ES2873600T3 - Nanopartículas biodegradables y clínicamente compatibles como vehículos de suministro de fármacos. - Google Patents

Abstract

Una nanopartícula para suministrar un agente útil desde el punto de vista médico que comprende: un núcleo biodegradable y clínicamente compatible que comprende fosfato de magnesio; y un agente útil desde el punto de vista médico, donde el agente útil es un ARNai, un ARNip o una mezcla de estos; y una cubierta alrededor del núcleo, donde la cubierta comprende una proteína o un péptido.

Description

DESCRIPCIÓN

Nanopartículas biodegradables y clínicamente compatibles como vehículos de suministro de fármacos

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica la prioridad y el beneficio de la solicitud de patente provisional de EE. UU. n. ° 61/761,012, pendiente de manera conjunta, presentada el 5 de febrero de 2013.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a nuevas composiciones de nanopartículas, método de elaboración y uso de estas como vehículos de suministro de fármacos.

Antecedentes de la invención

Con el arsenal cada vez mayor de agentes terapéuticos, incluyendo tanto macromoléculas como moléculas pequeñas, las industrias biomédica y farmacéutica han caído cada vez más en la cuenta de la importancia de un vehículo de suministro seguro, práctico y eficaz de estos agentes terapéuticos para los mamíferos, de manera especial, la población humana. Existen muchas características convenientes para que un vehículo de suministro sea satisfactorio: debe ser no tóxico, por lo tanto, biocompatible, preferiblemente, biodegradable o absorbible en un período de tiempo razonable. Para administración sistémica, necesita ser lo suficientemente estable para circular al sitio diana mientras protege los agentes terapéuticos contra la degradación o la posibilidad de ser digeridos en el cuerpo y evitar respuestas inmunes significativas a menos que el suministro se encuentre diseñado para desencadenar tales respuestas. Necesita poder penetrar barreras fisiológicas con el fin de acceder a tejidos, células, compartimentos celulares u orgánulos diana. Además, necesita ser lo suficientemente soluble en las condiciones fisiológicas de un sitio diana o durante un período de tiempo diana para liberar los agentes que transporta. Además, una liberación controlada de los agentes terapéuticos a lo largo del tiempo resulta altamente conveniente.

Entre los nuevos tipos de agentes terapéuticos que se han desarrollado en las últimas décadas se encuentran los que se basan en el proceso natural de interferencia por ARN (iARN) después de su descubrimiento en 1998 realizado por Fire y Mello en C. elegans. Dos tipos de moléculas de ácido ribonucleico (ARN) son centrales con respecto al proceso de iARN: microARN (miARN) y ARN interferente pequeño o corto (ARNip). Los investigadores han estado desarrollando aplicaciones terapéuticas prometedoras sobre la base de ambos tipos de moléculas y sus roles tanto en plantas como en animales, en particular, silenciamiento génico transcripcional y postranscripcional. Por ejemplo, se han diseñado ARNip exógenos o sus vectores de expresión para que se introduzcan de manera directa en un huésped o se expresen en células huésped para regular la expresión génica que se encuentra involucrada en el desarrollo, la respuesta inmune y las enfermedades.

Se ha concebido, además, de manera racional, un nuevo tipo de moléculas de ARN sobre la base de la forma de ARNip de origen natural (bicatenario y de 21 pares de bases de longitud con 2 nucleótidos 3' sobresaliendo en ambas cadenas). Se denomina ARN interferente asimétrico (ARNai). Véase la publicación de patente PCT WO 2009/029688. Las ventajas del ARNai con respecto al ARNip incluyen mejor eficacia y potencia, comienzo rápido de acción, mayor durabilidad, una menor duración de dúplex de ARN para evitar un interferón no específico como respuesta, reducción de efectos no diana y reducción del coste de síntesis.

A pesar de la explosión de inmenso interés en el ARNi, y siendo que muchos lo denominan el avance farmacológico más importante de los últimos tiempos, los investigadores han caído en la cuenta de que el éxito de la terapia sobre la base de ARNi en mamíferos depende, en gran medida, del suministro intracelular de ARNip a tejidos y órganos específicos donde se expresa el gen de interés. Véase Vaishnaw, A. et al., "A status report on RNAi therapeutics," Silence (2010) 1:14. De hecho, la falta de un sistema de suministro satisfactorio se ha convertido cada vez más en el cuello de botella para aprovechar el poder de la terapéutica con ARNi, ya que muchos otros aspectos relacionados con obstáculos técnicos se están resolviendo. Véase Davidson, B. et al., "Current prospects for RNA interferencebased therapies," Nature Reviews (mayo de 2011) 12:329-340. Por ejemplo, un desafío al momento de concebir un sistema de suministro fiable de ARNip consiste en aumentar la vida media de circulación del ARNip en sangre y evitar la excreción renal prematura. Con ese fin, los investigadores han modificado los ARNip mediante el uso de un enfoque sobre la base de conjugación para lograr cierto éxito. Por ejemplo, en un sistema de ratón, se ha demostrado que los ARNip conjugados con colesterol que se administran de manera intravenosa aumentan de manera significativa la vida media de circulación y desactivación del ARNm diana en el hígado. Véase Soutschek J., et al. Nature (2004) 432: 173­ 178. Sin embargo, el mayor desafío sigue siendo diseñar un sistema de suministro que pueda ser clínicamente compatible y que pueda ofrecer, a su vez, suficiente ARN de silenciamiento a tejidos y células para alcanzar un silenciamiento génico significativo.

La búsqueda de un sistema óptimo de suministro de fármacos ha conducido a los investigadores a tecnologías de nanopartículas, que han demostrado un gran potencial con respecto a los controles tanto espaciales como temporales del suministro de fármacos. Se han propuesto muchas nanopartículas para su uso como vehículos de macromoléculas biológicas, tales como proteínas y ácidos nucleicos, véanse, p. ej., las patentes de EE. UU. n. ° 5,219,577 y 7,651,694. En 2010, surgieron informes referidos a la administración sistémica eficaz de ARNip a pacientes a través de un sistema de suministro dirigido en el que se utilizan nanopartículas elaboradas de un polímero sobre la base de ciclodextrina, véase, Davis, M. et al. Nature (2010) 464, 1067-1070. Sin embargo, el enfoque de nanopartículas sobre la base de ciclodextrina, aunque era prometedor, solo demostró eficacia marginal de silenciamiento génico después de la administración sistémica. Todavía se necesita, de manera urgente, una nueva tecnología de nanopartículas, con el fin de alcanzar la eficacia de suministro necesaria para la eficacia de fármacos.

El documento US 2012/201872 describe nanopartículas de liposomas/fosfato de calcio (LCP) que comprenden un liposoma que encapsula un compuesto bioactivo tal como ARN interferente. El documento WO 2009/029688 describe composiciones que comprenden moléculas de ARN dúplex asimétrico y nanopartículas.

La mayor parte de la exploración actual de vehículos de suministro a escala nanométrica para agentes terapéuticos sobre la base de ARNi se ha enfocado en vehículos sobre la base de liposomas o vehículos sobre la base de polímeros. Las nanopartículas sobre la base de otras constituciones tales como metales (p. ej., oro) y fosfato de calcio (véase Li, J. et al J Control Release. (2010) 142 (3): 416-421) se han estudiado también, pero en mucha menor medida. Sin embargo, de manera constante aparecen inquietudes y desilusiones ante la falta de biodegradabilidad con determinados metales y su consiguiente citotoxicidad y en cuanto a la seguridad y la eficacia del suministro de partículas de fosfato de calcio. Como resultado, a pesar de sus ventajas potenciales con respecto a los vectores virales, la capacidad de aplicación de nanopartículas elaboradas de estos materiales sigue siendo limitada como herramientas viables de suministro de moléculas biológicamente activas. De acuerdo con esto, todavía existe una gran necesidad en lo que se refiere a composiciones innovadoras de nanopartículas no virales como vehículos de suministro de fármacos.

Sumario

La presente invención proporciona nuevos materiales y composiciones de nanopartículas que se pueden utilizar para suministrar agentes terapéuticos, incluidos los basados en tecnologías de ARNi.

En un aspecto, la presente invención proporciona una nanopartícula para suministrar un agente útil desde el punto de vista médico o un agente terapéutico, donde la nanopartícula incluye un núcleo biodegradable y clínicamente compatible que incluye una sal de magnesio y un agente útil desde el punto de vista médico.

En particular, la presente invención proporciona una nanopartícula para suministrar un agente útil desde el punto de vista médico que comprende:

un núcleo biodegradable y clínicamente compatible que comprende fosfato de magnesio; y

un agente útil desde el punto de vista médico, donde el agente útil desde el punto de vista médico es un ARNai, un ARNip o una mezcla de estos;

y

una cubierta alrededor del núcleo, donde la cubierta comprende una proteína o un péptido.

En algunas realizaciones, dicho agente útil desde el punto de vista médico comprende un ARNai.

En algunas realizaciones, dicha cubierta comprende además un ingrediente que se selecciona a partir del grupo que consiste en una proteína o un péptido, un tensioactivo, un lípido, un ligando, un aminoácido, un carbohidrato, un ácido nucleico y un polímero biocompatible; preferiblemente, donde dicho ingrediente se selecciona a partir del grupo que consiste en un ligando de direccionamiento, un péptido de penetración celular, una ciclodextrina, un tripéptido RGD, un colesterol y un fosfolípido.

En algunas realizaciones, dicha nanopartícula es más soluble en una solución con un valor de pH entre 6,0 y 7,0 en comparación con una con un pH de 7,0 o más; preferiblemente, incluso más soluble en una solución con un pH ácido igual a o menor que 6,0 en comparación con una con un pH de 7,0 o más.

En algunas realizaciones, dicha nanopartícula está caracterizada por una carga superficial de entre -30 mV y 50 mV; preferiblemente, entre -10 mV y 20 mV.

La invención proporciona, además, una composición farmacéutica que comprende una pluralidad de nanopartículas, cada una siendo una nanopartícula de la invención.

La invención proporciona, además, una nanopartícula o una composición farmacéutica de la invención para su uso en el tratamiento de una enfermedad en un sujeto mamífero.

La presente invención se define por las reivindicaciones adjuntas.

