ES2873650T3 - Variantes de anticuerpos - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo IgG1 que comprende un dominio de unión a TNFα y un sitio de unión a FcRn, en el que la secuencia de aminoácidos del anticuerpo comprende, con referencia al sistema de numeración de la UE, (i) los aminoácidos 233P, 234V, 235A, y una deleción en la posición del aminoácido 236; (ii) el aminoácido 434A o los aminoácidos 252Y, 254T y 256E; y (iii) los aminoácidos 239D, 330L y 332E; en una región Fc de una IgG humana; y en el que el anticuerpo comprende (i) un dominio VL que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NÚM.:10, y (ii) un dominio VH que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NÚM.:9.

Description

DESCRIPCIÓN

Variantes de anticuerpos

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a anticuerpos modificados con resistencia mejorada contra la degradación proteolítica y funciones efectoras y/o propiedades farmacocinéticas alteradas. Los anticuerpos son útiles en el tratamiento terapéutico de diversos trastornos, en particular de afecciones inflamatorias.

ANTECEDENTES

Los anticuerpos monoclonales han adquirido una importancia creciente como reactivos terapéuticos en la medicina clínica durante los últimos 20 años. Durante muchos años, los esfuerzos para mejorar los anticuerpos se concentraron en reducir su inmunogenicidad potencial, lo que derivó en anticuerpos humanizados o incluso totalmente humanos. Otro enfoque apunta a optimizar los anticuerpos mejorando sus funciones efectoras. Mientras que los efectos directos están mediados por la región variable de unión del antígeno del anticuerpo, los efectos indirectos están mediados por la región Fc constante. Los esfuerzos para mejorar las funciones efectoras se concentran principalmente en la modulación de la región de Fc. Además, es deseable mejorar la semivida sérica de los anticuerpos terapéuticos, lo que puede reducir la cantidad de anticuerpos necesarios y puede aumentar su comodidad para los pacientes al prolongar los intervalos de tratamiento.

Para aplicaciones terapéuticas, la inmunoglobulina G (IgG) ha sido la clase preferente por varias razones; las IgG son fáciles de purificar, son relativamente estables en el almacenamiento, se pueden administrar por vía intravenosa, tienen semivida biológica in vivo extendida y son capaces de realizar una serie de funciones de efectos biológicos, tal como la activación de la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) y el reclutamiento de células efectoras a través de varias interacciones con los receptores Fc (citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos; ADCC). De las cinco clases de inmunoglobulina, IgG presenta la semivida biológica más larga debido a su interacción única con el receptor de reciclaje de IgG, el receptor Fc neonatal (FcRn). Una de las funciones conocidas del receptor es rescatar IgG de la degradación catalítica. Una estructura cocristalina de FcRn-Fc resuelta ha demostrado que la interacción con Fc se produce en la región IgG-C de bisagra-CH2-CH3. Esta interacción ocurre de manera estrictamente dependiente del pH a pH ácido de 6,0-6,5 en los endosomas. Las moléculas de IgG unidas se reciclan nuevamente a la superficie celular, en la que se liberan a un pH fisiológico de 7,4 en la circulación, mientras que las moléculas de IgG sin complejo están destinadas a la degradación lisosómica. Este reciclaje es el mecanismo para la semivida prolongada de IgG; por lo tanto, la modulación de la interacción FcRn-IgG permitirá un control específico de la semivida sérica de las inmunoglobulinas gamma y las proteínas de fusión Fc.

Dependiendo de la aplicación, puede ser conveniente aumentar o reducir el tiempo de residencia sérica de IgG. Para la aplicación terapéutica es deseable una vida media más larga, ya que se necesitarán dosis más pequeñas y menos inyecciones. Se han investigado diversos enfoques para aumentar la semivida, entre estos el uso de polietilenglicol (PEG), la generación de proteínas de fusión de albúmina o Fc y el fortalecimiento de la interacción entre FcRn e IgG. Los productos farmacéuticos pegilados han estado en la práctica clínica desde 1990 y la pegilación es una tecnología establecida para la extensión de la residencia de fármacos en la sangre. Dado que la albúmina sérica humana (HSA) también se recicla mediante FcRn mediante una interacción dependiente del pH, también se han producido diversas proteínas de fusión de albúmina para mejorar la estabilidad y la semivida. Además, los fragmentos de anticuerpos fusionados con albúmina o dominios de unión a albúmina han demostrado un tiempo prolongado de residencia sérica en estudios preclínicos. La generación de proteínas de fusión Fc es otra estrategia que dotará a proteínas o péptidos de propiedades similares a las de un anticuerpo intacto.

Las modificaciones de la región Fc que han sido investigadas se resumen en Saxena (2016) Frontiers in Immunology, Vol. 7, Article 580. Varias mutaciones de Fc se describen con más detalle en los documentos WO 1998/023289 a 1, WO 2000/042072 A2, WO 2010/106180 A2 y WO 2014/108198 A1.

El documento WO 2012/087746 A1yKinder et al (2013) The Journal Of Biological Chemistry Vol. 288, No. 43, pp.

30843-30854investigaron diversas mutaciones en la región Fc de un anticuerpo para mejorar la resistencia a la degradación proteolítica.

Biancheri et al (2015) Gastroenterology, 149, pp. 1564-1574se refieren a la degradación proteolítica de anticuerpos neutralizantes TNF por ciertas proteasas in vivo.

Rajpal et al (2014) "Therapeutic Fc-Fusion Proteins", Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim, Germany, pp.1-44 desvelan diversas mutaciones en la región Fc para aumentar la semivida de un anticuerpo.

Existe una necesidad constante de anticuerpos con funciones efectoras, farmacocinética y/o resistencia a la degradación proteolítica mejoradas.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Los inventores de esta solicitud han descubierto que una combinación de mutaciones específicas en la región Fc de un anticuerpo confiere propiedades favorables al anticuerpo, incluyendo una mejor resistencia a la degradación proteolítica y una mayor afinidad a FcRn a pH6. Los anticuerpos que tienen las mutaciones tienen propiedades farmacocinéticas mejoradas. Además, los anticuerpos presentan funciones efectoras superiores en comparación con los anticuerpos no modificados y/o los anticuerpos conocidos como infliximab (IFX).

Por lo tanto, la presente invención se refiere al tópico definido en los siguientes apartados [1] a [88]:

[1] Un anticuerpo IgG1 que comprende un dominio de unión TNFa y un sitio de unión FcRn, en el que la secuencia de aminoácidos del anticuerpo comprende

(i) los aminoácidos 233P, 234V, 235A, y una deleción en la posición del aminoácido 236;

(ii) el aminoácido 434A o los aminoácidos 252Y, 254T y 256E; y

(iii) los aminoácidos 239D, 330L y 332E

en una región Fc de una IgG humana; y en el que el anticuerpo comprende (i) un dominio VL que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NÚM.:10, y (ii) un dominio VH que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NÚM.:9.

[2] El anticuerpo del apartado [1], en el que el anticuerpo es un anticuerpo modificado que tiene las sustituciones E233P, L234V y L235A y una deleción de G236.

[3] El anticuerpo del apartado [2], en el que el anticuerpo tiene además la sustitución N434A.

[4] El anticuerpo del apartado [2], en el que el anticuerpo tiene además las sustituciones M252Y, S254T y T256E.

[5] El anticuerpo del apartado [1], en el que el anticuerpo es un anticuerpo modificado que tiene las sustituciones S239D, A330L e I332E.

[6] El anticuerpo del apartado [1], en el que la secuencia de aminoácidos del anticuerpo comprende los aminoácidos 233P, 234V, 235A, 239D, 330L, 332E y 434A, y una deleción en la posición del aminoácido 236.

[7] El anticuerpo del apartado [6], en el que el anticuerpo es un anticuerpo modificado que tiene las sustituciones E233P, L234V, L235A, S239D, A330L, 1332E y N434A, y una deleción de G236.

[8] El anticuerpo del apartado [6] o [7], que comprende la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NÚM.:29.

[9] El anticuerpo del apartado [1], en el que la secuencia de aminoácidos del anticuerpo comprende los aminoácidos 233P, 234V, 235A, 239D, 330L, 332E, 252Y, 254T y 256E, y una deleción en la posición del aminoácido 236.

[10] El anticuerpo del apartado [9], en el que el anticuerpo es un anticuerpo modificado que tiene las sustituciones E233P, L234V, L235A, S239D, A330L, I332E, M252Y, S254T y T256E, y una deleción de G236.

[11] El anticuerpo del apartado [9] o [10], que comprende la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NÚM.:28.

[12] El anticuerpo de uno cualquiera de los apartados anteriores, que tiene una afinidad con el FcRn humano a pH 6 mayor que el de infliximab.

[13] El anticuerpo de uno cualquiera de los apartados anteriores; con afinidad a FcRn humano a pH 6 que se caracteriza por una constante de disociación Kd inferior a 500 Nm.

[14] El anticuerpo de uno cualquiera de los apartados anteriores; con afinidad a FcRn humano a pH 6 que se caracteriza por una constante de disociación Kd inferior a 400 Nm.

[15] El anticuerpo de uno cualquiera de los apartados anteriores; con afinidad a FcRn humano a pH 6 que se caracteriza por una constante de disociación Kd inferior a 300 Nm.

[16] El anticuerpo de uno cualquiera de los apartados anteriores; con afinidad a FcRn humano a pH 6 que se caracteriza por una constante de disociación Kd inferior a 200 Nm.

[17] El anticuerpo de uno cualquiera de los apartados anteriores, con afinidad a FcRn humano a pH 6 que se caracteriza por una constante de disociación Kd en el intervalo de 5 Nm a 500 Nm, o de 10 Nm a 400 Nm, o de 25 Nm a 300 Nm, o de 50 Nm a 200 Nm, o de 75 Nm a 175 Nm.

[18] El anticuerpo de uno cualquiera de los apartados anteriores, en el que dicha Kd que caracteriza la afinidad con el FcRn humano a pH 6 está determinada por la resonancia de plasmón superficial (SPR).

[19] El anticuerpo de uno cualquiera de los apartados anteriores, que tiene una afinidad con FcRn humano a pH 7,4 que se caracteriza por una constante de disociación Kd superior a 10 pm.

[20] El anticuerpo de uno cualquiera de los apartados anteriores, en el que dicha Kd que caracteriza la afinidad con el FcRn humano a pH 7,4 está determinada por la resonancia de plasmón superficial (SPR).

[21] El anticuerpo de uno cualquiera de los apartados [1] a [18], en donde su afinidad con el FcRn humano a pH 7,4 es tan baja que un valor Kd no puede determinarse mediante SPR.

[22] El anticuerpo de uno cualquiera de los apartados anteriores, que se une a la TNFa a humana con una Kd inferior a 200 PM.

[23] El anticuerpo de uno cualquiera de los apartados anteriores, que se une a la TNFa a humana con una Kd inferior a 100 PM.

[24] El anticuerpo de uno cualquiera de los apartados anteriores, que se une a la TNFa a humana con una K^D inferior a 50 PM.

[25] El anticuerpo de uno cualquiera de los apartados anteriores, que se une a la TNFa a humana con una K^D inferior a 25 PM.

[26] El anticuerpo de uno cualquiera de los apartados anteriores, que se une a la TNFa a humana con una K^D inferior a 10 PM.

[27] El anticuerpo de uno cualquiera de los apartados anteriores, que se transporta a través de una monocapa celular polarizada del lado apical al lado basolateral.

[28] El anticuerpo de uno cualquiera de los apartados anteriores, que se transporta a través de una monocapa celular polarizada del lado apical al lado basolateral en mayor cantidad que un anticuerpo de control que comprende una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NÚM.:1 y una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NÚM.:2.

[29] El anticuerpo de uno cualquiera de los apartados anteriores, que se transporta a través de una monocapa celular polarizada de lado apical al lado basolateral en mayor cantidad que infliximab.

