ES2874482T3 - Método y dispositivo para el tratamiento de los tumores residuales microscópicos que permanecen en los tejidos después de la resección quirúrgica - Google Patents

Abstract

Un agente antineoplásico para usar como medicamento para reducir la recurrencia del crecimiento tumoral en un tejido de mamífero en un mamífero en y alrededor de una ubicación en dicho mamífero de un tumor extirpado: en el que dicho agente se selecciona a partir del grupo que consiste en Bleomicina, cisplatino, una proteína, un anticuerpo, ARNi, un ácido nucleico antisentido, un gen expresable que codifica un polipéptido terapéuticamente activo, una quimiocina y una citocina; en el que dicho agente es para la administración a dicho tejido mediante inyección intravenosa o inyectado directamente en y alrededor de dicho tejido antes o simultáneamente con la administración de un pulso eléctrico electroporativo a dicho tejido, que suministra de esta manera dicho agente en las células de dicho tejido lo que resulta en una reducción o eliminación del crecimiento de células tumorales en dicho tejido.

Description

DESCRIPCIÓN

Método y dispositivo para el tratamiento de los tumores residuales microscópicos que permanecen en los tejidos después de la resección quirúrgica

Campo de la invención

Esta invención se refiere a sistemas, dispositivos y métodos de electroporación para usar tales dispositivos para tratar tejidos que rodean sitios de tumores. Más específicamente, esta invención se refiere a la preservación del tejido que rodea a los tumores y a la reducción de las tasas de recurrencia de tumores mediante el tratamiento de tejidos aparentemente no cancerosos con pulsos electroporativos y agentes antineoplásicos.

Antecedentes de la invención

La siguiente descripción incluye información que puede ser útil para comprender la presente invención. No es una admisión de que dicha información sea técnica anterior, o relevante, para las invenciones reivindicadas aquí, o que cualquier publicación a la que se haga referencia específica o implícitamente sea técnica anterior.

A excepción de la enfermedad vascular, el cáncer es la causa más frecuente de muerte en los países industrializados. El paradigma tradicionalmente aceptado para tratar cánceres y tumores que comprenden una sola masa de tejido relativamente bien definida ha incluido el uso de radiación y quimioterapia típicamente en asociación con la eliminación quirúrgica. En los casos en que la resección quirúrgica es una opción, la cirugía suele ser la forma de tratamiento más eficaz. Sin embargo, la eficacia del tratamiento quirúrgico depende de la eliminación completa del tejido maligno, que abarca la masa tumoral principal, así como las ramas y micrometástasis que suelen estar presentes en las proximidades del tumor principal.

Al extirpar el tumor principal, el cirujano también intenta eliminar tales micrometástasis locales o regionales mediante la resección del tejido aparentemente normal que rodea al tumor. Ese tejido se denomina "tejido de margen" o simplemente "margen". Hasta qué punto se extrae el tejido de los márgenes está sujeto al criterio del cirujano. Por lo general, es aceptable un margen de 0,5 a 2 cm alrededor de todo el tumor. Sin embargo, las resecciones más extensas no son infrecuentes para los tumores invasivos. Incluso después de una resección cuidadosa del tumor y el margen, la mayoría de los tipos de tumores reaparecen con una frecuencia del 10 al 40 %. La tasa de recurrencia depende de múltiples factores, que incluye el tamaño del tumor, el tipo y la ubicación del tumor, el estado del paciente, etc. Para reducir la tasa de recurrencia, la cirugía suele ir seguida de radiación y/o quimioterapia. A pesar de estos tratamientos secundarios, las tasas de recurrencia siguen siendo incómodamente altas.

Además de la cirugía y la radiación, se usan otros métodos de control local de tumores.

Estos incluyen ablación por radiofrecuencia (RF), terapia fotodinámica (PDT), crioterapia (CRYO), quimio-radiación (CR), braquiterapia (BT), galvanoterapia (GT) y otras. La cirugía, RF, TFD, CRYO y CR dependen de la eliminación o destrucción completa del tumor y los tejidos de los márgenes, mientras que la radiación, la BT y la GT dejan el tejido normal tratado más o menos intacto, aunque la radiación y la BT pueden causar cicatrices graves, fibrosis y daño vascular y neural. En cualquier caso, la eliminación, cicatrización y daño físico del tejido sano puede resultar en una desfiguración sustancial y una pérdida sustancial del uso físico de partes del cuerpo y/o funcionalidad de estas. Por ejemplo, la mayoría de los adyuvantes actuales enumerados anteriormente para la cirugía para destruir o eliminar masas tumorales causan daño inespecífico a los tejidos normales que rodean el tumor. La extirpación de una masa tumoral puede ser completamente debilitante para el funcionamiento cuando los tumores deben extirparse de órganos como la lengua, las cuerdas vocales, el recto, los labios vaginales, el pene o los músculos finos y las estructuras visuales del tejido facial.

Para evitar tal desfiguración y preservación de la función y para asegurar que los tejidos que rodean el tumor se eliminen de tales células cancerosas, la presente invención se proporciona como adyuvante o neoadyuvante de la cirugía ya que todavía existe la necesidad en las técnicas de oncología de un método de preservar los tejidos aparentemente sanos que se encuentran adyacentes a los tumores y reducir las tasas de recurrencia de tumores. S. Li y otros, " Regression of Tumor Growth and Induction of Long-Term Antitumor Memory by Interleukin 12 Electro-Gene Therapy", Journal of the National Cancer Institute, vol. 94, no. 10, 15 de mayo de 2002, páginas 762-768, describe el uso de la electroporación para suministrar el gen IL-12 por vía intratumoral en un modelo de carcinoma de células escamosas murino. Los autores concluyeron que la terapia electrogenética con IL-12 parece ser eficaz para reducir el crecimiento tumoral al desencadenar efectos antiangiogénicos y una respuesta inmune.

Resumen de la invención

La invención comprende un método para reducir la probabilidad de recurrencia del crecimiento de células cancerosas en un tejido. De acuerdo con la invención, se proporciona un agente antineoplásico para usar como medicamento para reducir la recurrencia del crecimiento tumoral en un tejido de mamífero en un mamífero en y alrededor de una ubicación en dicho mamífero de un tumor extirpado, en el que dicho agente se selecciona del grupo que consta de bleomicina, cisplatino, una proteína, un anticuerpo, ARNi, un ácido nucleico antisentido, un gen expresable que codifica un polipéptido terapéuticamente activo, una quimiocina y una citocina; y en el que dicho agente se administra a dicho tejido mediante inyección intravenosa o se inyecta directamente en y alrededor de dicho tejido antes o simultáneamente con la administración de un pulso eléctrico electroporativo a dicho tejido, que suministra de esta manera dicho agente en las células de dicho tejido lo que resulta en una reducción o eliminación del crecimiento de células tumorales en dicho tejido.

En una realización, la invención comprende un agente antineoplásico para usar en el tratamiento de células cancerosas residuales que quedan en los tejidos después de la resección quirúrgica. Preferentemente, la invención proporciona el control de la propagación adicional del cáncer al someter nódulos microscópicos u otras formas de tejido canceroso al medicamento en un campo eléctrico de electroporación. En la invención, tal tratamiento es un adyuvante de la cirugía porque se aplica después de la eliminación del tumor. En algunas circunstancias descritas en el presente documento, pero no reivindicadas, especialmente cuando las células cancerosas aún no se han formado en una masa fibrosa, no puede emplearse ningún procedimiento quirúrgico. En tal caso, el tratamiento con EP proporciona un método para reducir la masa tumoral y terminar o retrasar el crecimiento adicional de células cancerosas en el tejido. Los métodos descritos permiten la citorreducción de masas tumorales más grandes al provocar, mediante el efecto de un agente antineoplásico, como la bleomicina, un "ablandamiento" del tejido tumoral de modo que la masa tumoral sea más fácil de eliminar del tejido circundante sano o normal.

En una realización, la invención prevé la disminución de la cantidad de tejido normal que rodea el sitio del tumor, es decir, el tejido del "margen", que debe eliminarse en el momento de la extirpación del tumor y, por lo tanto, preservar el tejido normal y, en consecuencia, proporcionar una mayor retención de la función del tejido, y apariencia.

Se describe, pero no se reivindica, un instrumento que es capaz de proporcionar dichos pulsos de energía de electroporación al tejido que rodea un tumor extirpado a demanda y de una manera fácilmente operable. El dispositivo puede proporcionar tanto la administración de un agente antineoplásico como la administración de campos eléctricos suficientes para provocar la electroporación de los tejidos en la región del margen. A continuación se proporcionan más ejemplos del dispositivo.