En algunas realizaciones, el núcleo consiste en un vehículo o un ingrediente inactivo que consiste en, de manera sustancial, solo la sal de magnesio, en otras palabras, en esas realizaciones, no hay, de manera sustancial, otro ingrediente inactivo que se utiliza para constituir el núcleo. La sal de magnesio es inorgánica, a saber, fosfato de magnesio. En la invención, el núcleo comprende fosfato de magnesio. El agente útil desde el punto de vista médico, o el ingrediente terapéutico activo, por ejemplo, puede ser un ácido nucleico, una proteína o un péptido o una molécula pequeña. El ácido nucleico se puede seleccionar a partir del grupo que consiste en un ADN antisentido, un ARN, un híbrido de ADN-ARN, un PNA y un aptámero. En la invención las nanopartículas comprenden un agente útil desde el punto de vista médico, a saber, ARNai, ARNip o una mezcla de estos. En una realización, el ARN incluye ARNai. En otra realización, el ARN incluye ARNip o una mezcla de ARNip y ARNai. En una característica, los ARNai o ARNip se dirigen a, al menos, un ARN mensajero (ARNm) que codifica una proteína o regula una parte de una vía biológica que se encuentra involucrada en una enfermedad de mamíferos. En un ejemplo alternativo, la proteína o el péptido es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo.

En una característica, el agente útil desde el punto de vista médico se elimina dentro del núcleo de la nanopartícula.

De manera opcional, en una característica, el núcleo de la nanopartícula de la invención puede incluir, además, fosfato de calcio. Además, el núcleo puede incluir también un aditivo tal como un ácido nucleico, una proteína o un péptido pequeño, un lípido, un tensioactivo, un aminoácido, un carbohidrato, una molécula pequeña y/o un polímero biocompatible.

En una característica, la nanopartícula de la invención incluye, además, una cubierta o recubrimiento alrededor del núcleo; la cubierta puede comprender un tensioactivo (p. ej., Cremophor EL, Tween-20, Tween-80, Solutol y/o Triton), una proteína o un péptido pequeño (p. ej., histona y/o protamina), un lípido, un ligando, un aminoácido, un carbohidrato, un ácido nucleico, una molécula pequeña y/o un polímero biocompatible. En algunas realizaciones, el núcleo o la cubierta pueden contener un ligando de direccionamiento, incluyendo ligando de direccionamiento específico de tipo celular, específico de tejido y ligando dirigido, un péptido de penetración celular (p. ej., poliarginina y polilisina), una albúmina, un derivado de la albúmina, una histona, una protamina, un Cremophor EL, un Solutol, un Tween, un Triton, una ciclodextrina, un tripéptido RGD, un colesterol, un fosfolípido, un polietilenglicol (PEG), o una combinación de estos.

En algunas realizaciones, el diámetro promedio de la nanopartícula de la invención (incluida cualquier cubierta) es de aproximadamente 200 nanómetros o menos, o, preferiblemente, entre aproximadamente 5 nanómetros y aproximadamente 100 nanómetros, más preferiblemente, entre aproximadamente 5,5 nanómetros y aproximadamente 80 nanómetros e incluso más preferiblemente, entre aproximadamente 5,5 nanómetros y aproximadamente 30 nanómetros.

En una característica, la nanopartícula de la invención es más soluble en una solución con un valor de pH entre 6,0 y 7,0 en comparación con una con un pH de aproximadamente 7,0 o más. En una realización, la nanopartícula es incluso más soluble en una solución con un pH ácido igual a o menor que aproximadamente 6,0 en comparación con una con un pH de aproximadamente 7,0.

En otra característica, la nanopartícula de la invención está caracterizada por una carga superficial (en un recubrimiento o una cubierta, si corresponde) entre aproximadamente -30 mV y aproximadamente 50 mV, o preferiblemente, entre aproximadamente -10 mV y aproximadamente 20 mV, o incluso más preferiblemente, entre aproximadamente -5 mV y aproximadamente 10 mV.

Estas y otras características de la invención se aplican a todas las realizaciones que se describen en el presente documento a menos que no se reivindique de manera explícita.

En una primera realización, la presente invención proporciona una nanopartícula que incluye un núcleo que consiste en, de manera sustancial, una sal de magnesio y un agente útil desde el punto de vista médico recubierto de una superficie del núcleo. La sal de magnesio es fosfato de magnesio. La nanopartícula incluye una cubierta alrededor del núcleo. Y el agente útil desde el punto de vista médico es ARNai, ARNip o una mezcla de estos.

En una segunda realización, la presente invención proporciona una nanopartícula que incluye un núcleo que incluye, a su vez, solo un fosfato de magnesio y uno o más agentes útiles desde el punto de vista médico que se disponen dentro de dicho núcleo. La nanopartícula incluye una cubierta alrededor del núcleo. Y el agente útil desde el punto de vista médico es ARNai, ARNip o una mezcla de estos.

En una tercera realización, la presente invención proporciona una nanopartícula que incluye un núcleo que incluye, a su vez, solo fosfato de magnesio y uno o más agentes útiles desde el punto de vista médico. La nanopartícula incluye una cubierta alrededor del núcleo. Y el agente útil desde el punto de vista médico es ARNai, ARNip o una mezcla de estos.

En una cuarta realización, la presente invención proporciona una nanopartícula que incluye un núcleo que incluye, a su vez, fosfato de magnesio, un aditivo biocompatible y un agente útil desde el punto de vista médico. El aditivo puede ser un lípido, un tensioactivo, una proteína o un péptido, una albúmina o derivados de albúmina, un ácido nucleico, un carbohidrato, un aminoácido, un polímero biocompatible, una poliarginina, una polilisina, o un polialquilenglicol (p. ej., PEG). El lípido puede ser colesterol o un fosfolípido. Y el agente útil desde el punto de vista médico es ARNai, ARNip o una mezcla de estos. Existe una cubierta que rodea el núcleo. La cubierta puede incluir diversos ingredientes como se describe anteriormente en el sumario y a continuación en detalle. En la invención, la cubierta comprende una proteína o un péptido.

En una realización preferida, la presente invención proporciona una nanopartícula que incluye un núcleo que incluye, a su vez, fosfato de magnesio con ARNai que se elimina dentro de dicho núcleo, una cubierta alrededor del núcleo y que incluye una proteína o un péptido (p. ej., histona y/o protamina) y, de manera opcional, un tensioactivo (p. ej., Cremophor EP, Solutol, Tween o Triton), un lípido, un ligando, un aminoácido, un carbohidrato, una molécula pequeña, un ácido nucleico y/o un polímero biocompatible. Y el diámetro promedio de la nanopartícula se encuentra entre aproximadamente 2 nanómetros y aproximadamente 200 nanómetros, más preferiblemente, entre aproximadamente 5 nm y aproximadamente 100 nm, 80 nm o 50 nm. La proteína o el péptido puede ser una albúmina o un derivado de albúmina y el lípido puede ser colesterol o un fosfolípido. En una realización particularmente preferida, una nanopartícula de la invención incluye un núcleo de fosfato de magnesio mezclado o cargado con un agente activo; el núcleo se encuentra rodeado, además, por una cubierta que incluye uno o más tensioactivos. En un método que se describe en el presente documento, se fabrica una nanopartícula mediante el recubrimiento de su núcleo con un tensioactivo para alcanzar un tamaño de entre aproximadamente 5 nm y aproximadamente 50 nm.

En otro aspecto de la invención, se proporciona una composición farmacéutica que incluye las nanopartículas de la invención. En una realización, la composición incluye, además, un excipiente, un vehículo o un diluyente farmacéuticamente aceptable. En una realización preferida, la composición farmacéutica de la presente invención se formula para administración oral.

La invención proporciona, además, una nanopartícula o composición farmacéutica de la invención para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad o afección en un sujeto mamífero. El método incluye la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica de la invención al sujeto mamífero. En una realización preferida, la composición se administra al sujeto de manera oral.

Se proporciona en el presente documento, además, un método de suministro de un agente activo a un sujeto mamífero. El método incluye la administración de una pluralidad de nanopartículas, cada una siendo una nanopartícula de la invención, al sujeto mamífero. En un ejemplo preferido, las nanopartículas se administran al sujeto de manera oral.

Se proporciona en el presente documento, además, un método de suministro de un agente activo a un sujeto mamífero. El método incluye la administración de manera oral de, al menos, una nanopartícula cargada con un agente activo, y preferiblemente, una pluralidad de nanopartículas, cada una cargada con dicho agente, al sujeto. El agente activo puede ser un ingrediente farmacéutico activo. En un ejemplo particular, la nanopartícula comprende un núcleo que incluye una sal de magnesio y el agente activo es un ARNai o un ARNip. En un ejemplo, se proporciona un método de tratamiento de una enfermedad en un sujeto mamífero, comprendiendo dicho método la administración de manera oral a dicho sujeto mamífero de una cantidad terapéuticamente eficaz de un ingrediente farmacéutico activo transportada por una pluralidad de nanopartículas, preferiblemente, con núcleos que comprenden una sal de magnesio.

Con respecto a estos aspectos, la presente invención proporciona nanopartículas y composiciones farmacéuticas que son eficaces para el suministro de manera oral de un agente activo, p. ej., un ingrediente farmacéutico o un agente útil desde el punto de vista médico a un sujeto mamífero. En una realización preferida, se proporciona una composición farmacéutica con una nanopartícula y un ingrediente farmacéutico activo, donde la composición puede provocar, después de ser administrada de manera oral, efectos medicinales o terapéuticos, tratar, al menos, una enfermedad o afección, de manera tal que la composición calificaría como un candidato farmacéutico que cumple con los requisitos normales para aplicaciones clínicas, sola o en combinación con otros productos farmacéuticos.

Un aspecto adicional de la divulgación proporciona una nanopartícula que incluye un núcleo sobre la base de albúmina y un agente útil desde el punto de vista médico. El núcleo puede incluir un péptido que es una albúmina modificada, un fragmento de albúmina o un derivado de albúmina. La nanopartícula puede incluir, además, una tablilla de magnesio, tal como fosfato de magnesio. Como en otros ejemplos que se describen en el presente documento, el agente útil desde el punto de vista médico puede ser un ARNai, un ARNip o una mezcla de estos.

