ES2878043T3 - Composiciones purificadas de proteínas IVIG y KH para la modulación de los linfocitos y el tratamiento del virus de la hepatitis B - Google Patents

Composiciones purificadas de proteínas IVIG y KH para la modulación de los linfocitos y el tratamiento del virus de la hepatitis B Download PDF

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Abstract

Producto plasmático de inmunoglobulina intravenosa (IVIG) purificada aislada que comprende un complejo de proteínas purificado aislado que contiene proteínas definidas por las secuencias de aminoácidos SEC ID nº 33 a nº 37.

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones purificadas de proteínas IVIG y KH para la modulación de los linfocitos y el tratamiento del virus de la hepatitis B
Campo de la invención:
La invención se refiere a productos plasmáticos de IVIG purificados y aislados que comprenden un complejo de proteínas purificado y aislado y productos plasmáticos de IVIG purificados y aislados, para la utilización en el tratamiento de la hepatitis B.
Antecedentes de la invención:
La práctica de administrar anticuerpos o antitoxinas adquiridas de individuos o animales expuestos o vacunados en un paciente susceptible a la enfermedad en cuestión ha sido la práctica médica subyacente en inmunoterapia pasiva desde finales del siglo XIX. Desde los años 1940, la albúmina humana y otras proteínas terapéuticas han sido extraídas del plasma para satisfacer necesidades clínicas específicas.
En comparación con la mayoría de antibióticos, las terapias a base de anticuerpos que utilizan anticuerpos humanos presentan una baja toxicidad y una elevada especificidad. La elevada especificidad significa que el anticuerpo presenta como diana únicamente el microorganismo patógeno que causa la enfermedad sin afectar a los organismos endógenos del huésped; por lo tanto, minimizando las reacciones adversas y la probabilidad de desarrollo de organismos resistentes. Sin embargo, lo anterior también significa que puede requerirse más de una preparación de anticuerpos para el reconocimiento de microorganismos con una elevada variación antigénica. Los productos plasmáticos de combinación que contienen anticuerpos específicos para una diversidad de enfermedades y aflicciones, así como terapias de administración de los mismos, por lo tanto, resultan deseables para tratar un abanico de enfermedades, minimizando simultáneamente los daños a las células sanas.
La identificación de diversas fracciones de plasma humano, así como las proteínas que residen en ellas y las características únicas de dichas proteínas han resultado en nuevos tratamientos que salvan vidas para una diversidad de enfermedades crónicas y agudas, hereditarias y adquiridas. Las mejoras en los procedimientos de fabricación que garantizan la seguridad y eficacia del producto, y la identificación de aplicaciones clínicas específicas requieren nuevos avances tecnológicos.
Diversas técnicas para eliminar agregados de proteínas, tales como la cromatografía, han permitido que algunos productos resulten más tolerables al administrarlos por vía intravenosa y la adición de etapas de eliminación/inactivación vírica ha permitido que los productos se encuentren esencialmente libres de virus con cubierta lipídica y no lipídica.
La inmunoglobulina intravenosa (IVIG) es un producto sanguíneo que se administra generalmente por vía intravenosa. IVIG se administra en pacientes con inmunodeficiencias y sus beneficios en enfermedades secundarias relacionadas con las inmunodeficiencias lo ha convertido en un tratamiento de primera o segunda línea crecientemente atractivo. IVIG se fabrica a partir de plasma humano agrupado y contiene glóbulos blancos denominados linfocitos. Un linfocito es cualquiera de entre tres tipos de células inmunitarias, entre ellas: (1) células asesinas naturales (células NK, que funcionan en inmunidad innata citotóxica mediada por células), (2) células T (para inmunidad adaptativa citotóxica mediada por células), y (3) células B (para inmunidad adaptativa humoral, desarrollada por anticuerpos).
Los anticuerpos son producidos por las células B y las células plasmáticas después de la exposición a los antígenos. Pueden ser la inmunoglobulina G (IgG), IgA, IgM, IgE, o IgD, aunque en el caso de hiperinmunes, las IgG son los anticuerpos de interés. La IgG consiste en cuatro cadenas polipeptídicas, dos pares de cadenas polipeptídicas, dos pares de cadenas pesadas y ligeras en una estructura en forma de Y. Los extremos superiores de la molécula de IgG, Fab o zona de unión de anticuerpo se crean a partir de una cadena pesada y una cadena ligera, formando el sitio de unión a antígeno. Dicho fragmento de zona variable (Fv) contiene diversas combinaciones de aminoácidos, que hacen que cada anticuerpo sea único. Resulta importante que los productos hiperinmune intravenosos de IVIG purificada contienen proteínas IgG humanas de las que por lo menos 96% son IgG que contienen anticuerpos específicos contra el antígeno específico. Resulta significativo que entre mediados y finales de los años 2000, la necesidad de una preparación más eficiente de IVIG purificadas aisladas se ha incrementado drásticamente. Los productos que regulan los porcentajes de células B y T que reconocen dolencias y enfermedades específicas también resultan deseables. Echevarria J. M. et al. (Transfusion, American Association of Blood Banks, Bethesda, MD, US, vol 36, n° 8, 1 de agosto de 1996, páginas 725 a 730) informan de la transferencia pasiva de anticuerpos a virus de la hepatitis C (VHC) tras la infusión de inmunoglobulina intravenosa humana (IVIG) en pacientes con inmunodeficiencias humorales.
Breuer G. S. et al. (Journal of Clinical Gastoenterology, Raven Press LTD., New York, NY, US, vol. 32, n° 2, 1 de febrero de 2001, páginas 179 a 180) informan del tratamiento del síndrome de Guillain-Barre (SGB) tras hepatitis A con inmunoglobulina intravenosa.
El documento n° WO 2009/117085 se refiere a la utilización combinada de una composición de inmunoglobulinas y hialuronidasa para la administración subcutánea, en el que el régimen de administración es el mismo que para la administración intravenosa de la misma dosis para el tratamiento de una enfermedad o condición tratable con IG. El documento n° US 2010/047249 A1 se refiere a composiciones para inhibir la fagocitosis mediada por Fcy con preparaciones de inmunoglobulina reducida, de manera que dicho inhibidor de inmunoglobulina reducida de la fagocitosis mediada por Fcy comprende una IVIG reducida.
Descripción resumida de la invención
La invención se define según las reivindicaciones adjuntas 1 a 18.
La presente exposición se refiere a productos de plasma purificados de inmunoglobulina humana, a métodos de preparación de los mismos y a su utilización en el tratamiento del virus de la hepatitis B. Los productos de plasma purificados de inmunoglobulinas humanas resultan útiles en el tratamiento de una diversidad de enfermedades crónicas y agudas, hereditarias y adquiridas, mediante la regulación de los niveles de las células inmunitarias y sus proteínas relacionadas en el sujeto tratado.
En realizaciones de la invención, diversos productos de plasma sanguíneo purificados resultan de utilidad en el tratamiento de infecciones víricas, tales como el VHB.
En la presente memoria se da a conocer la regulación de los niveles de las células B y T en la sangre periférica y órganos de un individuo tratado mediante la administración profiláctica o terapéutica de productos de plasma sanguíneo purificados.
En la presente memoria se da a conocer además la regulación de los niveles de granulocitos y macrófagos en la sangre periférica y órganos de un individuo tratado mediante la administración profiláctica o terapéutica de productos de plasma sanguíneo purificados.
En la presente exposición, se obtiene un complejo de proteínas purificado mediante la purificación de inmunoglobulina G intravenosa (IVIG) de pasta de la fracción II+III de plasma humano. FIG. 73. Además del componente principal de inmunoglobulinas, el análisis del complejo de proteínas ha mostrado que el producto contiene las proteínas siguientes: 120/E19 IGHV4-31, IGHG1 44kDa, 191/H18 IGHV4 31, IGHG1 32kDa, proteína no caracterizada putativa IGHG1, DKFZp686G11190, y proteínas KH 33-37. FIG 75. La combinación de proteínas KH 33-37 con una concentración de 30% se ha mostrado que resulta muy eficaz contra virus tales H1N1, H5N1, enfermedad del virus de la fiebre aftosa y para detener la replicación del ADN del virus de la hepatitis B.
En la presente exposición, se obtuvo un complejo de proteínas purificado mediante la purificación de la inmunoglobulina de la hepatitis B (HBIG) a partir de fracción II+III de plasma humano de donantes que presentaban niveles elevados de anticuerpos del antígeno superficial de la hepatitis B. FIG. 74. Además de las proteínas inmunoglobulinas, HBIG contenía la proteína TF serotransferrina (secuencia n° 197/H24). Este complejo contenía las proteínas KH 22-37 y se ha encontrado que resulta eficaz en detener la replicación del ADN del virus de la hepatitis B.
