ES2877084T3 - Carga remota de fármacos poco solubles en agua en liposomas - Google Patents

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Abstract

Una formulación farmacéutica que comprende un agente poco soluble en agua encapsulado dentro de un liposoma, dicha formulación fabricada mediante un método que comprende: (a) preparar una suspensión de los liposomas en un medio acuoso que tiene un gradiente de protones o iones a través de la membrana del liposoma; (b) preparar una solución del agente poco soluble en agua disolviendo completamente dicho agente poco soluble en agua en un disolvente seleccionado entre un disolvente aprótico y un poliol; (c) formar una suspensión de carga que comprende dicho agente sólido poco soluble en agua poniendo en contacto la suspensión del liposoma en (a) con la solución del agente poco soluble en agua en (b), diluyendo así (b) más allá del punto de solubilidad del agente, precipitando el agente activo poco soluble en agua en el medio acuoso formando así la suspensión de carga que comprende el agente sólido poco soluble en agua y los liposomas, en la que dicha suspensión de carga dispersa más luz que dicha suspensión de liposomas; y (d) incubar la suspensión final de (c) durante un período de tiempo suficiente para que el agente sólido poco soluble en agua se cargue remotamente desde el medio acuoso en los liposomas mediante el gradiente de protones o iones.

Description

DESCRIPCIÓN
Carga remota de fármacos poco solubles en agua en liposomas
Antecedentes de la invención
Esta invención se refiere a los campos de las composiciones farmacéuticas, los métodos para prepararlas y los usos de las composiciones resultantes en terapia con fármacos. Las composiciones farmacéuticas incluyen el agente terapéutico activo encapsulado dentro del interior acuoso de una vesícula de liposoma.
Descripción de la técnica relacionada
La industria farmacéutica, en su búsqueda de fármacos mejorados, ha generado un gran número de compuestos potentes que son poco solubles en agua, el disolvente omnipresente que hace posible la vida. La baja solubilidad en agua de estos nuevos medicamentos ha dificultado su administración en animales, incluidos los seres humanos. Esto ha creado la necesidad de sistemas de administración de fármacos que puedan solubilizar fármacos poco solubles en agua para permitir su administración en el cuerpo.
Los liposomas son estructuras vesiculares normalmente compuestas por una membrana bicapa de moléculas anfipáticas tales como fosfolípidos, que atrapan un núcleo acuoso. Los diámetros y la morfología de varios tipos de liposomas se ilustran en la Figura 1. Los medicamentos se encapsulan en el núcleo acuoso o se interdigitan en la membrana bicapa. Los medicamentos interdigitados en la membrana se transfieren fuera del liposoma cuando se diluye en el cuerpo. Es importante destacar que los medicamentos que se encapsulan en el núcleo acuoso o se mantienen en complejos en el núcleo acuoso se retienen sustancialmente durante más tiempo que los medicamentos en la bicapa. El uso de liposomas con medicamentos encapsulados en el núcleo acuoso para la administración de medicamentos está bien establecido (D. Drummond et al., J. Pharm. Sci., (2008) 97 (11): 4696-4740, PMID 10581328).
Está disponible una variedad de métodos de carga para encapsular compuestos funcionales, particularmente medicamentos, en liposomas. Los compuestos hidrófilos, por ejemplo, pueden encapsularse en liposomas hidratando una mezcla de compuestos funcionales y lípidos formadores de vesículas. Esta técnica se llama carga pasiva. El compuesto funcional se encapsula en el liposoma a medida que se forma la nanopartícula. Los procedimientos de producción de vesículas lipídicas (liposomas) disponibles son satisfactorios para la mayoría de las aplicaciones en las que se encapsulan medicamentos solubles en agua (G. Gregoriadis, Ed., Liposome Technology, (2006) Liposome Preparation and Related Techniques, 3a Ed.). Sin embargo, la fabricación de Las vesículas lipídicas que encapsulan medicamentos poco solubles en agua (por ejemplo, con una solubilidad en agua inferior a 2 mg/ml) en el compartimento interno acuoso del liposoma son extremadamente difíciles (D. Zucker et al., Journal of Controlled Release (2009) 139 : 73-80, PMID 19508880).
La carga pasiva de compuestos funcionales lipófilos y, en menor grado, anfifílicos, es algo más eficaz que los compuestos funcionales hidrófilos porque se reparten tanto en la bicapa lipídica como en el medio acuoso intraliposomal (interno). Sin embargo, utilizando la carga pasiva, la relación final del compuesto funcional con respecto al lípido, así como la eficacia de encapsulación, son generalmente bajas. La concentración de medicamento en el liposoma es igual a la del fluido circundante y el medicamento no atrapado en el medio acuoso interno se lava después de la encapsulación. Además, los medicamentos cargados en la bicapa se liberan del liposoma muy rápidamente cuando el liposoma se inyecta en un sujeto. Para la liberación sostenida del medicamento en un paciente, es preferible que el medicamento esté encapsulado dentro del interior del liposoma.
Ciertos compuestos hidrófilos o anfifílicos se pueden cargar en liposomas preformados usando gradientes de iones o de pH transmembrana (D. Zucker et al., Journal of Controlled Release (2009) 139: 73-80). Esta técnica se llama carga activa o remota. Los compuestos susceptibles de carga activa deberían poder cambiar de una forma sin carga, que puede difundirse a través de la membrana liposómica, a una forma cargada que no es capaz de hacerlo. Típicamente, el compuesto funcional se carga agregándolo a una suspensión de liposomas preparada para tener un gradiente iónico o de pH interno más bajo/externo más alto. A través de la carga activa, se puede lograr una alta relación de masa de compuesto funcional a lípido y una alta eficiencia de carga (hasta el 100%). Los ejemplos son la carga activa de los medicamentos anticancerígenos doxorrubicina, daunorrubicina y vincristina (P.R. Cullis et al., Biochimica et Biophysica Acta, (1997) 1331: 187-211, y la referencias citadas allí).
Los medicamentos hidrófobos solo se consideran capaces de cargarse en los liposomas a través de la intercalación de membranas a través de algún mecanismo de carga/ensamblaje pasivo. Wasan et al., afirma que "los agentes que tienen atributos hidrófobos pueden intercalarse en la bicapa lipídica y esto se puede lograr añadiendo el agente a los liposomas preformados" en una descripción del uso de micelas para transferir agentes poco solubles a una bicapa de liposomas (documento US 2009/0028931).
La carga remota de un medicamento poco soluble en un liposoma en condiciones en las que el medicamento está por encima de su límite de solubilidad y está en forma de precipitado es un evento inesperado. D. Zucker et al., Journal of Controlled Release (2009) 139: 73-80 afirma que "las moléculas hidrofóbicas pueden agregarse, y estos agregados tienen baja permeabilidad a través de la membrana liposomal. Por lo tanto, cuando la relación de superficie no polar/polar es > 2,31 véase la Figura 4 en Zucker et al. Journal of Controlled Release (2009) 139: 73-80), es necesario que el medicamento tenga una solubilidad razonable, > 1,9 mM, para lograr una alta carga porque solo las moléculas solubles sin carga pueden entrar en el liposoma" (D. Zucker et al., Journal of Controlled Release (2009) 139: 73-80). Hasta la fecha, no se ha desarrollado un método para la carga activa del núcleo acuoso de un liposoma con un agente poco soluble en agua a partir de un precipitado.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 ilustra los diámetros y la morfología de varios tipos de liposomas.
La Figura 2. Se incubaron formulaciones de liposomas compuestas de HSPC/Chol/Peg-DSPE que contenían sulfato de sodio (tono claro) o sulfato de amonio (tono oscuro) con carfilzomib en dos proporciones de entrada de medicamento con respecto al lípido usando las condiciones descritas a continuación. Los liposomas se purificaron a partir del medicamento no encapsulado y se muestra la cantidad de carfilzomib encapsulado dentro de los liposomas, expresada como |jg de carfilzomib por jm ol de lípido.
La Figura 3 es un gráfico de barras que muestra un efecto del agente de captura sobre la carga de liposomas de carfilzomib.
La Figura 4 es un gráfico de barras que muestra el efecto de un método de introducción de un medicamento sobre la carga de liposomas de carfilzomib.
La Figura 5 es un gráfico de líneas que muestra la carga de carfilzomib del precipitado demostrado por la reducción de la dispersión de la luz a 600 nm.
La Figura 6 es un cromatograma de HPLC de Carfilzomib antes de cargarlo en los liposomas (superior) y después de cargarlo en los liposomas de un precipitado y luego ser liberado de los liposomas usando un gradiente de sulfato de amonio inverso cuando se convierte de nuevo en un precipitado en la solución extraliposomica (inferior).
La Figura 7 es un gráfico de líneas que muestra la eficacia de encapsulación de liposomas en función de la concentración de DMSO. La relación de entrada del medicamento con respecto al lípido fue de 200 jg /jm o l.
La Figura 8 es un gráfico de líneas que muestra la dispersión de la luz de la solución de carfilzomib en función de la concentración de DMSO. La concentración de carfilzomib fue de 0,2 mg/ml.
La Figura 9 es un gráfico de barras que muestra el efecto del tiempo de retardo entre la formación del precipitado de medicamento y la carga del liposoma del precipitado.
La Figura 10 es un gráfico de líneas que muestra el efecto de la concentración del agente de captura de sulfato de amonio sobre la carga útil del medicamento liposómico de carfilzomib cargado a partir de un precipitado.
La Figura 11 es un gráfico de líneas que muestra el efecto de la concentración del agente de captura de sulfato de amonio sobre la eficacia de carga de liposomas del carfilzomib a partir del precipitado.
La Figura 12 es un gráfico de líneas de la carga de un precipitado de carfilzomib insoluble en liposomas usando un gradiente de sulfato de trietilamonio.
La Figura 13 es un gráfico de líneas que muestra la transferencia del precipitado de carfilzomib insoluble a los liposomas mediante carga remota.
La Figura 14 es un gráfico de barras que muestra la comparación de la carga de liposomas de aripiprazol cuando se mezcla con liposomas como un complejo SBCD (Abilify) o cuando se diluye a partir de una solución madre de DMSO directamente en liposomas, creando una suspensión de medicamento.
La Figura 15 es un gráfico de barras que muestra la absorbancia a 600 nm (dispersión) de soluciones de medicamentos (barras oscuras) y mezclas de medicamentos de liposomas (barras grises). El rectángulo indica las muestras en las que se midió una disminución sustancial de la dispersión tras la incubación con liposomas, lo que indica la carga de medicamento.
La Figura 16 es un gráfico de barras que muestra la eficacia de carga de DFX en liposomas de acetato de calcio. La Figura 17 es un gráfico que muestra la capacidad de carga de DFX en liposomas que contienen acetato de calcio como agente de captura.
La Figura 18 es un gráfico que muestra la capacidad de carga de DFX en liposomas que contienen diferentes agentes de captura de acetato.
Sumario de la invención
Al utilizar liposomas para el suministro de compuestos funcionales, generalmente es deseable cargar los liposomas a una alta concentración, lo que da como resultado una alta relación de masa del compuesto funcional con respecto a al lípido, ya que esto reduce la cantidad de liposomas a administrar por tratamiento para lograr el efecto terapéutico requerido, tanto más cuanto que varios lípidos utilizados en liposomas tienen por sí mismos una toxicidad limitante de la dosis. El porcentaje de carga también es importante para la rentabilidad, ya que una carga deficiente da como resultado una gran pérdida del compuesto activo.
La invención proporciona liposomas que encapsulan un agente poco soluble en agua como se define en las reivindicaciones adjuntas.
En una realización de ejemplo, la invención proporciona un liposoma que comprende una membrana lipídica liposomal que encapsula un medio acuoso interno. El medio acuoso interno comprende una solución acuosa de un complejo entre un agente de captura y un agente terapéutico poco soluble en agua.
En un ejemplo de realización adicional, la invención proporciona formulaciones farmacéuticas que comprenden un liposoma de la invención. Las formulaciones incluyen el liposoma y un diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. En varias realizaciones, la formulación farmacéutica está en un formato de dosis unitaria, que proporciona una dosis unitaria del agente terapéutico encapsulado en el liposoma.
En otro ejemplo de realización, la invención proporciona métodos para preparar los liposomas de la invención. En varias realizaciones, se proporciona un método para cargar remotamente un liposoma con un agente que es poco soluble en agua. El método comprende: a) incubar una mezcla acuosa que comprende: (i) una suspensión de liposomas que tiene un gradiente de protones y/o iones que existe a través de la membrana liposomal; (ii) con una suspensión acuosa de un medicamento poco soluble (iii) en el que la suspensión del medicamento se prepara disolviendo completamente el medicamento en un disolvente aprótico o poliol y diluyéndolo en la solución acuosa más allá del punto de solubilidad del medicamento cuando se forma un precipitado, en el que la incubación de la mezcla de precipitado de medicamento liposómico combinado durante un período de tiempo da como resultado que el medicamento se acumule dentro del interior del liposoma en respuesta al gradiente de protones/iones. La mezcla usada para cargar el liposoma con el agente se prepara de manera que exista un gradiente de protones y/o iones a través de la membrana liposomal entre la membrana acuosa interna y el medio acuoso externo. La incubación puede ser durante cualquier período útil, pero preferiblemente durante un período de tiempo suficiente para hacer que al menos parte del precipitado de medicamento insoluble se acumule en el medio acuoso interno bajo la influencia del gradiente de protones y/o iones.
Otras realizaciones, objetivos y ventajas se establecen en la Descripción detallada que sigue.
Descripción de las realizaciones preferidas
Introducción
Al utilizar liposomas para la administración de compuestos funcionales, generalmente es deseable cargar los liposomas a una alta concentración, lo que da como resultado una alta relación de masa de agente con respecto al lípido, ya que esto reduce la cantidad de liposomas que se administrarán por tratamiento para lograr el efecto terapéutico requerido del agente, tanto más cuanto que varios lípidos usados en liposomas tienen por sí mismos una toxicidad limitante de la dosis. El porcentaje de carga también es importante para la rentabilidad, ya que una carga deficiente da como resultado un aumento de la pérdida de agente durante la carga del agente en el liposoma.
La presente invención proporciona liposomas encapsulantes de agentes, por ejemplo, moderadamente solubles en agua, métodos para fabricar dichos liposomas, formulaciones que contienen dichos liposomas y métodos para fabricar los liposomas y formulaciones de la invención.
En un ejemplo de realización, la invención proporciona un liposoma que tiene una membrana que encapsula un compartimento acuoso. El liposoma se prepara de manera que exista un gradiente de protones y/o iones a través de la membrana liposómica entre el compartimento acuoso interno y el medio acuoso externo. El agente se disuelve en un disolvente aprótico a una concentración que, cuando se diluye en la suspensión de liposomas para formar la mezcla de carga remota, se excede su solubilidad en la suspensión y el agente forma un precipitado. Una porción del precipitado del agente se carga en el compartimento acuoso del liposoma usando un gradiente de protones y/o iones a través de la membrana liposomal entre el compartimento acuoso interno y el medio acuoso externo.
En algunas realizaciones, esencialmente la cantidad total del precipitado de agente insoluble en la mezcla de carga remota se carga en el compartimento acuoso del liposoma. En un ejemplo de realización, al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 80% o al menos aproximadamente el 70% del precipitado de medicamento insoluble en la mezcla de carga remota se carga en el compartimento acuoso del liposoma.
Liposomas
El término liposoma se usa en el presente documento de acuerdo con su significado habitual, refiriéndose a vesículas lipídicas microscópicas compuestas por una bicapa de fosfolípidos o cualquier lípido anfipático similar que encapsula un medio acuoso interno. Los liposomas de la presente invención pueden ser vesículas unilaminares tales como vesículas unilaminares pequeñas (SUV) y vesículas unilaminares grandes (LUV), y vesículas multilaminares (MLV), que varían típicamente en tamaño de 30 nm a 200 nm. No se impone ninguna limitación particular sobre la estructura de la membrana liposomal en la presente invención. El término membrana liposomal se refiere a la bicapa de fosfolípidos que separa el medio acuoso interno del medio acuoso externo.
Los ejemplos de membranas liposomales útiles en la presente invención se pueden formar a partir de una variedad de lípidos formadores de vesículas, que incluyen típicamente lípidos de cadena dialifática, tales como fosfolípidos, diglicéridos, glicolípidos dialifáticos, lípidos simples tales como esfingomielina y glicoesfingolípido, colesterol y derivados de los mismos y sus combinaciones. Como se define en el presente documento, los fosfolípidos son agentes anfifílicos que tienen grupos hidrófobos formados por cadenas de alquilo de cadena larga y un grupo hidrófilo que contiene una fracción fosfato. El grupo de fosfolípidos incluye ácido fosfatídico, fosfatidil gliceroles, fosfatidilcolinas, fosfatidiletanolaminas, fosfatidilinositoles, fosfatidilserinas y mezclas de los mismos. Preferiblemente, los fosfolípidos se eligen entre 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC), dimiristoil-fosfatidilcolina (DMPC), fosfatidilcolina de soja hidrogenada (HSPC), fosfatidilcolina de soja (SPC), dimiristoilfosfatidilglicerol (DMPG), diestearoilfosfatidilglicerol (DSPG), 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC), diestearoilfosfatidilcolina (DSPC), fosfatidilcolina de yema de huevo (EYPC) ) o fosfatidilcolina de yema de huevo hidrogenada (HEPC), lípidos modificados con esterol (SML), lípidos catiónicos y lípidos anfotéricos inversos.
