ES2874593T3

ES2874593T3 - Formulación farmacéutica que comprende anticuerpo anti-EGFR

Info

Publication number: ES2874593T3
Application number: ES16740356T
Authority: ES
Inventors: Yong Woon Choi; Yoo Hoon Kim; Jungsub Choi
Original assignee: Green Cross Corp Korea
Current assignee: GC Biopharma Corp
Priority date: 2015-01-19
Filing date: 2016-01-15
Publication date: 2021-11-05
Anticipated expiration: 2036-01-15
Also published as: WO2016117883A2; WO2016117883A3; HRP20210890T1; JP2018502139A; WO2016117883A8; US10918717B2; EP3247394A2; CN107249634B; US20170368175A1; EP3247394A4; KR101776879B1; KR20160089136A; PT3247394T; DK3247394T3; HUE054716T2; SI3247394T1; JP6545806B2; EP3247394B1; PL3247394T3; CN107249634A

Abstract

Una formulación farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), acetato de sodio anhidro y polisorbato 80, donde no se incluye cloruro de sodio (NaCl) en la formulación farmacéutica, donde el anticuerpo anti-EGFR es GC1118A, donde el anticuerpo anti-EGFR se encuentra comprendido en una concentración de 2 a 10 mg/ml, donde el acetato de sodio anhidro se encuentra comprendido en una concentración de 10 a 100 mM, y donde el polisorbato 80 se encuentra comprendido en una concentración de 0.05 a 2.0 mg/ml.

Description

DESCRIPCIÓN

Formulación farmacéutica que comprende anticuerpo anti-EGFR

Campo técnico

La presente invención se refiere a una formulación farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-EGFR.

Técnica antecedente

Un anticuerpo de unión al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) se denomina anticuerpo anti-EGFR. Los ejemplos de tal anticuerpo incluyen cetuximab, que es un anticuerpo quimérico que contiene una región variable de origen murino y una región constante de origen humano (Naramura et al., Cancer Immunol. Immunotherapy, 1993, 37: 343-349 y publicación internacional No. WO 96/40210) y MAB 425, que es un anticuerpo de ratón original contra EGFR (Kettleborough et al., Protein Engineering, 1991, 4: 773-783).

De acuerdo con diversos resultados de estudios in vitro e in vivo sobre el anticuerpo anti-EGFR, el anticuerpo anti-EGFR inhibe la proliferación de células cancerosas, reduce la angiogénesis mediada por tumores, induce la apoptosis de las células cancerosas y mejora los efectos tóxicos de la radioterapia y la quimioterapia tradicional. Como tal, el anticuerpo anti-EGFR puede suprimir tumores en diversos niveles.

Sin embargo, una formulación líquida que comprende un anticuerpo anti-EGFR con un fin terapéutico puede presentar problemas en cuanto a que se pueden formar multímeros de proteínas debido a la propiedad de agregación de los anticuerpos, y una reacción de desaminación puede ocurrir también debido a reacciones proteolíticas. Tal reacción de desnaturalización puede ser causada mediante, por ejemplo, el almacenamiento a una temperatura elevada durante el transporte o un esfuerzo de corte. Si una formulación líquida que comprende el anticuerpo anti-EGFR muestra agregación debido a reacciones de desnaturalización, pueden ocurrir una precipitación y la formación de partículas, que pueden inducir una embolia.

A tal respecto, la formulación líquida se puede someter a un proceso de filtración antes de la administración a un paciente (p. ej., inyección mediante una jeringa) con el fin de evitar la agregación. Sin embargo, tal etapa adicional puede hacer que el método de administración sea complicado e inadecuado para una prueba clínica. Además, la formación de partículas puede continuar ocurriendo incluso después del proceso de filtración, lo que conduce a una reducción de la estabilidad.

Por lo tanto, permanece la necesidad de desarrollar una formulación farmacéutica estable que comprenda un anticuerpo anti-EGFR que presenta baja turbidez, sin que muestre agregación o formación de partículas, incluso en condiciones de estrés.

Mientras tanto, una formulación farmacéutica convencional que comprende un anticuerpo anti-EGFR comprende normalmente cloruro de sodio (NaCl) como agente de isotonización con el fin de reducir una reacción de dolor en el cuerpo causada por la presión osmótica cuando se administra la formulación farmacéutica. Sin embargo, una formulación farmacéutica que comprende una terapia proteica debe contener ingredientes apropiados que sean adecuados para esta. A tal respecto, la compatibilidad de NaCl se debería verificar también.

El documento WO 2007/147001 divulga una formulación acuosa estable adecuada para liofilización que comprende un anticuerpo anti-EGFR, preferiblemente cetuximab; ácido lactobiónico; y un regulador, preferiblemente histidina. El documento WO 2011/080209 divulga una formulación farmacéutica que comprende 1 a 200 mg/ml de un anticuerpo anti-EGFR de clase IgG; 1 a 100 mM de un agente regulador; 0.001 % a 1 % (p/v) de un tensioactivo; y 1 a 500 mM de al menos un estabilizador; a un pH que se encuentra en el rango de 4.0 a 7.0.

El documento WO2012/138997 describe proteínas de unión a EGFR derivadas de panitumumab, así como métodos de tratamiento de cánceres y otras enfermedades mediante la administración de proteínas.