De acuerdo con incluso otro aspecto de la divulgación, el cual no forma parte de la invención, se proporciona una nanopartícula con un núcleo que incluye oro y un ARNai. En un ejemplo, el ARNai se recubre por la superficie de un núcleo sustancialmente de oro. El núcleo puede incluir, además, fosfato de magnesio, que se recubre, preferiblemente, por la misma capa del núcleo con el ARNai como una mezcla o por una capa separada. La nanopartícula puede incluir, además, una cubierta opcional alrededor del núcleo. La cubierta puede incluir una proteína o un péptido, un lípido, un tensioactivo, un ligando, un aminoácido, un carbohidrato, una molécula pequeña, un ácido nucleico o un polímero biocompatible. El ARNai, en una característica, se dirige a, al menos, un ARN que codifica una proteína o regula una parte de una vía biológica que se encuentra involucrada en una enfermedad autoinmune o una enfermedad inflamatoria. En una realización, el ARNai se dirige a la función del TNF-a humano (factor de necrosis tumoral alfa). En otra realización, el ARNai se dirige a la función de la IL-6 humana (interleucina 6).

Otros aspectos y realizaciones de la presente invención se exponen o serán evidentes de manera sencilla a partir de la siguiente descripción detallada de la invención.

Breve descripción de las figuras

Las Figuras 1 a 4 ilustran diversas realizaciones de la nanopartícula de la invención y ejemplos de la divulgación en vistas en sección transversal.

La Figura 5 ilustra, de manera esquemática, métodos de ejemplo para elaborar las nanopartículas de la presente invención y divulga cuando sus núcleos sobre la base de magnesio, cargados con ARNai, se recubren de manera adicional con una cubierta que puede contener lípidos, polímeros, proteínas y/o tensioactivos.

La Figura 6 presenta, a través de gráficos, datos físicos en una realización de nanopartículas con un núcleo de magnesio. En el gráfico superior izquierdo, se muestra la distribución del tamaño de partículas de seis diferentes lotes y, en el gráfico inferior izquierdo, se muestra la distribución del potencial zeta de esos lotes. La tabla de la derecha muestra el tamaño promedio y el potencial zeta de esos seis lotes.

La Figura 7 consiste en imágenes fotográficas de fluorescencia como resultado de la transfección de plásmido GFP en células de una línea celular SW480 mediante el uso de calcio (divulgación) o núcleos de fosfato de magnesio de la invención con un recubrimiento de histona. Las imágenes muestran un período de transfección de 24 h y 48 h.

La Figura 8 ilustra, de manera esquemática, un método de ejemplo para elaborar una nanopartícula de oro y cargarla con ARNai.

La Figura 9 presenta, a través de gráficos, datos físicos en una nanopartícula de oro, que se muestra, de manera esquemática, a la derecha, antes de que tenga lugar la conjugación con ARNai como se indica en la Fig. 8. En el gráfico superior izquierdo se muestra la distribución del tamaño de la partícula y, en el gráfico inferior izquierdo, se muestra el potencial zeta.

La Figura 10 ilustra, de manera esquemática, cómo la nanopartícula de oro que se muestra en la Fig. 9 se puede conjugar con una molécula de ARNai.

La Figura 11, ilustra de manera esquemática, cómo la molécula de ARNai se puede liberar de la nanopartícula de oro que se muestra en la Fig. 10.

La Figura 12 es una imagen de una electroforesis en gel con inmunotransferencia con la que se compara la eficacia del silenciamiento génico entre nanopartículas de oro PEGiladas no cargadas y las cargadas con ARNai La concentración de nanopartículas de oro no cargadas fue de 3,17 x 10-10 M.

La Figura 13 ilustra el efecto de silenciamiento génico in vitro que se alcanza a través del suministro de ARNai mediante el uso de una nanopartícula sobre la base de fosfato de magnesio con una cubierta sobre la base de polímero. El lateral izquierdo es una imagen de una electroforesis en gel con inmunotransferencia donde los carriles primero y cuarto, contando desde la izquierda, son controles negativos (nanopartículas no cargadas) y el resto de los carriles son nanopartículas cargadas con ARNai de diversas concentraciones. El lateral superior derecho ilustra, de manera esquemática, la composición de la nanopartícula cargada. El lateral Inferior derecho es un gráfico que muestra datos analíticos de las nanopartículas.

La Figura 14 ilustra el efecto de silenciamiento génico in vitro que se alcanza a través del suministro de ARNai mediante el uso de una nanopartícula sobre la base de fosfato de magnesio con una cubierta sobre la base de proteína/péptido. La proteína era albúmina. La hilera superior consiste en imágenes de dos electroforesis en gel con inmunotransferencia (la izquierda detecta p-catenina y la derecha detecta PLK1). El lateral inferior derecho es un gráfico que muestra datos analíticos de las nanopartículas.

La Figura 15 ilustra los efectos de silenciamiento génico in vitro e in vivo que se alcanzan a través del suministro de ARNai modificado (2'-O-Me-ARNai) mediante el uso de una nanopartícula sobre la base de fosfato de magnesio con una cubierta sobre la base de proteína/péptido. La proteína era albúmina. La hilera superior consiste en imágenes de dos electroforesis en gel con inmunotransferencia que muestran una supresión eficaz de p-catenina a través del suministro de 2'-O-Me-ARNai. La fila inferior ilustra de manera gráfica la eficacia in vivo que se observa en el xenoinjerto SW480.

La Figura 16 ilustra el efecto de silenciamiento génico in vitro que se alcanza a través del suministro de ARNai mediante el uso de una nanopartícula sobre la base de fosfato de magnesio con una cubierta sobre la base de histona. El lateral izquierdo es una imagen de una electroforesis en gel con inmunotransferencia que muestra supresión de expresión de p-catenina mediante el uso de nanopartículas cargadas con el ARNai de diversas concentraciones. En el lateral derecho se encuentra un gráfico que muestra datos analíticos de las nanopartículas.

La Figura 17 ilustra el efecto de silenciamiento génico in vitro que se alcanza a través del suministro de ARNai mediante el uso de una nanopartícula sobre la base de fosfato de magnesio con una cubierta que incluye tanto una histona como un péptido pequeño (tripéptido RGD). Se incluyen aquí imágenes de tres inmunotransferencias que muestran supresión de p-catenina mediante el uso de nanopartículas cargadas con ARNai de diversas concentraciones (“V7” se recubrió con RGD cíclico y “V8”, con RGD lineal). En el lateral derecho se encuentra un gráfico que muestra datos analíticos de las nanopartículas.

La Figura 18 ilustra el efecto de silenciamiento génico in vivo que se alcanza a través del suministro de ARNai mediante el uso de una nanopartícula sobre la base de fosfato de magnesio con una cubierta que incluye tanto una histona como un péptido pequeño (tripéptido RGD).

La Figura 19 ilustra diversos grados del efecto de silenciamiento génico in vitro que se alcanza a través del suministro de ARNai mediante el uso de una nanopartícula sobre la base de fosfato de magnesio con una cubierta que incluye tanto una histona como un tensioactivo o un tripéptido RGD.

La Figura 20 ilustra el efecto de silenciamiento génico in vitro que se alcanza a través del suministro de ARNai mediante el uso de una nanopartícula sobre la base de fosfato de magnesio con una cubierta que incluye tanto histona como Cremophor EL. Se incluyen aquí imágenes de tres inmunotransferencias (izquierda) que muestran supresión de pcatenina, PLK1 y survivina mediante el uso de nanopartículas cargadas con ARNai de diversas concentraciones. En el lateral derecho se encuentra un gráfico que muestra datos analíticos de las nanopartículas.

La Figura 21 ilustra el efecto de silenciamiento génico in vivo que se alcanza a través del suministro de ARNai mediante el uso de una nanopartícula sobre la base de fosfato de magnesio con una cubierta que incluye tanto histona como Cremophor EL.

La Figura 22 incluye cuatro imágenes de inmunotransferencia que muestran el efecto de silenciamiento génico in vitro que se alcanza a través del suministro de ARNai mediante el uso de una nanopartícula sobre la base de fosfato de magnesio con una cubierta que incluye tanto histona como Cremophor EL en diversos puntos temporales durante el almacenamiento. Además, se incluye un gráfico que resume los tamaños de partículas y las cargas de las nanopartículas durante el almacenamiento.

La Figura 23 incluye una imagen de transferencia Northern (izquierda) que muestra resistencia a la digestión por nucleasas de ARNai cargado en una nanopartícula sobre la base de fosfato de magnesio con una cubierta que incluye tanto protamina como Cremophor EL. Se incluye, además, un gráfico que muestra datos analíticos de las nanopartículas a la derecha.

La Figura 24 ilustra el efecto de silenciamiento génico in vitro que se alcanza a través del suministro de ARNai mediante el uso de una nanopartícula sobre la base de fosfato de magnesio con una cubierta que incluye tanto protamina como Cremophor EL. Se incluyen aquí imágenes de tres inmunotransferencias que muestran supresión de p-catenina mediante el uso de nanopartículas cargadas con el ARNai donde las etapas específicas para recubrimiento de las nanopartículas, así como las concentraciones de nanopartículas, se variaron.

La Figura 25 muestra datos que caracterizan a una nanopartícula sobre la base de fosfato de magnesio con una cubierta que incluye tanto protamina como Cremophor EL en comparación con la misma nanopartícula, a excepción de que se agrega ciclodextrina en la cubierta. En el gráfico inferior, se presenta también la distribución del tamaño de nanopartículas de la composición “K7” (MgP con protamina 5x y Cremophor EL al 5 %).

La Figura 26 compara los efectos in vivo en tumores xenoinjertados (SW480) entre una formulación intravenosa (i. v.) y una oral (p. o.) con respecto a ARNai (dirigido a p-catenina) que se transporta por nanopartículas sobre la base de fosfato de magnesio con una cubierta que incluye tanto protamina como Cremophor EL (nanopartículas “K7”).

La Figura 27 ilustra los efectos in vivo en el tumor por formulaciones intravenosas (i. v.) con respecto al ARNai (dirigido a p-catenina) que se transporta por nanopartículas sobre la base de fosfato de magnesio con una cubierta que incluye (1) tanto histona como Cremophor EL (nanopartículas “V13”); o (2) protamina y Cremophor EL (nanopartículas “K7”).

La Figura 28 ilustra datos de estudios in vivo adicionales para un régimen antitumoral eficaz con formulaciones intravenosas (i. v.) con respecto a ARNai (dirigido a p-catenina, survivina y PLK1) que se transporta por nanopartículas “K7” en células sW480.

La Figura 29 ilustra datos de estudios in vivo adicionales para un régimen antitumoral eficaz con formulaciones intravenosas (i. v.) con respecto a ARNai (dirigido a p-catenina, survivina y PLK1) que se transporta por nanopartículas “K7” en ratones transfectados con xenoinjerto de tumor de cáncer de páncreas humano.