Otras características y ventajas de la invención resultarán evidentes a partir de los siguientes dibujos, descripción detallada y reivindicaciones adjuntas.

Breve descripción de los dibujos

El expediente de patente o solicitud contiene al menos un dibujo ejecutado en color. La Oficina de Patentes y Marcas Registradas de los EE. UU. proporcionará copias de esta patente o publicación de solicitud de patente con dibujos a color si se solicita y se paga la tarifa necesaria.

La Figura 1 es un gráfico que muestra la resistencia de la herida medida por el punto de rotura de las muestras de piel en curación tratadas in vivo con solución salina sola, solución salina más electroporación, bleomicina sola y bleomicina más electroporación. En estos experimentos también se trataron la grasa y el tejido muscular subyacentes.

Las Figuras 2A-F son micrografías de tejidos teñidos con tricrómico que muestran comparaciones entre (A) tejido sin tratar el día 2 después de la incisión y (B) tejido tratado con solución salina más electroporación el día 2 después de la incisión, (C) solución salina más electroporación en la semana 2, (D) Bleomicina más electroporación a las 2 semanas, (E) solución salina más electroporación a las 3 semanas y (F) Bleomicina más electroporación a las 3 semanas.

Las Figuras 3A-D son micrografías teñidas (Trichrome) de la deposición de colágeno en incisiones de la piel después de tres semanas. Las Figuras 3A y C son imágenes de campo brillante para tejidos de piel tratados con Bleomicina y Solución salina, respectivamente, mientras que las Figuras 3B y C son imágenes de luz polarizada que muestran tejidos de piel tratados con Bleomicina y Solución salina, respectivamente.

Las Figuras 4A-D son micrografías que muestran muestras de tejido muscular 3 semanas después de la incisión; (A) solución salina sola, (B) solución salina más electroporación, (C) Bleomicina sola y (D) Bleomicina más electroporación.

La Figura 5 es una figura en sección transversal de un ejemplo del dispositivo descrito en el presente documento que muestra un ejemplo que comprende un mango que comprende una ruedecilla para subir y bajar una serie de émbolos que accionan la carga o dispensación de una sustancia a través de las agujas de los electrodos.

La Figura 6 es un dibujo que muestra una vista despiezada de un ejemplo del dispositivo.

La Figura 7 es un dibujo en sección transversal de un ejemplo del dispositivo en el que los émbolos son accionados por un tomillo impulsado por la rotación de la carcasa 50 en el sentido de las agujas del reloj (levantando los émbolos) y en sentido contrario a las agujas del reloj (bajando los émbolos).

Las Figuras 8A y B son dibujos en perspectiva de un ejemplo del dispositivo en el que la rotación del alojamiento 50 impulsará la matriz de émbolos hacia adelante y hacia atrás. La Figura A muestra el ejemplo con la bandeja 20 mientras que la Figura B muestra el cuerpo principal del ejemplo sin la bandeja 20.

La Figura 9 es un dibujo en perspectiva que muestra un ejemplo del dispositivo en el que el conjunto de émbolos se acciona mediante una tuerca de mariposa.

La Figura 10 muestra un ejemplo de la matriz de la pluralidad de agujas de electrodo desde la parte inferior del sustrato 22.

Las Figuras 11 A, B, C y D son fotografías de animales de la cohorte del Grupo 2 que muestran el animal de prueba con tumor (A), el tumor expuesto quirúrgicamente antes de la eliminación completa del tumor (B), el lecho abierto de la herida después de la eliminación del tumor pero antes de EP simulada (C) y el sitio de la cirugía / tratamiento después de 3 semanas después del tratamiento (D). Con este Grupo 2, no se realizó electroporación y el tumor recidivó a pesar de que el tumor se había extirpado por completo.

Las Figuras 12 A, B, C y D son fotografías de animales de la cohorte del Grupo 1 que muestran el animal de prueba con tumor (A), el tumor expuesto quirúrgicamente antes de la eliminación completa del tumor (B), el lecho de la herida abierta después de la eliminación del tumor pero antes de tratamiento con EP (C), y el lugar de la cirugía/tratamiento después de 3 semanas después del tratamiento (D). Como se observó con el tratamiento con Bleomicina-EP, ningún tumor recidivó en el sitio del tratamiento.

Las Figuras 13 A, B y C son fotografías de animales de la cohorte del Grupo 7 que muestran el animal de prueba con tumor (A), después de la eliminación parcial del tumor (B), y el sitio quirúrgico / de tratamiento después de 3 semanas después del tratamiento (C). El ratón a las 3 semanas no mostró recurrencia tumoral a pesar de que el tumor solo se extirpó parcialmente.

Las Figuras 14 A, B y C son fotografías de animales de la cohorte del Grupo 4 que muestran el animal de prueba con tumor (A), después de la eliminación parcial del tumor (B), y el sitio quirúrgico/de tratamiento después de 3 semanas después del tratamiento (C). Sin EPT, el tumor siguió creciendo.

La Figura 15 muestra un gráfico de barras de los datos presentados en la Tabla V. PTE se refiere a la extirpación parcial del tumor, CTE se refiere a la extirpación completa del tumor, Bi.v. significa Bleomicina administrada a animales de prueba por vía intravenosa, EP significa electroporación, itB se refiere a Bleomicina administrada intratumoralmente y PEP significa electroporación parcial.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

Como apreciarán los expertos en la técnica, la siguiente descripción describe en detalle ciertas realizaciones preferidas de la invención y, por lo tanto, es sólo representativa y no describe el alcance real de la invención. Antes de describir la presente invención en detalle, se entiende que la invención no se limita a las disposiciones, sistemas y metodologías de dispositivos particulares descritos, ya que estos pueden variar.

Visión general

La terapia de electroporación (EPT), también conocida como electroquimioterapia (ECT), es un método para tratar lesiones cancerosas localizadas y masas tumorales. El método comprende administrar ciertos fármacos quimioterapéuticos, más comúnmente Bleomicina, por vía intratumoral o intravenosa. En la mayoría de los casos, la electroporación (EP) se realiza al insertar conjuntos de electrodos de aguja y suministrar campos eléctricos pulsados que emanan de estos electrodos directamente a la masa de células cancerosas. Los parámetros de pulso están generalmente dentro de los siguientes intervalos: intensidad de campo 200-2000 V/cm; longitud de pulso 0,1-10,0 ms; número de pulso 2-20; y frecuencia de pulso 1-5 Hz. La aplicación de tales campos eléctricos resulta en la permeabilización de las membranas de las células tumorales, lo que permite que los fármacos anticancerosos entren en las células y provoquen una citotoxicidad hasta 5000 veces mayor debido a la absorción del fármaco que la observada en ausencia de electroporación. Se ha demostrado que la EPT es eficaz contra muchos tipos de tumores sólidos en animales y varios tipos de tumores en humanos. De hecho, actualmente se encuentran en curso varios estudios clínicos, incluido un estudio de fase III que evalúa la seguridad y eficacia de la EPT para el tratamiento de carcinomas de células escamosas de cabeza y cuello. Sin embargo, tales estudios de tratamiento no están diseñados ni tienen la intención de tratar o probar el efecto de la EPT en el tejido del margen no canceroso coincidente con las células cancerosas.

