ES2875498T3 - Compuestos de péptidos sintéticos y procedimientos de uso - Google Patents

Abstract

Un péptido sintético que comprende una secuencia de aminoácidos y modificaciones seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 10, 12, 21, 35, 36, 37, 39, 43, 45 y 47.

Description

DESCRIPCIÓN

Compuestos de péptidos sintéticos y procedimientos de uso

Referencia a solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica el beneficio de prioridad a tenor de 35 U.S.C. § 119(e) de la solicitud provisional de los Estados Unidos n.° 62/185.202, presentada el 26 de junio de 2015.

Declaración acerca de la investigación patrocinada por el gobierno federal

La presente invención se realizó con el apoyo del gobierno según el mecanismo de financiación de Virginia Innovation Partnership i6 (subconcesión n.° GG11598142515), otorgado por el Departamento de Comercio de los Estados Unidos. El gobierno tiene ciertos derechos en la invención.

Campo

La invención se refiere a compuestos peptídicos sintéticos y usos de los mismos para terapia, incluyendo para enfermedades mediadas por el complemento, tales como enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunitarias e infecciones microbianas y bacterianas; y enfermedades no mediadas por el complemento, tales como fibrosis quística y diversas enfermedades agudas.

Antecedentes

El sistema del complemento

El sistema del complemento, un componente esencial del sistema inmunitario innato, desempeña una función fundamental como mecanismo de defensa contra patógenos invasores, prepara respuestas inmunitarias adaptativas y ayuda a eliminar inmunocomplejos y células apoptóticas. Tres vías diferentes comprenden el sistema del complemento: la vía clásica, la vía de la lectina y la vía alternativa. C1q y la lectina de unión a manosa (MBL) son las moléculas de reconocimiento relacionadas estructuralmente de las vías clásica y de la lectina, respectivamente. Mientras que la IgM o la IgG agrupada actúan como ligandos principales para C1q, MBL reconoce polisacáridos tales como el manano. La unión del ligando con C1q y MBL da lugar a la activación secuencial de C4 y C2 para formar la C3-convertasa de la vía clásica y de la lectina. Por el contrario, la activación de la vía alternativa no requiere una molécula de reconocimiento, pero puede amplificar la activación de C3 iniciada por las vías clásica o de lectina. La activación de cualquiera de estas tres vías da lugar a la formación de mediadores inflamatorios (C3a y C5a) y el complejo de ataque a la membrana (CAM), lo que provoca lisis celular.

Aunque el sistema del complemento desempeña una función fundamental en muchas funciones inmunitarias protectoras, la activación del complemento es un mediador significativo del daño tisular en una amplia gama de procesos patológicos autoinmunitarios e inflamatorios. (Ricklin y Lambris, "Complement-targeted therapeutics". Nat Biotechnol 2007; 25 (11): 1265-75).

Existe una necesidad de reguladores complementarios. Por un lado, el sistema del complemento es una defensa vital del huésped contra organismos patógenos. Por otro lado, su activación descontrolada puede causar daños devastadores a las células huésped. En la actualidad, a pesar de la morbilidad y mortalidad conocidas asociadas con la desregulación del complemento en muchos procesos patológicos, incluyendo enfermedades autoinmunitarias tales como el lupus eritematoso sistémico, la miastenia grave y la esclerosis múltiple, solo se han aprobado recientemente dos terapias anticomplementarias para su uso en seres humanos: 1) inhibidor de C1 humano, purificado, autorizado para su uso en pacientes que padecen angioedema hereditario (AEH) y 2) eculizumab (Soliris™), un anticuerpo monoclonal, humanizado, de acción prolongada, contra C5 usado en el tratamiento de la hemoglobinuria paroxística nocturna (HPN). Tanto la HPN como el AEH son enfermedades huérfanas que afectan a muy pocas personas. En la actualidad, no se han aprobado reguladores del complemento para los procesos patológicos más comunes en los que la activación desregulada del complemento desempeña una función fundamental. La activación del complemento desregulada puede desempeñar una función tanto en las indicaciones de enfermedades crónicas como en las indicaciones de enfermedades agudas. Las indicaciones de enfermedad aguda incluyen, entre otras, reacción transfusional hemolítica intravascular aguda (RTHIA), asfixia perinatal, encefalopatía isquémica hipóxica, lesión por isquemia y reperfusión (LIR) en el infarto de miocardio, cirugía de derivación de arteria coronaria e ictus, y rechazo de trasplante de órganos sólidos.

Proteína de cubierta de astrovirus

La Astroviridae constituye una familia de virus icosaédricos sin envoltura con un genoma de ARN mensajero monocatenario con sentido. Estos virus son una causa importante de la gastroenteritis en seres humanos, así como de otras enfermedades en otras especies animales. Se estima que causan aproximadamente entre el 2 y el 17 % de las enfermedades diarreicas en niños en todo el mundo.

La proteína de la cubierta ("PC") de Astrovirus reduce la actividad del sistema del complemento, lo que sugiere que la parte "activa" de la proteína puede tener utilidad clínica para disminuir el daño tisular por enfermedades mediadas por el complemento. La proteína de la cubierta de tipo salvaje ("PC TS") purificada del astrovirus humano de tipo 1 (HAstV-1) puede unirse a C1q y MBL y regula la activación tanto de la vía clásica como de la de lectina (Bonaparte y col., 2008. J. Virol. 82, 817-827; Hair y col., 2010. Molec. Immunol. 47, 792-798). Esta propiedad es análoga a las propiedades descritas para el péptido de neutrófilo humano 1 (HNP-1) (Van Den Berg y col., 1998. Blood. 92, 3898­ 3903; Groeneveld y col., 2007. Molec. Immunol. 44, 3608-3614). La proteína de la cubierta HAstV-1 es una molécula de 787 aminoácidos que se ha expresado a partir de una construcción de baculovirus recombinante y a continuación se ha purificado (Bonaparte y col., 2008. J. Virol. 82, 817-827).

Es necesario desarrollar compuestos peptídicos para inhibir las vías clásica, de lectina y alternativa del sistema del complemento, ya que se ha demostrado que cada una de estas tres vías contribuye a numerosos procesos patológicos autoinmunitarios e inflamatorios. Es particularmente necesario el bloqueo específico de las vías clásica y de la lectina, ya que ambas de estas vías se han implicado en la lesión inducida por isquemia y reperfusión en muchos modelos animales. Los seres humanos con deficiencias en la vía alternativa padecen infecciones bacterianas graves. Por tanto, una vía alternativa funcional es esencial para la vigilancia inmunitaria contra patógenos invasores.

Infecciones microbianas y bacterianas

Muchos microorganismos son resistentes a los antibióticos disponibles en la actualidad. Los antibióticos actuales proceden de otros organismos microbianos contra los que las bacterias han competido por espacio y energía durante muchos años, lo que ha conducido a una aparición rápida y predecible de resistencia. Algunas de las bacterias más patógenas para los seres humanos son Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, SARM y enterobacterias resistentes a carbapenemasa (ERC) tales como Klebsiella pneumonía. Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus también son patógenos importantes en los pulmones con fibrosis quística. Gardnerella es un cocobacilo anaerobio gramvariable que es una causa habitual de vaginosis bacteriana. Gardnerella también causa activación del complemento e inflamación, lo que causa los síntomas de la vaginosis bacteriana y aumenta el riesgo de transmisión del VIH al alterar las defensas de barrera normales en la vagina. Existe la necesidad de tratamientos para la vaginosis bacteriana que destruyan el organismo causante y bloqueen la inflamación. También existe la necesidad de nuevos compuestos antimicrobianos dada la creciente resistencia a los antibióticos convencionales.

El virus del herpes simple 1 (VHS-1) y el virus del herpes simple 2 (VHS-2) son virus responsables de causar el herpes. La infección por VHS-1 puede producirse por interacciones generales tales como comer con los mismos utensilios, compartir protector labial o besarse. El virus es muy contagioso y es posible contraer herpes genital por VHS-1 si la persona ha tenido herpes labial y ha realizado actividades sexuales durante ese tiempo. De manera similar, el VHS-2 también es muy contagioso. El VHS-2 se contrae a través de formas de contacto sexual con una persona que tiene VHS-2. Se estima que aproximadamente el 20 por ciento de los adultos sexualmente activos dentro de los Estados Unidos se han infectado con VHS-2, según la Academia Estadounidense de Dermatología (AAD). Aunque las infecciones por VHS-2 se transmiten al entrar en contacto con una úlcera herpética, la AAD informa de que la mayoría de las personas contraen el VHS-1 de una persona infectada que es asintomática o que no tiene úlceras. Los tratamientos actuales como el aciclovir para VHS-1 o VHS-2 pueden no ser completamente eficaces. Por tanto, existe la necesidad de tratamientos antivíricos para VHS-1 y VHS-2 que sean más eficaces contra los virus.

Crecimiento de Lactobacillus

Lactobacillus es un género de bacterias que contiene más de 180 especies. Múltiples especies de Lactobacillus se administran con frecuencia juntas como un solo agente probiótico. En combinación, se sabe que diversas especies de Lactobacillus ayudan a individuos con síndrome del intestino irritable, previenen la enterocolitis necrotizante y otras infecciones neonatales. Debido a sus numerosos beneficios para la salud, existe la necesidad de compuestos que puedan estimular el crecimiento de especies de Lactobacillus.

Fibrosis quística

La fibrosis quística (FQ) es una enfermedad genética causada por mutaciones en el gen regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR). Los pacientes con FQ producen mucosidad pegajoso, inusualmente espesa, que obstruye los pulmones y conduce a infecciones pulmonares potencialmente mortales, y obstruye el páncreas y evita que las enzimas naturales ayuden al cuerpo a descomponer los alimentos y absorber nutrientes vitales. La FQ se caracteriza por un ciclo de obstrucción de las vías respiratorias pequeñas, infección con patógenos bacterianos, p. ej., P. aeruginosa, Staphylococcus aureus (incluyendo S. aureus resistente a la meticilina (SARM), Burkholderia cepacia, y daño pulmonar inflamatorio. La inflamación mediada por el complemento puede ser un factor contribuyente importante del daño pulmonar inflamatorio en la FQ. El tratamiento de la FQ incluye una rutina de tratamiento regular para mantener la salud pulmonar y una buena nutrición. Otros tratamientos para la FQ incluyen la limpieza de las vías respiratorias todos los días para ayudar a aligerar y eliminar la mucosidad espesa que se puede acumular en los pulmones, medicamentos inhalados, incluyendo antibióticos, para ayudar a mantener despejadas las vías respiratorias y complementos de enzimas pancreáticas para mejorar la absorción de nutrientes vitales. Existe la necesidad de tratamientos tanto antiinflamatorios como antimicrobianos para la FQ.

Reacciones a la transfusión hemolítica

Las transfusiones de sangre pueden salvar vidas, pero también pueden conllevar el riesgo de diversas reacciones, algunas de las cuales son potencialmente mortales, tales como reacciones transfusionales hemolíticas intravasculares agudas (RTHIA). Se estima que la RTHIA ocurre en una quinta parte de las transfusiones totales. Los individuos que reciben transfusiones de sangre frecuentes desarrollarán aloanticuerpos y autoanticuerpos contra los antígenos de los glóbulos rojos (RBC) con el tiempo, lo que hace que la compatibilidad sea cada vez más difícil y aumente de este modo el riesgo de RTHIA. Las medidas preventivas actuales para transfusión incluyen "determinación del grupo sanguíneo", "detección de anticuerpos", así como "pruebas cruzadas". Aunque estas medidas han hecho que las transfusiones sean más seguras, todavía se producen reacciones transfusionales. La RTHIA ocurre cuando los anticuerpos del huésped se unen a los eritrocitos transfundidos, iniciando la activación de la vía clásica del complemento, lo que conduce a la generación de los mediadores inflamatorios C3a y C5a, así como opsonización de C3b y hemólisis de las células transfundidas a través del complejo de ataque a la membrana (CAM). Hasta la fecha, solo se ha informado de un caso que describe la intervención clínica de una RTHIA mediante la inhibición de la generación de las anafilotoxinas del complemento C3a y C5a. No existen intervenciones específicas para estas reacciones; el tratamiento actual de la reacción es de naturaleza complementaria. Aunque las medidas preventivas existentes hacen que la incompatibilidad AB0 sea poco habitual en el mundo desarrollado, las personas con anemia drepanocítica y talasemias graves que requieren transfusiones frecuentes tienen un mayor riesgo de reacciones transfusionales debido a la acumulación de anticuerpos contra determinantes antigénicos menores en los eritrocitos. La incompatibilidad AB0 neonatal en recién nacidos puede provocar ictericia y, en casos graves, kernícterus. Ninguna organización de bancos de sangre o práctica de medicina transfusional tiene un procedimiento para evaluar directamente el riesgo de lisis de glóbulos rojos mediada por el complemento entre el donante y el receptor. Actualmente no existe una intervención médica eficaz para las RTA, excepto para detener la transfusión. Se necesitan herramientas de diagnóstico, tratamientos profilácticos para prevenir la RTHIA y tratamientos de rescate durante una RTHIA.

Asfixia perinatal

La asfixia perinatal es una afección médica resultante de la privación de oxígeno a un recién nacido que causa daño cerebral. La encefalopatía isquémica hipóxica (EHI) es una afección que ocurre cuando todo el cerebro se ve privado de un suministro adecuado de oxígeno, pero la privación no es total. La EHI se asocia con mayor frecuencia con la asfixia perinatal. La lesión por reperfusión es el daño tisular que se produce cuando el suministro de sangre vuelve a un tejido después de un período de isquemia o falta de oxígeno. La ausencia de oxígeno y nutrientes de la sangre durante el período isquémico crea una condición en la que la restauración de la circulación da lugar a inflamación y daño oxidativo a través de la inducción de tensión oxidativa en lugar de la restauración de la función normal. La activación del complemento es fundamental en el desarrollo de lesiones por isquemia y reperfusión tales como la EHI neonatal. La hipotermia terapéutica (HT), el tratamiento habitual actual para EHI, ofrece solo una reducción del 11 % en muerte o discapacidad. Los datos publicados han mostrado que la HT aumenta paradójicamente la activación del complemento proinflamatorio, lo que potencialmente limita su beneficio. Existe la necesidad de tratamientos para la EHI y la asfixia perinatal que regulen el complemento y tengan efectos neuroprotectores.

Anemia hemolítica autoinmunitaria

La anemia hemolítica autoinmunitaria (AHAI) es una enfermedad que se produce cuando los anticuerpos dirigidos contra los propios glóbulos rojos de una persona causan que estallen, dando lugar a una concentración plasmática insuficiente. La AHAI está causada más habitualmente por IgG e IgM. La IgM es un potente activador de la vía clásica del complemento. Por tanto, la AHAI se caracteriza por lisis de glóbulos rojos mediada por el complemento. Por tanto, existe la necesidad de terapias dirigidas al sistema del complemento para tratar AHAI.

Sería deseable desarrollar compuestos peptídicos que puedan regular la activación del complemento y puedan usarse terapéuticamente para prevenir y tratar enfermedades mediadas por el complemento, tales como enfermedades inflamatorias y autoinmunitarias. También sería deseable desarrollar compuestos peptídicos que traten enfermedades y afecciones agudas tales como la reacción transfusional hemolítica intravascular aguda (RTHIA), asfixia perinatal, anemia hemolítica autoinmunitaria, infecciones víricas e infecciones bacterianas, entre otras. También sería deseable desarrollar compuestos peptídicos que traten la fibrosis quística.

Sumario

En un aspecto, la presente invención proporciona compuestos peptídicos sintéticos que regulan el sistema del complemento y procedimientos de uso de estos compuestos. Específicamente, en algunas realizaciones, los compuestos peptídicos sintéticos pueden unirse a, regular e inactivar C1 y MBL y, por lo tanto, pueden inhibir eficientemente la activación de la vía clásica y de la lectina en su punto más temprano, dejando intacta la vía alternativa. Estos compuestos peptídicos tienen valor terapéutico para regular e inhibir selectivamente la activación de C1 y MBL sin afectar a la ruta alternativa y pueden usarse para tratar enfermedades mediadas por la activación desregulada de las vías clásica y de lectina. En otras realizaciones, los compuestos peptídicos regulan la activación de la vía clásica pero no la activación de la vía de la lectina. Los compuestos peptídicos son útiles para diversas indicaciones terapéuticas, incluso para indicaciones que no están relacionadas con la regulación del complemento. En algunas realizaciones, estos compuestos peptídicos tienen valor terapéutico para el tratamiento de enfermedades y afecciones agudas tales como la reacción transfusional hemolítica intravascular aguda (RTHIA), asfixia perinatal, así como infecciones bacterianas, víricas y antimicrobianas, entre otras. Estos compuestos peptídicos también tienen valor terapéutico para el tratamiento de la fibrosis quística.

En algunas realizaciones, la invención se basa en la identificación y modificación de péptidos de 15 aminoácidos del péptido clasificador polar (PA) (SEQ ID NO: 3), derivados de los péptidos y procedimientos de su uso. El péptido PA es un péptido mezclado derivado de la proteína del astrovirus humano, denominada CP1 (SEQ ID NO: 1). El péptido PA también se conoce como PIC1 (inhibidores peptídicos del complemento C1), AstroFend, AF o SEQ ID NO: 3. Como se usa en el presente documento, la expresión "péptidos PIC1" incluye la SEQ ID NO: 3 así como otras secuencias de aminoácidos que son iguales que la SEQ ID NO: 3 pero con modificaciones de PEGilación. El péptido PIC1 se denominó originalmente como tal porque se encontró que estaba asociado con enfermedades mediadas por el sistema del complemento. En algunos aspectos, sorprendentemente, la divulgación también está relacionada con el uso del péptido Pa y derivados para el tratamiento de enfermedades y afecciones que no están asociadas con el sistema del complemento, tales como, pero sin limitación, fibrosis quística y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). En algunas realizaciones, la divulgación se basa en el péptido PIC1 y modificaciones del mismo, que tiene las secuencias de aminoácidos y modificaciones expuestas en las SEQ ID NO: 3-47. Estos péptidos se pueden usar para regular la activación del complemento, incluyendo la inhibición del complemento; tratar y/o prevenir reacciones hemolíticas; tratar la encefalopatía isquémica hipóxica; tratar la fibrosis quística; para uso antimicrobiano; y para tratar y/o prevenir otras enfermedades y afecciones desveladas en el presente documento.

En un primer aspecto, la invención proporciona un péptido sintético que comprende una secuencia de aminoácidos y modificaciones seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 10, 12, 21, 35, 36, 37, 39, 43, 45 y 47. Determinados compuestos peptídicos desvelados en el presente documento son miméticos peptídicos, análogos peptídicos y/o derivados sintéticos de PA que tienen, por ejemplo, supresiones y sustituciones peptídicas internas, supresiones y sustituciones en los extremos N y C, y que son capaces de regular la activación de la ruta clásica y de la lectina uniéndose a C1q y MBL.

Determinados compuestos peptídicos desvelados en el presente documento se modifican mediante sustitución de sarcosina, sustitución de alanina y/o PEGilación del extremo N, extremo C o extremo N y extremo C. En un segundo aspecto, la invención proporciona un péptido sintético que comprende la secuencia de aminoácidos y modificaciones de PEGilación de la SEQ ID NO: 21.

En el presente documento se desvelan secuencias peptídicas que tienen al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 91 %, al menos aproximadamente 92 %, al menos aproximadamente 93 %, al menos aproximadamente 94 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 96 %, al menos aproximadamente 97 %, al menos aproximadamente 98 % o al menos aproximadamente 99 % de identidad de secuencia con las SEQ ID NO: 3-47. En un tercer aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de los péptidos sintéticos del primer o segundo aspecto y al menos un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

En un cuarto aspecto, la invención proporciona el péptido sintético o la composición farmacéutica del primer, segundo o tercer aspecto para su uso en un procedimiento de tratamiento y/o prevención de una reacción hemolítica en un sujeto que lo necesite, que comprende: administrar al sujeto que lo necesite una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del péptido sintético. En otras realizaciones, la reacción hemolítica se selecciona del grupo que consiste en la reacción transfusional hemolítica intravascular aguda (RTHIA), lesión pulmonar aguda relacionada con la transfusión (LPART) y refractariedad a la transfusión de plaquetas. En realizaciones adicionales, la composición se administra antes de que se administre al sujeto una transfusión de sangre, después de que se administre al sujeto la transfusión de sangre y/o durante la transfusión de sangre.

En otro aspecto, la invención proporciona el péptido sintético o la composición farmacéutica del primer, segundo o tercer aspecto para su uso en un procedimiento de tratamiento de la encefalopatía isquémica hipóxica en un sujeto que lo necesite, que comprende: administrar al sujeto que lo necesite una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del péptido sintético.

En otro aspecto, la invención proporciona el péptido sintético o la composición farmacéutica del primer, segundo o tercer aspecto para su uso en un procedimiento de tratamiento de la fibrosis quística en un sujeto que lo necesite, que comprende: administrar al sujeto que lo necesite una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del péptido sintético.

En otro aspecto, la invención proporciona el péptido sintético o la composición farmacéutica del primer, segundo o tercer aspecto para su uso en un procedimiento de tratamiento de una infección bacteriana en un sujeto que lo necesite, que comprende: administrar al sujeto que lo necesite una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del péptido sintético 47. En algunas realizaciones, la infección bacteriana es causada por bacterias grampositivas o gramnegativas. En algunas realizaciones, la infección bacteriana es causada por bacterias seleccionadas del grupo que consiste en Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumonía, Pseudomonas aeruginosa, Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis y Gardnerella sp. En realizaciones adicionales, la infección bacteriana es causada por bacterias grampositivas o gramnegativas.

En otro aspecto, la invención proporciona un péptido sintético que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ iD NO: 10, 12, 21, 35, 36, 37, 39, 43, 45 y 47 para su uso en un procedimiento de mejora del crecimiento de Lactobacillus en un sujeto.

En otro aspecto, la invención proporciona el péptido sintético o la composición farmacéutica del primer, segundo o tercer aspecto para su uso en un procedimiento de tratamiento de una infección vírica en un sujeto que lo necesite, que comprende: administrar al sujeto que lo necesite una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del péptido sintético. En algunas realizaciones, la infección vírica es causada por el virus del herpes simple 1 (VHS-1) o el virus del herpes simple 2 (VHS-2).

En otro aspecto, la invención proporciona el péptido sintético o la composición farmacéutica del primer, segundo o tercer aspecto para su uso en un procedimiento de tratamiento de la anemia hemolítica autoinmunitaria en un sujeto que lo necesite, que comprende: administrar al sujeto que lo necesite una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del péptido sintético. La anemia hemolítica autoinmunitaria puede caracterizarse por uno o más de los niveles elevados de bilirrubina sérica, exceso de urobilinógeno urinario, reducción de la haptoglobina plasmática, aumento de la deshidrogenasa láctica (LDH) sérica, hemosiderinuria, metahemalbuminemia, esferocitosis, reticulocitosis y/o hiperplasia eritroide de la médula ósea.

En otro aspecto, la invención proporciona el péptido sintético o la composición farmacéutica del primer, segundo o tercer aspecto para su uso en un procedimiento de tratamiento de la asfixia perinatal en un sujeto que lo necesite, que comprende: administrar al sujeto que lo necesite una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del péptido sintético. En algunas realizaciones, la presencia de asfixia perinatal se caracteriza por una puntuación de Apgar de 3 o menos que dura cinco minutos o más.

En otro aspecto, la invención proporciona el péptido sintético o la composición farmacéutica del primer, segundo o tercer aspecto para su uso en un procedimiento de tratamiento de la lesión renal aguda en un sujeto que lo necesite, que comprende: administrar al sujeto que lo necesite una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del péptido sintético.

Los péptidos sintéticos desvelados en el presente documento incluyen péptidos sintéticos que comprenden la secuencia de aminoácidos y modificaciones de las SEQ ID NO: 4-18 y 30-47 y SEQ ID NO: 3 y 19-29. En algunas realizaciones, la invención es un péptido sintético que comprende la secuencia de aminoácidos y modificaciones de PEGilación de la SEQ ID NO: 21. Las composiciones farmacéuticas de la invención comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz del péptido sintético y al menos un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto, la divulgación está dirigida a un péptido PIC1, en el que el péptido se modifica mediante PEGilación del extremo N, el extremo C o tanto el extremo N como el extremo C. En otro aspecto, la divulgación está dirigida a un péptido PIC1, en el que el péptido se ha modificado mediante sustituciones de sarcosina y/o alanina. En otras realizaciones, el péptido se modifica mediante PEGilación y sustituciones de sarcosina y/o alanina. En algunas realizaciones, los péptidos se aíslan y/o purifican.

En el presente documento se desvela un procedimiento para seleccionar al menos un péptido para tratar a un sujeto que tiene fibrosis quística que comprende: (a) analizar péptidos seleccionados del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3-47 para determinar su actividad sobre la fibrosis quística; y (b) seleccionar del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3-47 al menos un péptido sintético que tiene actividad sobre la fibrosis quística.

En el presente documento se desvela un procedimiento para seleccionar al menos un péptido para tratar a un sujeto que tiene una reacción hemolítica que comprende: (a) analizar péptidos seleccionados del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3-47 para determinar su actividad sobre la reacción hemolítica; y (b) seleccionar del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3-47 al menos un péptido sintético que tiene actividad sobre la reacción hemolítica. En algunas realizaciones, la reacción hemolítica se selecciona del grupo que consiste en RTHIA, lesión pulmonar aguda relacionada con la transfusión (LPART) y refractariedad a la transfusión de plaquetas.

En el presente documento se desvela un procedimiento para seleccionar al menos un péptido para tratar a un sujeto que tiene una infección bacteriana que comprende: (a) analizar péptidos seleccionados del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3-47 para determinar su actividad sobre la infección bacteriana; y (b) seleccionar del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3-47 al menos un péptido sintético que tiene actividad sobre la infección bacteriana. En algunas realizaciones, la infección bacteriana es causada por bacterias seleccionadas del grupo que consiste en Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumonía, Pseudomonas aeruginosa, Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis y Gardnerella sp. En algunas realizaciones, la infección bacteriana es causada por bacterias grampositivas o gramnegativas.

