ES2875022T3 - Anticuerpo monoclonal humano específico para la proteína F del virus sincitial respiratorio (RSV) - Google Patents

Abstract

Una célula que comprende una primera secuencia de ADNc que codifica una región variable de la cadena pesada y una segunda secuencia de ADNc que codifica una región variable de la cadena ligera, en la que la célula produce un anticuerpo humano o fragmento de anticuerpo que comprende la región variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena ligera, en la que la región variable de la cadena pesada codificada por la primera secuencia de ADNc comprende (a) una región determinante de complementariedad de cadena pesada (CDR) CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GASINLYD (SEQ ID NO: 8), (b) una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos GYISGST (SEQ ID NO: 9), y (c) una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos ARDVGWGPQYYYGLDV (SEQ ID NO: 10); y en la que la región variable de la cadena ligera codificada por la segunda secuencia de ADNc comprende (a) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos HSVQSTS (SEQ ID NO: 14), (b) una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos GGS (SEQ ID NO: 15) y (c) una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos QQSDRSPPIT (SEQ ID NO: 16), en la que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une con especificidad a la región antigénica II/A de la proteína F del RSV con una afinidad mayor a 1 x 10-9 M.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpo monoclonal humano específico para la proteína F del virus sincitial respiratorio (RSV)

Campo de la invención

Esta invención se refiere a un constructo de anticuerpo monoclonal o fragmento de anticuerpo específico para la proteína de fusión (proteína F) del virus sincitial respiratorio (RSV), ácidos nucleicos que codifican el constructo o fragmento de anticuerpo y líneas celulares que expresan el constructo o fragmento de anticuerpo. Esta invención se refiere además a métodos para producir dicho constructo de anticuerpo monoclonal o fragmento de anticuerpo y al uso de dicho constructo de anticuerpo monoclonal o fragmento de anticuerpo para tratar o prevenir la infección por RSV que tiene una versión normal o mutada de la proteína F.

Descripción de la técnica relacionada

El virus sincitial respiratorio (RSV) es una de las causas más comunes de infecciones respiratorias en humanos y es la principal causa de hospitalización infantil y una de las principales causas víricas de muerte en lactantes. Las epidemias del RSV se repiten anualmente durante la temporada de invierno. La gravedad de los brotes puede variar de un año a otro debido a la circulación conjunta de 2 cepas principales del RSV, grupos A y B. Durante una epidemia anual determinada, una gran parte de la población desarrolla infecciones de las vías respiratorias superiores y/o inferiores por RSV.

Aproximadamente dos tercios de todos los bebés se infectan con RSV durante su primer año de vida. La incidencia máxima de aparición se observa entre los 2 y los 8 meses de edad; a los 2 años de edad, el 99 % de los niños se han infectado con RSV al menos una vez y el 36 % ha tenido al menos dos infecciones. La mayoría de estas infecciones por RSV causan una enfermedad leve de las vías respiratorias superiores y síntomas similares a los del resfriado. En general, entre 4 y 5 millones de niños menores de 4 años adquieren una infección por RSV y más de 120.000 niños son hospitalizados anualmente en los Estados Unidos debido a esta infección.

Hasta ahora, los intentos de desarrollar una vacuna eficaz no han tenido éxito. Incluso con vacunaciones repetidas, el sistema inmunológico humano es incapaz de generar una respuesta inmunitaria suficientemente protectora con base en anticuerpos. Las infecciones que se repiten anualmente son comunes incluso entre personas previamente infectadas con funciones inmunes normales, aunque se observan pocas hospitalizaciones entre niños mayores y adultos con el sistema inmunológico intacto. Actualmente se desconocen las razones de la ausencia de una inmunidad protectora después de la vacunación o de infecciones repetidas. Actualmente, hay pocas opciones de tratamiento disponibles para las infecciones de las vías respiratorias inferiores con RSV, y el tratamiento debe iniciarse de inmediato al inicio de la infección para inhibir eficazmente la replicación del virus. En 1986, la Administración de Alimentos y Fármacos (FDA) de los Estados Unidos aprobó la ribavirina, un agente antivírico de amplio espectro, para el tratamiento de niños con enfermedad grave por RSV.

La proteína F media la fusión de la membrana viral con la membrana de la célula diana y, por lo tanto, media la entrada del genoma del virus en la célula diana. La proteína F incrustada en la membrana de las células infectadas media la fusión entre las células infectadas y sus vecinas, lo que conduce a la formación de sincitios característica de la infección por RSV. La proteína F es una proteína de fusión tipo I que se reordena de una conformación previa a la fusión metaestable a una estructura posterior a la fusión altamente estable. Este cambio estructural en la proteína es necesario para la fusión a la membrana. La unión del anticuerpo al sitio antigénico II/A interfiere con este cambio estructural, evitando así la infección de la célula diana, así como la fusión de las células infectadas con las células vecinas y la posterior formación de sincitios.

La inhibición del mecanismo de fusión previene la infección in vitro e in vivo, neutralizando eficazmente el virus. Experimentos previos en animales indicaron que la protección contra la infección por RSV se confiere principalmente por anticuerpos neutralizantes, en particular anticuerpos hacia la proteína F en la superficie de la partícula del RSV. Posteriormente se desarrollaron anticuerpos monoclonales derivados de roedores, tales como MED-493 (también conocido como palivizumab o Synagis) para su uso en humanos con riesgo de infecciones por RSV (Boeckh, M et al., 2001). Palivizumab fue aprobado por la FDA en 1998 para su uso en pacientes de alto riesgo y, hasta ahora, es el único anticuerpo monoclonal dirigido contra el RSV que está aprobado para uso humano.

Se construyó un mapa topológico y operativo detallado de epítopos implicados en la neutralización y fusión utilizando anticuerpos neutralizantes derivados de roedores específicos para la proteína F de la cepa A2 del RSV. Se identificaron tres sitios antigénicos no superpuestos (A, B y C) y un sitio puente (AB). El anticuerpo monoclonal anti-RSV disponible comercialmente, palivizumab, se une a una región altamente conservada en el dominio extracelular de la proteína F madura, denominada sitio antigénico II o sitio A (sitio antigénico II/A), que se dice que abarca los aminoácidos 262 al 275.

La seguridad y eficacia de palivizumab validan el sitio antigénico II/A como un objetivo crucial y eficaz para un anticuerpo monoclonal para su uso como medida profiláctica para prevenir infecciones. No obstante, un subconjunto de cepas del RSV son resistentes al palivizumab, y el uso de palivizumab puede seleccionar tales cepas resistentes.

Se generó un anticuerpo de segunda generación, motavizumab, manipulando aminoácidos individuales dentro de las seis regiones determinantes de complementariedad (CDR) de palivizumab. Los aminoácidos en estas regiones se sustituyeron individualmente por cualquier aminoácido y se seleccionaron las mejores combinaciones para mejorar la potencia sobre palivizumab sin cambiar la especificidad del epítopo definido. Motavizumab es aproximadamente diez veces más potente que su predecesor, palivizumab, debido a una mayor afinidad por la proteína F. Sin embargo, motavizumab no proporciona una mejora significativa en la protección contra la infección por RSV en pacientes con alto riesgo de contraer infecciones de las vías respiratorias inferiores y tiene un mayor riesgo de efectos secundarios no deseados, en particular reacciones alérgicas. La FDA no aprobó el uso de motavizumab en humanos. Como lo demuestran los resultados clínicos, la manipulación de unos pocos aminoácidos en la secuencia de un anticuerpo existente puede aumentar los riesgos de efectos secundarios graves en los seres humanos.

Se han realizado más intentos para mejorar el anticuerpo palivizumab. En moléculas de unión específicas al RSV y medios para producirlas (documento U.S. 8.562.996) de Spits, se presenta un anticuerpo de alta afinidad contra una región de epítopo diferente del RSV. Parece que el anticuerpo puede tener una mayor IC50 contra ciertas cepas del RSV que palivizumab. En anticuerpos humanos contra la proteína F del virus sincitial respiratorio y métodos de uso de la misma (documento US 14/207797) de Gurnett, se divulga un anticuerpo con una región de epítopo que se superpone a la de palivizumab, con una mayor afinidad y capaz de neutralizar el subtipo A y B del RSV. Sin embargo, ninguna de las referencias divulga diferencias en las capacidades de cualquier anticuerpo para neutralizar aislados del RSV no neutralizados por palivizumab.

Los anticuerpos que reconocen la región antigénica II/a de la proteína F del RSV como palivizumab o motavizumab se describen en Jason Mclellan et al., Journal of Molecular Biology, vol. 409, No. 1, páginas 853-866 (2011).

Por lo tanto, existe una necesidad significativa de nuevos anticuerpos que se dirijan a una amplia gama de cepas del RSV, incluidas las cepas resistentes a palivizumab. Además, son de interés los anticuerpos que tienen un menor riesgo de reacciones adversas en humanos.

Sumario de la invención

Esta invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que los constructos de anticuerpos completamente humanos que reconocen la proteína F del RSV son capaces de neutralizar cepas del RSV tanto resistentes a palivizumab como sensibles a palivizumab. Además, se presentan métodos y composiciones para mejorar aún más la farmacocinética y la citotoxicidad de los anticuerpos.

Se ha demostrado que todas las cepas del RSV que exhiben resistencia a palivizumab contienen cambios de aminoácidos dentro de una región específica en la región antigénica II/A de la proteína F (Zhao, X et al., 2004). Como ejemplo, las cepas del RSV resistentes a palivizumab seleccionadas in vitro tenían mutaciones en la posición 272 de la proteína de fusión, de lisina por asparagina, metionina, treonina, glutamina o glutamato. Se detectaron variantes que contenían mutaciones en las posiciones 272 y 275 en pacientes con progresos.

La idoneidad de la región antigénica II/A de la proteína F como diana para prevenir la infección por RSV, incluida la infección del tracto respiratorio inferior, ha sido confirmada por la eficacia de palivizumab. Aunque se informó anteriormente que la mayoría de los epítopos dentro de la región antigénica II/A eran constantes entre los virus del subgrupo A, varios epítopos en el sitio II/A son muy variables entre los virus del subgrupo B. El sitio antigénico II/A en la proteína F, y en particular el epítopo cubierto por palivizumab y motavizumab (posiciones de aminoácidos en la región de 262 a 275) está sujeto a mutaciones con una frecuencia de 1 en 20 de todos los aislados clínicos probados. Palivizumab es ineficaz para prevenir las infecciones del tracto respiratorio inferior por estas cepas mutantes. Por lo tanto, los anticuerpos dirigidos a la misma región antigénica podrían mostrar una eficacia mejorada en comparación con palivizumab y motavizumab en los casos en que se encuentren mutaciones en estas posiciones de aminoácidos. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de desarrollar nuevos anticuerpos monoclonales que se unan a la región antigénica II/A de la proteína F del RSV con mayor afinidad que el palivizumab y que sean capaces de prevenir y/o tratar la infección por cepas del RSV resistentes a palivizumab.

Las reacciones alérgicas graves son efectos secundarios comunes de las intervenciones preventivas y/o terapéuticas basadas en anticuerpos, lo que limita significativamente el uso de dichos anticuerpos. Se han observado efectos secundarios alérgicos graves durante las pruebas clínicas de motavizumab. Por ejemplo, en las pruebas clínicas se observó una mayor frecuencia de reacciones de hipersensibilidad, incluidos casos sugestivos de anafilaxia. Varios pacientes tratados con múltiples dosis de motavizumab desarrollaron anticuerpos antifármaco (ADA) y tuvieron reacciones alérgicas graves debido a ADA. Tanto el palivizumab como el motavizumab son derivados del ratón y no son de origen humano. La estructura de aminoácidos diseñada de novo de motavizumab en las CDR y sus secuencias murinas residuales son posibles razones de reacciones adversas en los estudios clínicos de etapa tardía, y finalmente se consideró que el motavizumab no era seguro para uso humano.

Los anticuerpos generados por el sistema inmunológico humano contra patógenos tales como RSV exhiben inherentemente una menor propensión a reaccionar con autoantígenos humanos. Los nuevos constructos de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos que se dirigen a RSV descritos en este documento se construyen completamente a partir de origen humano.

El palivizumab no es suficiente para prevenir la infección por cada aislado del RSV. Por lo tanto, es muy deseable un constructo de anticuerpo de alta afinidad completamente humano o un fragmento de anticuerpo con especificidad para una región antigénica del RSV (tal como II/A).

La invención se expone en el conjunto de reivindicaciones adjuntas. Las realizaciones y/o ejemplos de la siguiente descripción que no están cubiertos por las reivindicaciones adjuntas no se consideran parte de la presente invención.

El anticuerpo o fragmento de anticuerpo reconoce preferiblemente cepas del RSV tanto sensibles a palivizumab como resistentes a palivizumab. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo tiene preferiblemente una constante de afinidad mayor de aproximadamente 10-9 M, y preferiblemente mayor de aproximadamente 10-10 M, o mayor de aproximadamente 10-11 M. El constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo reconoce y neutraliza cepas del RSV humano de tipo A y B. El constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo reconoce y neutraliza más de una cepa del RSV, y preferiblemente una o más cepas del RSV resistentes a palivizumab.

En la presente divulgación, se describe un constructo de anticuerpo completamente humano o un fragmento del mismo con especificidad para la región antigénica II/A del RSV y una constante de afinidad de al menos 10-9 M, y preferiblemente mayor que 10-10 M. El constructo de anticuerpo completamente humano o su fragmento es capaz de neutralizar cepas de virus RSV de tipo A y B. El anticuerpo es capaz de inhibir la unión por palivizumab. El constructo de anticuerpo o el fragmento de anticuerpo neutraliza una o más cepas resistentes a palivizumab.