En todavía otra realización, se formuló un complejo de proteínas purificado para combatir la escasez de anticuerpo de la hepatitis B. FIGS. 77-78. Este complejo de proteínas purificado es una combinación de 80% de inmunoglobulina normal purificada y 20% de inmunoglobulina de hepatitis B purificada que contiene niveles elevados de anticuerpos de la hepatitis B. En la presente realización, ambos productos presentan una concentración por ultrafiltración de por lo menos 30%. El complejo de proteínas purificado de la presente realización contiene proteínas denominadas KH22-37 y KH51. En la presente memoria se incluye información adicional sobre las proteínas denominadas KH.
En una realización relacionada, un método de preparación de un complejo de proteínas purificado comprende: seguir el protocolo de fabricación para preparar por separado inmunoglobulina normal y anticuerpo de la hepatitis B hasta la etapa de obtención de masa final no estéril de ambos productos, utilizando 80% de masa final no estéril de inmunoglobulina normal y mezclando 20% de masa final no estéril de anticuerpo de la hepatitis B, y llevando a cabo la filtración estéril para el llenado del producto final. FIG 77.
La otra realización del método de preparación de un complejo de proteínas purificado comprende: utilizar 80% de fracción II+III de inmunoglobulinas normales y 20% de fracción II-III de anticuerpos de la hepatitis B y disolver las fracciones juntas en un tanque de proceso para la producción de la inmunoglobulina normal hasta llenar el producto final. FIG 78.
La presente exposición incluye complejos de proteínas purificados que contienen diversas proteínas que presentan características únicas útiles en el tratamiento de infecciones y enfermedades. Se ha asignado una denominación "KH" a determinadas proteínas contenidas en los complejos de proteínas purificados. Dichas denominaciones, así como la información adicional correspondiente a dichas proteínas se encuentra en las figuras, posteriormente.
Se han identificado 538 funciones para las 55 proteínas KH, que les proporcionan características únicas para el tratamiento de un amplio abanico de enfermedades, infecciones y otras alteraciones celulares, según se expresa en la presente exposición.
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Se proporciona información adicional de secuencias de proteínas, así como identificadores de secuencia y números de acceso para las proteínas KH 1-55 en la tabla, a continuación.
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o Los datos de una o más realizaciones de la presente invención se proporcionan en las figuras adjuntas y en la descripción, posteriormente. Resultarán evidentes áreas adicionales de aplicabilidad a partir de la descripción proporcionada en la presente memoria.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es un gráfico que ilustra los porcentajes de linfocitos T y B en sangre periférica, con y sin tratamiento terapéutico de RAAS 105.
La figura 2 es un gráfico que ilustra los porcentajes de linfocitos T y B en sangre periférica, en el que se lleva a cabo un análisis adicional de linajes de células T CD4 y CD8, con y sin tratamiento terapéutico de RAAS 105. La figura 3 es un gráfico que ilustra los porcentajes de células T CD4 y CD8 en sangre periférica, con y sin tratamiento terapéutico de RAAS 105.
La figura 4 es un gráfico que ilustra los porcentajes de células T CD4 y CD8 en sangre periférica, en el que se lleva a cabo análisis adicional de los porcentajes de células dendríticas (DC) CD1 1c+ y granulocitos Gr-1+.
La figura 5 es un gráfico que ilustra los porcentajes de células dendríticas y granulocitos en sangre periférica, con y sin tratamiento terapéutico de RAAS 105.
La figura 6 es un gráfico que muestra otra representación de células Gr-1 vs. CD 11c, con y sin tratamiento terapéutico de RAAS 105.
La figura 7 es un gráfico que ilustra el porcentaje de monocitos en sangre periférica, con y sin tratamiento terapéutico de RAAS 105.
La figura 8 es un gráfico que muestra otra representación de monocitos en sangre periférica, con y sin tratamiento terapéutico de RAAS 105.
La figura 9 es un gráfico que ilustra los porcentajes de linfocitos T y B en el bazo, con y sin tratamiento terapéutico de RAAS 105.
La figura 10 es un gráfico que otra representación de linfocitos T y B en el bazo, con y sin tratamiento terapéutico de RAAS 105.
La figura 11 es un gráfico que ilustra los porcentajes de células T CD4 y CD8 en el bazo, con y sin tratamiento terapéutico de RAAS 105.
La figura 12 es un gráfico que muestra otra representación de células T CD4 y CD8 en el bazo, con selección de las células T CD3, con y sin tratamiento terapéutico de RAAS 105.
La figura 13 es un gráfico que ilustra los porcentajes de subgrupos de células T en el bazo, con y sin tratamiento terapéutico de RAAS 105.
La figura 14 es un gráfico que ilustra los porcentajes de subgrupos de células T en el bazo, con y sin tratamiento terapéutico de RAAS 105.
La figura 15 es un gráfico que ilustra los porcentajes de subgrupos de células T en el bazo, con y sin tratamiento terapéutico de RAAS 105.
La figura 16 es un gráfico que ilustra los porcentajes de subgrupos de células T CD8 en el bazo, con y sin tratamiento terapéutico de RAAS 105.
La figura 17 es un gráfico que ilustra los porcentajes de células T reguladoras en el bazo, con y sin tratamiento terapéutico de RAAS 105.
La figura 18 es otra representación gráfica de los porcentajes de células T reguladoras en el bazo, con y sin tratamiento terapéutico de RAAS 105.
La figura 19 es un gráfico que ilustra los porcentajes de mDC y pDC en el bazo, con y sin tratamiento terapéutico de RAAS 105.
La figura 20 es otra representación gráfica de mDC y pDC en el bazo, con y sin tratamiento terapéutico de RAAS 105.
La figura 21 es un gráfico que ilustra los porcentajes de macrófagos y granulocitos en el bazo, con y sin tratamiento terapéutico de RAAS 105.
La figura 22 es otra representación gráfica de los porcentajes de macrófagos y granulocitos en el bazo, con y sin tratamiento terapéutico de RAAS 105.
La figura 23 es un gráfico que ilustra los porcentajes de células T en los ganglios linfáticos, con y sin tratamiento terapéutico de RAAS 105.
La figura 24 es un gráfico que muestra los porcentajes de células T CD3 en los ganglios linfáticos, con y sin tratamiento terapéutico de RAAS 105.
La figura 25 es un gráfico que ilustra los porcentajes de células T CD4 y CD8 en los ganglios linfáticos, con y sin tratamiento terapéutico de RAAS 105.
La figura 26 es otra representación gráfica de células T CD4 y CD8 en los ganglios linfáticos, con y sin tratamiento terapéutico de RAAS 105.
La figura 27 es un gráfico que ilustra los porcentajes de subgrupos de células T CD4 en los ganglios linfáticos, con y sin tratamiento terapéutico de RAAS 105.
La figura 28 es otra representación gráfica de los porcentajes de subgrupos de células T CD4 en los ganglios linfáticos, con y sin tratamiento terapéutico de RAAS 105.
La figura 29 es un gráfico que ilustra los porcentajes de subgrupos de células T CD8 en los ganglios linfáticos, con y sin tratamiento terapéutico de RAAS 105.
La figura 30 es otra representación gráfica de los porcentajes de subgrupos de células T CD8 en los ganglios linfáticos, con y sin tratamiento terapéutico de RAAS 105.
La figura 31 es un gráfico que ilustra los porcentajes de células T reguladoras Foxp3 en los ganglios linfáticos, con y sin tratamiento terapéutico de RAAS 105.
La figura 32 es otra representación gráfica de células T reguladoras Foxp3 en los ganglios linfáticos, con y sin tratamiento terapéutico de RAAS 105.
La figura 33 es un gráfico que ilustra los porcentajes de DC en los ganglios linfáticos, con y sin tratamiento terapéutico de RAAS 105.
La figura 34 es otra representación gráfica de los porcentajes de DC en los ganglios linfáticos, con y sin tratamiento terapéutico de RAAS 105.
La figura 35 es un gráfico que ilustra los porcentajes de macrófagos y granulocitos en los ganglios linfáticos, con y sin tratamiento terapéutico de RAAS 105.
La figura 36 es otra representación gráfica de los porcentajes de macrófagos y granulocitos en los ganglios linfáticos, con y sin tratamiento terapéutico de RAAS 105.