[30] El anticuerpo del apartado [28] o [29], en el que dicha cantidad se refiere a la masa de anticuerpo transportada a través de la monocapa celular polarizada en un plazo de cuatro horas.

[31] El anticuerpo de uno cualquiera de los apartados [27] a [30], en el que la cantidad de anticuerpo transportado a través de la monocapa celular polarizada es superior a dos veces la cantidad de una inmunoglobulina madre transportada a través de la monocapa celular polarizada, en el que dicha inmunoglobulina madre difiere de dicho anticuerpo sólo en que su región Fc tiene sólo aminoácidos de tipo silvestre.

[32] El anticuerpo de uno cualquiera de los apartados anteriores, en el que un porcentaje mayor del anticuerpo que el de infliximab se transporta a través de una monocapa celular polarizada del lado apical al lado basolateral en presencia de un exceso de diez veces de inmunoglobulinas competidoras, en el que el porcentaje se refiere a la masa total de inmunoglobulinas transportadas a través de la monocapa celular polarizada.

[33] El anticuerpo del apartado [32], en el que el porcentaje del anticuerpo transportado a través de la monocapa celular polarizada es mayor que dos veces el porcentaje de una inmunoglobulina madre transportada a través de la monocapa celular polarizada, en el que dicha inmunoglobulina madre difiere de dicho anticuerpo sólo en que su región de Fc tiene sólo aminoácidos de tipo silvestre.

[34] El anticuerpo de uno cualquiera de los apartados [27] a [33], en el que dicha monocapa de células polarizadas es una monocapa de células T84 polarizadas.

[35] El anticuerpo de uno cualquiera de los apartados anteriores, unido a CD16a(V) con una Kd inferior a 500 Nm, o inferior a 300 Nm, o inferior a 200 Nm, o inferior a 100 Nm.

[36] El anticuerpo de uno cualquiera de los apartados anteriores, unido a CD16a(F) con una Kd inferior a 10 pm o inferior a 1 pm.

[37] El anticuerpo de uno cualquiera de los apartados anteriores, unido a CD16b(NA2) con una Kd inferior a 10 pm, o inferior a 5 pm, o inferior a 1 pm.

[38] El anticuerpo de uno cualquiera de los apartados anteriores, con citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC).

[39] El anticuerpo de uno cualquiera de los apartados anteriores, capaz de inducir macrófagos CD14+CD206+.

[40] El anticuerpo de uno cualquiera de los apartados anteriores, capaz de inducir macrófagos CD14+CD206+ a un nivel igual o mayor que infliximab.

[41] El anticuerpo de uno cualquiera de los apartados anteriores, capaz de suprimir la proliferación de células T.

[42] El anticuerpo de uno cualquiera de los apartados anteriores, capaz de suprimir la proliferación de células T en un grado igual o superior al infliximab.

[43] El anticuerpo de uno cualquiera de los apartados anteriores, que es un anticuerpo no fucosilado o un anticuerpo con una reducción de la fucosilación.

[44] El anticuerpo de uno cualquiera de los apartados anteriores, que comprende un dominio Vh que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NÚM.:9 y un dominio Vl que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NÚM.:10.

[45] El anticuerpo de uno cualquiera de los apartados anteriores, que comprende una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NÚM.:1 y una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NÚM.:11, SEQ ID 12 o SEQ ID NÚM.:13.

[46] El anticuerpo de uno cualquiera de los apartados anteriores, en el que dicho anticuerpo se une específicamente al TNFa humano.

[47] El anticuerpo de uno cualquiera de los apartados anteriores, en el que dicho anticuerpo no se une significativamente a TNFp.

[48] El anticuerpo de uno cualquiera de los apartados anteriores, en el que dicho anticuerpo

(i) se une a la TNFa a humana con una constante de disociación (Kd) inferior a 125 pM;

(ii) tiene reactividad cruzada con Macaca mulatta TNFa y Macaca fascicularis TNFa;

(iii) tiene una potencia mayor que infliximab, según lo determinado por un ensayo de L929; y/o

(iv) es capaz de unirse al TNFaTrímero humano en una estequiometría (anticuerpo : TNFaTrímero) de al menos 2.

[49] El anticuerpo de uno cualquiera de los apartados anteriores, que se une a TNFa de Macaca mulatta con una Kd inferior a 1 Nm.

[50] El anticuerpo de uno cualquiera de los apartados anteriores, que se une a TNFa de Macaca fascicularis con una Kd inferior a 1 Nm.

[51] El anticuerpo de uno cualquiera de los apartados anteriores, en el que la potencia del anticuerpo para inhibir la apoptosis inducida por TNFa en relación con la de infliximab (potencia relativa), determinada en un ensayo de L929, es superior a 3, y en el que dicha potencia relativa es la relación del valor de IC⁵⁰ en ng/ml de infliximab en el ensayo de L929 con el valor de IC⁵oen ng/ml del anticuerpo en el ensayo de L929.

[52] El anticuerpo de uno cualquiera de los apartados anteriores, en el que la temperatura de fusión del dominio variable del anticuerpo en formato scFv, determinada por fluorimetría de exploración diferencial, es de al menos 65°C.

[53] El anticuerpo de uno cualquiera de los apartados anteriores, en el que la temperatura de fusión del dominio variable del anticuerpo en formato scFv, determinada por fluorimetría de exploración diferencial, es de al menos 68°C.

[54] El anticuerpo de uno cualquiera de los apartados anteriores, en el que la temperatura de fusión, determinada por fluorimetría de exploración diferencial, es de al menos 70°C.

[55] El anticuerpo de uno cualquiera de los apartados anteriores, en el que el anticuerpo es capaz de bloquear la interacción entre la TNFa a humana y el receptor I de TNF (TNFRI).

[56] El anticuerpo de uno cualquiera de los apartados anteriores, en el que el anticuerpo es capaz de bloquear la interacción entre la TNFa a humana y el receptor II de TNF (TNFRII).

[57] El anticuerpo de uno cualquiera de los apartados anteriores, que es capaz de inhibir la proliferación celular de células mononucleares de sangre periférica en una reacción linfocítica mixta.

[58] El anticuerpo de uno cualquiera de los apartados anteriores, que es capaz de inhibir la secreción inducida por LPS de interleucina-1p de monocitos CD14⁺ .

[59] El anticuerpo del apartado [58], en el que el valor IC⁵⁰ para inhibir la secreción inducida por LPS de interleucina-1p es inferior a 1 Nm.

[60] El anticuerpo del apartado [59], en el que dicho valor de IC⁵⁰ para inhibir la secreción inducida por LPS de interleucina-1p, sobre una base molar, es menor que el de adalimumab.

[61] El anticuerpo de uno cualquiera de los apartados anteriores, que es capaz de inhibir la secreción inducida por LPS de TNFa de monocitos CD14⁺ .

[62] El anticuerpo del apartado [61], en el que el valor IC⁵⁰ para inhibir la secreción inducida por LPS de TNFa es inferior a 1 Nm.

[63] El anticuerpo del apartado [62], en el que dichovalor de IC⁵⁰ para inhibir la secreción de TNFa inducida por LPS, sobre una base molar, es menor que el de adalimumab.

[64] El anticuerpo de uno cualquiera de los apartados anteriores, que es más resistente a la degradación proteolítica que un anticuerpo de tipo silvestre.

[65] El anticuerpo del apartado [64], en el que dicho anticuerpo de tipo silvestre es infliximab.

[66] El anticuerpo del apartado [64], en el que dicho anticuerpo de tipo silvestre es una inmunoglobulina que difiere de dicho anticuerpo sólo en que su región Fc tiene sólo aminoácidos de tipo silvestre.

[67] El anticuerpo del apartado [64], en el que dicho anticuerpo tipo silvestre comprende una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NÚM.:1 y una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NÚM.:2.

[68] El anticuerpo de uno cualquiera de los apartados [64] a [67], en donde dicha degradación proteolítica incluye la degradación por la metaloproteinasa de matriz 3 (MMP-3).

[69] El anticuerpo de uno cualquiera de los apartados [64] a [68], en el que dicha degradación proteolítica incluye la degradación por la enzima degradante de inmunoglobulina G de S. pyogenes (IdeS).

[70] El anticuerpo de uno cualquiera de los apartados [64] a [69], en el que dicha degradación proteolítica incluye la degradación por Endoproteinasa Glu-C de Staphylococcus aureus cepa V8 (GluC).

[71] Un ácido nucleico que codifica el anticuerpo de uno cualquiera de los apartados anteriores.

[72] Un vector o plásmido que comprende el ácido nucleico del apartado [71].

[73] Una célula que comprende el ácido nucleico del apartado [60] o el vector o plásmido del apartado [72].

[74] Un procedimiento de preparación del anticuerpo de uno cualquiera de los apartados [1] a [70], que comprende cultivar la célula del elemento [71] en un medio en condiciones que permiten la expresión del ácido nucleico que codifica el anticuerpo, y recuperar el anticuerpo de las células o del medio.

[75] El anticuerpo como se define en uno cualquiera de los apartados [1] a [70] para uso en un procedimiento de tratamiento de un trastorno inflamatorio o un trastorno relacionado con TNFa.

[76] El anticuerpo para uso de acuerdo con el apartado [75], en el que dicho trastorno inflamatorio se selecciona de la lista de enfermedades y trastornos enumerados en la sección “Trastornos a tratar” a continuación.

[77] El anticuerpo para uso de acuerdo con el apartado [75], en el que dicho trastorno inflamatorio es un trastorno inflamatorio del tracto gastrointestinal.

[78] El anticuerpo para uso de acuerdo con el apartado [77], en el que dicho trastorno inflamatorio del tracto gastrointestinal es enfermedad inflamatoria intestinal.

[79] El anticuerpo para uso de acuerdo con el apartado [77] o [78], en el que dicho trastorno inflamatorio del tracto gastrointestinal es la enfermedad de Crohn.

[80] El anticuerpo para uso de acuerdo con el apartado [79], en el que dicha enfermedad de Crohn se selecciona del grupo que consiste en ileal, colónica, ileocolónica, y/o enfermedad de Crohn superior aislada (gástrica, duodenal y/o yeyunal) e incluyendo comportamiento de la enfermedad sin constricción/no penetrante, con constricción, penetrante y perianal de la enfermedad, permitiendo cualquier combinación de localización y comportamiento de la enfermedad de cualquiera de los arriba mencionados.

[81] El anticuerpo para uso de acuerdo con el apartado [77] o [78], en el que dicho trastorno inflamatorio del tracto gastrointestinal es colitis ulcerosa.

[82] El anticuerpo para uso de acuerdo con el apartado [81], en el que dicha colitis ulcerosa se selecciona del grupo que consiste en proctitis ulcerosa, sigmoiditis, proctosigmoiditis, colitis del lado izquierdo, colitis pan-ulcerativa, y pouchitis.

[83] El anticuerpo para uso de acuerdo con el apartado [77] o [78], en el que dicho trastorno inflamatorio del tracto gastrointestinal es colitis microscópica.

[84] El anticuerpo para uso de acuerdo con el apartado [75], en el que dicho trastorno inflamatorio es artritis.

[85] El anticuerpo para uso de acuerdo con el apartado [75] o [84], en el que dicho trastorno inflamatorio es artritis reumatoide.

[86] El anticuerpo para uso de acuerdo con uno cualquiera de los apartados [75] a [85], en el que dicho procedimiento comprende administrar oralmente el anticuerpo a un individuo.

[87] El anticuerpo para uso de acuerdo con uno cualquiera de los apartados [75] a [85], en el que dicho procedimiento comprende la aplicación tópica del anticuerpo.

[88] Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de uno cualquiera de los apartados [1] a [70]. DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1: Potencia de las variantes de anticuerpos anti-TNFa para neutralizar el TNFa humano en el ensayo de L929. Se muestran las curvas de respuesta de dosis para las variantes de anticuerpos TNFa y el infliximab de referencia.

