ES2874090T3 - Métodos y sistemas para el endurecimiento de tejidos para un procesamiento mejorado - Google Patents
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Abstract
Un método para producir un dispositivo para el tratamiento de heridas, que comprende: seleccionar un tejido; poner en contacto el tejido con una solución que comprende un ácido a una concentración seleccionada para producir un nivel deseado de endurecimiento de uno o más componentes en el tejido y en donde la solución no provoca una desnaturalización irreversible sustancial de uno o más componentes en el tejido; y mecanizar el tejido endurecido para crear una forma alargada.
Description
DESCRIPCIÓN
Métodos y sistemas para el endurecimiento de tejidos para un procesamiento mejorado
Esta solicitud reivindica el beneficio de la fecha de presentación bajo la 35 U.S.C. §119(e), de la solicitud provisional de los Estados Unidos Núm. 62/266,221, presentada el 11 de diciembre de 2015.
La presente divulgación se refiere en general a un método para producir un dispositivo para el tratamiento de heridas, en particular para tratar heridas profundas o tunelizadas, incluidas las fístulas.
Las heridas profundas, incluidas las fístulas y las heridas tunelizadas, pueden ser difíciles de tratar y pueden requerir el uso de rellenos especializados o tapones, incluidos tapones sintéticos y materiales inyectables a base de colágeno. Los dispositivos sintéticos, aunque eficaces, no regeneran el tejido natural y pueden requerir la presencia de un cuerpo extraño a relativamente largo plazo, mientras que los materiales inyectables pueden reabsorberse prematuramente o migrar desde el sitio de tratamiento objetivo.
Aunque actualmente se encuentran disponibles un número de productos de matriz de tejido acelular, mecanizar o procesar esos materiales para producir nuevas formas puede ser un desafío. Por ejemplo, estos tejidos son a menudo blandos y flexibles, lo que dificulta el corte, el cizallamiento, el taladrado o el mecanizado de otro modo. Por tanto, se necesitan métodos mejorados de preparación y procesamiento de tejidos.
Por consiguiente, la presente divulgación proporciona métodos para alterar productos de matriz de tejido que facilitan el procesamiento y el mecanizado. Los métodos se pueden utilizar para producir dispositivos que se adaptan a una variedad de formas y tamaños para llenar completamente un espacio de herida o fístula. Los métodos pueden proporcionar además o alternativamente medios para producir dispositivos que son más uniformes, de mayor calidad, y/o tienen respuestas biológicas mejoradas cuando se implantan in vivo. Los dispositivos y métodos mejorados pueden permitir el tratamiento de heridas profundas, con tunelización y/o fístulas.
Se presenta un método para producir un dispositivo para el tratamiento de heridas de acuerdo con varias modalidades. El método puede incluir seleccionar un tejido y poner en contacto el tejido con una solución que comprende un ácido a una concentración seleccionada para producir un nivel deseado de endurecimiento de uno o más componentes en el tejido, por lo que la solución no provoca una desnaturalización irreversible sustancial del uno o más componentes en el tejido. El método también incluye mecanizar el tejido endurecido para producir un tamaño y forma deseados.
Se presenta un dispositivo para el tratamiento de heridas producido mediante un proceso de acuerdo con varias modalidades de la presente invención. El proceso de producción del dispositivo para el tratamiento de heridas puede incluir seleccionar un tejido y poner en contacto el tejido con una solución que comprende un ácido a una concentración seleccionada para producir un nivel deseado de endurecimiento de uno o más componentes en el tejido, por lo que la solución no causa una desnaturalización irreversible sustancial del uno o más componentes en el tejido. El proceso de producción del dispositivo para el tratamiento de heridas también incluye mecanizar el tejido endurecido para producir el dispositivo para el tratamiento de heridas con la configuración deseada.
Se presenta un método para producir un dispositivo para el tratamiento de heridas de acuerdo con varias modalidades de la presente invención. El método puede comprender seleccionar un tejido; poner en contacto el tejido con un fluido que comprende un ácido a una concentración seleccionada para producir un nivel deseado de endurecimiento de uno o más componentes en el tejido; mecanizar el tejido endurecido para producir un tamaño y forma deseados; y tratar el tejido con una enzima.
Se describe un dispositivo para tratar una fístula. El dispositivo puede comprender una composición de matriz de tejido alargada, en donde la composición de matriz de tejido comprende una matriz de tejido acelular que se forma a partir de un tejido que se trató con un ácido para endurecer el tejido y se trató con una proteasa para remover los materiales inmunogénicos de la matriz de tejido.
Breve Descripción de los Dibujos
La Figura 1 representa un proceso para producir un producto tisular de acuerdo con varias modalidades.
La Figura 2 representa un método para tratar una fístula anal con el empleo de dispositivos producidos por los métodos descritos.
La Figura 3 representa un proceso para producir un producto tisular de acuerdo con varias modalidades.
La Figura 4 incluye secciones de tejido teñidas con hematoxilina y eosina de implantes subcutáneos de tejido procesado de rata con el empleo de endurecimiento ácido (izquierda) o endurecimiento ácido seguido de tratamiento enzimático, como se discutió en el Ejemplo 1.
La Figura 5 ilustra un proceso para la producción de una fístula madura en una rata, como se discutió en el Ejemplo 2. La lesión aguda por aguja se crea desde la cara perianal hasta el canal anal, y se coloca una sutura de alambre en el sitio durante cuatro semanas para permitir la creación de un tracto maduro similar a una fístula. Se retira el alambre, se realiza un desbridamiento ligero en el tracto, y se insertan los materiales de prueba y se suturan en su lugar para realizar la prueba.
La Figura 6 ilustra explantes macroscópicos del modelo de fístula anal discutido en el Ejemplo 2, que incluye dos materiales de implante producidos de acuerdo con los métodos descritos en la presente (dos imágenes de la izquierda) y un implante con el empleo del producto COOK@ BIODESIGN.
La Figura 7 incluye secciones de tejido teñidas con hematoxilina y eosina del modelo de fístula anal discutido en el Ejemplo 2, que incluye materiales producidos de acuerdo con los métodos descritos en la presente (imágenes superiores) y materiales con el empleo del producto COOK@ BIODESIGN.
