécula", es decir, cualquier molécula orgánica, independientemente de si es de origen natural, producida de forma recombinante, sintetizada químicamente en su totalidad o en parte, o si está químicamente o biológicamente modificada, es decir, era o forma parte de un organismo vivo. El término abarca, por ejemplo, analitos nucleotídicos, analitos peptídicos y analitos sacarídicos.

Los analitos nucleotídicos pueden ser nucleósidos o nucleótidos per se, pero también comprenden nucleósidos y nucleótidos que contienen no solo las bases convencionales de purina y pirimidina, es decir, adenina (A), timina (T), citosina (C), guanina (G) y uracilo (U), sino también formas protegidas de las mismas, por ejemplo, en donde la base está protegida con un grupo protector tal como acetilo, difluoroacetilo, trifluoroacetilo, isobutirilo o benzoílo, y análogos de purina y pirimidina. Los expertos en la materia conocerán análogos adecuados y se describen en los textos y la bibliografía pertinentes. Los análogos comunes incluyen, pero no se limitan a, 1-metiladenina, 2-metiladenina, N6-metiladenina, N6 -isopentil-adenina, 2-metiltio-N6-isopentiladenina, N,N-dimetiladenina, 8-bromoadenina, 2-tiocitosina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, 5-etilcitosina, 4-acetilcitosina, 1-metilguanina, 2-metilguanina, 7-metilguanina, 2,2-dimetilguanina, 8-bromo-guanina, 8-cloroguanina, 8-aminoguanina, 8-metilguanina, 8-tioguanina, 5-fluoro-uracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, 5-etiluracilo, 5-propiluracilo, 5-metoxiuracilo, 5-hidroximetiluracilo, 5-(carboxihidroximetil)uracilo, 5-(metil-aminometil)uracilo, 5-(carboximetilaminometil)-uracilo, 2-tiouracilo, 5-metil-2-tiouracilo, 5-(2-bromovinil)uracilo, ácido uracil-5-oxiacético, éster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, pseudouracilo, 1-metilpseudouracilo, queosina, inosina, 1-metilinosina, hipoxantina, xantina, 2-aminopurina, 6-hidroxiaminopurina, 6-tiopurina y 2,6-diaminopurina. Además, los términos "nucleósido" y "nucleótido" incluyen los restos que contienen no solo azúcares convencionales de ribosa y desoxirribosa, sino también otros azúcares. Los nucleósidos o nucleótidos modificados también incluyen modificaciones en el resto de azúcar, por ejemplo, en donde uno o más de los grupos hidroxilo se reemplazan con átomos de halógeno o grupos alifáticos, o se funcionalizan como éteres, aminas o similares.

Los analitos nucleotídicos también incluyen oligonucleótidos, en donde el término "oligonucleótido", para los fines de la presente invención, es genérico para polidesoxirribonucleótidos (que contienen 2-desoxi-D-ribosa), para polirribonucleótidos (que contienen D-ribosa), para cualquier otro tipo de polinucleótido que sea un N-glucósido de una base de purina o pirimidina, y para otros polímeros que contengan cadenas principales no nucleotídicas. Por tanto, un analito oligonucleotídico en el presente documento puede incluir modificaciones de oligonucleótidos, por ejemplo, sustitución de uno o más de los nucleótidos de origen natural con un análogo, modificaciones internucleotídicas tales como, por ejemplo, las que tienen enlaces no cargados (por ejemplo, metil fosfonatos, fosfotriésteres, fosforoamidatos, carbamatos, etc.), las que no tienen enlaces cargados negativamente (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), y las que tienen enlaces cargados positivamente (por ejemplo, aminoalquilfosforamidatos, aminoalquilfosfotriésteres, las que contienen fracciones colgantes, tales como, por ejemplo, proteínas (incluidas nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos señal, poli-L-lisina, etc.), las que tienen intercaladores (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), las que contienen quelantes (por ejemplo, metales, metales radiactivos, boro, metales oxidativos, etc.). No se pretende que haya distinción en la longitud entre los términos "polinucleótido" y "oligonucleótido", y estos términos se utilizarán indistintamente. Estos términos se refieren solo a la estructura primaria de la molécula. Como se usa en el presente documento, los símbolos de nucleótidos y polinucleótidos son conformes a las recomendaciones de la Comisión de Nomenclatura Bioquímica de la IUPAC-IUB (Biochemistry 9:4022, 1970).

Se pretende que los analitos "peptídicos" incluyan cualquier estructura compuesta por uno o más aminoácidos y, por tanto, incluyan péptidos, dipéptidos, oligopéptidos, polipéptidos y proteínas. Los aminoácidos que forman todo o parte de un analito peptídico pueden ser cualquiera de los veinte aminoácidos naturales convencionales, es decir, alanina (A), cisteína (C), ácido aspártico (D), ácido glutámico (E), fenilalanina (F), glicina (G), histidina (H), isoleucina (I), lisina (K), leucina (L), metionina (M), asparagina (N), prolina (P), glutamina (Q), arginina (R), serina (S), treonina (T), valina (V), triptófano (W) y tirosina (Y), así como los aminoácidos no convencionales, tales como isómeros y modificaciones de los aminoácidos convencionales, por ejemplo, D-aminoácidos, aminoácidos no proteicos, aminoácidos modificados postraduccionalmente, aminoácidos modificados enzimáticamente, p-aminoácidos, construcciones o estructuras diseñadas para imitar aminoácidos (por ejemplo, aminoácidos a,a-disustituidos, N-alquil aminoácidos, ácido láctico, palanina, naftilalanina, 3-piridilalanina, 4-hidroxiprolina, O-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina y nor-leucina) y otros aminoácidos no convencionales, como se describe, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos N.° 5.679.782 de Rosenberg et al. Los analitos peptídicos también pueden contener enlaces de estructura no peptídica, en donde el enlace amida -CONH- de origen natural se reemplaza en uno o más sitios dentro de la estructura del péptido con un enlace no convencional tal como amida N-sustituida, éster, tioamida, retropéptido (-NHCO-), retrotiamida (-NHCS-), sulfonamido (-SO²NH-) y/o enlaces peptoides (glicina N sustituida). Por consiguiente, los analitos peptídicos pueden incluir pseudopéptidos y peptidomiméticos. Los analitos peptídicos pueden ser (a) de origen natural, (b) producidos por síntesis química, (c) producidos mediante tecnología de ADN recombinante, (d) producidos por fragmentación bioquímica o enzimática de moléculas más grandes, (e) producidos por métodos resultantes de una combinación de los métodos (a) a (d) enumerados anteriormente, o (f) producidos por cualquier otro medio para producir péptidos.

Los analitos sacarídicos incluyen, sin limitación, monosacáridos, disacáridos, oligosacáridos, polisacáridos, mucopolisacáridos o peptidoglicanos (peptidopolisacáridos) y similares.