Figura 2: Transporte de variantes IgG anti-TNFa a través de células polarizadas T84. Las cantidades de variantes de anticuerpos anti-TNFa e infliximab (IFX) desde el apical hasta el reservorio basolateral a las 4 horas posteriores a la adición. Presentado como ng/cm2 Las barras de error indican SD de dos a cuatro monocapas individuales.

Figura 3: Transporte de variantes de IgG anti-TNFa a través de células polarizadas T84 en presencia de cantidades excesivas de IgG de mieloma. Las cantidades de las variantes anti-TNFa IFX y Ab transportadas desde el apical hasta el reservorio basolateral en presencia de un exceso de 4 veces de IgG de mieloma humano a las 10 horas posteriores a la adición. Presentado como ng/cm2. Las barras de error indican SD de tres a cuatro monocapas individuales.

Figura 4: Actividad de ADCC. Inducción de ADCC mediante variantes de anticuerpos anti-TNFa y Ab-wt. Figura 5: Inducción de macrófagos CD14+CD206+por cada compuesto en relación con la inducción de IFX. Datos resumidos de 4 experimentos independientes. Las barras representan la media y las barras de error representan SEM.

Figura 6: deleción de la proliferación de células T por cada compuesto en relación con IFX. Datos resumidos de 3 experimentos independientes. Las barras representan la media y las barras de error representan SEM. Figura 7: Resistencia a la degradación proteolítica por MMP-3.

Figura 8: Resistencia a la degradación proteolítica por IDE.

Figura 9: Resistencia a la degradación proteolítica por GluC.

Figura 10: Presentación esquemática de mutagénesis dirigida al sitio.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

La presente invención se refiere a un anticuerpo IgG1 que es capaz de unión a TNFA y comprende una región modificada de Fc. El anticuerpo tiene resistencia mejorada a la degradación proteolítica. Además, el anticuerpo tiene una alta afinidad con el FcRn humano a pH 6 y una baja afinidad con el FcRn humano a pH 7,4. La secuencia de aminoácidos del anticuerpo comprende los aminoácidos 233P, 234V, 235A y una deleción en la posición del aminoácido 236 (numeración de la UE). El anticuerpo comprende además el aminoácido 434A o los aminoácidos 252Y, 254T y 256E (numeración de la UE). Además, el anticuerpo comprende los aminoácidos 239D, 330L y 332E (numeración de la UE). Además, el anticuerpo comprende (i) un dominio Vl que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NÚM.:10 y (ii) un dominio Vh que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NÚM.:9.

A lo largo de la presente solicitud y reivindicaciones, generalmente se utiliza el sistema de numeración Kabat cuando se refiere a un residuo en el dominio variable (aproximadamente, residuos 1-107 de la cadena ligera y residuos 1-113 de la cadena pesada) (Kabat et al., Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). El «sistema de numeración de la UE» o «índice de la UE» se utiliza generalmente cuando se hace referencia a un residuo en una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina (por ejemplo, el índice de la UE notificado en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) expresamente incorporado en la presente memoria por referencia). A menos que se indique lo contrario en la presente memoria, las referencias a los números de residuos en el dominio variable de anticuerpos se refieren a la numeración de residuos por el sistema de numeración Kabat. A menos que se indique lo contrario en la presente memoria, las referencias a los números de residuos en el dominio constante de anticuerpos se refieren a la numeración de residuos por el sistema de numeración de la UE (véase por ejemplo, documento WO 2006/073941).

Anticuerpo

En el contexto de la presente solicitud, el término «anticuerpo» se utiliza como sinónimo de «inmunoglobulina» (Ig), que se define como una proteína perteneciente a la clase IgG, IgM, IgE, IgA o IgD (o cualquier subclase de la misma), e incluye todos los anticuerpos y fragmentos funcionales convencionalmente conocidos. De acuerdo con la presente solicitud, el anticuerpo es un anticuerpo IgG1. En el contexto de la presente invención, un «fragmento funcional» de un anticuerpo/inmunoglobulina se define como fragmento de unión al antígeno u otro derivado de un anticuerpo parental que esencialmente mantiene una o más de las propiedades de tal anticuerpo parental. Un «fragmento de unión al antígeno» o «dominio de unión al antígeno» de un anticuerpo/inmunoglobulina se define como fragmento (por ejemplo, una región variable de una IgG) que retiene la región de unión al antígeno. Una región de unión al antígeno de un anticuerpo se encuentra típicamente en una o más regiones hipervariables de un anticuerpo, es decir, las regiones CDR-1, -2 y/o -3. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser parte de construcciones bi- o multifuncionales.

Preferentemente, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. El término «anticuerpo monoclonal» utilizado en la presente memoria no se limita a los anticuerpos producidos a través de la tecnología de hibridomas. El término anticuerpo monoclonal se refiere a un anticuerpo que se deriva de un solo clon, incluyendo cualquier clon eucariótico, procariótico o fago, y no al procedimiento por el cual se produce. Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar utilizando una amplia variedad de técnicas conocidas en la técnica, incluyendo el uso de tecnologías de visualización de hibridomas, recombinantes y fagos, o una combinación de las mismas. (Harlow and Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual" CSH Press 1988, Cold Spring Harbor N.Y).

En otras realizaciones, incluyendo realizaciones relacionadas con el uso in vivo de los anticuerpos anti-TNFa en humanos, pueden ser utilizados anticuerpos quiméricos, primatizados, humanizados, o humanos En una realización preferente, el anticuerpo es un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado, más preferentemente un anticuerpo humano monoclonal o un anticuerpo humanizado monoclonal.

Dominio de enlaceTNFa

El anticuerpo de la invención se une específicamente a TNFa. Como se utiliza en la presente memoria, un anticuerpo «reconoce específicamente», o «se une específicamente a TNFa humanos TNFa, cuando el anticuerpo es capaz de discriminar entre humanos y una o más moléculas de referencia. Preferentemente, el valor deI C⁵⁰ para la unión a cada una de las moléculas de referencia es al menos 1.000 veces mayor que el valor de IC⁵⁰ para la unión a TNFa. En su forma más general (y cuando no se menciona ninguna referencia definida), la «unión específica» se refiere a la capacidad del anticuerpo para discriminar entre la TNFa a humana y una biomolécula no relacionada, según se determina, por ejemplo, de acuerdo con los procedimientos de ensayo de especificidad conocidos en la técnica. Estos procedimientos comprenden, pero no se limitan a, las pruebas Western blots y ELISA. Por ejemplo, se puede realizar un ensayo ELISA estándar. Normalmente, la determinación de la especificidad de unión se realiza utilizando no una sola biomolécula de referencia, sino un conjunto de aproximadamente tres a cinco biomoléculas no relacionadas, como la leche en polvo, BSA, transferrina o similares. En una realización, la unión específica se refiere a la capacidad del anticuerpo de discriminar entre TNFa y TNFp humanos.

El anticuerpo de la invención comprende un dominio Vl y un dominio Vh. El dominio Vl comprende una región de CDR1 (CDRL1), una región de CDR2 (CDRL2), una región de CDR3 (CDRL3) y regiones de Marco. El dominio Vh comprende una región de CDR1 (CDRH¹ ), una región de CDR2 (CDRH² ), una región de CDR3 (CDRH3) y regiones de Marco.

El término «CDR» se refiere a una de las seis regiones hipervariables dentro de los dominios variables de un anticuerpo que contribuyen principalmente a la unión al antígeno. Una de las definiciones más utilizadas para las seis CDR fue proporcionada por Kabat E. A. et al., (1991) Sequences of proteins of immunological interest. NIH Publication 91­ 3242). Como se utiliza en la presente memoria, la definición de CDR de Kabat sólo se aplica a CDR1, CDR2 y CDR3 del dominio variable de cadena ligera (CDR L1, CDR L2, CDR L3 o L1, L2, L3), así como para CDR2 y c Dr 3 del dominio variable de cadena pesada (CDR H2, CDR H3, o H2, H3). CDR1 del dominio variable de cadena pesada (CDR H1 o H1), sin embargo, tal como se utiliza en la presente memoria se define por los siguientes residuos (numeración Kabat): Comienza con la posición 26 y termina antes de la posición 36.

El anticuerpo de la invención comprende (i) un dominio V^l que comprende una región CDR1 que tiene la secuencia del aminoácido como se muestra en la SEQ ID NÚM.:3, una región CDR2 que tiene la secuencia del aminoácido como se muestra en la SEQ ID NÚM.:4, y una región CDR3 que tiene la secuencia del aminoácido como se muestra en la SEQ ID NÚM.:5, y (ii) un dominio V^h que comprende una región de CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NÚM.:6, una región de CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NÚM.:7, y una región de CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NÚM.:8.

El anticuerpo de la invención comprende (i) un dominio V^h que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NÚM.:9, y (ii) un dominio V^l que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NÚM.:10.

Se describe en forma adicional en la presente memoria un anticuerpo que comprende (i)un dominio V L que comprende una región CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NÚM.:14, una región CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NÚM.:15, y una región CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NÚM.:16, y (ii) un dominio V^h que comprende una región de CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NÚM.:17, una región de CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NÚM.:18, y una región de CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NÚM.:19.

Se describe en forma adicional en la presente memoria un anticuerpo que comprende un dominio V^h que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NÚM.:20. El anticuerpo de la presente revelación puede comprender un dominio V^l con la secuencia de aminoácidos como se muestra en la s Eq ID NÚM.:21 o SEQ ID Nú M.:22. Además, el anticuerpo de la presente divulgación puede comprender (i) un dominio V^h con la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NÚM.:21, y (ii) un dominio V L que tenga la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NÚM.:21 o SEQ ID NÚM.:22.

El anticuerpo de la invención tiene una alta afinidad a la TNFa a humana. El término K^d se refiere a la constante de equilibrio de disociación de una interacción anticuerpo-antígeno particular. Típicamente, el anticuerpo de la invención se une a TNFa humana con una disociación constante de equilibrio (K^d ) inferior a aproximadamente 2x10-10M, preferentemente inferior a 1,5x10-10M, preferentemente inferior a 1,25x10-10M, más preferentemente inferior a 1x10-10M, más preferentemente inferior a 7.5x10-11M o incluso inferior a 5x10-11M, según se determina utilizando tecnología de plasmón de superficie (SPR) en un instrumento BIACORE. En particular, la determinación de K^d se lleva a cabo como se describe en el Ejemplo 1.

Modificaciones de la región Fc

Una «región Fc modificada» comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la de una región Fc de secuencia nativa en virtud de al menos una «modificación de aminoácidos» o «mutación», tal como se define en la presente memoria. Preferentemente, la región Fc modificada comprende un sitio de unión de FcRn modificado que tiene al menos una sustitución de aminoácidos en comparación con un sitio de unión de FcRn de secuencia nativa o con el sitio de unión de FcRn de un anticuerpo primario, por ejemplo, de aproximadamente una a aproximadamente diez sustituciones de aminoácidos, y preferentemente de aproximadamente una a aproximadamente cinco sustituciones de aminoácidos en un sitio de unión de secuencia nativa FcRn o en el sitio de unión de FcRn del anticuerpo primario. Alternativamente, el anticuerpo puede tener una modificación fuera del sitio de unión de FcRn que afecta la afinidad con FcRn, por ejemplo, por cambios estructurales. Típicamente, la afinidad con FcRn humano a pH 6 se incrementa debido a la modificación. Es preferente que la afinidad con FcRn humano a pH 7,4 no se vea sustancialmente afectada por la modificación. Las modificaciones pueden ser generadas por procedimientos que se conocen per se, por ejemplo, por mutagénesis dirigida por el sitio como se describe en Antibody Engineering - Methods and Protocols", edited by Patrick Chames, 2nd ed., 2012, Chapter 31 (ISBN 978-1-61779-973-0).