Descripción de las modalidades ilustrativas
Ahora se hará referencia en detalle a varias modalidades de los dispositivos y métodos divulgados, ejemplos de las cuales se ilustran en los dibujos adjuntos. Siempre que sea posible, se usarán los mismos números de referencia en todos los dibujos para referirse a las mismas partes o a partes similares.
En esta solicitud, el uso del singular incluye el plural a menos que se indique específicamente lo contrario. En esta solicitud, el uso de "o" significa "y/o" a menos que se indique lo contrario. Además, el uso del término "que incluye", así como también otras formas, tales como "incluye" e "incluido", no es limitante. Se entenderá que cualquier intervalo descrito en la presente descripción incluye los puntos finales y todos los valores entre los puntos finales. Los títulos de las secciones que se usan en la presente descripción son solo para fines organizativos y no deben interpretarse como limitantes de la materia objeto descrita.
Se encuentran disponibles varios productos tisulares para el tratamiento de los tejidos duros y/o blandos. Dichos productos tisulares pueden incluir tejidos procesados que se trataron para remover algunos o todos los componentes celulares y/u otros materiales (por ejemplo, antígenos y lípidos). Dichos productos tisulares se pueden usar para el tratamiento, reparación, regeneración y/o aumento de una variedad de tejidos diferentes. Por ejemplo, se pueden usar matrices de tejido acelular para reemplazar tejido blando perdido o dañado debido a, por ejemplo, cirugía, traumatismo, enfermedad y/o atrofia.
Las matrices de tejido actuales u otros materiales de reemplazo o sostén de tejido (por ejemplo, colágeno procesado o materiales sintéticos) están disponibles en una variedad de formas diferentes. Por ejemplo, STRATTICE™ y ALLODERM® (Corporación LIFECELL®, Branchburg, N.J.) son dos productos de matriz de tejido dérmico acelular que se venden como láminas. Además, CYMETRA® (también de LIFECELL®) es una matriz dérmica acelular seca y particulada, que se produce mediante la criofractura de la dermis acelular. Cada uno de estos materiales se pueden usar para tratar varios sitios anatómicos. STRATTICE™ y ALLODERM® se pueden usar para el aumento de tejidos blandos, por ejemplo, para tratar defectos de la pared abdominal; y CYMETRA® se puede inyectar para el aumento de tejidos blandos.
Aunque las matrices de tejidos actualmente disponibles son adecuadas para el tratamiento de ciertos sitios anatómicos, dichos materiales pueden no ser adecuados para algunas aplicaciones. Por ejemplo, las heridas profundas requieren una matriz de tejido que sea lo suficientemente larga para llenar toda la herida sin dejar huecos o áreas sin rellenar. La producción de matrices de tejidos con las dimensiones y formas adecuadas (con longitudes del orden de varios centímetros o más, aunque quizás con un ancho estrecho) puede ser un desafío porque el tejido precursor es a menudo flexible o maleable y no se presta fácilmente al mecanizado, corte, cizallamiento, taladrado u otras técnicas de mecanizado. Por consiguiente, la presente divulgación proporciona un método de tratamiento de un tejido para endurecer el tejido antes de mecanizar o cortar. Los productos de tejido resultante producidos por los métodos descritos en la presente descripción se pueden usar para rellenar defectos de tejido que tienen geometrías profundas, variables y/o irregulares. Además, los productos de tejidos de la presente divulgación pueden proporcionar configuraciones adecuadas para permitir el crecimiento celular y la formación vascular internos.
La presente divulgación se refiere en general a dispositivos y métodos para endurecer tejidos o matrices de tejidos. Los tejidos o las matrices de tejidos endurecidos resultantes pueden procesarse adicionalmente para crear dispositivos para el tratamiento de heridas para tratar heridas profundas o tunelizadas. Tales heridas pueden incluir, por ejemplo, heridas tunelizadas que se forman en la piel (por ejemplo, en las extremidades), y pueden extenderse a través de los tejidos subcutáneos, por ejemplo, a través de la fascia, el músculo y/o el hueso. Tales heridas pueden asociarse con traumatismos, cirugías, infecciones y/o una variedad de enfermedades diferentes (por ejemplo, trastornos vasculares y/o diabetes). Además, para los propósitos de la presente solicitud, se entenderá que las "heridas" profundas o tunelizadas incluyen fístulas u otras malformaciones anatómicas/estructurales, incluidas fístulas anales, fístulas recto-vaginales, fístulas recto-anales, fístulas relacionadas con estructuras urinarias, y cualquier otra abertura o espacio anatómico anormal que deseablemente se cerraría por medios quirúrgicos o no
quirúrgicos.
Los dispositivos y métodos descritos en la presente descripción pueden incluir o permitir la producción de un tejido o una matriz de tejido endurecido que puede tolerar mejor las técnicas de mecanizado y manipulación, diseñadas para crear dispositivos para el tratamiento de heridas. Los dispositivos para el tratamiento de heridas resultantes pueden proporcionar una serie de mejoras sobre los materiales existentes usados para reparar o tratar de otro modo heridas de tunelización y fístulas. Por ejemplo, los dispositivos descritos en la presente descripción pueden estar formados por materiales regenerativos, por ejemplo, matrices de tejido acelular regenerativo que favorecen el crecimiento de las células circundantes y la regeneración del tejido. En algunos casos, los materiales se seleccionan para permitir la formación de tejido que es similar al tejido que se produce naturalmente y tiene una formación de cicatriz limitada o nula.
Los métodos y dispositivos descritos en la presente descripción pueden adaptar mejor el tamaño y la forma de un dispositivo para el tratamiento de heridas resultante a una herida en particular. Por ejemplo, los dispositivos descritos en la presente descripción pueden incluir tejido endurecido que está configurado de tal manera que se puede adaptar fácilmente a la forma y el tamaño deseados, incluida la longitud, el ancho, y la curvatura de un dispositivo para el tratamiento de heridas resultante para llenar de manera completa o casi completa una herida, incluido el relleno de heridas largas o tortuosas, como fístulas.