La figura 37 es un gráfico que ilustra los porcentajes de linfocitos T y B en sangre periférica, con y sin tratamiento profiláctico de RAAS 105.
La figura 38 es otra representación gráfica de las células T y B en sangre periférica, con y sin tratamiento profiláctico de RAAS 105.
La figura 39 es un gráfico que ilustra los porcentajes de células T CD4 y CD8 en sangre periférica, con y sin tratamiento profiláctico de RAAS 105.
La figura 40 es otra representación gráfica de las células T CD4 y CD8 en sangre periférica, con y sin tratamiento profiláctico de RAAS 105.
La figura 41 es un gráfico que ilustra los porcentajes de células dendríticas y granulocitos en sangre periférica, con y sin tratamiento profiláctico de RAAS 105.
La figura 42 es otra representación gráfica de las células dendríticas y granulocitos en sangre periférica, con y sin tratamiento profiláctico de RAAS 105.
La figura 43 es un gráfico que ilustra los porcentajes de monocitos en sangre periférica, con y sin tratamiento profiláctico de RAAS 105.
La figura 44 es otra representación gráfica de los porcentajes de monocitos en sangre periférica, con y sin tratamiento profiláctico de RAAS 105.
La figura 45 es un gráfico que ilustra los porcentajes de linfocitos T y B en el bazo, con y sin tratamiento profiláctico de RAAS 105.
La figura 46 es otra representación gráfica de los porcentajes de linfocitos T y B en el bazo, con y sin tratamiento profiláctico de RAAS 105.
La figura 47 es un gráfico que ilustra los porcentajes de células T CD4 y CD8 en el bazo, con y sin tratamiento profiláctico de RAAS 105.
La figura 48 es otra representación gráfica de los porcentajes de células T CD4 y CD8 en el bazo, con y sin tratamiento profiláctico de RAAS 105.
La figura 49 es un gráfico que ilustra los porcentajes de subgrupos de células T en el bazo, con y sin tratamiento profiláctico de RAAS 105.
La figura 50 es otra representación gráfica de los porcentajes de subgrupos de células T en el bazo, con y sin tratamiento profiláctico de RAAS 105.
La figura 51 es un gráfico que ilustra los porcentajes de subgrupos de células T en el bazo, con y sin tratamiento profiláctico de RAAS 105.
La figura 52 es otra representación gráfica de los porcentajes de subgrupos de células T en el bazo, con y sin tratamiento profiláctico de RAAS 105.
La figura 53 es un gráfico que ilustra las células T reguladoras Foxp3 en el bazo, con y sin tratamiento profiláctico de RAAS 105.
La figura 54 es otra representación gráfica de las células T reguladoras Foxp3 en el bazo, con y sin tratamiento profiláctico de RAAS 105.
La figura 55 es un gráfico que ilustra los porcentajes de pDC y mDC el bazo, con y sin tratamiento profiláctico de RAAS 105.
La figura 56 es otra representación gráfica de los porcentajes de pDC y mDC en el bazo, con y sin tratamiento profiláctico de RAAS 105.
La figura 57 es un gráfico que ilustra los porcentajes de macrófagos y granulocitos en el bazo, con y sin tratamiento profiláctico de RAAS 105.
La figura 58 es otra representación gráfica de los porcentajes de macrófagos y granulocitos en el bazo, con y sin tratamiento profiláctico de RAAS 105.
La figura 59 es un gráfico que ilustra los porcentajes de células T en los ganglios linfáticos, con y sin tratamiento profiláctico de RAAS 105.
La figura 60 es otra representación gráfica de células T CD3 en los ganglios linfáticos, con y sin tratamiento profiláctico de RAAS 105.
La figura 61 es un gráfico que ilustra los porcentajes de células T CD4 y CD8 en los ganglios linfáticos, con y sin tratamiento profiláctico de RAAS 105.
La figura 62 es otra representación gráfica de los porcentajes de células T CD4 y CD8 en los ganglios linfáticos, con y sin tratamiento profiláctico de RAAS 105.
La figura 63 es un gráfico que ilustra los porcentajes de subgrupos de células T en los ganglios linfáticos, con y sin tratamiento profiláctico de RAAS 105.
La figura 64 es otra representación gráfica de los porcentajes de subgrupos de células T en los ganglios linfáticos, con y sin tratamiento profiláctico de RAAS 105.
La figura 65 es un gráfico que ilustra los porcentajes de subgrupos de células T en los ganglios linfáticos, con y sin tratamiento profiláctico de RAAS 105.
La figura 66 es otra representación gráfica de los porcentajes de subgrupos de células T en los ganglios linfáticos, con y sin tratamiento profiláctico de RAAS 105.
La figura 67 es un gráfico que ilustra los porcentajes de células T reguladoras Foxp3 en los ganglios linfáticos, con y sin tratamiento profiláctico de RAAS 105.
La figura 68 es otra representación gráfica de células T reguladoras Foxp3 en los ganglios linfáticos, con y sin tratamiento profiláctico de RAAS 105.
La figura 69 es un gráfico que ilustra los porcentajes de DC en los ganglios linfáticos, con y sin tratamiento profiláctico de RAAS 105.
La figura 70 es otra representación gráfica de los porcentajes de DC en los ganglios linfáticos, con y sin tratamiento profiláctico de RAAS 105.
La figura 71 es un gráfico que ilustra los porcentajes de macrófagos y granulocitos en los ganglios linfáticos, con y sin tratamiento profiláctico de RAAS 105.
La figura 72 es otra representación gráfica de los porcentajes de macrófagos y granulocitos en los ganglios linfáticos, con y sin tratamiento profiláctico de RAAS 105.
La figura 73 es un gráfico de flujo del procedimiento de preparación de AFOD RAAS 102 a partir de pasta de la fracción II+III.
La figura 74 es un gráfico de flujo del procedimiento de purificación de AFOD RAAS 104 HBIG a partir de pasta de la fracción II+III.
La figura 75 es un análisis de las proteínas HBIG, aparte de las proteínas inmunoglobulinas que contienen la proteína TF serotransferrina.
La figura 76 es una comparación del análisis de proteínas de las inmunoglobulinas de la pasta de fracción II+III, inmunoglobulinas producidas a partir de la pasta de fracción III e inmunoglobulina de hepatitis B producida a partir de pasta de la fracción II+III, incluyendo una ilustración de las diferentes proteínas en cada uno de los productos junto con el análisis principal de las proteínas inmunoglobulinas.
La figura 77 es un gráfico de flujo del procedimiento para AFOD RAAS 105.
La figura 78 es un gráfico de flujo del procedimiento para AFOD RAAS 105.
Descripción detallada de la invención
Caracterización de los tejidos linfoides y sangre periférica en ratones BALB/c infectados por VHB tratados con RAAS 105.
Sumario ejecutivo
Se llevó a cabo una investigación sobre los efectos de RAAS 105 sobre múltiples linajes celulares en tejidos linfoides y sangre periférica en ratones BALB/c infectados por VHB. La infección por VHB y el tratamiento de RAAS 105 se llevaron a cabo en la unidad ID en Wuxi. Al finalizar, las muestras de sangre y los tejidos linfoides fueron proporcionados a los presentes inventores para el análisis de los diversos linajes celulares mediante FACS.
Se llevaron a cabo dos experimentos independientes. En un experimento se sometieron a ensayo los efectos terapéuticos de RAAS 105, y en el otro experimento se sometieron a ensayo los efectos profilácticos de RAAS 105. En comparación con el grupo de vehículo, entre las diferencias observadas en los animales tratados terapéuticamente con RAAS 105 se incluían: 1) los porcentajes de células T y células B en sangre periférica, bazo y ganglios linfáticos se redujeron significativamente; 2) CD62L se encontraba regulada negativamente en grado elevado tanto en células T CD4+ como CD8+ en el bazo y los ganglios linfáticos; 3) los granulocitos y monocitos/macrófagos en sangre periférica y ganglios linfáticos se incrementaron significativamente; 4) los porcentajes de células T reguladoras (CD4+CD25+Foxp3+) en el bazo y los ganglios linfáticos se incrementaron significativamente.
Sin embargo, el tratamiento profiláctico con RAAS 105 condujo a resultados algo diferentes. En el grupo tratado con RAAS 105, también se redujeron los linfocitos T y B. Los porcentajes de monocitos y macrófagos se incrementaron, aunque en menor grado.
Estos resultados sugieren que la administración de RAAS 105 presentó efectos significativos sobre las frecuencias de los linajes de células inmunitarias.