La invención implica el reemplazo de una sal tampón estándar, relativamente no volátil asociada con la supresión de iones por una sal tampón sustituta que es más volátil que la sal tampón estándar y proporciona una supresión de iones reducida como lo demuestra una señal de analito aumentada y/o una relación de señal-ruido aumentada. Está establecido que las sales relativamente no volátiles en muestras de fluidos son contaminantes frecuentes que pueden causar supresión de iones y, por lo tanto, resultados imprecisos o incorrectos.

En esta realización, el componente no analito necesario es el componente de sal de un sistema tampón estándar, y el componente sustituto es una sal más volátil que sirve para el mismo propósito, es decir, mantiene el mismo pH, y que reduce o elimina la supresión de iones observada con la sal tampón estándar. En general, las sales de ácidos o bases fuertes no son suficientemente volátiles para el presente propósito. Por ejemplo, los cationes de sodio, los cationes de potasio, los cationes de calcio y los cationes de tetrabutilamonio deberían evitarse, al igual que los aniones como los sulfatos y los nitratos. Una excepción notable es el ácido clorhídrico, que aunque es un ácido fuerte en el agua, es un ácido relativamente débil en la fase gaseosa. Igualmente, es poco probable que los iones con cargas múltiples, tales como sulfatos, citratos y fosfatos, sean volátiles. Por último, no es probable que las sales de mayor peso molecular, tales como las sales de ácidos grasos, sean volátiles excepto a temperaturas muy elevadas.

Los ejemplos de sales tampón relativamente volátiles que pueden reemplazar las sales tampón convencionales, o el componente original no analito, incluyen, sin limitación, las siguientes:

Bicarbonato de amonio

Formiato de amonio

Acetato de amonio

Propionato de amonio

Butirato de amonio

Formiato de piridinio

Acetato de piridinio

Propionato de piridinio

Butirato de piridinio

Acetato de etilmorfolinio

Formiato de dimetilamino

Acetato de dimetilamino

Propionato de dimetilamino

Butirato de dimetilamino

Formiato de metiletilamino

Acetato de metiletilamino

Propionato de metiletilamino

Butirato de metiletilamino

Formiato de dietilamino

Acetato de dietilamino

Propionato de dietilamino

Butirato de dietilamino

Dentro del grupo mencionado anteriormente, las sales tampón volátiles preferidas incluyen las siguientes:

Bicarbonato de amonio

Formiato de amonio

Acetato de amonio

Acetato de piridinio

Formiato de piridinio

Acetato de etilmorfolinio

Acetato de trimetilamino

Formiato de trietilamino

Debe entenderse que las sales anteriormente mencionadas son meramente representativas, y que también se pueden usar otras sales, siempre que sirvan para el mismo propósito que la sal a la que están reemplazando y que cumplan con los criterios de volatilidad y mejora de los criterios de señal-ruido establecidos.

Las sales candidatas pueden analizarse fácilmente para determinar la volatilidad usando métodos conocidos por los expertos en la materia. Dichos métodos incluyen, por ejemplo, un análisis de residuo seco, en el cual la composición de sal candidata o tampón se coloca en un disolvente volátil y a continuación se calienta a sequedad. La presencia de cualquier residuo seco sugiere que la sal no es suficientemente volátil para su uso en el presente propósito. Las sales candidatas establecidas como suficientemente volátiles se prueban a continuación para determinar su capacidad para reducir la supresión de iones, realizando una comparación de la sal candidata con el componente no analito necesario al que la sal candidata está destinada a reemplazar. La volatilidad también se puede evaluar utilizando el índice de acetato de butilo, una medida de las tasas de evaporación relativas, como apreciarán los expertos en el campo.

Generalmente, aunque no necesariamente, el dispositivo de detección iónica es un espectrómetro de masas. Se apreciará que están disponibles diversas técnicas de volatilización en relación con la espectrometría de masas, incluidos los métodos térmicos y la electronebulización, y se puede utilizar cualquier técnica de volatilización eficaz junto con el presente método. También se puede usar cualquiera de varios medios de ionización conocidos, incluyendo la ionización química, ionización por desorción de campo, ionización por electronebulización, ionización química a presión atmosférica, ionización por desorción láser asistida por matriz e ionización por plasma acoplado inductivamente y, de nuevo, cualquier técnica de ionización efectiva que pueda emplearse ventajosamente en el presente documento. Dependiendo de la naturaleza del analito, las mediciones espectrométricas de masas se pueden realizar en modo negativo o positivo, ionizándose preferentemente los analitos ácidos en el modo negativo e ionizándose preferentemente los analitos básicos en el modo positivo.

En una realización preferida, el método mejorado de la invención emplea eyección acústica para producir gotitas muy pequeñas que a continuación se volatilizan, ionizan y analizan. Estas pequeñas gotitas son gotitas del tamaño de nanolitros, definidas en el presente documento como gotitas que contienen como máximo aproximadamente 5 nl de muestra de fluido, preferentemente no más de aproximadamente 2,5 nl, más preferentemente menos de 1 nl, lo más preferentemente menores de aproximadamente 50 pl y óptimamente menos de aproximadamente 1 pl. La eyección acústica de gotitas de la superficie de una muestra de fluido se efectúa utilizando un eyector acústico como se describirá en detalle a continuación. La tecnología de eyección acústica es particularmente adecuada para la espectrometría de masas de alto rendimiento (HTMS), en la medida en que la HTMS se ha visto obstaculizada por la falta de preparación y carga de muestras fácilmente automatizadas, la necesidad de conservar la muestra, la necesidad de eliminar la contaminación cruzada, la incapacidad de ir directamente desde un depósito de fluido al dispositivo analítico, y la incapacidad de generar gotitas del tamaño apropiado.

El presente método ha demostrado ser inesperadamente eficaz con gotitas del tamaño de nanolitros, como se demuestra en los Ejemplos del presente documento. Se entiende bien que la física fundamental de los fluidos cambia a medida que disminuye la escala de tamaño, es decir, a medida que las gotitas de fluido se vuelven cada vez más pequeñas. Los principios de difusión y mezcla que de otro modo serían aplicables tienden a no aplicarse a las gotitas del tamaño de nanolitros, ni los análisis convencionales son viables cuando se intenta predecir la dinámica de flujo de un elemento, ion o compuesto que se mueve desde el interior de una gotita del tamaño de nanolitros hasta la superficie de la gotita, por ejemplo, para propósitos de volatilización.