La secuencia de aminoácidos del anticuerpo de la invención comprende el aminoácido prolina en la posición 233, el aminoácido valina en la posición 234, y el aminoácido alanina en la posición 235, y tiene además una deleción del aminoácido en la posición 236 (numeración de la UE). Esto se conoce como "233P/234V/235A/236del" en la presente memoria. El aminoácido nativo en la posición 233 de los anticuerpos IgG humanos no modificados es el ácido glutámico (E). El aminoácido nativo en la posición 234 de los anticuerpos IgG humanos no modificados es la leucina (L). El aminoácido nativo en la posición 235 de los anticuerpos IgG humanos no modificados es la leucina (L). El aminoácido nativo en la posición 236 de los anticuerpos IgG humanos no modificados es la glicina (G). Así, el anticuerpo de la invención puede ser obtenido introduciendo las mutaciones E233P, L234V, L235A y G236del en un anticuerpo. Esto se conoce como "E233P/L234V/L235A/G236del" en la presente memoria. Preferentemente, el anticuerpo de la invención es obtenible u obtenido substituyendo prolina para el ácido glutámico en la posición 233, substituyendo valina para leucina en la posición 234, substituyendo alanina para leucina en la posición 235, y suprimiendo glicina en la posición 236.

La secuencia de aminoácidos del anticuerpo de la invención comprende además (i) el aminoácido alanina en la posición 434, o (ii) el aminoácido tirosina en la posición 252, el aminoácido treonina en la posición 254 y el aminoácido glutámico ácido en la posición 256. Esto se conoce como 434A y 252Y/254T/256E en la presente memoria, respectivamente. El aminoácido nativo en la posición 434 de los anticuerpos IgG humanos no modificados es asparagina (N). El aminoácido nativo en la posición 252 de los anticuerpos IgG humanos no modificados es metionina (M). El aminoácido nativo en la posición 254 de los anticuerpos IgG humanos no modificados es serina (S). El aminoácido nativo en la posición 256 de los anticuerpos IgG humanos no modificados es treonina (T). Por lo tanto, el anticuerpo de la invención puede ser obtenido introduciendo las mutaciones adicionales N434A o M252Y/S254T/T256E en un anticuerpo.

Es decir, la secuencia de aminoácidos del anticuerpo de la invención comprende 233P/234V/235A/236del/434A o 233P/234V/235A/236del/252Y/254T/256E. Esta secuencia de aminoácidos se puede obtener introduciendo las mutaciones E233P/L234V/L235A/ G236del/N434A o E233P/L234V/L235A/G236del/M252Y/S254T/T256E en una secuencia de aminoácidos de un anticuerpo, por ejemplo, de un anticuerpo cuya región Fc tiene una secuencia de aminoácidos de tipo natural o no modificada.

La secuencia restante de aminoácidos de la región de Fc puede ser idéntica a la secuencia nativa de aminoácidos de una IgG humana típica. Sin embargo, es posible que la secuencia de aminoácidos del anticuerpo incluya una o más mutaciones o sustituciones adicionales a la secuencia de aminoácidos nativos de la región Fc de un anticuerpo nativo, siempre que el anticuerpo siga teniendo actividad de unión TNFa, actividad de unión de FcRn a pH 6,0 y una o más funciones efectoras.

La secuencia de aminoácidos del anticuerpo tiene los aminoácidos 239D/330L/332E, preferentemente obtenibles u obtenidos introduciendo las sustituciones S239D/A330L/I332E.

En una realización preferente, la secuencia de aminoácidos del anticuerpo de la invención comprende 233P/234V/235A/236del/239D/330L/332E/434A. Este anticuerpo se puede obtener introduciendo las mutaciones E233P/L234V/L235A/236del/S239D/A330L/l332E/N434A en una secuencia de aminoácidos de un anticuerpo, por ejemplo, de un anticuerpo cuya región Fc tiene una secuencia de aminoácidos de tipo natural o no modificada.

En otra realización preferente, la secuencia de aminoácidos del anticuerpo de la invención comprende 233P/234V/235A/236del/239D/330L/332E/252Y/254T/256E Este anticuerpo se puede obtener introduciendo las mutaciones E233P/L234V/L235A/236del/S239D/A330L/I332E/ M252Y/S254T/T256E en una secuencia de aminoácidos de un anticuerpo, por ejemplo, de un anticuerpo cuya región Fc tiene una secuencia de aminoácidos de tipo natural o no modificada.

En una realización preferente, la región Fc del anticuerpo de la invención, incluyendo la región de bisagra, comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NÚM.:28, y SEQ ID NÚM.:29.

En una realización, la cadena pesada del anticuerpo de la invención tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NÚM.:2, en la que las mutaciones E233P/L234V/L235A/236del/ S239D/A330L/I332E/N434A han sido introducidas. Preferentemente este anticuerpo comprende además una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NÚM.:1.

En otra realización, la cadena pesada del anticuerpo de la invención tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NÚM.:2, en la que las mutaciones E233P/L234V/L235A/236del/ S239D/A330L/I332E/M252Y/S254T/T256E han sido introducidas. Preferentemente este anticuerpo comprende además una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NÚM.:1.

En un aspecto preferente de la invención, el anticuerpo de la invención es un anticuerpo no fucosilado o un anticuerpo con fucosilación reducida.

El término «anticuerpo que ha reducido la fucosilación», tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un anticuerpo en el que inferior al 90% de los N-glicanos del anticuerpo están fucosilados. Los procedimientos para determinar el porcentaje de la fucosilación se conocen en la técnica En una realización, menos que 75%, o menos que 50%, o menos que 25% de los N-glicanos del anticuerpo están fucosilados. Lo más preferente es que menos que 10% de los N-glicanos del anticuerpo estén fucosilatados. En una realización particular, los N-glicanos del anticuerpo de la invención no contienen ninguna fucosa.

Preferentemente, menos que 90% de los N-glicanos a N297 (numeración de la UE) del anticuerpo están fucosilatados. En otra realización, menos que 75%, o menos que 50%, o menos que 25% de los N-glicanos en N297 (numeración de la UE) del anticuerpo están fucosilados. Lo más preferente es que menos que 10% de los N-glicanos a N297 (numeración de la UE) del anticuerpo estén fucosilatados.

En otra realización, los N-glicanos en N297 del anticuerpo no contienen ninguna fucosa.

Los anticuerpos no fucosilados, a menudo también denominados anticuerpos afucosilados, pueden ser generados por varios procedimientos. Por ejemplo, la reducción sinérgica de los genes para la a1,6-fucosiltransferasa (FUT8) y la GDP-manosa 4,6-deshidratatasa (GMD) en las células CHO se puede utilizar para producir variantes de anticuerpos monoclonales que están completamente afucosiladas y mejoradas con ADCC (véase, por ejemplo, Imai-Nishiya et al (2007) BMC Biotechnol. 7, 84). Un procedimiento que utiliza nucleasas de dedo de zinc (ZFNs) que escinde el gen FUT8 en una región que codifica el núcleo catalítico de la a1,6-fucosiltransferasa y, por lo tanto, interrumpe la función enzimática correspondiente en las células CHO se puede utilizar para producir anticuerpos monoclonales que carecen completamente de fucosa central (véase, por ejemplo, Malphettes et al (2010) Biotechnol. Bioeng. 106, 774-783).

Los anticuerpos que tienen una reducción de la fucosilación pueden prepararse añadiendo un sustrato de señuelo tal como 2-deoxi-2-fluoro-2-fucosa al medio de cultivo (véase, por ejemplo, Dekker(2016) Sci Rep 6:36964), lo que resulta en una menor incorporación de la fucosa en los glicanos IgG-Fc.

En otra realización, el anticuerpo de la invención tiene un alto contenido de ácido siálico. El aumento en la sialilación se puede lograr, por ejemplo, mediante transfección simultánea de la citidina monofosfato-ácido siálico sintasa (CMP-SAS), la citidina monofosfato-siálico transportador de ácido (CMP-SAT), y a 2,3-sialiltransferasas (véase, por ejemplo, Son et al. (2011) Glycobiology 21, 1019-1028).

Afinidad con FcRn

La afinidad a pH 6 con FcRn humano del anticuerpo de la invención es alta. La unión de alta afinidad del anticuerpo a FcRn humano a pH 6 se caracteriza típicamente por un valor Kd inferior a 500 nm. Preferentemente, el valor Kd de la unión de alta afinidad a pH 6 es inferior a 400 nm, o inferior a 300 nm, o inferior a 200 nm. Por ejemplo, el valor Kd que caracteriza la afinidad a pH 6 puede estar en el intervalo de 5 a 500 Nm, o de 10 a 400 Nm, o de 25 a 300 Nm, o de 50 a 200 Nm, o de 100 a 175 Nm.

En una realización preferente, la afinidad del anticuerpo de la invención a FcRn humano a pH 6 es mayor que la afinidad de infliximab al FcRn humano a pH 6,0.

La afinidad del anticuerpo de la invención a FcRn humano es preferentemente determinada por resonancia de plasmón en superficie (SPR), por ejemplo como se describe en el Ejemplo 4 de esta solicitud.

El anticuerpo de la presente invención típicamente tiene una afinidad baja a FcRn humano en pH 7,4. La baja afinidad se caracteriza por un valor Kd superior a 1 pm. Preferentemente, la baja afinidad con FcRn humano a pH 7,4 se caracteriza por un valor Kd superior a 2 pm, o superior a 5 pm, o superior a 10 pm.

En una realización particular, la baja afinidad en pH 7,4 es tan baja que un valor Kd no puede ser determinado por SPR.

En una realización especial, la proporción de (i) un valor Kd para la unión del anticuerpo de la invención al FcRn humano en el pH 7,4 a (ii) un valor Kd para la unión a FcRn humano en el pH 6,0, es de al menos 50. Preferentemente, esta proporción es de al menos 100, o al menos 150, o al menos 200.

Propiedades funcionales del anticuerpo

El anticuerpo de la invención es eficientemente transportado a través de una célula polarizada monocapa del lado apical al lado basolateral. Típicamente, el transporte a través de la monocapa celular polarizada es mayor que el de infliximab, en el que la cantidad de anticuerpo en infliximab se refiere a la masa/cm2de la monocapa celular polarizada. La cantidad de anticuerpo transportado a través de la monocapa celular polarizada, en relación con la cantidad de infliximab transportado a través de la monocapa celular polarizada, es de al menos 110%, preferentemente al menos 120%, preferentemente al menos 130% o al menos 140%, o al menos 150% (en el que la cantidad de infliximab transportado se establece en 100%).

Además, el anticuerpo se transporta específicamente a través de la monocapa celular polarizada del lado apical al lado basolateral en presencia de un exceso de inmunoglobulinas competidoras. En la presente memoria, esto se denomina transporte específico.

El porcentaje de la masa total de inmunoglobulinas transportadas a través de la monocapa celular polarizada es mayor que el porcentaje de infliximab transportado a través de la monocapa celular polarizada del lado apical al lado basolateral en presencia de un exceso de 10 veces de inmunoglobulinas competidoras. El porcentaje de anticuerpo de la invención transportado a través de la célula polarizada monocapa en la presencia de un exceso de 10 veces de inmunoglobulinas no relacionadas, en relación al porcentaje de infliximab transportado a través de la célula polarizada monocapa en la presencia de un exceso 10 veces de anticuerpos no relacionados, es por lo menos 120%, o al menos el 130%, o al menos el 140%, o al menos el 150% (infliximab se establece en el 100%).

Preferentemente, la monocapa celular polarizada es una monocapa de células T84 polarizadas. El ensayo de transporte que imita el proceso de transcitosis se puede llevar a cabo como se describe en el Ejemplo 5 de esta solicitud.

El anticuerpo de la invención se une a CD16a(V), CD16a(F) y CD16b(NA2).

El anticuerpo de la invención se une típicamente a CD16a(V) con un Kd inferior a 1 |jm, preferentemente inferior a 500 Nm, más preferentemente inferior a l0o Nm.