Las membranas liposomales de acuerdo con la presente invención pueden comprender además ionóforos como la nigericina y A23187.
En el método de acuerdo con la presente invención, un ejemplo de temperatura de transición de fase liposomal está entre -25 °C y 100 °C, por ejemplo, entre 4 °C y 65 °C. La temperatura de transición de fase es la temperatura requerida para inducir un cambio en el estado físico de los lípidos que constituyen el liposoma, desde la fase de gel ordenada, en la que las cadenas de hidrocarburos están completamente extendidas y empaquetadas, hasta la fase cristalina líquida desordenada, en la que las cadenas hidrocarbonadas están orientadas al azar y son fluidas. Por encima de la temperatura de transición de fase del liposoma, aumenta la permeabilidad de la membrana liposomal. La elección de una temperatura de transición alta, en la que el liposoma siempre estaría en estado de gel, podría proporcionar una composición liposomal sin fugas, es decir, la concentración del agente poco soluble en agua en el medio acuoso interno se mantiene durante la exposición al medio ambiente. Alternativamente, un liposoma con una temperatura de transición entre la temperatura inicial y final del entorno al que está expuesto proporciona un medio para liberar el agente poco soluble en agua cuando el liposoma pasa por su temperatura de transición. Por lo tanto, la temperatura del proceso para la técnica de carga activa está típicamente por encima de la temperatura de transición de la fase liposomal para facilitar el proceso de carga activa. Como se conoce generalmente en la técnica, las temperaturas de transición de fase de los liposomas pueden, entre otros parámetros, estar influenciadas por la elección de fosfolípidos y por la adición de esteroides como colesterol, lanosterol, colestanol, estigmasterol, ergosterol y similares. Por lo tanto, en una realización de la invención, se proporciona un método de acuerdo con cualquiera de los anteriores en el que los liposomas comprenden uno o más componentes seleccionados de diferentes fosfolípidos y colesterol en varias proporciones molares con el fin de modificar la transición, la temperatura de proceso requerida y la estabilidad de los liposomas en plasma. Menos colesterol en la mezcla dará como resultado liposomas menos estables en plasma. Un ejemplo de composición de fosfolípidos de uso en la invención comprende entre aproximadamente un 10 y aproximadamente un 50% en moles de esteroides, preferiblemente colesterol.
De acuerdo con la invención, los liposomas pueden prepararse mediante cualquiera de las técnicas ahora conocidas o desarrolladas posteriormente para preparar liposomas. Por ejemplo, los liposomas pueden formarse mediante la técnica convencional para preparar vesículas lipídicas multilaminares (MLV), es decir, depositando uno o más lípidos seleccionados en las paredes internas de un recipiente adecuado disolviendo los lípidos en cloroformo y luego evaporando el cloroformo y añadiendo luego la solución acuosa que se va a encapsular en el recipiente, permitiendo que la solución acuosa hidrate el lípido y arremolinando o agitando en vórtex la suspensión de lípidos resultante. Este proceso genera una mezcla que incluye los liposomas deseados. Alternativamente, las técnicas utilizadas para producir grandes vesículas lipídicas unilaminares (LUV), tal como la evaporación en fase inversa, los procedimientos de infusión y la dilución de detergente, pueden utilizarse para producir los liposomas. Se puede encontrar una revisión de estos y otros métodos para producir vesículas lipídicas en el texto Liposome Technology, Volumen I, Gregory Gregoriadis Ed., CRC Press, Boca Raton, Fla., (1984), que se incorpora en el presente documento como referencia. Por ejemplo, las partículas que contienen lípidos pueden estar en forma de vesículas lipídicas esteroideas, vesículas lipídicas plurilaminares estables (SPLV), vesículas monofásicas (MPV) o portadores de matriz lipídica (LMC). En el caso de las MLV, si se desea, los liposomas pueden someterse a múltiples (cinco o más) ciclos de congelacióndescongelación para mejorar sus volúmenes atrapados y sus eficiencias de captura y para proporcionar una distribución interlaminar de soluto más uniforme.
Después de la preparación de los liposomas, los liposomas se dimensionan opcionalmente para lograr un intervalo de tamaños deseado y una distribución relativamente estrecha de los tamaños de los liposomas. Un intervalo de tamaño de aproximadamente 20-200 nanómetros permite esterilizar la suspensión de liposomas mediante filtración a través de un filtro convencional, típicamente un filtro de 0,22 o 0,4 micrómetros. El método de esterilización por filtración se puede llevar a cabo con un alto rendimiento si los liposomas se han reducido a aproximadamente 20-200 nanómetros. Se encuentran disponibles varias técnicas para dimensionar los liposomas a un tamaño deseado. La sonicación de una suspensión de liposomas mediante sonicación en baño o sonda produce una reducción progresiva de tamaño hasta pequeñas vesículas unilaminares de menos de aproximadamente 50 nanómetros de tamaño. La homogeneización es otro método que se basa en la energía de corte para fragmentar liposomas grandes en otros más pequeños. En un procedimiento de homogeneización típico, las vesículas multilaminares se recirculan a través de un homogeneizador de emulsión estándar hasta que se observan tamaños de liposomas seleccionados, típicamente entre aproximadamente 50 y 500 nanómetros. En ambos métodos, la distribución del tamaño de partícula se puede controlar mediante la determinación del tamaño de partícula con un haz de láser convencional. La extrusión de liposomas a través de una membrana de policarbonato de poros pequeños o una membrana cerámica asimétrica también es un método eficaz para reducir los tamaños de los liposomas hasta una distribución de tamaños relativamente bien definida. Normalmente, la suspensión se cicla a través de la membrana una o más veces hasta que se logra la distribución de tamaño de liposoma deseada. Los liposomas pueden extrudirse sucesivamente a través de membranas de poros más pequeños, para lograr una reducción gradual del tamaño de los liposomas. Alternativamente, los liposomas de tamaño controlado se pueden preparar utilizando técnicas de microfluidos en las que el lípido en un disolvente orgánico como etanol o mezclas de etanol-disolvente aprótico se mezclan rápidamente con el medio acuoso, de modo que la relación disolvente orgánico/agua sea inferior al 30%, en un microcanal con dimensiones inferiores a 300 micrómetros y preferiblemente inferiores a 150 micrómetros de ancho y 50 micrómetros de alto. A continuación, el disolvente orgánico se elimina de los liposomas mediante diálisis. Los expertos en la técnica conocen otros métodos útiles de dimensionamiento tales como sonicación, vaporización de disolvente o evaporación en fase inversa.
Los ejemplos de liposomas para su uso en diversas realizaciones de la invención tienen un tamaño de aproximadamente 30 nanómetros a aproximadamente 40 micrómetros.
El medio acuoso interno, como se menciona en el presente documento, es típicamente el medio original en el que se prepararon los liposomas y que inicialmente se encapsula tras la formación del liposoma. De acuerdo con la presente invención, los liposomas recién preparados que encapsulan el medio acuoso original pueden usarse directamente para activar la carga. Sin embargo, también se contemplan realizaciones en las que los liposomas, después de la preparación, se deshidratan, por ejemplo para almacenamiento. En tales realizaciones, el presente proceso puede implicar la adición de los liposomas deshidratados directamente al medio acuoso externo usado para crear los gradientes transmembrana. Sin embargo, también es posible hidratar los liposomas en otro medio externo primero, como entenderán los expertos en la técnica. Los liposomas se deshidratan opcionalmente a presión reducida usando un equipo de liofilización estándar o un aparato equivalente. En varias realizaciones, los liposomas y el medio que los rodea se congelan en nitrógeno líquido antes de deshidratarlos y colocarlos a presión reducida. Para asegurar que los liposomas sobrevivirán al proceso de deshidratación sin perder una parte sustancial de su contenido interno, se emplean típicamente uno o más azúcares protectores para interactuar con las membranas de las vesículas lipídicas y mantenerlas intactas mientras se elimina el agua del sistema. Puede usarse una variedad de azúcares, incluidos azúcares tales como trehalosa, maltosa, sacarosa, glucosa, lactosa y dextrano. En general, se ha encontrado que los azúcares disacáridos funcionan mejor que los azúcares monosacáridos, siendo los azúcares disacáridos trehalosa y sacarosa los más efectivos. También se pueden utilizar otros azúcares más complicados. Por ejemplo, se ha descubierto que los aminoglucósidos, que incluyen estreptomicina y dihidroestreptomicina, protegen a los liposomas durante la deshidratación. Normalmente, se incluyen uno o más azúcares como parte del medio interno o externo de las vesículas lipídicas. Lo más preferiblemente, los azúcares se incluyen tanto en el medio interno como en el externo para que puedan interactuar con las superficies internas y externas de las membranas de los liposomas. La inclusión en el medio interno se logra agregando el azúcar o azúcares al tampón que se encapsula en las vesículas lipídicas durante el proceso de formación de liposomas. En estas realizaciones, el medio externo utilizado durante el proceso de carga activa también debe incluir preferiblemente uno o más de los azúcares protectores.
Como es conocido generalmente por los expertos en la técnica, los conjugados de polietilenglicol (PEG)-lípido se han utilizado ampliamente para mejorar los tiempos de circulación de compuestos funcionales encapsulados en liposomas, para evitar o reducir la fuga prematura del compuesto funcional de la composición del liposoma y para evitar la detección de liposomas por el sistema inmunológico del cuerpo. La unión de lípidos derivados de PEG a los liposomas se denomina PEGilación. Por lo tanto, en un ejemplo de realización de la invención, los liposomas son liposomas PEGilados. La PEGilación se puede lograr incubando un derivado reactivo de PEG con los liposomas diana. Los lípidos derivados de PEG adecuados de acuerdo con la invención incluyen conjugados de DSPE-PEG, funcionalizados con uno de ácidos carboxílicos, glutatión (GSH), maleimidas (MAL), ácido 3-(2-piridilditio)propiónico (PDP), cianuro, azidas, aminas, biotina o folato, en los que el peso molecular de PEG se encuentra entre 2.000 y 5.000 g/mol. Otros lípidos derivados de PEG adecuados son los mPEG conjugados con ceramida, que tienen colas Cg o C16, en las que el peso molecular de mPEG está entre 750 y 5.000 daltons. Aún otros ligandos apropiados son mPEG o PEG funcionalizados conjugados con glicerofosfolípidos tales como 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DMPE), 1,2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DPPE), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DOPE) y 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (DSPE), y similares. La PEGilación de liposomas es una técnica generalmente conocida por los expertos en la materia.
En varias realizaciones, los liposomas se PEGilan con conjugados DSPE-PEG-GSH (hasta 5% en moles) y/o conjugados DSPE-mPEG (en los que el peso molecular de p Eg está típicamente dentro del intervalo de 750-5.000 daltons, por ejemplo, 2000 daltons). La composición de fosfolípidos de un ejemplo de liposoma PEGilado de la invención puede comprender hasta 5-20% en moles de conjugados de PEG-lípido.
Además, en determinadas realizaciones, se incorporan a la membrana una o más fracciones que dirigen específicamente el liposoma a un tipo de célula, tejido o similar en particular. El direccionamiento de liposomas usando una variedad de fracciones de direccionamiento (por ejemplo, ligandos, receptores y anticuerpos monoclonales) se ha descrito previamente. Ejemplos adecuados de tales fracciones de direccionamiento incluyen ácido hialurónico, anticuerpos y fragmentos de anticuerpos de la familia anti-ErbB, lipoproteína lipasa (LPL), [a]2-macroglobulina ([a]2M), proteína asociada al receptor (RAP), lactoferrina, desmoteplasa, activador del plasminógeno tipo tejido y uroquinasa (tPA/uPA), inhibidor del activador del plasminógeno (PAI-I), complejos tPA/upA:PAI-1, melanotransferrina (o P97), trombospondina 1 y 2, lipasa hepática, inhibidor de la vía del factor Vila/factor de tejido (TFPI), factor Villa, factor IXa, A[p]1-40, proteína precursora [p]amiloide (APP), inhibidor de CI, complemento C3, apolipoproteína E (apoE), exotoxina A de pseudomonas, CRM66, Proteína Tat del HIV, rinovirus, metaloproteinasa 9 de matriz (MMp-9), MMP-13 (colagenasa 3), proteína activadora de esfingolípidos (SAP), proteína de la zona de embarazo, antitrombina III, cofactor II de heparina, [a]1 -antitripsina, proteína 96 de choque térmico (HSP-96), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), apolipoproteína J (apoJ o clusterina), A[p] unido a apoJ y apoE, aprotinina, angiopep-2 (TFFYGGSRGKRNNFKTEEY), lipoproteína de muy baja densidad (VLDL), transferrina, insulina, leptina, un factor de crecimiento similar a la insulina, factores de crecimiento epidérmico, lectinas, anticuerpos peptidomiméticos y/o monoclonales humanizados, anticuerpos de cadena simple o péptidos específicos para dichos receptores (por ejemplo, secuencias HAIYPRH y THRPPMWSPVWP que se unen al receptor de transferrina humana, o al anticuerpo monoclonal A24 del receptor de transferrina anti-humana (TfR)), hemoglobina, porción no tóxica de una cadena polipeptídica de la toxina de la difteria, toda o una porción de la cadena B de la toxina de la difteria, toda o una porción de un mutante no tóxico de la toxina CRM197 de la difteria, apolipoproteína B, apolipoproteína E (por ejemplo, después de unirse al recubrimiento de polisorb-80), proteína de unión a vitamina D, proteína de unión a vitamina A/retinol, proteína transportadora en plasma de vitamina B12/cobalamina, glutatión y transcobalamina B12.
Los mecanismos de direccionamiento generalmente requieren que los agentes de direccionamiento se posicionen en la superficie del liposoma de tal manera que las fracciones diana estén disponibles para la interacción con la diana, por ejemplo, un receptor de la superficie celular. En un ejemplo de realización, el liposoma se fabrica para incluir una porción de conector incorporada en la membrana en el momento de formar la membrana. Un ejemplo de porción del conector tiene una porción lipófila que está firmemente incrustada y anclada en la membrana. Un ejemplo de porción del conector también incluye una porción hidrofílica que está disponible químicamente en la superficie acuosa del liposoma. La porción hidrofílica se selecciona de modo que sea químicamente adecuada para formar un enlace químico estable con el agente de direccionamiento, que se añade posteriormente. Las técnicas para incorporar una fracción de direccionamiento en la membrana liposómica se conocen generalmente en la técnica.
En un ejemplo de realización, el liposoma incluye HSPC, colesterol, PEG-DSPE y una combinación de los mismos. En un ejemplo de realización, el liposoma incluye de aproximadamente 50 moles a aproximadamente 70 moles de HSPC, de aproximadamente 30 moles a aproximadamente 50 moles de colesterol y de aproximadamente 1 mol a aproximadamente 10 moles de PEG-DSPE. En una realización, el liposoma incluye aproximadamente 60 moles de HSPC, aproximadamente 40 moles de colesterol y aproximadamente 5 moles de PEG-DSPE.
Agente poco soluble en agua
Como se indicó anteriormente, la presente invención proporciona liposomas que encapsulan un agente poco soluble en agua. En el contexto de la presente invención, el término 'poco soluble en agua' significa ser insoluble o tener una solubilidad muy limitada en agua, más en particular tener una solubilidad acuosa de menos de 2 mg/ml, por ejemplo, menos de 1,9 mg/ml, por ejemplo, que tiene una solubilidad acuosa de menos de 1 mg/ml. Como se usa en este documento, las solubilidades en agua se refieren a solubilidades medidas a temperatura ambiente, que típicamente es de aproximadamente 20 °C. En un ejemplo de realización, la solubilidad en agua del agente se mide a aproximadamente pH = 7.
De acuerdo con un ejemplo de realización de la invención, el agente poco soluble en agua es un agente terapéutico seleccionado del grupo de un compuesto terapéutico que se selecciona de un grupo que consiste en un compuesto de antraciclina, un compuesto de camptotecina, un alcaloide de la vinca, un compuesto de elipticina, un compuesto de taxano, un compuesto de wortmanina, un compuesto de geldanamicina, un compuesto de pirazolopirimidina, un compuesto a base de péptidos tal como carfilzomib, un compuesto de esteroides, un derivado de cualquiera de los anteriores, un profármaco de cualquiera de los anteriores, y un análogo de cualquiera de los anteriores.
