ES2877178T3

ES2877178T3 - Procesos informáticos tras una versión mejorada de AQUA

Info

Publication number: ES2877178T3
Application number: ES16858376T
Authority: ES
Inventors: Jennifer Bordeaux; Brian Little
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 2015-10-23
Filing date: 2016-10-21
Publication date: 2021-11-16
Anticipated expiration: 2036-10-21
Also published as: US11430111B2; US10621721B2; US20200286230A1; EP3365677A1; JP2018536852A; WO2017070584A1; CN114578038A; AU2016341306B2; JP2021156898A; EP3365677B1; EP3365677A4; CN108449973B; AU2016341306A1; US20180330498A1; JP7124173B2; JP6898316B2; CN108449973A

Abstract

Sistema para determinar una puntuación representativa de la proximidad entre al menos un par de células en una muestra de tejido tumoral, sistema que comprende: un controlador programable (200) programado para: recibir datos de imagen de un dispositivo de obtención de imágenes (100), separar los datos de imagen en datos de imagen sin mezclar y proporcionar los datos a través de una pluralidad de canales de datos; donde los datos de imagen sin mezclar de un primer canal de datos describen señales de fluorescencia atribuibles a un núcleo celular, los datos sin mezclar de un segundo canal de datos describen señales de fluorescencia atribuibles al tejido tumoral, los datos sin mezclar de un tercer canal de datos describen señales de fluorescencia atribuibles a un primer biomarcador, y los datos de imagen sin mezclar de un cuarto canal de datos describen señales de fluorescencia atribuibles a un segundo biomarcador; recibir datos de imagen del primer canal de datos y generar una imagen representativa de todos los núcleos de un campo de visión y dilatar la imagen para generar una máscara de células; recibir datos de imagen del segundo canal de datos y generar una máscara de toda el área tumoral en el campo de visión; recibir datos de imagen del tercer canal de datos y generar una máscara del primer biomarcador de todas las células del campo de visión que expresan el primer biomarcador; recibir datos de imagen del cuarto canal de datos y generar una máscara del segundo biomarcador de todas las células del campo de visión que expresan el segundo biomarcador; combinar la máscara de células y la máscara de área tumoral para generar al menos una máscara de células no tumorales y una máscara de células tumorales; dilatar la máscara del primer biomarcador en un margen suficiente para abarcar las células localizadas proximalmente que expresan el segundo biomarcador para generar una máscara del primer biomarcador dilatada; combinar la máscara del primer biomarcador dilatada y la máscara del segundo biomarcador para generar una máscara de interacción; calcular una puntuación de proximidad espacial basada en el área de la máscara de interacción y el área de al menos una de entre la máscara de células no tumorales, la máscara de células tumorales y la máscara de células.

Description

DESCRIPCIÓN

Procesos informáticos tras una versión mejorada de AQUA

REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS

[0001] La presente solicitud reivindica el beneficio y la prioridad de la solicitud provisional de EE. UU. con n.° 62/245,938, presentada el 23 de octubre de 2015, de la solicitud provisional de EE. UU. con n.° 62/259,328, presentada el 24 de noviembre de 2015, y de la solicitud provisional de EE. UU. con n.° 62/301,037, presentada el 29 de febrero de 2016.

ANTECEDENTES

[0002] La presente invención se refiere en general al campo del tratamiento del cáncer. En la patente WO 2015/124777 A1 se describe un método de análisis de imágenes médicas para identificar células tumorales con resultado positivo en biomarcadores, método que comprende: - la lectura de una primera imagen digital y una segunda imagen digital que representan la misma área de un primer portaobjetos; donde el primer portaobjetos comprende múltiples células tumorales que se han teñido con una primera tinción y con una segunda tinción; la primera tinción tiñe selectivamente un núcleo y la segunda tinción tiñe selectivamente núcleos y la segunda tinción tiñe selectivamente un biomarcador particular, donde la presencia y/o cantidad del biomarcador en una célula tumoral indica una célula tumoral que pertenece a un subtipo de cáncer particular; - la identificación de una pluralidad de núcleos e información sobre la ubicación de dichos núcleos mediante el análisis de las intensidades de la luz en la primera imagen digital; - la identificación de las membranas celulares que comprenden el biomarcador mediante el análisis de las intensidades de la luz en la segunda imagen digital y el análisis de la información de ubicación de los núcleos identificados; - la identificación de células tumorales con resultado positivo en biomarcadores en dicha área, en donde una célula tumoral con resultado positivo en biomarcadores es una combinación de un núcleo identificado y una membrana celular identificada que rodea el núcleo identificado.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0003] En este documento, en un aspecto, se describen sistemas de obtención de imágenes que comprenden un controlador de procesamiento de imágenes que comprende un circuito de procesamiento configurado para ejecutar instrucciones almacenadas en un medio legible por ordenador que permiten al controlador del sistema de procesamiento de imágenes:

estar configurado para recibir datos de imagen de un dispositivo de obtención de imágenes, donde los datos de imagen describen una muestra de tejido tumoral procedente de un paciente con cáncer; y determinar, utilizando los datos de imagen, una puntuación representativa de la proximidad entre al menos un par de células del tejido tumoral, donde un primer miembro del al menos un par de células expresa un primer biomarcador y un segundo miembro del al menos un par de células expresa un segundo biomarcador que es diferente del primer biomarcador; en donde la puntuación es indicativa de la probabilidad de que el paciente con cáncer tenga una respuesta positiva a inmunoterapia. En algunas formas de realización, la puntuación representativa de una proximidad entre al menos un par de células es representativa de un grado en el que el par de células está dentro de una proximidad predeterminada entre sí. En algunas formas de realización, la proximidad se evalúa a escala de píxeles. En algunas formas de realización, la proximidad predeterminada entre el par de células varía de aproximadamente 1 píxel a aproximadamente 100 píxeles. En algunas formas de realización, la proximidad predeterminada entre el par de células varía de aproximadamente 5 píxeles a aproximadamente 40 píxeles. En algunas formas de realización, la proximidad predeterminada entre el par de células varía de aproximadamente 0,5 pm a aproximadamente 50 pm. En algunas formas de realización, la proximidad predeterminada entre el par de células varía de aproximadamente 2,5 pm a aproximadamente 20 pm. En algunas formas de realización, la puntuación se determina obteniendo una proximidad entre los límites del par de células. En algunas formas de realización, la puntuación se determina obteniendo una proximidad entre los centros de masa del par de células. En algunas formas de realización, la puntuación se determina usando lógica de límites basada en un perímetro alrededor de una primera célula seleccionada del par de células. En algunas formas de realización, la puntuación se determina mediante la determinación de una intersección en los límites del par de células. En algunas formas de realización, la puntuación se obtiene determinando un área de superposición del par de células. En algunas formas de realización, el controlador de procesamiento de imágenes está configurado además para separar los datos de imagen en datos de imagen sin mezclar; y proporcionar los datos a través de una pluralidad de canales de datos, en los que los datos de imagen sin mezclar de un primer canal de datos describen señales de fluorescencia atribuibles al primer biomarcador y los datos de imagen sin mezclar de un segundo canal de datos describen señales de fluorescencia atribuibles al segundo biomarcador. En algunas formas de realización, para determinar la puntuación, el controlador de procesamiento de imágenes está configurado para dilatar las señales de fluorescencia atribuibles al primer biomarcador del primer canal de datos en un margen predeterminado que se selecciona de modo que abarque células localizadas proximalmente que expresan el segundo biomarcador para generar una máscara del primer biomarcador dilatada; determinar un área de interacción, en la que el área de interacción es una primera área total para todas las células que expresan el segundo biomarcador y están incluidas dentro de las señales de fluorescencia dilatadas atribuibles a las células que expresan el primer biomarcador; y dividir el área de interacción por un factor de normalización y multiplicar el cociente resultante por un factor predeterminado para obtener una puntuación de proximidad espacial. En algunas formas de realización, el factor de normalización es un área total para todas las células que tienen la capacidad de expresar el segundo biomarcador. En algunas formas de realización, el área de interacción se determina combinando la máscara del primer biomarcador dilatada con una máscara representativa de las células que expresan el segundo biomarcador, determinada a partir de señales del segundo canal de datos. En algunas formas de realización, un tercer canal de datos describe señales de fluorescencia atribuibles a núcleos celulares y un cuarto canal de datos describe señales de fluorescencia atribuibles al área tumoral de la muestra. En algunas formas de realización, el área total para todas las células que tienen la capacidad de expresar el segundo biomarcador se determina combinando una máscara de células representativa de todas las células de la muestra, basada en señales del tercer canal de datos, y una máscara de área tumoral representativa de el área tumoral de la muestra, según las señales del cuarto canal de datos. En algunas formas de realización, la combinación de la máscara de células y la máscara del área tumoral comprende eliminar la máscara del área tumoral de la máscara de células. En algunas formas de realización, cada máscara se genera asignando un valor binario a cada píxel de datos de imagen de un canal seleccionado. En algunas formas de realización, el valor binario se asigna a cada valor mediante una función de umbral, en donde la función de umbral asigna un valor de 1 a cada píxel que tiene una intensidad igual o mayor que un umbral de intensidad predeterminado, y asigna un valor de 0 a cada píxel que tiene una intensidad por debajo del umbral de intensidad predeterminado. En algunas formas de realización, el valor binario se asigna a cada valor mediante una función de umbral de histograma, en donde la función de umbral de histograma utiliza una escala móvil de intensidad de píxeles para determinar un umbral, y asigna un valor de 1 a cada píxel que tiene una intensidad igual o mayor que un umbral de intensidad, y asigna un valor de 0 a cada píxel que tiene una intensidad por debajo del umbral de intensidad. En algunas formas de realización, el umbral se determina sumando la intensidad de cada píxel para obtener una intensidad total; multiplicando un porcentaje de umbral por la intensidad total para obtener una suma de corte; agrupando todos los píxeles por intensidad en un histograma; y sumando las intensidades de los píxeles de menor a mayor hasta que se obtiene la suma de corte;

en donde la última intensidad de píxel más alta tratada en el proceso es el umbral de intensidad. En algunas formas de realización, la combinación de las máscaras se realiza usando una operación “y” (and); en donde la operación “y” es una multiplicación de la intensidad de píxel de un píxel de una primera máscara por la intensidad de píxel del píxel de una segunda máscara. En algunas formas de realización, la combinación de las máscaras se realiza usando una operación “fuera” (out); en donde la operación “fuera” elimina una segunda máscara de una primera máscara. En algunas formas de realización, el controlador de procesamiento de imágenes está configurado además para obtener datos de imagen con bajo aumento representativas de la concentración del primer o segundo biomarcador en la imagen; identificar áreas que incluyen la concentración más alta del primer o segundo biomarcador; seleccionar un número predeterminado de áreas que incluyen la concentración más alta del primer o segundo biomarcador; enviar instrucciones al dispositivo de obtención de imágenes para obtener datos de imagen de gran aumento para el número predeterminado de áreas; y en donde los datos de imagen de gran aumento se proporcionan al controlador para ser analizados y utilizados para determinar la puntuación. En algunas formas de realización, el bajo aumento es menor o igual al aumento de 10x y el gran aumento es mayor de 10x. En algunas formas de realización, el bajo aumento es un aumento de 10x y el gran aumento es de 40x. En algunas formas de realización, el bajo aumento es un aumento de 10x y el gran aumento es de 20x. En algunas formas de realización, el bajo aumento es un aumento de 4x y el gran aumento es de 40x. En algunas formas de realización, el bajo aumento es un aumento de 4x y el gran aumento es de 20x. En algunas formas de realización, la unidad de procesamiento de imágenes está configurada además para asociar la puntuación con los metadatos asociados con las imágenes de la muestra. En algunas formas de realización, la unidad de procesamiento de imágenes genera un informe que incluye la puntuación. En algunas formas de realización, la unidad de procesamiento de imágenes está configurada además para proporcionar la puntuación a un operador para determinar la estrategia de inmunoterapia. En algunas formas de realización, la unidad de procesamiento de imágenes está configurada además para registrar la puntuación en una base de datos. En algunas formas de realización, la unidad de procesamiento de imágenes está configurada además para asociar la puntuación con el historial médico de un paciente. En algunas formas de realización, la unidad de procesamiento de imágenes está configurada además para mostrar la puntuación en un dispositivo de visualización. En algunas formas de realización, el primer miembro del al menos un par de células comprende una célula tumoral y el segundo miembro del al menos un par de células comprende una célula no tumoral. En algunas formas de realización, la célula no tumoral comprende una célula inmunitaria. En algunas formas de realización, el primer y segundo miembros del al menos un par de células comprenden células inmunitarias. En algunas formas de realización, el primer miembro del al menos un par de células comprende una célula tumoral, una célula mieloide o una célula estromal y el segundo miembro del al menos un par de células comprende una célula inmunitaria. En algunas formas de realización, la célula tumoral, la célula mieloide o la célula estromal expresa PD-L1 y la célula inmunitaria expresa PD-1. En algunas formas de realización, la unidad de procesamiento de imágenes está configurada además para seleccionar un número predeterminado de campos de visión disponibles de la muestra que comprende tejido tumoral procedente del paciente con cáncer y determinar la puntuación a partir de los datos asociados con cada campo de visión. En algunas formas de realización, la muestra se tiñe con una pluralidad de marcadores de fluorescencia y cada uno de los marcadores de fluorescencia está dirigido a un biomarcador específico. En algunas formas de realización, la pluralidad de marcadores de fluorescencia comprende un primer marcador de fluorescencia para el primer biomarcador y un segundo marcador de fluorescencia para el segundo biomarcador. En algunas formas de realización, el margen varía de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 píxeles. En algunas formas de realización, las células localizadas proximalmente que expresan el segundo biomarcador están dentro de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 50 |_im de una membrana plasmática de las células que expresan el primer biomarcador. En algunas formas de realización, el factor predeterminado es 104. En algunas formas de realización, el primer miembro del al menos un par de células expresa un primer biomarcador seleccionado del grupo que consiste en PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4, HLA-DR, Galectina 9, CD80, CD86, 4.1BBL, ICOSL, CD40, OX40L, IDO-1, GITRL y combinaciones de los mismos, y el segundo miembro del al menos un par de células expresa un segundo biomarcador seleccionado del grupo que consiste en PD-1, TIM3, LAG3 , 41BB, OX40, CTLA-4, CD40L, CD28, GITR, ICOS, CD28 y combinaciones de los mismos. En algunas formas de realización, el valor umbral varía de aproximadamente 500 a aproximadamente 5000. En algunas formas de realización, el valor umbral es aproximadamente 900 más o menos 100. En algunas formas de realización, la inmunoterapia comprende terapia de puntos de control inmunitario. En algunas formas de realización, el método proporciona una capacidad predictiva superior en comparación con la cuantificación de la expresión del primer biomarcador o la cuantificación de la expresión del segundo biomarcador. En algunas formas de realización, la capacidad predictiva se cuantifica como un valor predictivo positivo, un valor predictivo negativo o una combinación de los mismos. En algunas formas de realización, el valor predictivo positivo es del 65 % o más. En algunas formas de realización, el valor predictivo positivo es del 70 % o más. En algunas formas de realización, el valor predictivo positivo es del 75 % o más. En algunas formas de realización, el valor predictivo negativo es del 65 % o más. En algunas formas de realización, el valor predictivo negativo es del 80 % o más.

[0004] En otro aspecto, en este documento se describen sistemas para determinar una puntuación representativa de una proximidad entre al menos un par de células en una muestra de tejido tumoral, donde el sistema comprende una memoria, la memoria comprende un desmezclador espectral que recibe datos de imagen de un dispositivo de obtención de imágenes, separa los datos de imagen en datos de imagen sin mezclar y proporciona los datos a través de una pluralidad de canales de datos, en donde los datos de imagen sin mezclar de un primer canal de datos describen señales de fluorescencia atribuibles a un núcleo celular, los datos sin mezclar de un segundo canal de datos describen señales de fluorescencia atribuibles al tejido tumoral, los datos sin mezclar de un tercer canal de datos describen señales de fluorescencia atribuibles a un primer biomarcador, y los datos de imagen sin mezclar de un cuarto canal de datos describen señales de fluorescencia atribuibles a un segundo biomarcador; un enmascarador de células que usa datos de imagen del primer canal de datos y genera una imagen representativa de todos los núcleos de un campo de visión y dilata la imagen para generar una máscara de células; un enmascarador de área tumoral que usa datos de imagen del segundo canal de datos y genera una máscara de toda el área tumoral del campo de visión; un enmascarador del primer biomarcador que usa datos de imagen del tercer canal de datos y genera una máscara del primer biomarcador de todas las células del campo de visión que expresan el primer biomarcador; un enmascarador del segundo biomarcador que usa datos de imagen del cuarto canal de datos y genera una máscara del segundo biomarcador de todas las células del campo de visión que expresan el segundo biomarcador; un enmascarador de tumores que combina la máscara de células y la máscara del área tumoral para generar al menos una máscara de células no tumorales y una máscara de células tumorales; un dilatador que dilata la máscara del primer biomarcador para generar una máscara del primer biomarcador dilatada; un enmascarador de interacción para combinar la máscara del primer biomarcador dilatada y la máscara del segundo biomarcador para generar una máscara de interacción; una calculadora de interacción que calcula una puntuación de proximidad espacial. En algunas formas de realización, la calculadora de interacción divide el área de la máscara de interacción por el área de una de entre la máscara de células no tumorales, la máscara de células tumorales y la máscara de células. En algunas formas de realización, la puntuación de proximidad espacial se calcula de acuerdo con la ecuación:

en la que A i es un área de interacción total (área de la máscara de interacción) y Ac es el área total de al menos una de entre la máscara de células no tumorales, la máscara de células tumorales y la máscara de células. En algunas formas de realización, el método proporciona una capacidad predictiva superior en comparación con la cuantificación de la expresión del primer biomarcador o la cuantificación de la expresión del segundo biomarcador. En algunas formas de realización, la capacidad predictiva se cuantifica como un valor predictivo positivo, un valor predictivo negativo o una combinación de los mismos. En algunas formas de realización, el valor predictivo positivo es del 65 % o más. En algunas formas de realización, el valor predictivo positivo es del 70 % o más. En algunas formas de realización, el valor predictivo positivo es del 75 % o más. En algunas formas de realización, el valor predictivo negativo es del 65 % o más. En algunas formas de realización, el valor predictivo negativo es del 80 % o más.

[0005] En otro aspecto, en el presente documento se describen métodos para procesar una imagen de una muestra de tejido para determinar una puntuación representativa de una proximidad entre al menos un par de células del tejido, método que comprende: recibir datos de imagen asociados con una muestra de tejido que comprende tejido tumoral procedente de un paciente con cáncer; seleccionar al menos un campo de visión de la muestra que comprende tejido tumoral procedente del paciente con cáncer, que se tiñe con una pluralidad de marcadores de fluorescencia, donde dicha selección está sesgada hacia la selección de al menos un campo de visión que contenga un mayor número de células que expresan el primer biomarcador en comparación con otros campos de visión; dilatar, para cada uno de los campos de visión seleccionados, las señales de fluorescencia atribuibles al primer biomarcador en un margen suficiente para abarcar las células localizadas proximalmente que expresan el segundo biomarcador; dividir una primera área total para todas las células de cada uno de los campos de visión seleccionados, que expresan el segundo biomarcador y están dentro de las señales de fluorescencia dilatadas atribuibles a las células que expresan el primer biomarcador, entre un factor de normalización, y multiplicar el cociente resultante por un factor predeterminado para obtener una puntuación de proximidad espacial; y registrar la puntuación, la cual, cuando se compara con un valor umbral, indica una probabilidad de que el paciente con cáncer responda de manera positiva a la inmunoterapia. En algunas formas de realización, el método proporciona una capacidad predictiva superior en comparación con la cuantificación de la expresión del primer biomarcador o la cuantificación de la expresión del segundo biomarcador. En algunas formas de realización, la capacidad predictiva se cuantifica como un valor predictivo positivo, un valor predictivo negativo o una combinación de los mismos. En algunas formas de realización, el valor predictivo positivo es del 65 % o más. En algunas formas de realización, el valor predictivo positivo es del 70 % o más. En algunas formas de realización, el valor predictivo positivo es del 75 % o más. En algunas formas de realización, el valor predictivo negativo es del 65 % o más. En algunas formas de realización, el valor predictivo negativo es del 80 % o más.

[0006] En otro aspecto, en este documento se describen sistemas para determinar un valor de positividad de un biomarcador en una muestra de tejido, donde el sistema comprende un circuito de procesamiento que comprende una memoria, la cual comprende un desmezclador espectral que recibe datos de imagen de un dispositivo de obtención de imágenes, separa los datos de imagen en datos de imagen sin mezclar y proporciona los datos a través de una pluralidad de canales de datos, en donde los datos de imagen sin mezclar de un primer canal de datos describen señales de fluorescencia atribuibles a un núcleo celular, los datos sin mezclar de un segundo canal de datos describen señales de fluorescencia atribuibles a un tejido de subconjunto de interés, y los datos sin mezclar de un tercer canal de datos describen señales de fluorescencia atribuibles a un primer biomarcador; un enmascarador de células que usa datos de imagen del primer canal de datos y genera una imagen representativa de todos los núcleos de un campo de visión y dilata la imagen para generar una máscara de células; un enmascarador de área de subconjunto que usa datos de imagen del segundo canal de datos y genera una máscara de todo el área de subconjunto del campo de visión; un enmascarador del primer biomarcador que usa datos de imagen del tercer canal de datos y genera una máscara del primer biomarcador de todas las células del campo de visión que expresan el primer biomarcador; un enmascarador de subconjunto que combina la máscara de células y la máscara de área de subconjunto para generar al menos una máscara de células que no forman parte del subconjunto y una máscara de células de subconjunto; un enmascarador de combinación para combinar la máscara de biomarcador y al menos una de entre la máscara de células que no son de subconjunto y la máscara de células de subconjunto; una calculadora de positividad para calcular el valor de positividad de un biomarcador. En algunas formas de realización, la calculadora divide un área de la máscara de biomarcador entre un área de al menos una de entre la máscara de células que no son de subconjunto y la máscara de células de subconjunto. En algunas formas de realización, el tejido de subconjunto de interés es tejido tumoral, la célula de subconjunto es una célula tumoral y la célula que no es de subconjunto es una célula no tumoral.

[0007] En algunas formas de realización, el primer biomarcador comprende un biomarcador seleccionado de entre PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4, HLA-DR, Galectina 9, CD80, CD86, 4.1BBL, ICOSL, CD40, OX40L, IDO- 1, GITRL, PD-1, TIM3, LAG3, 41BB, OX40, CTLA-4, CD40L, CD28, GITR, ICOS, CD28, CD3, CD4, CD8, FoxP3, CD25, CD16, CD56, CD68, CD163, CD80, y CD86.

[0008] En algunas formas de realización, el segundo biomarcador es diferente del primer biomarcador y comprende un biomarcador seleccionado de entre PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4, HLA-DR, Galectina 9, CD80, c D86, 4.1BBL, ICOSL , CD40, OX40L, IDO-1, GITRL, PD-1, TIM3, LAG3, 41BB, OX40, CTLA-4, CD40L, CD28, GITR, ICOS, CD28, CD3, CD4, CD8, FoxP3, CD25, CD16, CD56 , CD68, CD163, CD80 y CD86.

[0009] En otro aspecto, en el presente documento se describen sistemas que comprenden una unidad de procesamiento de imágenes configurada para recibir datos de imagen de un dispositivo de obtención de imágenes, donde los datos de imagen describen una muestra de tejido procedente de un paciente y para determinar un valor de positividad de un biomarcador representativo de una cantidad de células de un tipo en la muestra que expresan un biomarcador de interés en comparación con la cantidad total de células de dicho tipo en la muestra.

[0010] En este documento, en un aspecto, se describen sistemas de obtención de imágenes para puntuar una muestra que comprende tejido tumoral procedente de un paciente con cáncer, donde el sistema de obtención de imágenes comprende un dispositivo de obtención de imágenes que comprende una superficie para colocar la muestra en un campo de obtención de imágenes, una fuente de radiación electromagnética para dirigir la radiación electromagnética hacia la muestra y un detector configurado para detectar la radiación electromagnética de la muestra, y un controlador. El controlador comprende una interfaz de usuario para intercambiar información entre un operador y el controlador; y un circuito de procesamiento configurado para ejecutar instrucciones almacenadas en un medio legible por ordenador. Las instrucciones están configuradas para hacer que el controlador: (i) reciba información sobre la radiación electromagnética detectada a partir del dispositivo de obtención de imágenes; (ii) genere datos de imagen en función de la radiación electromagnética detectada; (iii) analice los datos de imagen para determinar una puntuación representativa de la proximidad entre al menos un par de células, donde un primer miembro del menos un par de células expresa un primer biomarcador y un segundo miembro del al menos un par de células expresa un segundo biomarcador que es diferente del primer biomarcador; y (iv) registre la puntuación, la cual, cuando se compara con un valor umbral, es indicativa de la probabilidad de que el paciente con cáncer tenga una respuesta positiva a la inmunoterapia.

[0011] En algunas formas de realización, la puntuación es representativa de una proximidad entre al menos un par de células y es representativa de un grado en el que el par de células está dentro de una proximidad predeterminada entre sí. En algunas formas de realización, la proximidad se evalúa a escala de píxeles. En algunas formas de realización, la proximidad predeterminada entre el par de células varía de aproximadamente 1 píxel a aproximadamente 100 píxeles. En algunas formas de realización, la proximidad predeterminada entre el par de células varía de aproximadamente 5 píxeles a aproximadamente 40 píxeles. En algunas formas de realización, la proximidad predeterminada entre el par de células varía de aproximadamente 0,5 |_im a aproximadamente 50 |_im. En algunas formas de realización, la proximidad predeterminada entre el par de células varía de aproximadamente 2,5 |_im a aproximadamente 20 |_im.

[0012] En algunas formas de realización, la puntuación se calcula obteniendo una proximidad entre los límites del par de células. En algunas formas de realización, la puntuación se calcula obteniendo una proximidad entre los centros de masa del par de células. En algunas formas de realización, la puntuación se calcula usando lógica de límites basada en un perímetro alrededor de una primera célula seleccionada del par de células. En algunas formas de realización, la puntuación se calcula determinando una intersección en los límites del par de células. En algunas formas de realización, la puntuación se calcula determinando un área de superposición del par de células.

[0013] En algunas formas de realización, la generación de los datos de imagen comprende: (i) separar la información sobre la radiación electromagnética detectada en datos de imagen sin mezclar; y (ii) proporcionar los datos a través de una pluralidad de canales de datos, en donde los datos de imagen sin mezclar de un primer canal de datos describen señales de fluorescencia atribuibles al primer biomarcador y los datos de imagen sin mezclar de un segundo canal de datos describen señales de fluorescencia atribuibles al segundo biomarcador.

[0014] En algunas formas de realización, el análisis de los datos comprende: (i) dilatar, usando un dilatador del circuito de procesamiento, las señales de fluorescencia atribuibles al primer biomarcador del primer canal de datos en un margen predeterminado que se selecciona de modo que abarque células localizadas proximalmente que expresan el segundo biomarcador para generar una máscara del primer biomarcador dilatada; (ii) determinar un área de interacción, en donde el área de interacción es una primera área total para todas las células que expresan el segundo biomarcador y están incluidas dentro de las señales de fluorescencia dilatadas atribuibles a las células que expresan el primer biomarcador; y (iii) dividir, usando una calculadora de interacción del circuito de procesamiento, el área de interacción entre un factor de normalización, y multiplicar el cociente resultante por un factor predeterminado para obtener una puntuación de proximidad espacial.

[0015] En algunas formas de realización, el factor de normalización es un área total para todas las células que tienen la capacidad de expresar el segundo biomarcador. En algunas formas de realización, el área de interacción se determina combinando la máscara del primer biomarcador dilatada con una máscara representativa de las células que expresan el segundo biomarcador, determinada a partir de señales del segundo canal de datos. En algunas formas de realización, un tercer canal de datos describe señales de fluorescencia atribuibles a núcleos celulares y un cuarto canal de datos describe señales de fluorescencia atribuibles al área tumoral de la muestra. En algunas formas de realización, el área total para todas las células que tienen la capacidad de expresar el segundo biomarcador se determina combinando una máscara de células representativa de todas las células de la muestra, en función de señales del tercer canal de datos, y una máscara de área tumoral representativa de el área tumoral en la muestra, según las señales del cuarto canal de datos. En algunas formas de realización, la combinación de la máscara de células y la máscara del área tumoral comprende retirar la máscara del área tumoral de la máscara de células.

[0016] En algunas formas de realización, el circuito de procesamiento está configurado además para hacer que el controlador: (i) obtenga datos de imagen con un bajo aumento representativo de la concentración del primer o segundo biomarcador en la imagen; (ii) identifique áreas que incluyan la concentración más alta del primer o segundo biomarcador; (iii) seleccione un número predeterminado de áreas que incluyan la concentración más alta del primer o segundo biomarcador; (iv) envíe instrucciones al dispositivo de obtención de imágenes para obtener datos de imagen de gran aumento para el número predeterminado de áreas; en donde los datos de imagen de gran aumento se proporcionan al controlador para ser analizados y utilizados para determinar la puntuación.

[0017] En algunas formas de realización, el bajo aumento es menor o igual a un aumento de 10x y el gran aumento es mayor de 10x. En algunas formas de realización, el bajo aumento es un aumento de 10x y el gran aumento es de 40x. En algunas formas de realización, el bajo aumento es un aumento de 10x y el gran aumento es de 20x. En algunas formas de realización, el bajo aumento es un aumento de 4x y el gran aumento es de 40x. En algunas formas de realización, el bajo aumento es un aumento de 4x y el gran aumento es de 20x.

[0018] En algunas formas de realización, el controlador asocia la puntuación con metadatos asociados con las imágenes de la muestra. En algunas formas de realización, el controlador genera un informe que incluye la puntuación. En algunas formas de realización, el controlador proporciona la puntuación a un operador para determinar la estrategia de inmunoterapia. En algunas formas de realización, el controlador registra la puntuación en una base de datos. En algunas formas de realización, el controlador asocia la puntuación con el historial médico de un paciente.

[0019] En algunas formas de realización, la fuente de radiación electromagnética es una fuente de radiación electromagnética incoherente seleccionada del grupo que consiste en una lámpara incandescente, una lámpara fluorescente o un diodo. En algunas formas de realización, la fuente de radiación electromagnética es una fuente de radiación electromagnética coherente. En algunas formas de realización, el sistema comprende además elementos ópticos de acondicionamiento de la radiación electromagnética colocados de modo que dirijan la radiación electromagnética desde la fuente de radiación electromagnética hacia la muestra. En algunas formas de realización, los elementos ópticos de acondicionamiento de la radiación electromagnética incluyen un elemento de filtro espectral ajustable configurado para proporcionar iluminación a la muestra utilizando diferentes bandas de longitud de onda de radiación electromagnética.

[0020] En algunas formas de realización, el sistema comprende además elementos ópticos de recogida de radiación electromagnética configurados para recibir radiación electromagnética emitida desde la muestra y dirigir la radiación electromagnética emitida como radiación electromagnética de salida al detector. En algunas formas de realización, los elementos ópticos de recogida de radiación electromagnética incluyen un elemento de filtro espectral ajustable configurado para seleccionar bandas de longitud de onda de radiación electromagnética particulares de la radiación electromagnética de la muestra.

[0021] En algunas formas de realización, el detector comprende al menos un sensor CCD. En algunas formas de realización, el detector comprende un tubo fotomultiplicador. En algunas formas de realización, el detector está configurado para generar una señal eléctrica correspondiente a la radiación electromagnética de la muestra y comunicar la señal eléctrica al controlador.

[0022] En algunas formas de realización, el controlador está configurado además para enviar señales eléctricas a uno o más de entre la superficie, la fuente de radiación electromagnética y el detector para ajustar al menos una propiedad de la superficie, la fuente de radiación electromagnética y/o el detector. En algunas formas de realización, el sistema comprende además un dispositivo de visualización para mostrar información al operador. En algunas formas de realización, la información presentada es uno de entre los parámetros del sistema, las propiedades del sistema y las imágenes capturadas de la muestra. En algunas formas de realización, el controlador muestra la puntuación en el dispositivo de visualización.

[0023] En algunas formas de realización, la información sobre la radiación electromagnética detectada procedente del dispositivo de obtención de imágenes es una pluralidad de imágenes espectrales. En algunas formas de realización, la pluralidad de imágenes espectrales corresponde cada una a una longitud de onda diferente de radiación electromagnética emitida por la muestra y detectada por el detector. En algunas formas de realización, cada longitud de onda de radiación electromagnética emitida por la muestra corresponde a un fluoróforo diferente añadido a la muestra para identificar características específicas en la muestra.

[0024] En algunas formas de realización, el método proporciona una capacidad predictiva superior en comparación con la cuantificación de la expresión del primer biomarcador o la cuantificación de la expresión del segundo biomarcador. En algunas formas de realización, la capacidad predictiva se cuantifica como un valor predictivo positivo, un valor predictivo negativo o una combinación de los mismos. En algunas formas de realización, el valor predictivo positivo es del 65 % o más. En algunas formas de realización, el valor predictivo positivo es del 70 % o más. En algunas formas de realización, el valor predictivo positivo es del 75 % o más. En algunas formas de realización, el valor predictivo negativo es del 65 % o más. En algunas formas de realización, el valor predictivo negativo es del 80 % o más.

