ES2879400T3 - ADNc de ATP7A de tamaño reducido con codones optimizados y usos para el tratamiento de trastornos del transporte de cobre - Google Patents

Abstract

Una molécula de ácido nucleico con codones optimizados aislada que codifica una proteína ATPasa de tipo P transportadora de cobre ATPasa 1 (ATP7A) de tamaño reducido que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, opcionalmente en donde la molécula de ácido nucleico con codones optimizados codifica una proteína ATP7A que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

Description

DESCRIPCIÓN

ADNc de ATP7A de tamaño reducido con codones optimizados y usos para el tratamiento de trastornos del transporte de cobre

Referencia cruzada a solicitud relacionada

Esto reivindica el beneficio de la solicitud provisional de EE. UU. núm. 62/244,594, presentada el 21 de octubre de 2015,

Campo de la divulgación

Esta divulgación se refiere a ácidos nucleicos de ATP7A optimizados con codones y su uso en el tratamiento de trastornos del transporte de cobre relacionados con ATP7A.

Antecedentes

El cobre juega un papel crítico en el metabolismo como un cofactor de enzimas metabólicas claves (como dopamina p hidroxilasa, lisil oxidasa, Cu/Zn superóxido dismutasa y citocromo c oxidasa). La ATPasa de tipo P transportadora de cobre ATPasa 1 humana (ATP7A) transporta el cobre desde los enterocitos (donde se absorbe del cobre de la dieta) a la sangre. El ATP7A también media el paso del cobre a través de la barrera sangre-líquido cefalorraquídeo (CSF) y la barrera hematoencefálica. En la enfermedad de Menkes y el síndrome del cuerno occipital (OHS), la actividad de ATP7A está reducida o ausente y la exportación de cobre de los enterocitos está alterada (Kaler, Nat. Rev. Neurol. 7:15-29, 2011). Como resultado, el cobre se acumula en las células intestinales y se suministra menos cobre a la sangre, lo que reduce el suministro de cobre a otros tejidos, en particular al cerebro. También se ha identificado recientemente una neuropatía motora distal hereditaria asociada con mutaciones de ATP7A (neuropatía motora distal relacionada con ATP7A; también conocida como atrofia muscular espinal, distal, ligada al cromosoma X 3 (SMAX3)) (Kennerson y otros, J. Hum. Genet. 86:343-352, 2009). Este trastorno de inicio en la edad adulta no se asocia con una disminución de los niveles de cobre en suero, a diferencia de la enfermedad de Menkes y OHS. Resumen

En la presente descripción se proporcionan moléculas de ácidos nucleicos de ATP7A optimizados con codones, específicamente ácidos nucleicos optimizados con codones que codifican una proteína ATP7A de tamaño reducido, y vectores y virus recombinantes que incluyen los ácidos nucleicos de ATP7A optimizados con codones. Estos ácidos nucleicos pueden usarse en métodos para el tratamiento de trastornos del transporte de cobre, tal como la enfermedad de Menkes, el síndrome del cuerno occipital o la neuropatía motora distal relacionada con ATP7A. En algunas modalidades, se divulgan en la presente descripción moléculas aisladas de ácidos nucleicos optimizados con codones que codifican una proteína ATP7A de tamaño reducido. En algunos ejemplos, las moléculas de ácidos nucleicos incluyen un ácido nucleico con al menos un 90 % de identidad de secuencia con la secuencia nucleotídica de la SEQ ID NO: 1. En ejemplos particulares, la molécula de ácido nucleico tiene la secuencia de la SEQ ID NO: 1 o codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2.

También se divulgan en la presente descripción vectores, tales como vectores de virus adenoasociados (AAV), que incluyen las moléculas de ácidos nucleicos optimizados con codones divulgadas que codifican la APT7A humana de tamaño reducido. En algunos ejemplos, los vectores comprenden además un promotor, tal como un promotor de pactina. En ejemplos adicionales, los vectores comprenden además un potenciador, tal como un potenciador de citomegalovirus. También se divulgan en la presente descripción virus recombinantes (como AAV recombinante (rAAV)) que incluyen las moléculas de ácidos nucleicos optimizados con codones que codifican la ATP7A humana de tamaño reducido. Se proporcionan además células huésped aisladas que comprenden las moléculas de ácidos nucleicos o los vectores divulgados en la presente descripción. Por ejemplo, las células huésped aisladas pueden ser células adecuadas para la propagación de rAAV. También se divulgan en la presente descripción composiciones que incluyen las moléculas de ácidos nucleicos, los vectores y los virus divulgados.

En la presente descripción se divulgan métodos para tratar a un sujeto diagnosticado con un trastorno del transporte de cobre relacionado con ATP7A (como enfermedad de Menkes, OHS o neuropatía motora distal relacionada con ATP7A). En algunas modalidades, los métodos incluyen administrar al sujeto una cantidad eficaz de un vector o virus recombinante divulgado que incluye una molécula de ácido nucleico con codones optimizados que codifica una ATP7A humana de tamaño reducido, o composiciones que incluyen el vector o virus. En algunos ejemplos, los métodos incluyen además administrar terapia de cobre (como histidinato de cobre, cloruro de cobre, sulfato de cobre o gluconato de cobre) al sujeto. En otras modalidades, los métodos incluyen tratar a un sujeto con enfermedad de Menkes al administrar al sujeto una cantidad eficaz de un vector que comprende una molécula de ácido nucleico con codones optimizados aislada que codifica una proteína ATP7A de tamaño reducido operativamente unida a un promotor y al administrar cobre al sujeto. En algunos ejemplos, el vector o virus se administra al sujeto por vía enteral o parenteral, intratecal o intracraneal en el líquido cefalorraquídeo o el cerebro.

Las características anteriores y otras de la divulgación serán más evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, que procede con referencia a las figuras adjuntas.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 es un diagrama esquemático de la proteína ATP7A humana que muestra la porción eliminada (porción en caja) para producir la proteína ATP7A humana de tamaño reducido. Adaptado de Donsante y otros, Mol. Ther.

19:2114-2123, 2011,

Las figuras 2A-2D muestran un alineamiento de secuencia de la secuencia de ácido nucleico de ATP7A humana de tamaño reducido con codones optimizados (co_rsATP7A; SEQ ID NO: 1) con la secuencia nativa de ácido nucleico de ATP7A humana de tamaño reducido (nat_rsATP7A; SEQ ID NO: 3).