Los ejemplos de compuestos de molécula pequeña que tienen una solubilidad en agua inferior a aproximadamente 2 mg/ml incluyen, pero no se limitan a, carfilzomib, voriconazol, amiodarona, ziprasidona, aripiprazol, imatinib, lapatinib, ciclopamina, oprozomib, CUR-61414, PF-05212384, PF-4691502, toceranib, PF-477736, PF-337210, sunitinib, SU14813, axitinib, AG014699, veliparib, MK-4827, ABT-263, SU11274, PHA665752, Crizotinib, XL880, PF-04217903, XR5000, AG14361, veliparib, bosutinib, PD-0332991, PF-01367338, AG14361, NVP-ADW742, NVP-AUY922, NVP-LAQ824, NVP-TAE684, NVPLBH589, errubulina, doxorrubicina, daunorrubicina, mitomicina C, epirrubicina, pirarrubicina, rubidomicina, carcinomicina, N-acetiladriamicina, rubidazona, 5-imido daunomicina, N-acetil daunomicina, daunorilina, mitoxantrona, camptotecina, 9-aminocamptotecina, 7-etilcamptotecina, 7-etil-10-hidroxicamptotecina, 10-hidroxicamptotecina, 9-nitrocamptotecina, 10,11-metilendioxicamptotecina, 9-amino-10,11-metilendioxicamptotecina, 9-cloro-10,11-metilendioxicamptotecina, irinotecano, lurtotecano, silatecano, (7-(4-metil piperazinometilen)-10,11-etilendioxi-20(S)-camptotecina, 7-(4-metilpiperazinometilen)-10,11-metilendioxi-20(S)-camptotecina , 7-(2-N-isopropilamino)etil)-(20S)-camptotecina, CKD-602, vincristina, vinblastina, vinorelbina, vinflunina, vinpocetina, vindesina, elipticina, 6-3-aminopropil-elipticina, 2-dietilaminoetil-elipticinio, dateliptio, reteliptina, paclitaxel, docetaxel, diclofenaco, bupivacaína, 17-dimetilaminoetilamino-17-demetoxigeldanamicina, cetirizina, fexofenadina, primidona y otras catecolaminas, epinefrina, ácido (S)-4,5-(2,4-didihidroxifenil)-4,5-dihidro-4-metil-4-tiazolcarboxílico (deferitrina), ácido (S)-4,5-dihidro-2-(3-hidroxi-2-piridinil)-4-metil-4-tiazolcarboxílico (desferritiocina), ácido (S)-4,5-dihidro-2-[2-hidroxi-4-(3,6,9,12-tetraoxatrideciloxi)fenil]-4-metil-4-tiazolcarboxílico, ácido (S)-4,5-dihidro-2-[2-hidroxi-4-(3,6-dioxaheptiloxi)fenil]-4-metil-4-tiazolcarboxílico, (S)-4,5-dihidro-2-[2-hidroxi-4-(3,6-dioxaheptiloxi)fenil]-4-metil-4-tiazolcarboxilato de etilo, ácido (S)-4,5-dihidro-2-[2-hidroxi-3-(3,6,9-trioxadeciloxi)]-4-metil-4-tiazolcarboxílico, sales de desazadesferritiocina, profármacos y derivados de estos compuestos medicinales y mezclas de los mismos.
Un ejemplo de agente terapéutico se selecciona de: un derivado de antihistamina etilendiamina, bromfenifamina, difenhidramina, un medicamento antiprotozoarios, quinolona, yodoquinol, un compuesto de amidina, pentamidina, un compuesto antihelmíntico, pirantel, un medicamento antiesquistosómico, oxaminiquina, un derivado del antifúngico triazol, fliconazol, itraconazol, ketoconazol, miconazol, una cefalosporina antimicrobiana, agentes quelantes, deferoxamina, deferasirox, deferiprona, FBS0701, cefazolina, cefonicid, cefotaxima, ceftazimida, cefuoxima, un derivado antimicrobiano de beta-lactama, aztreopam, cefmetazol, cefoxitina, un antimicrobiano del grupo de la eritromicina, eritromicina, azitromicina, claritromicina, oleandomicina, un compuesto de penicilina, bencilpenicilina, fenoximetilpenicilina, cloxacilina, meticilina, nafcilina, oxacilina, carbenicilina, un compuesto, de tetraciclina; novobiocina, espectinomicina, vancomicina; un medicamento antimicobacteriano, ácido aminosalicíclico, capreomicina, etambutol, isoniazida, pirazinamida, rifabutina, rifampina, clofazimina, un compuesto antiviral de adamantano, amantadina, rimantadina, un compuesto de quinidina, quinina, quinacrina, cloroquina, hidroxicloroquina, primaquina, amodiaquina, mefloquina, un antimicrobiano, quinolona, ciprofloxacina, enoxacina, lomefloxacina, ácido naladíxico, norfloxacina, ofloxacina, una sulfonamida; un antimicrobiano del tracto urinario, nitrofurantoína, trimetoprim; derivado de anitroimidazoles, metronidazol, un compuesto colinérgico de amonio cuaternario, ambetinio, neostigmina, fisostigmina, una aminoacridina contra el Alzheimer, tacrina, un medicamento contra el Parkinson, benztropina, biperideno, prociclidina, trihexilenidilo, un agente antimuscarínico, atropina, hiosciamina, escopolamina, propantelina, un compuesto adrenérgico, dopamina, serotonina, un inhibidor de erizo, albuterol, dobutamina, efedrina, epinefrina, norepinefrina, isoproterenol, metaproterenol, salmeterol, terbutalina, un inhibidor de la recaptación de serotonina, un derivado de ergotamina, un miorrelajante, una serie del curare un miorrelajante de acción central, baclofeno, ciclobenzepina, dentroleno, nicotina, un antagonista del receptor de nicotina, un beta-adrenobloqueador, acebutilo, amiodarona, un compuesto de benzodiazepina, diltiazem, un medicamento antiarrítmico, diisopiramida, encaidina, un compuesto anestésico local, procaína, procainamida, lidocaína, flecaimida, quinidina, un inhibidor de ACE, captopril, enelaprilat, un inhibidor de Hsp90, fosinoprol, quinapril, ramipril; un derivado opiáceo, codeína, meperidina, metadona, morfina, un antilipidémico, fluvastatina, gemfibrosil, un inhibidor de HMG-coA, pravastatina, un medicamento hipotensivo, clonidina, guanabenz, prazocina, guanetidina, granadril, hidralazina, un vasodilatador no coronario, dipiridamol, un inhibidor de acetilcolina esterasa, pilocarpina, un alcaloide, fisostigmina, neostigmina, un derivado de cualquiera de los anteriores, un profármaco de cualquiera de los anteriores y un análogo de cualquiera de los anteriores.
Sin embargo, esta lista de agentes no pretende limitar el alcance de la invención. De hecho, el compuesto encapsulado dentro del liposoma puede ser cualquier base débil anfipática o ácido débil anfipático poco soluble en agua. Como se indicó anteriormente, las realizaciones en las que el agente poco soluble en agua no es un agente farmacéutico o medicinal también están incluidas en la presente invención.
Normalmente, dentro del contexto de la presente invención, las bases débiles anfipáticas poco solubles en agua tienen un coeficiente de distribución octanol-agua (logD) a pH 7 entre -2,5 y 2 y un pKa <11, mientras que los ácidos débiles anfipáticos poco solubles en agua tienen un logD a pH 7 entre -2,5 y 2 y un pKa > 3.
Normalmente, los términos base débil y ácido débil, como se usaron anteriormente, se refieren respectivamente a compuestos que están solo parcialmente protonados o desprotonados en agua. Los ejemplos de agentes protonables incluyen compuestos que tienen un grupo amino, que pueden protonarse en medios ácidos, y compuestos que son zwitteriónicos en medios neutros y que también pueden protonarse en entornos ácidos. Los ejemplos de agentes desprotonables incluyen compuestos que tienen un grupo carboxilo, que pueden desprotonarse en medios alcalinos, y compuestos que son zwitteriónicos en medios neutros y que también pueden desprotonarse en ambientes alcalinos.
El término zwitteriónico se refiere a compuestos que pueden portar simultáneamente una carga eléctrica positiva y negativa en diferentes átomos. El término anfipático, como se mencionó anteriormente, se emplea típicamente para referirse a compuestos que tienen fracciones tanto lipofílicas como hidrofílicas. Lo anterior implica que las soluciones acuosas de compuestos que son ácidos o bases anfipáticos débiles comprenden simultáneamente formas cargadas y no cargadas de dichos compuestos. Solo las formas no cargadas pueden atravesar la membrana liposomal.
Cuando los agentes de uso en la presente invención contienen funciones relativamente básicas o ácidas, las sales de tales compuestos se incluyen en el alcance de la invención. Las sales se pueden obtener poniendo en contacto la forma neutra de tales compuestos con una cantidad suficiente del ácido o base deseado, puro o en un disolvente inerte adecuado. Los ejemplos de sales para compuestos ácidos relativos de la invención incluyen sales de sodio, potasio, calcio, amonio, amino orgánico o magnesio, o sales similares. Cuando los compuestos de la presente invención contienen funciones relativamente básicas, se pueden obtener sales de adición de ácido poniendo en contacto la forma neutra de tales compuestos con una cantidad suficiente del ácido deseado, puro o en un disolvente inerte adecuado. Los ejemplos de sales de adición de ácido incluyen las derivadas de ácidos inorgánicos como los ácidos clorhídrico, bromhídrico, nítrico, carbónico, monohidrogenocarbónico, fosfórico, monohidrogenofosfórico, dihidrogenofosfórico, sulfúrico, monohidrogenosulfúrico, yodhídrico o fosforoso y similares, así como las sales derivadas de ácidos orgánicos tales como acético, propiónico, isobutírico, maleico, malónico, benzoico, succínico, subérico, fumárico, láctico, mandélico, Itálico, bencenosulfónico, p-tolilsulfónico, cítrico, tartárico, metanosulfónico y similares. También se incluyen sales de aminoácidos tales como arginato y similares, y sales de ácidos orgánicos tales como ácidos glucurónico o galacturónico y similares (véase, por ejemplo, Berge et al., Journal of Pharmaceutical Science 1977, 66: 1-19). Ciertos compuestos específicos de la presente invención contienen funciones tanto básicas como ácidas que permiten que los compuestos se conviertan en sales de adición de base o de ácido.
Las formas neutras de los compuestos se regeneran preferiblemente poniendo en contacto la sal con una base o ácido y aislando el compuesto original de la manera convencional. La forma original del compuesto difiere de las diversas formas de sal en ciertas propiedades físicas, tales como solubilidad en disolventes polares, pero por lo demás, las sales son equivalentes a la forma original del compuesto para los propósitos de la presente invención.
Un ejemplo de agente es una pequeña molécula orgánica con un peso molecular entre aproximadamente 100 Da y 3.000 Da.
Carga activa
El proceso de carga activa implica el uso de potenciales transmembrana. El principio de carga activa, en general, se ha descrito ampliamente en la técnica. Los términos carga activa y carga remota son sinónimos y se usarán indistintamente.
Durante la carga activa, el precipitado del agente poco soluble en agua se transfiere desde el medio acuoso externo a través de la membrana liposomal al medio acuoso interno mediante un gradiente de iones o protones transmembrana. El término gradiente de un compuesto particular como se usa en este documento se refiere a un aumento discontinuo de la concentración de dicho compuesto a través de la membrana liposomal desde el exterior (medio acuoso externo) al interior del liposoma (medio acuoso interno).
Para crear el gradiente de concentración, los liposomas se forman típicamente en una primera fase líquida, típicamente acuosa, seguida de la sustitución o dilución de dicha primera fase líquida. El medio externo diluido o nuevo tiene una concentración diferente de la especie cargada o una especie cargada totalmente diferente, estableciendo así el gradiente de iones o protones.
El reemplazo del medio externo se puede lograr mediante diversas técnicas, tales como, por ejemplo, pasando la preparación de vesículas lipídicas a través de una columna de filtración en gel, por ejemplo, una columna de Sefadex o Sefarosa, que se ha equilibrado con el nuevo medio, o mediante centrifugación, diálisis o técnicas relacionadas.
La eficacia de la carga activa en liposomas depende, entre otros aspectos, de las propiedades químicas del complejo a cargar y del tipo y magnitud del gradiente aplicado. En una realización de la invención, se proporciona un método como se define en cualquiera de los anteriores empleando un gradiente a través de la membrana liposomal, en el que el gradiente se elige entre un gradiente de pH, un gradiente de sal de sulfato, fosfato, fosfonato, citrato, o acetato, un gradiente de ión de EDTA, un gradiente de sal de amonio, un gradiente de sal de amonio alquilada, por ejemplo, de metilo, etilo, propilo y amilo, un gradiente de Mn2+, Cu2+, Na+, K+, con o sin uso de ionóforos, o una combinación de los mismos. Estas técnicas de carga se han descrito ampliamente en el arte.
Preferiblemente, el medio acuoso interno de liposomas preformados, es decir, no cargados, comprende un denominado tampón de carga activa que contiene agua y, dependiendo del tipo de gradiente empleado durante la carga activa, puede comprender además una sal de sulfato, fosfato, fosfonato, citrato o acetato, una sal de amonio, una sal de amonio alquilada, por ejemplo, de metilo, etilo, propilo y amilo, una sal de Fe+2, Mn2+, Cu2+, Na+ y/o K+, una sal de iones de EDTA y opcionalmente un tampón de pH para mantener un gradiente de pH. Las sales pueden ser poliméricas tales como sulfato de dextrano, polietilenimina, dendrímeros de poliamidoamina, la versión terminal de carboxilato 1,5 de poliamidoaminas, polifosfatos, heparina de bajo peso molecular o ácido hialurónico. En un ejemplo de realización, la concentración de sales en el medio acuoso interno de los liposomas sin carga está entre 1 y 1.000 mM.
El medio acuoso externo, utilizado para establecer el gradiente transmembrana para la carga activa, comprende agua, el precipitado del o los agentes poco solubles en agua a cargar y, opcionalmente, sacarosa, solución salina o algún otro agente para ajustar la osmolaridad y/o un quelante tal como EDTA para ayudar a la actividad ionófora, más preferiblemente sacarosa y/o EDTA.
En un ejemplo de realización, el gradiente se elige entre una amina o una sal metálica de un miembro seleccionado entre un carboxilato, sulfato, fosfonato, fosfato o un acetato. Como es conocido generalmente por los expertos en la técnica, se pueden usar gradientes de pH transmembrana (pH interior más bajo, pH exterior más alto) o acetato catiónico para cargar activamente ácidos débiles anfifílicos. Las bases débiles anfipáticas también se pueden cargar activamente en liposomas usando un gradiente de sulfato de amonio o sulfato de trietilamina o cloruro de amonio.
Los carboxilatos de uso en la invención incluyen, sin limitación, carboxilato, citrato, dietilentriaminopentaacetato, acetato melético, 1,2,3,4-butanotetracarboxilato, benzoato, isoftalato, ftalato, 3,4-bis(carboximetil) ciclopentanocarboxilato, la generación de carboxilato de dendrímeros de poliamidoamina, bencenotricarboxilatos, bencenotetracarboxilatos, ascorbato, glucuronato y ulosonato.
Los sulfatos de uso en la invención incluyen, pero no se limitan a, sulfato, 1,5-naftalenodisulfonato, sulfato de dextrano, sulfobutiléter beta ciclodextrina, sacarosa octasulfato bencenosulfonato, poli(4-estirenosulfonato) trans resveratroltrisulfato.
Los fosfatos y fosfonatos de uso en la invención incluyen, pero no se limitan a, fosfato, hexametafosfato, vidrios de fosfato, polifosfatos, trifosfato, trimetafosfato, bisfosfonatos, etanohidroxi bisfosfonato, hexafosfato de inositol.
Los ejemplos de sales de uso en la invención incluyen una mezcla de carboxilato, sulfato o fosfato que incluye pero no se limita a: 2-carboxibencenosulfonato, fosfato de creatina, fosfocolina, fosfato de carnitina, la generación carboxilo de poliamidoaminas.
Las aminas de uso en la invención incluyen, pero no se limitan a, monoaminas, poliaminas, trimetilamonio, trietilamonio, tributilamonio, dietilmetilamonio, diisopropiletilamonio, triisopropilamonio, N-metilmorfolinio, N-etil morfolinio, N-hidroxi-etilpiperidinio, N-metilpirrolidinio, N,N-dimetilpiperazinio, isopropiletilamonio, isopropilmetilamonio, diisopropilamonio, terc-butiletilamonio, dicicohexilamonio, formas protonizadas de morfolina, piridina, piperidina, pirrolidina, piperazina, imidazol, terc-butilamina, 2-amino-2-metilpropanol, 2-amino-2-metilpropanodiol, tris-(hidroxietil)-aminometano, dietil-(2-hidroxietil)amina, tris-(hidroximetil)-aminometano tetrametilamonio, tetraetilamonio, N-metilglucamina y tetrabutilamonio, polietilenimina y dendrímeros de poliamidoamina.
Dependiendo de la permeabilidad de las membranas de la vesícula lipídica, el potencial transmembrana completo correspondiente al gradiente de concentración se formará espontáneamente o se formará un agente potenciador de la permeabilidad, por ejemplo, se puede añadir un ionóforo de protón al medio. Si se desea, el agente potenciador de la permeabilidad puede eliminarse de la preparación de liposomas después de que se complete la carga con el complejo usando cromatografía u otras técnicas.
Normalmente, la temperatura del medio durante la carga activa está entre aproximadamente -25 °C y aproximadamente 100 °C, por ejemplo, entre aproximadamente 0 °C y aproximadamente 70 °C, por ejemplo, entre aproximadamente 4 °C y 65 °C.
La eficacia de encapsulación o carga, definida como la cantidad encapsulada (por ejemplo, medida en gramos de agente/moles de fosfolípido o g de medicamento/g de lípido total) del agente poco soluble en agua en la fase acuosa interna dividida por la cantidad inicial en la fase acuosa externa multiplicada por 100%, es al menos 10%, preferiblemente al menos 50%, al menos 90%.