El anticuerpo de la invención se une típicamente a CD16a(F) con un Kd inferior a 10 jm , preferentemente inferior a 1 jm .

El anticuerpo de la invención se une típicamente a CD16b(NA2) con un Kd inferior a 10 jm , preferentemente inferior a 1 jm .

El anticuerpo de la invención es además capaz de inducir macrófagos CD14+CD206+. El nivel de inducción es preferentemente comparable, igual o mayor que el de infliximab.

El anticuerpo de la invención es más capaz de suprimir la proliferación de células T. El grado de deleción de la proliferación de células T es preferentemente comparable, igual o mayor que el de infliximab.

Composición farmacéutica y tratamiento

El tratamiento de una enfermedad comprende el tratamiento de los pacientes ya diagnosticados como portadores de cualquier forma de la enfermedad en cualquier etapa clínica o manifestación; el retraso del inicio o evolución o agravamiento o deterioro de los síntomas o signos de la enfermedad; y/o prevención y/o reducción de la gravedad de la enfermedad.

Un "individuo" o "paciente" al que se administra un anticuerpo anti-TNFa puede ser un mamífero, tal como un no primate (por ej., vaca, cerdo, caballo, gato, perro, rata, etc.) o primate (por ejemplo, mono o ser humano). En ciertos aspectos, el ser humano es un paciente pediátrico. En otros aspectos, el ser humano es un paciente adulto.

Se describen en la presente memoria composiciones que comprenden un anticuerpo anti-TNFa y, opcionalmente, uno o más agentes terapéuticos adicionales, como los segundos agentes terapéuticos descritos a continuación. Las composiciones se suministran normalmente como parte de una composición farmacéutica estéril que incluye un vehículo farmacéuticamente aceptable. Esta composición puede estar en cualquier forma adecuada (dependiendo del procedimiento deseado de administrarlo a un paciente).

Los anticuerpos anti-TNFa se pueden administrar a un paciente por una variedad de vías, tal como oral, transdérmica, subcutánea, intranasal, por vía intravenosa, intramuscular, intratecal, tópica o local, por ejemplo, mucosal. La vía más adecuada para la administración en un caso determinado dependerá del anticuerpo en particular, del individuo y de la naturaleza y gravedad de la enfermedad y del estado físico del individuo. En una realización, el anticuerpo anti-TNFa se administra por vía intravenosa.

En una realización particularmente preferente, el anticuerpo de la invención es administrado oralmente. Si la administración se realiza por vía oral, el anticuerpo es preferentemente una IgG, preferentemente una IgG-i.

El anticuerpo anti-TNFa puede estar presente en una composición farmacéutica a una concentración suficiente para permitir la administración intravenosa a 0,5 mg/kg de peso corporal a 20 mg/kg de peso corporal. En algunas realizaciones, la concentración de anticuerpos adecuada para uso en las composiciones y procedimientos descritos en la presente memoria incluye, pero sin limitación, 0,5 mg/kg, 0,75 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 2,5 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg, 10 mg/kg, 11 mg/kg, 12 mg/kg, 13 mg/kg, 14 mg/kg, 15 mg/kg, 16 mg/kg, 17 mg/kg, 18 mg/kg, 19 mg/kg, 20 mg/kg, o una concentración que oscila entre cualquiera de los valores anteriores, por ejemplo, de 1 mg/kg a 10 mg/kg, de 5 mg/kg a 15 mg/kg, o de 10 mg/kg a 18 mg/kg.

La dosis efectiva de un anticuerpo anti-TNFa puede oscilar entre aproximadamente 0,001 y aproximadamente 750 mg/kg por administración única (por ejemplo, bolo), varias administraciones o administración continua, o para lograr una concentración sérica de 0,01-5000 jg/m l por administración única (por ejemplo, bolo), varias administraciones o administración continua, o cualquier intervalo o valor efectivo en este dependiendo de la condición que se esté tratando, la vía de administración y la edad, peso y condición del individuo. En caso de administración oral, la concentración sérica puede ser muy baja o incluso inferior al límite de detección. En ciertas realizaciones, cada dosis puede variar de aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 50 mg por kilogramo de peso corporal o aproximadamente 3 mg a aproximadamente 30 mg por kilogramo de peso corporal. El anticuerpo puede formularse como una solución acuosa.

En una realización particularmente preferente, el anticuerpo de la invención es administrado oralmente. Si la administración se realiza por vía oral, el anticuerpo es preferentemente una IgG, preferentemente una IgG-i. Si el anticuerpo se administra por vía oral, la dosis diaria de anticuerpo suele estar en el intervalo de unos 0,01 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal, o de unos 0,05 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal, o de unos 0,1 mg/kg a aproximadamente 25 mg/kg de peso corporal, o aproximadamente 0,15 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal, o aproximadamente 0,16 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal, o aproximadamente 0,2 mg/kg a aproximadamente 2 mg/kg de peso corporal, O alrededor de 0,2 mg/kg a aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal, generalmente, las dosis ventajosas son dosis de 1 a 200 mg por día, preferentemente de 5 a 100 o de 10 a 50 mg por día.

Las composiciones farmacéuticas se pueden presentar convenientemente en formas de dosis unitarias que contienen una cantidad predeterminada de un anticuerpo anti-TNFa por dosis. Dicha unidad puede contener de 0,5 mg a 5 g, por ejemplo, pero sin limitación, 1 mg, 10 mg, 20 mg, 30 mg, 40 mg, 50 mg, 100 mg, 200 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, 750 mg, 1000 mg o cualquier intervalo entre dos de los valores anteriores, por ejemplo, de 10 mg a 1000 mg, de 20 mg a 50 mg, o de 30 mg a 300 mg. Los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden tomar una amplia variedad de formas dependiendo, por ejemplo, de la condición a tratar o vía de administración.

La determinación de la dosis efectiva, el número total de dosis y la duración del tratamiento de un anticuerpo anti-TNFa del mismo está dentro de las capacidades de los expertos en la técnica, y puede ser determinada usando un estudio estándar de aumento de dosis.

Las formulaciones terapéuticas de los anticuerpos anti-TNFa adecuados en los procedimientos descritos en la presente memoria pueden prepararse para su almacenamiento como formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas mezclando el anticuerpo con el grado deseado de pureza con portadores opcionales farmacéuticamente aceptables, excipientes o estabilizadores normalmente empleados en la técnica (todos los cuales se denominan en la presente memoria «vehículos»), es decir, agentes de amortiguación, agentes estabilizantes, conservantes, isotónicos, detergentes no iónicos, antioxidantes y otros aditivos diversos. Véase, Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition (Osol, ed. 1980). Dichos aditivos deben ser no tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas.

Los agentes de tampón ayudan a mantener el pH en el intervalo que se aproxima a las condiciones fisiológicas. Pueden estar presentes a una concentración que oscila entre aproximadamente 2 mm y aproximadamente 50 mm. Entre los agentes tamponantes adecuados se incluyen ácidos orgánicos e inorgánicos y sus sales, como tampones de citrato (por ejemplo, mezcla de citrato de citrato de monosodio-disodio monosódico, mezcla de citrato de ácido cítrico-monosodio, etc.), tampones de citrato-fosfato, tampones de succinato (por ejemplo, mezcla de ácido succínicomonósodio, mezcla de succinato, hidróxido de sodio, etc.) tampones de tartrato (por ejemplo, mezcla de tartrato ácido tartárico-sodio, mezcla de tartrato ácido tartárico-potasio, mezcla de hidróxido ácido tartárico-sodio, etc.), tampones de fumarato (por ejemplo, mezcla de fumarato ácido fumarico-monosódico, mezcla de fumarato monosódico, mezcla de ácido fumarato-gluconato sódico, etc.), mezcla de ácido gluconato gluconódico-gluconato, mezcla de sodio-ácido gluconato, mezcla de sodio-gluconato, mezcla de ácido gluconato (por ejemplo, mezcla de oxalato de ácido oxálicosodio, mezcla de hidróxido de ácido oxálico-sodio, mezcla de oxalato de ácido oxálico-potasio, etc.), tampones de lactato (por ejemplo, mezcla de lactato de ácido láctico-sodio, mezcla de hidróxido de ácido láctico-sodio, mezcla de lactato de ácido láctico-potasio, etc.) y tampones de acetato (por ejemplo, mezcla de ácido acético-hidróxido de sodio, mezcla de sodio, etc.). Además, se pueden utilizar tampones de fosfato, tampones de histidina y sales de trimetilamina como Tris.

La composición farmacéutica de la invención puede comprender al menos una sal, por ejemplo, cloruro sódico. La concentración de sal oscila preferentemente entre 100 mm y 200 mm, por ejemplo, aproximadamente 150 mm.

Se pueden añadir conservantes para retardar el crecimiento microbiano y se pueden añadir en cantidades que oscilan entre 0,2% y 1% (p/v). Los conservantes adecuados incluyen fenol, alcohol bencílico, meta-cresol, metil parabeno, propil parabeno, cloruro de amonio octadecildimetilbencilo, haluros de benzalconio (por ejemplo, cloruro, bromuro y yoduro), cloruro de hexametonio, y alquilo parabenos tal como metil o propil paraben, catecol, resorcinol, ciclohexanol, y 3-pentanol. Pueden añadirse isotonificadores a menudo conocidos como "estabilizadores" para garantizar la isotonicidad de las composiciones líquidas e incluir alcoholes de azúcar polihidricos, preferentemente alcoholes de azúcar trihidricos o superiores, como glicerina, eritritol, arabitol, xilitol, sorbitol y manitol. Los estabilizadores se refieren a una amplia categoría de excipientes que pueden variar en función de un agente de bulto a un aditivo que solubiliza el agente terapéutico o ayuda a prevenir la desnaturalización o adherencia a la pared del recipiente. Los estabilizadores típicos pueden ser alcoholes de azúcar polihidricos (enumerados con anterioridad); aminoácidos tales como arginina, lisina, glicina, glutamina, asparagina, Histidina, alanina, ornitina, L-leucina, 2-fenilalanina, ácido glutámico, treonina, etc., azúcares orgánicos o alcoholes de azúcar, como lactosa, trehalosa, estaquiosa, manitol, sorbitol, xilitol, ribitol, mioinositol, galactitol, glicerol y similares, incluyendo ciclitoles tales como inositol; polietilenglicol; polímeros de aminoácidos; azufre que contiene agentes reductores, tales como urea, glutatión, ácido tiocítico, tioglicolato de sodio, tioglicerol, a-monotioglicerol y sulfato de sodio; polipéptidos de bajo peso molecular (por ejemplo, péptidos de 10 residuos o menos); proteínas como albúmina sérica humana, albúmina sérica bovina, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófílicos, como monosacáridos de polivinilpirrolidona, como xilosa, manosa, fructosa, glucosa; disacáridos como la lactosa, la maltosa, la sacarosa y los trisacacaridos como la raffinosa; y los polisacáridos como el dextrano. Los estabilizadores pueden estar presentes en el intervalo de 0,1 a 10.000 pesos por parte de la proteína activa de peso.

Se pueden añadir tensioactivos no iónicos o detergentes (también conocidos como agentes humectantes) para ayudar a solubilizar el agente terapéutico, así como para proteger la proteína terapéutica contra la agregación inducida por agitación, lo que también permite exponer la formulación a la superficie de cizalla estresada sin causar desnaturalización de la proteína. Entre los tensioactivos no iónicos adecuados se incluyen los polisorbatos (20, 80, etc.), los polioxamadores (184, 188, etc.), Polioles plurónicos, monoéteres de polioxietileno sorbitano (TWEEN®-20, TWEEN®-80, etc.). Los tensioactivos no iónicos pueden estar presentes en un intervalo de aproximadamente 0,05 mg/ml a aproximadamente 1,0 mg/ml, o en un intervalo de aproximadamente 0,07 mg/ml a aproximadamente 0,2 mg/ml.

