ES2878036T3 - Métodos y composiciones para el análisis de vitamina D - Google Patents

Métodos y composiciones para el análisis de vitamina D Download PDF

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Abstract

Un método para analizar un resto de vitamina D en una muestra, cuyo método comprende: a) poner en contacto una muestra que contiene o se sospecha que contiene un resto de vitamina D con un tampón de pH ácido en el intervalo de 2,5 a 6,9, y al menos dos anticuerpos que se conjugan por separado a partículas, en donde al menos uno de dichos anticuerpos o el primer anticuerpo tiene una afinidad de unión específica hacia el resto de vitamina D, y al menos otro de dichos anticuerpos o el segundo anticuerpo tiene una afinidad de unión específica hacia el complejo formado entre el primer anticuerpo y el resto de vitamina D; y b) evaluar la unión entre dichos anticuerpos y dicho resto de vitamina D para determinar la presencia, ausencia y/o cantidad de dicho resto de vitamina D en dicha muestra, en donde dicho método se realiza como un ensayo homogéneo.

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos y composiciones para el análisis de vitamina D
Referencia cruzada a una solicitud relacionada
Esta solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la solicitud provisional U.S. No. de serie 62/368,940, presentada el 29 de julio de 2012.
Campo de la invención
Esta invención se refiere en general al campo de la detección de vitamina D. En particular, la invención proporciona métodos y kits novedosos para analizar un resto de vitamina D en una muestra, tal como un fluido biológico.
Antecedentes de la invención
La vitamina D es una prohormona soluble en grasa similar a los esteroides. La vitamina D tiene dos formas principales: D2 (ergocalciferol) y D3 (colecalciferol). El cuerpo puede fabricar vitamina D3 tras la exposición a la radiación ultravioleta. Tanto la vitamina D3 como la vitamina D2 se convierten en la hormona activa 1,25-dihidroxi vitamina D a través de su metabolismo en el hígado y el riñón.
La vitamina D3 se sintetiza en la piel por exposición a la luz solar (radiación ultravioleta) y se obtiene de la dieta principalmente a partir de aceites de hígado de pescado y yemas de huevo. La vitamina D2 se obtiene principalmente de suplementos nutricionales y el único fármaco recetado en los Estados Unidos para la deficiencia de vitamina D está hecho de vitamina D2. La vitamina D3 o D2 es metabolizada por el hígado a 25(OH)D, que luego es convertida por los riñones en 1,25(OH)2D. La 25(OH) vitamina D es la forma circulante principal que refleja los niveles de vitamina D en el cuerpo, pero la 1,25(OH)2 vitamina D es la forma más activa biológicamente.
La exposición inadecuada a la luz solar o la baja ingesta en la dieta o en los suplementos pueden causar una deficiencia de vitamina D. La deficiencia de vitamina D altera la mineralización ósea, lo que provoca raquitismo en los niños y osteomalacia en los adultos y puede contribuir a la osteoporosis. Estudios recientes han demostrado que la deficiencia de vitamina D también está relacionada con cánceres, enfermedades cardiovasculares, diabetes, esclerosis múltiple, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, eficacia de fármacos y mortalidad por todas las causas.
Un intervalo normal o suficiente típico para la vitamina D es de aproximadamente 30 a 100 ng/ml. El nivel de vitamina D de aproximadamente 10 a 30 ng/ml se considera deficiente. El nivel de vitamina D inferior a 10 ng/ml se considera gravemente deficiente. El nivel de vitamina D superior a 150 ng/ml se considera tóxico.
Se conocen en la técnica varios ensayos de vitamina D. Por ejemplo, se describen varios ensayos de vitamina D en en los documentos de Patente U.S. patent Nos. 5,821,020, 7,087,395 B1,7,482,162 B2, 7,964,363 B2, 8,133,694 B2, en la solicitud de Patente patent publication U.S. patent Nos. 2004/0132104 A1 y WO 2012/091569 A1.
Sigue existiendo la necesidad de un método confiable, sensible y específico para analizar un resto de vitamina D en una muestra, tal como un fluido biológico, particularmente uno que se pueda realizar como un ensayo homogéneo y/o sea susceptible de analizadores de química clínica automatizados en entornos típicos de laboratorio clínico.
Breve exposición de la invención
En un aspecto, la presente invención proporciona un método para analizar un resto de vitamina D en una muestra, cuyo método comprende: a) poner en contacto una muestra que contiene o se sospecha que contiene un resto de vitamina D con un tampón que es capaz de disociar un resto de vitamina D de su proteína de unión y/o un tampón de pH ácido, y al menos dos anticuerpos, por ejemplo, al menos dos anticuerpos monoclonales, que están unidos a, por ejemplo, unido por separado a la(s) superficie(s) o partículas, en donde un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal o el primer anticuerpo, tiene una afinidad de unión específica hacia el resto de vitamina D, y otro anticuerpo, por ejemplo, otro anticuerpo monoclonal o el segundo anticuerpo, tiene una afinidad de unión específica hacia el complejo formado entre el primer anticuerpo y el resto de vitamina D; y b) evaluar la unión entre dichos anticuerpos específicos y dicho resto de vitamina D para determinar la presencia, ausencia y/o cantidad de dicho resto de vitamina D en dicha muestra. Opcionalmente, los anticuerpos son diferentes de una proteína de unión a vitamina D natural para el resto de vitamina D.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para analizar un resto de vitamina D en una muestra, cuyo método comprende: a) poner en contacto una muestra que contiene o se sospecha que contiene un resto de vitamina D con un tampón que es capaz de disociar un resto de vitamina D de su proteína de unión y/o un tampón de pH ácido, y al menos dos anticuerpos, por ejemplo, al menos dos anticuerpos monoclonales, en los que al menos uno de dichos anticuerpos (o el primer anticuerpo) tiene una afinidad de unión específica hacia el resto de vitamina D y está unido a una superficie sólida, por ejemplo, superficie sólida de una placa de microtitulación o una partícula, y al menos otro de dichos anticuerpos (o el segundo anticuerpo) tiene una afinidad de unión específica hacia el complejo formado entre dicho primer anticuerpo y dicho resto de vitamina D y está marcado con un resto generador de señal, y b) evaluar la unión entre dichos anticuerpos, por ejemplo, dichos anticuerpos específicos y dicho resto de vitamina D para determinar la presencia, ausencia y/o cantidad de dicho resto de vitamina D en dicha muestra. Opcionalmente, los anticuerpos son diferentes de una proteína de unión a vitamina D natural para el resto de vitamina D.
En otro aspecto más, la presente invención proporciona un kit para analizar un resto de vitamina D en una muestra, cuyo kit comprende: a) un tampón que es capaz de disociar un resto de vitamina D de su proteína de unión y/o un tampón de pH ácido; b) al menos dos anticuerpos, por ejemplo, al menos dos anticuerpos monoclonales, que están unidos a, por ejemplo, unidos por separado a superficies o partículas tales como partículas de látex, en donde un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal o el primer anticuerpo tiene la afinidad de unirse con el resto de vitamina D, y otro anticuerpo, por ejemplo, otro anticuerpo monoclonal o el segundo anticuerpo, tiene la afinidad de unirse con el complejo formado entre el primer anticuerpo y el resto de vitamina D.
En otro aspecto más, la presente invención proporciona un método para analizar un resto de vitamina D en una muestra, cuyo método comprende: a) poner en contacto dicha muestra con un primer reactivo que comprende un tampón de pH ácido para disociar dicho resto de vitamina D en dicha muestra de sus proteínas de unión; b) poner en contacto dicho resto de vitamina D en dicha muestra de la etapa a) con un segundo reactivo que comprende partículas, por ejemplo, partículas magnéticas, recubiertas con un primer anticuerpo que tiene una afinidad de unión específica a dicho resto de vitamina D para formar un complejo de resto de vitamina D/primer anticuerpo; y c) poner en contacto dicho complejo de vitamina D/primer anticuerpo con un tercer reactivo que comprende un segundo anticuerpo marcado con una molécula generadora de señal para formar un complejo entre dicho resto de vitamina D, dicho primer complejo de anticuerpo y dicho segundo anticuerpo marcado con un resto o molécula generadora de señal; y d) evaluar dicha señal de dicho complejo entre dicho resto de vitamina D, dicho primer anticuerpo y dicho segundo anticuerpo para determinar la presencia, ausencia y/o cantidad del resto de vitamina D en dicha muestra. En algunas realizaciones, el resto o molécula generadora de señal se selecciona del grupo que consiste en éster de acridinio, isoluminol, fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante y fluoresina.
En otro aspecto más, la presente invención proporciona una mezcla de reacción para analizar un resto de vitamina D en una muestra, cuya mezcla de reacción que comprende: un tampón que es capaz de disociar un resto de vitamina D de su proteína de unión y/o un tampón de pH ácido; y al menos dos anticuerpos, por ejemplo, al menos dos anticuerpos monoclonales, que están unidos a, por ejemplo, unido por separado a la(s) superficie(s) o partículas tales como partículas de látex, en donde un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal o el primer anticuerpo tiene la afinidad de unirse con el resto de vitamina D, y otro anticuerpo, por ejemplo, otro anticuerpo monoclonal o el segundo anticuerpo, tiene la afinidad de unirse con el complejo formado entre el primer anticuerpo y el resto de vitamina D.