En un ejemplo de realización, la invención proporciona un método para cargar un agente poco soluble en agua en un liposoma. Un ejemplo de método comprende poner en contacto una suspensión acuosa de dicho liposoma con una suspensión acuosa del agente bajo condiciones apropiadas para encapsular el agente poco soluble en agua en dicho liposoma. El liposoma tiene un entorno acuoso interno encapsulado por una membrana lipídica. La suspensión acuosa del liposoma comprende un gradiente seleccionado de un gradiente de protones, un gradiente de iones y una combinación de los mismos a través de la membrana. El agente poco soluble en agua y la suspensión de liposomas se incuban en condiciones y durante un período de tiempo seleccionado apropiado para que el agente poco soluble en agua atraviese la membrana y se concentre en el entorno acuoso interno, formando así dicha formulación farmacéutica.
En varias realizaciones, la mezcla de reacción anterior se incuba durante un período de tiempo seleccionado y el gradiente de pH, gradiente de sulfato, gradiente de fosfato, gradiente de fosfonato, gradiente de carboxilato (gradiente de citrato, gradiente de acetato, etc.), gradiente de iones de EDTA, gradiente de sal de amonio, gradiente de sal de amonio alquilado, gradiente de Mg2, Mn2, Cu2, Na+, K+ o una combinación de los mismos, existe a través de la membrana liposomal durante la incubación.
En ejemplos de realizaciones de la invención, el agente terapéutico poco soluble en agua no está unido covalentemente a un componente del liposoma, ni tampoco está unido covalentemente a ningún componente del pH o gradiente de sal usado para formar la preparación del agente liposómico de la invención.
Disolvente aprótico
En un ejemplo de realización, el agente poco soluble en agua se disuelve completamente en un disolvente aprótico que es miscible con agua. La solución del agente se añade a la suspensión acuosa de liposomas a una concentración que es mayor que la solubilidad del medicamento en la suspensión de liposomas o en la mezcla de suspensión de liposomas/disolvente aprótico, por lo que se forma un precipitado. Los ejemplos de disolventes apróticos incluyen dimetilsulfóxido, dioxano, tetrahidrofurano, dimetilformamida, acetonitrilo, dimetilacetamida, sulfolano, gamma butirolactona, pirrolidonas, 1 -metil-2-pirrolidinona, metilpirrolina, etilenglicol monometiléter, dietilenglicol monometiléter, PEG400, y polietilenglicoles.
Precipitado del agente poco soluble en agua
La invención proporciona métodos para cargar un precipitado insoluble dentro del compartimento interno acuoso de la membrana lipídica de un liposoma. Un ejemplo de precipitado se conceptualiza como una porción algo insoluble del agente en suspensión. La porción insoluble se define como una porción del agente que no está solvatada como lo indica cualquiera de los siguientes: cualquier apariencia de turbidez mayor que la de la suspensión de liposomas en ausencia del agente, cualquier grado de aumento de la dispersión de la luz a una longitud de onda en la que el contenido no absorbe luz, como a 600 nm más que la suspensión de liposomas sola, cualquier porción del medicamento que pueda aislarse (sedimentar) mediante centrifugación a una velocidad inferior a 12.000 RPM durante 15 min, cualquier porción del medicamento que se puede aislar mediante filtración a través de un filtro de 0,2 pm.
Ejemplo de formulación
En un ejemplo de realización, la invención proporciona una formulación de un agente poco soluble en agua encapsulado dentro del núcleo acuoso de un liposoma que comprende colesterol, PEG-DSPE y un componente lipídico con un grupo de cabeza de fosfocolina y uno o dos residuos de ácido graso. En varias realizaciones, el liposoma comprende una combinación de HSPC, colesterol y PEG-DSPE. En un ejemplo de realización, el liposoma incluye una relación molar de componentes de aproximadamente 50 por ciento en moles a aproximadamente 70 por ciento en moles de HSPC, de aproximadamente 25 por ciento en moles a aproximadamente 50 por ciento en moles de colesterol y de aproximadamente 0 por ciento en moles a aproximadamente 10 por ciento en moles de PEG-DSPE. En una realización, el liposoma incluye una relación molar de componentes de aproximadamente 60 por ciento en moles de HSPC, aproximadamente 40 por ciento en moles de colesterol y aproximadamente 2,8 por ciento en moles de PEG-DSPE. En un ejemplo de realización, el agente se encapsula en el liposoma mediante carga activa.
En un ejemplo de realización adicional, la invención proporciona una formulación de un agente poco soluble en agua encapsulado dentro del núcleo acuoso de un liposoma que comprende una combinación de esfingomielina (SM), colesterol y PEG-DSPE. En un ejemplo de realización, el liposoma incluye una relación molar de componentes de aproximadamente 45 a aproximadamente 75 SM, de aproximadamente 25 por ciento en moles a aproximadamente 50 por ciento en moles de colesterol y de aproximadamente 0 por ciento en moles a aproximadamente 10 por ciento en moles de PEG-DSPE. En una realización, el liposoma incluye una relación molar de componentes de aproximadamente 55 por ciento en moles de SM, aproximadamente 45 por ciento en moles de colesterol y aproximadamente 2,8 por ciento en moles de PEG-DSPE.
En un ejemplo de realización, la relación del agente poco soluble en agua (por ejemplo, carfilzomib) o una sal, un análogo o derivado del mismo:lípido es de aproximadamente 30 mg a aproximadamente 90 mg de agente a aproximadamente 90 mg a aproximadamente 250 mg de lípido. En un ejemplo de realización, la formulación de la relación agente: lípido es de aproximadamente 60 mg de agente a aproximadamente 170 mg de lípido.
En varias realizaciones, la relación de agente (pg): lípido (pmol) es de aproximadamente 250 a aproximadamente 450. En un ejemplo de realización, esta relación es de aproximadamente 300 a aproximadamente 400.
En un ejemplo de realización, el agente de carga remota es una sal de amonio de un sulfato de carbohidrato. En diversas realizaciones, el agente de carga remota es sulfato de dextrano y trietilamonio.
En un ejemplo de realización, la invención proporciona una formulación farmacéutica que comprende aproximadamente 60 mg de agente encapsulado dentro de una población de liposomas cuya masa es de aproximadamente 90 mg a aproximadamente 200 mg. Los liposomas comprenden una membrana lipídica que define un compartimento acuoso interno. El agente está encapsulado dentro del compartimento acuoso definido por la membrana lipídica. La membrana lipídica tiene una relación molar de componentes: (a) de aproximadamente 55 % en moles de esfingomielina (SM); (b) aproximadamente un 45 por ciento en moles de colesterol; y (c) aproximadamente 2,8 por ciento en moles de PEG-(1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina) (PEG-DSPE). La formulación se selecciona de una formulación liofilizada y una formulación en la que dichos liposomas se suspenden en un diluyente farmacéuticamente aceptable.
En un ejemplo de realización, la invención proporciona una formulación de liposómica de agente en la que el agente tiene un T1/2 in vivo de aproximadamente 2 horas a aproximadamente 12 horas, por ejemplo, de aproximadamente 3 horas a aproximadamente 6 horas, en una sujeto a quien se administra. En un ejemplo de formulación, el agente está en forma libre o encapsulada.
Un ejemplo de formulación farmacéutica de la invención incluye un liposoma que encapsula adicionalmente el sulfato de carbohidrato. En un ejemplo de realización, el sulfato de carbohidrato es sulfato de dextrano.
En un ejemplo de realización, la formulación de la invención se forma mediante un método que comprende: (a) preparar una suspensión del liposoma en una solución acuosa de una sal de amonio de un sulfato de carbohidrato, formando una primera población de dicha sal de amonio encapsulada dentro de dicho liposoma y una segunda población de dicha sal externa a dicho liposoma; (b) reemplazar la sal externa a dicho liposoma con un tampón acuoso, formando así un gradiente de dicho sulfato de carbohidrato a través de dicha membrana lipídica; y (c) añadir una solución de agente en un disolvente aprótico a la suspensión formada en (b), formando un precipitado de agente que permite que el agente atraviese la membrana lipídica, concentrándose en dicho compartimento acuoso interno, encapsulando así el agente.
En un ejemplo de realización, la sal de amonio del sulfato de carbohidrato es sulfato de dextrano y trietilamonio o sulfato de dextrano y amonio.
En un ejemplo de realización, los liposomas cargados con agente tienen un diámetro de aproximadamente 40 nm a aproximadamente 150 nm.
En varias realizaciones, el agente encapsulado se solubiliza en el compartimento acuoso interno. En varias realizaciones, el agente está en forma de una suspensión. En un ejemplo de realización, la fracción de agente está parcialmente solubilizada y parcialmente en forma de una suspensión.
Como apreciarán los expertos en la técnica, los parámetros individuales expuestos anteriormente se pueden combinar libremente en cualquier formato útil.
Kits
En un ejemplo de realización, la invención proporciona un kit que contiene uno o más componentes de los liposomas o formulaciones de la invención e instrucciones sobre cómo combinar y usar los componentes y la formulación resultante de la combinación. En varias realizaciones, el kit incluye un agente poco soluble en agua en un recipiente y una preparación de liposomas en otro recipiente. Un ejemplo de preparación de liposoma incluye una distribución de sal en el exterior y el interior de la membrana lipídica para establecer y/o mantener un gradiente iónico, como el que se describe en el presente documento. También se incluyen instrucciones para combinar el contenido de los recipientes para producir un liposoma o una formulación del mismo de la invención. En diversas realizaciones, la cantidad de complejo y liposoma es suficiente para formular una formulación de dosis unitaria del agente complejado.
En un ejemplo de realización, un recipiente incluye un liposoma o solución de liposoma, que se usa para convertir al menos parte del contenido de un recipiente de una formulación de agente terapéutico poco soluble en agua (por ejemplo, de un agente terapéutico aprobado) en una formulación líquida del agente terapéutico encapsulado en liposomas en el punto de atención para su administración a un sujeto. En un ejemplo de realización, el contenido de los recipientes es suficiente para formular una formulación de dosis unitaria del agente terapéutico.
En la realización en la que se forma un formato de dosis unitaria, el recipiente incluye de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 500 mg del agente terapéutico, por ejemplo, de aproximadamente 1 mg a aproximadamente 200 mg, por ejemplo, de aproximadamente 5 mg a aproximadamente 100 mg, por ejemplo, de aproximadamente 10 mg a aproximadamente 60 mg.
En un ejemplo de realización, el agente terapéutico aprobado es carfilzomib y está presente en el recipiente en una cantidad de aproximadamente 40 mg a aproximadamente 80 mg, por ejemplo, de aproximadamente 50 mg a aproximadamente 70 mg. En un ejemplo de realización, el carfilzomib está presente en aproximadamente 60 mg.
Ejemplos de formulación
En un ejemplo de realización, la invención proporciona una formulación de un agente poco soluble en agua encapsulado dentro del núcleo acuoso de un liposoma que comprende colesterol, PEG-DSPE y un componente lipídico con un grupo de cabeza de fosfocolina y uno o dos residuos de ácido graso. En varias realizaciones, el liposoma comprende una combinación de HSPC, colesterol y PEG-DSPE. En un ejemplo de realización, el liposoma incluye una relación molar de componentes de aproximadamente 50 por ciento en moles a aproximadamente 70 por ciento en moles de HSPC, de aproximadamente 25 por ciento en moles a aproximadamente 50 por ciento en moles de colesterol y de aproximadamente 1 por ciento en moles a aproximadamente 10 por ciento en moles de PEG-DSPE. En una realización, el liposoma incluye una relación molar de componentes de aproximadamente 60 por ciento en moles de HSPC, aproximadamente 40 por ciento en moles de colesterol y aproximadamente 2,8 por ciento en moles de PEG-DSPE. En un ejemplo de realización, el agente se encapsula en el liposoma mediante carga activa.
En un ejemplo de realización adicional, la invención proporciona una formulación de un agente poco soluble en agua encapsulado dentro del núcleo acuoso de un liposoma que comprende una combinación de esfingomielina (SM), colesterol y PEG-DSPE. En un ejemplo de realización, el liposoma incluye una relación molar de componentes de aproximadamente 45 a aproximadamente 75 SM, de aproximadamente 25 por ciento en moles a aproximadamente 50 por ciento en moles de colesterol y de aproximadamente 0 por ciento en moles a aproximadamente 10 por ciento en moles de PEG-DSPE. En una realización, el liposoma incluye una relación molar de componentes de aproximadamente 55 por ciento en moles de SM, aproximadamente 45 por ciento en moles de colesterol y aproximadamente 2,8 por ciento en moles de PEG-DSPE.
En un ejemplo de realización, la relación del agente poco soluble en agua (por ejemplo, carfilzomib) o una sal, un análogo o derivado del mismo: lípido es de aproximadamente 30 mg a aproximadamente 90 mg de agente a aproximadamente 90 mg a aproximadamente 250 mg de lípido. En un ejemplo de realización, la formulación de la relación agente: lípido es de aproximadamente 60 mg de agente a aproximadamente 170 mg de lípido.
En varias realizaciones, la relación del agente (|jg): lípido (jm ol) es de aproximadamente 250 a aproximadamente 450. En un ejemplo de realización, esta relación es de aproximadamente 300 a aproximadamente 400.
En un ejemplo de realización, el agente de carga remota es una sal de amonio de un sulfato de carbohidrato. En diversas realizaciones, el agente de carga remota es dextrano.
En un ejemplo de realización, la invención proporciona una formulación farmacéutica que comprende aproximadamente 60 mg de agente encapsulado dentro de una población de liposomas cuya masa es de aproximadamente 90 mg a aproximadamente 200 mg. Los liposomas comprenden una membrana lipídica que define un compartimento acuoso interno. El agente está encapsulado dentro del compartimento acuoso definido por la membrana lipídica. La membrana lipídica tiene una relación molar de componentes: (a) de aproximadamente 55 por ciento en moles de esfingomielina (SM); (b) aproximadamente un 45 por ciento en moles de colesterol; y (c) aproximadamente 2,8 por ciento en moles de PEG-(1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina) (PEG-DSPE). La formulación se selecciona de una formulación liofilizada y una formulación en la que dichos liposomas se suspenden en un diluyente farmacéuticamente aceptable.
En un ejemplo de realización, la invención proporciona una formulación liposómica del agente en la que el agente tiene un T1/2 in vivo de aproximadamente 2 horas a aproximadamente 12 horas, por ejemplo, de aproximadamente 3 horas a aproximadamente 6 horas, en un sujeto a quien se administra. En un ejemplo de formulación, el agente está en forma libre o encapsulada.
Un ejemplo de formulación farmacéutica de la invención incluye un liposoma que encapsula adicionalmente el sulfato de carbohidrato. En un ejemplo de realización, el sulfato de carbohidrato es sulfato de dextrano.
En un ejemplo de realización, la formulación de la invención se forma mediante un método que comprende: (a) preparar una suspensión del liposoma en una solución acuosa de una sal de amonio de un sulfato de carbohidrato, formando una primera población de dicha sal de amonio encapsulada dentro de dicho liposoma y una segunda población de dicha sal externa a dicho liposoma; (b) reemplazar la sal externa a dicho liposoma con un tampón acuoso, formando así un gradiente de dicho sulfato de carbohidrato a través de dicha membrana lipídica; y (c) añadir una solución de agente en un disolvente aprótico a la suspensión formada en (b), formando un precipitado del agente que permite que el agente atraviese la membrana lipídica, concentrándose en dicho compartimento acuoso interno, encapsulando así el agente.
En un ejemplo de realización, la sal de amonio del sulfato de carbohidrato es sulfato de dextrano y trietilamonio o sulfato de dextrano de amonio.
En un ejemplo de realización, los liposomas cargados con agente tienen un diámetro de aproximadamente 40 nm a aproximadamente 150 nm.
En varias realizaciones, el agente encapsulado se solubiliza en el compartimento acuoso interno. En varias realizaciones, el agente está en forma de suspensión. En un ejemplo de realización, la fracción de agente está parcialmente solubilizada y parcialmente en forma de suspensión.
Como apreciarán los expertos en la técnica, los parámetros individuales expuestos anteriormente se pueden combinar libremente en cualquier formato útil.
Métodos de tratamiento
En un aspecto, la invención proporciona un método para tratar un trastorno proliferativo, por ejemplo, un cáncer, en un sujeto, por ejemplo, un ser humano, comprendiendo el método administrar una composición que comprende una formulación farmacéutica de la invención a un sujeto en una cantidad eficaz para tratar el trastorno, tratando así el trastorno proliferativo.
En una realización, la formulación farmacéutica se administra en combinación con uno o más agentes anticancerígenos adicionales, por ejemplo, un agente quimioterapéutico, por ejemplo, un agente quimioterapéutico o una combinación de agentes quimioterapéuticos descritos en este documento, y radiación.
En una realización, el cáncer es un cáncer descrito en el presente documento. Por ejemplo, el cáncer puede ser un cáncer de vejiga (incluido el cáncer de vejiga acelerado y metastásico), de mama (por ejemplo, cáncer de mama positivo para el receptor de estrógeno; cáncer de mama negativo para el receptor de estrógeno; cáncer de mama positivo para HER-2; cáncer de mama negativo para HER-2; cáncer de mama positivo para el receptor de progesterona; cáncer de mama negativo para el receptor de progesterona; cáncer de mama negativo para el receptor de estrógeno negativo para HER-2 y negativo para el receptor de progesterona (es decir, cáncer de mama triple negativo); cáncer de mama inflamatorio), de colon (incluido el cáncer colorrectal), de riñón (por ejemplo, carcinoma de células de transición), de hígado, de pulmón (incluido el cáncer de pulmón de células pequeñas y no pequeñas, adenocarcinoma de pulmón y cáncer de células escamosas), de tracto genitourinario, por ejemplo, de ovario (incluidos cánceres de trompas de Falopio y peritoneal), de cuello uterino, de próstata, de testículo, de riñón y uréter, del sistema linfático, de recto, de laringe, de páncreas (incluido el carcinoma pancreático exocrino), de esófago, de estómago, de vesícula biliar, de tiroides, de piel (incluido el cáncer de células escamosas), de cerebro (incluido glioblastoma multiforme), de cabeza y cuello (por ejemplo, primario oculto) y de tejidos blandos (por ejemplo, sarcoma de Kaposi (por ejemplo, sarcoma de Kaposi relacionado con SIDA), de leiomiosarcoma, de angiosarcoma e histiocitoma).