De acuerdo con la presente invención, se proporciona una célula que comprende una primera secuencia de ADNc que codifica una región variable de la cadena pesada y una segunda secuencia de ADNc que codifica una región variable de la cadena ligera, en la que la célula produce un anticuerpo humano o fragmento de anticuerpo que comprende la región variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena ligera,

en la que la región variable de la cadena pesada codificada por la primera secuencia de ADNc comprende (a) una región determinante de complementariedad de cadena pesada (CDR) CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GASINLYD (SEQ ID NO: 8), (b) una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos GYISGST (SEQ ID NO: 9), y (c) una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos ARDVGWGPQYYYGLDV (SEQ ID NO: 10);

y en la que la región variable de la cadena ligera codificada por la segunda secuencia de ADNc comprende (a) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos HSVQSTS (SEQ ID NO: 14), (b) una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos GGS ( SEQ ID NO: 15) y (c) una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos QQSDRSPPIT (SEQ ID NO: 16),

en la que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une con especificidad a la región antigénica II/A de la proteína F del RSV con una afinidad mayor a 1 x 10-9 M.

En una realización, la célula es una célula eucariota. En una realización, la célula es una célula de mamífero. En una realización, la célula es una célula vegetal. En una realización, la célula es una célula HEK293T. En una realización, la célula es una célula de tabaco.

En una realización, la secuencia de ADNc de la región variable de la cadena pesada se acopla a una secuencia de ADNc que codifica una región constante de inmunoglobulina humana. En una realización preferida, la secuencia de ADNc de la región constante es de un paciente diferente a la región variable de la cadena pesada y/o la región variable de la cadena ligera. En una realización, la inmunoglobulina humana es de IgG1. La célula comprende uno o más vectores de expresión, en los que el uno o más vectores de expresión comprenden la primera secuencia de ADNc o comprenden la segunda secuencia de ADNc.

En una realización, la secuencia de ADNc de la región variable de la cadena pesada comprende una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2.

En una realización, la secuencia de ADNc de la región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 4.

En una realización, esta invención se refiere a una secuencia de ADNc como se describe en el presente documento. En una realización, esta invención se refiere a una molécula de ARN codificada por una secuencia de ADNc como se describe en el presente documento.

La invención proporciona además un anticuerpo humano o un fragmento de anticuerpo que comprende al menos una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera,

en el que una región variable de la cadena pesada codificada por una primera secuencia de ADNc que comprende (a) una región determinante de complementariedad de cadena pesada (CDR) 1 que comprende la secuencia de aminoácidos GASINLYD (SEQ ID NO: 8), (b) una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos GYISGST (SEQ ID NO: 9), y (c) una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos ARDVGWGPQYYYGLDV (SEQ ID NO: 10),

y en el que una región variable de la cadena ligera codificada por una segunda secuencia de ADNc comprende (a) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos HSVQSTS (SEQ ID NO: 14), (b) una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos GGS (SEQ ID NO: 15) y (c) una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos QQSDRSPPIT (SEQ ID NO: 16),

en el que el constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une a la región antigénica II/A del RSV con una afinidad mayor a 1 x 10-9 M. En una realización, el constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo es capaz de neutralizar al menos una cepa del RSV. En una realización preferida, el constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo es capaz de neutralizar una o más cepas del RSV que son resistentes a palivizumab. En una realización, la capacidad de neutralización del constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo contra al menos una cepa del RSV es al menos 2 veces mayor que la capacidad de neutralización de palivizumab. En una realización, la capacidad de neutralización del constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo contra al menos una cepa del RSV es al menos 3 veces mayor que la capacidad de neutralización de palivizumab. En una realización, la capacidad de neutralización del constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo contra al menos una cepa del RSV es al menos 4 veces mayor que la capacidad de neutralización de palivizumab. En una realización, la capacidad de neutralización del constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo contra al menos una cepa del RSV es al menos 5 veces mayor que la capacidad de neutralización de palivizumab. En una realización, la capacidad de neutralización del constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo contra al menos una cepa del RSV es al menos 10 veces mayor que la capacidad de neutralización de palivizumab. En una realización, la capacidad de neutralización del constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo contra al menos una cepa del RSV es al menos 15 veces mayor que la capacidad de neutralización de palivizumab.

En una realización, la región variable de la cadena pesada del constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de homología de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 y en la que además la región variable de la cadena ligera del constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de homología de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3.

En una realización, el constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo reconoce un epítopo en la proteína F del RSV. En una realización, el constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo reconoce un epítopo dentro de la región antigénica II/A de la proteína F del RSV. En una realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo reconoce una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90 % de homología de secuencia con el epítopo de la SEQ ID NO: 23 y/o la SEQ ID NO: 24.

El anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede construirse para comprender glucanos que carecen de fucosa y xilosa, y/o incorporar una región Fc adaptada para unirse al receptor neonatal FcRn de células epiteliales con al menos 10 veces (o 100 veces) menos afinidad que AR201. El anticuerpo puede ser una versión modificada de AR201, por ejemplo, conservando las 6 CDR identificadas en este documento.

En una realización, esta invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo como se describe en el presente documento y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. En una realización, el constructo de anticuerpo o el fragmento de anticuerpo se liofiliza. En una realización, el constructo de anticuerpo o el fragmento de anticuerpo está en una solución acuosa. En una realización, esta invención se refiere a una bolsa para terapia intravenosa, que comprende el constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo como se describe en el presente documento y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

En una realización, esta invención se refiere a un método para producir un constructo de anticuerpo o parte funcional del misma, comprendiendo el método cultivar una célula como se describió anteriormente en condiciones en las que se expresan las secuencias de ADNc, produciendo así un constructo o fragmento de anticuerpo que se une con especificidad a la región antigénica II/A del RSV. En una realización preferida, el anticuerpo o un fragmento del mismo se une a la región antigénica II/A del RSV con una afinidad mayor a 1 x 10-9 M. En una realización preferida adicional, el anticuerpo o fragmento del mismo es capaz de neutralizar al menos una cepa del RSV. En una realización especialmente preferida, el anticuerpo o fragmento del mismo es capaz de neutralizar una o más cepas del RSV que son resistentes a palivizumab.

En una realización, esta invención se refiere a una columna o membrana de cromatografía que comprende un constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo como se describe en el presente documento, en la que el constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une a la columna o membrana de cromatografía. En una realización, la columna o membrana de cromatografía comprende proteína A, por ejemplo una resina de proteína A. En una realización, la columna o membrana de cromatografía comprende una resina de intercambio iónico. En una realización, la columna o membrana de cromatografía comprende una columna de cromatografía de inducción de carga hidrófoba.

En un aspecto, esta invención se refiere a un anticuerpo humano o fragmento de anticuerpo como se describe en el presente documento para el paciente para su uso en la profilaxis y/o tratamiento de una infección por RSV en un paciente con o en riesgo de infección por RSV.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un esquema del proceso utilizado para aislar un anticuerpo específico para la proteína F del RSV de linfocitos humanos seleccionados y cultivados.

La Figura 2 describe la secuencia de nucleótidos completa (SEQ ID NO: 1) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) de la región variable de la cadena pesada de AR201.

La Figura 3 describe la secuencia de nucleótidos completa (SEQ ID NO: 3) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 4) de la región variable de la cadena ligera kappa de AR201.

La Figura 4 describe las secuencias de nucleótidos completas (SEQ ID NO: 5; SEQ ID NO: 6; SEQ ID NO: 7) y las secuencias de aminoácidos (SEQ ID NO: 8; SEQ ID NO: 9; S^eQ ID NO: 10) de las regiones CDR de la región variable de la cadena pesada de AR201.

La Figura 5 describe las secuencias de nucleótidos completas (SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 13) y las secuencias de aminoácidos (SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 16) de las regiones CDR de la región variable de la cadena ligera de AR201.

La Figura 6 describe la unión de AR201 (•) purificado e IgG1 monoclonal no específica humana (A) al antígeno RSV-EIA en un amplio intervalo de concentraciones.

La Figura 7 describe el reconocimiento y la unión de cepas de referencia del RSV-A y RSV-B por AR201.

Las Figuras 8A y 8B comparan el reconocimiento de aislados clínicos del RSV por AR201 (barras negras) y palivizumab (barras blancas).

La Figura 8C indica la proporción de unión de AR201 y palivizumab a aislados clínicos del RSV. Las barras negras indican una relación de unión mayor a 5 para la unión de AR201 sobre palivizumab al aislado clínico del RSV respectivo, indicativo de resistencia del aislado clínico hacia palivizumab.

La Figura 9A proporciona la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 17) de la proteína F de un aislado clínico que es resistente a palivizumab.

La Figura 9B describe la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 18) de la proteína F de un aislado clínico resistente a palivizumab.

La Figura 10 proporciona la secuencia de aminoácidos de la región del epítopo de palivizumab (SEQ ID NO: 23) y la secuencia de aminoácidos correspondiente de la proteína F de una cepa resistente a palivizumab (SEQ ID NO: 24) que es reconocida por AR201.

La Figura 11 proporciona los péptidos predichos (SEQ ID NO: 25 y SEQ ID NO: 26) resultantes de la digestión con Asp-N de la proteína F del RSV que contiene fragmentos de la región del epítopo de palivizumab.

La Figura 12 describe la escisión con Asp-N de la proteína F del RSV que está unida por AR201 (barras negras) o palivizumab (barras blancas).

La Figura 13 es un gráfico que muestra la eficacia profiláctica relativa del AR201 administrado por vía intramuscular para proteger a las ratas de una exposición al RSV en comparación con palivizumab.

Descripción detallada

Debe entenderse que esta invención no se limita a las realizaciones particulares descritas, ya que, por supuesto, pueden variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en este documento tiene el propósito de describir únicamente realizaciones particulares, y no pretende ser limitante, ya que el alcance de esta invención estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas.

La descripción detallada de la invención se divide en varias secciones sólo para conveniencia del lector y la divulgación que se encuentra en cualquier sección puede combinarse con la de otra sección. A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto en la técnica a la que pertenece esta invención.

Debe observarse que, como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno, una" y "el, la" incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "un compuesto" incluye una pluralidad de compuestos.

Definiciones

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Como se usa en este documento, los siguientes términos tienen los siguientes significados.

El término "aproximadamente" cuando se usa antes de una designación numérica, por ejemplo, temperatura, tiempo, cantidad, concentración y otros, incluido un intervalo, indica aproximaciones que pueden variar en (+) o (-) 10 %, 5 % o 1 %.

Se pretende que "que comprende" o "comprende" signifique que las composiciones y métodos incluyen los elementos enumerados, pero sin excluir otros. "Consistir esencialmente en" cuando se usa para definir composiciones y métodos, significará excluir otros elementos de cualquier significado esencial para la combinación para el propósito establecido. Por lo tanto, una composición que consiste esencialmente en los elementos tal como se definen en este documento no excluiría otros materiales o etapas que no afecten materialmente a la característica o características básicas y novedosas de la invención reivindicada. "Consistente en" significará excluir más que los oligoelementos de otros ingredientes y etapas sustanciales del método. Las realizaciones definidas por cada uno de estos términos de transición están dentro del alcance de esta invención.

"Composición farmacéuticamente aceptable" se refiere a una composición que es adecuada para la administración a un ser humano. Tales composiciones incluyen varios excipientes, diluyentes, vehículos y otros agentes inactivos bien conocidos por el experto en la materia.

"Cantidad terapéuticamente eficaz" o "cantidad terapéutica" se refiere a una cantidad de un fármaco o un agente que, cuando se administra a un paciente que padece una afección, tendrá el efecto terapéutico pretendido, por ejemplo, alivio, mejora, paliación o eliminación de una o más manifestaciones de la afección en el paciente. La cantidad terapéuticamente eficaz variará dependiendo del paciente y la afección que se esté tratando, el peso y la edad del sujeto, la gravedad de la afección, la sal, solvato o derivado de la porción de fármaco activo elegida, la composición particular o excipiente elegido, el régimen de dosificación a seguir, el momento de la administración, la forma de administración y similares, todo lo cual puede ser determinado fácilmente por un experto en la técnica. El efecto terapéutico completo no ocurre necesariamente por la administración de una dosis y puede ocurrir solo después de la administración de una serie de dosis. Por lo tanto, se puede administrar una cantidad terapéuticamente eficaz en una o más administraciones.

"Tratamiento", "que trata" y "tratar" se definen como actuar sobre una enfermedad, trastorno o afección con un agente para reducir o mejorar los efectos nocivos o no deseados de la enfermedad, trastorno o afección y/o sus síntomas. "Tratamiento", como se usa en el presente documento, cubre el tratamiento de un paciente e incluye: (a) reducir el riesgo de aparición de la afección en un paciente que se determina que está predispuesto a la afección pero que aún no se ha diagnosticado que la padezca, (b) impedir el desarrollo de la afección y/o (c) aliviar la afección, es decir, provocar la regresión de la afección y/o aliviar uno o más síntomas de la afección. "Tratar" o "tratamiento de" una condición o paciente se refiere a tomar medidas para obtener resultados beneficiosos o deseados, incluidos resultados clínicos tal como la reducción de síntomas. Para los propósitos de esta invención, los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a: prevenir la infección de un paciente con riesgo de infección por RSV; o reducir la gravedad de la infección por RSV, por ejemplo, reduciendo uno o más síntomas, reduciendo la duración de la infección, etc.

Como se usa en este documento, el término "paciente" se refiere a un mamífero. En una realización preferida, el paciente es un ser humano.

Como se usa en este documento, el término "cepa" o "cepa del RSV" se refiere a cualquier RSV. Las cepas incluyen, pero no se limitan a, aislados clínicos, variantes, mutantes y similares. Las cepas pueden ser resistentes a palivizumab o sensibles a palivizumab. Las cepas pueden ser rSv , de tipo A o B. En general, las cepas se distinguen por una o más mutaciones genéticas, incluso si dicha mutación no confiere una característica diferente al virus.

Como se usa en este documento con respecto a la unión de un anticuerpo a una secuencia de péptido del RSV, una "región de epítopo" es una secuencia identificada que incluye aquellos aminoácidos que participan en la interacción de unión con el anticuerpo. Por ejemplo, aunque ciertos ensayos tienen una resolución adecuada para identificar una región de aminoácidos del antígeno dentro de la cual tienen lugar interacciones de unión de anticuerpos, no todos los aminoácidos participan realmente en la interacción de unión. El "epítopo", como se usa en este documento, es la combinación de aminoácidos dentro de la región del epítopo que interactúan con el anticuerpo para proporcionar la unión específica entre el antígeno y el anticuerpo.