La Figura 30 ilustra datos de estudios in vivo para la concentración de protamina más eficaz en la formulación K7.

La Figura 31 ilustra datos de estudios in vivo para cualquier efecto terapéutico que surge a partir de la adición de ciclodextrano en la formulación K7.

La Figura 32 ilustra datos de estudios in vivo para cualquier efecto terapéutico que surge a partir de la adición de ciclodextrano y Labrafil en la formulación K7. Se utilizó 2'-O-MeiARNai aquí.

Descripción detallada

A menos que se defina lo contrario, todos los términos y expresiones técnicas y científicas que se utilizan en el presente documento presentan el mismo significado que una persona de conocimiento ordinario en la técnica a la que pertenece la invención entiende comúnmente.

Como se usa en el presente documento, la forma singular “un”, “una” y “el” incluye referencias en plural, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, la expresión “una célula” incluye una pluralidad de células que incluyen mezclas de estas.

Como se usa en el presente documento, “aproximadamente” se refiere a un valor numérico, incluyendo, por ejemplo, números enteros, fracciones y porcentajes, ya sea que se indiquen de manera explícita o no. El término “aproximadamente” se refiere, de manera general, a un rango de valores numéricos (p. ej., /- 5 % al 10 % del valor recitado) que una persona de conocimiento ordinario en la técnica consideraría equivalente al valor listado (p, ej., que presenta la misma función o resultado). En algunos casos, el término “aproximadamente” puede incluir valores numéricos que redondean la cifra significativa más cercana.

Como se usa en el presente documento, la expresión “clínicamente compatible” se refiere a la característica de una composición o fórmula que se puede preparar y administrar de manera sencilla a los pacientes con la seguridad suficiente que resulta superior a los requisitos reglamentarios en vigencia.

Como se usa en el presente documento, “encapsulado”, “incrustado”, “atrapado” o “incorporado” y sus términos derivados se refieren a encontrarse en un complejo, en una cápsula, unido con, recubierto con, en capas o encerrado por una sustancia. De este modo, una sustancia o agente encapsulado en una partícula se refiere a que la sustancia o el agente se incorpora a la estructura de la partícula o se encuentra recubierto/unido a la superficie de la partícula o ambos.

Los términos “aislado” o “purificado” como se utilizan en el presente documento se refieren a un material que se encuentra de manera sustancial o esencial exento de componentes que lo acompañan normalmente en su estado nativo. La pureza y la homogeneidad se determinan comúnmente mediante el uso de técnicas de química analítica, tales como electroforesis en gel de poliacrilamida o cromatografía líquida de alto rendimiento.

Como se utiliza en el presente documento, el término “sujeto” se refiere a cualquier animal (p. ej., un mamífero), incluidos, pero sin limitación, humanos, primates no humanos, roedores y similares, que será el destinatario de un tratamiento particular. Comúnmente, los términos “sujeto” y “paciente” se utilizan de manera indistinta en el presente documento con referencia a un sujeto humano.

Los términos y expresiones tales como “tratar” o “tratamiento” o “para tratar” o “aliviar” o “para aliviar” como se utilizan en el presente documento se refieren a ya sea (1) medidas terapéuticas que curan, ralentizan, reducen los síntomas y/o detienen la progresión de una afección o trastorno patológico diagnosticado y (2) medidas profilácticas o preventivas que impiden o ralentizan el desarrollo de una afección o trastorno patológico dirigido. De este modo, entre los que necesitan tratamiento se incluyen los que ya padecen el trastorno; los propensos a presentar el trastorno y aquellos en los que se debe prevenir el trastorno.

El magnesio juega un papel importante en muchas funciones celulares en mamíferos. Es el cuarto mineral más abundante en el cuerpo humano. Resulta necesario para más de 300 reacciones bioquímicas en el cuerpo y ayuda a mantener huesos fuertes, funciones musculares y nerviosas normales y un ritmo cardíaco regular. Participa, además, en el metabolismo de carbohidratos y la síntesis de proteínas. Y su deficiencia puede dar como resultado muchos síntomas y enfermedades, p. ej., hiperexcitabilidad, mareos, calambres musculares, debilidad muscular, fatiga y diabetes.

Normalmente, el cuerpo humano absorbe magnesio a través de la ingesta dietética y aproximadamente el 50 % del magnesio corporal total se utiliza para formar huesos. La gran mayoría de la otra mitad se encuentra en células de tejidos y órganos corporales que cuentan con aproximadamente el 1 % en sangre. De acuerdo con el Comité de Nutrición y Alimentos del Instituto de Medicina, que forma parte de las Academias Nacionales, las ingestas dietéticas recomendadas (RDA) para un hombre adulto son iguales o mayores que 400 mg/día, y para una mujer adulta no embarazada son iguales o mayores que 310 mg/día. Cerca del 60 % de la población de EE. UU. no cumple con los requisitos de las RDA en EE. Uu . para la ingesta dietética de magnesio, de acuerdo con un estudio realizado por el Community Nutrition Mapping Project en 2009. Por lo tanto, el magnesio y muchos iones de magnesio no solo resultan seguros, biocompatibles y con capacidad de ser absorbidos por el ser humano, sino que proporcionan además una nutrición muy necesaria.

Las sales de magnesio producen cationes divalentes Mg2+, y como partículas inorgánicas, no sufren ataques microbianos y presentan una buena estabilidad de almacenamiento. Pueden formar complejos con macromoléculas, así como con moléculas pequeñas y transportarse a través de la membrana celular por endocitosis mediada por canales iónicos.

A. Nanopartículas sobre la base de sal de magnesio y encapsuladas con agente útil desde el punto de vista médico De manera básica, la invención puede estar caracterizada porque proporciona una nanopartícula que incluye un núcleo biodegradable y clínicamente compatible que comprende una sal de magnesio, donde la nanopartícula encapsula un agente útil desde el punto de vista médico.

El núcleo es, de manera general y sustancial, de forma esférica, lo que significa que es sustancialmente redondo u ovalado en secciones transversales e incluye partículas que no presentan facetas y que son sustancialmente lisas o que presentan facetas. El núcleo puede ser facetado o angular y se encuentra todavía dentro de lo que contempla la presente invención.

La sal de magnesio útil en la presente invención es fosfato de magnesio. Fosfato de magnesio (que se abrevia a veces como “MgP” en el presente documento) se puede referir a fosfato de magnesio tribásico (Mg3(PO4)2), fosfato de magnesio dibásico o fosfato de dimagnesio (MgHPO4) o fosfato de monomagnesio (Mg(H2PO4)2), o una combinación de cualquiera de los anteriores. El fosfato de magnesio se disuelve mejor en condiciones ácidas. En comparación con un ambiente acuoso, donde el pH es aproximadamente 7,0, la solubilidad del fosfato de magnesio aumenta en una solución donde el valor de pH se encuentra entre 6,0 y 7,0, incluso más cuando el pH se encuentra por debajo de 6,0, e incluso más todavía cuando el pH se encuentra por debajo de 5,0. Y algún otro caso o más sales de magnesio que exhiben aumentos de solubilidad similares en una condición ácida se pueden utilizar también, ya sea en lugar de (divulgación) o además de (invención) el fosfato de magnesio.

El agente útil desde el punto de vista médico encapsulado en la nanopartícula de la invención, para suministrar a un sitio diana, puede ser una macromolécula biológicamente activa o una molécula pequeña. Puede ser un agente terapéutico, un fármaco o un agente de diagnóstico. Los ejemplos de agentes de diagnóstico incluyen agentes de imágenes de contraste que permiten la visualización del sitio de suministro de fármacos.

En términos generales, el agente útil desde el punto de vista médico puede ser un ácido nucleico. El ácido nucleico puede ser un ARN. En una realización, el ARN incluye ARNai. En otra realización, el ARN incluye ARNip. En una realización, la nanopartícula de la invención encapsula una mezcla de ARNai y ARNip. En una característica, el ARNai y/o el ARNip se dirigen, al menos, a un ARN que codifica una proteína o regula una parte de una vía biológica que se encuentra involucrada en una enfermedad de mamíferos. En un ejemplo alternativo, la proteína o el péptido es un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo

Muchos fármacos se pueden incorporar de manera sencilla en las nanopartículas de la invención. Ejemplos de estos incluyen, pero sin limitación, una insulina, una hormona del crecimiento, un esteroide, un interferón, un fármaco contra el cáncer, un antibiótico, un fármaco antivírico, un anticuerpo terapéutico, un agente anticoagulante, tal como heparina, etc. Como se utiliza en el presente documento, los términos “cáncer” y “canceroso” se refieren o describen la afección fisiológica en mamíferos en la que una población de células está caracterizada por un crecimiento celular no regulado.

En un ejemplo, el agente útil desde el punto de vista médico es un conductor de energía adecuado para terapias de hipertermia o hipotermia que incluyen ablación con láser o similares.

El agente útil desde el punto de vista médico se puede encontrar dentro del núcleo. El núcleo puede ser sólido con una superficie sustancialmente lisa, o poroso con una superficie que presenta aberturas. El núcleo se puede recubrir. Cuando la superficie del núcleo se recubre con un material, ese material forma un recubrimiento que se denomina una “cubierta” en la presente memoria. La cubierta puede ser porosa y no debe rodear o encerrar la superficie entera del núcleo, aunque lo hace ciertamente en algunas realizaciones. Pueden existir múltiples capas de cubiertas alrededor de un núcleo.

De manera adicional a la sal de magnesio, el núcleo puede incluir, además, fosfato de calcio, otro material bioabsorbible que se ha utilizado como el material de núcleo para nanoestructuras. Véase Khosravi-Darani, K. et al. Acta Medica Iranica (2010) 48 (3): 133-141.

Cuando los aditivos se recubren o adsorben en la superficie del núcleo, se forma una cubierta alrededor del núcleo. Además de ayudar a reducir o mantener el tamaño de las nanopartículas, conservando o modulando la carga de la nanopartícula como se describe anteriormente, los componentes de la cubierta opcional pueden servir, además, para otros propósitos importantes. De manera general, la cubierta protege el núcleo y su carga útil contra la degradación lisosomal, enzimática, así como por DNasa o RNasa, prolonga su circulación en la sangre y ayuda a alcanzar una liberación de tiempo controlado de la carga útil. Véase, p. ej., Li, J. et al. J Control Release (2010) 142 (3): 416-421. La adición de algunos polímeros, preferiblemente biodegradables, p. ej., PEG o un ácido nucleico, ayuda a mantener el tamaño de partícula pequeño y obtiene una buena estabilidad coloidal mediante su efecto estérico. El PEG puede presentar un peso molecular de aproximadamente 500 daltons a aproximadamente 20.000 daltons, p. ej., aproximadamente 500, 1000, 5000, 10.000, 15.000 y 20.000 daltons.