La EPT es algo única entre los muchos métodos empleados para el control de tumores locales y regionales, ya que es mucho menos dañino para el tejido normal que para el tejido maligno. Los resultados de estudios in vitro e in vivo en animales y humanos indican que la EPT que usa un fármaco, como la bleomicina, destruye eficazmente la mayoría de los tumores a través de mecanismos apoptóticos y necróticos, mientras que solo causa un efecto menor (inflamación, necrosis menor) en los tejidos normales que rodean el tumor, particularmente cuando la concentración de bleomicina, las dosis y los parámetros del pulso están dentro de los intervalos apropiados. El tejido del margen que rodea los tumores que normalmente es susceptible de tratamiento incluye, sin limitación, los de órganos que incluyen mama, próstata, lengua, pene, labios, recto, cuerdas vocales, hígado, carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (SCCHN), piel y otros tumores. La EPT puede realizarse en tales tejidos tanto si se ha eliminado la masa tumoral como si no. En tales cánceres, el paciente se beneficiaría sustancialmente del tratamiento de los tejidos de una manera en la que la curación pueda desarrollarse en gran medida sin alteraciones y existe la posibilidad de eliminar las metástasis microscópicas y las ramas tumorales que tienden hacia los tejidos que dan lugar a recidivas locales. Como también es comprensible con respecto a la invención, los tratamientos de electroporación con agentes tales como Bleomicina proporcionan un grado medible de selectividad en el direccionamiento de células cancerosas. Esta metodología también es pertinente para tratamientos con otros agentes que tienen actividades específicas contra estados patológicos particulares, tales como enfermedades infecciosas altamente localizadas y otros estados patológicos donde hay focos de tejidos infectados o enfermos en los que una célula o grupo de células están infectadas o enfermo, puede ser el objetivo del agente para destruir las células afectadas. En tal caso, la electroporación de tales células y el tejido circundante permitirá que el agente alcance su objetivo deseado en las células infectadas o enfermas, pero no tendrá un efecto perjudicial sobre las células normales o no infectadas como se observa empíricamente. Actualmente se desconocen los mecanismos moleculares y celulares que subyacen a las diferentes respuestas de las células anormales y normales, respectivamente. Además, el uso de los métodos y dispositivos descritos es aplicable a estados de enfermedad en los que los sitios de células cancerosas se distribuyen en áreas que no son fácilmente susceptibles de cirugía. Por ejemplo, los tejidos de la piel de la cara que contienen sitios de enfermedad microscópicos o focales pueden tratarse con el dispositivo de la misma manera que se usa para tratar un lecho de tejido marginal, lo que resulta en sustancialmente menos cicatrices que las que causaría la cirugía. Por tanto, los métodos descritos pueden usarse como adyuvante de la cirugía o incluso como neoadyuvante. Específicamente, las células de la masa tumoral pueden electroporarse junto con el tejido normal circundante y así proporcionar un método para reducir la masa tumoral al proporcionar un mecanismo para obstaculizar, terminar o reducir de otro modo las tasas de crecimiento y/o recurrencia de las células enfermas. En tal caso, el tejido tumoral puede extirparse antes o después de la EPT, o incluso puede permitirse que permanezca sin cortar después de la EPT, en cuyo caso el efecto de un agente como Bleomicina proporcionará la muerte celular por mecanismos apoptóticos y/o necróticos ablandamiento de la masa de células tumorales seguido de más necrosis. El tejido normal de las inmediaciones no se verá afectado en gran medida. En la presente invención, el tumor se extirpa antes de la EPT.

Normalmente, el tratamiento de un tumor con EPT incluye una dosis de Bleomicina de 1 Unidad/ccm de tejido a tratar, inyectada por vía intratumoral a una concentración de 4 Unidades/ml. Los campos pulsados se generan de manera que el campo se aplica generalmente en seis pulsos separados a 4 Hz, uno en cada 6 orientaciones de campo diferentes, cada una de 100usec de duración, con una intensidad de campo nominal de entre 200 y 2000 V/cm 600 y 1500 V/cm, más habitualmente entre 600 y 1400 V/cm e incluso más habitualmente entre 1200-1300 V/cm a través de la masa tumoral. El aumento de la dosis o la concentración de bleomicina y el aumento de la intensidad del pulso de electroporación más allá de los parámetros estándar pueden producir efectos más graves en el tejido normal. Con intensidades de campo y/o longitudes de pulso muy altas, la EP por sí misma (es decir, por ejemplo, sin bleomicina) puede inducir un deterioro irreversible de la membrana celular, lo que conduce a la destrucción del tumor y del tejido celular normal que cae dentro del campo eléctrico efectivo. Como se describe en el presente documento, un dispositivo para operar la invención puede operarse en sí mismo mediante el uso de intensidades de campo pulsado de entre 1 y 600 V/cm cuando se inyecta ADN como agente terapéutico como se establece en Patente de Estados Unidos 6,528,315. En tal realización, el ADN codifica idealmente un polipéptido que proporciona un efecto terapéutico contra el cáncer en el tejido que contiene el tumor que se está tratando.

Con respecto a otros agentes, que incluyen genes, proteínas, citocinas, quimiocinas, esteroides, anticuerpos, ARNi y ácidos nucleicos antisentido, pueden usarse los mismos parámetros de alta pulsación (es decir, por ejemplo, 800­ 1500 V/cm o, alternativamente, 1-600 V/cm, con mayor preferencia 200 a 600 V/cm, y con la máxima preferencia 400-600 V/cm. Se contempla además que estos y otros agentes pueden usarse cuando tales agentes promueven la cicatrización de heridas sin promover el crecimiento de células malignas. Con respecto al uso de tales agentes en EPT, pueden usarse intensidades de campo de extremo inferior tan bajas como 50 V/cm para electroporar células dentro de tejido que contiene lesiones microscópicas y células enfermas donde los tejidos no han formado una masa de tejido anormal.

Como se mencionó anteriormente, la presente justificación para la terapia del cáncer implica en un ejemplo la eliminación quirúrgica de la masa tumoral ('citorreducción') para reducir el estrés biológico en el paciente, la eliminación quirúrgica del tejido de los márgenes para erradicar las micrometástasis y la invasión del tejido tumoral, y la radiación y/o quimioterapia para controlar la diseminación local, regional y sistémica del tumor. Si bien la eliminación quirúrgica del tumor en sí generalmente proporciona alivio al paciente, sin secuelas graves, los pasos posteriores de resección del margen, radiación y quimioterapia pueden ser muy perjudiciales para el paciente. La función fisiológica y mecánica, el aspecto, la calidad de vida y el resultado final pueden verse gravemente afectados por estos tratamientos. Por lo tanto, sería ideal combinar la eliminación quirúrgica del tumor con un método de tratamiento que (a) previene la recurrencia del tumor debido a micrometástasis y tejido tumoral invasivo de manera más eficaz que los métodos actuales, y (b) minimiza la pérdida de tejido del margen circundante. En los métodos descritos en la presente, se proporciona una nueva aplicación de EPT como adyuvante quirúrgico o neoadyuvante para lograr la reducción de la masa tumoral, la prevención de la recurrencia del tumor y la minimización de la necesidad de extirpar el tejido de los márgenes o ambos.

Pasando ahora a la invención, la presente invención está destinada a proporcionar un método novedoso para reducir la probabilidad de recurrencia del crecimiento tumoral en tejidos por lo demás normales que rodean un sitio de células cancerosas extirpadas. En otras palabras, la invención comprende tratar "márgenes" de tejido que rodean un sitio de células cancerosas, tales células cancerosas se forman típicamente en un sitio de tejido distinto. En una realización preferida, la invención prevé reducir la cantidad de tejido que debe extirparse junto con el tumor y sus células cancerosas y hacer superflua la radiación o la quimioterapia. El método comprende aplicar un pulso electroporativo de energía eléctrica a los tejidos que rodean el sitio del tumor. Además de la aplicación de un pulso electroporativo, se proporciona una formulación que comprende un medicamento contra el cáncer antes o simultáneamente con el pulso eléctrico. Tal medicamento comprende una molécula biológicamente activa. Por ejemplo, el medicamento puede comprender un ácido nucleico que codifica un polipéptido expresable, tal como, por ejemplo, un ácido nucleico en un vector de expresión y que comprende una secuencia génica para una citocina o quimiocina, anticuerpo o enzima. Otro ejemplo comprende el ADN o ARN antisentido, o ARN de interferencia (ARNi). Alternativamente, el medicamento puede comprender un polipéptido o una molécula orgánica tal como, por ejemplo, una citocina, quimiocina, anticuerpo, cisplatino o bleomicina. Además, cualquiera de los compuestos descritos anteriormente puede administrarse en una formulación que puede comprender cualquier combinación de sales, tampones y otros excipientes farmacéuticamente aceptables como son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, las formulaciones para ácidos nucleicos pueden comprender, por ejemplo, dicho ácido nucleico y ácido poliglutámico (poli-L-glutamato) como se describe en la patente de EE. UU. 7,173,116.