Otros excipientes diversos incluyen agentes de bulto (por ejemplo, almidón), agentes quelantes (por ejemplo, EDTA), antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, metionina, vitamina E), inhibidores de proteasa y codisolventes.

La formulación de la presente memoria también puede contener un segundo agente terapéutico además de un anticuerpo anti-TNFa del mismo. A continuación se ofrecen ejemplos de segundos agentes terapéuticos adecuados.

El programa de dosificación puede variar de una vez al mes a diario dependiendo de varios factores clínicos, incluyendo el tipo de enfermedad, la gravedad de la enfermedad y la sensibilidad del paciente al anticuerpo anti-TNFa. En las realizaciones específicas, un anticuerpo anti-TNFa del mismo se administra diariamente, dos veces por semana, tres veces por semana, cada dos días, cada 5 días, una vez por semana, cada 10 días, cada dos semanas, cada tres semanas, cada cuatro semanas o una vez al mes, o en cualquier intervalo entre dos de los valores anteriores, por ejemplo, de cada cuatro días a cada mes, de cada 10 días a cada dos semanas, o de dos a tres veces a la semana, etc.

La dosis de un anticuerpo anti-TNFa que se administrará variará según el anticuerpo en particular, el individuo y la naturaleza y gravedad de la enfermedad, el estado físico del individuo, el régimen terapéutico (por ejemplo, si se utiliza un segundo agente terapéutico) y la vía de administración seleccionada; la dosis apropiada puede ser fácilmente determinada por un experto en la técnica.

Se reconocerá por un experto en la técnica que la cantidad óptima y el espaciamiento de dosis individuales de un anticuerpo anti-TNFa del mismo será determinado por la naturaleza y extensión de la condición que se está tratando, la forma, vía y lugar de administración, y la edad y condición del individuo en particular que está siendo tratado, y que un médico determinará en última instancia las dosis apropiadas a ser utilizadas. Esta dosis se puede repetir tan a menudo como sea apropiado. Si se desarrollan efectos secundarios, la cantidad y/o frecuencia de la dosis puede ser alterada o reducida, de acuerdo con la práctica clínica normal.

Trastornos a tratar

La invención se refiere a un procedimiento para tratar o prevenir una enfermedad humana TNFa-relacionada en un individuo, comprendiendo administrar al individuo el anticuerpo definido en la presente memoria. El término «trastorno relacionado con TNFa» o «enfermedad relacionada con TNFa» se refiere a cualquier trastorno, cuyo inicio, progresión o persistencia de los síntomas o estados patológicos requiere la participación de TNFa. Los trastornos relacionados con TNFa incluyen, pero sin limitación, estados crónicos y/o autoinmunes de inflamación en general, trastornos inflamatorios mediados por el sistema inmunitario en general, enfermedad inflamatoria del SNC, enfermedades inflamatorias que afectan el ojo, las articulaciones, la piel, las membranas mucosas, el sistema nervioso central, tracto gastrointestinal, tracto urinario o pulmón, estados de uveítis en general, retinitis, uveítis HLA-B27+, enfermedad de Behget, síndrome de ojo seco, Glaucoma, síndrome de Sjogren, diabetes mellitus (incluida neuropatía diabética), resistencia a la insulina, estados de artritis en general, artritis reumatoide, osteoartritis, artritis reactiva y síndrome de Reiter, artritis juvenil, espondilitis anquilosante, esclerosis múltiple, síndrome de Guillain-Barre, miastenia grave, esclerosis lateral amiotrófica, sarcoidosis, glomerulonefritis, enfermedad renal crónica, Cistitis, psoriasis (incluyendo artritis psoriásica), hidradenitis supurativa, paniculitis, pioderma gangrenoso, síndrome de SApHO (sinovitis, acné, pustulosis, hiperostosis y osteítis), acné, el hipódromo de Sweet, Pénfigo, enfermedad de Crohn (incluyendo manifestaciones extraintestinales), colitis ulcerosa, asma bronquial, neumonitis por hipersensibilidad, alergias generales, rinitis alérgica, sinusitis alérgica, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), fibrosis pulmonar, granulomatosis de Wegener, síndrome de Kawasaki, arteritis de células gigantes, Vasculitis Churg-Strauss, poliarteritis nodosa, quemaduras, enfermedad de injerto contra huésped, reacciones de huésped contra injerto, episodios de rechazo tras trasplante de órganos o médula ósea, estados sistémicos y locales de vasculitis en general, lupus eritematodos sistémico y cutáneo, polimiositis y dermatomiositis, esclerodermia, preeclampsia, pancreatitis aguda y crónica, hepatitis viral, hepatitis alcohólica, inflamación posquirúrgica, como después de la cirugía ocular (por ejemplo, cirugía de cataratas (reemplazo de lentes oculares) o glaucoma), cirugía articular (incluyendo cirugía artroscópica), cirugía en estructuras relacionadas con las articulaciones (por ejemplo, ligamentos), cirugía oral y/o dental, procedimientos cardiovasculares mínimamente invasivos (por ejemplo PTCA, aterectomía, colocación de stent), procedimientos laparoscópicos y/o endoscópicos intraabdominales y ginecológicos, procedimientos urológicos endoscópicos (por ejemplo, cirugía de próstata, ureteroscopia, cistoscopia, cistitis intersticial) o inflamación perioperatoria (prevención) en general, dermatitis bullosa, dermatitis neutrofílica, necrolisis epidérmica tóxica, dermatitis pustular, malaria cerebral, síndrome urémico hemolítico, rechazo del aloinjerto, otitis media, mordida de serpiente, eritema nodoso, síndromes mielodisplásicos, colangitis esclerosante primaria, espondilarteropatía seronegativa, anemia hematolítica autoinmune, granulamatosis orofacial, piostomatitis vegetans, estomatitis aftosa, lengua geográfica, estomatitis migratoria, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington, parálisis de Bell, enfermedad de Creutzfeld-Jakob y afecciones neurodegenerativas en general.

La ostólisis relacionada con el cáncer, inflamación relacionada con el cáncer, dolor relacionado con el cáncer, caquexia relacionada con el cáncer, metástasis óseas, formas agudas y crónicas de dolor, independientemente de si son causadas por efectos centrales o periféricos de TNFa y si están clasificadas como formas inflamatorias, nociceptivas o neuropáticas de dolor, ciática, dolor lumbar, síndrome del túnel carpiano, síndrome de dolor regional complejo (SDRC), gota, neuralgia postherpética, fibromialgia, estados locales del dolor, síndrome de dolor crónico debido a tumor metastásico, dismenorrea.

Los trastornos particulares a tratar incluyen estados de artritis en general, artritis reumatoide, osteoartritis, artritis reactiva, artritis juvenil; psoriasis incluyendo artritis psoriásica; enfermedad inflamatoria intestinal, incluyendo enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa incl. Proctitis, sigmoiditis, proctosigmoiditis, colitis izquierda, colitis extensa y pancolitis, colitis indeterminada, colitis microscópica incluyendo colitis colagenosa y linfocítica, colitis en enfermedad del tejido conjuntivo, colitis desviada, colitis en enfermedad diverticular, colitis eosinofílica y pouchitis.

Preferentemente, el anticuerpo de la invención se utiliza para tratar una enfermedad inflamatoria intestinal, en particular la enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa o colitis microscópica. La enfermedad de Crohn puede ser ileal, colónica, ileocolónica o aislada superior (gástrica, duodenal y/o yeyunal), incluyendo el comportamiento de la enfermedad sin estricción/penetración, con estricción, penetración y perianal, permitiendo cualquier combinación de localización y comportamiento de la enfermedad de cualquiera de las mencionadas. La colitis ulcerosa puede ser proctitis ulcerosa, proctosigmoiditis, colitis izquierda, colitis panulcerosa y pouchitis.

Terapia de combinación y otros aspectos

Preferentemente, el paciente tratado con un anticuerpo anti-TNFa del mismo también se trata con otro medicamento convencional. Por ejemplo, un paciente que padece una enfermedad inflamatoria intestinal, especialmente si padece una enfermedad de moderada a grave, también suele tratarse con mesalazina o derivados o profármacos de la misma, corticosteroides, por ejemplo budesonida o prednisolona (oral o i.v.), inmunosupresores, por ejemplo azatioprina/6-mercaptopurina (6-MP) o metotrexato, ciclosporina o tacrolimús. Otros medicamentos que se pueden administrar conjuntamente al paciente incluyen otros anticuerpos anti-TNFa (por ejemplo, infliximab, adalimumab, etanercept, certolizumab pegol, golimumab), Antagonistas de la integrina (por ejemplo, natalizumab, vedolizumab), anticuerpos anti-IL-23 (por ejemplo MEDI2070), anticuerpos anti-p7 (por ejemplo, etrolizumab), inhibidores JAK en la vía JAK/STAT (por ejemplo, tofacitinib) y otros. Otros medicamentos que se pueden administrar conjuntamente al paciente incluyen inmunosupresores (por ejemplo, azatioprina/6-MP o metotrexato o ciclosporina oral) para mantener una remisión estable y más prolongada. Otro aspecto de la invención es el uso de un anticuerpo anti-TNFa según lo definido anteriormente para reducir la inflamación.

Otro aspecto de la invención es un anticuerpo anti-TNFa según lo definido anteriormente para uso para reducir la inflamación en un paciente que sufre de una afección inflamatoria.

Un aspecto adicional de esta invención es un procedimiento para tratar una afección inflamatoria, comprendiendo administrar a un paciente en necesidad de dicho tratamiento una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-TNFa según lo definido anteriormente. La afección inflamatoria es preferentemente una de las condiciones descritas con anterioridad.

Un aspecto adicional de esta invención es un procedimiento para prevenir una afección inflamatoria, comprendiendo administrar a un paciente en necesidad de ella una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-TNFa según lo definido anteriormente. La afección inflamatoria es preferentemente una de las afecciones descritas con anterioridad.

Se describe más detalladamente en la presente memoria un procedimiento para mejorar la transcitosis de un anticuerpo dirigido contra TNFa, que comprende introducir las sustituciones E233P, L234V y L235A, suprimir G236 e introducir las siguientes sustituciones adicionales (a) o (b):

(a) M252Y, S254T y T256E

(b) N434A;

y, opcionalmente, introducir una o más de las otras sustituciones descritas en la presente memoria; para obtener un anticuerpo modificado con transcitosis mejorada. El anticuerpo modificado es preferentemente un anticuerpo como se describe anteriormente.

Se describe más detalladamente en la presente memoria un procedimiento para extender la semivida plasmática de un anticuerpo dirigido contra TNFa, que comprende introducir las sustituciones E233P, L234V y L235A, eliminar G236 e introducir las siguientes sustituciones adicionales (a) o (b):

(a) M252Y, S254T y T256E

(b) N434A;

y, opcionalmente, introducir una o más de las otras sustituciones descritas en la presente memoria; para obtener un anticuerpo modificado con una semivida plasmática prolongada. El anticuerpo modificado es preferentemente un anticuerpo como se describe anteriormente. La semivida plasmática puede aumentarse en al menos 10%, o al menos 20%, o al menos 30%, o al menos 40%, o al menos 50%, con relación a la semivida plasmática del anticuerpo no modificado (es decir, el anticuerpo primario respectivo que carece de las mutaciones mencionadas).

Se describe más detalladamente en la presente memoria un procedimiento para mejorar la resistencia contra la degradación proteolítica de un anticuerpo dirigido contra TNFa, que comprende introducir las sustituciones E233P, L234V y L235a , eliminar G236 e introducir las siguientes sustituciones adicionales (a) o (b):

(a) M252Y, S254T y T256E

(b) N434A;

y, opcionalmente, introducir una o más de las otras sustituciones descritas en la presente memoria, para obtener un anticuerpo modificado con resistencia mejorado a la degradación proteolítica. El anticuerpo modificado es preferentemente un anticuerpo como se describe anteriormente.

Tabla 1. Descripción general de las secuencias de la lista de secuencias.