El documento WO 2005/058365 divulga una preparación farmacéutica acuosa que contiene un anticuerpo anti-EGFR, que presenta un periodo de conservación aumentado incluso a temperaturas elevadas y se puede utilizar para el tratamiento de tumores.

Divulgación de la invención

Problema técnico

Un objeto de la presente invención consiste en proporcionar una formulación farmacéutica que comprenda un anticuerpo anti-EGFR que muestre una excelente estabilidad.

Solución al problema

La presente invención proporciona una formulación farmacéutica según se define en las reivindicaciones adjuntas, que contiene el anticuerpo anti-EGFR GC1118A, acetato de sodio anhidro y polisorbato 80, que no contiene cloruro de sodio (NaCl).

Efectos ventajosos de la invención

Una formulación farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-EGFR de acuerdo con la presente invención no contiene cloruro de sodio, a diferencia de la mayoría de las formulaciones farmacéuticas convencionales que comprenden un anticuerpo anti-EGFR, que contienen cloruro de sodio. Tal formulación farmacéutica presenta baja turbidez, sin mostrar agregación o formación de partículas, incluso en condiciones aceleradas, y exhibe buena estabilidad. Por lo tanto, la presente formulación farmacéutica se puede utilizar de manera eficaz para el tratamiento del cáncer y similares.

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1A, 1B y 1C muestran respectivamente los resultados de la inspección visual, la turbidez y el análisis de dispersión dinámica de la luz (DLS) mediante el uso de las muestras que se prepararon para la selección del tipo de un tensioactivo y un tonicificador.

Las Figuras 2A y 2B muestran respectivamente los resultados de la turbidez y el análisis DLS mediante el uso de las muestras que se prepararon para la selección de factores relacionados con la agregación y la formación de partículas; y las Figuras 3A y 3B muestran respectivamente los resultados del análisis SE-HPLC e IE-HPLC mediante el uso de estas muestras.

Las Figuras 4A, 4B y 4C muestran respectivamente los resultados de la inspección visual, la turbidez y el análisis DLS mediante el uso de las muestras que se prepararon para el cribado del tipo de tonicificador.

Las Figuras 5A, 5B y 5C muestran respectivamente los resultados de la inspección visual, la turbidez y el análisis DLS mediante el uso de las muestras que se prepararon para la determinación de la concentración de polisorbato 80.

Las Figuras 6A y 6B muestran respectivamente los resultados de la turbidez y el análisis DLS después del almacenamiento a alta temperatura mediante el uso de las formulaciones farmacéuticas de los ejemplos de preparación y los ejemplos de preparación comparativos.

Las Figuras 7A, 7B y 7C muestran respectivamente los resultados de los cambios de turbidez de los ejemplos de preparación 1 a 3 (formulaciones 3 a 5) a diferentes temperaturas.

Las Figuras 8A y 8B muestran respectivamente los resultados de SDS-PAGE de las formulaciones farmacéuticas de los ejemplos de preparación y los ejemplos de preparación comparativos almacenados a 37 °C, en condiciones reductoras y no reductoras.

Las Figuras 9 a 14 muestran respectivamente los resultados de la inspección visual, la concentración de proteínas, SE-HPLC, IE-HPLC, IEF (enfoque isoeléctrico) y el análisis SDS-PAGE de cada muestra que se preparó mediante el diseño de la metodología de superficie de respuesta (RSM) en condiciones de almacenamiento de 37 °C durante dos semanas.

Las Figuras 15 a 18 muestran respectivamente los resultados de la inspección visual, la turbidez, el análisis DLS y la potencia 1 (ensayo de unión) de cada muestra que se preparó mediante el diseño RSM en condiciones de almacenamiento de 60 °C durante 1 día.

La Figura 19 muestra el resultado del gráfico optimizado de las muestras que se prepararon mediante el diseño RSM.

El mejor modo de realizar la invención

La presente invención proporciona una formulación farmacéutica líquida que contiene un anticuerpo anti-EGFR, acetato de sodio anhidro y polisorbato 80, que no contiene cloruro de sodio (NaCl). El anticuerpo anti-EGFR es GC1118A y se encuentra comprendido en una concentración de 2 a 10 mg/ml, el acetato de sodio anhidro se encuentra comprendido en una concentración de 10 a 100 mM y el polisorbato 80 se encuentra comprendido en una concentración de 0.05 a 2.0 mg/ml.

La formulación farmacéutica de la presente invención se puede encontrar preferiblemente en forma de formulación líquida, teniendo en cuenta la conveniencia del usuario.

La formulación farmacéutica de la presente invención se caracteriza porque no contiene NaCl.

De manera general, las formulaciones farmacéuticas que contienen un anticuerpo anti-EGFR comprenden NaCl como modificador de tonicidad con el fin de reducir una reacción de dolor en el cuerpo causada por la presión osmótica cuando se administra la formulación farmacéutica. Sin embargo, a diferencia de las formulaciones farmacéuticas convencionales, el NaCl no se encuentra comprendido en las formulaciones farmacéuticas de la presente invención, de manera tal que se prepara una formulación farmacéutica más estable que comprende un anticuerpo anti-EGFR que presenta baja turbidez, sin mostrar agregación o formación de partículas, incluso en condiciones de aceleración. No se incluye NaCl en la formulación de anticuerpo anti-EGFR de la presente invención, considerando la compatibilidad con NaCl, lo que conduce a una agregación y una formación de partículas mínimas, lo que permite la distribución de productos más estables.