Lista de abreviaturas
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Materiales y métodos:
Materiales
Reactivos
FITC, anticuerpo de rata anti-CD4 de ratón, BD, n° de cat.: 557307
PerCP-Cy5.5, anticuerpo de rata anti-CD4 de ratón, BD, n° de cat.: 550954
FITC, complejo molecular de anticuerpo de rata anti-CD3 de ratón, BD, n° de cat.: 561798
PerCP-Cy5.5, anticuerpo de rata anti-CD3 de ratón, BD, n° de cat.: 560527
PerCP-Cy5.5, anticuerpo de rata anti-CD8a de ratón, BD, n° de cat.: 551162
PE, anticuerpo de rata anti-CD8a de ratón, BD, n° de cat.: 553032
PE, anticuerpo de rata anti-B220/CD45R de ratón, BD, n° de cat.: 553089
APC, anticuerpo de rata anti-CD11b de ratón, BD, n° de cat.: 553312
APC, anticuerpo anti-CD11c de ratón de Ar/Ham, BD, n° de cat.: 550261
PE, anticuerpo de rata anti-CD62L de ratón, BD, n° de cat.: 553151
APC, anticuerpo de rata anti-CD44 de ratón, BD, n° de cat.: 559250
PE, anticuerpo de rata anti-Gr-1 de ratón (Ly-6G y Ly-6C), BD, n° de cat.: 553128
anticuerpo de rata anti-Foxp3 de ratón-Alexa Fluor® 647, BD, n° de cat.: 560401
PerCP-Cy5.5, anticuerpo de rata anti-CD19 de ratón, BD, n° de cat.: 551001
PE, anticuerpo de rata anti-CD25 de ratón, BD, n° de cat.: 553075
tampón de lisis ACK, Invitrogen, n° de cat.: A10492-01
medio RPMI 1640, Invitrogen Gibco, n° de cat.: 22400105
solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco, Thermo. n° de cat.: SH30028.01B.
Suero de feto bovino, Invitrogen Gibco, n° de cat.: 10099141
Equipo
analizador de viabilidad celular Vi-CELL, Beckman Coulter, n° de cat.: 731050
citómetro de flujo FACS Calibur, BD, n° de cat.: 342975
Tamiz celular (70 |jm), BD, n° de cat.: 352350
Tubos BD Falcon (12x75 mm, 5 ml), BD, n° de cat.: 352054
Métodos
Se recolectó sangre periférica mediante punción cardiaca. Tras separar los glóbulos rojos con tampón de lisis seguido de dos rondas de lavado mediante la utilización de 1x PBS, se obtuvieron células mononucleares (monocitos, macrófagos, células dendríticas y linfocitos) y granulocitos. Se obtuvo una suspensión celular de bazo y ganglios linfáticos tras el filtrado por un tamiz celular de 70 jm . Se analizó la viabilidad y número de células con el analizador de viabilidad celular Vi-CELl seguido de la tinción de la superficie celular. Las células se centrifugaron y resuspendieron en tampón de tinción (NaN3 al 0,08%/PBS FBS al 1%) que contenía anticuerpos apropiados con conjugado fluorescente. Tras 30 min de incubación a 4°C en la oscuridad, las células se lavaron dos veces con NaN3 al 0,08%/PBS (200 j l por muestra) y se resuspendieron con 400 j l de NaN3 al 0,08%/PBS en tubos BD Falcon (12x75 mm, 5 ml) seguido de análisis de FACS.
Análisis de los datos
Los datos de FACS se analizaron mediante el software Flowjo.
Sumario del estudio
Fecha de inicio y fecha de finalización del estudio
Con el fin de investigar el efecto terapéutico y profiláctico de RAAS 105 sobre el sistema inmunitario de ratones infectados por VHB, el estudio se dividió en dos partes.
Objetivo del estudio
El objetivo del presente estudio era investigar el efecto de RAAS 105 sobre la composición celular en tejidos linfoides y sangre periférica en ratones infectados por VHB tratados con RAAS 105.
Resultados del estudio
Efecto del tratamiento terapéutico con RAAS 105
Información sobre los ratones
Se transfirió un total de 10 ratones BALB/c hembra que incluían 2 ratones no expuestos de la misma edad, procedentes del grupo de enfermedades infecciosas (ID, por sus siglas en inglés) de Wuxi Apptec. En la Tabla 1 se muestra la información sobre los grupos y regímenes.
Tabla 1. Grupo experimental y régimen de dosis de la 1a parte del estudio.
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Poblaciones celulares en sangre periférica
Tras extraer los glóbulos rojos, se analizaron mediante análisis FACS los linajes de células T, células B, DC, granulocitos y monocitos/macrófagos en sangre periférica.
Se caracterizó el total de células T y células B a partir de CD3 y CD19, respectivamente. La infección por VHB no modificó los porcentajes de células T CD3+ en comparación con los ratones no expuestos. El tratamiento terapéutico de RAAS 105 redujo los porcentajes tanto de células T CD3+ como de células B CD19+ significativamente (figura 1). Los perfiles de FACs representativos de cada grupo se ilustran en la figura 2.
Figura 1. Porcentajes de linfocitos T y B en sangre periférica. Se seleccionaron los linfocitos totales. Tras el tratamiento terapéutico de RAAS 105, los porcentajes de células T/B se redujeron significativamente en la sangre periférica. (en ensayo)
Figura 2. Porcentaje de células T y B en sangre periférica. Se seleccionaron los linfocitos totales.
Se llevó a cabo el análisis adicional de los porcentajes de linajes de células CD4+ y CD8+ (no CD4+) seleccionando sobre las células T CD3+ totales. Los resultados mostraron que no había diferencias en los porcentajes de células T CD4+ y CD8+ en todos los grupos (figura 3). Los perfiles de FACS representativos de cada grupo se ilustran en la figura 4.
Figura 3. Porcentajes de células T CD4 y CD8 en sangre periférica. Se seleccionaron las células T CD3 totales y se analizaron adicionalmente para los porcentajes de CD4/CD8.
Figura 4. Porcentajes de células T CD4 y CD8 en sangre periférica. Se seleccionaron las células T CD3 totales. Se investigaron los porcentajes de células dendríticas (DC) CD11c+ totales y de granulocitos Gr-1+ en sangre periférica. La infección por VHB redujo los porcentajes de CD CD11c+, un fenómeno que también se observó en pacientes humanos, mientras que los porcentajes de granulocitos Gr-1+ no resultaron afectados. El tratamiento terapéutico de RAAS 105 no mostró ningún efecto sobre las DC CD11c+, aunque incrementó los porcentajes de granulocitos Gr-1+ significativamente (figura 5). Los perfiles de FACS representativos de cada grupo se ilustran en la figura 6.
Figura 5. Porcentajes de células dendríticas y granulocitos en sangre periférica. Se seleccionaron las células vivas totales. Tras el tratamiento terapéutico, los porcentajes de granulocitos se incrementaron en sangre periférica (mediante prueba T).
Figura 6. Porcentajes de granulocitos/células dendríticas en sangre periférica. Se seleccionaron las células vivas totales.
Se examinaron los porcentajes de monocitos mediante la utilización del marcador de superficie CD11b. Se incrementaron significativamente al igual que los granulocitos Gr1+, en comparación con el grupo de vehículo (figura 7). Los perfiles de FACS representativos de cada grupo se ilustran en la figura 8.
Figura 7. Porcentajes de monocitos en sangre periférica. Se seleccionaron las células vivas totales. Tras el tratamiento, los porcentajes de monocitos en sangre periférica se incrementaron significativamente (prueba t).
Figura 8. Porcentajes de monocitos en sangre periférica. Se seleccionaron las células vivas totales.
Poblaciones celulares en el bazo.
Los linajes celulares en el bazo, entre ellos los linajes de células T (células T CD4+/CD8+, células T no expuestas, células T de memoria y células T reguladoras), células B, mDC, pDC, granulocitos y macrófagos, se caracterizaron mediante marcadores de superficie celular e intracelulares.
Se investigaron los porcentajes de células T y células B totales en el bazo. El tratamiento terapéutico de RAAS 105 redujo los porcentajes tanto de células T CD3+ como de células B CD19+ significativamente (figura 9). Los perfiles de FACS representativos de cada grupo se ilustran en la figura 10.
Figura 9. Porcentajes de linfocitos T y B en el bazo. Se seleccionaron los linfocitos totales. Tras el tratamiento terapéutico de RAAS 105, los porcentajes de células T y de células B se redujeron significativamente en el bazo. Figura 10. Porcentaje de células T y células B en el bazo. Se seleccionaron los linfocitos totales.