Como se usa en el presente documento, el término "constructo de anticuerpo" se refiere a un anticuerpo en el que al menos una parte del anticuerpo se deriva de un anticuerpo de un paciente humano que ha estado expuesto al antígeno de interés. Un constructo de anticuerpo puede ser un anticuerpo completo o un fragmento o porción del mismo, siempre que el anticuerpo, fragmento o porción tenga la afinidad indicada por la proteína F. Un constructo de anticuerpo puede ser completamente humano, humanizado o quimérico. Un constructo de anticuerpo puede comprender secuencias de aminoácidos derivadas de un solo paciente, múltiples pacientes y/o secuencias de anticuerpos conocidas (por ejemplo, una secuencia de región constante de consenso).

Como se usa en este documento, el término "fragmento de anticuerpo" se refiere a cualquier porción del anticuerpo que reconoce un epítopo. Los fragmentos de anticuerpos pueden glicosilarse. A modo de ejemplo no limitativo, el fragmento de anticuerpo puede ser un fragmento Fab, un fragmento Fab', un fragmento F(ab% un fragmento Fv, un fragmento rIgG, un fragmento de anticuerpo funcional, formas recombinantes de cadena sencilla del anterior y similares. F(ab')2, Fab, Fab' y Fv son fragmentos de unión a antígeno que se pueden generar a partir de la región variable de IgG e IgM. Varían en tamaño, valencia y contenido de Fc. Los fragmentos se pueden generar mediante cualquier método, incluida la expresión de los constituyentes (por ejemplo, porciones de cadena pesada y ligera) por una célula o línea celular, o múltiples células o líneas celulares.

Los fragmentos "F(ab')2" contienen dos regiones de unión a antígeno unidas en la bisagra mediante enlaces disulfuro y carecen de la mayor parte de la región Fc. Los fragmentos "Fab" se derivan de F(ab')2 pero incluyen sólo una región de unión al antígeno. Pueden contener una pequeña porción de Fc.

Los fragmentos "Fab" son fragmentos monovalentes producidos a partir de IgG e IgM, que constan de las regiones de cadena pesada variable, cadena pesada constante, cadena ligera variable, y cadena ligera constante, unidas por un enlace disulfuro intramolecular.

"Fv" es el fragmento más pequeño producido a partir de IgG e IgM que contiene un sitio completo de unión al antígeno. Fv comprende una porción de las cadenas ligeras y pesadas variables, unidas por interacciones no covalentes. Estas cadenas tienden a disociarse tras la dilución, pero pueden entrecruzarse, por ejemplo, usando glutaraldehído, disulfuros intermoleculares o un enlazador peptídico. Los fragmentos Fv tienen las mismas propiedades de unión y características de unión tridimensionales similares a las de Fab.

"rIgG" se refiere a IgG reducida o semi-IgG, que contiene una cadena pesada y una cadena ligera. rIgG se puede producir reduciendo selectivamente los enlaces disulfuro de la región bisagra.

Como se usa en este documento, el término "anticuerpo completamente humano" se refiere a un anticuerpo, constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo que consiste completamente en una secuencia de aminoácidos humana. Es decir, la secuencia de aminoácidos del constructo de anticuerpo monoclonal humano se deriva de una célula humana. Esto se puede obtener de diferentes formas. Por ejemplo, el constructo de anticuerpo monoclonal humano que consiste en una secuencia de aminoácidos humana puede obtenerse de una célula diseñada para expresar las cadenas ligeras y pesadas de la región variable y/o CDR de un anticuerpo derivado de un paciente humano (por ejemplo, un paciente que ha sido expuestos al RSV y/o a la proteína F del RSV). Alternativamente, el constructo de anticuerpo monoclonal humano se puede obtener a partir de un hibridoma, en el que la célula B es una célula B humana. Alternativamente, el constructo de anticuerpo monoclonal humano puede obtenerse mediante injerto de CDR de las regiones CDR, por ejemplo, las indicadas en las Figuras 4 y 5, en anticuerpos monoclonales humanos disponibles, produciendo así un constructo de anticuerpo monoclonal humano de acuerdo con la presente invención. La secuencia de aminoácidos completamente humana del constructo de anticuerpo monoclonal humano evita la aparición de efectos adversos no deseados tales como reacciones de rechazo o choque anafiláctico.

El término "neutralizar" o "capacidad neutralizante", como se usa en el presente documento, se refiere a la capacidad del constructo de anticuerpo para atenuar la infectividad por el virus. Por ejemplo, el constructo de anticuerpo puede hacer que la proteína de fusión viral sea ineficaz de manera que la fusión entre el virus y una célula, y/o entre las células infectadas, se bloquee o atenúe. En este documento se expone un anticuerpo que tiene al menos el doble de la capacidad neutralizante de palivizumab, como se muestra en el Ejemplo 6 (como se determina mediante el ensayo de infectividad).

Constructos de anticuerpos monoclonales y fragmentos de los mismos

La presente invención se refiere a un constructo de anticuerpo monoclonal o fragmento de anticuerpo que se une específicamente a la proteína F del RSV. Preferiblemente, el constructo de anticuerpo o el fragmento de anticuerpo se une específicamente a la región antigénica II/A de la proteína F.

En una realización, el constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une a la proteína F con una afinidad mayor a 1 x 10-9 M. En una realización, el constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une a la proteína F con una afinidad mayor a 1 x 10-10 M. En una realización, el constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une a la proteína F con una afinidad mayor a 5 x 10-10 M. En una realización, el constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une a la proteína F con una afinidad mayor a 1 x 10-11 M. En una realización, el constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une a la proteína F con una afinidad mayor a 1 x 10-12 M. En una En la realización, el constructo de anticuerpo o el fragmento de anticuerpo se une a la proteína F con una afinidad mayor a 5 x 10-12 M.

En una realización, el constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une a la proteína F con una afinidad mayor que palivizumab. En una realización, el constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une a la proteína F con una afinidad de entre aproximadamente 2:1 y aproximadamente 500:1 frente a palivizumab. En una realización preferida, el constructo de anticuerpo o el fragmento de anticuerpo se une a la proteína F con una afinidad de entre aproximadamente 20:1 y aproximadamente 200:1 frente a palivizumab. Debe entenderse que la relación puede oscilar entre dos de estos valores o cualquier valor entre ellos (incluidos los puntos extremos). En una realización, el constructo de anticuerpo o el fragmento de anticuerpo se une a la proteína F con una afinidad de al menos aproximadamente 2:1 frente a palivizumab. En una realización, el constructo de anticuerpo o el fragmento de anticuerpo se une a la proteína F con una afinidad de al menos aproximadamente 5:1 frente a palivizumab. En una realización, el constructo de anticuerpo o el fragmento de anticuerpo se une a la proteína F con una afinidad de al menos aproximadamente 10:1 frente a palivizumab. En una realización, el constructo de anticuerpo o el fragmento de anticuerpo se une a la proteína F con una afinidad de al menos aproximadamente 50:1 frente a palivizumab. En una realización, el constructo de anticuerpo o el fragmento de anticuerpo se une a la proteína F con una afinidad de al menos aproximadamente 100:1 frente a palivizumab. En una realización, el constructo de anticuerpo o el fragmento de anticuerpo se une a la proteína F con una afinidad de al menos aproximadamente 200:1 frente a palivizumab. En una realización, el constructo de anticuerpo o el fragmento de anticuerpo se une a la proteína F con una afinidad de al menos aproximadamente 300:1 frente a palivizumab. En una realización, el constructo de anticuerpo o el fragmento de anticuerpo se une a la proteína F con una afinidad de al menos aproximadamente 400: 1 frente a palivizumab. En una realización, el constructo de anticuerpo o el fragmento de anticuerpo se une a la proteína F con una afinidad de al menos aproximadamente 500:1 frente a palivizumab.

En un aspecto, el constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo es capaz de neutralizar las cepas del virus RSV. En una realización, el constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo es capaz de neutralizar al menos una cepa del RSV. En una realización, el constructo de anticuerpo o el fragmento de anticuerpo es capaz de neutralizar al menos una cepa del RSV tipo A. En una realización, el constructo de anticuerpo o el fragmento de anticuerpo es capaz de neutralizar al menos una cepa del RSV tipo B. En una realización preferida, el constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo es capaz de neutralizar al menos una cepa del rSv tipo A y al menos una cepa de tipo B. En una realización especialmente preferida, el constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo es capaz de neutralizar una o más cepas que son resistentes a palivizumab.

En una realización, el constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo es capaz de neutralizar al menos una cepa del RSV con una mayor capacidad de neutralización que palivizumab. En una realización, la capacidad de neutralización del constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo contra al menos una cepa del RSV es al menos dos veces mayor que la capacidad de neutralización de palivizumab. En una realización, la capacidad de neutralización del constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo contra al menos una cepa del RSV es al menos cinco veces mayor que la capacidad de neutralización de palivizumab. En una realización, la capacidad de neutralización del constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo contra al menos una cepa del RSV es al menos diez veces mayor que la capacidad de neutralización de palivizumab. En una realización, la capacidad de neutralización del constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo contra al menos una cepa del RSV es al menos quince veces mayor que la capacidad de neutralización de palivizumab.

En un aspecto, el constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85% de homología de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1. En una realización, el constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90% de homología de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1. En una realización, el constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95% de homología de secuencia con la secuencia de aminoácido de la SEQ ID NO: 1. En una realización, el constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 96% de homología de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1. En una realización, el constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 97% de homología de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1. En una realización, el constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una secuencia de aminoácido que tiene al menos 98% de homología de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1. En una realización, el constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 99% de homología de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1. En una realización, el constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1. En una realización preferida, la región variable de la cadena pesada del constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1.

En un aspecto, el constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende al menos una CDR con una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85% de homología de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8, SEQ iD NO: 9, y/o SEQ ID NO: 10. En una realización, el constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende al menos una CDR con una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90% de homología de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9 y/o SEQ ID NO: 10. En una realización, el constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende al menos una CDR con una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95% de homología de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8, SEQ ⁱD NO: 9 y/o SEQ ID NO: 10. En una realización, el constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende al menos una CDR con una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 96% de homología de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8, SEQ iD NO: 9 y/o SEQ ID NO: 10. En una realización, el constructo de anticuerpo o el fragmento de anticuerpo comprende al menos una CDR con una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 97% de homología de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8, SEQ iD NO: 9 y/o SEQ ID NO: 10. En una realización, el constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende al menos una CDR con una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 98% de homología de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, y/o SEQ ID NO: 10. En una realización, el constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende al menos una CDR con una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 99% de homología de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8, SEQ iD NO: 9, y/o SEQ ID NO: 10. En una realización, el constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende al menos una CDR con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, y/o SEQ ID NO: 10. En una realización preferida, el constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una CDR1 de cadena pesada con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8, una CDR2 de cadena pesada con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9, y una CDR3 de cadena pesada con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10.

En un aspecto, el constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85% de homología de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3. En una realización, el constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90% de homología de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3. En una realización, el constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95% de homología de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3. En una realización, el constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 96% de homología de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3. En una realización, el constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 97% de homología de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3. En una realización, el constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 98% de homología de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3. En una realización, el constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 99% de homología de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3. En una realización, el constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3. En una realización preferida, la región variable de la cadena ligera del constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3.

En un aspecto, el constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende al menos una CDR con una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 85% de homología de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, y/o SEQ ID NO: 16 En una realización, el constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende al menos una CDR con una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90% de homología de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 y/o SEQ ID NO: 16. En una realización, el constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende al menos una CDR con una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95% de homología de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 y/o SEQ ID NO: 16. En una realización, el constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende al menos una CDR con una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 96% de homología de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, y/o SEQ ID NO: 16. En una realización, el constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende al menos una CDR con una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 97% de homología de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, y/o SEQ ID NO: 16. En una realización, el constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende al menos una CDR con una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 98% de homología de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 y/o SEQ ID NO: 16. En una realización, el constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende al menos una CDR con una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 99% de homología de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 y/o SEQ ID NO: 16. En una realización, el constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende al menos una CDR con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 y/o SEQ ID NO: 16. En una realización preferida, el constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende una CDR1 de cadena ligera con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14, una CDR2 de cadena ligera con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15 y una CDR3 de cadena ligera con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16.

La invención se refiere además a derivados del constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo descrito en este documento. El término "derivado" abarca cualquier mutante del constructo de anticuerpo que se diferencia por la adición, eliminación y/o sustitución de al menos un aminoácido. Preferiblemente, el derivado es un mutante del constructo de anticuerpo que porta al menos una sustitución conservadora en cualquiera de las CDR en la cadena pesada y/o cadena ligera como se indica en las Figuras 4 y 5. Más preferiblemente, el mutante no tiene más de 5, no más de 4, preferiblemente no más de 3, particularmente preferido no más de 2 sustituciones conservadoras. La capacidad del fragmento o derivado del anticuerpo para unirse al epítopo puede determinarse mediante ELISA directo, por ejemplo, como se describe en la sección de Ejemplos a continuación.

De acuerdo con la presente invención, el término "sustitución conservadora" significa un reemplazo de un aminoácido que pertenece a un grupo fisicoquímico particular por un aminoácido que pertenece al mismo grupo fisicoquímico. Los grupos fisicoquímicos se definen como sigue: el grupo de aminoácidos apolares comprende: glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, prolina, fenilalanina y triptófano. El grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales polares no cargadas comprende asparagina, glutamina, tirosina, cisteína y cisteína. El grupo fisicoquímico de aminoácidos que tiene una cadena lateral polar cargada positivamente comprende lisina, arginina e histidina. El grupo fisicoquímico de aminoácidos que tiene una cadena lateral polar cargada negativamente comprende ácido aspártico y ácido glutámico, también denominados aspartato y glutamato.