En el presente documento se desvela un procedimiento para seleccionar al menos un péptido para potenciar el crecimiento de Lactobacillus que comprende (a) analizar péptidos seleccionados del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3-47 para determinar su actividad potenciadora del crecimiento de especies de Lactobacillus; y (b) seleccionar del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3-47 al menos un péptido sintético que tiene actividad potenciadora del crecimiento de especies de Lactobacillus.

En el presente documento se desvela un procedimiento para seleccionar al menos un péptido para tratar y/o prevenir una infección vírica que comprende (a) analizar péptidos seleccionados del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3­ 47 para determinar actividad que trata o previene la infección vírica; y (b) seleccionar del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3-47 al menos un péptido sintético que tiene actividad que trata o previene la infección vírica. En algunas realizaciones, la infección vírica es causada por VHS-1 o VHS-2.

En el presente documento se desvela un procedimiento para seleccionar al menos un péptido para tratar y/o prevenir la anemia hemolítica autoinmunitaria que comprende (a) analizar péptidos seleccionados del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3-47 para determinar su actividad sobre la anemia hemolítica autoinmunitaria; y (b) seleccionar del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3-47 al menos un péptido sintético que tiene actividad sobre la anemia hemolítica autoinmunitaria.

En el presente documento se desvela un procedimiento para seleccionar al menos un péptido para tratar la asfixia perinatal que comprende (a) analizar péptidos seleccionados del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3-47 para determinar su actividad sobre la asfixia perinatal; y (b) seleccionar del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3-47 al menos un péptido sintético que tiene actividad sobre la asfixia perinatal.

En el presente documento se desvela un procedimiento para seleccionar al menos un péptido para tratar la encefalopatía isquémica hipóxica que comprende: (a) analizar péptidos seleccionados del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3-47 para determinar su actividad sobre la encefalopatía isquémica hipóxica; y (b) seleccionar del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3-47 al menos un péptido sintético que tiene actividad sobre la encefalopatía isquémica hipóxica.

En otros aspectos, la invención proporciona los péptidos sintéticos y las composiciones farmacéuticas para su uso en un procedimiento de tratamiento de una enfermedad mediante la administración de las composiciones descritas en el presente documento, en el que la enfermedad que está mediada al menos parcialmente por el complemento incluye, pero sin limitación: reacciones a la transfusión hemolítica, enfermedad por crioaglutininas, enfermedades por inmunocomplejos, talasemia, anemia drepanocítica, incompatibilidad AB0, rechazo agudo/hiperagudo de trasplante de órganos sólidos, reacción inflamatoria instantánea mediada por sangre (IBMIR), isquemia caliente/fría por trasplante de órganos sólidos, lupus eritematoso sistémico (LES), artritis reumatoide, lesión por isquemia y reperfusión, infarto de miocardio, ictus, encefalopatía isquémica hipóxica, lesión traumática cerebral, cirugía de derivación de la arteria coronaria, cicatrización de heridas, cáncer, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, hemoglobinuria paroxística nocturna (HPN), síndrome urémico hemolítico atípico (SHUa), asma, enfermedad de Crohn, síndrome séptico/SDRA/SIRS, glomerulonefritis, nefritis lúpica, enfermedad de la membrana basal antiglomerular, glomerulonefritis membranoproliferativa inducida por autoanticuerpos citoplásmicos antineutrófilos, enfermedad por depósitos densos, nefropatía membranosa, nefropatía por IgA o glomerulopatía por C3.

En el presente documento se desvela un procedimiento para tratar una enfermedad mediante la administración de las composiciones descritas en el presente documento, en el que la enfermedad no está mediada por el complemento, que incluye, entre otras, fibrosis quística y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC).

En el presente documento se desvela un procedimiento para tratar una enfermedad asociada con daño tisular mediado por el complemento, que comprende además administrar a un sujeto al menos otro principio activo eficaz en el tratamiento de la enfermedad, en el que al menos otro principio activo incluye un agente antiinflamatorio no esteroideo, un corticoesteroide, un fármaco antirreumático que modifica la enfermedad, inhibidor de C1 y eculizumab. A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende habitualmente una persona normalmente experta en la materia. Aunque puede usarse cualquier procedimiento y material similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la práctica o prueba de la presente invención, se describen a continuación procedimientos y materiales adecuados. Además, los materiales, procedimientos y ejemplos son únicamente ilustrativos y no se pretende que sean limitantes.

Otras características y ventajas de la invención resultarán evidentes a partir de la descripción detallada, los dibujos y las reivindicaciones.

Breve descripción de las figuras

La FIG. 1 muestra la valoración de PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21), PA-P7Sar (SEQ ID NO: 10) y PA-C9Sar (SEQ ID NO: 12), en un ensayo hemolítico usando suero empobrecido en factor B. Las concentraciones de péptidos se muestran en mM.

Las FIGS. 2A-B muestran que PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) inhibe la activación del complemento en un ensayo hemolítico usando suero empobrecido en factor B en el mismo grado que PA (SEQ ID NO: 3).

La FIG.3 muestra la estructura de PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21).

Las FIGS. 4A-E muestran ensayos de dilución en placas. La FIG. 4A muestra ensayos de dilución en placas para Staphylococcus aureus tratado con PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) o control de solución salina. El eje de abscisas muestra la concentración de inhibidor de PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) en mg/ml. La FIG. 4B muestra ensayos de dilución en placas para Staphylococcus aureus tratado con PA-dPEG24 o vancomicina. El eje de abscisas muestra la concentración de inhibidor de PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) en mg/ml y vancomicina a partir de 5 |jg/ml. La FIG. 4C muestra ensayos de dilución en placas para Klebsiella pneumonía tratada con PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) o gentamicina. El eje de abscisas muestra la concentración de inhibidor de PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) en mg/ml. La gentamicina comienza en 4 jg/ml. La FIG. 4D muestra ensayos de dilución en placas para Pseudomonas aeruginosa tratada con PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) o control de gentamicina. El eje de abscisas muestra la concentración de inhibidor de PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) en mg/ml. La gentamicina comienza en 4 |jg/ml. La FIG. 4E muestra ensayos de dilución en placas para Pseudomonas aeruginosa tratada con cuatro versiones diferentes de PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) o control de gentamicina. Leyenda de las figuras: PIC1 = PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21); PA-L3Sar (H2N-IA(Sar)ILEPICCQERAA-OH) (SEQ ID NO: 6); PA-I4Sar (H2N-lAL(Sar)LEPICCQERAA-OH) (SEQ ID NO: 7); PA-L5Sar (H2N-IALI(Sar)EPICCQERAA-OH) (SEQ ID NO: 8). La FIG. 5 muestra la inhibición del crecimiento de Gardnerella en presencia de PA-dPEG24 (^s E^q ID NO: 21), PA-L3Sar (SEQ ID NO: 6), PA-I4Sar (SEQ ID NO: 7) o PA-L5Sar (SEQ ID NO: 8). PIC1 = PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21); Sarc-1 = PA-L3Sar (SEQ ID NO: 6); Sarc-2 = PA-I4Sar (SEQ ID NO: 7); Sarc-3 = PA-L5Sar (SEQ ID NO: 8). La FIG. 6 muestra la liberación de C5a cuando el suero se incuba con Gardnerella a diferentes concentraciones de PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21). PIC1 = PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21).

La FIG. 7 muestra dos plasmas de grupo 0 de las transfusiones de glóbulos rojos que causaron RTA en un receptor de sangre de grupo B. Los títulos de IgG para cada plasma fueron bastante altos, pero no diferenciadores. Sin embargo, en un ensayo hemolítico de tipo CH50, se comportan de manera drásticamente diferente. Uno es muy hemolítico, mientras que el otro no causa hemólisis significativa.

La FIG. 8 muestra el plasma de grupo 0 (n.° 426) de las transfusiones de glóbulos rojos que causaron RTA en el receptor de sangre de grupo B. Antes de añadir eritrocitos B, se añadió PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) al plasma en concentraciones crecientes. Se demostró una inhibición de la hemólisis en respuesta a la dosis con PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) que demuestra hasta >95 % de inhibición.

La FIG. 9 muestra bacterias que inician la activación del complemento de la vía clásica con reclutamiento y activación de neutrófilos mediados por C5a.

Las FIGS. 10A-D muestran anafilotoxinas complementarias en la FQ y líquido pulmonar de control. FIG. 10A:

Concentraciones de C5a en fracciones solubles (sol) de esputo de pacientes con FQ (n = 15) y controles (n = 3). La caja muestra los cuartiles, los bigotes son el percentil 90 y 10 y la línea discontinua es la media. El nivel de C5a en las fracciones solubles de FQ es 5 veces mayor que en las fracciones solubles de control (P = 0,04). FIG.

10B: Transferencia de Western de C5a para fracciones solubles de esputo para dos controles sanos (A y B) y 2 sujetos con FQ (X e Y). FIG. 10C: Concentraciones de C3a en fracciones solubles de esputo de pacientes con FQ (n = 14) y controles (n = 4). La caja muestra los cuartiles, los bigotes son el percentil 90 y 10 y la línea discontinua es la media. P = 0,03. FIG. 10D: Concentraciones de C4a en fracciones solubles de esputo de pacientes con FQ (n = 15) y controles (n = 5). La caja muestra los cuartiles, los bigotes son el percentil 90 y 10 y la línea discontinua es la media. P = 0,05.

Las FIGS. 11A-B muestran opsonización del complemento de Staphylococcus aureus. FIG. 11A: Fragmentos de C3 unidos a Staphylococcus aureus después de la incubación en fracciones solubles de esputo de pacientes con FQ (n = 5) y controles (n = 3). La caja muestra los cuartiles, los bigotes son el percentil 90 y la línea discontinua es la media. P = 0,42. FIG. 11B: Fragmentos C4 unidos a Staphylococcus aureus después de la incubación en fracciones solubles de esputo de pacientes con FQ (n = 5) y controles (n = 3). La caja muestra los cuartiles, los bigotes son el percentil 90 y 10 y la línea discontinua es la media. P = 0,13.

Las FIGS. 12A-D muestran C5a generado por bacterias en fracciones solubles de FQ. FIG. 12A: Concentraciones de C5a en fracciones solubles de esputo de pacientes con FQ (n = 3) o controles (n = 3) antes y después de la incubación con Pseudomonas aeruginosa o Staphylococcus aureus vivos o muertos. Los datos son las medias ± DT. Se generó C5a en fracción soluble de F^q en presencia de Pseudomonas aeruginosa (P = 0,03) o Staphylococcus aureus (P = 0,03). FIG. 12B: Concentraciones de C5a en fracciones solubles de esputo de pacientes con FQ (sujetos A, B y C) antes (inicial) y después de la incubación con Pseudomonas aeruginosa viva o muerta. FIG. 12C: Concentraciones de C5a en fracciones solubles de esputo de pacientes con FQ (sujetos A, B y C) antes (inicial) y después de la incubación con Staphylococcus aureus vivo o muerto. FIG. 12D:

Concentraciones de C5a en fracciones solubles de FQ que se incubaron solas en tampón (solo fracción soluble de FQ), se incubaron con Pseudomonas aeruginosa muerta (fracción soluble de FQ Pseudomonas aeruginosa) o se incubaron con PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) y Pseudomonas aeruginosa muerta (fracción soluble FQ PA-dPEG24 P. aerug). PA-dPEG24, SEQ ID NO: 21 reduce la generación de C5a en fracciones solubles de FQ incubadas con Pseudomonas aeruginosa.

Las FIGS. 13A-C muestran gráficos de correlación para los efectores del complemento y las medidas clínicas.

FIG. 13A: Las concentraciones de C5a en fracciones solubles de FQ se correlacionan positivamente con el aumento de la edad, r = 0,53, P = 0,04. FIG. 13B: Las concentraciones de C5a en fracciones solubles de FQ se correlacionan inversamente con el percentil de IMC en niños, r = -0,77, P = 0,04. FIG. 13C: Las concentraciones de C3a en fracciones solubles de FQ se correlacionan positivamente con el % de FEV1, rs = 0,63, P = 0,02. Las FIGS. 14A-E muestran compuestos peptídicos que se unen a e inhiben C1q. FIG. 14 A: muestra la unión de PA (SEQ ID NO: 3) a C1q, pero no a C^rT o BSA. La FIG. 14B muestra que PIC1 (SEQ ID NO: 21) inhibe la unión de C1q marcada con DyLight 680 en CRT recombinante. La FIG. 14C muestra que PIC1 (SEQ ID NO: 21) inhibe la unión de 488 C1q marcada con DyLight a células Raji y la FIG. 14D muestra un ensayo en placa Western In-Cell representativo con imágenes capturadas en LICOR Odyssey que demuestra que cantidades crecientes de PIC 1 (SEQ ID NO: 21) inhiben la unión de C1q marcado con DyLight 680 con células Raji. La FIG. 14E muestra la configuración del experimento.

La FIG. 15 muestra calreticulina (CRT) de unión a C1q soluble, pero no BSA.

La FIG. 16 muestra PA (SEQ ID NO: 3) que inhibe la unión de C1q a calreticulina (CRT) en comparación con un péptido de control negativo CP2.

Las FIGS. 17A-C muestran células Raji con un aumento de 20x. FIG. 17B: FITC (C1q) a una exposición de 1/50 s. FIG. 17C: DAPI a una exposición de 1/500 s. FIG. 17A: Superposición.

Las FIGS. 18A-C muestran células Raji con un aumento de 20x tratadas con PA-dPEG240,523 mM (SEQ ID NO: 21). FIG. 18 B: FITC (C1q) a una exposición de 1/50 s. FIG. 18C: DAPI a una exposición de 1/500 s. FIG. 18A:

Superposición.

Las FIGS. 19A-C muestran células Raji con un aumento de 20x tratadas con PA-dPEG24 1,05 mM (SEQ ID NO: 21). FIG. 19B: FITC (C1q) a una exposición de 1/50 s. FIG. 19C: DAPI a una exposición de 1/500 s. FIG. 19A:

Superposición.

La FIG. 20 muestra la lisis de glóbulos rojos en un ensayo hemolítico en ratas tratadas con dos dosis diferentes de PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) o con solución salina normal.

Las FIGS. 21A-B muestran el diseño experimental y las ramas de estudio. La FIG.21A muestra la dosificación de PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) en el modelo de RTHIA, la FIG 21B muestra la eficacia de PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) en el modelo de RTHIA.

Las FiGs .22A-B muestran estudios de dosificación de PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) en el modelo de RTHIA que comparan dosis alta de PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) (40 mg) frente a dosis baja de PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) (20 mg). La FIG. 22A muestra la hemoglobina libre presente en el plasma de rata recogido a los 0 segundos (antes del sangrado), 30 segundos, 5 minutos, 20 minutos, 60 minutos y 120 minutos después de una transfusión al 15 % de glóbulos rojos humanos (HuRBC), medida por espectrofotometría. El control del vehículo es solución salina. El control positivo es el factor de veneno de cobra (CVF). n = número de animales en cada grupo. Las barras de error indican el error típico de las medias. La FIG.22B muestra el porcentaje de HuRBC supervivientes (detectados usando anti-CD235a humano conjugado con FITC (anticuerpo monoclonal de glucoforina A) a los 30 segundos, 5 minutos y 20 minutos después de la transfusión medida por citometría de flujo. Las barras de error indican el error típico de las medias. CVF: factor de veneno de cobra. Solución salina: solución salina normal al 0,9 %.

Las FIGS. 23A-C muestran la eficacia de PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) en la profilaxis (pretransfusión) frente al tratamiento (terapia de rescate, administrada después de la transfusión) en el modelo de RTHIA. La FIG. 23A muestra la hemoglobina libre presente en el plasma de rata recogido a los 0 segundos (antes del sangrado), 30 segundos, 5 minutos, 20 minutos, 60 minutos y 120 minutos después de una transfusión al 15% de HuRBC, medida por espectrofotometría. Las barras de error indican el error típico de las medias. La FIG. 23B muestra el área bajo la curva (hemoglobina total liberada) durante 120 minutos. Las barras de error indican el error típico de las medias. La FIG. 23C muestra bilirrubina sin conjugar medida a los 120 minutos en comparación con la pretransfusión (antes del sangrado). Las barras de error indican el error típico de las medias.

Las FIGS. 24A-D muestran la protección por PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) de los glóbulos rojos humanos frente a la lisis por suero de rata in vitro. La FIG. 24A muestra el análisis de citometría de flujo de HuRBC incubados durante 5 min en suero de rata y después marcados con anti-glucoforina A (APC) y anti-C3 (FITC). Los glóbulos rojos opsonizados marcados se añadieron a los glóbulos rojos sin marcar (gráfico representativo). La FIG. 24B muestra el análisis por citometría de flujo de HuRBC incubados 5 min en suero de rata tratado con PA-dPEG24 (gráfico representativo). La FIG. 24C muestra un aumento relativo en el número de HuRBC sin deposición de C3 (Q3) en el suero tratado con PA-dPEG24 en comparación con el suero sin tratar después de 5 min. Las barras de error indican el error típico de las medias para dos experimentos independientes. La FIG. 24D muestra que el porcentaje de glóbulos rojos incubados en suero que se unen a fragmentos C3 (Q2/Q2 Q3) se reduce en el suero tratado con PA-dPEG24 en comparación con el suero sin tratar después de 5 min. Las barras de error indican el error típico de las medias para 2 experimentos independientes. Q2: Células con tinción doble con C3 y glucoforina A (deposición de C3 en células marcadas con glucoforina A). Q3: Células con marcador de glucoforina A (células intactas).

Las FIGS. 25A-F muestran protección por PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) frente a la solución salina de glóbulos rojos humanos transfundidos en ratas a los 30 segundos (FIGS. 25A y 25D), 5 minutos (FIGS. 25B y 25E) y 20 minutos (FIGS. 25C y 25F). Análisis de citometría de flujo de glóbulos rojos recuperados de extracciones de sangre y marcados con antiglucoforina A (APC) y anti-C3 (FITC). En las FIGS. 25A-C, el animal recibió un control de solución salina. En las FIGS. 25D-F, el animal se trató profilácticamente con PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21). Q2: Células con tinción doble con C3 y glucoforina A. Q3: Células con marcador de glucoforina A (HuRBC intactas).

Las FIGS. 26A-D muestran la supervivencia de glóbulos rojos humanos transfundidos en ratas. La FIG. 26A muestra el número de acontecimientos medidos a los 30 segundos después de la transfusión con HuRBC que muestran todos glóbulos rojos anti gpA+ (Q2+Q3), anti gpA+ anti C3-(Q3) y anti gpA+ anti C3+ (Q2) para ^{profilaxis de PA-dPEG24} (sEq ID NO: 21), control de solución salina, control de CVF (factor de veneno de cobra) y tratamiento con PA-dPEG24 (rescate). Las barras de error indican el error típico de las medias. La FIG. 26B muestra el porcentaje de anti gpA+, glóbulos rojos anti C3+ en comparación con glóbulos rojos anti gpA+ totales (Q2/Q2+Q3). Las barras de error indican el error típico de las medias. La FIG. 26C muestra el total de glóbulos rojos anti gpA+ (Q2+Q3) presentes en la sangre a los 5 minutos y 20 minutos en comparación con los controles (solución salina y CVF). Las barras de error indican el error típico de las medias. La FIG. 26D muestra los glóbulos rojos anti gpA-anti C3+ (Q1) presentes en la sangre hasta 20 minutos. Leyenda: la profilaxis de PIC1 (SEQ ID nO: 21) se indica con una estrella; el tratamiento con PIC1 (SEQ ID NO: 21) (tratamiento de rescate en comparación con el control de solución salina) se indica con un rombo; el control de solución salina se indica con un cuadrado; el control de CVF se indica con un triángulo. Las barras de error indican el error típico de las medias. Las FIGS. 27A-F muestran la protección de PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) de los glóbulos rojos humanos transfundidos en ratas en comparación con la inmunoglobulina intravenosa (IGIV) a los 30 segundos (FIGS. 27A y 27D), 5 minutos (FIGS. 27B y 27E) y 20 minutos (FIGS. 27C y 27F) después de la transfusión. Análisis de citometría de flujo de glóbulos rojos recuperados de extracciones de sangre y marcados con antiglucoforina A (APC) y anti-C3 (FITC). Las FIGS.27A-C muestran el animal tratado profilácticamente con IGIV. Las FIGS. 27D-F muestran el animal tratado profilácticamente con PA-dPEG24. Q2 muestra células con tinción doble con C3 y glucoforina A. Q3 muestra células con marcador de glucoforina A (HuRBC intactos).

Las FIGS. 28A-C muestran la eficacia profiláctica de PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) en comparación con la inmunoglobulina intravenosa (IGIV) profiláctica. La FIG. 28A muestra la hemoglobina libre presente en el plasma de rata recogido a los 0 segundos (antes del sangrado), 30 segundos, 5 minutos, 20 minutos, 60 minutos, 120 minutos, 180 minutos, 240 minutos, 300 minutos y 360 minutos después de una transfusión al 15 % de HuRBC, medida por espectrofotometría. Las barras de error indican el error típico de las medias. La FIG. 28B muestra el número de acontecimientos medidos a los 30 segundos después de la transfusión con HuRBC que muestran todos glóbulos rojos anti gpA+ (Q2+Q3), anti gpA+ anti C3-(Q3) y anti gpA+ anti C3+ (Q2) para profilaxis de PA-dPEG24 y profilaxis de IGIV. Las barras de error indican el error típico de las medias. La FIG. 28C muestra glóbulos rojos anti gpA-anti C3+ (Q1) presentes en la sangre a los 30 segundos para la profilaxis de PA-dPEG24 y la profilaxis de IGIV. Las barras de error indican el error típico de las medias. La FIG. 28D muestra glóbulos rojos anti-gpAl totales para la profilaxis de IGIV (sin líneas) y PIC1 (líneas diagonales) a los 5 y 20 minutos después de la transfusión.

Las FIGS. 29A-C muestran la eficacia profiláctica de PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) (marcado como PIC1) en comparación con la inmunoglobulina profiláctica intravenosa (IGIV) en la lesión renal aguda. La FIG.29A muestra los pesos brutos de los riñones medidos para la profilaxis con IGIV y la profilaxis con PA-dPEG24 antes de la fijación con formalina. Las barras de error indican el error típico de las medias, n = 6. La FIG. 29B muestra una imagen de riñón macroscópica para la profilaxis con IGIV y la profilaxis con PA-dPEG24 antes de la fijación con formalina (animal representativo). FIG.29C Histología representativa (tinción de hematoxilina y eosina) de riñones de ratas que recibieron solución salina (i, ii), profilaxis con IGIV (iii, iv) o profilaxis con PIC1 (v, vi). Las ratas tratadas con PIC 1 muestran una arquitectura renal normal, mientras que las ratas tratadas con solución salina e IGIV muestran una alteración de la arquitectura celular compatible con la necrosis tubular aguda. La barra representa 20 mm. Los tejidos se observaron con un microscopio (Bmax, Olympus) con un aumento de 4003 a temperatura ambiente. Las imágenes se adquirieron con una cámara digital (DP71, Olympus).

La FIG.30 muestra el porcentaje de hemólisis sérica máxima después de la hipoxia en ratas 1, 2, 4, 8, 16, 24, 48 horas después del tratamiento con PIC1 (PA-dPEG24) (SEQ ID NO: 21), factor de veneno de cobra (CVF) o hipotermia terapéutica (31-32 °C durante 6 horas).

La FIG. 31 muestra imágenes de cortes de cerebro después de hipoxia en ratas tratadas con péptido PIC 1 (PA-dPEG24), hipotermia terapéutica con factor de veneno de cobra (CVF) (31-32 °C durante 6 horas).

La FIG. 32A muestra los niveles craneales de C1q combinados en EHI. Hay una deposición de C1q significativamente menor en el grupo tratado con PIC1 (SeQ ID NO: 21) (Normotermia PIC1 (SEQ ID NO: 21) -triángulo) en comparación con los controles de EHI sin tratar (Normotermia - rombo) en 4, 12 y 24 horas después de la lesión cerebral. Los animales tratados con PIC1 (SEQ ID NO: 21) tenían niveles similares de C1q en comparación con animales que se sometieron a hipotermia terapéutica (cuadrado).

La FIG. 32B muestra pruebas de neuroprotección post-EHI con tratamiento con PIC1 (SEQ ID NO: 21). Los paneles A-D de la FIG. 32B muestran tinción con violeta de cresilo. El violeta de cresilo tiñe la sustancia Nissl en las neuronas. El grupo de EHI (panel B) muestra una disminución significativa en la tinción con violeta de cresilo en comparación con el grupo de PIC1 (SEQ ID NO: 21) (panel D), lo que indica la acción neuroconservadora de PIC1 (SEQ ID NO: 21) similar a la hipotermia terapéutica (panel C). Los paneles E-H muestran tinción con hematoxilina y eosina. La tinción con hematoxilina y eosina demostró un mayor grado de destrucción neuronal (necrosis, picnosis y cariorrexis) en el cerebro de eHi (panel F) en comparación con los tratados con PIC1 (SEQ ID NO: 21) (panel H). Los paneles I-L muestran tinción con naranja de acridina. La naranja de acridina tiñe partes viables del cerebro de un verde brillante (paneles K y L). EHI disminuye significativamente la tinción con naranja de acridina en el cerebro (panel J). El tratamiento con PIC1 (SEQ ID NO: 21) restauró la tinción con naranja de acridina, lo que indica la presencia de células más viables en el cerebro (panel L).

La FIG. 32C muestra que la neuroprotección histológica también se traduce en una mejora neurofuncional después de la EHI. Los animales en los que se inyectó PIC1 (SEQ ID NO: 21) rindieron mejor que los animales normotérmicos y similar a los animales sin intervención o los animales que recibieron hipotermia terapéutica (sin intervención, primera barra a la izquierda; EHI: normotermia, segunda barra desde la izquierda; hipotermia terapéutica eH|+: hipotermia, tercera barra desde la izquierda, EHI+PIC1 (SEQ ID NO: 21): normo-PIC1 (SEQ ID NO: 21), cuarta barra desde la izquierda).