En una realización de la presente invención, se examinaron los principales factores que influyen en la turbidez, la agregación y la formación de partículas de una formulación de anticuerpo. Se encontró que los principales factores que influyeron en la turbidez eran el NaCl, la concentración de agente regulador y el pH (Figura 2A); y de acuerdo con el análisis DLS, se encontró que los principales factores que influyeron en la reducción de la intensidad del monómero eran el pH y el NaCl (Figura 2B). Además, de acuerdo con el análisis SE-HPLC, se encontró que los principales factores que influyeron en la reducción del pico principal eran el pH y el NaCl (Figura 3A); y de acuerdo con el análisis IE-HPLC, los principales factores que influyeron en la reducción del pico principal eran el pH y la concentración de agente regulador (Figura 3B).

Sobre la base de estos resultados, la formulación de anticuerpos no debe contener NaCl para reducir la turbidez e inhibir la agregación y la formación de partículas.

La formulación farmacéutica de la presente invención contiene un anticuerpo anti-EGFR. El anticuerpo anti-EGFR se encuentra comprendido en una concentración de 2 a 10 mg/ml (por ejemplo, 10 mg/ml).

El anticuerpo anti-EGFR para su uso en la presente invención es el anticuerpo anti-EGFR GC1118A que ya se conoce y se encuentra disponible comercialmente por Mogam Biotechnology Institute. Un estudio de GC1118A (que se denomina a veces también como simplemente GC1118) se describe en Lim et al., Mol. Cancer Ther. 15 (2), 251 263 (2016). Lim et al. señalan que “la estructura del complejo sEGFR-GC1118 se encuentra depositada en PDB (PDB ID: 4UV7)”. La entrada p Db del NCBI (Centro Nacional de Información Biotecnológica) para el número de acceso 4UV7 brinda las secuencias de aminoácidos VH y VL como siguen a continuación:

>pdb|4uv7|H

EVQLVESGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYDMSWIR

Q APGKGLE WV S GIL GGS ERS Y YRD S VKGRFTIS RDN SR

KTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHGSPGYTLYAWDYWGQ

GTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK

DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV

VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKAEPKSC

>pdb|4uv7|L

DIVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSNQDLTHSNGNTYL

EW YLQKPGQ S PRLLIYKV SNRF S GVPDRF S GS GAGTDF

TLRISRVEAEDVGVYYCMQGTHWPWTFGQGTKVDIKRT

VAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQ

WKVDNALNSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKAD

YEKHKV YACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC

La formulación farmacéutica de la presente invención contiene acetato de sodio anhidro como agente regulador.

Los factores que influyen en la turbidez, la agregación y la formación de partículas incluyen la concentración de agente regulador y el pH. Por lo tanto, el tipo de agente regulador y su concentración y el pH son factores importantes.

Se utiliza acetato de sodio anhidro para mantener el pH de una formulación farmacéutica de la presente invención, el cual minimiza los cambios de pH debidos a influencias externas.

Con el fin de reducir la turbidez e inhibir la agregación y la formación de partículas en la formulación farmacéutica, se debería seleccionar un rango de pH apropiado.

Se puede incluir acetato de sodio anhidro en una concentración de 10 a 100 mM (por ejemplo, 50 mM).

Una formulación farmacéutica de la presente invención puede presentar un pH que se encuentra en el rango de 5 a 7, preferiblemente de 5.3 a 6.1.

La formulación farmacéutica de la presente invención contiene polisorbato 80 como tensioactivo.

De manera general, una solución que contiene un anticuerpo presenta una tensión superficial alta en la interfaz aireagua. Para reducir tal tensión superficial, los anticuerpos presentan una tendencia a agregarse en la interfaz aireagua. Mediante la minimización de la agregación del anticuerpo en la interfaz aire-agua, un tensioactivo ayuda a mantener la actividad biológica de los anticuerpos en la solución.

Se realizó una prueba de esfuerzo mecánico de una formulación de anticuerpo que contiene polisorbato 80, polisorbato 20 o poloxámero 188 como tensioactivo. Como resultado, se encontró que resulta preferible contener polisorbato 80 para lograr los efectos de reducción de la turbidez e inhibición de la agregación y la formación de partículas de la formulación farmacéutica (véase ejemplo 1).

De manera adicional, con respecto a una formulación de anticuerpo que contiene diversas concentraciones de polisorbato 80, se encontró que una formulación de anticuerpos que contiene polisorbato 80 en una concentración de 0.05 a 2.0 mg/ml presenta los efectos de reducción de la turbidez e inhibición de la agregación y la formación de partículas. En particular, se encontró que el grado de agregación y formación de partícula resultaba ser el menor cuando el polisorbato 80 se encontraba comprendido en una concentración de 0.2 mg/ml (véase el ejemplo 4). Por lo tanto, el polisorbato 80 se puede encontrar comprendido en una concentración de 0.05 a 2.0 mg/ml, preferiblemente de 0.1 a 1.0 mg/ml (por ejemplo, 0.2 mg/ml).