En un ejemplo de realización, el cáncer es mieloma múltiple o un tumor sólido. En una realización, la formulación farmacéutica de la invención incluye carfilzomib como el agente terapéutico poco soluble en agua.
En un aspecto, la divulgación presenta un método para tratar una enfermedad o trastorno asociado con la inflamación, por ejemplo, una reacción alérgica o una enfermedad autoinmune, en un sujeto, por ejemplo, un ser humano, comprendiendo el método: administrar una composición que comprende una formulación farmacéutica de la invención a un sujeto en una cantidad eficaz para tratar el trastorno, para así tratar la enfermedad o trastorno asociado con la inflamación.
En una realización, la enfermedad o trastorno asociado con la inflamación es una enfermedad o trastorno descrito en el presente documento. Por ejemplo, la enfermedad o trastorno asociado con la inflamación puede ser, por ejemplo, esclerosis múltiple, artritis reumatoide, artritis psoriásica, enfermedad degenerativa de las articulaciones, espondiloartropatias, artritis gotosa, lupus eritematoso sistémico, artritis juvenil, artritis reumatoide, osteoartritis, osteoporosis, diabetes (por ejemplo , diabetes mellitus insulinodependiente o diabetes de aparición juvenil), calambres menstruales, fibrosis quística, enfermedad inflamatoria del intestino, síndrome del intestino irritable, enfermedad de Crohn, colitis mucosa, colitis ulcerosa, gastritis, esofagitis, pancreatitis, peritonitis, enfermedad de Alzheimer, conmoción, espondilitis anquilosante, gastritis, conjuntivitis, pancreatitis (aguda o crónica), síndrome de lesión de múltiples órganos (por ejemplo, secundario a septicemia o trauma), infarto de miocardio, aterosclerosis, accidente cerebrovascular, lesión por reperfusión (por ejemplo, debido a derivación cardiopulmonar o diálisis renal), glomerulonefritis aguda, vasculitis , lesión térmica (es decir, quemaduras solares), enterocolitis necrotizante , síndrome asociado a transfusión de granulocitos y/o síndrome de Sjogren. Los ejemplos de afecciones inflamatorias de la piel incluyen, por ejemplo, eccema, dermatitis atópica, dermatitis de contacto, urticaria, esclerodermia, psoriasis y dermatosis con componentes inflamatorios agudos. En algunas realizaciones, la enfermedad autoinmune es una enfermedad autoinmune de órganos y tejidos (por ejemplo, síndrome de Raynaud), esclerodermia, miastenia grave, rechazo de trasplante, choque de endotoxina, sepsis, psoriasis, eccema, dermatitis, esclerosis múltiple, tiroiditis autoinmune, uveítis, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Addison, enfermedad poliglandular autoinmune (también conocida como síndrome poliglandular autoinmune) o enfermedad de Grave.
En otra realización, una formulación farmacéutica de la invención o el método descrito en este documento puede usarse para tratar o prevenir alergias y afecciones respiratorias, incluyendo asma, bronquitis, fibrosis pulmonar, rinitis alérgica, toxicidad por oxígeno, enfisema, bronquitis crónica, síndrome de angustia respiratoria aguda y cualquier enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). La formulación, partícula o composición farmacéutica de la invención se puede usar para tratar la infección por hepatitis crónica, incluidas la hepatitis B y la hepatitis C.
En un aspecto, la divulgación presenta un método para tratar una enfermedad cardiovascular, por ejemplo, una enfermedad cardíaca, en un sujeto, por ejemplo, un ser humano, comprendiendo el método administrar una formulación farmacéutica de la invención a un sujeto en una cantidad eficaz para tratar el trastorno, tratando así la enfermedad cardiovascular.
En una realización, la enfermedad cardiovascular es una enfermedad o trastorno descrito en el presente documento. Por ejemplo, la enfermedad cardiovascular puede ser cardiomiopatía o miocarditis; tal como cardiomiopatía idiopática, cardiomiopatía metabólica, cardiomiopatía alcohólica, cardiomiopatía inducida por medicamentos, cardiomiopatía isquémica y cardiomiopatía hipertensiva. También tratables o prevenibles usando una formulación farmacéutica de las invenciones, partículas, composiciones y métodos descritos en este documento son los trastornos ateromatosos de los vasos sanguíneos principales (enfermedad macrovascular) tales como la aorta, las arterias coronarias, las arterias carótidas, las arterias cerebrovasculares, las arterias renales, las arterias ilíacas, las arterias femorales y las arterias poplíteas. Otras enfermedades vasculares que pueden tratarse o prevenirse incluyen las relacionadas con la agregación plaquetaria, las arteriolas retinianas, las arteriolas glomerulares, los vasa nervorum, las arteriolas cardíacas y los lechos capilares asociados del ojo, el riñón, el corazón y los sistemas nerviosos central y periférico. Aún otros trastornos que pueden tratarse con la formulación farmacéutica de la invención incluyen reestenosis, por ejemplo, después de una intervención coronaria, y trastornos relacionados con un nivel anormal de colesterol de alta y baja densidad.
En una realización, la formulación farmacéutica de la invención se puede administrar a un sujeto que se somete o que se ha sometido a una angioplastia. En una realización, la formulación, partícula o composición farmacéutica de la invención se administra a un sujeto que se somete o que se ha sometido a una angioplastia con la colocación de una cánula intraluminal. En algunas realizaciones, la formulación, partícula o composición farmacéutica de la invención se puede utilizar como un puntal de una cánula luminal o como revestimiento para una cánula luminal.
En un aspecto, la invención proporciona un método para tratar una enfermedad o trastorno asociado con el riñón, por ejemplo, trastornos renales, en un sujeto, por ejemplo, un ser humano, comprendiendo el método: administrar una formulación farmacéutica de la invención a un sujeto en una cantidad eficaz para tratar el trastorno, tratando así la enfermedad o trastorno asociado con la enfermedad renal.
En una realización, la enfermedad o trastorno asociado con el riñón es una enfermedad o trastorno descrito en el presente documento. Por ejemplo, la enfermedad o trastorno asociado con el riñón puede ser, por ejemplo, insuficiencia renal aguda, síndrome nefrítico agudo, nefropatía por analgésicos, enfermedad renal ateroembólica, insuficiencia renal crónica, nefritis crónica, síndrome nefrótico congénito, enfermedad renal en etapa terminal, síndrome de Goodpasture, nefritis intersticial, daño renal, infección renal, lesión renal, cálculos renales, nefritis lúpica, GN I membranoproliferativa, GN II membranoproliferativa, nefropatía membranosa, enfermedad de cambios mínimos, glomerulonefritis necrotizante, nefroblastoma, nefrocalcinosis, diabetes insípida nefrogénica, nefrosis (síndrome nefrótico), enfermedad renal poliquística, GN posestreptocócica, nefropatía por reflujo, embolia de la arteria renal, estenosis de la arteria renal, necrosis papilar renal, acidosis tubular renal tipo I, acidosis tubular renal tipo II, infusión renal insuficiente, trombosis de la vena renal.
En un ejemplo de realización, la invención proporciona un método para tratar la toxicidad por metales o la sobrecarga de metales. Ejemplos de enfermedades o trastornos asociados con el metal incluyen trastornos por sobrecarga de hierro (por ejemplo, Talasemia o anemia de células falciformes), trastornos por sobrecarga de cobre (por ejemplo, Enfermedad de Wilson) y contaminación por radioisótopos (por ejemplo, que ocurre después de la contaminación con plutonio, uranio y otros radioisótopos).
Una "cantidad eficaz" o "una cantidad efectiva" se refiere a una cantidad de la formulación farmacéutica de la invención que es eficaz, tras administraciones de dosis única o múltiple a un sujeto, para tratar una célula o curar, mitigar, aliviar, o mejorar un síntoma de un trastorno. Una cantidad eficaz de la composición puede variar de acuerdo con factores tales como el estado patológico, la edad, el sexo y el peso del individuo, y la capacidad del compuesto para provocar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad eficaz es también aquella en la que los efectos terapéuticamente beneficiosos superan los efectos tóxicos o perjudiciales de la composición.
Como se usa en el presente documento, el término "prevenir" o "que previene" como se usa en el contexto de la administración de un agente a un sujeto, se refiere a someter al sujeto a un régimen, por ejemplo, la administración de una formulación farmacéutica de la invención de manera que la aparición de al menos un síntoma del trastorno se retrasa en comparación con lo que se observaría en ausencia del régimen.
Como se usa en este documento, el término "sujeto" pretende incluir animales humanos y no humanos. Los ejemplos de sujetos humanos incluyen un paciente humano que tiene un trastorno, por ejemplo, un trastorno descrito en el presente documento, o un sujeto normal. El término "animales no humanos" incluye todos los vertebrados, por ejemplo, no mamíferos (tales como pollos, anfibios, reptiles) y mamíferos, como primates no humanos, animales domésticos y/o agrícolas útiles, por ejemplo, ovejas, perros, gato, vaca, cerdo, etc.
Como se usa en el presente documento, el término "tratar" o "tratamiento" de un sujeto que tiene un trastorno se refiere a someter al sujeto a un régimen, por ejemplo, la administración de una formulación farmacéutica de la invención de manera que al menos un síntoma del trastorno se cure, sane, alivie, mitigue, altere, remedie, mejore o disminuya. El tratamiento incluye administrar una cantidad eficaz para aliviar, mitigar, alterar, remediar, mejorar, disminuir o afectar el trastorno o los síntomas del trastorno. El tratamiento puede inhibir el deterioro o empeoramiento de un síntoma de un trastorno.
Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar ejemplos de realizaciones de la invención y no deben interpretarse como limitantes del alcance de la invención.
Ejemplos
Ejemplo 1
Atrapamiento de carfilzomib en liposomas mediante carga remota
Materiales y método
Se preparó una solución de sulfato de amonio disolviendo sulfato de amonio sólido hasta una concentración final de 250 mM (500 mequivalentes de anión/l), no se hizo ningún ajuste de pH para producir un pH final de 5,6. Se preparó una solución de sulfato de sodio (250 mM) añadiendo 0,35 g de sulfato de sodio a 10 ml de agua desionizada.
Los liposomas se formaron por extrusión. Los lípidos se disolvieron en etanol a una concentración de HSPC 500 mM (591 mg/ml de lípidos totales) a 65 °C y los 9 volúmenes de la solución de agente de captura calentada a 65 °C se agregaron a la solución de etanol/lípido también a 65 °C. La mezcla se agitó con vórtex y se transfirió a un extrusor Lipex de 10 ml controlado termostáticamente (65 °C). Los liposomas se formaron extruyéndolos 10 veces a través de membranas de policarbonato que tenían poros de 0,1 pm. Después de la extrusión, los liposomas se enfriaron en hielo. El gradiente electroquímico transmembrana se formó mediante la purificación de los liposomas mediante diálisis en un tubo de diálisis con un corte de peso molecular de 12.000-14.000. Las muestras se dializaron contra HEPES 5 mM, sacarosa al 10% pH 6,5 (agitando a 4 °C) con un volumen que es 100 veces mayor que el volumen de la muestra. El dializado se cambió después de 2 h, luego 4 veces más después de 12 h cada una. Se midió la conductividad de la solución de liposomas y era indistinguible del medio de diálisis ~40 pS/cm.
La concentración de lípidos se determinó midiendo el colesterol por HPLC usando un HPLC Agilent 1100 con una columna Agilent Zorbax 5 pm, 4,6 x 150 mM, Eclipse XDB-C8 y una fase móvil de A = TFA al 0,1%, B = TFA al 0,1%/MeOH con una elución isocrática de 99% de B. El caudal es de 1,0 ml/min, la temperatura de la columna es 50 °C, inyección de 10 pl y detección por absorbancia a 205 nm. El tiempo de retención del colesterol es de 4,5 min. El tamaño de los liposomas se mide mediante la dispersión dinámica de la luz.
Se disolvió carfilzomib (Selleck Chemicals) en DMSO a una concentración de 10 mg/ml. El carfilzomib se introdujo en los liposomas en una proporción de carfilzomib a HSPC de 100 g de medicamento/mol de HSPC (proporción de medicamento a lípido total (peso/peso) de 0,12). Los liposomas se diluyeron con citrato 50 mM, sacarosa al 10% pH 4,0 para aumentar el volumen hasta un punto en el que, después de la adición del medicamento, la concentración final de DMSO es del 2%. Se añadió carfilzomib/DMSO a los liposomas diluidos, que se mezclaron a temperatura ambiente y luego se transfirieron a un baño a 65 °C y se agitaron cada 30 s durante los primeros 3 min y luego se agitaron cada 5 min durante un tiempo de calentamiento total de 30 min. Todas las muestras estaban muy turbias cuando se añadió el medicamento y todas se aclararon (igual que los liposomas sin medicamento añadido) después de 15 min. Después de calentar durante 30 min, todas las muestras se colocaron en hielo durante 15 min. Los liposomas cargados se agitaron en vórtex y 100 pl de la muestra se mantuvieron como el "antes de la columna" y el resto se transfirió a tubos de microcentrífuga y se centrifugó a 10.000 RPM durante 5 min. Los sobrenadantes se purificaron en una columna Sephadex G25, se recogieron y analizaron por HPLC. El análisis por HPLC de carfilzomib se realizó en el mismo sistema que se describe para el análisis de colesterol. La fase móvil consiste en A = TFA al 0,1% , B = TFA al 0,1%/MeOH con un gradiente de elución que comienza con 50% de B y aumenta hasta 83% de B en 13 min con 7 min de equilibrio retornando hasta 50% de B. El caudal es 1,0 ml/min, la temperatura de la columna es 30 °C, inyección de 10 pl y detección por absorbancia a 205 nm. El tiempo de retención de carfilzomib es de 12,2 min. La concentración de lípidos se determina mediante análisis del colesterol por HPLC.
Resultados
La carga de liposomas que contenían sulfato de amonio 250 mM dio como resultado una relación final de medicamento a lípido de 95,26 ± 3,47 g de medicamento/mol de liposomas de HSPC cuando el medicamento se añadió a 100 g de medicamento/mol de lípido de HSPC (95,26 ± 3,47% de eficiencia) y una relación final de medicamento a lípido de 136,9 ± 7,35 g de medicamento/mol de liposomas de HSPC cuando el medicamento se añadió a 200 g de medicamento/mol de lípido de HSPC (67,94 ± 3,67% de eficiencia) (Figura 2). Esto demuestra que la capacidad de carga de estos liposomas particulares está entre 100 y 200 g de medicamento/mol de fosfolípido. Los liposomas de control que contienen sulfato de sodio 250 mM que no tienen gradiente electroquímico para la carga remota dieron como resultado una carga final de medicamento de 33,28 ± 0,79 y 29,01 ± 0,79 g de medicamento/mol de HSPC cuando el medicamento se añadió en una proporción de 100 y 200 g de medicamento/mol de HSPC respectivamente. Esto demuestra que la capacidad para cargar estos liposomas estaba saturada por debajo de 100 g de medicamento/mol de HSPC y, en esta relación de entrada de medicamento, los liposomas cargados de forma remota exhiben una capacidad de carga > 3 veces. La saturación de la capacidad de carga del medicamento para los liposomas de sulfato de sodio en una proporción al menos 3 veces menor que la de los liposomas de sulfato de amonio indica que cuando no hay gradiente electroquímico para la carga remota, el medicamento se divide en la bicapa lipídica pero no forma una sal con el agente interior de captura. La Figura 5 ilustra que el precipitado está todavía presente después del proceso de carga con liposomas de sulfato de sodio pero no con liposomas de sulfato de amonio. Conclusión
Los liposomas de composición y tamaño de matriz lipídica idénticos pero que variaban en la composición de la sal de sulfato atrapada internamente tenían capacidades muy diferentes para cargar carfilzomib. El liposoma capaz de generar un gradiente electroquímico (sulfato de amonio) fue capaz de cargar cerca del 100% del medicamento en condiciones óptimas y el que no pudo crear un gradiente tuvo una baja eficiencia de carga, lo que sugiere que la carga remota o activa fue el mecanismo principal de incorporación de carfilzomib en el liposoma.
Ejemplo 2
Comparación de agentes de captura de liposomas
Introducción
Los liposomas que se utilizarán para la carga remota se forman en una solución iónica que está destinada a complejar el medicamento cargado como una sal. Los agentes de captura pueden formar complejos con los medicamentos cargados y la estabilidad de este complejo es un factor que dicta la capacidad de carga del medicamento en los liposomas, la estabilidad y las velocidades de liberación del medicamento. La comparación de diferentes agentes de captura de liposomas se realizó mediante la evaluación de la eficacia de la carga de carfilzomib.