En algunas realizaciones, el primer anticuerpo puede recubrirse sobre superficies o partículas tales como partículas magnéticas, y otro anticuerpo o el segundo anticuerpo puede marcarse con moléculas generadoras de señales tales como enzimas (por ejemplo, fosfatasa alcalina y peroxidasa), o una molécula generadora de señal quimioluminiscente tal como éster de acridinio, isoluminol, o una molécula fluorescente tal como fluoresceína y proteína verde fluorescente. En presencia de un resto de vitamina D en la mezcla de reacción, el segundo anticuerpo se une al complejo formado entre el resto de vitamina D de una muestra y el primer anticuerpo que recubre la (s) superficie (s) o partículas para formar un complejo, por ejemplo, un complejo "sándwich" (primer anticuerpo-vitamina D-segundo anticuerpo), y la cantidad del "sándwich" formada en la(s) superficie(s) o partículas es proporcional a la cantidad del resto de vitamina D en la muestra, y puede ser evaluado cuantitativamente detectando la señal de la molécula generadora de señal que está marcada en las segundas moléculas de anticuerpo.
En algunas realizaciones, los al menos dos anticuerpos se pueden unir a una misma partícula o superficie, o al mismo tipo de partícula o superficies. En otras realizaciones, los al menos dos anticuerpos pueden unirse a diferentes partículas o superficies, o diferentes tipos de partículas o superficies.
En algunas realizaciones, los métodos presentes y kits pueden usar o incorporar elementos o características seleccionados de los métodos y kits descritos y/o reivindicados en las solicitudes de Patente U.S. Patent Application Serial Nos. 13/707,514 y 14/169,118 y en la solicitud de Patente PCT No. PCT/US2015/013831.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 ilustra una curva de calibración ejemplar o típica del ensayo de 25(OH)D total usando el método de inmunoensayo potenciado con látex en un analizador AU680.
La Figura 2 ilustra una curva de linealidad ejemplar o típica del ensayo de 25(OH)D total usando un método de inmunoensayo potenciado con partículas de látex en un analizador AU680.
La Figura 3 ilustra los datos de comparación de un método ejemplar o típico del ensayo de 25(OH)D total usando un método de inmunoensayo potenciado con látex en comparación con un método de inmunoensayo quimioluminiscente disponible comercialmente (ensayo DiaSorin).
La Figura 4 ilustra los datos de comparación de un método ejemplar o típico del ensayo de 25(OH)D total usando un método de inmunoensayo potenciado con partículas de látex en comparación con un método estándar de oro, el método LC-MS/MS.
La Figura 5 ilustra una curva de calibración ejemplar o típica del ensayo de 25(OH)D total usando un método de detección de inmunoensayo basado en partículas magnéticas.
La Figura 6 ilustra los datos de comparación de un método ejemplar o típico del ensayo de 25(OH)D total usando un método de detección de inmunoensayo basado en partículas magnéticas en comparación con un método de inmunoensayo quimioluminiscente disponible comercialmente.
La figura 7 ilustra los resultados de prueba de linealidad ejemplares.
La figura 8 ilustra los resultados de comparación de métodos ejemplares.
La Figura 9 ilustra los resultados de comparación de matrices ejemplares (K2-EDTA frente a suero).
La Figura 10 ilustra los resultados de comparación de matrices ejemplares (K3-EDTA frente a suero).
La Figura 11 ilustra los resultados de comparación de matrices ejemplares (K2-Li-Heparina frente a suero).
La Figura 12 ilustra los resultados de comparación de métodos ejemplares (v. Ensayo Roche VD).
Descripción detallada de la invención
Para mayor claridad de la divulgación, y no a modo de limitación, la descripción detallada de la invención se divide en las subsecciones que siguen.
A. Definiciones
A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Todas las patentes, solicitudes, solicitudes publicadas y otras publicaciones a las que se hace referencia en la presente memoria se incorporan como referencia en su totalidad. Si una definición establecida en esta sección es contraria a o incompatible con una definición establecida en las patentes, solicitudes, solicitudes publicadas y otras publicaciones que se incorporan en la presente memoria como referencia, la definición establecida en esta sección prevalece sobre la definición que se incorpora en la presente memoria como referencia.
Como se usa en la presente memoria, "un" o "una" significa "al menos uno" o "uno o más".
Como se usa en la presente memoria, "resto de vitamina D" se refiere a todos los miembros o formas de la familia de la vitamina D que es un grupo de secosteroides solubles en grasa responsables de la absorción intestinal de calcio y fosfato. Las formas de vitamina D ejemplares incluyen vitamina D1, D2 (ergocalciferol), D3 (colecalciferol), D4 y D5. Los restos de vitamina D ejemplares también incluyen calcidiol, que también se conoce como calcifediol (INN), 25-hidroxicolecalciferol o 25-hidroxivitamina D-abreviado como 25(OH)D; y que es el metabolito específico de la vitamina
D que se mide en el suero para determinar el estado de vitamina D de una persona, y calcitriol, la forma biológicamente activa de la vitamina D. En algunas realizaciones, "resto de vitamina D" se refiere a 25-hidroxivitamina D abreviado como 25(OH)D, incluyendo las formas D2 y D3.
Como se usa en la presente memoria, "anticuerpo" incluye no solo anticuerpos policlonales o monoclonales intactos, sino también fragmentos de los mismos (tales como Fab, Fab', F(ab')2, Fv), de cadena sencilla (ScFv), un diacuerpo, un anticuerpo multi-específico formado a partir de fragmentos de anticuerpo, mutantes de los mismos, proteínas de unión que comprenden una porción de anticuerpo y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprende un sitio de reconocimiento de antígeno de la especificidad requerida. Un anticuerpo incluye un anticuerpo de cualquier clase, tal como IgG, IgA o IgM (o una subclase de las mismas), y el anticuerpo no necesita ser de ninguna clase en particular. Como se usa en la presente memoria, el término "se une específicamente" se refiere a la especificidad de un reactivo de unión, por ejemplo, un anticuerpo, de manera que se une preferentemente a un analito o diana definido, por ejemplo, un resto de vitamina D. El reconocimiento por un reactivo de unión o un anticuerpo de un analito o diana particular en presencia de otras dianas potenciales es una característica de dicha unión. En algunas realizaciones, un reactivo de unión que se une específicamente a un analito evita la unión a otro resto o restos que interfieren en la muestra que se va a analizar.
Una "proteína de unión a vitamina D" también se conoce como gc-globulina (componente específico de grupo). En algunas realizaciones, una "proteína de unión a vitamina D" se refiere a una proteína de unión a vitamina D de la familia de la albúmina. Una "proteína de unión a vitamina D" se encuentra a menudo en el plasma, fluido ascítico, fluido cefalorraquídeo y/o en la superficie de muchos tipos de células. Una "proteína de unión a vitamina D" a menudo se une a la vitamina D y sus metabolitos y los transporta a los tejidos diana in vivo. Una "proteína de unión a vitamina
D" ejemplar en humanos está codificada por el gen GC. En algunas realizaciones, una "proteína de unión a vitamina
D" se refiere a una proteína de unión a vitamina D conocida en la técnica, por ejemplo, una proteína de unión a vitamina
D como se describe en el sitio web: https://en.wikipedia.org/wiki/Albumin.
En algunas realizaciones, "fluido ascético" se usa como se describe en el sitio
web: https://en.wikipedia.org/wiki/Ascites. En algunas realizaciones, el "líquido cefalorraquídeo" se usa como se describe en el sitio web: https://en.wikipedia.org/wiki/ Líquido cefalorraquídeo.
Como se usa en la presente memoria, el término "evaluar" pretende incluir la determinación cuantitativa y cualitativa en el sentido de obtener un valor absoluto para la cantidad o concentración del analito presente en la muestra, y también de obtener un índice, proporción, porcentaje, visual u otro valor indicativo del nivel de analito en la muestra. La evaluación puede ser directa o indirecta y la especie química realmente detectada no necesita, por supuesto, ser el analito en sí, sino que puede ser, por ejemplo, un derivado del mismo o alguna sustancia adicional.
Como se usa en la presente memoria, el término "muestra" se refiere a cualquier cosa que pueda contener un analito para el que se desea un ensayo de analito. La muestra puede ser una muestra biológica, tal como un fluido biológico o un tejido biológico. Los ejemplos de fluidos biológicos incluyen orina, sangre, plasma, suero, saliva, semen, heces, esputo, líquido cefalorraquídeo, lágrimas, moco, líquido amniótico o similares. Los tejidos biológicos son agregados de células, generalmente de un tipo particular junto con su sustancia intercelular, que forman uno de los materiales estructurales de una estructura humana, animal, vegetal, bacteriana, fúngica o viral, incluyendo los tejidos conectivos, epitelio, muscular y nervioso. Los ejemplos de tejidos biológicos también incluyen órganos, tumores, ganglios linfáticos, arterias y células individuales.
Como se usa en la presente memoria, "muestra de sangre" se refiere a una muestra de sangre completa o una fracción de plasma o suero derivada de la misma. Preferiblemente, la muestra de sangre se refiere a una muestra de sangre humana tal como sangre completa o una fracción de plasma o suero derivada de la misma. También preferiblemente, la muestra de sangre se trata previamente antes del ensayo eliminando sustancialmente toda la hemoglobina (es decir, glóbulos rojos) para eliminar o reducir significativamente la interferencia oxidativa de las moléculas de hemoglobina.