En una realización, la cadena ligera del constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo de acuerdo con la presente invención es del tipo kappa o lambda. En una realización preferida, la cadena ligera es del tipo kappa. La cadena ligera puede ser una cadena de origen natural que incluye un tipo de cadena ligera reordenada naturalmente, modificada genéticamente o sintética. De acuerdo con una realización adicional, la cadena pesada del anticuerpo de la presente invención se selecciona de todos los isotipos humanos, a saber, IgM, IgA o IgG. La cadena ligera y la cadena pesada pueden estar unidas covalentemente como un anticuerpo monocatenario (por ejemplo, scFv bivalente, scFv bifuncional y scFv biespecífico) o unidas no covalentemente entre sí.

En un aspecto, el constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo reconoce un epítopo en la proteína F del RSV. En una realización, el epítopo está dentro de la región antigénica II/A. En una realización, el constructo de anticuerpo reconoce un epítopo dentro de la región antigénica II/A que tiene al menos un 85% de homología de secuencia con una porción de la secuencia de aminoácidos de la ^s E^q ID NO: 23 o SEQ ID NO: 24. En una realización, el constructo de anticuerpo reconoce un epítopo dentro de la región antigénica II/A que tiene al menos un 90% de homología de secuencia con una porción de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 24. En una realización, el constructo de anticuerpo reconoce un epítopo dentro de la región antigénica II/A que tiene al menos un 95% de homología de secuencia con una porción de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 24. En una realización, el constructo de anticuerpo reconoce un epítopo dentro de la región antigénica II/A que tiene al menos un 96% de homología de secuencia con una porción de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 24. En una realización, el constructo de anticuerpo reconoce un epítopo dentro de la región antigénica II/A que tiene al menos un 97% de homología de secuencia con una porción de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 24. En una realización, el constructo de anticuerpo reconoce un epítopo dentro de la región antigénica II/A que tiene al menos un 98% de homología de secuencia con una porción de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 24. En una realización, el constructo de anticuerpo reconoce un epítopo dentro de la región antigénica II/A que tiene al menos un 99% de homología de secuencia con una porción de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 23 o SEQ ID NO: 24.

En una realización, el constructo de anticuerpo reconoce un epítopo dentro de la región antigénica II/A que tiene al menos un 85% de homología de secuencia con una porción de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 25 o SEQ ID NO: 26. En una realización, el constructo de anticuerpo reconoce un epítopo dentro de la región antigénica II/A que tiene al menos un 90% de homología de secuencia con una porción de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 25 o SEQ ID NO: 26. En una realización, el constructo de anticuerpo reconoce un epítopo dentro de la región antigénica II/A que tiene al menos un 95% de homología de secuencia con una porción de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 25 o SEQ ID NO: 26. En una realización, el constructo de anticuerpo reconoce una epítopo dentro de la región antigénica II/A que tiene al menos 96% de homología de secuencia con una porción de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 25 o SEQ ID NO: 26. En una realización, el constructo de anticuerpo reconoce un epítopo dentro de la región antigénica II/A que tiene al menos un 97% de homología de secuencia con una porción de la secuencia de aminoácidos de la ^s E^q ID NO: 25 o SEQ ID NO: 26. En una realización, el constructo de anticuerpo reconoce un epítopo dentro de la región antigénica II/A que tiene al menos un 98% de homología de secuencia con una porción de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 25 o SEQ ID NO: 26. En una realización, el constructo de anticuerpo reconoce un epítopo dentro de la región antigénica II/A que tiene al menos un 99% de homología de secuencia con una porción de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 26 o SEQ ID NO: 26.

La presente invención se refiere además a secuencias de nucleótidos que codifican el constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo, o porciones de los mismos. En una realización, la secuencia de nucleótidos comprende una secuencia de ADNc. En una realización, la secuencia de nucleótidos comprende una secuencia de ADNc que codifica la región variable de la cadena pesada. En una realización, la secuencia de ADNc que codifica la región variable de la cadena pesada tiene al menos un 85% de homología de secuencia con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2. En una realización, la secuencia de ADNc que codifica la región variable de la cadena pesada tiene al menos 90% de homología de secuencia con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2. En una realización, la secuencia de ADNc que codifica la región variable de la cadena pesada tiene al menos un 95% de homología de secuencia con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2. En una realización, la secuencia de ADNc que codifica la región variable de la cadena pesada tiene al menos un 96% de homología de secuencia con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2. En una realización, la secuencia de ADNc que codifica la región variable de la cadena pesada tiene al menos 97 % de homología de secuencia con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2. En una realización, la secuencia de ADNc que codifica la región variable de la cadena pesada tiene al menos un 98% de homología de secuencia con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2. En una realización, la secuencia de ADNc que codifica la región variable de la cadena pesada tiene al menos un 99% de homología de secuencia con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2.

En una realización, la secuencia de nucleótidos comprende una secuencia de ADNc que codifica la región variable de la cadena ligera. En una realización, la secuencia de ADNc que codifica la región variable de la cadena ligera tiene al menos un 85% de homología de secuencia con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 4. En una realización, la secuencia de ADNc que codifica la región variable de la cadena ligera tiene al menos 90% de homología de secuencia con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 4. En una realización, la secuencia de ADNc que codifica la región variable de la cadena ligera tiene al menos un 95% de homología de secuencia con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 4. En una realización, la secuencia de ADNc que codifica la región variable de la cadena ligera tiene al menos un 96% de homología de secuencia con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 4. En una realización, la secuencia de ADNc que codifica la región variable de la cadena ligera tiene al menos 97% de homología de secuencia con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 4. En una realización, la secuencia de ADNc que codifica la región variable de la cadena ligera tiene al menos un 98% de homología de secuencia con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 4. En una realización, la secuencia de ADNc que codifica la región variable de la cadena ligera tiene al menos un 99% de homología de secuencia con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 4.

En una realización, la secuencia de nucleótidos codifica una o más CDR. En una realización, la secuencia de nucleótidos que codifica una o más CDR comprende un nucleótido con al menos un 85% de homología de secuencia con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 y/o SEQ ID NO: 13. En una realización, la secuencia de nucleótidos que codifica una o más CDR comprende un nucleótido con al menos un 90% de homología de secuencia con la secuencia de nucleótidos. de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, y/o SEQ ID NO: 13. En una realización, la secuencia de nucleótidos que codifica una o más CDR comprende un nucleótido con al menos 96%, 97%, 98% o 99% de homología de secuencia con la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 y/o SEQ ID NO: 13. En una realización preferida, la secuencia de nucleótidos que codifica una o más CDR comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO.: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11, SEQ ID nO: 12, y/o SEQ ID NO: 13. En una realización especialmente preferida, la secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 y/o SEQ ID NO: 7 codifica una CDR de la región variable de la cadena pesada del constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo. En una realización, la secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 y/o SEQ ID NO: 7 codifica una CDR de la región variable de la cadena ligera del constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo. En una realización, la secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID N^o : 11, SEQ ID NO: 12 y/o SEQ ID NO: 13 codifica una CDR de la región variable de la cadena pesada del constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo. En una realización especialmente preferida, la secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 y/o SEQ ID NO: 13 codifica una CDR de la región variable de la cadena ligera del constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo.

En una realización, la secuencia de nucleótidos es una secuencia de ADNc. En una realización, la secuencia de nucleótidos es una molécula de ARN codificada por un nucleótido que comprende la SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 y/o SEQ ID NO: 13. En una realización, la secuencia de nucleótidos es una molécula de ARN codificada por un nucleótido que comprende la SEQ ID NO: 2. En una realización, la secuencia de nucleótidos es una molécula de ARN codificada por un nucleótido que comprende la SEQ ID NO: 4.

La presente invención proporciona además vectores que comprenden al menos un ácido nucleico que codifica la cadena ligera del constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la presente invención y/o al menos un ácido nucleico que codifica la cadena pesada del constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la presente invención. Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en el mismo vector o pueden estar presentes en forma de vectores binarios. El vector comprende preferiblemente el promotor unido operativamente al ácido nucleico para facilitar la expresión del ácido nucleico que codifica la cadena ligera y/o pesada. Preferiblemente, el vector también incluye un origen para la replicación y el mantenimiento en una célula huésped. El vector también puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia señal ubicada en 5' del ácido nucleico que codifica la cadena ligera y/o la cadena pesada. La secuencia señal puede facilitar la secreción de la cadena codificada en el medio. El vector puede comprender además una secuencia de nucleótidos codificante de etiqueta His que da como resultado la expresión de un constructo para producir un producto de fusión con una etiqueta His en el extremo N de la cadena ligera y/o pesada del constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo, lo que facilita la purificación de la proteína.

En una realización, se modifica el constructo de anticuerpo o el fragmento de anticuerpo de acuerdo con la presente invención. Las modificaciones incluyen la di, oligo o polimerización de la forma monomérica por ejemplo, por entrecruzamiento usando diciclohexilcarbodiimida. Los di, oligo o polímeros se pueden separar entre sí mediante filtración en gel. Otras modificaciones incluyen modificaciones de la cadena lateral, por ejemplo, modificaciones de residuos de £-amino-lisina, o modificaciones del terminal amino y carboxilo, respectivamente. Otras modificaciones incluyen modificaciones postraduccionales, por ejemplo, glicosilación y/o desglicosilación parcial o completa de la proteína y formación de enlaces disulfuro. El constructo o fragmento de anticuerpo también se puede conjugar con una etiqueta, tal como una etiqueta enzimática, fluorescente o radiactiva.

En una realización, el constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo es un anticuerpo quimérico. En una realización, el constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo es un anticuerpo humanizado. En una realización preferida, el constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo es un anticuerpo humano. En una realización especialmente preferida, el constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo es un anticuerpo completamente humano.

En una realización, el constructo de anticuerpo o el fragmento de anticuerpo está liofilizado.

En un aspecto, esta invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo como se describe en el presente documento. Tales composiciones incluyen varios excipientes, diluyentes, vehículos y otros agentes inactivos bien conocidos por el experto en la materia. En una realización, la composición farmacéutica comprende el constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

Métodos para preparar constructos de anticuerpos y fragmentos de los mismos

Esta invención se refiere además a métodos y composición para preparar el constructo de anticuerpo o el fragmento de anticuerpo como se describe en el presente documento.

En una realización, las células B humanas se obtienen de pacientes que han estado expuestos a RSV y/o proteína F del RSV (por ejemplo, pacientes convalecientes o pacientes inmunizados con proteína F o un fragmento de la misma). Se pueden tomar muestras de sangre de los pacientes y se pueden aislar células B humanas de una manera conocida (por ejemplo, Current Protocols in Immunology. Capítulo 7.1. Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood. Publicado por Wiley & Sons, Eds: J C Coligan et al.). En una realización, la célula B humana puede fusionarse con un mieloma o heteromieloma para producir un hibridoma de acuerdo con técnicas conocidas de acuerdo con el enfoque clásico de Kohler y Milstein, como lo describen Lang et al., "Prophylaxis and therapy of Pseudomonas aeruginosa infection in cystic fibrosis and immunocompromised patients" Vaccine 22: S44-S48 (2004). En una realización preferida, se cultiva la célula B y se aísla la secuencia de ADNc de una región variable de la cadena pesada, región variable de la cadena ligera y/o una o más CDR. Las secuencias de ADNc se pueden usar para generar uno o más vectores. Los métodos para producir anticuerpos completamente humanos se describen, por ejemplo, en Beerli et al. "Isolation of Human Monoclonal Antibodies by Mammalian Cell Display", PNAS 105 (38): 14336-14341 (2008).

El vector o los vectores pueden introducirse en una célula de modo que la célula produzca el constructo de anticuerpo, el fragmento de anticuerpo o una porción del mismo. La célula puede ser una célula procariota o una célula eucariota. En una realización preferida, la célula es una célula vegetal o una célula de mamífero. En una realización, la célula es una célula humana. En una realización, la célula es una célula HEK293. En una realización, la célula es una célula PerC6, una célula CHO, una célula COS o una célula HELA.

En una realización, el constructo de anticuerpo o el fragmento de anticuerpo descrito en este documento se produce en una célula vegetal. Los métodos para producir anticuerpos en células vegetales se describen, por ejemplo, en las patentes de los Estados Unidos Nos. 8.119.406 y 8.513.397. En una realización preferida, la célula es de una planta de tabaco (por ejemplo, género Nicotiana). Se pueden obtener beneficios de la expresión en un sistema hospedador de plantas. Por ejemplo, las glicosilaciones alternativas de un sistema vegetal pueden mejorar la farmacocinética y/o los efectos citotóxicos deseables del anticuerpo del producto.

Preferiblemente, la célula huésped comprende al menos un ácido nucleico que codifica la cadena ligera y al menos un ácido nucleico que codifica la cadena pesada y es capaz de ensamblar el constructo de anticuerpo de manera que se genera una estructura tridimensional que es equivalente a la estructura tridimensional de un anticuerpo humano producido por una célula B humana. Si la cadena ligera se produce por separado de la cadena pesada, entonces ambas cadenas se pueden purificar y posteriormente ensamblar para producir un anticuerpo que tiene esencialmente la estructura tridimensional de un anticuerpo humano producido por una célula B humana. Alternativamente, la célula huésped comprende al menos un ácido nucleico que codifica al menos la porción de unión al antígeno de la cadena ligera y al menos un ácido nucleico que codifica al menos la porción de unión al antígeno de la cadena pesada, y es capaz de ensamblar el constructo o fragmento de anticuerpo tal que el constructo o fragmento de anticuerpo sea capaz de unirse al antígeno.

El constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo también se puede obtener mediante expresión recombinante de la cadena ligera y/o pesada codificada (o porción de la misma), en la que el ácido nucleico se produce aislando un ácido nucleico que codifica un anticuerpo humano e injertando la secuencia de ácido nucleico que codifica las CDR como se define en las figuras sobre el ácido nucleico aislado.

Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos pueden purificarse, por ejemplo, a partir del sobrenadante del cultivo celular, mediante cualquier método. Se describen ejemplos de métodos de purificación de anticuerpos en Liu et al., "Recovery and purification process development for monoclonal antibody production", mAbs 2 (5): 480-499 (2010).