La FIG. 33 muestra PIC1 (SEQ ID NO: 21) frente a la inhibición por aciclovir de VHS-1 que codifica GFP. En el control negativo sin virus (como se indica en la etiqueta), el histograma muestra un pico a la izquierda, lo que indica que no hay células infectadas (GFP-). En el control positivo, el pico se desplaza hacia la derecha, lo que indica células infectadas (GFP+). En la fila 2, una concentración creciente de PIC1 (SEQ ID NO: 21) desplaza gradualmente el pico hacia la izquierda, lo que indica que PIC1 (SEQ ID NO: 21) inhibe la replicación vírica. Por el contrario, la fila 3 muestra el efecto dependiente de la dosis del aciclovir (ACV) sobre la replicación vírica. El tratamiento con 5 mM de ACV dio lugar a un pequeño pico derecho, lo que indica que todavía había replicación vírica residual.

La FIG. 34 muestra PIC1 (SEQ ID NO: 21) frente a la inhibición por aciclovir de VHS-2. En el control negativo (como se indica en la etiqueta), el histograma muestra un pico a la izquierda, lo que indica que no hay células infectadas (GFP-). En el control positivo, el pico se desplaza hacia la derecha, lo que indica células infectadas (GFP+). En la fila 2, una concentración creciente de PIC1 (SEQ ID NO: 21) desplaza gradualmente el pico hacia la izquierda, lo que indica que PIC1 (SEQ ID NO: 21) inhibe la replicación vírica. Por el contrario, la fila 3 muestra el efecto dependiente de la dosis del aciclovir (ACV) sobre la replicación vírica.

La FIG. 35 muestra que PIC1 (SEQ ID NO: 21), denominado AF1 en el eje de abscisas de la figura, promueve el crecimiento de L. acidophilus y L. leichmannii.

La FIG.36A-C muestra la actividad antimicrobiana de PIC1 (SEQ ID NO: 7, 8, 12 y 21). La FIG.36A muestra que PIC1 (SEQ ID NO: 21) inhibe el crecimiento de Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa y Klebsiella pneumoniae en la prueba de microdilución de CIM. La FIG. 36B muestra las variantes peptídicas AF1-AF5 (SEQ ID NO: 21, 5, 6, 7 y 8, respectivamente) en las pruebas de microdilución de CIM para Pseudomonas aeruginosa. La FIG. 36C muestra microscopia confocal que muestra PIC1 (SEQ ID NO: 21) unido a la superficie externa de las bacterias.

La FIG. 37A-D muestra crecimiento de Neisseria gonorrhoeae en presencia o ausencia de PIC 1 (SEQ ID NO: 21). La FIG. 37A muestra crecimiento de Neisseria gonorrhoeae en presencia o ausencia de 20 mg/ml de PIC1 (SEQ ID NO: 21). La FIG. 37B muestra crecimiento de Neisseria gonorrhoeae en presencia o ausencia de 30 mg/ml de PIC1 (SEQ ID NO: 21). La FIG.37C muestra Neisseria gonorrhoeae cultivado en concentraciones de titulación de PIC1 (SEQ ID NO: 21). La FIG. 37D muestra recuentos de colonias de Neisseria gonorrhoeae incubada con y sin PiC1 (SEQ ID NO: 21).

La FIG. 38 muestra que PIC1 (SEQ ID NO: 21) inhibe la actividad de MPO en muestras de esputo (sol) aisladas de pacientes con fibrosis quística (FQ). Las muestras de fracción soluble de FQ se incubaron en presencia o ausencia de 20 mg/ml de PIC1 (SEQ ID NO: 21) durante 30 minutos, seguido de la adición de TMB durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, se midió la actividad de MPO mediante la detección del cambio de color de TMB en un espectrofotómetro a 450 nm.

La FIG. 39 muestra que PlC1 (SEQ ID NO: 21) inhibe de forma dependiente de la dosis la actividad de MPO en una muestra de esputo (sol) aislada de un paciente con fibrosis quística (FQ). La fracción soluble de FQ se incubó en presencia de cantidades crecientes de PIC1 (SEQ ID NO: 21) a temperatura ambiente. A continuación, se midió la actividad de MPO mediante la detección del cambio de color de tMb en un espectrofotómetro a 450 nm. La FIG. 40 muestra que PIC1 (SEQ ID NO: 21) inhibe la actividad de MPO en cerebros de rata sujetos a encefalopatía hipóxica isquémica (EHI). Los sobrenadantes del lisado de cerebro de rata que se sometió a EHI se incubaron en presencia o ausencia de 20 mg/ml de PIC1 (SEQ ID NO: 21). A continuación, se midió la actividad de MPO mediante la detección del cambio de color de TMB en un espectrofotómetro a 450 nm.

La FIG. 41 muestra lisados cerebrales de crías de rata con EHI que no reciben tratamiento (NT = normotermia), hipotermia (HT) o PIC1 (SEQ ID NO: 21) i.p. (NP = normotermia PIC1 (SEQ ID NO: 21)). A continuación, se ensayó la actividad de MPO de los lisados con TNB. Durante 48 horas, los animales NT experimentan un aumento de la actividad de MPO compatible con un aumento de la lesión por reperfusión y el tamaño del infarto. El animal tratado con PIC1 (SEQ ID NO: 21) muestra una tendencia hacia la disminución de la actividad de MPO en comparación con ningún tratamiento (NT) en cada punto temporal, lo que sugiere una disminución de la actividad de MPO en el cerebro de EHI después de la administración i.p. de PIC1 (SEQ ID NO: 21).

La FIG. 42 muestra que PIC1 (SEQ ID NO: 21) inhibe de forma dependiente de la dosis la actividad de MPO en lisados de neutrófilos humanos purificados (PMN). Los lisados de PMN se incubaron en presencia de cantidades crecientes de PIC1 (SEQ ID NO: 21). A continuación, se midió la actividad de MPO mediante la detección del cambio de color de TMB en un espectrofotómetro a 450 nm.

La FIG. 43 muestra la titulación de la inhibición de la actividad de MPO aumentando las cantidades de PIC1 (SEQ ID NO: 21). PIC1 (SEQ ID NO: 21) inhibe directamente la MPO.

La FIG. 44 muestra que cantidades crecientes de lisados de glóbulos rojos que contenían hemoglobina demostraron un aumento dependiente de la dosis en la oxidación del sustrato cromógeno tetrametilbencidina (TMB). En presencia de PIC1 (SEQ ID NO: 21) a 20 mg/ml, se inhibió la oxidación de TMB.

La FIG. 45 muestra que cantidades crecientes de PIC1 (SEQ ID NO: 21) condujeron a una disminución dependiente de la dosis de la señal de TMB oxidada por la hemoglobina de los lisados de glóbulos rojos.

La FIG. 46 muestra que cantidades crecientes de PIC1 (SEQ ID NO: 21) inhibieron de forma dependiente de la dosis la oxidación de tetrametilbencidina TMB con cantidades crecientes de hemoglobina del lisado de glóbulos rojos.

Descripción detallada

La presente invención proporciona compuestos peptídicos sintéticos basados en la modificación de péptidos aislados, purificados, de 15 aminoácidos del péptido clasificador polar (PA) (SEQ ID NO: 3), derivados de los péptidos y procedimientos para su uso. El péptido PA es un péptido mezclado, acortado, derivado de la proteína del astrovirus humano, denominada CP1 (sEq ID NO: 1). En algunas realizaciones, la invención se basa en la modificación de un péptido aislado, purificado, de CP1 y los derivados peptídicos tienen las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ iD NO: 10, 12, 21, 35, 36, 37, 39, 43, 45 y 47. Las SEQ ID NO: 4-47 son derivados de PA (SEQ ID NO: 3) que tienen, por ejemplo, sustituciones y/o modificaciones de sarcosina en el extremo N y el extremo C, incluyendo PEGilación. Estos péptidos se pueden usar para regular la activación del complemento, incluyendo la inhibición del complemento; tratar y/o prevenir reacciones hemolíticas; tratar la encefalopatía isquémica hipóxica; tratar la fibrosis quística; para uso antimicrobiano; y tratar y/o prevenir otras enfermedades y afecciones desveladas en el presente documento.

En algunos aspectos, estos compuestos peptídicos tienen valor terapéutico para el tratamiento de enfermedades y afecciones mediadas por la activación desregulada de las rutas clásica y de la lectina. Se desvelan procedimientos para seleccionar péptidos que tienen actividad antimicrobiana, se puede usar para tratar la fibrosis quística y/o se puede usar para tratar diversas enfermedades agudas. El péptido PA (SEQ ID NO: 3) tiene baja solubilidad en soluciones acuosas. Los péptidos de SEQ ID NO: 21 y otras sustituciones de sarcosina y PEGiladas (p. ej., las SEQ ID NO: 5-8, 10-12, 21-25, 27-29, 30-40, 43, 45 y 47), tienen mayor solubilidad en soluciones acuosas, lo que puede aumentar su eficacia como compuestos terapéuticos.

En algunas realizaciones, la invención se basa en la identificación y modificación de un péptido aislado, purificado, de 30 aminoácidos derivados de la proteína de la cubierta del astrovirus humano, denominada CP1, y que tiene una secuencia (SEQ ID NO: 1) que es capaz de regular la activación de la vía clásica y de la lectina uniéndose a C1q y MBL. En otras realizaciones, los compuestos peptídicos regulan la activación de la vía clásica pero no la activación de la vía de la lectina.

Las modificaciones de la estructura de aminoácidos de CP1 han conducido al descubrimiento de compuestos peptídicos adicionales que pueden regular la activación del complemento, tal como la actividad C1q.

La expresión "compuesto o compuestos peptídicos", como se usa en el presente documento, se refiere a secuencias de aminoácidos, que pueden ser de origen natural, o peptidomiméticos, análogos peptídicos y/o derivados sintéticos de aproximadamente 15 aminoácidos basados en la s Eq ID NO: 3. Además, el compuesto peptídico puede tener menos de aproximadamente 15 restos de aminoácidos, tal como entre aproximadamente 10 y aproximadamente 15 restos de aminoácidos y tal como compuestos peptídicos de entre aproximadamente 5 y aproximadamente 10 restos de aminoácidos. Es igualmente probable que restos peptídicos de, por ejemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 y 15 aminoácidos sean compuestos peptídicos dentro del contexto de la presente invención. Los compuestos peptídicos también pueden tener más de 15 aminoácidos, tales como, por ejemplo, 16, 17, 18, 19 y 20 o más aminoácidos. Los compuestos peptídicos desvelados están en general restringidos (es decir, tienen algún elemento de estructura como, por ejemplo, la presencia de aminoácidos que inician una vuelta p o una lámina plegada p, o, por ejemplo, se ciclan por la presencia de restos de Cys unidos por enlaces disulfuro) o secuencias de aminoácidos no restringidas (es decir, lineales) de aproximadamente 15 restos de aminoácidos o menos de aproximadamente 15 restos de aminoácidos.

Los sustitutos de un aminoácido dentro de la secuencia peptídica pueden seleccionarse de otros miembros de la clase a la que pertenece el aminoácido. Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrófobos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina. Los aminoácidos que contienen estructuras de anillos aromáticos incluyen fenilalanina, triptófano y tirosina. Los aminoácidos polares neutros incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina. Los aminoácidos con carga positiva (básicos) incluyen arginina y lisina. Los aminoácidos con carga negativa (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. Por ejemplo, uno o más restos de aminoácidos dentro de la secuencia pueden sustituirse por otro aminoácido de polaridad similar, que actúa como un equivalente funcional, lo que da lugar a una alteración silenciosa.

Un cambio conservador conduce en general a menor cambio en la estructura y función de la proteína resultante. Es más probable que un cambio no conservador altere la estructura, actividad o función de la proteína resultante. Por ejemplo, el péptido de la presente divulgación comprende una o más de las siguientes sustituciones conservadoras de aminoácidos: reemplazo de un aminoácido alifático, tal como alanina, valina, leucina e isoleucina, con otro aminoácido alifático; reemplazo de una serina con una treonina; reemplazo de una treonina con una serina; reemplazo de un resto ácido, tal como ácido aspártico y ácido glutámico, con otro resto ácido; reemplazo de un resto que porta un grupo amida, tal como asparagina y glutamina, con otro resto que porta un grupo amida; intercambio de un resto básico, tal como lisina y arginina, con otro resto básico; y reemplazo de un resto aromático, tal como fenilalanina y tirosina, con otro resto aromático.

Las sustituciones de aminoácidos particularmente preferidas incluyen:

a) Glu por Ala o viceversa, de modo que se pueda reducir una carga negativa;

b) Arg por Lys o viceversa, de modo que se pueda mantener una carga positiva;

c) Arg por Ala o viceversa, de modo que se pueda reducir una carga positiva;

d) Asp por Glu o viceversa, de modo que se pueda mantener una carga negativa;

e) Thr por Ser o viceversa, de modo que se pueda mantener un -OH libre;

f) Asn por Gln o viceversa, de modo que se pueda mantener un NH2 libre;

g) Leu o Val por Ile o viceversa, como aminoácidos hidrófobos aproximadamente equivalentes;

h) Tyr por Phe o viceversa, como aminoácidos aromáticos aproximadamente equivalentes; y

i) Cys por Ala o viceversa, de modo que se vea afectada la unión por enlaces disulfuro.

Los sustitutos de un aminoácido dentro de la secuencia peptídica pueden seleccionarse de cualquier aminoácido, incluyendo, pero sin limitación, alanina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteína, ácido glutámico, glutamina, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, pirrolisina, selenocisteína, serina, treonina, triptófano, tirosina, valina, N-formil-L-metionina, sarcosina u otros aminoácidos N-metilados. En algunas realizaciones, la sarcosina sustituye a un aminoácido dentro de la secuencia peptídica.

En una realización, la invención desvela péptidos sintéticos derivados de la proteína de la cubierta del astrovirus humano, los péptidos que comprenden las secuencias de aminoácidos y las modificaciones de las SEQ ID NO: 10, 12, 21, 35, 36, 37, 39, 43, 45 y 47. En el presente documento se desvelan péptidos sintéticos derivados de la proteína de la cubierta del astrovirus humano, los péptidos que comprenden las secuencias de aminoácidos y las modificaciones de las SEQ ID NO: 3 y 19-29. En el presente documento se desvelan péptidos sintéticos derivados de la proteína de la cubierta del astrovirus humano, los péptidos que comprenden las secuencias de aminoácidos y las modificaciones de las SEQ ID NO: 4-18 y 30-47.

Se desvela un péptido sintético que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, con una o más sustituciones, modificaciones, inserciones o supresiones de aminoácidos, en el que el péptido regula la activación del complemento y/o tiene actividad antimicrobiana, entre otras actividades terapéuticas descritas en el presente documento.

En el presente documento se desvela un péptido sintético que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, con una o más sustituciones de sarcosina, en el que el péptido regula la activación del complemento y/o tiene actividad antimicrobiana entre otras actividades terapéuticas descritas en el presente documento.

En el presente documento se desvela un péptido sintético que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, con una o más sustituciones de alanina, en el que el péptido regula la activación del complemento y/o tiene actividad antimicrobiana entre otras actividades terapéuticas descritas en el presente documento.

En el presente documento se desvela un péptido sintético que comprende la secuencia PEGilada de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3, en el que el péptido regula la activación del complemento y/o tiene actividad antimicrobiana entre otras actividades terapéuticas descritas en el presente documento.

Los compuestos peptídicos pueden tener supresiones y sustituciones de péptidos internos, así como supresiones y sustituciones en el extremo N y el extremo C basados en la SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones, el péptido tiene aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más sustituciones, modificaciones, inserciones o supresiones de aminoácidos.

Las secuencias peptídicas desveladas en el presente documento pueden tener al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 85 %, al menos aproximadamente 90 %, al menos aproximadamente 91 %, al menos aproximadamente 92 %, al menos aproximadamente 93 %, al menos aproximadamente 94 %, al menos aproximadamente 95 %, al menos aproximadamente 96 %, al menos aproximadamente 97 %, al menos aproximadamente 98 % o al menos aproximadamente 99 % de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 3.

En algunas realizaciones, la presente invención se refiere a péptidos terapéuticamente activos que tienen el efecto de tratar o prevenir la disfunción orgánica inducida por isquemia, inflamación y/o efectos tóxicos de intoxicación o tratamiento farmacológico. En otras realizaciones, la presente invención también se refiere a péptidos terapéuticamente activos que tienen efectos antimicrobianos. En otras realizaciones, la presente invención se refiere a péptidos terapéuticamente activos que tienen el efecto de tratar la fibrosis quística. En otras realizaciones, la presente invención se refiere a péptidos terapéuticamente activos que tienen el efecto de tratar o prevenir reacciones transfusionales hemolíticas intravasculares agudas (RTHIA). En otras realizaciones, la presente invención se refiere a péptidos terapéuticamente activos que tienen el efecto de tratar la asfixia perinatal. La presente invención también se refiere a péptidos terapéuticamente activos que tienen el efecto de tratar enfermedades agudas mediadas por el complemento.

Como se usa en el presente documento, una secuencia peptídica es "terapéuticamente activa" si se puede usar para el tratamiento, remisión o atenuación de una patología, condición fisiológica, síntomas o indicación o indicaciones etiológicas, o evaluación o diagnóstico de los mismos. Una secuencia peptídica es "profilácticamente activa" si se puede usar para prevenir una patología, condición fisiológica, síntomas o indicaciones etiológicas.

El término "sujeto", como se usa en el presente documento, significa cualquier sujeto para el que se desee diagnóstico, pronóstico o terapia. Por ejemplo, un sujeto puede ser un mamífero, p. ej., un primate humano o no humano (tal como un simio, mono, orangután o chimpancé), un perro, gato, cobaya, conejo, rata, ratón, caballo, ganado bovino o vaca.

Como se usa en el presente documento, "tratar", "que trata" o "tratamiento" se refiere a administrar una terapia en una cantidad, manera (p. ej., programa de administración) y/o modo (p. ej., vía de administración), eficaz para mejorar un trastorno (p. ej., un trastorno descrito en el presente documento) o un síntoma del mismo, o para prevenir o ralentizar la progresión de un trastorno (p. ej., un trastorno descrito en el presente documento) o un síntoma del mismo. Esto se puede evidenciar por, p. ej., una mejora en un parámetro asociado con un trastorno o un síntoma del mismo, p. ej., en un grado estadísticamente significativo o en un grado detectable por un experto en la materia. Una cantidad, manera o modo eficaz pueden variar dependiendo del sujeto y pueden adaptarse al sujeto. Al prevenir o ralentizar la progresión de un trastorno o un síntoma del mismo, un tratamiento puede prevenir o retrasar el deterioro resultante de un trastorno o un síntoma del mismo en un sujeto afectado o diagnosticado.

Péptidos y derivados de la proteína de la cubierta del astrovirus

CP1 es un péptido derivado de la proteína de la cubierta del astrovirus humano, comprendiendo el péptido una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1.

Usando CP1 como péptido precursor, se realizaron supresiones internas del resto 8 al resto 22 para el péptido A8-22 (SEQ ID NO: 2) (las supresiones internas se muestran como guiones en la TABLA 1). Este péptido fue activo en todos los ensayos funcionales probados y se unió a C1q. Los 15 restos de aminoácidos del péptido A8-22 se mezclaron para generar el péptido clasificador polar (SEQ iD NO: 3). El péptido clasificador polar mezclado (SEQ ID NO: 3) también se denomina PA, PIC1, AstroFend o AF. Como se analiza en el presente documento, el término péptido "PIC1" incluye péptidos con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 3 así como péptidos con la misma secuencia de aminoácidos pero con modificaciones tales como PEGilación. El péptido PA fue activo en todos los ensayos funcionales probados. Se describe una serie de supresiones, sustituciones y modificaciones peptídicas de CP1 adicionales en la patente de los Estados Unidos n.° 8906845.

Se desvela una serie de sustituciones peptídicas y modificaciones de PA, como se muestra en las TABLAS 1,2, 3 y 4 a continuación. La presente solicitud desvela péptidos sintéticos que comprenden una cualquiera de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 1-47, como se muestra en las TABLAS 1-4. Como agentes terapéuticos para seres humanos, la vía de administración de los compuestos peptídicos puede ser, por ejemplo, tópica, entérica, inhalada, parenteral (es decir, intramuscular, subcutánea, intravenosa) o administrada a través de un nebulizador, así como cualquier otra vía de administración conocida en la técnica.

Péptido Secuencia peptídica (N ^ C)

CP1 PAICQRATATLGTVGSNTSGTTEIEACILL (SEQ ID NO: 1) A8-22 PAICQRA----------EIEACILL (SEQ ID NO: 2) Clasificador polar (también conocido como PA,

PIC1, AstroFend o AF) IALILEPICCQERAA (SEQ ID NO: 3)

Sustituciones de sarcosina

La sarcosina ("Sar") es un aminoácido natural, también conocido como N-metilglicina. La sarcosina es un intermedio en el metabolismo de la colina a la glicina. Se usó sustitución de sarcosina para sustituir cada resto de PA secuencialmente (TABLA 2). La sustitución de sarcosina puede usarse para identificar un péptido que conserva la actividad inhibidora del complemento y es soluble en agua.

En el presente documento se desvelan compuestos peptídicos sustituidos con sarcosina en determinadas posiciones. La tabla 2 desvela péptidos sintéticos que comprenden la secuencia de la SEQ ID NO: 3, en los que uno o más de los aminoácidos están sustituidos con sarcosina y en los que los péptidos regulan la activación del complemento y/o tienen actividad antimicrobiana. En una o más realizaciones, los aminoácidos sustituidos con sarcosina están en las posiciones 7 o 9. En una o más realizaciones, dos o más de los aminoácidos están sustituidos con sarcosina.

TABLA 2

Nombre del Secuencia de aminoácidos _{SEQ ID NO}

PA IALILEPICCQERAA SEQ ID NO: 3

PA-I1Sar (Sar)ALILEPICCQERAA SEQ ID NO: 4

PA-A2Sar I (Sar) LILEPICCQERAA SEQ ID NO: 5

PA-L3Sar IA (Sar) ILEPICCQERAA SEQ ID NO: 6

PA-I4Sar IAL (Sar) LEPICCQERAA SEQ ID NO: 7

PA-L5Sar IALI (Sar) EPICCQERAA SEQ ID NO: 8

PA-E6Sar IALIL (Sar) PICCQERAA SEQ ID NO: 9

PA-P7Sar IALILE (Sar) ICCQERAA SEQ ID NO: 10 PA-I8Sar IALILEP (Sar) CCQERAA SEQ ID NO: 11

PA-C9Sar IALILEPI(Sar)CQERAA SEQ ID NO: 12 PA-C10Sar IALILEPIC (Sar) QERAA SEQ ID NO: 13 PA-Q11Sar ALILEPICC (Sar) ERAA SEQ ID NO: 14 PA-E12Sar IALILEPICCQ (Sar) RAA SEQ ID NO: 15 PA-R13Sar IALILEPICCQE(Sar)AA SEQ ID NO: 16 PA-A14Sar IALILEPICCQER(Sar)A SEQ ID NO: 17 PA-A15Sar IALILEPICCQERA(Sar) SEQ ID NO: 18

PEGilación

El polietilenglicol (PEG) es un oligómero o polímero de óxido de etileno. En el presente documento se desvelan compuestos peptídicos que están PEGilados (es decir, tienen uno o más restos de PEG unidos). La PEGilación puede usarse para identificar un péptido modificado que conserva la actividad inhibidora del complemento y es soluble en agua. Se pueden unir uno o más restos de PEG al extremo N del péptido, el extremo C del péptido o tanto al extremo N como al C del péptido. El compuesto peptídico PEGilado incluye cualquiera de los péptidos descritos en el presente documento (tablas 1-4) en el que el péptido se modifica mediante PEGilación del extremo N, el extremo C o tanto el extremo N como el extremo C.

Se usó PEGilación para unir uno o más restos de PEG al extremo N, el extremo C o tanto el extremo N como el extremo C de PA (TABLA 3). En una o más realizaciones, se unen 24 restos de PEG al extremo N de PA. En una o más realizaciones, se unen 24 restos de PEG al extremo C de PA. En una o más realizaciones, se unen 24 restos de PEG al extremo N de PA y al extremo C de PA. En una o más realizaciones, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o más restos de PEG están unidos al extremo N de PA. En una o más realizaciones, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 o 24 restos de PEG estaban unidos al extremo C de PA. En una o más realizaciones, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 o más restos de PEG están unidos tanto al extremo N como al extremo C de PA.

En el presente documento se desvelan compuestos peptídicos PEGilados. La presente solicitud desvela péptidos sintéticos que comprenden la secuencia de la SEQ ID NO: 3 (PIC1), en los que se unen uno o más restos de PEG y en los que los péptidos regulan la activación del complemento y/o tienen actividad antimicrobiana.

TABLA 3

Nombre del péptido Secuencia de aminoácidos peptídicos

SEQ ID NO

dPEG24-PA-dPEG24 dPEG24-IALILEPICCQERAA-dPEG24 SEQ ID NO: 19

dPEG24-PA dPEG24-IALILEPICCQERAA SEQ ID NO: 20

PA-dPEG24 IALILEPICCQERAA-dPEG24 SEQ ID NO: 21

PA-dPEG20 IALILEPICCQERAA-dPEG20 SEQ ID NO: 22

PA-dPEG16 IALILEPICCQERAA-dPEG16 SEQ ID NO: 23

PA-dPEG12 IALILEPICCQERAA-dPEG12 SEQ ID NO: 24

PA-dPEG08 IALILEPICCQERAA-dPEG08 SEQ ID NO: 25

PA-dPEG06 IALILEPICCQERAA-dPEG06 SEQ ID NO: 26

PA-dPEG04 IALILEPICCQERAA-dPEG04 SEQ ID NO: 27

PA-dPEG03 IALILEPICCQERAA-dPEG03 SEQ ID NO: 28

PA-dPEG02 IALILEPICCQERAA-dPEG02

SEQ ID NO: 29

PEGilación de péptidos en combinación con sustituciones de aminoácidos

La presente solicitud desvela PA/PIC1 que ha sido modificado por una combinación de sustituciones de sarcosina y/o sustituciones de alanina y/o PEGilación. Se desvela una serie de sustituciones peptídicas y modificaciones de Pa, como se muestra en la TABLA 4 a continuación. Los péptidos modificados y sustituidos pueden usarse para identificar un péptido que conserva la actividad inhibidora del complemento y es soluble en agua. La presente solicitud desvela un péptido sintético que comprenden la secuencia de la SEQ iD NO: 3, en el que uno o más de los aminoácidos están sustituidos con sarcosina o alanina, en el que los péptidos regulan la activación del complemento y/o tienen actividad antimicrobiana. La presente solicitud también desvela un péptido sintético que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 3, en el que uno o más de los aminoácidos están sustituidos con sarcosina o alanina y uno o más restos de PEG están unidos al extremo N de los péptidos, el extremo C de los péptidos o tanto al extremo N como al extremo C de los péptidos, en el que los péptidos regulan la activación del complemento y/o tienen actividad antimicrobiana.