Como se usa en la presente memoria, el término "sangre completa" se refiere a una muestra de sangre que no ha sido fraccionada y contiene componentes tanto celulares como fluidos. Como se usa en la presente memoria, "sangre completa" se refiere a sangre recién extraída que se analiza antes de que se coagule, o una muestra de sangre extraída convencionalmente, que se puede extraer en un vacutainer y que puede contener un anticoagulante, como heparina de litio, EDTA. etc., o al que se pueden añadir uno o más agentes clínicos estándar en el curso de las pruebas clínicas de rutina.
Como se usa en la presente memoria, la frase "sustancialmente toda la hemoglobina se ha eliminado" se refiere a una muestra de sangre en la que preferiblemente al menos aproximadamente el 50%, 60% o 70%, más preferiblemente, al menos aproximadamente el 80%, 90% o 95%, y lo más preferiblemente, al menos aproximadamente el 96%, 97%, 98%, 99 o 100% de todos los glóbulos rojos que contienen hemoglobina en la muestra se han eliminado para eliminar o reducir significativamente la interferencia oxidativa de la hemoglobina.
Como se usa en la presente memoria, el término "plasma" se refiere al componente líquido no celular de la sangre completa. Dependiendo del método de separación usado, el plasma puede estar completamente libre de componentes celulares o puede contener varias cantidades de plaquetas y/o una pequeña cantidad de otros componentes celulares. Debido a que el plasma incluye varios factores de coagulación tales como fibrinógeno, el término "plasma" se distingue de "suero" como se expone a continuación.
Como se usa en la presente memoria, el término "suero" se refiere a suero de mamífero completo, tal como suero humano completo. Además, como se usa en la presente memoria, "suero" se refiere al plasma sanguíneo del que se han eliminado factores de coagulación (por ejemplo, fibrinógeno).
Como se usa en la presente memoria, el término "fluido" se refiere a cualquier composición que pueda fluir. Los fluidos abarcan, por tanto, composiciones que están en forma de semisólidos, pastas, soluciones, mezclas acuosas, geles, lociones, cremas y otras composiciones similares.
Como se usa en la presente memoria, el término "enfermedad" o "trastorno" se refiere a una afección patológica en un organismo que resulta, por ejemplo, de una infección o un defecto genético, y que se caracteriza por síntomas identificables.
Como se usa en la presente memoria, "poner en contacto" significa juntar dos o más componentes. El "contacto" se puede lograr mezclando todos los componentes en una mezcla fluida o semifluida. El "contacto" también se puede lograr cuando uno o más componentes se ponen en contacto con uno o más de otros componentes en una superficie sólida, tal como una sección de tejido sólido o un sustrato.
Como se usa en la presente memoria, el término "comparar" generalmente significa examinar para observar similitudes o diferencias entre dos o más valores. Preferiblemente, "comparar" se refiere a comparaciones cuantitativas tales como, por ejemplo, restar un valor de otro, calcular una proporción de dos valores, calcular un porcentaje de un valor con respecto a otro o combinar estos tipos de cálculos para producir un solo número. Como se usa en la presente memoria, "comparar" se refiere además a comparaciones hechas por un humano, comparaciones hechas por una computadora u otro procesador, y comparaciones hechas por un humano en combinación con una computadora u otro procesador.
Se entiende que los aspectos y realizaciones de la invención descritos en la presente memoria incluyen "que consiste" y/o "que consiste esencialmente en” aspectos y realizaciones.
Otros objetivos, ventajas y características de la presente invención resultarán evidentes a partir de la siguiente especificación tomada junto con los dibujos adjuntos.
B. Métodos para analizar un resto de vitamina D
En un aspecto, la presente invención proporciona un método para analizar un resto de vitamina D en una muestra, cuyos métodos comprenden: a) poner en contacto una muestra que contiene o se sospecha que contiene un resto de vitamina D con un tampón de pH ácido, al menos dos anticuerpos, por ejemplo, al menos dos anticuerpos monoclonales, que están unidos a, por ejemplo, unido de manera separada a partículas o superficies, por ejemplo, partículas de látex, uno de los anticuerpos o el primer anticuerpo que tiene una afinidad de unión específica hacia dicho resto de vitamina D, y el otro anticuerpo o el segundo anticuerpo que tiene una afinidad de unión específica hacia el complejo formado entre el primer anticuerpo y dicho resto de vitamina D; y b) evaluar la unión (por ejemplo, el grado de aglutinación de partículas debido a la formación de un complejo formado entre dichos al menos dos anticuerpos y dicho resto de vitamina D, por ejemplo, un complejo tipo sándwich entre dichos dos anticuerpos monoclonales y dicho resto de vitamina D para determinar la presencia, ausencia y/o cantidad de dicho resto de vitamina D en dicha muestra. Opcionalmente, los anticuerpos son diferentes de una proteína de unión a vitamina D natural para el resto de vitamina D. En algunas realizaciones, los al menos dos anticuerpos se pueden unir a una misma partícula o superficie, o al mismo tipo de partícula o superficies. En otras realizaciones, los al menos dos anticuerpos pueden unirse a diferentes partículas o superficies, o diferentes tipos de partículas o superficies.
En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para analizar un resto de vitamina D en una muestra, cuyo método comprende: a) poner en contacto una muestra que contiene o se sospecha que contiene un resto de vitamina D con un tampón que es capaz de disociar un resto de vitamina D de su proteína de unión y/o un tampón de pH ácido, y al menos dos anticuerpos, por ejemplo, al menos dos anticuerpos monoclonales, en los que al menos uno de dichos anticuerpos (o el primer anticuerpo) tiene una afinidad de unión específica hacia el resto de vitamina D y está unido a una superficie sólida, por ejemplo, superficie sólida de una placa de microtitulación o una partícula, y al menos otro de dichos anticuerpos (o el segundo anticuerpo) tiene una afinidad de unión específica hacia el complejo formado entre dicho primer anticuerpo y dicho resto de vitamina D y está marcado con un resto generador de señal, y b) evaluar la unión entre dichos anticuerpos, por ejemplo, dichos anticuerpos específicos, y dicho resto de vitamina D para determinar la presencia, ausencia y/o cantidad de dicho resto de vitamina D en dicha muestra. Opcionalmente, los anticuerpos son diferentes de una proteína de unión a vitamina D natural para el resto de vitamina D.
En algunas realizaciones, los métodos presentes no comprenden una etapa de eliminación de proteína de la muestra (Véase, por ejemplo, el documento de Patente U.S. patent no. 5,821,020), tal como la proteína de unión a la vitamina D natural para el resto de vitamina D, antes de evaluar la unión entre los anticuerpos específicos y el resto de vitamina D. En otras realizaciones, los métodos presentes no comprenden ninguna etapa de lavado.
Los métodos presentes pueden realizarse en cualquier formato de ensayo adecuado. En algunas realizaciones, los métodos presentes se llevan a cabo como un ensayo homogéneo. En otras realizaciones, los métodos presentes se llevan a cabo como un ensayo heterogéneo.
Una muestra puede ponerse en contacto con un tampón de pH ácido y dos anticuerpos, por ejemplo, dos anticuerpos monoclonales, que se recubren por separado sobre partículas, por ejemplo, partículas de látex, en una sola etapa o en varias etapas, por ejemplo, 2 o 3 etapas. El orden de contacto de múltiples etapas ejemplar puede ser: 1) un tampón de pH ácido, incubando durante un período de tiempo antes de la adición de las partículas de látex que se recubren por separado con los dos anticuerpos monoclonales mencionados; 2) un tampón de pH ácido, partículas de látex que se recubren con el primer anticuerpo, incubándose durante un período de tiempo antes de la adición de las partículas de látex recubiertas con dicho segundo anticuerpo.
El pH en una mezcla de reacción final que comprende la muestra, el tampón de pH ácido, las partículas, por ejemplo, partículas de látex, recubiertas por separado con los dos anticuerpos específicos puede estar en cualquier valor o intervalo adecuado. En algunas realizaciones, el pH en una mezcla de reacción final que comprende la muestra, el tampón de pH ácido y las partículas de látex es de 2,5 o superior. En otras realizaciones, el pH en una mezcla de reacción final que comprende la muestra, el tampón de pH ácido y las partículas de látex es de 13 o menor. En otras realizaciones más, el pH en una mezcla de reacción final que comprende la muestra, el tampón de pH ácido y las partículas de látex está en un intervalo de aproximadamente 2,5 a aproximadamente 13, por ejemplo, a aproximadamente 2,5, 3, 3,5. 4, 4,5, 5, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5 o 13.
En algunas realizaciones, los métodos presentes no comprenden una etapa de poner en contacto la muestra con una composición liberadora de vitamina D que comprende una ciclodextrina, un salicilato de sodio y NaOH, tal como la composición liberadora de vitamina D descrita en el documento de Patente U.S. patent No. 7,087,395 B1.
En algunas realizaciones, los métodos presentes no comprenden una etapa de poner en contacto la muestra con un ácido de perfluoro alquilo, o una sal del mismo, para liberar 25(OH) vitamina D de la proteína de unión a vitamina D, tal como la etapa descrita en el documento de Patente WO 2012/091569 A1.
En algunas realizaciones, los métodos presentes no comprenden una etapa de poner en contacto la muestra con una serina proteasa con actividad endo y exoproteolítica para digerir proteínas de unión a vitamina D en la muestra, tal como la etapa descrita en el documento de Patente U.S. patent No. 7,964,363 B2.
Los métodos presentes pueden usarse para cualquier fin adecuado. En algunas realizaciones, los métodos presentes pueden usarse para evaluar el estado del resto de vitamina D en un sujeto, y la muestra es una muestra biológica obtenida y/o derivada del sujeto. Los métodos presentes pueden usarse para evaluar el estado del resto de vitamina D en cualquier sujeto adecuado, por ejemplo, un mamífero, un mamífero no humano, un ser humano o un animal de experimentación.