La Figura 1 ilustra un proceso para producir un dispositivo para el tratamiento de heridas de acuerdo con varias modalidades. Como se muestra en la etapa 102, el proceso comienza con la selección de un tejido 100. Los tejidos adecuados pueden incluir cualquier tejido humano o animal que pueda formarse en una matriz de tejido sustancialmente acelular que conserve la capacidad de soportar el crecimiento celular y la regeneración de tejido sin una inflamación excesiva. Por ejemplo, los tejidos adecuados incluyen, pero no se limitan a, tejido dérmico, tejido adiposo, tejido dérmico de transición, fascia, tejido pericárdico, duramadre, tejido del cordón umbilical, cartílago, tendón, reticulado, tejido placentario, tejido de la válvula cardíaca, tejido del ligamento, tejido del tendón, tejido arterial, tejido venoso, tejido conectivo neural, tejido de la vejiga urinaria, tejido del uréter, submucosa del intestino delgado u otros tejidos que contienen un alto contenido de colágeno. La fuente del tejido puede ser humana o de mamíferos no humanos tales como, por ejemplo, pero sin limitarse a, cerdos. El tejido adecuado puede incluir tejidos intactos o tejidos que se han descelularizado parcialmente o poblados con células exógenas.
A continuación, como se muestra en la etapa 104, el tejido 100 se procesa mediante inmersión o contacto de otro modo con una solución 101. La inmersión del tejido 100 puede incluir una inmersión total en donde todo el tejido se sumerge en la solución 101 o una inmersión parcial en donde solo se sumerge una parte del tejido. Además, la solución puede rociarse o aplicarse de otro modo al tejido siempre que una cantidad suficiente de la solución entre en contacto con el tejido para producir el endurecimiento deseado. Cabe señalar que la "solución" puede no incluir componentes 100% disueltos, pero en general se entenderá que incluye un fluido en el que se puede sumergir el tejido.
La solución 101 incluye componentes ácidos. Los componentes ácidos de la solución 101 pueden incluir, pero no se limitan a, ácido clorhídrico, sulfúrico, carbónico, fluorhídrico, nítrico, oxálico, fosfórico, bórico, cítrico, málico, ascórbico, láctico, fórmico, o cualquier otro ácido que cumpla los requisitos específicos de la aplicación. En una modalidad ilustrativa, la solución 101 incluye ácido acético. La fuerza molar del ácido se puede elegir para satisfacer las necesidades de una aplicación. En una modalidad ilustrativa, la molaridad de un componente ácido de una solución es 0,1 M, pero se entenderá que la concentración puede seleccionarse en base al ácido o ácidos usados y el pH deseado. De acuerdo con varias modalidades, la fuerza molar y la composición química de la solución 101 pueden elegirse para evitar una desnaturalización irreversible sustancial de uno o más componentes en el tejido. En una modalidad, la solución 101 no provoca una desnaturalización irreversible sustancial de las fibras de colágeno. En algunas modalidades, el pH de la solución 101 está en un intervalo entre 2 y 3,5, entre 1 y 4, entre, 2 y 3, entre 2,5 y 4. En algunos casos, el pH no es inferior a 1, no es inferior a 1,5, no es inferior a 2.
Se puede entender que la desnaturalización irreversible sustancial se refiere a la desnaturalización que da como resultado propiedades biológicas no deseadas, como una infiltración celular reducida o una inflamación excesiva. Además, la desnaturalización se puede medir por un cambio excesivo en las temperaturas de inicio de la desnaturalización de la calorimetría diferencial de barrido (por ejemplo, un cambio mayor de 5 grados Celsius).
El tejido 100 puede sumergirse en la solución 101 durante los períodos y temperaturas que requieran otras limitaciones del sistema y/o propiedades deseadas del tejido. En algunas modalidades, el tejido 100 se sumerge en la solución 101 durante aproximadamente 2 a 48 horas, 2 a 72 horas, entre 2 y 24 horas, menos de 48 horas y menos de 24 horas. En varias modalidades, el tejido 100 sumergido en la solución 101 se mantiene a temperatura ambiente, o a baja temperatura (por ejemplo, frío pero no congelado). De acuerdo con varias modalidades, el tejido 100 se puede desengrasar antes de sumergirlo en la solución 101. En algunas modalidades, para la piel, "desengrasar" puede incluir la remoción de una capa de grasa subcutánea mientras se mantiene la capa dérmica y/o epidérmica.
El tejido 100 que se sumerge en la solución 101 puede experimentar un grado variable de hinchazón en
dependencia de las propiedades estructurales del tejido 100. Las propiedades estructurales incluyen, pero no se limitan a, densidad de colágeno e intercalado de grasas. En algunas modalidades, las regiones firmes de un tejido 100 pueden hincharse en menor grado que las regiones maleables. El aumento de la hinchazón de las regiones maleables del tejido 100 puede conducir a una región mecánicamente más débil del tejido 100 que puede ser difícil de manipular en dependencia de la aplicación. Por tanto, la hinchazón concomitante de un tejido 100 que puede ocurrir cuando se sumerge en una solución 101 no es tan ventajosa como el cambio en las propiedades de endurecimiento del tejido 100. En algunas modalidades, el tejido endurecido resultante 100 puede tener un valor de módulo de Young en el intervalo de 100 a 3000 MPa. El tejido endurecido 100 puede doblarse bajo fuerza pero puede tener un nivel de elasticidad que haga que la forma se recupere lentamente.
A continuación, como se muestra en la etapa 106, el tejido endurecido 100 se mecaniza para producir uno o más dispositivos para el tratamiento de heridas 110. El mecanizado o proceso de mecanizado puede incluir, pero no se limita a, taladrado, perforado, corte, rebanado, mecanizado, punzonado, troceado o cualquier otra técnica de mecanizado que cumpla con los requisitos específicos de la aplicación. El tejido 100 se puede dividir en piezas más pequeñas antes del mecanizado. En algunas modalidades, el tejido 100 se puede cortar inicialmente en secciones (por ejemplo, secciones de 10 x 10 cm u otros tamaños apropiados en dependencia del tejido de origen y la escala de producción) en preparación para el mecanizado adicional. El tejido endurecido 100 se puede montar de una manera que mejore la mecanizabilidad, como en una plantilla. Además, el proceso de mecanizado puede continuar a lo largo de cualquier eje direccional del tejido 100 o en cualquier orientación. En una modalidad ilustrativa, el tejido endurecido 100 puede perforarse con el empleo de un taladro hueco a lo largo de un eje paralelo a la superficie del tejido 100 (es decir, un eje transversal). Si el tejido endurecido 100 es tejido dérmico, el tejido 100 se puede mecanizar a lo largo de un eje paralelo a la interfaz dermo-epidérmica, o en una dirección análoga si se ha removido la epidermis. El mecanizado o proceso de mecanizado puede ser completamente manual o puede incluir etapas automatizadas, como el uso de una máquina habilitada de Control Numérico por Computadora (CNC). Si el proceso de mecanizado utiliza un taladro u otro elemento giratorio, el proceso puede usar más de una velocidad de rotación para que el elemento giratorio optimice la forma, textura, o cualquier otra característica del dispositivo para el tratamiento de heridas 110 resultante.