En un aspecto, esta invención se refiere a una columna o membrana de cromatografía que comprende un constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo como se describe en el presente documento, en el que el constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une a la columna o membrana de cromatografía. En una realización, la columna o membrana de cromatografía comprende proteína A, por ejemplo una resina de proteína A. En una realización, la columna o membrana de cromatografía comprende una resina de intercambio iónico. En una realización, la columna o membrana de cromatografía comprende una columna de cromatografía de inducción de carga hidrófoba.

Aunque las descripciones y ejemplos en este documento están dirigidos a la producción del constructo o fragmento de anticuerpo dentro de una sola célula o línea celular, se contempla que una o más porciones del constructo o fragmento de anticuerpo pueden ser producidas por células o líneas celulares separadas y luego se combinan para formar un constructo o fragmento de anticuerpo funcional. Por ejemplo, la cadena pesada (o porción de la misma) puede ser producida por una célula, y la cadena ligera (o porción de la misma) puede ser producida por una segunda célula. Los componentes pueden aislarse o purificarse, por ejemplo del sobrenadante del cultivo celular, y enlazado covalentemente o no covalentemente por métodos rutinarios.

En una realización, esta invención se refiere a un método para determinar la potencia de un anticuerpo putativo frente a cepas del RSV que son resistentes a anticuerpos disponibles comercialmente, por ejemplo, palivizumab. La afinidad de unión, la capacidad neutralizante, la antigenicidad o cualquier otra medida de la utilidad del anticuerpo putativo contra al menos una cepa del RSV se puede comparar con el constructo de anticuerpo de la presente invención. En una realización, un anticuerpo putativo que se determina que se une con una afinidad igual o mayor que, tiene una capacidad de neutralización igual o mayor que, y/o exhibe una antigenicidad igual o menor que, un constructo de anticuerpo como se describe en el presente documento se ensaya adicionalmente por su efectividad contra el RSV.

Métodos de tratamiento

Esta invención se refiere además a métodos de tratamiento que utilizan el constructo de anticuerpo o el fragmento de anticuerpo como se describe en el presente documento.

En un aspecto, esta invención se refiere a métodos para prevenir la infección por RSV en un paciente con riesgo de infección por RSV. En una realización, se previene la infección de las vías respiratorias superiores. En un aspecto, se previene la infección de las vías respiratorias inferiores. En un aspecto, se previene la infección respiratoria tanto superior como inferior.

En un aspecto, esta invención se refiere a métodos para tratar la infección por RSV en un paciente. En una realización, se trata la infección de las vías respiratorias superiores. En un aspecto, se trata la infección de las vías respiratorias inferiores. En un aspecto, se trata la infección respiratoria tanto superior como inferior.

En una realización, el paciente es un ser humano. En una realización preferida, el paciente es un bebé (por ejemplo, menor de 12 meses de edad). En una realización, el paciente es un ser humano que padece una afección que aumenta el riesgo de infección por RSV. Las condiciones que aumentan el riesgo de infección por RSV incluyen, entre otras, tener menos de 6 meses de edad; tener menos de 12 meses de edad y haber nacido prematuramente (por ejemplo, antes de las 40 semanas de edad gestacional); enfermedad pulmonar; enfermedad pulmonar obstructiva crónica; cardiopatía congénita; insuficiencia cardíaca congestiva; sistema inmunológico debilitado; asma; inmunodeficiencia (por ejemplo, órgano trasplantado, leucemia, VIH/SIDA). Si bien las infecciones por RSV se consideran problemáticas principalmente para los bebés (prematuros), también los pacientes ancianos y con inmunodeficiencia (por ejemplo, pacientes VIH positivos, pacientes sometidos a quimioterapia o pacientes con otra afección subyacente grave) están en riesgo. Palivizumab no se usa normalmente para tratar estos grupos de pacientes debido a su baja eficacia. AR-201 muestra una mayor afinidad por el virus, reconoce más cepas virales y actualmente está siendo diseñado para mejorar la ADCC y prolongar la vida media. Se espera que tal potencia mejorada y durabilidad de acción aumenten el valor medicinal de un mAb anti-RSV en pacientes inmunodeprimidos y ancianos infectados con RSV.

En una realización, el constructo de anticuerpo o el fragmento de anticuerpo se administra a un paciente con riesgo de infección por RSV. En una realización, el constructo de anticuerpo o el fragmento de anticuerpo se administra a un paciente que tiene o se cree que tiene una infección por RSV. En una realización, se administra una cantidad terapéuticamente eficaz del constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo. En una realización, la cantidad terapéuticamente eficaz está entre aproximadamente 1 mg por kg de peso corporal y aproximadamente 1000 mg por kg de peso corporal. En una realización preferida, la cantidad terapéuticamente eficaz está entre aproximadamente 1 mg por kg de peso corporal y aproximadamente 100 mg por kg de peso corporal. En una realización más preferida, la cantidad terapéuticamente eficaz está entre aproximadamente 5 mg por kg de peso corporal y aproximadamente 50 mg por kg de peso corporal. Debe entenderse que la cantidad puede ser un intervalo entre dos de estos valores, o cualquier valor entre ellos (incluidos los puntos extremos).

El constructo de anticuerpo o el fragmento de anticuerpo se puede administrar por cualquier vía apropiada. Las composiciones, proporcionadas en este documento o conocidas, adecuadas para la administración de acuerdo con los métodos proporcionados en este documento, pueden ser adecuadas para una variedad de modos de administración que incluyen, sin limitación, administración intramuscular e intravenosa. También se pueden usar composiciones adecuadas para las vías interna, pulmonar, rectal, nasal, vaginal, lingual, intraarterial, intraperitoneal, intracutánea y subcutánea. También se pueden usar formas de dosificación de liberación sostenida. Todas las formas de dosificación pueden prepararse usando métodos que son estándar en la técnica (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a ed., A. Oslo editor, Easton Pa. 1980).

En una realización, el constructo o fragmento de anticuerpo se administra una vez. En una realización preferida, el constructo o fragmento de anticuerpo se administra varias veces. En una realización más preferida, el constructo o fragmento de anticuerpo se administra una vez al mes durante la temporada del RSV. Lo más preferiblemente, el constructo o fragmento de anticuerpo se administra solo una vez por temporada. La temporada del RSV es generalmente de noviembre a abril (en el hemisferio norte), pero puede ser más larga según el área y otros factores (por ejemplo, las cepas primarias que circulan en un año determinado).

En una realización, la invención se refiere a una bolsa para administración intravenosa, que comprende una bolsa IV que contiene el constructo de anticuerpo o fragmento de anticuerpo y un excipiente farmacéuticamente aceptable. Ejemplos

A menos que se indique lo contrario, las abreviaturas utilizadas a lo largo de la especificación tienen los siguientes significados:

ADNc: = ácido desoxirribonucleico complementario

CDR: = región determinante de complementariedad

ELISA: = ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas

FCS: = suero de ternera fetal

g: = gramo

HC: = cadena pesada

HRP: = peroxidasa de rábano picante

Ig: = inmunoglobulina

KD: = constante de disociación

kg: = kilogramo

LC: = cadena ligera

M: = molar

mAb: = anticuerpo monoclonal

mg: = miligramo

min: = minuto

ml: = mililitro

mM: = milimolar

ng: = nanogramo

nM: = nanomolar

PBS: = solución salina tamponada con fosfato

PCR: = reacción en cadena de la polimerasa

pM: = picomolar

ARN: = ácido ribonucleico

RSV: = virus sincitial respiratorio

RT-PCR: = PCR de transcripción inversa

Mg: = microgramo

Ml: = microlitro

MM: = micromolar

°C: = grado Celsius

Estos símbolos de una letra tienen el siguiente significado cuando representan aminoácidos:

A: = Alanina

R: = Arginina

N: = Asparagina

D: = Ácido aspártico

C: = Cisteína

E: = Ácido glutámico

Q: = Glutamina

G: = Glicina

H: = Histidina

I: = Isoleucina

L: = Leucina

K: = Lisina

M: = Metionina

F: = Fenilalanina

P: = Prolina

S: = Serina

T: = Treonina

W: = Triptófano

Y: = Tirosina

V: = Valina

Cuando se representan ácidos nucleicos, A = Adenina; T = Timina; C = Citosina; G = Guanina; U = Uracilo, N = cualquier ácido nucleico.

Los siguientes ejemplos están destinados a ilustrar adicionalmente ciertas realizaciones de la divulgación y no están destinados a limitar su alcance.

Ejemplo 1: Selección de células B humanas específicas para el RSV

Para la generación de un constructo de anticuerpo específico para la proteína F del RSV, se aislaron linfocitos humanos de amígdalas recientemente resecadas de bebés humanos infectados por RSV mediante rotura mecánica y paso a través de un filtro celular. Los linfocitos aislados se agotaron en paralelo de los monocitos por adhesión plástica en matraces de cultivo celular y, posteriormente, las células B específicas del RSV se enriquecieron mediante la incubación de linfocitos con antígeno total del RSV inmovilizado. Para este propósito, se recubrieron placas de 6 pocillos con antígeno del RSV total (antígeno EIA) a razón de 10 pg/ml en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante la noche. Después del recubrimiento, los pocillos se bloquearon mediante incubación con suero de ternera fetal (FCS) al 10% en PBS. Se incubaron entre uno y diez millones de células empobrecidas en monocitos por pocillo de la placa de seis pocillos recubierta. Después de la incubación durante una hora, los pocillos se lavaron y las células unidas se recogieron mediante tripsinización. Las células se agregaron a placas que contenían medio de cultivo celular que contenía FCS al 10% y sobrenadante acondicionado al 10% con 20.000 células alimentadoras EL-4B5 (amable obsequio del Hospital Universitario de Ginebra, Ginebra, Suiza) que habían sido irradiadas a 5000 cGy mediante un irradiador de investigación Gammacell 40. El sobrenadante acondicionado se generó estimulando linfocitos de sangre periférica aislados con fitohemaglutinina (PHA, 5 pg/ml) y acetato de miristato de forbol (PMA, 10 ng/ml) durante 36 horas, seguido de la eliminación de células y detritos antes de la criopreservación. El sobrenadante acondicionado se descongeló antes de la adición a los linfocitos seleccionados de RSV-EIA. Después de hasta diez días, se analizaron pequeñas alícuotas de los sobrenadantes del cultivo celular en busca de anticuerpos específicos mediante ELISA de RSV-EIA.

Las placas de ELISA se recubrieron con antígeno RSV-EIA o proteína F del RSV purificada (proteína F del RSV de glicoproteína de fusión del RSV (A2) humana, Sino Biological Inc., Beijing, China) a razón de 0,5 pg/ml durante la noche a 4 °C, luego bloqueado con BSA al 0,5% en PBS. Los sobrenadantes del cultivo celular se diluyeron con PBS que contenía Tween al 0,05% (PBS-Tween) y se colocaron alícuotas en los pocillos. Después de la incubación y el posterior lavado con PBS-Tween, se usó anti-IgG humana de cabra marcada con peroxidasa de rábano picante (HRP) para detectar la IgG humana unida al antígeno. Los pocillos positivos se identificaron mediante medición colorimétrica y las células de los pocillos positivos se expandieron a baja densidad en presencia de células alimentadoras irradiadas y medio de cultivo celular que contenía FCS al 10% y sobrenadante acondicionado al 10% (como se describió anteriormente) durante un período de varios días. Después de volver a analizar los sobrenadantes para determinar la especificidad de la proteína F del RSV, se recolectaron las células de los pocillos positivos y se procesaron para el aislamiento del ARN.

Ejemplo 2: Generación de anticuerpo monoclonal humano contra el RSV

El método para aislar el anticuerpo específico se resume en la Figura 1. Específicamente, se usó ARN de células B seleccionadas para generar ADNc de 5'RACE, seguido de RT-PCR específica de isotipo para identificar la región variable de la cadena pesada (HC) y la cadena ligera (LC) como lo describen Welschof M, et al., 1995. La región variable de la HC se combinó mediante PCR con la región constante de una IgG1 que está esencialmente de acuerdo con la secuencia de referencia del IMGT Y14737 (Lefranc, M.-P. et al., 2001, The Immunoglobulin Facts Book Academic Press, Londres, Reino Unido) y se clonó en el vector de expresión eucariota pcDNA3.3-Topo (Invitrogen, EE. UU.). La región codificante completa de la LC se amplificó mediante RT-PCR y se clonó en el vector de expresión. Posteriormente, los vectores se transfectaron transitoriamente en células HEK293T [ATCC # CRL-11268 (American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA 20110 EE.UU.)]. De cuatro a cinco días después de la transfección, los sobrenadantes se analizaron mediante ELISA para determinar la presencia de anticuerpos de unión a antígeno como se describió anteriormente. El candidato más prometedor, AR201 (también llamado KBRV201), fue seleccionado para secuenciar las regiones variables de las cadenas pesada y ligera. Los vectores finales se amplificaron y analizaron mediante secuenciación de Sanger.

Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos correspondientes se proporcionan en las Figuras 2 (cadena pesada, SEQ ID NO: 1 y 2) y 3 (cadena ligera, SEQ ID NO: 3 y 4). Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos correspondientes de las regiones CDR individuales se proporcionan en las Figuras 4 (cadena pesada: CDR1, SEQ ID NO: 5 y 8; CDR2, SEQ ID NO: 6 y 9; CDR3, SEQ ID NO: 7 y 10) y 5 (cadena ligera: CDR1, SEQ ID NO: 11 y 14; CDR2, SEQ ID NO: 12 y 15; CDR3, SEQ ID NO: 13 y 16).