En una realización adicional, el pulso electroporativo se aplica mediante el uso de un dispositivo capaz de proporcionar tales pulsos electroporativos a áreas localizadas en el sitio del tumor. En una realización preferida, tal dispositivo puede incluir una serie de electrodos alargados en forma de aguja. Las realizaciones alternativas pueden usar electrodos cortos no penetrantes o electrodos de microagujas semipenetrantes en dependencia de la fuerza del pulso eléctrico requerido y del modo de suministro del agente antineoplásico. En tal realización, el dispositivo se diseñaría sin necesidad de un émbolo y agujas de suministro. En su lugar, los métodos de tratamiento pueden aplicarse mediante el uso de un dispositivo de electroporación que comprende solamente una matriz de electrodos, comprendiendo tal matriz los electrodos no penetrantes o semipenetrantes. En tal caso, el medicamento se suministraría por medios separados, como una jeringa. En una realización preferida adicional con respecto a cualquiera de las disposiciones físicas del dispositivo, durante la realización del procedimiento de tratamiento, los electrodos pueden colocarse con respecto a los tejidos a tratar para crear un campo eléctrico que tiene una fuerza de campo y energía suficientes para electroporar células en dicho tejido dentro de un área y profundidad especificadas. Normalmente, el dispositivo se colocará para impartir un pulso electroporativo a todos los tejidos dentro de un margen de tejido preseleccionado alrededor (en tres dimensiones) del sitio de extirpación del tumor. En dependencia del tamaño del tumor extirpado y del tamaño de la matriz de electrodos, el lecho de tejido del margen circundante puede electroporarse completamente en una aplicación de pulso electroporativo o puede requerir una multiplicidad de aplicaciones de pulso electroporativo mediante el posicionamiento y reposicionamiento de la matriz de electrodos de manera que como para abarcar completamente el tejido del margen del sitio del tumor en campos de energía de electroporación. En algunas realizaciones, los electrodos pueden servir como agujas de suministro para el agente destinado a electroporarse en las células, mientras que en otras realizaciones, el agente puede administrarse al tejido independientemente de la administración/colocación de los electrodos en el tejido.

Además, para estar seguros de que la invención es capaz de exponer tejidos sanos no cancerosos a pulsos electroporativos sin dañar sustancialmente dichos tejidos sanos, se realizó un estudio sobre las características de recuperación del tejido sano que rodea una herida abierta tras la exposición a pulsos electroporativos. Como se describe a continuación, el tratamiento de tejidos sanos con pulsos electroporativos, o pulsos electroporativos y un agente antineoplásico, no impartió ningún efecto significativo mensurable a las células del área tratada y las heridas abiertas cicatrizaron de manera similar a los tejidos normales y/o no tratados. Dado que los tejidos sanos pueden exponerse a un pulso electroporativo sin detrimento sustancial, ahora es posible el uso de la electroporación en el tratamiento de los tejidos que rodean un tumor con el fin de permitir que los cirujanos extirpen un margen más estrecho de tejido sano.

Procedimiento de tratamiento general

Una realización de la invención es tratar los márgenes de la herida quirúrgica o, más generalmente, los márgenes del tumor y en el proceso (a) lograr una tasa de recurrencia superior (es decir, recurrencia menos frecuente) en comparación con el tumor quirúrgico convencional y la resección de los márgenes con o sin tratamiento secundario; (b) reducir o eliminar la necesidad de resección quirúrgica del tejido del margen mientras se mantienen tasas de recurrencia iguales o mejores que con la eliminación del margen quirúrgico tradicional, y así preservar el tejido funcional; y (c) reducir o eliminar la necesidad de radiación o quimioterapia posterior a la resección quirúrgica del tumor (con o sin resección de márgenes) mientras se mantienen tasas de recurrencia iguales o superiores a las de la resección de márgenes quirúrgica tradicional y tratamientos secundarios como, por ejemplo, radiación y quimioterapia.

Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar pero no limitar la invención. Si bien son típicos de los que podrían usarse, alternativamente pueden usarse otros procedimientos conocidos por los expertos en la técnica.

Ejemplo I

Tratamiento de tejido aparentemente sano que rodea una herida abierta con pulsos de electroporación y/o agente antineoplásico

Con el fin de usar con éxito la electroporación en áreas de heridas abiertas que comprenden en su mayor parte tejido normal, realizamos una serie de experimentos para demostrar que la electroporación de tejido normal, con o sin agente antineoplásico, puede realizarse sin afectar significativamente los procesos de cicatrización en tejidos cutáneos, subcutáneos y musculares.

En este experimento, se hicieron dieciocho incisiones transcutáneas en los músculos dorsales en cada uno de los ocho animales de ensayo de cerdos agrupados 1-6. En los grupos de estudio 1-5, se realizaron incisiones longitudinales mientras que en el grupo 6 las incisiones fueron transversales a la orientación longitudinal de la fibra muscular. En cada sitio de incisión, no se inyectó nada, solución salina normal o bleomicina en solución, de modo que las inyecciones se colocaron a una profundidad de 1 cm y se espaciaron a una distancia de 1 cm entre sí con tres inyecciones, una a cada lado de cada incisión dentro de los 3 cm uno del otro y uno en el centro de la incisión. Se usó bleomicina, un agente antineoplásico, en el que cada inyección consistía en 0,125 ml (4 unidades/ml de solución salina). A continuación, las incisiones se trataron con pulsos bipolares de 530 V, 100 ps cada uno, de un generador de pulsos mediante el uso de una matriz de electrodos de 6 agujas de 0,5 cm de diámetro (la intensidad de campo nominal para cada pulso fue de 1,233 V/cm).

Específicamente, se aclimataron 8 cerdos cruzados Yorkshire/Hampshire machos (40-50 kg) 5-7 días antes de la cirugía. Las ubicaciones de las incisiones se marcaron en el dorso mediante el uso de marcadores quirúrgicos estériles. Cada incisión tenía 5 cm de largo y se hizo a una profundidad de 5 mm en el músculo. Todos los animales de los grupos 1-5 recibieron 18 incisiones longitudinales cada uno, mientras que los animales del grupo 6 recibieron incisiones transversales, de acuerdo con la Tabla I. Cada grupo de estudio comprendió 24 incisiones.

Se administraron inyecciones de un volumen total de 1,5 ml de solución salina o bleomicina (6 U) en 12 sitios por incisión, 6 en el músculo y 6 en la piel. Las incisiones tratadas con electroporación se electroporaron mediante el uso de una matriz de agujas de 0,5 cm de diámetro y 1,5 cm de largo. A cada lado de la incisión del músculo, se aplicó electroporación 3 veces en los 3 cm centrales de la incisión, estando cada sitio de electroporación a 1 cm de distancia del otro. La piel no fue electroporada. El epimisio se cerró con suturas interrumpidas absorbibles de Vicryl 4-0. La piel se cerró con suturas interrumpidas de nailon 4-0. Los cerdos se sacrificaron a los 2 días, 1 semana, 2 semanas o 3 semanas después de la cirugía. Se tomaron muestras de histología que contenían piel y al menos 5 mm de profundidad del músculo subyacente del centro de la incisión y se colocaron inmediatamente en formalina tamponada neutra al 10 %. Se tomó una muestra de control adicional de la piel sin incisión del dorso. Después de teñir y seccionar, la piel, el tejido subcutáneo y el músculo se clasificaron histológicamente en una escala de 0-3 mediante el uso de los siguientes parámetros: curación, granulaciones/fibrosis, PMN, linfocitos, histiocitos, necrosis, hemorragia y células atípicas.

Se realizaron pruebas mecánicas en tiras de piel extraídas del centro de la incisión en tres puntos de tiempo diferentes, a saber, los días 7, 14 y 21. Las tiras de piel se envolvieron en una gasa empapada en solución salina y se ensayaron el mismo día para determinar la resistencia a la rotura de la incisión mediante el uso de un Instron 900 (Instron Corp. Norwood, mA) con una celda de carga de 100 libras corrida a 0,5 pulg/min. La resistencia a la rotura se determinó al trazar el estiramiento frente a la deformación para cada incisión hasta el punto de rotura. La resistencia a la rotura de las incisiones cutáneas aumentó con el tiempo en el Grupo 1 (sin solución salina o bleomicina) de ~1800kPa en 1 semana hasta ~2500kPa a las 2 semanas y -5000 kPa a las 3 semanas posteriores a la incisión. La inyección de solución salina (Grupo 2) produjo resultados similares. El grupo 3 (inyección de solución salina con electroporación) no fue significativamente diferente del grupo 2 en ningún momento, lo que indica que la electroporación no provocó efectos adversos en la resistencia a la rotura. A la semana, los tres grupos tratados con bleomicina tenían resistencias a la rotura significativamente reducidas (es decir, 90 %) en comparación con los tres grupos sin bleomicina, lo que indica que la bleomicina había retrasado la cicatrización de la herida dérmica. La electroporación no tuvo efectos adversos sobre la resistencia a la rotura ya que los Grupos 4 y 5 no fueron significativamente diferentes entre sí. En la semana 2, no hubo diferencias significativas entre los Grupos 1-5. Solo las incisiones transversales con bleomicina y electroporación mostraron resistencias a la rotura más bajas. Este efecto se prolongó hasta la semana 3, donde el Grupo 6 tenía una resistencia a la rotura significativamente menor que los Grupos 1-5.

Como se muestra en la Figura 1, no hubo una diferencia sustancial entre solución salina sola, solución salina más electroporación, bleomicina sola o bleomicina más electroporación después de tres semanas después de la incisión. Incluso la fuerza de las incisiones transversales curadas es suficiente para no ser motivo de preocupación clínica en términos de riesgo para el paciente.