Se llevó a cabo el análisis adicional de los porcentajes de linajes de células CD4+ (no CD8+) y CD8+ seleccionando sobre las células T CD3+ totales. No se observaron diferencias en los porcentajes de células T CD4+ y CD8+ en todos los grupos (figura 11). Los perfiles de FACS representativos de cada grupo se ilustran en la figura 12.
Figura 11. Porcentajes de células T CD4 y CD8 en el bazo. Se seleccionaron las células T CD3 totales y se analizaron adicionalmente para los porcentajes de CD4/CD8.
Figura 12. Porcentajes de células T CD4 y CD8 en el bazo. Se seleccionaron las células T CD3 totales.
Se caracterizaron tres linajes de células T: células T no expuestas (CD44lowD62Lhigh), células T de memoria central (Tc m S, CD44highCD62Lhigh) y células T de memoria efectora (Te m S, CD44highCD62u°w), con los marcadores de superficie CD44 y CD62L. Los porcentajes de dichos linajes de células T en células T CD4+ o CD8+ se analizaron, respectivamente. Tanto en las células T CD4+ como CD8+, se redujeron los porcentajes de células T no expuestas y de Tc m S y se incrementaron las Te m S después del tratamiento terapéutico de RAAS 105, sugiriendo que el compuesto presenta el efecto de estimular la transformación de las células T de células T no expuestas a células T de memoria en el bazo (figuras 13 y 15). Los perfiles de FACS representativos de cada grupo se ilustraron en las figuras 14 y 16. Figura 13. Porcentajes de subgrupos de células T en el bazo. Se seleccionaron las células T CD4 totales y se determinaron los subgrupos de células T.
Figura 14. Porcentajes de subgrupos de células T CD4 en el bazo. Se seleccionaron las células T CD4 totales y se determinaron los subgrupos de células T.
Figura 15. Porcentajes de subgrupos de células T en el bazo. Se seleccionaron las células T CD8 totales y se determinaron los subgrupos de células T.
Figura 16. Porcentajes de subgrupos de células T CD8 en el bazo. Se seleccionaron las células T CD8 totales y se determinaron los subgrupos de células T.
Se analizaron las células T reguladoras (Treg) mediante tinción de superficie celular de anticuerpos anti-CD4 y anti-CD25 seguido de la tinción intracelular del anticuerpo anti-Foxp3. Se incrementaron los porcentajes de Treg en el bazo en comparación con el grupo de vehículo (figura 17). Los perfiles de FACS representativos de cada grupo se ilustran en la figura 18.
Figura 17. Porcentajes de células T reguladoras Foxp3 en el bazo. Se analizaron las células T reguladoras Foxp3 mediante tinción intracelular. Tras el tratamiento, se incrementó el porcentaje de células T reguladoras.
Figura 18. Porcentajes de células T reguladoras en el bazo. Se seleccionaron las células T CD4 totales.
Se analizaron las células dendríticas, entre ellas las células dendríticas mieloides (mDC, B220-CD11c+) y las células dendríticas plasmacitoides (pDC, B220+CD11c+) en el bazo. No se observaron diferencias significativas de mDC y pDC en todos los grupos (figura 19). Los perfiles de FACS representativos de cada grupo se ilustran en la figura 20. Figura 19. Porcentajes de pDC y mDC en el bazo. Se seleccionaron las células vivas totales. No se observaron diferencias significativas tras el tratamiento de compuesto (mediante prueba t).
Figura 20. Porcentajes de pDC y mDC en el bazo. Se seleccionaron las células vivas totales.
Se analizaron los macrófagos CD11b+ y los granulocitos Gr-1+ en el bazo. No se observaron alteraciones significativas en todos los grupos en porcentajes de dichos linajes celulares en el bazo, tal como se muestra en la figura 21. Los perfiles de FACS representativos de cada grupo se ilustran en la figura 22.
Figura 21. Porcentajes de macrófagos y granulocitos en el bazo. Se seleccionaron las células vivas totales. No se observaron diferencias significativas tras el tratamiento de compuesto (mediante prueba t).
Figura 22. Porcentajes de macrófagos/granulocitos en el bazo. Se seleccionaron las células vivas totales.
Poblaciones celulares en ganglios linfáticos secretores
Los linajes celulares en los ganglios linfáticos secretores, entre ellos los linajes de células T (células T CD4+/CD8+, células T no expuestas, células T de memoria y células T reguladoras), DC, granulocitos y macrófagos, se caracterizaron mediante marcadores de superficie celular e intracelulares.
Se analizaron los porcentajes de células T totales en los ganglios linfáticos. La infección por el VHB no afectó a los porcentajes de células T CD3+, aunque el tratamiento terapéutico de RAAS 105 los redujo significativamente en comparación con el grupo de vehículo (figura 23). Los perfiles de FACS representativos de cada grupo se ilustran en la figura 24.
Figura 23. Porcentajes de células T en ganglios linfáticos. Se seleccionaron los linfocitos totales. Tras el tratamiento, los porcentajes de células T en los ganglios linfáticos se redujeron significativamente (prueba t).
Figura 24. Porcentajes de células T CD3 en ganglios linfáticos. Se seleccionaron los linfocitos totales.
Se llevó a cabo el análisis adicional de los porcentajes de linajes de células CD4+ y CD8+ seleccionando sobre las células T CD3+ totales. Los porcentajes de células T CD4+ tendían a reducirse, mientras que las células T CD8+ tendían a incrementarse, sugiriendo que el tratamiento terapéutico de RAAS 105 podría presentar un efecto sobre la proporción de células T CD4+/CD8+ en los ganglios linfáticos (figura 25). Los perfiles de FACS representativos de cada grupo se ilustran en la figura 26.
Figura 25. Porcentajes de células T CD4 y CD8 en los ganglios linfáticos. Se seleccionaron las células T CD3 totales y se analizaron adicionalmente para los porcentajes de CD4/CD8. Después del tratamiento terapéutico, se redujo el porcentaje de células T CD4 (según la prueba t).
Figura 26. Porcentajes de células T CD4 y CD8 en los ganglios linfáticos. Se seleccionaron las células T CD3 totales y se analizaron adicionalmente para los porcentajes de CD4/CD8.
Se caracterizaron tres linajes de células T: células T no expuestas, TcmS y TemS mediante los marcadores de superficie CD44 y CD62L. Los porcentajes de dichos linajes de células T en células T CD4+ o CD8+ se analizaron, respectivamente. Los resultados en los ganglios linfáticos eran comparables a los observados en el bazo. Tanto en las células T CD4+ como CD8+, se redujeron los porcentajes de células T no expuestas y de TcmS y se incrementaron las TemS después del tratamiento terapéutico de RAAS 105, sugiriendo que el compuesto también presenta el efecto de estimular la transformación de las células T de células T no expuestas a células T de memoria en los ganglios linfáticos (figuras 27 y 29). Los perfiles de FACS representativos de cada grupo se ilustraron en las figuras 28 y 30.
Figura 27. Porcentajes de subgrupos de células T CD4 en los ganglios linfáticos. Se seleccionaron las células T CD4 totales y se determinaron los subgrupos de células T. No se observaron diferencias significativas en todos los grupos comparados con el grupo de vehículo.
Figura 28. Porcentajes de subgrupos de células T CD4 en los ganglios linfáticos. Se seleccionaron las células T CD4 totales y se determinaron los subgrupos de células T.
Figura 29. Porcentajes de subgrupos de células T CD8 en los ganglios linfáticos. Se seleccionaron las células T CD8 totales y se determinaron los subgrupos de células T.
Figura 30. Porcentajes de subgrupos de células T CD8 en los ganglios linfáticos. Se seleccionaron las células T CD8 totales y se determinaron los subgrupos de células T.
Se analizaron las células T reguladoras (Treg). Los porcentajes de Treg en los ganglios linfáticos se incrementaron ligeramente, aunque las diferencias no eran significativas (figura 31). Los perfiles de FACS representativos de cada grupo se ilustran en la figura 32.
Figura 31. Porcentajes de células T reguladoras Foxp3 en ganglios linfáticos. No se observaron alteraciones significativas tras el tratamiento de compuesto.
Figura 32. Porcentajes de células T reguladoras en ganglios linfáticos. Se seleccionaron las células T CD4 totales. Se muestra un perfil representativo de cada grupo.
