ES2874888T3 - Extracto acuoso de trufa y composición cosmética del mismo - Google Patents

Abstract

Una composición que comprende un extracto acuoso de trufa, que comprende compuestos que tienen un peso molecular inferior a 5 kDa, en donde dicho extracto de Trufa se obtiene del cuerpo fructífero de Tuber Melanosporum mediante extracción acuosa e hidrólisis enzimática realizada con enzimas seleccionadas entre carbohidrasas y proteasas, en donde después de la hidrólisis enzimática, se lleva a cabo una etapa de desactivación de enzimas, y un medio fisiológicamente aceptable, que se aplica tópicamente a la piel, las mucosas y/o los apéndices cutáneos superficiales, para el uso para proteger la piel contra las agresiones debidas a la radiación ultravioleta.

Description

DESCRIPCIÓN

Extracto acuoso de trufa y composición cosmética del mismo

Campo técnico

La presente invención pertenece al campo de la cosmética y más concretamente al campo del cuidado de la piel. La invención se refiere a los usos de una composición que comprende un extracto de trufa.

El extracto de trufa se puede usar solo o en combinación con otros agentes activos.

Antecedentes

La piel es un órgano vital compuesto por varias capas (dermis, capas proliferativas y stratum corneum), que recubre toda la superficie del cuerpo y asegura funciones protectoras, sensibles, inmunes, metabólicas o termorreguladoras. La piel, como los demás órganos, está sujeta al envejecimiento.

Por ejemplo, la apariencia de la piel se ve modificada por diversos tipos de agresiones internas (enfermedades y cambios hormonales tales como el embarazo) o externas (factores ambientales, tales como contaminación, luz solar, patógenos). Entonces pueden aparecer arrugas y líneas finas, hiperpigmentación o imperfecciones de hipopigmentación, sequedad o incluso deshidratación de la piel, adelgazamiento de la epidermis, elastosis, imperfecciones, manchas de la edad. Todos estos cambios afectan no solo a la piel, sino también a los apéndices queratinosos tales como las uñas y el cabello.

Se sabe que los radicales libres, especies químicamente inestables y muy reactivas generadas por el metabolismo intracelular o agresiones externas, juegan un papel clave en el proceso de envejecimiento y más particularmente en la formación de proteínas oxidadas y dañadas (Harman y otros "Aging: a theory based on free radical and radiation chemistry" J. Gerontol., 11, 298-300). Estas agresiones externas pueden incluir: radiación ultravioleta, toxinas, contaminantes atmosféricos, oxidantes alimentarios. La exposición de la piel a las radiaciones ultravioleta induce una gran generación de especies reactivas del oxígeno (ROS). Estos pueden reaccionar con ADN, proteínas, ácidos grasos y sacáridos lo que causa daño oxidativo.

En la piel se observa un envejecimiento prematuro, que se produce en las zonas expuestas a la radiación ultravioleta, caracterizado por fenómenos de alteración de las macromoléculas (peroxidación lipídica, carbonilación de proteínas), lo que afecta en particular a elastina, colágeno o fibronectina.

Una de las consecuencias importantes de la acumulación de daño oxidativo es la reducción de la capacidad de la célula para producir ATP (Porteous y otros, Eur J Biochem 1998, 257(1):192-201). Por tanto, el fenómeno del envejecimiento celular está relacionado con el daño oxidativo que sufre la célula, pero también con el proceso de producción de energía necesaria para que la célula sobreviva.

Se sabe que los hongos son una amplia familia de organismos vivos. Los cuerpos fructíferos de algunos hongos silvestres y cultivables contienen compuestos medicinales que se usan en la medicina tradicional y la cosmética. Los hongos han desarrollado durante su evolución diversas propiedades para resistir el estrés ambiental y se sabe que algunos compuestos de hongos pueden tener un efecto de moderar los daños causados por las circunstancias de la vida y el medio natural en los organismos. Por tanto, se ha intensificado la investigación de nuevos compuestos bioactivos naturales de origen fúngico.

Por ejemplo, el hongo Inonotus obliquus contiene una enzima tal como la superóxido dismutasa (SOD), que es un elemento clave para proteger la célula contra las ROS.

Además, se sabe que las trufas son eficaces en determinadas afecciones, tales como la mejora de la inmunidad y la hiperlipidemia.

El género Tuber pertenece al Ascomycete phylum y es un hongo subterráneo. El género de hongos Tuber comprende algunas especies de trufas. Estas especies de trufas son hongos hipogeos que establecen una simbiosis ectomicorrízica con árboles y arbustos y forman un cuerpo fructífero.

Algunas de las especies de trufas son muy apreciadas como alimento, debido a sus cuerpos fructíferos, aroma característico y delicioso sabor. Estas especies se denominan "trufas" o "trufas reales" y son delicias preciosas y caras que se usan ampliamente en las famosas cocinas francesa e italiana.

En la descripción de la invención "Trufas" se refiere a las siguientes especies: trufa negra (también conocida como trufas del Périgord de Francia, nombre científico: Tubermelanosporum), las trufas blancas italianas (nombre científico: Tubermagnatumpico), la trufa de Borgoña (Tuberuncinatum), trufa de Kalahari (Terfeziapfeilii), trufa de león (Trefezia leonis), trufa de verano (Tuber aestivum), trufa de invierno (Tuber brumale), trufa china (Tuber sinensis o Tuber indicum) y Bianchetto o trufa blanquecina (Tuber borchii).

El documento US2004/009143 describe composiciones cosméticas que comprenden extractos acuosos de trufas en una base de gel. Las trufas usadas son las seleccionadas del Tuber Melanosporum. En el proceso de extracción de las trufas se liberan varios agentes activos tales como aminoácidos, vitaminas B1, B2 y B3 y polisacáridos. La composición cosmética se produce (a) al mezclar trozos de trufa con agua durante 1,5-12 horas, (b) dejar reposar la mezcla durante 0,5-12 horas, (c) separar la fase acuosa, convirtiéndola en forma sólida y esterilizándola, (d) dispersar el polvo esterilizado en un fosfolípido acuoso, (e) homogeneizar la dispersión en un gel cosmético y neutralizarla, y (f) formular el producto con otros aditivos cosméticos, portadores tales como glicerina o etanol y/o ingredientes activos (es decir, agentes de protección solar, etc.). Las composiciones son útiles como cremas (por ejemplo, cremas de día o de noche o cremas solares), lociones corporales, productos de maquillaje; cosméticos para los ojos (especialmente cremas o sombras de ojos), champús o geles de ducha.

El documento JP2002249438A describe una composición anti-envejecimiento útil en cosméticos, cuasifármacos o productos farmacéuticos que comprende un extracto acuoso de trufa de Tuber Melanosporum. El extracto tiene un excelente efecto inhibidor del envejecimiento. La trufa seca se extrajo con agua caliente durante 2 horas a 95-100 °C, el filtrado se concentró y se liofilizó para obtener el extracto acuoso. Se formuló una crema al mezclar (en partes en peso) el extracto acuoso de trufa (0,05), escualano (5,5), aceite de oliva (3,0), ácido esteárico (2,0), cera de abejas (2,0), ácido mirístico octildodecilo (3,5), polioxietilen cetil éter (20 óxido de etileno) (3,0), alcohol behenílico (1,5), monoestearato de glicerilo (2,5), fragancia (0,1), 1 ,3-butilenglicol (8,5), paraoxietil-benzoato (0,05), paraoximetilbenzoato (0,2) y cantidad suficiente de agua. La crema es eficaz para activar el fibroblasto al promover la síntesis de colágeno, lo que inhibe el envejecimiento.