Métodos
Se usaron tres formulaciones de liposomas, todas en una relación molar de 3 HSPC/2 de colesterol/0,15 de PEG-DSPE cada una con un agente de captura diferente: 1. ácido melítico; 2. sulfato de amonio; y 3. ácido naftalenodisulfónico.
Se disolvió ácido melítico (MA) en agua y se valoró con dietilamina hasta un pH final de 5,5 y una concentración de 83 mM (500 mequivalentes de anión/l). El sulfato de amonio se preparó disolviendo el sulfato de amonio sólido hasta una concentración final de 250 mM (500 mequivalentes de anión/l), no se hizo ningún ajuste de pH para obtener un pH final de 5,6.
Se disolvió ácido naftalenodisulfónico (NDS) en agua y se valoró con dietilamina hasta un pH final de 8,0 y una concentración de 250 mM (500 mequivalentes de anión/l).
Véase el Ejemplo 1, Atrapamiento de carfilzomib en liposomas mediante carga remota para obtener detalles sobre cómo se fabricaron, purificaron y caracterizaron los liposomas.
T l 1. T m ñ l li m r n rfilz mi .
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Para asegurar la eliminación completa del DMSO añadido con carfilzomib, las muestras de carfilzomib liposomal se dializaron en un tubo de diálisis que tenía un corte de peso molecular de 12.000-14.000. Las muestras se dializan contra HEPES 5 mM, sacarosa al 10%, pH 6,5 (agitando a 4 °C) con un volumen que es 100 veces mayor que el volumen de la muestra. El dializado se cambió después de 2 h, luego 2 veces más después de 12 h cada vez. Los liposomas de carfilzomib se analizaron de nuevo para determinar la concentración de medicamento y lípido como se describió anteriormente.
Resultados
La eficacia de la carga remota de carfilzomib en liposomas a razón de 100 g de medicamento/mol de lípido de HSPC para liposomas con los agentes de captura ácido melítico, sulfato de amonio y ácido naftalenodisulfónico fue 37,4% ± 2,01%, 97,0% ± 2,38% y 95,1% ± 1,76% respectivamente (Figura 3).
Conclusión
La invención descrita en el presente documento permite que la carga remota de carfilzomib desde un precipitado insoluble en liposomas se pueda lograr con varios usando el gradiente electroquímico generado por varios agentes de captura que incluyen ácido melítico, sulfato de amonio y ácido naftelenodisulfonónico.
Ejemplo 3
Comparación del método para introducir el medicamento
Método
Una comparación del método utilizado para la adición del medicamento a los liposomas durante el procedimiento de carga. El procedimiento de carga fue el mismo que se describió anteriormente en el Ejemplo 1 con la excepción de que el medicamento se añadió a la solución de carga de liposomas como un polvo sólido, como una solución de 10 mg/ml de DMSO rápidamente y como una solución de 10 mg/ml de DMSO lentamente.
Resultados
La eficacia de la carga remota de carfilzomib en liposomas a razón de 100 g de medicamento/mol de lípido de HSPC para el medicamento que se añadió como polvo sólido fue de 3,88% ± 0,053% y 3,47% ± 0,030% cuando se calentó a 65 °C durante 30 y 120 min respectivamente. La eficiencia de cargar el medicamento como una solución de 10 mg/ml de DMSO fue de 97,0% ± 2,38% cuando el medicamento/DMSO se añadió rápidamente y del 96,3% ± 1,09% cuando se añadió el medicamento/DMSO en 5 incrementos durante 1 minuto a una solución de liposoma mientras se agitaba con el vórtex. La mezcla de medicamento/liposoma que resulta de la adición lenta del medicamento es más clara que la mezcla de medicamento/liposoma que resulta de la adición rápida del medicamento. Sin embargo, ambas soluciones no tienen un precipitado visible (o un precipitado centrífugo a 10.000 rpm durante 5 min) después de calentar a 65 °C durante 30 min, lo que es el resultado de que todo el medicamento se cargó en los liposomas independientemente del precipitado formado tras la adición del medicamento (Figura 4).
Ejemplo 4
Carga de carfilzomib en liposomas a temperatura ambiente
Introducción
La capacidad de cargar un medicamento en liposomas a temperatura ambiente es beneficiosa para reducir la degradación del medicamento inducida por el calor, simplificar la fabricación y permitir la carga del liposoma. El transporte eficiente a través de la membrana del liposoma requiere que la membrana esté en fase fluida. Esto se logra con fosfolípidos saturados que tienen una alta temperatura de transición de fase (Tm) tal como HSPC (Tm = 55 °C) calentando los liposomas por encima de la Tm durante el proceso de carga. Una alternativa al calentamiento es utilizar lípidos en fase fluida a temperatura ambiente. La desventaja de estos lípidos es que son inestables en circulación y dan como resultado una rápida liberación del medicamento. Los lípidos modificados con esteroles incorporan una nueva construcción lipídica en la que el colesterol (esterol) se une covalentemente al grupo de cabeza de fosfato. Se ha demostrado que los lípidos modificados con esterol hacen que el esterol no sea intercambiable de la bicapa lipídica en circulación. Los lípidos modificados con esteroles también están en fase fluida a temperatura ambiente, lo que los hace ideales para la carga a temperatura ambiente de medicamentos en liposomas que se utilizarán para la administración in vivo de productos terapéuticos.
Método
La carga de carfilzomib en liposomas a temperatura ambiente se realizó utilizando dos formulaciones de liposomas compuestas por una relación molar de 95 PChemsPC/5 PEG-DSPE y otra con una relación molar de 3 POPC/2 de colesterol/0,15 de PEG-DSPE que contenía cada una sulfato de amonio 250 mM como agente de captura. Los liposomas se prepararon usando el procedimiento, relación medicamento/liposoma, tampones y pH como se describe en el Ejemplo 1. Los liposomas se agitaron a temperatura ambiente (20 °C) y el carfilzomib se añadió como una solución de 10 mg/ml de DMSO en 5 incrementos durante 1 minuto para dar como resultado una solución turbia. La mezcla de liposoma/medicamento se agitó a temperatura ambiente durante un total de 30 min para producir una solución transparente con el mismo aspecto que la solución de liposoma antes de añadir el medicamento.
Resultados
La eficacia de la carga remota de carfilzomib en liposomas a razón de 100 g de medicamento/mol de PChemsPC fue del 95,5% ± 1,23%. La eficacia de la carga remota de carfilzomib en liposomas a razón de 187 g de medicamento/mol de 3 POPC/2 de colesterol/0,15 de PEG-DSPE fue de 100,52% ± 1,01%
Conclusión
La invención descrita en el presente documento no pudo cargar carfilzomib en liposomas añadiendo la forma cristalina del medicamento directamente a la solución de carga. El medicamento requiere solubilización en algún disolvente antes de añadirlo a la solución de carga a una concentración superior a la solubilidad del medicamento. La eficacia de carga de liposomas del precipitado que se forma tras la adición del medicamento a la solución de carga no depende de la velocidad de adición en este caso usando carfilzomib.
Ejemplo 5
Carga de precipitado de medicamento en liposomas según se determina mediante dispersión de luz a 600 nm. Introducción
La carga del liposoma con medicamento a partir de un precipitado en liposomas se evidencia por la relación de medicamento a lípido resultante y la clarificación de la solución a medida que el precipitado de medicamento se transfiere al liposoma. Para obtener una medida cuantitativa de la carga de liposomas de un precipitado de medicamento, se midió la dispersión de luz a 600 nm durante el proceso de carga.
Método
Liposomas que contienen sulfato de amonio 250 mM como agente de captura y sulfato de sodio 250 mM como liposomas de control que no cargarían el medicamento de forma remota. Los liposomas se prepararon y cargaron usando el procedimiento descrito en el Ejemplo 1 excepto que se usó una cubeta de poliestireno desechable como recipiente de reacción. La dispersión de luz a 600 nm se midió con un espectrofotómetro UV/Vis durante el proceso de carga.
Resultados/Conclusión
Los liposomas de sulfato de sodio no muestran ninguna clarificación del precipitado durante el procedimiento de carga, lo que indica que el medicamento no se está cargando a distancia en los liposomas (véase la Figura 5). Los liposomas de sulfato de amonio cargan eficazmente el medicamento, lo que da como resultado la clarificación de la solución en 15 min.
Ejemplo 6
Confirmación de liberación de medicamento de liposomas cargados a distancia
Introducción
Se utilizó un gradiente inverso para intentar liberar el medicamento activo desde el interior del liposoma. La teoría es que si se puede liberar un medicamento desde el interior de un liposoma con un gradiente inverso, existe una alta probabilidad de que la liberación del medicamento se produzca in vivo.
Método
Los liposomas se cargaron con carfilzomib como se describe en el Ejemplo 1 y se purificaron en agua desionizada. La muestra se dividió en dos alícuotas. A la primera alícuota, se le añadió Hepes concentrado pH 7,4 y NaCl de modo que la concentración final fuera Hepes 5 mM, NaCl 145 mM (HBS). A la segunda alícuota se le añadió sulfato de amonio concentrado de modo que la concentración final fuera 250 mM. Inicialmente no se observaron cambios físicos evidentes. A continuación, las muestras se calentaron a 65 °C durante 30 min. Las muestras se transfirieron a tubos Eppendorf limpios y se centrifugaron a 10.000 rpm durante 5 minutos, después de lo cual se separaron los sobrenadantes y los precipitados y se ensayó el contenido de carfilzomib mediante un ensayo de HPLC. El medicamento liberado precipitó, el medicamento encapsulado en el liposoma permaneció en el sobrenadante. El % de carfilzomib liberado se calculó mediante
Cantidad de medicamento en el precipitado
% de liberación = -----------------------------------------------— — — ----------------------- --------------------------------------------------------------; -------------------------- Cantidad de medicamento total
Resultados
T l 2. L li r i n l m i m n iri i r r i n inv r l li m
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El medicamento liberado usando el gradiente inverso es 6,5 veces mayor que el medicamento liberado del control sin gradiente inverso (Tabla 2). El cromatograma de HPLC del medicamento liberado era idéntico al material de partida, lo que indica que no había tenido lugar degradación del carfilzomib (Figura 7). El tiempo de retención por HPLc para la solución madre de carfilzomib fue de 12,2 min y el tiempo de retención para el carfilzomib que se liberó del liposoma cargado a distancia fue de 12,3 min, como se muestra en la Figura 6. Estos dos tiempos de separación están dentro de la variabilidad del sistema de HPLC y no son estadísticamente diferentes entre sí.
Conclusión
Se liberó carfilzomib del liposoma usando un gradiente inverso para obtener la molécula original como se indica por análisis de HPLC.
Ejemplo 7
Carga de carfilzomib en función del contenido de DMSO
Introducción
La forma física del medicamento cuando se añade a los liposomas es importante para la eficacia de carga, es decir, cuando se añade como un polvo seco casi no se observa carga, pero la adición usando una solución disuelta previamente en un disolvente aprótico puede conducir a una alta eficacia de atrapamiento. Este estudio analiza el efecto de la concentración de disolvente aprótico sobre la eficacia de carga del medicamento carfilzomib.
Método
Se diluyeron liposomas que contenían sulfato de amonio en tampón de sacarosa con ácido cítrico 50 mM (10% p/p) pH 4,0 con fosfolípido 1 mM. Se añadieron varias cantidades de DMSO de modo que cuando se añadieron 200 |jg de medicamento a partir de una solución de 10 mg/ml de carfilzomib en DMSO, hasta una concentración final de DMSO que oscilaba entre el 1 y el 10% v/v.
Resultados
El DMSO tuvo un efecto espectacular sobre la capacidad de carfilzomib para cargarse de forma remota en los liposomas. Cuando está ausente, prácticamente no hay carga. A concentraciones del 1% y superiores, la eficiencia de carga varía del 74 al 94%, observándose mayores eficiencias a concentraciones más altas de DMSO (Figura 7). Cabe señalar que se observaron precipitados de medicamento en todas las muestras antes de que comenzara la carga, lo que sugiere que las concentraciones de DMSO utilizadas en el presente documento están por debajo de la concentración mínima requerida para solubilizar eficazmente carfilzomib a la concentración de medicamento utilizada (0,2 mg/ml).
Conclusiones
La introducción de carfilzomib previamente solubilizado es necesaria para una carga remota eficaz. Sin embargo, por encima del 1% de DMSO hay un cambio relativamente pequeño en la eficiencia de carga, hasta un 10%.
Ejemplo 8
Solubilidad de carfilzomib en función del contenido de DMSO
Introducción
En las condiciones descritas anteriormente, carfilzomib se solubiliza en DMSO antes de diluirlo en una solución tampón de liposomas antes de cargarlo. Luego precipita inmediatamente antes de la carga remota. Este estudio está diseñado para determinar la concentración de DMSO que se requiere para solubilizar eficazmente carfilzomib a temperatura ambiente y a la temperatura requerida para la carga de liposomas en liposomas compuestos de lípidos de alta Tm (65 °C).
Método
Se añadió carfilzomib desde una solución madre de 10 mg/ml en DMSO a 1 ml de una mezcla de ácido cítrico/DMSO de modo que la composición de DMSO fuera del 2%, 25%, 50%, 75% y 100%. La concentración final de medicamento fue de 0,2 mg/ml. Se prepararon las soluciones y se midió la densidad óptica a 600 nm. La densidad óptica a 600 nm es una buena medida de cuán turbio o cuánto material de dispersión (como precipitados de medicamentos) hay en una solución; generalmente, cuanto más precipita, mayor es la absorbancia. A partir de la Figura 8 es evidente que a concentraciones de DMSO inferiores al 50% vol/vol (25 °C) y al 25% vol/vol (65 °C) el medicamento permanece en forma precipitada. Sólo cuando aumenta la concentración de DMSO se solubiliza eficazmente a esta concentración de 0,2 mg/ml.
Para probar la integridad de los liposomas en DMSO al 25%, se intentó cargar en forma remota los medicamentos de base débil solubles en agua doxorrubicina y 17-dimetilaminoetilamino-17-demetoxigeldanamicina (17-DMAG) y se compararon con la misma carga sin DMSO. Se encontró que la eficiencia de carga se vio afectada negativamente (Tabla 3).
Resultados
A 0,2 mg/ml de carfilzomib, el medicamento precipita y los agregados son lo suficientemente grandes como para provocar una señal de dispersión de luz a 600 nm. A medida que aumenta el % de DMSO, la señal se reduce e indica la solubilización del medicamento. Se observó que se requiere > 25% vol/vol de DMSO para disolver completamente el medicamento a 0,2 mg/ml a una temperatura de 65 °C.
Tabla 3. Comparación de la carga remota de doxorrubicina y 17-DMAG en liposomas que contienen sulfato de amonio en resencia ausencia de DMSO al 25%.
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Conclusiones
Se realizaron estudios previos cargando carfilzomib usando DMSO al 10% v/v o menos y los resultados de dispersión de luz anteriores muestran que la gran mayoría del medicamento bajo estas condiciones está en forma precipitada a las concentraciones usadas. Agregar suficiente disolvente aprótico para solubilizar completamente el medicamento (es decir, más del 25% de DMSO a 65 °C) tiene un impacto negativo de la carga de liposomas de medicamentos anfipáticos de base débil que indica inestabilidad de los liposomas causada por fugas de contenido o disipación de gradiente electroquímico, por ejemplo. En condiciones que mantienen una buena estabilidad de los liposomas, no se ha encontrado una concentración de DMSO que solubilice carfilzomib por completo o, alternativamente, no se han encontrado condiciones usando DMSO en las que simultáneamente el medicamento se solubiliza por completo y los liposomas no se desestabilizan adversamente.
Ejemplo 9
Efecto del retraso en la carga de liposomas de carfilzomib después de que se forma el precipitado del medicamento Introducción
La invención descrita en esta solicitud permite cargar un precipitado de medicamento insoluble en liposomas. El ejemplo 9 evalúa el efecto del tiempo entre la formación del precipitado del medicamento y el momento en que se carga en los liposomas.
Procedimiento
Se prepararon liposomas a partir de la misma composición y métodos que se describen en el Ejemplo 1.
Se disolvió carfilzomib en DMSO a una concentración de 10 mg/ml y se añadió hasta una concentración final del 2% (v/v) con citrato 50 mM, sacarosa al 10% a pH 3,5 que no contenía liposomas. Tras la adición del medicamento al tampón citrato se formó un precipitado. Los liposomas para la carga se agregaron a la solución que contenía el precipitado del medicamento inmediatamente después de la formación, después de un retraso de 1 hora o después de un retraso de 12 horas y luego el precipitado se cargó en los liposomas usando las condiciones de carga descritas en el Ejemplo 1.
Resultados/Conclusión
El tiempo entre la formación del precipitado de medicamento y la carga del precipitado no tiene un impacto significativo en la eficacia del procedimiento de carga de liposomas para carfilzomib incluso si el tiempo de retraso es de hasta 12 h.
Ejemplo 10
Efecto de la carga útil del medicamento liposómico sobre la eficiencia del carfilzomib cargado a partir del precipitado Procedimiento
Se prepararon liposomas a partir de la misma composición y métodos que se describen en Comparación de los agentes de captura, excepto que la concentración del agente de captura interno de sulfato de amonio fue 250 mM o 500 mM.