La figura 3 es un esquema de un constructo de virus adenoasociado recombinante (rAAV) ilustrativo que incluye un ADNc de ATP7A de tamaño reducido con codones optimizados (co-rsATP7A). ITR: repetición terminal invertida; CMV: potenciador de citomegalovirus; CBA: promotor de p-actina de pollo; poliA: señal de poliadenilación.

La figura 4 es una imagen digital de expresión de ATP7A de tamaño reducido (rs-ATP7A) y co-rsATP7A en células HEK293T transfectadas. Carril 1: simulacro transfectado; Carril 2: pTR-CAG-rsATP7A (25 |jg); Carril 3: pTR-CAG-co-rsATP7A (1,25 jg); Carril 4: pTR-CAG-co-rsATP7A (25 jg); beta-actina: control de carga de proteínas.

La figura 5 es un gráfico que muestra la supervivencia de ratones mo-br tratados con rAAV9-co-rsATP7A (AAV9) e histidinato de cobre, no tratados (UT), tratados con AAV9co solo o tratados con histidinato de cobre solo.

La figura 6 es un gráfico que muestra la supervivencia al destete (barras de color gris oscuro) o la supervivencia prolongada (barras de color gris claro) en ratones no tratados (UT), ratones tratados con AAV5-rsATP7A e histidinato de cobre (AAV5 Cu), AAVrh10-rsATP7A e histidinato de cobre (AAVrh10 cobre), AAV9-rsATP7A y cobre (AAV9 Cu), y co-rsATP7A de AAV9 y cobre (AAV9co Cu). La rsATP7A es ADNc de ATP7A de tamaño reducido (secuencia nativa (no con codones optimizados)).

Listado de secuencias

Cualquiera de las secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos proporcionadas en la presente descripción o en el listado de secuencias adjunto se muestra mediante el uso de abreviaturas de letras estándar para bases de nucleótidos y aminoácidos, como se definió en 37 C.F.R. § 1.822. En al menos algunos casos, solo se muestra una cadena de cada secuencia de ácido nucleico, pero se entiende que la cadena complementaria está incluida por cualquier referencia a la cadena mostrada.

La SEQ ID NO: 1 es una secuencia de ácido nucleico de ATP7A de tamaño reducido con codones optimizados ilustrativa.

La SEQ ID NO: 2 es la secuencia de aminoácidos de una proteína ATP7A de tamaño reducido ilustrativa.

La SEQ ID NO: 3 es una secuencia de ácido nucleico de ATP7A de tamaño reducido nativa ilustrativa.

I. Términos

A menos que se indique de cualquier otra manera, los términos técnicos se usan de acuerdo con el uso convencional. Las definiciones de términos comunes en biología molecular pueden encontrarse en Lewin's Genes X, ed. Krebs y otros, Jones y Bartlett Publishers, 2009 (ISBN 0763766321); Kendrew y otros (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Publishers, 1994 (Is Bn 0632021829); Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por Wiley, John & Sons, Inc., 1995 (ISBN 0471186341); y George P. Redei, Encyclopedic Dictionary of Genetics, Genomics, Proteomics and Informatics, 3ra Edición, Springer, 2008 (ISBN: 1402067534).

Las siguientes explicaciones de términos y métodos se proporcionan para describir mejor la presente divulgación y para guiar a los expertos en la técnica a poner en práctica la presente divulgación. Las formas singulares "un", "una" y "el/la" se refieren a uno o más de uno, a menos que el contexto claramente lo indique de cualquier otra manera. Por ejemplo, el término "que comprende una molécula de ácido nucleico" incluye moléculas de ácidos nucleicos en singular o plural y se considera equivalente a la frase "que comprende al menos una molécula de ácido nucleico". Como se usa en la presente descripción, "comprende" significa "incluye". Por lo tanto, "que comprende A o B" significa "que incluye A, B o A y B," sin que excluya elementos adicionales.

En caso de conflicto, la presente especificación, que incluye las explicaciones de términos, controlará.

Aunque pueden usarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente descripción para poner en práctica o probar la tecnología divulgada, a continuación se describen métodos y materiales adecuados. Los materiales, métodos y ejemplos son solo ilustrativos y no pretenden ser limitantes.

Para facilitar la revisión de las diversas modalidades de esta divulgación, se proporcionan las siguientes explicaciones de términos específicos:

Virus adenoasociado (AAV): un virus no envuelto pequeño, defectuoso en la replicación que infecta a seres humanos y algunas otras especies de primates. No se sabe que el AAV cause enfermedades y provoca una respuesta inmune muy leve. Los vectores de terapia génica que utilizan AAV pueden infectar tanto células en división como quiescentes y pueden persistir en un estado extracromosomal sin integrarse en el genoma de la célula huésped. Estas características hacen que el AAV sea un vector viral atractivo para la terapia génica. Actualmente hay 11 serotipos reconocidos de AAV (AAV1-11).

ATP7A: ATPasa, transportadora de Cu++, polipéptido alfa. También conocida como ATPasa de tipo P transportadora de cobre ATPasa 1. Una proteína transmembrana involucrada en el transporte de cobre a través de las membranas. Hay dos ATPasas transportadoras de cobre en los seres humanos (ATP7A y ATP7B) que son miembros de la familia de ATPasas de tipo P transportadoras de metales (véase, por ejemplo, Lutsenko y otros, Physiol. Rev.

87:1011-1046, 2007). La proteína ATP7A tiene ocho segmentos que atraviesan la membrana. El segmento aminoterminal contiene seis sitios de unión a cobre. La ATP7A también contiene un dominio A, que se requiere para la etapa de fosfatasa del ciclo catalítico y un dominio de unión a ATP que consiste de un dominio P y un dominio N (véase, la figura 1).

