ES2877400T3 - Ensayos mejorados para la potencia de células del epitelio pigmentario de la retina (RPE) humanas y progenitores de fotorreceptores - Google Patents

Abstract

Un método de evaluación de la actividad de fagocitosis que comprende incubar células con segmentos externos de los fotorreceptores (POS) durante un tiempo y temperatura suficientes para que las células fagociten los POS, en donde los POS se marcan con una marca fluorescente que fluoresce más a un pH ácido que a un pH mayor, y detectar la intensidad de fluorescencia de las células después de la incubación, en donde un aumento en la fluorescencia en comparación con un control indica fagocitosis de los POS por las células, en donde las células se incuban con los POS a una temperatura que varía desde 25-40 °C, o 34-40 °C, o a 37 °C, y en donde el control es células incubadas con los POS a una temperatura que varía desde 10-16 °C o 12-15 °C.

Description

DESCRIPCIÓN

Ensayos mejorados para la potencia de células del epitelio pigmentario de la retina (RPE) humanas y progenitores de fotorreceptores

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere al uso de un método in vitro basado en células para medir la fagocitosis de segmentos externos de los bastones fotorreceptores.

ANTECEDENTES

El epitelio pigmentario de la retina (RPE) es la capa de células pigmentadas fuera de la retina neurosensorial entre la coroides subyacente (la capa de vasos sanguíneos detrás de la retina) y que recubre las células visuales de la retina (por ejemplo, bastones y conos fotorreceptores). El RPE es crítico para la función y la salud de los fotorreceptores y la retina. El RPE mantiene la función de los fotorreceptores recirculando fotopigmentos, suministrando, metabolizando y almacenando vitamina A, fagocitando segmentos externos de los bastones fotorreceptores, transportando hierro y moléculas pequeñas entre la retina y la coroides, manteniendo la membrana de Bruch y absorbiendo luz parásita para permitir una mejor resolución de la imagen. Véanse, por ejemplo, el documento de patente WO 2009/051671; Engelmann y Valtink (2004) "RPE Cell Cultivation". Graefe’s Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology 242(1): 65-67; Irina Klimanskaya, Retinal Pigment Epithelium Derived From Embryonic Stem Cells, en STEM CELL ANTHOLOGY 335-346 (Bruce Carlson ed., 2009).

La degeneración del RPE puede provocar desprendimiento de retina, displasia de la retina o atrofia de la retina que está asociada con varias afecciones que alteran la visión que dan como resultado el daño de fotorreceptores y ceguera, tales como coroideremia, retinopatía diabética, degeneración macular (incluyendo degeneración macular senil, AMD) y distrofia macular de Stargardt (SMD), siendo estas dos últimas dos de las causas principales de ceguera del adulto y juvenil en el mundo, respectivamente. Aunque ambas son actualmente intratables, existe evidencia en modelos preclínicos de degeneración macular de que el trasplante de RPE derivado de hESC puede rescatar fotorreceptores y prevenir la pérdida visual (Lund RD, Wang S, Klimanskaya I, et al. Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic rats. Cloning and Stem Cells 2006; 8,189-199; Lu B, Malcuit C, Wang S, et al. Long-term safety and function of RPE from human embryonic stem cells in preclinical models of macular degeneration. Stem Cells 2009; 21,2125-2135).

La pérdida adicional de células neuronales posmitóticas contribuye también a algunas de las enfermedades anteriormente mencionadas. Entre estas, las enfermedades de la retina son distrofias de bastones o conos, degeneración de la retina, retinitis pigmentosa (RP), retinopatía diabética, degeneración macular, amaurosis congénita de Leber y enfermedad de Stargardt. En la mayoría de los casos de degeneración de la retina, la pérdida de células es principalmente en la capa nuclear externa (ONL), que incluye fotorreceptores de bastones y conos.

Una posible fuente de sustitución de células fotorreceptoras incluye células madre. Estudios previos evaluaron células de ratón, células madre de ratón o poblaciones heterogéneas de células progenitoras de la retina como una posible fuente de células de sustitución de fotorreceptores perdidos. Estos estudios previos describieron el trasplante de células precursoras de fotorreceptores de la retina de ratón de día posnatal 1 (Maclaren et al. Nature 444(9):203-207, 2006), generación in vitro de células precursoras de la retina de células madre embrionarias de ratón (Ikeda et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 102(32):11331 -11336, 2005), generación de células progenitoras de la retina de retinas de ratón de día posnatal 1 (Klassen et al. Invest. Ophthal. Vis. Sci. 45(11):4167-4175, 2004), implantación de células madre mesenquimatosas de médula ósea en un modelo RCS de rata de degeneración de la retina (Inoue et al. Exp. Eye Res.

8(2):234-241, 2007), producción de células progenitoras de la retina, que incluyen células ganglionares, células amacrinas, fotorreceptores en donde el 0,01 % de las células totales expresaron S-opsina o rodopsina, células bipolares y células horizontales, de la estirpe de células madre embrionarias humanas H1 (Lamba et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 10(34):12769-12774, 2006) e inducción de células madre pluripotentes inducidas (iPS) de fibroblastos humanos para producir células progenitoras de la retina (Lamba et al. PLoS ONE 5(1):e8763. doi:10.1371/journal.pone.0008763). Ninguno de estos enfoques produjo una población homogénea de células progenitoras de fotorreceptores o células fotorreceptoras para implantación. Ninguno de estos enfoques produjo una población homogénea de células progenitoras de fotorreceptores o células fotorreceptoras que mostraran in vivo la función de bastones o de conos (por ejemplo, detectable confiriendo mejoras en la agudeza visual). Están limitados los suministros de tejido derivado de donante de los que se puedan aislar los fotorreceptores y progenitores de fotorreceptores (tales como cadáveres, tejido fetal y animales vivos). Las células madre se pueden propagar y expandir in vitro indefinidamente, proporcionando una fuente posiblemente inagotable de células no derivadas de donante para terapia humana. La diferenciación de células madre en una población homogénea de progenitores de fotorreceptores o fotorreceptores puede proporcionar un suministro abundante de células no derivadas de donante para la implantación y el tratamiento de enfermedades de la retina. Las células progenitoras de fotorreceptores pueden tener actividad fagocítica.

Cierta materia que incluye métodos de preparación de células RPE, composiciones de células RPE y ensayos de liberación (incluyendo ensayos de fagocitosis) para células RPE se desvela en la solicitud de EE. UU. del mismo solicitante N° de serie 13/510.426, presentada el 17 de noviembre de 2010, y el documento de patente WO2013/074681. Cierta materia que incluye métodos de preparación de progenitores de fotorreceptores, y composiciones de progenitores de fotorreceptores y métodos de prueba de la función (incluyendo ensayos de fagocitosis) se desvelan en el documento de patente WO2014/145108 del mismo solicitante. Los documentos de patente WO2013/074681 y WO2014/145108 describen métodos de evaluación de la actividad de fagocitosis en células RPE humanas y células progenitoras de fotorreceptores humanas. Los métodos usan pHrodo® Red E.Coli Bioparticles.

Gordiyenko et al. (2010; Investigative Ophthalmology & Visual Science; 51 (2): 1143-1150) describen una preparación de segmentos externos de los fotorreceptores marcada con el colorante pHrodo® Red, y su uso en un ensayo de fagocitosis en células RPE.

Lin et al. (2010; 14a Conferencia Internacional sobre Sistemas Miniaturizados para Química y Ciencias de la Vida; http://www.rsc.org/binaries/loc/2010/pdfs/Papers/330_0130.pdf) describe un estudio de endocitosis de colorantes que no existen de forma natural (FM4-64 y AlexaFluor 488 dextrano) por células HeLa.

SUMARIO

La presente invención proporciona un método de evaluación de la actividad de fagocitosis que comprende incubar células con segmentos externos de los fotorreceptores (POS) durante un tiempo y temperatura suficientes para que las células fagociten los POS, en donde los POS se marcan con una marca fluorescente que fluoresce más a un pH ácido que a un pH mayor, y detectar la intensidad de fluorescencia de las células después de la incubación, en donde un aumento en la fluorescencia en comparación con un control indica fagocitosis de los POS por las células, en donde las células se incuban con los POS a una temperatura que varía desde 25-40 °C, o 34-40 °C, o a 37 °C, y en donde el control es células incubadas con los POS a una temperatura que varía desde 10-16 °C o 12-15 °C.

Se han usado segmentos externos (OS) de los fotorreceptores marcados con FITC (normalmente bovinos o porcinos) para estudiar la fagocitosis por epitelio pigmentario de la retina (RPE) in vitro. Sin embargo, la mayoría de los métodos cuantitativos usados para la evaluación de la fagocitosis (FACS, lector de placas de fluorescencia) no diferencian entre partículas unidas a la superficie e internalizadas y así no permiten que se traten específicamente los mecanismos implicados en las etapas de unión al receptor superficial e internalización de la fagocitosis. Además, la fluorescencia de FITC es sensible al pH y se reduce significativamente a pH inferior a 6, mientras que el pH de los lisosomas y los fagosomas fusionados con lisosomas es inferior a 5. Así, la fluorescencia de OS marcados con FITC puede no ser verdaderamente representativa de la cantidad de OS internalizado.

En el presente documento se proporciona un ensayo más sensible y preciso para detectar fagocitosis internalizada de segmentos externos de los fotorreceptores, una medida importante de la función de células RPE y progenitores de fotorreceptores y, por consiguiente, un criterio de liberación importante para células RPE y progenitores de fotorreceptores que se van a usar en el tratamiento de enfermedades retinianas, tales como distrofias de los bastones o de los conos, degeneración de la retina, retinitis pigmentosa, coroideremia, retinopatía diabética, degeneración macular (incluyendo degeneración macular senil y degeneración macular miópica), amaurosis congénita de Leber y enfermedad de Stargardt (fundus flavimaculatus). Véase, por ejemplo, el documento de patente WO 2009/051671.

Las células RPE descritas en el presente documento son funcionales después del trasplante. Para este fin, las células RPE forman una monocapa entre la retina neurosensorial y la coroides en el sujeto (o paciente) que recibe las células trasplantadas. Las células RPE también pueden suministrar nutrientes a fotorreceptores adyacentes y eliminar segmentos externos de los fotorreceptores desprendidos por fagocitosis.

Se pueden seleccionar células RPE adecuadas para el trasplante basándose en varias características funcionales y/o fenotípicas, que incluyen, pero no se limitan a, actividad de fagocitosis. Por ejemplo, las células RPE adecuadas para trasplante se pueden evaluar según su actividad de fagocitosis, así como su potencial proliferativo. Por ejemplo, las células RPE pueden tener mayor potencial proliferativo que las células derivadas de donantes de ojos (por ejemplo, las células RPE son "más jóvenes" que las de los donantes de ojos). Esto permite que la célula RPE descrita en el presente documento tenga mayor esperanza de vida útil que las células derivadas de donantes de ojos.