En una o más realizaciones, dos o más de los aminoácidos están sustituidos con sarcosina. En una o más realizaciones, dos o más de los aminoácidos están sustituidos con alanina. En una o más realizaciones, uno o más de los aminoácidos están sustituidos con sarcosina y uno o más de los aminoácidos están sustituidos con alanina. Los péptidos sustituidos se pueden modificar adicionalmente mediante PEGilación como se ha descrito anteriormente.

____________________________________TABLA 4____________________________________

Nombre del péptido y controles Secuencia de aminoácidos peptídicos SEQ ID NO

Agua -DMSO -PA-dPEG24 IALILEPICCQERAA-dPEG24 SEQ ID NO : 21 (continuación)

Nombre del péptido y controles Secuencia de aminoácidos peptídicos SEQ ID NO

PA-E6Sar-dPEG24 IALIL (Sar) PICCQERAA-dPEG24 SEQ ID NO 33 PA-Q11Sar-dPEG24 IALILEPICC (Sar) ERAA-dPEG24 SEQ ID NO 34 PA-R13Sar-dPEG24 IALILEPICCQE (Sar)AA-dPEG24 SEQ ID NO 35 PA-A14Sar-dPEG24 IALILEPICCQER (Sar) A-dPEG24 SEQ ID NO 36 E6SarP7Sar IALIL (Sar) (Sar) ICCQERAA SEQ ID NO 37 E6SarC9Sar IALIL (Sar) PI (Sar) CQERAA SEQ ID NO 38 Q11SarP7Sar IALILE (Sar) ICC (Sar) ERAA SEQ ID NO 39 Q11SarC9Sar IALILEPI (Sar) C (Sar) ERAA SEQ ID NO 40 R13SarP7Sar IALILE (Sar) ICCQE (Sar) AA SEQ ID NO 41 R13SarC9Sar IALILEPI (Sar) CQE (Sar)AA SEQ ID NO 42 A14SarP7Sar IALILE (Sar) ICCQER (Sar) A SEQ ID NO 43 A14SarC9Sar IALILEPI (Sar) CQER (Sar) A SEQ ID NO 44 E6AE12A-dPEG24 IALILAPICCQARAA-dPEG24 SEQ ID NO 45 E6AE12AC9Sar IALILAPI (Sar) CQARAA SEQ ID NO 46 E6AE12AP7Sar IALILA (Sar) ICCQARAA SEQ ID NO 47

Actividad antimicrobiana de los péptidos PIC 1

Actualmente existe una necesidad crítica de nuevos antibióticos ya que muchos microorganismos se han vuelto resistentes a los antibióticos prescritos actualmente. Adicionalmente, la mayoría de los antibióticos proceden de otros organismos microbianos contra los que las bacterias han competido por espacio y energía durante milenios, lo que conduce a una aparición rápida y predecible de resistencias.

El péptido CP1 se identificó inicialmente por su débil homología con el péptido defensina de neutrófilos humanos 1 (HNP-1). Además de inhibir la activación del complemento, HNP-1 tiene la capacidad de inhibir el crecimiento bacteriano. Los péptidos PIC1 descritos en el presente documento, incluyendo las SEQ ID NO: 3-47, son muy diferentes en su secuencia de aminoácidos a HNP-1 y no tienen homólogos conocidos en la naturaleza. Sorprendentemente, en algunos aspectos, los péptidos PIC1 tienen actividad antibacteriana.

En algunos aspectos, los compuestos peptídicos desvelados tienen un efecto antimicrobiano directo y son, por tanto, ideales para inhibir el crecimiento de enfermedades bacterianas. Los compuestos peptídicos desvelados pueden usarse para prevenir y tratar enfermedades mediadas por bacterias. En algunas realizaciones, los compuestos peptídicos desvelados pueden usarse para prevenir y tratar infecciones bacterianas grampositivas y gramnegativas. En algunas realizaciones, los compuestos peptídicos desvelados pueden usarse para prevenir y tratar, por ejemplo, Pseudomonas aeruginosa, SARM y enterobacterias resistentes a carbapenemasa (ERC) (p. ej., Klebsiella pneumonía resistente). Los compuestos peptídicos desvelados se pueden usar para prevenir y tratar la vaginosis y vaginitis bacterianas. En una o más realizaciones, los compuestos peptídicos desvelados destruyen el organismo causante de la vaginosis bacteriana y también bloquean la inflamación, que rompe las defensas de barrera aumentando el riesgo de transmisión del VIH. Como los péptidos PIC1 no tienen homología con proteínas o péptidos conocidos, esto tiene el potencial de disminuir la probabilidad de aparición de resistencia.

Los compuestos peptídicos desvelados también pueden mejorar el crecimiento de Lactobacillus. En algunas realizaciones de la invención, L. acidophilus y L. leichmannii son potenciados por los compuestos peptídicos desvelados. En determinados aspectos, la invención proporciona un péptido sintético que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID nO: 10, 12, 21, 35, 36, 37, 39, 43, 45 y 47 para su uso en mejora del crecimiento de Lactobacillus en un sujeto.

La vaginosis y la vaginitis bacterianas se tratan actualmente con antibióticos sistémicos. Los compuestos peptídicos desvelados se pueden usar para prevenir y tratar la vaginosis y vaginitis bacterianas mediante administración local (p. ej., administración tópica) o mediante administración sistémica (p. ej., administración intravenosa).

En determinados aspectos, la invención proporciona el péptido sintético o la composición farmacéutica del primer, segundo o tercer aspecto para su uso en un procedimiento de tratamiento de una infección bacteriana que comprende administrar a un sujeto una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del péptido sintético. En una o más realizaciones, las bacterias son Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumonia, Pseudomonas aeruginosa, Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis o Gardnerella sp. En una o más realizaciones, el sujeto tiene fibrosis quística y los compuestos peptídicos tratan la fibrosis quística. En una o más realizaciones, el sujeto tiene gonorrea o clamidia y los compuestos peptídicos tratan la gonorrea o clamidia. En una o más realizaciones, el sujeto tiene neumonía y los compuestos peptídicos tratan la neumonía.

En determinados aspectos, la invención proporciona un péptido sintético o la composición farmacéutica del primer, segundo o tercer aspecto para su uso en un procedimiento de tratamiento de la vaginitis bacteriana que comprende administrar a un sujeto una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un péptido sintético que comprende la secuencia de aminoácidos y modificaciones seleccionadas de las SEQ ID NO: 10, 12, 21, 35, 36, 37, 39, 43, 45 y 47.

El sistema del complemento y las enfermedades asociadas a su desregulación

Aunque el complemento es una defensa vital del huésped contra microorganismos tales como bacterias y algunos virus con envoltura, su activación descontrolada puede causar daños devastadores a las células huésped. El daño tisular del huésped mediado por el complemento se ha implicado en una amplia variedad de enfermedades, incluyendo patologías autoinmunitarias tales como: artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, esclerosis múltiple, miastenia grave, anemia hemolítica autoinmunitaria, glomerulonefritis membranoproliferativa y enfermedad del suero. También se ha identificado como contribuyente al desarrollo de las siguientes enfermedades: síndrome de dificultad respiratoria del adulto (SDRA), lesiones por isquemia y reperfusión (incluyendo ictus e infarto de miocardio), complicaciones de alo y xenotrasplantes (incluyendo el rechazo hiperagudo y la enfermedad del injerto contra el huésped (EICH), enfermedad de Alzheimer, quemaduras, daño por hemodiálisis, daño por derivación cardiopulmonar y hemoglobinuria paroxística nocturna (HPN).

El angioedema hereditario (AEH) es un trastorno genético poco común causado por el inhibidor de C1 no funcional a niveles reducidos; los síntomas del AEH incluyen edema agudo. El inhibidor de C1 regula de forma natural la activación de C1 y el tratamiento del edema agudo requiere una infusión sustancial de inhibidor de C1 o transfusión de plasma. Debido a que la PC de astrovirus bloquea funcionalmente la activación de C1, el uso de los compuestos peptídicos desvelados para tratar el AEH satisface una necesidad terapéutica porque el inhibidor de C1 debe purificarse a partir de sueros humanos de múltiples sujetos y, por lo tanto, podría estar contaminado con patógenos transmitidos por la sangre humana. La administración terapéutica de los compuestos peptídicos desvelados regula C1 en terapia adjunta con inhibidor de C1 o como tratamiento terapéutico independiente.

Los compuestos peptídicos desvelados pueden regular selectivamente la activación de C1q y MBL sin afectar a la actividad de la vía alternativa y son, por tanto, ideales para prevenir y tratar enfermedades mediadas por la activación desregulada de las vías clásica y de la lectina. Es particularmente necesario el bloqueo específico de las vías clásica y de la lectina, ya que ambas de estas vías se han implicado en la lesión inducida por isquemia y reperfusión en muchos modelos animales. [Castellano y col., "Therapeutic targeting of classical and lectin pathways of complement protects from ischemia-reperfusion-induced renal damage". Am J Pathol. 2010; 176 (4): 1648-59; Lee y col., "Early complement factors in the local tissue immunocomplex generated during intestinal ischemia/reperfusion injury". Mol. Immunol. febrero de 2010; 47 (5): 972-81; Tjernberg, y col., "Acute antibody-mediated complement activation mediates lysis of pancreatic islets cells and may cause tissue loss in clinical islet transplantation". Transplantation.

2008; 27 de abril; 85 (8): 1193-9; Zhang y col., "The role of natural IgM in myocardial ischemia-reperfusion injury". J Mol Cell Cardiol. julio de 2006; 41 (1): 62-7). La vía alternativa es esencial para la vigilancia inmunitaria contra patógenos invasores y los seres humanos con defectos en la vía alternativa padecen infecciones bacterianas graves. Al unirse a e inactivar C1q y MBL, los compuestos peptídicos pueden regular eficientemente la activación de la vía clásica y de la lectina mientras dejan intacta la vía alternativa.

El término "regular", como se usa en el presente documento, se refiere a i) controlar, reducir, inhibir o regular la función biológica de una enzima, proteína, péptido, factor, producto secundario o derivado de los mismos, ya sea individualmente o en complejos; ii) reducir la cantidad de una proteína biológica, péptido o derivado de los mismos, ya sea in vivo o in vitro; o iii) interrumpir una cadena biológica de acontecimientos, cascada o vía que se sabe que comprende una serie relacionada de reacciones biológicas o químicas. Por tanto, se puede usar el término "regular", por ejemplo, para describir la reducción de la cantidad de un solo componente de la cascada del complemento en comparación con una muestra de control, la reducción de la velocidad o la cantidad total de formación de un componente o complejo de componentes o la reducción de la actividad general de un proceso complejo o una serie de reacciones biológicas, lo que conduce a resultados tales como la lisis celular, formación de enzimas convertasa, formación de complejos de ataque a la membrana derivados del complemento, inflamación o enfermedad inflamatoria. En un ensayo in vitro, el término "regular" puede referirse al cambio medible o la reducción de algún acontecimiento biológico o químico, pero el experto en la materia apreciará que no es necesario que el cambio o la reducción medible sea total para ser "regulador".

En uno o más aspectos, los compuestos peptídicos desvelados pueden usarse para tratar una enfermedad inflamatoria. En una o más realizaciones, los compuestos peptídicos desvelados pueden usarse para tratar una enfermedad autoinmunitaria. En una o más realizaciones, los compuestos peptídicos desvelados se pueden usar para tratar reacciones de transfusión hemolítica, enfermedad por crioaglutininas, enfermedades por inmunocomplejos (p. ej. enfermedad del suero), talasemia, anemia drepanocítica, incompatibilidad AB0 (p. ej., ictericia neonatal), rechazo agudo/hiperagudo de trasplante de órganos sólidos, isquemia caliente/fría por trasplante de órganos sólidos, reacción inflamatoria instantánea mediada por sangre (IBMIR), lupus eritematoso sistémico (LES), artritis reumatoide, lesión por isquemia y reperfusión, infarto de miocardio, ictus, encefalopatía isquémica hipóxica (p. ej., lesión cerebral por asfixia perinatal), lesión traumática cerebral, cirugía de derivación de la arteria coronaria, fibrosis quística, cicatrización de heridas, cáncer, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, hemoglobinuria paroxística nocturna (HPN), síndrome urémico hemolítico atípico (SHUa), asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), enfermedad de Crohn, síndrome séptico/SDRA/SIRS, glomerulonefritis (p. ej., nefritis lúpica, enfermedad antimembrana basal glomerular, glomerulonefritis membranoproliferativa inducida por autoanticuerpos citoplásmicos antineutrófilos (p. ej., enfermedad de depósitos densos), nefropatía membranosa), nefropatía por IgA o glomerulopatía por C3.

Reacción transfusional hemolítica intravascular aguda (RTHIA) mediada por el complemento

La reacción transfusional hemolítica intravascular aguda ("RTA", "RTHA" o "RTHIA") es un tipo de reacción transfusional que se asocia con hemólisis. La RTHIA puede dar lugar a lisis mediada por el complemento y rápida destrucción de los glóbulos rojos del donante. Las RTHIA tienen una presentación clínica amplia desde signos y síntomas leves y transitorios hasta casos graves de choque, coagulación intravascular diseminada, insuficiencia renal y muerte.

La Cruz Roja estadounidense estima que cada año se transfunden 30 millones de componentes sanguíneos en los Estados Unidos (EE. UU.) [Barbee I. Whitaker PSH, PhD, The 2011 National Blood Collection and Utilization Survey Report; 2011]. Aproximadamente 70000 pacientes estadounidenses que viven con anemia drepanocítica y 1,6 millones de personas a las que se ha diagnosticado cáncer necesitan transfusiones de sangre de forma rutinaria como parte del tratamiento de su enfermedad. Las transfusiones de sangre salvan vidas, pero conllevan el riesgo de diversas reacciones, algunas de las cuales son potencialmente mortales, tales como las reacciones transfusionales hemolíticas intravasculares agudas (RTHIA) (Murphy MF, Waters JH, Wood EM, Yazer MH. "Transfusing blood safely and appropriately". BMJ. 2013; 347: f4303]. Se estima que la RTHIA ocurre en una quinta parte de las transfusiones totales (Refaai Ma , Blumberg N. "The transfusion dilemma--weighing the known and newly proposed risks of blood transfusions against the uncertain benefits". Best practice & research Clinical anaesthesiology. 2013; 27 (1): 17-35). Los individuos que reciben transfusiones de sangre frecuentes desarrollarán aloanticuerpos y autoanticuerpos contra los antígenos de los glóbulos rojos (RBC) con el tiempo, lo que hace que la compatibilidad sea cada vez más difícil y, por tanto, aumenta el riesgo de RTHIA (Aygun B, Padmanabhan S, Paley C, Chandrasekaran V. "Clinical significance of RBC alloantibodies and autoantibodies in sickle cell patients who received transfusions". Transfusion. 2002; 42 (1): 37-43]. Las medidas preventivas actuales para transfusión incluyen 'determinación del grupo sanguíneo', 'detección de anticuerpos' así como 'pruebas cruzadas' y, aunque estas medidas han hecho que las transfusiones sean más seguras que nunca, todavía se producen reacciones transfusionales (Osterman JL, Arora S. "Blood product transfusions and reactions". Emergency medicine clinics of North America. 2014; 32 (3): 727-738]. La RTHIA se produce cuando los anticuerpos del huésped se unen a los eritrocitos transfundidos iniciando la activación de la vía clásica del complemento que conduce a la generación de los mediadores inflamatorios C3a y C5a, así como así como opsonización de C3b y hemólisis de las células transfundidas a través del complejo de ataque a la membrana (CAM) (Stowell SR, Winkler AM, Maier CL, y col., "Initiation and regulation of complement during hemolytic transfusion reactions". Clinical & developmental immunology. 2012; 2012: 307093]. Aunque la función del complemento en RTHIA está bien reconocida, hasta la fecha, solo se ha informado de un caso que describe la intervención clínica de una RTHIA mediante la inhibición de la generación de las anafilotoxinas del complemento C3a y C5a [Weinstock C, Mohle R, Dorn C, y col., "Successful use of eculizumab for treatment of an acute hemolytic reaction after ABO-incompatible red blood cell transfusion". Transfusion. 2015; 55 (3): 605-610].

La vía clásica del complemento actúa como una cascada de amplificación después de la activación inicial del complejo C1 del complemento por los anticuerpos (Frank MM AJ ed Complement system. en: Austen KF, Atkinson JP, Cantor HI ed. Samter's Immunologic Disease. Nueva York: Lippincott Williams y Wilkins; 2001]. El complejo C1 consiste en la molécula de reconocimiento de patrones C1q y el tetrámero de serina proteasa C1r-C1s-C1s-C1r. Tras la unión de C1q a IgM o anticuerpos IgG agrupados, C1q experimenta un cambio conformacional para activar C1 r-C1s-C1s-C1r e iniciar la activación del complemento mediada por la vía clásica. El inhibidor peptídico del complemento C1 (PIC1) descrito en el presente documento es un inhibidor peptídico de la vía clásica del complemento (Mauriello CT, Pallera HK, Sharp JA, y col., "A novel peptide inhibitor of classical and lectin complement activation including ABO incompatibility". Mol Immunol. 2013; 53 (1-2): 132-139; Sharp JA, Whitley PH, Cunnion KM, Krishna NK. "Peptide inhibitor of complement C1, a novel suppressor of classical pathway activation: mechanistic studies and clinical potential". FrontImmunol. 2014; 5: 406; Gronemus JQ, Hair pS, Crawford KB, Nyalwidhe JO, Cunnion KM, Krishna NK. "Potent inhibition of the classical pathway of complement by a novel C1q-binding peptide derived from the human astrovirus coat protein". Mol Immunol. 2010; 48 (1-3): 305-313). PIC1 inhibe la activación de C1 iniciada por anticuerpos al unirse a C1q y evitar la activación de C1r-C1s-C1s-C1r12. También se ha mostrado que PIC1 inhibe la hemólisis con incompatibilidad AB0 mediada por la vía del complemento clásica de eritrocitos humanos in vitro (Mauriello CT, Pallera HK, Sharp JA, y col., "A novel peptide inhibitor of classical and lectin complement activation including ABO incompatibility". Mol Immunol. 2013; 53 (1-2): 132-139; Sharp JA, Whitley PH, Cunnion KM, Krishna NK. "Peptide inhibitor of complement C1, a novel suppressor of classical pathway activation: mechanistic studies and clinical potential". FrontImmunol2014; 5: 406; Shah TA, Mauriello CT, Hair PS, y col., "Complement inhibition significantly decreases red blood cell lysis in a rat model of acute intravascular hemolysis". Transfusion. 2014). Cuando la versión conjugada con polietilenglicol (PEG) acuoso del PIC1, PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21), descrito en el presente documento, se administra por vía intravascular a ratas, puede lograr una inhibición sistémica superior al 90 % de los niveles de complemento sérico del animal en 30 segundos (Sharp JA, Whitley PH, Cunnion KM, Krishna NK. "Peptide inhibitor of complement C1, a novel suppressor of classical pathway activation: mechanistic studies and clinical potential". Front Immunol. 2014; 5: 406]. La capacidad de PIC 1 para inhibir la activación del complemento lo convierte en una molécula ideal para bloquear la hemólisis rápida mediada por el complemento que caracteriza a la RTHIA.

Se estableció un modelo de enfermedad de RTHIA en ratas basado en la xenotransfusión de glóbulos rojos humanos (Shah TA, Mauriello CT, Hair PS, y col., "Complement inhibition significantly decreases red blood cell lysis in a rat model of acute intravascular hemolysis". Transfusion. 2014]. Las ratas Wistar tienen hemaglutininas naturales en su suero que se unirán a eritrocitos A^b humanos (Shah y col.; Aptekman PM, Bogden AE. "Characterization of the natural hemagglutinins in normal rat serum associated with a negative phase following tumor implantation". Cancer Research. 1956; 16 (3): 216-221). Tras la transfusión de eritrocitos humanos, producirán una hemólisis rápida similar a la incompatibilidad AB0 a través de la activación de la vía clásica del complemento iniciada por anticuerpos (Yazdanbakhsh K, Kang S, Tamasauskas D, Sung D, Scaradavou A. "Complement receptor 1 inhibitors for prevention of immune-mediated red cell destruction: potential use in transfusion therapy". Blood. 2003; 101 (12): 5046-5052]. Los péptidos PIC1, incluyendo PA (SEQ ID NO: 3) y PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21), pueden bloquear la lisis mediada por el complemento de glóbulos rojos (RBC) humanos AB mediante suero 0 in vitro. Este ensayo imita la incompatibilidad AB0. PA-dPEG24 tiene eficacia en un modelo de roedor de RTHIA que demuestra la inhibición de la lisis de glóbulos rojos humanos en un escenario de prevención y rescate. Por tanto, los péptidos PIC1 se pueden usar en el tratamiento de reacciones transfusionales en seres humanos para las que no existe una terapia actual. La organización actual de bancos de sangre o la práctica de la medicina transfusional no tienen un procedimiento para evaluar directamente el riesgo de lisis de glóbulos rojos mediada por el complemento entre el donante y el receptor. Los compuestos peptídicos desvelados se pueden usar como herramienta de diagnóstico. Los compuestos peptídicos desvelados también se pueden usar como tratamiento profiláctico para prevenir RTHIA o como tratamiento de rescate durante una RTHIA que tiene implicaciones clínicas significativas. Los compuestos peptídicos desvelados pueden prevenir las altas concentraciones de hemoglobina libre que causan daño renal agudo en RTHIA. En la actualidad, no existen terapias para las RTA distintas de los cuidados complementarios.

Los compuestos peptídicos desvelados pueden usarse para detectar la lisis de glóbulos rojos mediada por el complemento y, por tanto, son ideales para diferenciar si una transfusión de eritrocitos puede causar RTHIA. Los compuestos peptídicos desvelados se pueden usar para predecir RTHIA.

En el presente documento se desvela un procedimiento para tratar una reacción transfusional aguda que comprende administrar a un sujeto una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un péptido sintético que comprende la secuencia de aminoácidos y las modificaciones seleccionadas de las SEQ ID NO: 3-47. En una o más realizaciones, la composición farmacéutica se administra antes de que se administre al sujeto una transfusión de sangre. En una o más realizaciones, la composición farmacéutica se administra después de que se administre al sujeto una transfusión de sangre. En una o más realizaciones, la composición farmacéutica se administra antes y después de que se administre al sujeto una transfusión de sangre.

Efectores del complemento en la fibrosis quística (FQ)

En la fibrosis quística (FQ), se cree que el daño pulmonar está mediado por un ciclo de obstrucción, infección e inflamación. Se ha determinado que los efectores del complemento están elevados en los líquidos pulmonares de los pacientes con FQ en comparación con los controles normales.

La fibrosis quística (FQ) afecta a 30000 personas en los Estados Unidos (Boyle MP "Adult cystic fibrosis". JAMA 2007; 298 (15): 1787-93) causando la insuficiencia respiratoria la mayoría de las muertes. La destrucción progresiva del parénquima pulmonar está mediada por un ciclo de obstrucción, infección por patógenos bacterianos e inflamación (Rowe SM, Miller S, Sorscher EJ, "Cystic fibrosis". N Engl J Med 2005; 352 (19): 1992-2001). A medida que el ciclo se repite, hay una progresión desde el daño pulmonar hasta la cicatrización pulmonar y finalmente la insuficiencia pulmonar (Gibson RL, Burns JL, Ramsey BW. "Pathophysiology and management of pulmonary infections in cystic fibrosis". Am JRespir Crit Care Med 2003; 168 (8): 918-51].