Las secuencias de ATP7A están disponibles públicamente. Por ejemplo, los números de acceso de GenBank NC_000023.11 (región 77910656..78050395) y NC_000086.7 (región 106027276..106128160) divulgan secuencias de ácido nucleico genómico de ATP7A de ratón y humano ilustrativos, respectivamente. Los números de acceso de GenBank NM_000052, NM_001282224 y NR_104109 divulgan secuencias de ADNc de ATP7A humanas ilustrativas y NP_000043 y NP_001269153 divulgan secuencias de proteínas ATP7A humanas ilustrativas. Los números de acceso de GenBank NM_009726 y NM_001109757 divulgan secuencias de ADNc de Atp7a de ratón ilustrativas y NP_033856 y NP_001103227 divulgan secuencias de proteínas Atp7a de ratón ilustrativas. Todos los números de acceso de GenBank descritos en la presente descripción están como se presentan en GenBank el 21 de octubre de 2015.

Un experto en la técnica puede identificar moléculas de proteína y ácido nucleico de ATP7A que varían de las descritas en la presente descripción, tales como las secuencias de ATP7A que tienen una o más sustituciones, deleciones, inserciones o combinaciones de las mismas, mientras que aún retienen la actividad biológica de ATP7A (como la actividad transportadora de cobre). Además, las moléculas de ATP7A incluyen isoformas y fragmentos empalmados alternativamente que retienen la actividad biológica de ATP7A.

Neuropatía motora distal relacionada con ATP7A: una neuropatía motora distal de inicio en la edad adulta asociada con mutaciones en ATP7A. El trastorno se caracteriza por neuropatía motora distal progresiva y pérdida de reflejos tendinosos profundos. Son típicas las deformidades de los pies y las manos, tales como el pie cavo. Los sujetos con neuropatía motora distal relacionada con ATP7A no tienen niveles bajos de cobre en suero y no tienen anomalías en el cabello, la piel o las articulaciones asociadas con la enfermedad de Menkes u OHS.

Con codones optimizados: Un ácido nucleico "con codones optimizados" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que se ha alterado de manera que los codones son óptimos para la expresión en un sistema particular (como una especie particular o grupo de especies). Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico puede optimizarse para la expresión en células de mamífero o en una especie de mamífero particular (como células humanas). La optimización de codón no altera la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada.

Trastornos del transporte de cobre: Un trastorno causado por una deficiencia en el metabolismo del cobre, específicamente el transporte de cobre (por ejemplo, captación y/o movimiento de cobre por las células). El cobre se transporta por dos ATPasas que transportan cobre en los seres humanos (ATP7A y ATP7B). Los trastornos del transporte de cobre asociados con mutaciones en ATP7A (trastornos del transporte de cobre relacionados con ATP7A) incluyen enfermedad de Menkes, síndrome del cuerno occipital, neuropatía motora distal relacionada con ATP7A. La enfermedad de Wilson se asocia con mutaciones en ATP7B.

Cantidad eficaz: una cantidad de un agente o composición que, solo o junto con un portador farmacéuticamente aceptable o uno o más agentes adicionales, induce la respuesta deseada. Un agente o preparación terapéutica, tal como un compuesto, un ácido nucleico aislado, un vector o una composición que contiene un ácido nucleico o un vector, se administra en cantidades terapéuticamente eficaces. Las cantidades eficaces de un agente terapéutico pueden determinarse de muchas vías diferentes, tal como al ensayar para una reducción de los síntomas o la mejora del estado fisiológico de un sujeto que tiene un trastorno (como un trastorno del transporte de cobre). Las cantidades eficaces pueden determinarse, además, mediante diversos inmunoensayos in vitro, in vivo o in situ.

Aislado: Un componente biológico "aislado" (como una molécula de ácido nucleico, proteína o virus) se ha separado o purificado sustancialmente de otros componentes biológicos (por ejemplo, otros ADN y ARN cromosómicos y extracromosómicos, proteínas y/u organelos). Los ácidos nucleicos, proteínas y/o virus que se han "aislado" incluyen ácidos nucleicos, proteínas y virus purificados mediante métodos de purificación estándar. El término también abarca ácidos nucleicos, proteínas y virus preparados por expresión recombinante en una célula huésped, así como también ácidos nucleicos o proteínas sintetizados químicamente.

El término "aislado" (o purificado) no requiere pureza absoluta; más bien, está pensado como un término relativo. Así, por ejemplo, un ácido nucleico, proteína, virus u otro compuesto activo aislado o purificado es uno que está aislado en su totalidad o en parte de los ácidos nucleicos, proteínas y otros contaminantes asociados. En determinadas modalidades, el término "sustancialmente purificado" se refiere a un ácido nucleico, proteína, virus u otro compuesto activo que se ha aislado de una célula, medio de cultivo celular u otra preparación cruda y se ha sometido a fraccionamiento para eliminar diversos componentes de la preparación inicial, tales como proteínas, restos celulares y otros componentes.

Enfermedad de Menkes (también conocida como enfermedad del cabello rizado o enfermedad del cabello acerado): un trastorno neurodegenerativo recesivo ligado al cromosoma X de inicio infantil causado por la deficiencia o disfunción de la ATPasa transportadora de cobre ATP7A (OMIM 309400). Como una enfermedad ligada al cromosoma X, la enfermedad de Menkes ocurre típicamente en hombres que parecen normales al nacer, pero presentan pérdida de hitos del desarrollo previamente obtenidos y el inicio de hipotonía, convulsiones y retraso del crecimiento a los 2 o 3 meses de edad. Los cambios físicos característicos del cabello y la facies, junto con los hallazgos neurológicos típicos, a menudo sugieren el diagnóstico. El cabello del cuero cabelludo de los bebés con la enfermedad de Menkes clásica es corto, escaso, áspero y retorcido. La microscopía de luz del cabello del paciente ilustra pili torti patognomónico (por ejemplo, torsión de 180° del tallo del cabello) y el cabello tiende a estar ligeramente pigmentado y puede mostrar colores inusuales, tales como blanco, plateado o gris. El rostro del individuo con la enfermedad de Menkes tiene papada pronunciada, mejillas y orejas caídas que a menudo parecen grandes. El paladar tiende a ser arqueado y la erupción dentaria se retrasa. La piel a menudo parece flácida y redundante, particularmente en la nuca y en el tronco. Neurológicamente, casi invariablemente está presente una hipotonía troncal profunda con un control deficiente de la cabeza. Las habilidades de desarrollo se limitan a sonreír y balbucear ocasionalmente en la mayoría de los pacientes. El retraso del crecimiento comienza poco después del inicio de la neurodegeneración y es asimétrico, con un crecimiento lineal relativamente conservado en comparación con el peso y la circunferencia de la cabeza.