Uno de los parámetros clave para la potencia de las células RPE en el contexto clínico es la medida cuantitativa de la actividad de fagocitosis de los segmentos externos de las preparaciones farmacéuticas de células RPE. La fagocitosis de los segmentos externos da como resultado la acumulación de fragmentos celulares fagocitados en compartimentos de pH bajo en las células RPE. En el presente documento se describen segmentos externos de los fotorreceptores que se han asociado (es decir, covalentemente o no covalentemente) con un marcador detectable que es detectable espectrofotométricamente para proporcionar una señal espectrofotométrica, siendo el marcador detectable selectivo para tener una primera señal espectrofotométrica cuando está presente un pH neutro o pH fisiológico, es decir, a pH de 7 a 7,5, y una segunda señal espectrofotométrica cuando está presente en el entorno de pH bajo de un compartimento intracelular, tal como un lisosoma, fagosoma, endosoma o similares. La diferencia entre la primera y segunda señales espectrofotométricas puede ser una o más del grado de emisión de fluorescencia (elevada intensidad a pH bajo con respecto a pH neutro), un cambio en la longitud de onda de emisión de fluorescencia entre pH neutro y bajo, un cambio en la longitud de onda de excitación de fluorescencia entre pH neutro y bajo, o similares.

El marcador detectable es un sensor de pH fluorescente, tal como colorante fluorescente. Los colorantes fluorescentes a modo de ejemplo que se pueden usar en la presente invención pueden ser un resto de colorante fluorescente que tiene un grupo amino (alifático o aromático) como resto indicador sensible al pH, es decir, una amina que no está protonada al pH de los medios de cultivo en los que se incuban juntos las células RPE y los segmentos externos (es decir, un pH neutro o pH fisiológico), y se protona al pH del compartimento intracelular en el que los segmentos externos se absorben por las células, tales como las células RPE por fagocitosis. Cuando dicho colorante adsorbe un fotón, creando un estado electrónico excitado, el electrón del par no compartido del grupo amino se transfiere al orbital desocupado por excitación. Dicha transferencia de electrones, denominada transferencia electrónica fotoinducida (PET) previene la transición de emisión de la molécula excitada, así se inactiva la fluorescencia del colorante. La protonación del grupo amino cambia la naturaleza y la energía del orbital del par y detiene la PET. Como resultado, el resto indicador fluorescente responde a un cambio de pH. Debido a que la protonación del grupo amino cancela la extinción, los sensores basados en PET se vuelven más fluorescentes a medida que disminuye el pH.

En ciertas realizaciones, el colorante fluorescente es un colorante sensible al pH basado en rodamina, tal como se describe en el documento de patente WO 2005/098437, siempre que la marca fluorescente fluorezca más a un pH ácido que a un pH mayor. Estos colorantes tienen un anillo de benceno sustituido en orto con respecto al resto xanteno por -OH o -SH (o sus formas desprotonadas). Estos colorantes muestran una dependencia del pH similar a los iniciadores de PET de amina, pero se diseñaron para tener valores de pKa inferiores a 6 basándose en una necesidad percibida de un sensor de pH que se dirigiría a compartimentos celulares con un pH inferior a 6.

En otra realización a modo de ejemplo, el marcador fluorescente es una nanopartícula fluorescente sensible al pH, siempre que la marca fluorescente fluorezca más a un pH ácido que a un pH mayor. Las nanopartículas fluorescentes sensibles al pH emplean principalmente polímeros conjugados con colorantes sensibles al pH moleculares pequeños (Srikun, D., J. Chem. Sci. 2011, 2, 1156; Benjaminsen, R. V., ACS Nano 2011, 5, 5864; Albertazzi, L., J. Am. Chem. Soc. 2010, 132, 18158; Urano, Y., Nat. Med. 2009, 15, 104) o el uso de conectores sensibles al pH con colorantes insensibles al pH conjugados (Li, C, Adv. Fund. Mater. 2010, 20, 2222; Almutairi, J. Am. Chem. Soc. 2007, 130, 444). Para ilustración adicional, el documento de patente WO 2013152059 describe nanoplataformas fluorescentes multicoloreadas altamente activables ajustables por pH que se pueden adaptar para su uso en los presentes ensayos.

Así, en el presente documento se proporciona en un aspecto un método de evaluación de la actividad de fagocitosis que comprende incubar las células con segmentos externos de los fotorreceptores (POS) durante un tiempo y temperatura suficientes para que las células fagociten los POS, en donde los POS están marcados con una marca fluorescente que fluoresce más a un pH ácido que a un pH mayor, y detectar la intensidad de fluorescencia de las células después de la incubación, en donde un aumento en la fluorescencia en comparación con un control indica fagocitosis de los POS por las células, en donde las células se incuban con los POS a una temperatura que varía desde 25-40 °C, o 34-40 °C, o a 37 °C, y en donde el control es células incubadas con los POS a una temperatura que varía desde 10-16 °C o 12-15 °C.

En algunas realizaciones, las células se incuban con los POS a una temperatura que varía desde aproximadamente temperatura ambiente hasta aproximadamente 37 °C o aproximadamente temperatura ambiente a aproximadamente 40 °C. En algunas realizaciones, las células se incuban con los POS a aproximadamente temperatura ambiente, a aproximadamente temperatura fisiológica, o a aproximadamente 37 °C.

En el presente documento también se proporciona un método según las reivindicaciones para evaluar la actividad de fagocitosis de una población de células adheridas que comprende incubar una población de células adheridas con segmentos externos de los fotorreceptores (POS) durante un tiempo y temperatura suficientes para que las células en la población de células fagociten los POS, en donde los POS están marcados con una marca fluorescente que fluoresce más a un pH ácido que a un pH mayor, y detectar la intensidad de fluorescencia de la población de células después de la incubación, en donde un aumento en la fluorescencia en comparación con un control indica fagocitosis de los POS por las células.

La población de células adheridas se incuba con los POS a una temperatura que varía desde 25-40 °C, o desde 34­ 40 °C, o a una temperatura de 37 °C. El control es una población de células incubadas con los POS a una temperatura de 10-16 °C. En algunas realizaciones, el control es una población de células incubadas con los POS a una temperatura de 12-15 °C.

En el presente documento también se proporciona un método de evaluación de la actividad de fagocitosis según las reivindicaciones en donde los segmentos externos de los fotorreceptores (POS) se marcan con una marca fluorescente que tiene un aumento de señal de fluorescencia cuando se internalizan por fagocitosis en un compartimento de pH bajo en una célula con respecto a la señal de fluorescencia cuando están presentes extracelularmente; y que comprende detectar el aumento de fluorescencia, si lo hay, en las células de prueba después de la incubación con los POS marcados, y cuantificar la actividad de fagocitosis de las células de prueba a partir del mismo.

Según las reivindicaciones, la señal de fluorescencia alterada (cuando la marca se internaliza por fagocitosis en un compartimento a pH bajo) es un aumento en la intensidad de la señal de fluorescencia con respecto a cuando la marca fluorescente está presente extracelularmente. En algunas realizaciones, la señal de fluorescencia alterada (cuando la marca está internalizada por fagocitosis en un compartimento de pH bajo) es detectable por citometría de flujo. En algunas realizaciones, la señal de fluorescencia alterada distingue entre POS marcados internalizados por fagocitosis y POS marcados unidos sobre la superficie de las células de prueba, pero no internalizados. Según las reivindicaciones, la señal de fluorescencia alterada detectada en las células de prueba se compara con una población de células de control incubadas con POS marcados para cuantificar la actividad de fagocitosis de las células de prueba.

En algunas realizaciones, las células de prueba se incuban con POS marcados a aproximadamente temperatura ambiente, a aproximadamente temperatura fisiológica, a aproximadamente 37 °C, o entre temperatura ambiente y 37 °C, o entre temperatura ambiente y 40 °C.

También se proporciona un método de evaluación de la actividad de fagocitosis según las reivindicaciones, que comprende proporcionar segmentos externos de los fotorreceptores (POS) marcados con una marca fluorescente que tiene un aumento de señal de fluorescencia cuando se internaliza por fagocitosis en un compartimento de pH bajo en una célula con respecto a la señal de fluorescencia cuando está presente extracelularmente; incubar células de prueba adheridas con los POS marcados en condiciones que permiten la fagocitosis de los POS marcados; y detectar el aumento de fluorescencia, si lo hay, en las células de prueba adheridas después de la incubación con los POS marcados, y cuantificar la actividad de fagocitosis de las células de prueba adheridas a partir del mismo.

Según las reivindicaciones, las células de prueba se incuban con los POS a una temperatura que varía desde 25­ 40 °C, o desde 34-40 °C, o a una temperatura de 37 °C. La señal de fluorescencia alterada detectada en las células de prueba adheridas se compara con una población de células de control incubadas con POS marcados a una temperatura que mantiene la viabilidad de las células, pero induce baja o ninguna fagocitosis. Según las reivindicaciones, dicha temperatura puede variar de12-15 °C, para cuantificar la actividad de fagocitosis de las células de prueba. Según las reivindicaciones, la población de células de control se incuba con los POS a una temperatura de aproximadamente 10-16 °C.

También se describe en el presente documento una preparación de segmentos externos de los fotorreceptores (POS) marcados para evaluar la actividad fagocítica de una población de células de prueba, estando los POS marcados con una marca fluorescente que tiene una señal de fluorescencia alterada cuando se internalizan por fagocitosis en un compartimento de pH bajo en una célula con respecto a la señal de fluorescencia cuando la marca fluorescente está presente extracelularmente. La señal de fluorescencia alterada (cuando la marca es internalizada por fagocitosis en un compartimento de pH bajo) puede ser un aumento en la intensidad de la señal de fluorescencia con respecto a cuando está presente extracelularmente. La señal de fluorescencia alterada (cuando la marca es internalizada por fagocitosis en un compartimento de pH bajo) puede ser detectable por citometría de flujo. La marca fluorescente puede ser pHrodo® Red. Los POS se pueden marcar con pHrodo® Red.

También se describe en el presente documento un método de medición de la actividad de fagocitosis en una población de células que comprende medir la fluorescencia de prueba en una población de células de prueba que se pone en contacto con segmentos externos de los fotorreceptores (POS) marcados fluorescentemente no con FITc , y comparar la fluorescencia de prueba medida con una fluorescencia de control, en donde el POS marcado fluorescentemente no con FITC fluoresce a un ácido pH pero no fluoresce o fluoresce mínimamente a pH mayor. La población de células de prueba se puede poner en contacto con POS fluorescentemente marcados no con FITC a una temperatura que varía desde aproximadamente temperatura ambiente hasta aproximadamente temperatura fisiológica, que incluye, por ejemplo, aproximadamente 37 °C (es decir, aproximadamente temperatura ambiente a aproximadamente 37 °C), o aproximadamente temperatura ambiente a aproximadamente 40 °C. La población de células de prueba se puede poner en contacto con POS fluorescentemente marcados no con FITC a una temperatura entre aproximadamente 15­ 40 °C, o a aproximadamente temperatura fisiológica, que incluye, por ejemplo, aproximadamente 37 °C. La fluorescencia de control puede ser fluorescencia de una población de células que se pone en contacto con los POS marcados fluorescentemente no con FITC a por debajo de la temperatura ambiente. La fluorescencia de control puede ser fluorescencia de una población de células que se pone en contacto con los POS fluorescentemente marcados no con FITC a 4 °C.