Los métodos presentes pueden usarse para analizar un resto de vitamina D en cualquier muestra adecuada. En algunas realizaciones, la muestra es un fluido biológico, por ejemplo, sangre total, plasma, suero u orina.
Los métodos presentes pueden usarse para analizar cualquier resto de vitamina D adecuado en una muestra. En algunas realizaciones, el resto de vitamina D es vitamina D3 , vitamina D2 , un metabolito de la vitamina D o 1,25-dihidroxivitamina D3 [1,25(OH)2D3]. En otras realizaciones, el resto de vitamina D es 25-hidroxi-vitamina D (25(OH) D), por ejemplo, 25(OH)D3, 25(OH)D2 o una suma de 25(OH)D2 y 25(OH)D3.
En los métodos presentes se puede utilizar cualquier tampón de pH ácido. En algunas realizaciones, el tampón de pH ácido puede ser acetato de sodio, citrato de sodio o ácido fosfórico, u otros tampones que tienen funciones tampón en el intervalo de pH ácido.
En otras realizaciones, el anticuerpo se une específicamente a 25(OH)D y el anticuerpo se une específicamente al complejo de 25(OH)D y el primer anticuerpo puede estar en cualquier forma adecuada. Por ejemplo, se puede utilizar un anticuerpo policlonal o un anticuerpo monoclonal o fragmentos de los anticuerpos tales como un fragmento Fab o un anticuerpo monocatenario. En otras realizaciones más, se pueden utilizar los anticuerpos ejemplares descritos en el documento de Patente U.S. patent publication No. 2011/0097733 A1.
Se puede usar cualquier partícula adecuada en los presentes formatos de ensayo basados en partículas. En algunas realizaciones, la partícula comprende poliestireno, polimetil metacrilato, polimetil naftaleno, poli (divinilbenceno), polivinil naftaleno, copolímero de estireno, ácido acrílico divinilbenceno, naftaleno, carbono 60, perlas magnéticas, oro, plata, sílice, dióxido de silicio dióxido de cromo y/o dióxido de titanio. En otras realizaciones, la partícula es una nanopartícula. La nanopartícula puede tener cualquier tamaño o diámetro adecuado. Por ejemplo, la nanopartícula puede tener cualquier diámetro que varíe entre aproximadamente 30 nm y aproximadamente 500 nm, por ejemplo, aproximadamente 30 nm, 40 nm, 50 nm, 60 nm, 70 nm, 80 nm, 90 nm, 100 nm, 150 nm, 200 nm, 250 nm, 300 nm, 350 nm, 400 nm, 450 nm o 500 nm.
Los métodos presentes pueden usarse en cualquier formato de ensayo adecuado. En algunas realizaciones, los métodos presentes se llevan a cabo usando un método inmunoturbidimétrico potenciado con partículas. Véase, por ejemplo, el documento de Patente U.S. Patent No. 4,703,018. En otras realizaciones, los métodos presentes se llevan a cabo usando un método inmunonefelométrico potenciado con partículas. Véase, por ejemplo, el documento de Patente U.S. Patent No. 4,690,906. En otras realizaciones más, los métodos presentes se llevan a cabo usando un método de inmunoensayo basado en partículas magnéticas (perlas). Véase, por ejemplo, Yu et al., Journal of Immunological Methods, 218 (1-2): 1-8 (1998). En otras realizaciones más, los métodos presentes se llevan a cabo usando un método de ensayo de inmunoaglutinación basado en partículas. Véase, por ejemplo, Wang et al., Clinical Chemistry, 52 (11): 2065-2071 (2006).
En algunas realizaciones, el tamaño de las partículas magnéticas puede variar entre 500 y 2000 nanómetros, preferiblemente entre 800 y 1500 nanómetros.
En algunas realizaciones, las partículas magnéticas se conjugan con el primer anticuerpo y el segundo anticuerpo se conjuga con moléculas de señalización tales como éster de acridinio, isoluminol, fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano picante.
En algunas realizaciones, el ensayo de vitamina D se realiza usando un formato de inmunoensayo quimioluminiscente de dos etapas. Las muestras se ponen en contacto con el tampón de pH ácido y, a continuación, se realiza un período de incubación antes de la adición de un anticuerpo conjugado con partículas, por ejemplo, partículas magnéticas. Después de la incubación, las partículas, por ejemplo, las partículas magnéticas se lavan 1-3 veces con un tampón de lavado y se re-suspenden en un tampón antes de la adición de un segundo anticuerpo marcado con una molécula de señalización. Después de la incubación, las partículas magnéticas se lavan nuevamente y se re-suspenden en un tampón antes de la adición de un sustrato necesario para la reacción quimioluminiscente.
En algunas realizaciones, el ensayo de vitamina D se realiza usando un formato de inmunoensayo quimioluminiscente de una sola etapa. Las muestras se ponen en contacto con el tampón de pH ácido, las partículas, por ejemplo, partículas magnéticas, se recubren con el primer anticuerpo y el segundo anticuerpo marcado con una molécula de señalización al mismo tiempo. Después de un período de tiempo de incubación, las partículas, por ejemplo, partículas magnéticas, se lavan 1 -3 veces y se re-suspenden en un tampón antes de la adición de un sustrato necesario para la reacción quimioluminiscente.
En algunas realizaciones, los métodos presentes se llevan a cabo usando un formato de ensayo homogéneo. En otras realizaciones, los métodos presentes se llevan a cabo usando un formato de ensayo heterogéneo. En otras realizaciones más, los métodos presentes se llevan a cabo usando un formato de ensayo tipo sándwich o competitivo. En otras realizaciones más, los métodos presentes se llevan a cabo usando un formato de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA).
Puede usarse cualquier formato de ensayo homogéneo adecuado. En algunas realizaciones, se lleva a cabo un ensayo homogéneo en una única mezcla de reacción sin separación de fases o etapa de lavado, tal como las etapas de separación de partículas y lavado descritas en la publicación de Patente U.S. patent publication No. U.S.
2004/0132104 A1 o en el documento de Patente U.S. patent No. 8,133,694 B2.
Los métodos presentes pueden realizarse con cualquier tiempo de reacción adecuado. En algunas realizaciones, los métodos presentes tienen un tiempo total de ensayo que es de aproximadamente 60 minutos o menos, por ejemplo, aproximadamente 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, 48, 47, 46. 45., 44, 43, 42, 41,40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 3, 31,30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22 ,21,20 , 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 minutos o 1 minuto. Por ejemplo, los métodos presentes pueden tener un tiempo de ensayo desde el inicio, por ejemplo, adición de una muestra y/o un reactivo(s), hasta el tiempo de lectura de la señal, que es de aproximadamente 60 minutos o menos, por ejemplo, aproximadamente 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, 48, 47, 46. 45., 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 3, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25 ,24 , 23, 22, 21,20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 minutos o 1 minuto .
Los métodos presentes pueden realizarse en cualquier instrumento analítico adecuado. En algunas realizaciones, los métodos presentes se llevan a cabo en un analizador de química general o un analizador de química clínica, por ejemplo, analizador de química general o analizador de química clínica de Roche, Hitachi, Modular P, Cobas series, Beckman/Olympus AU series, Beckman Synchron and DXC series, o Abbot Architect series.
Los métodos presentes pueden realizarse para lograr cualquier precisión adecuada. En algunas realizaciones, los métodos presentes se pueden realizar para lograr una precisión o CV de aproximadamente el 30% o menos, por ejemplo, aproximadamente 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14 %, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% o menos. Por ejemplo, los métodos presentes se pueden realizar para lograr una precisión o CV de aproximadamente el 5% o menos, por ejemplo, aproximadamente 5%, 4%, 3%, 2,5%, 2%, 1,5% 1%, 0,5% o menos para un nivel de resto de vitamina D de aproximadamente 30 ng/ml o menos, por ejemplo, aproximadamente 30 ng/ml, 25 ng/ml, 20 ng/ml, 15 ng/ml, 10 ng/ml, 5 ng/ml, 4 ng/ml, 3 ng/ml, 2 ng/ml, 1 ng/ml, o menos. En otro ejemplo, los métodos presentes se pueden realizar para lograr una precisión o CV de aproximadamente el 10% o menos, por ejemplo, aproximadamente 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4,5%, 4,0%, 3%, 2,5%, 2%, 1,5% 1 %, 0,5% o menos para un nivel de resto de vitamina D de aproximadamente 100 ng/ml o menos, por ejemplo, aproximadamente 100 ng/ml, 90 ng/ml, 80 ng/ml, 70 ng/ml, 60 ng/ml, 50 ng/ml, 40 ng/ml, 30 ng/ml, 20 ng/ml, 10 ng/ml o menos.
C. Kits para analizar un resto de vitamina D y uso de los mismos
En otro aspecto, la presente invención proporciona un kit para analizar un resto de vitamina D en una muestra, cuyo kit comprende: a) un tampón que es capaz de disociar un resto de vitamina D de su proteína de unión y/o un tampón de pH ácido (R1); b) superficie(s) o partículas, por ejemplo, partículas de látex, recubiertas (R2), por ejemplo, recubiertas por separado, con al menos dos anticuerpos, uno de los anticuerpos o el primer anticuerpo que tiene una afinidad de unión específica hacia el resto de vitamina D, y otro anticuerpo o el segundo anticuerpo que tiene una afinidad de unión específica hacia el complejo formado entre el primer anticuerpo y el resto de vitamina D. Opcionalmente, los anticuerpos son diferentes de una proteína de unión a vitamina D natural para el resto de vitamina D. En algunas realizaciones, los al menos dos anticuerpos se pueden unir a una misma partícula o al mismo tipo de partícula(s) o superficie(s). En otras realizaciones, los al menos dos anticuerpos pueden unirse a diferentes partículas o superficies, o diferentes tipos de partículas o superficies.