En una característica de la presente invención, uno o más tensioactivos recubren o se adsorben en la superficie del núcleo de nanopartículas. De manera sorprendente, los tensioactivos contribuyeron en gran medida a alcanzar el objetivo de reducir y mantener el tamaño de las nanopartículas. Para el suministro de un agente útil desde el punto de vista médico en un entorno biofísico, el tamaño promedio de las nanopartículas se encuentra preferiblemente entre aproximadamente 5 nm y aproximadamente 200 nm, y más preferiblemente, entre aproximadamente 5 nm y aproximadamente 100, 80 o incluso 60 nm, con el fin de poder atravesar determinadas barreras biológicas, incluso sin ser filtrado de manera inmediata del torrente sanguíneo. En algunas realizaciones de la presente invención, los aditivos de tensioactivos presentan partículas de tamaño reducido no solo de conformidad con los rangos listados anteriormente, sino que se reducen, además, de manera adicional al rango de entre aproximadamente 5 nm y aproximadamente 50 nm, o incluso menor que aproximadamente 20 nm o 15 nm, un gran desafío técnico para todos los fabricantes de nanopartículas. En diversas realizaciones de la presente invención, el aditivo de tensioactivo es no iónico, por ejemplo, un alcohol tal como un alcohol graso, alcohol estearílico, alcohol cetílico, alcohol cetoestearílico y alcohol oleílico. En una realización preferida, el tensioactivo es Cremophor EL® (que se denomina de manera general en el presente documento como “Cremophor”), Tween®-20 o -80 (que se conoce además como polisorbato-20 o -80, y se denomina de manera general en el presente documento como “Tween”, a veces), Solutol® HS 15 y/o Triton.

Otros posibles aditivos que pueden formar parte de la cubierta de la nanopartícula de la presente invención incluyen: ARNai y/o ARNip, proteína o péptido (p. ej., albúmina o su derivado, y preferiblemente, protamina y/o histona), lípido (p. ej., colesterol o fosfolípidos), carbohidrato, excipiente, y un ligando de direccionamiento tal como uno específico de tipo celular, ligando de direccionamiento específico de tejido o ligando dirigido (p. ej., un ligando para un marcador de superficie celular, un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo, nanocuerpo). Tal ligando ayuda a dirigir la nanopartícula a una célula o tejido diana específico (p. ej., células cancerosas). En una realización, el ligando de direccionamiento es anisamida, un ligando del receptor sigma-1, que se puede combinar con un PEG, y se enlaza a la nanopartícula de la invención para dirigirse a células tumorales. Véase Guo J. et al. Biomateriales (2012) 33 (31): 7775-7784.

Otro aditivo opcional con respecto a una nanopartícula de la presente invención es un péptido de penetración celular que ayuda a facilitar la ingesta celular de la nanopartícula. Un péptido de penetración celular común contiene una secuencia de aminoácidos que contiene abundancia relativa de aminoácidos de carga positiva (policatónicos), p. ej., poliarginina y polilisina, o un patrón alterno de aminoácidos polares/cargados y aminoácidos no polares, hidrófobos (anfifáticos), o un derivado o mimético de un péptido de penetración celular de origen natural, tal como HIV Tat.

De acuerdo con esto, con referencia a la Fig. 1, en un ejemplo ilustrativo, una nanopartícula 10 incluye un núcleo 20 sustancialmente esférico. El núcleo 20 consiste sustancialmente en solo una sal de magnesio, p. ej., fosfato de magnesio. En un ejemplo, consiste en solo fosfato de magnesio sustancialmente puro. La superficie del núcleo 20 se recubre con una capa 30 del agente 15 útil desde el punto de vista médico (p. ej., ARNai y/o ARNip), formando una primera cubierta alrededor del núcleo 20. La adsorción del agente 15 útil desde el punto de vista médico puede ayudar a detener el crecimiento o la agrupación de nanopartículas, manteniendo así su tamaño pequeño.

De manera opcional una segunda capa 40 de uno o más aditivos forma una cubierta exterior que rodea la primera cubierta 30. El aditivo de ejemplo que se ilustra aquí es un lípido 45, pero puede ser cualquiera de los aditivos que se describen en la presente memoria, p. ej., un tensioactivo.

Con referencia a la Fig. 2, en otro ejemplo ilustrativo, una nanopartícula 10 incluye un núcleo 20 donde el agente 15 útil desde el punto de vista médico (p. ej., ARNai y/o ARNip) se encuentra encapsulado dentro de una sal de magnesio (p. ej., fosfato de magnesio). Una cubierta 30 opcional alrededor del núcleo 20 incluye uno o más aditivos. Los aditivos de ejemplo que se ilustran en la figura aquí incluyen albúmina 43, PEG 47 y PEG con un ligando 49 de direccionamiento, pero pueden ser cualquiera de los aditivos que se describen en la presente memoria, p. ej., uno o más lípidos, polímeros biodegradables, tensioactivos, proteínas y excipientes.

Con referencia ahora a la Fig. 3, en otro ejemplo ilustrativo, no de acuerdo con la invención, una nanopartícula 10 incluye un núcleo 20 donde el agente 15 útil desde el punto de vista médico (p. ej., ARNai y/o ARNip) se encuentra encapsulado dentro de una mezcla de una sal de magnesio (p. ej., fosfato de magnesio) y fosfato 22 de calcio. En la versión ilustrada, el núcleo 20 se encuentra desnudo, pero puede presentar una o más cubiertas opcionales a su alrededor. El fosfato de calcio (que se abrevia a veces como “CaP” en el presente documento) se puede referir a Caa(PO4)2, CaHPO4 o Ca(H2PO4)2, o una combinación de cualquiera de los anteriores.

Con referencia ahora a la Fig. 4, en otro ejemplo ilustrativo, una nanopartícula 10 incluye un núcleo 20 donde el agente 15 útil desde el punto de vista médico (p. ej., ARNai y/o ARNip) se encuentra encapsulado dentro de una mezcla de una sal de magnesio (p. ej., fosfato de magnesio) y un polímero 24 biocompatible. En la versión ilustrada, el núcleo 20 se encuentra rodeado por una cubierta 30 opcional formada por un ligando 49 de direccionamiento de ejemplo. La cubierta 30, en esta versión de ejemplo, es bastante porosa; como tal resulta ser el caso del núcleo 20.

La invención proporciona, además, una composición farmacéutica que comprende las nanopartículas de la invención y un excipiente, vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Los vehículos adecuados y sus formulaciones se conocen en la técnica y se describen en Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 20a ed. Mack Publishing (2000). La composición farmacéutica se puede formular en forma de líquido, cápsula, comprimido, polvo y aerosol; y se puede formular en la forma adecuada para suministro intravenoso, intramuscular, intradérmico, oral, suministro a través de la mucosa, tópico o suministro a una superficie ocular, etc. La composición puede incluir otros componentes, tales como reguladores, conservantes, tensioactivos no iónicos, agentes solubilizadores, agentes estabilizantes, emolientes, lubricantes y agentes de tonicidad. La composición se puede formular para alcanzar una liberación controlada de las macromoléculas.

Cada vehículo debe ser “aceptable” en el sentido que es compatible con los demás ingredientes de la formulación y no perjudicial para el paciente. Algunos ejemplos de materiales que pueden servir como vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen: azúcares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; almidones, tales como almidón de maíz y almidón de papa; celulosa y sus derivados, tales como carboximetilcelulosa de sodio, etilcelulosa y acetato de celulosa; tragacanto en polvo; malta; gelatina; talco; excipientes, tales como manteca de cacao y ceras para supositorios; aceites, tales como aceite de maní, aceite de semilla de algodón, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja; glicoles, tales como propilenglicol; polioles, tales como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; ésteres, tales como oleato de etilo y laurato de etilo; agar; agentes reguladores, tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; ácido algínico; agua exenta de pirógenos; solución salina isotónica; solución de Ringer; alcohol etílico; soluciones reguladoras de fosfato; y otras sustancias compatibles no tóxicas que se emplean en formulaciones farmacéuticas. Agentes humectantes, emulsionantes y lubricantes, tales como lauril sulfato de sodio, estearato de magnesio y copolímero de óxido de polietileno-óxido de polipropileno, así como agentes colorantes, agentes de liberación, agentes de recubrimiento, agentes edulcorantes, aromatizantes y perfumantes, conservantes y antioxidantes se pueden presentar, además, en las composiciones de la presente invención.

B. Métodos de fabricación de las nanopartículas de la invención.

Las nanopartículas sobre la base de sales de magnesio se pueden preparar a través de un proceso de doble emulsión o proceso de nanoprecipitación, o adaptar a partir de otros procesos que se conocen para la fabricación de nanopartículas.

Método de ejemplo I:

Con referencia a la Fig. 5, en la etapa 1, se prepara una primera emulsión mediante la mezcla, en primer lugar, de la cantidad conveniente de un agente útil desde el punto de vista médico, p. ej., una solución de ARNai y una solución acuosa de sal de magnesio (p. ej., MgCh o nitrato de magnesio), y el agregado luego de la solución acuosa a una solución orgánica con un tensioactivo o sin este (p. ej., ciclohexano/Igepal CO-520 (71/29, v/v) con agitación vigorosa para formar una micro o nanoemulsión bien dispersa. Para elaborar un núcleo sobre la base de calcio o para agregar calcio al núcleo, se puede reemplazar MgCh con CaCh o agregar simplemente CaCh. La mezcla se incuba, además, a temperatura ambiente. La mezcla de solución orgánica se puede preparar mediante la mezcla de ciclohexano/solución Igepal CO-520 (71/29 v/v) con giro continuo en un agitador magnético para asegurar la mezcla.

Se prepara una segunda emulsión mediante el agregado de una solución acuosa de sal de fosfato (p. ej., hidrogenofosfato disódico (Na2HPO4,) o fosfato de hidrógeno de diamonio) con agitación vigorosa a una solución orgánica con un tensioactivo o sin este (p. ej., ciclohexano/Igepal Co-520 (71/29, v/v) para formar una micro o nanoemulsión. La mezcla se incuba, además, a temperatura ambiente.