En algunas realizaciones existe un método de medición de la actividad de fagocitosis en una población de células adheridas que comprende medir la fluorescencia de la prueba en una población de células de prueba adheridas que se pone en contacto con segmentos externos de los fotorreceptores (POS) fluorescentemente marcados no con FITC, y comparar la fluorescencia de prueba medida con una fluorescencia de control, en donde el POS marcado fluorescentemente no con FITC fluoresce a un pH ácido pero no fluoresce o fluoresce mínimamente a pH mayor. En algunas realizaciones, la población de células de prueba se pone en contacto con POS fluorescentemente marcado no FITC a una temperatura que varía desde 25-40 °C, o desde 34-40 °C, o una temperatura de 37 °C. En algunas realizaciones, la fluorescencia de control es fluorescencia de una población de células adheridas que se pone en contacto con el POS fluorescentemente marcado no con FITC a temperatura de aproximadamente 12-15 °C. En algunas realizaciones, la fluorescencia de control es fluorescencia de una población de células adheridas que se pone en contacto con el POS fluorescentemente marcado no con FITC a temperatura de aproximadamente 10-16 °C.

En el presente documento también se proporciona un método de medición de la actividad de fagocitosis que comprende (1) medir una fluorescencia de prueba en una primera alícuota de una población de células incubada con segmentos externos de los fotorreceptores (POS) marcados con pHrodo® Red y/o con pHrodo® Red E. coli BioParticles, a una temperatura que varía desde 25-40 °C, o 34-40 °C, o 37 °C, y (2) medir una fluorescencia de control en una segunda alícuota de la población de células incubada con segmentos externos de los fotorreceptores (POS) marcados con pHrodo® Red y/o con pHrodo® Red E. coli BioParticles, a una temperatura que varía desde 10-16 °C, opcionalmente desde 12-15 °C, en donde una fluorescencia de prueba que es mayor que una fluorescencia de control indica la actividad de fagocitosis de la población de células.

En el presente documento también se proporciona un método de medición de la actividad de fagocitosis que comprende (1) medir una fluorescencia de prueba en una primera alícuota de una población de células adheridas incubada con segmentos externos de los fotorreceptores (POS) marcados con pHrodo® Red y/o con pHrodo® Red E. coli BioParticles, a una temperatura que varía desde 25-40 °C, o desde 34-40 °C, o una temperatura de 37 °C, y (2) medir una fluorescencia de control en una segunda alícuota de la población de células adheridas incubada con segmentos externos de los fotorreceptores (POS) marcados con pHrodo® Red y/o con pHrodo® Red E. coli BioParticles, a temperatura que varía desde 10-16 °C o 12-15 °C, en donde una fluorescencia de prueba que es mayor que una fluorescencia de control indica la actividad de fagocitosis de la población de células.

Diversas realizaciones se aplican igualmente a todos y cada uno de los aspectos anteriormente mencionados. Estos se citan a continuación.

Según las reivindicaciones, las células, la población de células, células de prueba, o población de células de prueba, se incuban con POS marcados a una temperatura que varía desde 25-40 °C, o desde 34-40 °C, o a una temperatura de 37 °C.

Según las reivindicaciones, las células de control, población de células de control, células de prueba de control, o población de células de prueba de control se incuban con los POS a una temperatura que varía desde 10-16 °C o desde 12-15 °C.

En algunas realizaciones, las células, la población de células, las células de prueba, o la población de células de prueba comprenden células del epitelio pigmentario de la retina (RPE). En algunas realizaciones, las células, la población de células, las células de prueba, o la población de células de prueba, comprenden células progenitoras de fotorreceptores. En algunas realizaciones, las células, la población de células, las células de prueba, o la población de células de prueba, son células humanas.

En algunas realizaciones, las células, la población de células, las células de prueba, o la población de células de prueba, se producen por diferenciación in vitro de células madre pluripotentes.

En algunas realizaciones, las células, la población de células, las células de prueba, o la población de células de prueba, se crioconservaron y se descongelaron antes de uso.

En algunas realizaciones, las células, la población de células, las células de prueba, o la población de células de prueba, se proporcionan como una monocapa confluente.

En algunas realizaciones, las células, la población de células, las células de prueba, o la población de células de prueba, son digeridas o es digerida por enzimas antes de uso.

En algunas realizaciones, las células, la población de células, las células de prueba, o la población de células de prueba, se proporciona o se proporcionan como una población de células adheridas.

En algunas realizaciones, los POS son POS fragmentados. En algunas realizaciones, los POS son POS sonicados.

En algunas realizaciones, la marca fluorescente es pHrodo® Red. Así, en algunas realizaciones, los POS se marcan con el colorante pHrodo® Red. En algunas realizaciones, las células se incuban con POS marcados con pHrodo® Red y pHrodo® Red E. coli BioParticles.

En algunas realizaciones, la fluorescencia se detecta por citometría de flujo. En algunas realizaciones, la fluorescencia se detecta usando un lector de placas.

En algunas realizaciones, las células se incuban con los POS durante aproximadamente 15-30 horas, o 16-20 horas, o 20-28 horas.

En algunas realizaciones, las células se proporcionan como un cultivo celular. En algunas realizaciones, las células son un cultivo celular confluente.

Se debe entender que las células de prueba o de control pueden ser alícuotas diferentes de la misma población de células.

También se describe en el presente documento una población aislada de células caracterizada por tener una tasa de fagocitosis de segmentos externos de los fotorreceptores (POS) que es al menos 50 % superior a una tasa de fagocitosis de POS para un número equivalente de células primarias. La población de células puede ser una población de células RPE. La población de células puede ser una población de células RPE obtenida por diferenciación in vitro de células madre pluripotentes y las células primarias son células RPE de ojos adultos aislados. La población de células puede ser progenitores de fotorreceptores.

Estos y diversos otros aspectos y realizaciones se describirán en mayor detalle en el presente documento.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

FIG. 1A-C. Análisis por FACS de fagocitosis por RPE. (A) ROS marcados con FITC. (B) ROS marcados con pHrodo®. Se muestran los gráficos para el control en el que no se añadieron ROS, el control en el que se añadieron ROS y las células se incubaron a 4 °C, y la prueba en la que se añadieron ROS y las células se incubaron a 37 °C. (C) BioParticles marcados con pHrodo® (fragmentos bacterianos). Se muestran los gráficos para el control en el que no se añadieron partículas, el control en el que se añadieron partículas y las células se incubaron a 4 °C, y la prueba en la que se añadieron las partículas y las células se incubaron a 37 °C. Se debe entender que POS y ROS se usan indistintamente en el presente documento para referirse a segmentos externos de bastones de los fotorreceptores.

FIG. 2A-B. Dependencia del pH de la fluorescencia de ROS marcados con FITC (A) y pHrodo® (B). Se representa la fluorescencia a pH neutro y a un pH ácido.

FIG. 3A-F. Análisis de FACS de fagocitosis de ROS fluorescentemente marcados por células ARPE19 en monocapa. No se observó respuesta de fagocitosis dependiente de la dosis cuando diferentes concentraciones de ROS fluorescentemente marcados se incubaron con ARPE-19 durante 24 horas en una monocapa de células. (A) Se incubaron ARPE-19 con 6x106 ROS marcados con pHrodo® Red a 37 °C. (B) Se incubaron ARPE-19 con 3x106 ROS marcados con pHrodo® Red a 37 °C. (C) Se incubaron ARPE-19 con 1,5x106 ROS marcados con pHrodo® Red a 37 °C. (D) Se incubaron ARPE-19 con 6x106 ROS marcados con pHrodo® Red a 15 °C. (E) Se incubaron ARPE-19 con 3x106 ROS marcados con pHrodo® Red a 15 °C. (F) Se incubaron ARPE-19 con 1,5x106 ROS marcados con pHrodo® Red a 15 °C. En cada uno, se muestran los gráficos para las células incubadas sin ROS y para células incubadas con ROS.

FIG. 4A-F. Análisis por FACS de fagocitosis de ROS fluorescentemente marcados por células RPE derivadas de hESC. No se observó respuesta de la fagocitosis dependiente de la dosis cuando diferentes concentraciones de ROS fluorescentemente marcados se incubaron con RPE durante 24 horas a 37 °C en una monocapa de células. La sonicación por pulsos de ROS fluorescentemente marcados durante la reconstitución aumentó la fagocitosis en aproximadamente el 10 %. (A) Células RPE incubadas con 3,75x106 ROS marcados con pHrodo® Red reconstituidas sin sonicación. (B) Células RPE incubadas con 5x106 ROS marcados con pHrodo® Red reconstituidas sin sonicación. (C) Células RPE incubadas con 7,5x106 ROS marcados con pHrodo® Red reconstituidas sin sonicación. (D) Células RPE incubadas con 10x106 ROS marcados con pHrodo® Red reconstituidas sin sonicación. (E) Células RPE incubadas con 10x106 ROS marcados con pHrodo® Red reconstituidas con sonicación. (F) Células RPE incubadas con 13,5x106 ROS marcados con pHrodo® Red reconstituidas con sonicación.

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Se puede evaluar la fagocitosis (ensayo de potencia) por análisis cuantitativo de citometría de flujo activada por fluorescencia (FACS) de cultivos RPE expuestos a segmentos externos de los fotorreceptores (POS) marcados con el colorante pHrodo® Red (Life Technologies, Molecular Probes).

La fagocitosis se puede evaluar por un ensayo basado en FACS usando POS marcados con el colorante pHrodo® Red (Life Technologies, Molecular Probes). El colorante y los POS así marcados fluorescen cuando se internalizan en el entorno de pH reducido de los fagosomas intracelulares. Los POS se pueden marcar como se describe en el presente documento.

En algunas realizaciones, los cultivos de células RPE son confluentes. Como un ejemplo, se pueden cultivar RPE confluentes en placas multipocillo, y se pueden incubar con POS marcados con el colorante pHrodo® Red, opcionalmente en presencia de medio independiente de CO² (Invitrogen). La incubación puede ocurrir durante cualquier tiempo suficiente para que las células RPE fagociten los POS. Como un ejemplo, la incubación puede ocurrir durante 16-20 horas. El ensayo ocurre a una temperatura suficiente para que las células RPE fagociten los POS. En algunas realizaciones, el ensayo ocurre a aproximadamente temperatura fisiológica o a aproximadamente 37 °C. En algunas realizaciones, el ensayo ocurre a temperatura ambiente. En algunos ejemplos de referencia descritos en el presente documento, las placas de control (o control negativo) se incuban a 4 °C. Las células se pueden examinar bajo el microscopio, la fluorescencia se mide usando lectores de placas y/o las células se pueden recoger después de la digestión enzimática (por ejemplo, digestión con tripsina) y se analiza por citometría de flujo.