El documento US2013/136765 se refiere a una composición cosmética (es decir, una loción) que tiene beneficios anti­ envejecimiento y que comprende un extracto de trufas. En particular, el extracto se obtiene al secar y triturar el Tuber Melanosporum y extraerlo con agua caliente.

El documento DE202006006676 se refiere a composiciones cosméticas para el cuidado de la piel que comprenden como agente activo un extracto de trufa. En particular, el extracto se obtiene al extraer el Tuber Melanosporum con agua y dicho extracto se usa en una composición en combinación con otros agentes activos. Dichas composiciones se usan con el fin de proporcionar beneficios anti-envejecimiento (es decir, que tienen propiedades de elevación).

El documento DE202006006675 se refiere a composiciones cosméticas para el cuidado de la piel que comprenden como agente activo un extracto de trufa y champán. En particular, el extracto se obtiene al extraer el Tuber Melanosporum con agua y dicho extracto se usa en una composición en combinación con otros agentes activos. Dichas composiciones se usan con el fin de proporcionar beneficios anti-envejecimiento (es decir, especialmente para el rejuvenecimiento de la piel, para prevenir arrugas y como componente anti-envejecimiento).

A pesar de los diversos productos cosméticos anti-envejecimiento que existen en el mercado para el tratamiento de la piel, existe la necesidad de composiciones cosméticas de aplicación tópica eficaces que aporten beneficios anti­ envejecimiento o rejuvenecedores a la piel, cabello y/o uñas mediante el uso de ingredientes naturales como agente activo. Los productos no naturales, sintetizados químicamente, pueden percibirse como inseguros para el medio ambiente o para las personas. Por el contrario, los productos naturales se perciben como puros, suaves, y superiores a los productos sintetizados químicamente. Se sabe que numerosos productos de base natural extraídos de plantas o hierbas contienen agentes antioxidantes/eliminadores de radicales libres que pueden neutralizar los efectos del daño de los radicales libres. Además, pueden contener agentes que estimulan la síntesis y restauración de estructuras de tejido conectivo dañadas en la dermis y la función de barrera en la epidermis.

Resumen

El objetivo de la presente invención es proporcionar un nuevo extracto de origen natural para la industria cosmética que siempre está en demanda de nuevos ingredientes activos.

A tal fin, la presente invención propone un extracto de Trufa para el tratamiento cosmético de la piel y/o apéndices.

Más concretamente de acuerdo con la invención, el extracto de Trufa se obtiene a partir de cuerpos fructíferos de Tuber melanosporum.

Los inventores han demostrado ahora que un extracto acuoso de trufas ( Tuber Melanosporum) es un agente cosmético activo capaz de disminuir la producción de especies reactivas del oxígeno mitocondriales (ROS), al aumentar la producción de trifosfato de adenosina (ATP) y aumentar la viabilidad celular después de un estrés externo tal como exposición a la radiación ultravioleta, por ejemplo.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: Efecto del extracto de Trufa de acuerdo con el ejemplo 1 sobre la producción de especies reactivas del oxígeno mitocondriales.

Figura 2: Efecto del extracto de Trufa de acuerdo con el ejemplo 2 sobre la producción de especies reactivas del oxígeno mitocondriales después del tratamiento con rotenona.

Figura 3: Efecto del extracto de Trufa de acuerdo con el ejemplo 1 sobre la producción de especies reactivas del oxígeno mitocondriales después del tratamiento con radiaciones ultravioleta B.

Figura 4: Efecto del extracto de Trufa de acuerdo con el ejemplo 1 sobre los niveles de ATP en fibroblastos después del tratamiento con radiaciones ultravioleta A.

Figura 5: Efecto del extracto de Trufa de acuerdo con el ejemplo 1 sobre la viabilidad de los fibroblastos después del tratamiento con radiaciones ultravioleta A.

Descripción detallada

El primer objeto de la presente invención es una composición que comprende un nuevo extracto acuoso de trufa, que comprende compuestos que tienen un peso molecular inferior a 5 kDa como se define en la reivindicación 1 que se aplica tópicamente a la piel, las membranas mucosas y/o los apéndices cutáneos superficiales, para el uso para proteger la piel de las agresiones por radiación ultravioleta. Las "trufas" en la presente invención se refiere a trufa negra (también conocida como trufas de Perigord de Francia, nombre científico: Tuber melanosporum).

La piel se refiere a todo el tejido de cobertura que constituye la piel, las membranas mucosas y los apéndices de la piel, incluidos el cabello, las pestañas y las cejas.

Está claro que la invención está diseñada para mamíferos en general, y más específicamente para seres humanos.

De hecho, los inventores han identificado actividades biológicas que son útiles para reducir y/o corregir los signos cutáneos de envejecimiento y fotoenvejecimiento de la piel y apéndices queratinosos, y para proteger la piel contra las agresiones debidas a la radiación ultravioleta.

Los "signos cutáneos de envejecimiento y fotoenvejecimiento" se refieren a todos los cambios en el aspecto externo de la piel y apéndices cutáneos debido al envejecimiento, tal como, por ejemplo, adelgazamiento de la piel, flacidez, pérdida de hidratación y atonía, arrugas profundas y líneas finas, pérdida de firmeza y tono, atrofia dérmica o cualquier otra degradación interna de la piel resultante de la exposición a la radiación ultravioleta, manchas hepáticas y manchas de la edad. Las manchas hepáticas también conocidas como "Lentigo solar", "Lentigo senilis", "Mancha de la vejez", "Peca senil", son imperfecciones en la piel asociadas con el envejecimiento y el fotoenvejecimiento debido a la exposición a la radiación ultravioleta del sol. Varían en color de marrón claro a rojo o negro y se encuentran en las áreas más expuestas al sol, particularmente las manos, la cara, los hombros, los brazos y la frente, y el cuero cabelludo si es calvo.

Las actividades biológicas del extracto de Trufa de acuerdo con la invención se definen in vitro por la capacidad del extracto acuoso de Trufas de disminuir la producción de especies reactivas del oxígeno mitocondriales (ROS) al aumentar la producción de trifosfato de adenosina (ATP) y aumentar la viabilidad celular después de una estrés externo, tal como la exposición a la radiación ultravioleta, por ejemplo.

Se entiende por "extracto acuoso" una mezcla de compuestos obtenidos por extracción con agua.

Se entiende por "aplicación tópica" la aplicación o extensión de una composición que contiene dicho extracto de trufa, sobre la superficie de la piel o una membrana mucosa.

Se entiende por "fisiológicamente aceptable" que el agente activo para el uso de acuerdo con la invención, o una composición que contenga dicho agente, es adecuado para entrar en contacto con la piel o una membrana mucosa sin provocar una reacción de toxicidad o intolerancia.