EJEMPLOS

Variantes de anticuerpos

Se generaron varias variantes de un anticuerpo anti-TNFa (a continuación denominado «anticuerpo primario» o «Abwt») introduciendo sustituciones en la región Fc de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo. La cadena ligera de Ab-wt tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NÚM.:1, y la cadena pesada de Ab-wt tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NÚM.:2. Las mutaciones fueron introducidas por mutagénesis dirigida por el sitio por procedimientos establecidos. Brevemente, las mutaciones fueron introducidas por PCR. El cebador directo fue diseñado para contener la mutación deseada mientras que el cebador inverso fue diseñado para que los extremos de 5' de los dos cebadores tengan los anillos de espalda a espalda (pero no se superpongan) (Figura 10). La PCR se realizó durante 25 ciclos (98 °C durante 10 s, 64 °C durante 30s, 72 °C durante 3 min). Antes de utilizar el producto de PCR en un gel de agarosa, la plantilla de PCR no mutada se retiró del conjunto de productos de PCR utilizando la enzima de restricción Dpnl. Tras la purificación en gel del producto de PCR, los extremos romos se ligaron para obtener un plásmido circulado que se transformó en células de E. coli competentes. Tras la incubación hasta el día siguiente se seleccionaron varias colonias, el ADN plasmídico se aisló y secuenció para confirmar que la mutación había sido incorporada.

Tabla 2: Variantes de anticuerpos generadas de un anticuerpo anti-TNFa (numeración europea)

Ejemplo 1. Afinidad a TNFa

Procedimiento:

La afinidad con TNFa fue medida por Biacore. Se preparó un chip de CM5 utilizando procedimientos estándar de inmovilización de aminas Biacore. Tras la inserción de un chip de CM5, el sistema se cebó y luego se normalizó con una solución de normalización BIA (Biacore Preventative Maintenance Kit 2). El chip se añadió al sistema con tampón de funcionamiento de Tween-20 (PBS-T) tamponado con fosfato salino; antes de la inmovilización, la superficie del chip se cebó con tres inyecciones de NaOH de 50 mm. La proteína A se inmovilizó en la superficie del chip. Para esto, la proteína se diluyó a 5 pg/ml en tampón de acetato de 10 mm a pH 4,5 y se inyectó para generar una respuesta unida de -1000 RU en las 4 células de flujo. Para eliminar material no covalente de todas las celdas de flujo del chip, se realizaron tres lavados NaOH de 15 segundos y 50 mm. En el chip de proteína A, el anticuerpo se capturó en las células de flujo 2 y 4, con las células de flujo 1 y 3 utilizadas para la sustracción de referencia. Los anticuerpos de ensayo se diluyeron en PBS-T a 10 Nm y se inyectaron 2,5-7,5 UL para obtener 120 RU de anticuerpo capturado. El analito TNFa se preparó a 500 pg/ml en agua, según lo señalado por el proveedor, y se diluyó aún más en el tampón de funcionamiento PBS-T. Se utilizó cinética de ciclo único para estimar la afinidad de estado estable. Para cada ciclo de análisis de un solo ciclo se inyectó una valoración de 5 concentraciones de analitos sobre el ligando y luego se midió la disociación del complejo. La superficie fue regenerada usando glicina pH 1,7. Se utilizó un procedimiento de doble referencia en el que los datos de la superficie de captura enlazada al ligando (fc 2 y 4) se restaron de las superficies de referencia en las que no se capturó ningún ligando (fc 1 y 3 respectivamente). Las inyecciones en blanco de tampón se ejecutaron cada 3-4 ciclos y, a continuación, se restaron de los ciclos de inyección del analito para corregir pequeños cambios en la superficie de captura del ligando. Se utilizaron inyecciones repetidas de analito al inicio y al final de cada análisis para comprobar la degradación de la muestra o los cambios en el rendimiento del instrumento. Todos los análisis se realizaron a 25 °C y la gradilla de muestras se incubó a 10 °C durante las pruebas experimentales. Cada experimento se ejecutó al menos tres veces. Se utilizó un modelo de unión de 1 a 1 para ajustarse a los datos cinéticos resultantes.

Resultados:

Todos los anticuerpos mostraron una cinética de unión similar a TNFa, lo que indica que cualquier modificación introducida no había llevado a cambios significativos en la región de unión del antígeno.

Tabla 3: Cinética de unión de variantes humanas IgG1 a TNFa según lo determinado por SPR

Ejemplo 2. Potencia

Procedimiento:

Se incubaron células L929 con 0,25 ng/ml de TNFa y 1 pg/pocillo de actinomicina D en presencia de diluciones seriadas de variantes de anticuerpos anti-TNFa. Tras la incubación durante 20 h a CO² 37°C/5%, las respuestas proliferativas se midieron mediante MTS (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenilo)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio y un reactivo de acoplamiento de electrones (fenetosulfato, PES). EL MTS se convirtió en producto formazano por enzimas deshidrogenasas presentes en células metabólicamente activas. La cantidad de producto formazán medida por absorbancia a 492 nm fue directamente proporcional al número de células vivas en cultivo.

Resultados:

Los resultados se muestran en la Figura 1. La introducción de mutaciones en la región Fc del anticuerpo anti-TNFa no afectó la potencia.

Ejemplo 3. Afinidad a los receptores F^cy (CD16a, CD16b)

Procedimiento:

La afinidad con FcyR fue medida por Biacore. Se preparó un chip de CM5 utilizando procedimientos estándar de inmovilización de aminas Biacore. Tras la inserción de un chip de CM5, el sistema se cebó y luego se normalizó con una solución de normalización BIA (Biacore Preventative Maintenance Kit 2). El chip se añadió al sistema con tampón de funcionamiento PBS-T; antes de la inmovilización, la superficie del chip se cebó con tres inyecciones de NaOH de 50 mm. Los FcyR fueron inmovilizados en la superficie de la viruta utilizando un sistema de captura His-tag. El chip anti-His fue preparado de acuerdo con las instrucciones del kit Biacore, con -12000 RU del anticuerpo depositado en las 4 células de flujo. Para eliminar el material no covalente de todas las células de flujo de chip, se realizaron tres lavados de glicina de 1,5 segundos y 10 mm de pH 30. Los receptores Fcy se diluyeron en PBS-T a un rango de 0.5­ 2 |jg/ml, con 2,5-5,0 jL inyectados en el chip generando niveles de captura entre 60 y 200 RU. Los anticuerpos se diluyeron en PBS-T antes del análisis. Se utilizó cinética de ciclo único para estimar la afinidad de estado estable. Para cada ciclo de análisis de un solo ciclo se inyectó una valoración de 5 concentraciones de anticuerpos sobre el ligando FcyR y luego se midió la disociación del complejo. La superficie se regeneró utilizando la solución recomendada, glicina de 1,5 mm de pH 10 para la superficie de captura anti-HIS. Se utilizó un procedimiento de doble referencia en el que los datos de la superficie de captura enlazada al ligando (fc 2 y 4) se restaron de las superficies de referencia en las que no se capturó ningún ligando (fc 1 y 3 respectivamente). Se realizaron inyecciones en blanco de tampón para cada ciclo de valoración de anticuerpos y, a continuación, se restaron de los ciclos de inyección de analito para corregir pequeños cambios en la superficie de captura del ligando. Todos los análisis se realizaron a 25 °C y la gradilla de muestras se incubó a 10 °C durante las pruebas experimentales. Cada experimento se ejecutó al menos tres veces.

Resultados:

La introducción de las mutaciones no afectó la afinidad a CD16a(V), CD16a(F) y CD16b. Sin embargo, algunas variantes de anticuerpos mostraron un aumento de la unión a CD16a. Especialmente Ab-A-DLE-PVAAG tuvo una mejor unión al receptor de baja afinidad CD16a y a CD16b.

Tabla 4: Afinidad a los receptores Fcy CD16a(V), CD16a(F) y CD16b según lo determinado por SPR. Se muestra la afinidad de desviación media y estándar calculada a partir de dos o más experimentos independientes.

Ejemplo 4. Afinidad con FcRn

Procedimiento:

SPR se realizó utilizando un instrumento Biacore 3000 con chips de sensor CM5 acoplados con anticuerpos anti-TNFa IgG1 (-500 unidades de resonancia (RU)) utilizando química de acoplamiento de aminas, tal como lo describe el fabricante. El acoplamiento se realizó inyectando 2,0 ug/ml de cada proteína en acetato de sodio de 10 mm, pH 4,5, utilizando el kit de acoplamiento de aminas (GE Healthcare). Se utilizó tampón HBS-P pH 7,4 (HEPES 10 mm, NaCl 150 mm, tensioactivo 0,005% P20) o tampón fosfato pH 6,0 (tampón fosfato 67 Nm, NaCl 150 mm, Tween 200,005%) como tampón de dilución y de funcionamiento. La cinética de unión se determinó inyectando cantidades tituladas (1000 - 31,2 Nm) de FcRn humano (hFcRn) marcado con His monomérico sobre anticuerpos inmovilizados a pH 7,4 o pH 6,0. Todos los experimentos de SPR se realizaron a 25°C con un caudal de 40 ul/min Los datos de enlace se ajustaron a cero y se restó el valor de la celda de referencia. Para determinar la cinética de enlace se utilizó el modelo de enlace de ligando Langmuir 1:1 proporcionado por el software BIAevaluation (versión 4.1).

Resultados:

Los resultados mostraron que el anticuerpo de tipo silvestre Ab-wt se une estrictamente al pH en función de hFcRn. Todas las variantes de anticuerpos diseñadas tienen una mayor afinidad con FcRn a pH 6,0, pero mantienen su dependencia del pH y no se unen al receptor a pH 7,4. Todas las variantes de anticuerpos mostraron una mejor unión a FcRn en comparación con infliximab, que contiene una región Fc de tipo silvestre IgG1.

Tabla 5: Afinidad de las variantes de anticuerpos anti-TNFa con FcRn a pH 6,0 y pH 7,4 según lo determinado por SPR

Ejemplo 5. Transcitosis

Procedimiento:

Los filtros de transpocillos (1,12 cm2) con membranas de politetrafluoroetileno (PTFE) revestidas con colágeno con un tamaño de poro de 0,4 pm se incubaron en un medio de crecimiento completo seguido de la siembra de 1,0 x 106 células T84 por pocillo. La resistencia eléctrica transepitelial (TEER) fue monitoreada diariamente usando un medidor MILLICELL-ERS-2 voltio-ohmio. Los cultivos se cultivaron durante 4 - 5 días antes de alcanzar la confluencia con un valor de TEER de -1000 - 1300 O x cm 2. Antes de los experimentos, las monocapas se privaron de alimento durante 1 horas en la solución salina equilibrada de Hank (HBSS). A continuación, se añadieron a la cámara apical Transwell 400 Nm de las variantes de anticuerpos o IFX sola o junto con 4000 Nm de IgG de mieloma humano con especificidad irrelevante. Las muestras se recogieron en el reservorio basolateral a las 0 y 4 horas después de la adición. Las concentraciones de anticuerpos en el reservorio basolateral se determinaron mediante ELISA. Brevemente, las placas Maxisorp de 96 pocillos se revisten con O/N con TNFa recombinante o un anticuerpo específico de Fc anti-humano de cabra, ambos diluidos a 1 pg/ml en PBS. Posteriormente, las placas se bloquearon con PBS que contenía 2% de leche desnatada durante 4 h a RT seguida de un lavado 4 veces con PBS que contenía 0,05% Tween 20. Las muestras recogidas durante los experimentos de transcitosis se añadieron a los pocillos e incubaron durante 2 h a TA antes del lavado, como se ha indicado anteriormente. Se detectaron variantes de anticuerpos capturados, IFX o IgG total mediante un anticuerpo específico de Fc anti-humano conjugado con fosfatasa alcalina (ALP) de cabra. La unión se visualizó añadiendo 100 pl de sustrato de ALP y se registró el espectro de absorción de 405 nm. La cantidad de variantes de anticuerpos, IFX e IgG total transportadas se calcularon a partir de curvas estándar de cada una de las variantes de anticuerpos individuales.