Ejemplo 3: Unión del anticuerpo monoclonal humano al antígeno de la proteína F del RSV

Se ensayó el anticuerpo humano AR201 aislado y secuenciado para determinar las características de unión a la proteína F del RSV, como se muestra en la Figura 6. Se sembraron células Hek293T a razón de 300.000 células por pocillo de una placa de seis pocillos y se cultivaron durante la noche. Después de un día, se cambió el medio y se añadió cuidadosamente a las células una solución recién preparada de plásmidos de expresión. Las células se incubaron durante otras 24 horas y el medio se cambió de nuevo por medio Pro293a-CDM. Después de tres a cinco días, se recogió el sobrenadante resultante que contenía el anticuerpo recombinante y el anticuerpo se purificó mediante cromatografía de afinidad con una columna de afinidad de sefarosa de proteína A HiTrap (GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA, EE. UU.). El anticuerpo resultante se almacenó a -20 °C hasta su uso. Para los experimentos de unión, se recubrieron placas de ELISA como se describió anteriormente, y se agregaron diluciones en serie de AR201 purificado o un anticuerpo IgG1 monoclonal completamente humano no relacionado (control). Después de un lavado cuidadoso, los anticuerpos unidos se detectaron con un anticuerpo secundario marcado con IgG-HRP antihumana. Los valores de EC50 se calcularon basándose en la medición colorimétrica del anticuerpo unido aplicando una ecuación de pendiente variable de cuatro parámetros (software GraphPad Prism V5.02, software GraphPad Inc. San Diego, CA, EE. UU.). El valor de EC50 de AR201 se calculó como 0,1031 nM. No se pudo calcular ningún valor de EC50 para el anticuerpo IgG1 humano monoclonal de control.

Ejemplo 4: Medición de afinidad de AR201

La caracterización cinética de la interacción de AR201 frente a un anticuerpo específico disponible comercialmente para la proteína F del RSV (palivizumab) se realizó mediante resonancia de plasmón de superficie (Biaffin GmbH, Kassel, Alemania). El AR201 se produjo y se purificó como se describió anteriormente. La proteína F del RSV humana recombinante se inmovilizó covalentemente mediante acoplamiento de amina a un chip sensor CM5 para la caracterización cinética de la interacción con los anticuerpos usando resonancia de plasmón de superficie en un instrumento Biacore 2000 (GE Healthcare, Biacore AB, Uppsala, Suecia). Para el análisis cinético del anticuerpo AR201, se prepararon diluciones de anticuerpo AR201 comenzando a 100 nM y terminando a 49 pM después de doce diluciones 1:1 en tampón de operación. Las muestras se inyectaron durante un tiempo de asociación de dos minutos y la disociación se controló al cambiar a tampón de operación durante 30 minutos a un caudal de 30 pl/min. El anticuerpo unido se eliminó después de cada inyección mediante regeneración de la superficie usando HCl 100 mM (3 x 10 segundos). La evaluación de los datos se realizó mediante el ajuste global de las curvas de unión asumiendo un modelo de unión 1:1 de Langmuir utilizando el software Biacore Evaluation versión 4.1. La constante de disociación determinada (KD) para AR201 es 58 ± 6 pM. En comparación, palivizumab tiene un valor de KD significativamente menor de 960 pM (www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/EPAR_-_Scientific_ Discussion/human/000257/WC500056731.pdf). Los resultados se proporcionan en la Tabla 1.

Tabla 1. Constantes de asociación y disociación para AR201.

Analito Kdis en s-1 Kasoc en M'1 s'1 K^d en M

AR201 (2,7 ± 0,1) x 10-5 (4,7 ± 0,5) x 105 (5,8 ± 0,6) x 10-11

Ejemplo 5: Unión de AR201 a cepas de referencia del RSV

La unión de AR201 a cepas de referencia del RSV se probó mediante ensayo ELISA. Las cepas de referencia del RSV RSV-A Long (ATCC VR-26), RSV-B (ATCC VR 1580) y RSV-A2 (ATCC VR-1540) se adquirieron todas a través de LCG (LGC Standards Sarl, Molsheim, Francia) y se amplificaron en células Vero. Posteriormente, el sobrenadante de los pocillos positivos se crioconservó a -80 °C hasta su uso posterior. Para el ELISA, las placas de ensayo se recubrieron con un anticuerpo policlonal anti-RSV a razón de 500 ng/ml. Mientras tanto, se incubaron 10 |jg/ml de AR201 o anticuerpo de control de isotipo IgG1 monoclonal humano con RSV a una dilución 1:10 de las cepas del RSV amplificadas congeladas. Después de 1 hora, los complejos inmunes se transfirieron a las placas de ELISA recubiertas y se añadió un anticuerpo secundario marcado con IgG-HRP antihumano. La IgG humana unida se detectó mediante medición colorimétrica. Como se muestra en la Figura 7, las tres cepas de referencia son reconocidas por AR201.

Ejemplo 6: Neutralización de cepas de referencia por AR201

La neutralización de las cepas de referencia del RSV por AR201 y palivizumab se probó en un ensayo de infectividad. La existencia de virus (25-250 ufp/pocillo) de las cepas de referencia RSV-A Long (ATCC VR-26) y RSV-B (ATCC VR 1580) se incubó con una serie de dilución doble de solución de anticuerpo y luego se añadió a células Vero que se sembraron en placas de 24 pocillos el día anterior. Después de cuatro horas, el inóculo se reemplazó por una capa de agarosa semisólida y se incubó durante otros tres días. Posteriormente, las células se fijaron y se tiñeron mediante inmunohistoquímica para detectar la presencia de placas específicas del RSV. El porcentaje de neutralización para cada concentración de los anticuerpos específicos del RSV se calculó basándose en el número de placas por pocillo. Basándose en la concentración de la existencia de anticuerpos, se calculó la concentración mínima de anticuerpo neutralizante que logró > 50% de neutralización del virus. Como se muestra en la Tabla 2, AR201 fue al menos dos veces más eficaz para neutralizar las partículas virales de cualquiera de las cepas y prevenir la formación de sincitios indicativos de una infección reproductiva activa, en comparación con palivizumab. Un anticuerpo de control monoclonal humano de isotipo IgG no tuvo ningún efecto sobre la prevención de infecciones de células Vero con ninguna de las cepas de referencia del RSV.

Tabla 2: Concentración de anticuerpo efectiva media máxima estimada (ng/mL).

Palivizumab AR201 Control de isotipo Relación Palivizumab/AR201

RSV-A/Long 100 ng/ml 40 ng/ml > 1000 2,5

RSV-B 200 ng/ml 100 ng/ml > 1000 2

Ejemplo 7: Unión de AR201 a aislados clínicos del RSV

El reconocimiento de aislados del RSV clínicos aislados frescos por AR201 se probó mediante ensayo ELISA. Se recolectaron aislados clínicos del RSV (21 aislados separados) de moco nasofaríngeo de pacientes que dieron positivo para RSV. El moco recogido se cultivó mediante incubación en células Vero, y el sobrenadante de los pocillos positivos (identificados por la formación de sincitios) se pasó en serie dos veces sobre células Vero frescas. El sobrenadante de los pocillos positivos se crioconservó a -80 °C hasta su uso posterior. Para el análisis de unión, las placas de ELISA se recubrieron con aislados individuales del RSV (diluidos 1:10) y posteriormente se incubaron con AR201, palivizumab o un anticuerpo de control de isotipo IgG monoclonal humano, a razón de 1 pg/ml. Se añadió a cada pocillo un anticuerpo secundario marcado con IgG antihumana-HRP. La IgG humana unida se detectó mediante medición colorimétrica. La absorbancia de fondo, determinada por la señal del anticuerpo monoclonal IgG de control, se dedujo dos veces de la señal detectada con AR201 o palivizumab y cualquier valor de absorbancia mayor a 0,1 se consideró una señal positiva. El experimento se repitió tres veces; un experimento representativo se muestra en las Figuras 8A y 8B. AR201 reconoció los 21 aislados clínicos en diferente medida, mientras que palivizumab siempre mostró una menor intensidad de señal. Para identificar cepas resistentes a palivizumab, se analizó la relación de la señal de unión de AR201 con respecto a palivizumab. Cualquier aislado clínico con una relación de señal de unión de 5 o más de AR201 sobre palivizumab se consideró un aislado resistente a palivizumab.

Los resultados del análisis se muestran en la Figura 8C y la Tabla 3. AR201 reconoció los 21 aislados clínicos en un grado variable, mientras que palivizumab siempre mostró una menor intensidad de señal. Palivizumab no reconoció 4 de los 21 aislados, en particular los aislados clínicos # 6, # 9, # 12 y # 20. El aislado clínico # 20 tuvo una proporción justo por encima de 5.

Tabla 3A. Reconocimiento de aislados clínicos del RSV

Anticuerpo monoclonal Reconocimiento de aislados clínicos

AR201 21/21

Palivizumab 17/21

mAb de control de IgG humana 0/21

En un análisis adicional, se analizaron 68 aislados adicionales mediante un método alternativo: ensayo de reducción de placa. Este segundo ensayo produjo un formato de salida diferente en comparación con el primer ensayo (ELISA): para el aislado # 1 y el aislado # 20 ("primer ensayo ELISA", se probaron una serie de diluciones de anticuerpos para encontrar el IC50 que se consideró para pruebas adicionales. En el ensayo de reducción de placa, el análisis implicó probar UNA concentración de anticuerpo y contar cuántas placas se formaron. Menos placas indicaron que el anticuerpo ha hecho que el virus sea menos infeccioso.

Se analizaron 42 aislados del RSV/A y 26 aislados del RSV/B para la neutralización por AR201 y palivizumab en el ensayo de reducción de placa. Se incubó una solución de 20 pg/ml de AR201 o palivizumab con 5E4 UFP/ml de virus durante 1 hora a 36°C, se diluyó en serie y se añadió a una monocapa casi confluente de células diana HEp-2 en placas de 24 pocillos. Después de 1,5 horas, se aspiró el sobrenadante, las células se recubrieron con medio y se incubaron adicionalmente. Los efectos citopatogénicos se controlaron diariamente y las placas se fijaron y tiñeron después de que se formaran placas bien definidas. Se contaron las unidades formadoras de placa (UFP) y se calculó la reducción de las UFP mediante AR201 o palivizumab.

En el ensayo de reducción de placa, AR201 redujo el número de placas en todos los casos a menos del 1%, mientras que palivizumab mostró una reducción tan fuerte sólo en el 45% de los aislados. Para los virus RSV/A, la capacidad de reducir las placas fue en promedio 100 veces más fuerte para AR201 que para palivizumab. Para los aislados del RSV-B, AR201 mostró una reducción 20 veces más fuerte que palivizumab. AR201 inhibió completamente la formación de placa (inmunidad esterilizante) para 38 de 42 cepas A probadas (palivizumab: 2 de 42 cepas A) y para 23 de 26 cepas B probadas (palivizumab 7 de 26 cepas B). De los 68 aislados A y B probados, 59 fueron neutralizados de manera más eficiente por AR201 que por palivizumab. Los otros 9 fueron completamente neutralizados por ambos anticuerpos (0 placas formadas); no se pudo determinar ninguna diferencia en la eficiencia de neutralización a la concentración de anticuerpo probada.

Tabla 3B. Resumen del efecto de AR201 en comparación con los anticuerpos monoclonales palivizumab en múlti les ce as del RSV/A RSV/B se ún lo determinado or un ensa o de reducción de laca.

Tabla 3C. Efecto de AR201 y Palivizumab sobre la reducción >100 veces en UFP y la inmunidad esterilizante con ce as de virus RSV/A RSV/B

Ejemplo 8: Neutralización de aislados clínicos por AR201

La neutralización de dos aislados clínicos del RSV (aislamiento # 1 y # 20) por AR201 y palivizumab se ensayó en un ensayo de infectividad. Los dos aislados del RSV se amplificaron en células Vero y el sobrenadante se crioconservó hasta su uso posterior. La dilución de la solución madre que alcanza una tasa de infectividad del 50% en un cultivo de tejidos (TCID) se calculó con base en el algoritmo de Spearman y Karber (Hierholzer et al., 1996, en Virology Methods Manual, editado por BMJ Mahy y HO Kangro, Londres: Academic Press, página 47). Las existencias de virus se descongelaron y diluyeron a 10 x TCID50, y se incubaron con diluciones seriadas de anticuerpos AR201, palivizumab o anticuerpo monoclonal de control humano de isotipo IgG1. La mezcla se añadió a células Hep2 confluentes (ATCC CCL-23) en placas de 96 pocillos y se incubó durante cuatro días. Las células se fijaron y las células infectadas se detectaron con un clon 631 de anticuerpo monoclonal de ratón anti-RSV (Milan Analytica AG, Suiza). La tasa de infección y los valores de IC50 se calcularon basándose en la medición colorimétrica del anticuerpo unido aplicando una ecuación de pendiente variable de cuatro parámetros (software GraphPad Prism V5.02, GraphPad Software Inc. San Diego, CA, EE. UU.). La IC50 sirvió como medida de la actividad de neutralización. IC50 es la concentración de anticuerpos (g/ml) que neutraliza la capacidad de infectividad de una dosis infecciosa del RSV en un 50%.

Los resultados se muestran en la Tabla 4. AR201 tenía una IC50 que era 18 veces más baja que palivizumab para el aislado # 1. Para el aislado # 20, no se observó capacidad de neutralización para palivizumab, lo que confirma que palivizumab no se une al aislado clínico # 20, mientras que AR201 mostró una IC50 similar en el aislado # 20 como se observa con el aislado # 1.

continuación

Ejemplo 9: Secuenciación de la secuencia de la proteína F del aislado clínico # 20 resistente a palivizumab

Se determinaron las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la proteína F del aislado clínico # 20. El ARN se aisló del aislado clínico # 20 amplificado y el ADNc se generó con cebadores específicos de la proteína F (Cebador de proteína F del RSV-A: GAAATTAAACCTGGGGCAAATAACC [SEQ ID NO: 19]; cebados de proteína F del RSV-B: ACAAAATMAACTCTGGGGCAAATAAC [SEQ ID NO: 20]). El fragmento resultante (tamaño esperado: 1935 pb) se amplificó usando cebadores específicos (RSV-7607: CTtCg YGACATATTTGCCCcAg [SEQ ID NO: 21]; ZhaoF: GGGGCAMTMCMTGGAGTTGC [SEQ ID No : 22]). El ADN amplificado se secuenció mediante secuenciación de Sanger en Microsynth (Balgach, Suiza).