La cascada inflamatoria más destructiva del cuerpo humano es el sistema del complemento, que contribuye al daño del tejido del huésped en numerosos procesos patológicos inflamatorios (Ricklin D, Lambris JD. "Complementtargeted therapeutics". Nat Biotechnol 2007; 25 (11): 1265-75). Pruebas recientes han mostrado que las proteínas del complemento son constituyentes principales del líquido pulmonar en pacientes con FQ y en seres humanos normales, en las que C3 y C4 representan dos de las cuatro proteínas más prevalentes (Gharib SA, Vaisar T, Aitken ML, y col., "Mapping the lung proteome in cystic fibrosis". J Proteome Res 2009; 8 (6): 3020-8). Esto sugiere que el complemento puede desempeñar una función mucho más importante en la inflamación pulmonar por FQ de lo que se sospechaba anteriormente. La unión de anticuerpos a bacterias puede activar la vía clásica del complemento a través del componente iniciador C1 (FIG. 9). C4 es un componente en cascada de la vía clásica (es decir, iniciada por anticuerpos) que conduce a la formación de la opsonina C4b y la activación corriente abajo de C3 (Lambris JD, Sahu A, Wetsel RA. "The chemistry and biology of C3, C4, and C5". en: Volanakis JE, Frank MM, (eds). The human complement system in health and disease. Nueva York: Marcel Dekker; 1998, 83-118). C3 es el componente central del complemento, que tras la activación genera el efector del complemento C3a y une covalentemente las células con los fragmentos opsónicos C3b e iC3b. C3b inicia a continuación la activación de C5, generando la anafilotoxina extremadamente potente C5a. El C5a se encuentra entre los estimulantes más potentes para la migración y activación de neutrófilos, que conduce al estallido oxidativo y la desgranulación (Lambris JD, Sahu A, Wetsel RA. "The chemistry and biology of C3, C4, and C5". en: Volanakis JE, Frank MM, (eds). The human complement system in health and disease. Nueva York: Marcel Dekker; 1998, 83-118; Tralau T, Meyer-Hoffert U, Schroder JM, y col., "Human leukocyte elastase and cathepsin G are specific inhibitors of C5a-dependent neutrophil enzyme release and chemotaxis". Exp Dermatol 2004; 13 (5): 316-25). La muerte de neutrófilos, que sigue a la desgranulación, es una fuente importante de ADN viscoso que contribuye a la obstrucción de las vías respiratorias en el pulmón con FQ (Dwyer M, Shan Q, D'Ortona S, y col., "Cystic Fibrosis Sputum DNA Has NETosis Characteristics and Neutrophil Extracellular Trap Release Is Regulated by Macrophage Migration-Inhibitory Factor". J Innate Immun 2014; Hodson ME. "Aerosolized dornase alfa (rhDNase) for therapy of cystic fibrosis". Am J Respir Crit Care Med 1995; 151 (3 Pt 2): S70-4]. Entre los productos de gránulos de neutrófilos liberados se encuentra la elastasa de neutrófilos, que es uno de los principales contribuyentes al daño pulmonar parenquimatoso en la FQ (Gifford AM, Chalmers JD. "The role of neutrophils in cystic fibrosis". Curr Opin Hematol 2014; 21 (1): 16-22; Le Gars M, Descamps D, Roussel D, y col., "Neutrophil elastase degrades cystic fibrosis transmembrane conductance regulator via calpains and disables channel function in vitro and in vivo". Am J Respir Crit Care Med 2013; 187 (2): 170-9; Sagel SD, Wagner BD, Anthony MM, y col., "Sputum biomarkers of inflammation and lung function decline in children with cystic fibrosis". Am J Respir Crit Care Med 2012; 186 (9): 857-65]. Por tanto, la activación del complemento puede desempeñar una función significativa en el reclutamiento y la activación de neutrófilos en los pulmones con FQ, que contribuye al daño tisular. Las propiedades adicionales de C5a que también pueden contribuir a la enfermedad pulmonar por FQ son la estimulación de la liberación de histamina, mejora de la permeabilidad vascular e inducción de la contracción del músculo liso (Lambris JD, Sahu A, Wetsel RA. "The chemistry and biology of C3, C4, and C5". en: Volanakis JE, Frank MM, (eds). The human complement system in health and disease. Nueva York: Marcel Dekker; 1998, 83-11]. Las propiedades inflamatorias conocidas de C5a son compatibles con las pruebas cada vez más abundantes de la función de C5a en las enfermedades pulmonares inflamatorias (Schmudde I, Strover HA, Vollbrandt T, y col., "C5a receptor signalling in dendritic cells controls the development of maladaptive Th2 and Th17 immunity in experimental allergic asthma". Mucosal Immunol 2013; 6 (4): 807-25; Bosmann M, Ward PA. "Role of C3, C5 and anaphylatoxin receptors in acute lung injury and in sepsis". Adv Exp Med Biol 2012; 946: 147-59], incluyendo la lesión pulmonar aguda. Por tanto, aunque sin quedar limitados por teoría alguna, múltiples líneas de razonamiento sugieren que la inflamación mediada por el complemento puede ser un contribuyente importante del daño pulmonar inflamatorio en la FQ.

Se ha realizado alguna investigación acerca de la función potencialmente importante de C5a en el pulmón con FQ. En 1986, Fick y col., describieron la presencia de cantidades mayores de C5a, medidas por radioinmunoensayo en el lavado broncoalveolar (LBA) de nueve pacientes con FQ con enfermedad pulmonar clínicamente estable en comparación con LBA de controles sanos. (Fick RB, Jr., Robbins RA, Squier SU, y col., "Complement activation in cystic fibrosis respiratory fluids: in vivo and in vitro generation of C5a and chemotactic activity". Pediatr Res 1986; 20 (12): 1258-68). Los líquidos de LBA de FQ fueron quimiotácticos para los neutrófilos, lo que parecía correlacionarse con las concentraciones de C5a. Los líquidos de LBA mostraron pruebas de activación previa del complemento por la presencia de C3c, ensayado mediante inmunoelectroforesis cruzada. Se observó que dos pacientes con FQ con las medidas más bajas de C5a tenían medidas normales de FEV1 y FVC, lo que sugiere una posible asociación con el daño pulmonar. Sin embargo, no se realizaron después más estudios para probar si las concentraciones de C5a en el líquido pulmonar de la FQ se correlacionan con los agravamientos pulmonares agudos o con la progresión de la enfermedad pulmonar crónica en FQ.

Aunque sin quedar limitados por mecanismo alguno, los compuestos peptídicos desvelados pueden regular selectivamente la activación de C1q y MBL sin afectar a la actividad de la vía alternativa y son, por tanto, ideales para el tratamiento de la fibrosis quística. En una o más realizaciones, los compuestos peptídicos desvelados pueden usarse para tratar la fibrosis quística. En una o más realizaciones, los compuestos peptídicos desvelados pueden usarse como agentes antiinflamatorios y antimicrobianos. En una o más realizaciones, los compuestos peptídicos desvelados pueden usarse para tratar la fibrosis quística administrando el péptido o péptidos mediante nebulización directamente en el pulmón. En una o más realizaciones, la administración del compuesto o compuestos peptídicos desvelados mediante nebulización mitiga la destrucción pulmonar provocada por la fibrosis quística. Los compuestos peptídicos desvelados tienen un beneficio clínico para los pacientes con FQ al retrasar la progresión del daño pulmonar, lo que conduce a una mayor esperanza de vida y calidad de vida.

En determinados aspectos, la invención proporciona el péptido sintético o composiciones farmacéuticas del primer, segundo o tercer aspecto de la invención para su uso en un procedimiento de tratamiento de la fibrosis quística en un sujeto que comprende administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del péptido sintético.

Modulación de la interacción de C1q con receptores de C1q

Las interacciones de C1q con los receptores de C1q parecen desempeñar funciones importantes en funciones homeostáticas tales como la captura de residuos celulares apoptóticos e inmunocomplejos, así como la señalización de linfocitos T a través de células presentadoras de antígenos (macrófagos y células dendríticas). En la actualidad, ningún agente farmacológico clínico modula la interacción de C1q con los receptores de C1q.

Los compuestos peptídicos desvelados se pueden usar para bloquear la unión de C1q a los receptores de C1q, incluyendo calreticulina/cC1qR. La capacidad de los compuestos peptídicos desvelados para bloquear la unión de C1q a los receptores celulares puede tener una función importante en la modulación de los procesos de señalización intracelular mediados por la unión de C1q a los receptores de C1q. Los compuestos peptídicos desvelados se pueden usar para regular la respuesta del complemento en procesos patológicos tales como el lupus eritematoso sistémico y el cáncer.

Daño cerebral en la asfixia perinatal

La activación del complemento es fundamental en el desarrollo de lesiones por isquemia y reperfusión tales como la encefalopatía hipóxica isquémica (EHI) neonatal. La hipotermia terapéutica (HT) ofrece solo una reducción del 11 % en la muerte o la discapacidad. Los datos in vitro publicados han mostrado que la HT aumenta paradójicamente la activación del complemento proinflamatorio, limitando potencialmente su beneficio.

Los péptidos PIC1 pueden reducir los volúmenes de infarto cerebral sin un agotamiento prolongado del complemento sistémico. Los péptidos PIC1 pueden ser un complemento útil de la HT para mejorar los resultados neurológicos en la EHI.

Los compuestos peptídicos desvelados pueden usarse para prevenir el daño cerebral por asfixia perinatal. Los compuestos peptídicos desvelados también se pueden usar para prevenir la lesión por isquemia y reperfusión (LIR) en enfermedades tales como infarto de miocardio, cirugía de derivación de la arteria coronaria, ictus, etc. Los compuestos peptídicos desvelados también se pueden usar para prevenir el rechazo de trasplantes de órganos sólidos hiperagudo y agudo, que son acontecimientos mediados por la vía clásica del complemento.

En determinados aspectos, la invención proporciona el péptido sintético o la composición farmacéutica del primer, segundo o tercer aspecto de la invención para su uso en un procedimiento de tratamiento de la asfixia perinatal en un sujeto que comprende administrar al sujeto una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del péptido sintético. En algunas realizaciones, el sujeto se trata además mediante hipotermia terapéutica.

En determinados aspectos, la invención proporciona el péptido sintético o la composición farmacéutica del primer, segundo o tercer aspecto de la invención para su uso en un procedimiento de tratamiento de la encefalopatía hipóxica isquémica en un sujeto que comprende administrar al sujeto una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un péptido sintético. En algunas realizaciones, el sujeto se trata además mediante hipotermia terapéutica.

Actividad mieloperoxidasa (MPO)

La mieloperoxidasa (MPO) es una enzima de los neutrófilos que crea hipoclorito (lejía) en la inflamación aguda y daña tanto las células invasoras como las del huésped. Se sabe que esta enzima es destructiva para los tejidos del huésped en la fibrosis quística (FQ) y la encefalopatía hipóxica isquémica (EHI).

En algunas realizaciones, PIC1 bloqueó la actividad enzimática de MPO en el esputo de pacientes con fibrosis quística. En algunas realizaciones, PIC1 bloqueó la actividad enzimática en el tejido cerebral de los pacientes con EHI. En algunas realizaciones, La actividad de MPO presente en los lisados de neutrófilos humanos purificados puede inhibirse directamente mediante PIC1. En algunas realizaciones, la invención demuestra que PIC1 tiene actividad antiinflamatoria contra la fibrosis quística y la EHI.

Anemia hemolítica autoinmunitaria

La presente divulgación proporciona compuestos peptídicos capaces de tratar la anemia hemolítica autoinmunitaria. La anemia hemolítica autoinmunitaria es un grupo de trastornos caracterizados por un mal funcionamiento del sistema inmunitario que produce autoanticuerpos, que atacan a los glóbulos rojos como si fueran sustancias extrañas al organismo. La anemia hemolítica autoinmunitaria puede caracterizarse por uno o más de los niveles elevados de bilirrubina sérica, exceso de urobilinógeno urinario, reducción de la haptoglobina plasmática, aumento de la deshidrogenasa láctica (LDH) sérica, hemosiderinuria, metahemalbuminemia, esferocitosis, reticulocitosis y/o hiperplasia eritroide de la médula ósea. La invención proporciona un péptido sintético o la composición farmacéutica del primer, segundo o tercer aspecto de la invención para su uso en un procedimiento de tratamiento de la anemia hemolítica autoinmunitaria en un sujeto que comprende administrar al sujeto una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del péptido sintético.

Formulación y administración farmacéutica

La presente divulgación proporciona composiciones farmacéuticas capaces de regular el sistema del complemento, que comprenden al menos un compuesto peptídico, como se ha analizado anteriormente, y al menos un vehículo, diluyente, estabilizador o excipiente farmacéuticamente aceptable. Los vehículos, excipientes o estabilizadores farmacéuticamente aceptables no son tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas. Pueden ser sólidos, semisólidos o líquidos. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden estar en forma de comprimidos, píldoras, polvos, pastillas para chupar, bolsitas, obleas, elixires, suspensiones, emulsiones, soluciones o jarabes.

Algunos ejemplos de vehículos, diluyentes, estabilizadores o excipientes farmacéuticamente aceptables incluyen: lactosa, dextrosa, sacarosa, sorbitol, manitol, almidones, goma arábiga, fosfato cálcico, alginatos, tragacanto, gelatina, silicato cálcico, celulosa microcristalina, polivinilpirrolidona, celulosa, agua estéril, jarabe y metilcelulosa. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden formular usando procedimientos conocidos en la técnica para proporcionar liberación rápida, normal o sostenida o retardada del principio activo.

La divulgación se refiere a un procedimiento para regular el sistema del complemento en un sujeto que comprende administrar a un sujeto las composiciones descritas anteriormente. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se preparan mezclando el compuesto peptídico que tiene el grado apropiado de pureza con vehículos, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables. Se conocen bien en la técnica ejemplos de formulaciones y procedimientos para preparar dichas formulaciones. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención son útiles como agente profiláctico y terapéutico para diversos trastornos y enfermedades, como se ha expuesto anteriormente. En una realización, la composición comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto peptídico. En otra realización, la composición comprende al menos otro principio activo eficaz en el tratamiento de al menos una enfermedad asociada con el daño tisular mediado por el complemento. La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz", como se usa en el presente documento, se refiere a la cantidad total de cada componente activo que es suficiente para mostrar un beneficio al sujeto.

La cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto peptídico varía dependiendo de varios factores, tales como la afección que se trate, la gravedad de la afección, el momento de administración, la vía de administración, la tasa de excreción del compuesto empleado, la duración del tratamiento, la coterapia implicada, y la edad, el sexo, el peso y el estado del sujeto, etc. Un experto habitual en la materia puede determinar la cantidad terapéuticamente eficaz. Por consiguiente, un experto habitual en la materia puede necesitar valorar la dosis y modificar la vía de administración para obtener el efecto terapéutico máximo.

La dosis diaria eficaz generalmente está dentro del intervalo de aproximadamente 0,001 a aproximadamente 200 miligramos por kilogramo (mg/kg) de peso corporal, preferentemente de aproximadamente 80 a aproximadamente 160 mg/kg, más preferentemente de aproximadamente 0,1 a aproximadamente 20 mg/kg. Esta dosis se puede lograr mediante un régimen de dosificación de 1 a 6 veces al día. Como alternativa, se puede lograr un tratamiento óptimo mediante una formulación de liberación sostenida con un régimen de dosificación menos frecuente.

Las formulaciones farmacéuticas pueden adaptarse para su administración por cualquier vía adecuada, por ejemplo, por la vía oral, nasal, tópica (incluyendo bucal, sublingual o transdérmica) o parenteral (incluyendo inyecciones o infusiones subcutáneas, intracutáneas, intramusculares, intraarticulares, intraperitoneales, intrasinoviales, intraesternales, intratecales, intralesionales, intravenosas o intradérmicas). Para la administración a seres humanos, las formulaciones cumplen preferentemente las normas de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y pureza, según lo requieran las oficinas de la Administración de Alimentos y Fármacos (FDA).

Terapias de combinación

En el presente documento se desvela un procedimiento para prevenir o tratar una enfermedad asociada con daño tisular mediado por el complemento, que comprende administrar a un sujeto una composición farmacéutica desvelada en el presente documento. Aunque las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar como el único agente farmacéutico activo, también se pueden usar en combinación con uno o más agentes terapéuticos o profilácticos que sean eficaces para prevenir o tratar la enfermedad. En este aspecto, el procedimiento comprende administrar una composición farmacéutica antes, simultáneamente y/o después de uno o más agentes terapéuticos o profilácticos adicionales eficaces en el tratamiento de al menos una enfermedad asociada con daño tisular mediado por el complemento.

Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden usar para tratar la asfixia cerebral o la encefalopatía isquémica hipóxica, ya sea solas o en combinación con hipotermia terapéutica.

Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden usar para tratar la artritis reumatoide, ya sea solas o en combinación con un agente antiinflamatorio no esteroideo (AINE), un corticoesteroide o un fármaco antirreumático modificador de la enfermedad (FARME).

Algunos ejemplos de AINE incluyen: salicilatos (tales como aspirina, amoxiprina, benorilato, salicilato de magnesio y colina, diflunisal, faislamina, salicilato de metilo, salicilato de magnesio y salicilato de salicilo (salsalato)), ácidos arilalcanoicos (tales como diclofenaco, aceclofenaco, acemetacina, bromfenaco, etodolaco, indometacina, ketorolaco, nabumetona, sulindaco y tolmeti), ácidos 2-arilpropiónicos (tales como ibuprofeno, carprofeno, fenbufeno, fenoprofeno, flurbiprofeno, ketoprofeno, loxoprofeno, naproxeno, ácido tiaprofénico y suprofeno), ácidos N-arilantranílicos (tales como ácido mefenámico y ácido meclofenámico), derivados de pirazolidina (tales como fenilbutazona, azapropazona, metamizol, oxifenbutazona y sulfinprazona), oxicámicos (tales como piroxicam, lornoxicam, meloxicam y tenoxicam), inhibidores de COX-2 (tales como etoricoxib, lumiracoxib y parecoxib), sulfonanilidas tales como nimesulida y otros tales como licofelona y ácidos grasos omega-3.

Los ejemplos de corticoesteroides incluyen: triamcinolona (Aristocort®), cortisona (comprimidos de acetato de Cortone®), dexametasona (elixir Decadron®), prednisona (Deltasone®) y metilprednisolona (Medrol®).

Los ejemplos de FARME incluyen: metotrexato (Rheumatrex®), leflunomida (Arava®), etanercept (Enbrel®), infliximab (Remicade®), adalimumab (Humira®), anakinra (Kineret®), sulfasalazina (Azulfidine EN-Tabs®), antipalúdicos, sales de oro, d-penicilamina, ciclosporina A, ciclofosfamida y azatioprina.

Soliris™ (eculizumab) es un anticuerpo monoclonal humanizado anti-C5. Ha sido aprobado por la FDA para el tratamiento de la forma poco común de anemia hemolítica, hemoglobinuria paroxística nocturna. En una realización, las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden usar en combinación con Soliris™ en el tratamiento de la hemoglobinuria paroxística nocturna, síndrome urémico hemolítico atípico, cardiopatía, neumopatías, enfermedades autoinmunitarias, asma, así como la atención complementaria de trasplantes.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar con agente o agentes adicionales en terapia de combinación, ya sea de forma conjunta o por separado, o combinando las composiciones farmacéuticas y el agente o agentes adicionales en una composición. La dosis se administra y ajusta para lograr el máximo control de las afecciones. Por ejemplo, tanto las composiciones farmacéuticas como el agente o agentes adicionales normalmente están presentes a niveles de dosis de entre aproximadamente el 10 % y aproximadamente el 150%, más preferentemente, entre aproximadamente el 10% y aproximadamente el 80%, de la dosis administrada normalmente en un régimen de monoterapia.

Ejemplos

La invención se ilustra además mediante los siguientes ejemplos, proporcionado solo con fines ilustrativos. No deben interpretarse como limitantes del ámbito o contenido de la invención de ninguna manera.

Ejemplo 1: Ensayo de solubilidad y hemolítico de péptidos de sustitución de sarcosina (SAR)

Procedimientos: Ensayo hemolítico.

Los péptidos se diluyeron a 0,77 mM en sueros humanos empobrecidos en factor B (Complement Technologies, Inc.) y se incubaron durante 1 hora a 37 °C. Estos péptidos se diluyeron después con GVBS++ para igualar el suero al 2,5%, de los que se combinaron 0,25 ml con 0,4 ml de GVBS++ y 0,1 ml de glóbulos rojos (RBC) de oveja sensibilizados y se incubaron de nuevo durante 1 hora a 37 °C. El procedimiento se detuvo mediante la adición de 4,0 ml de GVBS", se centrifugó durante 5 minutos a 1620 xg y se leyó la absorbancia de los sobrenadantes a 412 nm en un espectrofotómetro. El porcentaje de lisis de cada muestra se normalizó con respecto al del control de solo suero.

Resultados: Solubilidad de péptidos sustituidos con sarcosina

La TABLA 5 muestra la solubilidad y el ensayo hemolítico en suero empobrecido en factor B de péptidos de sustitución de sarcosina (Sar). La concentración final de péptido en suero empobrecido en factor B fue de 0,77 mM. Cada péptido se evaluó por triplicado y se informa de los valores medios. Los péptidos no solubles en agua se resuspendieron en DMSO. En el ensayo hemolítico, los péptidos solubles están normalizados con respecto a agua y los péptidos insolubles están normalizados con respecto a DMSO.

TABLA 5

Nombre del péptido y Secuencia de aminoácidos

controles peptídicos______________ ^{SEQ ID NO} Solubilidad en

_{agua_______} Hemólisis (%) Agua - - 100,00 GVBS++ - - 1,31

DMSO - - 95,13

PA IALILEPICCQERAA SEQ ID NO 3 No 3,15

PA-I1Sar (Sar)ALILEPICCQERAA SEQ ID NO 4 No 84,49

PA-A2Sar I (Sar) LILEPICCQERAA SEQ ID NO 5 Sí 37,72

PA-L3Sar IA (Sar) ILEPICCQERAA SEQ ID NO 6 Sí 87,36

PA-I4Sar IAL (Sar) LEPICCQERAA SEQ ID NO 7 Sí 93,19

PA-L5Sar IALI (Sar) EPICCQERAA SEQ ID NO 8 Sí 85,13

PA-E6Sar IALIL (Sar) PICCQERAA SEQ ID NO 9 No 5,19

PA-P7Sar IALILE (Sar) ICCQERAA SEQ ID NO 10 Sí 3,01

PA-I8Sar IALILEP (Sar) CCQERAA SEQ ID NO 11 Sí 33,92

PA-C9Sar IALILEPI (Sar) CQERAA SEQ ID NO 12 Sí 5,63

(continuaciób)

Nombre del péptido y Secuencia de aminoácidos

controles peptídicos ^{SEQ ID NO} Solubilidad en

_agua Hemólisis (%) PA-C10Sar IALILEPIC (Sar) QERAA SEQ ID NO 13 No 56,18

PA-Q11Sar ALILEPICC (Sar) ERAA SEQ ID NO 14 No 3,02

PA-E12Sar IALILEPICCQ (Sar) RAA SEQ ID NO 15 No 105,72

PA-R13Sar IALILEPICCQE (Sar) AA SEQ ID NO 16 No 3,42

PA-A14Sar IALILEPICCQER (Sar) A SEQ ID NO 17 No 3,88

PA-A15Sar IALILEPICCQERA (Sar) SEQ ID NO 18 No 21,68

Los derivados peptídicos PA-P7Sar (SEQ ID NO: 10) y PA-C9Sar (SEQ ID NO: 12) fueron ambos hidrosolubles e inhibieron la actividad del complemento en el mismo grado que el péptido PA (SEQ ID NO: 3). En la FIG. 1 se muestra una inhibición dependiente de la dosis de la actividad del complemento tanto por PAP7Sar como por PA-C9Sar en un ensayo hemolítico.

Ejemplo 2 - Ensayo de solubilidad y hemolítico de péptidos de PA PEGilados.

Procedimientos: Ensayo hemolítico.

Los péptidos clasificadores polares se diluyeron en serie en sueros humanos empobrecidos en factor B sin diluir (Complement Technologies, Inc.) y se incubaron durante 1 hora a 37 °C. Se incluyeron agua, GVBS++ y DMSO como controles. A continuación, estos péptidos se diluyeron con GVBS++ para igualar para igualar el suero al 2,5 %, de los que se combinaron 0,25 ml con 0,4 ml de GVBS++ y 0,1 ml de glóbulos rojos (RBC) de oveja sensibilizados y se incubaron de nuevo durante 1 hora a 37 °C. El procedimiento se detuvo mediante la adición de 4,0 ml de GVBS", se centrifugó durante 5 minutos a 1620 xg y se leyó la absorbancia de los sobrenadantes a 412 nm en un espectrofotómetro. El porcentaje de lisis de cada muestra se normalizó con respecto al del control de solo suero. Inicialmente, PA se pegiló con 24 restos de PEG en el extremo N (dPEG24-PA, SEQ ID NO: 20), en el extremo C (PA-dPEG24, SEQ ID NO: 21) o tanto en el extremo N como en el extremo C (dPEG24-PA-dPEG24, SEQ ID NO: 19). Los tres péptidos PEGilados eran solubles en agua y mostraron grados variables de inhibición del complemento con PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) inhibiendo la activación del complemento en el mismo grado que PA (FIG. 2A). Como se muestra en la FIG. 2B, PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) inhibió la activación del complemento en el mismo grado que PA y presentó una respuesta a la dosis más amplia muy probablemente debido a su mayor solubilidad en solución acuosa. La estructura de PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) se muestra en la FIG. 3.

A continuación, se diseñaron derivados de PIC1 PEGilados con cantidades cada vez menores de restos de PEG en el extremo C. Como se muestra en la TABLA 6 a continuación, la mayoría de estos péptidos conservaron la solubilidad y la actividad inhibidora del complemento, demostrando PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) la mejor actividad inhibidora.

Resultados: Solubilidad de péptidos PEGilados

La TABLA 6 muestra la solubilidad y el ensayo hemolítico en suero empobrecido en factor B de péptidos PA PEGilados. La concentración final de péptido en suero empobrecido en factor B fue de 0,77 mM. Los péptidos no solubles en agua se resuspendieron en DMSO. En el ensayo hemolítico, los péptidos solubles estaban normalizados con respecto a agua y los péptidos insolubles estaban normalizados con respecto a DMSO.

TABLA 6

Nombre del

_péptido Secuencia peptídica SEQ ID NO Solubilidad en

_agua Hemólisis (%) Agua - 100,00

DMSO - 95,17

PA-dPEG24 IALILEPICCQERAA-dPEG24 21 Sí 2,99

PA-dPEG20 IALILEPICCQERAA-dPEG20 22 Sí 11,41

PA-dPEG16 IALILEPICCQERAA-dPEG16 23 Sí 12,04

PA-dPEG12 IALILEPICCQERAA-dPEG12 24 Sí 11,41

PA-dPEG08 IALILEPICCQERAA-dPEG08 25 Sí 34,66

PA-dPEG06 IALILEPICCQERAA-dPEG06 26 No 44,82

PA-dPEG04 IALILEPICCQERAA-dPEG04 27 Sí 12,36

PA-dPEG03 IALILEPICCQERAA-dPEG03 28 Sí 12,57

PA-dPEG02 IALILEPICCQERAA-dPEG02 29 Sí 11,62

Los datos in vivo en ratas demostraron que PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) inhibe la activación del complemento (medida por lisis de glóbulos rojos en un ensayo hemolítico) hasta en un 90 % en 30 segundos tras la inyección en ratas, observándose actividad inhibidora todavía hasta 4 horas (FIG. 20). Las dos dosis se proporcionaron por vía intravenosa (IV). Esto se comparó con el control de vehículo (solución salina normal) que muestra hemólisis máxima en todos los puntos temporales. PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) fue eficaz in vivo en NaCl al 0,9 % NaHPO410 mM, pero también funciona en solución salina y probablemente otras soluciones acuosas habituales (p. ej., lactato de Ringer, D5W, etc.) para infusión IV en seres humanos.

Ejemplo 3 - Ensayo de solubilidad y hemolítico de péptidos PEGilados y de sustitución de sarcosina (SAR) y/o alanina.

La tabla 7 muestra la solubilidad y el ensayo hemolítico en suero empobrecido en factor B de péptidos PEGilados y de sustitución de sarcosina (SAR). La concentración final de péptido en suero empobrecido en factor B fue de 0,77 mM. Los péptidos no solubles en agua se resuspendieron en DMSO. En el ensayo hemolítico, los péptidos solubles están normalizados con respecto a agua y los péptidos insolubles están normalizados con respecto a DMSO.