La formulación farmacéutica de la presente invención puede contener, además, un tonicificador.

Un tonicificador en la presente invención cumple el rol de inhibir la agregación y la degradación de la formulación farmacéutica.

En particular, se prefiere el uso de manitol, glicina o una combinación de estos como tonicificador, de manera tal que se reduce la turbidez y se inhibe la agregación y la formación de partículas. De acuerdo con una realización de la presente invención, se encontró que una formulación de anticuerpos que contiene manitol o glicina como tonicificador puede inhibir de manera significativa el aumento de la turbidez (véase ejemplo 3).

El tonicificador puede ser manitol, que se puede encontrar comprendido en una concentración del 1 % al 20 % (p/v), preferiblemente del 2 % al 10 % (p/v), por ejemplo, 5 % (p/v).

El tonicificador puede ser glicina, que se puede encontrar comprendida en una concentración del 1 % al 10 % (p/v), preferiblemente del 2 % al 5 % (p/v), por ejemplo, 3 % (p/v).

El tonicificador puede ser una combinación de manitol y glicina donde el manitol y la glicina se mezclan en una relación de peso de 5:1 a 1:5, que se puede encontrar comprendida en una concentración del 1 % al 10 % (p/v), preferiblemente, del 2 % al 5 % (p/v).

Una realización de la presente invención proporciona una formulación farmacéutica que consiste en 10 mg/ml del anticuerpo anti-EGFR, 50 mM de acetato de sodio anhidro y 0.2 mg/ml de polisorbato 80, que no contiene NaCl. Otra realización de la presente invención proporciona una formulación farmacéutica que consiste en 10 mg/ml del anticuerpo anti-EGFR, 50 mM de acetato de sodio anhidro, 0.2 mg/ml de polisorbato 80 y 5 % (p/v) de manitol, que no contiene NaCl.

Una realización adicional de la presente invención proporciona una formulación farmacéutica que consiste en 10 mg/ml del anticuerpo anti-EGFR, 50 mM de acetato de sodio anhidro, 0.2 mg/ml de polisorbato 80 y 3 % (p/v) de glicina, que no contiene NaCl.

De acuerdo con los resultados del análisis de estabilidad que se examinó en condiciones de estrés, las formulaciones farmacéuticas de la presente invención mantuvieron un estado incoloro y transparente, mostrando una tasa baja de aumento de turbidez; y no exhibieron agregaciones incluso después de un almacenamiento prolongado, manteniendo una buena pureza, en comparación con una formulación farmacéutica que contiene NaCl. Sobre la base de estos resultados, se encontró que una formulación farmacéutica que contiene el anticuerpo anti-EGFR presenta una estabilidad superior cuando no se incluye NaCl (véanse ejemplos de prueba).

Una formulación farmacéutica de acuerdo con la presente invención puede contener, además, aditivos farmacéuticamente aceptables tales como un diluyente, un vehículo, un estabilizador, un antioxidante, un conservante, etc., si resulta necesario.

El diluyente puede ser una solución salina, glucosa, Ringer o una solución reguladora acuosa. El vehículo puede ser una solución salina regulada, etanol, poliol (p. ej., glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido) y similares. El estabilizador puede ser un aminoácido, ciclodextrina, polietilenglicol, albúmina (p. ej., albúmina de suero humano (HSA) y albúmina de suero bovino (BSA)), una sal (p. ej., cloruro de sodio, cloruro de magnesio y cloruro de calcio), un quelante (p. ej., EDTA) y similares. El antioxidante puede ser ácido ascórbico, glutatión y similares. El conservante puede ser fenol, m-cresol, metil o propilparabeno, clorobutanol, cloruro de benzalconio y similares. Una formulación farmacéutica de acuerdo con la presente invención se puede administrar de diversas maneras que se conocen en la técnica, por ejemplo, administración oral o parenteral. Los ejemplos de administración parenteral pueden incluir intravenosa, intramuscular, intraarterial, intramembranosa, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, vía broncoscópica, subcutánea, intrasubcutánea, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intratecal, inyección e infusión epidural e intraesternal, pero sin limitación a estas.

La dosis diaria de una formulación farmacéutica de la presente invención puede variar entre 0.01 y 10 mg/kg (peso corporal), preferiblemente de 0.01 a 1.0 mg/kg de peso corporal, y se puede administrar una vez o en dosis divididas al día. Sin embargo, la dosis real de la formulación farmacéutica se debe determinar teniendo en cuenta diversos factores relevantes, tales como la vía de administración, la edad, el sexo, el peso, la gravedad de la enfermedad, etc., y de este modo, la dosis anterior no se limita al alcance de la presente invención de ninguna manera.

Ejemplos

A continuación, la presente invención se explica en detalle mediante ejemplos. Los siguientes ejemplos se dirigen a ilustrar la presente invención de manera adicional sin limitar su alcance.