El agente activo de uso de acuerdo con la invención se obtiene mediante extracción acuosa, seguida de hidrólisis enzimática que libera compuestos biológicamente activos, lo que realiza la hidrólisis enzimática con enzimas seleccionadas entre carbohidrasas y proteasas, en donde tras la hidrólisis enzimática se lleva a cabo una etapa de desactivación de enzimas.

Es probable que una gran cantidad de compuestos que se encuentran en las trufas tengan actividad biológica. La hidrólisis controlada permite la liberación de estos compuestos.

El extracto de Trufa se obtiene del cuerpo fructífero de Tuber Melanosporum.

Las trufas son hongos hipogeos. Durante su evolución, las trufas perdieron la capacidad de dispersar sus esporas a través de las corrientes de aire, y en cambio se propagaron por consumo animal y la posterior dispersión de sus esporas. El término "cuerpo fructífero de la trufa" se refiere a los ascocarpos hipogeos de la trufa, que es una estructura multicelular sobre la que se apoyan las estructuras productoras de esporas. El cuerpo fructífero es parte de la fase sexual del ciclo de vida de los hongos, y el resto del ciclo de vida se caracteriza por el crecimiento de micelio vegetativo y la producción de esporas asexuales.

Dado que los cuerpos fructíferos de la trufa aún no se pueden obtener en condiciones controladas in vitro, nuestro conocimiento de los eventos morfogenéticos que conducen al desarrollo y maduración del ascocarpio, así como sus bases moleculares subyacentes, es bastante limitado. Se han descrito cambios en la expresión génica durante la formación de los cuerpos fructíferos (Gabella y otros, 2005). Además, el micelio de la trufa y el cuerpo fructífero de la trufa se consideran dos compartimentos distintos, y se sabe que tienen una composición y un contenido distintos (Tang y otros, Food Chemistry 132 (2012) 1207-1213; Splivallo y otros, Phytochemistry 68 (2007) 2584-2598).

Una de las ventajas de la presente modalidad es que los cuerpos fructíferos de las trufas recolectadas en la maduración están altamente enriquecidos en diferentes compuestos de interés en comparación con el micelio natural o el micelio cultivado in vitro.

Todos los métodos de extracción o purificación acuosa conocidos por el experto en la técnica pueden usarse para la preparación del extracto de Trufa comprendido en una composición para uso de acuerdo con la invención.

En una primera etapa, el material de la trufa se muele en agua y se macera en agua.

La extracción de agua se puede llevar a cabo a temperatura ambiente o con agua calentada entre 40 y 90 °C.

En una modalidad preferida, la extracción se lleva a cabo mediante maceración en agua calentada a 50 °C durante 2 horas.

Esta solución cruda se hidroliza luego en condiciones controladas para producir compuestos solubles.

De acuerdo con la invención, la hidrólisis se lleva a cabo mediante carbohidrasas o celulasas y proteasas. El uso de carbohidrasas (por ejemplo, VISCOZYM®: complejo de múltiples enzimas que contiene una amplia gama de carbohidrasas, incluidas arabanasa, celulasa, p-glucanasa, hemicelulasa y xilanasa; GLUCANEX®: una beta glucanasa extraída de la levadura (Trichoderma harzianum)), por tanto, se pueden citar aquí endoproteasas producidas por plantas (papaína, bromelina, ficina) y por microorganismos (Aspergillus, Rhizopus, Bacillus, etc.). La hidrólisis se puede llevar a cabo con varias enzimas al mismo tiempo o una etapa de hidrólisis tras otra con una enzima a la vez.

En modalidades preferidas se lleva a cabo una primera hidrólisis entre 1 y 2 horas a una temperatura entre 40 y 80 grados Celsius, y pH entre 3 y 6 con entre 1 y 10 % de enzima carbohidrasa.

En una modalidad particularmente preferida, la primera hidrólisis se lleva a cabo 2 horas a 55 °C, pH entre 4,5 y 5 con VISCOZYME® o GLUCANEX® al 4 %.

En modalidades preferidas se lleva a cabo una segunda hidrólisis entre 1 y 2 horas a una temperatura entre 40 y 80 grados Celsius, y pH entre 3 y 6 con entre 1 y 10 % de enzima endoproteasa.

En una modalidad particularmente preferida, la segunda hidrólisis se lleva a cabo 2 horas a 55 °C, pH entre 4,5 y 5 con bromelaína al 2 %.

Después de las etapas de hidrólisis, la solución obtenida no está clara. Para eliminar los residuos se llevan a cabo centrifugación y filtraciones. Se llevan a cabo sucesivas filtraciones mediante filtros de porosidad decreciente. El filtrado obtenido es una solución clara y brillante.

Luego se lleva a cabo una etapa de desactivación de enzimas. Preferentemente, las enzimas se desactivan térmicamente, por ejemplo al calentar el filtrado obtenido entre un par de horas y una noche a una temperatura entre 40 y 90 °C, preferentemente 80 °C.

Después de la desactivación térmica de las enzimas, opcionalmente se pueden realizar filtraciones adicionales para eliminar más las enzimas residuales y seleccionar compuestos con un peso molecular bajo.

Después de la desactivación y eliminación por filtración, casi todas las enzimas se eliminan del filtrado. Se obtiene por tanto un primer filtrado activo.

La ventaja es que el filtrado activo obtenido está libre de enzimas residuales que podrían ser irritantes o alergénicas para la piel. De hecho, se sabe que las enzimas proteolíticas, tales como la papaína, son muy irritantes si se aplican sobre la piel.

Después de la clarificación y la desactivación de enzimas, se añade al filtrado carbón vegetal.

De hecho, se sabe que los extractos de trufa emiten compuestos volátiles olorosos desagradables para una aplicación cosmética. El carbón vegetal absorbe ventajosamente estos compuestos volátiles odorantes.

Por ejemplo, se añade carbón vegetal SX plus (NORIT®), preferentemente en una concentración de 0,1 % a 1 %, con mayor preferencia en una concentración de 0,25 % a 0,5 % durante 30 minutos a temperatura ambiente para eliminar el olor.

Ventajosamente, estos intervalos de concentración disminuyen significativamente el olor desagradable del extracto sin que parte de las moléculas activas sean absorbidas por el carbón vegetal.

A continuación, el filtrado se diluye a una concentración entre 3 g/kg y 10 g/kg, preferentemente a 5 g/kg de materia seca con disolventes, tales como agua, glicerol, etanol, propanodiol, butilenglicol, dipropilenglicol, glicoles etoxilados o propoxilados, polioles cíclicos o cualquier mezcla de estos disolventes, por ejemplo, 30 % de glicerol y 0,5 % de benzoato de sodio.

Luego, opcionalmente, el agente activo diluido se esteriliza mediante filtración estéril, por ejemplo, durante una noche en el horno a 65 °C.

El extracto obtenido comprendido en una composición para uso de acuerdo con la invención se analiza cualitativa y cuantitativamente.