El fenotipo bioquímico en la enfermedad de Menkes implica (1) niveles bajos de cobre en plasma, hígado y cerebro debido a la absorción intestinal deficiente de cobre, (2) actividades reducidas de numerosas enzimas dependientes del cobre y (3) acumulación paradójica de cobre en ciertos tejidos (como duodeno, riñón, bazo, páncreas, músculo esquelético y/o placenta). El fenotipo de retención de cobre también es evidente en fibroblastos y linfoblastos cultivados, en los que la salida reducida de cobre radiomarcado es demostrable en experimentos de persecución de pulsos.

Los modelos de ratón de la enfermedad de Menkes están disponibles e incluyen el ratón moteado (Mercer, Am. J. Clin. Nutr. 76:1022S-1028S, 1998; por ejemplo, ratones atigrados (mo-br), tortuga, moteados, atigrados viables y/o con manchas (mo-blo)) y el ratón macular (por ejemplo Kodama y otros, J. Histochem. Cytochem. 41:1529-1535, 1993).

Síndrome del cuerno occipital (OHS): una variante alélica más leve de la enfermedad de Menkes (OMIM 304150). Los niveles de cobre en suero suelen estar ligeramente por debajo de los niveles normales en pacientes con OHS. El OHS se caracteriza por calcificaciones en forma de cuña que se forman en los sitios de unión del músculo trapecio y el músculo esternocleidomastoideo al occipucio ("cuernos occipitales"), que pueden ser clínicamente palpables y/o visibles en la radiografía. El fenotipo del OHS incluye debilidad muscular leve y generalizada y disautonomía (síncope, hipotensión ortostática y diarrea crónica). Los sujetos con OHS también suelen tener piel y articulaciones laxas, divertículos de vejiga, hernia inguinal y tortuosidad vascular. El intelecto suele ser normal o ligeramente reducido.

Portador farmacéuticamente aceptable: Los portadores farmacéuticamente aceptables (vehículos) útiles en esta divulgación son convencionales. Remington: The Science and Practice of Pharmacy, The University of the Sciences in Philadelphia, Editor, Lippincott, Williams, & Wilkins, Filadelfia, PA, 21ra Edición (2005), describe composiciones y formulaciones adecuadas para el suministro farmacéutico de uno o más compuestos, moléculas o agentes terapéuticos.

En general, la naturaleza del portador dependerá del modo particular de administración que se emplee. Por ejemplo, las formulaciones parenterales generalmente comprenden fluidos inyectables que incluyen fluidos farmacéuticamente y fisiológicamente aceptables tales como agua, solución salina fisiológica, soluciones salinas equilibradas, dextrosa acuosa, glicerol o similares como un vehículo. Para composiciones sólidas (por ejemplo, formas de polvo, píldora, comprimido o cápsula), los portadores sólidos no tóxicos convencionales pueden incluir, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón o estearato de magnesio. Además de los portadores biológicamente neutros, las composiciones farmacéuticas a administrar pueden contener cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas, tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes y agentes de tamponamiento de pH y similares, por ejemplo, acetato de sodio o monolaurato de sorbitán.

Administración parenteral: administración de una sustancia (como una composición o compuesto terapéutico) por una vía distinta a la del tracto gastrointestinal. Las vías ilustrativas de administración parenteral incluyen intravenosa, subcutánea, intramuscular, intracerebral, intracerebroventricular (por ejemplo, en un ventrículo cerebral), intratecal (por ejemplo, en el canal espinal o líquido cefalorraquídeo), tópica, transdérmica o por inhalación. Un médico experto puede seleccionar una vía de administración apropiada en base a la afección que se trata y el tratamiento que se administra.

Promotor: Una región de ADN que dirige/inicia la transcripción de un ácido nucleico (por ejemplo, un gen). Un promotor incluye las secuencias de ácido nucleico necesarias cerca del sitio de inicio de la transcripción. Normalmente, los promotores se ubican cerca de los genes que transcriben. Un promotor también incluye opcionalmente elementos potenciadores o represores distales que pueden ubicarse hasta varios miles de pares de bases desde el sitio de inicio de la transcripción.

En ejemplos particulares, un promotor está "operativamente unido" a un ácido nucleico, de manera que el promotor y el ácido nucleico (como un ácido nucleico de rsATP7A con codones optimizados divulgado en la presente descripción) se colocan en una relación funcional. Por ejemplo, un promotor está operativamente unido a una secuencia codificante si el promotor afecta la transcripción o expresión de la secuencia codificante. En general, las secuencias de ADN operativamente unidas son contiguas y, donde sea necesario unir dos regiones codificantes de proteínas, en el mismo marco de lectura.

Recombinante: Una molécula de ácido nucleico recombinante es una que tiene una secuencia que no es de origen natural (como una secuencia con codones optimizados) o que tiene una secuencia que se crea por una combinación artificial de dos de segmentos de secuencias separados de cualquier otra manera. Esta combinación artificial puede lograrse mediante síntesis química o mediante la manipulación artificial de segmentos aislados de moléculas de ácidos nucleicos, tales como, mediante técnicas de ingeniería genética.

De manera similar, un virus recombinante es un virus con una secuencia de ácido nucleico que no es de origen natural (como una secuencia heteróloga que no es del virus) o que se obtiene mediante una combinación artificial de al menos dos secuencias de diferente origen. El término "recombinante" también incluye ácidos nucleicos, proteínas y virus que se han alterado únicamente mediante la adición, sustitución o deleción de una porción de una molécula de ácido nucleico natural, proteína o virus. Como se usa en la presente descripción, "AAV recombinante" (rAAV) se refiere a una partícula de AAV en la que se ha empaquetado una molécula de ácido nucleico heteróloga (como una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína ATP7A con codones optimizados).

Vector: una molécula de ácido nucleico que permite la inserción de un ácido nucleico extraño sin interrumpir la capacidad del vector para replicarse y/o integrarse en una célula huésped. Un vector puede incluir secuencias de ácido nucleico que le permiten replicarse en una célula huésped, tal como un origen de replicación. Un vector puede incluir, además, uno o más genes marcadores seleccionables y otros elementos genéticos conocidos en la técnica. Un vector de expresión es un vector que contiene las secuencias reguladoras necesarias para permitir la transcripción y traducción del gen o genes insertados. En algunos ejemplos no limitantes, el vector es un AAV.