La secuencia de nucleótidos de la región codificante de la proteína F del aislado clínico # 20 (SEQ ID NO: 17) se proporciona en la Figura 9A. La secuencia de aminoácidos correspondiente (SEQ ID NO: 18) se proporciona en la Figura 9B.

La comparación con la secuencia publicada de la región del epítopo postulada de palivizumab (McLellan JS. et al., 2010), identificada como la secuencia de los aminoácidos 254 a 277 de la cepa A2 de la proteína F del RSV, reveló una mutación de lisina en la posición 272 por asparagina (K272N) para el aislado clínico # 20, como se muestra en la Figura 10. Una mutación en la posición 272 de lisina por otro aminoácido se describió anteriormente como crítica para la pérdida de unión de palivizumab a la proteína F (Zhu, et al., 2011; Adams et al., 2010), lo que confirma la incapacidad de palivizumab para unirse dentro de la región del epítopo del aislado clínico # 20, confirmando que la secuencia de la región del aislado # 20 no incluye una secuencia de aminoácidos funcional como epítopo de palivizumab. Además, se generaron dos virus mutantes resistentes a palivizumab y ambos tenían una única mutación de aminoácido (aa) en la posición 262.

Ejemplo 10: Generación de mutantes resistentes a palivizumab.

Se generaron mutantes resistentes a palivizumab de RSV/A/Tracy y RSV/B/18537, respectivamente, después del pase en serie de los virus en concentraciones crecientes (40, 80, 160 y 320 pg/ml) de palivizumab. Se aislaron dos virus mutantes resistentes a palivizumab y ambos tenían una mutación de un solo aminoácido (aa) en la posición 262, como se muestra en la Figura 10. Ambas cepas parentales tenían asparagina (una amida, aa polar neutro) en aa262 y ambos mutantes resistentes al palivizumab tenían tirosina (un aa polar neutro aromático). El cambio de N262Y ocurrió en el dominio antigénico II putativo y dentro de la región del epítopo definida por palivizumab (aa262-276). La mayoría de los mutantes resistentes al palivizumab publicados tienen cambios que ocurren en los aa 272, 268, 275 y 276. Como se muestra en la Tabla 5 a continuación, el mutante resistente al palivizumab de las ratas algodoneras infectadas con RSV/A/Tracy o RSV/B/18537 se comparó igualmente bien con el virus original, sin embargo, el virus mutante fue resistente a los efectos de la inmunoprofilaxis con palivizumab.

Tabla 5. Comparación del efecto inhibidor de AR201 y palivizumab (40 pg/ml cada uno) sobre RSV/A/Tracy y RSV/B/18537 resistentes a alivizumab.

__________

Ejemplo 11: Inhibición cruzada en aislados clínicos del RSV con AR201 y palivizumab

El palivizumab es el único anticuerpo monoclonal anti-RSV que ha sido aprobado por la FDA hasta la fecha para la prevención de la infección por RSV en bebés y recién nacidos. Palivizumab se une a la región antigénica A de la proteína F del RSV e inhibe los eventos de fusión del RSV con células epiteliales de pulmón humano.

La inhibición cruzada eficaz de la unión de dos anticuerpos monoclonales independientes solo puede ocurrir si ambos anticuerpos reconocen un epítopo, o epítopos muy próximos (por ejemplo, la misma región del epítopo), de modo que un anticuerpo cuando se une a su epítopo ejerce un impedimento estérico para unión del otro anticuerpo. Se preincubaron partículas del RSV intactas con anticuerpo competidor (palivizumab, AR201 o control a razón de 20 pg/ml) durante una hora y posteriormente se añadieron a placas de ELISA de poliestireno que habían sido recubiertas con palivizumab o AR201. Después de la incubación durante una hora a 4 °C, se lavaron las placas y se añadió a cada pocilio antisuero policlonal de conejo anti-RSV marcado con HRP. Las partículas virales unidas se detectaron mediante medición colorimétrica. La unión máxima del RSV al anticuerpo inmovilizado en presencia del anticuerpo competidor se determinó en relación con la unión en presencia del anticuerpo de control IgG humano monoclonal.

Los resultados se proporcionan en la Tabla 6. La preincubación de partículas virales del RSV con AR201 redujo la unión a placas recubiertas con AR201 hasta 22,5%, mientras que la preincubación con palivizumab afectó menos la unión a las placas recubiertas con AR201 y redujo la señal a solo un 29,2% del valor de control. Por el contrario, la preincubación de partículas virales del RSV con AR201 redujo la unión del RSV a placas recubiertas con palivizumab hasta 40,8%, mientras que la preincubación con palivizumab redujo la unión a placas recubiertas con palivizumab a un nivel ligeramente más bajo, 35,3%.

Estos resultados indican que AR201 se dirige a la región antigénica idéntica en la proteína F del RSV como palivizumab. Es decir, AR201 y palivizumab pueden tener epítopos diana en la región similar de aminoácidos en la proteína F del RSV, pero estos anticuerpos no necesariamente interactúan con los mismos miembros del epítopo de aminoácidos dentro de la región. La diferencia en la inhibición cruzada indica que AR201 reconoce un epítopo similar o cercano al epítopo de palivizumab, pero no el epítopo idéntico.

Tabla 6. In ânticuerpos

Ejemplo 12: Digestión con proteasa de la proteína F

Asp-N es una endoproteasa que escinde selectivamente enlaces peptídicos del terminal N hasta residuos de ácido aspártico. La digestión con Asp-N de la proteína F del RSV cortará el epítopo del terminal N postulado de palivizumab de las posiciones de aminoácidos 263 y 269, generando dos fragmentos de proteína de 62 aminoácidos y 40 aminoácidos de longitud. Cada péptido contiene solo una parte del epítopo intacto de palivizumab, como se muestra en la Figura 11.

La proteína F recombinante purificada se incubó durante 5 horas con Asp-N (Promega, Madison, WI, EE. UU.) A 37 °C, de acuerdo con las instrucciones del fabricante, en presencia de ditiotreitol (DTT) y yodoacetamida, y posteriormente se recubrió en placas ELISA. Se añadió anticuerpo (AR201 o palivizumab) a la placa a dos concentraciones diferentes, seguido de la adición de un anticuerpo policlonal IgG anti-humano marcado con HRP. El anticuerpo unido se detectó basándose en la medición colorimétrica.

Palivizumab no reconoció ninguno de los fragmentos de la digestión completa de la proteína F del RSV, mientras que AR201 todavía se unió como se muestra en la Figura 10. Esto demuestra que los dos anticuerpos no comparten el mismo epítopo, y AR201 reconoce una combinación de aminoácidos del epítopo en la región del epítopo 254-277 de la proteína F del RSV diferente de los aminoácidos que forman los aminoácidos del epítopo diana de palivizumab. Además, la región de unión del epítopo existe en una configuración tridimensional de modo que AR201 se une de manera diferente que palivizumab.

Ejemplo 13: Mapeo de epítopos conformacionales

Para caracterizar aún más el epítopo de AR201, las permutaciones de péptidos que contienen la secuencia de la región del epítopo se estructuraron en 3 dimensiones para imitar epítopos no lineales y se probaron para determinar la unión de AR201 y palivizumab mediante ELISA (tecnología CLIPS: Timmerman et al., 2007 Functional reconstruction and synthetic mimicry of a conformational Epitope using CLIPSMR technology. J. Mol. Recognit. 20: 283-99; Slootstra et al., 1996; Structural aspects of antibody-antigen interaction revealed through small random peptide libraries, Molecular Diversity 1: 87-96; llevado a cabo en Pepscan Presto BV, Países Bajos; véase más abajo). El objetivo principal de este estudio fue determinar si AR201 y palivizumab se unen a los mismos o diferentes epítopos.

El segmento de interés se redujo a NSELLSLINDMPITNDQKK LMSSNVQIVRQQSYSI, un segmento de la proteína F del virus RS (aminoácidos 254-288). Se diseñó un conjunto de péptidos estructurados CLIPS que cubren este segmento, se sintetizaron en el formato de matriz de Pepscan y se analizaron en ELISA de Pepscan.

Para resumir la primera fase del estudio, se encontró que ambos anticuerpos parecían unirse dentro de regiones de epítopo superpuestas en el segmento investigado. Sin embargo, la especificidad de unión fue muy diferente, lo que significa que los CLIPS parecen colocar los péptidos en una conformación que favorece a un anticuerpo, mientras que el otro favorece al segundo.

Con base en el resultado, se llevó a cabo un seguimiento detallado de escaneo de alanina de dos aglutinantes identificados. Para ambos anticuerpos, se encontró que las posiciones similares eran esenciales (en negrita y subrayado):

NSELLSLINDMPITNDOKKLMSSNVOIVROOSYSI [SEQ ID No: 29]

Sorprendentemente, con AR201 varias mutaciones de alanina simples o dobles aumentaron la actividad de unión, especialmente en la parte NVQIVRQQSYSI del péptido (que no es la "parte esencial" del epítopo reconocido por palivizumab). Se observó un resultado similar al alargar el péptido con MSI en la primera parte del estudio.

La conclusión general es que ambos anticuerpos se unen a NSELLSLINDMPITN DQKKLMSSN (SEQ ID NO: 29) pero con diferente especificidad. Pequeñas diferencias estructurales del epítopo, pero también fuera del epítopo, afectan la unión de ambos anticuerpos de formas completamente diferentes. Nuevamente, esto sugiere que la interacción de unión y los aminoácidos del epítopo son diferentes entre AR201 y palivizumab.

Ejemplo 14: Producción de AR201 en plantas

El AR201 se produjo en la planta Nicotiana benthamiana utilizando la tecnología de magnifección (Giritch et al, 2006, Rapid high-yield expression of full-size IgG antibodies in plants coinfected with noncompeting vir l vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 103(40):14701-14706), que permite la producción de anticuerpos en un período de tiempo muy corto. El uso de plantas con fucosiltransferasa y xilosiltransferasa disminuida (Strasser et al, 2008, Generation of glyco-engineered Nicotiana benthamiana for the production of monoclonal antibodies with a homogeneous human-like N-glycan structure. Plant Biotechnology Journal 6 (4): 392-402) permitió la producción de anticuerpos portadores de glucanos que carecen de fucosa y xilosa. La provisión de anticuerpos IgG sin fucosa tiene una mayor capacidad para provocar ADCC (citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos) debido a su mayor afinidad por FcRIIIA (CD16a).

Para las condiciones de crecimiento de las plantas, los vectores, la infiltración, la extracción y la purificación, se siguieron los métodos descritos en otra parte (Castilho et al., 2011; Rapid high yield production of different glycoforms of Ebola virus monoclonal antibody. PloS one, 6 (10), e26040, Giritch et al., 2006). En resumen, las cadenas pesadas y ligeras con codones optimizados se clonaron en vectores de expresión de plantas (Giritch et al, 2006) y se transformaron en Agrobacterium tumefaciens. Se mezclaron volúmenes iguales de cultivos de Agrobacterium cultivados durante la noche en tampón de infiltración (MES 1 mM/MgSO4 10 mM, pH 5,5) dando como resultado una dilución 1:1000 para cada cultivo individual. Las plantas de N. benthamiana cultivadas durante 4-5 semanas a 22 °C con un ciclo de luz/oscuridad de 16/8 horas se invirtieron y las partes aéreas se sumergieron en la solución bacteriana/tampón. Se aplicó un vacío de 0,5 bares durante 2 min y al soltarse las hojas se infiltraron con la solución bacteriana. Las plantas se devolvieron a la sala de crecimiento y el tejido de la hoja se extrajo 7 días después en un mezclador con 250 ml de tampón enfriado (Tris 100 mM, EDTA 1 mM, ácido ascórbico 40 mM) por kg de material foliar. El extracto se clarificó bajando el pH a 4,8 con ácido fosfórico 1 M y luego reajustando a pH 7,5 con base Tris 2 M para insolubilizar los polímeros vegetales, por centrifugación (16.000 g, 30 min) y por filtración (0,2 |jm). La purificación en una resina de proteína A fue seguida de pulido mediante cromatografía de aniones. Tras la concentración de TFF, el extracto se filtra (0,2 jm ) y se aplica inmediatamente a una columna de Proteína A. Tras el lavado de la columna (HEPES 50 mM/NaCl 100 mM, pH 7,5), la elución (ácido acético 0,1 M, pH 3,0), neutralización del eluato (Tris 2 M, pH 8,0) y la adición de Tween 80 al 0,01%, se pulió la solución de mAb mediante filtración Q (membrana acrodiscos Q Mustang; Pall), se dividieron en alícuotas y se almacenaron a -80 °C hasta su uso.

El anticuerpo AR201 producido por células CHO y alternativamente en plantas se comparó con palivizumab en un modelo de rata de algodón, como se describe a continuación. Además, se produjeron 2 mutantes AR201 en plantas para aumentar la vida media del anticuerpo en suero. AR201-YTE es una triple mutación M252Y/S254T/T256E (YTE) que se introdujo en la porción Fc. De manera similar, la porción Fc puede modificarse para presentar el receptor Fc neonatal para IgG (FcRn) para mejorar la vida media.

Se trataron ratas algodoneras (A-F) con 5 mg/kg de AR201, AR201-YTE, AR201-XTND y palivizumab en forma intramuscular, respectivamente, y se desafiaron con RSV/A/Tracy el día 0.

A continuación se muestra que el material de las células CHO y el material de las plantas es comparable en el ensayo de reducción de placas de lavado pulmonar y en el ensayo de neutralización. Además, los mutantes generados para AR201 muestran resultados comparables a AR201 en los 2 ensayos mencionados anteriormente. Nótese que "nic" indica expresión de Nicotiana y "CHO" indica expresión de células CHO. Las letras siguientes, -XTND o -YTE, indican mutantes del anticuerpo AR201.