Se analizaron las células dendríticas totales en los ganglios linfáticos. El tratamiento terapéutico de RAAS 105 podría revertir la reducción de las DC inducidas por la infección por VHB (figura 33). Los perfiles de FACS representativos de cada grupo se ilustran en la figura 34.
Figura 33. Porcentajes de DC en ganglios linfáticos. Se seleccionaron las células vivas totales. Tras el tratamiento, los porcentajes de DC se incrementaron significativamente (según prueba t).
Figura 34. Porcentajes de DC en ganglios linfáticos. Se seleccionaron las células vivas totales.
Se analizaron los macrófagos CD11b+ y los granulocitos Gr-1 en los ganglios linfáticos. Tanto los porcentajes de macrófagos CD11b+ como de granulocitos Gr-1+ se incrementaron significativamente (figura 35). Los perfiles de FACS representativos de cada grupo se ilustran en la figura 36.
Figura 35. Porcentajes de macrófagos y granulocitos en los ganglios linfáticos. Se seleccionaron las células vivas totales. Los porcentajes de macrófagos y granulocitos se incrementaron significativamente en los ganglios linfáticos. (según prueba t)
Figura 36. Porcentajes de macrófagos/granulocitos en los ganglios linfáticos. Se seleccionaron las células vivas totales.
Efecto del tratamiento profiláctico con RAAS 105
Información sobre los ratones
Se transfirió un total de 14 ratones BALB/c hembra que incluían 2 ratones no expuestos de la misma edad, procedentes del grupo de enfermedades infecciosas (ID, por sus siglas en inglés) de Wuxi Apptec. En la Tabla 2 se muestra la información sobre los grupos y regímenes.
Tabla 2. Grupo experimental y régimen de dosis de la 2a parte del estudio.
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Poblaciones celulares en sangre periférica
Tras extraer los glóbulos rojos, se analizaron mediante análisis FACS los linajes de células T, células B, DC, granulocitos y monocitos/macrófagos en sangre periférica.
Se caracterizaron las células T y células B totales. Al contrario que el tratamiento terapéutico, el tratamiento profiláctico de RAAS 105 no presentó ningún efecto sobre los porcentajes de células T CD3+, aunque redujo el porcentaje de células B CD19+, si bien no de manera estadísticamente significativa (figura 37). Los perfiles de FACS representativos de cada grupo se ilustran en la figura 38.
Figura 37. Porcentajes de linfocitos T y B en sangre periférica. Se seleccionaron los linfocitos totales.
Figura 38. Porcentaje de células T y B en sangre periférica. Se seleccionaron los linfocitos totales.
Se llevó a cabo el análisis adicional de los porcentajes de linajes de células CD4+ y CD8+ (no CD4+) seleccionando sobre las células T CD3+ totales. Al contrario que el tratamiento terapéutico, el tratamiento profiláctico redujo los porcentajes de células T CD4+ e incrementó el porcentaje de células T CD8+, sugiriendo un efecto potencial de RAAS 105 de reducción de la proporción de células T CD4+/CD8+ en sangre periférica (figura 39). Los perfiles de FACS representativos de cada grupo se ilustran en la figura 40.
Figura 39. Porcentajes de células T CD4 y CD8 en sangre periférica. Se seleccionaron las células T CD3 totales y se analizaron adicionalmente para los porcentajes de CD4/CD8. Tras el tratamiento profiláctico con RAAS 105, se redujeron los porcentajes de células T CD4, mientras que se incrementaron los de células T CD8 (según prueba t). Figura 40. Porcentajes de células T CD4 y CD8 en sangre periférica. Se seleccionaron las células T CD3 totales. Los resultados de las células dendríticas (DC) CD11c+ totales y granulocitos Gr-1+ en sangre periférica también eran diferente de los observados en el tratamiento terapéutico. El tratamiento profiláctico de RAAS 105 revertió la reducción de las DC inducidas por la infección por VHB, aunque no presentó ningún efecto significativo sobre los granulocitos en sangre periférica (figura 41). Los perfiles de FACS representativos de cada grupo se ilustran en la figura 42.
Figura 41. Porcentajes de células dendríticas y granulocitos en sangre periférica. Se seleccionaron las células vivas totales. Tras el tratamiento profiláctico, se incrementaron los porcentajes de células dendríticas en sangre periférica. Figura 42. Porcentajes de granulocitos/células dendríticas en sangre periférica. Se seleccionaron las células vivas totales.
Se examinaron los porcentajes de monocitos. No se observaron diferencias significativas entre todos los grupos (figura 43). Los perfiles de FACS representativos de cada grupo se ilustran en la figura 44.
Figura 43. Porcentajes de monocitos en sangre periférica. Se seleccionaron las células vivas totales.
Figura 44. Porcentajes de monocitos en sangre periférica. Se seleccionaron las células vivas totales.
Poblaciones celulares en el bazo.
Los linajes celulares en el bazo, entre ellos los linajes de células T (células T CD4+/CD8+, células T no expuestas, células T de memoria y células T reguladoras), células B, mDC, pDC, granulocitos y macrófagos, se caracterizaron mediante marcadores de superficie celular e intracelulares.
Se investigaron los porcentajes de células T y células B totales en el bazo. Al contrario que el tratamiento terapéutico, el tratamiento profiláctico no mostró efectos sobre los porcentajes de células T CD3+ y de células B CD19+ (figura 45). Los perfiles de FACS representativos de cada grupo se ilustran en la figura 46.
Figura 45. Porcentajes de linfocitos T y B en el bazo. Se seleccionaron los linfocitos totales.
Figura 46. Porcentajes de linfocitos T y B en el bazo. Se seleccionaron los linfocitos totales.
Se llevó a cabo el análisis adicional de los porcentajes de linajes de células CD4+ (no CD8+) y CD8+ seleccionando sobre las células T CD3+ totales. Los porcentajes de células T CD4+ se redujeron ligeramente y las células T CD8+ se incrementaron ligeramente en el bazo (figura 47). Los perfiles de FACS representativos de cada grupo se ilustran en la figura 48.
Figura 47. Porcentajes de células T CD4 y CD8 en el bazo. Se seleccionaron las células T CD3 totales y se analizaron adicionalmente para los porcentajes de CD4/CD8. Tras el tratamiento profiláctico con RAAS 105, se redujeron LIGERAMENTE los porcentajes de células T CD4, mientras que se incrementaron ligeramente los de células T CD8 (según prueba t).
Figura 48. Porcentajes de células T CD4 y CD8 en el bazo. Se seleccionaron las células T CD3 totales y se analizaron adicionalmente para los porcentajes de CD4/CD8.
Se investigaron las células T no expuestas, células T de memoria central y células T de memoria efectora. Se analizaron los porcentajes de dichos linajes de células T en células T CD4+ o c D8+ en el bazo, respectivamente. Tanto en células T CD4+ como en T CD8+, los porcentajes de células T no expuestas se redujeron y las Te m S se incrementaron significativamente después del tratamiento profiláctico de RAAS 105 (figuras 49 y 51). Los perfiles de FACS representativos de cada grupo se ilustraron en las figuras 50 y 52.
Figura 49. Porcentajes de subgrupos de células T en el bazo Se seleccionaron las células T CD4 totales y se determinaron los subgrupos de células T.
Figura 50. Porcentajes de subgrupos de células T en el bazo Se seleccionaron las células T CD4 totales y se determinaron los subgrupos de células T.
Figura 51. Porcentajes de subgrupos de células T en el bazo Se seleccionaron las células T CD8 totales y se determinaron los subgrupos de células T.
Figura 52. Porcentajes de subgrupos de células T en el bazo Se seleccionaron las células T CD8 totales y se determinaron los subgrupos de células T.
Los resultados de células T reguladoras (Treg) eran comparables a los del tratamiento terapéutico. Los porcentajes de Treg en el bazo se incrementaron en comparación con el grupo de vehículo con el tratamiento profiláctico de RAAs 105 (figura 53). Los perfiles de FACS representativos de cada grupo se ilustran en la figura 54.
Figura 53. Porcentajes de células T reguladoras Foxp3 en el bazo. Se analizaron las células T reguladoras Foxp3 mediante tinción intracelular.
Figura 54. Porcentajes de células T reguladoras en el bazo. Se seleccionaron las células T CD4 totales.
Se analizaron las células dendríticas, incluyendo mDC y pDC, en el bazo. No se observaron diferencias significativas de mDC y pDC en todos los grupos después del tratamiento profiláctico (figura 55). Los perfiles de FACS representativos de cada grupo se ilustran en la figura 56.