II. ATP7A con codones optimizados, vectores y virus adenoasociados recombinantes

En la presente descripción se divulgan ácidos nucleicos que codifican una proteína ATP7A de tamaño reducido que se han con codones optimizados para la expresión en células humanas. En algunas modalidades, un ácido nucleico con codones optimizados que codifica una proteína ATP7A de tamaño reducido incluye un ácido nucleico que es menos de aproximadamente 5 kb de longitud (por ejemplo, menos de aproximadamente 4,5 kb, menos de aproximadamente 4 kb, menos de aproximadamente 3,5 kb, o menos de aproximadamente 3 kb) que codifica una proteína ATP7A, en donde la proteína codificada retiene al menos una actividad de una proteína ATP7A nativa, que incluye actividad de unión de cobre, transporte de cobre y/o ATPasa. En algunos ejemplos, la proteína ATP7A codificada carece de uno o más de los seis sitios de unión de cobre N-terminales (por ejemplo, carece de 1, 2, 3, 4 o 5 sitios de unión de cobre). En ejemplos particulares, la proteína ATP7A codificada tiene dos sitios de unión de cobre N-terminales (por ejemplo, comienza después del cuarto sitio de unión de cobre N-terminal). En algunos ejemplos, la proteína APT7A de tamaño reducido comienza con un residuo de metionina presente en la proteína nativa (de longitud completa), mientras que en otros ejemplos, el ácido nucleico que codifica la proteína ATP7A de tamaño reducido incluye un sitio de inicio de traducción exógeno. En un ejemplo particular, el ácido nucleico de ATP7A de tamaño reducido con codones optimizados codifica una proteína que comienza en el aminoácido número 461 (metionina) de la proteína ATP7A nativa. En un ejemplo específico, el ácido nucleico que codifica la proteína ATP7A de tamaño reducido tiene aproximadamente 3,1 kb de longitud. Un ácido nucleico de ATP7A de tamaño reducido con codones optimizados ilustrativo se expone como SEQ ID NO: 1. En algunos ejemplos, el ácido nucleico con codones optimizados codifica una proteína ATP7A de tamaño reducido que tiene una secuencia de aminoácidos establecida como la SEQ ID NO: 2.

En otros ejemplos, los ácidos nucleicos optimizados con codones tienen una secuencia de ácido nucleico al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % idéntico a la SEQ ID NO: 1. Los ácidos nucleicos optimizados con codones divulgados codifican una secuencia de aminoácidos al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 2, en donde la proteína codificada retiene al menos una actividad de una proteína ATP7A nativa, que incluye actividad de unión de cobre, transporte de cobre y/o ATPasa.

La secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína ATP7A de tamaño reducido divulgada en la presente descripción es con codones optimizados para la célula en la que se va a expresar. El sesgo en el uso de codones, el uso de codones sinónimos en frecuencias desiguales, es omnipresente entre los sistemas genéticos (Ikemura, J.

Mol. Biol. 146:1-21, 1981; Ikemura, J. Mol. Biol. 158:573-97, 1982). La fuerza y la dirección del sesgo en el uso de codones está relacionada con el contenido de G C genómico y la abundancia relativa de diferentes ARNt isoaceptores (Akashi, Curr. Opin. Genet. Dev. 11:660-666, 2001; Duret, Curr. Opin. Genet. Dev. 12:640-9, 2002;

Osawa y otros, Microbiol. Rev. 56:229-264, 1992). El uso de codones puede afectar la eficiencia de la expresión génica. La optimización con codones se refiere al reemplazo de al menos un codón (como al menos 5 codones, al menos 10 codones, al menos 25 codones, al menos 50 codones, al menos 75 codones, al menos 100 codones o más) en una secuencia de ácido nucleico con un codón sinónimo (uno que codifica el mismo aminoácido) usado con más frecuencia (preferido) en el organismo. Cada organismo tiene un sesgo en el uso de codones particular para cada aminoácido, que puede determinarse a partir de tablas de uso de codones disponibles públicamente (por ejemplo, véase Nakamura y otros, Nucleic Acids Res. 28:292, 2000 y referencias allí citadas). Por ejemplo, una base de datos de uso de codones está disponible en la Red Informática Mundial en kazusa.or.jp/codon. Un experto en la técnica puede modificar un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos particular, de modo que codifique la misma secuencia de aminoácidos, mientras se optimiza para la expresión en un tipo de célula particular (como una célula humana). En algunos ejemplos, se genera una secuencia de ATP7A con codones optimizados mediante el uso de software, tales como las herramientas de optimización de codones disponibles en Integrated DNA Technologies (Coralville, IA, disponible en la Red Informática Mundial en idtdna.com/CodonOpt), GenScript (Piscataway, NJ) o Entelechon (Eurofins Genomics, Ebersberg, Alemania, disponible en la Red Informática Mundial en entelechon.com/2008/10/backtranslation-tool/).

También se divulgan en la presente descripción vectores que incluyen los ácidos nucleicos optimizados con codones que codifican la proteína APT7A de tamaño reducido. En algunos ejemplos, el vector incluye un ácido nucleico de ATP7A de tamaño reducido con codones optimizados operativamente unido a un promotor. En un ejemplo no limitante, el promotor es un promotor de p-actina, tal como un promotor de p-actina de pollo. En otros ejemplos no limitantes, el promotor es un promotor ATP7A (como un promotor ATP7A humano), un promotor de transcripto asociado a latencia (LAT) de HSV-1, un promotor de enolasa específica de neurona o un promotor de pglucuronidasa (véase, por ejemplo, Husain y otros, Gene Ther. 16:927-932. 2009). Un experto en la técnica puede seleccionar promotores adicionales que pueden usarse en los vectores divulgados. En ejemplos adicionales, el ácido nucleico de ATP7A también está operativamente unido a un elemento potenciador (como un potenciador de CMV) y/o una señal de poliadenilación (como una señal de poliadenilación de p-globina o una señal de poliadenilación de SV40).

En algunas modalidades, el vector es un vector de virus adenoasociado (AAV), un vector de adenovirus, un vector de alfavirus, un vector de herpesvirus, un vector de lentivirus o un vector de virus vaccinia. Un experto en la técnica puede seleccionar un vector apropiado, por ejemplo, para el uso en los métodos descritos en la presente descripción.