Las características son las siguientes:

- Proteínas: <2 g/kg

- Azúcares: alrededor de 1 - 3 g/kg

- Aminoácidos: 1 - 2 g/kg

- Compuestos fenólicos 0,1 - 0,3 g/Kg

El análisis de cromatografía en capa fina mostró que nuestro extracto final comprende los aminoácidos esperados de acuerdo con lo descrito en la trufa, más particularmente en Tuber Melanosporum.

La electroforesis SDS PAGE mostró que el extracto obtenido está compuesto por péptidos con un peso molecular inferior a 5 kDa.

Ventajosamente, la hidrólisis controlada permite el acceso a moléculas de interés del cuerpo fructífero de las Trufas. La composición que comprende un extracto acuoso de Trufa para usar de acuerdo con la invención es un extracto de Trufas enriquecido en compuestos de interés y enriquecido en compuestos recién formados a partir de la lisis de proteínas y carbohidratos nativos.

La composición que comprende un extracto acuoso de Trufa para el uso de acuerdo con la invención, comprende compuestos con un peso molecular inferior a 5 kDa. La ventaja del extracto comprendido en una composición para uso de acuerdo con la invención es que los compuestos pequeños son más estables y reproducibles sin tener efecto alergénico

Después de esta etapa de dilución, el agente activo puede encapsularse o introducirse en un portador cosmético o farmacéutico como liposomas o cualquier otra microcápsula usada en el campo de la cosmética o adsorberse sobre polímeros orgánicos en polvo o soportes minerales como talco y bentonitas.

La composición para uso de acuerdo con la invención se aplica tópicamente y la formulación de las composiciones será adaptada por el experto en la técnica, en particular para composiciones cosméticas o dermatológicas. Las composiciones para uso de acuerdo con la invención están diseñadas para administrarse tópicamente. Por lo tanto, estas composiciones deben contener un medio fisiológicamente aceptable, es decir, compatible con la piel y los apéndices epiteliales, y cubrir todas las formas cosméticas o dermatológicas.

De acuerdo con una modalidad ventajosa de la invención, el extracto acuoso de Trufa comprendido en una composición para uso de acuerdo con la invención está presente en una cantidad eficaz es decir en una concentración entre aproximadamente 0,0001 % y 20 % y preferentemente en una concentración de entre aproximadamente 0,001 % y 5 % con respecto al peso total de la composición final.

Estas composiciones pueden existir específicamente en forma de solución acuosa, hidroalcohólica u oleosa; emulsión de aceite en agua, emulsión de agua en aceite o emulsiones múltiples; estos también pueden existir en forma de cremas, suspensiones o incluso polvos adaptados para su aplicación sobre la piel, membranas mucosas, labios y/o apéndices epiteliales. Estas composiciones también pueden ser más o menos fluidas y tener el aspecto de una crema, loción, leche, suero, pomada, gel, pasta o mousse. También pueden existir en forma sólida, como una barra, o se pueden aplicar a la piel como un aerosol. También se pueden usar como producto para el cuidado de la piel y/o como producto de maquillaje. Además, la composición comprende cualquier aditivo convencionalmente usado contemplado en el ámbito de aplicación así como también los aditivos necesarios para su formulación, tales como codisolventes (etanol, glicerol, alcohol bencílico, amortiguador...), espesantes, diluyentes, emulsionantes, antioxidantes, colorantes, filtros solares, pigmentos, cargas, conservantes, perfumes, absorbentes de olores, aceites esenciales, oligoelementos, ácidos grasos esenciales, tensioactivos, polímeros filmógenos, filtros químicos o minerales, agentes humectantes o aguas termales. Polímeros solubles en agua, preferentemente naturales, tales como polisacáridos o polipéptidos, derivados de celulosa del tipo metilcelulosa o hidroxipropilcelulosa, o incluso polímeros sintéticos, poloxámeros, carbómeros, siloxanos, PVA o PVP, y en particular polímeros comercializados por la empresa Ashland, pueden citarse, por ejemplo.

En todos los casos, el experto en la técnica se asegurará de que estos aditivos y sus proporciones se seleccionen de tal manera que no sean perjudiciales para las propiedades ventajosas deseadas de la composición para el uso de acuerdo con la invención. Estos aditivos pueden estar presentes, por ejemplo, en concentraciones de 0,01 % a 20 % del peso total de la composición. Cuando la composición para uso de acuerdo con la invención es una emulsión, la fase grasa puede representar de 5 a 80 % en peso, y preferentemente de 5 a 50 % en peso con respecto al peso total de la composición. Los emulsionantes y coemulsionantes usados en la composición deben seleccionarse de los que se usan típicamente en el campo relevante. Por ejemplo, se pueden usar en una proporción de 0,3 a 30 % en peso, con respecto al peso total de la composición.

Se entiende bien que el agente activo para uso de acuerdo con la invención se puede usar solo o junto con otros ingredientes activos.

Además, las composiciones usables de acuerdo con la invención contienen ventajosamente al menos otro agente activo. Se pueden citar los siguientes tipos de ingredientes, de manera no limitativa: otros agentes activos peptídicos, extractos vegetales, agentes curativos, agentes anti-envejecimiento, agentes anti-arrugas, agentes calmantes, anti­ radicales libres, agentes anti-radiación ultravioleta, agentes para estimular la síntesis macromolecular dérmica o el metabolismo energético, agentes hidratantes, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos, antiinflamatorios, anestésicos, agentes moduladores de la diferenciación cutánea, pigmentación o despigmentación cutánea, y agentes para estimular el crecimiento de uñas y cabello.

Es preferible que se use un agente anti-radicales libres o antioxidante, o un agente que estimule la síntesis macromolecular dérmica o el metabolismo energético.

En una modalidad más específica, la composición para uso de acuerdo con la invención comprenderá, además del extracto de Trufa para uso de acuerdo con la invención:

- protectores solares, pantallas ultravioleta e infrarroja

- agentes anti-radicales libres,

- DHEA (dehidroepiandrosterona),

- al menos un compuesto que activa el citocromo c, y/o;

- uno (o más) compuestos activadores de acuaporina y/o;

- uno (o más) compuesto activador de sirtuina y/o;

- uno (o más) compuestos que aumentan la adhesión celular y/o;

- uno (o más) compuestos que aumentan la producción de proteínas de matriz del tipo colágeno o laminina; - uno (o más) compuestos moduladores de proteína HSP;

- uno (o más) compuestos que aumentan la energía celular;

- uno (o más) compuestos moduladores de la pigmentación tales como levadura, amaranto, linaza, frijol, cacao, maíz, soja, girasol, colza o extracto de péptido de guisante;

- uno (o más) compuestos que mejoran la función de barrera de la piel;

- uno (o más) compuestos protectores de mitocondrias.