El(Los) dispositivo(s) 110 para el tratamiento de heridas se pueden crear en una variedad de tamaños y formas. Como ejemplo no limitante, los dispositivos para el tratamiento de heridas 110 pueden ser cilíndricos o de tipo cilíndrico con una sección transversal sustancialmente circular u ovalada y una longitud. Se entenderá que cilíndrico y de tipo cilíndrico se refieren a cualquier forma que se parezca a un cilindro, pero que no necesariamente satisfaga la definición matemática de un cilindro. Un dispositivo de este tipo puede ser generalmente una estructura similar a un tubo alargado y no necesita ser perfectamente simétrico en sección transversal. En algunas modalidades, el cilindro puede tener un ancho (o para dispositivos circulares, un diámetro de la sección transversal circular) en un intervalo de 1 a 5 mm, de 1 mm a 1 cm, de 1 mm a 2 cm. En ciertas modalidades, al menos una de las dimensiones de un dispositivo para el tratamiento de heridas puede ser superior a 1 centímetro, superior a 3 centímetros o superior a 5 centímetros de longitud, entre 1 y 20 cm, 1 y 10 cm, 5 y 15 cm, 2 y 15 cm, o 2 y 10 cm. En algunas modalidades, un dispositivo para el tratamiento de heridas 110 puede tener una forma sustancialmente esférica, ovoide, cúbica u otra forma poligonal tridimensional. En algunas modalidades, el dispositivo para el tratamiento de heridas 110 tal como está mecanizado puede tener un valor de módulo de Young en el intervalo de 100 y 3000 MPa.
Para algunos tejidos, las diferencias en el intercalado de la grasa del tejido y los cambios en la densidad del colágeno pueden contribuir al rizado o plegado del tejido endurecido. De acuerdo con varias modalidades, un tejido 100 que se somete a un procedimiento de endurecimiento puede restringirse mecánicamente para hacer que el tejido endurecido resultante quede sustancialmente plano. En otras modalidades, una plantilla o el propio dispositivo de mecanizado puede adaptarse para manipular un tejido que esté curvado o abultado. En algunas modalidades, la solución 101 se puede aplicar con diferentes fuerzas o durante diferentes períodos de tiempo a porciones de un tejido 100 para hacer que el tejido endurecido resultante quede sustancialmente plano.
Después que se hayan creado los dispositivos para el tratamiento de heridas 110, se les puede aplicar una o más etapas de postprocesamiento. El dispositivo para el tratamiento de heridas 110 puede someterse a una o más etapas de lavado para remover los remanentes de la solución 101. Las etapas de lavado pueden incluir poner el(los) dispositivo(s) 110 para el tratamiento de heridas en contacto con agua, soluciones tampón o lavados tales como solución salina tamponada con fosfato (PBS), o cualquier otra solución de lavado adecuada. De acuerdo con varias modalidades, lavar el dispositivo para el tratamiento de heridas 110 o el tejido endurecido 100 puede revertir los efectos de la solución 101 y devolver el tejido 100 a un estado sustancialmente similar al que tenía antes de que comenzara la inmersión (además de los cambios de forma mecanizados). Es decir, lavar el dispositivo para el tratamiento de heridas 110 o el tejido endurecido 100 puede provocar una pérdida de endurecimiento y revertir parcial o completamente el tejido 100 a su flexibilidad original. En algunas modalidades, el dispositivo 110 de tratamiento de heridas lavado puede tener un valor de módulo de Young en el intervalo de 0,1 y 1 MPa. Además, la(s) etapa(s) de lavado pueden reducir o revertir cualquier hinchazón del tejido que pueda haber ocurrido. Un dispositivo para el tratamiento de heridas 110 lavado puede ser lo suficientemente blando y/o maleable como para doblarse fácilmente por la mitad de modo que los extremos se toquen.
En algunas modalidades opcionales, el dispositivo para el tratamiento de heridas 110 o el tejido 100 pueden
someterse a una técnica de descelularización para crear una matriz de tejido sustancialmente acelular como se muestra en la etapa 108 de la Figura 1. En la etapa 108, el tejido 100 o el dispositivo para el tratamiento de heridas 110 se pone en contacto con una solución de descelularización 105 o se trata de otro modo para remover los componentes celulares. De acuerdo con varias modalidades, la descelularización del tejido 100 puede ocurrir antes de que el tejido se someta a un tratamiento de endurecimiento con ácido y se mecanice para darle forma. En otras modalidades, el(los) dispositivo(s) 110 para el tratamiento de heridas que resulta(n) del proceso de endurecimiento y mecanizado pueden someterse además al tratamiento de descelularización.
En general, las etapas involucradas en la producción de una matriz de tejido acelular incluyen la remoción de células del tejido de un donante (por ejemplo, un cadáver humano o una fuente animal) bajo condiciones que preserven la función biológica y estructural. En ciertas modalidades, el proceso incluye tratamiento químico para estabilizar el tejido 100 o el dispositivo para el tratamiento de heridas 110 y evitar la degradación bioquímica y estructural junto con o antes de la remoción de células. En varias modalidades, la solución estabilizadora detiene y previene la degradación osmótica, hipóxica, autolítica y proteolítica, protege contra la contaminación microbiana, y reduce el daño mecánico que puede ocurrir con los tejidos que contienen, por ejemplo, componentes del músculo liso (por ejemplo, vasos sanguíneos). La solución estabilizadora puede contener un tampón apropiado, uno o más antioxidantes, uno o más agentes oncóticos, uno o más antibióticos, uno o más inhibidores de proteasa, y/o uno o más relajantes del músculo liso.