Figura 55. Porcentajes de pDC y mDC en el bazo. Se seleccionaron las células vivas totales. No se observaron diferencias significativas tras el tratamiento de compuesto (según prueba t).
Figura 56. Porcentajes de mDC y pDC en el bazo. Se seleccionaron las células vivas totales.
Se analizaron los macrófagos CD11b+ y los granulocitos Gr-1 en el bazo. Se incrementaron los porcentajes de macrófagos y granulocitos, aunque no se observaron diferencias estadísticas, tal como se muestra en la figura 57. Los perfiles de FACS representativos de cada grupo se ilustran en la figura 58.
Figura 57. Porcentajes de macrófagos y granulocitos en el bazo. Se seleccionaron las células vivas totales. No se observaron diferencias significativas tras el tratamiento de compuesto (mediante prueba t).
Figura 58. Porcentajes de macrófagos/granulocitos en el bazo. Se seleccionaron las células vivas totales.
Poblaciones celulares en ganglios linfáticos secretores
Los linajes celulares en los ganglios linfáticos secretores, entre ellos los linajes de células T (células T CD4+/CD8+, células T no expuestas, células T de memoria y células T reguladoras), DC, granulocitos y macrófagos, se caracterizaron mediante marcadores de superficie celular e intracelulares.
Se analizaron los porcentajes de células T totales en los ganglios linfáticos. De manera similar al tratamiento terapéutico, la infección por el VHB no afectó a los porcentajes de células T CD3+, aunque el tratamiento profiláctico de RAAS 105 los redujo significativamente en comparación con el grupo de vehículo (figura 59). Los perfiles de FACS representativos de cada grupo se ilustran en la figura 60.
Figura 59. Porcentajes de células T en ganglios linfáticos. Se seleccionaron los linfocitos totales. Tras el tratamiento, los porcentajes de células T en los ganglios linfáticos se redujeron significativamente. (según prueba t)
Figura 60. Porcentajes de células T CD3 en ganglios linfáticos. Se seleccionaron los linfocitos totales.
Se llevó a cabo el análisis adicional de los porcentajes de linajes de células T CD4+ y CD8+ seleccionando sobre las células T CD3+ totales. Los porcentajes de células T CD4+ tendían a reducirse, mientras que las células T CD8+ tendían a incrementarse tras el tratamiento profiláctico, tal como se observó en el tratamiento terapéutico (figura 61). Los perfiles de FACS representativos de cada grupo se ilustran en la figura 62.
Figura 61. Porcentajes de células T CD4 y CD8 en los ganglios linfáticos. Se seleccionaron las células T CD3 totales y se analizaron adicionalmente para los porcentajes de CD4/CD8. Después del tratamiento profiláctico, se redujo el porcentaje de células T CD4 (según la prueba t).
Figura 62. Porcentajes de células T CD4 y CD8 en los ganglios linfáticos. Se seleccionaron las células T CD3 totales y se analizaron adicionalmente para los porcentajes de CD4/CD8.
Los resultados de células T no expuestas, células T de memoria central y células T de memoria efectora fueron totalmente diferentes a los del tratamiento terapéutico. El tratamiento profiláctico no mostró efectos significativos sobre las células T no expuestas y las Tc m S, aunque se incrementaron los porcentajes de Te m S (figuras 63 y 65). Los perfiles de FACS representativos de cada grupo se ilustraron en las figuras 64 y 66.
Figura 63. Porcentajes de subgrupos de células T en los ganglios linfáticos. Se seleccionaron las células T CD4 totales y se determinaron los subgrupos de células T. No se observaron diferencias significativas, excepto para las células T de memoria efectora en comparación con el grupo de vehículo.
Figura 64. Porcentajes de subgrupos de células T en los ganglios linfáticos. Se seleccionaron las células T CD4 totales y se determinaron los subgrupos de células T.
Figura 65. Porcentajes de subgrupos de células T en los ganglios linfáticos. Se seleccionaron las células T CD8 totales y se determinaron los subgrupos de células T. No se observaron diferencias significativas en todos los grupos comparados con el grupo de vehículo.

Claims (16)

  1. REIVINDICACIONES
    i. Producto plasmático de inmunoglobulina intravenosa (IVIG) purificada aislada que comprende un complejo de proteínas purificado aislado que contiene proteínas definidas por las secuencias de aminoácidos SEC ID n° 33 a n° 37.
  2. 2. Complejo de proteínas purificado aislado según la reivindicación 1, que comprende además proteínas definidas por las secuencias de aminoácidos SEC ID n° 22 a n° 31.
  3. 3. Complejo de proteínas purificado aislado según la reivindicación 1, que comprende además una proteína definida por la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 51.
  4. 4. Producto plasmático de IVIG purificado aislado que comprende un complejo de proteínas purificado aislado que contiene:
    una primera proteína sustancialmente pura que presenta una homología de por lo menos 90% respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 22,
    una segunda proteína sustancialmente pura que presenta una homología de por lo menos 90% respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 23,
    una tercera proteína sustancialmente pura que presenta una homología de por lo menos 90% respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 24,
    una cuarta proteína sustancialmente pura que presenta una homología de por lo menos 90% respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 25,
    una quinta proteína sustancialmente pura que presenta una homología de por lo menos 90% respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 26,
    una sexta proteína sustancialmente pura que presenta una homología de por lo menos 90% respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 27,
    una séptima proteína sustancialmente pura que presenta una homología de por lo menos 90% respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 28,
    una octava proteína sustancialmente pura que presenta una homología de por lo menos 90% respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 29,
    una novena proteína sustancialmente pura que presenta una homología de por lo menos 90% respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 30,
    una décima proteína sustancialmente pura que presenta una homología de por lo menos 90% respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 31,
    una undécima proteína sustancialmente pura que presenta una homología de por lo menos 90% respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 32,
    una duodécima proteína sustancialmente pura que presenta una homología de por lo menos 90% respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 33,
    una decimotercera proteína sustancialmente pura que presenta una homología de por lo menos 90% respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 34,
    una decimocuarta proteína sustancialmente pura que presenta una homología de por lo menos 90% respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 35,
    una decimoquinta proteína sustancialmente pura que presenta una homología de por lo menos 90% respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 36 y
    una decimosexta proteína sustancialmente pura que presenta una homología de por lo menos 90% respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 37.
  5. 5. Producto plasmático de IVIG purificado aislado que comprende un complejo de proteínas purificado aislado que contiene:
    una primera proteína sustancialmente pura que presenta una homología de por lo menos 90% respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 33,
    una segunda proteína sustancialmente pura que presenta una homología de por lo menos 90% respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 34,
    una tercera proteína sustancialmente pura que presenta una homología de por lo menos 90% respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 35,
    una cuarta proteína sustancialmente pura que presenta una homología de por lo menos 90% respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 36 y
    una quinta proteína sustancialmente pura que presenta una homología de por lo menos 90% respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 37.