- vitamina A y notablemente ácido retinoico, retinol, propionato de retinol, palmitato de retinol,

- vitamina B3 y notablemente niacinamida, niconitato de tocoferol,

- vitamina B5, vitamina B6, vitamina B12, pantenol,

- vitamina C, y notablemente ácido ascórbico, glucósido de ascorbilo, tetrapalmitato de ascorbilo, fosfato de ascorbilo de magnesio y sodio,

- vitaminas E, F, H, K, PP y coenzima Q10,

- inhibidor de metaloproteinasa, activador del inhibidor de tejido metaloproteinasa (TIMP),

- aminoácidos y en particular arginina, ornitina, hidroxiprolina, dipalmitato de hidroxiprolina, palmitoilglicina, hidroxilisina, metionina y sus derivados, aminoácidos N-acilados,

- péptidos naturales o sintéticos, incluidos di-, tri-, tetra-, penta- y hexapéptidos y sus derivados lipofílicos, isómeros y complejos con otras moléculas tales como iones metálicos (es decir, cobre, zinc, manganeso, magnesio y otros), péptidos vendidos bajo los nombres comerciales MATRIXYL®, ARGIRELINE®, COLLAXYL™, PEPTIDE VINCI 02™, CHRONOGEN™, LAMINIXYL IS™, PEPTIDE Q10™,

- extractos de plantas peptídicas obtenidos por hidrólisis o cualquier otro método como extracto de soja, extracto de escaña, extracto de vitis vinifera, extracto de colza, extracto de linaza extracto de arroz, extracto de maíz o extracto de guisante, extracto de algarroba, extracto de frijol, extracto de habas,

- extracto de levadura, extracto de artemia salina,

- ácido deshidroacético (DHA),

- fistosteroles naturales o sintéticos,

- alfa- y beta- hidroxiácidos, silanoles,

- aminas de azúcar, glucosamina, D-glucosamina, N-acetil-glucosamina, N-acetil-D-glucosamina, manosamina, N-acetil manosamina, galactosamina, N-acetil galactosamina,

- polifenoles, isoflavonas, flavonoides, tales como extracto de grap, extracto de pino, extracto de oliva, - lípidos tales como ceramidas o fosfolípidos,

- aceites animales tales como escualenos o escualenos,

- aceites vegetales, tales como aceite de almendras, aceite de coco, aceite de ricino, aceite de jojoba, aceite de oliva, aceite de colza, aceite de cacahuete, aceite de girasol, aceite de germen de trigo, aceite de germen de maíz, aceite de soja, aceite de algodón, aceite de alfalfa, aceite de amapola, calabaza aceite de semilla, aceite de onagra, aceite de mijo, aceite de cebada, aceite de centeno, aceite de cártamo, aceite de pasión, aceite de avellana, aceite de palma, aceite de semilla de albaricoque, aceite de aguacate, aceite de caléndula, aceites vegetales etoxilados o manteca de karité, los compuestos mencionados anteriormente pueden ser naturales, tales como hidrolizados de péptidos de plantas, o también sintéticos, tales como compuestos peptídicos.

El segundo aspecto de la invención es un uso cosmético de una composición que comprende un extracto acuoso de Trufa, que comprende compuestos que tienen un peso molecular inferior a 5 kDa, en donde dicho extracto de Trufa se obtiene a partir del cuerpo fructífero de Tuber Melanosporum mediante extracción acuosa e hidrólisis enzimática realizada con enzimas seleccionadas entre carbohidrasas y proteasas, en donde después de la hidrólisis enzimática se lleva a cabo una etapa de desactivación de enzimas, y un medio fisiológicamente aceptable, que se aplica tópicamente a la piel, las mucosas y/o los apéndices cutáneos superficiales para aumentar los niveles de ATP en las células de la piel y/o para reducir los niveles de especies reactivas del oxígeno en las células de la piel, para reducir y/o corregir los signos de fotoenvejecimiento de la piel y apéndices queratinosos.

Los "signos cutáneos de envejecimiento y fotoenvejecimiento" se refieren a todos los cambios en el aspecto externo de la piel y apéndices cutáneos debido al envejecimiento, tal como, por ejemplo, adelgazamiento de la piel, flacidez, pérdida de hidratación y atonía, arrugas profundas y líneas finas, pérdida de firmeza y tono, atrofia dérmica o cualquier otra degradación interna de la piel resultante de la exposición a la radiación ultravioleta, manchas hepáticas y manchas de la edad.

Las modalidades que son específicas de este método cosmético también resultan de la descripción anterior.

Se pueden ver más ventajas y características de la invención con mayor detalle al leer los ejemplos ilustrativos, no limitativos, proporcionados.

Ejemplo 1: Preparación de un extracto de Trufa (Tuber melanosporum)

Se muelen 100 g de trufa negra (Tubermelanosporum) en 1 litro de agua. Se agrega 4 % de VISCOSYM® a la mezcla y la solución se calienta 2 horas a 50 °C. El VISCOZYM® es un complejo de múltiples enzimas que contiene una amplia gama de carbohidrasas, que incluyen arabanasa, celulasa, p-glucanasa, hemicelulasa y xilanasa. Luego, se agrega bromelina al 2 % en la solución y la mezcla se calienta 2 horas a 50-55 °C. Luego, la enzima se desactiva al calentar la solución a 80 °C durante 2 horas.

Después de la centrifugación, el sobrenadante se filtra en filtros con porosidad decreciente. El proceso de purificación comienza por filtraciones sucesivas mediante el uso de filtros Seitz-Orion de porosidad decreciente (hasta 0,2 pm) para obtener una solución clara y brillante.

Después de la clarificación, el filtrado se calienta durante la noche a 65 °C y luego se agrega carbón vegetal (SX plus - 0,25 %) durante 30 min a temperatura ambiente para eliminar el olor. El filtrado se diluye luego para obtener un extracto que tiene 6 g/kg de materia seca con 30 % de glicerol y 0,5 % de benzoato de sodio.

Luego, esta solución se purifica al eliminar las enzimas y las proteínas de alto peso molecular mediante filtración de flujo cruzado.

El extracto de Trufa se analizó mediante el uso de un procedimiento estándar. Las características del extracto de Trufa obtenido son las siguientes: materia seca: 6 g/kg - proteínas: <1 g/kg - azúcares: 2 g/kg - aminoácidos: 1,4 g/kg -compuestos fenólicos 0,1 - 0,3 g/Kg

Se realizó electroforesis SDS PAGE (NuPAGE® Bis-Tris Pre-cast (Invitrogen)) para evaluar el peso molecular de las proteínas del extracto. El extracto de Trufa se calienta a 70 °C durante 10 minutos en condiciones reductoras de desnaturalización en un tampón de muestra NuPAGE® LDS. Se agrega una solución antioxidante NuPAGE® a la cámara interna (cátodo) para que las proteínas reducidas no se vuelvan a oxidar durante la electroforesis. La migración de proteínas se lleva a cabo mediante el uso del tampón de ejecución NuPAGE® MES con SeeBlue Plus2 estándar como un marcador de peso molecular. La tinción de proteínas se lleva a cabo con Coomassie® Brilliant Blue R-250.

El extracto obtenido está compuesto por péptidos con un peso molecular inferior a 3,5 kDa.

Ejemplo 2: Preparación de un extracto de Trufa (Tuber melanosnorum)

Se muelen 100 g de trufa negra (Tubermelanosporum) en 1 litro de agua. Se agrega GLUCANEX® al 4 % a la mezcla y la solución se calienta 2 horas a 50 °C. La GLUCANEX® es una beta glucanasa extraída de levadura (Trichoderma harzianum) Luego, se agrega bromelina al 2 % en la solución y la mezcla se calienta 2 horas a 50-55 °C. Después de la centrifugación, el sobrenadante se filtra en filtros con porosidad decreciente.