Comparación de CHO/material vegetal: títulos de RSV/A/Tracy en un ensayo de reducción de placa de lavado pulmonar

Tabla 7. Títulos de RSV/A/Tracy en líquidos de lavado pulmonar el día 4

Títulos de anticuerpos neutralizantes en suero de RSV/A/Tracy:

Tabla 8. Título de neutralización en suero de RSV/A/Trac el día 0

Tabla 9. Tjtulo de neutralización en suero de RSV/A/Tracy el día 4 Grupo Tratamiento ^{Título de neutralización RSV/A (} log2) en ata alg odonera Prueba T/2 _{A B C D} E F Media SD vs Gp 1* 1 Sin tratamiento 2 2 2 2 2 2 2 0 ^—

2 Nic-AR201 9,0 8,0 8,0 9,0 8,5 7,5 8,3 0,6 <0,00001 3 Nic-AR201- XTN

8,0 8,5 8,0 8,0 7,5 8,0 8,0 0,3 <0,00001 4 CHO-AR201-N 8,5 8,0 8,5 9,0 9,0 9,0 8,7 0,4 <0,00001

5

CHO-AR201-XTND 8,5

9,0

9,0 8,0 8,5

8,5 8,6

0,4 <0,00001

6 Palivizumab 5,5 5,5 5,0 5,0 5,5 5,5 5,3 0,3 <0,00001 *Prueba t de Student, de dos colas. Detección mínima = 2,5; para el análisis estadístico, un valor de <2,5 se contó como 2. Valores P significativos adicionales (prueba t de Student, de dos colas): Grupo 3 vs 4, 5, P<0,016; Grupo 6 vs 2, 3, 4, 5, P <0,00001._______________________________________________________________ Los mutantes generados para AR201 muestran resultados comparables a AR201 en el ensayo de título de reducción de placa de lavado pulmonar de RSV/A/Tracy:

T l 1. Tí l R VATr n lí i l v lm n r l í 4

Títulos de anticuerpos neutralizantes en suero de RSV/A/Tracy:

Tabla 11. Título de neutralización en suero de RSV/A/Tracy el día 0

Tabla 12. Título de neutralización en suero de RSV/A/Trac el día 4

Es un aspecto opcional de la invención que el anticuerpo (por ejemplo, AR201) comprenda una o ambas de glicosilación modificada (por ejemplo, expresión vegetal) y mutaciones de Fc. Se tiene la expectativa de que una combinación de expresión vegetal (por ejemplo, anticuerpos que presentan glucanos que carecen de fucosa y/o xilosa) y mutaciones de Fc (M252Y/S254T/T256E - YTE) mejorará de forma aditiva o sinérgica la eficacia del anticuerpo en la prevención y el tratamiento de infecciones por RSV.

Ejemplo 15: Eficacia de la administración IM de AR201 y palivizumab en el modelo de rata de algodón de RSV/A/Tracy

Se realizaron ensayos de microneutralización para analizar los anticuerpos neutralizantes del RSV/A/Tracy en el suero de ratas algodoneras. Las muestras de suero se inactivaron por calor a 56 °C durante 30 min, se diluyeron en serie dos veces por duplicado y se mezclaron con RSV/A/Tracy (^rS^v/A) purificado en placa. Se infectaron placas de microtitulación de 96 pocillos con células HEp-2 casi confluentes, se incubaron adicionalmente y se evaluó la formación de placas como se describió anteriormente (Ejemplo 8, "Ensayo de reducción de placas"). El título de anticuerpo neutralizante se definió como la dilución de suero a la que se observó una reducción > 50% en la formación de placa.

La eficacia de la administración IM de AR201 y palivizumab para reducir los títulos del RSV se probó en un modelo de rata algodonera. Las ratas algodoneras (A^f) recibieron 5 mg de anticuerpo por kg de peso corporal (o formulación de control) el día -1 y fueron desafiadas con RSV/A/Tracy con 1,35 x 105 unidades formadoras de placa por rata algodonera el día 0. Directamente después de la exposición se recogió sangre para la determinación de los niveles de anticuerpos neutralizantes del RSV. El día 4 se sacrificaron los animales, se tomaron muestras de sangre y se extrajo el lóbulo del pulmón izquierdo. Se extrajo sangre del lóbulo y se lavó transpleuralmente usando 3 ml de medio de Iscove con glicerina al 15% mezclada con FBS-MEM al 2% (1:1, v:v). El líquido de lavado se recuperó presionando suavemente el lóbulo inflado y se utilizó para lavar el lóbulo derecho siguiendo la misma técnica. Los títulos del RSV se determinaron como se describió anteriormente (Ejemplo 8, "Ensayo de reducción de placa").

Las ratas algodoneras que habían recibido una dosis profiláctica de AR201 tenían un título sustancialmente más alto de anticuerpos neutralizantes de RSV/A/Tracy en el suero que las ratas algodoneras que habían recibido palivizumab. Aunque AR201 y palivizumab se dosificaron a 5 mg/kg, en el momento de la exposición a RSV/A/Tracy (día 0) el título de anticuerpos neutralizantes en suero para AR201 era significativamente mayor que para palivizumab. Esta diferencia en el título de anticuerpos neutralizantes se reflejó en el título reducido de virus el día 4 en el líquido de lavado pulmonar de ratas algodoneras tratadas con AR201 (véase más adelante).

Ambos, AR201 y palivizumab redujeron el título de virus en el líquido de lavado pulmonar, sin embargo, mientras que palivizumab redujo el título solo en un factor de ~ 70, AR201 redujo el título de virus de pulmón más de 500 veces y, por lo tanto, fue varias veces más eficaz que palivizumab. Por lo tanto, AR201 es un anticuerpo monoclonal más potente para reducir el título del virus pulmonar en comparación con palivizumab en el modelo de rata algodonera de RSV/A. Véase la Figura 13.

Tabla 13. Título de neutralización en suero de RSV/A/Trac el día 0

Tabla^ 14. Título de neutralización en suero de RSV/A/Trac el día 4

Tabla 15. Títulos de RSV/A/Tracy en líquidos de lavado pulmonar el día 4

Título del RSV (log-iQ UFP/g de pulmón) en rata algodonera

Grupo Tratamiento Cambio Prueba T/2 A B C D E F Media SD (log-10) vs Gp 1* 1 Sin tratamiento 5,57 5,40 5,40 5,43 5,67 5,44 5,48 0,1 1 ^{— —}

2 AR201 3,09 3,37 2,94 2,82 2,65 1,71 2,76 0,57

-2,72 <0,00001

3 Palivizumab 3,63 3,32 3,44 3,76 4,20 3,48 3,64 0,32 -1,85 <0,00001 *Detección mínima = 1,3 log-iü/g de pulmón. Valores P significativos adicionales (prueba t de Student, de dos colas): Grupo 2 vs 3___________________________________________________________________

Ejemplo 16: AR201 mejorado.

Se han descrito diferentes mutaciones de IgG para prolongar la vida media de una IgG en suero cambiando su unión al receptor Fc neonatal (FcRn). El FcRn se une a las IgG a pH ácido en los endosomas y las libera a pH neutro en la célula. Las mutaciones de la IgG en el sitio de unión de FcRn, pero también en posiciones más distantes, pueden influir en este comportamiento de unión, aumentar la afinidad del anticuerpo por FcRn y prolongar la vida media de una IgG aproximadamente 3-4 veces.

Se generaron dos mutantes AR201-YTE y AR201-XTND (véase el Ejemplo 14 anterior) para producir un anticuerpo de RSV de alta afinidad con una vida media prolongada. Esto permitirá reducir la frecuencia de dosificación de estos anticuerpos de aproximadamente una vez al mes a solo una vez por temporada de infección por RSV (4-6 meses). Especialmente para los bebés de alto riesgo, sus padres y sus médicos, esto será una mejora significativa con respecto a las opciones actuales de tratamiento/profilaxis.

Las funciones efectoras de anticuerpos como la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) en la lucha contra las infecciones virales son importantes. La ADCC está mediada por anticuerpos que entrecruzan el antígeno y las células inmunes, por ejemplo, células asesinas naturales, uniéndose al mismo tiempo al epítopo y al FcRIIIA (CD16a), el "receptor de ADCC", que se expresa en determinadas células inmunitarias. Esto provoca ADCC, o muerte de las células diana. Una mayor afinidad del anticuerpo por el FcYRIIIa se traduce en una mayor destrucción de la diana por parte de las células inmunes, es decir, en una mejor ADCC. La afinidad del anticuerpo por el receptor se puede influir alterando la secuencia de aminoácidos del anticuerpo, pero también alterando el perfil de glicosilación del anticuerpo (Shinkawa, J. Biol. Chem. 2003; 278 (5): 3466-3473). La ausencia de una fracción de glucano específico (a-1,6-fucosa) aumenta drásticamente la afinidad por el receptor FcRIIIa y, por lo tanto, también ADCC). Desafortunadamente, la mayoría de los sistemas de producción de IgG comúnmente utilizados producen anticuerpos con un alto grado de fucosilación (~ 95 %). Las alternativas que permiten la producción de anticuerpos no fucosilados o poco fucosilados incluyen los sistemas de producción de plantas, discutidos anteriormente.

La producción de AR201 en un sistema de producción de anticuerpos basado en plantas (por ejemplo, Nicotiana benthamiana con el sistema Magnifection) dio como resultado la producción de AR201 con fucosa apenas detectable. La producción de anticuerpos (por ejemplo, AR201-YTE) con modificaciones de Fc ha mostrado una buena afinidad y mejorará la vida media del anticuerpo. Un producto mejorado puede ser un anticuerpo con ambas características. Por ejemplo, un anticuerpo anti-RSV (tal como AR201) puede diseñarse con mutaciones de Fc para una mejor vida media y expresarse en plantas para una mejor citotoxicidad. La combinación puede proporcionar la eficacia más allá de las contribuciones individuales por sí solas. Tal AR201, en los trabajos, es un anticuerpo que combina los efectos de una vida media más larga por mutaciones de aminoácidos, así como un aumento de ADCC por perfiles de glicosilación optimizados y/o mutaciones de aminoácidos, y se espera que sea mayor a cualquier anti-RSV descrito hasta ahora. Tales anticuerpos anti-RSV mejorados pueden proporcionar ventajas que salvan la vida de los lactantes, los ancianos y los pacientes inmunodeprimidos.

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Una célula que comprende una primera secuencia de ADNc que codifica una región variable de la cadena pesada y una segunda secuencia de ADNc que codifica una región variable de la cadena ligera, en la que la célula produce un anticuerpo humano o fragmento de anticuerpo que comprende la región variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena ligera,

en la que la región variable de la cadena pesada codificada por la primera secuencia de ADNc comprende (a) una región determinante de complementariedad de cadena pesada (CDR) CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos GASINLYD (SEQ ID NO: 8), (b) una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos GYISGST (SEQ ID NO: 9), y (c) una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos ARDVGWGPQYYYGLDV (SEQ ID NO: 10);

y en la que la región variable de la cadena ligera codificada por la segunda secuencia de ADNc comprende (a) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos HSVQSTS (SEQ ID NO: 14), (b) una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos GGS (SEQ ID NO: 15) y (c) una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos QQSDRSPPIT (SEQ ID NO: 16),

en la que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une con especificidad a la región antigénica II/A de la proteína

F del RSV con una afinidad mayor a 1 x 10-9 M.

2. La célula de la reivindicación 1, que es una célula vegetal o una célula de mamífero.

3. La célula de la reivindicación 1, en la que dicha secuencia de ADNc de la región variable de la cadena pesada está acoplada a una tercera secuencia de ADNc que codifica una región constante de inmunoglobulina humana y en la que la región constante es distinta de la del ser humano que produce los anticuerpos contra RSV.

4. La célula de la reivindicación 1, en la que la célula comprende uno o más vectores de expresión, en la que el uno o más vectores de expresión comprenden la primera secuencia de ADNc o comprenden la segunda secuencia de ADNc.

5. La célula de la reivindicación 1, en la que la secuencia de ADNc de la región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 2 o

en la que la secuencia de ADNc de la región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 4.

6. Un método para producir un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, comprendiendo el método cultivar la célula de la reivindicación 1 en condiciones en las que se expresan las secuencias de ADNc, produciendo así un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une con especificidad a la región antigénica II/A de la proteína F del RSV con una afinidad mayor a 1 x 10-9 M.

7. Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo humano que comprende al menos una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera,

en el que la región variable de la cadena pesada codificada por una primera secuencia de ADNc que comprende (a) una región determinante de complementariedad de cadena pesada (CDR) 1 que comprende la secuencia de aminoácidos GASINLYD (SEQ ID NO: 8), (b) una CDR2 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos GYISGST (SEQ ID NO: 9), y (c) una CDR3 de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos ARDVGWGPQYYYGLDV (SEQ ID NO: 10),

y en el que la región variable de la cadena ligera codificada por una segunda secuencia de ADNc comprende (a) una CDR1 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos HSVQSTS (SEQ ID NO: 14), (b) una CDR2 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos GGS (SEQ ID NO: 15) y (c) una CDR3 de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos QQSDRSPPIT (SEQ ID NO: 16),

en el que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se une con especificidad a la región antigénica II/A de la proteína

F del RSV con una afinidad mayor a 1 x 10-9 M.

8. La célula o anticuerpo o fragmento de anticuerpo humano de la reivindicación 1 o 7, en la que el anticuerpo o fragmento de anticuerpo humano tiene una capacidad de neutralización contra al menos una cepa del RSV que es al menos dos veces mayor que la capacidad de neutralización de palivizumab.

9. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo humano de la reivindicación 7, en el que dicha región variable de la cadena pesada está acoplada con una región constante de inmunoglobulina humana, siempre que dicha región constante no se obtenga del mismo ser humano del que se obtuvo la región CDR de cadena pesada.

10. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo humano de la reivindicación 1 o 7, en el que la región variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1, y además en el que la región variable de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3.

11. Composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de anticuerpo humano de la reivindicación

7 y un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

12. Anticuerpo o fragmento de anticuerpo humano de la reivindicación 7 para uso en la profilaxis y/o tratamiento de una infección por RSV en un paciente con o en riesgo de infección con ^rS^v .