Evaluación histológica

Se tomaron muestras de histología en cuatro puntos de tiempo diferentes, a saber, los días 2, 7, 14 y 21 que contenían piel y al menos 5 mm de músculo del centro de las incisiones y se colocaron inmediatamente en formalina tamponada neutra al 10%. Los estudios histológicos mostraron cambios estadísticamente significativos (solo grupos de bleomicina) presentes en el día 7. Todo el tejido no tratado y el tejido inyectado con solución salina permanecieron normales en apariencia. El día 21, todas las muestras inyectadas con bleomicina eran comparables con los controles inyectados con solución salina. Por ejemplo, al comparar muestras de tejido inyectadas con solución salina frente a inyectadas con solución salina más muestras de tejido electroporadas, los únicos efectos de la electroporación fueron ligeros aumentos en el número de histiocitos cutáneos a la semana y una reducción de los linfocitos cutáneos a las 2 semanas. No hubo efectos de la electroporación sobre ninguno de los otros parámetros, como la cicatrización de la piel, el tejido subcutáneo y el músculo. Además, al comparar las muestras de tejido tratado con Bleomicina v.s. Bleomicina más EP no hubo diferencias significativas a los 2 días o 1 semana. A las 2 semanas, la electroporación provocó un aumento significativo de la necrosis muscular, pero esa diferencia desapareció a las 3 semanas. A las 3 semanas, la electroporación provocó una reducción de los histiocitos de la piel, pero mostró un aumento de tejido de granulación/fibrosis en el músculo, evidencia de curación. No hubo diferencias significativas sostenidas en la cicatrización de la piel, el tejido subcutáneo o el músculo causadas por la electroporación, incluso en presencia de bleomicina.

Como se muestra en las Figuras 2 AF, la cicatrización de heridas en comparación entre tejido no tratado, tejido tratado con solución salina más electroporación y tejido tratado con bleomicina más electroporación, se vuelve histológicamente equivalente en la semana tres. Específicamente, a la semana tres la solución salina más electroporación es equivalente a la Bleomicina más electroporación (comparar E y F). En la semana 2, la solución salina más electroporación muestra una curación más avanzada que la bleomicina y la electroporación (comparar C y A). En la semana 3, la solución salina más electroporación parece equivalente a Bleomicina más electroporación en la semana 2 (comparar E y D).

Con respecto a otras características histológicas como se muestra en las Figuras 3 AD, el colágeno se deposita en la herida que cicatriza, pero quizás a una velocidad más lenta para las muestras tratadas con Bleomicina que para las muestras tratadas con solución salina. Específicamente, sin electroporación, las incisiones en animales tratados con solución salina (C y D) muestran fibras de colágeno azul oscuro en continuidad con las fibras de colágeno de la dermis, mientras que las incisiones de animales tratados con bleomicina (A y B) muestran fibras de colágeno azul pálido con menos zonas de continuidad con el colágeno dérmico. Con respecto al efecto, si lo hay, sobre el tejido muscular, como se muestra en las Figuras 4A-D, a las 3 semanas las micrografías indican que la electroporación no causa diferencias significativas en la curación del tejido muscular en comparación con la solución salina o la bleomicina sola.

Teniendo en cuenta el efecto, si lo hubo, de las incisiones longitudinales frente a las transversales, en presencia de solución salina frente a bleomicina, no hubo diferencias significativas a los 2 días o 1 semana. A las 2 y 3 semanas, las únicas diferencias histológicas significativas fueron la cantidad de tejido de granulación/fibrosis en las tres capas de tejido estudiadas. En piel, tejido subcutáneo y músculo, las incisiones longitudinales tuvieron más tejido de granulación/fibrosis que las incisiones transversales en todos los casos en los que hubo diferencias significativas. Esto se espera ya que las incisiones longitudinales generalmente cicatrizan mejor que las incisiones transversales. Las puntuaciones de curación de la piel, el tejido subcutáneo y el músculo no fueron significativamente diferentes para las incisiones longitudinales y transversales.

Resumen

La electroporación del músculo no provocó una alteración significativa en la resistencia a la rotura de la dermis porcina en presencia o ausencia de bleomicina en las semanas 2 y 3 y posiblemente incluso en la semana 1. Sin embargo, la presencia de Bleomicina, independientemente de si se usó EP, se asoció con una reducción en la resistencia a la rotura de la dermis porcina hasta 1-2 semanas después del tratamiento en comparación con la incisión solo o con la incisión inyectada con solución salina, con o sin EP. Con respecto a la histología, la electroporación de los tejidos no produjo diferencias significativas en la cicatrización de la piel, el tejido subcutáneo o el músculo. Por tanto, la terapia de electroporación no afecta significativamente de forma adversa a la curación del músculo o la piel. Esto parece aplicarse también cuando se usa EPT para el tratamiento del tejido que rodea a los tumores y, por tanto, la invención proporciona una alternativa a la resección quirúrgica u otras intervenciones terapéuticas en el tratamiento de los márgenes de las heridas destinadas a reducir la recurrencia del tumor.

Ejemplo II

Régimen de tratamiento hipotético

Se contempla que la cirugía que usa la invención y el dispositivo generalmente seguirá un protocolo que probablemente empleará los siguientes pasos:

1. La masa tumoral principal se resecará quirúrgicamente como lo practica habitualmente un cirujano experto en la técnica. El cirujano resecará solo la masa del tumor primario o también resecará un margen quirúrgico. Alternativamente, el tumor principal puede extirparse mediante una de las muchas terapias ablativas, como la ablación por RF (radiofrecuencia), la TFD (terapia fotodinámica), la crioterapia, la quimiorradioterapia, la braquiterapia o incluso la galvanoterapia, con o sin ablación del tejido de los márgenes.

2. Después de la resección quirúrgica (o ablación) de la masa tumoral, con o sin resección (o ablación) del tejido del margen, todo el tejido que rodea el sitio de resección (o ablación) será tratado por EPT empleando Bleomicina u otros fármacos quimioterapéuticos o biológicos. El tratamiento farmacológico-EPT se realizará con la profundidad que determine el cirujano de acuerdo con consideraciones teóricas, estudios científicos o experiencia práctica.

Variación A. Protocolo para resecar un tumor con márgenes estándar

1. En esta variación del protocolo, una vez que se ha extirpado el tumor junto con los márgenes estándar, toda la superficie de la herida (lecho del margen del tumor) se trata a una profundidad adecuada, típicamente 1 cm con un régimen estándar de EPT que generalmente comprende la inyección local de un agente antineoplásico electroporación mediante el uso de al menos un dispositivo equipado con una matriz de múltiples electrodos (por ejemplo, una matriz de seis agujas u otra disposición de electrodos de un dispositivo como se describe en las figuras 5-10) y, por ejemplo, pulsando en al menos tres orientaciones de campo con un voltaje apropiado. Por orientaciones de campo se entiende la orientación espacial y direccional del campo eléctrico generado por el pulso eléctrico entre dos electrodos cualesquiera cargados de manera opuesta. En esta realización, la Variación A del protocolo puede realizarse sin el uso de (o alternativamente un uso reducido de) tratamiento secundario posquirúrgico tradicional. En tal caso, la invención está destinada a lograr tasas de recurrencia iguales o mejores en comparación con la resección completa del margen quirúrgico y el tratamiento secundario.

2. Después de la EPT del lecho del margen tumoral, si se desea, el paciente puede ser tratado adicionalmente con un tratamiento secundario convencional, como radiación o quimioterapia, y de ese modo proporcionar una protección potencial adicional contra la recurrencia del tumor en comparación con ningún tratamiento con EPT de los tejidos del margen.

Se pretende que el resultado de realizar los pasos 1 y 2 anteriores comprenda una tasa de curación mejorada o el tiempo hasta la recurrencia con cierto grado de preservación del tejido en comparación con las terapias convencionales, pero el tejido de los márgenes se habría eliminado de todos modos.

Variación B. Protocolo de resección de un tumor sin resección de márgenes

1. En este protocolo Método de variación, después de la eliminación del tumor y la eliminación de márgenes reducida o nula, toda la superficie de la herida se trata a una profundidad adecuada, generalmente 1 cm con un régimen estándar de EPT que generalmente comprende la inyección local de un agente antineoplásico seguida de electroporación mediante el uso de un electrodo múltiple matriz (por ejemplo, una matriz de seis agujas o una matriz como se describe en las figuras adjuntas) y, por ejemplo, pulsando en al menos tres orientaciones de campo con un voltaje apropiado.