Luego, se agrega la segunda emulsión de manera muy lenta, p. ej., gota a gota, en la primera emulsión bajo agitación vigorosa, formando una mezcla combinada. La relación entre la primera emulsión y la segunda emulsión en la mezcla de combinación resulta fundamental para alcanzar el tamaño conveniente de las partículas, y en diversas realizaciones, es de aproximadamente 10 a 20 contra 1. La mezcla de combinación se incuba, además, a temperatura ambiente durante un tiempo determinado dependiendo de sus tamaños convenientes.

Luego, en la etapa 2, un disolvente (p. ej., etanol absoluto) se agrega para lavar las nanopartículas producidas de la etapa anterior. El sobrenadante se retira a través de un proceso de centrifugación. Las nanopartículas producidas, cada una con un núcleo que consiste en sustancialmente solo una sal de magnesio inorgánica sola (MgP), se secan en condiciones de baja presión o se secan simplemente al aire.

En la etapa de recubrimiento (etapa 3 como se ilustra), se forma una cubierta alrededor de las nanopartículas después de que se suspenden y combinan con ingredientes que se seleccionan para la cubierta tales como lípidos, polímeros biodegradables, proteínas y/o tensioactivos. Por ejemplo, para elaborar una cubierta sobre la base de proteína/tensioactivo alrededor de la nanopartícula de la invención, se prepara, en primer lugar, una solución de proteínas con tensioactivos o sin estos (p. ej., histona 10x (p/p con respecto a la carga) y tensioactivo al 1 % (v/v)) en agua exenta de nucleasas (o solución salina, solución de albúmina humana (p. ej., al 10 %)) y se incuba a temperatura ambiente. La solución se agrega a tubos secos de los núcleos de MgP cargados con ARNai, y se mezclan luego por completo. Luego, la mezcla se somete a sonicación, p. ej., mediante el uso de un sonicador de baño de agua, para alcanzar una nanosuspensión para impedir la agrupación. La suspensión se somete a, de manera opcional, ajuste de pH a 7,0, se incuba a temperatura ambiente y se centrifuga para recolección, análisis y uso para administración terapéutica de su sobrenadante. La preparación de nanopartícula se puede formular, además, como vía o propósito de administración, como se conoce bien en la técnica.

Las nanopartículas con cubiertas sobre la base de lípidos o sobre la base de polímeros se pueden preparar de manera similar. Por ejemplo, para elaborar una cubierta sobre la base de lípidos, el contenido de lípido conveniente se puede mezclar en relaciones adecuadas y convertirse en una película seca mediante el uso de un rotavapor durante 3 a 4 horas. Luego se agrega el volumen necesario de solución salina reguladora de fosfato para reconstituir la película seca. Una vez que el volumen conveniente de la solución se agrega a los tubos secos de los núcleos de MgP cargados con ARNai y se mezcla por completo, se continúa con la misma etapa de sonicación durante 5 minutos a temperatura ambiente y la etapa de centrifugación durante 30 segundos.

Método de ejemplo II:

De manera alternativa, el agente útil desde el punto de vista médico, p. ej., ARNai, se agrega a nanopartículas sobre la base de sal de magnesio una vez que las nanopartículas se forman en primer lugar como se describe anteriormente, a excepción de que el agente útil desde el punto de vista médico se encuentra ausente en la primera emulsión. Además, se agregan uno o más materiales seleccionados (p. ej., albúmina o sus derivados, tensioactivo, ciclodextrina o aminoácidos) para la cubierta, de manera similar a las formas que se describen anteriormente con respecto a las nanopartículas.

C. Métodos de uso de las nanopartículas de la invención

La invención proporciona, además, una nanopartícula de composición farmacéutica de la invención para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad en un sujeto mamífero. El método incluye la administración al sujeto mamífero de una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica de la invención.

Se proporciona, además, en el presente documento un método de suministro de un agente activo y útil desde el punto de vista médico o agente médico a un sujeto mamífero. El método incluye la administración de una pluralidad de nanopartículas, cada una siendo una nanopartícula de la invención, al sujeto mamífero. Además de agentes terapéuticos, el agente activo puede ser también un agente de formación de imágenes, tal como uno útil para la formación de imágenes radiofarmacéuticas.

La administración de la composición de la invención se puede realizar por cualquier medio que se conoce en la técnica, incluyendo, de manera oral, intravenosa, subcutánea, por inhalación, intraarterial, intramuscular, intracardíaca, intraventricular, parenteral, intratecal e intraperitoneal. La administración puede ser sistémica, p. ej., de manera intravenosa o localizada.

En algunas realizaciones, las nanopartículas de la composición farmacéutica incluyen un recubrimiento entérico. Las partículas con recubrimiento entérico se pueden administrar de manera adecuada por vía oral.

Las partículas de la invención se pueden utilizar para suministrar los agentes útiles desde el punto de vista médico a una superficie de la mucosa para protección inmunitaria a través de la mucosa, suministro de vacunas a través de la mucosa o suministro de fármacos a través de la mucosa. De manera específica, los agentes terapéuticos se pueden administrar a través de las nanopartículas de la invención a la superficie de la mucosa en las vías respiratorias para tratar una enfermedad respiratoria, la superficie ocular para tratar una enfermedad ocular, el tracto gastrointestinal para tratar una enfermedad gastrointestinal. En una realización, los agentes se suministran a través de las nanopartículas de la invención de manera tópica para tratar indicaciones dermatológicas. Los ejemplos no limitantes de agentes útiles desde el punto de vista médico incluyen uno o más de los siguientes: material antigénico, factores inmunopotenciadores naturales, material polinucleotídico que codifica polipéptidos inmunogénicos, fármacos terapéuticos, tales como insulina, fármacos anticancerosos o cualquier otra composición que puede presentar un efecto terapéutico cuando se administra a una superficie de la mucosa. Las partículas pueden formar complejos con cualquier excipiente fisiológico aceptable y administrarse a través de superficies de la mucosa, tal como de manera oral, intrapulmonar, nasal, rectal u ocular.

En una realización preferida, las nanopartículas de la presente invención se administran de manera oral a un sujeto mamífero para suministrar un agente activo y/o para tratar una afección o enfermedad. El suministro oral mediante el uso de nanopartículas enfrenta desafíos particulares ya que cualquier formulación de las partículas debe no solo proteger el agente activo de la fuerte digestión enzimática en el sistema digestivo, sino que además, debe asegurar que el agente sea absorbido en el sistema circulatorio. Diversas formulaciones de las nanopartículas de la presente invención han demostrado que presentan eficacia terapéutica, p. ej., efecto de silenciamiento génico sustancial, cuando se administran de manera oral a un sujeto mamífero.

En una realización, la composición farmacéutica de la invención está prevista para su uso en el tratamiento de indicaciones oncológicas, así como enfermedades relacionadas con la patología de hígado y hepatocitos. En otra realización, la composición farmacéutica de la invención está prevista para su uso en el tratamiento de enfermedades metabólicas, p. ej., las relacionadas con el hígado.

En otra realización, la composición farmacéutica de la invención está prevista para su uso en el tratamiento de cáncer de colon y otras indicaciones oncológicas.

D. Ejemplos

Ejemplo 1: transfección de GFP mediante el uso de nanopartículas con núcleos de fosfato de magnesio

Se prepararon nanopartículas mediante el uso del proceso de emulsión doble que se describe anteriormente. De manera específica, se mezclaron 100 |jl de MgCh 500 mM con ADN plasmídico que codificaba para la proteína de fluorescencia verde (GFP) antes de ser agregado a 5 ml de ciclohexano/lgepal CO-520 (71/29, v/v) con agitación vigorosa. La segunda emulsión se preparó a partir de 100 |jl de Na2HPO425 mM. Y una vez que los núcleos de MgP resultantes cargados con ADN se secaron, se les agregó una solución acuosa exenta de nucleasa con histona 10x (p/p con respecto al plásmido de ADN) y tensioactivo al 1 % (v/v). La mezcla resultante produjo nanopartículas con un núcleo clínicamente compatible que consiste en una sal de magnesio como vehículo para el agente, en este caso, ADN que codifica GFP, donde el núcleo se encuentra rodeado, además, por una cubierta o recubrimiento que presenta tanto un tensioactivo como un péptido pequeño (histona). El material del vehículo del núcleo consistía en solo una sal de magnesio sustancialmente pura y ningún otro material en este ejemplo particular.

La Fig. 6 muestra los datos analíticos que incluyen la distribución del tamaño y del potencial zeta de las nanopartículas cargadas con plásmido GFP. Para los seis registros que se muestran, el diámetro promedio, incluida la cubierta, varía de aproximadamente 10 nm a aproximadamente 25 nm, y los rangos de potencial zeta promedio, de aproximadamente -6,0 mV a aproximadamente -18,0 mV.

La Fig. 7 muestra los resultados de fluorescencia donde las fotos de la hilera inferior muestran manchas verdes de fluorescencia, lo que indica expresión exitosa de GFP 48 horas después de la transfección mediante el uso de la nanopartícula como un vehículo de suministro in vitro en una línea celular SW480.

Ejemplo 2 no de acuerdo con a la invención: el suministro de ARNai mediante el uso de nanopartículas de oro da como resultado el silenciamiento génico in vitro

Con referencia a la Fig. 8, que ilustra las etapas de conjugación de ARNai con una nanopartícula de oro. En primer lugar, las nanopartículas de oro disponibles comercialmente se pegilaron primero, es decir, se funcionalizaron con cadenas de PEG mediante modificación de la superficie. La Fig. 9 muestra la distribución del tamaño y la distribución del potencial zeta de las nanopartículas de oro modificadas, junto con un dibujo esquemático de la nanopartícula modificada. Las nanopartículas de oro PEGiladas presentaban aproximadamente 19 nm de diámetro en promedio. El potencial zeta promedio de nanopartículas de oro era de aproximadamente -8,53 mV antes de la modificación y de aproximadamente -7,29 mV, después.

Con referencia de nuevo a la Fig. 8, una vez que las nanopartículas de oro se habían pegilado, se modificaron de manera adicional con el fin de formar un enlace disulfuro con el agente útil desde el punto de vista médico, ARNai. En primer lugar, la nanopartícula de oro PEGilada se entrecruzó con moléculas de succinimidil 3-(2-piridilditio) propionato (SPDP), lo que le permitió formar un enlace disulfuro. A continuación, la nanopartícula se introdujo en un ARNai modificado donde se expuso su tiolato. Como resultado, el ARNai se cargó en la nanopartícula de oro con la formación de un nuevo enlace disulfuro entre los dos. La Fig. 10 ilustra, de manera adicional, detalles de esta etapa.