En los presentes kits se puede utilizar cualquier tampón adecuado de pH ácido. En algunas realizaciones, el tampón de pH ácido es el tampón de acetato de sodio, o el tampón de citrato de sodio o el tampón de ácido fosfórico.
Puede usarse cualquier combinación de anticuerpos adecuada que comprenda un anticuerpo o el primer anticuerpo se une específicamente al resto de vitamina D y el otro anticuerpo o el segundo anticuerpo se une específicamente al complejo formado entre el primer anticuerpo y el resto de vitamina D. Se pueden usar anticuerpos en cualquier forma adecuada. Por ejemplo, se puede utilizar un anticuerpo policlonal o un anticuerpo monoclonal, un fragmento de un anticuerpo tal como un fragmento Fab o un anticuerpo monocatenario. En otras realizaciones más, se pueden utilizar los anticuerpos ejemplares descritos en la publicación de Patente U.S. patent publication No. 2011/0097733 A1.
Los presentes kits pueden comprender cualquier componente o reactivo adecuado adicional. En algunas realizaciones, los presentes kits comprenden además medios para evaluar la unión entre los anticuerpos específicos y el resto de vitamina D para determinar la presencia, ausencia y/o cantidad del resto de vitamina D en la muestra.
Los reactivos o componentes en los presentes kits pueden formularse o disponerse de cualquier modo o forma adecuada. En algunas realizaciones, los presentes kits comprenden los siguientes reactivos: (1) un primer reactivo de ensayo (R1) que comprende un tampón de pH ácido; (2) un segundo reactivo de ensayo (R2) que comprende dos anticuerpos específicos que están recubiertos, por ejemplo, recubiertos por separado, en superficies o partículas, por ejemplo, partículas de látex, un anticuerpo o el primer anticuerpo que tiene una afinidad frente al resto de vitamina D, y el otro anticuerpo o el segundo anticuerpo que tiene una afinidad frente al complejo formado entre el primer anticuerpo y el resto de vitamina D.
Los kits anteriores se pueden usar en un método para analizar un resto de vitamina D en una muestra, cuyo método comprende: a) formar una mezcla de una muestra y el primer reactivo de ensayo e incubar la mezcla durante un período de tiempo antes de añadir el segundo reactivo de ensayo (por ejemplo, partículas de látex recubiertas con anticuerpos específicos) a la mezcla; y b) cuantificar la cantidad de un resto de vitamina D, por ejemplo, 25(OH)D, en la muestra midiendo el cambio óptico de la mezcla de reacción y usando un conjunto de restos de vitamina D, por ejemplo, un conjunto de calibradores de 25(OH)D.
En otras realizaciones más, los presentes kits comprenden (1) un primer reactivo de ensayo que comprende un tampón de pH ácido y (2) una superficie sólida que comprende un anticuerpo inmovilizado que tiene afinidad de unión específica hacia un resto de vitamina D, y 3) un reactivo de detección que comprende un anticuerpo que tiene una afinidad de unión hacia el complejo formado entre el anticuerpo inmovilizado y el resto de vitamina D de muestra. Los presentes kits pueden comprender además reactivos de lavado adecuados. El procedimiento de ensayo puede incluir etapas de lavado entre las diferentes adiciones de reactivos.
En otras realizaciones más, los presentes kits comprenden (1) un primer reactivo de ensayo que comprende un tampón de pH ácido; y (2) superficie(s) o partículas, por ejemplo, partículas magnéticas, recubiertas con un anticuerpo que tiene una afinidad hacia el resto de vitamina D; y (3) un anticuerpo marcado con una molécula de señalización necesaria para la quimioluminiscencia; y (4) un sustrato (iniciador) o sustratos necesarios para iniciar la reacción quimioluminiscente. El kit también puede contener calibradores, controles, un tampón de dilución y/o un tampón de lavado.
En otras realizaciones más, la presente invención proporciona un método para analizar un resto de vitamina D en una muestra, cuyo método comprende: a) poner en contacto dicha muestra con un primer reactivo que comprende un tampón de pH ácido para disociar dicho resto de vitamina D en dicha muestra de sus proteínas de unión; b) poner en contacto dicho resto de vitamina D en dicha muestra de la etapa a) con un segundo reactivo que comprende partículas, por ejemplo, partículas magnéticas, recubiertas con un primer anticuerpo que tiene una afinidad de unión específica a dicho resto de vitamina D para formar un complejo de resto de vitamina D/primer anticuerpo; y c) poner en contacto dicho complejo del resto de vitamina D/primer anticuerpo con un tercer reactivo que comprende un segundo anticuerpo marcado con un resto o molécula generadora de señal para formar un complejo entre dicho resto de vitamina D, dicho primer anticuerpo y dicho segundo anticuerpo marcado con un resto o molécula generadora de señal; y d) evaluar dicha señal de dicho complejo entre dicho resto de vitamina D, dicho primer complejo de anticuerpo y dicho segundo anticuerpo para determinar la presencia, ausencia y/o cantidad del resto de vitamina D en dicha muestra. Opcionalmente, los anticuerpos son diferentes de una proteína de unión a vitamina D natural para el resto de vitamina D. En algunas realizaciones, la molécula generadora de señal se selecciona del grupo que consiste en éster de acridinio, isoluminol, fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante y fluoresina.
Los kits anteriores se pueden usar en un método para analizar un resto de vitamina D en una muestra, cuyo método comprende: a) formar una mezcla de una muestra y el primer reactivo de ensayo e incubar la mezcla durante un período de tiempo; y b) poner en contacto la mezcla con la(s) superficie(s) o partículas, por ejemplo, partículas magnéticas, recubiertas con el primer anticuerpo específico para unirse con el resto de vitamina D, y c) después un período de tiempo de incubación, seguido de una etapa de lavado, y d) re-suspender la(s) superficie(s) o partículas, por ejemplo, partículas magnéticas, y ponerlo en contacto con el segundo anticuerpo que es específico para el complejo formado entre el primer anticuerpo en la(s) superficie(s) o partículas, por ejemplo, partículas magnéticas y el resto de vitamina D de muestra y marcarlo con una molécula de señalización para quimioluminiscencia; y e) después de un período de incubación seguido de otra etapa de lavado, la(s) superficie(s) o las partículas magnéticas se mezclan con un iniciador o sustratos que desencadenan la reacción quimioluminiscente. La intensidad quimioluminiscente (RLU) se detecta para determinar la presencia, ausencia y/o cantidad del resto de vitamina D en la muestra.
Las presentes mezclas de reacción o kits pueden formularse o disponerse de cualquier modo o manera adecuada. En algunas realizaciones, las mezclas de reacción o kits presentes están contenidos en una fase única o una fase homogénea. En otras realizaciones, las mezclas de reacción o kits presentes están contenidos en múltiples fases (ensayo heterogéneo), por ejemplo, dos o tres fases.
Opcionalmente, los anticuerpos en los kits y métodos anteriores son diferentes de una proteína de unión a vitamina D natural para el resto de vitamina D.
Los presentes kits se pueden configurar para que se realicen dentro de cualquier tiempo de reacción adecuado. En algunas realizaciones, los kits presentes pueden configurarse para tener un tiempo total de ensayo que es de aproximadamente 60 minutos o menos, por ejemplo, aproximadamente 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, 48, 47, 46. 45., 44, 43, 42, 41,40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 3, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21,20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 minutos o 1 minuto. Por ejemplo, los presentes kits pueden configurarse para tener un tiempo de ensayo desde el inicio, por ejemplo, adición de una muestra y/o reactivo(s), hasta el tiempo de lectura de la señal, que es de aproximadamente 60 minutos o menos, por ejemplo, aproximadamente 59, 58, 57, 56, 55, 54, 53, 52, 51, 50, 49, 48, 47, 46. 45., 44, 43, 42, 41,40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 3, 31,30, 29, 28, 27, 26, 25 ,24 , 23, 22, 21,20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 minutos o 1 minuto .
Los kits presentes pueden configurarse para lograr cualquier precisión adecuada. En algunas realizaciones, los kits presentes se pueden configurar para lograr una precisión o CV de aproximadamente el 30% o menos, por ejemplo, aproximadamente 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14 %, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% o menos. Por ejemplo, los kits presentes se pueden configurar para lograr una precisión o CV de aproximadamente el 5% o menos, por ejemplo, aproximadamente 5%, 4%, 3%, 2,5%, 2%, 1,5% 1%, 0,5% o menos para un nivel de resto de vitamina D de aproximadamente 30 ng/ml o menos, por ejemplo, aproximadamente 30 ng/ml, 25 ng/ml, 20 ng/ml, 15 ng/ml, 10 ng/ml, 5 ng/ml, 4 ng/ml, 3 ng/ml, 2 ng/ml, 1 ng/ml o menos. En otro ejemplo, los kits presentes se pueden configurar para lograr una precisión o CV de aproximadamente el 10% o menos, por ejemplo, aproximadamente 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4,5%, 4,0%, 3%, 2,5%, 2%, 1,5% 1%, 0,5% o menos para un nivel de resto de vitamina D de aproximadamente 100 ng/ml o menos, por ejemplo, aproximadamente 100 ng/ml, 90 ng/ml, 80 ng/ml, 70 ng/ml, 60 ng/ml, 50 ng/ml, 40 ng/ml, 30 ng/ml , 20 ng/ml, 10 ng/ml o menos.