[0025] En otro aspecto, en el presente documento se describen métodos para puntuar una muestra de tejido, que comprenden: (i) usar un sistema de obtención de imágenes para obtener datos de imagen para la muestra de tejido procedente de un paciente con cáncer. El sistema de obtención de imágenes comprende una carcasa que comprende una plataforma para colocar la muestra en un campo de obtención de imágenes, una fuente de radiación electromagnética para dirigir la radiación electromagnética hacia la muestra y un detector para recoger la salida de radiación electromagnética; y un controlador que comprende una memoria y un circuito de procesamiento que tiene módulos de procesamiento de imágenes; (ii) analizar, utilizando los módulos de procesamiento de imágenes, los datos de imagen para determinar una puntuación representativa de una proximidad entre un par de células, donde un primer miembro del par de células expresa un primer biomarcador y un segundo miembro del par de células expresa un segundo biomarcador que es diferente del primer biomarcador; y (iii) registrar la puntuación en la memoria, puntuación que, cuando se compara con un valor umbral, es indicativa de la probabilidad de que el paciente con cáncer tenga una respuesta positiva a la inmunoterapia.

[0026] En algunas formas de realización, la puntuación es representativa de la proximidad entre el par de células, es representativa de un grado en el que el par de células está dentro de una proximidad predeterminada entre sí. En algunas formas de realización, analizar los datos de imagen comprende evaluar la proximidad en una escala de píxeles. En algunas formas de realización, la proximidad predeterminada entre el par de células varía de aproximadamente 1 píxel a aproximadamente 100 píxeles. En algunas formas de realización, la proximidad predeterminada entre el par de células varía de aproximadamente 5 píxeles a aproximadamente 40 píxeles. En algunas formas de realización, la proximidad predeterminada entre el par de células varía de aproximadamente 0,5 |_im a aproximadamente 50 |_im. En algunas formas de realización, la proximidad predeterminada entre el par de células varía de aproximadamente 2,5 |_im a aproximadamente 20 |_im. En algunas formas de realización, la puntuación se calcula obteniendo una proximidad entre los límites del par de células. En algunas formas de realización, la puntuación se calcula obteniendo una proximidad entre los centros de masa del par de células. En algunas formas de realización, la puntuación se calcula usando lógica de límites basándose en un perímetro alrededor de una primera célula seleccionada del par de células. En algunas formas de realización, la puntuación se calcula determinando una intersección en los límites del par de células. En algunas formas de realización, la puntuación se calcula determinando un área de superposición del par de células.

[0027] En algunas formas de realización, la generación de los datos de imagen comprende: (i) separar la información sobre la radiación electromagnética detectada en datos de imagen sin mezclar; y (ii) proporcionar los datos a través de una pluralidad de canales de datos, en donde los datos de imagen sin mezclar de un primer canal de datos describen señales de fluorescencia atribuibles al primer biomarcador y los datos de imagen sin mezclar de un segundo canal de datos describen señales de fluorescencia atribuibles al segundo biomarcador.

[0028] En algunas formas de realización, el análisis de los datos de imagen comprende: (i) dilatar, usando un dilatador del circuito de procesamiento, señales de fluorescencia atribuibles al primer biomarcador del primer canal de datos en un margen predeterminado que se selecciona para que abarque las células localizadas proximalmente que expresan el segundo biomarcador para generar una máscara del primer biomarcador dilatada; (ii) determinar un área de interacción, en la que el área de interacción es una primera área total para todas las células que expresan el segundo biomarcador y están incluidas dentro de las señales de fluorescencia dilatadas atribuibles a las células que expresan el primer biomarcador; y (iii) dividir, usando una calculadora de interacción del circuito de procesamiento, el área de interacción entre un factor de normalización, y multiplicar el cociente resultante por un factor predeterminado para obtener una puntuación de proximidad espacial.

[0029] En algunas formas de realización, el factor de normalización es un área total para todas las células que tienen la capacidad de expresar el segundo biomarcador. En algunas formas de realización, la determinación del área de interacción comprende combinar la máscara del primer biomarcador dilatada con una máscara representativa de las células que expresan el segundo biomarcador, determinada a partir de señales del segundo canal de datos. En algunas formas de realización, un tercer canal de datos describe señales de fluorescencia atribuibles a núcleos celulares y un cuarto canal de datos describe señales de fluorescencia atribuibles al área tumoral de la muestra.

[0030] En algunas formas de realización, el método comprende además determinar el área total para todas las células que tienen la capacidad de expresar el segundo biomarcador combinando una máscara de células representativa de todas las células de la muestra, en función de señales del tercer canal de datos, y una máscara del área tumoral representativa del área tumoral de la muestra, en función de señales del cuarto canal de datos. En algunas formas de realización, la combinación de la máscara de células y la máscara del área tumoral comprende eliminar la máscara del área tumoral de la máscara de células.

[0031] En algunas formas de realización, los métodos comprenden además (i) usar el sistema de obtención de imágenes para obtener datos de imagen de bajo aumento representativas de la concentración del primer o segundo biomarcador en la imagen; (ii) identificar áreas que incluyen la concentración más alta del primer o segundo biomarcador; (iii) seleccionar un número predeterminado de áreas que incluyen la concentración más alta del primer o segundo biomarcador; (iv) enviar instrucciones al dispositivo de obtención de imágenes para obtener datos de imagen de gran aumento para el número predeterminado de áreas; y (iv) en donde los datos de imagen de gran aumento se proporcionan al controlador para ser analizados y utilizados para determinar la puntuación.

[0032] En algunas formas de realización, el bajo aumento es menor o igual a un aumento de 10x y el gran aumento es mayor de 10x. En algunas formas de realización, el bajo aumento es un aumento de 4x y el gran aumento es de 20x.

[0033] En algunas formas de realización, los métodos comprenden además asociar la puntuación con metadatos asociados con las imágenes de la muestra. En algunas formas de realización, los métodos comprenden además generar un informe que incluye la puntuación. En algunas formas de realización, los métodos comprenden además proporcionar la puntuación a un profesional para que determine la estrategia de inmunoterapia. En algunas formas de realización, los métodos comprenden además registrar la puntuación en una base de datos. En algunas formas de realización, los métodos comprenden además asociar la puntuación con el historial médico de un paciente. En algunas formas de realización, los métodos comprenden además mostrar la puntuación en un dispositivo de visualización.

[0034] En algunas formas de realización, el método proporciona una capacidad predictiva superior en comparación con la cuantificación de la expresión del primer biomarcador o la cuantificación de la expresión del segundo biomarcador. En algunas formas de realización, la capacidad predictiva se cuantifica como un valor predictivo positivo, un valor predictivo negativo o una combinación de los mismos. En algunas formas de realización, el valor predictivo positivo es del 65 % o más. En algunas formas de realización, el valor predictivo positivo es del 70 % o más. En algunas formas de realización, el valor predictivo positivo es del 75 % o más. En algunas formas de realización, el valor predictivo negativo es del 65 % o más. En algunas formas de realización, el valor predictivo negativo es del 80 % o más.

[0035] En otro aspecto, en el presente documento se describen sistemas de puntuación de muestras de tejido que comprenden: (i) un dispositivo de obtención de imágenes que obtiene datos de imagen de una muestra de tejido procedente de un paciente con cáncer; y (ii) un controlador que recibe datos de imagen del dispositivo de obtención de imágenes y analiza los datos para determinar una puntuación representativa de la proximidad entre un par de células, donde un primer miembro del al menos un par de células expresa un primer biomarcador y un segundo miembro del al menos un par de células expresan un segundo biomarcador que es diferente del primer biomarcador; (iii) en donde la puntuación, cuando se compara con un valor umbral, es indicativa de una probabilidad de que el paciente con cáncer tenga una respuesta positiva a la inmunoterapia.

[0036] En algunas formas de realización, el dispositivo de obtención de imágenes comprende una plataforma para colocar la muestra en un campo de obtención de imágenes, una fuente de radiación electromagnética para dirigir la radiación electromagnética hacia la muestra y un detector configurado para detectar la radiación electromagnética de la muestra.

[0037] En algunas formas de realización, la radiación electromagnética se selecciona del grupo que consiste en luz visible y no visible. En algunas formas de realización, la luz visible comprende bandas de luz visible que tienen longitudes de onda comprendidas entre aproximadamente 380 nm y aproximadamente 720 nm. En algunas formas de realización, la luz visible comprende bandas de luz visible que tienen longitudes de onda comprendidas entre aproximadamente 400 nm y aproximadamente 700 nm. En algunas formas de realización, la luz visible comprende bandas de luz visible que tienen longitudes de onda comprendidas entre aproximadamente 380 nm y aproximadamente 720 nm.

[0038] En algunas formas de realización, la radiación electromagnética emitida o de salida comprende una o más bandas de luz visible del grupo que consiste en bandas que incluyen longitudes de onda que están en el intervalo de aproximadamente 440 nm a aproximadamente 480 nm, aproximadamente 490 nm a aproximadamente 550 nm, aproximadamente 505 nm. a aproximadamente 535 nm, aproximadamente 550 nm a aproximadamente 595 nm, aproximadamente 585 nm a aproximadamente 630 nm, aproximadamente 600 nm a aproximadamente 640 nm y aproximadamente 650 nm a aproximadamente 710 nm. En algunas formas de realización, la radiación electromagnética se selecciona del grupo que consiste en luz visible y no visible. En algunas formas de realización, la luz visible comprende bandas de luz visible que tienen longitudes de onda comprendidas entre aproximadamente 380 nm y aproximadamente 720 nm. En algunas formas de realización, la luz visible comprende bandas de luz visible que tienen longitudes de onda comprendidas entre aproximadamente 400 nm y aproximadamente 700 nm. En algunas formas de realización, la luz visible comprende bandas de luz visible que tienen longitudes de onda comprendidas entre aproximadamente 380 nm y aproximadamente 720 nm.

[0039] En algunas formas de realización, el método proporciona una capacidad predictiva superior en comparación con la cuantificación de la expresión del primer biomarcador o la cuantificación de la expresión del segundo biomarcador. En algunas formas de realización, la capacidad predictiva se cuantifica como un valor predictivo positivo, un valor predictivo negativo o una combinación de los mismos. En algunas formas de realización, el valor predictivo positivo es del 65 % o más. En algunas formas de realización, el valor predictivo positivo es del 70 % o más. En algunas formas de realización, el valor predictivo positivo es del 75 % o más. En algunas formas de realización, el valor predictivo negativo es del 65 % o más. En algunas formas de realización, el valor predictivo negativo es del 80 % o más.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

[0040]

La figura 1 es un diagrama de bloques de un dispositivo de obtención de imágenes para obtener datos de imagen de una muestra.

La figura 2 es un diagrama de bloques de un controlador configurado para puntuar una muestra que comprende tejido tumoral procedente de un paciente con cáncer, según una forma de realización ejemplar. La figura 3 es un diagrama de flujo de un proceso para puntuar una muestra que comprende tejido tumoral, según una forma de realización ejemplar.

La figura 4 es un diagrama de flujo de un proceso para puntuar una muestra que comprende tejido tumoral, según una segunda forma de realización ejemplar.

La figura 5 es un diagrama de flujo de los pasos de procesamiento de imágenes utilizadas para puntuar una muestra que comprende tejido tumoral, según una forma de realización ejemplar.

La figura 6 muestra un ejemplo no limitativo de una descripción general de anticuerpos y reactivos de detección utilizados en la preparación de las muestras de tejido para obtención de imágenes y análisis. La figura 7a muestra un ejemplo no limitativo de todos los núcleos detectados con DAPI dentro de una imagen. La figura 7b muestra un ejemplo no limitativo de una máscara binaria dilatada de todas las células de la figura 7a.

La figura 8a muestra un ejemplo no limitativo de una imagen de S100 detectada con colorante 488.

La figura 8b muestra un ejemplo no limitativo de una máscara binaria de toda el área tumoral de la figura 8a. La figura 8c muestra un ejemplo no limitativo de una máscara de todas las células tumorales de la figura 8a. La figura 8d muestra un ejemplo no limitativo de una máscara de todas las células no tumorales de la figura 8a.

La figura 9a muestra un ejemplo no limitativo de una imagen de PD-L1 detectada con Cy® 5.

La figura 9b muestra un ejemplo no limitativo de una máscara binaria de todas las células positivas para PD-L1 de la figura 9a.

La figura 9c muestra un ejemplo no limitativo de una máscara de todas las células tumorales positivas para PD-L1 de la figura 9a.

La figura 9d muestra un ejemplo no limitativo de una máscara de todas las células no tumorales positivas para PD-L1 de la figura 9a.

La figura 10a muestra un ejemplo no limitativo de una imagen de PD-1 detectada con Cy® 3.5.

La figura 10b muestra un ejemplo no limitativo de una máscara binaria de todas las células no tumorales positivas para PD-1 de la figura 10 a.

La figura 11a muestra un ejemplo no limitativo de una máscara de interacción de todas las células positivas para PD-L1 y las células adyacentes más cercanas.

La figura 11b muestra un ejemplo no limitativo de un compartimento de interacción de las células positivas para PD-1 en estrecha proximidad a las células positivas para PD-L1.

La figura 12a muestra un ejemplo no limitativo de puntuaciones de interacción de 26 pacientes con melanoma. La figura 12b muestra un ejemplo no limitativo de las puntuaciones máximas de interacción de los 26 pacientes de la figura 12a.

La figura 13 muestra resultados de análisis basados en imágenes de portaobjetos completos en lugar de un algoritmo de enriquecimiento.

La figura 14 muestra una comparación de las puntuaciones de interacción con la supervivencia libre de progresión de los 26 pacientes. Nota: * indica una prueba de Mantel-Cox sin corregir.

La figura 15 muestra una comparación de la expresión de PD-L1 con la supervivencia libre de progresión de los pacientes.

La figura 16 muestra un ejemplo no limitativo de una máscara de señales de fluorescencia que corresponde a células positivas para PD-L1 (rojo), células positivas para PD-1 (amarillo), todas las células tumorales (verde) y todas las células (azul) para un resultado con respuesta positiva a la inmunoterapia.

La figura 17 muestra un ejemplo no limitativo de una máscara de señales de fluorescencia correspondientes a células positivas para PD-L1 (rojo), células positivas para PD-1 (amarillo), todas las células tumorales (verde) y todas las células (azul) para un resultado sin respuesta a la inmunoterapia.

La figura 18 muestra puntuaciones de interacción de PD-1/PD-L1 representativas y valores de % de positividad del biomarcador (PBP) para PD-L1 y PD-1 de 38 pacientes con cáncer de pulmón no microcítico. La figura 19 muestra una comparación de la expresión de PD-L1 determinada usando el ensayo IHC 22C3 aprobado por la FDA con la supervivencia libre de progresión de los pacientes. Nota: * indica que el valor p se determinó utilizando una prueba de Mantel-Cox sin corregir.

La figura 20a muestra un ejemplo no limitativo de puntuaciones de interacción de 34 pacientes con melanoma adicionales.

La figura 20b muestra una comparación de las puntuaciones de interacción con la supervivencia libre de progresión de los pacientes de la figura 20a.

La figura 20c muestra las puntuaciones de interacción de los pacientes de las FIGS. 12a y 12b y los pacientes de la FIG 20a.

La figura 20d muestra una comparación de las puntuaciones de interacción con la supervivencia libre de progresión de los pacientes de la figura 20c. Nota: * indica que el valor p se determinó mediante una prueba de Mantel-Cox sin corregir.

La figura 20e muestra una comparación de las puntuaciones de interacción con la supervivencia global (SG) de los pacientes de la figura 20c. Nota: * indica que el valor p se calculó utilizando una prueba de Mantel-Cox sin corrección.

La figura 21 muestra un ejemplo no limitativo de puntuaciones de interacción CTLA-4/CD80 de 29 pacientes con melanoma metastásico.

La figura 22 muestra un ejemplo no limitativo de puntuaciones de interacción PD-1/PD-L1 de 29 pacientes con carcinoma testicular.

La figura 23 muestra un diagrama de bloques de un controlador configurado para derivar un valor de positividad de un biomarcador, de acuerdo con una forma de realización ejemplar.

La figura 24 muestra un diagrama de flujo de un proceso para derivar un valor de positividad de un biomarcador, según una forma de realización ejemplar.

La figura 25 muestra un diagrama de flujo de un proceso para derivar un valor de positividad de un biomarcador, según una segunda forma de realización ejemplar.

La figura 26 muestra un diagrama de flujo de los pasos de procesamiento de imágenes usados para derivar un valor de positividad de un biomarcador, de acuerdo con una forma de realización ejemplar.

La figura 27a muestra un ejemplo no limitativo de valores de % de positividad de un biomarcador (PBP) para todas las células que expresan PD-L1 en muestras de tejido de 21 pacientes con melanoma, ordenados por aumento de la expresión de PD-L1.

La figura 27b muestra un ejemplo no limitativo de valores de PBP para todas las células no tumorales que expresan PD-1 en muestras de tejido de los mismos 21 pacientes con melanoma de la figura 27a, ordenados por aumento de la expresión de PD-1.

La figura 28 muestra una comparación del % de positividad de PD-L1 según se determina mediante un método de recuento celular automático en contraste con un método descrito en el presente documento. La figura 29a muestra un ejemplo no limitativo de todos los núcleos detectados con DAPI dentro de una imagen.

La figura 29b muestra un ejemplo no limitativo de una máscara binaria dilatada de todas las células de la figura 29a.

La figura 30a muestra un ejemplo no limitativo de una imagen de PD-1 detectada con Cy® 5.

La figura 30b muestra un ejemplo no limitativo de una máscara binaria de todas las células positivas para PD-1 de la figura 30a.

La figura 31a muestra un ejemplo no limitativo de una imagen de CD3 detectado con Cy® 3.

La figura 31b muestra un ejemplo no limitativo de una máscara binaria de todas las células positivas para CD3 de la figura 31a.

La figura 32 muestra un ejemplo no limitativo de una máscara binaria de todas las células que son doblemente positivas para PD-1 y CD3.

La figura 33a muestra un ejemplo no limitativo de evaluación cuantitativa de linfocitos T CD3+ en muestras de tejido de pacientes con DLBCL (n = 43).

La figura 33b muestra un ejemplo no limitativo de evaluación cuantitativa de linfocitos T CD3+/PD1+ en muestras de tejido de pacientes con DLBCL (n = 43).

La figura 34a muestra un ejemplo no limitativo de evaluación cuantitativa de CD25 en tejidos de NSCLC, gástricos y de melanoma.

La figura 34b muestra un ejemplo no limitativo de evaluación cuantitativa de FoxP3 en tejidos de NSCLC, gástricos y de melanoma.

La figura 35 muestra un ejemplo no limitativo de evaluación cuantitativa de linfocitos T CD25+/FoxP3+ en tejidos de NSCLC, gástricos y de melanoma.

La figura 36a muestra un ejemplo no limitativo de evaluación cuantitativa de CD4 en tejidos de NSCLC, gástricos y de melanoma.

La figura 36b muestra un ejemplo no limitativo de evaluación cuantitativa de CD8 en tejidos de NSCLC, gástricos y de melanoma.

La figura 37a muestra un ejemplo no limitativo de evaluación cuantitativa del fenotipo CD11b+/HLA-DR- en tejidos de melanoma metastásico.

La figura 37b muestra un ejemplo no limitativo de evaluación cuantitativa del fenotipo CD11b+/IDO-1+/HLA-DR- en tejidos de melanoma metastásico.

La figura 38a muestra un ejemplo no limitativo de evaluación cuantitativa del fenotipo IDO-1+/HLA-DR+ en tejidos de melanoma metastásico.

La figura 38b muestra un ejemplo no limitativo de evaluación cuantitativa del fenotipo CD11b+/IDO-1+/HLA-DR+ en tejidos de melanoma metastásico.

La figura 39a muestra un ejemplo no limitativo de evaluación cuantitativa del fenotipo CD11b+/CD33+/ARG1 en tejidos de NSCLC.

La figura 39b muestra un ejemplo no limitativo de evaluación cuantitativa del fenotipo CD11b+/HLA-DR+/IDO-1+ en tejidos de NSCLC.

La figura 40 muestra un ejemplo no limitativo de evaluación cuantitativa del fenotipo CD11b+/HLA-DR-/IDO-1+ en tejidos de NSCLC.

La figura 41 muestra un ejemplo no limitativo de evaluación cuantitativa de linfocitos TCD8+ Ki67+ en tejidos de melanoma metastásico.

La figura 42a muestra un ejemplo no limitativo de evaluación cuantitativa de células CD163+ en tejidos de melanoma metastásico.

La figura 42b muestra un ejemplo no limitativo de evaluación cuantitativa de células CD68+ en tejidos de melanoma metastásico.

La figura 42c muestra un ejemplo no limitativo de evaluación cuantitativa de células CD163+ CD68+ en tejidos de melanoma metastásico.

La figura 43a muestra un ejemplo no limitativo de evaluación cuantitativa de linfocitos T positivos para LAG-3 en tejidos de DLBCL y NET.

La figura 43b muestra un ejemplo no limitativo de evaluación cuantitativa de linfocitos T positivos para TIM-3 en tejidos de DLBCL y NET.

La figura 44a muestra un ejemplo no limitativo de evaluación cuantitativa de CTLA-4 en linfocitos T en tejidos de melanoma.

La figura 44b muestra un ejemplo no limitativo de evaluación cuantitativa de CD80 en tejidos de melanoma. La figura 45 muestra una clasificación de tumores representativa basada en su contextura inmune.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

[0041] A continuación se describen varias formas de realización. Cabe señalar que las formas de realización específicas no pretenden ser una descripción exhaustiva o una limitación de los aspectos más amplios descritos en este documento. Un aspecto descrito junto con una forma de realización particular no se limita necesariamente a esa forma de realización y se puede poner en práctica con cualquier otra forma de realización.

[0042] Como se usa en el presente documento, "aproximadamente" será entendido por personas con conocimientos en la técnica y variará hasta cierto punto dependiendo del contexto en el que se use. Si hay usos del término que no son claros para los expertos en la técnica, dado el contexto en el que se usa, "aproximadamente" significará hasta más o menos del 10 % del término particular.

[0043] Debe interpretarse que el uso de los términos "un" y "una" y "el/la" y referencias similares en el contexto de la descripción de los elementos (especialmente en el contexto de las reivindicaciones que siguen) cubre tanto el singular como el plural, a menos que se indique lo contrario en este documento o que el contexto lo contradiga claramente. La mención de intervalos de valores en el presente documento está destinada simplemente a servir como un método abreviado para hacer referencia individualmente a cada valor separado que se encuentre dentro del intervalo, a menos que se indique lo contrario en el presente documento, y cada valor separado se incorpora en la especificación como si se citara individualmente en el presente documento. Todos los métodos descritos en el presente documento se pueden realizar en cualquier orden adecuado a menos que se indique lo contrario en el presente documento o que el contexto lo contradiga claramente. El uso de cualquiera y todos los ejemplos, o lenguaje de ejemplificación (por ejemplo, "tal como") proporcionado en este documento, está destinado simplemente a ilustrar mejor las formas de realización y no plantea ninguna limitación en el alcance de las reivindicaciones a menos que se indique lo contrario. Ningún lenguaje de la especificación debe interpretarse en el sentido de que indique cualquier elemento no reivindicado como esencial.

[0044] El término "tratar" o "tratamiento" se refiere a administrar una terapia en una cantidad, manera o modo eficaz para mejorar un estado, síntoma o parámetro asociado con un trastorno o para prevenir la progresión de un trastorno, ya sea en un grado estadísticamente significativo o en un grado detectable por un experto en la técnica. Una cantidad, forma o modo eficaz puede variar según el sujeto y puede adaptarse al paciente.

[0045] En un aspecto, en el presente documento se proporcionan sistemas y métodos para realizar métodos de puntuación de una muestra que comprende tejido tumoral procedente de un paciente con cáncer. En otro aspecto, en el presente documento se proporcionan sistemas y métodos para derivar un porcentaje de positividad de un biomarcador en una muestra de tejido.

[0046] En los métodos descritos en el presente documento, el paciente con cáncer es un mamífero. En algunas formas de realización, el mamífero es un ser humano. En algunas formas de realización, el mamífero no es un ser humano. En formas de realización adicionales, el mamífero es un ratón, rata, cobaya, perro, gato o caballo.

[0047] En los métodos descritos en el presente documento, se extrae tejido tumoral de un paciente con cáncer. El tipo de cáncer incluye, entre otros, cánceres del sistema circulatorio, por ejemplo, de corazón (sarcoma [angiosarcoma, fibrosarcoma, rabdomiosarcoma, liposarcoma], mixoma, rabdomioma, fibroma, lipoma y teratoma), de mediastino y pleura, y otros órganos intratorácicos, tumores vasculares y tejido vascular asociado a tumores; de las vías respiratorias, por ejemplo, de la cavidad nasal y del oído medio, de los senos paranasales, de laringe, tráquea, bronquios y pulmones, como carcinoma pulmonar microcítico (CPCP), carcinoma pulmonar no microcítico (CPCNP), carcinoma broncogénico (de células escamosas, de células pequeñas indiferenciadas, de células grandes indiferenciadas, adenocarcinoma), carcinoma alveolar (bronquiolar), adenoma bronquial, sarcoma, linfoma, hamartoma condromatoso, mesotelioma; del sistema gastrointestinal, por ejemplo, de esófago (carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma, leiomiosarcoma, linfoma), de estómago (carcinoma, linfoma, leiomiosarcoma), gástrico, de páncreas (adenocarcinoma ductal, insulinoma, glucagonoma, gastrinoma, tumores carcinoides, vipoma), del intestino delgado (adenocarcinoma, linfoma, tumores carcinoides, sarcoma de Kaposi, leiomioma, hemangioma, lipoma, neurofibroma, fibroma), del intestino grueso (adenocarcinoma, adenoma tubular, adenoma velloso, hamartoma, leiomioma); del aparato genitourinario, por ejemplo, de riñón (adenocarcinoma, tumor de Wilms [nefroblastoma], linfoma, leucemia), de vejiga y/o de uretra (carcinoma de células escamosas, carcinoma de células de transición, adenocarcinoma), de próstata (adenocarcinoma, sarcoma), de testículo (seminoma, teratoma, carcinoma embrionario, teratocarcinoma, coriocarcinoma, sarcoma, carcinoma de células intersticiales, fibroma, fibroadenoma, tumores adenomatoides, lipoma); de hígado, por ejemplo, hepatoma (carcinoma hepatocelular), colangiocarcinoma, hepatoblastoma, angiosarcoma, adenoma hepatocelular, hemangioma, tumores endocrinos pancreáticos (tales como feocromocitoma, insulinoma, tumor secretor de péptido intestinal vasoactivo, tumor de células de los islotes y glucagonoma); de hueso, por ejemplo, sarcoma osteogénico (osteosarcoma), fibrosarcoma, histiocitoma fibroso maligno, condrosarcoma, sarcoma de Ewing, linfoma maligno (sarcoma de células del retículo), mieloma múltiple, cordoma, tumor maligno de células gigantes, osteocondroma (exosteoblastoma osteocartilaginoso), condroma benigno condromixofibroma, osteoma osteoide y tumores de células gigantes; del sistema nervioso, por ejemplo, neoplasias del sistema nervioso central (SNC), linfoma primario del SNC, cáncer de cráneo (osteoma, hemangioma, granuloma, xantoma, osteítis deformante), de las meninges (meningioma, meningiosarcoma, gliomatosis), cáncer de cerebro (astrocitoma, meduloblastoma , glioma, ependimoma, germinoma [pinealoma], glioblastoma multiforme, oligodendroglioma, schwannoma, retinoblastoma, tumores congénitos), neurofibroma de la médula espinal, meningioma, glioma, sarcoma); del aparato reproductor, por ejemplo, ginecológico, de útero (carcinoma de endometrio), de cuello uterino (carcinoma de cuello uterino, displasia cervical pretumoral), de ovario (carcinoma de ovario [cistadenocarcinoma seroso, cistadenocarcinoma mucinoso, carcinoma no clasificado], tumores de las células de la granulosa, tumores de células de Sertoli-Leydig, disgerminoma, teratoma maligno), de vulva (carcinoma de células escamosas, carcinoma intraepitelial, adenocarcinoma, fibrosarcoma, melanoma), de vagina (carcinoma de células claras, carcinoma de células escamosas, sarcoma botrioide (rabdomiosarcoma embrionario), de las trompas de Falopio (carcinoma) y otros sitios asociados con los órganos genitales femeninos; de placenta, de pene, de próstata, de testículo y otros sitios asociados con los órganos genitales masculinos; del sistema hematológico, por ejemplo, de sangre (leucemia mieloide [aguda y crónica], leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfocítica crónica, enfermedades mieloproliferativas, mieloma múltiple, síndrome mielodisplásico), linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin [linfoma maligno]; de la cavidad oral por ejemplo, de labio, de lengua, de encía, del suelo de la boca, de paladar y de otras partes de la boca, de la glándula parótida y otras partes de las glándulas salivales, de amígdala, orofaringe, nasofaringe, seno piriforme, hipofaringe y otros sitios en el labio, la cavidad oral y la faringe; de piel, por ejemplo, melanoma maligno, melanoma cutáneo, carcinoma de células basales, carcinoma de células escamosas, sarcoma de Kaposi, nevos displásicos, lipoma, angioma, dermatofibroma y queloides; de las glándulas suprarrenales: neuroblastoma; y de otros tejidos que incluyen tejido conectivo y blando, de retroperitoneo y peritoneo, de ojo, melanoma intraocular y anexos, de mama, de cabeza y/o cuello, de la zona anal, de las glándulas tiroides, paratiroides, suprarrenal y otras glándulas endocrinas y estructuras relacionadas, neoplasias malignas secundarias y no especificadas de los ganglios linfáticos, neoplasia maligna secundaria de los sistemas respiratorio y digestivo y neoplasia maligna secundaria de otros sitios, o una combinación de uno o más de estos.

[0048] Los ejemplos de inmunoterapia incluyen, entre otros, anticuerpos monoclonales (por ejemplo, alemtuzumab o trastuzumab), anticuerpos monoclonales conjugados (por ejemplo, ibritumomab tiuxetán, brentuximab vendotin o ado-trastuzumab emtansina), anticuerpos monoclonales biespecíficos (blinatumomab), inhibidores de puntos de control inmunitario (por ejemplo, ipilimumab, pembrolizumab, nivolumab, atezolizumab o durvalumab), talidomida, lenalidomida, pomalidomida e imiquimod, y combinaciones de estos. En algunas formas de realización, la inmunoterapia comprende una terapia de puntos de control inmunitario.

[0049] Los tumores se pueden clasificar según contexto inmunológico como "calientes" (inflamados) o "fríos" (no inflamados) (véase la figura 45). Aunque se puede esperar que los pacientes con tumores calientes respondan a determinadas inmunoterapias y potencialmente vivan más que los pacientes con tumores fríos, los expertos en la técnica no tenían claro previamente qué biomarcadores se correlacionan con la respuesta y la supervivencia.

[0050] Para abordar este problema, algunas formas de realización de los métodos descritos en este documento ayudan en la identificación de pacientes con cáncer que responden a una o más inmunoterapias mediante la expresión de biomarcadores de agotamiento inmunológico (por ejemplo, PD-1 y PD-L1) y pacientes con cáncer que no respondían al tratamiento mediante la presencia de tipos de células que se sabe que causan supresión inmunológica (por ejemplo, CD11b, HLA-DR, IDO-1, ARG1) o células tumorales de alta proliferación sin expresión de MHC de clase I (por ejemplo, Ki67+, B2M-). En algunas formas de realización, los métodos descritos en el presente documento comprenden el uso de ensayos de inmunohistoquímica múltiplex (por ejemplo, ensayos FIHC múltiplex) basados en distintivos de activación o supresión inmunológica específicos. En la siguiente tabla se muestran ejemplos no limitantes de ensayos de FIHC múltiplex basados en distintivos de activación o inmunosupresión específicos.

[0051] La figura 1 es un diagrama esquemático que muestra un dispositivo de obtención de imágenes 100 para adquirir múltiples imágenes resueltas espectralmente de una muestra. Una fuente de radiación electromagnética (REM) 102 proporciona radiación electromagnética a los elementos ópticos de acondicionamiento 104. En algunas formas de realización, la radiación electromagnética es luz visible. La fuente de REM 102 puede ser una fuente de luz incoherente, como una lámpara incandescente, una lámpara fluorescente o un diodo. La fuente de REM 102 también puede ser una fuente de luz coherente, tal como una fuente láser, y la fuente coherente puede proporcionar luz de onda continua (OC) o pulsada. La fuente de REM 102 puede contener múltiples elementos de fuente de luz para producir luz con un rango de longitudes de onda (por ejemplo, múltiples diodos). La luz puede ser de onda continua (OC) o luz controlada por tiempo (es decir, pulsada). Además, se puede proporcionar luz en una parte seleccionada del espectro electromagnético. Por ejemplo, la luz puede tener una longitud de onda central y/o una distribución de longitudes de onda que caiga dentro de las zonas ultravioleta, visible, infrarroja u otras del espectro. En algunas formas de realización, la luz tiene longitudes de onda que oscilan entre aproximadamente 380 nm y aproximadamente 720 nm. La fuente de REM 102 también puede incluir varios elementos ópticos tales como lentes, espejos, placas de ondas y cristales no lineales, todos los cuales pueden usarse para producir luz con características seleccionadas. En general, la fuente de REM 102 incluye elementos ópticos y dispositivos configurados para proporcionar luz con las propiedades espectrales, espaciales y, en algunas formas de realización, temporales deseadas.