Transcitosis de variantes de anticuerpos a través de células epiteliales humanas polarizadas

Resultados:

Se analizaron las variantes de anticuerpos anti-TNFa diseñadas para detectar transcitosis en una monocapa celular y se compararon con el anticuerpo wt o IFX como otro anticuerpo anti-TNFa IgG1 humano. Los resultados se muestran en la Figura 2. El anticuerpo anti-TNFa wt fue transportado desde el apical al reservorio basolateral. Del panel de anticuerpos de las variantes diseñadas para mejorar la unión a FcRn, se demostró que se liberaba algo más de Ab-YTE-DLE-PVAAG en el lado basolateral en comparación con Ab-wt. En comparación con IFX, otro anticuerpo de IgG1 con una región de Fc de Wt, Ab-A-DLE-PVAAG se transportó 1,8 veces más eficientemente.

Transcitosis de variantes de anticuerpos a través de células epiteliales humanas polarizadas en La presencia de IgG competidora

Resultados:

La cantidad total de inmunoglobulina transportada a través de una monocapa polarizada de T84 células desde el apical hasta el reservorio basolateral cuando las variantes de anticuerpos anti-TNFa se incubaron con un exceso de 10 veces de IgG de mieloma humano a las 4 horas posteriores a la adición fue comparable para todos los anticuerpos. Sin embargo, una mayor afinidad con FcRn a pH 6,0 dio lugar a un porcentaje significativamente mayor de transporte anti-TNFa específico a través de la monocapa celular también en presencia de un exceso de IgG humana competidora con especificidad irrelevante. Los resultados se muestran en la Figura 3.

Ejemplo 6. ADCC

Procedimiento:

Se utilizó un kit básico de bioensayo de reportero de ADCC de Promega. Brevemente, mTNFa las células objetivo CHO-K1 a 1 x 105/ml se sembraron en placas de cultivo de tejidos blancas (fondo transparente), de 100 pL por pocillo. Las placas se incubaron O/N a CO²37°C/5%. El día 2, se retiraron 95 pL del medio de ensayo y se reemplazaron por 25 pL de células efectoras de Jurkat a 3 x 106/ml. A continuación, las placas se incubaron durante 6 h a CO²37°C/5%. El reactivo BioGlo™ se preparó hacia el final de la incubación. Las placas se equilibraron a TA durante 10 - 20 min antes de añadir 75 pL de reactivo BioGlo™ por pocillo. Después de 5 a 10 minutos de incubación en la oscuridad, se midió la luminiscencia. Se utilizó un modelo 4-PL para ajustar los datos.

Resultados:

Los resultados (véase la Figura 4) mostraron que todos los anticuerpos anti-TNFa inducían ADCC pero con distintas fuerzas. En comparación con el anticuerpo tipo silvestre Ab-wt, Ab-A-AEA-PVAAG mostró una actividad similar de la ADCC, mientras que las otras variantes de anticuerpos mostraron un aumento de la ADCC. Específicamente Ab-A-DLE-PVAAG había mejorado significativamente la ADCC.

Ejemplo 7. Inducción de macrófagos reguladores

Procedimiento:

Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se aislaron de capas de leucoplaquetarias de donantes sanos. Las células se aislaron mediante centrifugación en gradiente de Ficoll. Las células de dos donantes individuales fueron mezcladas en igual número y 2 x 10⁵ células de la mezcla fueron laminadas en placas de 96 pocillos en un volumen total de 100 pL/pocillo. Las células se incubaron durante 48 h a CO²37°C/5%. Después de 48 h, se añadieron variantes de anticuerpos anti-TNFa o IFX para alcanzar una concentración final de 10 pg/ml. Cada compuesto fue agregado en réplicas de cinco o seis. El volumen final fue de 150 pL/pocillo. Se utilizó como control el suero humano IgG1 (Sigma #15154). Después de la adición de los compuestos, se cultivaron reacciones linfocitarias mixtas (MLRS) durante otros 4 días a 37°C/5% CO². Posteriormente, las placas se lavaron con PBS/EDTA de 5 mm (PBS/EDTA) e incubaron con PBS/ EDTA de 50 pL/pocillo durante 20 min a TA. Las placas se centrifugaron y el líquido se salió. El anticuerpo se diluyó en PBS/EDTA (anti-CD14-PE, anti-CD206-APC, ambos diluidos 1:10). Las células se resuspendieron en 50 pL de solución de anticuerpo e incubaron durante 20 min a TA. Después, las células se lavaron con PBS/EDTA y se resuspendieron en 50 pL de PBS/EDTA. Las muestras teñidas se analizaron en una FACS Fortessa utilizando el software FACSDiva. El análisis se realizó con el software FlowJo.

Resultados:

La inducción de macrófagos reguladores fue analizada en cuatro MLR independientes y tuvo éxito en todos los experimentos (comparando IFX con control de IgG). Los resultados se muestran en la Figura 5. Los niveles de inducción por IFX pueden diferir entre experimentos debido al hecho de que cada experimento fue realizado utilizando diferentes donantes con variación interindividual. Todas las variantes de anticuerpos anti-TNFa probadas indujeron macrófagos CD14+CD206+reguladores con ligera variación entre los compuestos. AB-A-DLE-PVAAG indujo más macrófagos reguladores que IFX.

Ejemplo 8. Inhibición de la proliferación de células T.

Procedimiento:

Los PBMC fueron aislados de capas leucoplaquetarias de donantes sanos. Las células se aislaron mediante centrifugación en gradiente de Ficoll. Las células de dos donantes individuales fueron mezcladas en igual número y 2 x 105células de la mezcla fueron laminadas en placas de 96 pocillos en un volumen total de 100 pL/pocillo. Las células se incubaron durante 48 h aCO²37°C/5%. Después de 48 h, se añadieron variantes de anticuerpos anti-TNFa o IFX para alcanzar una concentración final de 10 pg/ml. Cada compuesto fue añadido en réplicas de cinco o seis. El volumen final fue de 150 pL/pocillo. Se utilizó como control el suero humano IgG1 (Sigma # i5154). Después de la adición de los compuestos, se cultivaron reacciones linfocitarias mixtas (MLRS) durante otros 2 días a CO² 37°C/5%. Posteriormente, se añadió timidina tritiada (timidina 3 H, 0,5 microCurie/pocillo) a los cultivos. Los cultivos se incubaron durante 18 h a CO² 37°C/5%. Las muestras se recolectaron utilizando una cosechadora de 96 células Filtermat Microbeta y se analizaron utilizando un Microbeta MicroplateCounter equipado con un único detector. Las muestras se recontaron durante 10 segundos/pocillo y se convirtieron en recuentos por minuto (cpm).

Resultados:

La inhibición de la proliferación de células T se midió en tres MLRS independientes y se definió como exitosa si IFX como deleción indujo control positivo. Los niveles de deleción por IFX en experimentos individuales pueden diferir presumiblemente debido a la varianza en la inducción regulatoria de macrófagos. En cada experimento, se calculó el potencial de las variantes de anticuerpos anti-TNFa para suprimir la proliferación de células T en relación con el control positivo IFX. El anticuerpo Ab-A-DLE-PVAAG mostró una deleción significativamente mejorada en comparación con IFX, mientras que la deleción con Ab-YTE-DLE-PVAAG fue comparable con IFX (véase la Figura 6).

Ejemplo 9. Estabilidad de proteasa

Procedimientos:

El análisis se realizó en condiciones de reducción y no reducción. El tampón de muestra correspondiente del kit de reactivos PerkinElmer Protein Express con y sin el agente reductor DTT se utilizó para apagar la reacción (es decir, como reactivos de parada).

Para poder diferenciar entre las variantes, se seleccionó la cantidad de proteasa por IgG de la siguiente manera que los perfiles de tiempo de degradación se podían obtener en entre 30 horas. El análisis se realizó utilizando el sistema de electroforesis basado en microchip.

Digestión de IdeS

Para preparar la solución de trabajo (ws), se reconstituyó una alícuota de IdeS en 100 pL de agua Milli-Q. Los IdeS ws y las muestras se combinaron en una relación de 1:1 (v/v) y se homogeneizaron exhaustivamente. La solución se incubó a 37 °C, las muestras se extrajeron después de 5, 10, 30 y 60 minutos y se apagaron con uno de los reactivos de parada. Relación molar de proteasa/IgG: 4:1.

Digestión de GluC

Para preparar la solución de trabajo (ws), el caldo GluC se diluyó con 2X tampón de reacción GluC a una concentración de 50 pg/ml. GluC ws y las muestras se combinaron en una relación de 1:1 (v/v) y se homogeneizaron exhaustivamente. La solución se incubó a 37 °C, las muestras se extrajeron después de 2, 6, 24 y 30 horas y se apagaron con uno de los reactivos de parada. Relación molar de IgG/proteasa: 4:1.

Digestión MMP-3

La solución madre de quimotripsina se diluyó con el tampón de ensayo MMP a 50 pg/ml. MMP-3 A 0,186 mg/ml se picó con la quimotripsina diluida en una relación de 1:1 (v/v) e incubó a 37 °C durante 30 minutos. La activación se detuvo con PMSF en una concentración final de 2 mm. Para preparar la solución de trabajo (ws), el MMP-3 activado se diluyó en el tampón de ensayo MMP a 3,72 pg/ml.

MMP-3 ws y las muestras se combinaron en una proporción de 1:1 (v/v) y se homogeneizaron exhaustivamente. La solución se incubó a 37 °C, las muestras se extrajeron después de 2, 6, 24 y 30 horas y se apagaron con uno de los reactivos de parada. Relación molar de IgG/proteasa: 98:1.

Resultados:

Las variantes de anticuerpos probadas mostraron una excelente resistencia a la degradación proteolítica por MMP-3 e IdeS, y una buena resistencia a la degradación por GluC (véanse las Figuras 7-9).

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo IgGi que comprende un dominio de unión a TNFa y un sitio de unión a FcRn, en el que la secuencia de aminoácidos del anticuerpo comprende, con referencia al sistema de numeración de la UE,

(i) los aminoácidos 233P, 234V, 235A, y una deleción en la posición del aminoácido 236;

(ii) el aminoácido 434A o los aminoácidos 252Y, 254T y 256E; y

(iii) los aminoácidos 239D, 330L y 332E;

en una región Fc de una IgG humana; y en el que el anticuerpo comprende (i) un dominio Vl que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NÚM.:10, y (ii) un dominio Vh que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NÚM.:9.

2. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que la secuencia de aminoácidos del anticuerpo comprende los aminoácidos 233P, 234V, 235A, 239D, 330L, 332E y 434A, y una deleción en la posición del aminoácido 236.

3. El anticuerpo de la reivindicación 1, en el que la secuencia de aminoácidos del anticuerpo comprende los aminoácidos 233P, 234V, 235A, 239D, 330L, 332E, 252Y, 254T y 256E, y una deleción en la posición del aminoácido 236.

4. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que se transporta a través de una monocapa celular polarizada del lado apical al lado basolateral en mayor cantidad que un anticuerpo de control que comprende una cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NÚM.:1 y una cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en la SEQ ID NÚM.:2.

5. Un ácido nucleico que codifica el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

6. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para uso en el tratamiento de una afección inflamatoria.

7. El anticuerpo para uso de acuerdo con la reivindicación 6, en el que la afección inflamatoria es un trastorno inflamatorio del tracto gastrointestinal.

8. El anticuerpo para uso de acuerdo con la reivindicación 6, en el que dicho tratamiento comprende administrar oralmente una cantidad efectiva de dicho anticuerpo.

9. El anticuerpo para uso de acuerdo con la reivindicación 6, en el que dicho anticuerpo se aplica tópicamente.

10. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.