D. Realizaciones ejemplares
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un método, por ejemplo, un método homogéneo o heterogéneo para determinar las concentraciones totales de 25-hidroxi-vitamina D 25(OH)D en una muestra, por ejemplo, muestras de sangre, en donde la disociación de la 25(OH)D de las proteínas de unión a la vitamina D (VBP), la unión de la [25(OH)D] disociada o la 25(OH)D libre con dos anticuerpos monoclonales que forman el complejo anticuerpo-vitamina D-anticuerpo, y la detección de 25(OH)D en la muestra se lleva a cabo en una única mezcla de reacción sin separación de fases ni etapas de lavado implicadas.
Una ventaja particular de las realizaciones es el tiempo total de ensayo significativamente más corto (a menudo < 13 min en un formato de ensayo homogéneo) y su formato de ensayo homogéneo fácil de usar que elimina las necesidades de pretratamiento de muestras o etapas de separación de fases/lavado, y eso permite que el ensayo se adapte fácilmente para su uso en analizadores de química general que se utilizan habitualmente en los laboratorios clínicos.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un método para analizar una muestra de sangre o componentes sanguíneos para determinar la cantidad de 25-hidroxi-vitamina D que comprende: a) mezclar la muestra con un tampón de pH ácido que es capaz de disociar 25(OH)D de su proteína de unión; b) añadir dos anticuerpos monoclonales que se recubren por separado sobre las partículas de látex, con un anticuerpo o el primer anticuerpo que tiene una afinidad específicamente hacia el resto de vitamina D, y el otro anticuerpo o el segundo anticuerpo que tiene una afinidad específicamente hacia el complejo formado entre el primer anticuerpo y resto de vitamina D; y c) determinar la concentración de 25(OH)D en la muestra con una única mezcla de reacción, en la que las proteínas de unión a vitamina D no se eliminan de la muestra y no están implicadas etapas de separación de fases o lavado.
En algunas realizaciones, el tampón de pH ácido es un tampón de acetato de sodio que contiene una cantidad apropiada de sales, polímeros tales como PEG 100k y detergentes. El pH del tampón ácido puede variar entre 2,5 y 6,5. El tampón de pH ácido también puede ser un tampón de citrato de sodio o un tampón de ácido fosfórico u otro tampón que tenga una función tampón en el intervalo de pH ácido.
En algunas realizaciones, las partículas de látex tienen tamaños de diámetro de 30 nm a 500 nm, preferiblemente de 120 nm a 360 nm.
En algunas realizaciones, la muestra son fluidos biológicos que incluyen, pero no se limitan a, sangre completa, plasma, suero y orina.
En algunas realizaciones, la concentración de 25(OH)D incluye la concentración total de 25(OH)D que incluye 25 (OH)D3 y 25(OH)D2.
En algunas realizaciones, el formato de ensayo del método homogéneo de determinación de 25(OH)D son los métodos inmunoturbidimétricos potenciados por partículas. En otras realizaciones, el formato de ensayo del método homogéneo de determinación de 25(OH)D son los métodos inmunonefelométricos potenciados por partículas. En otras realizaciones más, el formato de ensayo de la determinación de 25(OH)D son los métodos de inmunoensayo basados en partículas magnéticas heterogéneas (perlas).
En algunas realizaciones, el formato de ensayo del método heterogéneo de determinación de 25(OH)D es un método de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA).
Puede usarse cualquier anticuerpo adecuado. En algunas realizaciones, el anticuerpo es policlonal. En otras realizaciones, el anticuerpo es monoclonal.
Puede usarse cualquier partícula adecuada. En algunas realizaciones, las partículas son nanopartículas que incluyen, pero no se limitan a, partículas hechas de poliestireno, polimetilmetacrilato, polimetilnaftaleno, carbono 60, co-polímero de estireno, ácido acrílico, naftaleno, partículas magnéticas, oro, plata, sílice, dióxido de silicio, dióxido de cromo y dióxido de titanio.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un kit para determinar 25(OH)D en una muestra, el kit comprende 2 reactivos que incluyen (1) un tampón de pH ácido capaz de disociar 25(OH)D de su proteína de unión; y (2) partículas de látex recubiertas por separado con dos anticuerpos monoclonales, con un anticuerpo o el primer anticuerpo que tiene afinidad de unión hacia el resto de vitamina D, y el otro anticuerpo o el segundo anticuerpo que tiene una afinidad de unión hacia el complejo formado entre el primer anticuerpo y el resto de la vitamina D. En un ensayo ejemplar, se mezclan muestras tales como plasma o suero con el tampón de pH ácido y se incuban durante un corto período de tiempo antes de la adición del segundo reactivo que contiene los anticuerpos conjugados sobre partículas de látex. La concentración de 25(OH)D en la muestra se cuantifica midiendo el cambio óptico de la mezcla de reacción y utilizando un conjunto de calibradores de 25(OH)D.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un kit para determinar 25(OH)D en una muestra, el kit comprende 2 reactivos que incluyen (1) un tampón de pH ácido capaz de disociar 25(OH)D de su proteína de unión (parcial o completamente); y (2) un reactivo que contiene dos anticuerpos que se conjugan por separado sobre partículas con un anticuerpo que tiene una afinidad de unión hacia el resto de vitamina D, y el otro anticuerpo que tiene afinidad de unión hacia el complejo formado entre el primer anticuerpo y el resto de vitamina D. En un ensayo ejemplar, se mezclan muestras tales como plasma o suero con el tampón de pH ácido y se incuban durante un corto período de tiempo antes de la adición del segundo reactivo que contiene los anticuerpos recubiertos sobre las partículas. La concentración de 25(OH)D en la muestra se cuantifica midiendo el cambio óptico de la mezcla de reacción y utilizando un conjunto de calibradores de 25(OH)D.
En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un kit para determinar 25(OH)D en una muestra, el kit contiene una solución de disociación que comprende un tampón de pH ácido. Este kit se puede utilizar en formato ELISA con placas de microtitulación para la determinación de 25(OH)D.
En algunas realizaciones, los ensayos de vitamina D ejemplares usan partículas magnéticas acopladas con moléculas de señalización quimioluminiscentes o fluorescentes. El método de ensayo de vitamina D utiliza partículas magnéticas recubiertas con un anticuerpo monoclonal o policlonal que tiene una afinidad de unión hacia el resto de vitamina D, y usa otro anticuerpo marcado con moléculas de detección quimioluminiscentes y que tiene una afinidad de unión hacia el complejo formado entre el anticuerpo recubierto sobre las partículas magnéticas y el resto de vitamina D. Después de las incubaciones y las etapas de lavado, las concentraciones de vitamina D en las muestras se determinan en base a la intensidad de la señal (RLU) de la quimioluminiscencia y una curva de calibración.
En algunas realizaciones, los ensayos de vitamina D ejemplares tienen ciertas ventajas sobre los ensayos de vitamina D en la técnica. Las ventajas ejemplares incluyen una o más de las siguientes: ensayo de vitamina D rápido o más rápido (resultados en ~ 10 minutos o menos); ensayo universal de vitamina D para analizadores de química general; sistema de dos reactivos líquido estable, listo para usar; calibradores y controles líquidos estables; automatización o automatización completa; ningún requisito para pretratamientos o etapas de pre-diluciones; reconocimiento igual de 25-OH Vitamina D2 y 25-OH Vitamina D3; apto para un alto rendimiento en analizadores de química clínica; y/o trazable a NIST SRM972. Otras ventajas ejemplares incluyen una o más de las siguientes: tiempo de prueba rápido (menos de 10 minutos); formato de dos reactivos que es un ensayo fácil de usar para la vitamina D; y/o formato de ensayo adaptable a muchos o todos los analizadores de química clínica automatizados que son los instrumentos más comúnmente utilizados en todos los tamaños de laboratorios clínicos. En algunas realizaciones, estas ventajas hacen posible el uso del ensayo de vitamina D ejemplar como un verdadero ensayo clínico de rutina.
La presente invención se ilustra además mediante los siguientes ejemplos de realización.
Ejemplos
Ejemplo 1: Kit de ensayo de 25(OH)D
Los reactivos de inmunoensayo potenciados con partículas de látex utilizados en este ejemplo se enumeran a continuación:
Reactivo 1
Acetato de sodio 0,05M, pH 4,0
NaCl al 10%
Cloruro de colina 0,5M MES al 5%
azúcar al 0,5%
Tween 20 al 0,04%
PEG 100k al 0,9%
NaN3 al 0,09%
Reactivo 2
Tris 0,6M, pH 8,0
BSA al 0,1%
Sacarosa al 10%
Tween 20 al 0,2%
primer conjugado anticuerpo-partícula de látex al 0,05%
segundo conjugado anticuerpo-partícula de látex al 0,08%
NaN3 al 0,09%
1. Procedimiento de ensayo con el analizador Beckman AU 680
Figure imgf000012_0001
Se mezclaron tres (3) pL de muestra con 160 pL de Reactivo 1 dentro de una cubeta y se incubaron a 37°C durante aproximadamente 3,5 min. Se añadieron cuarenta (40) pl de Reactivo 2 a la mezcla y se incubaron durante aproximadamente 4 min. El cambio en la absorbancia a 700 nm se midió usando los parámetros del ensayo como se indica en la hoja de parámetros a continuación (Tabla 1).