Los proveedores de los reactivos que se utilizan en los ejemplos que siguen a continuación son los siguientes. Reactivos y soluciones de prueba

Acetato de sodio anhidro (Scharlau, Cat. No. SO0032)

Fosfato de sodio monobásico (Scharlau, Cat. No. SO0333)

Fosfato de sodio dibásico (JT Baker, Cat. No. 3817-05)

Polisorbato 20 (Tween 20, Merck, Cat. No. 8.17072.1000)

Polisorbato 80 (Tween 80, Fluka, Cat. No. 59924)

Poloxámero 188 (Pluronic F68, Sigma, Cat. No. P-1300)

NaCl (Scharlau, Cat. No. SO0225)

Manitol (JT Baker, Cat. No. 238506)

Sorbitol (Sigma, Cat. No. S7547)

Glicina (Sigma, Cat. No. 15527)

Trehalosa dihidrato (Sigma, Cat. No. T5251)

Clorhidrato de arginina (Arg-HCl, Scharlau, Cat. No. AR0125)

Las muestras de los ejemplos que siguen a continuación se prepararon mediante la mezcla de los ingredientes de acuerdo con cada condición de diseño, la filtración a través de un filtro de 0.22 pm, la subdivisión en viales de vidrio de 3 ml en un banco limpio y la cubierta con un tapón de goma, que se almacenó para su uso en los experimentos.

Los métodos de prueba que se utilizaron en la presente invención son los siguientes.

(1) Estrés mecánico: se fijó un vial en un agitador vorticial (Vortex-Genie 2, Scientific Industries) y se sometió a agitación vorticial a 3000 r.p.m. a temperatura ambiente durante 4 horas.

(2) Estrés térmico: se colocó un vial en un termohigrostato de 37 °C (LHD-2250C, Labtech) o un termostato de 60 °C (DX7, Hanyoung).

(3) Inspección visual: se observó la formación de agregaciones a simple vista.

(4) Turbidez: después de preparar 1 ml de cada solución de muestra sin diluir, se midió la absorbancia mediante el uso de un espectrofotómetro UV (LibraS32, Biochem) a 350 nm, para analizar la turbidez.

(5) Dispersión dinámica de luz (DLS): después de preparar al menos 1 ml de cada solución de muestra sin diluir, se analizó el gráfico de distribución por tamaño de la solución de muestra mediante el uso de un instrumento DLS (Zetasizer Nano ZS90, Malvern Instrument).

(6) SDS-PAGE: el análisis se llevó a cabo mediante un método de análisis SDS-PAGE convencional mediante el uso de un dispositivo de electroforesis

(7) Enfoque isoeléctrico (IEF): el análisis se llevó a cabo mediante un método de análisis IEF convencional mediante el uso de un dispositivo de electroforesis.

(8) Cuantificación de proteínas UV: la absorbancia se midió mediante el uso de un espectrofotómetro a 280 nm y se llevó a cabo el análisis de cuantificación de proteínas.

(9) SE-HPLC: el análisis se llevó a cabo mediante el uso de una columna analítica SE-HPLC (TSK gel G3000SW^xl, Cat. No. 08541, Tosoh Corporation).

(10) IE-HPLC: el análisis se llevó a cabo mediante el uso de una columna analítica IE-HPLC (Propac WCX-10 analítica, Cat. No. 054993, Dionex).

(11) Potencia 1 (ensayo de unión): se utilizó un lector de ELISA (Spectra Max 190, Molecular Devices) para el análisis de potencia 1.

(12) Potencia 2 (ensayo sobre la base de células): el número idéntico de células que se calculó mediante el recuento de células se dividió en alícuotas en cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Después de cultivarlos durante 24 horas, se retiró el medio de cultivo. Luego, se colocaron 100 pl de solución de muestra en cada pocillo. Y se colocaron 100 pl de sustancia convencional diluida y muestra diluida en cada pocillo y se cultivaron durante 5 días. Se colocaron 40 pl de reactivo MTS en cada pocillo y se envolvieron con una lámina y se hicieron reaccionar a 37 °C durante 3 horas. La absorbancia se midió a 490 nm mediante el uso de un lector ELISA (Spectra Max 190, Molecular Devices).

Cribado para la preparación de una formulación de anticuerpos optimizada

Ejemplo 1: Selección del tipo de tensioactivo y tonicificador

Para seleccionar el tipo de tensioactivo y tonicificador que pueden inhibir la agregación y la formación de partículas, cada muestra se preparó mediante la mezcla de los ingredientes según se muestra en la Tabla 1.

T l 11

continuación

Se realizó una prueba de esfuerzo mecánico con las muestras que se prepararon anteriormente, y los resultados de la inspección visual, la turbidez y el análisis DLS se muestran en las Figuras 1A, 1B y 1C, respectivamente.

Según se muestra en la Figura 1, la turbidez que se determinó mediante inspección visual fue del orden de # 1, # 5, # 8> # 7, # 9> # 6> # 2, # 3, # 4. Y la medición de la turbidez de las muestras reveló los siguientes resultados: las muestras con un tensioactivo no mostraron aumento de turbidez; y las muestras con un tonicificador adicional mostraron reducción de la turbidez. Más particularmente, la muestra con la adición de Arg-HCl (# 6) mostró una reducción del 46 % y la muestra con adición de trehalosa (# 9) mostró una reducción del 12 % de la turbidez en comparación con la muestra # 1. El análisis DLS reveló que un tensioactivo inhibía la formación de agregación, mientras que un tonicificador aumentaba la intensidad de agregación.