Después de la clarificación, el filtrado se calienta durante la noche a 65 °C y luego se agrega carbón vegetal (SX plus - 0,25 %) durante 30 min a temperatura ambiente para eliminar el olor. El filtrado se diluye luego para obtener un extracto que tiene 8 g/kg de materia seca con 30 % de glicerol y 0,5 % de benzoato de sodio.

Luego, esta solución se purifica al eliminar las enzimas y las proteínas de alto peso molecular mediante filtración de flujo cruzado.

La siguiente etapa es la fase de dilución en una mezcla de agua y glicerol. A continuación, el agente activo diluido se esteriliza mediante filtración estéril.

El extracto de Trufa se analizó mediante el uso de un procedimiento estándar. Las características del extracto de Trufa obtenido son las siguientes: materia seca: 8 g/kg - proteínas: <1 g/kg - azúcares: 6,9 g/kg - aminoácidos: 1,4 g/kg

Se realizó electroforesis SDS PAGE (NuPAGE® Bis-Tris Pre-cast (Invitrogen)) para evaluar el peso molecular de las proteínas del extracto. El extracto de Trufa se calienta a 70 °C durante 10 minutos en condiciones reductoras de desnaturalización en un tampón de muestra NuPAGE® LDS. Se agrega una solución antioxidante NuPAGE® a la cámara interna (cátodo) para que las proteínas reducidas no se vuelvan a oxidar durante la electroforesis. La migración de proteínas se lleva a cabo mediante el uso del tampón de ejecución NuPAGE® MES con SeeBlue Plus2 estándar como un marcador de peso molecular. La tinción de proteínas se lleva a cabo con Coomassie® Brilliant Blue R-250.

El extracto obtenido está compuesto por péptidos con un peso molecular inferior a 3,5 kDa.

Ejemplo 3: Efecto del extracto de Trufa de acuerdo con el ejemplo 1 sobre la producción de especies reactivas del oxígeno mitocondriales

El propósito de este estudio es determinar la influencia del extracto de Trufa de acuerdo con el ejemplo 1 en la producción de especies reactivas del oxígeno (ROS) mitocondriales.

Método: Se sembraron queratinocitos humanos normales extraídos de la piel abdominal de una mujer europea de 52 años de edad en portaobjetos de plástico PERMANOX® de 8 pocillos de cultivo (Thermo Scientific, Waltham, MA, Estados Unidos). Las células se pretrataron con dos aplicaciones por día del extracto de Trufa de acuerdo con el ejemplo 1 (respectivamente al 0,01 % y al 0,05 % durante 48 h en medio KSFM (Gibco, Auckland, NZ) suplementado con 50 pg.ml-1 de extracto de pituitaria bovina (Gibco), 5 ng.ml-1 de EGF recombinante humano (Gibco) y 0,1 mg.ml-1 de PRIMOCIN™ (Invivogen, San Diego, CA, Estados Unidos). El medio de cultivo se reemplazó con KSFM reciente durante 1 hora. Al final de la incubación, se incubó una solución 5 pM de MITOSOX® (Life Technologies, Carlsbad, CA, Estados Unidos) durante 20 minutos más a 37 °C en una atmósfera de CO2 al 5 %. Las células se lavaron tres veces en solución salina equilibrada de Hank (Gibco), se fijaron con formaldehído al 3,7 % (Sigma, Steinheim, Alemania) durante 20 minutos y luego se revelaron los núcleos mediante tinción con una solución DAPI 0,3 pM (Life Technologies) durante diez minutos. Las imágenes digitales se adquirieron con un microscopio invertido Zeiss Axiovert 200M (Zeiss, Oberkochen, Alemania) con un objetivo de 20x. Las fotos se tomaron con una cámara azul Qimaging EXI (Qimaging, Surrey, BC, Canadá) acoplada al software de adquisición Volocity (Perkin Elmer, Waltham, MA, Estados Unidos). Todos los valores se representan como medias ± SEM. La significación estadística de los datos se evaluó mediante la prueba t de Student pareada (n = 3, p< 0,05 se consideró significativo; p< 0,01 como muy significativo y p< 0,005 como altamente significativo).

Resultados: Como se ilustra en la Figura 1, observamos una disminución del 23 % de la producción de ROS en los queratinocitos tratados con extracto de trufa al 0,01 % de acuerdo con el ejemplo 1, en comparación con los queratinocitos no tratados y una disminución muy significativa del 66 % de la producción de ROS en los queratinocitos tratados con 0,05 % de extracto de Trufa de acuerdo con el ejemplo 1, en comparación con los queratinocitos no tratados

Conclusión: El extracto de Trufa de acuerdo con el ejemplo 1, disminuye los niveles de ROS mitocondrial en la piel.

Ejemplo 4: Efecto del extracto de Trufa de acuerdo con el ejemplo 2 sobre la producción de especies reactivas del oxígeno mitocondriales después de la producción de ROS inducida por rotenona

El propósito de este estudio es determinar la influencia del extracto de Trufa de acuerdo con el ejemplo 2 sobre la producción de especies reactivas del oxígeno (ROS) mitocondriales. Las ROS mitocondriales fueron inducidas por rotenona, un inhibidor del complejo de la cadena de transporte de electrones.

Método: Se sembraron queratinocitos humanos normales extraídos de la piel abdominal de una mujer europea de 52 años de edad en portaobjetos de plástico PERMANOX® de 8 pocillos de cultivo (Thermo Scientific, Waltham, MA, Estados Unidos). Las células se pretrataron con dos aplicaciones por día del extracto de Trufa del ejemplo 2 (al 0,01 % y al 0,05 %) durante 48 h en medio KSFM (Gibco, Auckland, NZ) suplementado con 50 pg.ml-1 de extracto de pituitaria bovina (Gibco), 5 ng.ml-1 de EGF recombinante humano (Gibco) y 0,1 mg.ml-1 de pRlMOCIN™ (Invivogen, San Diego, CA, Estados Unidos). Luego, las células se sometieron a una aplicación de rotenona 1 pM durante 4 horas. Inmediatamente después del estrés, el medio de cultivo se reemplazó con KSFM nuevo durante 1 hora. Al final de la incubación, se incubó una solución 5 pM de MITOSOX® (Life Technologies, Carlsbad, CA, Estados Unidos) durante 20 minutos más a 37 °C en una atmósfera de CO2 al 5 %. Las células se lavaron tres veces en solución salina equilibrada de Hank (Gibco), se fijaron con formaldehído al 3,7 % (Sigma, Steinheim, Alemania) durante 20 minutos y luego se revelaron los núcleos mediante tinción con una solución DAPI 0,3 pM (Life Technologies) durante diez minutos. Las imágenes digitales se adquirieron con un microscopio invertido Zeiss Axiovert 200M (Zeiss, Oberkochen, Alemania) con un objetivo de 20x. Las fotos se tomaron con una cámara azul Qimaging EXI (Qimaging, Surrey, BC, Canadá) acoplada al software de adquisición Volocity (Perkin Elmer, Waltham, MA, Estados Unidos). Todos los valores se representan como medias ± SEM. La significación estadística de los datos se evaluó mediante la prueba t de Student pareada (n = 3, p< 0,05 se consideró significativo; p< 0,01 como muy significativo y p< 0,005 como altamente significativo).