2. El resultado esperado siguiendo este protocolo y el tratamiento secundario convencional adicional es la preservación completa o parcial del tejido del margen y una tasa de curación potencialmente mejorada o el tiempo hasta la recurrencia.

En realizaciones alternativas de los protocolos anteriores, no se proporciona ningún tratamiento secundario tradicional, sin embargo, el resultado deseado es la preservación completa o parcial del tejido de los márgenes y una tasa de curación mejorada o tiempo hasta la recurrencia.

Ejemplo III

Pasando ahora a la descripción de un dispositivo de electroporación adecuado para tratar lechos marginales de tumores resecados, en un primer ejemplo, el dispositivo está destinado a proporcionar la capacidad de suministrar al tejido del margen un agente antineoplásico, por ejemplo, bleomicina, distribuido uniformemente por todo el lecho de margen. En un segundo ejemplo, el dispositivo proporciona la capacidad de suministrar al tejido del margen una pluralidad de pulsos de energía eléctrica suficientes para provocar la electroporación de las células en todo el lecho del margen a una profundidad de entre 1 y 1,5 cm.

En un tercer ejemplo, el dispositivo puede proporcionar el suministro de pulsos de electroporación a una parte sustancial del lecho del margen, sino a todo el lecho del margen (en dependencia de las dimensiones relativas del dispositivo y el tumor), mediante una sola colocación del dispositivo de tal manera que para proporcionar pulsos de electroporación a todo el lecho del margen, el dispositivo debería preferiblemente ser colocado solo una vez.

En otros ejemplos, el dispositivo incluye una pluralidad de electrodos colocados en una matriz geométrica para proporcionar el suministro de una serie de pulsos eléctricos entre electrodos seleccionados de la matriz. En un ejemplo relacionado, el dispositivo puede comprender una pluralidad de formas para adaptarse a diversas formas y tamaños de tumores y además proporcionar una serie de electrodos en una geometría preferida.

En otros ejemplos más, los electrodos del dispositivo pueden comprender agujas huecas alargadas de manera que los electrodos puedan actuar tanto como electrodos como agujas de suministro de agentes antineoplásicos. En un ejemplo particularmente preferido, el dispositivo puede incluir una cubierta para objetos cortantes para cubrir los electrodos y proporcionar un mecanismo para el suministro de agente antineoplásico a las agujas huecas y un medio para mantener los electrodos estériles antes de la cirugía.

Pasando ahora a los detalles específicos del dispositivo, la Figura 5 muestra el dispositivo 10 que comprende una cubierta 20 para objetos punzantes sustancialmente rígida que funciona como una bandeja de llenado de agente terapéutico. La cubierta/bandeja 20 comprende además un puerto de llenado 21 que puede diseñarse con un accesorio capaz de conectarse con cualquier tipo de accesorio deseado para unirlo a una fuente de fluido para llenar la bandeja hasta un nivel deseado de sustancia terapéutica. La cubierta/bandeja 20 encaja cómodamente en el cuerpo principal del dispositivo, que a su vez comprende un sustrato 22 sustancialmente rígido a través del cual pasa una serie de una pluralidad de electrodos alargados 23 y que están conectados individualmente a conductores eléctricos 24 que terminan en una porción lateral del dispositivo en un enchufe o conector 25 para fijarlo a una fuente de energía eléctrica. El sustrato 22 y el tapón 25 están conectados al sustrato del cuerpo principal 30, que a su vez comprende una serie de una pluralidad de pozos 31 (véase la Figura 6). Cada pocillo comprende un electrodo hueco/aguja a través del cual puede transmitirse una sustancia tal como una sustancia terapéutica.

Encajando con el sustrato 30 está el sustrato 40 que comprende una serie de una pluralidad de émbolos 41. El sustrato 40 está conectado a un mecanismo que puede accionar el movimiento del sustrato 40 hacia y desde el sustrato 30 para impulsar o extraer del sustrato 30 el conjunto de pistones 41 del sustrato 40. En un ejemplo, el sustrato 40 es accionado por una varilla central 60 conectada al sustrato 40 en un extremo y en el otro configurado en un trinquete y una rueda 61 activada con el pulgar. En un ejemplo relacionado, el sustrato 50 forma además una estructura de soporte envolvente 63 para rodear y encerrar la varilla central 60. La estructura de soporte 63 puede comprender además una empuñadura 64 fácil de usar. En funcionamiento, el operador usaría el puerto 21 para llenar la tapa/bandeja 20 hasta un nivel deseado con un agente terapéutico fluido, como por ejemplo Bleomicina, luego usaría la ruedecilla 61 para introducir el agente en los pocillos 31 (Fig.6). A continuación, el operador retiraría el dispositivo de la bandeja 20 mediante el uso del asa formada por la estructura de soporte 63 y colocaría el dispositivo en una posición apropiada sobre el tejido o el lecho de margen. El operador entonces insertaría los electrodos, activaría la ruedecilla 61 para administrar el agente en el tejido seguido de la activación de los electrodos, habiendo sido previamente conectado el dispositivo a una fuente de energía eléctrica a través del enchufe 25.

El dispositivo puede comprender además otras diversas disposiciones de componentes para proporcionar el mismo resultado. Por ejemplo, en un ejemplo, el dispositivo puede comprender unido al sustrato 30, una carcasa 50 opcionalmente dinámica. La carcasa 50 se considera dinámica de forma opcional ya que, en dependencia del estilo del dispositivo elegido, la carcasa puede girar en sentido horario y antihorario para subir y bajar el émbolo en lugar de usar una ruedecilla. En ejemplos como el que se muestra en la Figura 5, el alojamiento 50 no es dinámico en el sentido de que aunque el alojamiento 50 puede ser capaz de girar, pero para el mango y la ruedecilla, tal rotación en este ejemplo no tiene utilidad. Alternativamente, como se muestra en las Figuras 7 y 8, el alojamiento es dinámico porque el sustrato 40 se acciona hacia o desde el sustrato 30 mediante el tornillo 70 que se fija en un extremo al sustrato 40 y al alojamiento 50 en el otro extremo mediante el acoplamiento de dicho tornillo 70. La parte de la carcasa 50 que interactúa con las roscas del tornillo 70 está formada a su vez en roscas 71 que, al girar la carcasa 50, alejarán el sustrato 40 del sustrato 30 o lo acercarán. En funcionamiento, el operador llenaría la cubierta/bandeja 20 con el agente como se describió anteriormente, luego colocaría el dispositivo discoide apropiadamente sobre el tejido a tratar. Después de insertar los electrodos en el tejido, el usuario, mientras presiona el dispositivo hacia abajo, rotará el alojamiento 50 en la dirección que moverá los émbolos hacia el sustrato 30 y de ese modo expulsaría el agente a los tejidos. El operador entonces activaría los electrodos, asumiendo que el dispositivo había sido previamente conectado por el enchufe 25 a una fuente de energía eléctrica.

Son posibles todavía otros ejemplos del dispositivo, como por ejemplo el uso de una tuerca de mariposa 80 unida al tornillo 70 para accionar los émbolos 41 (véase la Figura 9). En tal ejemplo, el alojamiento 50 no comprendería roscas 71 de tornillo, sino sólo un orificio liso por el que puede pasar la varilla 60 central roscada. En tal ejemplo, el operador no necesitaría girar la carcasa sino solo la tuerca de mariposa.

Son posibles todavía otros ejemplos del dispositivo, tales como el uso de medios inanimados para accionar la serie de émbolos. Por ejemplo, en lugar de emplear fuerza animada para accionar una tuerca de mariposa, una rueda de pulgar o un tornillo de accionamiento, los émbolos pueden ser accionados por un émbolo accionado por motor. En tal ejemplo, puede colocarse un motor en disposición con la carcasa 50 para, por ejemplo, provocar la rotación bidireccional de la carcasa con respecto al ejemplo descrito en las figuras 6-8. Asimismo, puede fijarse un motor a los engranajes como en el ejemplo de la ruedecilla para accionar la subida y bajada de los émbolos. Además, como entendería un experto en la técnica, el dispositivo puede incluir indicadores para avisar al operador cuando los émbolos han alcanzado su máximo respectivo de desplazamiento hacia dentro o fuera de los pozos 31.