[0052] Los elementos ópticos de acondicionamiento 104 se pueden configurar para transformar la radiación electromagnética, como la luz visible, de varias formas. Por ejemplo, los elementos ópticos de acondicionamiento 104 pueden filtrar espectralmente la luz para proporcionar luz de salida en una zona de longitud de onda seleccionada del espectro. Alternativamente, o además, los elementos ópticos de acondicionamiento puede ajustar la distribución espacial de la luz y las propiedades temporales de la luz. La radiación electromagnética incidente, o luz incidente, se genera por la acción de los elementos de los elementos ópticos de acondicionamiento 104 sobre la REM.

[0053] La luz incidente se dirige de modo que incida sobre la muestra 108 montada en la plataforma de iluminación 106. La plataforma 106 puede proporcionar medios para asegurar la muestra 108, tales como clips de montaje u otros dispositivos de sujeción. Alternativamente, la plataforma 106 puede incluir una pista o cinta móvil en la que se fijan una pluralidad de muestras 108. Se puede configurar un mecanismo impulsor para mover la cinta con el fin de trasladar sucesivamente la pluralidad de muestras, una cada vez, a través de una zona de iluminación en la plataforma 106, donde la luz incidente incide sobre la muestra. La plataforma 106 puede incluir además ejes de traslación y mecanismos para desplazar la muestra 108 con respecto a una posición fija de la plataforma de iluminación 106. Los mecanismos de traslación pueden manipularse manualmente (por ejemplo, varillas roscadas) o pueden moverse automáticamente mediante activación eléctrica (por ejemplo, controladores motorizados, actuadores piezoeléctricos).

[0054] En respuesta a la radiación electromagnética incidente, como la luz visible, la radiación electromagnética emitida emerge de la muestra 108. La luz emitida se puede generar de varias formas. Por ejemplo, en algunas formas de realización, la luz emitida corresponde a una parte de la luz incidente transmitida a través de la muestra 108. En otras formas de realización, la luz emitida corresponde a una parte de la luz incidente reflejada por la muestra. En otras formas de realización más, la muestra 108 puede absorber la luz incidente, y la luz emitida corresponde a la emisión de fluorescencia de la muestra 108 en respuesta a la luz incidente. En otras formas de realización más, la muestra 108 puede ser luminiscente y puede producir luz emitida incluso en ausencia de luz incidente. En algunas formas de realización, la luz emitida puede incluir luz producida mediante dos o más de los mecanismos anteriores.

[0055] Los elementos ópticos de recogida 110 se colocan de modo que reciban la radiación electromagnética emitida, tal como la luz emitida, de la muestra 108. Los elementos ópticos de recogida 110 pueden configurarse para colimar la luz emitida cuando la luz es divergente, por ejemplo. Los elementos ópticos de recogida 110 también pueden configurarse para filtrar espectralmente la luz emitida. Las operaciones de filtrado pueden ser útiles, por ejemplo, para aislar una parte de la luz emitida que surge a través de uno de los mecanismos mencionados anteriormente de la luz que surge mediante otros procesos. Además, los elementos ópticos de recogida 110 pueden configurarse para modificar las propiedades espaciales y/o temporales de la luz emitida para propósitos particulares en formas de realización. Los elementos ópticos de recogida de luz 110 transforman la luz emitida en luz de salida que incide en el detector 112.

[0056] los elementos ópticos de acondicionamiento 104 y los elementos ópticos de recogida 110 pueden incluir una variedad de elementos ópticos para manipular las propiedades de la luz incidente y emitida desde una muestra de interés. Por ejemplo, los elementos ópticos de acondicionamiento 104 y los elementos ópticos de recogida 110 pueden incluir cada uno elementos de filtro espectral para seleccionar bandas de longitud de onda particulares de la luz incidente y emitida. Los elementos de filtro espectral pueden incluir, por ejemplo, filtros de interferencia montados en un filtro. En algunas formas de realización, se pueden usar elementos de filtro ajustables basados en máscaras de cristal líquido para modificar las propiedades espectrales de la luz incidente o emitida. Los dispositivos basados en cristal líquido pueden ser controlados por el controlador 150 a través de la interfaz de comunicaciones 152.

[0057] Los elementos ópticos de acondicionamiento 104 y los elementos ópticos de recogida 110 también pueden incluir elementos tales como máscaras de luz espacial, moduladores de luz espacial y modeladores de pulsos ópticos para manipular la distribución espacial de la luz incidente o emitida desde una muestra. Los moduladores de luz espacial y otros dispositivos adaptativos también se pueden controlar a través de la interfaz de comunicaciones 152 mediante el controlador 150.

[0058] Finalmente, los elementos ópticos de acondicionamiento 104 y los elementos ópticos de recogida 110 pueden incluir otros elementos ópticos comunes tales como espejos, lentes, divisores de haz, placas de ondas y similares, configurados para impartir características seleccionadas a la luz incidente o emitida.

[0059] En general, el detector 112 incluye uno o más dispositivos de medición configurados para detectar y capturar la luz emitida por una muestra como múltiples imágenes de la muestra. En algunas formas de realización, el detector 112 se puede configurar para que mida las propiedades espaciales y/o temporales y/o espectrales de la luz. El detector 112 puede incluir dispositivos tales como matrices de dispositivos de carga acoplada (CCD) y tubos fotomultiplicadores, junto con sus respectivos sistemas de control, para adquirir las imágenes. El detector 112 genera una señal eléctrica que corresponde a la luz de salida y se comunica con el controlador 150. Los dispositivos ópticos adaptativos del detector 112 pueden, en general, ser controlados por el controlador 150 a través de la interfaz de comunicaciones 152.

[0060] El controlador 150 incluye una interfaz de comunicaciones 152 y un circuito 156 de procesamiento. Además de recibir señales correspondientes a la luz de salida detectada por el detector 112, el controlador 150 envía señales eléctricas al detector 112 para ajustar varias propiedades del detector 112, a través de la interfaz de comunicaciones 152. Por ejemplo, si el detector 112 incluye un sensor CCD, el controlador 150 puede enviar señales eléctricas al detector 112 para controlar el tiempo de exposición, el área activa, los ajustes de ganancia y otras propiedades del sensor CCD.

[0061] El controlador 150 también se comunica con la fuente de REM 102, los elementos ópticos de acondicionamiento 104, la plataforma 106 y los elementos ópticos de recogida 110 a través de la interfaz de comunicaciones 152. El sistema de control 114 proporciona señales eléctricas a cada uno de estos elementos del sistema 100 para ajustar varias propiedades de los elementos. Por ejemplo, las señales eléctricas proporcionadas a la fuente de luz 102 se pueden usar para ajustar la intensidad, la longitud de onda, el ritmo de repetición u otras propiedades de la luz 122. Cuando la luz producida por la fuente de REM 102 es pulsada (es decir, controlada por tiempo), varias propiedades de los pulsos de luz se pueden manipular de acuerdo con las señales de control proporcionadas a la fuente de REM 102 desde el controlador 150 a través de la interfaz de comunicaciones 152. Las señales proporcionadas a los elementos ópticos de acondicionamiento de luz 104 y los elementos ópticos de recogida de luz 110 pueden incluir señales para configurar las propiedades de los dispositivos que ajustan las propiedades espaciales de la luz (por ejemplo, moduladores de luz espacial) y para configurar dispositivos de filtrado espectral, por ejemplo. Las señales proporcionadas a la plataforma de iluminación 106 pueden permitir el posicionamiento de la muestra 108 con respecto a la plataforma 106 y/o mover muestras a la posición para la iluminación en la plataforma 106, por ejemplo.

[0062] La interfaz de comunicaciones 152 puede incluir interfaces cableadas o inalámbricas (por ejemplo, enchufes, antenas, transmisores, receptores, transceptores, terminales de cables, etc.) para realizar comunicaciones de datos con varios sistemas, dispositivos o redes. Por ejemplo, la interfaz de comunicaciones 152 puede incluir una tarjeta Ethernet y un puerto para enviar y recibir datos a través de una red de comunicaciones basada en Ethernet y/o un transceptor WiFi para comunicarse a través de una red de comunicaciones inalámbrica. La interfaz de comunicaciones 152 puede configurarse para comunicarse a través de redes de área local o redes de área amplia (por ejemplo, Internet, una WAN de un edificio, etc.) y puede usar una variedad de protocolos de comunicaciones (por ejemplo, BACnet, IP, LON, etc.).

[0063] El controlador 150 también puede comunicarse, a través de la interfaz de comunicaciones 152, con una interfaz de usuario 154. La interfaz de usuario 154 puede ser un dispositivo de visualización para mostrar las propiedades y parámetros del sistema, y para mostrar imágenes capturadas de la muestra 108. La interfaz de usuario 154 se proporciona con el fin de facilitar la interacción del operador con el dispositivo de obtención de imágenes 100 y su control. El circuito de procesamiento 156 incluye un dispositivo de almacenamiento, como la memoria 160, para almacenar datos de imagen capturados usando el detector 112, y también incluye software informático que incorpora instrucciones para el procesador 158 que hacen que el procesador 158 lleve a cabo funciones de control, como las mencionadas anteriormente y más adelante, por ejemplo. Además, las instrucciones de software hacen que el procesador 158 manipule matemáticamente las imágenes capturadas por el detector 112. El procesamiento y cálculo de las imágenes se describen con mayor detalle en este documento, realizados por el procesador 116 del dispositivo de obtención de imágenes 100 o un sistema informático externo asociado con el dispositivo de obtención de imágenes 100, tal como el controlador 200 representado en la figura 2 y que se describe a continuación.

[0064] En muchas formas de realización, el sistema 100 está configurado para adquirir múltiples imágenes espectrales de la muestra 108. Las múltiples imágenes espectrales pueden corresponder a la iluminación de la muestra 108 en una variedad de longitudes de onda de luz seleccionadas, y a la detección de una intensidad de luz transmitida o reflejada por la muestra 108. Alternativamente, las múltiples imágenes espectrales pueden corresponder a la iluminación de la muestra 108 con luz con propiedades espectrales similares, y a la recolección de múltiples imágenes de la muestra 108, donde cada imagen corresponde a una longitud de onda diferente de luz emitida. Los elementos de filtrado espectral en los elementos ópticos de acondicionamiento 104 y los elementos ópticos de recogida 110 se utilizan generalmente para obtener los datos resueltos espectralmente.

[0065] En algunas formas de realización, las imágenes de la muestra 108 se pueden recopilar en secuencia, con ajustes en la configuración de los componentes ópticos (por ejemplo, filtros ópticos) entre imágenes capturadas sucesivas. En otras formas de realización, se pueden capturar múltiples imágenes simultáneamente usando sistemas de detección configurados para detectar múltiples vistas de muestra. Por ejemplo, los sistemas de detección pueden configurarse para proyectar diferentes vistas de la muestra correspondientes a diferentes longitudes de onda de iluminación o emisión en un detector como una cámara CCD, y las múltiples vistas pueden capturarse simultáneamente.

[0066] En algunas formas de realización, los elementos ópticos de acondicionamiento 104 incluye un elemento de filtro espectral ajustable, tal como una rueda de filtro o un filtro espectral de cristal líquido. El elemento de filtro puede configurarse para proporcionar iluminación de la muestra 108 usando diferentes bandas de longitud de onda de luz. La fuente de REM 102 puede proporcionar luz con una amplia distribución de componentes de longitud de onda espectral. Una zona seleccionada de esta amplia distribución de longitud de onda se deja pasar como luz incidente por el elemento de filtro en los elementos ópticos de acondicionamiento 104, y se dirige para que incida en la muestra 108. El detector 112 registra una imagen de la luz transmitida a través de la muestra 108. Posteriormente, la longitud de onda de la banda de paso del filtro de los elementos ópticos de acondicionamiento 104 se modifica para proporcionar luz incidente que tiene una longitud de onda diferente, y se registra una imagen de la luz transmitida a través de la muestra 108 (y correspondiente a la nueva longitud de onda de la luz incidente). También se puede registrar un conjunto similar de imágenes resueltas espectralmente empleando una fuente de REM 102 que tenga múltiples elementos fuente que generen luz de diferentes longitudes de onda, y encendiendo y apagando alternativamente los diferentes elementos fuente para proporcionar luz incidente que tenga diferentes longitudes de onda.

[0067] Como se ha mencionado anteriormente, la luz emitida de la muestra 108 también puede corresponder a la luz incidente que se refleja en la muestra 108. Además, la luz emitida puede corresponder a la emisión de fluorescencia de la muestra 108 si la muestra incluye estructuras químicas fluorescentes. Para algunas muestras, la luz emitida puede incluir contribuciones de múltiples fuentes (es decir, transmisión y fluorescencia) y los elementos de filtrado espectral de los elementos de acondicionamiento de luz 110 pueden usarse para separar estas contribuciones a la señal.

[0068] En general, tanto los elementos ópticos de acondicionamiento 104 como los elementos ópticos de recogida 110 incluyen elementos de filtro espectral configurables. Por lo tanto, la resolución espectral se puede proporcionar en el lado de excitación de la muestra 108 (por ejemplo, a través de los elementos ópticos de acondicionamiento 104) o en el lado de emisión de la muestra 108 (por ejemplo, a través de los elementos ópticos de recogida 110), o ambos. En cualquier caso, el resultado de recolectar múltiples imágenes resueltas espectralmente de la muestra 108 es una "pila de imágenes" donde cada imagen de la pila es una imagen bidimensional de la muestra correspondiente a una longitud de onda particular. Conceptualmente, el conjunto de imágenes se puede visualizar de tal manera que forma una matriz tridimensional, donde dos de las dimensiones de la matriz son la longitud y el ancho espaciales de cada una de las imágenes, y la tercera dimensión de la matriz es la longitud de onda espectral (emisión o excitación) a que corresponde a la imagen. Por esta razón, el conjunto de imágenes resueltas espectralmente puede denominarse "cubo espectral" de imágenes. Como se usa en este documento, un "píxel" en tal conjunto de imágenes (o pila de imágenes o cubo espectral) se refiere a una ubicación espacial común para cada una de las imágenes. Por consiguiente, un píxel de un conjunto de imágenes incluye un valor asociado con cada imagen en la ubicación espacial correspondiente al píxel.

[0069] Pueden emplearse otras configuraciones para obtener imágenes espectrales que son conocidas en la técnica, de acuerdo con los requisitos de la muestra en cuestión.

[0070] Si bien cada imagen espectral descrita anteriormente se refiere por lo general a una longitud de onda o rango de longitudes de onda particular (por ejemplo, una banda espectral), de manera más general, cada imagen espectral puede corresponder a un índice espectral que puede incluir una o más bandas de longitud de onda, o una distribución de bandas espectrales más compleja. Por ejemplo, una imagen de este tipo se puede generar utilizando un filtro de peine espectral. Generalmente, el cubo de imágenes incluirá varias imágenes espectrales, por ejemplo, 10 o más. Sin embargo, en algunas formas de realización, el cubo de imágenes puede incluir menos imágenes, por ejemplo, solo dos o tres imágenes espectrales. Un ejemplo de ello es una imagen de color rojoverde-azul (RGB), en la que cada píxel incluye un valor asociado con la intensidad de cada uno de los colores rojo, verde y azul. Dicha información puede mostrarse como una imagen de un solo color, en lugar de como un conjunto de imágenes separadas; sin embargo, el contenido de la información es el mismo que el del conjunto de imágenes, por lo que se usa la expresión "imágenes espectrales" para hacer referencia a ambos casos.

[0071] El dispositivo de obtención de imágenes 100 puede incluir una amplia variedad de elementos ópticos y dispositivos para capturar imágenes y generar datos de imagen 130 de una muestra que se utiliza en algoritmos de análisis de muestras posteriores, tales como métodos y algoritmos para puntuar una muestra que comprende tejido tumoral procedente de un paciente con cáncer, como se describe en este documento. Estos dispositivos de obtención de imágenes se describen en la patente de EE. UU. n.° 7,555,150 con el título "Classifying Image Features", que se incorpora a la presente por referencia en su totalidad.

[0072] Antes de obtener imágenes de una muestra, la muestra de tejido puede teñirse usando una pluralidad de marcadores de fluorescencia con afinidad por biomarcadores específicos. Se puede obtener una imagen digital de la muestra teñida, y la imagen se puede analizar adicionalmente basándose en la ubicación de los marcadores de fluorescencia. En lugar de un análisis de la imagen completa, el circuito de procesamiento 156 del dispositivo de obtención de imágenes 100 puede incluir software para hacer que el controlador 150 realice una selección del campo de visión. De este modo, los campos de visión se pueden priorizar en función del número de células que expresan un primer biomarcador de interés. A continuación, se puede analizar adicionalmente un número predeterminado de campos de visión en busca de señales de fluorescencia. En algunas formas de realización, el uso de cuatro tipos diferentes de marcadores de fluorescencia genera una imagen de señales de fluorescencia correspondiente a un primer biomarcador de interés y una imagen de señales de fluorescencia correspondiente a un segundo biomarcador de interés, así como una imagen de señales de fluorescencia correspondiente a un biomarcador expresado por todas las células y una imagen de señales de fluorescencia correspondiente a un biomarcador expresado por células tumorales.

[0073] Los ejemplos de fluoróforos incluyen, entre otros, fluoresceína, 6-FAM, rodamina, Texas Red, California Red, iFluor594, tetrametilrodamina, una carboxirodamina, carboxirodamina 6F, carboxirodol, carboxirodamina 110, Cascade Blue, Cascade Yellow, cumarina, Cy2® , Cy3®, Cy3.5®, Cy5®, Cy5.5®, Cy7®, Cy-Chrome, DyLight® 350, DyLight® 405, DyLight® 488, DyLight® 549, DyLight® 594, DyLight® 633, DyLight® 649, DyLight® 680, DyLight® 750, DyLight® 800, ficoeritrina, PerCP (proteína peridinin clorofila-a), PerCP-Cy5.5, JOE (6-carboxi-4',5'-dicloro-2',7'-dimetoxifluoresceína), NED, ROX (5-(y -6 -)-carboxi-X-rodamina), HEX, Lucifer Yellow, Marina Blue, Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green 514, Alexa Fluor® 350, Alexa Fluor® 430, Alexa Fluor® 488, Alexa Fluor® 532, Alexa Fluor® 546, Alexa Fluor® 568, Alexa Fluor® 594, Alexa Fluor® 633, Alexa Fluor® 647, Alexa Fluor® 660, Alexa Fluor® 680, ácido 7-amino-4-metilcumarina-3-acético, BODIPY® FL, BODIPY® FL-Br2, BODIPY® 530/550, BODIPY® 558/568, BODIPY® 630/650, BODIPY® 650/665, BODIPY® R6G, BODIPY® TMR, BODIPY® TR, OPAL™ 520, OPAL™ 540, OPAL™ 570, OPAL™ 620, OPAL™ 650, OPAL™ 690 y combinaciones de los mismos. En algunas formas de realización, el fluoróforo se selecciona del grupo que consiste en DAPI, Cy® 2, Cy® 3, Cy® 3,5, Cy® 5, Cy® 7, FITC, TRITC, un colorante 488, un colorante 555, un colorante 594, Texas Red y cumarina. Los ejemplos de un colorante 488 incluyen, pero no se limitan a, Alexa Fluor® 488, OPAL™ 520, DyLight® 488 y CF™ 488A. Los ejemplos de un colorante 555 incluyen, pero no se limitan a, Alexa Fluor® 555. Los ejemplos de un colorante 594 incluyen, pero no se limitan a, Alexa Fluor® 594.

[0074] Como se usa en este documento, un "campo de visión" se refiere a una sección de una imagen digital de portaobjetos completo de una muestra de tejido. En algunas formas de realización, la imagen de portaobjetos completo tiene 2-200 campos de visión predeterminados. En algunas formas de realización, la imagen de portaobjetos completo tiene de 10 a 200 campos de visión predeterminados. En algunas formas de realización, la imagen de portaobjetos completo tiene 30-200 campos de visión predeterminados. En algunas formas de realización, la imagen de portaobjetos completo tiene de 10 a 150 campos de visión predeterminados. En algunas formas de realización, la imagen de portaobjetos completo tiene de 10 a 100 campos de visión predeterminados. En algunas formas de realización, la imagen de portaobjetos completo tiene de 10 a 50 campos de visión predeterminados. En algunas formas de realización, la imagen de portaobjetos completo tiene de 10 a 40 campos de visión predeterminados. En algunas formas de realización, la imagen de portaobjetos completo tiene 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 campos de visión predeterminados, incluyendo incrementos en los mismos.

[0075] La manipulación de los datos de imagen del dispositivo de obtención de imágenes 100 para puntuar la muestra de tejido, como se describe en este documento, puede llevarse a cabo mediante el controlador 200, que se muestra esquemáticamente en la figura 2. Se muestra que el controlador 200 incluye una interfaz de comunicaciones 202 y un circuito de procesamiento 204. El circuito de procesamiento 204 está configurado para implementar pasos para puntuar la muestra de tejido. Se contempla que los elementos y funciones del controlador 200 pueden incluirse en el controlador 150 del dispositivo de obtención de imágenes 100, o pueden estar presentes en un sistema informático separado del dispositivo de obtención de imágenes 100.

[0076] En algunas formas de realización, las imágenes de señales de fluorescencia se manipulan para generar una o más máscaras de señales de fluorescencia correspondientes a células dentro de la imagen. En algunas formas de realización, una o más máscaras de señales de fluorescencia comprenden una o más seleccionadas del grupo que consiste en una máscara de todas las células dentro de la imagen, una máscara de todas las células que expresan el biomarcador de subconjunto (por ejemplo, todas las células tumorales) dentro de la imagen, una máscara de todas las células que no expresan el biomarcador de subconjunto (por ejemplo, todas las células no tumorales) dentro de la imagen, una máscara de todas las células que expresan un primer biomarcador de interés dentro de la imagen, una máscara de todas las células que expresan un segundo biomarcador de interés dentro de la imagen y una máscara de interacción que representa todas las células que expresan un primer biomarcador de interés dentro de la imagen, así como células localizadas proximalmente que expresan un segundo biomarcador de interés. En otras formas de realización más, la máscara de interacción se usa para generar un compartimento de interacción de las células de todos los campos de visión seleccionados que expresan el segundo biomarcador de interés que estaban localizadas proximalmente a las células que expresan el primer biomarcador de interés. El área total del compartimento de interacción puede usarse para generar una puntuación representativa de una proximidad espacial entre al menos un par de células, donde un primer miembro del al menos un par de células expresa el primer biomarcador y un segundo miembro del al menos un par de células expresa el segundo biomarcador, que es diferente del primer biomarcador. En algunas formas de realización, la puntuación indica la probabilidad de que el paciente con cáncer tenga una respuesta positiva a la inmunoterapia. En algunas formas de realización, el sistema proporciona una capacidad predictiva superior en comparación con una cuantificación de la expresión del primer biomarcador de interés o una cuantificación de la expresión del segundo biomarcador de interés.

[0077] La figura 3 es un diagrama de flujo que representa los pasos de una forma de realización de un método para puntuar una muestra que comprende tejido tumoral procedente de un paciente con cáncer. En el paso 301, se obtienen datos de imagen, tales como datos de imagen 130. Los datos de imagen pueden obtenerse mediante un dispositivo de obtención de imágenes, tal como el dispositivo de obtención de imágenes 100. En el paso 302, los datos de imagen no se mezclan, de modo que los datos específicos de varios tipos de señales de fluorescencia se separan en diferentes canales. En el paso 303, los datos de un primer canal se utilizan para generar una máscara de todas las células positivas para un primer biomarcador (máscara del primer biomarcador). La máscara de todas las células se dilata luego (paso 304) para generar una máscara dilatada representativa de una proximidad predeterminada dentro de la cual se puede encontrar una célula con interacción (positiva para un segundo biomarcador). En algunas formas de realización, la máscara del primer biomarcador está dilatada entre 1 y 100 píxeles. En el paso 305, los datos de un segundo canal se utilizan para generar una máscara de todas las células positivas para el segundo biomarcador (máscara del segundo biomarcador). En el paso 306, la máscara del primer biomarcador y la máscara del segundo biomarcador se combinan para generar una máscara de interacción que identifica las células positivas para el segundo biomarcador que están dentro de la proximidad predeterminada de una célula positiva para el primer biomarcador. En el paso 307, se calcula una puntuación de proximidad espacial basándose en el área de la máscara de interacción.

[0078] La figura 4 es un segundo diagrama de flujo que representa los pasos de una segunda forma de realización de un método para puntuar una muestra que comprende tejido tumoral procedente de un paciente con cáncer. En el paso 401, se obtienen los datos de imagen y en el paso 402, los datos de imagen no se mezclan, de modo que los datos específicos de varios tipos de señales de fluorescencia se separan en diferentes canales. En el paso 403, los datos de un primer canal se usan para generar una máscara de todas las células del campo de visión y en el paso 404 los datos de un segundo canal se usan para generar una máscara de un área de subconjunto, como el área tumoral del campo de visión. En el paso 405, la máscara de todas las células se combina con la máscara de área de subconjunto para generar una máscara de células de subconjunto y una máscara de células que no son de subconjunto. En el paso 406, los datos de un tercer canal se utilizan para generar una máscara de todas las células positivas que son positivas para un primer biomarcador (máscara del primer biomarcador). La máscara de todas las células se dilata luego (paso 407) para generar una máscara dilatada representativa de una proximidad predeterminada dentro de la cual se puede encontrar una célula con interacción (es decir, una célula que es positiva para un segundo biomarcador). En algunas formas de realización, la máscara del primer biomarcador se dilata entre 1 y 100 píxeles. En el paso 408, los datos de un cuarto canal se utilizan para generar una máscara de todas las células positivas para el segundo biomarcador (máscara del segundo biomarcador). En el paso 409, la máscara del primer biomarcador dilatada y la máscara del segundo biomarcador se combinan para generar una máscara de interacción que identifica las células positivas para el segundo biomarcador y que están dentro de la proximidad predeterminada de una célula positiva para el primer biomarcador. En el paso 410, se calcula una puntuación de proximidad espacial dividiendo el área de la máscara de interacción entre un área de todas las células del subconjunto, o de todas las células (como se indica mediante las líneas de puntos en el diagrama de flujo de la Figura 15, que representa el uso de cualquiera de las dos entradas). En algunas formas de realización, las células de subconjunto son células que pueden ser positivas para el segundo biomarcador. En algunas formas de realización, las células que pueden ser positivas para el segundo biomarcador son células tumorales o células no tumorales.

[0079] En algunas formas de realización, un subconjunto de células identificado por un biomarcador de subconjunto y un no subconjunto de células corresponde a células tumorales y células no tumorales, respectivamente o viceversa. En algunas formas de realización, un subconjunto de células identificado por un biomarcador de subconjunto y un no subconjunto de células corresponde a células viables y células no viables, respectivamente o viceversa. En algunas formas de realización, un subconjunto de células identificado por un biomarcador de subconjunto es un subconjunto de células viables y un no subconjunto de células consiste en las células viables no incluidas en el subconjunto de células viables. En algunas formas de realización, un subconjunto de células identificado por un biomarcador de subconjunto y un no subconjunto de células corresponde a linfocitos T y linfocitos no T, respectivamente o viceversa. En algunas formas de realización, un subconjunto de células identificado por un biomarcador de subconjunto y un no subconjunto de células corresponde a células mieloides y células no mieloides, respectivamente o viceversa.

[0080] En alguna forma de realización, la puntuación de proximidad espacial es representativa de la proximidad de un par de células. En algunas formas de realización, la proximidad de un par de células puede determinarse por una proximidad entre los límites del par de células, una proximidad entre los centros de masa del par de células, utilizando la lógica de límites basada en un perímetro alrededor de una primera célula seleccionada del par de células, determinando una intersección en los límites del par de células, y/o determinando un área de superposición del par de células.

[0081] En alguna forma de realización, la puntuación de proximidad espacial se asocia con metadatos asociados con las imágenes de la muestra, se incluye en un informe generado, se proporciona a un operador para determinar la estrategia de inmunoterapia, se registra en una base de datos, se asocia con el historial médico de un paciente, y/o se muestra en un dispositivo de visualización.

[0082] En algunas formas de realización, el sistema proporciona una capacidad predictiva superior en comparación con una cuantificación de la expresión del primer biomarcador de interés o una cuantificación de la expresión del segundo biomarcador de interés.

[0083] En los métodos descritos en este documento, la manipulación de las imágenes digitales puede llevarse a cabo mediante un sistema informático que comprende un controlador, tal como el controlador ilustrado en el diagrama de bloques de la figura 2, según un ejemplo de realización. Se muestra que el controlador 200 incluye una interfaz de comunicaciones 202 y un circuito de procesamiento 204. La interfaz de comunicaciones 202 puede incluir interfaces cableadas o inalámbricas (por ejemplo, enchufes, antenas, transmisores, receptores, transceptores, terminales de cable, etc.) para realizar comunicaciones de datos con varios sistemas, dispositivos o redes. Por ejemplo, la interfaz de comunicaciones 202 puede incluir una tarjeta Ethernet y un puerto para enviar y recibir datos a través de una red de comunicaciones basada en Ethernet y/o un transceptor WiFi para comunicarse a través de una red de comunicaciones inalámbrica. La interfaz de comunicaciones 202 puede configurarse para comunicarse a través de redes de área local o redes de área amplia (por ejemplo, Internet, una WAN de un edificio, etc.) y puede usar una variedad de protocolos de comunicaciones (por ejemplo, BACnet, IP, LON, etc.).

[0084] La interfaz de comunicaciones 202 puede ser una interfaz de red configurada para facilitar las comunicaciones de datos electrónicos entre el controlador 200 y varios sistemas o dispositivos externos (por ejemplo, el dispositivo de obtención de imágenes 102). Por ejemplo, el controlador 200 puede recibir datos de imagen para los campos de visión seleccionados desde el dispositivo de obtención de imágenes 102, para analizar los datos y calcular la puntuación de proximidad espacial (SPS).

[0085] Aún en referencia a la figura 2, se muestra que el circuito de procesamiento 204 incluye un procesador 206 y una memoria 208. El procesador 206 puede ser un procesador para fines generales o específicos, un circuito integrado para aplicaciones específicas (ASIC), una o más matrices de puertas programables in situ (FPGA), un grupo de componentes de procesamiento u otros componentes de procesamiento adecuados. El procesador 506 puede configurarse para ejecutar un código informático o instrucciones almacenadas en la memoria 508 o recibidas de otros medios legibles por ordenador (por ejemplo, CDROM, almacenamiento en red, un servidor remoto, etc.).

[0086] La memoria 208 puede incluir uno o más dispositivos (por ejemplo, unidades de memoria, dispositivos de memoria, dispositivos de almacenamiento, etc.) para almacenar datos y/o código informático para completar y/o facilitar los diversos procesos descritos en la presente divulgación. La memoria 208 puede incluir una memoria de acceso aleatorio (RAM), memoria de solo lectura (ROM), almacenamiento en disco duro, almacenamiento temporal, memoria no volátil, memoria flash, memoria óptica o cualquier otra memoria adecuada para almacenar objetos de software y/o instrucciones informáticas. La memoria 208 puede incluir componentes de base de datos, componentes de código de objeto, componentes de script o cualquier otro tipo de estructura de información para soportar las diversas actividades y estructuras de información descritas en la presente divulgación. La memoria 508 puede estar conectada de forma comunicable al procesador 206 a través del circuito de procesamiento 204 y puede incluir un código informático para ejecutar (por ejemplo, mediante el procesador 206) uno o más procesos descritos en el presente documento.

[0087] Aún en referencia a la figura 2, se muestra que el controlador 200 recibe la entrada de un dispositivo de obtención de imágenes 102. El dispositivo de obtención de imágenes adquiere todos los datos de imagen y los registra, junto con todos los metadatos que los describen. El dispositivo de obtención de imágenes serializará entonces los datos en un flujo que puede ser leído por el controlador 200. El flujo de datos puede acomodar cualquier tipo de flujo de datos binarios como el sistema de archivos, un RDBM o comunicaciones TCP/IP directas. Para el uso del flujo de datos, se muestra que el controlador 200 incluye un desmezclador espectral 210. El desmezclador espectral 210 puede recibir datos de imagen de un dispositivo de obtención de imágenes 102 en el que realiza la desmezcla espectral para desmezclar una imagen que presenta varias longitudes de onda en canales discretos individuales cada banda de longitudes de onda. Por ejemplo, los datos de imagen pueden "desmezclarse" en canales separados para cada uno de los diversos fluoróforos usados para identificar células o proteínas de interés en la muestra de tejido. El fluoróforo, solo a modo de ejemplo, puede ser uno o más del grupo que consiste en DAPI, Cy® 2, Cy® 3, Cy® 3,5, Cy® 5, FITC, TRITC, un colorante 488, un colorante 555, un colorante 594 y Texas Red. En un ejemplo, uno de los canales puede incluir datos de imagen que están dentro de una banda predeterminada que rodea una longitud de onda de 461 nm (la longitud de onda de emisión máxima para DAPI), para identificar núcleos en la imagen. Otros canales pueden incluir datos de imagen para diferentes longitudes de onda para identificar diferentes partes de la muestra de tejido utilizando diferentes fluoróforos.