Resultados: La Figura 2 muestra los resultados. Primero, observamos que el tratamiento con rotenona produjo un aumento del 45 % en la producción de ROS en los queratinocitos, en comparación con el control no tratado.

Observamos que el aumento de la producción de ROS en los queratinocitos tratados con extracto de Trufa al 0,01 % y 0,05 % de acuerdo con el ejemplo 2 después del tratamiento con rotenona fue respectivamente de 27 % y 42 % menor en comparación con los queratinocitos no tratados con el extracto de Trufa y tratados con rotenona.

Conclusión: El extracto de Trufa de acuerdo con el ejemplo 2 protege eficazmente la piel de la producción mitocondrial de ROS inducida por rotenona.

Ejemplo 5: Efecto del extracto de Trufa de acuerdo con el ejemplo 1 sobre la producción de especies reactivas del oxígeno mitocondriales después de la producción de ROS inducida por ultravioleta B

El propósito de este estudio es determinar la influencia del extracto de Trufa de acuerdo con el ejemplo 1 en la producción de especies reactivas del oxígeno (ROS) mitocondriales.

Método: Se sembraron queratinocitos humanos normales extraídos de la piel abdominal de una mujer europea de 52 años de edad en portaobjetos de plástico Permanox® de 8 pocillos de cultivo (Thermo Scientific, Waltham, MA, Estados Unidos). Las células se pretrataron con dos aplicaciones por día del extracto de trufa (respectivamente al 0,01 % y al 0,05 %) durante 48 h en medio KSFM (Gibco, Auckland, NZ) suplementado con 50 pg.ml-1 de extracto de pituitaria bovina (Gibco), 5 ng.ml-1 de EGF recombinante humano (Gibco) y 0,1 mg.ml-1 de PRIMOCIN™ (Invivogen, San Diego, CA, Estados Unidos). Luego, las células se sometieron a una aplicación de UVB de 75 mJ/cm2 durante 4 horas. Inmediatamente después del estrés, el medio de cultivo se reemplazó con KSFM nuevo durante 1 hora. Al final de la incubación, se incubó una solución 5 pM de MITOSOX® (Life Technologies, Carlsbad, CA, Estados Unidos) durante 20 minutos más a 37 °C en una atmósfera de CO2 al 5 %. Las células se lavaron tres veces en solución salina equilibrada de Hank (Gibco), se fijaron con formaldehído al 3,7 % (Sigma, Steinheim, Alemania) durante 20 minutos y luego se revelaron los núcleos mediante tinción con una solución DAPI 0,3 pM (Life Technologies) durante diez minutos. Las imágenes digitales se adquirieron con un microscopio invertido Zeiss Axiovert 200M (Zeiss, Oberkochen, Alemania) con un objetivo de 20x. Las fotos se tomaron con una cámara azul Qimaging EXI (Qimaging, Surrey, BC, Canadá) acoplada al software de adquisición Volocity (Perkin Elmer, Waltham, MA, Estados Unidos). Todos los valores se representan como medias ± SEM. La significación estadística de los datos se evaluó mediante la prueba t de Student pareada (n = 3, p< 0,05 se consideró significativo; p< 0,01 como muy significativo y p< 0,005 como altamente significativo).

Resultados: La Figura 3 muestra los resultados. Primero, observamos que el estrés inducido por la radiación ultravioleta B produjo un aumento del 18 % en la producción de ROS en los queratinocitos en comparación con el control no tratado.

Observamos que el aumento de producción de ROS en queratinocitos tratados con extracto de Trufa al 0,01 % y 0,05 % de acuerdo con el ejemplo 1 después del tratamiento con rotenona fue 29% y 64 % menor en comparación con los queratinocitos no tratados con extracto de Trufa y radiación ultravioleta B.

Conclusión: El extracto de Trufa de acuerdo con el ejemplo 1 protege eficazmente la piel de la producción mitocondrial de ROS inducida por rayos ultravioleta B.

Ejemplo 6: Efecto del extracto de Trufa de acuerdo con el ejemplo 1 sobre los niveles de ATP en fibroblastos El propósito de este estudio es determinar la influencia del extracto de Trufa de acuerdo con el ejemplo 1 sobre los niveles intracelulares de Trifosfato de Adenosina (o ATP).

Método: Se tratan fibroblastos humanos normales de un donante de 62 años con el extracto de Trufa de acuerdo con el ejemplo 1 al 0,001 % durante 24 horas, se irradian con ultravioleta A (10 J/cm2) y luego se cultivan de nuevo 24 horas en presencia de la misma concentración de extracto de Trufa de acuerdo con el ejemplo 1. Los controles no tratados y no irradiados se llevan a cabo en las mismas condiciones.

El kit de ensayo de ATP es un sistema de monitorización de 5'-trifosfato de adenosina (ATP) a base de luciferasa de luciérnaga (Photinus pyralis). Este ensayo se usa para determinar los niveles totales de ATP celular en cultivo. El ensayo de ATP se basa en la producción de luz provocada por la reacción de ATP con luciferasa y D-luciferina añadidas. La luz emitida es proporcional a la concentración de ATP dentro de la célula.

Preparar la solución de sustrato mediante reconstitución de la solución de sustrato liofilizada del kit de ensayo de ATP en 5 ml de solución tampón de sustrato. Lavar las células con PBS y luego agregar 50 pl de solución de lisis a cada pocillo y colocar la placa en un agitador durante 5 min. Retirar 20 pl de cada pocillo y colocarlo en la placa de 96 pocilios que contiene 20 pl de solución de trabajo del ensayo de proteínas MICRO BCA™ en cada pocillo. Agregar 50 pl de solución de sustrato a cada pocillo. Colocar la placa en el agitador durante 5 min. Medir la luminiscencia con un luminómetro.

Resultados: La Figura 4 ilustra los resultados. Observamos un aumento del 9 % del nivel de ATP en fibroblastos tratados con extracto de Trufa al 0,001 % de acuerdo con el ejemplo 1 e irradiados con ultravioleta A, en comparación con los fibroblastos no tratados.

Conclusión: El extracto de Trufa de acuerdo con el ejemplo 1, aumenta eficazmente el nivel de ATP en las células de la piel sometidas al estrés ultravioleta A.

Ejemplo 7: Efecto del extracto de Trufa de acuerdo con el ejemplo 1 sobre la viabilidad de los fibroblastos

El objetivo de este estudio es determinar el efecto protector del extracto de Trufa de acuerdo con el ejemplo 1 con respecto a los fibroblastos humanos normales sometidos a estrés por radiación ultravioleta A.

Para ello, se realizaron ensayos de viabilidad celular mediante el Método de Ensayo de Viabilidad Azul Alamar: Se tratan fibroblastos humanos normales de un donante de 62 años con el extracto de Trufa de acuerdo con el ejemplo 1 al 0,001 % durante 24 horas, irradiado con ultravioleta A (10 J/cm2) y luego se volvió a cultivar 24 horas en presencia de la misma concentración de extracto de Trufa de acuerdo con el ejemplo 1.