Un ejemplo no limitante a modo de ejemplo es el siguiente:

Se prueban RPE fabricados a partir de células madre pluripotentes (tales como, pero no se limitan a, célula ES y células iPS) como se describe previamente para su capacidad para fagocitar. El RPE crioconservado se puede haber congelado y descongelado previamente antes de uso. Las células RPE se siembran en cultivo en un medio adecuado y se cultivan hasta la confluencia y se mantienen en cultivo antes de la prueba para su capacidad para fagocitar POS marcado con el colorante pHrodo® Red que fluoresce cuando se internaliza en el entorno ácido de fagosomas de las células RPE. Las células RPE se incuban con los POS marcados a 37 °C para permitir la fagocitosis, o a 4 °C como control negativo (ejemplo de referencia). Los desplazamientos en la intensidad de la fluorescencia se pueden detectar por citometría de flujo para las células incubadas a 37 °C, que indica la fagocitosis de los POS marcados. La integración estadística de los picos da los porcentajes de células positivas fagocíticas para cada lote de células RPE y temperatura de incubación.

Como se entenderá por la presente divulgación, la fagocitosis se detecta incubando células RPE con POS marcados que fluorescen en el espectro rojo en el entorno ácido de los fagosomas. Los porcentajes de células positivas fagocíticas se pueden mostrar para las células incubadas a 37 °C o a 4 °C (control negativo), como se detecta por citometría de flujo.

La población de células RPE resultante se puede caracterizar basándose en su actividad fagocítica según los métodos proporcionados en el presente documento. Se pueden determinar las tasas de fagocitosis y así se caracterizan las células RPE. Por ejemplo, las células RPE se pueden caracterizar por tener una tasa de fagocitosis de segmentos externos de los fotorreceptores (POS) que es al menos el 50 por ciento superior a la tasa de fagocitosis de POS para un número equivalente de células RPE aisladas de ojos adultos, o al menos 75, 100, 150 o 200 por ciento superior a la tasa de fagocitosis de POS para un número equivalente de células RPE aisladas de ojos adultos. Alternativamente o además, las células RPE se pueden caracterizar por una tasa de fagocitosis de segmentos externos de los fotorreceptores (POS) que es al menos el 20 por ciento de la concentración total de POS después de 24 horas, o al menos 25, 30, 25, 40 o 50 por ciento de la concentración total de POS después de 24 horas.

Así, usando los métodos descritos en el presente documento, se han logrado poblaciones de células RPE que tienen una tasa de fagocitosis de segmentos externos de los fotorreceptores (POS) que es al menos el 50 por ciento superior a la tasa de fagocitosis de POS para un número equivalente de células RPE aisladas de ojos adultos (es decir, pacientes adultos humanos de la edad de 25-80, más preferentemente adultos de la edad de 50-80), y más preferentemente al menos el 75, 100, 150 o incluso el 200 por ciento mayor.

Usando los métodos descritos en el presente documento, se han logrado poblaciones de células RPE que tienen una tasa de fagocitosis de segmentos externos de los fotorreceptores (POS) que es al menos el 20 por ciento de la concentración total de POS después de 24 horas, y más preferentemente al menos el 25, 30, 25, 40 o incluso el 50 por ciento de la concentración total de POS después de 24 horas.

Así, en el presente documento se describe un método que comprende detectar o medir la fluorescencia en una célula RPE (o una población de células RPE) que se pone en contacto con segmentos externos de los fotorreceptores (POS) fluorescentemente marcados que no se han marcado fluorescentemente con FITC (considerada la fluorescencia de prueba, o, en general, "prueba")) y comparar la fluorescencia detectada o medida con un control (considerada la fluorescencia de control o, en general, "control"). La prueba se puede realizar a una temperatura que es aproximadamente temperatura ambiente, o una temperatura entre aproximadamente 15-40 °C, o a aproximadamente una temperatura fisiológica (por ejemplo, a aproximadamente 37 °C). El control se puede realizar a aproximadamente 4 °C. Así, la fluorescencia de control puede ser la fluorescencia que se detecta o se mide después de la incubación de células RPE con POS no marcados con FITC a 4 °C. Los POS fluorescentemente marcados no con FITC son POS que se marcan con un fluoróforo que no es FITC. La marca fluorescente distinta de FITC es una marca que fluoresce a un pH ácido tal como el pH de los fagosomas, y particularmente fagosomas de células RPE, pero que no fluoresce o que fluoresce mínimamente a pH mayores, tales como pH neutro (o un pH de entorno extracelular). La marca fluorescente distinta de FITC es útil en discriminar entre marcado superficial y marcas internalizadas. Un ejemplo de dicho fluoróforo es el colorante pHrodo® Red (Life Technologies, Molecular Probes). Un mayor grado de fagocitosis en la prueba se indica por una mayor fluorescencia en comparación con el control.

Así, en el presente documento se describe un método que comprende

(1) detectar o medir la fluorescencia en una primera alícuota de una célula RPE (o una población de células RPE) que se pone en contacto con (y se incuba con) segmentos externos de los fotorreceptores (POS) fluorescentemente marcados que se marcan con el colorante pHrodo® Red a 37 °C (considerado la fluorescencia de prueba, o, en general, "prueba")), y

(2) detectar o medir la fluorescencia en una segunda alícuota de una célula RPE (o una población de células RPE) que se pone en contacto con (y se incuba con) segmentos externos de los fotorreceptores (POS) fluorescentemente marcados que se marcan con el colorante pHrodo® Red a 4 °C (considerado la fluorescencia de control, o, en general, "control")), y

(3) comparar, determinar y/o cuantificar opcionalmente las fluorescencias de prueba y de control, en donde una fluorescencia de prueba que es mayor que una fluorescencia de control es una indicación de la actividad de fagocitosis de la célula RPE (o población de células).

Se debe entender que los métodos descritos en el presente documento también se pueden usar para ensayar la actividad de fagocitosis en células progenitoras (o precursoras) de fotorreceptores.

En ciertas realizaciones, las células RPE y progenitoras de fotorreceptores tienen actividad fagocítica, tal como la capacidad de fagocitar segmentos externos de los fotorreceptores pHrodo® Red aislados, pHrodo® Red E. coli BioParticles, o ambos, y los métodos proporcionados en el presente documento ensayan una o más de estas funciones.

En el presente documento se describe un ensayo para determinar la potencia de una composición farmacéutica que comprende: una pluralidad de células del epitelio pigmentario de la retina (RPE) o células progenitoras de fotorreceptores; y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En una realización, el contenido promedio de melanina de dicha pluralidad de células RPE es inferior a 8 pg/célula. Dichas células RPE, o células progenitoras de fotorreceptores, pueden estar contenidas en una suspensión, gel, coloide, matriz, sustrato, armazón o injerto.

Dicho vehículo farmacéuticamente aceptable puede comprender una disolución estéril que tiene una osmolalidad de entre aproximadamente 290 mOsm/kg y aproximadamente 320 mOsm/kg, o entre aproximadamente 300 mOsm/kg y 310 mOsm/kg, o aproximadamente 305 mOsm/kg. Dicho vehículo farmacéuticamente aceptable puede comprender una solución salina equilibrada. Dicha solución salina equilibrada puede comprender, consistir en, o consistir esencialmente en, en cada mL, cloruro sódico 7,14 mg, cloruro de potasio 0,38 mg, cloruro de calcio dihidratado 0,154 mg, cloruro de magnesio hexahidratado 0,2 mg, fosfato de sodio dibásico 0,42 mg, bicarbonato sódico 2,1 mg, dextrosa 0,92 mg, disulfuro de glutatión (glutatión oxidado) 0,184 mg y ácido clorhídrico y/o hidróxido sódico (para ajustar el pH a aproximadamente 7,4) en agua.

El volumen de dicha composición farmacéutica puede ser entre aproximadamente 100 pL y 1000 pL o puede ser al menos aproximadamente 150 pL. Dicha composición farmacéutica puede comprender entre aproximadamente 1.000 y aproximadamente 1x109 células RPE viables. Dicha composición farmacéutica puede comprender entre aproximadamente 333 células RPE viables/pL y aproximadamente 2.000 células RPE viables/pL, entre aproximadamente 444 células RPE viables/pL y aproximadamente 1766 células RPE viables/pL, aproximadamente 333 células RPE viables/pL, aproximadamente 444 células RPE viables/pL, aproximadamente 666 células RPE viables/pL, aproximadamente 888 células RPE viables/pL, aproximadamente 999 células RPE viables/pL, o aproximadamente 1.333 células RPE viables/pL.

La concentración de células RPE en dicha composición farmacéutica puede ser suficientemente alta de manera que no más de aproximadamente el 30 % de dichas células RPE pierda la viabilidad en 60 minutos, y opcionalmente no más de aproximadamente el 10 % de dichas células RPE pierda viabilidad en 4 horas. Dicha concentración de células RPE puede ser al menos aproximadamente 1.000 células/pL, al menos aproximadamente 2.000 células/pL, entre aproximadamente 1.000-10.000 células/pL, o entre aproximadamente 2.000-5.000 células/pL.

La preparación farmacéutica puede comprender menos de aproximadamente el 25 %, 20 %, 15 %, 10 %, 5 %, 1 %, 0,5 %, 0,1 %, 0,01 %, 0,001 % o el 0,0001 % de células que pueden no ser células RPE.

El contenido promedio de melanina de dichas células RPE puede ser inferior a 8 pg/célula, inferior a 7 pg/célula, inferior a 6 pg/célula, inferior a 5 pg/célula, inferior a 4 pg/célula, inferior a 3 pg/célula, inferior a 2 pg/célula y al menos 0,1 pg/célula y opcionalmente al menos 0,5 pg/célula o 1 pg/célula; entre 0,1-8 pg/célula, entre 0,1-7 pg/célula, entre 0,1-6 pg/célula, entre 0,1-5 pg/célula, entre 0,1-4 pg/célula, entre 0,1-3 pg/célula, entre 0,1-2 pg/célula, entre 0,1-1 pg/célula, entre 1-7 pg/célula, entre 0,5-6 pg-célula, o entre 1-5 pg/célula.