[0088] También se muestra que el controlador 200 incluye varios enmascaradores, tales como el enmascarador de células 212, el enmascarador de subconjunto 216, el enmascarador del primer biomarcador 22 y el enmascarador del segundo biomarcador 224. Estos u otros enmascaradores que pueden incluirse en el controlador 200 en otras formas de realización se utilizan para recibir una señal desmezclada del desmezclador espectral 210 y crear una máscara para la célula o área de interés particular, dependiendo del fluoróforo utilizado para identificar ciertas características de interés en la muestra de tejido. Para crear una máscara, los enmascaradores (tales como el enmascarador de células 212, el enmascarador de área de subconjunto 216, el enmascarador del primer biomarcador 22 y el enmascarador del segundo biomarcador 224) reciben datos de imagen relacionados con la intensidad de cada píxel en el campo de visión. La intensidad de los píxeles es directamente proporcional a la cantidad de fluorescencia emitida por la muestra, que, a su vez, es directamente proporcional a la cantidad de biomarcador de proteína en la muestra (cuando se usa un fluoróforo para identificar un biomarcador en particular). Se puede establecer un umbral absoluto en función de los valores que existen en los píxeles de la imagen. Todos los píxeles que sean mayores o iguales al valor de umbral se asignarán a 1,0, o "activados", y todos los demás píxeles se asignarán a 0,0 o "desactivados". De esta manera, se crea una máscara binaria para identificar la parte de célula o tejido de interés en el campo de visión. En otras formas de realización, se crea una máscara utilizando un límite inferior en el que todos los píxeles con una intensidad igual o superior a un límite inferior se aceptan y se utilizan como valor de píxel para la máscara. Si la intensidad está por debajo del límite inferior, el valor de píxel se establece en 0,0 o "desactivado".

[0089] En el diagrama de flujo de ejemplo para el enmascaramiento que se muestra en la figura 5, se muestra que los canales para señales de fluorescencia que identifican núcleos y áreas tumorales (como los canales de DAPI y de colorante 488, respectivamente) utilizan el protocolo del límite inferior (pasos 510, 512, 520, 522), mientras que los canales para identificar biomarcadores (como los canales de Cy5 y Cy3.5) utilizan un protocolo de valor umbral (pasos 530, 540), para proporcionar las salidas de la máscara. En asociación con el protocolo de límite inferior, también hay un paso de histograma para determinar el límite inferior. En particular, umbral de histograma (paso 512, 522) produce un umbral de una imagen de entrada pero usa una escala móvil para determinar el punto en el que se produce el umbral. Las entradas son la imagen actual y un porcentaje de umbral definido por el usuario. Este último se utiliza para determinar en qué porcentaje de la intensidad total debe establecerse el nivel de umbral. En primer lugar, la intensidad de cada píxel se suma a una intensidad total. El porcentaje de umbral se multiplica por esta intensidad total para obtener una suma de corte. Finalmente, todos los píxeles se agrupan por intensidad (en un histograma) y sus intensidades se suman de menor a mayor (bin por bin) hasta que se alcanza la suma de corte. La última intensidad de píxel más alta visitada en el proceso es el umbral de la imagen actual. Todos los píxeles con intensidades superiores a ese valor tienen sus intensidades establecidas al máximo, mientras que todos los demás están configurados al mínimo.

[0090] Los pasos identificados como pasos 514, 516, 524, 526, 528, 532, 534, 536, 542, 544 en la figura 5 representan pasos intermedios que ocurren en los enmascaradores iniciales, como el enmascarador celular 212, el enmascarador de área de subconjunto 216, el enmascarador del primer biomarcador 222 y el enmascarador del segundo biomarcador 224. Estos pasos se definen como sigue:

[0091] Dilatar aumenta el área de las zonas más brillantes de una imagen. Se necesitan dos entradas para dilatar. La primera es la imagen actual implícita y la segunda es el número de iteraciones para dilatar. Se supone que solo se utilizan imágenes binarias para la primera entrada. El procedimiento se realizará en imágenes continuas, pero la salida no será una dilatación válida. El procedimiento de dilatar comienza encontrando primero la máxima intensidad de píxeles en la imagen. Posteriormente, cada píxel de la imagen se examina una vez. Si el píxel por examen tiene una intensidad igual a la intensidad máxima, ese píxel se dibujará en la imagen de salida como un círculo con radio de iteraciones y centrado en el píxel original. Todos los píxeles de ese círculo tendrán una intensidad igual a la intensidad máxima. Todos los demás píxeles se copian en la imagen de salida sin modificaciones.

[0092] El procedimiento llenar agujeros llenará las zonas "vacías" de una imagen con píxeles a la máxima intensidad. Estas zonas vacías son aquellas que tienen una intensidad mínima y cuya área de píxeles (tamaño) es la especificada por el usuario. La imagen actual y el tamaño son las dos entradas necesarias. Al igual que dilatar, este procedimiento solo debe aplicarse a imágenes binarias.

[0093] Erosionar procesa imágenes de la misma manera que dilatar. Toda la funcionalidad es la misma que dilatar excepto en que el primer paso determina la intensidad mínima en la imagen, solo se alteran los píxeles que coinciden con la intensidad más baja y los círculos utilizados para aumentar la intensidad de los píxeles de intensidad mínima encontrados se rellenan con el valor de intensidad más bajo. Al igual que dilatar, este procedimiento solo debe aplicarse a imágenes binarias.

[0094] Eliminar objetos. Se esperan dos entradas: la imagen actual y el tamaño del objeto. Eliminar objetos es lo contrario del procedimiento llenar agujeros. Cualquier zona que contenga solo píxeles con la máxima intensidad que llene un área menor que la entrada tamaño del objeto se ajustará a la intensidad mínima y, por tanto, se "eliminará". Este procedimiento solo debe aplicarse a imágenes binarias; la aplicación a imágenes continuas puede producir resultados inesperados.

[0095] La salida en los pasos finales 518, 529, 538 y 546 son la máscara de células resultante, la máscara del subconjunto del área (o, en este ejemplo particular, la máscara del área tumoral), la máscara de células del biomarcador 1 y la máscara de células del biomarcador 2, respectivamente. La figura 5 describe además las combinaciones de estas máscaras resultantes para calcular la puntuación de proximidad espacial. Estas combinaciones se describen a continuación con referencia a los enmascaradores de combinación del controlador 200, representados en la figura 2.

[0096] Se muestra que el controlador 200 incluye enmascaradores de combinación, tales como el enmascarador de células de subconjunto 218, el enmascarador de células que no son de subconjunto 220 y el enmascarador de interacción 230. El enmascarador de células de subconjunto realiza una operación Y, como se muestra en el paso 552 en la figura 5, para combinar la salida del enmascarador de células 212 (que representa todas las células de la imagen) con la salida del enmascarador de área de subconjunto 216. Por consiguiente, el enmascarador de células de subconjunto genera una máscara de todas las células de subconjunto de la imagen. En algunas formas de realización, las células de subconjunto son células tumorales. En algunas de tales formas de realización, el enmascarador de células de subconjunto 218 es un enmascarador tumoral y el enmascarador de células que no son de subconjunto 220 es un enmascarador no tumoral. Esta misma combinación, al usar una operación Fuera realizada por el enmascarador 220 de células que no forman parte del subconjunto, como se muestra en el paso 554 en la figura 5, se genera una máscara de todas las células que no pertenecen a un subconjunto en la imagen de muestra. En algunas formas de realización, las células que no pertenecen a un subconjunto son células que no son tumorales.

[0097] Antes de combinarse con otra máscara, la máscara del primer biomarcador (del enmascarador del primer biomarcador 222) se dilata con el dilatador 226. La máscara dilatada representa un área que rodea a las células que expresan un primer biomarcador, para identificar un espacio en el que las células que expresan el segundo biomarcador estarían dentro de una proximidad adecuada para interactuar con la célula que expresa el primer biomarcador. Esto está representado por los pasos 556 y 558 de la figura 5. El diagrama de flujo de la figura 5 muestra la dilatación que tiene lugar en dos pasos, 556 y 558. Esto puede ser necesario cuando hay un límite para las iteraciones máximas en cada paso. Por ejemplo, puede haber un máximo de 10 iteraciones (correspondientes a un aumento de 10 píxeles), por lo que, cuando se necesita un aumento de 20 píxeles, la dilatación debe dividirse en dos pasos subsiguientes.

[0098] Dentro del enmascarador del segundo biomarcador 224, la máscara de biomarcador puede combinarse con la máscara de células que no pertenecen a un subconjunto descrita anteriormente, usando una operación Y, como se muestra en el paso 560 de la figura 5, para generar una máscara de todas las células que no pertenecen a un subconjunto que son positivas para el primer biomarcador. A continuación, esta máscara se combina (paso 562) en el enmascarador de interacción 230 con la máscara dilatada del dilatador 226 para generar una máscara de interacción. La máscara de interacción identifica las células no tumorales que son positivas para el segundo biomarcador y que también están dentro del área de interacción, o que se superponen a la máscara dilatada. Estas células identificadas, entonces, representan las células que podrían interactuar con las células positivas para el primer biomarcador, resultando así en una mayor respuesta a la terapia.

[0099] Para calcular una puntuación de proximidad espacial (SPS), el área de la máscara de interacción se determina en píxeles en el evaluador de área 232. En algunas formas de realización, el área de todas las células que son capaces de expresar el segundo biomarcador se determina en píxeles en el evaluador de área 234. Las células que son capaces de expresar el segundo biomarcador pueden ser células tumorales o células no tumorales. En algunas formas de realización, el área de todas las células del campo de visión se determina en píxeles en el evaluador de área 234. Una puntuación de interacción, o proximidad espacial, se determina en la calculadora de interacción 236 dividiendo el área del evaluador de área 232 por el área del evaluador de área 234 y multiplicando por un factor predeterminado. Como se ha descrito anteriormente, en una forma de realización, la ecuación ejecutada por la calculadora de interacción 236 es:

A¡ .

SPS = -rx 104

A-c

donde A i es un área de interacción total (área total de células que expresan el segundo biomarcador específico y abarcada por señales de fluorescencia dilatadas atribuibles a las células que expresan el primer biomarcador específico) y Ac es el factor de normalización. En este caso, la normalización es el área total de células que tienen la capacidad de expresar el segundo biomarcador específico. En algunas formas de realización, el factor de normalización es el área total de todas las células tumorales o no tumorales. En algunas formas de realización, el factor de normalización es el área total de todas las células.

[0100] El procedimiento Y se modela según una operación Y binaria, pero difiere de manera significativa. Y acepta la imagen actual y un usuario seleccionado como resultado. La salida es una imagen creada al realizar una multiplicación de las intensidades normalizadas de píxeles coincidentes de las dos imágenes de entrada. En algunas aplicaciones, los datos de intensidad de la imagen ya están normalizados. Por lo tanto, el procedimiento Y es simplemente una multiplicación por píxeles de las dos imágenes. Las dos entradas necesarias para Fuera son la imagen actual y un resultado seleccionado por el usuario. Fuera elimina la segunda imagen de la primera según la fórmula A * (1 - B/Bmax) donde A es la imagen actual, B la imagen seleccionada por el usuario para eliminar y Bmax es la intensidad máxima de B. Nótese que la división de B por Bmax normaliza B.

[0101] En algunas formas de realización, se proporciona un sistema de obtención de imágenes para puntuar una muestra que comprende tejido tumoral procedente de un paciente con cáncer, donde el sistema de obtención de imágenes comprende un aparato de obtención de imágenes que comprende una plataforma para colocar la muestra en un campo de obtención de imágenes, una fuente de radiación electromagnética para dirigir la radiación electromagnética hacia la muestra y un detector configurado para detectar la radiación electromagnética procedente de la muestra, y un controlador. El controlador comprende una interfaz de usuario para intercambiar información entre un operador y el sistema de control electrónico y un circuito de procesamiento configurado para ejecutar instrucciones almacenadas en un medio legible por ordenador. Las instrucciones hacen que el sistema de control electrónico del sistema de obtención de imágenes: (i) reciba información sobre la radiación electromagnética detectada a partir del dispositivo de obtención de imágenes; (ii) genere datos de imagen en función de la radiación electromagnética detectada; (iii) analice los datos de imagen para determinar una puntuación representativa de la proximidad entre al menos un par de células, donde un primer miembro del menos un par de células expresa un primer biomarcador y un segundo miembro del al menos un par de células expresa un segundo biomarcador que es diferente del primer biomarcador; y (iv) registre la puntuación, la cual, cuando se compara con un valor umbral, es indicativa de la probabilidad de que el paciente con cáncer tenga una respuesta positiva a la inmunoterapia.

[0102] En algunas formas de realización, la puntuación representativa de una proximidad entre al menos un par de células es representativa de un grado en el que el par de células está dentro de una proximidad predeterminada entre sí.

[0103] En algunas formas de realización, el primer miembro del al menos un par de células comprende una célula tumoral y el segundo miembro del al menos un par de células comprende una célula no tumoral. En algunas formas de realización, la célula no tumoral es una célula inmunitaria. En algunas formas de realización, la célula no tumoral es una célula estromal.

[0104] En algunas formas de realización, el primer y segundo miembros del al menos un par de células comprenden células inmunitarias.

[0105] En algunas formas de realización, el primer miembro del al menos un par de células comprende una célula tumoral, una célula mieloide o una célula estromal y el segundo miembro del al menos un par de células comprende una célula inmunitaria. En algunas formas de realización, la célula tumoral, la célula mieloide o la célula estromal expresa PD-L1 y la célula inmunitaria expresa PD-1.

[0106] En algunas formas de realización, el primer miembro del al menos un par de células comprende una célula tumoral y el segundo miembro del al menos un par de células comprende una célula inmunitaria. En algunas formas de realización, el primer miembro del al menos un par de células comprende una célula mieloide y el segundo miembro del al menos un par de células comprende una célula inmunitaria. En algunas formas de realización, el primer miembro del al menos un par de células comprende una célula estromal y el segundo miembro del al menos un par de células comprende una célula inmunitaria. En algunas formas de realización, el primer miembro del al menos un par de células expresa PD-L1 y la célula inmunitaria expresa PD-1.

[0107] En algunas formas de realización, el primer miembro del al menos un par de células expresa un primer biomarcador seleccionado del grupo que consiste en PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4, HLA-DR, Galectina 9, CD80, CD86, 4.1BBL, ICOSL, CD40, Ox 40L, IDO-1, GITRL y combinaciones de estos. En algunas formas de realización, el segundo miembro del al menos un par de células expresa un segundo biomarcador seleccionado del grupo que consiste en PD-1, TIM3, LAG3, 41BB, OX40, CTLA-4, CD40L, CD28, GITR, ICOS, CD28 y combinaciones de los mismos. En algunas formas de realización, el primer miembro del al menos un par de células expresa un primer biomarcador seleccionado del grupo que consiste en PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4, HLA-DR, Galectina 9, CD80, CD86, 4.1BBL, ICOSL, CD40, OX40L, IDO-1, GITRL y combinaciones de estos, y el segundo miembro del al menos un par de células expresa un segundo biomarcador seleccionado del grupo que consiste en PD-1, TIM3, LAG 3, 41Bb , OX40, CTLA-4, CD40L, CD28, GITR, ICOS, CD28 y combinaciones de los mismos.

[0108] En algunas formas de realización, el primer miembro del al menos un par de células expresa PD-L1 y el segundo miembro del al menos un par de células expresa PD-1. En algunas formas de realización, el primer miembro del al menos un par de células expresa PD-L1 y el segundo miembro del al menos un par de células expresa CD80. En algunas formas de realización, el primer miembro del al menos un par de células expresa CTLA-4 y el segundo miembro del al menos un par de células expresa CD80. En algunas formas de realización, el primer miembro del al menos un par de células expresa PD-L2 y el segundo miembro del al menos un par de células expresa PD-1. En algunas formas de realización, el primer miembro del al menos un par de células expresa CTLA-4 y el segundo miembro del al menos un par de células expresa CD86. En algunas formas de realización, el primer miembro del al menos un par de células expresa LAG-3 y el segundo miembro del al menos un par de células expresa HLA-DR. En algunas formas de realización, el primer miembro del al menos un par de células expresa TIM-3 y el segundo miembro del al menos un par de células expresa Galectina 9. En algunas formas de realización, el primer miembro del al menos un par de células expresa 41BB y el segundo miembro del al menos un par de células expresa 4.1BBL. En algunas formas de realización, el primer miembro del al menos un par de células expresa OX40 y el segundo miembro del al menos un par de células expresa OX40L. En algunas formas de realización, el primer miembro del al menos un par de células expresa CD40 y el segundo miembro del al menos un par de células expresa CD40L. En algunas formas de realización, el primer miembro del al menos un par de células expresa ICOS y el segundo miembro del al menos un par de células expresa ICOSL. En algunas formas de realización, el primer miembro del al menos un par de células expresa GITR y el segundo miembro del al menos un par de células expresa GITRL. En algunas formas de realización, el primer miembro del al menos un par de células expresa HLA-DR y el segundo miembro del al menos un par de células expresa TCR.

[0109] En algunas formas de realización, el primer biomarcador expresado por el primer miembro del al menos un par de células y el segundo biomarcador expresado por el segundo miembro del al menos un par de células interactúan entre sí. En algunas formas de realización, el primer biomarcador expresado por el primer miembro del al menos un par de células y el segundo biomarcador expresado por el segundo miembro del al menos un par de células no interactúan entre sí.

[0110] En algunas formas de realización, la proximidad espacial entre el al menos un par de células varía de aproximadamente 0,5 pm a aproximadamente 50 pm. En algunas formas de realización, la proximidad espacial varía de 2,5 pm a aproximadamente 50 pm. En algunas formas de realización, la proximidad espacial varía de 2,5 l_im a aproximadamente 45 pm. En algunas formas de realización, la proximidad espacial varía de 2,5 pm a aproximadamente 40 l_im. En algunas formas de realización, la proximidad espacial varía de 2,5 pm a aproximadamente 35 l_im. En algunas formas de realización, la proximidad espacial varía de 2,5 pm a aproximadamente 30 l_im. En algunas formas de realización, la proximidad espacial varía de 2,5 pm a aproximadamente 25 l_im. En algunas formas de realización, la proximidad espacial varía de 2,5 pm a aproximadamente 20 l_im. En algunas formas de realización, la proximidad espacial varía de 2,5 pm a aproximadamente 15 l_im. En algunas formas de realización, la proximidad espacial varía de 5 pm a aproximadamente 50 l_im. En algunas formas de realización, la proximidad espacial varía de 5 pm a aproximadamente 45 l_im. En algunas formas de realización, la proximidad espacial varía de 5 pm a aproximadamente 40 l_im. En algunas formas de realización, la proximidad espacial varía de 5 pm a aproximadamente 35 l_im. En algunas formas de realización, la proximidad espacial varía de 5 pm a aproximadamente 30 l_im. En algunas formas de realización, la proximidad espacial varía de 5 pm a aproximadamente 25 pm. En algunas formas de realización, la proximidad espacial varía de 5 pm a aproximadamente 20 pm. En algunas formas de realización, la proximidad espacial varía de 5 pm a aproximadamente 15 pm. En algunas formas de realización, la proximidad espacial es de aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25. , 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, o 50 pm.

[0111] En algunas formas de realización, la proximidad espacial entre el al menos un par de células varía de aproximadamente 1 píxel a aproximadamente 100 píxeles. En algunas formas de realización, la proximidad espacial varía de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 píxeles. En algunas formas de realización, la proximidad espacial varía de aproximadamente 5 a aproximadamente 90 píxeles. En algunas formas de realización, la proximidad espacial varía de aproximadamente 5 a aproximadamente 80 píxeles. En algunas formas de realización, la proximidad espacial varía de aproximadamente 5 a aproximadamente 70 píxeles. En algunas formas de realización, la proximidad espacial varía de aproximadamente 5 a aproximadamente 60 píxeles. En algunas formas de realización, la proximidad espacial varía de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 píxeles. En algunas formas de realización, la proximidad espacial varía de aproximadamente 5 a aproximadamente 40 píxeles. En algunas formas de realización, la proximidad espacial varía de aproximadamente 5 a aproximadamente 30 píxeles. En algunas formas de realización, la proximidad espacial varía de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 píxeles. En algunas formas de realización, la proximidad espacial varía de aproximadamente 10 a aproximadamente 90 píxeles. En algunas formas de realización, la proximidad espacial varía de aproximadamente 10 a aproximadamente 80 píxeles. En algunas formas de realización, la proximidad espacial varía de aproximadamente 10 a aproximadamente 70 píxeles. En algunas formas de realización, la proximidad espacial varía de aproximadamente 10 a aproximadamente 60 píxeles. En algunas formas de realización, la proximidad espacial varía de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 píxeles. En algunas formas de realización, la proximidad espacial varía de aproximadamente 10 a aproximadamente 40 píxeles. En algunas formas de realización, la proximidad espacial varía de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 píxeles. En algunas formas de realización, la proximidad espacial es de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21. , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 ,47 , 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 5859, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100 píxeles. En algunas formas de realización, un píxel tiene 0,5 pm de ancho.

[0112] En algunas formas de realización, la generación los datos de imagen comprende (i) separar la información sobre la radiación electromagnética detectada en datos de imagen sin mezclar; y (ii) proporcionar los datos a través de una pluralidad de canales de datos, en donde los datos de imagen sin mezclar de un primer canal de datos describen señales de fluorescencia atribuibles al primer biomarcador y los datos de imagen sin mezclar de un segundo canal de datos describen señales de fluorescencia atribuibles al segundo biomarcador.

[0113] En algunas formas de realización, el análisis de los datos comprende: (i) seleccionar un número predeterminado de campos de visión disponibles de la muestra que comprende tejido tumoral procedente del paciente con cáncer, que se tiñe con una pluralidad de marcadores de fluorescencia, donde dicha selección está sesgada hacia la selección de campos de visión que contienen un mayor número de células que expresan el primer biomarcador en relación con otros campos de visión; (ii) para cada uno de los campos de visión seleccionados, dilatar las señales de fluorescencia atribuibles al primer biomarcador en un margen suficiente para abarcar células localizadas proximalmente que expresan el segundo biomarcador; y (iii) dividir una primera área total para todas las células de cada uno de los campos de visión seleccionados, que expresan el segundo biomarcador y están dentro de las señales de fluorescencia dilatadas atribuibles a las células que expresan el primer biomarcador, por un factor de normalización, y multiplicar el cociente resultante por un factor predeterminado para obtener una puntuación de proximidad espacial.

[0114] En algunas formas de realización, el análisis de los datos comprende: (i) seleccionar un número predeterminado de campos de visión disponibles de la muestra que comprende tejido tumoral procedente del paciente con cáncer, que se tiñe con una pluralidad de marcadores de fluorescencia, donde dicha selección está sesgada hacia la selección de campos de visión que contienen un mayor número de células que expresan el primer biomarcador en relación con otros campos de visión; (ii) para cada uno de los campos de visión seleccionados, dilatar las señales de fluorescencia atribuibles al primer biomarcador para abarcar células localizadas proximalmente que expresan el segundo biomarcador dentro de aproximadamente 0,5 pm a aproximadamente 50 pm de una membrana plasmática de las células que expresan el primer biomarcador; y (iii) dividir una primera área total para todas las células de cada uno de los campos de visión seleccionados, que expresan el segundo biomarcador y están englobadas dentro de las señales de fluorescencia dilatadas atribuibles a las células que expresan el primer biomarcador, por un factor de normalización, y multiplicar el cociente resultante por un factor predeterminado para obtener una puntuación de proximidad espacial.

[0115] En algunas formas de realización, el análisis de los datos comprende: (i) seleccionar un número predeterminado de campos de visión disponibles de la muestra que comprende tejido tumoral procedente del paciente con cáncer, que se tiñe con una pluralidad de marcadores de fluorescencia, donde dicha selección está sesgada hacia la selección de campos de visión que contienen un mayor número de células que expresan el primer biomarcador en relación con otros campos de visión; (ii) para cada uno de los campos de visión seleccionados, dilatar las señales de fluorescencia atribuibles al primer biomarcador en un margen que varía de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 píxeles para abarcar células localizadas proximalmente que expresan el segundo biomarcador; y (iii) dividir una primera área total, medida en píxeles, para todas las células de cada uno de los campos de visión seleccionados, que expresan el segundo biomarcador y están englobadas dentro de las señales de fluorescencia dilatadas atribuibles a las células que expresan el primer biomarcador, por un factor de normalización y multiplicar el cociente resultante por un factor predeterminado para obtener una puntuación de proximidad espacial.

[0116] En algunas formas de realización, el análisis de los datos comprende: (i) seleccionar un número predeterminado de campos de visión disponibles de la muestra que comprende tejido tumoral procedente del paciente con cáncer, que se tiñe con una pluralidad de marcadores de fluorescencia, donde dicha selección está sesgada hacia la selección de campos de visión que contienen un mayor número de células que expresan el primer biomarcador en relación con otros campos de visión; (ii) para cada uno de los campos de visión seleccionados, dilatar las señales de fluorescencia atribuibles al primer biomarcador en un margen que varía de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 píxeles para abarcar las células que expresan el segundo biomarcador dentro de aproximadamente 0,5 |_im a aproximadamente 50 |_im de una membrana plasmática de las células que expresan el primer biomarcador; y (iii) dividir una primera área total, medida en píxeles, para todas las células de cada uno de los campos de visión seleccionados, que expresan el segundo biomarcador y están englobadas dentro de las señales de fluorescencia dilatadas atribuibles a las células que expresan el primer biomarcador, con un factor de normalización, y multiplicar el cociente resultante por un factor predeterminado para obtener una puntuación de proximidad espacial.

[0117] En algunas formas de realización, la puntuación de proximidad espacial se determina mediante la siguiente ecuación:

A¡ ^A

SPS = —í- x 104

A c

donde A i es un área de interacción total (área total de células que expresan el segundo biomarcador específico y abarcada por señales de fluorescencia dilatadas atribuibles a las células que expresan el primer biomarcador específico) y AC es el área total de células que tienen la capacidad de expresar el segundo biomarcador específico (el factor de normalización).

[0118] En algunas formas de realización, la puntuación de proximidad espacial (SPS) se determina mediante la siguiente ecuación:

A j .

SPS = - 1- x 104

A N t

donde A i es un área de interacción total (área total de células que expresan el segundo biomarcador específico y abarcada por señales de fluorescencia dilatadas atribuibles a las células que expresan el primer biomarcador específico) y Ant es el área total de células no tumorales.

[0119] En algunas formas de realización, la puntuación de proximidad espacial se determina mediante la siguiente ecuación:

A¡ .

SPS =

a -1 t x 104

donde A i es un área de interacción total (área total de células que expresan el segundo biomarcador específico y abarcada por señales de fluorescencia dilatadas atribuibles a las células que expresan el primer biomarcador específico) y At es el área total de todas las células.

[0120] En algunas formas de realización, se utilizan cuatro marcadores de fluorescencia, cada uno específico para un biomarcador diferente, en el paso de determinación. En formas de realización adicionales, un primer marcador de fluorescencia está asociado con el primer biomarcador, un segundo marcador de fluorescencia está asociado con el segundo biomarcador, un tercera marcador de fluorescencia está asociado con un tercer biomarcador y un cuarto marcador de fluorescencia está asociado con un cuarto biomarcador. En algunas formas de realización, el primer biomarcador comprende un marcador tumoral y no tumoral. En algunas formas de realización, el segundo biomarcador comprende un marcador no tumoral. En algunas formas de realización, el primer biomarcador comprende un marcador tumoral y no tumoral, y el segundo biomarcador comprende un marcador no tumoral. En algunas formas de realización, todas las células expresan el tercer biomarcador. En algunas formas de realización, el cuarto biomarcador se expresa solo en células tumorales. En algunas formas de realización, el tercer biomarcador es expresado por todas las células y el cuarto biomarcador se expresa solo en células tumorales. En algunas formas de realización, una o más marcadores de fluorescencia comprenden un fluoróforo conjugado con un anticuerpo que tiene afinidad de unión por un biomarcador específico u otro anticuerpo. En algunas formas de realización, uno o más marcadores de fluorescencia son fluoróforos con afinidad por un biomarcador específico.

[0121] En algunas formas de realización, las señales de fluorescencia atribuibles al primer biomarcador se dilatan en un margen que varía de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 píxeles. En algunas formas de realización, el margen es de aproximadamente 5 a aproximadamente 100 píxeles. En algunas formas de realización, el margen es de aproximadamente 5 a aproximadamente 90 píxeles. En algunas formas de realización, el margen es de aproximadamente 5 a aproximadamente 80 píxeles. En algunas formas de realización, el margen es de aproximadamente 5 a aproximadamente 70 píxeles. En algunas formas de realización, el margen es de aproximadamente 5 a aproximadamente 60 píxeles. En algunas formas de realización, el margen es de aproximadamente 5 a aproximadamente 50 píxeles. En algunas formas de realización, el margen es de aproximadamente 5 a aproximadamente 40 píxeles. En algunas formas de realización, el margen es de aproximadamente 5 a aproximadamente 30 píxeles. En algunas formas de realización, el margen es de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 píxeles. En algunas formas de realización, el margen es de aproximadamente 10 a aproximadamente 90 píxeles. En algunas formas de realización, el margen es de aproximadamente 10 a aproximadamente 80 píxeles. En algunas formas de realización, el margen es de aproximadamente 10 a aproximadamente 70 píxeles. En algunas formas de realización, el margen es de aproximadamente 10 a aproximadamente 60 píxeles. En algunas formas de realización, el margen es de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 píxeles. En algunas formas de realización, el margen es de aproximadamente 10 a aproximadamente 40 píxeles. En algunas formas de realización, el margen es de aproximadamente 10 a aproximadamente 30 píxeles. En algunas formas de realización, el margen es de aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72 ,73 , 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97 , 98, 99 o 100 píxeles. En algunas formas de realización, un píxel tiene 0,5 |_im de ancho.