La eyección acústica de gotitas que a continuación se volatilizan proporciona numerosas ventajas. Al volatilizar las gotitas que tienen un tamaño de nanolitros, por ejemplo, utilizando una técnica de volatilización térmica, la gran superficie de estas pequeñas gotitas facilita la extracción en fase gaseosa del componente sustituto relativamente volátil, dejando atrás el analito cargado en la gotita que se evapora. Por tanto, al permitir la extracción en fase gaseosa del componente sustituto, por ejemplo, la sal tampón sustituta o similar, la eyección acústica elimina la necesidad de una "limpieza" en fase líquida o en fase sólida de una muestra de fluido para eliminar los componentes interferentes que causan la supresión de iones. Esto aumenta significativamente el número de muestras que se pueden analizar usando espectrometría de masas o similar en un período de tiempo determinado. Con la metodología actual disponible comercialmente, la necesidad de una etapa adicional para eliminar el tampón, otras sales, detergentes y cualquier otra especie no analítica da como resultado un tiempo de procesamiento en el intervalo de 7 a 20 segundos por muestra, mientras que la presente invención permite un tiempo de procesamiento muy por debajo de 1 segundo por muestra, normalmente del orden de aproximadamente 0,3 segundos por muestra. La combinación de esta característica con el hecho de que el presente proceso se puede llevar a cabo utilizando tamaños de muestra mucho más pequeños y con el hecho de que la señal del analito obtenida aumenta en virtud de la etapa de extracción en fase gaseosa significa que la invención permite una operación mucho más rápida, económica, y un método preciso para analizar muestras de fluidos utilizando espectrometría de masas u otros dispositivos de detección iónica.

La eyección acústica, como se ha indicado anteriormente, permite un procesamiento rápido de la muestra así como la generación de gotitas del tamaño de nanolitros de tamaño predeterminado y constante; véase la patente de los Estados Unidos N.° 6.416.164 de Stearns et al. citada. La patente anteriormente mencionada describe cómo el tamaño de las gotitas eyectadas acústicamente desde la superficie de un fluido se puede controlar cuidadosamente variando la potencia acústica, la frecuencia acústica, la duración de la ráfaga de tono y/o el número F de la lente de enfoque. Una ventaja adicional de usar la eyección acústica junto con la presente invención es que se pueden expulsar gotitas de un tamaño de muestra muy pequeño, del orden de 5 UI o menos. Esto es particularmente ventajoso cuando la disponibilidad de la muestra es limitada y es necesario analizar una pequeña muestra de fluido. En términos de capacidad de procesamiento, la Patente de los Estados Unidos N.° 6.938.995 de Mutz et al. explica que la tecnología de eyección acústica, utilizada junto con la evaluación acústica de muestras de fluidos en una pluralidad de depósitos, puede lograr un análisis de más de 5, 10 o incluso 25 depósitos por segundo, lo que se traduce en más de 50.000 muestras de fluido por día.

En una realización, entonces, el método mejorado de la invención hace uso de un eyector acústico como un dispositivo de generación de gotitas de muestra de fluido, incluyendo el dispositivo al menos un depósito para contener la muestra de fluido, un eyector acústico y un medio para posicionar el dispositivo acústico en relación de acoplamiento acústico con el depósito. Normalmente, se usa un único eyector que está compuesto por un generador de radiación acústica y un medio de enfoque para enfocar la radiación acústica generada por el generador de radiación acústica. Sin embargo, también se pueden utilizar ventajosamente una pluralidad de eyectores. De forma análoga, aunque se puede utilizar un único depósito, el dispositivo normalmente incluye una pluralidad de depósitos.

Los ejemplos de dispositivos de eyección acústica útiles junto con la presente invención se describen en detalle en las Patentes de los Estados Unidos números 6.802.593 de Ellson et al., 7.270.986 de Mutz et al., 7.439.048 de Mutz et al., y 6.603.118 de Ellson et al. Como se ha descrito en el presente documento, se puede construir un dispositivo de eyección acústica para incluir múltiples depósitos como un componente integrado o unido permanentemente del dispositivo. Sin embargo, para proporcionar modularidad e intercambiabilidad de componentes, se prefiere que el dispositivo se construya con depósitos extraíbles. Generalmente, los depósitos están dispuestos en un patrón o una matriz para proporcionar a cada depósito una direccionabilidad sistemática individual. Además, si bien cada uno de los depósitos puede proporcionarse como un elemento discreto o independiente, en circunstancias que requieran una gran cantidad de depósitos, se prefiere que los depósitos estén unidos entre sí o representen porciones integradas de una única unidad de depósito. Por ejemplo, los depósitos pueden representar pocillos individuales en una placa de pocillos. Muchas placas de pocillos adecuadas para su uso con el dispositivo están disponibles en el mercado y pueden contener, por ejemplo, 96, 384, 1536 o 3456 pocillos por placa de pocillos, con faldón completo, medio faldón o sin faldón. Las placas de pocillos o las placas de microvaloración se han convertido en artículos de laboratorio de uso común. La Sociedad de automatización y detección de laboratorios (SLAS) ha establecido y mantiene estándares para placas de microtitulación junto con el Instituto Nacional Estadounidense de Estándares, incluidos los estándares de huella y dimensión ANSI/SLAS 1-2004. Los pocillos de tales placas de pocillos forman normalmente matrices rectilíneas.

Sin embargo, la disponibilidad de tales placas de pocillos disponibles en el mercado no excluye la fabricación y el uso de placas de pocillos hechas a medida en otras configuraciones geométricas que contienen al menos aproximadamente 10.000 pocillos, o hasta 100.000 a 500.000 pocillos, o más. Asimismo, el material utilizado en la construcción de depósitos debe ser compatible con las muestras de fluido contenidas en ellos. Por tanto, si se pretende que los depósitos o pocillos contengan un disolvente orgánico tal como acetonitrilo, los polímeros que se disuelven o se hinchan en acetonitrilo serían inadecuados para su uso en la formación de depósitos o placas de pocillos. De manera análoga, los depósitos o pocillos destinados a contener DMSO deben ser compatibles con DMSO. Para fluidos acuosos, son adecuados varios materiales para la construcción de depósitos e incluyen, pero no se limitan a, materiales cerámicos tales como óxido de silicio y óxido de aluminio, metales tales como acero inoxidable y platino, y polímeros tales como poliéster, polipropileno, copolímeros de olefinas cíclicas (por ejemplo, los disponibles en el mercado como Zeonex® de Nippon Zeon y Topas® de Ticona), poliestireno y politetrafluoroetileno. Para fluidos que son fotosensibles, los depósitos se pueden construir a partir de un material ópticamente opaco que tenga suficiente transparencia acústica para un funcionamiento sustancialmente intacto del dispositivo.