En modalidades particulares, el vector es un vector de AAV. El serotipo AAV puede ser cualquier serotipo adecuado para el suministro de transgenes a un sujeto. En algunos ejemplos, el vector de AAV es un AAV de serotipo 9 (AAV9). En otros ejemplos, el vector de AAV es un AAV de serotipo 5 (AAV5). En otros ejemplos, el vector de AAV es un vector de serotipo 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 10, 11 o 12 (es decir, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV6, AAV7, AAV8, AAV10, AAV11 o AAV12). En otros ejemplos más, el vector de AAV es un híbrido de dos o más serotipos de AAV (como, entre otros, AAV2/1, AAV2/7, AAV2/8 o AAV2/9). La selección del serotipo de AAV dependerá en parte del tipo o tipos de células a las que están dirigidas la terapia génica. Para el tratamiento de los trastornos del transporte de cobre relacionados con ATP7A, las neuronas (como las neuronas del sistema nervioso central o neuronas motoras) son ejemplos de células diana relevantes. En otros ejemplos, las células epiteliales del túbulo renal, los enterocitos, las células de la piel y/o las células musculares también son células diana relevantes.

El AAV es un parvovirus dependiente auxiliar no envuelto, pequeño, clasificado en el género Dependovirus de la familia Parvoviridae. El AAV tiene un genoma de ADN monocatenario lineal de aproximadamente 4,7 kb. El genoma está flanqueado por repeticiones terminales invertidas (ITR) que flanquean dos marcos de lectura abiertos (ORF), rep y cap. El ORF rep codifica cuatro proteínas de replicación (Rep78, Rep68, Rep52 y Rep4) y el ORF cap codifica tres proteínas de la cápside viral (Vp1, VP2 y VP3) y una proteína de activación de ensamblaje (AAP). El AAV requiere un virus auxiliar (como adenovirus, virus del herpes simple u otros virus) para completar su ciclo de vida. El AAV se usa actualmente en numerosos ensayos clínicos de terapia génica en todo el mundo. Aunque el VAA infecta a los seres humanos y algunas otras especies de primates, no se sabe que cause enfermedades y provoca una respuesta inmune muy leve. Los vectores de terapia génica que utilizan AAV pueden infectar células tanto en división como quiescentes y persistir en un estado extracromosómico sin integrarse en el genoma de la célula huésped. El AAV posee varias características deseables para un vector de terapia génica, incluidas la capacidad de unirse y entrar en células diana, entrar en el núcleo, la capacidad de expresarse en el núcleo durante un período de tiempo prolongado y baja toxicidad. Debido a las características ventajosas de AAV, en algunas modalidades la presente divulgación contempla el uso de AAV para las moléculas de ácidos nucleicos recombinantes y los métodos divulgados en la presente descripción.

Las ITR son el único componente necesario para el empaquetamiento exitoso de una proteína heteróloga en una cápside de AAV. Por tanto, en la presente descripción se divulgan vectores AAV que incluyen un ácido nucleico con codones optimizados que codifica una proteína ATP7A de tamaño reducido (como la SEQ ID NO: 1) operativamente unida a un promotor. En algunos ejemplos, el vector de AAV incluye ITR 5' y 3' que flanquean un ácido nucleico con codones optimizados que codifica una proteína ATP7A de tamaño reducido (como la SEQ ID NO: 1) operativamente unida a un promotor. En un ejemplo específico, las ITR flanqueantes son de AAV2.

El vector también puede incluir elementos adicionales, tales como un elemento potenciador (por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que aumenta la velocidad de transcripción al aumentar la actividad de un promotor) y/o una señal de poliadenilación. En ejemplos particulares, el potenciador es un potenciador del citomegalovirus (CMV) o un elemento regulador postranscripcional de la marmota (WPRE). Los ejemplos de promotores incluyen un promotor de p-actina de pollo (CBA), un promotor ubicuo (como un promotor de glucuronidasa beta (GUSB)) o un promotor neuronal específico (como un promotor de la cadena B del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF-beta) o promotor de enolasa específico de neurona (NSE)). En ejemplos adicionales, la señal de poliadenilación es una señal de poliadenilación de p-globina, una señal de poliadenilación de SV40 o una señal de poliadenilación de hormona de crecimiento bovina. Otros elementos que pueden incluirse opcionalmente en el vector incluyen etiquetas (como 6xHis, HA u otras etiquetas para la detección de proteínas). Puede usarse cualquier combinación de ITR, potenciadores, promotores, señales de poliadenilación y/u otros elementos en los vectores divulgados en la presente descripción.

En algunos ejemplos, el vector incluye (de 5'a 3'): un ITR 5' de AAV, un potenciador, un promotor, una secuencia codificante de ATP7A de tamaño reducido con codones optimizados, una señal de poliadenilación y una ITR 3' de AAV. En un ejemplo no limitante, el vector incluye (de 5'a 3') ITR 5' de AAV2, un potenciador de CMV, un promotor de p-actina de pollo, la SEQ ID NO: 1 (o una secuencia con al menos 80 % de identidad con la SEQ ID NO: 1), señal de poliadenilación de p-globina de conejo e ITR 3' de AAV2 (por ejemplo, figura 3).

Hay al menos 10 serotipos diferentes de AAV (AAV1 a AAV10), que tienen diferente tropismo celular o tisular. Por ejemplo, las proteínas de la cápside de los serotipos 1, 5 y 6 de a Av se unen al ácido siálico unido al N, el AAV4 se une al ácido siálico unido al O, los AAV2, 3 y 6 se unen a proteoglicanos de sulfato de heparina y el AAV9 se une residuos de galactosa N-terminal. Véase, por ejemplo, Murlidharan y otros, Front. Mol. Neurosci. 7:76, 2014. Por tanto, los serotipos de AAV específicos pueden ser particularmente adecuados para transducir tipos de células específicos, tales como las neuronas. En ejemplos no limitantes, el serotipo 2 de AAV, el serotipo 5 de AAV o el serotipo 9 de AAV se utilizan para la expresión del sistema nervioso central (CNS) con los ácidos nucleicos recombinantes, los vectores y los métodos descritos en la presente descripción. Un experto en la técnica apreciará que también se pueden utilizar otros serotipos de AAV en los constructos y métodos divulgados en la presente descripción.