[0122] En algunas formas de realización, las señales de fluorescencia dilatadas atribuibles al primer biomarcador abarcan células localizadas proximalmente que expresan el segundo biomarcador dentro de aproximadamente 0,5 l_im a aproximadamente 50 |_im de una membrana plasmática de las células que expresan el primer biomarcador. En algunas formas de realización, las señales de fluorescencia dilatadas atribuibles al primer biomarcador abarcan células localizadas proximalmente que expresan el segundo biomarcador dentro de aproximadamente 2,5 |_im a aproximadamente 50 |_im de una membrana plasmática de las células que expresan el primer biomarcador. En algunas formas de realización, las señales de fluorescencia dilatadas atribuibles al primer biomarcador abarcan células localizadas proximalmente que expresan el segundo biomarcador dentro de aproximadamente 2,5 |_im a aproximadamente 45 |_im de una membrana plasmática de las células que expresan el primer biomarcador. En algunas formas de realización, las señales de fluorescencia dilatadas atribuibles al primer biomarcador abarcan células localizadas proximalmente que expresan el segundo biomarcador dentro de aproximadamente 2,5 |_im a aproximadamente 40 |_im de una membrana plasmática de las células que expresan el primer biomarcador. En algunas formas de realización, las señales de fluorescencia dilatadas atribuibles al primer biomarcador abarcan células localizadas proximalmente que expresan el segundo biomarcador dentro de aproximadamente 2,5 |_im a aproximadamente 35 |_im de una membrana plasmática de las células que expresan el primer biomarcador. En algunas formas de realización, las señales de fluorescencia dilatadas atribuibles al primer biomarcador abarcan células localizadas proximalmente que expresan el segundo biomarcador dentro de aproximadamente 2,5 |_im a aproximadamente 30 |_im de una membrana plasmática de las células que expresan el primer biomarcador. En algunas formas de realización, las señales de fluorescencia dilatadas atribuibles al primer biomarcador abarcan células localizadas proximalmente que expresan el segundo biomarcador dentro de aproximadamente 2,5 |_im a aproximadamente 25 |_im de una membrana plasmática de las células que expresan el primer biomarcador. En algunas formas de realización, las señales de fluorescencia dilatadas atribuibles al primer biomarcador abarcan células localizadas proximalmente que expresan el segundo biomarcador dentro de aproximadamente 2,5 |_im a aproximadamente 20 |_im de una membrana plasmática de las células que expresan el primer biomarcador. En algunas formas de realización, las señales de fluorescencia dilatadas atribuibles al primer biomarcador abarcan células localizadas proximalmente que expresan el segundo biomarcador dentro de aproximadamente 2,5 |_im a aproximadamente 15 |_im de una membrana plasmática de las células que expresan el primer biomarcador. En algunas formas de realización, las señales de fluorescencia dilatadas atribuibles al primer biomarcador abarcan células localizadas proximalmente que expresan el segundo biomarcador dentro de aproximadamente 5 |_im a aproximadamente 50 |_im de una membrana plasmática de las células que expresan el primer biomarcador. En algunas formas de realización, las señales de fluorescencia dilatadas atribuibles al primer biomarcador abarcan células localizadas proximalmente que expresan el segundo biomarcador dentro de aproximadamente 5 |_im a aproximadamente 45 |_im de una membrana plasmática de las células que expresan el primer biomarcador. En algunas formas de realización, las señales de fluorescencia dilatadas atribuibles al primer biomarcador abarcan células localizadas proximalmente que expresan el segundo biomarcador dentro de aproximadamente 5 |_im a aproximadamente 40 |_im de una membrana plasmática de las células que expresan el primer biomarcador. En algunas formas de realización, las señales de fluorescencia dilatadas atribuibles al primer biomarcador abarcan células localizadas proximalmente que expresan el segundo biomarcador dentro de aproximadamente 5 |_im a aproximadamente 35 |_im de una membrana plasmática de las células que expresan el primer biomarcador. En algunas formas de realización, las señales de fluorescencia dilatadas atribuibles al primer biomarcador abarcan células localizadas proximalmente que expresan el segundo biomarcador dentro de aproximadamente 5 |_im a aproximadamente 30 |_im de una membrana plasmática de las células que expresan el primer biomarcador. En algunas formas de realización, las señales de fluorescencia dilatadas atribuibles al primer biomarcador abarcan células localizadas proximalmente que expresan el segundo biomarcador dentro de aproximadamente 5 |_im a aproximadamente 25 |_im de una membrana plasmática de las células que expresan el primer biomarcador. En algunas formas de realización, las señales de fluorescencia dilatadas atribuibles al primer biomarcador abarcan células localizadas proximalmente que expresan el segundo biomarcador dentro de aproximadamente 5 |_im a aproximadamente 20 |_im de una membrana plasmática de las células que expresan el primer biomarcador. En algunas formas de realización, las señales de fluorescencia dilatadas atribuibles al primer biomarcador abarcan células localizadas proximalmente que expresan el segundo biomarcador dentro de aproximadamente 5 |_im a aproximadamente 15 |_im de una membrana plasmática de las células que expresan el primer biomarcador. En algunas formas de realización, la dilatación de las señales de fluorescencia atribuibles al primer biomarcador abarca células localizadas proximalmente que expresan el segundo biomarcador dentro de aproximadamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 o 50 |_im de una membrana plasmática de las células que expresan el primer biomarcador. En algunas formas de realización, el segundo biomarcador en las células localizadas proximalmente está en contacto directo con el primer biomarcador.

[0123] En algunas formas de realización, el primer área total para todas las células de cada uno de los campos de visión seleccionados, que expresan el segundo biomarcador, se mide en píxeles.

[0124] En algunas formas de realización, el factor de normalización es una segunda área total para todas las células no tumorales de cada uno de los campos de visión seleccionados. En algunas formas de realización, la segunda área total se mide en píxeles. En algunas formas de realización, tanto la primera área total como la segunda área total se miden en píxeles.

[0125] En algunas formas de realización, el factor de normalización es una segunda área total para todas las células de cada uno de los campos de visión seleccionados que tienen la capacidad de expresar el segundo biomarcador. En algunas formas de realización, la segunda área total se mide en píxeles. En algunas formas de realización, tanto la primera área total como la segunda área total se miden en píxeles.

[0126] En algunas formas de realización, el factor de normalización es una segunda área total para todas las células de cada uno de los campos de visión seleccionados. En algunas formas de realización, la segunda área total se mide en píxeles. En algunas formas de realización, tanto la primera área total como la segunda área total se miden en píxeles.

[0127] En algunas formas de realización, la puntuación umbral es de aproximadamente 500 a aproximadamente 5000. En algunas formas de realización, la puntuación umbral es de aproximadamente 500 a aproximadamente 4500. En algunas formas de realización, la puntuación umbral es de aproximadamente 500 a aproximadamente 4000. En algunas formas de realización, la puntuación umbral es de aproximadamente 500 a aproximadamente 3500. En algunas formas de realización, la puntuación umbral es de aproximadamente 500 a aproximadamente 3000. En algunas formas de realización, la puntuación umbral es de aproximadamente 500 a aproximadamente 2500. En algunas formas de realización, la puntuación umbral es de aproximadamente 500 a aproximadamente 2000. En algunas formas de realización, la puntuación umbral es de aproximadamente 500 a aproximadamente 2000. formas de realización, la puntuación umbral es de aproximadamente 500 a aproximadamente 1500. En algunas formas de realización, la puntuación umbral es de aproximadamente 500 a aproximadamente 1000. En algunas formas de realización, la puntuación umbral es de aproximadamente 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700, 3800, 3900, 4000, 4100, 4200, 4300, 4400, 4500, 4600, 4700, 4800, 4900 o 5000, incluidos los incrementos en los mismos. En algunas formas de realización, la puntuación umbral es de aproximadamente 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700, 3800, 3900, 4000, 4100, 4200, 4300, 4400, 4500,4600, 4700, 4800, 4900 o 5000, incluidos los incrementos en los mismos, más o menos 100.

[0128] En algunas formas de realización, el factor predeterminado es de aproximadamente 10 a aproximadamente 105. En algunas formas de realización, el factor predeterminado es de aproximadamente 102 a aproximadamente 105. En algunas formas de realización, el factor predeterminado es de aproximadamente 103 a aproximadamente 105. En algunas formas de realización, el factor predeterminado es de aproximadamente 104 a aproximadamente 105. En algunas formas de realización, el factor predeterminado es aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000,

90000 o 105, incluidos los incrementos.

[0129] En algunas formas de realización, la capacidad predictiva se cuantifica como un valor predictivo positivo, un

valor predictivo negativo o una combinación de los mismos. Un valor predictivo positivo se calcula dividiendo el

número de pacientes que responden al tratamiento con puntuaciones superiores a la puntuación umbral entre el

número total de pacientes que responden al tratamiento. Un valor predictivo negativo se calcula dividiendo el

número de pacientes que no responden al tratamiento con puntuaciones por debajo de la puntuación umbral entre

el número total de pacientes que no responden al tratamiento.

[0130] En algunas formas de realización, el valor predictivo positivo es superior al 60 %. En algunas formas de

realización, el valor predictivo positivo es del 65 % o más. En algunas formas de realización, el valor predictivo

positivo es del 70 % o más. En algunas formas de realización, el valor predictivo positivo es del 75 % o más. En

algunas formas de realización, el valor predictivo positivo es del 80 % o más. En algunas formas de realización, el

valor predictivo positivo es aproximadamente 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 %, incluidos los incrementos.

[0131] En algunas formas de realización, el valor predictivo negativo es del 60 % o más. En algunas formas de

realización, el valor predictivo negativo es del 65 % o más. En algunas formas de realización, el valor predictivo

negativo es del 70 % o más. En algunas formas de realización, el valor predictivo negativo es del 75 % o más. En

algunas formas de realización, el valor predictivo negativo es del 80 % o más. En algunas formas de realización,

el valor predictivo negativo es aproximadamente 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99 %, incluidos los incrementos.

[0132] En otro aspecto, en este documento se describen métodos que utilizan un sistema que comprende un

dispositivo de obtención de imágenes y un controlador para determinar una puntuación representativa de una

proximidad espacial entre al menos un par de células seleccionadas entre una pluralidad de células presentes en

un número predeterminado de campos de visión disponibles a partir de una muestra que comprende tejido tumoral,

donde dicha muestra se toma de un paciente con cáncer, donde el método comprende: (i) seleccionar un número

predeterminado de campos de visión disponibles de la muestra que comprende tejido tumoral procedente del

paciente con cáncer, que se tiñe con una

pluralidad de marcadores de fluorescencia, donde dicha selección está sesgada hacia la selección de campos de

visión que contienen un mayor número de células que expresan un primer biomarcador específico en relación con

otros campos de visión; (ii) para cada uno de los campos de visión seleccionados, dilatar las señales de

fluorescencia atribuibles al primer biomarcador específico para abarcar células localizadas proximalmente que

expresan un segundo biomarcador específico; y (iii) dividir una primera área total para todas las células de cada

uno de los campos de visión seleccionados, que expresan el segundo biomarcador específico y están englobadas

dentro de las señales de fluorescencia dilatadas atribuibles a las células que expresan el primer biomarcador

específico, con una puntuación de normalización, y multiplicar el cociente resultante por un factor predeterminado

para obtener una puntuación de proximidad espacial. En algunas formas de realización, el método proporciona

una capacidad predictiva superior en comparación con una cuantificación de la expresión del primer biomarcador

específico o una cuantificación de la expresión del segundo biomarcador específico.

[0133] En otro aspecto, en este documento se describen métodos que utilizan un sistema que comprende un

proximidad espacial entre al menos un par de células seleccionadas de entre una pluralidad de células presentes

en un número predeterminado de campos de visión disponibles de una muestra que comprende tejido tumoral,

muestra que se toma de un paciente con cáncer, donde el método comprende: (i) seleccionar un número

paciente con cáncer, que se tiñe con una pluralidad de marcadores de fluorescencia, donde dicha selección está

sesgada hacia la selección de campos de visión que contienen un mayor número de células que expresan un

primer biomarcador en relación con otros campos de visión; (ii) para cada uno de los campos de visión

seleccionados, dilatar las señales de fluorescencia atribuibles al primer biomarcador para abarcar células que

expresan un segundo biomarcador dentro de aproximadamente 0,5 |_im a aproximadamente 50 |_im de una

membrana plasmática de las células que expresan el primer biomarcador; y (iii) dividir una primera área total para

todas las células de cada uno de los campos de visión seleccionados, que expresan el segundo biomarcador y

están englobadas dentro de las señales de fluorescencia dilatadas atribuibles a las células que expresan el primer

biomarcador, con un factor de normalización, y multiplicar el cociente resultante por un factor predeterminado para

obtener una puntuación de proximidad espacial. En algunas formas de realización, el método proporciona una

capacidad predictiva superior en comparación con una cuantificación de la expresión del primer biomarcador

[0134] En otro aspecto, en este documento se describen métodos que utilizan un sistema que comprende un

dispositivo de obtención de imágenes y un controlador para determinar una puntuación representativa de una proximidad espacial entre al menos un par de células seleccionadas entre una pluralidad de células presentes en un número predeterminado de campos de visión disponibles a partir de una muestra que comprende tejido tumoral, cuya muestra se toma de un paciente con cáncer, donde el método comprende: (i) seleccionar un número predeterminado de campos de visión disponibles de la muestra que comprende tejido tumoral procedente del paciente con cáncer, que se tiñe con un pluralidad de marcadores de fluorescencia, donde dicha selección está sesgada hacia la selección de campos de visión que contienen un mayor número de células que expresan un primer biomarcador en relación con otros campos de visión; (ii) para cada uno de los campos de visión seleccionados, dilatar las señales de fluorescencia atribuibles al primer biomarcador en un margen que varía de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 píxeles para abarcar células localizadas proximalmente que expresan un segundo biomarcador; y (iii) dividir una primera área total, medida en píxeles, para todas las células de cada uno de los campos de visión seleccionados, que expresan el segundo biomarcador y están englobadas dentro de las señales de fluorescencia dilatadas atribuibles a las células que expresan el primer biomarcador, por un factor de normalización y multiplicar el cociente resultante por un factor predeterminado para obtener una puntuación de proximidad espacial. En algunas formas de realización, el método proporciona una capacidad predictiva superior en comparación con una cuantificación de la expresión del primer biomarcador específico o una cuantificación de la expresión del segundo biomarcador específico.

[0135] En otro aspecto, en este documento se describen métodos que utilizan un sistema que comprende un dispositivo de obtención de imágenes y un controlador para determinar una puntuación representativa de una proximidad espacial entre al menos un par de células seleccionadas entre una pluralidad de células presentes en un número predeterminado de campos de visión disponibles a partir de una muestra que comprende tejido tumoral, muestra procedente de un paciente con cáncer, donde el método comprende: (i) seleccionar un número predeterminado de campos de visión disponibles de la muestra que comprende tejido tumoral procedente del paciente con cáncer, que se tiñe con un pluralidad de marcadores de fluorescencia, donde dicha selección está sesgada hacia la selección de campos de visión que contienen un mayor número de células que expresan un primer biomarcador en relación con otros campos de visión; (ii) para cada uno de los campos de visión seleccionados, dilatar las señales de fluorescencia atribuibles al primer biomarcador en un margen que varía de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 píxeles para abarcar las células que expresan un segundo biomarcador dentro de aproximadamente 0,5 |_im a aproximadamente 50 |_im de una membrana plasmática de las células que expresan el primer biomarcador; y (iii) dividir una primera área total, medida en píxeles, para todas las células de cada uno de los campos de visión seleccionados, que expresan el segundo biomarcador y están englobadas dentro de las señales de fluorescencia dilatadas atribuibles a las células que expresan el primer biomarcador, por un factor de normalización y multiplicar el cociente resultante por un factor predeterminado para obtener una puntuación de proximidad espacial. En algunas formas de realización, el método proporciona una capacidad predictiva superior en comparación con una cuantificación de la expresión del primer biomarcador específico o una cuantificación de la expresión del segundo biomarcador específico.

[0136] En algunas formas de realización, la puntuación de proximidad espacial (SPS) se determina mediante la siguiente ecuación:

donde A i es un área de interacción total (área total de células que expresan el segundo biomarcador específico y abarcadas por señales de fluorescencia dilatadas atribuibles a las células que expresan el primer biomarcador específico) y Ant es el área total de células no tumorales.

[0137] En algunas formas de realización, la puntuación de proximidad espacial se determina mediante la siguiente ecuación:

A¡ ,

SPS = — L x 104

¿ c

donde AI es un área de interacción total (área total de células que expresan el segundo biomarcador específico y abarcadas por señales de fluorescencia dilatadas atribuibles a las células que expresan el primer biomarcador específico) y Ac es el área total de células que tienen la capacidad de expresar el segundo biomarcador específico.

[0138] En otro aspecto, se describen métodos que utilizan un sistema que comprende un dispositivo de obtención de imágenes y un controlador para puntuar una muestra que comprende tejido tumoral de un paciente con cáncer que se utilizan en métodos para tratar el cáncer en el paciente. En algunas formas de realización, los métodos de puntuación de una muestra que comprende tejido tumoral de un paciente con cáncer se realizan antes de la administración de inmunoterapia. En algunas formas de realización, el método proporciona una capacidad predictiva superior en comparación con una cuantificación de la expresión del primer biomarcador específico o una cuantificación de la expresión del segundo biomarcador específico.

[0139] En algunas formas de realización, la puntuación de proximidad espacial se determina mediante la siguiente ecuación:

donde A i es un área de interacción total (área total de células que expresan el segundo biomarcador específico y abarcadas por señales de fluorescencia dilatadas atribuibles a las células que expresan el primer biomarcador específico) y At es el área total de todas las células.

[0140] En algunas formas de realización, en el presente documento se describen métodos que utilizan un sistema que comprende un dispositivo de obtención de imágenes y un controlador para tratar el cáncer en un paciente que lo necesite, donde el método comprende: (a) puntuar una muestra que comprende tejido tumoral procedente del paciente, lo que comprende (i) utilizar la muestra que comprende tejido tumoral procedente del paciente y determinar una puntuación representativa de una proximidad espacial entre al menos un par de células, donde un primer miembro del al menos un par de células expresa un primer biomarcador y un segundo miembro del al menos un par de células expresa un segundo biomarcador que es diferente del primer biomarcador; y (ii) registrar la puntuación; (b) comparar la puntuación con un valor umbral; y (b) administrar inmunoterapia al paciente si la puntuación, cuando se compara con el valor umbral, es indicativa de una probabilidad de que el paciente tenga una respuesta positiva a la inmunoterapia. En algunas formas de realización, el paso de determinación es como se describe en el presente documento. En algunas formas de realización, el método proporciona una capacidad predictiva superior en comparación con una cuantificación de la expresión del primer biomarcador específico o una cuantificación de la expresión del segundo biomarcador específico.

[0141] En algunas formas de realización, en el presente documento se describen métodos para puntuar una muestra de tejido que comprenden: (i) usar un sistema de obtención de imágenes para obtener datos de imagen para la muestra de tejido procedente de un paciente con cáncer, donde el sistema de obtención de imágenes comprende: una carcasa que comprende una plataforma para colocar la muestra en un campo de obtención de imágenes, una fuente de radiación electromagnética para dirigir la radiación electromagnética hacia la muestra y un detector para recoger la salida de radiación electromagnética; y un sistema de control electrónico que comprende una memoria y un circuito de procesamiento que tiene módulos de procesamiento de imágenes; (ii) analizar, utilizando los módulos de procesamiento de imágenes, los datos de imagen para determinar una puntuación representativa de la proximidad entre un par de células, donde un primer miembro del par de células expresa un primer biomarcador y un segundo miembro del par de células expresa un segundo biomarcador que es diferente del primer biomarcador; y (iii) registrar la puntuación en la memoria, puntuación que, cuando se compara con un valor umbral, es indicativa de la probabilidad de que el paciente con cáncer tenga una respuesta positiva a la inmunoterapia. En algunas formas de realización, el método proporciona una capacidad predictiva superior en comparación con una cuantificación de la expresión del primer biomarcador específico o una cuantificación de la expresión del segundo biomarcador específico.

[0142] En algunas formas de realización, en el presente documento se describen sistemas de puntuación de muestras de tejido que comprenden: un dispositivo de obtención de imágenes que obtiene datos de imagen de una muestra de tejido procedente de un paciente con cáncer; y un controlador que recibe datos de imagen del dispositivo de obtención de imágenes y analiza los datos para determinar una puntuación representativa de la proximidad entre un par de células, donde un primer miembro del al menos un par de células expresa un primer biomarcador y un segundo miembro del al menos un par de células expresa un segundo biomarcador que es diferente del primer biomarcador, en el que la puntuación, cuando se compara con un valor umbral, es indicativa de una probabilidad de que el paciente con cáncer tenga una respuesta positiva a la inmunoterapia. En algunas formas de realización, el método proporciona una capacidad predictiva superior en comparación con una cuantificación de la expresión del primer biomarcador específico o una cuantificación de la expresión del segundo biomarcador específico.

EJEMPLOS

Ejemplo 1. Preparación de las muestras, obtención de imágenes y análisis de imágenes para muestras de tejido de melanoma de pacientes humanos

[0143] Preparación de las muestras. Se desparafinaron muestras de tejido fijadas con formalina e incluidas en parafina (FFPE). A continuación, los portaobjetos se rehidrataron mediante una serie de lavados de xileno a alcohol antes de incubarlos en agua destilada. A continuación, se realizó la recuperación de antígenos inducida por calor usando condiciones de presión y temperatura elevadas, se dejaron enfriar y se transfireron a solución salina con pH regulado con Tris. Luego se realizó la tinción, para la que se llevaron a cabo los siguientes pasos. Primero, se bloqueó la peroxidasa endógena y luego se realizó una incubación con una solución de bloqueo de proteínas para reducir la tinción de anticuerpos inespecíficos. A continuación, los portaobjetos se tiñeron con un anticuerpo primario anti-PD1 de ratón. A continuación, se lavaron los portaobjetos antes de la incubación con un anticuerpo secundario anti-HRP de ratón. Los portaobjetos se lavaron y luego se detectó la tinción de PD-1 usando TSA+ Cy® 3.5 (Perkin Elmer). A continuación, se neutralizó cualquier HRP residual usando dos lavados de 100 mM de benzhidrazida recién preparada con 50 mM de peróxido de hidrógeno. Los portaobjetos se lavaron de nuevo antes de la tinción con un anticuerpo primario anti-PD-Ll de conejo. Los portaobjetos se lavaron y luego se incubaron con un “cóctel” de anticuerpos secundarios anti-HRP de conejo más anti-S 100 de ratón marcados directamente con colorante 488 y 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Los portaobjetos se lavaron y luego se detectó la tinción de PD-L1 usando TSA-Cy® 5 (Perkin Elmer). Los portaobjetos se lavaron por última vez antes de cubrirlos con un cubreobjetos y medio de montaje y se dejaron secar durante la noche a temperatura ambiente. Se muestra una descripción esquemática de los anticuerpos y reactivos de detección en la FIG 6. Alternativamente, los portaobjetos se tiñeron con anticuerpo primario anti-CD8 en lugar de anticuerpo primario anti-PD1.

[0144] Abtención de imágenes y análisis de muestras. A continuación, se adquirieron imágenes de fluorescencia utilizando el sistema de análisis de portaobjetos inteligente Vectra 2 (Vectra 2 Intelligent Slide Analysis System) utilizando el software Vectra versión 2.0.8 (Perkin Elmer). En primer lugar, se obtuvieron imágenes monocromáticas del portaobjetos con un aumento de 4x utilizando DAPI. Se utilizó un algoritmo automatizado (desarrollado con inForm) para identificar las áreas del portaobjetos que contenían tejido.

[0145] Se tomaron imágenes de las áreas del portaobjetos identificadas como que contenían tejido con un aumento de 4x para los canales asociados con DAPI (azul), FITC (verde) y Cy® 5 (rojo) para crear imágenes RGB. Estas imágenes de 4x se procesaron utilizando un algoritmo de enriquecimiento automatizado (desarrollado con inForm) en el selector de campo de visión 101 para identificar y clasificar los posibles campos de visión con aumento de 20x de acuerdo con la expresión de Cy® 5 más alta.

[0146] Se obtuvieron imágenes de los 40 campos de visión superiores con un aumento de 20x en las longitudes de onda de DAPI, FITC, Texas Red y Cy® 5. Las imágenes sin procesar se revisaron para verificar su aceptabilidad, y las imágenes que estaban desenfocadas, que carecían de células tumorales, que eran altamente necróticas o que contenían altos niveles de señal de fluorescencia no asociada con la localización esperada de anticuerpos (es decir, tinción de fondo) se descartaron antes del análisis. Las imágenes aceptadas se procesaron usando AQUAduct (Perkin Elmer), en donde cada fluoróforo se desmezcló espectralmente mediante el desmezclador espectral 210 en canales individuales y se guardó como un archivo separado.

[0147] Los archivos procesados se analizaron adicionalmente utilizando AQUAnalysis™ o mediante un proceso totalmente automatizado utilizando AQUAserve™. Los detalles fueron los siguientes.

[0148] Cada imagen de DAPI fue procesada por el enmascarador celular 212 para identificar todos los núcleos celulares dentro de esa imagen (figura 7a), y luego dilatada 3 píxeles para representar el tamaño aproximado de una célula completa. Esta máscara resultante representaba todas las células dentro de esa imagen (figura 7b).

[0149] S100 (marcador de células tumorales para melanoma) detectada con colorante 488 (figura 8a) fue procesada por el enmascarador de subconjunto 216 para crear una máscara binaria de toda el área tumoral dentro de esa imagen (figura 8b). La superposición entre esta máscara y la máscara de todas las células creó una nueva máscara para las células tumorales (figura 8c), utilizando el enmascarador de células tumorales 218.

[0150] De manera similar, la ausencia del marcador de células tumorales en combinación con la máscara de todos los núcleos creó una nueva máscara para todas las células no tumorales (figura 8d), realizada con el enmascarador de células no tumorales 220.

[0151] Cada imagen de Cy® 5 (figura 9a) fue procesada por el enmascarador del primer biomarcador 222 y se superpuso con la máscara de todas las células para crear una máscara binaria de todas las células positivas para PD-L1 (figura 9b). La superposición de la máscara de biomarcador con la máscara de todas las células eliminó los píxeles de ruido que podían identificarse falsamente en la máscara como células positivas de biomarcadores.

[0152] Cada imagen de Cy® 3.5 (figura 10 a) fue procesada por el enmascarador del segundo biomarcador 224 para crear una máscara binaria para las células positivas para PD-1 y se superpuso con la máscara de todas las células no tumorales para crear una máscara binaria de todas las células no tumorales positivas para PD-1 (figura 10b). La superposición de la máscara de biomarcador con la máscara de todas las células no tumorales eliminó los píxeles de ruido que podían identificarse falsamente en la máscara como células positivas de biomarcadores.

[0153] La máscara binaria de todas las células positivas para PD-L1 se dilató utilizando un segundo dilatador 226 para crear una máscara de interacción que abarcaba las células adyacentes más cercanas (por ejemplo, células con PD-1) (figura 11a). Esta máscara de interacción se combinó con una máscara binaria de todas las células no tumorales positivas para PD-1 utilizando el enmascarador de interacción 230 para crear un compartimento de interacción de las células positivas para PD-1 lo suficientemente cerca de las células positivas para PD-L1 como para que PD-1 interactuara probablemente con PD-L1 (figura 11b).

[0154] El área total de todos los campos aceptados (hasta 40 campos de visión) para el compartimento de interacción y el área total de las células no tumorales se calculó en los evaluadores de área 232, 234 respectivamente. El área total de todos los campos de visión aceptados para el compartimento de interacción se dividió entre el área total de las células no tumorales y se multiplicó por un factor de 10000, utilizando la calculadora de interacción 236 para crear un número entero que representara una puntuación de interacción para cada muestra. Las mediciones de PD-L1 y PD-1 fueron altamente reproducibles (R2 = 0,98 y 0,97, respectivamente). Se observó un amplio rango de puntuaciones de expresión e interacción de PD-L1 y PD-1 en muestras clínicas de archivo (n = 53). En una cohorte de 26 pacientes con melanoma avanzado tratados con nivolumab (n = 5) o pembrolizumab (n = 21), se observó que la puntuación de interacción PD-1/PD-L1 distinguía de manera fiable a los que respondían al tratamiento de los que no respondían al tratamiento (p = 0,01) mientras que con PD-L1 solo (p = 0,07) o CD8 solo (p = 0,23) no. Además, los pacientes con puntuaciones de interacción PD-1/PD-L1 más altas tuvieron tasas de respuesta superiores (82 % frente a 20 %, p = 0,01). Los pacientes con puntuaciones altas de interacción PD-1/PD-L1 experimentaron una mediana de supervivencia libre de progresión más prolongada (p = 0,059) y menos muertes (22 % frente a 58 %) en comparación con los pacientes con puntuaciones de interacción PD-1/PD-L1 más bajas. Estos resultados sugieren que este método de puntuación de la muestra de tejido para obtener puntuaciones de interacción PD-1/PD-L1 proporciona una capacidad predictiva superior (82 % de valor predictivo positivo, 80 % de valor predictivo negativo) en comparación con la expresión de PD-L1 sola.

[0155] Las puntuaciones representativas de los 26 pacientes se muestran en la figura 12a. Según los datos, se seleccionó un umbral de 800-900 para indicar la probabilidad de respuesta al tratamiento.

[0156] Alternativamente, la puntuación de interacción se calculó para cada campo de visión individual y la puntuación máxima para cada paciente se muestra en la figura 12b. En función de la puntuación máxima, se seleccionó un umbral de 1900 para indicar la probabilidad de respuesta al tratamiento.

[0157] Para evaluar el efecto del algoritmo de enriquecimiento en la puntuación de interacción, los procedimientos mencionados anteriormente se realizaron utilizando imágenes de portaobjetos completos en lugar del algoritmo de enriquecimiento (véase la figura 13). Cuando se realizó el análisis de la imagen de portaobjetos completo, ya no hubo una diferencia estadísticamente significativa entre los pacientes que respondieron a la terapia anti-PDl y los que no lo hicieron. Como tal, no se pudo determinar un umbral con este análisis.

[0158] Las puntuaciones de interacción se compararon con la supervivencia libre de progresión (SLP) de los pacientes (figura 14). Las puntuaciones de interacción de al menos 803 se correlacionaron bien con la supervivencia. En particular, la expresión de PD-L1 no se correlacionó con una mejor SLP (figura 15).

[0159] En las FIGS. 16 y 17 se muestran ejemplos representativos de máscaras superpuestas que indican células positivas para PD-L1 (rojo), células positivas para PD-L (amarillo), células tumorales (SI00, verde) y todas las células (DAPI, azul). Para un paciente con respuesta positiva a la inmunoterapia, la máscara de la figura 16 indica fácilmente la presencia de células positivas para PD-L1 (rojo), células positivas para PD-1 (amarillo) y todas las células tumorales (verde). Por el contrario, para un paciente sin respuesta a la inmunoterapia, la máscara de la figura 17 indica la presencia de células tumorales (SI00, verde) y todas las células (DAPI, azul), pero muestra pocas o ninguna célula positiva para PD-L1 (rojo) o células positivas para PD-1 (amarillo). La figura 16 representa una puntuación de interacción de 2176 (respuesta completa a la inmunoterapia). La figura 17 representa una puntuación de interacción de 8 (sin respuesta a la inmunoterapia).

[0160] Las muestras de tejido también se evaluaron utilizando un método aprobado por la FDA para medir PD-L1 en cáncer de pulmón no microcítico con el clon 22C3 de anticuerpo anti-PD-L1, que no se utiliza actualmente para muestras de tejido de melanoma. La expresión de PD-L1 se comparó con la SLP del paciente y se muestra en la figura 19. Este método no demuestra un valor diagnóstico estadísticamente relevante en comparación con los métodos descritos en este documento que utilizan puntuaciones de interacción.

[0161] Se examinó una cohorte de verificación de 34 pacientes adicionales con melanoma metastásico y se obtuvieron puntuaciones de interacción PD-1/PD-L1 (véase la figura 20a). Estas puntuaciones de interacción también se compararon con la supervivencia libre de progresión (SLP) de los pacientes (figura 20b). Aunque no es estadísticamente significativa (p = 0,19), la comparación indica una tendencia de que pacientes con puntuaciones de interacción PD-1/PD-L1 más altas tienen una SLP más prolongada. La importancia estadística puede ser limitada debido al uso relativamente reciente de estas terapias en la clínica, lo que limita el tiempo de seguimiento para estos pacientes.

[0162] Las puntuaciones de interacción PD-1/PD-L1, así como la comparación de estas puntuaciones con la SLP del paciente o la supervivencia global (SG) del paciente para la combinación de la cohorte anterior de 26 pacientes con la cohorte de verificación de 34 pacientes se muestran en las FIG. 20c-20e. El análisis combinado indica claramente que los pacientes con niveles elevados de PD-1/PD-L1 presentan una respuesta mejorada a las terapias anti-PD-1.

Ejemplo 2. Preparación de las muestras, obtención de imágenes y análisis de las imágenes obtenidas para muestras de tejido de carcinoma pulmonar no microcítico de pacientes humanos.

[0163] Se realizaron procedimientos análogos a los del Ejemplo 1, sustituyendo el anti-S100 de ratón marcado directamente con el colorante 488 con anti-pancitoqueratina de ratón directamente marcado con el colorante 488 para las muestras de tumores epiteliales. Las puntuaciones de interacción de 38 muestras se muestran en la figura 18.

Ejemplo 3. Preparación de las muestras, obtención de imágenes y análisis de las imágenes obtenidas para muestras de tejido con células que expresan PD-L1 y células que expresan CD80.

[0164] Preparación de las muestras Las muestras de tejido incluidas en parafina y fijadas con formalina (FFPE) se desparafinaron, se rehidrataron y la recuperación de antígenos se realizó en condiciones de temperatura elevada. Luego se realizó la tinción, para la que se llevaron a cabo los siguientes pasos. Primero, los tejidos se sometieron a una detección de la expresión de CTLA-4 usando 20 pares de sondas de hibridación que abarcaban aproximadamente 1 kb del ARNm de CTLA-4 usando RNAScope® (Advanced Cell Diagnostics). La hibridación in situ se visualizó con TSA-Cy®3. Los portaobjetos se lavaron y luego se neutralizó cualquier HRP residual usando dos lavados de 100 mM de benzhidrazida recién preparada con 50 mM de peróxido de hidrógeno. Los portaobjetos se lavaron de nuevo antes de la tinción con un anticuerpo primario anti-CD80 de ratón. Los portaobjetos se lavaron y luego se incubaron con un anticuerpo secundario anti-HRP de ratón. Los portaobjetos se lavaron y luego se detectó la tinción de CD80 usando TSA-Cy® 5 (Perkin Elmer). A continuación, se neutralizó cualquier h Rp residual usando dos lavados de 100 mM de benzhidrazida recién preparada con 50 mM de peróxido de hidrógeno. Los portaobjetos se lavaron de nuevo antes de la tinción con un anticuerpo primario anti-CD3 de conejo. Los portaobjetos se lavaron y luego se incubaron con un cóctel de anticuerpos secundarios anti-conejo HRP más 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Los portaobjetos se lavaron y luego se detectó la tinción de CD3 usando TSA-AlexaFluor488® (Life Technologies). Los portaobjetos se lavaron por última vez antes de cubrirlos con un cubreobjetos y medio de montaje y se dejaron secar durante la noche a temperatura ambiente.