TABLA 7

Nombre del péptido y

_controles Secuencia peptídica SEQ ID NO Solubilidad en

_agua Hemólisis (%) Agua - - 100,00 DMSO - - 95,17 PA-dPEG24 IALILEPICCQERAA-dPEG24 21 Sí 2,99 PA-C9SarC10A IALILEPI (Sar) AQERAA 30 Sí 99,37 PA-C9SarD10 IALILEPI (Sar) QERAA 31 Sí 100,52 PA-P7SarC9Sar IALILE (Sar) I (Sar) CQERAA 32 Sí 82,72

PA-E6Sar-dPEG24 ^{IALIL (Sar) PICCQERAA-} _dPEG24 33 Sí 12,88

PA-Q11Sar-dPEG24 ^{IALILEPICC (Sar) ERAA-} _dPEG24 34 Sí 12,04

PA-R13Sar-dPEG24 ^{IALILEPICCQE (Sar) AA-} _dPEG24 35 Sí 4,26

PA-A14Sar-dPEG24 ^{IALILEPICCQER (Sar) A-} 36 Sí 3,68 _dPEG24

E6SarP7Sar IALIL (Sar) (Sar) ICCQERAA 37 Sí 3,57 E6SarC9Sar IALIL (Sar) PI (Sar) CQERAA 38 Sí 6,21 Q11SarP7Sar IALILE (Sar) ICC (Sar) ERAA 39 Sí 3,22 Q11SarC9Sar IALILEPI (Sar) C (Sar) ERAA 40 Sí 15,42 R13SarP7Sar IALILE (Sar) ICCQE (Sar) AA 41 No 26,35 R13SarC9Sar IALILEPI (Sar) CQE (Sar) AA 42 No 84,81 A14SarP7Sar IALILE (Sar) ICCQER (Sar) A 43 Sí 4,37 A14SarC9Sar IALILEPI (Sar) CQER (Sar) A 44 No 14,73 E6AE12A-dPEG24 IALILAPICCQARAA-dPEG24 45 Sí 4,95 E6AE12AC9Sar IALILAPI (Sar) CQARAA 46 No 2,99 E6AE12AP7Sar IALILA (Sar) ICCQARAA 47 Sí 4,60

Se realizaron cambios en el péptido PA en los que se sustituyeron múltiples aminoácidos con sarcosina y/o alanina. Algunos péptidos se combinaron adicionalmente con PEGilación. Múltiples péptidos conservaron el mismo nivel de actividad inhibidora y solubilidad que PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21), incluyendo, PA-R13Sar-dPEG24 (SEQ ID NO: 35), PA-A14SardPEG24 (SEQ ID NO: 36), E6SarP7Sar (SEQ ID NO: 37), Q11SarP7Sar (SEQ ID NO: 39), A14SarP7Sar (SEQ ID NO: 43), E6AE12A-dPEG24 (SEQ ID NO: 45) y E6AE12AP7Sar (SEQ ID NO: 47).

Ejemplo 4 - Concentración inhibidora mínima (CIM) para péptidos PIC1

Procedimientos: Ensayo de concentración inhibidora mínima (CIM).

Se realizó un ensayo de microdilución de concentración inhibidora mínima (CIM) en el que se añadieron cantidades crecientes de PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) o derivados de sarcosina (SEQ ID NO: 4-18, 30-47) a diversas bacterias que crecían en caldo de cultivo en una placa de microtitulación. A continuación, las placas se incubaron a 37 °C durante una noche y después se leyeron las placas en un espectrofotómetro a una absorbancia de DO600 nm para determinar la turbidez de la solución. La disminución de la turbidez es indicativa de la inhibición del crecimiento bacteriano.

Resultados

PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) pudo inhibir de forma dependiente de la dosis el crecimiento de Staphylococcus aureus en comparación con un control de solución salina (FIG. 4A) por encima de la concentración de 1 mM e inhibió el mismo patógeno de una manera similar al antibiótico vancomicina (FIG. 4B). PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) pudo inhibir Klebsiella pneumonía a >3 mg/ml de forma similar a la gentamicina (FIG. 4C) y también inhibir Pseudomonas aeruginosa (FIG. 4D) a >13 mg/ml. La actividad de PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) se comparó con 3 péptidos de sustitución de sarcosina hidrosolubles (PA L3Sar (SEQ ID NO: 6), P^a I4Sar (SEQ ID NO: 7) y PA L5Sar (S^e Q ID NO: 8)) contra Pseudomonas aeruginosa y se encontró que los 3 péptidos derivados de sarcosina inhibían de forma dependiente de la dosis esta especie de bacterias a >6 mg/ml (FIG. 4E). Estos resultados demuestran una propiedad antimicrobiana completamente novedosa de estos péptidos que no se ha señalado previamente que es completamente independiente de las propiedades supresoras del complemento de la familia de péptidos PIC1.

A continuación, se analizó si PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21), PA L3Sar (SEQ ID NO: 6), PA I4Sar (SEQ ID NO: 7) y PA L5Sar (SEQ ID NO: 8) podrían inhibir el crecimiento de Gardnerella, un cocobacilo anaerobio gramvariable que es una causa habitual de vaginosis bacteriana. Los 4 péptidos inhibieron el crecimiento de Gardnerella (FIG. 5). También se analizó si PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) podría inhibir la activación del complemento mediada por Gardnerella. En este ensayo se incubó suero humano normal con Gardnerella en presencia de cantidades crecientes de PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) durante 1 hora a temperatura ambiente. La activación del complemento se ensayó midiendo la producción de C5a usando metodología de ELISA. Cantidades crecientes de PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) inhibieron la formación de C5a (FIG. 6). Estos resultados sugieren que los péptidos PIC1 (p. ej., las SEQ ID NO: 3-47) podrían administrarse localmente en la vagina para tratar la vaginosis bacteriana al inhibir la replicación de Gardnerella así como inflamación iniciada por Gardnerella. La inflamación asociada causa los síntomas de la vaginosis bacteriana y aumenta el riesgo de transmisión del VIH al alterar las defensas de barrera normales en la vagina.

Ejemplo 5 - El ensayo para detectar la hemólisis mediada por el complemento puede diferenciar las transfusiones de eritrocitos que probablemente causen reacciones transfusionales agudas (RTA)

Procedimientos: Ensayo para detectar hemólisis mediada por el complemento.

Una niña B+ de 13 años con anemia drepanocítica recibió tres unidades de concentrado de glóbulos rojos (pRBC) 0+ de dos donantes diferentes. Durante la primera transfusión de dos unidades, el paciente experimentó hipotensión (TA 89/39) seguida de fiebre (Tmáx 39,22 °C). Las transfusiones del tercer producto transfundido se toleraron sin complicaciones. Debido a la sospecha de una reacción transfusional aguda (RTA), el análisis de la reacción transfusional del primer producto sanguíneo transfundido reveló títulos anti-B elevados. El estudio de investigación posterior de ambos donantes identificados indicó lo siguiente: El donante n.° 1 era un hombre de 48 años del que no se señalaron acontecimientos adversos de transfusión. La donante n.° 2 era una mujer de 61 años con embarazos previos, pero no se señalaron acontecimientos adversos de transfusión.

El plasma de ambos donantes se diluyó con GVBS++ (solución salina tamponada con veronal con gelatina al 0,1 %, CaCl20,15 mM y MgCh 1 mM) y se incubaron con eritrocitos purificados de un donante B+ a 37 °C durante 1 hora. La hemoglobina libre se midió mediante espectrofotómetro a 412 nm. La activación clásica del complemento se evaluó adicionalmente añadiendo el inhibidor de la vía clásica del complemento PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) a la muestra de plasma hemolítico antes de la incubación con eritrocitos.

Resultados

La hemólisis mediada por el complemento fue >100 veces diferente entre las dos muestras de plasma de los diferentes donantes (TABLA 8). La TABLA 8 muestra los títulos de anti-B en plasma y la hemólisis del complemento para dos donantes 0+. La activación clásica del complemento se confirmó bloqueando la hemólisis con el inhibidor de la vía clásica del complemento, PA-dPEG24 (SEQ ⁱD NO: 21).

___________________________________________ TABLA 8___________________________________________

Título de anti-B Hemólisis del complemento (Abs Hemólisis en presencia de PA-(plasma) 412 nm) dPEG24

TA 37 °C IgG

Donante 0+ 128 64 256 0,747 0,008

n.° 1

Donante 0+ 128 16 256 0,007

n.° 2

Estos datos demuestran que los péptidos PIC1 (por ejemplo, las SEQ ID NO: 3-47) podrían utilizarse para determinar si las RTA están mediadas por el complemento. Los datos de la TABLA 8 anterior se muestran en la FlG. 7 junto con un estudio de inhibición de PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) en respuesta a la dosis de la muestra de plasma muy hemolítica (FlG. 8). Se demostró una inhibición de la hemólisis en respuesta a la dosis con PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) hasta >95 % de inhibición. Esto mostró que la transfusión de glóbulos rojos de grupo 0 que condujo a RTA en el receptor de grupo B fue un acontecimiento clásico mediado por el complemento. La FlG. 8 mostró que era posible bloquear farmacológicamente la actividad hemolítica extremadamente robusta mediada por el plasma de este donante en este modelo de RTA in vitro.

Conclusión

Las metodologías pasadas no han podido predecir adecuadamente la probabilidad de RTA mediada por el complemento. En este caso, se administraron dos unidades de glóbulos rojos de grupo 0 a un receptor de grupo B que después padeció RTA. Se estimó que había aproximadamente 30 - 40 % de plasma por volumen en una unidad de concentrado de glóbulos rojos (pRBC) (es decir, 150 - 200 ml de plasma por unidad de 500 ml). Los anticuerpos en el plasma de las transfusiones de glóbulos rojos probablemente iniciaron RTA mediada por el complemento de la vía clásica. Los títulos de IgG para el plasma del donante de cada transfusión de glóbulos rojos fueron altos y, por tanto, no fueron predictivos de esta transfusión de plaquetas causada por la RTHA. Un ensayo hemolítico del complemento de tipo CH50, sin embargo, fue capaz de identificar fácilmente qué plasma de grupo 0 causa hemólisis masiva de eritrocitos de grupo B (aumento >100 veces). Por lo tanto, un ensayo del complemento hemolítico realizado antes de la transfusión de plaquetas habría identificado que una de las unidades de plaquetas probablemente causaría RTHA y podría haber prevenido este acontecimiento adverso grave.

Por lo tanto, se pueden usar péptidos PIC1 (SEQ ID NO: 3-47) para diferenciar el riesgo de RTA mediada por el complemento antes de una transfusión de sangre. Estos datos también apoyan el uso de péptidos PIC1 (SEQ ID NO: 3-47) como tratamiento para las RTA en diversos escenarios clínicos.

Ejemplo 6 - PIC1 (SEQ ID NO: 21) mejora la supervivencia de eritrocitos humanos en un modelo animal de reacción transfusional hemolítica intravascular aguda

Procedimientos: Declaración ética.

Se compraron ratas Wistar macho adolescentes (200-250 g) con catéteres yugulares permanentes en los laboratorios Harlan y se usaron según los protocolos 12-003 y 15-003 aprobados por el IACUC (Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales) de la Escuela de Medicina de Virginia Oriental (EVMS). Se siguió el mantenimiento de la línea central según lo recomendado por el proveedor de animales, con aprobación del IACUC de la EVMS.

Después de proporcionarse el consentimiento informado por escrito, un voluntario humano sano donó sangre AB que se usó para generar glóbulos rojos (RBC) purificados (protocolo EVMS IRB 02-06-EX 0216). Estos glóbulos rojos también se usaron para análisis in vitro como fuente de glóbulos rojos humanos (huRBC).

Procedimientos: Purificación de glóbulos rojos humanos y experimentos con animales

Los glóbulos rojos humanos (huRBC) adquiridos la mañana de los experimentos con animales se procesaron como se describe en (Shah y col., "Complement inhibition significantly decreases red blood cell lysis in a rat model of acute intravascular hemolysis". Transfusion. 2014). Este procedimiento genera 1 ml de huRBC al 80 % de hematocrito, que se administró como una transfusión al 15 % a las ratas.

Se ha establecido previamente el modelo de rata Wistar de RTHIA en el que se demostró que el factor de veneno de cobra (CVF) inhibe la lisis de huRBC mediada por el complemento, mientras que los animales que recibieron solución salina normal (SN) demostraron una hemólisis mediada por el complemento de vía clásica. (Shah TA, Mauriello CT, Hair PS, y col., "Complement inhibition significantly decreases red blood cell lysis in a rat model of acute intravascular hemolysis". Transfusion. 2014). Se estableció dosificación del derivado PEGilado, PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) (New England Peptide, MA) en ratas Wistar. La FIG. 21A muestra la secuencia de acontecimientos en un experimento de dosificación usando una dosis baja (20 mg) y alta (40 mg) de PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) en el modelo animal de RTHIA. Los animales se asignaron al azar a diversos grupos en los que recibieron solución salina normal (n = 6), 20 mg de PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) (n = 4) o 40 mg de PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) (n = 7) antes de la transfusión de huRBC (rama de profilaxis). La FIG. 21B muestra el segundo conjunto de experimentos en el que un grupo de animales recibió 40 mg de PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) (n = 8) antes de la transfusión de huRBC (rama de profilaxis) y un grupo separado de animales (n = 10) que recibieron 40 mg de PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) después de la transfusión de huRBC (rama de rescate). Para ambos experimentos, los animales asignados al grupo de control de solución salina recibieron SN antes de la transfusión de huRBC, mientras que el grupo de CVF recibió 130 |jg de CVF (Complement Technologies, Inc.) por vía intraperitoneal (I.P.) 24 horas antes de la transfusión de huRBC. En un experimento adicional, se inyectaron en grupos separados de animales 40 mg de inmunoglobulina intravenosa (POLYGAM®, Baxter Healthcare Corporation, cA) IGIV (n = 3) y 40 mg de PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) (n = 3) antes de la transfusión de huRBC (IGIV frente a PA-dPEG24).

Usando dosis de ketamina y acepromazina basadas en el peso, los animales estuvieron sedados durante el transcurso del experimento con un seguimiento periódico de los signos vitales. Se recogieron muestras de sangre en tubos microtainer (BD) con EDTA de los animales antes de la transfusión de huRBC y después a los 30 segundos, 5 minutos, 20 minutos, 60 minutos y 120 minutos después de la transfusión de huRBC. En el grupo de animales que recibieron IGIV frente a PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21), se extrajeron muestras de sangre antes de la transfusión de huRBC y después 30 segundos, 5 minutos, 20 minutos, 60 minutos, 120 minutos, 180 minutos, 240 minutos, 300 minutos y 360 minutos después de la transfusión de huRBC. Estas muestras se mantuvieron en agitación a temperatura ambiente antes del procesamiento y se centrifugaron a 2655 x g durante cinco minutos para separar el plasma y sedimentar los glóbulos rojos. El plasma se dividió en alícuotas y el sedimento de RBC se procesó por separado como se describe a continuación. Una vez completada la extracción de sangre final (120 minutos o 360 minutos), el animal se sacrificó usando Fatal Plus (Vortech). Se realizó una necropsia para recoger órganos (hígado, bazo y riñón bilateral) para histopatología. En el experimento de IGIV frente a PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21), los riñones bilaterales adquiridos de cada animal se pesaron por separado y se almacenaron en formalina antes del procesamiento y la inclusión en parafina. Un patólogo desconocedor del tratamiento revisó las secciones teñidas con hematoxilina y eosina (H&E).

Procedimientos: Citometría de flujo

Se realizó citometría de flujo en los glóbulos rojos recogidos usando un citómetro de flujo FACS Calibur (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) con DXP 8 Color 488/637/407 Upgrade (Cytek Development, Fremont, CA). Las muestras se tiñeron con anticuerpos marcados con FITC y/o APC. Los datos se adquirieron usando Cytek FlowJo CE versión 7.5.110.6. Se recopilaron aproximadamente 1x105 y 5x105 acontecimientos por muestra para flujo de marcaje sencillo y doble, respectivamente. Los datos se analizaron usando FlowJo X versión 10.0.7r2 (FlowJo L^lC, Ashland, OR). Aunque no se espera que FITC y APC causen muchos efectos secundarios, en el análisis se usó compensación digital.

Flujo de marcaje sencillo: El sedimento de glóbulos rojos recogido después de separar el plasma se lavó, diluyó y tiñó con anti-CD235a humano conjugado con FITC (glucoforina A, eBioscience, San Diego, CA) a 1:200 en GVBS - -(solución salina tamponada con veronal (VBS) con gelatina al 0,1 %, EDTA 0,01 mol/l) durante 20 min mientras se agitaba a temperatura ambiente para minimizar la aglutinación. Un control de anticuerpos consistió en el sedimento de glóbulos rojos lavado, diluido y sin teñir o teñido con FITC de control de Iso de IgG2b de ratón a 1:200 (eBioscience, San Diego, CA).

Flujo de marcaje doble: El sedimento de glóbulos rojos generado anteriormente se lavó y se tiñó dos veces con CD235a de ratón antihumano conjugado con APC (glucoforina A, BD Bioscience, San José, CA) a 1:50 y C3 de cabra-anti-rata conjugado con FITC (MP Biomedical, Santa Ana, CA) a 1:200 en GVBS - - durante 20 minutos a temperatura ambiente. Se usaron tres controles que consistían en glóbulos rojos sin teñir, glóbulos rojos adquiridos a los 30 segundos teñidos con el anticuerpo marcado con APC y el anticuerpo marcado con FITC para el análisis de cuadrantes.

Experimento de citometría de flujo in vitro: Se incubaron sueros de rata Wistar suficientes para complemento al 100 % (Innovative Research, Novi, MI) con PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) a 12 mg/ml (4 mMol) durante 5 minutos a temperatura ambiente para generar suero tratado con PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21). Los HuRBC preparados como anteriormente se incubaron después con suero tratado con PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) o con suero sin tratar de sueros de ratas Wistar suficientes para complemento al 100 % durante 5 min cada uno a 37 °C. A continuación, las células se lavaron dos veces con GVBS para terminar la activación del complemento. A continuación, estas células se tiñeron dos veces con anti-CD235a de ratón conjugado con APC y anti-C3 de cabra conjugado con FITC como se ha descrito anteriormente. Después del lavado, las células se combinaron con 85 % de células no opsonizadas, no teñidas para imitar la transfusión del 15 % usada in vivo y se analizaron por citometría de flujo usando las mismas condiciones indicadas en el flujo de marcaje doble, anterior.

Procedimientos: Mediciones de hemoglobina y bilirrubina

El plasma generado a partir de los experimentos anteriores se analizó para determinar la hemoglobina libre usando espectrofotometría, como se ha descrito anteriormente (Shah y col., "Clinical hypothermia temperatures increase complement activation and cell destruction via the classical pathway". J Transl Med 2014; 12:181.). Para las mediciones de bilirrubina, Las muestras de plasma de presangrado y de 120 minutos de los grupos de profilaxis (n = 8) y SN (n = 7) se analizaron para determinar la cantidad de bilirrubina presente utilizando el equipo de ensayo de bilirrubina (Sigma-Aldrich, San Luis, MO) a la mitad del volumen recomendado por el fabricante. Debido a las grandes cantidades de hemólisis en los últimos puntos temporales y la interferencia óptica asociada en el análisis de bilirrubina, todas las muestras se pretrataron con HemogloBindTM (Biotech, NJ) antes del análisis con el equipo de ensayo de bilirrubina. (Koseoglu M, Hur A, Atay A, Cuhadar S. "Effects of hemolysis interferences on routine biochemistry parameters". Biochemia medica. 2011; 21 (1): 79-85].

Resultados

PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) bloqueó RTHIA en ratas cuando se proporcionó de forma profiláctica antes de la transfusión, así como cuando se administró PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) como tratamiento de rescate después de la transfusión. Se comparó PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) en una forma de dosis comparable con la inmunoglobulina intravenosa (IGIV) en el modelo animal de enfermedad RTHIA. La IGIV se usa en la práctica clínica junto con la fototerapia para reducir la necesidad de exanguinotransfusión en recién nacidos con hiperbilirrubinemia debido a una enfermedad hemolítica relacionada con la incompatibilidad AB0 [Schwartz HP, Haberman BE, Ruddy RM. "Hyperbilirubinemia: current guidelines and emerging therapies". Pediatric emergency care. 2011; 27 (9): 884-889; "Management of hyperbilirubinemia in the newborn infant 35 or more weeks of gestation". Pediatrics. 2004; 114 (1): 297-316; Cortey A, Elzaabi M, Waegemans T, Roch B, Aujard Y. "Efficacy and safety of intravenous immunoglobulins in the management of neonatal hyperbilirubinemia due to ABO incompatibility: a meta-analysis". Archives de pediatrie: organe officiel de la Societe francaise de pediatrie. 2014; 21 (9): 976-983].

Ejemplo 7 - PIC1 (SEQ ID NO: 21) mejora la supervivencia de eritrocitos humanos en un modelo animal de reacción transfusional hemolítica intravascular aguda - La administración profiláctica de SEQ ID NO: 21 reduce la hemólisis de huRBC en el modelo de RTHIA

Trabajos anteriores habían establecido el modelo de RTHIA en ratas Wistar y habían demostrado que una transfusión al 15% de HuRBC daba lugar a una lisis intravascular mediada por la vía clásica de las células xenotransfundidas [Shah y col., "Complement inhibition significantly decreases red blood cell lysis in a rat model of acute intravascular hemolysis". Transfusion. noviembre de 2014; 54 (11): 2892-900] "Clinical hypothermia temperaturas increase complement activation and cell destruction via the classical pathway". J Transl Med 2014; 12: 181.]. El agotamiento de la actividad del complemento por CVF condujo a una mayor supervivencia de HuRBC como lo muestra la citometría de flujo y las mediciones de hemoglobina libre con las células transfundidas que con el tiempo se inmovilizan en el bazo y el hígado [Shah y col., "Complement inhibition significantly decreases red blood cell lysis in a rat model of acute intravascular hemolysis". Transfusion. noviembre de 2014; 54 (11): 2892-900.]. Para evaluar la eficacia de la inhibición de PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) sobre la supervivencia de huRBC en este modelo de RTHIA, los animales se trataron de forma profiláctica con PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) a dosis de 20 y 40 mg/animal seguido de xenotransfusión al 15% de HuRBC y extracciones de sangre en los puntos temporales indicados (FIG. 22A). Los animales pretratados con CVF actuaron como control positivo para el agotamiento del complemento y un conjunto separado de animales recibió SN (control de vehículo). El plasma aislado de animales tratados con SN demostró un aumento de hemólisis según lo analizado por la hemoglobina libre liberada (FIG. 22A). Por el contrario, los animales pretratados con CVF tenían niveles bajos de hemoglobina libre como se ha señalado anteriormente (FIG. 22A) [Shah y col., "Complement inhibition significantly decreases red blood cell lysis in a rat model of acute intravascular hemolysis". Transfusion. noviembre de 2014; 54 (11): 2892-900.]. Los animales que recibieron ambas dosis de PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) mostraron menores niveles de hemoglobina libre similares a los observados para los animales tratados con CVF; los animales que recibieron 40 mg de PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) mostraron una reducción significativa de la hemoglobina libre en comparación con los animales de control SN a los 5 minutos y 20 minutos (P < 0,05) (FIG. 22A). Para verificar la destrucción mediada por el complemento de los huRBC transfundidos, los glóbulos rojos de la sangre recogida en los puntos temporales indicados se aislaron y marcaron con anticuerpo para la glucoforina A humana (CD235a) y se analizaron mediante citometría de flujo. Los animales que recibieron dosis de 20 o 40 mg de PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) mostraron una supervivencia de las células transfundidas comparable a la observada en los animales tratados con CVF hasta 20 minutos (FIG. 22B). No se observaron diferencias estadísticamente significativas entre los efectos provocados por ambas dosis de PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) y CVF en estos experimentos. Estos resultados muestran el efecto protector de PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) sobre la supervivencia de HuRBC incompatibles en el modelo animal de RTHIA.

Ejemplo 8 - Supervivencia mejorada por PIC1 (SEQ ID NO: 21) de eritrocitos humanos en un modelo animal de reacción transfusional hemolítica intravascular aguda - La administración de SEQ ID NO: 21 después de la transfusión de HuRBC protege las células transfundidas de la hemólisis mediada por el complemento

PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) pudo mostrar protección de los HuRBC cuando se administró a ratas antes de la xenotransfusión, También se descubrió que PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) administrado inmediatamente después de la xenotransfusión podría proteger a los HuRBC del ataque mediado por el complemento. Las ratas recibieron una dosis de 40 mg de PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) 30 segundos antes (rama de profilaxis) o 30 segundos después de la xenotransfusión de HuRBC (rama de tratamiento/rescate). Un grupo separado de animales también recibió control de vehículo SN o se pretrató con CVF (FIG. 21B). El efecto protector de 40 mg de PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) proporcionados antes de la transfusión (grupo de profilaxis) y después de la transfusión (grupo de tratamiento/rescate) sobre la cantidad de hemólisis como se analizó por la hemoglobina libre se redujo significativamente en comparación con los animales que recibieron SN a los 5 minutos (P < 0,005) y 20 minutos (P < 0,005) (FIG. 23A), lo que representa la mayor cantidad de hemólisis en este modelo de RTHIA (FIG. 22A y 23A). La FIG. 23B muestra la hemólisis acumulativa que se produce en los diversos grupos de animales (solución salina, profilaxis, tratamiento y CVF). Tanto el grupo de tratamiento como el de profilaxis demostraron una reducción de la hemólisis en comparación con el grupo de animales con solución salina (P <= 0,05). Otra vía habitual del metabolismo de la hemoglobina cuando se libera en el plasma como resultado de la hemólisis intravascular es la bilirrubinemia indirecta [Strobel E. "Hemolytic Transfusion Reactions". Transfusion medicine and hemotherapy: offizielles Organ der Deutschen Gesellschaft fur Transfusionsmedizin und Immunhamatologie. 2008; 35 (5): 346-353]. Los animales tratados con SN mostraron un gran aumento de bilirrubina libre entre el presangrado y el punto temporal de 120 minutos (FIG. 23C), compatible con la lisis de RBC según se evaluó por hemoglobina libre y citometría de flujo. A diferencia de los animales tratados con SN, 40 mg de PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) proporcionados antes de la transfusión de HuRBC redujeron significativamente la cantidad de bilirrubina circulante a los 120 minutos en comparación con los animales que recibieron SN (P = 0,0015) (FIG. 23C).