Se disolvió carfilzomib en DMSO a una concentración de 10 mg/ml. El carfilzomib se introdujo en los liposomas en proporciones de carfilzomib a HSPC de 91,8, 167, 251, 338 y 433 g de medicamento/mol de HSPC para los liposomas que tenían sulfato de amonio 250 mM como agente de captura y 451, 546, 639 y 759 g de medicamento/mol de HSPC para los liposomas que tienen sulfato de amonio 500 mM como agente de captura. Los liposomas se diluyeron con citrato 50 mM, sacarosa al 10% pH 4,0 para aumentar el volumen hasta un punto en el que, después de la adición del medicamento, la concentración final de DMSO es del 10%. Se añadió carfilzomib/DMSO a los liposomas diluidos, que se mezclaron a temperatura ambiente y luego se transfirieron a un baño a 65 °C y se agitaron cada 30 s durante los primeros 3 min y luego se agitaron cada 5 min durante un tiempo de calentamiento total de 30 min. Todas las muestras estaban muy turbias cuando se añadió el medicamento y todas se aclararon (igual que los liposomas sin medicamento añadido) después de 15 min. Después de calentar durante 30 min, todas las muestras se colocaron en hielo durante 15 min. Los liposomas cargados se purificaron y analizaron como se describe en el Ejemplo 1.
Resultados/Conclusión
Tabla 4. Efecto de la concentración del agente de captura de sulfato de amonio sobre la carga útil del medicamento
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La carga útil de medicamento resultante aumenta a medida que aumenta la proporción de lípidos de entrada de medicamento a liposoma en la solución de carga. La eficiencia es máxima con la relación de entrada más baja utilizada para cada concentración diferente de agente de captura de sulfato de amonio. Usando las condiciones descritas en este ejemplo, carfilzomib se puede cargar en liposomas desde un precipitado insoluble hasta una carga útil final de medicamento de 469 ± 4,9 g de medicamento/mol de HSPC (relación en peso de medicamento/lípidos totales del portador de 0,4) con una eficiencia de 61,7 ± 1,2%.
Ejemplo 11
Carga de carfilzomib insoluble en liposomas usando un gradiente de sulfato de trietilamonio
Introducción
La carga remota de medicamentos en liposomas se logra comúnmente usando un gradiente de sulfato de amonio. Algunas moléculas de medicamentos, incluido el ejemplo de carfilzomib que se utiliza en el presente documento, tienen un grupo epóxido que se requiere para la actividad. El epóxido de estos medicamentos es potencialmente susceptible a la aminólisis de cualquier amoniaco restante que se utilice en la carga remota de sulfato de amonio. En este Ejemplo 11, el sulfato de amonio se reemplaza con un agente de carga remota de sulfato de trietilamonio para eliminar las reacciones potenciales de amoníaco/epóxido por reemplazo con trietilamina no reactiva.
Métodos
Los liposomas se prepararon usando las mismas composiciones y procedimiento que se describen en Atrapamiento de carfilzomib en liposomas mediante carga remota con la siguiente excepción de que se usó sulfato de trietilamonio 50 mM como agente de captura. Se preparó sulfato de trietilamonio valorando ácido sulfúrico 1 M con trietilamina hasta un pH final de 7,3 y una concentración de sulfato de 500 mM.
Se disolvió carfilzomib en DMSO a una concentración de 10 mg/ml. El carfilzomib se introdujo en los liposomas en proporciones de carfilzomib a HSPC de 650 g de medicamento/mol de HSPC. Los liposomas se diluyeron con citrato 50 mM, sacarosa al 10% pH 4,0 para aumentar el volumen hasta un punto en el que, después de la adición del medicamento, la concentración final de DMSO es del 10%. Se añadió carfilzomib/DMSO a los liposomas diluidos, que se mezclaron a temperatura ambiente y luego se transfirieron a un baño a 65 °C y se agitaron cada 30 s durante los primeros 3 min y luego se agitaron cada 5 min. Se extrajo una muestra de la mezcla de carga a los 10, 20, 30 y 40 minutos durante el procedimiento de carga y se colocó en hielo durante 15 minutos. Los liposomas cargados se agitaron en vórtex y se mantuvieron 100 pl de muestra como el "antes de la columna" y el resto se transfirió a tubos de microcentrífuga y se centrifugó a 10.000 RPM durante 5 min. Los sobrenadantes se purificaron en una columna Sephadex G25, se recogieron y analizaron por HPLC. Los sedimentos del precipitado de medicamento se disolvieron en DMSO/MeOH (10:1) y se analizaron por HPLC.
Resultados/Conclusión
La carga de un precipitado de carfilzomib insoluble en liposomas usando un gradiente de sulfato de trietilamonio da como resultado liposomas similares a los producidos usando un gradiente de sulfato de amonio (Ejemplo 1). La Figura 12 ilustra la dependencia del tiempo sobre la carga de liposomas, que comienza rápidamente a los 10 min. La mayor carga útil alcanzada fue de 440 ± 12,6 g de medicamento/mol de HSPC (eficiencia de 65,9 ± 1,98%) a los 30 min. Este resultado usando trietilamina 500 mM como agente de captura en proporciones de medicamento a HSPC de 650 g de medicamento/mol de HSPC es muy similar al que usa sulfato de amonio 500 mM que las relaciones de agente de captura de medicamentos a HSPC de 639 g medicamento/mol de HSPC que dio como resultado una relación final de medicamento a lípido de 440 ± 10,2 g de medicamento/mol de HSPC (eficacia de 68,7 ± 4,80%).
El precipitado de medicamento insoluble en el exterior del liposoma se transfiere (carga remota) al interior del liposoma como indica una reducción en la cantidad de precipitado en la mezcla durante el transcurso del proceso de carga. La Figura 12 muestra que la mayor reducción en el precipitado extraliposomal ocurre entre 0-10 min que corresponde a la carga de precipitado en los liposomas como se observa en La Figura 13.
Ejemplo 12
Carga de otro medicamento poco soluble a partir de un precipitado
Introducción
Otro medicamento, el aripiprazol, se formula con sulfobutil ciclodextrano (SBCD) y se usa para tratar trastornos bipolares y esquizofrenia (Abilify, Pfizer). El medicamento es muy insoluble en agua y cuando se añade a una suspensión de liposomas, se observan inmediatamente precipitados finos.
Se probó si el aripiprazol se cargaba de forma remota en condiciones similares descritas anteriormente para carfilzomib.
Método
Se diluyeron liposomas (HSPC/Col/PEG-DSPE 3/2/0,15 mol/mol/mol) que contenían sulfato de amonio 250 mM o sulfato de sodio 250 mM en 1 ml de ácido cítrico 50 mM, sacarosa al 10% (peso/peso), pH 4,0 a una concentración de fosfolípido de 6 mM. Se añadieron 0,3 mg de aripiprazol a partir de una solución madre de 15 mg/ml en DMSO, de modo que la concentración final de DMSO fue del 2% (v/v). Se observaron precipitados finos inmediatamente después de que se añadió el medicamento a ambas muestras de liposomas. Las muestras se calentaron a 65 °C durante 30 min, luego se enfriaron en hielo. Las muestras se filtraron a través de un filtro de jeringa de polietersulfona de 0,2 pm para eliminar cualquier medicamento precipitado, seguido de purificación en una columna Sephadex G25 equilibrada con HBS, pH 6,5 para eliminar cualquier medicamento extraliposomal soluble. La fracción turbia se recogió y se analizó en busca de lípidos y medicamentos como se describió anteriormente.
Resultados
Tabla 5. Resultados de la carga de aripiprazol en liposomas que contienen
sulfato de amonio sodio.
Figure imgf000023_0001
Se encontró que los liposomas que contienen sulfato de amonio cargan aproximadamente el 85% del medicamento, mientras que la carga en los liposomas de sulfato de sodio fue menos del 2%, con un aumento de aproximadamente 50 veces en la carga atribuible a la capacidad de los liposomas de sulfato de amonio para facilitar la carga remota (Tabla 5).
El aripiprazol, cuando se introdujo en la solución de liposomas en forma de un complejo de SBCD (del producto farmacéutico Abilify) produjo una eficiencia de carga del 68% bajo la misma concentración y condiciones de carga (Figura 14).
Conclusión
Este es otro ejemplo de un medicamento poco soluble, que puede cargarse de forma remota en liposomas usando el enfoque descrito anteriormente, y proporciona una carga ligeramente mejor que si el medicamento se introdujera como un complejo SBDC.
Ejemplo 13
Carga de medicamentos poco solubles a partir de precipitados elaborados mediante la dilución de diversas soluciones de disolvente con el medicamento en una solución de liposomas
Este ejemplo describe una técnica para la carga remota de medicamentos poco solubles en liposomas que comienza disolviendo el medicamento en un agente solubilizante que inicialmente forma precipitados del medicamento cuando se añade a una solución acuosa de liposomas. Después de algún tiempo de incubación, el medicamento ingresa al liposoma en respuesta a un gradiente electroquímico, acumulándose en el núcleo del liposoma. Los disolventes que se pueden usar incluyen, entre otros, dimetilsulfóxido, dioxano, tetrahidrofurano, dimetilformamida, acetonitrilo, dimetilacetamida, sulfolano, gamma butirolactona, pirrolidonas, 1 -metil-2-pirrolidinona, metilpirrolina, éter monometílico de etilenglicol, éter monometílico de dietilenglicol, polietilenglicol.
Método
Se disolvió aripiprazol en una gama de disolventes indicada a continuación a razón de 4 mg/ml. Se utilizaron liposomas compuestos de HSPC/Col/PEG-DSPE (3/2/0,15 mol/mol/mol) que se prepararon en sulfato de amonio 250 mM y se diluyeron hasta 6 mM en sacarosa al 10% tamponada con Hepes (p/p) (HBSuc pH 6,5). Se introdujeron 0,3 mg de medicamento mediante la adición lenta de cada disolvente mientras se agitaba con vórtex. La concentración final de disolvente fue del 7,5% para todas las muestras. Como controles, se añadió el medicamento de cada disolvente al mismo volumen de HBSuc pH 6,5 sin los liposomas. Las muestras se calentaron a 65 °C durante 30 min y luego se enfriaron en hielo. Después de alcanzar de nuevo la temperatura ambiente, se midió la absorbancia de las muestras a 600 nm (espectrómetro Cary 100 Bio UV-Vis) y los valores se muestran a continuación (Figura 15).
Resultados
Todas las soluciones sin liposomas se volvieron extremadamente turbias o hubo una gran precipitación y sedimentación (especialmente en el caso de metanol y 1-butanol). Algunas de las muestras de liposomas también estaban muy turbias, pero algunas aclararon el precipitado del medicamento en consonancia con los resultados anteriores que indicaban que había tenido lugar la carga del medicamento del precipitado del medicamento (es decir, en los casos en los que el medicamento se disolvió inicialmente en DMSO, 1-4-metilpirrolidona, dietileno monoetil éter o polietilenglicol (PM 400), véase Figura15.
Ejemplo 14
Carga remota de un precipitado insoluble de deferasirox en liposomas usando un gradiente de acetato
La carga remota de deferasirox en liposomas que contienen acetato de calcio demuestra el uso de un gradiente de acetato para cargar un agente quelante de hierro. La carga remota de gradiente de acetato de calcio difiere de la carga remota de sulfato de amonio en que la molécula de medicamento que se carga debe tener un carboxilato (o hidroxamato) en lugar de una amina. Se sabe que el deferasirox tiene una toxicidad renal significativa y la administración de liposomas es una técnica para reducir la toxicidad renal.
Método
La carga remota de un precipitado insoluble de deferasirox en liposomas usando un gradiente de acetato se realiza de la misma manera que la carga de acetato de carboxifluoresceína soluble y ácido nalidíxico por Clerc y Barenholtz 1995 (PMID 8541297). Los liposomas se preparan como se describe en el Ejemplo 1 pero en este caso los liposomas se extruyen en una solución de acetato de calcio 120 mM a pH 8. El gradiente de acetato se forma intercambiando el medio externo por sulfato de sodio 120 mM a pH 6,0. Deferasirox se disuelve en DMSO a una concentración de 10 mg/ml y se agrega a la suspensión de liposomas donde forma un precipitado. El precipitado se carga en los liposomas calentando a 65 °C durante 1 hora y se realiza la purificación y el análisis como se describe en el Ejemplo 1.
Resultados
Deferasirox forma un precipitado cuando se diluye a partir de una solución madre de DMSO de 10 mg/ml a una concentración de 1 mg/ml en la suspensión de carga de liposomas debido a su escasa solubilidad en agua (~ 0,038 mg/ml). El precipitado de deferasirox insoluble se carga en los liposomas usando un gradiente de acetato de calcio con una eficacia al menos 5 veces mayor que la que se carga en los liposomas de control que contienen sulfato de sodio y ningún gradiente de acetato.
La carga remota de un precipitado insoluble de deferasirox en el liposoma proporciona un ejemplo del uso de un gradiente de acetato para cargar de forma remota un medicamento carboxilato a partir de un precipitado. En este ejemplo, el medicamento que se carga es un agente quelante, en particular un agente quelante de hierro. La carga 5 veces mayor en los liposomas que tienen un gradiente de acetato sobre los liposomas de control indica que la mayoría del deferasirox está cargado de forma remota en lugar de intercalado en la bicapa lipídica.
Ejemplo 15
Introducción
Un objetivo de la administración liposómica de carfilzomib es proteger el medicamento de la degradación y eliminación que requiere que el medicamento se retenga dentro del liposoma. Una técnica para evaluar la retención del medicamento dentro del liposoma y, por lo tanto, los beneficios obtenidos del suministro de liposomas, es medir la farmacocinética del medicamento en ratones. Las formulaciones estables con mayor retención de medicamento dentro del liposoma darán como resultado una mayor concentración de medicamento no metabolizado en el plasma de ratón en comparación con las formulaciones menos estables o el medicamento no encapsulado.
Materiales y métodos
Se formaron liposomas de 100 nm compuestos por HSPC/Colesterol/PEG-DSPE (60/40/5 mol/mol/mol) y esfingomielina/colesterol/PEG-DSPE (55/45/2,8, mol/mol/mol), se purificaron y se cargó con el medicamento carfilzomib usando los métodos descritos en el Ejemplo 1. Los agentes de captura usados para la carga remota de carfilzomib fueron sulfato de dextrano y trietilamonio (SO41,0 M) o octasulfato de sacarosa trietilamonio (SO41,0 M). Los liposomas cargados con medicamento se purificaron mediante filtración de flujo tangencial con intercambio de tampón en HBS, pH 6,5. Los liposomas se filtraron de forma estéril a través de filtros de polietersulfona de 0,2 pm y se analizaron para determinar el contenido de carfilzomib y lípido como se describe en el Ejemplo 1. Se calcularon la relación medicamento a lípido, la concentración de medicamento y la eficacia de carga y los resultados se muestran en la Tabla 6.
Resultados.
Tabla 6. Concentración de carfilzomib en plasma de ratón después de administración IV de formulaciones de li osomas.
Figure imgf000025_0001
Además, se examinó la farmacocinética de carfilzomib encapsulado en las formulaciones de liposomas en ratones CD1 machos. Los ratones se dosificaron mediante inyección intravenosa en bolo a través de la vena de la cola a razón de 5 mg/kg de carfilzomib usando 3 ratones por formulación. A las 4 h, se sacrificaron los ratones y se recogió el plasma mediante centrifugación de la sangre. Se mezclaron 0,1 ml de plasma con 0,2 ml de metanol, se mezcló bien y se midió la concentración de carfilzomib por HPLC como se describe en el Ejemplo 1. La eficiencia de carga, la relación medicamento/lípido y el porcentaje de la dosis inyectada que queda en el plasma 4 horas después de una inyección en la vena de la cola de carfilzomib en liposoma (% ID a 4 h) se muestran en la Tabla 6. Si bien no se hizo ningún esfuerzo para distinguir entre el medicamento no atrapado en liposomas y el medicamento atrapado en liposomas en el plasma, ya que este análisis mide el contenido total del medicamento, se supone que la mayor parte del carfilzomib medido está atrapado en el liposoma porque el medicamento se elimina muy rápidamente en el torrente sanguíneo (t-i/2 <20 min) (Yang et al. 2011, Drug Metab Dispos. Octubre de 2011; 39 (10): 1873-82). Se observó un intervalo de retención de medicamento de 100 veces desde el 0,65% hasta el 66,3% de ID dependiendo de la composición de la formulación de liposomas. El liposoma más estable probado estaba basado en esfingomielina y contenía una solución interna de sulfato de dextrano y amonio. Los liposomas descritos anteriormente aumentaron la retención en plasma de carfilzomib de 46 a 4735 veces más que una formulación de SBCD, o de 5 a 510 veces más que las formulaciones de liposomas publicadas 4 h después de la administración (Chu et al., 2012 AAPS Meeting Póster T2082).
Ejemplo 16
Carga remota de un precipitado insoluble de deferasirox en liposomas usando un gradiente de acetato
Introducción
La carga remota de deferasirox (DFX) en liposomas que contienen acetato de calcio demuestra el uso de un gradiente de acetato para cargar un agente quelante de hierro. La carga remota de gradiente de acetato de calcio difiere de la carga remota de sulfato de amonio en que la molécula de medicamento que se carga debe tener un carboxilato (o hidroxamato) en lugar de una amina. Se sabe que el deferasirox tiene una toxicidad renal significativa y la administración de liposomas es una técnica para reducir la toxicidad renal.