Con referencia ahora a la Fig. 11, para liberar el ARNai conjugado de la nanopartícula de oro, se redujo el enlace disulfuro mediante el uso de DTT. Se utilizó un ensayo de ribogreen para cuantificar la concentración de ARNai liberado continuando con la reducción del enlace disulfuro y C fue de aproximadamente 4,12 a 5,2 jg/m l de ARNai que se libera de la nanopartícula de oro.

La Figura 12 muestra la eficacia de suministro de la nanopartícula de oro que se preparó mediante el uso del método que se describe anteriormente en este ejemplo. Un ARNai de la siguiente secuencia y que se diseñó para silenciar la expresión de p-catenina se conjugó con nanopartículas de oro como se describe anteriormente:

5'-CACAAGAUGGAAUUU-3' (SEQ ID NO:1)

3'-AAUAAAUUCCAUCUUGUGAUC-5' (SEQ ID NO:2)

Se agregó una solución que contiene histona 10x (p/p con respecto al ARNai) y Tween-80 al 1 % (v/v) a las nanopartículas de oro para recubrirlas con una cubierta. Como se muestra en la figura, las nanopartículas cargadas mostraron de manera significativa un efecto mayor de silenciamiento génico in vitro contra la diana, p-catenina, en comparación con las nanopartículas descargadas.

Ejemplo 3 no de acuerdo con la invención: el suministro de ARNai mediante el uso de nanopartículas de fosfato de magnesio con cubierta sobre la base de polímero alcanza silenciamiento génico in vitro

Se prepararon núcleos de MgP cargados con ARNai mediante el uso de, en gran parte, el proceso de doble emulsión que se describe anteriormente. De manera específica:

En cada uno de los viales A y B, se preparó una solución de 5 ml de ciclohexano/Igepal CO-520 (71/29 v/v) de reactivos disponibles respectivamente de EMD y Sigma. Mientras tanto, el ARNai se dispersó en regulador 1x exento de ARNasa para elaborar la concentración conveniente (p. ej., aproximadamente 5 jg / jl) . Se mezcló un volumen de ARNai (p. ej., aproximadamente 50 jg ) con 100 j l de MgCb 500 mM. Luego, la solución de MgCb-ARNai se agregó gota a gota a la solución de aceite/tensioactivo en el vial A para formar una emulsión bien dispersa sin microemulsión inversa.

En el vial B, se agregaron 100 j l de Na2HPO425 mM (pH= 9) gota a gota a la solución de aceite/tensioactivo. Los contenidos de los viales A y B se mezclaron y agitaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, los contenidos se transfirieron a 10 tubos de centrífuga (1,5 ml) y se centrifugaron durante 30 minutos a 13.000 g. Se descartó el sobrenadante y el sedimento se lavó con etanol absoluto (1 ml) dos veces. Una vez que se retiró el alcohol, el sedimento resultante se secó al aire durante 3 a 4 horas.

Los núcleos de nanopartículas de MgP ya cargados con ARNai se recubrieron con una cubierta sobre la base de polímero. De manera específica, los núcleos se recubrieron con polímeros biodegradables, Peg(5k)-Poli-Lisina (10U), poli-L-arginina (50U), en una relación de los polímeros de 2,5:1 (PLL:PLR) y una relación del complejo de 2,5:1 (polímero:ARNai).

Con referencia a la Fig. 13, los datos físicos y farmacológicos de las nanopartículas resultantes se muestran en el lateral correcto. Por ejemplo, el tamaño promedio de las nanopartículas fue de aproximadamente 70 nm (y aproximadamente 80 nm en otros experimentos, pero ciertamente por debajo de 200 nm o 100 nm) y la carga superficial fue de aproximadamente 25 mV. Las nanopartículas exhibieron buena estabilidad plasmática, y se logró alcanzar tanto la captación celular como el escape endosomal (los datos no se muestran).

Debido a que la observación del efecto in vitro con vehículos de nanopartículas siempre ha resultado difícil, resultó particularmente alentador el poder observar un fuerte efecto de silenciamiento génico (80 % al 90 %) como se muestra en el lateral izquierdo de la Fig. 13. Las líneas celulares que se sometieron a prueba incluían células SW480 y DLD1 (líneas celulares de cánceres de colon y colorrectal humanos). La expresión de proteína dirigida por el ARNai era survivina, y el ARNai presenta la siguiente secuencia (como resulta cierto para otros ejemplos donde la survivina era la diana a menos que se hubiera indicado lo contrario):

5'- GAUCAACAUUUUCAA -3' (SEQ ID NO: 3)

3'- AAUUUGAAAAUGUUGAUCUCC - 5' (SEQ ID NO: 4)

Ejemplo 4: el suministro de ARNai mediante el uso de nanopartículas de fosfato de magnesio con cubierta sobre la base de albúmina alcanza el silenciamiento génico in vitro

Se prepararon núcleos de MgP cargados con ARNai mediante el uso del proceso de doble emulsión que se describe en el ejemplo anterior. Una cubierta sobre la base de proteína/péptido recubrió los núcleos de nanopartículas de MgP ya cargados con ARNai. De manera específica, se utilizó albúmina de suero humano (10 %) para recubrir los núcleos.

La Fig. 14 muestra los datos físicos y farmacológicos de las nanopartículas resultantes. Por ejemplo, el tamaño promedio de las nanopartículas fue de aproximadamente 25 nm a 35 nm y la carga superficial fue de aproximadamente -8 mV a -12 mV. Las nanopartículas exhibieron buena estabilidad plasmática, y se logró alcanzar tanto la captación celular como el escape endosomal (los datos no se muestran).

Se observó un efecto de silenciamiento génico (75 % al 85 %) como se resume en el lateral izquierdo de la Fig. 14. Las líneas celulares que se sometieron a prueba incluyeron SW480. La expresión de dos proteínas se dirigió aquí por el ARNai: p-catenina y PLK1 (quinasa tipo polo 1), respectivamente. PLK1 es un protooncogén que se encuentra involucrado en una variedad de cánceres, incluidos los cánceres de colon y de pulmón. Las secuencias de ARNai que se utilizaron para dirigir p-catenina fueron las mismas que se describieron anteriormente como SEQ ID NOS: 1 y 2. Y las secuencias de ARNai que se utilizaron para dirigir p LK1 son las siguientes (como resulta cierto para otros ejemplos donde se dirigió PLK1 a menos que se hubiera indicado lo contrario):

5'- GAUCACCCUCCUUAA -3' (SEQ ID NO: 5)

3'- AAUUUAAGGAGGGUGAUCUUC -5' (SEQ ID NO: 6)

Ejemplo 5: el suministro de 2'-O-Me-ARNai mediante el uso de nanopartículas de fosfato de magnesio con cubierta sobre la base de albúmina alcanza el silenciamiento génico in vitro

Los oligonucleótidos con un grupo metilo en el residuo 2'-OH de la molécula de ribosa pueden resultar ventajosos en diversas aplicaciones. Entre otras cosas, los 2'-O-Me-ARN muestran el mismo comportamiento que el a Dn , pero resultan más estables ya que se encuentran protegidos contra la degradación por nucleasas. Además, forman híbridos más estables con cadenas de ARN complementario en comparación con ADN o ARN.

Se utilizaron nanopartículas con un núcleo que utilizaba solo fosfato de magnesio y que se recubrieron de manera adicional con una cubierta sobre la base de albúmina para el suministro exitoso de 2'-O-Me-ARN para suprimir la expresión génica dirigida tanto in vitro como in vivo. Los datos se presentan en la Fig. 15. Las secuencias de ARNai que se utilizaron para dirigir p-catenina fueron las mismas que se describen anteriormente como SEQ ID NOS: 1 y 2, a excepción de que nucleótidos en determinadas posiciones que se seleccionaron en la secuencia se modificaron con un grupo metilo 2'-OH.

Ejemplo 6: el suministro de ARNai mediante el uso de nanopartículas de fosfato de magnesio con cubierta sobre la base de histona alcanza el silenciamiento génico in vitro

Se prepararon núcleos de MgP cargados con ARNai mediante el uso del proceso de doble emulsión que se describe en los ejemplos anteriores. Una cubierta sobre la base de proteína/péptido recubrió luego los núcleos de nanopartículas de MgP ya cargados con ARNai. De manera específica, se utilizó histona humana 7x que se mezcló con histona de ternero 5x (p/p, con respecto a la carga de ARNai) para recubrir los núcleos.

La Fig. 16 muestra los datos físicos y farmacológicos de las nanopartículas resultantes. Por ejemplo, el tamaño promedio de las nanopartículas fue de aproximadamente 15 nm a 25 nm y la carga superficial fue de aproximadamente 10 mV a 20 mV. Las nanopartículas exhibieron buena estabilidad plasmática, y se logró alcanzar tanto la captación celular como el escape endosomal (los datos no se muestran).

Se observó un efecto de silenciamiento génico (65 % al 75 %) como se resume en el lateral izquierdo de la Fig. 16. Las líneas celulares que se sometieron a prueba incluyeron SW480. La expresión de p-catenina se dirigió aquí por el ARNai.

Ejemplo 7: el suministro de ARNai mediante el uso de nanopartículas de fosfato de magnesio con cubierta sobre la base de histona y péptido pequeño alcanza el silenciamiento génico in vitro

Se prepararon núcleos de nanopartículas que consisten en MgP y se cargaron con ARNai mediante el uso del proceso de doble emulsión que se describe anteriormente.

Una cubierta sobre la base de proteína y péptido pequeño recubrió los núcleos de nanopartículas que fueron cargados con ARNai. De manera específica, se utilizó histona humana 5x que se mezcló con péptidos pequeños (RGD) 3x para recubrir los núcleos. El péptido arginina-glicina-ácido aspártico (RGD) es un tripéptido y se puede utilizar para el reconocimiento celular como un ligando de direccionamiento.

La Fig. 17 muestra los datos físicos y farmacológicos de las nanopartículas resultantes. Por ejemplo, el tamaño promedio de las nanopartículas fue de aproximadamente 15 nm a 25 nm y la carga superficial fue de aproximadamente 10 mV a 20 mV. Las nanopartículas exhibieron buena estabilidad plasmática, y se logró alcanzar tanto la captación celular como el escape endosomal (los datos no se muestran).