Por lo tanto, con respecto a un tensioactivo (considerando la turbidez, la formación de agregación y otras formulaciones de fármacos de competencia), se prefirió polisorbato 80 (PS80) con respecto a polisorbato 20 (PS20) o poloxámero 188 (P-188); y con respecto a un tonicificador, se prefirió Arg-HCl, en términos de turbidez.

Ejemplo 2: selección de factores para la agregación y la formación de partículas

Para Identificar los principales factores que influyen en la agregación y la formación de partículas en una formulación farmacéutica que contiene un anticuerpo anti-EGFR (GC1118A, Mogam Biotechnology Institute), cada muestra se preparó mediante la mezcla de los ingredientes según se muestra en la Tabla 2.

T l 2

continuación

Se realizó una prueba de estrés térmico con las muestras que se prepararon anteriormente. Después de la prueba de estrés térmico (almacenamiento a 37 °C durante 2 semanas), se realizó el análisis de turbidez mediante inspección visual y se llevaron a cabo los análisis DLS, SE-HPLC e IE-HPLC para seleccionar los tres factores principales que influyen en la agregación y la formación de partículas.

Para la selección de los factores principales se utilizó el software Minitab, de manera tal que se analizaron los resultados del gráfico de Pareto (alfa= 0.15). Los resultados se muestran en los gráficos 2A y 2B y las Figuras 3A y 3B.

Según se muestra en la Figura 2, los principales factores que influyeron en la turbidez fueron el NaCl, la concentración de regulador y el pH (Figura 2A). Además, los resultados del análisis DLS indicaron que los principales factores que influyeron en la reducción de la intensidad del monómero fueron el pH y el NaCl (Figura 2B). De manera adicional, según se muestra en la Figura 3, los resultados del análisis SE-HPLC indicaron que los principales factores que influyeron en la reducción del pico principal fueron el pH y el NaCl (Figura 3A). Además, los resultados del análisis IE-HPLC indicaron que los principales factores que influyeron en la reducción del pico principal fueron el pH y la concentración de regulador (Figura 3B).

Sobre la base de los resultados, se seleccionaron el pH, el NaCl y la concentración de regulador como los factores principales que influyen en la agregación y la formación de partículas. En los siguientes experimentos, se llevó a cabo el diseño de la metodología de superficie de respuesta (RSM) mediante el uso del programa Minitab.

Ejemplo 3: Selección de condiciones para la formulación farmacéutica mediante el diseño RSM

Con el fin de examinar los principales factores que influyen en la agregación y la formación de partículas que se seleccionan en el Ejemplo 2 con respecto a una condición optimizada para una formulación líquida estable en condiciones de estrés térmico, el diseño RSM se llevó a cabo mediante el programa Minitab (CCI, nivel 5), y se prepararon diversas muestras de acuerdo con el pH (4 a 8) y las concentraciones de NaCl (0 a 300 mM) y regulador (10 a 100 mM).

Los ingredientes específicos de las muestras que se prepararon se describen en la Tabla 3 que sigue a continuación.

T l 1

continuación

En primer lugar, cada muestra se preparó mediante la mezcla de los ingredientes según se indica en la Tabla 3. Las muestras que se prepararon se sometieron a pruebas térmicas, en condiciones de almacenamiento de: (i) 37 °C durante dos semanas; o (ii) 60 °C durante un día.

Los resultados de la inspección visual, la concentración de proteínas, los análisis SE-HPLC, IE-HPLC, IEF y SDS-PAGE de cada muestra en condiciones de almacenamiento de 37 °C durante dos semanas se muestran en las Figuras 9 a 14. El resultado del análisis de inspección visual reveló que solo el # 9 era opaco mientras que todos los demás eran incoloros y transparentes, y los resultados de IEF revelaron que el # 9 mostró un fenómeno de arrastre de banda causado por la formación de partículas.

Los resultados de la inspección visual, la turbidez y el análisis de DLS, y el ensayo de unión 1 de cada muestra en las condiciones de almacenamiento de 60 °C durante un día se muestran en las Figuras 15 a 18. El análisis de inspección visual mostró que la turbidez se encontraba en el orden de # 9> # 5> # 7> # 1 y # 3 (todas las demás muestras eran incoloras y transparentes), y el resultado del ensayo de unión 1 mostró que la muestra # 15 presentaba % de EC⁵⁰% del 114 % al 121 % en comparación con un grupo de control.

De manera adicional, en la Figuras 19 y en la Tabla 4 se muestra un gráfico optimizado sobre la base de los resultados anteriores.

T l 4

continuación

Las condiciones de una preparación farmacéutica preferida que se sugirieron mediante análisis estadístico sobre la base de los resultados de la Tabla 4 se muestran en la Tabla 5 que sigue a continuación.

T l 1

Más particularmente, se encontró que la condición que satisface una potencia deseada mientras minimiza la agregación, la formación de partículas y la variación potencial bajo la condición de estrés térmico es una concentración de proteína (anticuerpo anti-EGFR) de 10 mg/ml, acetato de sodio de 10 a 100 mM, pH de 5.3 a 6.1 y NaCl 0 mM (basado en el contorno). Además, la condición de seguridad óptima entre las condiciones anteriores fue un pH de 5.94, acetato de sodio 50 mM y sin NaCl (es decir, NaCl 0 mM) (basado en el gráfico optimizado).