Los métodos para producir AAV recombinante (rAAV), por ejemplo, rAAV adecuado para terapia génica, son bien conocidos en la técnica y pueden utilizarse con las moléculas de ácidos nucleicos recombinantes, vectores y métodos divulgados en la presente descripción. En algunos ejemplos, el rAAV se produce mediante el uso de un sistema de tres plásmidos con un plásmido (vector) que incluye las ITR de AAV que flanquean un promotor operativamente unido a un ácido nucleico que codifica una proteína de interés (como un ácido nucleico que codifica rsATP7A con codones optimizados), un plásmido que incluye genes rep y cap de AAV operativamente unidos a promotores y un plásmido que codifica proteínas de virus auxiliares. Las células se cotransfectan con los tres plásmidos y se produce el ensamblaje viral. Las partículas de rAAV resultantes se purifican (por ejemplo, mediante centrifugación en gradiente o HPLC) y pueden administrarse a un sujeto (como un sujeto con trastorno del transporte de cobre relacionado con ATP7A) o se usan para la transducción de células diana para la producción de la proteína de interés (como rsATP7A). En otros ejemplos, se utiliza un sistema de dos plásmidos, con un plásmido de empaquetamiento (por ejemplo, que incluye genes rep y/o cap) y un plásmido que incluye las ITR de AAV que flanquean un promotor operativamente unido a un ácido nucleico que codifica una proteína de interés (como un ácido nucleico que codifica rsATP7A con codones optimizados). En este caso, la infección con un virus auxiliar proporciona factores adicionales para la producción de rAAV. Véase, por ejemplo, las Solicitudes de Publicaciones de Patentes de EE. UU. Nos. 2012/0100606, 2012/0135515, 2011/0229971, y 2013/0225666. En ejemplos particulares, el rAAV es el serotipo AAV9 o el serotipo AAV5.

También se proporcionan en la presente descripción células huésped aisladas que comprenden las moléculas de ácidos nucleicos o los vectores divulgados en la presente descripción. Por ejemplo, la célula huésped aislada puede ser una célula (o línea celular) apropiada para la producción de rAAV. En algunos ejemplos, la célula huésped es una célula de mamífero, tal como una célula HEK-293 (o HEK293T), BHK, Vero, RD, HT-1080, A549, COS-7, ARPE19 o MRC-5. Un experto en la técnica puede seleccionar células adicionales que se puedan transformar con los ácidos nucleicos y/o vectores divulgados en la presente descripción.

III. Métodos y composiciones para tratar los trastornos del transporte de cobre

En la presente descripción se divulgan métodos para tratar a un sujeto con un trastorno del transporte de cobre relacionado con ATP7A que incluyen administrar al sujeto una cantidad eficaz de un vector que comprende un ácido nucleico de ATP7A de tamaño reducido con codones optimizados o un virus recombinante (como un rAAV) que incluye un ácido nucleico de ATP7A de tamaño reducido con codones optimizados. En ejemplos particulares, se administra al sujeto una composición que incluye el virus recombinante (por ejemplo, un virus recombinante y un portador farmacéuticamente aceptable). La composición puede administrarse como una sola dosis o en múltiples dosis (como 2, 3, 4 o más dosis).

Las composiciones que incluyen un vector o virus (como un rAAV) divulgados en la presente descripción y un portador farmacéuticamente aceptable también se proporcionan en la presente divulgación. Los portadores farmacéuticamente aceptables se determinan en parte por la composición particular que se administra, así como por el método particular usado para administrar la composición. Véase, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, The University of the Sciences en Filadelfia, Editor, Lippincott, Williams y Wilkins, Filadelfia, PA, 21ra Edición (2005). Por consiguiente, existe una amplia variedad de formulaciones adecuadas de composiciones farmacéuticas de la presente divulgación.

Las preparaciones para administración parenteral incluyen soluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas estériles. Los ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Los portadores acuosos incluyen agua, soluciones, emulsiones o suspensiones alcohólicas/acuosas, que incluyen sorbitol, solución salina y medios tamponados. Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, Ringer lactato o aceites fijos. En ejemplos particulares, las composiciones divulgadas en la presente descripción incluyen uno o más de sorbitol, polietilenglicol o propilenglicol (por ejemplo, de aproximadamente 0,1 % a aproximadamente 50 %, tal como aproximadamente 1-10 %, aproximadamente 1-5 %, aproximadamente 5-40 %, o aproximadamente 10-30 % p/v). En otro ejemplo particular, las composiciones divulgadas en la presente descripción incluyen solución de Ringer lactato.

Los vehículos intravenosos también pueden incluir reponedores de fluidos y nutrientes, reponedores de electrolitos (como los basados en dextrosa de Ringer) y similares. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes y similares. Las composiciones también pueden incluir detergentes, tales como TWEEN-20, TWEe N-40, TWEEN-60 o TWEEN-80 (por ejemplo, a aproximadamente 0,05-5 %, tal como aproximadamente 0,1 %-1 %, aproximadamente 0,5-5 %, aproximadamente 0,2-2 %, o aproximadamente 1-5 %). En algunas modalidades, las composiciones se formulan para administración intracerebral o intravenosa. Las formulaciones farmacéuticas adecuadas para la administración de rAAV pueden encontrarse, por ejemplo, en la solicitud de publicación de patente de EE. UU. núm. 2012/0219528

Las composiciones divulgadas se administran a un sujeto que tiene o se sospecha que tiene un trastorno del transporte de cobre relacionado con ATP7A, que incluye, pero no se limita a, enfermedad de Menkes, síndrome del cuerno occipital o neuropatía motora hereditaria distal ligada al cromosoma X. Un experto en la técnica puede identificar a un sujeto que tiene un trastorno del transporte de cobre relacionado con ATP7A en base a en la presentación clínica, los niveles de cobre en suero (por ejemplo, enfermedad de Menkes o OHS) y/o diagnóstico genético (por ejemplo, presencia de una o más mutaciones en el gen que codifica la ATP7A). Véase, por ejemplo, Kaler, Nature Rev. Neurol 7:15-29, 2011; Kaler, Handbook Clin. Neurol. 113:1745-1754, 2013.