Se observó un efecto de silenciamiento génico (80% al 90 %) in vitro como se resume en el lateral izquierdo de la Fig. 17. Las líneas celulares que se sometieron a prueba incluyeron SW480. La expresión de p-catenina y PLK1 se dirigió aquí por ARNai correspondientes. Se sometieron a prueba tanto RGD cíclico (“V7”) como lineal (“V8”).

Se observó, además, un efecto de silenciamiento génico significativo in vivo como se resume en el lateral derecho de la Fig. 18 (aquí se muestran solamente los datos para nanopartículas recubiertas con RGD lineal). El xenoinjerto tumoral SW480 se sometió a prueba en ratones. La expresión de p-catenina y PLK1 se dirigió por ARNai correspondientes.

Ejemplo 8: el suministro de ARNai mediante el uso de nanopartículas de fosfato de magnesio con cubiertas que incluyen diferentes tensioactivos

Se prepararon núcleos de nanopartículas que consisten en MgP y cargados con ARNai mediante el uso del proceso de doble emulsión que se describe anteriormente. Como se muestra en la Fig. 19, para la cubierta/recubrimiento alrededor del núcleo, se utilizaron además de histona (5x), diversos tensioactivos tales como Cremophor EL, Tween-80, Tween-20 y Triton-XlOO (“V13-16”, respectivamente).

Los resultados del silenciamiento génico in vitro contra p-catenina se mostraron lateral a lateral con nanopartículas cargadas con RGD cíclico y lineal en la cubierta con histona. Mientras que los resultados no fueron uniformes, no se pudo observar variación del grado de silenciamiento génico.

Ejemplo 9: el suministro de ARNai mediante el uso de nanopartículas de fosfato de magnesio con cubierta sobre la base de histonas y Cremophor alcanza el silenciamiento génico in vitro e in vivo

Se prepararon núcleos de nanopartículas que consisten en MgP y se cargaron con ARNai mediante el uso del proceso de doble emulsión que se describe anteriormente. Una cubierta sobre la base de proteína y tensioactivo recubrió los núcleos de nanopartículas que fueron cargados con ARNai. De manera específica, se utilizó histona de ternero 5x que se mezcló con Cremophor EL al 5 % para recubrir los núcleos mediante el uso de métodos que se describen anteriormente.

La Fig. 20 muestra un gráfico con los datos físicos y farmacológicos de las nanopartículas resultantes (“V13”). Por ejemplo, el tamaño promedio de las nanopartículas fue muy pequeño, de aproximadamente 6 nm a 15 nm. La carga superficial fue de aproximadamente 5 mV a 12 mV. Las nanopartículas exhibieron buena estabilidad plasmática, y se logró alcanzar tanto la captación celular como el escape endosomal (los datos no se muestran).

El efecto de silenciamiento génico que se observó in vitro y se resumió en el lateral izquierdo de la Fig. 20 resultó excelente también, alcanzando un impresionante 85 % al 98 %. Las líneas celulares que se sometieron a prueba incluyeron SW480. La expresión de p-catenina, PLK1 y survivina se dirigió por ARNai correspondientes. En el lateral izquierdo, la Fig. 20 muestra imágenes de inmunotransferencia resultante para cada proteína dirigida. Las secuencias de ARNai que se utilizaron como control aleatorio son las siguientes (como resulta cierto para otros ejemplos a menos que se hubiera indicado lo contrario):

5'- GUAGUUAUAGUCGAU -3' (SEQ ID NO: 7)

3'- AACAUCGACUAUAACUACCUG -5' (SEQ ID NO: 8)

Se observó, además, un efecto de silenciamiento génico significativo in vivo como se ilustra en la Fig. 21. El xenoinjerto tumoral SW480 se sometió a prueba en ratones. La expresión de p-catenina se dirigió por ARNai que se suministró con las nanopartículas de fosfato de magnesio recubiertas con histona y Cremophor. Como se muestra en la Fig. 21, en el día 13 después de la dosificación mediante el uso de las nanopartículas de la invención, resultaba evidente todavía una inhibición significativa del crecimiento del tumor.

Esta nanopartícula mostró, además, una estabilidad duradera como se ilustra en la Fig. 22. Almacenadas a 4 °C, las nanopartículas “V13” mantuvieron en gran medida su tamaño de partícula y cargas originales durante las seis semanas de tiempo. La eficacia en la inducción de silenciamiento génico permaneció, además, intacta durante las seis semanas como se muestra en la imagen en gel tomada en diversos puntos temporales (Fig. 22). Las nanopartículas “V13” resultaron lo suficientemente estables, además, para resistir la degradación de nucleasa después de que permanecieron en 50 % de plasma de ratón durante dos horas (los datos no se muestran). Diversas pruebas han demostrado también que las nanopartículas “V13” se pueden liofilizar y reconstituir sin comprometer de manera significativa su capacidad de suministro o la eficacia de los agentes útiles desde el punto de vista médico que llevan.

Ejemplo 10: el suministro de ARNai mediante el uso de nanopartículas de fosfato de magnesio con cubierta sobre la base de protamina y Cremophor alcanza el silenciamiento génico in vitro

Se prepararon núcleos de MgP cargados con ARNai mediante el uso del proceso de doble emulsión que se describe en los ejemplos anteriores. Una cubierta sobre la base de proteína/tensioactivo recubrió los núcleos de nanopartículas de MgP ya cargados con ARNai. De manera específica, se utilizó protamina 7x (p/p con respecto a la carga de ARNai) que se mezcló con Cremophor al 5 % para recubrir los núcleos.

La Fig. 23 muestra los datos físicos y farmacológicos de las nanopartículas resultantes. Por ejemplo, el tamaño promedio de las nanopartículas fue de aproximadamente 9 nm a 20 nm y la carga superficial fue de aproximadamente 5 mV a 18 mV. Las nanopartículas exhibieron buena estabilidad plasmática, y se logró alcanzar tanto la captación celular como el escape endosomal (los datos no se muestran).

Como se indica en la foto en gel de la Fig. 23, las nanopartículas resultantes fueron lo suficientemente estables, además, para resistir la degradación de nucleasa después de que permanecieron en 50 % de plasma de ratón durante cuatro horas.

Se observó el efecto de silenciamiento génico (70 % al 80 % in vitro) como se resume en la parte superior de la Fig. 24. Las líneas celulares que se sometieron a prueba incluyeron SW480. La expresión de p-catenina se dirigió aquí por el ARNai. Las etapas de adsorción de la solución de recubrimiento en los núcleos de las nanopartículas se variaron para someter a prueba el efecto de eficacia de suministro.

Ejemplo 11: el suministro de ARNai mediante el uso de nanopartículas de fosfato de magnesio con cubierta sobre la base de protamina y Cremophor alcanza el silenciamiento génico in vitro

Se prepararon núcleos de nanopartículas de MgP cargados con ARNai mediante el uso del proceso de doble emulsión que se describe anteriormente. Una cubierta sobre la base de proteína y tensioactivo recubrió los núcleos de nanopartículas que se cargaron con ARNai. De manera específica, se agregó una solución de recubrimiento donde protamina de ternera 5x (p/p con respecto a la carga de ARNai) se mezcló previamente con Cremophor EL al 5 % a los núcleos mediante el uso de los métodos que se describen anteriormente. De manera opcional, la solución de recubrimiento se agregó con hidroxipropil-beta-ciclodextrina al 3,5 % p/v.

La Fig. 25 muestra un gráfico con los datos físicos y farmacológicos de las nanopartículas resultantes (“K7” apara formulación de cubierta con protamina y Cremophor, y “K7C” para la misma formulación con la adición de ciclodextrina). Para las nanopartículas K7, el tamaño de partícula promedio fue de aproximadamente 13 nm a 21 nm. La carga superficial de las nanopartículas K7 fue de aproximadamente 15 mV a 18 mV. Para las nanopartículas K7C, el tamaño de partícula promedio fue de aproximadamente 13 nm a 20 nm. La carga superficial de las nanopartículas K7 varió de aproximadamente 14 mV a 16 mV.

Las nanopartículas exhibieron, además, buena estabilidad plasmática, de manera específica, contra plasma humando o plasma de ratón (los datos no se muestran).

Se observó el efecto de silenciamiento génico in vitro mediante el uso de las nanopartículas en células SW480. El perfil del ciclo temporal mostró que el efecto de dosis única duró hasta 72 horas después de la administración de nanopartículas cargadas con ARNai dirigido p-catenina (los datos no se muestran).

Claims (6)

REIVINDICACIONES

1. Una nanopartícula para suministrar un agente útil desde el punto de vista médico que comprende:

un núcleo biodegradable y clínicamente compatible que comprende fosfato de magnesio; y

un agente útil desde el punto de vista médico, donde el agente útil es un ARNai, un ARNip o una mezcla de estos; y una cubierta alrededor del núcleo, donde la cubierta comprende una proteína o un péptido.

2. La nanopartícula de la reivindicación 1, donde dicho agente útil desde el punto de vista médico comprende un ARNai.

3. La nanopartícula de la reivindicación 1, donde dicha cubierta comprende, además, un ingrediente que se selecciona a partir del grupo que consiste en una proteína o un péptido, un tensioactivo, un lípido, un ligando, un aminoácido, un carbohidrato, un ácido nucleico y un polímero biocompatible; preferiblemente, donde dicho ingrediente se selecciona a partir del grupo que consiste en un ligando de direccionamiento, un péptido de penetración celular, una ciclodextrina, un tripéptido RGD, un colesterol y un fosfolípido.

4. La nanopartícula de la reivindicación 1, donde

(i) dicha nanopartícula es más soluble en una solución con un valor de pH entre 6,0 y 7,0 en comparación con una con un pH de 7,0 o más; preferiblemente, incluso más soluble en una solución con un pH ácido igual a o menor que 6,0 en comparación con una con un pH de 7,0 o más; o

(ii) dicha nanopartícula está caracterizada por una carga superficial de entre -30 mV y 50 mV; preferiblemente, entre -10 mV y 20 mV.

5. Una composición farmacéutica que comprende una pluralidad de nanopartículas, cada una siendo la nanopartícula de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. Una nanopartícula de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o la composición farmacéutica de la reivindicación 5 para su uso en el tratamiento de una enfermedad en un sujeto mamífero.