Ejemplo 4: cribado del tipo de tonicificador

Para seleccionar el tipo de tonicificador para utilizar en la formulación farmacéutica de acuerdo con la presente invención, cada muestra se preparó mediante la mezcla de los ingredientes según se muestra en la Tabla 6. Las muestras que se prepararon se almacenaron a 60 °C durante un día, y luego los resultados de la inspección visual, la turbidez y el análisis DLS se muestran en las Figuras 4A, 4B y 4C, respectivamente.

T l 1

continuación

Como se muestra en la Figura 4, el resultado del análisis de inspección visual mostró que todas las muestras eran incoloras y transparentes (Figura 4A), y los resultados de la turbidez y el análisis DLS mostraron que las formulaciones que contenían 3 % de glicina o 5 % de manitol inhibieron de manera significativa el aumento de la turbidez (Figuras 4B y 4C).

Ejemplo 5: determinación de la concentración de polisorbato 80

Con el fin de determinar la concentración de polisorbato 80 para utilizar en una formulación farmacéutica de acuerdo con la presente invención, cada muestra se preparó mediante la mezcla de los ingredientes según se muestra en la Tabla 7. Luego, las muestras que se prepararon se sometieron a pruebas mecánicas y los resultados de la inspección visual, la turbidez y el análisis DLS se muestran en las Figuras 5A, 5B y 5C, respectivamente.

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Como se muestra en la Figura 5, solo la muestra # 1 era opaca y todas las demás muestras eran incoloras y transparentes (Figura 5A). De manera adicional, no existió un cambio significativo de turbidez excepto en la muestra # 1, y se observó un efecto de inhibición de la turbidez en todo el rango de concentración de 0.05 a 2.0 mg/ml (Figura 5B). Mientras tanto, el resultado del análisis DLS reveló también que el efecto de inhibición de la agregación se observó en todo el rango de concentración de 0.05 a 2.0 mg/ml (Figura 5C).

Entre ellos, 0.2 mg/ml de polisorbato 80 dieron como resultado la agregación más baja y esa concentración se eligió como la óptima.

Ejemplos de preparación 1 a 3 y ejemplos de preparación comparativos 1 y 2: preparación de formulaciones farmacéuticas

Las formulaciones farmacéuticas líquidas se prepararon de manera convencional mediante el uso de los ingredientes que se muestran en la Tabla 8.

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Ejemplo de prueba: análisis de estabilidad de formulaciones farmacéuticas

Después del almacenamiento de las formulaciones farmacéuticas que se prepararon de acuerdo con los ejemplos de preparación 1 a 3 y los ejemplos de preparación comparativos 1 y 2 en las condiciones de estrés que se describen a continuación, se llevaron a cabo los análisis de inspección visual, turbidez, DLS, contenido de proteínas, SE-HPLC, IE-HPLC, SDS-PAGE, IEF y potencias 1 y 2.

Condiciones de estrés

(1) almacenamiento a 60 °C durante 2 semanas (1 día, 3 días, 1 semana y 2 semanas)

(2) almacenamiento a 5 °C, 25 °C o 37 °C durante 2 semanas a 12 meses (inicial, 2 semanas, 4 semanas, 6 semanas, 8 semanas y 3 a 12 meses)

Resultados

En la condición de almacenamiento a 60 °C durante dos semanas, los resultados del análisis de inspección visual revelaron que las formulaciones farmacéuticas de los ejemplos de preparación comparativos 1 y 2 se volvieron opacas, mientras que la formulación del ejemplo de preparación 3 permaneció incolora y transparente después de 2 semanas de almacenamiento. La turbidez y el análisis DLS indicaron que la formulación farmacéutica del ejemplo de preparación 3, que contenía manitol y polisorbato 80, mostró el menor aumento de turbidez (Figuras 6A y 6B).

En la condición de almacenamiento a 5 °C, 25 °C o 37 °C durante 2 semanas a 12 meses, el resultado del análisis de inspección visual reveló que todas las formulaciones farmacéuticas eran incoloras y transparentes en cualquiera de las condiciones de almacenamiento. El análisis del cambio de turbidez de las formulaciones almacenadas a temperaturas diferentes indicó que las muestras almacenadas a 5 °C o 25 °C no mostraron cambios de la turbidez independientemente del tipo de formulación. Sin embargo, entre las muestras almacenadas a 37 °C, la formulación # 4 del ejemplo de preparación 2 mostró un aumento de 2.3 veces de la turbidez después de 8 semanas de almacenamiento en comparación con el punto inicial (Figura 7).

Por otro lado, el análisis cuantitativo de proteína UV reveló que todas las formulaciones en cualquiera de las condiciones de temperaturas se encontraban en el rango del 95 % al 105 % en comparación con el punto inicial, sin mostrar cambios significativos.