Ejemplo 9 - El inhibidor peptídico del complemento C1 (SEQ ID NO: 21) mejora la supervivencia de eritrocitos humanos en un modelo animal de reacción transfusional hemolítica intravascular aguda - Evaluación de la deposición del complemento en HuRBC transfundidos

Los resultados descritos anteriormente demuestran que PIC1 (SEQ ID NO: 21) se puede utilizar en una estrategia tanto profiláctica como de tratamiento para prevenir la hemólisis de los huRBC transfundidos según lo analizado por la supervivencia de los huRBC, niveles de hemoglobina libre y liberación de bilirrubina. Para obtener una comprensión más completa de la función de la deposición del complemento en las células transfundidas, se realizó un análisis de la unión de C3 a los huRBC. Para establecer condiciones experimentales, se realizó un estudio in vitro usando HuRBC expuestos a suero de rata seguido de análisis de la deposición de C3 en las células mediante citometría de flujo. Se añadió suero de rata tratado con y sin PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) a los HuRBC y se dejó opsonizar durante 5 minutos. A continuación, las células se analizaron mediante citometría de flujo con marcaje doble con gráficos representativos de HuRBC expuestos a suero sin tratar o tratado con PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) mostrado en la FIG. 24A y 24B, respectivamente. La cuantificación de HuRBC opsonizados en suero de rata con y sin PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) mostró un aumento relativo en el número de células sin depósito de C3 en el suero tratado con PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) (FIG. 24C). Cuando se calculó la fracción de células con marcaje doble en relación con el número total de células marcadas con glucoforina A, hubo una reducción >1,5 veces en la deposición de C3 en células incubadas con suero tratado con PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) frente a suero sin tratar (FIG. 24D). En suero sin tratar, se observó que una población mayor de células con marcaje doble (Q2) se desplazaba al cuadrante 1, que representaba células con deposición de C3. Estos hallazgos demostraron que PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) rescataba HuRBC de la opsonización y la hemólisis inminente mediante la activación de las proteínas del complemento in vitro.

Para evaluar el efecto de PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) sobre la deposición de C3 de HuRBC transfundidos en el modelo de RTHIA, se sometieron glóbulos rojos aislados de la sangre de animales que recibieron CVF, SN o PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) antes de la xenotransfusión o postxenotransfusión a citometría de flujo de dos colores para la expresión de glucoforina A humana y C3 de rata. Se muestran gráficos de citometría de flujo representativos de glóbulos rojos a los 30 segundos, 5 minutos y 20 minutos después de la transfusión para los animales tratados con SN (FIG. 25A-C) y PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) (FIG. 25D-F). Los animales tratados con SN presentaron un mayor número de células positivas dobles a lo largo del tiempo en comparación con los animales tratados con PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21). Por el contrario, los animales tratados con PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) tenían más células positivas para glucoforina A compatibles con una mayor supervivencia de RBC según se evaluó mediante citometría de flujo con marcaje sencillo y mediciones de hemoglobina libre (FIGS. 22A-B y 23A-C). Para cuantificar con mayor precisión estos resultados, se analizaron y representaron gráficamente los números de eventos capturados por citometría de flujo (FIG. 26A). 30 segundos después del tratamiento profiláctico de transfusión de HuRBC con PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) mostró un aumento drástico en el número de HuRBC en circulación (Humanos - Sin C3) en comparación con los animales sin intervención (SN) o incluso tratados con CVF (FIG. 26A). La cantidad de HuRBC supervivientes a los 30 segundos para el grupo de tratamiento con PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) fue similar a la de los animales que recibieron SN, lo que era esperable, ya que se proporcionó PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) 30 segundos después de la transfusión (FIG. 26A). A los 5 y 20 minutos después de la transfusión, los grupos de animales que recibieron profilaxis y tratamiento con PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) mostraron una disminución de la deposición de C3 en la superficie de los HuRBC en circulación en comparación con los animales que no recibieron ninguna intervención (SN) (FIG. 26B). Para los animales que recibían PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) después de la transfusión (rama de tratamiento), aunque se eliminaron muchos HuRBC de la circulación antes del tratamiento con PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) (FIG. 26A), los HuRBC persistieron en la circulación durante 20 minutos en números más altos que los observados para el grupo de SN (FIG. 26C). Para evaluar el ataque del complemento de glóbulos rojos adyacentes (es decir, glóbulos rojos de rata), se contaron los glóbulos rojos unidos al fragmento C3 que no estaban marcados con antiglucoforina A. La administración profiláctica de PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) disminuyó el ataque por vecindad de glóbulos rojos sin glucoforina A en todos los puntos temporales observados en comparación con los animales de control de SN. El tratamiento posterior a la transfusión con PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) disminuyó el ataque por vecindad en los puntos temporales de 5 y 20 minutos (FIG. 26D).

Ejemplo 10 - Investigación de los efectores del complemento de la inflamación en el líquido pulmonar de la fibrosis quística - Anafilotoxinas del complemento en el líquido pulmonar de la FQ

Procedimientos: Declaración ética.

Se obtuvieron muestras de esputo de pacientes que dieron su consentimiento como parte de su visita de tratamiento habitual en el Hospital Infantil del Centro de Fibrosis Quística de The King's Daughters y se recogieron del Laboratorio de Microbiología Clínica antes de descartarse. Esto se realizó según un protocolo aprobado por el IRB de la Escuela de Medicina de Virginia Oriental 12-08-EX-0200. Las muestras recibieron un código numérico que se vinculó en un archivo cifrado a la base de datos clínica. Se obtuvieron muestras de esputo de control de voluntarios humanos sanos.

Procedimientos: Fracciones solubles de esputo

Se obtuvieron muestras de esputo como esputo expectorado y se colocaron inmediatamente en hielo. Para confirmar que la inducción de esputo no alteraba el complemento en la fracción soluble, se realizó un experimento de control con un voluntario humano sano que produjo un esputo expectorado y un esputo inducido que no mostró diferencias en la activación del complemento ni en las concentraciones del efector del complemento. La fracción soluble (sol) se generó mediante centrifugación en frío (4 °C) a 14000 g durante 60 minutos y recuperación de la fracción líquida de flujo libre, de forma similar a los procedimientos descritos anteriormente [Davies JR, Svitacheva N, Lannefors L, y col., "Identification of MUC5B, MUC5AC and small amounts of MUC2 mucins in cystic fibrosis airway secretions". Biochem J 1999; 344 Pt 2: 321-30]. Las fracciones solubles se dividieron en alícuotas y se congelaron a -80 °C.

Datos clínicos

Se obtuvieron datos clínicos a partir de los datos introducidos en Port CF para la visita a la clínica en la que se recogió la muestra de esputo y de la revisión de la historia clínica. El valor predicho del % de FEV1 se obtuvo de pruebas de la función pulmonar realizadas en la visita a la clínica cuando se recogió la muestra de esputo. La puntuación de bronquiectasia se basó en el estudio radiográfico pulmonar más reciente antes de obtener la muestra de esputo, generalmente radiografía simple. Se asignó una puntuación de bronquiectasia de la siguiente manera: 0 = normal; 1 = 1 lóbulo, leve; 2 = 2-4 lóbulos; 3 = todos los lóbulos. El estado de la diabetes relacionada con la fibrosis quística (DRFQ) se basó en la evaluación endocrinológica más reciente antes de obtener la muestra de esputo. El estado de DRFQ se calificó de la siguiente manera: 0 = normal; 1 = intolerancia a la glucosa; 2 = DRFQ. Parte de cada muestra de esputo se envió para pruebas microbiológicas en el laboratorio de microbiología clínica en CHKD y se registraron los organismos. Los organismos se clasificaron en función de si estaban presentes o ausentes los siguientes: Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, complejo de Burkholderia cepacia o especie de Candida. También se registraron los medicamentos del paciente en el momento de la visita a la clínica. Los medicamentos se clasificaron en función de si estaban presentes o ausentes los siguientes: corticoesteroide sistémico, corticoesteroide inhalado, azitomicina, antibiótico inhalado o antibiótico sistémico (excluyendo azitromicina).

Procedimientos: ELISA y transferencias de Western

La concentración de C5a en la fracción soluble de esputo se cuantificó usando un equipo de ELISA C5a (R&D Systems). Se midieron tanto C3a como C4a de la fracción soluble de esputo usando sus equipos de ELISA respectivos (BD Biosciences). Los fragmentos de C3 unidos se determinaron usando un ELISA de C3 total. En resumen, se usó un anticuerpo de cabra anti-C3 humano (Complement Technology) para revestir placas Immulon-2 de fondo plano la noche anterior. A continuación, se lavaron las placas con PBST (PBS con TWEe N al 0,1 %), se bloquearon durante dos horas con BSA/PBS al 3 %, se lavaron de nuevo y se siguieron de la adición de muestras y un patrón de C3 puro (Complement Technology) durante 1 hora en tampón de bloqueo. Las placas se lavaron, se incubaron con un anticuerpo de pollo anti-C3 humano (Sigma) durante 1 hora, se lavaron de nuevo y se incubaron con un anticuerpo de cabra anti-HRP de pollo (Genway). Las placas se desarrollaron con solución de sustrato TMB (Thermo Scientific) y se detuvieron con H2SO4 2,5 N (Hair PS, Echague CG, Rohn RD, y col., "Hyperglycemic conditions inhibit C3-mediated immunologic control of Staphylococcus aureus". J Transl Med 2012; 10: 35], Los fragmentos de C4 unidos se evaluaron con el mismo procedimiento de ELISA que para C3, excepto usando un anticuerpo de cabra anti-C4 humano para recubrir las placas, un C4 puro como patrón (ambas Complement Technologies) y un anticuerpo de pollo anti-C4 humano (Abcam) como anticuerpo primario.

Los fragmentos de C5a se analizaron mediante transferencia de Western usando un anticuerpo de ratón anti-C5a humano (R&D Systems) para explorar seguido de un anticuerpo de cabra anti-HRP de ratón (Sigma) y se detectaron con ECL.

Resultados

Para evaluar si las anafilotoxinas del complemento estaban elevadas en el líquido pulmonar de la FQ, se analizaron las fracciones solubles de FQ del esputo de pacientes con FQ para cada anafilotoxina del complemento y se compararon con las fracciones solubles de esputo de controles humanos sanos. La anafilotoxina del complemento más inflamatoria fue C5a, que se ensayó mediante ELISA y transferencia de Western. La concentración media de C5a en las fracciones solubles de FQ fue 4,8 veces mayor (P = 0,04) en comparación con la media de los controles sanos (FIG. 10A). El análisis cualitativo mediante transferencia de Western para C5a confirmó que estaban presentes grandes cantidades de C5a en fracciones solubles de FQ en comparación con los controles (FIG. 10B). C3a es un efector del complemento que se genera durante la activación del componente central del complemento C3. Las concentraciones medias de C3a en las fracciones solubles de FQ fueron 4 veces mayores (P = 0,03) en comparación con los controles (FIG. 10C). C4a es la menos potente de las anafilotoxinas del complemento y se genera durante la activación del complemento por la vía clásica o de la lectina. La concentración media de C4a fue 2 veces mayor en las fracciones solubles de ^fQ (P = 0,05) en comparación con los controles (FIG. 10D). Juntos, estos datos muestran que la concentración de anafilotoxinas del complemento en el líquido pulmonar de la FQ fue significativamente elevada, lo que sugiere una activación significativa del complemento en el líquido pulmonar de la FQ. La potente capacidad de C5a para reclutar neutrófilos y estimular la desgranulación [Lambris JD, Sahu A, Wetsel RA. "The chemistry and biology of C3, C4, and C5. en: Volanakis JE, Frank MM, (eds)". The human complement system in health and disease. Nueva York: Marcel Dekker; 1998, 83-118; Mollnes TE, Brekke OL, Fung M, y col., "Essential role of the C5a receptor in E coli-induced oxidative burst and phagocytosis revealed by a novel lepirudin-based human whole blood model of inflammation". Blood 2002; 100 (5): 1869-77; Laursen NS, Magnani F, Gottfredsen RH, y col., "Structure, function and control of complement C5 and its proteolytic fragments". Curr Mol Med 2012; 12 (8): 1083-97], sugirió que C5a podría contribuir a las altas concentraciones de elastasa de neutrófilos en el líquido pulmonar de la FQ, que se asocia con la destrucción del parénquima. Adicionalmente, los niveles elevados de C4a en el líquido pulmonar de la FQ, sugirieron que gran parte de la activación del complemento que se produce en el líquido pulmonar de la FQ puede producirse a través de las vías del complemento clásica o de lectina.

Ejemplo 11 - Investigación de los efectores del complemento de la inflamación en el líquido pulmonar de la fibrosis quística - Opsonización del complemento de Staphylococcus aureus en el líquido pulmonar de la FQ Procedimientos: Opsonización de S. aureus con fracciones solubles de la FQ

La cepa de Staphylococcus aureus Reynolds se cultivó en caldo de cultivo Columbia de NaCl al 2 % a 37 °C hasta la fase logarítmica, se lavó dos veces con GVBS++ (solución salina tamponada con veronal con gelatina al 0,1 %, CaCh 0,15 mM y MgCh 1,0 mM) y se resuspendió a 1 x 109 células/ml. Se incubó un volumen igual de bacterias y fracción soluble de FQ o de control durante una hora a 37 °C. Las bacterias se lavaron dos veces con GVBS-- (VBS con gelatina al 0,1 % y EDTA 0,01 M) y después se despojó de los fragmentos del complemento unidos usando metilamina, como se ha descrito anteriormente [Cunnion KM, Lee JC, Frank MM. "Capsule production and growth phase influence binding of complement to Staphylococcus aureus". Infect Immun 2001; 69 (11): 6796-803].

Resultados

Para evaluar si el complemento en el líquido pulmonar de la FQ podría opsonizar adecuadamente una bacteria patógena, se evaluó la opsonización de la fracción soluble de la FQ de Staphylococcus aureus. Dadas las grandes cantidades de activación del complemento que ya se habían producido en los líquidos pulmonares de la FQ, era importante determinar si existía una defensa residual del huésped mediada por el complemento. Se incubaron Staphylococcus aureus con FQ o fracciones solubles de control, se lavaron y se eliminaron los fragmentos C3 unidos y los fragmentos C4 unidos. Staphylococcus aureus se opsonizó de forma robusta en la fracción soluble de la FQ produciendo un nivel medio casi idéntico de fragmentos C3 unidos en comparación con los controles normales (FIG.

11A). Staphylococcus aureus también se unió de forma robusta con fragmentos C4 (P = 0,13) con una tendencia no significativa hacia la unión media aumentada del fragmento C4 por las fracciones solubles de la FQ en comparación con los controles normales (FIG. 11B). Estos resultados sugirieron que el líquido pulmonar de la FQ conservaba una capacidad normal para opsonizar bacterias, lo que sugiere que esta faceta de las defensas del huésped no se ve comprometida. Estos resultados también muestran que a pesar de que se ha producido una activación significativa del complemento, como lo demuestran los niveles muy altos de anafilotoxina, permanece complemento significativo en el líquido pulmonar de la FQ. Esto sugirió un ciclo de activación y reposición del complemento compatible con una inflamación persistente. La robusta opsonización con fragmentos c4 sugirió que la vía clásica o de lectina del complemento estaba activa en el líquido pulmonar de la FQ y puede ser la vía predominante de activación del complemento.

Ejemplo 12 - Investigación de los efectores del complemento de la inflamación en el líquido pulmonar de la fibrosis quística - Generación de C5a en el líquido pulmonar de la FQ por Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus

La Pseudomonas aeruginosa se adquirió como un aislado clínico desidentificado descartado. Se cultivó en caldo Mueller Hinton hasta la fase logarítmica y se lavó y resuspendió como se hizo con el Staphylococcus aureus. Ambas bacterias se destruyeron por calor suavemente incubando en un baño de agua a 70 °C durante 15 minutos. Las muestras se sembraron para confirmar que las bacterias estaban muertas. Las fracciones solubles de FQ o de control se incubaron con Pseudomonas aeruginosa o Staphylococcus aureus vivas o muertas a volúmenes iguales durante una hora a 37 °C. A continuación, las muestras se centrifugaron a 14000xg durante 5 minutos y el sobrenadante se recogió y analizó para determinar C5a. El mismo volumen de fracción soluble de FQ y PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) [Shah y col., "Clinical hypothermia temperatures increase complement activation and cell destruction via the classical pathway". J Transl Med 2014; 12: 181; Mauriello CT, Pallera Hk, Sharp JA, y col., "A novel peptide inhibitor of classical and lectin complement activation including ABO incompatibility". Mol Immunol 2012; 53 (1-2): 132-9], a 50 mg/ml, o solución salina para los controles, se combinaron y se preincubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. A continuación, se añadieron 5x 107 UFC de Pseudomonas aeruginosa destruida por calor y se incubaron a 37 °C durante 30 minutos. A continuación, se centrifugaron las muestras a 14000xg durante 2 minutos y el sobrenadante se recogió y se ensayó en el ELISA de C5a.

Para evaluar si el fluido pulmonar con FQ expuesto a bacterias patógenas habitualmente presentes en los pulmones con FQ generaría C5a nuevo, la anafilotoxina más inflamatoria, las fracciones solubles de FQ se incubaron con Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus vivas y muertas. Se probaron versiones vivas y muertas de cada bacteria porque es probable que ambas formas estén presentes en un pulmón infectado con FQ. Adicionalmente, Los factores secretados o los cambios adaptativos que podrían producir las bacterias vivas también alterarían la generación de C5a. Antes y después de la incubación con bacterias, se midieron las concentraciones de C5a en FQ para determinar si se generó C5a nuevo. La incubación de fracciones solubles de FQ con Pseudomonas aeruginosa viva o muerta conduce a un aumento promedio en la generación de C5a de 2,3 veces (P = 0,02). De manera similar, la incubación con Staphylococcus aureus vivo o muerto conduce a un aumento promedio en la generación de C5a de 2,4 veces (P = 0,02) (FIG. 12A). Estos datos también mostraron una diferencia en la generación de C5a entre Pseudomonas aeruginosa (P = 0,05) viva o muerta, pero no entre Staphylococcus aureus vivo o muerto. Esta relación entre exposición a Pseudomonas aeruginosa viva o muerta pareció uniforme para las diferentes muestras de fracción soluble de FQ (FIG. 12B), pero no hubo una relación uniforme entre exposición a Staphylococcus aureus vivo o muerto (FIG. 12C). Estos datos mostraron que tanto Pseudomonas aeruginosa como Staphylococcus aureus provocan una generación robusta de la anafilotoxina C5a muy inflamatoria en el líquido pulmonar de la FQ, lo que sugiere que la presencia de estas bacterias en el pulmón con FQ puede aumentar la inflamación y el daño subsiguiente al tejido del huésped. Pseudomonas aeruginosa puede tener alguna capacidad para moderar la generación de C5a en el líquido pulmonar de la FQ en comparación con Pseudomonas aeruginosa muerta.

Con el fin de evaluar las probables vías del complemento por las que Pseudomonas aeruginosa estaba activando la generación de C5a, se probó un inhibidor de la activación de la vía clásica y de la lectina del complemento. Los inhibidores peptídicos del complemento C1 son inhibidores peptídicos pequeños de las vías clásica y de lectina de activación del complemento. Las fracciones solubles de la FQ se incubaron en tampón solo, con Pseudomonas aeruginosa muerta o con PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) y Pseudomonas aeruginosa muerta (FIG. 12D). La Pseudomonas aeruginosa muerta aumentó la concentración de C5a en 1,6 veces en comparación con la incubación de la fracción soluble de FQ en tampón solo. La adición de PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) a la fracción soluble de FQ disminuyó la generación de C5a por Pseudomonas aeruginosa (P = 0,001) a un nivel no significativamente diferente de la fracción soluble de FQ sola (P = 0,22). Por tanto, la adición de un inhibidor de la vía clásica/de lectina bloqueó la generación de C5a por Pseudomonas aeruginosa, lo que sugiere que Pseudomonas aeruginosa activa el complemento y la generación de C5a a través de las vías clásica o de lectina del complemento. Este hallazgo fue congruente con los niveles elevados de C4a y la opsonización robusta del fragmento C4.

Ejemplo 13 - Investigación de los efectores del complemento de la inflamación en el líquido pulmonar de la fibrosis quística - Correlación de anafilotoxina del complemento con características clínicas

Procedimientos: Análisis estadístico de medidas clínicas con C5a/C3a y de datos de laboratorio

Los datos se analizaron usando los programas informáticos SAS 9.4 (SAS Institute, Cary, NC) y SPSS 19 (SPSS Inc., Chicago, IL). El nivel de significación se fijó en 0,05. Se señalaron los coeficientes de correlación de Pearson y Spearman, cuando fuera adecuado, para el nivel de C5a, el nivel de C3a y las medidas clínicas. Se señalaron las estadísticas descriptivas para los niveles de C5a y C3a estratificados por medidas clínicas. Se usaron regresión lineal simple y pruebas de U de Mann-Whitney, cuando fuera adecuado, para determinar las asociaciones entre el nivel de C5a, el nivel de C3a y las medidas clínicas. Se utilizó un modelo de regresión lineal multivariable para el % de FEV1 para determinar las asociaciones con el nivel de C5a y el nivel de C3a.

Las medianas, los cuartiles y los percentiles 90 se calcularon usando la gráfica de PSI. Las medias y el error típico de las medias (ETM) se calcularon a partir de experimentos independientes. Se realizaron comparaciones estadísticas usando la prueba de la t de Student cuando fue adecuado con un nivel de significación establecido en 0,05.

Resultados

Se recogieron muestras de esputo de FQ de 15 pacientes. Las características clínicas de estos 15 sujetos se muestran en la TABLA 9. Los sujetos abarcan un amplio intervalo de edades de 2 a 65 años con una mediana de edad de 19. La mediana del % de FEV1 predicho fue 59; para los niños (n = 7) la mediana del IMC fue del 48 % y para los adultos (n = 4) la mediana del IMC fue de 23,87 mg/kg2. Se obtuvieron datos clínicos recopilados en el momento de la toma de muestras de esputo para un amplio intervalo de medidas, incluyendo el % de FEV1 previsto, porcentaje de IMC (niños), bronquiectasia, estado de DRFQ, microorganismos patógenos cultivados a partir del esputo y medicamentos (es decir, corticoesteroides, azitromicina y antibióticos). Se evaluaron las correlaciones estadísticas entre las anafilotoxinas, C5a y C3a, y las medidas clínicas, véase la TABLA 10. El aumento de la concentración del C5a muy inflamatorio se correlacionó positivamente con el aumento de la edad (r = 0,53, P = 0,04), como se muestra en la FIG. 13A. El aumento de la concentración de C5a se correlacionó inversamente con el percentil de IMC en niños (r = -0,77, P = 0,04), como se muestra en la FIG. 13B. El aumento de los niveles de C3a se correlacionó positivamente con el aumento del % de FEV1 previsto (rs = 0,63, P = 0,02), como se muestra en la FIG.

13C. Los microorganismos (es decir, Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia cepacia, Staphylococcus aureus o levadura) recuperados del esputo, corticoesteroides, azitromicina o antibióticos no se correlacionaron con los niveles de C5a o C3a. Estos resultados mostraron que el aumento de la concentración de C5a se correlacionó con una disminución del percentil de IMC en los niños, lo que sugiere que el aumento de C5a inflamatorio del complemento en el líquido pulmonar puede estar asociado con una peor salud general en niños con FQ. El nivel de C3a se correlacionó positivamente con el % de FEV1 previsto, lo que sugiere un efecto potencialmente protector del C3a sobre la función pulmonar de la FQ.

TABLA 9 - Características de los sujetos con FQ

Mediana (intervalo)

Edad,y 19 (2-65)

Sexo, % de mujeres 60

IMC infantil, % 26 (10-70)

IMC adulto 23,8 (21,8-25,9)

% de FEV1 59 (23-99)

TABLA 10 - Coeficientes de correlación para efectores del complemento y medidas clínicas

C5a (ng/ml) C3a (ng/ml)

Coeficiente de correlación 0,53a -0,12b

Valor de p (Ho: rho = 0) Edad, y 0,04 0,68

N 15 14

Coeficiente de correlación -0,77a -0,39b

Valor de p (Ho: rho = 0) IMC infantil, % 0,04 0,38

N 7 7

Coeficiente de correlación 0,04a 0,63b

Valor de p (H0: rho = 0) 1 % de FEV 0,89 0,02

N 14 13

Coeficiente de correlación _{Puntuación de} 0,12b 0,15b

Valor de p (H0: rho = 0) ^{bronquiectasia} 0,68 0,61

N 15 14

Coeficiente de correlación 0,27b 0,01b

Valor de p (H0: rho = 0) ^P

_D ^u

_R ⁿ

_F ^t

_Q ^{uación de} 0,38 0,98

N 13 12

Puntuación de bronquiectasia 0 = normal; 1 = 1 lóbulo, leve; 2 =

2-4 lóbulos; 3 = todos los lóbulos

Puntuación de DRFQ: 0 = normal; 1 = intolerancia a la glucosa; 2

= DRFQ

a Coeficiente de correlación de Pearson

b Coeficiente de correlación de Spearman

Ejemplo 14 - Modulación de la interacción de C1q con receptores de C1q - Unión al receptor de calreticulina Procedimientos

Para demostrar que PA bloquea la unión al receptor de calreticulina, se realizó el siguiente experimento. Se usó calreticulina recombinante o BSA (control negativo) para recubrir una placa de microtitulación. A continuación, se añadió C1q a la placa solo, se incubó con cantidades crecientes de péptido PA (SEQ ID NO: 3) y después se evaluó la unión a calreticulina. Como control negativo, se usó un péptido de 15 aminoácidos (CP2) que no se une a C1q. La interacción de C1q marcado con células Raji se probó mediante microscopia confocal. Se añadió C1q marcado a células Raji. Se fijaron 1,4125 x 106 células/ml con paraformaldehído al 4 % durante 5 min y se almacenaron durante una noche a 4 °C. 1 x 105 células se tiñeron con: C1q 4881:40 durante 20 min, se lavaron x2 y se tiñeron con medio de montaje DAPI, y se almacenaron durante una noche a 4 °C.