Además, para reducir la cantidad de movimiento y el tiempo necesario para alinear el generador de radiación acústica con cada depósito o pocillo de depósito durante la operación, es preferible que el centro de cada depósito esté ubicado a no más de aproximadamente 1 centímetro, más preferentemente no más de aproximadamente 1,5 milímetros, aún más preferentemente no más de aproximadamente 1 milímetro y óptimamente no más de aproximadamente 0,5 milímetros, desde un centro de depósito vecino. Estas dimensiones tienden a limitar el tamaño de los depósitos a un volumen máximo. Los depósitos se construyen para contener normalmente no más de aproximadamente 1 ml, preferentemente no más de aproximadamente 1 pl y, de manera óptima, no más de aproximadamente 1 nl de fluido.

Para facilitar la manipulación de múltiples depósitos, también se prefiere que los depósitos sean sustancialmente indistinguibles acústicamente.

Se utiliza un elemento vibratorio o transductor para generar radiación acústica. En algunos casos, el generador de radiación acústica se compone de un solo transductor. Además, el transductor puede utilizar un elemento piezoeléctrico para convertir la energía eléctrica en energía mecánica asociada con la radiación acústica. Como alternativa, se pueden usar generadores de radiación acústica de elementos múltiples tales como conjuntos de transductores. Por ejemplo, las matrices acústicas lineales, las matrices acústicas curvilíneas o las matrices acústicas en fase pueden usarse ventajosamente para generar radiación acústica que se transmite simultáneamente a una pluralidad de depósitos.

Un elemento añadido en forma de un dispositivo de extracción en fase gaseosa volatiliza térmicamente las gotitas eyectadas usando un generador de radiación acústica como se acaba de describir, y extrae especies no deseadas de las gotitas antes del análisis usando, por ejemplo, un espectrómetro de masas. El reemplazo de componentes usados convencionalmente con sustitutos más volátiles (por ejemplo, sales tampón) o sustitutos que se someten a una reacción química para proporcionar especies volátiles, facilita la extracción en fase gaseosa de estos componentes, eliminando o al menos reduciendo sustancialmente la supresión de iones u otros tipos de interferencia observados con los compuestos convencionales.

Como se ha indicado anteriormente en el presente documento, el método de la invención emplea una sal tampón como un componente sustituto del componente no analito original que sirve para el mismo propósito que el componente original pero es (1) más volátil que el componente original y/o el analito o (2) sufre una reacción química tras la volatilización para producir un producto de reacción que sea más volátil que el componente original y/o el analito. La realización (1) se ha descrito anteriormente. Pasando ahora a la realización (2), el componente sustituto en este caso no es necesariamente más volátil que el componente original y/o el analito, sino que se selecciona para que sufra una reacción química que produce al menos un producto de reacción volátil. El componente sustituto puede ser un compuesto bipolar que sufre una conversión intramolecular, como se discutirá en detalle a continuación, o el componente sustituto puede ser un compuesto no bipolar que se puede escindir químicamente para producir un producto de reacción volátil. Como alternativa, el componente sustituto puede ser un compuesto que sufre una reacción inducida térmicamente para dar lugar a al menos un producto de reacción volátil. El compuesto también puede seleccionarse para sufrir una reacción fotocatalítica que dé como resultado al menos un producto de reacción volátil, donde, se debe entender, que la expresión "producto de reacción volátil" se refiere a un producto de reacción que es más volátil que el componente original y/o el analito.

Compuesto bipolar como el componente sustituto:

Cuando se usa un compuesto bipolar como componente sustituto, por ejemplo, como sal tampón en una muestra de fluido que requiere un sistema tampón, el compuesto bipolar se selecciona para que sufra una reacción química a temperatura elevada y/o bajo presión reducida durante la volatilización, para proporcionar al menos un producto de reacción que sea más volátil que el componente no analito original y/o el analito.

Los compuestos bipolares descritos infra son útiles en otros métodos también, por ejemplo, en cualquier método que implique la ionización y volatilización de una muestra de fluido tamponada seguida de la detección del analito en la muestra ionizada y volatilizada.

Por compuesto de "ion híbrido" o "bipolar", como se utilizan estas expresiones en el presente documento, se entiende un compuesto que contiene un par de grupos ionizables, uno que se ioniza para formar una especie con carga positiva y el otro que se ioniza para formar una especie con carga negativa. El primero es normalmente un grupo que contiene un átomo de nitrógeno tal como una amina sustituida o no sustituida o un sustituyente diazo, y el último es generalmente, aunque no necesariamente un sustituyente carboxilo (COOH). Se apreciará que a valores de pH más altos sólo el grupo que contiene átomos de nitrógeno llevará una carga, de modo que el compuesto es catiónico, mientras que a valores de pH más bajos sólo se ionizará el grupo que contiene carboxilo, de modo que el compuesto es aniónico. A valores de pH intermedios, generalmente en el intervalo de aproximadamente 5 a aproximadamente 8, ambas entidades llevan una carga y de esta forma las reacciones descritas a continuación se desarrollan de manera óptima.

En una realización, el compuesto bipolar es un compuesto parcialmente insaturado, es decir, un compuesto que contiene al menos un enlace insaturado, tal como un doble enlace, y es "prearomático" en el sentido de que la descomposición intramolecular da como resultado la generación de un compuesto aromático volátil. Por ejemplo, el compuesto bipolar parcialmente insaturado, prearomático puede comprender un núcleo parcialmente insaturado, prearomático al cual están covalentemente unidos un grupo ácido carboxílico (-COOH) y un sustituyente que contiene nitrógeno, en donde el sustituyente que contiene nitrógeno puede seleccionarse de amino, amino primario, amino secundario, amino terciario y diazo. En este ejemplo, el grupo de ácido carboxílico y el sustituyente que contiene nitrógeno se colocan entre sí de modo que la descomposición intramolecular produzca un compuesto aromático volátil (es decir, un compuesto aromático que es más volátil que el componente original y/o el analito), libere dióxido de carbono y genere un compuesto que contiene nitrógeno, tal como amoníaco, una amina sustituida o no sustituida (generalmente gaseosa) o gas nitrógeno. El núcleo prearomático es generalmente cíclico, aunque es adecuado un núcleo acíclico siempre que la reacción de descomposición intramolecular antes mencionada dé como resultado un compuesto volátil, preferentemente un compuesto aromático volátil, además de la liberación de dióxido de carbono y un compuesto que contiene nitrógeno. Este compuesto prearomático bipolar que contiene el núcleo prearomático Q y el sustituyente N* que contiene nitrógeno puede estar representado por la estructura (1)

Cuando el núcleo Q es cíclico, la transformación del compuesto prearomático puede ocurrir de acuerdo con el siguiente esquema (I) cuando el grupo carboxilato y el sustituyente N* están unidos a átomos de carbono adyacentes en un anillo:

En el Esquema (I), Ar representa el producto de reacción aromático volátil y cada producto de reacción N** corresponde a cada sustituyente N*. Esta reacción se puede ilustrar usando un ejemplo más específico en el que, únicamente con fines ilustrativos, el núcleo Q comprende un anillo ciclohexa-1,3-dieno, de manera que, como se muestra en el Esquema (II), el producto de reacción aromático volátil es benceno:

El sustituyente N*, en forma catiónica, puede ser, por ejemplo, -(NH³), -(NHR¹)+, (NR²R³)⁺, (NR⁴R⁵R⁶)⁺, o diazo, de manera que el N** será, respectivamente, amoníaco (NH³), NH²R¹, NHR²R³, NR⁴R⁵R⁶, o gas nitrógeno. R¹a R⁶son sustituyentes no hidrógeno, tales como alquilo inferior, es decir, un grupo alquilo C¹-C⁶, preferentemente un grupo alquilo C¹-C³, que puede o no estar sustituido con sustituyentes que no interferirán en el proceso de detección ni interactuarán con ninguno de los componentes de la muestra de una manera perjudicial. La reacción de descomposición da como resultado dos productos que no se detectarán, es decir, el compuesto aromático volátil y el dióxido de carbono, y la especie nitrogenada N** la cual, es poco probable que cause supresión de iones (las reacciones de aromatización son generalmente conocidas; véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos n.° 2.280.828 de Inhoffen).

En el Esquema (II), el reactante ciclohexa-1,3-dieno puede estar sustituido o no con uno o más sustituyentes del anillo que no interfieren con la reacción química mostrada o con cualquier otro compuesto que esté presente, y generalmente se seleccionan del mismo grupo de sustituyentes que R¹a R⁶, y el carboxilato y el sustituyente que contiene nitrógeno catiónico que se muestran como orto entre sí pueden estar en relación cis o trans (compuesto (2)),

pero preferentemente en la configuración trans (compuesto (3)):

Los sustituyentes opcionalmente presentes se ilustran en la estructura (4),

en la cual, como se muestra, hay i sustituyentes donde i está en el intervalo de cero a 6 inclusive, en donde los sustituyentes, representados como R, pueden ser iguales o diferentes. En un caso particular, en donde N* es diazo, se prefiere que el sustituyente carboxilato y diazo estén en la posición trans con un sustituyente unido al mismo carbono que el grupo diazo, donde ese sustituyente, mostrado como R7 en el compuesto (5), es alquilo C¹-C⁶, preferentemente alquilo C¹-C³(la omisión de R7 da como resultado un compuesto que es demasiado inestable para el presente fin):

En una realización relacionada, el compuesto bipolar es un compuesto aromático sustituido con un grupo carboxilato y un grupo diazo, tal como ácido orto-diazo benzoico, en cuyo caso la reacción intramolecular da como resultado el producto de reacción N** bencina (Esquema (III):

La bencina es un compuesto muy reactivo que servirá como un compuesto intermedio para una reacción adicional. En este caso, un segundo reactante, por ejemplo, agua, o un dieno, se introduce en la muestra para que reaccione con bencina. El agua dará como resultado una reacción para dar fenol, mientras que la selección adecuada del dieno, como comprenderá un experto en la materia, producirá un producto de reacción volátil. Como ejemplo, el furano puede servir como dieno, en cuyo caso la reacción con bencina da el producto volátil 1,2,3,4-tetrahidro-1,4-epoxinaftaleno. Como otro ejemplo, el antraceno puede servir como dieno, dando como resultado el producto de reacción volátil tripticeno.

El compuesto bipolar puede ser cíclico o acíclico, y, si es cíclico, este puede ser monocíclico, bicíclico o policíclico, y puede contener anillos aromáticos así como un segmento molecular que está solo parcialmente insaturado. Cuando la reacción química del compuesto bipolar da como resultado un compuesto aromático volátil como producto de reacción, esto es generalmente, aunque no necesariamente, mediante la adición de un doble enlace a una estructura de anillo para generar aromaticidad 4n+2. Los ejemplos incluyen la adición de un doble enlace a un anillo de ciclohexil-1,3-dienilo sustituido o no sustituido para generar un anillo de benceno, o la adición de un doble enlace a un anillo de dihidrofurano sustituido o no sustituido para generar furano, un compuesto aromático. Por tanto, el compuesto bipolar puede, en un caso, comprender un núcleo de ciclohexil-1,3-dienilo que está sustituido con los restos -COOH y -N* en los átomos de carbono adyacentes, de modo que el compuesto comprende 5-carboxil-6-N*-ciclohexa-1,3-dieno, por ejemplo, 5-carboxil-6-aminociclohexa-1,3-dieno, el cual puede estar sustituido adicionalmente como se indicó anteriormente, y que se convierte en un anillo de benceno sustituido o no sustituido después de la reacción. Un compuesto bipolar adicional puede comprender un núcleo de ciclohexa-1,4-dieno sustituido con -COOH y -N* en la configuración para, de modo que el compuesto sea o contenga 3-carboxil-6-N*-ciclohexa-1,4-dieno, no sustituido o sustituido como anteriormente, el cual se convierte mediante la reacción de descomposición en un anillo de benceno sustituido o no sustituido. Otro compuesto bipolar puede comprender, por ejemplo, dihidrofurano sustituido en la posición 2 y posición 3 con el -COOH y restos -N*, de modo que el compuesto comprende 2-carboxil-3-N*-2,3-dihidrofurano o 2-N* -3-carboxil-2,3-dihidrofurano, sustituido o no sustituido como se ha descrito anteriormente en el presente documento, el cual, tras la reacción, convierte en furano sustituido o no sustituido, una molécula aromática.

Los ejemplos específicos de compuestos bipolares apropiados incluyen, sin limitación, los siguientes (por simplicidad, los compuestos se muestran en forma sin carga; se entenderá, sin embargo, que a valores de pH intermedios cada compuesto contendrá tanto especies aniónicas como catiónicas, es decir, un grupo carboxilato -COO y un átomo de nitrógeno cargado positivamente):

Ácido 6-amino-3,4-dimetilciclohexa-2,4-dieno-1-carboxílico:

Ácido 1,6-diamino-2,4-dieno-1 -carboxílico:

Ácido 6-amino-1,4-dimetilciclohexa-2,4-dieno-1-carboxílico:

Ácido 6-aminoddohexa-2,4-dieno-1-carboxíNco:

Ácido 6-(dimetNamino)ddohexa-2,4-dieno-1-carboxíNco:

Ácido 6-(etilamino)ciclohexa-2,4-dieno-1-carboxílico:

Ácido 3-amino-2,3-dihidrofuran-2-carboxílico:

Ácido 4-ammoddohexa-2,5-dienocarboxíNco:

Ácido 10-amino-9,10-dihidroantraceno-9-carboxílico:

Ácido 2-amino-1,2-dihidronaftaleno-1-carboxílico:

Ácido 2-amino-1,2-dihidronaftaleno-1-carboxílico:

Acido 4-(etilamino)-1,4-dihidronaftaleno-1-carboxílico:

Estos compuestos bipolares pueden obtenerse comercialmente o sintetizarse usando métodos conocidos en la técnica y descritos en la bibliografía pertinente. Los iones híbridos que contienen carboxilato se pueden sintetizar usando cualquiera de una variedad de técnicas para combinar un compuesto que contiene carboxilo con una amina u otro compuesto nitrogenado. Los compuestos bipolares que contienen ácido sulfónico tales como detergentes bipolares y tampones generalmente se pueden sintetizar a partir de 1,2-oxatiolano-2,2-dióxido sustituido o no sustituido y amina sustituida o no sustituida, de acuerdo con el Esquema (IV):

Otros componentes sustitutos escindibles químicamente:

Como alternativa, se puede seleccionar un compuesto no bipolar escindible químicamente para que sirva como componente sustituto, en donde el compuesto escindible químicamente contiene al menos un enlace que se puede escindir con un ácido, base u otro reactivo. Los enlaces representativos escindibles hidrolíticamente en presencia de ácidos o bases incluyen los siguientes: éster carboxilato (-(CO)-O-); éter enol (-CH=CH-O-); acetal (-O-CR²-O-); hemiacetal (-CH(OH)-O-); anhídrido (-(CO)-O-(CO)-); carbonato (-O-(CO)-O-); amida ((-(CO)-NH-); amida N-sustituida (-(CO)-NR-); uretano (-O-(CO)-NH-); uretano N-sustituido (-O-(CO)-NR-); imido (-CH=N-); hidrazo N,N-disustituido (-NR-NR-); tioéster (-(CO)-S-); éster fosfónico (-P(O)(OR)-O-); éster sulfónico (-SO²-OR-); orto éster (-C(OR)²-O-); y betaína éster (R-O-(CO)-N(R>⁺X -donde R' pueden ser los mismos o diferentes sustituyentes no hidrógeno y X es el contraion asociado). Otros enlaces escindibles químicamente incluyen, sin limitación: el enlace escindible con hidroxilamina -(CO)-O-CH²-CH²-O-(CO)-; el enlace escindible con tiol -S-S, también escindible tras el tratamiento con fosfinas trisustituidas tales como trifenilfosfina; cis-dioles escindibles con peryodato -CH(OH)-CH)OH-; y el enlace escindible con fluoruro -(O)-NH-(CH²)²-O-(CH²)²-O-(CH²)²-(NH)-(CO)-. Se han descrito tensioactivos que contienen enlaces escindibles químicamente, junto con la síntesis de los mismos, estos incluyen ProteaseMAX (V2071) (Promega); RapiGest SF (Waters); PPS Silent Surfactant (Agilent); MaSDeS (véase Chang et al. (Jan. 2015) J. Proteome Res. 14(3)); Invitrosol (Life Technologies, Inc.); Progenta AALS I (2,2-dihexoxipropil sulfato de sodio, de Protea Biosciences); Progenta AALS II (2,2-diheptoxipropil sulfato de sodio, también de Protea Biosciences); Progenta CALS I (bromuro de 2,2-dihexoxipropil amonio, también de Protea Biosciences); y Progenta CALS II (bromuro de 2,2-diheptoxipropil amonio, también de Protea Biosciences). Estos tensioactivos y sus análogos se pueden usar ventajosamente en las presentes composiciones, al igual que los tampones y otros compuestos que contienen estos y otros enlaces escindibles químicamente.

Componentes sustitutos escindibles térmicamente:

Los componentes sustitutos también pueden contener enlaces que se pueden escindir con calor, de modo que tienen el mismo propósito que el componente original en la muestra de fluido, pero se escinden en compuestos más pequeños tras la volatilización de la muestra, donde esos compuestos más pequeños son volátiles o es poco probable que causen supresión de iones. Los enlaces escindibles térmicamente incluyen enlaces éster, enlaces carbamato, enlaces carbonato, enlaces tipo uretano (-O-(CO)-NH-) y enlaces uretano N-sustituido (-O-(CO)-NR-) en los cuales el átomo de nitrógeno del enlace está sustituido con un sustituyente que no es hidrógeno, tal como alquilo inferior. Otros enlaces escindibles térmicamente incluyen aductos de Diels-Alder furano-maleimida (véase Szalal et al. (2007) Macromolecules 40(4): 818-823), enlaces basados en oxirano y tiirano, y sulfonas sustituidas con éster que se descomponen térmicamente en un éster y SO²gaseoso de acuerdo con el siguiente esquema

en donde R es un sustituyente no hidrógeno, generalmente un grupo alquilo (por ejemplo, piperileno, como se ha descrito por Eckert y Liotta, "Designing Smart Surfactants" impreso de www.chbe.gatech.edu/eckert/pdf/-surfactant.pdf, Acceso al sitio de internet el 19 de octubre de 2015).

Componentes sustitutos escindibles fotolíticamente:

La incorporación de uno o más sitios escindibles fotolíticamente en el componente sustituto permite la escisión inducida por irradiación antes de la introducción de la muestra en el espectrómetro de masas u otro dispositivo analítico. La muestra de fluido o fluidos se puede irradiar en la fase gaseosa, es decir, después de la eyección de las gotitas de fluido pero antes de entrar en el espectrómetro de masas, o se pueden irradiar en la fase líquida, por ejemplo, en una placa de pocillos u otro recipiente o grupo de recipientes. La irradiación en la fase gaseosa permite la conversión en tiempo real en los productos de escisión, mientras que la irradiación en la fase líquida, donde el fluido de muestra está presente en una multiplicidad de recipientes o pocillos, no lo permite.

Pueden incorporarse fácilmente sitios escindibles fotolíticamente en el componente sustituto, por ejemplo, el tampón, tensioactivo o similares, utilizando técnicas orgánicas sintéticas conocidas por los expertos en la materia y/o descritas en los textos y la bibliografía pertinentes. Un tipo de enlace escindible fotolíticamente está compuesto por un grupo orto-nitrobencilo como en la siguiente estructura representativa

donde R* es generalmente un átomo de nitrógeno u átomo de oxígeno unido al resto de la molécula. Dichas estructuras por tanto incluyen

así como el análogo N sustituido

en la que R, de nuevo, es un sustituyente que no es hidrógeno, tal como alquilo inferior, y el símbolo 'AA/I representa la unión al resto de la molécula. Otro enlace escindible fotolíticamente incluye, a modo de ejemplo, el enlace de tipo ácido cinámico

descrito, por ejemplo, por Sakai et al. (15 Junio 2012) J. Colloid e Interface Sci. 376(1): 160-164, con respecto al tensioactivo fotoescindible.