El resultado del análisis SDS-PAGE indicó que no existía diferencia en los patrones de bandas de acuerdo con las temperaturas de almacenamiento entre los Ejemplos de preparación y los Ejemplos de preparación comparativos. Sin embargo, según se puede observar a partir de las Figuras 8A y 8B, los resultados en el punto inicial y después de 8 semanas de almacenamiento a 37 °C en condiciones no reductoras y reductoras indicaron diferencias en los patrones de bandas entre las muestras en el punto inicial y después del almacenamiento a alta temperatura. En condiciones no reductoras, la totalidad de las formulaciones # 1 a # 5 de los Ejemplos de preparación y los Ejemplos de preparación comparativos después del almacenamiento a 37 °C mostraron un aumento de la intensidad de la banda a 250 kD, y de 37 a 50 kD en comparación con el punto inicial. Además, en condición reductora, las formulaciones # 1 a # 5 de los Ejemplos de preparación y los Ejemplos de preparación comparativa después del almacenamiento a 37 °C mostraron un aumento en la intensidad de la banda a 75 kD, y nuevas formaciones de banda a 25 a 50 kD, en comparación con el punto inicial.

Mientras tanto, los resultados de IEF indicaron que no existía diferencia en los patrones de bandas de IEF entre las formulaciones o de acuerdo con temperaturas diferentes en cualquiera de las condiciones de almacenamiento, y las bandas se posicionaron entre el pI de 7.8 a 8.3.

Los resultados del análisis SE-HPLC indicaron que la totalidad de las formulaciones # 1 a # 5 de los ejemplos de preparación y los ejemplos de preparación comparativos no mostraron cambios de pureza significativos después del almacenamiento a 5 °C o 25 C. Sin embargo, después del almacenamiento a 37 °C durante 8 semanas, las formulaciones # 1, # 2, # 3, # 4 y # 5 mostraron valores del 95.66 %, 95.15 %, 96.46 %, 96.42 % y 96.56 %, respectivamente, lo que implica una reducción de la pureza del 3.14 % al 4.55 %, en comparación con el punto inicial. Como tal, se encontró que las formulaciones de los ejemplos de preparación de la presente invención mostraron una estabilidad significativamente mayor en comparación con los ejemplos de preparación comparativos. Particularmente, las formulaciones de los ejemplos de preparación comparativos mostraron una gran proporción de reducción de la pureza, que se causó por el aumento de la porción antes del pico (se presume que se trató de agregaciones) que preceden al pico principal.

Los resultados del análisis de potencia 2 (ensayo sobre la base de células) revelaron que la totalidad de las formulaciones, independientemente de la temperatura de almacenamiento mostraron una EC⁵⁰del 70 % al 130 % en comparación con el grupo de control, lo que indica que no hubo cambios significativos.

Los resultados anteriores indican que un tonicificador para inhibir la agregación y la formación de partículas en la condición de estrés térmico para su uso en una formulación farmacéutica que comprende el anticuerpo anti-EGFR puede ser NaCl, glicina, manitol o similares, preferiblemente manitol o ausencia de NaCl; y la concentración preferida de polisorbato 80 para inhibir la agregación y la formación de partículas en condiciones de estrés mecánico es de 0.2 mg/ml.

Además, el resultado del análisis de estabilidad de las formulaciones farmacéuticas después del almacenamiento a la temperatura alta de 60 °C indicó que una formulación que comprende 10 mg/ml de un anticuerpo anti-EGFR se puede estabilizar en condiciones de estrés mecánico/térmico al contener 50 mM de acetato de sodio, pH 5.7 ± 0.4, 0.2 mg/ml de polisorbato 80 y 5 % de manitol.

De manera adicional, el resultado del análisis de estabilidad de las formulaciones farmacéuticas después del almacenamiento a 5 °C, 25 °C y 37 °C durante 8 semanas indicó que se prefiere que la formulación que comprende 10 mg/ml de anticuerpo anti-EGFR contenga, además, 50 mM de acetato de sodio, pH 5.7 ± 0.4, 0.2 mg/ml de polisorbato 80, sin contener NaCl en cuanto a la estabilidad física/química.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una formulación farmacéutica que comprende un anticuerpo anti-receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), acetato de sodio anhidro y polisorbato 80,

donde no se incluye cloruro de sodio (NaCl) en la formulación farmacéutica,

donde el anticuerpo anti-EGFR es GC1118A,

donde el anticuerpo anti-EGFR se encuentra comprendido en una concentración de 2 a 10 mg/ml,

donde el acetato de sodio anhidro se encuentra comprendido en una concentración de 10 a 100 mM, y donde el polisorbato 80 se encuentra comprendido en una concentración de 0.05 a 2.0 mg/ml.

2. La formulación farmacéutica de la reivindicación 1, que comprende, además, un tonicificador que se selecciona a partir de manitol, glicina o una combinación de estos.

3. La formulación farmacéutica de la reivindicación 1, donde el pH de la formulación farmacéutica varía de pH 5.3 a 6.1.

4. La formulación farmacéutica de la reivindicación 2, donde el tonicificador es manitol y se encuentra comprendido en una concentración del 1 % al 20 % (p/v).

5. La formulación farmacéutica de la reivindicación 2, donde el tonicificador es glicina y se encuentra comprendido en una concentración del 1 % al 10 % (p/v).

6. La formulación farmacéutica de la reivindicación 2, donde el tonicificador es una mezcla de manitol y glicina que se mezclan en una relación de peso de 5:1 a 1:5, y se encuentra comprendido en una concentración del 1 % al 10 % (p/v).