Al menos el 50 %, al menos el 60 %, al menos el 70 % o al menos el 80 % de las células en dicha composición farmacéutica pueden ser bestrofina+. Al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 % o al menos el 99 % de las células en dicha composición farmacéutica pueden ser PAX6+ y/o MITF+. Al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 % o al menos el 99 % de las células en dicha composición farmacéutica pueden ser PAX6+ y/o bestrofina+. Al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, al menos el 95 % o al menos el 99 % de las células en dicha composición farmacéutica pueden ser ZO-1+. Al menos el 50 %, al menos el 60 % o al menos el 70 % de las células en la composición farmacéutica pueden ser PAX6+ y bestrofina+. Al menos el 90 %, al menos el 95 % o al menos el 99 % de las células en dicha composición farmacéutica pueden ser PAX6+.

No más de aproximadamente una célula por millón de células y opcionalmente no más de dos células por nueve millones de células en dicha composición farmacéutica pueden ser positivos para tanto la expresión de OCT-4 como de fosfatasa alcalina (AP).

Una aguja o una cánula de inyección pueden contener al menos una porción de dichas células RPE. La concentración de dichas células RPE tras la carga en dicha aguja o cánula de inyección puede estar entre aproximadamente 444 células viables/pL y aproximadamente 1.766 células viables/pL. La concentración de células RPE viables a administrar de dicha aguja o cánula de inyección puede ser entre aproximadamente 333 células viables/pL y aproximadamente 1.333 células viables/pL. El diámetro de dicha aguja o cánula de inyección puede ser entre aproximadamente 0,3 mm y aproximadamente 0,9. El diámetro de dicha aguja o cánula de inyección puede ser entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 0,6 mm. Dicha aguja o cánula de inyección puede comprender una punta que tiene un diámetro entre aproximadamente 0,09 mm y aproximadamente 0,15 mm. Dicha cánula puede ser una cánula MEDONE POLYTIP® 25/38g (una cánula de 0,50 mm (25g) x 28 mm con 0,12 mm (38g) x 5 mm de punta) o una cánula de inyección Synergetics Angled 39g.

Dichas células RPE pueden comprender células RPE que se han crioconservado y descongelado.

Dichas células RPE pueden ser humanas.

Dichas células RPE, tales como células RPE humanas, se pueden producir a partir de cualquier fuente que incluya células pluripotentes, tales como células madre embrionarias o células madres pluripotentes inducidas, así como tejido adulto o fetal de donante. Dicha célula madre pluripotente que puede ser positiva para la expresión de uno o más marcadores puede comprender OCT-4, fosfatasa alcalina, Sox2, TDGF-1, SSEA-3, Ss EA-4, t Ra -1 -60 y/o TRA-1 -81. Dichas células pluripotentes pueden ser células pluripotentes humanas que se pueden cultivar en una población multicapa o cuerpo embrioide durante un tiempo suficiente para que las células epiteliales pigmentadas aparezcan en dicho cultivo. Dicho tiempo suficiente para que las células epiteliales pigmentadas aparezcan en dicho cultivo puede comprender al menos aproximadamente 1 semana, al menos aproximadamente 2 semanas, al menos aproximadamente 3 semanas, al menos aproximadamente 4 semanas, al menos aproximadamente 5 semanas, al menos aproximadamente 6 semanas, o al menos aproximadamente 7 semanas, al menos aproximadamente 8 semanas. Dicha población multicapa o cuerpo embrioide se puede cultivar en un medio que puede comprender DMEM. Dicho medio puede comprender, consistir esencialmente en, o consistir en, EB-DM. Dichas células epiteliales pigmentadas se pueden aislar y cultivar, produciendo así una población de células RPE. Dicho aislamiento puede comprender disociar las células o grupos de células del cultivo enzimáticamente, químicamente o físicamente y la selección de las células epiteliales pigmentadas o grupos de células puede comprender células epiteliales pigmentadas. Dicho cuerpo embrioide se puede cultivar en suspensión y/o como un cultivo adherido (por ejemplo, en suspensión seguido por cultivo adherido). Dicho cuerpo embrioide cultivado como cultivo adherido puede producir una o más excrecencias que comprenden células epiteliales pigmentadas. Dichas células madre pluripotentes tienen complejidad reducida del antígeno HLA. Antes de la formación de RPE, dichas células pluripotentes se pueden cultivar en una matriz que se puede seleccionar del grupo que consiste en laminina, fibronectina, vitronectina, proteoglicano, entactina, colágeno, colágeno I, colágeno IV, colágeno VIII, sulfato de heparano, Matrigel(TM) (una preparación soluble de células de sarcoma de ratón de Engelbreth-Holm-Swarm (EHS)), CellStart, un extracto de membrana basal humana y cualquier combinación de las mismas. Dicha matriz puede comprender Matrigel(TM) (una preparación soluble de células de sarcoma de ratón de Engelbreth-Holm-Swarm (EHS)).

La composición farmacéutica puede comprender células que carecen de expresión sustancial de uno o más marcadores de células madre embrionarias. Dicho uno o más marcadores de células madre embrionarias pueden comprender OCT-4, NANOG, Rex-1, fosfatasa alcalina, Sox2, TDGF-1, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1 -60 y/o TRA-1 -81.

Dichas células RPE pueden ser positivas para la expresión de uno o más marcadores de células RPE. Dicho uno o más marcadores de células RPE pueden comprender RPE65, CRALBP, PEDF, bestrofina, MITF, Otx2, PAX2, PAX6, ZO-1 y/o tirosinasa.

Dichas células RPE se pueden producir por un método que comprende mantener las células RPE como células quiescentes durante un tiempo suficiente para obtener dicho contenido promedio de melanina. Dichas células RPE se pueden producir por un método que comprende mantener las células RPE como células quiescentes durante un tiempo suficiente para establecer la expresión de bestrofina en al menos el 50 % de dichas células RPE.

Dicha composición farmacéutica puede estar sustancialmente libre de células nodrizas embrionarias de ratón (MEF) y células madre embrionarias humanas (hES).

Las células RPE pueden cumplir al menos uno de los criterios citados en la Tabla 1 y/o fabricadas según las prácticas correctas de fabricación (GMP).

Dichas células de epitelios pigmentarios de la retina (RPE) crioconservadas o progenitores de fotorreceptores se pueden proporcionar como una composición crioconservada.

Dichas células RPE pueden presentar una tasa de fagocitosis de segmentos externos de los fotorreceptores (POS) que puede ser al menos el 50 por ciento superior a la tasa de fagocitosis de POS para un número equivalente de células RPE de ojos adultos aislados, o al menos el 75, 100, 150 o el 200 por ciento superior a la tasa de fagocitosis de POS para un número equivalente de células RPE de ojos adultos aislados; o una tasa de fagocitosis de segmentos externos de los fotorreceptores (POS) que puede ser al menos el 20 por ciento de la concentración total de POS después de 24 horas, o al menos el 25, 30, 25, 40 o el 50 por ciento de la concentración total de POS después de 24 horas. Dichos progenitores de fotorreceptores pueden presentar una tasa de fagocitosis de segmentos externos de los fotorreceptores (POS) que puede ser al menos el 50 por ciento superior a la tasa de fagocitosis de POS para un número equivalente de progenitores de fotorreceptores de ojos adultos aislados, o al menos el 75, 100, 150 o el 200 por ciento superior a la tasa de fagocitosis de POS para un número equivalente de progenitores de fotorreceptores de ojos adultos aislados; o una tasa de fagocitosis de segmentos externos de los fotorreceptores (POS) que puede ser al menos el 20 por ciento de la concentración total de POS después de 24 horas, o al menos el 25, 30, 25, 40 o el 50 por ciento de la concentración total de POS después de 24 horas. La tasa y el grado de fagocitosis pueden depender del tiempo de incubación y de la madurez de las células. Las tasas de unión e internalización de POS puede ser diferentes basándose en la madurez y la pigmentación de las células. El porcentaje de células capaces de fagocitosis puede ser diferente basándose en la madurez de los cultivos celulares.

Marcando los segmentos externos de los fotorreceptores con un colorante que no es fluorescente o débilmente fluorescente a pH neutro, pero que es más fluorescente después de la acidificación, es posible una medición más sensible de POS internalizados en células RPE o progenitores de fotorreceptores en un ensayo de fagocitosis. La mayoría de los métodos cuantitativos usados para la evaluación de la fagocitosis (FACS, lector de placas de fluorescencia) no discriminan entre partículas fluorescentes internalizadas y unidas a la superficie. Además, la fluorescencia de FITC es sensible al pH y se reduce significativamente a pH inferior a 6, mientras que el pH de los lisosomas y los fagosomas fusionados con lisosomas es inferior a 5. Así, la fluorescencia de OS marcados con FITC en algunos casos no es representativa de la cantidad real de OS internalizados. Según su fabricante (Life Technologies, Molecular Probes), el colorante basado en rodamina sensible al pH pHrodo® Red no es fluorescente a pH neutro, que tras la acidificación se vuelve rojo brillante. El colorante es tanto fluorogénico como sensible al pH, y, por lo tanto, se puede usar como sensor específico de acontecimientos fagocíticos por lo que la acidificación del fagosoma después de la fagocitosis se indica por fluorescencia roja.

El uso de un colorante que no es fluorescente o es débilmente fluorescente a pH neutro, pero es más fluorescente después de la acidificación, tal como pHrodo® Red y CypHer5E que también es fluorescente de forma máxima en un entorno ácido, el colorante LysoSensor por Life Technologies, para marcar segmentos externos de los fotorreceptores es una mejora significativa con respecto a los métodos y reactivos del estado de la técnica. Los presentes inventores usaron este colorante basado en rodamina sensible al pH pHrodo® Red para marcar OS bovinos para medir específicamente las partículas internalizadas.

Cuando se comparan los segmentos externos de los fotorreceptores marcados con FITC, los segmentos externos de los fotorreceptores marcados con pHrodo®- BioParticles y pHrodo® mostraron todos un aumento significativo en la fluorescencia (FIG. 1A-C) en el ensayo de fagocitosis a 37 °C en comparación con 4 °C. Sin embargo, el análisis cuantitativo mostró que solo aproximadamente la mitad de la población de células RPE a 37 °C en el ensayo de fagocitosis mostraron un aumento en la fluorescencia durante el control a 4 °C cuando se incuba con partículas marcadas con FITC (FIG. 1A), y en el control a 4 °C aproximadamente la mitad de la población de células RPE también mostró un aumento significativo en la fluorescencia, que posiblemente indica la presencia de partículas unidas, pero no internalizadas, sobre la superficie celular. Dichas partículas sobre la superficie celular podrían representar tanto unión específica como no específica. Además, la interpretación de los datos de FACS de los segmentos externos de los fotorreceptores marcados con FITC no es muy precisa debido a que se podría perder algo de la fluorescencia de FITC a pH bajo (FIG. 2), por lo que una vez las partículas son internalizadas y los fagosomas se fusionan con los lisosomas, al pH bajo final (4,5-5,5) se pierde algo de la fluorescencia de FITC. Así la fluorescencia como se mide incluye la pérdida de algo de señal de las partículas internalizadas y señal adicional de las partículas no específicamente unidas sobre la superficie. Tanto BioParticles marcadas con pHrodo® como segmentos externos de los fotorreceptores marcados con pHrodo® no mostraron aumentos en la fluorescencia a 4 °C (FIG. 1B y 1C), pero mostraron un aumento a 37 °C, permitiendo así la medición específica de solo partículas internalizadas fusionadas con lisosomas.