Otros ejemplos más incluyen el uso de cualquier variedad de parámetros de activación, que incluye el uso de pulsos monopolares y/o bipolares en cualquier forma, que incluye pero no se limita a, trenes de pulsos, ventajas de desintegración exponencial, pulsos cuadrados, etc. Además, la invención puede usar pulsos que tengan una intensidad de campo de entre 10 y 1500 V/cm. Además, la invención contempla la capacidad de energizar cada electrodo de la matriz individualmente o junto con cualquier combinación de los electrodos restantes. Por ejemplo, en un ejemplo, pueden pulsarse 4 electrodos adyacentes cualesquiera de modo que dos sean positivos y un par de electrodos opuestos estén ambos cargados negativamente. Tal pulsación proporciona pulsaciones de "par opuesto" como se describe en números de patentes de EE. UU. 5,993,434 y 5,702,359. En otros formatos pulsantes más, pueden activarse pares únicos de electrodos para impartir un pulso de energía de electroporación al tejido hasta que todos los pares de electrodos adyacentes se activen al menos una vez. Aunque no se muestra en las figuras, debe entenderse que el dispositivo descrito en sus diversos ejemplos incluye agujas de electrodo direccionadas individualmente. Esto se logra al incorporar dentro del sustrato 22, por ejemplo, mediante la técnica de sándwich (es decir, el sustrato 22 puede comprender una construcción de dos capas con cables eléctricos colocados en una rejilla entre las dos capas) conexiones de cables eléctricos que van desde los electrodos hasta el costado del dispositivo (como se muestra como conductores 24) que terminan en el enchufe 25 que tiene capacidad de conector de múltiples clavijas.

Ejemplo IV

En este ejemplo, se realizaron una serie de experimentos en ratones en los que se determinaron las tasas de recurrencia tumoral después de la cirugía sola o después de la cirugía y la EPT. Específicamente, este experimento comprende un estudio in vivo para establecer la eficacia de la EPT en el tratamiento de los márgenes quirúrgicos en ratones desnudos después de la introducción subcutánea de células de carcinoma de colon humano HT-29 y la resección de los tumores que surgen de dicha introducción. El experimento se realizó en condiciones humanitarias con respecto al tratamiento de los animales de prueba.

El diseño experimental fue el siguiente. Se colocaron ratones hembras normales atímicos desnudos de 4-6 semanas de edad en 8 grupos de seis ratones cada uno, excepto el Grupo 1 que comprendía 10 animales y el Grupo 3 que comprendía 7 animales. La línea celular HT-29 se deriva de un carcinoma de colon humano y es un tumor agresivo de rápido crecimiento en ratones. En cada grupo, los animales recibieron células tumorales humanas HT-29 en forma de dos inóculos adyacentes de 5 x 106 células mediante el uso de una aguja y una jeringa de calibre 21. La línea celular HT-29 se obtuvo de ECACC (# HTB-38), cultivada en medio McCoy 5a (modificado) con 1,5 mM de L-glutamina ajustada para contener 2,2 g/L de bicarbonato de sodio, 90 %, y suero fetal bovino, 10 %. Las células se dividieron 1:2 a 1:4 en ciclos de crecimiento hasta que estuvieron disponibles suficientes células para usar en este experimento.

Después de la inoculación, los tumores se establecieron en el sitio de las inoculaciones. El volumen del tumor en cada animal se controló regularmente y se calculó mediante el uso de la fórmula: Volumen del tumor = (a2 x b/2) donde 'a' es el diámetro más pequeño y 'b' es el diámetro más grande perpendicular a 'a'. Los tumores se midieron tres veces por semana a partir del día en que los tumores fueron palpables a mano. Se permitió que los tumores progresaran hasta que el tamaño estuvo entre 500 y 1500 milímetros cúbicos. Después se realizó la eliminación quirúrgica del tumor, eliminación parcial o no eliminación en asociación con EPT o sin EPT. En estos experimentos, EPT significa tratamiento con Bleomicina y electroporación (EP). El EP, cuando se realizó, se realizó con un ciclo de pulso (es decir, 6 pulsos a 4 Hz) por inserción de electrodo mediante el uso de un generador MedPulser estándar (Genetronics, Inc. San Diego, CA) y un aplicador con una matriz desechable de seis agujas de 1 cm de diámetro, una distancia entre electrodos de 0,86 cm y una aguja de 1 cm de longitud. Cada pulso cuadrado tuvo una duración de 100 us y un voltaje aplicado de 1500 V. Para los Grupos 4-8 y 10 y 11, después de la inyección intratumoral de Bleomicina, la matriz de electrodos de aguja se insertó de tal manera que abarcara el tumor dentro de la matriz de aguja o, en el caso de los tumores más grandes, de manera que las agujas penetraron en el borde del tumor. La matriz de agujas se insertó de forma percutánea y esencialmente perpendicular a la superficie del flanco del ratón que portaba el tumor. Alternativamente, en aquellos casos en los que el tumor se extirpó primero, seguido de una inyección iv de bleomicina y luego de EP, la matriz de electrodos de aguja se insertó percutáneamente abarcando el área de la herida quirúrgica (Grupos 5-8).

Cuando se usó bleomicina en el experimento, se inyectó a 4 U/ml de solución salina (1U = 1 mg) lo más uniformemente posible en los tejidos tumorales y de los márgenes, como se indica, a una dosis de 0,25 ml/cm 3 de volumen de tejido a ser tratado. Alternativamente, cuando se indique, se inyectó una cantidad correspondiente de bleomicina en la vena de la cola.

El experimento usó 8 cohortes de al menos 6 ratones cada una. Cada cohorte se sometió a un régimen de tratamiento de una combinación de EP, bleomicina, solución salina en lugar de bleomicina, extirpación completa del tumor, extirpación parcial del tumor y sin extirpación del tumor. Las tablas II y III describen los regímenes de tratamiento.

TABLA II

Para los experimentos con animales enumerados en la Tabla II, los animales se anestesiaron, seguido de la eliminación o eliminación parcial del tumor como se indica, seguido a su vez por inyección intravenosa (iv) de Bleomicina o solución salina. La dosis de bleomicina dependía del tamaño del tumor como se describió anteriormente. Después de 3 a 4 minutos, los animales indicados fueron tratados con EP seguido del cierre de la herida con grapas y adhesivo quirúrgico. En la cohorte 1, se extirpó quirúrgicamente todo el tumor (ver, por ejemplo, la Figura 12B y C) y los animales se trataron con Bleomicina y EP. En la cohorte 2, los tumores se extirparon de los animales, pero solo se inyectó solución salina en lugar de bleomicina y no se realizó EP. Sólo se realizó un procedimiento de EP "simulado" en el que la matriz de electrodos se insertó en el tejido pero los electrodos no se pulsaron. En la cohorte 3, los tumores se extirparon parcialmente (al menos el 95 %) seguido de inyección de bleomicina y electroporación. En la cohorte 4, los tumores se eliminaron de nuevo parcialmente, seguido de una inyección de solución salina y una EP simulada.

TABLA III

En la Tabla III, los animales de la cohorte se anestesiaron seguido de la administración intratumoral de solución de Bleomicina a una dosis y volumen como se describió anteriormente. La EP se realizó 10 minutos después de la administración del fármaco, seguida de la eliminación del tumor o la eliminación parcial del tumor 15 minutos más tarde, seguida a su vez por el cierre de la herida. En la cohorte 8, la EP se realizó de forma incompleta (indicada por * en la Tabla III) porque los electrodos de la matriz de agujas se colocaron de manera que la electroporación efectiva solo se produjo en aproximadamente el 75 % del tumor y el tejido del margen asociado. En otras palabras, el tratamiento con EP se compensó con respecto al tumor.

Además de los experimentos anteriores, también aumentamos el tiempo entre la finalización de la EPT y la extirpación del tumor para evaluar la consistencia macroscópica del tejido tumoral y evaluarlo histológicamente. Para este propósito, se usaron tres grupos de cohortes adicionales 9, 10 y 11. El régimen experimental se muestra en la Tabla IV.

TABLA IV

Los animales del Grupo 9 se anestesiaron seguido de la extirpación completa de los tumores. Se examinó la consistencia de los tumores y se conservaron en formalina para una evaluación histológica posterior, al igual que los tejidos tumorales de las cohortes 10 y 11. Los animales anestesiados de la cohorte 10 se sometieron a la administración intratumoral de solución de bleomicina a una dosis y volumen como se describió anteriormente. La EP se realizó 10 minutos después de la administración del fármaco. Los tumores se extirparon 2 horas después de la EP. Los animales de la cohorte 11 se trataron como los de la cohorte 10, excepto que sus tumores se eliminaron por completo 24 horas después de la EP. Todas las heridas se cerraron como se describió anteriormente.

Resultados

Con respecto a las cohortes 1 a 8 anteriores, examinamos la tasa de recurrencia de los tumores en los animales de prueba tres semanas después del tratamiento. Como se describe en la Tabla V y la Figura 15, la mayoría de los animales que recibieron Bleomicina y EP estaban protegidos de la recurrencia del tumor.