Tabla 1. Parámetros del ensayo en el analizador AU 680
General
Nombre de la prueba: VITD Tipo: Suero Operación: si
Volumen de muestra 3,0pl Dilución 0pl Tasa de predilución 1
Reactivos: OD mín. OD máx.
Volumen R1 160pl Dilución 0pl L: H:
Volumen R240pl Dilución 0pl
Longitud de onda: Límite OD del reactivo:
Método: FIXED Primer L: -2.000; Primer H: 3.000
Pendiente de reacción: Último L: -2.000; Último H: 3.000
Punto de medición 1: Primero 11; Último 22 Intervalo dinámico:
Punto de medición 2: Primero; Último L: H:
Linealidad: Factor de correlación:
Sin tiempo de retraso: No A: 1,0000 B: 0,000
Período de estabilidad a bordo
Tipo de calibración: 5AB Fórmula: Recuentos:2
Spline
Proceso: CONC
Cal No. CONC Factor/OD-L Factor OD-H OD
Punto 1 : 1 0.00 -2,00000 3,0000
Punto 2: 2 * * * -2,00000 3,0000
Punto 3: 3 * * * -2,00000 3,0000
Punto 4: 4 * * * -2,00000 3,0000
Punto 5: 5 * * * -2,00000 3,0000
Punto 6: 6
Punto 7:
1-Punto Cal. Factor de tipo de MB de _con CONC- Calibración avanzada: Sin período de estabilidad de puntos: 0 calibración:
1. Curva de calibración del ensayo (ejemplo único)
El kit de ensayo de 25(OH)D se calibró con calibradores basados en suero de concentraciones conocidas de 25 (OH)D. La curva de calibración se muestra en la Figura 1.
Después de una calibración exitosa del kit de ensayo de 25(OH)D, se probaron los controles y los estándares de linealidad. Además, se analizaron muestras de suero de pacientes y se compararon los resultados con un método de ensayo de vitamina D disponible comercialmente y aprobado por la FDA (método de inmunoensayo DiaSorin), así como con un método de cromatografía líquida-espectrofotométrica de masas (LC-MS) para la vitamina D total (considerado como el estándar de oro para la prueba de vitamina D). Los resultados se muestran en las Tablas 1-3 a continuación y en las Figuras 2-6.
2. Resultados:
Las precisiones de los ensayos se muestran a continuación en la Tabla 2.
Tabla 2: Precisiones del ensayo de vitamina D
Figure imgf000013_0001
La linealidad del ensayo en el analizador AU 680 se muestra en la Figura 2. La precisión del ensayo en comparación con el método DiaSorin Liason se muestra en la Figura 3. La precisión del ensayo en comparación con el método LC MS/MS se muestra en la Figura 4.
Ejemplo 2: kit de ensayo de 25(OH)D
Los reactivos de inmunoensayo quimioluminiscente basado en partículas magnéticas utilizados se enumeran en este ejemplo:
Reactivo 1:
Tampón de acetato de sodio 0,05M, pH 4,0
NaCl al 8%
Sacarosa al 1,2%
Tween 20 al 0,05%
NaN3 al 0,09%
Reactivo 2:
1 x tampón PBS, pH 7,4
BSA al 0,3%
Tween 20 al 0,04%
NaN3 al 0,09%
0,1 mg/ml de partículas magnéticas recubiertas con el primer anticuerpo
Reactivo 3:
1 x tampón PBS, pH 8,0
BSA al 0,2%
Tween 20 al 0,04%
1ug/ml del segundo anticuerpo marcado con ABEI
NaN3 al 0,09%
Iniciador (sustratos):
a) NaOH al 5%; b) Peróxido al 0,1%
Solución de lavado:
Tampón Tris-HCl 0,1M y detergente.
Procedimiento de ensayo utilizando un instrumento comercial disponible:
Se mezclaron cinco ul (5 ul) de muestra de suero con 180 ul del Reactivo 1 y se incubaron durante 5 min para disociar la vitamina D en la muestra de sus proteínas de unión. Aspirar 100 ul de la mezcla de muestra/reactivo 1 anterior, y mezclar con 20 ul del reactivo 2 e incubar durante 20 min antes de añadir 50 ul del reactivo 3. Después de otros 10 min de incubación, las partículas magnéticas se lavaron con el tampón de lavado por 3 veces. Se añadieron 200 ul de sustratos y se leyó la intensidad quimioluminiscente o RLU durante 3 segundos. El contenido de vitamina D en la muestra se determinó basándose en la RLU y la curva de calibración establecida en las mismas condiciones de ensayo.
Resultados:
En la Figura 5 se muestra una curva de calibración ejemplar del método de detección quimioluminiscente. Las precisiones del ensayo (10 repeticiones para cada nivel de controles) se muestran a continuación en la Tabla 3. En la Figura 6 se muestran los datos comparativos entre un método ejemplar de la presente divulgación y un método predicado disponible comercialmente (inmunoensayo) sobre la precisión del ensayo.
Tabla 3. Precisiones del ensayo (10 repeticiones para cada nivel de controles)
Figure imgf000015_0001
Ejemplo 3: rendimiento analítico
a. Precisión/Reproducibilidad
La precisión de un ensayo de vitamina D de Dyazime ejemplar (inmunoensayo potenciado con partículas de látex en el Ejemplo 1) se evaluó según la guía EP5-A2 del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). La evaluación de precisión se realizó en el analizador químico Beckman AU680. En el estudio se utilizaron tres lotes de reactivos. Para cada lote de reactivo, se analizaron 12 muestras: 2 controles de vitamina D y 10 muestras de suero humano con vitamina D. Las muestras de suero analizadas que cuentan con la aprobación del IRB se obtuvieron de una fuente comercial (PromedDx) y cubrieron el intervalo dinámico del ensayo. Según lo recomendado por el protocolo CLSI EP5-A2, las muestras de precisión se analizaron por duplicado por ciclo y dos ciclos por día durante 20 días hábiles. Se obtuvieron ochenta (80) puntos de datos por muestra y por lote de reactivo.
Los resultados de precisión obtenidos para un lote representativo de reactivos se resumen a continuación en la Tabla 4.
Tabla 4
Figure imgf000015_0002
b. Linealidad/Intervalo notificable del ensayo
La linealidad del ensayo ejemplar de vitamina D de Dyazime se evaluó utilizando la guía CLSI EP6-A (Evaluation of the Linearity of Quantitative Analytical Methods; approved: 2003).
Criterios de aceptación
La regresión lineal de los valores medidos frente a los valores esperados tiene una pendiente de 1,0 ± 0,05 y un coeficiente de correlación R2 > 0,95.
El estudio de linealidad se realizó en el analizador químico Beckman AU680. A una muestra de suero humano se le añadió una solución madre de vitamina D a una concentración de 156,3 ng/ml (medida por triplicado usando el ensayo de vitamina D de Dyazime ejemplar). El material madre de vitamina D se adquirió de Sigma-Aldrich y las concentraciones molares se calcularon utilizando la información proporcionada por el certificado de análisis. La muestra alta así preparada se diluyó con una muestra baja que medía 4,3 ng/ml (medida por triplicado usando el ensayo de vitamina D de Dyazime ejemplar) para crear un total de 11 niveles de linealidad como sigue:
Nivel 01: 1,00 ml de muestra baja 0,00 ml de muestra alta
Nivel 02: 0,90 ml de muestra baja 0,10 ml de muestra alta
Nivel 03: 0,80 m de muestra baja 0,20 ml de muestra alta
Nivel 04: 0,70 m de muestra baja 0,30 ml de muestra alta
Nivel 05: 0,60 m de muestra baja 0,40 ml de muestra alta
Nivel 06: 0,50 m de muestra baja 0,50 ml de muestra alta
Nivel 07: 0,40 m de muestra baja 0,60 ml de muestra alta
Nivel 08: 0,30 m de muestra baja 0,70 ml de muestra alta
Nivel 09: 0,20 m de muestra baja 0,80 ml de muestra alta
Nivel 10: 0,10 m de muestra baja 0,90 ml de muestra alta
Nivel 11: 0,00 m de muestra baja 1,00 ml de muestra alta
El conjunto de linealidad preparado anteriormente se probó con el ensayo de vitamina D de Dyazime ejemplar por triplicado usando un lote de reactivos. Los resultados de la prueba de linealidad se muestran en la Tabla 5 a continuación y en la Figura 7.
Tabla 5
Figure imgf000016_0001
Ejemplo 4: estudios comparativos
a. Comparación de métodos con dispositivo predicado
Para este estudio de comparación de métodos, se analizaron muestras de suero individuales con el ensayo de vitamina D Dyazime ejemplar (inmunoensayo potenciado con partículas de látex en el Ejemplo 1) y se compararon con el dispositivo predicado (DiaSorin Liaison LX). Las muestras de suero se obtuvieron de una fuente comercial, Biochemed y venían con la aprobación del IRB. Se excluyeron las muestras que mostraban valores fuera del intervalo dinámico del ensayo. Se utilizó un total de 40 muestras inalteradas que abarcan el ensayo AMR en el análisis de la precisión. Los resultados se muestran en la Figura 8.
b. Comparación de matrices
Para evaluar el efecto de los anticoagulantes, se utilizó el ejemplo de ensayo de vitamina D de Dyazime para medir las concentraciones de 25-OH vitamina D de conjuntos de suero, K2-EDTA, K3-Plasma EDTA y plasma Heparina de litio. Las muestras utilizadas en este estudio se obtuvieron de una fuente comercial certificada (ProMedDx, LLC). Todas las muestras analizadas se recolectaron según un protocolo aprobado por el IRB por el proveedor comercial. Los valores reportados para cada muestra y para cada matriz se obtuvieron a partir de mediciones individuales. El número total de conjuntos emparejados probados fue 54. Con el fin de cubrir el intervalo de medición reivindicado para cada matriz, se incluyeron en el estudio siete muestras de pacientes enriquecidas. Los resultados se muestran en las Figuras 9-11.