Como se describe en el presente documento, ROS marcados con pHrodo® son fluorescentes a pH bajo, por lo que un desplazamiento observado en la fluorescencia indica partículas que son internalizadas. El uso de ROS marcado con FITC u otro colorante no sensible al pH tiende a mostrar partículas no específicamente unidas sobre la superficie celular, en concreto POS unido, pero no internalizado, y/o POS que se internaliza, pero no se fusiona con lisosomas. El marcado de segmentos externos de los fotorreceptores con pHrodo® u otro colorante sensible al pH, en lugar de FITC convencionalmente usado, cuya fluorescencia tiene una correlación inversa con la acidez, o el uso de POS marcados con pHrodo® en combinación con otro colorante sensible al pH y/o no sensible, es una mejora en la exactitud del ensayo de fagocitosis, ya que permite la medición de la fagocitosis de la diana fisiológicamente relevante y permite el análisis minucioso de los mecanismos de fagocitosis.

En algunas realizaciones, los POS se fragmentan antes de su uso con las células de interés. Los POS pueden ser fragmentados usando, por ejemplo, sonicación, o cizallamiento, u otros métodos en la técnica. Se ha encontrado, en algunos casos, que los POS fragmentados dan como resultado mayores lecturas de fagocitosis de las células. Esto puede ser útil en distinguir la actividad positiva de la actividad de control.

El ensayo de fagocitosis se puede llevar a cabo usando una suspensión de células individuales de células o se puede llevar a cabo usando una monocapa de células. Así, las células se pueden proporcionar como suspensiones de células o se pueden proporcionar como una monocapa, que incluye una monocapa cultivada. Esta última realización es útil, particularmente si las células crecen normalmente como una monocapa, ya que permite que se determine la actividad de fagocitosis de las células como si dichas células existieran normalmente. Las células se pueden incubar con los POS marcados como una capa adherida, tal como una monocapa, y luego se pueden digerir con enzima (por ejemplo, digerir con tripsina) para convertirlos en una población de células individuales que luego se puede analizar usando, por ejemplo, citometría de flujo.

Las células se incuban con POS a una temperatura que varía desde 25-40 °C, o 34-40 °C, o a 37 °C. La actividad de fagocitosis de prueba se puede medir a estas temperaturas. Las células se pueden proporcionar como una monocapa, que incluye una monocapa cultivada.

El control negativo corresponde a células incubadas con POS a una temperatura que varía desde 10-16 °C, 11-16 °C, o 12-16 °C. El control negativo corresponde alternativamente a células incubadas con POS a una temperatura que varía desde 10-15 °C, 11-15 °C, o 12-15 °C. Las células se pueden proporcionar como una monocapa, que incluye una monocapa cultivada.

En algunos casos, las células se han crioconservado previamente y se descongelan y se cultivan brevemente para establecer una monocapa. Una vez en la monocapa, la actividad de fagocitosis de las células se puede probar como se describe en el presente documento.

En algunas realizaciones, las células se pueden exponer a POS sin marcar durante un periodo de tiempo, y luego se exponen a POS fluorescentemente marcado para medir la fagocitosis para los últimos POS. De esta forma, las células se pueden sensibilizar antes de la introducción de los POS marcados.

Definiciones

Con el fin de que la invención descrita en el presente documento pueda ser completamente entendida, se expone la siguiente descripción detallada. Se describen con detalle diversas realizaciones de la invención y se pueden ilustrar aún más por los ejemplos proporcionados.

A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente es entendido por un experto habitual en la técnica a la que pertenece la presente invención. En el presente documento se proporcionan los siguientes términos y definiciones.

Como se usa en la descripción en el presente documento y en todas las reivindicaciones que siguen, el significado de "un", "una", "el" y "la" incluye referencia al plural, a menos que el contexto lo indique claramente de otro modo. Por tanto, como se usa en la descripción en el presente documento, el significado de "en" incluye "en" y "sobre", a menos que el contexto lo indique claramente de otro modo.

En toda esta memoria descriptiva, se entenderá que la palabra "comprender", o variaciones tales como "comprende" o "que comprende", implica la inclusión de un número entero establecido o grupos de números enteros, pero no la exclusión de cualquier otro número entero o grupo de números enteros.

"Células madre embrionarias" (células ES), como se usa en el presente documento, se refiere en líneas generales a células derivadas de la masa celular interna de blastocitos o mórulas que se han sometido a pases sucesivamente como estirpes celulares. Las células ES se pueden obtener de la fecundación de un óvulo con esperma o ADN, transferencia nuclear, partenogénesis, o por medios para generar células ES con homocigosidad en la región de HLA. Células ES también se puede referir a células derivadas de un cigoto, blastómeros, o embrión de mamífero de estadio blastocisto producido por la fusión de un espermatozoide y un óvulo, transferencia nuclear, partenogénesis, o la reprogramación de cromatina y posterior incorporación de la cromatina reprogramada en una membrana plasmática para producir una célula. Las células madre embrionarias, independientemente de su fuente o el método particular usado para producirlas, se pueden identificar basándose en: (i) la capacidad para diferenciar en células de las tres capas germinales, (ii) la expresión de al menos Oct-4 y fosfatasa alcalina, y (iii) la capacidad para producir teratomas cuando se trasplantan en animales inmunodeprimidos. El término también incluye células aisladas de uno o más blastómeros de un embrión, preferentemente sin destruir el resto del embrión (véase, por ejemplo, Chung et al., Cell Stem Cell. 2008 Feb 7 ;2(2):113-7; publicación de EE. UU. preconcedida N° 20060206953; publicación de EE. UU. preconcedida N° 2008/0057041). El término también incluye células producidas por transferencia nuclear de células somáticas, incluso cuando se usan células no embrionarias en el proceso. Las células ES se pueden obtener de la fecundación de un óvulo con un espermatozoide o ADN, transferencia nuclear, partenogénesis, o por medios para generar células ES con homocigosidad en la región HLA. Las células ES también son células derivadas de un cigoto, blastómeros, o embrión de mamífero de estadio blastocisto producido por la fusión de un espermatozoide y un óvulo, transferencia nuclear, partenogénesis, o la reprogramación de cromatina y posterior incorporación de la cromatina reprogramada en una membrana plasmática para producir una célula. Las células madre embrionarias humanas de la presente divulgación pueden incluir, pero no se limitan a, células madre embrionarias MA01, MA09, ACT-4, N° 3, H1, H7, H9, H14 y ACT30. En ciertas realizaciones, las células ES humanas usadas para producir células RPE se obtienen y mantienen según normas GMP.

"Degeneración macular", como se usa en el presente documento, se refiere en líneas generales a enfermedades caracterizadas por una pérdida progresiva de visión central asociada a anomalías de la membrana de Bruch, la retina neural y el epitelio del pigmento de la retina. Las enfermedades de degeneración macular incluyen, pero no se limitan a, degeneración macular senil, distrofia macular de Carolina del Norte, distrofia del fondo de Sorsby, enfermedad de Stargardt, distrofia en patrón, enfermedad de Best, malattia leventinese, coroiditis en panal de Doyne, drusas dominantes y drusas radiales.

"Célula madre pluripotente", como se usa en el presente documento, se refiere en líneas generales a una célula capaz de proliferación prolongada o prácticamente indefinida in vitro mientras que retiene su estado indiferenciado, que presenta un cariotipo estable (preferentemente normal) y que tiene la capacidad de diferenciarse en las tres capas germinativas (es decir, ectodermo, mesodermo y endodermo) en las condiciones apropiadas.

"Célula RPE", "célula RPE diferenciada", "célula RPE derivada de ES", como se usa en el presente documento, se pueden usar indistintamente en todo el presente documento para referirse en líneas generales a una célula RPE diferenciada de una célula madre pluripotente, por ejemplo, usando un método desvelado en el presente documento. El término se usa genéricamente para referirse a células RPE diferenciadas, independientemente del nivel de madurez de las células, y así puede englobar células RPE de diversos niveles de madurez. Las células RPE pueden ser visualmente reconocidas por su morfología en adoquín y el aspecto inicial del pigmento. Las células RPE también se pueden identificar molecularmente basándose en la ausencia sustancial de expresión de marcadores de células madre embrionarias, tales como Oct-4 y NANOG, así como basándose en la expresión de marcadores de RPE tales como RPE-65, PEDF, CRALBP y bestrofina. Por ejemplo, una célula se puede contar como positiva para un marcador dado marcador si se observa el patrón de tinción esperado, por ejemplo, PAX6 localizado en los núcleos, bestrofina localizada en la membrana plasmática en un patrón poligonal (que muestra tinción de bestrofina localizada en líneas nítidas en la periferia de las células), tinción de ZO-1 presente en las zonas de oclusión que revisten las células en un patrón poligonal, y tinción de MITF detectada confinada al núcleo. A menos que se especifique de otro modo, las células RPE, como se usa en el presente documento, se refieren a células RPE diferenciadas in vitro de células madre pluripotentes.

"Célula RPE madura" y "célula RPE diferenciada madura", como se usa en el presente documento, se pueden usar indistintamente en todo el presente documento para referirse en líneas generales a cambios que ocurren después de la diferenciación inicial de células RPE. Específicamente, aunque las células RPE se pueden reconocer, en parte, basándose en el aspecto inicial del pigmento, después de la diferenciación las células RPE maduras se pueden reconocer basándose en la mejora de la pigmentación.

"Pigmentado", como se usa en el presente documento, se refiere, en líneas generales, a cualquier nivel de pigmentación, por ejemplo, la pigmentación que ocurre inicialmente cuando las células RPE se diferencian de células ES. La pigmentación puede variar con la densidad celular y la madurez de las células RPE diferenciadas. La pigmentación de una célula RPE puede ser la misma que una célula RPE promedio después de la diferenciación terminal de la célula RPE. La pigmentación de una célula RPE puede estar más pigmentada que la célula RPE promedio después de la diferenciación terminal de la célula RPE. La pigmentación de una célula RPE puede estar menos pigmentada que la célula RPE promedio después de la diferenciación terminal.