(ver la descripción de la Fig. 15 para las definiciones de las abreviaturas en la misma).

TABLA V

Específicamente, los Grupos 1 a 8 proporcionan resultados que indican que el tratamiento del tejido del lecho tumoral proporciona un beneficio inesperado y sorprendente al proteger al animal de tumores recurrentes en el sitio del tratamiento. Como muestran los datos, la extirpación sola no es eficaz, ya sea que los tumores se hayan eliminado total o parcialmente. Esto se debe probablemente a la naturaleza agresiva del tipo de tumor usado que dejó segmentos tumorales invasivos y/o micrometástasis en o cerca del sitio del tumor a pesar de la eliminación quirúrgica cuidadosa del tumor que se correlaciona con tumores agresivos similares en el hombre. Esto imita situaciones encontradas en la terapia quirúrgica humana, aunque las tasas de recurrencia en humanos están generalmente en el rango del 10 al 40 % y no tan altas como las observadas en este experimento con ratones. Es importante destacar que, como lo muestran los resultados de la eliminación parcial del tumor, el uso de EPT con bleomicina se asocia con una reducción sustancial en la recurrencia del tumor, incluso si el procedimiento quirúrgico falló (en este caso a propósito) para extirpar toda la masa tumoral. Además, la vía de administración no parece jugar un papel significativo en la eficacia de esa administración por vía iv y, respectivamente, produjo resultados similares. Además, el efecto de eficacia se proporcionó sorprendentemente incluso después de un intervalo de 15 minutos entre la finalización del tratamiento con Bleomicina-EP y la extirpación del tumor. Los datos apoyan adicionalmente los métodos de tratamiento para tratar eficazmente la siembra de microtumor en el tejido, ya que el experimento en el que la EP se realizó solo parcialmente sin eliminación del tumor, es decir, el campo eléctrico eficaz estaba descentrado del tumor. Aquí, todavía había un 67 % de eficacia, lo que indica que había al menos un efecto microrregional causado por el EPT. En este ejemplo, las cohortes de estudio para probar la administración de Bleomicina sola sin EP o viceversa (es decir, EP sin Bleomicina) no se incluyeron ya que se sabe que la administración de Bleomicina sin EP no tiene actividad antitumoral significativa.

Con respecto a las células tumorales introducidas en los animales de prueba, permitimos que las masas tumorales crecieran hasta un tamaño relativamente grande. Véanse las Figuras 11A, 12A, 13A y 14A que representan tumores en animales de prueba antes del tratamiento. Las Figuras 11B y 12B representan ejemplos de eliminación quirúrgica de tumores en la etapa de tener el tumor expuesto antes de la extirpación final. Las figuras 11C, 12C, 13b y 14B representan ejemplos de la herida después de la eliminación completa del tumor antes de la bleomicina-EPT (Figura 12C) o el tratamiento con EP simulada con solución salina (Figura 11C), o después de la eliminación parcial del tumor antes de la terapia con solución salina al tratamiento simulado(Figura 14^b ), o 15 minutos después de la Bleomicina-EPT i.t. (Figura 13B).

La figura 11D muestra el tumor recurrente después de la extirpación completa del tumor y el tratamiento con EP simulada con solución salina y la figura 14C muestra el tumor recurrente después de la extirpación parcial del tumor y el tratamiento con EP simulada con solución salina. Las Figuras 12D y 13C muestran los sitios tumorales libres de tumor después de la extirpación del tumor y el tratamiento con i.v. Bleomicina y EP, o tratamiento con Bleomicina y EP i.t. con posterior extirpación parcial del tumor, respectivamente. Estos procedimientos tienen ventajas sobre los procedimientos estándar actuales que tratan el cáncer con medicamentos contra el cáncer i.t. o i.v. La extirpación del tumor, ya sea antes o después del tratamiento farmacológico-EPT evita la formación de una gran masa necrótica en el sitio del tumor que el cuerpo tiene que reabsorber o eliminar, lo que empíricamente lleva al menos varias semanas y aumenta la probabilidad de complicaciones. Es probable que la eliminación del tumor antes o después del fármaco-EPT acelere la cicatrización de la herida y reduzca las posibles complicaciones. Además, con esta metodología, pueden usarse inyecciones de fármaco tanto intratumoral como intravenosa.

Con respecto a las cohortes 9-11, observamos que la consistencia del tumor cambia progresivamente con el tiempo después del tratamiento. Cuando se extirpó el tumor dos horas después del tratamiento (cohorte 10), su consistencia era más suave, menos definida y goteaba líquido endémico pero relativamente poca sangre. Los tumores extirpados 24 horas después del tratamiento (cohorte 11) se habían reblandecido por completo hasta una consistencia que a veces se denomina necrosis licuefactiva. En ese momento, la extirpación quirúrgica fue algo difícil porque los límites del tumor estaban mal definidos en comparación con la masa de tejido tumoral sólido de la cohorte 9 de animales. Curiosamente, también notamos un ablandamiento del tumor incluso 15 minutos después del tratamiento cuando extirpamos los tumores de las cohortes 5 y 7, lo que hizo que fuera un poco más difícil realizar la eliminación quirúrgica con límites bien definidos que en el caso de los tumores no tratados. Sin embargo, esto no afectó el éxito del tratamiento ya que las cohortes 5 y 7 no mostraron recurrencia tumoral. Estas observaciones proporcionan una prueba de la oportunidad de usar un fármaco, como Bleomicina u otro agente antineoplásico, en combinación con EPT como terapia adyuvante o reductora de tumores que puede usarse adicionalmente solo o junto con otras terapias contra el cáncer. Por ejemplo, un tumor podría tratarse con Bleomicina-EPT, el material tumoral desintegrado podría eliminarse mediante un simple procedimiento mínimamente invasivo y, si se desea, seguido de tratamientos convencionales tales como radiación o quimioterapia, u otras realizaciones de terapia tumoral. La fácil eliminación del material tumoral licuado también puede permitir que la herida sane más rápido y con menos complicaciones, especialmente en el caso de tumores grandes.

Todas las composiciones y métodos descritos en este documento pueden prepararse y ejecutarse sin experimentación indebida a la luz de la presente divulgación.

Todas las patentes, solicitudes de patente y publicaciones mencionadas en la memoria descriptiva son indicativas de los niveles de los expertos en la técnica a la que pertenece la invención.

La invención descrita ilustrativamente en el presente documento puede ponerse en práctica de manera adecuada en ausencia de cualquier elemento o elementos no descritos específicamente en el presente documento. Así, por ejemplo, en cada caso de la presente memoria, cualquiera de los términos "que comprende", "que consiste esencialmente en" y "que consiste en" puede reemplazarse con cualquiera de los otros dos términos.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES

   Un agente antineoplásico para usar como medicamento para reducir la recurrencia del crecimiento tumoral en un tejido de mamífero en un mamífero en y alrededor de una ubicación en dicho mamífero de un tumor extirpado:

   en el que dicho agente se selecciona a partir del grupo que consiste en Bleomicina, cisplatino, una proteína,

   un anticuerpo, ARNi, un ácido nucleico antisentido, un gen expresable que codifica un polipéptido terapéuticamente activo, una quimiocina y una citocina;

   en el que dicho agente es para la administración a dicho tejido mediante inyección intravenosa o inyectado directamente en y alrededor de dicho tejido antes o simultáneamente con la administración de un pulso eléctrico electroporativo a dicho tejido, que suministra de esta manera dicho agente en las células de dicho tejido lo que resulta en una reducción o eliminación del crecimiento de células tumorales en dicho tejido.

   El agente antineoplásico para usar como medicamento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho ARNi, ácido nucleico antisentido y gen expresable se formulan en una solución de poli-L-glutamato.

   El agente antineoplásico para usar como medicamento de acuerdo con la reivindicación 1, y para usar en el tratamiento de tumores residuales microscópicos que permanecen en dicho tejido después de la resección quirúrgica de dicho tumor:

   en el que dicho agente es para la administración a dicho tejido previamente adyacente a y alrededor de dicho tumor y que contiene dichos tumores residuales, antes de o simultáneamente con la administración a dicho tejido de al menos un pulso eléctrico electroporativo,

   en el que la presencia del agente y el pulso eléctrico electroporativo proporcionan un tratamiento selectivo de dicho tejido para matar dichos tumores residuales.

   El agente antineoplásico para usar como medicamento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho pulso eléctrico electroporativo tiene una intensidad de campo de 200-2000 V/cm; una longitud de pulso de 0,1 a 10,0 ms; un número de pulso 2-20; y una frecuencia de pulso de 1-5 Hz.