[0165] Se realizaron procedimientos de obtención de imágenes y de análisis análogos a los del Ejemplo 1, obteniendo imágenes en las longitudes de onda de DAPI, FITC, Cy® 3 y Cy® 5. La expresión de CTLA-4 y CD80 se utilizó para desarrollar un algoritmo de enriquecimiento para adquirir imágenes de 20x. Se realizó un análisis para determinar las puntuaciones de interacción CTLA-4/CD80 midiendo el área total, en píxeles, de células positivas CTLA-4 y CD3 dentro de la proximidad de células positivas CD80 dividida por el área total, en píxeles, de las células positivas CD3, multiplicada por un factor de 10,000. Los resultados se muestran en la figura 21.

Ejemplo 4. Preparación de las muestras, obtención de imágenes y análisis de las imágenes obtenidas para muestras de tejido con células que expresan CTLA-4 y células que expresan CD80.

[0166] Se realizan procedimientos análogos a los del Ejemplo 1, sustituyendo la tinción y el análisis de PD-L1 y PD-1 por la tinción y el análisis de CTLA-4 y CD80.

Ejemplo 5. Preparación de las muestras, obtención de imágenes y análisis de las imágenes obtenidas para muestras de tejido con células que expresan PD-L2 y células que expresan PD-1.

[0167] Se realizan procedimientos análogos a los del Ejemplo 1, sustituyendo la tinción y el análisis de PD-L1 por la tinción y el análisis de PD-L2.

Ejemplo 6. Preparación de las muestras, obtención de imágenes y análisis de las imágenes obtenidas para muestras de tejido con células que expresan CTLA-4 y células que expresan CD86.

[0168] Se realizan procedimientos análogos a los del Ejemplo 1, sustituyendo la tinción y el análisis de PD-L1 y PD-1 por la tinción y el análisis de CTLA-4 y CD86.

Ejemplo 7. Preparación de las muestras, obtención de imágenes y análisis de las imágenes obtenidas para muestras de tejido con células que expresan LAG-3 y células que expresan HLA-DR.

[0169] Se realizan procedimientos análogos a los del Ejemplo 1, sustituyendo la tinción y el análisis de PD-L1 y PD-1 por la tinción y el análisis de LAG-3 y HLA-DR.

Ejemplo 8. Preparación de las muestras, obtención de imágenes y análisis de las imágenes obtenidas para muestras de tejido con células que expresan TIM-3 y células que expresan Galectina 9.

[0170] Se realizan procedimientos análogos al Ejemplo 1, sustituyendo la tinción y el análisis de PD-L1 y PD-1 por la tinción y el análisis de TIM-3 y Galectina 9.

Ejemplo 9. Preparación de las muestras, obtención de imágenes y análisis de las imágenes obtenidas para muestras de tejido con células que expresan 41BB y células que expresan 4.1BBL.

[0171] Se realizan procedimientos análogos a los del Ejemplo 1, sustituyendo la tinción y el análisis de PD-L1 y PD-1 por la tinción y el análisis de 41BB y 4.1BBL.

Ejemplo 10. Preparación de las muestras, obtención de imágenes y análisis de las imágenes obtenidas para muestras de tejido con células que expresan OX40 y células que expresan OX40L.

[0172] Se realizan procedimientos análogos a los del Ejemplo 1, sustituyendo la tinción y el análisis de PD-L1 y PD-1 por la tinción y el análisis de OX40 y OX40L.

Ejemplo 11. Preparación de las muestras, obtención de imágenes y análisis de las imágenes obtenidas para muestras de tejido con células que expresan CD40 y células que expresan CD40L.

[0173] Se realizan procedimientos análogos a los del Ejemplo 1, sustituyendo la tinción y el análisis de PD-L1 y PD-1 por la tinción y el análisis de CD40 y CD40L.

Ejemplo 12. Preparación de las muestras, obtención de imágenes y análisis de las imágenes obtenidas para muestras de tejido con células que expresan ICOS y células que expresan ICOSL.

[0174] Se realizan procedimientos análogos a los del Ejemplo 1, sustituyendo la tinción y el análisis de PD-L1 y PD-1 por la tinción y el análisis de ICOS e ICOSL.

Ejemplo 13. Preparación de las muestras, obtención de imágenes y análisis de las imágenes obtenidas para muestras de tejido con células que expresan GITR y células que expresan GITRL.

[0175] Se realizan procedimientos análogos a los del Ejemplo 1, sustituyendo la tinción y el análisis de PD-L1 y PD-1 por la tinción y el análisis de GITR y GITRL.

Ejemplo 14. Preparación de las muestras, obtención de imágenes y análisis de las imágenes obtenidas para muestras de tejido con células que expresan HLA-DR y células que expresan TCR.

[0176] Se realizan procedimientos análogos a los del Ejemplo 1, sustituyendo la tinción y el análisis de PD-L1 y PD-1 por la tinción y el análisis de HLA-DR y TCR.

Ejemplo 15. Preparación de las muestras, obtención de imágenes y análisis de las imágenes obtenidas para muestras de tejido con células que expresan PD-1, PD-L1 y CD3.

[0177] Se realizaron procedimientos análogos a los del Ejemplo 1 sin el anticuerpo anti-S100 de ratón. En cambio, después de la detección de PD-L1, los anticuerpos primarios y secundarios se eliminaron mediante microondas. A continuación, los portaobjetos se tiñeron con anticuerpo primario anti-CD3 de conejo. Los portaobjetos se lavaron y luego se incubaron con un cóctel de anticuerpos secundarios anti-conejo HRP más 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Los portaobjetos se lavaron y luego se detectó la tinción de CD3 con TSA-AlexaFluor488 (Life Technologies). La obtención de imágenes y el análisis fueron análogos al Ejemplo 1, donde la proximidad espacial (por ejemplo, la puntuación de interacción) se calculó dividiendo el área de células positivas para PD-1 en el área positiva para PD-L1, medida en píxeles, por el área de todas las células nucleadas, medidas en píxeles, multiplicado por un factor de 10000. Las puntuaciones de interacción de 29 muestras se muestran en la figura 22.

[0178] La manipulación de los datos de imagen del dispositivo de obtención de imágenes 100, para derivar un valor de porcentaje de positividad de un biomarcador de la muestra de tejido, como se describe en este documento, puede llevarse a cabo mediante el controlador 1900, que se muestra esquemáticamente en la figura 23. Se muestra que el controlador 1900 incluye una interfaz de comunicaciones 1902 y un circuito de procesamiento 1904. El circuito de procesamiento 1904 está configurado para implementar pasos para determinar el porcentaje de positividad de los biomarcadores. Se contempla que los elementos y funciones del controlador 1900 pueden incluirse en el controlador 150 del dispositivo de obtención de imágenes 100, o pueden estar presentes en un sistema informático separado del dispositivo de obtención de imágenes 100.

[0179] En algunas formas de realización, la muestra puede teñirse usando una pluralidad de marcadores de fluorescencia con afinidad por biomarcadores específicos. Se puede obtener una imagen digital de la muestra teñida, y la imagen se puede analizar adicionalmente basándose en la ubicación de los marcadores de fluorescencia. En lugar del análisis de la imagen completa, los campos de visión se pueden priorizar en función del número de células que expresan un primer biomarcador de interés. A continuación, se puede analizar adicionalmente un número predeterminado de campos de visión en busca de señales de fluorescencia. En algunas formas de realización, las imágenes de señales de fluorescencia se manipulan para generar una o más máscaras de señales de fluorescencia correspondientes a células dentro de la imagen. En algunas formas de realización, la máscara o máscaras de señales de fluorescencia comprenden una o más seleccionadas del grupo que consiste en una máscara de todas las células dentro de la imagen, una máscara de todas las células que expresan el biomarcador de subconjunto (por ejemplo, todas las células tumorales), dentro de la imagen, una máscara de todas las células que no expresan el biomarcador de subconjunto (por ejemplo, todas las células no tumorales) dentro de la imagen, una máscara de todas las células que expresan un primer biomarcador de interés dentro de la imagen y una máscara positiva para el biomarcador que representa todas las células de interés que expresan un biomarcador. Las áreas de estas máscaras pueden usarse para derivar un valor de PBP según se desee. El área total de la máscara de biomarcador puede usarse para calcular un valor de porcentaje de positividad del biomarcador dividiendo el área de la máscara de biomarcador para el tipo de célula de interés por el área de todas las células en el compartimento de interés.

[0180] La figura 24 es un diagrama de flujo que representa los pasos de una forma de realización de un método para derivar un valor para el % de positividad de un biomarcador (PBP). En el paso 2001, se obtienen los datos de imagen y, en el paso 2002, los datos de imagen no se mezclan, de modo que los datos específicos de varios tipos de señales de fluorescencia se separan en diferentes canales. En el paso 2003, los datos de un primer canal se utilizan para generar una máscara de todas las células. En el paso 2004, los datos de un segundo canal se utilizan para generar una máscara del área en un campo de visión que expresa un biomarcador de subconjunto, por ejemplo, esta máscara de subconjunto puede ser una máscara de un área tumoral presente en un campo de visión. En el paso 2005, la máscara de todas las células y la máscara de subconjunto (por ejemplo, una máscara del área tumoral) se combinan para generar una máscara de todas las células del subconjunto. En determinadas formas de realización, la combinación de la máscara de todas las células y la máscara de subconjunto puede identificar todas las células tumorales y/o todas las células no tumorales.

[0181] En algunas formas de realización, un subconjunto de células identificado por un biomarcador de subconjunto y un no subconjunto de células corresponde a células tumorales y a células no tumorales, respectivamente o viceversa. En algunas formas de realización, un subconjunto de células identificado por un biomarcador de subconjunto y un no subconjunto de células corresponde a células viables y a células no viables, respectivamente o viceversa. En algunas formas de realización, un subconjunto de células identificado por un biomarcador de subconjunto es un subconjunto de células viables y un no subconjunto de células consiste en las células viables no incluidas en el subconjunto de células viables. En algunas formas de realización, un subconjunto de células identificado por un biomarcador de subconjunto y un no subconjunto de células corresponde a linfocitos T y linfocitos no T, respectivamente o viceversa. En algunas formas de realización, un subconjunto de células identificado por un biomarcador de subconjunto y un no subconjunto de células corresponde a células mieloides y a células no mieloides, respectivamente o viceversa.

[0182] El proceso se puede llevar a cabo solo en un tipo seleccionado de células de interés, por ejemplo, solo células tumorales o solo células no tumorales. El proceso también puede estar dirigido a un análisis de ambos. En el paso 2006, los datos de un tercer canal se utilizan para generar una máscara de todas las células positivas para un biomarcador (basándose en señales de fluorescencia que representan la presencia de un marcador fluorescente con afinidad por la unión al biomarcador particular de interés). En los pasos 2007 y 2008, la máscara de biomarcador generada en el paso 2006 se combina con la máscara de células de subconjunto generada en el paso 2005. El paso 2007 combina la máscara de biomarcador con la máscara de células de subconjunto de una primera manera, para generar una máscara de todas las células de subconjunto que son positivas para el biomarcador. El paso 2008 combina la máscara de biomarcador con la máscara de células de subconjunto de una segunda manera, para generar una máscara de todas las células de subconjunto que no son positivas para el biomarcador. Uno o ambos de los pasos 2007 y 2008 se pueden realizar de acuerdo con las diversas formas de realización del método. En el paso 2009/2010, se calcula una puntuación de PBP dividiendo el área de las células de subconjunto de interés (por ejemplo, las células de subconjunto que son positivas para el biomarcador identificado por la máscara creada en el paso 2007 o las células de subconjunto que no son positivas para el biomarcador identificado por la máscara creada en el paso 2008) por el área total de todas las células de interés. El paso 2009 calcula el PBP para las células de subconjunto que son positivas para el biomarcador. El paso 2010 calcula el PBP para las células de subconjunto que no son positivas para el biomarcador. Uno o ambos de los pasos 2009 y 2010 se pueden realizar de acuerdo con las diversas formas de realización del método.

[0183] La figura 25 es un diagrama de flujo que representa los pasos de una segunda forma de realización de un método para derivar un valor para el % de positividad del biomarcador (PBP). En el paso 2101 se obtienen los datos de imagen y en el paso 2102 los datos de imagen no se mezclan, de modo que los datos específicos de varios tipos de señales de fluorescencia se separan en diferentes canales. En el paso 2103, los datos de un primer canal se utilizan para generar una máscara de todas las células. En el paso 2104, los datos de un segundo canal se utilizan para generar una máscara de todas las células positivas para un biomarcador (basándose en señales de fluorescencia que representan la presencia de un marcador fluorescente con afinidad por la unión al biomarcador particular de interés). En el paso 2105, se calcula una puntuación de PBP dividiendo el área de las células positivas para el biomarcador (que se identifica por la máscara creada en el paso 2104) por el área total de todas las células de interés (del paso 2103). El proceso de la FIG. 25 puede llevarse a cabo por separado o simultáneamente con el método descrito en la figura 24. En otras palabras, se puede calcular una puntuación de PBP para todas las células, todas las células tumorales y todas las células no tumorales, o cualquier combinación de las mismas, posiblemente combinando los métodos de las FIGS. 24 y 25.

[0184] En la figura 23, se muestra que el controlador 1900 incluye una interfaz de comunicaciones 1902 y un circuito de procesamiento 1904. La interfaz de comunicaciones 1902 puede incluir interfaces cableadas o inalámbricas (por ejemplo, enchufes, antenas, transmisores, receptores, transceptores, terminales de cable, etc.) para realizar comunicaciones de datos con varios sistemas, dispositivos o redes. Por ejemplo, la interfaz de comunicaciones 1902 puede incluir una tarjeta Ethernet y un puerto para enviar y recibir datos a través de una red de comunicaciones basada en Ethernet y/o un transceptor WiFi para comunicarse a través de una red de comunicaciones inalámbrica. La interfaz de comunicaciones 1902 puede configurarse para comunicarse a través de redes de área local o redes de área amplia (por ejemplo, Internet, la WAN de un edificio, etc.) y puede utilizar una variedad de protocolos de comunicación (por ejemplo, BACnet, IP, LON, etc.). La interfaz de comunicaciones 1902 puede ser una interfaz de red configurada para facilitar las comunicaciones de datos electrónicos entre el controlador 1900 y varios sistemas o dispositivos externos (por ejemplo, el dispositivo de obtención de imágenes 100). Por ejemplo, el controlador 1900 puede recibir datos de imagen para los campos de visión seleccionados desde el dispositivo de obtención de imágenes 100, para analizar los datos y calcular el porcentaje de positividad de los biomarcadores.

[0185] Se muestra que el circuito de procesamiento 1904 incluye un procesador 1906 y una memoria 1908. El procesador 1906 puede ser un procesador para fines generales o específicos, un circuito integrado para aplicaciones específicas (ASIC), una o más matrices de puertas programables in situ (FPGA), un grupo de componentes de procesamiento u otros componentes de procesamiento adecuados. El procesador 506 puede configurarse para ejecutar código informático o instrucciones almacenadas en la memoria 508 o recibidas de otros medios legibles por ordenador (por ejemplo, CDROM, almacenamiento en red, un servidor remoto, etc.).

[0186] La memoria 1908 puede incluir uno o más dispositivos (por ejemplo, unidades de memoria, dispositivos de memoria, dispositivos de almacenamiento, etc.) para almacenar datos y/o código informático para completar y/o facilitar los diversos procesos descritos en la presente divulgación. La memoria 1908 puede incluir una memoria de acceso aleatorio (RAM), memoria de solo lectura (ROM), almacenamiento en disco duro, almacenamiento temporal, memoria no volátil, memoria flash, memoria óptica o cualquier otra memoria adecuada para almacenar objetos de software y/o instrucciones informáticas. La memoria 1908 puede incluir componentes de base de datos, componentes de código objeto, componentes de script o cualquier otro tipo de estructura de información para soportar las diversas actividades y estructuras de información descritas en la presente divulgación. La memoria 508 se puede conectar de forma comunicable al procesador 1906 a través del circuito de procesamiento 1904 y puede incluir un código informático para ejecutar (por ejemplo, por el procesador 1906) uno o más procesos descritos en este documento.

[0187] Todavía en referencia a la figura 23, se muestra que el controlador 1900 recibe entradas de un dispositivo de obtención de imágenes 100. El dispositivo de obtención de imágenes adquiere todos los datos de obtención de imágenes y los registra, junto con todos los metadatos que los describen. El dispositivo de generación de imágenes serializará entonces los datos en un flujo que puede ser leído por el controlador 1900. El flujo de datos puede acomodar cualquier tipo de flujo de datos binarios como el sistema de archivos, un RDBM o comunicaciones directas TCP/IP. Para el uso del flujo de datos, se muestra que el controlador 1900 incluye un desmezclador espectral 1910. El desmezclador espectral 1910 puede recibir datos de imagen de un dispositivo de obtención de imágenes 100 en el que realiza la desmezcla espectral para desmezclar una imagen que presenta varias longitudes de onda en canales discretos individuales para cada banda de longitudes de onda. Por ejemplo, los datos de imagen pueden “desmezclarse" en canales separados para cada uno de los diversos fluoróforos usados para identificar células o proteínas de interés en la muestra de tejido. El fluoróforo, solo a modo de ejemplo, puede ser uno o más del grupo que consiste en DAPI, Cy® 2, Cy® 3, Cy® 3,5, Cy® 5, FITC, TRITC, un colorante 488, un colorante 555, un colorante 594 y Texas Red. En un ejemplo, uno de los canales puede incluir datos de imagen que caen dentro de una banda predeterminada que rodea una longitud de onda de 461 nm (la longitud de onda de emisión máxima para DAPI), para identificar núcleos en la imagen. Otros canales pueden incluir datos de imagen para diferentes longitudes de onda para identificar diferentes porciones de la muestra de tejido utilizando diferentes fluoróforos.

[0188] También se muestra que el controlador 1900 incluye varios enmascaradores, como el enmascarador de células 1912, el enmascarador de área de subconjunto 1916 y el enmascarador de biomarcadores 1922. Estos u otros enmascaradores que pueden incluirse en el controlador 1900 en otras formas de realización se utilizan para recibir una señal desmezclada del desmezclador espectral 1910 y crear una máscara para la célula o área de interés en particular, dependiendo del fluoróforo utilizado para identificar ciertas características de interés en la muestra de tejido. Para crear una máscara, los enmascaradores (tales como el enmascarador de células 1912, el enmascarador de área de subconjunto 1916 y el enmascarador de biomarcadores 1922) reciben datos de imagen relacionados con la intensidad de cada píxel en el campo de visión. La intensidad de los píxeles es directamente proporcional a la cantidad de fluorescencia emitida por la muestra que, a su vez, es directamente proporcional a la cantidad de biomarcador de proteína en la muestra (cuando se usa un fluoróforo para identificar un biomarcador en particular). Se puede establecer un umbral absoluto en función de los valores que existen en los píxeles de la imagen. Todos los píxeles que sean mayores o iguales al valor de umbral se asignarán a 1.0, o "activados", y todos los demás píxeles se asignarán a 0.0 o "desactivados". De esta manera, se crea una máscara binaria para identificar la porción de célula o tejido de interés en el campo de visión. En otras formas de realización, se crea una máscara utilizando un límite inferior en el que todos los píxeles con una intensidad igual o superior a un límite inferior se aceptan y se utilizan como valor de píxel para la máscara. Si la intensidad está por debajo del límite inferior, el valor de píxel se establece en 0.0 o "desactivado".

En el diagrama de flujo de ejemplo para el enmascaramiento que se muestra en la figura 26, se muestra que los canales de DAPI y colorante 488 (u otro fluoróforo para identificar núcleos y áreas tumorales, respectivamente) utilizan el protocolo del límite inferior (pasos 2210, 2212, 2220, 2222), mientras que el canal de Cy5 (u otro fluoróforo para identificar un biomarcador de interés) utiliza un protocolo de valor umbral (paso 2230), para proporcionar la salida de la máscara. En asociación con el protocolo de límite inferior, también hay un paso de histograma para determinar el límite inferior. En particular, umbral de histograma (paso 2212, 2222) produce un umbral de una imagen de entrada pero usa una escala móvil para determinar el punto en el que se produce el umbral. Las entradas son la imagen actual y un porcentaje de umbral definido por el usuario. Este último se utiliza para determinar a qué porcentaje de la intensidad total debe establecerse el nivel de umbral. En primer lugar, la intensidad de cada píxel se suma a una intensidad total. El porcentaje de umbral se multiplica por esta intensidad total para obtener una suma de corte. Finalmente, todos los píxeles se agrupan por intensidad (en un histograma) y sus intensidades se suman de menor a mayor (bin por bin) hasta que se alcanza la suma de corte. La última intensidad de píxel más alta visitada en el proceso es el umbral de la imagen actual. Todos los píxeles con intensidades superiores a ese valor tienen sus intensidades establecidas al máximo, mientras que todos los demás están configurados al mínimo.

[0189] Los pasos identificados como pasos 2214, 2216, 2224, 2226, 2228, 2232, 2234, 2236 en la FIG. 26 representan pasos intermedios que ocurren en los enmascaradores iniciales, como el enmascarador celular 1912 (pasos 2214, 2216), el enmascarador de área de subconjunto 1916 (pasos 2224, 2226, 2228) y el enmascarador de biomarcadores 1922 (pasos 2232, 2234, 2236). Estos pasos se definen de la siguiente manera:

[0190] Dilatar aumenta el área de las zonas más brillantes de una imagen. Se necesitan dos entradas para dilatar. La primera es la imagen actual implícita y la segunda es el número de iteraciones para dilatar. Se supone que solo se utilizan imágenes binarias para la primera entrada. El procedimiento se realizará en imágenes continuas, pero la salida no será un dilatar válido. El procedimiento de dilatar comienza encontrando primero la máxima intensidad de píxeles en la imagen. Posteriormente, cada píxel de la imagen se examina una vez. Si el píxel a examen tiene una intensidad igual a la intensidad máxima, ese píxel se dibujará en la imagen de salida como un círculo con radio de iteraciones y centrado en el píxel original. Todos los píxeles de ese círculo tendrán una intensidad igual a la intensidad máxima. Todos los demás píxeles se copian en la imagen de salida sin modificaciones.

[0191] El procedimiento llenar agujeros llenará las zonas "vacías" de una imagen con píxeles a la máxima intensidad. Estas zonas vacías son aquellas que tienen una intensidad mínima y cuya área de píxeles (tamaño) es la especificada por el usuario. La imagen actual y el tamaño son las dos entradas necesarias. Al igual que dilatar, este procedimiento solo debe aplicarse a imágenes binarias.

[0192] Erosionar procesa imágenes de la misma manera que dilatar. Toda la funcionalidad es la misma que dilatar excepto en que el primer paso determina la intensidad mínima en la imagen, solo se alteran los píxeles que coinciden con la intensidad más baja, y los círculos utilizados para aumentar la intensidad de los píxeles de intensidad mínima encontrados se rellenan con el valor de intensidad más bajo. Al igual que dilatar, este procedimiento solo debe aplicarse a imágenes binarias.

[0193] Eliminar objetos. Se esperan dos entradas: la imagen actual y el tamaño del objeto. Eliminar objetos es lo contrario del procedimiento llenar agujeros. Cualquier zona que contenga solo píxeles con la máxima intensidad que llene un área menor que la entrada tamaño del objeto se ajustará a la intensidad mínima y, por tanto, se "eliminará". Este procedimiento solo debe aplicarse a imágenes binarias; la aplicación a imágenes continuas puede producir resultados inesperados.

[0194] Las salidas obtenidas en los pasos 2218, 2229 y 2238 son la máscara de células resultante, la máscara de subconjunto (o, en este ejemplo particular, la máscara de área tumoral) y la máscara de células de biomarcador, respectivamente. La figura 26 describe además las combinaciones de estas máscaras resultantes para obtener la información de área relevante para la puntuación de PBP. Estas combinaciones se describen a continuación con referencia a los enmascaradores de combinación del controlador 1900, representados en la figura 23.

[0195] Se muestra que el controlador 1900 incluye enmascaradores de combinación, como el enmascarador de células de subconjunto 1918, el enmascarador de células que no son de subconjunto 1920 y el enmascarador de combinación 1930. En algunas formas de realización, las células de subconjunto identificadas por el enmascarador 1918 y las células que no forman parte del subconjunto identificadas por el enmascarador 1920 son células tumorales y células no tumorales, respectivamente. En algunas de tales formas de realización, el enmascarador de células de subconjunto 1918 es un enmascarador tumoral y el enmascarador de células que no forman parte del subconjunto 1920 es un enmascarador no tumoral. El enmascarador de células de subconjunto realiza una operación Y, como se muestra en el paso 2252 de la figura 26, para combinar la salida del enmascarador de células 1912 (representativo de todas las células en la imagen) con la salida del enmascarador de área de subconjunto 1916. Por consiguiente, el enmascarador de células de subconjunto genera una máscara de todas las células de subconjunto en la imagen. Esta misma combinación, al usar una operación Fuera realizada por el enmascarador 1920 de células que no forman parte del subconjunto como se muestra en el paso 2254 en la figura 26, se genera una máscara de todas las células que no pertenecen a un subconjunto en la imagen de muestra.

[0196] El enmascarador de combinación 1930 está configurado para combinar dos máscaras de entrada. Como se muestra en la figura 26, el enmascarador de combinación 1930 combina la máscara de biomarcador con una máscara de células de subconjunto (del enmascarador de células de subconjunto 1918) o una máscara de células que no son de subconjunto (del enmascarador de células que no son de subconjunto 1920), o tanto máscara de biomarcador máscara de subconjunto como máscara de biomarcador máscara de no subconjunto. Las líneas de puntos representan que una o ambas máscaras celulares pueden combinarse con la máscara de biomarcador en el enmascarador combinado 1930. El resultado del enmascarador combinado 1930 es una máscara representativa de todos los subconjuntos de células positivas para el biomarcador y/o todas células que no pertenecen a un subconjunto que son positivas para el biomarcador. El enmascarador de combinación 1930 puede combinar las máscaras de una manera alternativa de modo que el resultado del enmascarador de combinación 1930 sea una máscara representativa de un subconjunto de células que no son positivas para el biomarcador (es decir, negativas para el biomarcador). Si las células de interés no están relacionadas específicamente con el subconjunto, por ejemplo, tumorales o no tumorales, sino que son todas las células, entonces la máscara positiva para el biomarcador no se combina con ninguna máscara adicional y pasa a través del enmascarador de combinación 1930 sin ninguna modificación.

[0197] Para calcular puntuación de % de de positividad del biomarcador (PBP), el área de la máscara positiva para el biomarcador o de la máscara negativa para el biomarcador (en cuyo caso la puntuación representa la negatividad del biomarcador) de la célula de subconjunto seleccionada (por ejemplo, todas, tumorales o no tumorales) se determina en píxeles en el evaluador de área 1932. El área total de todas las células seleccionadas (positivas y no positivas para el biomarcador), se determina en píxeles en el evaluador de área 1932. Las líneas de puntos que terminan en el evaluador de área 1932 indican que las entradas de área total pueden ser una o más de la máscara de todas las células, la máscara de células de subconjunto y la máscara de células que no son de subconjunto, que se calculará por separado. Se determina un porcentaje de puntuación de positividad para biomarcadores en la calculadora de positividad 1936. En una forma de realización, la puntuación de BPB se calcula dividiendo el área de la máscara de de células positivas para el biomarcador seleccionada del evaluador de área 1932 por el área de la máscara de todas las células seleccionadas del evaluador de áreas 1932 y multiplicándola 100. En una forma de realización, la ecuación ejecutada por la calculadora de interacción 1936 es:

AP

BPB = x 100

A a

donde Ap es un área positiva para el biomarcador para el tipo seleccionado de subconjunto celular (por ejemplo, todas, tumorales o no tumorales) y Aa es el área total de todas las células del tipo de célula seleccionado (todas, tumorales, no tumorales). En algunas formas de realización, An reemplaza a Ap en la ecuación anterior, donde Ab es un área negativa para el biomarcador para el tipo de célula seleccionado (por ejemplo, todas, tumorales o no tumorales), para determinar una puntuación representativa del porcentaje de negatividad a biomarcadores para el tipo de subconjunto celular.

[0198] El procedimiento Y se basa en una operación Y binaria, pero difiere de manera significativa. Y acepta la imagen actual y un usuario seleccionado como resultado. La salida es una imagen creada al realizar una multiplicación de las intensidades normalizadas de píxeles coincidentes de las dos imágenes de entrada. En algunos casos, los datos de intensidad de la imagen ya están normalizados. Por lo tanto, el procedimiento Y es simplemente una multiplicación por píxeles de las dos imágenes. Las dos entradas necesarias para Fuera son la imagen actual y un resultado seleccionado por el usuario. Fuera elimina la segunda imagen de la primera según la fórmula A * (1 - B/Bmax) donde A es la imagen actual, B la imagen seleccionada por el usuario para eliminar y Bmax es la intensidad máxima de B. Nótese que la división de B por Bmax normaliza B.

[0199] En algunas formas de realización, se proporciona un sistema de obtención de imágenes para derivar un valor de % de positividad del biomarcador (PBP) para todas las células u, opcionalmente, uno o más subconjuntos de las mismas, presentes en un campo de visión de una muestra de tejido procedente de un paciente con cáncer, donde el sistema de obtención de imágenes comprende un aparato de obtención de imágenes que comprende una plataforma para colocar la muestra en un campo de obtención de imágenes, una fuente de radiación electromagnética para dirigir la radiación electromagnética hacia la muestra y un detector configurado para detectar radiación electromagnética de la muestra, y un controlador. El controlador comprende una interfaz de usuario para intercambiar información entre un operador y el sistema de control electrónico y un circuito de procesamiento configurado para ejecutar instrucciones almacenadas en un medio legible por ordenador. Las instrucciones hacen que el sistema de control electrónico del sistema de obtención de imágenes: (i) reciba información sobre la radiación electromagnética detectada del aparato de obtención de imágenes; (ii) genere datos de imagen basados en la radiación electromagnética detectada; y (iii) analice los datos de imagen para derivar un valor de PBP para todas las células u, opcionalmente, uno o más subconjuntos de las mismas presentes en un campo de visión.

[0200] En algunas formas de realización, el análisis de los datos comprende:

(i) generar una imagen de primeras señales de fluorescencia representativas de los núcleos de todas las células presentes en un campo de visión y dilatar las primeras señales de fluorescencia a un diámetro del de una célula completa para construir una primera máscara de todas las células presentes en el campo de visión; (ii) construir una segunda máscara de segundas señales de fluorescencia representativas de todas las áreas presentes en el campo de visión, que expresan un biomarcador de subconjunto;

(iii) opcionalmente, construir una tercera máscara de terceras señales de fluorescencia representativas de todas las áreas presentes en el campo de visión, que expresan un primer biomarcador de interés;

(iv) combinar dicha primera y segunda máscaras de una manera que proporcione una cuarta máscara que comprende señales de fluorescencia representativas de todas las células del campo de visión, que también expresan el biomarcador de subconjunto;

(v) opcionalmente, combinar dicha primera y tercera máscaras de una manera que proporcione una quinta máscara que comprende señales de fluorescencia representativas de un primer subconjunto de todas las células del campo de visión, que también expresan el primer biomarcador de interés;

(vi) derivar un valor de PBP para todas las células que expresan el biomarcador de subconjunto dividiendo el área total de la cuarta máscara por el área total de la primera máscara;

(vii) opcionalmente, combinar dicha cuarta y quinta máscaras de una manera que proporcione una sexta máscara que comprende señales de fluorescencia representativas del primer subconjunto de todas las células del campo de visión, que expresan el biomarcador de subconjunto y el primer biomarcador de interés; y (viii) opcionalmente, derivar un valor de PBP para el primer subconjunto de todas las células que expresan el biomarcador de subconjunto y el primer biomarcador de interés dividiendo el área total de la sexta máscara por el área total de la cuarta máscara.

[0201] En algunas formas de realización, el análisis de los datos comprende:

(i) generar una imagen de las primeras señales de fluorescencia representativas de los núcleos de todas las células presentes en un campo de visión y dilatar las primeras señales de fluorescencia a un diámetro del de una célula completa para construir una primera máscara de todas las células presentes en el campo de visión; (ii) construir una segunda máscara de segundas señales de fluorescencia representativas de todas las áreas presentes en el campo de visión, que expresan un biomarcador de subconjunto;

(iv) combinar dichas primera y segunda máscaras de una manera que proporcione una cuarta máscara que comprende señales de fluorescencia representativas de todas las células del campo de visión, que también expresan el biomarcador de subconjunto;

(v) opcionalmente, combinar dicha primera y tercera máscaras de una manera que proporcione una quinta máscara que comprende señales de fluorescencia representativas de todas las células del campo de visión, que también expresan el primer biomarcador de interés;

(vii) opcionalmente, combinar dicha cuarta y quinta máscaras de una manera que proporcione una sexta máscara que comprende señales de fluorescencia representativas de todas las células del campo de visión, que

(a) expresar el biomarcador de subconjunto y el primer biomarcador de interés; o

(b) expresar el biomarcador de subconjunto en ausencia del primer biomarcador de interés; y

(viii) opcionalmente, derivar un valor de PBP para el primer subconjunto de todas las células que (a) expresan el biomarcador de subconjunto y el primer biomarcador de interés o (b) expresan el biomarcador de subconjunto en ausencia del primer biomarcador de interés, dividiendo el área total de la sexta máscara por el área total de la cuarta máscara.