El tejido 100 o el dispositivo para el tratamiento de heridas 110 se pasa luego a una solución de descelularización 105 para remover células viables (por ejemplo, células epiteliales, células endoteliales, células de músculo liso, y fibroblastos) de la matriz estructural sin dañar la integridad biológica y estructural de la matriz de colágeno. La solución de descelularización 105 puede contener un tampón apropiado, sal, un antibiótico, uno o más detergentes, uno o más agentes para evitar el entrecruzamiento, uno o más inhibidores de proteasa, y/o una o más enzimas. En algunas modalidades, la solución de descelularización 105 comprende un detergente o enzimas, o ambos. En algunas modalidades, el tejido 100 o el dispositivo para el tratamiento de heridas 110 se incuba en la solución de descelularización 105 durante la noche a 37 °C. En ciertas modalidades, los detergentes adicionales se pueden usar para remover grasa de la muestra del tejido. Alternativamente, en lugar del uso o además del uso de detergentes, se pueden usar otros procesos de descelularización, incluidos, por ejemplo, el tratamiento con ácidos, enzimas u otros procesos.
Después del proceso de descelularización, el tejido 100 o el dispositivo para el tratamiento de heridas 110 se lava a fondo con solución salina. En algunas modalidades ilustrativas, por ejemplo, cuando se usa material xenogénico, el tejido descelularizado se trata durante la noche a temperatura ambiente con una solución de desoxirribonucleasa (DNasa).
Si bien una matriz de tejido acelular puede obtenerse a partir de uno o más individuos de la misma especie como un receptor del injerto de la matriz de tejido acelular, este no es necesariamente el caso. Así, por ejemplo, una matriz de tejido acelular puede obtenerse a partir de tejido porcino e implantarse en un paciente humano. Las especies que pueden servir como receptores de la matriz de tejido acelular y donantes de tejidos u órganos para la producción de la matriz de tejido acelular incluyen, sin limitación, mamíferos, tales como seres humanos, primates no humanos (por ejemplo, monos, babuinos, o chimpancés), cerdos, vacas, caballos, cabras, ovejas, perros, gatos, conejos, cobayas, jerbos, hámsteres, ratas, o ratones.
La eliminación de los epítopos a-gal del material que contiene colágeno puede disminuir la respuesta inmunitaria del recipiente contra el material que contiene colágeno. El epítopo a-gal se expresa en mamíferos no primates y en monos del Nuevo Mundo (monos de América del Sur) así como en macromoléculas tales como los proteoglicanos de los componentes extracelulares. U. Galili et al., J. Biol. Chem. 263: 17755 (1988). Sin embargo, este epítopo está ausente en los primates del Viejo Mundo (monos de Asia y África y simios) y en los seres humanos. Id.
Dado que los mamíferos no primates (por ejemplo, los cerdos) producen epítopos a-gal, el xenotrasplante del material que contiene colágeno de estos mamíferos a los primates a menudo da como resultado un rechazo debido a la unión anti-gal de los primates a estos epítopos en el material que contiene colágeno. Por consiguiente, en algunas modalidades, cuando los animales que producen epítopos a-gal se usan como fuente de tejido, la eliminación sustancial de los epítopos a-gal de las células y de los componentes extracelulares del material que contiene colágeno, y la prevención de la re-expresión de los epítopos a-gal celulares pueden disminuir la respuesta inmunitaria a diferencia del material que contiene colágeno asociado con la unión del anticuerpo anti-gal a los epítopos a-gal.
Para remover los epítopos a-gal, después de lavar minuciosamente el tejido 100 o el dispositivo para el tratamiento de heridas 110 con solución salina, la muestra de tejido puede someterse a uno o más tratamientos enzimáticos para remover ciertos antígenos inmunogénicos, si están presentes en la muestra. En algunas modalidades, la muestra de tejido puede tratarse con una enzima a-galactosidasa para eliminar los epítopos a-gal si están presentes en el tejido. Se puede usar cualquier concentración de enzima y tampón adecuados siempre que se logre una remoción suficiente de antígenos.
Alternativamente, en lugar de tratar el tejido 100 o el dispositivo para el tratamiento de heridas 110 con enzimas, pueden seleccionarse como fuente de tejido los animales que se modificaron genéticamente para carecer de uno o más epítopos antigénicos. Por ejemplo, los animales (por ejemplo, los cerdos) que se modificaron genéticamente para carecer del residuo a-galactosa terminal pueden seleccionarse como la fuente de tejido. Para las descripciones de los animales apropiados ver la solicitud de Estados Unidos con Núm. de Serie 10/896 594 y la patente de Estados Unidos Núm. 6 166 288. Además, se describen ciertos métodos ilustrativos de procesamiento de tejidos para producir matrices acelulares con o sin cantidades reducidas de o que carecen de residuos alfa-1,3-galactosa en Xu, Hui et al., "A Porcine-Derived Acellular Dermal Scaffold that Supports Soft Tissue Regeneration: Removal of Terminal Galactose- a-(1,3)-Galactose and Retention of Matrix Structure", Tissue Engineering, Vol. 15, 1-13 (2009).
En algunos casos, el tejido se puede tratar además con una o más enzimas, incluidas las proteasas. Específicamente, el Solicitante ha descubierto que el tratamiento de tejidos, especialmente después de la exposición a condiciones tales como pH ácido, puede mejorar la respuesta biológica de los tejidos cuando se implantan posteriormente en el cuerpo. La Figura 3, por lo tanto, ilustra un proceso alternativo para producir un dispositivo para el tratamiento de heridas 110. El proceso, como se muestra, incluye además el tratamiento con una proteasa que puede mejorar la respuesta biológica del tejido cuando se implanta.
Se pueden usar un número de diferentes enzimas para tratar las matrices de tejidos. Por ejemplo, las enzimas adecuadas pueden incluir proteasas sulfidril tales como la bromelina. Además, pueden incluir bromelina, papaína, ficina, actinidina, alcalasa, tripsina o combinaciones de las mismas. Las enzimas se pueden comprar comercialmente o extraer de fuentes naturales como fuentes de frutas o mediante producción biológica.