"Progenitor de fotorreceptores" se refiere a células de la retina neural, que se pueden diferenciar de células madre embrionarias o células madre pluripotentes inducidas y que expresan el marcador PAX6, mientras que no expresan el marcador CHX10 (es decir, CHX10(-)). Estas células expresan transitoriamente CHX10 en el estadio de progenitor neural de la retina, pero la expresión de CHX10 se apaga cuando las células se diferencian en el estadio de progenitor de fotorreceptores. Otros marcadores expresados por los progenitores de fotorreceptores pueden incluir: Pax6, Nr2e3, Trp2, Mash1, RORp y NRL. Por tanto, "fotorreceptor" puede referirse a células posmitóticas diferenciadas de células madre embrionarias o células madre pluripotentes inducidas y que expresan el marcador celular rodopsina o cualquiera de las tres opsinas de los conos, y opcionalmente expresan la fosfodiesterasa cGMP de los bastones o conos. Los fotorreceptores también pueden expresar el marcador recoverina, que se encuentra en los fotorreceptores. Los fotorreceptores pueden ser fotorreceptores de bastones y/o conos.

Marcadores celulares: Los marcadores celulares a modo de ejemplo que se pueden evaluar para la expresión incluyen los siguientes: PAX6, RX1, SIX3, SIX6, LHX2, TBX3, SOX2, CHX10, nestina, TRp2, NR2E3, NRL, MASH1, RORp, recoverina, opsina, rodopsina, fosfodiesterasa cGMP de los bastones o conos, que se pueden evaluar en la proteína y/o ARNm (véase Fischer AJ, Reh TA, Dev Neurosci. 2001;23(4-5):268-76; Baumer et al., Development. 2003 Jul;130(13):2903-15, Swaroop et al., Nat Rev Neurosci. 2010 Aug;11(8):563-76, Agathocleous y Harris, Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2009. 25:45-69). Dichos identificadores de marcador se usan, en general, como en la bibliografía y en la técnica, particularmente en los campos de la técnica relacionados con los contextos en los que los identificadores génicos se citan en el presente documento, que pueden incluir bibliografía relacionada con fotorreceptores, bastones, conos, diferenciación de fotorreceptores, progenitores de fotorreceptores, diferenciación neural, células madre neurales, células madre pluripotentes y otros campos como se indica por el contexto. Además, los marcadores son, en general, humanos, por ejemplo, excepto donde el contexto lo indique de otro modo. Los marcadores celulares se pueden identificar usando métodos inmunocitoquímicos convencionales o métodos de PCR convencionales cuyas técnicas son bien conocidas por los expertos habituales en la técnica.

"Signos" de enfermedad, como se usa en el presente documento, se refiere, en líneas generales, a cualquier anomalía indicativa de enfermedad, descubrible en un examen del paciente; una indicación objetiva de enfermedad, a diferencia de un síntoma, que es una indicación subjetiva de enfermedad.

"Síntomas" de enfermedad, como se usa en el presente documento, se refiere, en líneas generales, a cualquier fenómeno patológico o desviación de la normalidad en la estructura, función o sensación, experimentada por el paciente e indicativo de enfermedad.

"Terapia", "terapéutico", "tratar" o "tratamiento", como se usa en el presente documento, se refiere, en líneas generales, a tratar una enfermedad, detener o reducir el desarrollo de la enfermedad o sus síntomas clínicos, y/o aliviar la enfermedad, causando la regresión de la enfermedad o sus síntomas clínicos. La terapia engloba la profilaxis, la prevención, el tratamiento, la cura, el remedio, la reducción, el alivio y/o proporcionar alivio de una enfermedad, signos y/o síntomas de una enfermedad. La terapia engloba un alivio de signos y/o síntomas en pacientes con signos y/o síntomas de enfermedad en curso (por ejemplo, ceguera, deterioro de la retina). La terapia también engloba "profilaxis" y "prevención". La profilaxis incluye prevenir la enfermedad que ocurre posterior al tratamiento de una enfermedad en un paciente o la reducción de la incidencia o intensidad de la enfermedad en un paciente. El término "reducido", para el fin de la terapia, se refiere, en líneas generales, a la reducción clínica significativa en los signos y/o los síntomas. La terapia incluye tratar recaídas o signos y/o síntomas recurrentes (por ejemplo, degeneración de la retina, pérdida de visión). La terapia engloba, pero no se limita a, impedir la aparición de signos y/o síntomas en cualquier momento, así como reducir los signos y/o síntomas existentes y eliminar los signos y/o síntomas existentes. La terapia incluye tratar enfermedad crónica ("mantenimiento") y enfermedad aguda. Por ejemplo, el tratamiento incluye tratar o prevenir recaídas o la reaparición de signos y/o síntomas (por ejemplo, ceguera, degeneración de la retina).

Las células RPE o progenitoras de fotorreceptores de la preparación pueden tener una tasa de fagocitosis de segmentos externos de los fotorreceptores (POS) que es al menos el 50 por ciento superior a la tasa de fagocitosis de POS para un número equivalente de células RPE de ojos adultos aislados (es decir, pacientes adultos humanos de la edad de 25-80, más preferentemente de adultos de la edad de 50-80), y más preferentemente al menos el 75, 100, 150 o incluso el 200 por ciento mayor. Los progenitores de fotorreceptores de la preparación pueden tener una tasa de fagocitosis de segmentos externos de los fotorreceptores (POS) que es al menos el 50 por ciento superior a la tasa de fagocitosis de POS para un número equivalente de células progenitoras de fotorreceptores aisladas de ojos adultos (es decir, pacientes adultos humanos de la edad de 25-80, más preferentemente adultos de la edad de 50­ 80), y más preferentemente al menos el 75, 100, 150 o incluso el 200 por ciento mayor.

Las células RPE o progenitoras de fotorreceptores de la preparación pueden tener una tasa de fagocitosis de segmentos externos de los fotorreceptores (POS) que es al menos el 20 por ciento de la concentración total de POS después de 24 horas, y más preferentemente al menos el 25, 30, 25, 40 o incluso el 50 por ciento de la concentración total de POS después de 24 horas. La fagocitosis de POS se puede medir, como un ejemplo ilustrativo y no limitante, usando los protocolos descritos en Bergmann et al. FASEB Journal March 2004 vol. 18 páginas 562-564, con la variación de los POS no marcados con FITC descritos en el presente documento

Las poblaciones de células RPE o progenitoras de fotorreceptores pueden incluir células RPE diferenciadas de niveles variables de madurez, o pueden ser sustancialmente puras con respecto a células RPE diferenciadas de un nivel particular de madurez. Las células RPE pueden ser una preparación sustancialmente purificada que comprende células RPE de niveles variables de madurez/pigmentación.

Preparaciones crioconservadas de células RPE

Las células RPE o progenitores de fotorreceptores se pueden almacenar por cualquier método apropiado conocido en la técnica (por ejemplo, congelar criogénicamente) y se pueden congelar a cualquier temperatura apropiada para el almacenamiento de las células. Antes de usar estas células, se pueden probar en un ensayo de la invención para determinar la actividad de fagocitosis y/o potencia de las células.

Las células RPE o células progenitoras de fotorreceptores que muestran potencia en el ensayo de fagocitosis de la invención se pueden usar para tratar enfermedades de degeneración de la retina debidas a desprendimiento de retina, displasia de la retina, estrías angioides, degeneración macular miópica o atrofia de la retina, o se asocian a varias afecciones que alteran la visión que dan como resultado el daño de fotorreceptores y ceguera, tal como coroideremia, retinopatía diabética, degeneración macular (por ejemplo, degeneración macular senil), retinitis pigmentosa y enfermedad de Stargardt (fundus flavimaculatus).

Las células RPE o células progenitoras de fotorreceptores descritas en el presente documento pueden ser células RPE o progenitoras de fotorreceptores humanas. Obsérvese, sin embargo, que las células humanas se pueden usar en pacientes humanos, así como en modelos animales o pacientes animales. Por ejemplo, las células humanas se pueden probar en modelos de ratón, rata, gato, perro o primate no humano de degeneración de la retina. Además, las células humanas se pueden usar terapéuticamente para tratar animales en necesidad de las mismas, tal como en veterinaria.

Ensayos de cribado

También se describe en el presente documento un método de identificación de agentes que modulan la actividad fagocítica de células RPE o progenitores de fotorreceptores.

EJEMPLOS

La invención que ahora se describe, en general, será más fácilmente entendida por referencia a los siguientes ejemplos, que se incluyen simplemente para los fines de ilustración de ciertos aspectos y realizaciones de la presente invención.

Las células RPE se obtuvieron de células madre embrionarias humanas (hESC) como se describe previamente (Klimanskaya et al, 2004) y se usaron en los pases 2 a 5 después del aislamiento del cultivo de diferenciación de grupos pigmentados. Las células se cultivaron en medio EGM-2 (Lonza) hasta que alcanzaron la confluencia y en medio de mantenimiento de RPE (Klimanskaya et al, 2004) después de que las células usadas en los experimentos hubieran establecido un fenotipo de RPE diferenciado caracterizado por morfología hexagonal, diversos niveles de pigmento marrón, aspecto de célula cuboide, polarización y zonas de oclusión. Alternativamente, las células se usaron en experimentos antes de que maduraran completamente, pero aún después de que llegaran a ser confluentes.

Segmentos externos de los bastones bovinos (catálogo N° 98740) obtenidos de: InVision Bioresources. Isómero de FITC (catálogo N° F1906) I obtenido de Life Technologies. pHrodo® Red Phagocytosis Particle Labeling Kit (catálogo N° A10026) obtenido de Life Technologies.

Marcado de POS con FITC

Se resuspendió 1 vial de 10 mg del isómero I de FITC hasta 2 mg/mL en tampón carbonato sódico 0,1 M, pH 9,5. Se centrifugó a 3000 g durante 10 minutos para retirar las partículas sin diluir y solo se usó sobrenadante para marcar ROS bovinos. Se descongelaron 25 globos oculares bovinos con valor para ROS y se resuspendieron en 5 mL de tampón de lavado (10 % de sacarosa en tampón fosfato 20 mM con taurina 5 mM, pH 7,2). Se añadieron 1,5 mL de 2 mg/mL de sobrenadante de FITC a los ROS resuspensos y se dejó que se incubaran en la oscuridad con balanceo durante 1 h a TA. Después de la incubación, los segmentos de ROS-FITC se centrifugaron a 3000 g y se resuspendieron en 10 mL de tampón de lavado. Se repitió esta etapa de lavado un total de 2 veces. Después de lavar, se resuspendió en 10 mL de 2,5 % de sacarosa en DMEM (Gibco N° 11960) y se centrifugó nuevamente a 3000 g durante 10 minutos. Finalmente, se resuspendieron las células en 10 mL de 2,5 % de sacarosa en DMEM, se contaron las partículas de ROS-FITC usando un hemacitómetro, se ajustó la concentración a 1 * 108 partículas/mL en 2,5 % de sacarosa en DMEM, y se congelaron las partículas a -80 °C.