[0202] En algunas formas de realización, los pasos opcionales no se realizan. En algunas formas de realización, se realizan todos los pasos opcionales enumerados. En algunas formas de realización, el área total se mide en píxeles. En algunas formas de realización, el área total de la cuarta máscara y el área total de la primera máscara se miden cada una en píxeles. En algunas formas de realización, el área total de la sexta máscara y el área total de la cuarta máscara se miden cada una en píxeles. En algunas formas de realización, el área total de la primera máscara, el área total de la cuarta máscara y el área total de la sexta máscara se miden cada una en píxeles. En algunas formas de realización, un píxel tiene 0,5 |_im de ancho.

[0203] En algunas formas de realización, el análisis de los datos comprende además:

(ix) construir una séptima máscara de cuartas señales de fluorescencia representativas de todas las áreas presentes en el campo de visión, que expresan un segundo biomarcador de interés;

(x) combinar dichas primera y séptima máscaras de una manera que proporcione una octava máscara que comprende señales de fluorescencia representativas de un segundo subconjunto de todas las células del campo de visión, que también expresan el segundo biomarcador de interés;

(xi) combinar dicha cuarta y octava máscaras de una manera que proporcione una novena máscara que comprende señales de fluorescencia representativas del segundo subconjunto de todas las células del campo de visión, que expresan el biomarcador de subconjunto y el segundo biomarcador de interés; y

(xii) derivar un valor de PBP para el segundo subconjunto de todas las células que expresan el biomarcador de subconjunto y el segundo biomarcador de interés dividiendo el área total de la novena máscara por el área total de la cuarta máscara.

[0204] En algunas formas de realización, el área total se mide en píxeles. En algunas formas de realización, el área total de la novena máscara y el área total de la cuarta máscara se miden cada una en píxeles. En algunas formas de realización, un píxel tiene 0,5 |_im de ancho. En algunas formas de realización, el análisis de los datos comprende además:

(x) restar dicha segunda máscara de dicha primera máscara de una manera que proporcione una octava máscara que comprende señales de fluorescencia representativas de todas las células que no expresan el biomarcador de subconjunto en el campo de visión;

(xi) combinar dicha séptima y octava máscaras de una manera que proporcione una novena máscara que comprende señales de fluorescencia representativas de todas las células que expresan el segundo biomarcador de interés pero que no expresan el biomarcador de subconjunto en el campo de visión; y (xii) derivar un valor de PBP para todas las células que expresan el segundo biomarcador de interés pero no expresan el biomarcador de subconjunto dividiendo el área total de la novena máscara por el área total de la octava máscara.

[0205] En algunas formas de realización, el método comprende además:

(x) combinar dicha sexta y séptima máscaras de una manera que proporcione una octava máscara que comprende señales de fluorescencia representativas de todas las células que

(a) expresan el biomarcador de subconjunto, el primer biomarcador de interés y el segundo biomarcador de interés en el campo de visión;

(b) expresan el biomarcador de subconjunto y el primer biomarcador de interés en ausencia del segundo biomarcador de interés en el campo de visión; o

(c) expresan el biomarcador de subconjunto y el segundo biomarcador de interés en ausencia del primer biomarcador de interés en el campo de visión; y

(xii) derivar un valor de PBP para todas las células que expresan el primer biomarcador de interés o el segundo biomarcador de interés, o una combinación de los mismos, así como el biomarcador de subconjunto, dividiendo el área total de la octava máscara por el área total de la cuarta máscara.

En algunas formas de realización, el método comprende además ciclos adicionales de pasos análogos a los pasos (ix), (x) y (xii) con respecto a uno o más biomarcadores adicionales de interés (por ejemplo, un tercer biomarcador de interés).

[0206] En algunas formas de realización, el área total se mide en píxeles. En algunas formas de realización, el área total de la novena máscara y el área total de la octava máscara se miden cada una en píxeles. En algunas formas de realización, un píxel tiene 0,5 |_im de ancho.

[0207] En otro aspecto, se proporcionan métodos para derivar un valor de % de positividad del biomarcador (PBP) para todas las células tumorales presentes en un campo de visión, que comprenden:

(i) generar una imagen de las primeras señales de fluorescencia representativas de los núcleos de todas las células presentes en un campo de visión y dilatar las primeras señales de fluorescencia a un diámetro del de una célula completa para construir una primera máscara de todas las células presentes en el campo de visión; (ii) construir una segunda máscara de segundas señales de fluorescencia representativas de todas las áreas presentes en el campo de visión, que expresan un biomarcador tumoral;

(iii) combinar dicha primera y segunda máscaras de una manera que proporcione una tercera máscara que comprende señales de fluorescencia representativas de todas las células tumorales en el campo de visión; (iv) construir una cuarta máscara de terceras señales de fluorescencia representativas de todas las áreas presentes en el campo de visión, que expresan un biomarcador de interés;

(v) combinar dicha tercera y cuarta máscaras de una manera que proporcione una quinta máscara que comprende señales de fluorescencia representativas de todas las células tumorales en el campo de visión, que también expresan el biomarcador de interés; y

(vi) derivar un valor de PBP para todas las células tumorales que expresan el biomarcador de interés dividiendo el área total de la quinta máscara por el área total de la tercera máscara.

[0208] En algunas formas de realización, el área total se mide en píxeles. En algunas formas de realización, el área total de la quinta máscara y el área total de la tercera máscara se miden cada una en píxeles. En algunas formas de realización, un píxel tiene 0,5 |_im de ancho. En algunas formas de realización, el biomarcador de interés comprende un biomarcador seleccionado del grupo que consiste en PD-L1, Galectina 9 y MHC. En algunas formas de realización, el biomarcador de interés comprende PD-L1. En algunas formas de realización, el biomarcador de interés comprende Galectina 9. En algunas formas de realización, el biomarcador de interés comprende MHC. En algunas formas de realización, el campo de visión comprende además células no tumorales. En algunas formas de realización, las células no tumorales comprenden células inmunes y células estromales.

[0209] En otro aspecto, se proporcionan métodos para derivar un valor de % de positividad del biomarcador (PBP) para todas las células no tumorales presentes en un campo de visión, que comprenden:

(iii) restar dicha segunda máscara de dicha primera máscara de una manera que proporcione una tercera máscara que comprende señales de fluorescencia representativas de todas las células no tumorales en el campo de visión;

(iv) construir una cuarta máscara de señales de fluorescencia representativas de todas las áreas presentes en el campo de visión, que expresan un biomarcador de interés;

(v) combinar dicha tercera y cuarta máscaras de una manera que proporcione una quinta máscara que comprende señales de fluorescencia representativas de todas las células no tumorales en el campo de visión, que también expresan el biomarcador de interés; y

(vi) derivar un valor de PBP para todas las células no tumorales que expresan el biomarcador de interés dividiendo el área total de la quinta máscara por el área total de la tercera máscara.

[0210] En algunas formas de realización, el primer subconjunto de todas las células del campo de visión comprende células tumorales. En algunas formas de realización, el primer subconjunto de todas las células del campo de visión comprende células no tumorales. En algunas formas de realización, el primer subconjunto de todas las células del campo de visión comprende células tumorales y no tumorales.

[0211] En algunas formas de realización, un subconjunto de células y un no subconjunto de células corresponde a células tumorales y células no tumorales, respectivamente o viceversa. En algunas formas de realización, un subconjunto de células y un no subconjunto de células corresponde a células viables y células no viables, respectivamente o viceversa. En algunas formas de realización, un subconjunto de células es un subconjunto de células viables y un no subconjunto de células consiste en las células viables no incluidas en el subconjunto de células viables. En algunas formas de realización, un subconjunto de células y un no subconjunto de células corresponde a linfocitos T y células no T, respectivamente o viceversa. En algunas formas de realización, un subconjunto de células y un no subconjunto de células corresponde a células mieloides y células no mieloides, respectivamente o viceversa.

[0212] En algunas formas de realización, el primer subconjunto de todas las células del campo de visión comprende linfocitos T. En algunas formas de realización, los linfocitos T expresan CD3. En algunas formas de realización, los linfocitos T expresan CD8. En algunas formas de realización, los linfocitos T expresan CD4.

[0213] En algunas formas de realización, el primer subconjunto de todas las células del campo de visión comprende células mieloides. En formas de realización adicionales, las células mieloides son células supresoras derivadas de mieloides. En formas de realización adicionales, las células mieloides son macrófagos asociados a tumores. En algunas formas de realización, el biomarcador de subconjunto se expresa solo en células tumorales. En algunas formas de realización, el biomarcador de subconjunto se expresa solo en células no tumorales. En algunas formas de realización, el biomarcador de subconjunto se expresa en linfocitos T. En algunas formas de realización, el biomarcador de subconjunto comprende CD3. En algunas formas de realización, el biomarcador de subconjunto comprende CD19. En algunas formas de realización, el biomarcador de subconjunto se expresa en células mieloides. En algunas formas de realización, el biomarcador de subconjunto se expresa en células supresoras derivadas de mieloides. En algunas formas de realización, el biomarcador de subconjunto se expresa en macrófagos asociados a tumores. En algunas formas de realización, el primer biomarcador de interés comprende Ki67 y dicho primer subconjunto de todas las células del campo de visión comprende células positivas para CD8.

[0214] En algunas formas de realización, el primer biomarcador de interés comprende un biomarcador seleccionado del grupo que consiste en CD11b, CD33, HLA-DR, IDO-1, ARG1, granzima B, PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4 , HLA-DR, Galectina 9, CD80, CD86, 4.1BBL, ICOSL, CD40, OX40L, IDO-1, GITRL, PD-1, TIM3, LAG3, 41BB, OX40, CTLA-4, CD40L, CD28, GITR, ICOS , CD28, CD3, CD4, CD8, FoxP3, CD25, CD16, CD56, CD68, CD163, CD80 y CD86. En algunas formas de realización, el primer biomarcador de interés comprende un biomarcador seleccionado del grupo que consiste en PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4, HLA-DR, Galectina 9, CD80, CD86, 4.1BBL, ICOSL, CD40, OX40L, IDO-1, GITRL, ICOS, CD28, CD4, CD8, FoxP3, CD25, CD16, CD56, CD68, CD163, CD80 y CD86. En algunas formas de realización, el primer biomarcador de interés comprende un biomarcador seleccionado del grupo que consiste en PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4, HLA-DR, Galectina 9, CD80, CD86, 4.1BBL, ICOSL, CD40, OX40L, IDO-1 y GITRL. En algunas formas de realización, el primer biomarcador de interés comprende un biomarcador seleccionado del grupo que consiste en PD-L1, Galectina 9 y MHC. En algunas formas de realización, el primer biomarcador de interés comprende PD-L1.

[0215] En algunas formas de realización, el segundo biomarcador de interés comprende un biomarcador seleccionado de entre PD-1, TIM-3 y TCR. En algunas formas de realización, el segundo biomarcador de interés comprende PD-1.

[0216] En algunas formas de realización, el primer biomarcador de interés y el segundo biomarcador de interés son diferentes entre sí y comprenden un biomarcador seleccionado del grupo que consiste en PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4, HLA-DR, Galectina 9, CD80, CD86, 4.1BBL, ICOSL, CD40, OX40L, IDO-1, GITRL, ICOS, CD28, CD3, CD4, CD8, FoxP3, CD25, CD16, CD56, CD68, CD163, CD80 y CD86. En algunas formas de realización, el primer biomarcador de interés y el segundo biomarcador de interés son diferentes entre sí y comprenden un biomarcador seleccionado del grupo que consiste en CD11b, CD33, HLA-DR, IDO-1, ARG1, granzima B, PD-L1 , PD-L2, B7-H3, B7-H4, HLA-DR, Galectina 9, CD80, CD86, 4.1BBL, ICOSL, CD40, OX40L, IDO-1, GITRL, ICOS, CD28, CD3, CD4, CD8, FoxP3 , CD25, CD16, CD56, CD68, CD163, CD80 y CD86.

[0217] En algunas formas de realización, el primer biomarcador de interés comprende un biomarcador seleccionado del grupo que consiste en PD-L1, PD-L2, B7-H3, B7-H4, HLA-DR, Galectina 9, CD80, CD86, 4.1BBL, ICOSL, CD40, OX40L, IDO-1, GITRL, ICOS, CD28, CD4, CD8, FoxP3, CD25, CD16, CD56, CD68, CD163, CD80 y CD86; y el segundo biomarcador de interés comprende un biomarcador seleccionado de entre PD-1, TIM-3 y TCR. En algunas formas de realización, el primer biomarcador de interés comprende PD-L1 y el segundo biomarcador de interés comprende PD-1. En algunas formas de realización, el primer biomarcador de interés comprende PD-L1 y el segundo biomarcador de interés comprende CD80. En algunas formas de realización, el primer biomarcador de interés comprende CTLA-4 y el segundo biomarcador de interés comprende CD80. En algunas formas de realización, el primer biomarcador de interés comprende PD-L2 y el segundo biomarcador de interés comprende PD-1. En algunas formas de realización, el primer biomarcador de interés comprende CTLA-4 y el segundo biomarcador de interés comprende CD86. En algunas formas de realización, el primer biomarcador de interés comprende LAG-3 y el segundo biomarcador de interés comprende HLA-DR. En algunas formas de realización, el primer biomarcador de interés comprende TIM-3 y el segundo biomarcador de interés comprende Galectina 9. En algunas formas de realización, el primer biomarcador de interés comprende 41BB y el segundo biomarcador de interés comprende 4.1BBL. En algunas formas de realización, el primer biomarcador de interés comprende OX40 y el segundo biomarcador de interés comprende OX40L. En algunas formas de realización, el primer biomarcador de interés comprende CD40 y el segundo biomarcador de interés comprende CD40L. En algunas formas de realización, el primer biomarcador de interés comprende ICOS y el segundo biomarcador de interés comprende ICOSL. En algunas formas de realización, el primer biomarcador de interés comprende GITR y el segundo biomarcador de interés comprende GITRL. En algunas formas de realización, el primer biomarcador de interés comprende HLA-DR y el segundo biomarcador de interés comprende TCR. En algunas formas de realización, el primer biomarcador de interés comprende CD25 y el segundo biomarcador de interés comprende FoxP3. En algunas formas de realización, el primer biomarcador de interés comprende CD4 y el segundo biomarcador de interés comprende CD8. En algunas formas de realización, el primer biomarcador de interés comprende CD3 y el segundo biomarcador de interés comprende PD-1. En algunas formas de realización, el primer biomarcador de interés comprende CD56 y el segundo biomarcador de interés comprende CD16. En algunas formas de realización, el primer biomarcador de interés comprende HLA-DR y el segundo biomarcador de interés comprende IDO-1. En algunas formas de realización, el primer biomarcador de interés comprende CD33 y el segundo biomarcador de interés comprende ARG1.

[0218] En algunas formas de realización, el biomarcador de subconjunto solo se expresa en células tumorales. En algunas formas de realización, el biomarcador de subconjunto se expresa solo en células no tumorales. En algunas formas de realización, el biomarcador de subconjunto se expresa en linfocitos T. En algunas formas de realización, el biomarcador de subconjunto comprende CD3. En algunas formas de realización, el biomarcador de subconjunto comprende CD19. En algunas formas de realización, el biomarcador de subconjunto comprende CD45. En algunas formas de realización, el biomarcador de subconjunto se expresa en células mieloides. En algunas formas de realización, el biomarcador de subconjunto comprende CD11b.

[0219] En algunas formas de realización, el primer biomarcador de interés comprende Ki67 y el primer subconjunto de todas las células del campo de visión comprende células CD8 positivas.

[0220] En algunas formas de realización, las células no tumorales comprenden células inmunes y células estromales. En algunas formas de realización, las células no tumorales comprenden células mieloides.

[0221] En algunas formas de realización, las señales de fluorescencia provienen de cuatro marcadores de fluorescencia, cada uno específico para un biomarcador diferente. En formas de realización adicionales, un primer marcador de fluorescencia está asociado con el primer biomarcador de interés, un segundo marcador de fluorescencia está asociado con el segundo biomarcador de interés, un tercer marcador de fluorescencia está asociado con un tercer biomarcador de interés y un cuarto marcador de fluorescencia está asociado con un cuarto biomarcador de interés. En algunas formas de realización, el primer biomarcador de interés comprende un marcador tumoral y no tumoral. En algunas formas de realización, el segundo biomarcador de interés comprende un marcador no tumoral. En algunas formas de realización, el primer biomarcador de interés comprende un marcador tumoral y no tumoral, y el segundo biomarcador de interés comprende un marcador no tumoral. En algunas formas de realización, todas las células expresan el tercer biomarcador de interés. En algunas formas de realización, el cuarto biomarcador de interés se expresa solo en células tumorales. En algunas formas de realización, el tercer biomarcador de interés es expresado por todas las células y el cuarto biomarcador de interés se expresa solo en células tumorales. En algunas formas de realización, el cuarto biomarcador de interés es el biomarcador de subconjunto. En algunas formas de realización, el tercer biomarcador de interés es expresado por todas las células y el cuarto biomarcador de interés es el biomarcador de subconjunto. En algunas formas de realización, uno o más marcadores de fluorescencia comprenden un fluoróforo conjugado con un anticuerpo que tiene afinidad de unión por un biomarcador específico u otro anticuerpo. En algunas formas de realización, uno o más marcadores de fluorescencia son fluoróforos con afinidad por un biomarcador específico.

[0222] En otro aspecto, se describen métodos que utilizan un sistema que comprende un dispositivo de obtención de imágenes y un controlador para derivar un valor de % de positividad del biomarcador (PBP) para todas las células u, opcionalmente, uno o más subconjuntos de estas presentes en un campo de visión de una muestra de tejido de un paciente con cáncer que se utilizan en métodos de tratamiento del cáncer en el paciente.

En algunas formas de realización, en el presente documento se describen métodos que utilizan un sistema que comprende un dispositivo de obtención de imágenes y un controlador para tratar el cáncer en un paciente que lo necesite, donde el método comprende derivar un valor del % de positividad del biomarcador (PBP) para todas las células u, opcionalmente, uno o más subconjuntos de estas presentes en un campo de visión de una muestra de tejido del paciente. En algunas formas de realización, el paso de derivación es como se describe en el presente documento.

[0223] En algunas formas de realización, en el presente documento se describen métodos para derivar un valor de % de positividad de un biomarcador (PBP) para todas las células u, opcionalmente, uno o más subconjuntos de las mismas presentes en un campo de visión de una muestra de tejido que comprenden: (i) usar un sistema de obtención de imágenes para obtener datos de imagen para la muestra de tejido procedente de un paciente con cáncer, donde el sistema de obtención de imágenes comprende: una carcasa que comprende una plataforma para colocar la muestra en un campo de imagen, una fuente de radiación electromagnética para dirigir la radiación electromagnética hacia la muestra y un detector para recolectar la salida de radiación electromagnética; y un sistema de control electrónico que comprende una memoria y un circuito de procesamiento que tiene módulos de procesamiento de imágenes; y (ii) analizar, usando los módulos de procesamiento de imágenes, los datos de imagen para derivar el PBP para todas las células u, opcionalmente, uno o más subconjuntos de estas presentes en un campo de visión. En algunas formas de realización, los métodos para derivar un valor de PBP para todas las células u, opcionalmente, uno o más subconjuntos de las mismas presentes en un campo de visión de una muestra de tejido se usan como parte de métodos para monitorear el progreso de un paciente diagnosticado con cáncer y tratado con inmunoterapia. En algunas formas de realización, los métodos para derivar un valor de PBP para todas las células u, opcionalmente, uno o más subconjuntos de las mismas presentes en un campo de visión de una muestra de tejido se usan como parte de métodos para monitorear la modulación de células inmunes de un paciente diagnosticado con cáncer y tratado con inmunoterapia.

EJEMPLOS

Ejemplo 16. Preparación de las muestras, obtención de imágenes y análisis de imágenes para muestras de tejido de melanoma de pacientes humanos

[0224] Preparación de las muestras. Se desparafinaron muestras de tejido fijadas con formalina e incluidas en parafina (FFPE). A continuación, los portaobjetos se rehidrataron mediante una serie de lavados de xileno a alcohol antes de incubarlos en agua destilada. A continuación, se realizó la recuperación de antígenos inducida por calor usando condiciones de presión y temperatura elevadas, se dejaron enfriar y se transfirieron a solución salina con pH regulado con Tris. Luego se realizó la tinción, para la cual se llevaron a cabo los siguientes pasos. Primero, se bloqueó la peroxidasa endógena y luego se realizó una incubación con una solución de bloqueo de proteínas para reducir la tinción de anticuerpos inespecíficos. A continuación, los portaobjetos se tiñeron con un anticuerpo primario anti-PD1 de ratón. A continuación, se lavaron los portaobjetos antes de la incubación con un anticuerpo secundario anti-HRP de ratón. Los portaobjetos se lavaron y luego se detectó la tinción de PD-1 usando TSA+ Cy® 3.5 (Perkin Elmer). A continuación, se neutralizó cualquier HRP residual usando dos lavados con 100 mM de benzhidrazida recién preparada con 50 mM de peróxido de hidrógeno. Los portaobjetos se lavaron de nuevo antes de la tinción con un anticuerpo primario anti-PD-Ll de conejo. Los portaobjetos se lavaron y luego se incubaron con un cóctel de anticuerpos secundarios anti-conejo HRP más anti-SlOO de ratón marcados directamente con colorante 488 y 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Los portaobjetos se lavaron y luego se detectó la tinción de PD-L1 usando TSA-Cy® 5 (Perkin Elmer). Los portaobjetos se lavaron por última vez antes de cubrirlos con un cubreobjetos y medio de montaje y se dejaron secar durante la noche a temperatura ambiente. En la FIG 23 se muestra una descripción esquemática de los anticuerpos y reactivos de detección.

[0225] Imágenes y análisis de las muestras. A continuación, se adquirieron imágenes de fluorescencia utilizando el sistema de análisis de portaobjetos inteligente Vectra 2 utilizando el software Vectra versión 2.0.8 (Perkin Elmer). En primer lugar, se obtuvieron imágenes monocromáticas del portaobjetos con un aumento de 4x utilizando DAPI. Se utilizó un algoritmo automatizado (desarrollado con inForm) para identificar las áreas del portaobjetos que contenían tejido.

[0226] Se tomaron imágenes de las áreas del portaobjetos que se identificó que contenían tejido con un aumento de 4x para los canales asociados con DAPI (azul), FITC (verde) y Cy® 5 (rojo) para crear imágenes RGB. Estas imágenes con aumento de 4x se procesaron utilizando un algoritmo de enriquecimiento automático (desarrollado con inForm) en el selector de campo de visión 104 para identificar y clasificar los posibles campos de visión de aumento de 20x de acuerdo con la expresión de Cy® 5 más alta.

[0227] Se obtuvieron imágenes de los 40 campos de visión superiores con un aumento de 20x en las longitudes de onda de DAPI, FITC, Texas Red y Cy® 5. Las imágenes sin procesar se revisaron para verificar su aceptabilidad, y las imágenes que estaban desenfocadas, que carecían de células tumorales, que eran altamente necróticas o que contenían altos niveles de señal de fluorescencia no asociada con la localización esperada de anticuerpos (es decir, tinción de fondo) se rechazaron antes del análisis. Las imágenes aceptadas se procesaron usando AQUAduct (Perkin Elmer), en donde cada fluoróforo se desmezcló espectralmente por el desmezclador espectral 1910 en canales individuales y se guardó como un archivo separado.

[0228] Los archivos procesados se analizaron adicionalmente utilizando AQUAnalysis™ o mediante un proceso totalmente automatizado utilizando AQUAserve™. Los detalles fueron los siguientes.

[0229] Cada imagen de DAPI fue procesada por el enmascarador celular 1912 para identificar todos los núcleos celulares dentro de esa imagen (figura 7a), y luego dilatada 3 píxeles para representar el tamaño aproximado de una célula completa. Esta máscara resultante representaba todas las células dentro de esa imagen (figura 7b).

[0230] Se procesó S100 (marcador de células tumorales para melanoma) detectado con colorante 488 (figura 8a) por el enmascarador de subconjunto 1916 para crear una máscara binaria de toda el área tumoral dentro de esa imagen (figura 8b). La superposición entre esta máscara y la máscara de todas las células creó una nueva máscara para las células tumorales (figura 8c).

[0231] De manera similar, la ausencia del marcador de células tumorales en combinación con la máscara de todos los núcleos creó una nueva máscara para todas las células no tumorales (figura 8d), realizada por el enmascarador de células no tumorales 1920.

[0232] Cada imagen de Cy® 5 (figura 9a) fue procesada por el enmascarador de biomarcadores 1922 para crear una máscara binaria de todas las células que son positivas para PD-L1-(figura 9b). La superposición entre la máscara de todas las células tumorales y la máscara de todas las células positivas para PD-L1, utilizando el enmascarador combinado 1930, creó una nueva máscara de todas las células tumorales positivas para PD-L1 (figura 9c). De manera similar, la superposición entre la máscara de todas las células no tumorales y la máscara de todas las células positivas para PD-L1, utilizando el enmascarador de combinación 1930, creó una nueva máscara de todas las células no tumorales positivas para PD-L1 (figura 9d).

[0233] Cada imagen de Cy® 3.5 (figura 10a) se superpuso con la máscara de todas las células no tumorales para crear una máscara binaria de todas las células positivas para PD-1 (figura 10b).

[0234] El % de positividad del biomarcador (PBP) para todas las células tumorales que expresan PD-L1 se derivó, utilizando la calculadora de positividad 1936, dividiendo el área total, medida en píxeles y determinada por el evaluador de área 1932, de la máscara de todos los tumores positivos para PD-L1 células (figura 9c) por el área total, medida en píxeles y determinada por el evaluador de área 1932, de la máscara de todas las células tumorales (figura 8c). Los valores representativos de PBP para todas las células que expresan PD-L1 se muestran en la figura 27a (datos ordenados según expresión creciente).

[0235] El PBP para todas las células no tumorales que expresan PD-1 se obtuvo dividiendo el área total, medida en píxeles, de la máscara de todas las células no tumorales positivas para PD-1 (figura 10b) por el área total, medida en píxeles, de la máscara de todas las células no tumorales (figura 8d). Los valores representativos de PBP para todas las células no tumorales que expresan PD-1 se muestran en la figura 27b (datos ordenados según expresión creciente).

[0236] Las FIGS. 16 y 17 muestran ejemplos representativos de máscaras superpuestas que indican células positivas para PD-L1 (rojo), células positivas para PD-L (amarillo), células tumorales (S100, verde) y todas las células (DAPI, azul). La figura 16 indica fácilmente la presencia de células positivas para PD-L1 (rojo), células positivas para PD-1 (amarillo) y todas las células tumorales (verde). Por el contrario, para un paciente sin respuesta a la inmunoterapia, la máscara de la figura 17 indica la presencia de células tumorales (S100, verde) y todas las células (DAPI, azul), pero muestra pocas o ninguna célula positiva para PD-L1 (rojo) o células positivas para PD-1 (amarillo).

Ejemplo 17. Preparación de las muestras, obtención de imágenes y análisis de las imágenes obtenidas para muestras de tejido de carcinoma pulmonar no microcítico (NSCLC) de pacientes humanos.

[0237] Se realizaron procedimientos análogos a los del Ejemplo 15, sustituyendo el anticuerpo anti-S100 de ratón marcado directamente con el colorante 488 por un anticuerpo anti-pancitoqueratina de ratón marcado directamente con el colorante 488 para las muestras de tumores epiteliales. Los valores de PBP para PD-1 y PD-L1 se muestran en la figura 18. Un subconjunto de estos pacientes mostró altos niveles de interacción receptor-ligando similares a la supresión inmunológica.

Ejemplo 18. Comparación de técnicas de análisis

[0238] Para generar muestras de control, se cultivaron líneas celulares de linfoma con expresión previamente establecida de PD-L1 (Karpas 299) o falta de expresión (Ramos RA # 1) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A continuación, se contaron las células y se mezclaron las dos líneas celulares en porcentajes variables para generar una serie de bloques de sedimentos de líneas celulares FFPE que variaban en la expresión de PD-L1 del 0 al 100 %. A continuación, se utilizaron núcleos (600 |_im) de estas mezclas de líneas celulares, así como de resecciones de tejido de amígdalas normales, para crear una micromatriz de tejido (TMA). A continuación, se tiñó una sección de esta TMA, se tomaron imágenes y se puntuó el % de positividad de PD-L1 de cada núcleo utilizando AQUAnalysis™ (todos los pasos se describen en el Ejemplo 15) y los resultados se muestran en el eje Y de la figura 38, donde cada punto representa un solo núcleo (campo de visión único).

[0239] Alternativamente, las mismas imágenes se cuantificaron para detectar el % de expresión de PD-L1 usando un software basado en el recuento de células para comparar como sigue. Se utilizó DAPl para identificar primero cada núcleo celular y luego se creó un citoplasma morfológico alrededor de los núcleos celulares identificados. Se estableció un umbral de intensidad para identificar las células con expresión de PD-L1 en el citoplasma. El número total de células identificadas por encima de este umbral se dividió por el número total de células en la imagen para determinar el % de células positivas para PD-L1 en cada núcleo y los resultados se muestran en el eje X de la figura 28. En general, hubo un alto nivel de concordancia entre los dos métodos de recuento de células (R2 = 0,86, pendiente 1,1); sin embargo, hubo tres valores atípicos notables marcados como A, B, C en la figura 28 en los que el % de positividad de PD-L1 determinado por la puntuación AQUA® fue significativamente más alto que el del método de recuento de células. Los puntos A y B eran núcleos de líneas celulares donde el 100 % de las células eran Karpas299 y, por lo tanto, los valores determinados por la puntuación AQUA® estaban mucho más cerca de lo esperado y el método de recuento de células no pudo identificar el citoplasma de las células como positivo para PD-L1. De manera similar, en el punto C, la mezcla de células incluía un 40 % teórico de células Karpas299, donde el valor determinado por la puntuación AQUA® fue de nuevo mucho más cercano al esperado que el método de recuento de células. Estos resultados demostraron la superioridad de los métodos descritos en este documento frente al software basado en el recuento de células.

Ejemplo 19. Preparación de las muestras, obtención de imágenes y análisis de las imágenes obtenidas para muestras de tejido con células que expresan PD-L1 y células que expresan CD80.

[0240] Se realizan procedimientos análogos a los del Ejemplo 15, sustituyendo la tinción y el análisis de PD-1 por la tinción y el análisis de CD80.

Ejemplo 20. Preparación de las muestras, obtención de imágenes y análisis de las imágenes obtenidas para muestras de tejido con células que expresan CTLA-4 y células que expresan CD80.

[0241] Preparación de las muestras Las muestras de tejido incluidas en parafina fijadas con formalina (FFPE) se desparafinaron, se rehidrataron y la recuperación de antígenos se realizó en condiciones de temperatura elevada.

Luego se realizó la tinción, para la que se llevaron a cabo los siguientes pasos. Primero, los tejidos se sometieron a detección de la expresión de CTLA-4 usando 20 pares de sondas de hibridación que abarcan aproximadamente 1 kb del ARNm de CTLA-4 usando RNAScope® (Advanced Cell Diagnostics). La hibridación in situ se visualizó con TSA-Cy®3. Los portaobjetos se lavaron y luego se neutralizó cualquier HRP residual usando dos lavados de 100 mM de benzhidrazida recién preparada con 50 mM de peróxido de hidrógeno. Los portaobjetos se lavaron de nuevo antes de la tinción con un anticuerpo primario anti-CD80 de ratón. Los portaobjetos se lavaron y luego se incubaron con un anticuerpo secundario anti-HRP de ratón. Los portaobjetos se lavaron y luego se detectó la tinción de CD80 usando TSA-Cy® 5 (Perkin Elmer). A continuación, se neutralizó cualquier HRP residual usando dos lavados de 100 mM de benzhidrazida recién preparada con 50 mM de peróxido de hidrógeno. Los portaobjetos se lavaron de nuevo antes de la tinción con un anticuerpo primario anti-CD3 de conejo. Los portaobjetos se lavaron y luego se incubaron con un cóctel de anticuerpos secundarios anti-conejo HRP más 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Los portaobjetos se lavaron y luego se detectó la tinción de CD3 usando TSA-AlexaFluor488® (Life Technologies). Los portaobjetos se lavaron por última vez antes de cubrirlos con un cubreobjetos y medio de montaje y se dejaron secar durante la noche a temperatura ambiente.

[0242] Se realizaron procedimientos de obtención de imágenes y de análisis análogos a los del Ejemplo 1, obteniendo imágenes en las longitudes de onda de DAPI, FITC, Cy® 3 y Cy® 5. La expresión de CTLA-4 y CD80 se utilizó para desarrollar un algoritmo de enriquecimiento para adquirir imágenes de 20x. Se realizó un análisis para estudiar la prevalencia de CTLA-4 en linfocitos T positivos para CD3 y la expresión de CD80 en muestras tumorales tomadas de pacientes con melanoma metastásico. Los resultados se muestran en las FIGS. 44a y 44b.