En ciertas modalidades, la enzima es una serina proteasa de tipo subtilisina. Se pueden usar varias actividades de serina proteasa de tipo subtilisina y tiempos de tratamiento. Por ejemplo, se puede proporcionar una serina proteasa de tipo subtilisina, como ALCALASE®, en una solución a una concentración de aproximadamente 0,001 % a aproximadamente 0,1 % (v/v) con una actividad de aproximadamente 3,0 x 10-5 a aproximadamente 2,0 x 10-3 unidades/mL. Además, los tiempos de tratamiento pueden variar entre aproximadamente 15 y aproximadamente 25 horas a temperatura ambiente (por ejemplo, habitación). La actividad de una serina proteasa de tipo subtilisina, tal como ALCALASE®, se puede determinar por la cantidad de proteína caseína que la serina proteasa de tipo subtilisina, tal como ALCALASE®, puede hidrolizar. Por ejemplo, una unidad de una serina proteasa de tipo subtilisina, como ALCALASE@, es la cantidad de la serina proteasa de tipo subtilisina, como ALCALASE@, que hidroliza la caseína para producir un color equivalente a 1,0 mol de tirosina por minuto a pH 7,5 a 37 oC con el empleo de un espectrofotómetro UV a 280 nm.
La proteasa se puede aplicar a los tejidos en una variedad de soluciones adecuadas, en una variedad de concentraciones, y en una variedad de pH, como se describe en la presente descripción. Por ejemplo, un tampón HEPES que comprende ALCALASE@ a una concentración de aproximadamente 0,001 % a aproximadamente 0,1 % (v/v) con una actividad de aproximadamente 3,0 x 10-5 a aproximadamente 2,0 x 10-3 unidades/mL y de aproximadamente 5000 a aproximadamente 10 000 unidades/L de una desoxirribonucleasa, que tiene un pH de aproximadamente 7,0 a aproximadamente 8,0. En algunos casos, la enzima se puede combinar con otras etapas de procesamiento, que incluyen por ejemplo, junto con otra enzima seleccionada específicamente para remover los residuos de alfa-galactosa, como se discutió anteriormente.
En ciertas modalidades, la enzima es una serina proteasa de tipo tripsina. Se pueden usar varias actividades de serina proteasa de tipo tripsina y tiempos de tratamiento. Por ejemplo, se puede proporcionar una serina proteasa de tipo tripsina, tal como tripsina, en una solución a una concentración de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 1,0 mg/mL. Además, los tiempos de tratamiento pueden variar entre aproximadamente 15 y aproximadamente 25 horas a temperatura ambiente (por ejemplo, habitación).
En ciertas modalidades, la enzima es una tiol proteasa, como bromelina A, bromelina B, papaína, catepsina K y calpaína. Se pueden usar varias actividades de tiol proteasa y tiempos de tratamiento. Por ejemplo, una tiol proteasa, como la bromelina (bromelina A o B), se puede proporcionar en una solución con una actividad de aproximadamente 50 a aproximadamente 500 unidades/L, donde una unidad libera 1,0 pmol de p-nitrofenol de N-a-Z-L-lisina p-nitrofenil-lisina p-nitrofenil éster por minuto, pH 4,6, a 25 °C. Además, los tiempos de tratamiento pueden variar entre aproximadamente 15 y aproximadamente 25 horas a temperatura ambiente (por ejemplo, habitación) hasta aproximadamente 37 °C.
Las dispasas humanas o no humanas, nativas o manipuladas, adecuadas para su uso en los métodos de la presente descripción, incluyen aquellas dispasas que son proteasas neutras que escinden los enlaces peptídicos N-terminales de residuos de aminoácidos no polares, que incluyen alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, metionina, fenilalanina y triptófano.
En ciertas modalidades, la enzima es una dispasa, tal como dispasa I. En ciertas modalidades, la dispasa I es una dispasa I de Bacillus polymyxa. Se pueden usar varias actividades de dispasa y tiempos de tratamiento. Por ejemplo, una dispasa, como una dispasa I, se puede proporcionar en una solución con una actividad de aproximadamente 0,0075 a aproximadamente 0,75 U/L, donde una unidad de la dispasa I es la cantidad que hidroliza la caseína para
producir un color equivalente a 1,0 mol de tirosina por minuto a pH 7,5 a 37 °C con el empleo de un espectrofotómetro UV a 280 nm. Además, los tiempos de tratamiento pueden variar entre aproximadamente 15 y aproximadamente 25 horas a temperatura ambiente (por ejemplo, habitación) hasta aproximadamente 37 °C.
La proteasa se puede aplicar en varios momentos durante el procesamiento. Por ejemplo, en una modalidad, la proteasa se aplica en la etapa 109 en una solución 107 (como se muestra en la Figura 3) después de la descelularización. En otras modalidades, la Etapa 109 de tratamiento enzimático se implementa después del procesamiento para producir una configuración deseada (Etapa 106), pero antes de la descelularización. La proteasa se puede usar después del endurecimiento con ácido para revertir o remover el colágeno dañado u otras proteínas alteradas, provocado por el tratamiento con ácido u otras etapas del procesamiento.
La etapa de tratamiento con proteasa descrita como Etapa 109 puede mejorar la respuesta biológica del tejido cuando se implanta el tejido. Por ejemplo, sin estar ligada a ningún mecanismo de acción particular, la enzima puede mejorar la respuesta biológica al escindir o remover de otro modo el colágeno u otras proteínas del tejido que se alteran por el procesamiento ácido, u otras etapas del procesamiento. El colágeno u otras proteínas alteradas por el procesamiento ácido pueden causar un aumento de la respuesta inflamatoria en comparación con los tejidos no tratados con ácido, y la proteasa puede servir para disminuir la respuesta inflamatoria. Además, la proteasa también puede mejorar la respuesta biológica al reducir la inflamación asociada con las estructuras y moléculas del tejido nativo, que pueden removerse mejor mediante el tratamiento con proteasa.
Se puede identificar una respuesta biológica mejorada con el empleo de varios métodos conocidos. Por ejemplo, un cambio o reducción de la inflamación puede determinarse mediante análisis histológico (por ejemplo, por búsqueda de tipos y presencia de células inflamatorias), medición de quimiocinas o ensayos quimiotácticos. Además, las respuestas biológicas mejoradas, incluido, el crecimiento celular o la regeneración tisular mejorada, pueden determinarse mediante observaciones histológicas o macroscópicas.