Se preincubó PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) con C1q a dos concentraciones diferentes antes de su adición a células Raji. Se fijaron 1,4125 x 106 células/ml con paraformaldehído al 4 % durante 5 minutos y se almacenaron durante una noche a 4 °C. 1 x 105 células se tiñeron con: C1q 488 1:40 más PA-dPEG24 1,45 mg/ml (SEQ ID NO: 21) (1:20 de 29 mg/ml) o PA-dPEG242,9 mg/ml (SEQ ID NO: 21) (1:10 de 29 mg/ml) durante 20 minutos, se lavaron dos veces, se tiñeron con medio de montaje DAPI y se almacenaron durante una noche a 4 °C.

Resultados

PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21) bloqueó la unión de C1q a un receptor celular de C1q específico (calreticulina/cC1qR) en un ensayo in vitro y también bloqueó la unión de C1q a las células Raji (una línea celular de linfocitos B inmortalizados que se usa para evaluar las interacciones C1q con los receptores de C1q).

Se añadió C1q a una placa recubierta con calreticulina, los resultados mostraron que C1q se une específicamente a la calreticulina pero no a la BSA, como se esperaba (FIG. 15). Cuando las placas estaban recubiertas con C1q, calreticulina y BSA, el péptido PA (SEQ ID NO: 3) se unió específicamente a C1q, la interacción entre PA fue específica para C1q y no calreticulina o BSA (FIG. 14A). Cuando se incubó C1q con cantidades crecientes de péptido PA (SEQ ID NO: 3) y después se evaluó la unión a calreticulina, PA inhibió de forma dependiente de la dosis la unión a calreticulina (FIG. 16). Como control negativo, un péptido de 15 aminoácidos (CP2) que no se une a C1q no mostró inhibición competitiva de la unión de C1q a calreticulina (FIG. 16). Adicionalmente, PA (SEQ ID NO: 3) inhibió la unión de C1q a calreticulina purificada (FIG. 14B) y células Raji (FIG. 14C-D) de forma compatible con la inhibición de la unión de C1q a la CRT de superficie. La configuración del experimento se muestra en la FIG. 14E.

La interacción de C1q marcado con células Raji se investigó mediante microscopia confocal. C1q marcado (FITC) se unió a células Raji (dApI) como se muestra en las FIGS. 17A-C. Cuando se preincubó PA-dPEG24 (SEQ iD NO: 21) con C1q a dos concentraciones diferentes, la cantidad de C1q marcado unida a las células Raji disminuyó significativamente (FIGS. 18A-C y 19A-C), lo que demuestra que (SEQ ID NO: 21) inhibió la unión de C1q a estas ^{células. Aunque sin quedar limitados por teoría alguna, (SEQ} Id NO: 21) supuestamente inhibió la unión de C1q al alterar la interacción de C1q con un receptor o receptores de C1q en la superficie celular.

Ejemplo 15 - Los compuestos peptídicos redujeron significativamente la lesión cerebral en un modelo de rata de encefalopatía isquémica hipóxica neonatal

Procedimientos

Se sometieron crías de rata P10 Wistar a ligamiento unilateral de la carótida derecha (modelo de Vannucci) seguida de 8 % de hipoxia. A los animales experimentales se les inyectó PA-dPEG24 150 mg/kg (SEQ ID NO: 21) por vía intraperitoneal. Los controles incluyeron 1) inyección de factor de veneno de cobra (CVF) para agotar el complemento 2) hipotermia terapéutica durante 6 horas. Los animales se recogieron a las 4, 8, 16 y 48 horas después de la intervención. El ensayo de CH50 se realizó en plasma de rata para medir la actividad del complemento sistémico. Los volúmenes de infarto cerebral se midieron mediante la tinción del tejido cerebral recogido con TTC al 2 % usando el programa informático image J.

Resultados

La actividad sistémica del complemento se eliminó casi por completo en los animales a los que se inyectó CVF durante 72 horas después de la inyección, como se esperaba. En el grupo de PA-dPEG24 (SEQ ID NO: 21), la activación sistémica del complemento se redujo en un 70 % a las 0,5 horas después de la inyección antes de volver gradualmente al valor inicial a las 8 horas (FIG. 30). La hipoxia después del ligamiento de la carótida produjo un 20 % de infarto. La inyección de CVF antes del ligamiento/hipoxia atenuó casi por completo la lesión cerebral. ^hT reduce el infarto en un 50%. La inyección con PA-dPEG24 (s Eq ID NO: 21) mostró una neuroprotección variable (FIG. 31) con una reducción promedio del infarto del 40 %. Aunque sin quedar limitados por teoría alguna, La SEQ ID NO: 21 puede imitar el efecto neuroprotector de la hipotermia terapéutica al disminuir la deposición de C1q en el cerebro hasta 48 horas. Hubo una deposición de C1q significativamente menor en el grupo tratado con SEQ ID NO: 21 (Normotermia PIC1 (SEQ ID NO: 21) - triángulo) en comparación con los controles de EHI sin tratar (Normotermia -rombo) en 4, 12, 24 horas después de la lesión cerebral (FIG. 32A).

SEQ ID NO: 21 también mostró pruebas histológicas de neuroprotección después de EHI. La histología cerebral cinco días después de EHI mostró la acción de neuroconservación de la SEQ ID NO: 21 similar a la hipotermia terapéutica. La destrucción neuronal se redujo en los tratados con SEQ ID NO: 21 y el tratamiento también aumentó las células viables en el cerebro (FIG. 32B). Por ejemplo, en la FIG. 32B, los paneles A-D muestran tinción con violeta de cresilo. El violeta de cresilo tiñe la sustancia Nissl en las neuronas. El grupo de EHI (panel B) muestra una disminución significativa en la tinción con violeta de cresilo en comparación con el grupo de SEQ ID NO: 21 (panel D), lo que indica la acción neuroconservadora de la SEQ ID NO: 21 similar a la hipotermia terapéutica (panel C). Los paneles EH muestran tinción con hematoxilina y eosina. La tinción con hematoxilina y eosina demostró un mayor grado de destrucción neuronal (necrosis, picnosis y cariorrexis) en el cerebro con EHI (paneles E, F y G) en comparación con los tratados con la SEQ ID NO: 21 (panel H). Los paneles I-L muestran tinción con naranja de acridina. La naranja de acridina tiñe las partes viables del cerebro de un verde brillante. EHI disminuye significativamente la tinción con naranja de acridina en el cerebro (panel J). El tratamiento con la SEQ ID NO: 21 restaura la tinción con naranja de acridina, lo que indica la presencia de células más viables en el cerebro (panel L). La neuroprotección histológica también se tradujo en una mejora funcional después de la EHI. En una prueba de geotaxis negativa 1-7 días después de EHI, los animales inyectados con PIC1 (SEQ ID NO: 21) rindieron significativamente mejor (FIG. 32C, barras verdes) que los animales con EHI con normotermia (FIG. 32C, barras rojas). La prueba de geotaxia negativa es una prueba de respuesta de escape innata que mide el tiempo que tarda una cría en trepar cuando se coloca cabeza abajo sobre una malla de alambre.

Estos datos mostraron que la SEQ ID NO: 21 puede reducir los volúmenes de infarto cerebral sin un agotamiento prolongado del complemento sistémico y mejores resultados funcionales después de EHI. Aunque sin quedar limitados por teoría alguna, la SEQ ID NO: 21 puede haber disminuido la deposición de C1q en el cerebro. En algunas realizaciones, la SEQ ID NO: 21 es una terapia adjunta a la HT útil para mejorar los resultados neurológicos en la EHI.

Ejemplo 16 - Replicación inhibida por PIC1 del virus del herpes simple de tipo 1 y del virus del herpes simple de tipo 2 Se infectaron células CV-1 con VHS-1-GFP durante 16 horas. Después de la infección, las células CV-1 se detectaron mediante citometría de flujo (FIG. 33). Las células sin infectar (control negativo, GFP-) dan lugar a un pico izquierdo, mientras que el pico en las células infectadas (GFP+) se desplazará hacia la derecha. Cuando se añadió PA-PEG24 (SEQ ID NO: 21) a las células CV-1 antes de la infección, inhibió la infección vírica de una manera dependiente de la dosis. También se añadió aciclovir (el tratamiento habitual para las infecciones graves por VHS-1) como control en la misma proporción molar. Aunque el aciclovir pudo inhibir significativamente la replicación del VHS-1, nunca pudo inhibir completamente la replicación como lo indica la pequeña población de células GFP+. Esto contrastaba con PA-PEG24 (SEQ ID NO: 21), en el que no hubo detección de células GFP+ en PA-PEG244-5 mM (SEQ ID NO: 21). Además, PA-PEG24 (SEQ ID NO: 21) y aciclovir mostraron una toxicidad mínima en las células CV-1, lo que indicó que la inhibición de la replicación vírica no se debió a la muerte celular (FIG. 33). PA-PEG24 (SEQ ID NO: 21) también inhibió la replicación de VHS-2 de una manera dependiente de la dosis (FIG. 34).

Ejemplo 17 - Los compuestos peptídicos promovieron el crecimiento de L. acidophilus y L. leichmannii.

La capacidad de PIC1 para no destruir el comensal beneficioso Lactobacillus (como se muestra en la FIG. 35) mejora en gran medida la seguridad de este antibiótico. Los efectos secundarios más habituales de los antibióticos actuales son la diarrea asociada a los antibióticos y las infecciones por levadura debido a que los antibióticos destruyen la flora intestinal normal. Entre los efectos secundarios más temidos de los antibióticos se encuentra colitis por C. difficile, que puede ser potencialmente mortal y es, con frecuencia, recurrente. La FIG. 35 muestra que PA-PEG24 (SEQ ID NO: 21) puede promover el crecimiento de Lactobacillus de una manera dependiente de la dosis.

Ejemplo 18 - PIC1 tenía actividad antimicrobiana.

Varios péptidos de PIC1 fueron antibacterianos en una amplia gama de patógenos bacterianos. Por ejemplo, se ha mostrado que PA-dPEG24 (también conocido como AF1, SEQ ID NO: 21) inhibe el crecimiento de Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa y Klebsiella pneumoniae de una manera dependiente de la dosis (como se muestra en la FIG. 36A). Adicionalmente, se suprimió el crecimiento de Pseudomonas aeruginosa (FIG. 36B) mediante cinco variantes de péptidos PIC1 (AF1-5) (SEQ ID NO: 7, 8, 12 y 21. La actividad antibacteriana de los PIC1 (SEQ ID NO: 21) se confirmó adicionalmente mediante microscopia confocal, que mostró péptidos PIC1 unidos a la superficie exterior de bacterias Staph aureus (FIG. 36C).

En algunas realizaciones, los compuestos peptídicos inhibieron el crecimiento de Neisseria gonorrhoeae en cultivo líquido. PA-PEG24 (SEQ ID NO: 21) redujo el crecimiento de Neisseria gonorrhoeae a 20 mg (FIG. 37A) o 30 mg (FIG. 37B) de PA-pEg24 (SEQ ID NO: 21) y demostró una inhibición dependiente de la dosis de 0-30 mg/ml de PA-PEG24 (SEQ ID NO: 21) (FIG. 37C). Adicionalmente, los recuentos de colonias de Neisseria gonorrhoeae incubada con o sin PA-PEG24 (SEQ ID NO: 21) mostró una reducción sustancial de colonias de Neisseria gonorrhoeae tratadas con 30 mg/ml de PA-PEG24 (SEQ ID NO: 21).

En conclusión, los datos muestran que las SEQ ID NO: 21, 5, 6, 7 y 8, respectivamente, tenían actividad antibacteriana contra una amplia gama de patógenos bacterianos.

Ejemplo 19 - PIC1 inhibió la actividad mieloperoxidasa (MPO) de los neutrófilos.

La mieloperoxidasa (MPO) es una enzima de los neutrófilos que crea hipoclorito (lejía) en la inflamación aguda que daña tanto los microbios invasores como las células del huésped. Se sabe que esta enzima es destructiva para los tejidos del huésped en la fibrosis quística (FQ) y la encefalopatía hipóxica isquémica (EHI). Se encontró que PIC1 (SEQ ID NO: 21) inhibe la actividad de MPO en muestras de esputo (fracción soluble) aisladas de pacientes con fibrosis quística (FQ). Las muestras de fracción soluble de FQ se incubaron en presencia o ausencia de 20 mg/ml de PIC1 (SEQ ID NO: 21) durante 30 minutos, seguido de la adición de TMB durante 30 minutos a temperatura ambiente (como se muestra en la FIG. 38). A continuación, se midió la actividad de MPO mediante la detección del cambio de color de TMB en un espectrofotómetro a 450 nm. Se descubrió que la actividad de MPO se redujo en muestras de fracción soluble de FQ tratadas con PIC1. La MPO preexistente en el esputo de pacientes con FQ podría tener su actividad enzimática bloqueada con los compuestos peptídicos (FIG. 39 de una manera dependiente de la dosis (FIG. 39). Adicionalmente, PA-PEG24 (SEQ ID NO: 21) pudo bloquear la actividad enzimática de MPO en un lisado de preparaciones de cerebro o membrana cerebral de ratas sujetas a encefalopatía isquémica hipóxica (como se muestra en las FIGS. 40-42). La actividad de MPO presente en los lisados de neutrófilos humanos purificados también puede inhibirse directamente mediante PA-PEG24 (SEQ ID NO: 21) (como se muestra en la FIG.

42). La FIG. 42 muestra que PA-PEG24 (SEQ ID NO: 21) inhibe de forma dependiente de la dosis la actividad de MPO en lisados de neutrófilos humanos purificados (PMN). Los lisados de PMN se incubaron en presencia de cantidades crecientes de PA-PEG24 (SEQ ID NO: 21). A continuación, se midió la actividad de MPO mediante la detección del cambio de color de TMB en un espectrofotómetro a 450 nm. Finalmente, la valoración de la inhibición de la actividad de MPO purificada por PA-PEG24 (SEQ ID NO: 21) demostró que PA-PEG24 (SEQ ID NO: 21) puede inhibir directamente MPO (como se muestra en la FIG. 43). Estos hallazgos demostraron que PIC1 tiene un efecto antiinflamatorio sorprendente que es relevante tanto para la FQ como para la EHI. Esto muestra un mecanismo alternativo que podría explicar cómo las SEQ ID NO: 3-47 tienen actividad antiinflamatoria.

Ejemplo 20 - Lesión renal aguda y rabdomiólisis: Los compuestos peptídicos inhibieron la producción de hemoglobina de la actividad de radicales libres:

Los compuestos peptídicos inhibieron la actividad pseudoperoxidasa de la hemoglobina (Hg) de los glóbulos rojos humanos. La Hg, como la mieloperoxidasa (MPO), contiene un grupo hemo que puede catalizar reacciones de peróxido que afectan a las proteínas, ácidos nucleicos y lípidos que dañan los tejidos del huésped. La actividad de pseudoperóxido de la Hg se mide usando una reacción entre peróxido de hidrógeno (H2O2) y el cromógeno tetrametilbencidina (TMB). La TMB oxidada muestra un cambio de color que se puede leer en un espectrofotómetro. Ya que PA-PEG24 (SEQ ID NO: 21) podría inhibir la actividad peroxidasa de MPO, los inventores probaron si la actividad peroxidasa de la Hg de glóbulos rojos humanos lisados podría ser inhibida por PA-PEG24 (^s E^q ID NO: 21) en el mismo tipo de ensayo experimental. Para este fin, se incubaron lisados de glóbulos rojos que producían Hg libre con TMB en ausencia o presencia de PA-PEG24 (SEQ ID NO: 21). Como se muestra en la FIG. 44, cantidades crecientes de lisados de glóbulos rojos proporcionaron un aumento de la absorbancia que demuestra un aumento de sustrato de TMB oxidado. En presencia de PA-PEG2420 mg/ml (SEQ ID NO: 21), no hubo TMB oxidada detectable. En la FIG. 45, cantidades crecientes de PA-PEG24 (SEQ ID NO: 21) condujeron a una disminución dependiente de la dosis en la señal de TMB oxidada. La FIG. 46 muestra una valoración de TMB oxidada con cantidades crecientes de lisado de glóbulos rojos. En presencia de cantidades crecientes de PA-PEG24 (SEQ ID NO: 21), la señal de TMB oxidada disminuye de forma dependiente de la dosis. La hemólisis que conduce a la presencia de Hg libre en la circulación humana es tóxica para los riñones, lo que da lugar a toxicidad renal aguda e insuficiencia renal. Por tanto, los datos apoyaron que PA-PEG24 (SEQ ID NO: 21) puede prevenir la lesión renal aguda al reducir la hemólisis y la actividad de pseudoperoxidasa causada por la liberación de hemoglobina libre. Por tanto, los péptidos pueden prevenir la lesión renal aguda, así como tratar o prevenir afecciones hemolíticas tales como, p. ej., anemia drepanocítica, reacción a la transfusión hemolítica, hemólisis autoinmunitaria, etc.

Para comparar la actividad de IGIV frente a PIC1, los animales se trataron profilácticamente con una dosis igual de IGIV o PIC1 (40 mg/animal) o control de solución salina. La sangre de los animales que recibieron IGIV o PIC1 antes de la xenotransfusión se sometió a exploración por citometría de flujo de dos colores para la expresión de glucoforina A humana F y los fragmentos C3 unidos. Se muestran gráficos de citometría de flujo representativos de glóbulos rojos a los 0,5, 5 y 20 minutos después de la transfusión para los animales con IGIV (FIG. 27A-C) y PIC1 (FIG. 27D-F). La FIG. 28A muestra la hemólisis medida como Hb libre para animales que recibieron IGIV o PIC1 de forma profiláctica en comparación con el control de solución salina. A los 30 segundos después de la transfusión, los animales tratados con PIC1 demostraron un mayor número de glóbulos rojos humanos negativos para C3 (p = 0,05) y una disminución de 3,6 veces (p = 0,04) en los glóbulos rojos humanos opsonizados con C3 en comparación con los animales tratados con IGIV (FIG. 28B). A los 30 segundos después de la transfusión, Los animales tratados con PIC1 mostraron una tendencia hacia una disminución de la opsonización C3 de los glóbulos rojos no humanos (negativos para glucoforina A) (p = 0,08) en comparación con los animales con IGIV (FIG. 28C). El total de RBC humanos supervivientes a los 20 minutos se incrementó 1,6 veces (p = 0,03) para los animales tratados con PIC1 en comparación con los tratados con IGIV (FIG. 28D).

Para determinar si la Hb libre tóxica intravascular causaría lesión renal aguda, los animales se supervisaron durante 6 horas después de la transfusión. En el grupo de profilaxis con IGIV, se observó que dos de los tres animales presentaban hematuria macroscópica, así como tres de los cuatro animales del grupo de solución salina, pero la orina de los animales tratados con PIC1 parecía normal. En la necropsia, los riñones del grupo de IGIV tenían un aspecto más oscuro y agrandado en comparación con los riñones del grupo tratado con PIC1, que parecía normal (FIG. 29B). Al medir el peso de los riñones individualmente, el grupo de solución salina presentó un aumento significativo de peso en comparación con los animales que recibieron PIC1 (p = 0,0001) mientras que el grupo de IGIV también demostró un aumento significativo de peso en comparación con los animales que recibieron PIC1 (p = 0,005), compatible con riñones edematosos (FIG. 29A). Las secciones de histopatología revelaron que los animales tratados con solución salina y con IGIV tenían necrosis tubular aguda temprana, como se observa por la desaparición del núcleo y el material nuclear y el edema tubular (solución salina, FIG. 29C, i-ii; profilaxis con IGIV, FIG. 29C, iii-iv) en comparación con el edema ligero, pero por lo demás una arquitectura renal sana para los animales con PIC1 (profilaxis con PIC1, FIG. 29C, v y vi). Tomados en conjunto, estos datos demostraron que PIC1 inhibe la hemólisis de los glóbulos rojos no coincidentes transfundidos, lo que previene la posterior lesión renal aguda asociada a la Hb libre.

La rabdomiólisis es un síndrome grave causado por una lesión muscular directa o indirecta resultante de lesiones por aplastamiento, determinadas infecciones, uso de determinados medicamentos, convulsiones y otros acontecimientos. La lesión resultante en los tejidos provoca la liberación de mioglobina, la proteína transportadora de oxígeno que se encuentra en el tejido muscular, en el torrente sanguíneo. La mioglobina es perjudicial para los riñones y actualmente no existe tratamiento para la rabdomiólisis. El descubrimiento de que PA-PEG24 (SEQ ID NO: 21) puede inhibir la actividad pseudoperoxidasa de la hemoglobina (Hg) mostró que PA-PEG24 (SEQ ID NO: 21) es eficaz en el tratamiento de la rabdomiólisis. Debido a que la hemoglobina es similar a la mioglobina, la capacidad de PA-PEG24 (SEQ ID NO: 21) para inhibir la hemoglobina sugiere su eficacia para inhibir la actividad peroxidasa de la mioglobina.

Ejemplo 21 - Datos de toxicidad para péptidos y variantes de PIC1

Se han realizado estudios de toxicología de dosis individuales con PA-PEG24 (SEQ ID NO: 21) en ratas tanto para la dosis máxima administrable como para el límite superior del intervalo de dosis eficaz. Para la dosis máxima administrable (limitada por la concentración máxima alcanzable de PA-PEG24 (SEQ ID NO: 21) (60 mg [240 mg/kg] i.v.)) y el volumen administrable, en el grupo de tratamiento, se realizaron múltiples extracciones de sangre en seis animales durante 14 días. No se observaron toxicidades en los análisis de sangre (hemograma completo y análisis bioquímico completo de la sangre) durante las primeras 24 horas, 48 horas, día 7 o día 14. Se observa un pequeño descenso de la hemoglobina a las 48 horas debido a múltiples extracciones de sangre tomadas durante las primeras 24 horas. Se encontró histología normal en el cerebro, corazón, pulmones, hígado, bazo, riñones y páncreas. Los parámetros sanguíneos más pertinentes para este experimento se muestran en la TABLA 11.

Posteriormente se realizaron estudios de toxicidad con un mayor número de animales (n = 18 en el grupo de tratamiento) usando una dosis alta en el extremo superior del intervalo terapéutico (PA-PEG24 (SEQ ID NO: 21) a 40 mg [160 mg/kg] i.v.). Se sacrificaron ocho animales el día 3 y se sacrificaron diez el día 14. Los resultados de análisis de química sanguínea (CBC, superquímica y coagulación) no mostraron diferencias entre el pretratamiento, valores del día 3 o del día 14 (TABLA 12). No hubo pruebas histológicas de toxicidad en ningún órgano (incluyendo el cerebro, corazón, pulmones, hígado, bazo, riñones y páncreas) en cualquier punto temporal. Por tanto, la evaluación toxicológica de dosis individuales de la SEQ ID NO: 21 no reveló problemas de seguridad.

continuación

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Un péptido sintético que comprende una secuencia de aminoácidos y modificaciones seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 10, 12, 21, 35, 36, 37, 39, 43, 45 y 47.

2. Un péptido sintético que comprende la secuencia de aminoácidos y modificaciones de PEGilación de la SEQ ID NO: 21.

3. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del péptido sintético de cualquier reivindicación anterior y al menos un vehículo, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

4. El péptido sintético o la composición farmacéutica de cualquier reivindicación anterior para su uso en un procedimiento de:

a) tratamiento y/o prevención de una reacción hemolítica en un sujeto, opcionalmente, en el que el péptido se administra antes de que se administre al sujeto una transfusión de sangre, después de que se administre al sujeto la transfusión de sangre y/o durante la transfusión de sangre

b) tratamiento de la encefalopatía isquémica hipóxica en un sujeto

c) tratamiento de la fibrosis quística en un sujeto

d) tratamiento de la infección bacteriana en un sujeto

e) tratamiento de la infección vírica en un sujeto

f) tratamiento de la anemia hemolítica autoinmunitaria en un sujeto

g) tratamiento de la asfixia perinatal en un sujeto o

h) tratamiento de la lesión renal aguda en un sujeto,

comprendiendo el procedimiento administrar al sujeto que lo necesite una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del péptido sintético.

5. El péptido sintético o la composición farmacéutica para su uso en el procedimiento de la reivindicación 4a), en el que la reacción hemolítica se selecciona del grupo que consiste en la reacción transfusional hemolítica intravascular aguda (RTHIA), lesión pulmonar aguda relacionada con la transfusión (LPART) y refractariedad a la transfusión de plaquetas.

6. El péptido sintético o la composición farmacéutica para su uso en el procedimiento de la reivindicación 4d), en el que la infección bacteriana es causada por bacterias grampositivas o gramnegativas, en el que, opcionalmente, la infección bacteriana es causada por bacterias seleccionadas del grupo que consiste en Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumonía, Pseudomonas aeruginosa, Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis y Gardnerella sp.

7. El péptido sintético o la composición farmacéutica para su uso en el procedimiento de la reivindicación 4e), en el que la infección vírica es causada por el virus del herpes simple de tipo 1 (VHS-1) o el virus del herpes simple de tipo 2 (VHS-2).

8. El péptido sintético o la composición farmacéutica para su uso en el procedimiento de la reivindicación 4f), en el que la anemia hemolítica autoinmunitaria está caracterizada por uno o más de niveles elevados de bilirrubina sérica, exceso de urobilinógeno en la orina, reducción de la haptoglobina plasmática, aumento de la deshidrogenasa láctica (LDH) sérica, hemosiderinuria, metahemalbuminemia, esferocitosis, reticulocitosis y/o hiperplasia eritroide de la médula ósea.

9. El péptido sintético o la composición farmacéutica para su uso en el procedimiento de la reivindicación 4 g), en el que la presencia de asfixia perinatal se caracteriza por una puntuación de Apgar de 3 o menos que dura cinco minutos o más.

10. Un péptido sintético que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 10, 12, 21, 35, 36, 37, 39, 43, 45 y 47 para su uso en mejora del crecimiento de Lactobacillus en un sujeto.