Método
Se prepararon liposomas usando el método de extrusión y purificación descrito en el Ejemplo 1. La composición lipídica fue HSPC/Colesterol (3/0,5, mol/mol) o POPC/colesterol (3/0,5, mol/mol). El agente de captura consistía en acetato de calcio o sulfato de sodio cada uno a una concentración de 120 mM. Se añadió una solución de DFX en DMSO a razón de 20 mg/ml a la solución de liposomas lentamente durante 30 segundos mientras se agitaba con vórtex para producir un precipitado de medicamento en la solución de liposomas. La relación de medicamento diana a fosfolípido fue de 100 g de DFX/mol de fosfolípido. La solución se calentó durante 30 min (a 45 °C para los liposomas de POPC y 65 °C para los liposomas de HSPC) y luego se enfrió en hielo. Se extrajo una muestra para determinar la proporción de medicamento de entrada con respecto al lípido y la solución restante se centrifugó en una centrífuga a 12.000 RPM durante 5 minutos para sedimentar cualquier medicamento descargado. El sobrenadante se purificó adicionalmente del medicamento descargado usando una columna de exclusión por tamaño Sephadex G25 eluida con HEPES 5 mM, NaCl 145 mM a pH 6,5. Los liposomas purificados se analizan para determinar el contenido de medicamento y lípido mediante HPLC usando el sistema descrito en el Ejemplo 1 y un programa que consiste en elución en gradiente de 65% de B a 98% de B en 6 min con 5 min de equilibrio de nuevo a 65% de B (A = TFAal 0,1 %, B = TFA al 0,1%/MeOH, 1,0 ml/min), la temperatura de la columna se mantuvo constante a 30 °C, inyección de 10 pl y detección por absorbancia a 254 nm.
Resultados
Tras la adición del medicamento en DMSO a los liposomas que contenían acetato de calcio como agente de captura, la solución de liposomas de POPC estaba menos turbia que la solución de liposomas de HSPC, ambos contenían medicamento precipitado antes de la carga. Después de calentar, las soluciones se aclararon y aparecieron como liposomas sin precipitado de medicamento. Los liposomas que contienen sulfato de sodio como agente de captura de control nunca se aclararon durante el proceso de calentamiento y se formó un sedimento de precipitado de medicamento tras la centrifugación. La carga de liposomas que contienen acetato de calcio elaborado a partir de POPC y HSPC fue muy eficaz. Ambos liposomas que contenían la captura de acetato de calcio dieron como resultado una eficiencia de carga > 90%. Los liposomas que contenían sulfato de sodio dieron como resultado una eficiencia de carga del 3,3%, lo que indica que la carga de DFX en los liposomas de acetato de calcio no es pasiva, sino que puede describirse como carga remota. Los resultados de la carga de DFX se muestran en la Tabla 7 (Figura 16).
T l 7. Efi i n i r DFX n li m l i 2
Figure imgf000026_0001
Conclusión
La carga remota de un precipitado insoluble de deferasirox en el liposoma proporciona un ejemplo del uso de un gradiente de acetato para cargar de forma remota un medicamento carboxilato a partir de un precipitado. En este ejemplo, el medicamento cargado era un agente quelante, en particular un agente quelante de hierro. La carga 28 veces mayor en los liposomas que tienen un gradiente de acetato sobre los liposomas de control indica que la mayoría del deferasirox está cargado de forma remota en lugar de intercalado en la bicapa lipídica.
Ejemplo 17
Carga remota de un precipitado insoluble de deferasirox en liposomas. Evaluación de la proporción de medicamento a lípido y concentración del agente de captura acetato de calcio.
Introducción
La capacidad de carga remota de DFX en liposomas que contienen acetato de calcio se evaluó usando diferentes concentraciones de acetato de calcio en el interior del liposoma y cargando un intervalo de diferentes proporciones de DFX a lípido.
Método
Se prepararon liposomas usando el método de extrusión y purificación descrito en el Ejemplo 1. La composición del lípido era POPC/colesterol (3/0,5, mol/mol). El agente de captura consistía en acetato de calcio 120 mM, 250 mM o 500 mM. Se añadió una solución de DFX en DMSO a razón de 20 mg/ml a la solución de liposomas lentamente durante 30 segundos mientras se agitaba con vórtex para producir un precipitado de medicamento en la solución de liposomas. La relación del medicamento diana a fosfolípido fue 100, 200 o 300 g de DFX/mol de fosfolípido. La solución se calentó durante 30 min a 45 °C y luego se enfrió en hielo. Se extrajo una muestra para determinar la proporción de entrada de medicamento a lípido y la solución restante se centrifugó en una centrífuga a 12.000 RPM durante 5 minutos para sedimentar cualquier medicamento descargado. El sobrenadante se purificó adicionalmente del medicamento descargado usando una columna de exclusión por tamaño Sephadex G25 eluida con HEPES 5 mM, NaCl 145 mM a pH 6,5. Los liposomas purificados se analizan para determinar el contenido de medicamento y lípido mediante HPLC como se describe en el Ejemplo 16.
Resultados
Tras la adición del medicamento en DMSO a los liposomas que contienen acetato de calcio como agente de captura, el DFX forma un precipitado antes de la carga. Después de calentar, las soluciones se aclaran y parecen liposomas sin precipitado del medicamento. La carga máxima de medicamento fue mayor para los liposomas que contenían acetato de calcio 250 y 500 mM en comparación con acetato de calcio 120 mM. La máxima carga de medicamento y eficacia se consiguió con una entrada de 200 g de DFX/mol de fosfolípido para liposomas que contenían acetato de calcio 250 mM o acetato de calcio 500 mM. La eficiencia de carga para una diana de 100 g de DFX/mol de fosfolípido osciló entre 99,2 y 103% para las tres concentraciones de acetato de calcio interno. Cuando la carga de medicamento diana se incrementó a 200 g de DFX/mol de fosfolípido, la eficacia de los liposomas que tenían acetato de calcio interno 250 o 500 mM fue al menos dos veces mayor que los liposomas que tenían una concentración de acetato de calcio interno de 120 mM. La capacidad de los tres liposomas se superó con una entrada de 300 g de DFX/mol de fosfolípido, lo que resultó en una eficiencia n < 24%. Los resultados se muestran en la Figura 17.
Conclusión
La capacidad de carga útil del medicamento de DFX cuando se carga en forma remota en liposomas se puede aumentar sustancialmente aumentando la concentración del agente de captura dentro del liposoma. Este ejemplo demuestra la dependencia de la capacidad de carga de la concentración del agente de captura acetato de calcio. Este ejemplo también demuestra que la carga de liposomas con DFX puede tener una proporción óptima de medicamento a lípido cuando la eficacia y la carga de medicamento son máximas La relación lograda de medicamento a lípido permite que el DFX se administre a un animal usando una dosis tolerada de lípido.
Ejemplo 18
Carga remota de un precipitado insoluble de deferasirox en liposomas. Evaluación del agente de captura
La capacidad de carga remota de DFX en liposomas que contienen acetato de calcio, acetato de magnesio y acetato de zinc se evaluó preparando liposomas con diferentes agentes de captura en el interior y cargando una variedad de diferentes proporciones de DFX a lípido.
Método
Los liposomas se prepararon usando el método de extrusión y purificación descrito en el Ejemplo 1. La composición del lípido fue POPC/colesterol (3/0,5, mol/mol). El agente de captura consistió en acetato de calcio, acetato de magnesio o acetato de zinc a 120 mM. Se añadió una solución de DFX en DMSO a razón de 20 mg ml a la solución de liposoma lentamente durante 30 segundos mientras se agitaba con vórtex para producir un precipitado de medicamento en la solución de liposoma. La proporción de medicamento diana a fosfolípido fue de 100, 150 o 200 g de DFX/mol de fosfolípido. La solución se calentó durante 30 min a 45 °C y luego se enfrió en hielo. Una muestra se retiró para determinar la proporción de fármaco de entrada a lípido y la solución restante se centrifugó en una centrífuga a 12.000 RPM durante 5 minutos para sedimentar cualquier fármaco descargado. El sobrenadante se purificó aún más del fármaco descargado usando una columna de exclusión por tamaño Sephadex G25, eluida con HEPES 5 mM, NaCl 145 mM a pH 6,5. Los liposomas purificados son analizados para determinar el contenido de fármaco y lípido mediante HPLC como se describe en el Ejemplo 16.
Resultados
Tras la adición del medicamento en DMSO a los liposomas, el DFX forma un precipitado antes de la carga. Después de calentar, las soluciones que contienen liposomas con acetato de calcio y acetato de magnesio se volvieron mucho menos turbias que los liposomas que contenían acetato de zinc como agente de captura. La carga máxima de medicamento fue más alta para los liposomas que contenían magnesio, la segunda más alta para los liposomas que contenían acetato de calcio y los liposomas que contienen acetato de zinc dieron como resultado la carga útil de medicamento más baja. La eficiencia de carga para una diana de 100 g de DFX/mol de fosfolípido fue de 5,3 ± 0,07% usando acetato de zinc, mientras que la eficiencia usando acetato de calcio o acetato de magnesio fue de 97,6 ± 0,41% y 99,2 ± 2,42%, respectivamente. Los resultados se muestran en la Figura 18.
Conclusión
La capacidad de carga útil de medicamento de DFX cuando se carga en forma remota en liposomas puede depender de la sal metálica particular de acetato utilizada para la carga remota. Este ejemplo demuestra que el acetato de magnesio es un mejor agente de captura para DFX que el acetato de calcio o el acetato de zinc, y ambos son agentes de captura muy superiores al acetato de zinc.
Ejemplo 19
Introducción
El agente de carga y la composición de liposomas influyen en la eficacia con la que se pueden preparar las formulaciones de liposomas que contienen carfilzomib y en las propiedades farmacocinéticas in vivo de los liposomas.
Materiales y métodos
Se formaron liposomas de 100 nm compuestos por HSPC/Colesterol/PEG-DSPE (60/40/5, mol/mol/mol) y esfingomielina/colesterol/PEG-DSPE (55/45/2,8, mol/mol/mol), se purificaron y se cargó con carfilzomib usando los métodos descritos en el Ejemplo 1. Los agentes de captura usados para la carga remota de carfilzomib fueron ácido cítrico 0,65 M, citrato de trietilamonio 0,65 M, acetato melítico de trietilamonio 0,33 M y disulfato de naftaleno y trietilamonio (SO41,0 M). Los liposomas cargados con medicamento se purificaron mediante diálisis con intercambio de tampón en HBS, pH 6,5. Los liposomas se filtraron de forma estéril a través de filtros de polietersulfona de 0,2 pm y se analizaron para determinar el contenido de carfilzomib y lípido como se describe en el Ejemplo 1. La relación medicamento a lípido, la eficacia de carga y el porcentaje de dosis inyectada que queda en plasma 4 h después de una inyección en la cola en un ratón (% ID a 4 h) se calcularon y los resultados se muestran en la Tabla 8.
Resultados.
Tabla 8. Resultados de carga de liposomas con carfilzomib y concentración en plasma de ratón después de la mini r i n in r v n f rm l i n li m .
Figure imgf000028_0001
Tras la adición del medicamento en DMSO a los liposomas, el carfilzomib forma un precipitado antes de la carga. Después de calentar, las formulaciones 1-3 en la Tabla 8 mostraron un aumento en la turbidez debido a grandes agregados en la mezcla de carga remota que no permitieron la purificación de los liposomas. La formulación 4 de la tabla 8 se volvió menos turbia después del calentamiento y dio como resultado una eficiencia de carga de 85,7 ± 4,67%. Se evaluó la retención de medicamento en el plasma de la Formulación 4 de la Tabla 8 cuatro horas después de la inyección intravenosa en ratones. Cuatro horas después de la inyección, no había carfilzomib detectable presente en el plasma. Esto debe contrastarse con los resultados de la Tabla 6, cuando las cuatro formulaciones tenían cantidades medibles y significativas de carfilzomib en plasma cuatro horas después de la inyección.
Conclusión
A partir de la inspección de los datos de las Tablas 6 y 8, queda claro que la optimización de la formulación de liposomas para la retención de carfilzomib en plasma después de la inyección intravenosa en ratones requiere: un control preciso de la composición de liposomas y la encapsulación del agente apropiado de carga remota. Las formulaciones basadas en el producto Doxil®, ampliamente utilizado y aprobado por la FDA, fueron inferiores a la composición lipídica óptima de SM/Col/PEG-DSPE (55/45/2,8). Se encapsuló la sal de amina de sulfato de dextrano.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una formulación farmacéutica que comprende un agente poco soluble en agua encapsulado dentro de un liposoma, dicha formulación fabricada mediante un método que comprende: (a) preparar una suspensión de los liposomas en un medio acuoso que tiene un gradiente de protones o iones a través de la membrana del liposoma; (b) preparar una solución del agente poco soluble en agua disolviendo completamente dicho agente poco soluble en agua en un disolvente seleccionado entre un disolvente aprótico y un poliol; (c) formar una suspensión de carga que comprende dicho agente sólido poco soluble en agua poniendo en contacto la suspensión del liposoma en (a) con la solución del agente poco soluble en agua en (b), diluyendo así (b) más allá del punto de solubilidad del agente, precipitando el agente activo poco soluble en agua en el medio acuoso formando así la suspensión de carga que comprende el agente sólido poco soluble en agua y los liposomas, en la que dicha suspensión de carga dispersa más luz que dicha suspensión de liposomas; y (d) incubar la suspensión final de (c) durante un período de tiempo suficiente para que el agente sólido poco soluble en agua se cargue remotamente desde el medio acuoso en los liposomas mediante el gradiente de protones o iones.
2. La formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1, en la que al menos aproximadamente el 70% del agente activo sólido poco soluble en agua en la suspensión de carga se carga en forma remota en el liposoma.
3. La formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1, en la que los liposomas tienen un tamaño de aproximadamente 30 nanómetros a aproximadamente 40 micrómetros.
4. La formulación farmacéutica de cualquier reivindicación precedente, en la que el liposoma consiste de 50 por ciento en moles a 70 por ciento en moles de HSPC, de 25 por ciento en moles a 50 por ciento en moles de colesterol y de 0 por ciento en moles a 10 por ciento en moles de PEG-DSPE.
5. La formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 4, en la que los liposomas comprenden aproximadamente 60% en moles de HSPC, aproximadamente 40% en moles de colesterol y aproximadamente 5% en moles de PEG-DSPE.
6. La formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1, en la que los liposomas comprenden de aproximadamente 45% en moles a aproximadamente 75% en moles de esfingomielina, de aproximadamente 25% en moles a aproximadamente 50% en moles de colesterol y de aproximadamente 0% en moles a aproximadamente 10% en moles de PEG-DSPE.
7. La formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 6, en la que los liposomas comprenden aproximadamente 55% en moles de esfingomielina, aproximadamente 45% en moles de colesterol y aproximadamente 2,8% en moles de PEG-DSPE.
8. La formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el agente activo poco soluble en agua tiene una solubilidad acuosa de menos de 2 mg/ml.
9. La formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 8, en la que el agente activo poco soluble en agua tiene una solubilidad acuosa a pH 7 de menos de 2 mg/ml.
10. La formulación farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicho agente es carfilzomib.
11. La formulación farmacéutica de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el disolvente aprótico se selecciona entre dimetilsulfóxido, dioxano, tetrahidrofurano, dimetilformamida, acetonitrilo, dimetilacetamida, sulfolano, gamma butirolactona, pirrolidonas, 1 -metil-2-pirrolidinona, metilpirrolina, éter monometílico de etilenglicol, éter monometílico de dietilenglicol, polietilenglicol.
12. La formulación farmacéutica de la reivindicación 1 en la que la eficacia de encapsulación es al menos del 50%.
13. La formulación farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 12, en la que la eficacia de encapsulación es de al menos el 90%.
14. La formulación farmacéutica de cualquier reivindicación precedente, en la que el medio acuoso interno comprende un tampón de carga activa que consiste en agua, opcionalmente una sal seleccionada entre una sal de sulfato, fosfato, fosfonato, citrato o acetato, una sal de amonio, una sal de amonio alquilada, por ejemplo, de metilo, etilo, propilo y amilo, una sal de Fe+2, Mn2+, Cu2+, Na+ y/o K+, una sal de ión EDTA y, opcionalmente, un tampón de pH para mantener un gradiente de pH.
15. Un método para cargar remotamente un liposoma con un agente que es poco soluble en agua en el que el método comprende: (a) preparar una suspensión de los liposomas en un medio acuoso que tiene un gradiente de protones o de iones a través de la membrana del liposoma; (b) preparar una solución del agente poco soluble en agua disolviendo completamente dicho agente poco soluble en agua en un disolvente seleccionado entre un disolvente aprótico y un poliol; (c) formar una suspensión de carga que comprende dicho agente sólido poco soluble en agua poniendo en contacto la suspensión del liposoma en (a) con la solución del agente poco soluble en agua en (b), diluyendo así (b) más allá del punto de solubilidad del agente, precipitando el agente activo poco soluble en agua en el medio acuoso, formando así la suspensión de carga que comprende el agente sólido poco soluble en agua y los liposomas, en el que dicha suspensión de carga dispersa más luz que dicha suspensión de liposomas; y (d) incubar la suspensión final de (c) durante un período de tiempo suficiente para que el agente sólido poco soluble en agua se cargue remotamente desde el medio acuoso en los liposomas por el gradiente de protones o iones.
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