La Figura 2 ilustra un método para tratar una fístula anal 90 con el empleo de dispositivos para el tratamiento de heridas 110. Se puede generar un dispositivo para el tratamiento de heridas 110 mediante el mecanizado de un tejido endurecido como se describió anteriormente con referencia a la Figura 1. El dispositivo para el tratamiento de heridas 110 puede ser una matriz de tejido sustancialmente acelular. El tamaño y la forma del dispositivo para el tratamiento de heridas 110 pueden elegirse de modo que el dispositivo llene completamente la fístula anal 90 sin dejar espacios vacíos. Como se muestra, el dispositivo 110 se puede colocar en la fístula 90, para llenar así la fístula 90.
El dispositivo para el tratamiento de heridas 110 se puede producir a partir de una variedad de materiales de tejido, pero los materiales adecuados deben ser comprimibles de modo que el material pueda pasar a una abertura estrecha y expandirse para llenar un área mayor o más amplia en una fístula u otros defectos. Por consiguiente, en algunas modalidades, la composición del tejido 100 puede incluir una esponja o material similar. Una esponja de tejido puede incluir, por ejemplo, cualquier material de matriz de tejido que se haya cortado o micronizado para producir una suspensión de matriz de tejido, y resuspendido para crear un material similar a una esponja.
Cuando se implanta en una fístula 90 u otro sitio, el dispositivo 110 se puede sujetar mediante fuerzas de compresión naturales del tejido circundante. Alternativamente, el dispositivo 110 se puede asegurar con el empleo de suturas, clips, grapas, adhesivos quirúrgicos u otros mecanismos de anclaje adecuados.
Aunque los dispositivos para el tratamiento de heridas se describieron anteriormente en relación con el tratamiento de fístulas o heridas tunelizadas, se prevé que los dispositivos para el tratamiento de heridas se puedan usar para tratar una amplia variedad de heridas en la piel. Tales heridas y afecciones pueden incluir (como ejemplos no limitantes) cortes, incisiones, abscesos, bolsas, úlceras y/o pústulas.
Cabe señalar que se pueden incorporar varios agentes terapéuticos en los dispositivos descritos en la presente descripción. Por ejemplo, en varias modalidades, los dispositivos pueden incluir uno o más antimicrobianos (antibióticos, antivirales o antifúngicos), agentes trombóticos, agentes quimioterapéuticos o factores de crecimiento. Ejemplos
Para los presentes ejemplos, se produjeron tapones de matriz dérmica acelular porcina (denominados tapones pADM) en referencia a muestras preparadas de acuerdo con la presente solicitud. Se obtuvo piel de cerdo y se removió la grasa subcutánea. Se remojó el tejido dérmico en PBS o en ácido acético 0,1 M, y se taladraron cilindros para producir núcleos de 3 o 5 mm de diámetro con 3-5 cm de longitud. Los cilindros se sometieron a descelularización, y después de la descelularización se trataron opcionalmente con un proceso enzimático que incluía el tratamiento ALCALASE® antes de la esterilización con un haz de electrones.
Ejemplo 1: Análisis del efecto del tratamiento ácido con y sin enzima (tratamiento con alcalasa)
Se implantaron muestras de pADM preparadas con hinchamiento ácido (según la invención) o remojo en PBS (solo
como referencia), y con y sin postprocesamiento enzimático en un modelo subcutáneo de rata a los lados de la columna vertebral. Por consiguiente, hubo cuatro grupos de estudio: (1) pADM elaborado después del remojo en PBS, (2) pADM elaborado con endurecimiento ácido, (3) pADM elaborado después del remojo en PBS con tratamiento enzimático posterior, (4) pADM elaborado con endurecimiento ácido y posteriormente con tratamiento enzimático.
No hubo signos de inflamación macroscópica en ningún grupo. Todos los explantes estaban rodeados de tejido conectivo vascular a las dos y cuatro semanas. Las secciones de tejido H&E se evaluaron a las dos y cuatro semanas. El PBS remojado junto con tejido tratado con enzima funcionó mejor a las dos y cuatro semanas, como lo demuestra la infiltración celular, la inflamación leve y la vascularización moderada no asociada con la inflamación. El grupo remojado en PBS y tratado con enzima remojado en ácido se clasificó de manera similar, con un infiltrado celular ligeramente menor, inflamación de leve a moderada y revascularización con inflamación. El tejido remojado en ácido sin tratamiento enzimático tuvo el menor infiltrado celular, inflamación leve a moderada y revascularización leve.
La Figura 4 son secciones de tejido teñidas con hematoxilina y eosina de implantes subcutáneos de tejido procesado de rata con el empleo de endurecimiento con ácido (izquierda) o endurecimiento con ácido seguido de tratamiento enzimático, como se describe en la presente descripción. La adición de un tratamiento enzimático atenúa los efectos adversos del ácido, lo que da como resultado niveles más bajos de inflamación y una mayor infiltración celular de células similares tipo fibroblastos.
Ejemplo 2: Comparación de tapones para fístula fabricados con los procesos actuales con tapones COOK® BIODESIGN
El presente estudio se diseñó para evaluar la respuesta biológica de los actuales tapones de matriz dérmica acelular porcina (tapones pADM) y tapones de fístula anal COOK@ BIODESIGN después de la creación de una herida tipo fístula anal madura, parcialmente reepitelizada. La Figura 5 ilustra un proceso de fístula madura en una rata. Este procedimiento se describe y se adapta de (modelo adaptado de la literatura científica: Experimental Model of Anal Fistula in Rats, MS Arakaki et. al., Journal of Coloproctology, 2013; 33(3): 135-138). La lesión aguda por aguja se crea desde la cara perianal hasta el canal anal, y se coloca una sutura de alambre durante 4 semanas para permitir la creación de un tracto maduro tipo fístula. Se retira el alambre, se realiza un desbridamiento ligero en el tracto, y se insertan los materiales de prueba y se suturan en su lugar para realizar la prueba.