Otros enlaces escindibles fotolíticamente incluyen bencil éteres (que se escinden para formar alcoholes), enlaces carbamato (que se escinden para formar aminas), enlaces 1,3-ditiano (que se escinden para formar grupos carbonilo); enlaces orto-nitroanilida (que se escinden para formar grupos carboxilo), enlaces de tipo benzoína (que se escinden para formar grupos fosfato) y similares. Véase, por ejemplo, Pelliccioli et al. (2002) Photochem. Photobiol. Sci. 1:441 458, y Greene et al., Protective Groups in Organic Synthesis, 3a edición, John Wiley & Sons (New York, NY: 1999).

Los expertos en la materia podrán utilizar métodos conocidos de síntesis orgánica y/o métodos descritos en la bibliografía para sintetizar compuestos bipolares y/o escindibles adecuados que se pueden utilizar como componente sustituto en el presente documento. Adicionalmente, tampones conocidos (por ejemplo, los tampones de Good; véase Good et al. (1966) Biochemistry 5(2):467-477), tensioactivos y similares se pueden modificar para incorporar enlazadores escindibles.

Un tampón representativo de interés es el compuesto que contiene acetal (25)

que se descompone fotolíticamente y/o en presencia de ácido como sigue para dar 2-aminoetanol y ácido 2-formilbenzoico. Otro tampón de interés es el compuesto (26)

(26)

que se puede escindir fotolíticamente para dar metamina (CH³-NH²) y ácido 4-formil-3-nitrosobenzoico.

Los compuestos que tienen la estructura general

son componentes sustitutos adecuados en el presente documento, particularmente como un tampón escindible con ácido. En (27), L¹y L²son enlaces hidrocarbilo C¹-C⁶, generalmente hidrocarbilo C²-C⁴, R⁸, R⁹, R¹⁰, y R¹¹se seleccionan independientemente de H e hidrocarbilo C¹-C¹⁶(por ejemplo, alquilo, cicloalquilo, alquenilo, etc., particularmente alquilo inferior), R¹²es alquilo inferior, y R¹³es -COOH o -CH²OSO³H. Cuando R¹³es -COOH, el compuesto se puede representar como (28), mientras que cuando R¹³es -CH²OSO³H, el compuesto se puede representar como (29):

En una realización preferida, R⁸, R⁹, R¹⁰y R¹¹son H, L¹y L²son -CH²CH²- y R¹²es metilo, de modo que los compuestos genéricos (28) y (29) tienen las estructuras (30) y (31), respectivamente:

Ambos compuestos se pueden sintetizar a partir de piruvato de metilo. El compuesto (30) tiene un pH de aproximadamente 9,44 y se emplea de manera óptima como tampón a un pH en el intervalo de aproximadamente 7,5 a 10,5. El compuesto (31) tiene un pH de aproximadamente 9,44 y se emplea de manera óptima como tampón a un pH en el intervalo de aproximadamente 8,0 a 11,0. La FIG. 4 ilustra esquemáticamente la síntesis del compuesto (30), mientras que la FIG. 5 ilustra esquemáticamente la síntesis del compuesto (31). La implementación de las etapas de reacción individuales mostradas en el presente documento estará dentro del alcance de los expertos en la materia y/o se hará evidente al hacer referencia a una reacción análoga en los textos o la bibliografía.

EJEMPLO 1

En este ejemplo, se evaluó el impacto de la volatilidad del tampón en la determinación espectrométrica de masas de cafeína utilizando acetato de amonio como sal tampón volátil y cloruro de sodio como sal tampón no volátil. Se prepararon muestras de fluido con concentraciones variables de acetato de amonio o cloruro de sodio, a 1 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, 25 mM, 50 mM, 100 mM, 250 mM y 500 mM. Se generaron gotitas de muestra usando un manipulador de líquidos Echo® 555 modificado (Labcyte Inc., Sunnyvale, CA). El instrumento se modificó para mover el conjunto del transductor al exterior del instrumento por debajo de una boquilla para permitir que la corriente de gotitas se exponga a un calor de 195 °C, lo que permite la extracción en fase gaseosa de la sal volátil y su introducción en una versión beta del espectrómetro de masas SQ Detector II (Waters Micromass).

La FIG. 1 es una gráfica de señal normalizada en m/z = 195 frente a la concentración de acetato de amonio (♦) o cloruro de sodio (■) (mM). Como puede verse, la concentración de cafeína detectada disminuye rápidamente incluso a concentraciones bajas de cloruro de sodio, un fenómeno que no se observa con el acetato de amonio. Este resultado indica que la sal tampón más volátil permite la detección de analitos, incluso a concentraciones de sal tampón más altas, mientras que la sal tampón menos volátil no lo permite.

Parte experimental para los Ejemplos 2 y 3:

Todas las muestras se analizaron en un espectrómetro de masas Waters SQ Detector 2 equipado con una fuente de electronebulización estándar con una temperatura de bloque de fuente de 80 °C, una temperatura de desolvatación de 250 °C y un caudal de gas de 400 litros/h. El voltaje de la sonda de electronebulización se estableció en 3500 V y el cono de muestra en 25 V. Todas las muestras se introdujeron usando una bomba de jeringa Harvard 22 equipada con una jeringa Hamilton de 250 pl que funcionaba a 6 pl/min. Todos los reactivos se adquirieron en Sigma Aldrich como polvos secos excepto HEPES (ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinetanosulfónico, un tampón bipolar), que se suministró como una solución 1M. Se prepararon soluciones madre 1M para cada una de las sales usando agua de calidad HPLC y una solución madre de cafeína de 2 mg/ml, de nuevo en agua de calidad HPLC. Se realizaron diluciones en serie en cada una de las soluciones madre de sal para generar soluciones de trabajo 1 mM, 5 mM, 25 mM y 50 mM. A 1 ml de cada una de estas soluciones de trabajo se añadieron 50 pl de la solución madre de cafeína para producir una solución de cafeína de 10 |jg/ml para el análisis. Para cada muestra se realizó una infusión con jeringa y se sumaron y representaron las alturas absolutas de la señal de iones para los picos de cafeína M+H y M+Na (a 195 Da y 217 Da). Entre cada muestra, la jeringa y la sonda se enjuagaron con agua para eliminar los residuos de sal.

EJEMPLO 2

Este ejemplo describe una evaluación adicional del impacto de la volatilidad del tampón en la determinación espectrométrica de masas de cafeína, con acetato de magnesio utilizado como sal tampón volátil y cloruro de magnesio como sal tampón no volátil. La intensidad de la señal de la cafeína y su aducto de sodio se evaluó en cuatro concentraciones de seis sistemas de sal. Los datos, representados en la FIG. 2, muestran que la sensibilidad del sistema ESI estándar se ve fuertemente afectada por las sales no volátiles y menos afectada por una sal volátil, a concentraciones similares. Es decir, los puntos de datos superiores del gráfico corresponden a la señal obtenida con muestras de líquido que contienen cafeína y acetato de amonio como sal tampón. El experimento puede repetirse para realizar determinaciones espectrométricas de masas de otros analitos sustancialmente con los mismos resultados.