Ejemplo 21. Preparación de las muestras, obtención de imágenes y análisis de las imágenes obtenidas para muestras de tejido con células que expresan PD-L2 y células que expresan PD-1.

[0243] Se realizan procedimientos análogos a los del Ejemplo 15, sustituyendo la tinción y el análisis de PD-L1 por la tinción y el análisis de PD-L2.

Ejemplo 22. Preparación de las muestras, obtención de imágenes y análisis de las imágenes obtenidas para muestras de tejido con células que expresan CTLA-4 y células que expresan CD86.

[0244] Se realizan procedimientos análogos a los del Ejemplo 15, sustituyendo la tinción y el análisis de PD-L1 y PD-1 por la tinción y el análisis de CTLA-4 y CD86.

Ejemplo 23. Preparación de las muestras, obtención de imágenes y análisis de las imágenes obtenidas para muestras de tejido con células que expresan LAG-3 y células que expresan HLA-DR.

[0245] Se realizan procedimientos análogos a los del Ejemplo 15, sustituyendo la tinción y el análisis de PD-L1 y PD-1 por la tinción y el análisis de LAG-3 y HLA-DR.

Ejemplo 24. Preparación de las muestras, obtención de imágenes y análisis de las imágenes obtenidas para muestras de tejido con células que expresan TIM-3 y células que expresan Galectina 9.

[0246] Se realizan procedimientos análogos a los del Ejemplo 15, sustituyendo la tinción y el análisis de PD-L1 y PD-1 por la tinción y el análisis de TIM-3 y Galectina 9.

Ejemplo 25. Preparación de las muestras, obtención de imágenes y análisis de las imágenes obtenidas para muestras de tejido con células que expresan 41BB y células que expresan 4.1BBL.

[0247] Se realizan procedimientos análogos a los del Ejemplo 15, sustituyendo la tinción y el análisis de PD-L1 y PD-1 por la tinción y el análisis de 41BB y 4.1BBL.

Ejemplo 26. Preparación de las muestras, obtención de imágenes y análisis de las imágenes obtenidas para muestras de tejido con células que expresan OX40 y células que expresan OX40L.

[0248] Se realizan procedimientos análogos a los del Ejemplo 15, sustituyendo la tinción y el análisis de PD-L1 y PD-1 por la tinción y el análisis de OX40 y OX40L.

Ejemplo 27. Preparación de las muestras, obtención de imágenes y análisis de las imágenes obtenidas para muestras de tejido con células que expresan CD40 y células que expresan CD40L.

[0249] Se realizan procedimientos análogos a los del Ejemplo 15, sustituyendo la tinción y el análisis de PD-L1 y PD-1 por la tinción y el análisis de CD40 y CD40L.

Ejemplo 28. Preparación de las muestras, obtención de imágenes y análisis de las imágenes obtenidas para muestras de tejido con células que expresan ICOS y células que expresan ICOSL.

[0250] Se realizan procedimientos análogos a los del Ejemplo 15, sustituyendo la tinción y el análisis de PD-L1 y PD-1 por la tinción y el análisis de ICOS e ICOSL.

Ejemplo 29. Preparación de las muestras, obtención de imágenes y análisis de las imágenes obtenidas para muestras de tejido con células que expresan GITR y células que expresan GITRL.

[0251] Se realizan procedimientos análogos a los del Ejemplo 15, sustituyendo la tinción y el análisis de PD-L1 y PD-1 por la tinción y el análisis de GITR y GITRL.

Ejemplo 30. Preparación de las muestras, obtención de imágenes y análisis de las imágenes obtenidas para muestras de tejido con células que expresan HLA-DR y células que expresan TCR.

[0252] Se realizan procedimientos análogos a los del Ejemplo 15, sustituyendo la tinción y el análisis de PD-L1 y PD-1 por la tinción y el análisis de HLA-DR y TCR.

Ejemplo 31. Preparación de las muestras, obtención de imágenes y análisis de CD3 y PD-1 en muestras de tejido de pacientes con linfoma difuso de células B grandes (DLBCL)

[0253] Preparación de las muestras. Se desparafinaron muestras de tejido incluidas en parafina fijadas con formalina (FFPE) de pacientes con DLBCL (n = 43). A continuación, los portaobjetos se rehidrataron mediante una serie de lavados de xileno a alcohol antes de incubarlos en agua destilada. A continuación, se realizó la recuperación de antígenos inducida por calor usando condiciones de presión y temperatura elevadas, se dejaron enfriar y se transfirieron a solución salina con pH regulado con Tris. Luego se realizó la tinción, para la que se llevaron a cabo los siguientes pasos. Primero, se bloqueó la peroxidasa endógena y luego se realizó una incubación con una solución de bloqueo de proteínas para reducir la tinción de anticuerpos inespecíficos. A continuación, los portaobjetos se tiñeron con un anticuerpo primario anti-PD1 de ratón. A continuación, se lavaron los portaobjetos antes de la incubación con un anticuerpo secundario anti-HRP de ratón. Los portaobjetos se lavaron y luego se detectó la tinción de PD-1 usando TSA+ Cy® 3 (Perkin Elmer). A continuación, se eliminaron los reactivos de anticuerpos primarios y secundarios mediante microondas. Los portaobjetos se lavaron de nuevo antes de la tinción con un anticuerpo primario anti-CD3 de conejo. Los portaobjetos se lavaron y luego se incubaron con un cóctel de anticuerpos secundarios anti-conejo HRP más 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Los portaobjetos se lavaron y luego se detectó la tinción de CD3 usando TSA-Cy® 5 (Perkin Elmer). Los portaobjetos se lavaron por última vez antes de cubrirlos con un cubreobjetos y medio de montaje y se dejaron secar durante la noche a temperatura ambiente. En la FIG 31 se muestra una descripción esquemática de los anticuerpos y reactivos de detección.

[0254] Imágenes y análisis de las muestras. A continuación, se adquirieron imágenes de fluorescencia utilizando el sistema de análisis de portaobjetos inteligente Vectra 2 utilizando el software Vectra versión 2.0.8 (Perkin Elmer). En primer lugar, se obtuvieron imágenes monocromáticas del portaobjetos con un aumento de 4x utilizando DAPI. Se utilizó un algoritmo automatizado (desarrollado con inForm) para identificar las áreas del portaobjetos que contenían tejido.

[0255] Se tomaron imágenes de las áreas del portaobjetos identificadas como que contenían tejido con un aumento de 4x para los canales asociados con DAPI (azul), Cy®3 (verde) y Cy® 5 (rojo) para crear imágenes RGB. Estas imágenes de aumento de 4x se procesaron utilizando un algoritmo de enriquecimiento automático (desarrollado con inForm) en el selector de campo de visión 104 para identificar y clasificar los posibles campos de visión de aumento de 20x de acuerdo con la expresión de Cy® 3 más alta.

[0256] Se obtuvieron imágenes de los 40 campos de visión superiores con un aumento de 20x en las longitudes de onda de DAPI, Cy®3 y Cy® 5. Las imágenes sin procesar se revisaron para verificar su aceptabilidad, y las imágenes que estaban desenfocadas, que carecían de células tumorales, que eran altamente necróticas o que contenían altos niveles de señal de fluorescencia no asociada con la localización esperada de anticuerpos (es decir, tinción de fondo) se rechazaron antes del análisis. Las imágenes aceptadas se procesaron usando AQUAduct (Perkin Elmer), en donde cada fluoróforo se desmezcló espectralmente mediante el desmezclador espectral 210 en canales individuales y se guardó como un archivo separado.

[0257] Los archivos procesados se analizaron adicionalmente utilizando AQUAnalysis™ o mediante un proceso totalmente automatizado utilizando AQUAserve™. Los detalles fueron los siguientes.

[0258] Cada imagen de DAPI se procesó mediante el enmascarador celular 1912 para identificar todos los núcleos celulares dentro de esa imagen (figura 29a), y luego se dilató 2 píxeles para representar el tamaño aproximado de una célula completa. Esta máscara resultante representaba todas las células dentro de esa imagen (figura 29b).

[0259] Cada imagen de Cy® 5 (figura 30a) fue procesada por el enmascarador de biomarcadores 1922 para crear una máscara binaria de todas las células positivas para PD-1 (figura 30b).

[0260] Cada imagen de Cy® 3 (figura 31a) fue procesada por el enmascarador de biomarcadores 1922 para crear una máscara binaria de todas las células positivas para CD3 (figura 31b).

[0261] Las máscaras binarias para todas las células positivas para PD-1 y positivas para CD3 se combinaron para crear una máscara binaria de todas las células que eran doblemente positivas para PD-1 y CD3 (figura 32).

[0262] El % de positividad del biomarcador (PBP) para todas las células CD3 que expresan PD-1 se derivó, utilizando la calculadora de positividad 1936, dividiendo el área total, medida en píxeles y determinada por el evaluador de área 1932, de la máscara de todas las células positivas para PD-1 (figura 30b) por el área total, medida en píxeles y determinada por el evaluador de área 1932, de la máscara de todas las células positivas para CD3 (figura 31 b). Se observó una distribución diferencial de linfocitos T exhaustos (CD3+/PD1+) en sitios primarios (niveles bajos) frente a sitios secundarios (niveles altos). Los resultados se muestran en las FIGS. 33a y 33b.

Ejemplo 32. Comparación de plataformas

[0263] La precisión de procedimientos análogos a los de los Ejemplos 15 y 30 se confirmó por comparación con la citometría de flujo. Las frecuencias de los linfocitos T reguladores (en función de la expresión de FoxP3 y CD25) se determinaron en sangre completa estimulada con IL-2, TGF p y CD28 durante 5 días en una placa recubierta de CD3.

Ejemplo 33. Evaluación de linfocitos T CD25/FoxP3 en múltiples indicaciones tumorales

[0264] Se realizaron procedimientos análogos a los del Ejemplo 30 con la identificación adicional de células tumorales con anticuerpos anti-SlOO o anti-citoqueratina detectados con un anticuerpo secundario AlexaFluor488 y se obtuvieron imágenes en las longitudes de onda de DAPI, FITC, Cy® 3 y Cy® 5 para la evaluación cuantitativa de CD25 y FoxP3 en tejidos de NSCLC, gástricos y de melanoma. Los tejidos se tiñeron con anticuerpos que reconocen CD25 y FoxP3 y su expresión en áreas no tumorales se calculó como % de expresión. La prevalencia de linfocitos T CD25/FoxP3+ osciló entre el 1 % y el 10 % en muestras de tejido pulmonar, gástrico y de melanoma de archivo. Los resultados se muestran en las FIGS. 34 y 35.

Ejemplo 34. Evaluación de linfocitos T CD4/CD8 en múltiples indicaciones tumorales

[0265] Se realizaron procedimientos análogos a los del Ejemplo 30 con la identificación adicional de células tumorales con anticuerpos anti-S100 o anti-citoqueratina detectados con un anticuerpo secundario AlexaFluor488 y se obtuvieron imágenes en las longitudes de onda de DAPI, FITC, Cy® 3 y Cy® 5 para la evaluación cuantitativa de CD4 y CD8 en tejidos de NSCLC, gástricos y de melanoma. Los tejidos se tiñeron con anticuerpos que reconocen CD4 y CD8 y sus expresiones en áreas no tumorales se calcularon como % de expresión. Se observó un amplio rango de expresión (10 % -50 %) para los linfocitos TCD4+ y CD8+ en secciones secuenciales de las muestras tumorales. Los resultados se muestran en las FIGS. 36a y 36b.

Ejemplo 35. Evaluación de células similares a células supresoras derivadas de mieloides (MDSC) en muestras tumorales de pacientes diagnosticados con melanoma metastásico o cáncer de pulmón no microcítico.

[0266] Para identificar células similares a MDSC que expresan marcadores fenotípicos característicos de las células mieloides (por ejemplo, CD11b, CD33 y HLA-DR) y marcadores bioquímicos (por ejemplo, ARG1 e IDO-1) que ejercen una función supresora sobre estas células, las muestras se tiñeron con CD11b, HLA-DR e IDO, o CD11b, CD33 y ARG1.

[0267] Se utilizó la expresión diferencial de CD11b, HLA-DR e IDO-1 para estudiar la presencia de un subconjunto de células mieloides supresoras conocidas como TAM (macrófagos asociados a tumores) en biopsias de tumores de pacientes con melanoma metastásico. Los subfenotipos representativos que pueden ser relevantes para predecir la respuesta a las inmunoterapias contra el cáncer se muestran en las FIGS. 37a, 37b, 38a, y 38b.

[0268] Se utilizó la expresión diferencial de CD11b, CD33 y ARG-1 o CD11b, HLA-DR e IDO-1 para estudiar la presencia de células similares a MDSC y TAM en muestras tumorales de pacientes con cáncer de pulmón (NSCLC) avanzado. Los subfenotipos representativos que pueden ser relevantes para predecir la respuesta a las inmunoterapias contra el cáncer se muestran en las FIGS. 39a, 39b, y 40.

[0269] Preparación de las muestras. Se desparafinaron muestras de tejido fijadas con formalina e incluidas en parafina (FFPE). A continuación, los portaobjetos se rehidrataron mediante una serie de lavados de xileno a alcohol antes de incubarlos en agua destilada. A continuación, se realizó la recuperación de antígenos inducida por calor usando condiciones de presión y temperatura elevadas, se dejaron enfriar y se transfirieron a solución salina con pH regulado con Tris. Luego se realizó la tinción, para la que se llevaron a cabo los siguientes pasos. Primero, se bloqueó la peroxidasa endógena y y luego se realizó una incubación con una solución de bloqueo de proteínas para reducir la tinción de anticuerpos inespecíficos. A continuación, los portaobjetos se tiñeron con un anticuerpo primario anti-IDO-1 de conejo o anti-CD33 de ratón. A continuación, los portaobjetos se lavaron antes de la incubación con anticuerpo secundario anti-conejo HRP o anti-ratón. Los portaobjetos se lavaron y luego se detectó la tinción anti-IDO-1 o anti-CD33 usando TSA+ Cy® 5 (Perkin Elmer). A continuación, se neutralizó cualquier HRP residual usando dos lavados de 100 mM de benzhidrazida recién preparada con 50 mM de peróxido de hidrógeno. Los portaobjetos se lavaron de nuevo antes de la tinción con un anticuerpo primario anti-HLA-DR de ratón o un anticuerpo primario anti-ARG1 de conejo. Los portaobjetos se lavaron y luego se incubaron con anticuerpo secundario de HRP anti-ratón o anti-conejo. Los portaobjetos se lavaron y luego se detectó la tinción anti-HLA-DR o anti-ARG1 usando TSA-Cy® 3 (Perkin Elmer). A continuación, se eliminaron los reactivos de anticuerpos primarios y secundarios mediante microondas. Los portaobjetos se lavaron de nuevo antes de la tinción con un anticuerpo anti-CDIIb de conejo. Los portaobjetos se lavaron y luego se incubaron con un cóctel de anticuerpos secundarios anti-conejo HRP más 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Los portaobjetos se lavaron y luego se detectó la tinción con anti-CDIIb usando TSA-AlexaFluor488 (Life Technologies). Los portaobjetos se lavaron por última vez antes de cubrirlos con un cubreobjetos y medio de montaje y se dejaron secar durante la noche a temperatura ambiente.

[0270] Se utilizaron procedimientos análogos a los del Ejemplo 16 para la obtención de imágenes y el análisis de muestras en las longitudes de onda de DAPI, FITC, Cy®3 y Cy®5. Las imágenes de aumento de 4x se procesaron utilizando un algoritmo de enriquecimiento automático (desarrollado con inForm) en el selector de campo de visión 104 para identificar y clasificar los posibles campos de visión de aumento de 20x de acuerdo con la expresión más alta de Cy® 3 y Cy® 5.

[0271] Cada imagen de DAPI se procesó por el enmascarador celular 212 para identificar todos los núcleos celulares dentro de esa imagen y luego se dilató para representar el tamaño aproximado de una célula completa. Esta máscara resultante representaba todas las células dentro de esas imágenes.

[0272] Cada imagen de AlexaFluor488® fue procesada por el enmascarador de biomarcadores 222 para crear una máscara binaria de todas las células positivas para CD11b.

[0273] Cada imagen de Cy® 3 fue procesada por el enmascarador de biomarcadores 222 para crear una máscara binaria de todas las células positivas para HLA-DR o CD33.

[0274] Cada imagen de Cy® 5 fue procesada por el enmascarador de biomarcadores 222 para crear una máscara binaria de todas las células positivas para IDO-1 o ARG1.

[0275] Las máscaras binarias para todas las células positivas para CD11b y positivas para HLA-DR se combinaron para crear una máscara binaria de todas las células que son doblemente positivas para CD11b y HLA-DR o son positivas para CD11b y negativas para HLA-DR.

[0276] El % de positividad del biomarcador (PBP) para todas las células CD11b que carecen de expresión de HLA-DR se derivó, utilizando la calculadora de positividad 236, dividiendo el área total, medida en píxeles y determinada por el evaluador de área 232, de la máscara de todas las células positivas para CD11b y negativas para HLA-DR por el área total, medida en píxeles y determinada por el evaluador de área 232, de la máscara de todas las células positivas para CD11b. Los resultados se muestran en la figura 37a para muestras tumorales obtenidas de pacientes diagnosticados con melanoma metastásico.

[0277] Las máscaras binarias para todas las células positivas para CD11b, positivas para IDO y positivas para HLA-Dr se combinaron para crear una máscara binaria de todas las células que son positivas para CD11b, negativas para HLA-DR y positivas para IDO-1.

[0278] El PBP para todas las células CD11b que expresan IDO-1, pero que carecen de expresión de HLA-DR, se obtuvo dividiendo el área total, medida en píxeles, de la máscara de todas las células positivas para CD11b, negativas para HLA-DR, positivas para IDO-1 por el área total, medida en píxeles, de la máscara de todas las células positivas para CD11b. Los resultados se muestran en la figura 37b para muestras tumorales obtenidas de pacientes diagnosticados con melanoma metastásico y en la figura 40 para pacientes diagnosticados con cáncer de pulmón no microcítico.

[0279] Las máscaras binarias para todas las células positivas para HLA-DR y positivas para IDO-1 se combinaron para crear una máscara binaria de todas las células que son doblemente positivas para HLA-DR e IDO-1.

[0280] El % de positividad del biomarcador (PBP) para todas las células HLA-DR que expresan IDO-1 se derivó, utilizando la calculadora de positividad 236, dividiendo el área total, medida en píxeles y determinada por el evaluador de área 232, de la máscara de todas las células positivas para IDO-1 y positivas para HLA-DR por el área total, medida en píxeles y determinada por el evaluador de área 232, de la máscara de todas las células HLA-DR-positivas. Los resultados se muestran en la figura 38a para muestras tumorales obtenidas de pacientes diagnosticados con melanoma metastásico.

[0281] Las máscaras binarias para todas las células positivas para CD11b, positivas para IDO y positivas para HLA-Dr se combinaron para crear una máscara binaria de todas las células que son positivas para CD11b, positivas para HLA-DR y positivas para IDO-1.

[0282] El PBP para todas las células CD11b que expresan IDO-1 y HLA-DR se obtuvo dividiendo el área total, medida en píxeles, de la máscara de todas las células positivas para CD11b, positivas para HLA-DR y positivas para IDO-1 por el área total, medida en píxeles, de la máscara de todas las células positivas para CD11b. Los resultados se muestran en la figura 38b para muestras tumorales obtenidas de pacientes diagnosticados con melanoma metastásico y en la figura 39b para muestras tumorales obtenidas de pacientes diagnosticados con cáncer de pulmón no microcítico.

[0283] Las máscaras binarias para todas las células positivas para CD11b, positivas para CD33 y positivas para ARG1 se combinaron para crear una máscara binaria de todas las células positivas para CD11b, positivas para CD33 y positivas para ARG1.

[0284] El PBP para todas las células CD11b que expresan CD33 y ARG1 se derivó dividiendo el área total, medida en píxeles, de la máscara de todas las células positivas para CD11b, positivas para CD33 y positivas para ARG1 por el área total, medida en píxeles, de la máscara de todas las células positivas para CD11b. Los resultados se muestran en la figura 39a para muestras tumorales obtenidas de pacientes diagnosticados con cáncer de pulmón no microcítico.

Ejemplo 36. Evaluación de linfocitos T activados en muestras de tumores de pacientes diagnosticados con melanoma metastásico.

[0285] Se realizaron procedimientos análogos a los del Ejemplo 20 para teñir cada muestra con una combinación de DAPI, CD3, CD8 y Ki67 para identificar subpoblaciones de linfocitos T activados. Se evaluó la prevalencia de CD8+ Ki67+ en biopsias tumorales obtenidas de pacientes diagnosticados con melanoma metastásico (figura 41).

Ejemplo 37. Evaluación de la prevalencia de macrófagos en muestras de tumores de pacientes diagnosticados con melanoma metastásico.

[0286] Se realizaron procedimientos análogos a los del Ejemplo 16 con la identificación adicional de células tumorales con anticuerpo anti-S100 detectado con un anticuerpo secundario AlexaFluor488 y se obtuvieron imágenes en las longitudes de onda de DAPI, FITC, Cy® 3 y Cy® 5 para la evaluación cuantitativa de CD163 y CD68 en tejidos de melanoma. Los tejidos se tiñeron con anticuerpos que reconocen CD163 y CD68 y su expresión en áreas no tumorales se calculó como expresión de PBP simple o expresión de PBP doble. Los resultados se muestran en las FIGS. 42a, 42b, y 42c.

Ejemplo 38. Evaluación de la prevalencia de la supresión de linfocitos T en muestras de tumores de pacientes diagnosticados con linfoma difuso de células B grandes (DLBCL) y tumores neuroendocrinos (NET).

[0287] Se realizaron procedimientos análogos a los del Ejemplo 1 para teñir las muestras de tumores de DLBCL y NET con un anticuerpo primario anti-LAG-3 de ratón, secundario de HRP anti-ratón, detectado con TSA+ Cy®3.5, con el HRP restante atenuado con 100 mM de benzhidrazida y 50 mM de peróxido de hidrógeno. Después de esto, los portaobjetos se tiñeron con un anticuerpo primario anti-TIM-3 de conejo, secundario anti-conejo h Rp , detectado con TSA-Cy®5. A continuación, se eliminaron los anticuerpos primarios y secundarios mediante microondas. A continuación, los tejidos se tiñeron con un anticuerpo primario anti-CD3 de conejo, secundario de HRP anti-conejo más 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), detectado con Opal™ 520. La obtención de imágenes se realizó de forma análoga al Ejemplo 1 en las longitudes de onda de DAPI, FITC, Texas Red y Cy® 5. El análisis se realizó de forma análoga al Ejemplo 1 para determinar la prevalencia de PBP de los linfocitos T que eran positivos para LAG-3 y TIM-3, respectivamente. Los resultados se muestran en las FIGS. 43a y 43b.

[0288] Si bien se han ilustrado y descrito ciertas formas de realización, debe entenderse que se pueden realizar cambios y modificaciones en las mismas de acuerdo con la experiencia en la técnica sin apartarse de la tecnología en sus aspectos más amplios como se define en las siguientes reivindicaciones.

[0289] Las formas de realización, descritas ilustrativamente en el presente documento, pueden aplicarse de manera adecuada en ausencia de cualquier elemento o elementos, limitación o limitaciones, no descritos específicamente en el presente documento. Así, por ejemplo, los términos "que comprende", "que incluye", "que contiene", etc. se leerán de forma amplia y sin limitación. Además, los términos y expresiones empleados en este documento se han utilizado como términos de descripción y no de limitación, y no hay intención en el uso de dichos términos y expresiones de excluir ningún equivalente de las características mostradas y descritas o partes de las mismas, sino que se reconoce que son posibles varias modificaciones dentro del alcance de la tecnología reivindicada. Además, se entenderá que la frase "que consiste esencialmente en" incluye aquellos elementos específicamente enumerados y aquellos elementos adicionales que no afectan materialmente a las características básicas y novedosas de la tecnología reivindicada. La frase "que consiste en" excluye cualquier elemento no especificado.

[0290] La presente divulgación no debe limitarse en términos de las formas de realización particulares descritas en esta solicitud. Se pueden realizar muchas modificaciones y variaciones sin apartarse de su alcance, como será evidente para los expertos en la técnica. Los métodos y composiciones funcionalmente equivalentes dentro del alcance de la divulgación, además de los enumerados en este documento, serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de las descripciones anteriores. Se pretende que tales modificaciones y variaciones caigan dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. La presente divulgación debe estar limitada únicamente por los términos de las reivindicaciones adjuntas, junto con el alcance completo de los equivalentes a los que tienen derecho tales reivindicaciones. Debe entenderse que esta descripción no se limita a métodos, reactivos, composiciones, compuestos o sistemas biológicos particulares que, por supuesto, pueden variar. También debe entenderse que la terminología utilizada en este documento tiene el propósito de describir únicamente formas de realización particulares, y no pretende ser limitante.

[0291] Además, cuando las características o aspectos de la divulgación se describen en términos de grupos de Markush, los expertos en la técnica reconocerán que la divulgación también se describe en términos de cualquier miembro individual o subgrupo de miembros del grupo de Markush.

[0292] Como entenderá un experto en la técnica, para todos y cada uno de los propósitos, particularmente en términos de proporcionar una descripción escrita, todos los intervalos descritos en este documento también abarcan todos y cada uno de los posibles subintervalos y combinaciones de subintervalos de los mismos. Se puede reconocer fácilmente que cualquier intervalo enumerado describe suficientemente y permite que el mismo intervalo se divida en al menos mitades, tercios, cuartos, quintos, décimos, partes iguales. etc. Como ejemplo no limitativo, cada intervalo mencionado en este documento se puede dividir fácilmente en un tercio inferior, un tercio medio y un tercio superior, etc. Como también entenderá un experto en la técnica, todas las expresiones tales como "hasta", "al menos", "mayor que", "menor que" y similares, incluyen el número mencionado y se refieren a intervalos que pueden ser posteriormente divididos en subintervalos como se ha mencionado anteriormente. Finalmente, como entenderá un experto en la técnica, un intervalo incluye cada elemento individual.

[0293] La invención se expone en las siguientes reivindicaciones.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Sistema para determinar una puntuación representativa de la proximidad entre al menos un par de células en una muestra de tejido tumoral, sistema que comprende:

un controlador programable (200) programado para:

recibir datos de imagen de un dispositivo de obtención de imágenes (100), separar los datos de imagen en datos de imagen sin mezclar y proporcionar los datos a través de una pluralidad de canales de datos; donde los datos de imagen sin mezclar de un primer canal de datos describen señales de fluorescencia atribuibles a un núcleo celular, los datos sin mezclar de un segundo canal de datos describen señales de fluorescencia atribuibles al tejido tumoral, los datos sin mezclar de un tercer canal de datos describen señales de fluorescencia atribuibles a un primer biomarcador, y los datos de imagen sin mezclar de un cuarto canal de datos describen señales de fluorescencia atribuibles a un segundo biomarcador;

recibir datos de imagen del primer canal de datos y generar una imagen representativa de todos los núcleos de un campo de visión y dilatar la imagen para generar una máscara de células;

recibir datos de imagen del segundo canal de datos y generar una máscara de toda el área tumoral en el campo de visión;

recibir datos de imagen del tercer canal de datos y generar una máscara del primer biomarcador de todas las células del campo de visión que expresan el primer biomarcador;

recibir datos de imagen del cuarto canal de datos y generar una máscara del segundo biomarcador de todas las células del campo de visión que expresan el segundo biomarcador;

combinar la máscara de células y la máscara de área tumoral para generar al menos una máscara de células no tumorales y una máscara de células tumorales;

dilatar la máscara del primer biomarcador en un margen suficiente para abarcar las células localizadas proximalmente que expresan el segundo biomarcador para generar una máscara del primer biomarcador dilatada;

combinar la máscara del primer biomarcador dilatada y la máscara del segundo biomarcador para generar una máscara de interacción;

calcular una puntuación de proximidad espacial basada en el área de la máscara de interacción y el área de al menos una de entre la máscara de células no tumorales, la máscara de células tumorales y la máscara de células.

2. Sistema de la reivindicación 1, en el que el controlador programable (200) está configurado además para dividir el área de la máscara de interacción por el área de una de entre la máscara de células no tumorales, la máscara de células tumorales y la máscara de células.

3. Sistema de la reivindicación 1 en el que la puntuación de proximidad espacial se calcula de acuerdo con la ecuación:

A¡ ^A

SPS = - - x 104

A c

donde A i es un área de interacción total - área de la máscara de interacción - y Ac es el área total de al menos una de la máscara de células no tumorales, la máscara de células tumorales y la máscara de células.

4. Sistema de la reivindicación 1, en el que el margen suficiente para abarcar células localizadas proximalmente que expresan el segundo biomarcador varía de aproximadamente 1 a aproximadamente 100 píxeles.

5. Sistema de la reivindicación 1, en el que un primer miembro del al menos un par de células comprende una célula tumoral y un segundo miembro del al menos un par de células comprende una célula no tumoral.

6. Sistema para determinar un valor de positividad de un biomarcador en una muestra de tejido tumoral, donde el sistema comprende:

un controlador programable (1900) programado para:

recibir datos de imagen de un dispositivo de obtención de imágenes (100), separar los datos de imagen en datos de imagen sin mezclar y proporcionar los datos a través de una pluralidad de canales de datos, en donde los datos de imagen sin mezclar de un primer canal de datos describen señales de fluorescencia atribuibles a un núcleo celular, los datos sin mezclar de un segundo canal de datos describen señales de fluorescencia atribuibles a un tejido de subconjunto de interés, y los datos sin mezclar de un tercer canal de datos describen señales de fluorescencia atribuibles a un primer biomarcador;

utilizar datos de imagen del primer canal de datos y generar una imagen representativa de todos los núcleos en un campo de visión y dilatar la imagen para generar una máscara de células;

utilizar datos de imagen del segundo canal de datos y generar una máscara de todo el subconjunto del área de tejido en el campo de visión;

utilizar datos de imagen del tercer canal de datos y generar una máscara del primer biomarcador de todas las células del campo de visión que expresan el primer biomarcador;

combinar la máscara de células y la máscara de área de tejido de subconjunto para generar al menos una máscara de células de no subconjunto y una máscara de células de subconjunto;

combinar la máscara de biomarcador y la máscara de células de no subconjunto o la máscara de células de subconjunto para generar una máscara combinada de células que no pertenecen al subconjunto o células de un subconjunto que son positivas para el primer biomarcador;

calcular un valor de positividad de un biomarcador en función del área de la máscara combinada.

7. Sistema de la reivindicación 6, en el que el controlador programable (1900) está configurado además para dividir un área de la máscara combinada por un área de la máscara de células que no son de subconjunto o la máscara de células de subconjunto para calcular el valor de positividad del biomarcador.

8. Sistema de la reivindicación 6, en el que el controlador programable (1900) está configurado además para dividir un área de la máscara del primer biomarcador por un área de la máscara de células para calcular el valor de positividad del biomarcador.

9. Sistema de la reivindicación 6, en el que el tejido de subconjunto de interés es tejido tumoral, la célula de subconjunto es una célula tumoral y la célula de no subconjunto es una célula no tumoral.

10. Sistema de la reivindicación 1 o la reivindicación 6, en el que cada máscara se genera asignando un valor binario a cada píxel de datos de imagen de un canal seleccionado.

11. Sistema de la reivindicación 10, en el que el valor binario se asigna a cada valor mediante una función de umbral, en el que la función de umbral asigna un valor de 1 a cada píxel que tenga una intensidad igual o mayor que un umbral de intensidad predeterminado, y asigna un valor de 0 a cada píxel que tenga una intensidad por debajo del umbral de intensidad predeterminado.

12. Sistema de la reivindicación 10, en el que el valor binario se asigna a cada valor mediante una función de umbral de histograma, en el que la función de umbral de histograma utiliza una escala móvil de intensidad de píxeles para determinar un umbral, y asigna un valor de 1 a cada píxel que tenga una intensidad igual o mayor que un umbral de intensidad, y asigna un valor de 0 a cada píxel que tenga una intensidad por debajo del umbral de intensidad.

13. Sistema de la reivindicación 12, en el que el umbral se determina mediante:

la suma de una intensidad de cada píxel para obtener una intensidad total;

la multiplicación de un porcentaje de umbral por la intensidad total para obtener una suma de corte;

la agrupación de todos los píxeles por intensidad en un histograma; y

la suma de las intensidades de píxeles de menor a mayor hasta lograr la suma de corte;

en donde la última intensidad de píxel más alta visitada en el proceso es el umbral de intensidad.

14. Sistema de la reivindicación 1 o la reivindicación 6, en el que la combinación de las máscaras se realiza usando una operación "y"; en el que la operación "y" es una multiplicación de la intensidad de píxel de un píxel de una primera máscara por la intensidad de píxel del píxel de una segunda máscara.

15. Sistema de la reivindicación 1 o la reivindicación 6, en el que la combinación de las máscaras se realiza usando una operación “fuera”; en el que la operación “fuera” elimina una segunda máscara de una primera máscara.