Marcado de POS con pHrodo®

Se resuspendieron 25 globos oculares bovinos con valor para ROS en 4,165 mL de tampón bicarbonato sódico 0,1 M del pHrodo® Red phagocytosis Particle Labeling kit. Se separaron ROS en 4 alícuotas de 750 pL en tubos de microcentrifugadora. Se centrifugaron los tubos a 10000 rpm durante 1 minuto, y luego se resuspendieron en 750 pL de tampón bicarbonato sódico 0,1 M otra vez. Se resuspendió colorante pHrodo® a una concentración final de 10 mM en DMSO. Se añadió colorante pHrodo® a ROS en tampón bicarbonato sódico a una concentración final de 0,5 mM, y se incubó en la oscuridad durante 45 minutos. Después de 45 minutos, se añadieron 500 pL de "Componente C" (del kit) y se centrifugó a 10000 rpm durante 1 minuto. Se aspiró el sobrenadante y se resuspendió en 1 mL de 100 % de metanol. Se agitaron con vórtex los tubos durante 30 segundos y se centrifugaron a 10000 rpm durante 1 minuto. Se aspiró el metanol y se resuspendió en 1 mL de "Componente C" (tampón de lavado del kit) y se centrifugó otra vez a 10000 rpm durante 1 minuto. Se repitió esta etapa de lavado un total de 2 veces. Se resuspendieron todas las partículas en un total de 20 mL de "Tampón B" (del kit). Se centrifugó ROS- pHrodo® a 3000 rpm durante 10 minutos, se resuspendió ROS-pHrodo® en 2,5 % de sacarosa en DMEM, se ajustó la concentración a 1 * 108 partículas/mL en 2,5 % de sacarosa en DMEM, y se congelaron las partículas a -80 °C.

Las células RPE se incubaron o con BioParticles conjugadas con pHrodo® o con segmentos externos bovinos marcados o con FITC o con pHrodo® durante diversos tiempos desde 2 hasta 24 h a 37 °C. Después de que las células se lavaran, se recogieron por tripsina/tampón de disociación, 1:1, se centrifugaron y se analizaron por citometría de flujo. Como control negativo, se incubaron células durante la misma longitud de tiempo a 4 °C.

Además, la interpretación de los datos de FACS de ROS marcados con FITC no es muy precisa debido a que algo de la fluorescencia de FITC se podría perder a pH bajo (FIG. 2A y B), por lo que una vez las partículas son internalizadas y los fagosomas se fusionan con los lisosomas, al pH bajo final (4,5-5,5) se pierde algo de la fluorescencia de FITC. Así, la fluorescencia como se mide incluye la pérdida de alguna señal de partículas internalizadas y la señal adicional de partículas no específicamente unidas sobre la superficie.

pHrodo® es un colorante fluorescente sensible al pH, y tanto BioParticles como ROS marcados con pHrodo® no mostraron ningún aumento en la fluorescencia a 4 °C (FIG. 1B y 1C), permitiendo así medir específicamente solo partículas internalizadas fusionadas con lisosomas.

El marcado de ROS con pHrodo® es una mejora en la exactitud del ensayo de fagocitosis y se puede usar en lugar de o complementario a los ROS marcados con FITC para analizar minuciosamente los complejos mecanismos de fagocitosis.

Marcado con biopartículas fluorescentes de E. co í pHrodo®

Se evalúa la fagocitosis por un ensayo basado en FACS usando biopartículas fluorescentes de E. coIí pHrodo® (Invitrogen) que fluorescen cuando se internalizaron en el entorno de pH reducido de fagosomas intracelulares. Las biopartículas se prepararon según las instrucciones del fabricante. Se incubaron RPE confluentes con 50-200 pL de biopartículas por pocillo de una placa de 4 pocillos en medio independiente de CO² (Invitrogen) durante 16-20 horas a 37 °C. Se incubaron las placas de control negativo a 4 °C. Las células se examinaron bajo el microscopio, se recogieron por tripsina y se analizaron por FACS contando 10.000 acontecimientos en un citómetro de flujo C6.5 Tabla 1 Caracterización de células RPE y prueba de seguridad

Fagocitosis de ROS marcados con pHrodo® Red por células RPE.

Se cultivaron RPE derivadas de células hESC y ARPE-19 en medio de crecimiento RPE (RPE-GM) que consistía en medio de crecimiento celular endotelial (Lonza, cat. N° CC-3162, CC-3156).

Para el ensayo de fagocitosis, se sembraron células RPE en placas de cultivo de 96 pocilios (Becton-Dickinson) a una densidad de 5x105células/cm2 y se mantuvieron en una estufa de incubación humidificada a 37 °C con 5 % de CO². Para lecturas de ensayo óptimas, se cultivaron células RPE durante 3-5 días en RPE-GM antes de la evaluación de la capacidad de fagocitosis. Si las células se cultivaron durante más de 5 días, se cambió RPE-GM a medio de mantenimiento de RPE (RPE-MM) que consistía en DMEM complementado con 10 % de suero bovino fetal, GlutaMax y normocina. El medio se cambió cada 2-3 días para proporcionar nutrición suficiente. Para la determinación de actividades fagocitóticas de células RPE, se usaron segmentos externos de los bastones (ROS) marcados con pHrodo® Red basado en rodamina sensible al pH (InVision Bioresources, cat N° 98740). El marcado de ROS con pHrodo® Red Microscale Labeling Kit (Thermo Fisher Scientific, cat. N° P35363) se describió previamente. Cada pocillo de células RPE confluentes se inoculó con 0,1 mL de medio DMEM que contenía 10 % de FBS y normocina y 0,1 mL de ROS marcados, se reconstituyó en DMEM complementado con 10 % de FBS y normocina. Para evaluar la capacidad fagocitótica óptima de las células RPE, se probaron diferentes concentraciones de ROS de 1,5x106, 3x106, 3,75x106, 5 x106, 6 x106, 7,5 x106, 10 x106 y 13,5 x106 ROS/ pocillo de una placa de 96 pocillos. Para reducir los agregados de ROS y aumentar la eficiencia de fagocitosis, se introdujo una etapa de sonicación por pulsos directa durante la reconstitución de segmentos externos de los bastones. Las células RPE y ROS se incubaron durante 20 a 28 horas a 37 °C para las muestras de prueba y 12-15 °C para el control negativo en una atmósfera de 5 % de CO² y 95 % de aire. Al día siguiente, después de 20 a 28 horas de incubación de ROS con monocapa de células RPE, se aspiró el medio de cultivo y cada pocillo se lavó 3x con 0,2 mL de PBS sin Ca/Mg (Gibco/Invitrogen N° 14190-250). Se añadieron 0,2 mL de 0,25 % de tripsina/EDTA (Sigma, cat. N° T4049) más Cell Dissociation Buffer (Gibco/Invitrogen, cat. N° 13151) a cada pocillo en una relación 1:1 y se incubaron a temperatura ambiente hasta que fue visible una suspensión de células individuales (10 - 20 minutos). La suspensión de células de cada muestra se transfirió a un tubo de poliestireno de fondo redondo apropiadamente marcado que contenía 2 mL de DMEM más 10 % de FBS para neutralizar la reacción y se centrifugó a 160 g durante 5 minutos. El sobrenadante se decantó dejando ~0,2 - 0,25 mL de líquido. Se agitaron los tubos de muestra con vórtex y se evaluó la captación de ROS por células RPE usando el citómetro de flujo BD Accuri C6 como se describe previamente.

Para aumentar más la capacidad fagocitótica, células RPE sin tratamiento previo en monocapa se pueden volver "competentes" por exposición a ROS sin marcar durante periodos de tiempo definidos con o sin etapas de recuperación antes de la realización de la fagocitosis de ROS marcados con pHrodo® Red después del procedimiento anteriormente descrito.

REFERENCIAS

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Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un método de evaluación de la actividad de fagocitosis que comprende

incubar células con segmentos externos de los fotorreceptores (POS) durante un tiempo y temperatura suficientes para que las células fagociten los POS, en donde los POS se marcan con una marca fluorescente que fluoresce más a un pH ácido que a un pH mayor, y

detectar la intensidad de fluorescencia de las células después de la incubación, en donde un aumento en la fluorescencia en comparación con un control indica fagocitosis de los POS por las células, en donde las células se incuban con los POS a una temperatura que varía desde 25-40 °C, o 34-40 °C, o a 37 °C, y

en donde el control es células incubadas con los POS a una temperatura que varía desde 10-16 °C o 12-15 °C.

2. El método de la reivindicación 1, en donde las células se incuban con los POS durante aproximadamente 16-20 horas.

3. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde las células se proporcionan como un cultivo celular, opcionalmente en donde las células son un cultivo celular confluente.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde las células son células RPE, opcionalmente en donde las células son células RPE humanas, o en donde las células son células progenitoras de fotorreceptores, opcionalmente en donde las células son células progenitoras de fotorreceptores humanas.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde los POS se marcan con el colorante pHrodo® Red.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la fluorescencia se detecta por citometría de flujo.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la fluorescencia se detecta usando un lector de placas.

8. El método de la reivindicación 1, en donde las células son células adherentes, opcionalmente células RPE, y la fluorescencia se detecta usando un lector de placas.

9. El método de la reivindicación 1, en donde

los segmentos externos de los fotorreceptores (POS) se marcan con una marca fluorescente que tiene un aumento de señal de fluorescencia cuando se internaliza por fagocitosis en un compartimento de pH bajo en una célula con respecto a su señal de fluorescencia cuando está presente extracelularmente; y

el método comprende detectar el aumento de fluorescencia, si la hay, en las células después de la incubación con los POS marcados, y cuantificar la actividad de fagocitosis de las células a partir el mismo.

10. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde las células se producen por diferenciación in vitro de células madre pluripotentes, opcionalmente en donde las células se crioconservaron y descongelaron antes de uso.

11. Un método de medición de la actividad de fagocitosis que comprende

(1) medir una fluorescencia de prueba en una primera alícuota de una población de células incubada con segmentos externos de los fotorreceptores (POS) marcados con pHrodo® Red y/o con pHrodo® Red E. coli BioParticles, a una temperatura que varía desde 25-40 °C, o 34-40 °C, o 37 °C, y

(2) medir una fluorescencia de control en una segunda alícuota de la población de células incubada con segmentos externos de los fotorreceptores (POS) marcados con pHrodo® Red y/o con pHrodo® Red E. coli BioParticles, a una temperatura que varía desde 10-16 °C, opcionalmente desde 12-15 °C,

en donde una fluorescencia de prueba que es mayor que una fluorescencia de control indica la actividad de fagocitosis de la población de células.

12. El método de la reivindicación 11, en donde la población de células es una población de células RPE, opcionalmente en donde la población de células es una población de células RPE humanas, o en donde la población de células es una población de células progenitoras de fotorreceptores, opcionalmente en donde la población de células es una población de células progenitoras de fotorreceptores humanos.

13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde las células, o la población de células, se proporciona o se proporcionan como una población de células adheridas, y opcionalmente en donde las células o la población de células se digiere con enzima antes de uso.

14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde los POS son POS fragmentados o POS sonicados.

15. El método de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la población de células se proporciona como una monocapa, opcionalmente una monocapa confluente.