EJEMPLO 3

En este ejemplo, se realizó un ensayo de quinasa en el que la enzima utilizada requiere magnesio, y el ensayo mide el aumento en la concentración de un sustrato de péptido fosforilado con el tiempo. Un conjunto de muestras se formuló con cloruro de magnesio, un compuesto relativamente no volátil, y un segundo conjunto de muestras se formuló con acetato de magnesio, un compuesto más volátil. Los resultados del ensayo utilizando cada tipo de sal de magnesio se ilustran en la FIG. 3, donde el tiempo, en minutos, se representa en el eje X y la luminiscencia en el eje Y. El gráfico que compara los resultados obtenidos para el ensayo que emplea cloruro de magnesio (♦ ) con los obtenidos para el ensayo que emplea acetato de magnesio (■) muestra que el ensayo no se vio obstaculizado ni sesgado por la fuente de iones de magnesio.

En muchos sistemas de ensayo, se utilizan ciertos componentes tampón no volátiles y/o altamente electronegativos; sin embargo, estos componentes no son los únicos que crean el resultado biológico o químico del ensayo deseado. El intercambio no muestra ningún cambio significativo en los resultados para el intervalo de hasta 60, ya que está dentro del ruido de la medición. A partir de los ejemplos anteriores para la medición del analito con la ausencia del analito no volátil, este sistema de ensayo proporcionaría resultados mejorados con la extracción en fase gaseosa antes de la carga en la MS debido a la reducción de la supresión de iones en el analito.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para determinar la concentración de un analito en una muestra de fluido que además comprende una sal tampón para mantener el pH o la fuerza iónica, comprendiendo el método volatilizar e ionizar la muestra de fluido e introducir la muestra ionizada y volatilizada en un dispositivo de detección de analito iónico que proporciona una señal proporcional en intensidad a la cantidad de analito ionizado detectado,

en donde el método comprende: emplear un sal tampón que:

(a)

(i) es más volátil que el analito, o

(ii) tras volatilizar la muestra de fluido, sufre una reacción para producir al menos un producto de reacción que es más volátil que el analito; y

(b) da como resultado un aumento en la intensidad de la señal y/o una relación señal/ruido mayor que la intensidad de la señal o la relación señal/ruido obtenida en presencia de un sal tampón menos volátil,

en donde el método comprende además generar gotitas del tamaño de nanolitros de muestra de fluido antes de la volatilización e ionización, de modo que la muestra de fluido se introduce en el dispositivo de detección de analito iónico en forma de gotitas del tamaño de nanolitros que tienen un área superficial eficaz para facilitar la extracción en fase gaseosa de la sal tampón de las gotitas tras la volatilización de las gotitas.

2. El método de la reivindicación 1, en donde las gotitas de muestra de fluido del tamaño de nanolitros tienen un tamaño medio de gotita de menos de aproximadamente 5 nl; preferentemente en donde las gotitas de muestra de fluido del tamaño de nanolitros tienen un tamaño medio de gotita de menos de aproximadamente 50 pl; y además preferentemente en donde las gotitas de muestra de fluido del tamaño de nanolitros tienen un tamaño medio de gotita de menos de aproximadamente 1 pl.

3. El método de la reivindicación 1, en donde el método incluye además el uso de la eyección acústica para generar las gotitas del tamaño de nanolitros de la muestra de fluido.

4. El método de la reivindicación 3, en donde la eyección acústica se lleva a cabo usando un eyector acústico que dirige energía acústica enfocada a un depósito que contiene la muestra de fluido de una manera que da como resultado la eyección rápida de gotitas de fluido de tamaño uniforme desde la superficie de la muestra de fluido.

5. El método de cualquier reivindicación anterior, en donde el dispositivo de detección de analito iónico comprende un espectrómetro de masas.

6. El método de la reivindicación 5, en donde la ionización comprende un método seleccionado de ionización química, ionización por desorción de campo, ionización por electronebulización, ionización química a presión atmosférica, ionización por desorción láser asistida por matriz e ionización por plasma acoplado inductivamente.

7. El método de cualquier reivindicación anterior, en donde el analito se selecciona de fármacos, metabolitos, inhibidores, ligandos, receptores, catalizadores, polímeros sintéticos y efectores alostéricos.

8. El método de cualquier reivindicación anterior, en donde la sal tampón es más volátil que el analito.

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde la sal tampón se selecciona de modo que al volatilizar la muestra de fluido, la sal tampón sufre una reacción para producir al menos un producto de reacción que es más volátil que el analito.

10. El método de la reivindicación 9, en donde la reacción es una reacción de descomposición.

11. El método de la reivindicación 9, en donde la reacción se produce durante la volatilización para proporcionar la extracción en fase gaseosa de al menos un componente no analito en la muestra de fluido.

12. El método de la reivindicación 9, en donde la sal tampón comprende un compuesto bipolar; o en donde el compuesto bipolar comprende un compuesto prearomático parcialmente insaturado.

13. El método de la reivindicación 9, donde la reacción implica la escisión química de un enlace en el componente sustituto.

14. El método de la reivindicación 13, en donde un reactivo eficaz para escindir químicamente el enlace se añade a la muestra de fluido antes de la volatilización.

15. El método de la reivindicación 9, en donde la reacción implica la escisión fotolítica de un enlace en el componente sustituto y, preferentemente, en donde la muestra de fluido se irradia durante la volatilización.

16. El método de la reivindicación 14, en donde la reacción implica la escisión térmica de un enlace termolábil en el componente sustituto.

17. El método de la reivindicación 9, en donde la sal tampón comprende un compuesto bipolar que sufre una reacción durante la volatilización de la muestra de fluido para producir un producto de reacción que funciona como el componente original en la muestra de fluido, es más volátil que el componente original, el analito, o ambos, y el analito, y da como resultado un aumento en la intensidad de la señal del analito y/o un aumento en la relación señal-ruido respecto a la intensidad de la señal del analito y la relación señal-ruido obtenida utilizando el componente original.

18. El método de la reivindicación 9, en donde la sal tampón comprende un compuesto bipolar prearomático parcialmente insaturado que sufre una reacción de descomposición durante la volatilización de la muestra de fluido para producir un compuesto aromático volátil, genera dióxido de carbono y libera un grupo nitrogenado seleccionado de amoníaco, una amina primaria, una amina secundaria, una amina terciaria o gas nitrógeno y un compuesto aromático volátil.

19. El método de cualquier reivindicación anterior, en donde el aumento en la intensidad de la señal del analito y/o la relación señal-ruido es al menos del 10 %, preferentemente en donde el aumento en la intensidad de la señal del analito y/o la relación señal-ruido es al menos del 25 %.