Los controles no tratados y no irradiados se llevan a cabo en las mismas condiciones. Al final del experimento, las células se incuban en una solución de 200 pl que contiene 10 % de ALAMARBLUE®, luego se incuban durante 2 horas en la incubadora y se lee la fluorescencia en un lector de placas fluorescentes a 530 nm de excitación y 590 nm de emisión.

La resazurina, el ingrediente activo del reactivo ALAMARBLUE®, es un compuesto no tóxico, permeable a las células, de color azul y prácticamente no fluorescente. Al entrar en las células, la resazurina se reduce a resorufina, un compuesto de color rojo y muy fluorescente. Las células viables convierten continuamente la resazurina en resorufina, lo que aumenta la fluorescencia general y el color de los medios que rodean las células. La intensidad de la fluorescencia es entonces directamente proporcional a la actividad enzimática mitocondrial, así como al número de células vivas.

Resultados: La Figura 5 ilustra los resultados. La evaluación de la viabilidad celular mediante el Ensayo de Viabilidad de Azul Alamar muestra que el extracto de Trufa de acuerdo con el ejemplo 1 aumenta la viabilidad celular después de la irradiación ultravioleta A en un 10 %.

Conclusión: El extracto de Trufa de acuerdo con el ejemplo 1 al 0,001 % aumenta la viabilidad celular y protege eficazmente las células de la piel de los efectos citotóxicos de la radiación ultravioleta A.

Ejemplo 8: Preparación de las composiciones

1 - Crema de día

_ ________

Modo operativo:

Pesar los ingredientes de la fase grasa y calentar a 70 °C con agitación. Preparar la fase B y calentar a 70 °C. Emulsionar la fase A en la fase B. Añadir la fase C a aproximadamente 50 °C con agitación. Agregar el agente activo por debajo de 40 °C (Fase D). Perfumar y enfriar a temperatura ambiente.

2 - Crema de protección solar:

_ ___________

Los componentes de la fase A y la fase B se calientan por separado entre 70 °C y 75 °C. La fase B se emulsiona en la fase A con agitación. La Fase C se agrega a 45 °C, al aumentar la agitación. Luego se añade la fase D cuando la temperatura es inferior a 40 °C. Se continúa el enfriamiento hasta 25 °C bajo intensa agitación.

3-Crema anti-envejecimiento:

Preparar y fundir la fase A a 65-70 °C. Calentar la fase C a 65-70 °C. La fase B se añade a la fase A justo antes de emulsionar AB en C. A aproximadamente 45 °C, el carbómero se neutraliza al añadir la fase D. A continuación, se añade la fase E con agitación suave y se continúa el enfriamiento hasta 25 °C. Luego se agrega la Fase F si se desea.

4 -Crema protectora de día:

Preparar la fase A y calentar a 75 °C con agitación. Preparar la fase B al dispersar el carbopol y luego la goma xantana con agitación. Dejar reposar. Calentar a 75 °C.

A 75 °C, emulsionar A en B bajo agitación del estator del rotor. A 60 °C, neutralizar con la fase C con agitación rápida. Después de enfriar a 40 °C, agregue la fase D, y luego la fase E (ambos homogeneizados hasta aclarar antes). Se continúa el enfriamiento con agitación suave y se agrega la fase F.

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende un extracto acuoso de trufa, que comprende compuestos que tienen un peso molecular inferior a 5 kDa, en donde dicho extracto de Trufa se obtiene del cuerpo fructífero de Tuber Melanosporum mediante extracción acuosa e hidrólisis enzimática realizada con enzimas seleccionadas entre carbohidrasas y proteasas, en donde después de la hidrólisis enzimática, se lleva a cabo una etapa de desactivación de enzimas, y un medio fisiológicamente aceptable, que se aplica tópicamente a la piel, las mucosas y/o los apéndices cutáneos superficiales, para el uso para proteger la piel contra las agresiones debidas a la radiación ultravioleta.

2. La composición para el uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde después de llevar a cabo la etapa de desactivación de enzimas, se realizan filtraciones adicionales para obtener un filtrado activo libre de enzimas residuales.

3. La composición para el uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde dicha hidrólisis enzimática se lleva a cabo una etapa de hidrólisis tras otra con una enzima a la vez, una primera hidrólisis se lleva a cabo entre 1 y 2 horas a una temperatura entre 40 y 80 °C, y pH entre 3 y 6 con entre 1 y 10 % de enzima carbohidrasa, una segunda hidrólisis se lleva a cabo entre 1 y 2 horas a una temperatura entre 40 y 80 °C, y pH entre 3 y 6 con entre 1 y 10 % de enzima endoproteasa.

4. La composición para el uso de acuerdo con la reivindicación 3, en donde dicha primera hidrólisis se lleva a cabo 2 horas a 55 °C, pH entre 4,5 y 5 con un 4 % de complejo multienzimático que contiene un amplio intervalo de carbohidrasas, que incluye arabanasa, celulasa, p-glucanasa, hemicelulasa y xilanasa o una beta glucanasa extraída de la levadura (Trichoderma harzianum).

5. La composición para el uso de acuerdo con la reivindicación 3, en donde dicha segunda hidrólisis se lleva a cabo 2 horas a 55 °C, pH entre 4,5 y 5 con bromelaína al 2 %.

6. La composición para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicho extracto de trufa se diluye en un disolvente seleccionado de agua, glicerol, etanol, propanodiol, butilenglicol, dipropilenglicol, glicoles etoxilados o propoxilados, polioles cíclicos o cualquier mezcla de estos disolventes.

7. La composición para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dicho extracto de trufa está comprendido en una concentración de 0,0001 % en peso a 20 % en peso, preferentemente de 0,0005 % en peso a 5 % en peso, del peso total de la composición.

8. La composición para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde dicha composición está en una forma adaptada para la aplicación tópica.

9. La composición para el uso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde dicha composición está en forma de geles, cremas, bálsamos, leches o productos espumantes.

10. La composición para el uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende además al menos otro agente activo.

11. La composición para el uso de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el al menos otro agente activo se selecciona de agente antioxidante, hidrolizado de plantas, compuesto peptídico sintético, filtro solar, agente antiarrugas.

12. Un uso cosmético de una composición que comprende un extracto acuoso de trufa, que comprende compuestos que tienen un peso molecular inferior a 5 kDa, en donde dicho extracto de trufa se obtiene del cuerpo fructífero de Tuber Melanosporum mediante extracción acuosa e hidrólisis enzimática realizada con enzimas seleccionadas entre carbohidrasas y proteasas, en donde después de la hidrólisis enzimática, se lleva a cabo una etapa de desactivación de enzimas, y un medio fisiológicamente aceptable, que se aplica tópicamente a la piel, las membranas mucosas y/o los apéndices cutáneos superficiales para aumentar los niveles de ATP en las células de la piel y/o para reducir los niveles de especies reactivas del oxígeno en las células de la piel, para reducir y/o corregir los signos de fotoenvejecimiento de la piel y apéndices queratinosos.