Se crearon y desarrollaron heridas tipo fístulas en cada lado del ano en doce (12) ratas macho inmunocompetentes. A las cuatro (4) semanas, se implantaron un (1) tapón COOK@ BIo DeSiGN y un (1) tapón pADM, de aproximadamente 2 mm de diámetro x 1 cm de largo. Los animales se sacrificaron a las tres (3) y seis (6) semanas después de la implantación. Todos los implantes se colectaron, se colocaron en una solución de almacenamiento en frío, y se enviaron en hielo húmedo a LIFECELL CORPORATION para su análisis histológico. Todas las muestras de histología se cortaron en dos (2) piezas, el lado de la piel y el ano, y se colocaron individualmente en formalina para tinción con H&E, tricrómica de Masson y de alfa-actina de músculo liso (aSMA).
Un experto en la materia evaluó los portaobjetos, sin conocer la asignación del tratamiento, en cuanto a: persistencia del tapón, inflamación, vascularización, infección y nivel de integración. Esta puntuación se volvió inadecuada para la comparación entre grupos, debido a la carencia de tapones COOK@ BIODESIGN para evaluar, incluso a las tres semanas.
Tapones pADM: 6/6 tapones persistieron durante 3 semanas; 5/6 tapones persistieron durante 6 semanas (por observación visual macroscópica)n. El análisis histológico reveló una integración muy estrecha con el tejido del huésped a las 3 semanas, incluso en la grasa, el músculo y el tejido conectivo laxo. A las 6 semanas, los tapones habían comenzado a transformarse significativamente en tejido nuevo. No hubo signos de infección, aunque la inflamación varió de leve a significativa, incluso a las 6 semanas.
COOK@ BIODESIGN: 2/6 tapones persistieron durante 3 semanas; 0/6 tapones fueron macroscópicamente visibles a las 6 semanas. El análisis histológico de los tapones Cook fue imposible, debido a su erradicación en el primer punto de tiempo del estudio. Se pudieron observar pequeños focos de inflamación residual para 3/6 de injertos a las 3 semanas, con un caso de reforma de la fístula (reepitelización dentro del tejido); todas las demás muestras habían sido eliminadas y resueltas localmente.
La Figura 6 ilustra explantes macroscópicos del modelo de fístula anal discutido en el Ejemplo 3, que incluye dos materiales de implante producidos de acuerdo con los métodos descritos en la presente (dos imágenes de la izquierda) y un implante con el empleo del producto COOK@ BIODESIGN. Imágenes de explantes macroscópicos a las 3 semanas de tapones pADM y tapones COOK@ BIODESIGN en el modelo de fístula anal. Los tapones pADM mostraron una persistencia drásticamente mejor (6/6 tapones eran muy visibles, indicados con flechas) e integración en comparación con los tapones Cook (2/6 eran ligeramente palpables, los remanentes indicados con una flecha gris).
La Figura 7 son secciones de tejido teñidas con hematoxilina y eosina del modelo de fístula anal discutido en el Ejemplo 3, que incluyen materiales producidos de acuerdo con los métodos descritos en la presente (imágenes superiores) y materiales con el empleo del producto COOK@ BIODESIGN. Los tapones pADM muestran poca o ninguna degradación y están bien integrados en el tejido circundante (imagen 1), con infiltración celular sana en todo el tapón (imagen 2). Los tapones COOK@ BIODESIGN se reabsorben casi por completo (imagen 3), con altos niveles de inflamación residual en la interfaz de la herida fibrótica (imagen 4, resaltada con flechas dobles).
Otras modalidades serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la consideración de la descripción y la práctica de esta divulgación. Se pretende que la descripción y los ejemplos se consideren únicamente de modo ilustrativo. Sin embargo, el alcance de la invención se define exclusivamente mediante las siguientes reivindicaciones.
Claims (15)
1. Un método para producir un dispositivo para el tratamiento de heridas, que comprende:
seleccionar un tejido;
poner en contacto el tejido con una solución que comprende un ácido a una concentración seleccionada para producir un nivel deseado de endurecimiento de uno o más componentes en el tejido y en donde la solución no provoca una desnaturalización irreversible sustancial de uno o más componentes en el tejido; y
mecanizar el tejido endurecido para crear una forma alargada.
2. El método de la reivindicación 1, en donde el tejido es tejido dérmico.
3. El método de la reivindicación 1, en donde el tejido es al menos uno de fascia, tejido pericárdico, duramadre, tejido del cordón umbilical, cartílago, tendón, reticulado, tejido placentario, tejido de la válvula cardíaca, tejido del ligamento, tejido del tendón, tejido arterial, tejido venoso, tejido conectivo neural, tejido de vejiga urinaria, tejido del uréter y submucosa del intestino delgado.
4. El método de la reivindicación 1, en donde el uno o más componentes incluyen fibras de colágeno.
5. El método de la reivindicación 1, en donde la solución comprende ácido acético a una concentración de 0,1 M o menos.
6. El método de la reivindicación 1, en donde la solución tiene un valor de pH entre 2 y 3,5.
7. El método de la reivindicación 1, en donde la forma alargada es sustancialmente cilíndrica y tiene una longitud de al menos 1 centímetro, o preferiblemente 3 centímetros, o más preferiblemente 5 centímetros.
8. El método de la reivindicación 1, en donde la forma alargada es sustancialmente cilíndrica y tiene un diámetro en un intervalo de 1 a 5 milímetros.
9. El método de la reivindicación 1, que comprende además realizar un proceso de descelularización en el tejido antes de poner en contacto el tejido con la solución para endurecer el tejido.
10. El método de la reivindicación 1, que comprende además realizar un proceso de descelularización en el tejido después de poner en contacto el tejido con la solución para endurecer el tejido y mecanizar el tejido.
11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, que comprende además tratar el tejido con una enzima.
12. El método de la reivindicación 11, en donde la enzima comprende una serina proteasa de tipo subtilisina o una alcalasa.
13. El método de la reivindicación 11, en donde la enzima comprende al menos una de bromelina, papaína, ficina, actinidina, alcalasa, tripsina o combinaciones de las mismas.
14. El método de cualquiera de las reivindicaciones 11-13, en donde el tratamiento del tejido con la enzima mejora la respuesta biológica del tejido cuando se implanta in vivo.
15. El método de la reivindicación 14, en donde la respuesta biológica mejorada comprende al menos uno de inflamación reducida en comparación con un tejido no tratado con la enzima o crecimiento celular mejorado.
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