Ejemplo 5: Ensayo de quimioluminiscencia de vitamina D de Dyazime ejemplar
Un ensayo de quimioluminiscencia de vitamina D de Dyazime ejemplar se compone de 3 reactivos: perlas magnéticas conjugadas con el primer anticuerpo; tampón de extracción; y el segundo anticuerpo conjugado con la molécula ABEI (ISO-lumina) como se describe en el Ejemplo 2. El procedimiento de ensayo se muestra en la Tabla 6 a continuación: Tabla 6. Procedimiento de ensayo
Figure imgf000017_0001
El ensayo de quimioluminiscencia de vitamina D de Dyazime ejemplar se comparó con el ensayo de Roche VD. Los resultados de la comparación se muestran en la Figura 12. La precisión del Ensayo de quimioluminiscencia de vitamina D de Dyazime ejemplar se muestra en las Tablas 7 y 8 a continuación.
Tabla 7. Precisiones del ensayo
Figure imgf000017_0002
Tabla 8. Precisiones del ensayo
Figure imgf000018_0001
Los ejemplos anteriores se incluyen sólo con fines ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la invención. Son posibles muchas variaciones de las descritas anteriormente. Dado que las modificaciones y variaciones de los ejemplos descritos anteriormente serán evidentes para los expertos en esta técnica, se pretende que esta invención esté limitada únicamente por el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un método para analizar un resto de vitamina D en una muestra, cuyo método comprende:
a) poner en contacto una muestra que contiene o se sospecha que contiene un resto de vitamina D con un tampón de pH ácido en el intervalo de 2,5 a 6,9, y al menos dos anticuerpos que se conjugan por separado a partículas, en donde al menos uno de dichos anticuerpos o el primer anticuerpo tiene una afinidad de unión específica hacia el resto de vitamina D, y al menos otro de dichos anticuerpos o el segundo anticuerpo tiene una afinidad de unión específica hacia el complejo formado entre el primer anticuerpo y el resto de vitamina D; y b) evaluar la unión entre dichos anticuerpos y dicho resto de vitamina D para determinar la presencia, ausencia y/o cantidad de dicho resto de vitamina D en dicha muestra,
en donde dicho método se realiza como un ensayo homogéneo.
2. El método de la reivindicación 1, en el que la muestra se pone en contacto con una única mezcla de reacción que comprende un tampón de pH ácido capaz de disociar el resto de vitamina D de sus proteínas de unión, y anticuerpos emparejados conjugados por separado en partículas con un anticuerpo o el primer anticuerpo que tiene un afinidad de unión específica hacia el resto de vitamina D y el otro anticuerpo o el segundo anticuerpo que tiene una afinidad de unión específica hacia el complejo formado entre el primer anticuerpo y el resto de vitamina D.
3. El método de la reivindicación 1 o 2, que se usa para evaluar el estado del resto de vitamina D en un sujeto, y la muestra es una muestra biológica obtenida y/o derivada del sujeto.
4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, en el que el resto de vitamina D es 25(OH)D2, 25(OH)D3 o una suma de 25(OH)D2 y 25(OH)D3.
5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde las partículas comprenden poliestireno, polimetil metacrilato, polimetil naftaleno, poli (divinilbenceno), polivinil naftaleno, co-polímero de estireno, ácido acrílico divinilbenceno, naftaleno, carbono 60, perlas magnéticas, oro, plata, sílice, dióxido de silicio, dióxido de cromo y/o dióxido de titanio.
6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que se realiza usando un método inmunoturbidimétrico potenciado con partículas, un método inmunonefelométrico potenciado con partículas, un método de inmunoensayo basado en partículas magnéticas o perlas.
7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el ensayo se completa en 30 minutos o menos.
8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el ensayo se realiza con un analizador de química general o un analizador de química clínica.
9. Un kit para analizar un resto de vitamina D en una muestra, cuyo kit comprende:
a) un tampón de pH ácido en el intervalo de 2,5 a 6,9; y
b) al menos dos anticuerpos que se conjugan por separado a una superficie o superficies o partículas en las que al menos uno de dichos anticuerpos o el primer anticuerpo tiene una afinidad de unión específica hacia el resto de vitamina D, y al menos otro de dicho anticuerpo o el segundo anticuerpo tiene una afinidad de unión específica hacia el complejo formado entre el primer anticuerpo y el resto de vitamina D, si está presente en dicha muestra.
10. El kit de la reivindicación 9, que comprende:
1) un primer reactivo de ensayo que comprende un tampón de pH ácido que contiene una sal, un polímero y/o un detergente, y
2) un segundo reactivo de ensayo que comprende un par de anticuerpos conjugados por separado en partículas, con un anticuerpo o el primer anticuerpo que tiene una afinidad de unión específica a 25(OH)D y con otro anticuerpo o el segundo anticuerpo que tiene una afinidad de unión específica al complejo formado entre el primer anticuerpo y el 25(OH)D.
11. Un método para analizar un resto de vitamina D en una muestra usando el kit de la reivindicación 10, cuyo método comprende:
a) formar una mezcla de una muestra y el primer reactivo de ensayo e incubar la mezcla durante un período de tiempo antes de añadir el segundo reactivo de ensayo a la mezcla; y
b) cuantificar la cantidad de 25(OH)D en la muestra midiendo el cambio óptico de la mezcla de reacción y usando un conjunto de calibradores de 25(OH)D.
12. Un método para analizar un resto de vitamina D en una muestra usando el kit de la reivindicación 9, cuyo método comprende:
a) poner en contacto la muestra con el primer anticuerpo que se recubre en una placa de microtitulación en presencia del primer reactivo de ensayo e incubar la mezcla durante un período de tiempo;
b) añadir el segundo anticuerpo que está marcado con una molécula de señalización; y
c) después de la incubación y una etapa de lavado o etapas de lavado, determinar la presencia, ausencia y/o cantidad del resto de vitamina D en la muestra basándose en la intensidad de la señal y la curva de calibración.
13. Un kit para analizar un resto de vitamina D en una muestra, cuyo kit comprende:
a) un tampón de pH ácido en el intervalo de 2,5 a 6,9;
b) partículas recubiertas con un primer anticuerpo que tiene una afinidad de unión específica a dicho resto de vitamina D;
c) un segundo anticuerpo marcado con una molécula generadora de señal seleccionada entre éster de acridinio, isoluminol, fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante o fluoresina, teniendo dicho segundo anticuerpo una afinidad de unión específica hacia un complejo formado entre el primer anticuerpo y el resto de vitamina D; y d) una solución de sustrato o sustratos y/o iniciador necesario para la generación de señales quimioluminiscentes o fluorescentes.
14. Un método para analizar un resto de vitamina D en una muestra, cuyo método comprende:
a) poner en contacto dicha muestra con un primer reactivo que comprende un tampón de pH ácido en el intervalo de 2,5 a 6,9 para disociar dicho resto de vitamina D en dicha muestra de sus proteínas de unión;
b) poner en contacto dicho resto de vitamina D en dicha muestra de la etapa a) con un segundo reactivo que comprende partículas recubiertas con un primer anticuerpo que tiene una afinidad de unión específica a dicho resto de vitamina D para formar un complejo resto de vitamina D/primer anticuerpo; y
c) poner en contacto dicho complejo resto de vitamina D/primer anticuerpo con un tercer reactivo que comprende un segundo anticuerpo marcado con un resto o molécula generadora de señal para formar un complejo entre dicho resto de vitamina D, teniendo dicho segundo anticuerpo una afinidad de unión específica hacia el complejo formado entre el primer anticuerpo y el resto de vitamina D y dicho primer anticuerpo y dicho segundo anticuerpo marcados con un resto o molécula generadora de señal; y
d) evaluar dicha señal de dicho complejo entre dicho resto de vitamina D, dicho primer anticuerpo y dicho segundo anticuerpo para determinar la presencia, ausencia y/o cantidad del resto de vitamina D en dicha muestra.
15. Un método para analizar un resto de vitamina D en una muestra, cuyo método comprende:
a) poner en contacto una muestra que contiene o se sospecha que contiene un resto de vitamina D con un tampón de pH ácido en el intervalo de 2,5 a 6,9, y al menos dos anticuerpos, en donde al menos uno de dichos anticuerpos o el primer anticuerpo tiene una afinidad de unión específica hacia el resto de vitamina D y está unido a una superficie sólida de una placa de microtitulación o una partícula, y al menos otro de dichos anticuerpos o el segundo anticuerpo tiene una afinidad de unión específica hacia el complejo formado entre dicho primer anticuerpo y dicho resto de vitamina D y está marcado con un resto generador de señal, y
b) evaluar la unión entre dichos anticuerpos y dicho resto de vitamina D para determinar la presencia, ausencia y/o cantidad de dicho resto de vitamina D en dicha muestra.
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