  6. 6. Producto plasmático de IVIG purificado aislado que comprende un complejo de proteínas purificado aislado que contiene:
    una primera proteína sustancialmente pura que presenta una homología de por lo menos 80% respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 22, en el que dicha proteína sustancialmente pura presenta la misma actividad que la proteína definida por la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 22,
    una segunda proteína sustancialmente pura que presenta una homología de por lo menos 80% respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 23, en el que dicha proteína sustancialmente pura presenta la misma actividad que la proteína definida por la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 23,
    una tercera proteína sustancialmente pura que presenta una homología de por lo menos 80% respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 24, en el que dicha proteína sustancialmente pura presenta la misma actividad que la proteína definida por la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 24,
    una cuarta proteína sustancialmente pura que presenta una homología de por lo menos 80% respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 25, en el que dicha proteína sustancialmente pura presenta la misma actividad que la proteína definida por la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 25,
    una quinta proteína sustancialmente pura que presenta una homología de por lo menos 80% respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 26, en el que dicha proteína sustancialmente pura presenta la misma actividad que la proteína definida por la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 26,
    una sexta proteína sustancialmente pura que presenta una homología de por lo menos 80% respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 27, en el que dicha proteína sustancialmente pura presenta la misma actividad que la proteína definida por la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 27,
    una séptima proteína sustancialmente pura que presenta una homología de por lo menos 80% respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 28, en el que dicha proteína sustancialmente pura presenta la misma actividad que la proteína definida por la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 28,
    una octava proteína sustancialmente pura que presenta una homología de por lo menos 80% respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 29, en el que dicha proteína sustancialmente pura presenta la misma actividad que la proteína definida por la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 29,
    una novena proteína sustancialmente pura que presenta una homología de por lo menos 80% respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 30, en el que dicha proteína sustancialmente pura presenta la misma actividad que la proteína definida por la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 30,
    una décima proteína sustancialmente pura que presenta una homología de por lo menos 80% respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 31, en el que dicha proteína sustancialmente pura presenta la misma actividad que la proteína definida por la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 31,
    una undécima proteína sustancialmente pura que presenta una homología de por lo menos 80% respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 32, en el que dicha proteína sustancialmente pura presenta la misma actividad que la proteína definida por la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 32,
    una duodécima proteína sustancialmente pura que presenta una homología de por lo menos 80% respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 33, en el que dicha proteína sustancialmente pura presenta la misma actividad que la proteína definida por la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 33,
    una decimotercera proteína sustancialmente pura que presenta una homología de por lo menos 80% respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 34, en el que dicha proteína sustancialmente pura presenta la misma actividad que la proteína definida por la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 34, una decimocuarta proteína sustancialmente pura que presenta una homología de por lo menos 80% respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 35, en el que dicha proteína sustancialmente pura presenta la misma actividad que la proteína definida por la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 35, una decimoquinta proteína sustancialmente pura que presenta una homología de por lo menos 80% respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 36, en el que dicha proteína sustancialmente pura presenta la misma actividad que la proteína definida por la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 36 y una decimosexta proteína sustancialmente pura que presenta una homología de por lo menos 80% respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 37, en el que dicha proteína sustancialmente pura presenta la misma actividad que la proteína definida por la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 37.
  7. Producto plasmático de IVIG purificado aislado que comprende un complejo de proteínas purificado aislado que contiene:
    una primera proteína sustancialmente pura que presenta una homología de por lo menos 80% respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 33, en el que dicha proteína sustancialmente pura presenta la misma actividad que la proteína definida por la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 33,
    una segunda proteína sustancialmente pura que presenta una homología de por lo menos 80% respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 34, en el que dicha proteína sustancialmente pura presenta la misma actividad que la proteína definida por la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 34,
    una tercera proteína sustancialmente pura que presenta una homología de por lo menos 80% respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 35, en el que dicha proteína sustancialmente pura presenta la misma actividad que la proteína definida por la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 35,
    una cuarta proteína sustancialmente pura que presenta una homología de por lo menos 80% respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 36, en el que dicha proteína sustancialmente pura presenta la misma actividad que la proteína definida por la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 36 y
    una quinta proteína sustancialmente pura que presenta una homología de por lo menos 80% respecto a la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 37, en el que dicha proteína sustancialmente pura presenta la misma actividad que la proteína definida por la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 37.
  8. 8. Producto plasmático de IVIG purificado aislado según la reivindicación 1, en el que las proteínas definidas por las secuencias de aminoácidos SEC ID n° 33 a n° 37 presentan una concentración de por lo menos 30%.
  9. 9. Producto plasmático de IVIG purificado aislado según la reivindicación 2, en el que las proteínas definidas por las secuencias de aminoácidos SEC ID n° 22 a n° 37 presentan una concentración de por lo menos 30%.
  10. 10. Producto plasmático de IVIG purificado aislado según la reivindicación 3, en el que las proteínas definidas por las secuencias de aminoácidos SEC ID n° 22 a n° 37 y n° 51 presentan una concentración de por lo menos 30%.
  11. 11. Producto plasmático de IVIG purificado aislado para la utilización en el tratamiento de la hepatitis B mediante la administración de una dosis eficaz del plasma IVIG purificado aislado en un paciente, en el que el producto plasmático de IVIG purificado aislado comprende:
    una primera proteína definida por la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 33,
    una segunda proteína definida por la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 34,
    una tercera proteína definida por la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 35,
    una cuarta proteína definida por la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 36, y
    una quinta proteína definida por la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 37.
  12. 12. Producto plasmático de IVIG purificado aislado para la utilización según la reivindicación 11, en el que el producto plasmático de IVIG purificado aislado comprende, además:
    una sexta proteína definida por la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 22,
    una séptima proteína definida por la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 23,
    una octava proteína definida por la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 24,
    una novena proteína definida por la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 25,
    una décima proteína definida por la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 26,
    una undécima proteína definida por la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 27,
    una duodécima proteína definida por la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 28,
    una decimotercera proteína definida por la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 29,
    una decimocuarta proteína definida por la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 30,
    una decimoquinta proteína definida por la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 31 y
    una decimosexta proteína definida por la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 32.
  13. 13. Producto plasmático de IVIG purificado aislado para la utilización según la reivindicación 12, en el que el producto plasmático de IVIG purificado aislado comprende además una decimosexta proteína definida por la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 51.
  14. 14. Producto plasmático de IVIG purificado aislado para la utilización según la reivindicación 13, en el que CD62L está regulado a un intervalo eficaz sobre las células T CD4+ y/o las células T CD8+ en sangre periférica y/o en el bazo de un paciente de hepatitis B para el tratamiento del VHB.
  15. 15. Producto plasmático de IVIG purificado aislado para la utilización según la reivindicación 13, en el que los niveles seleccionados de uno o más de entre células T CD4+, células T CD28+, células T Foxp3+, células B, granulocitos o macrófagos, están regulados a un intervalo eficaz en sangre periférica y/o en el bazo de un paciente de hepatitis B para el tratamiento del VHB.
  16. 16. Método de preparación de un producto plasmático de IVIG purificado aislado que contiene proteínas definidas por las secuencias de aminoácidos SEC ID n° 33 a n° 37, que comprende:
    a) obtener una pasta de fracción II+III a partir de plasma sanguíneo humano,
    b) suspender y diluir una pasta de fracción II+III en una proporción 1:17,
    c) ajustar el pH de la pasta de fracción II+III diluida a un pH de 5,2 para producir una pasta de fracción II+III ajustada,
    d) añadir etanol a la pasta de fracción II+III ajustada para producir un producto de fracción II+III con etanol al 17%,
    e) someter a filtración de prensa el producto de fracción II+III con etanol al 17% y recolectar un filtrado que comprende fracción III,
    f) concentrar el filtrado mediante ultrafiltración para formar un ultrafiltrado 100k,
    g) ajustar el pH del ultrafiltrado 100k a un pH de 4,0,
    h) filtrar el ultrafiltrado de pH ajustado mediante la utilización de un filtro de 45 |jm y recolectar un producto filtrado, y
    i) nanofiltrar el producto filtrado con un filtro de 50 nm para obtener un producto final.
    Método de preparación de un producto plasmático de IVIG purificado aislado que contiene proteínas definidas por las secuencias de aminoácidos SEC ID n° 22 a n° 37, que comprende:
    a) obtener una pasta de fracción II+III a partir de inmunoglobulinas de hepatitis B humana que presenta niveles elevados de antígeno de superficie de hepatitis B,
    b) suspender y diluir una pasta de fracción II+III en una proporción 1:17,
    c) ajustar el pH de la pasta de fracción II+III diluida a un pH de 5,2 para producir una pasta de fracción II+III ajustada,
    d) añadir etanol a la pasta de fracción II+III ajustada para producir un producto de fracción II+III con etanol al 17%,
    e) someter a filtración de prensa el producto de fracción II+III con etanol al 17% y recolectar un filtrado que comprende fracción III,
    f) concentrar el filtrado mediante ultrafiltración para formar un ultrafiltrado 100k,
    g) ajustar el pH del ultrafiltrado 100k a un pH de 4,0,
    h) filtrar el ultrafiltrado de pH ajustado mediante la utilización de un filtro de 45 jm y recolectar un producto filtrado, y
    i) nanofiltrar el producto filtrado con un filtro de 50 nm para obtener un producto final.
    Método de preparación de un producto plasmático de IVIG purificado aislado que contiene proteínas definidas por las secuencias de aminoácidos SEC ID n° 22 a n° 37 y n° 51, que comprende:
    a) preparar una masa final no estéril de inmunoglobulinas normales,
    b) preparar una masa final no estéril de inmunoglobulinas de hepatitis B,
    c) crear una mezcla de inmunoglobulinas que comprende 80% de la masa final no estéril de inmunoglobulinas normales y 20% de la masa final no estéril de inmunoglobulinas de hepatitis B, d) llevar a cabo una filtración esterilizante de la mezcla de inmunoglobulinas y recoger un producto final.
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