En algunas modalidades, las composiciones divulgadas (como composiciones que incluyen vector(es) y/o virus) se administran al sujeto por cualquier vía eficaz, por ejemplo, parenteral o enteral. Las vías de administración ilustrativas incluyen vías de administración mediante inyección (como inyección intracraneal, intracerebral, intratecal, intracerebroventricular, intravenosa, intraperitoneal, subcutánea o intradérmica), oral, enteral, sublingual, transdérmica, intranasal o inhalación. En algunos ejemplos, las composiciones se administran mediante inyección en el CNS, tal como inyección intracerebral, intracerebroventricular, intratecal, intracefalorraquídea, epidural o intraparenquimatosa. En algunos ejemplos específicos, la composición se administra mediante inyección en el CSF. En otros ejemplos, las composiciones se administran por vía intravenosa. En ejemplos particulares, la vía de administración puede seleccionarse en base al serotipo del vector de AAV o rAAV usado. Por ejemplo, se ha observado transducción neuronal después de la administración intravenosa de AAV1, AAV6, AAV8, a AV9, AAVRh.8 y AAVRh.10 (véase, por ejemplo, Murlidharan y otros, Front. Mol. Neurosci. 7:76, 2014). Puede ser necesaria la administración directa de la composición al CNS si se utilizan AAV2, AAV4 o AAV5.

En algunas modalidades, un rAAV divulgado se administra a una dosis de aproximadamente 104 a aproximadamente 1014 viriones (partículas virales). En algunos ejemplos, el rAAV se administra a una dosis de aproximadamente 105 a aproximadamente 1013 viriones o de aproximadamente 108 a aproximadamente 1012 viriones. En ejemplos específicos no limitantes, el rAAV se administra a una dosis de al menos aproximadamente 104, al menos aproximadamente 105, al menos aproximadamente 106, al menos aproximadamente 107, al menos aproximadamente 108, al menos aproximadamente 109, al menos aproximadamente 10-10, al menos aproximadamente 1011, al menos aproximadamente 1012, al menos aproximadamente 1013, o al menos aproximadamente 1 x 1014 viriones. En otros ejemplos no limitantes, el rAAV se administra a una dosis de no más de aproximadamente 1010, no más de aproximadamente 1011, no más de aproximadamente 1012, no más de aproximadamente 1013 o no más de aproximadamente 1014 viriones. En ejemplos adicionales, el rAAV se administra a una dosis de aproximadamente 105 a aproximadamente 1014 genomas virales (vg) (como aproximadamente 1,6 x 109 vg, aproximadamente 5 x 109 vg, aproximadamente 1,6 x 1010 vg, aproximadamente 5 x 1010 vg, aproximadamente 1,6 x 1011 vg, aproximadamente 5 x 1011 vg, aproximadamente 1,6 x 1012 vg, aproximadamente 5 x 1012 vg, aproximadamente 1,6 x 1013 vg, o aproximadamente 5 x 1013 vg o aproximadamente 1,6 x 1014 vg.

En otras modalidades, el rAAV se administra a una dosis de aproximadamente 1 x 1010 a aproximadamente 1 x 1014 genomas virales (vg)/kg. En algunos ejemplos, el rAAV se administra a una dosis de aproximadamente 1 x 1010 a aproximadamente 1 x 1015 vg/kg. En ejemplos específicos no limitantes, el rAAV se administra a una dosis de al menos aproximadamente 1 x 1010, al menos aproximadamente 5 x 1010, al menos aproximadamente 1 x 1011, al menos aproximadamente 5 x 1011, al menos aproximadamente 1 x 1012, al menos aproximadamente 5 x 1012, al menos aproximadamente 1 x 1013, al menos aproximadamente 5 x 1013, o al menos aproximadamente 1 x 1014 vg/kg. En otros ejemplos no limitantes, el rAAV se administra a una dosis de no más de aproximadamente 1 x 1010, no más de aproximadamente 5 x 1010, no más de aproximadamente 1 x 1011, no más de aproximadamente 5 x 1011, no más de aproximadamente 1 x 1012, no más de aproximadamente 5 x 1012, no más de aproximadamente 1 x 1013, no más de aproximadamente 5 x 1013, o no más de aproximadamente 1 x 1014 vg/kg. En un ejemplo no limitante, el rAAV se administra a una dosis de aproximadamente 1 x 1012 vg/kg, aproximadamente 4 x 1012 vg/kg o aproximadamente 1 x 1013 vg/kg.

Las dosis apropiadas pueden determinarse por un experto en la técnica, por ejemplo, a través de ensayos de rutina que establecen curvas dosis-respuesta. El rAAV puede administrarse en una sola dosis o en múltiples dosis (como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 dosis) según sea necesario para obtener los resultados terapéuticos deseados.

En algunos sujetos con trastornos del transporte de cobre relacionados con ATP7A (particularmente enfermedad de Menkes y OHS), el tratamiento también puede incluir la administración de terapia de cobre por vía parenteral (por ejemplo, subcutánea) (véase, por ejemplo, Kaler y otros, N. Eng. J. Med. 358:605-614, 2008; Kaler J. Trace Elem. Med. Biol. 28:427-430, 2014). Esta terapia adicional puede ser necesaria debido a defectos en el transporte de cobre en el intestino que resultan de defectos de ATP7A y que conducen a niveles bajos de cobre en suero. Por tanto, en algunas modalidades, un sujeto tratado con las composiciones divulgadas en la presente descripción (por ejemplo, un sujeto con niveles reducidos de cobre en suero, tal como un sujeto que padece la enfermedad de Menkes o OHS) también se trata con terapia de cobre. La terapia de cobre puede no ser necesaria en sujetos con niveles de cobre en suero normales o casi normales, tales como sujetos con neuropatía motora distal relacionada con ATP7A; sin embargo, un médico puede identificar si la terapia de cobre debe administrarse en pacientes con un trastorno del transporte de cobre relacionado con ATP7A.

El cobre usado para el tratamiento puede estar en cualquier forma que se pueda administrar convenientemente y que tenga un nivel aceptable de efectos secundarios (como daño tubular renal proximal). En algunos ejemplos, el cobre está en forma de histidina de cobre, histidinato de cobre, gluconato de cobre, cloruro de cobre y/o sulfato de cobre. En algunos ejemplos, el cobre es cobre de grado cGMP, tal como histidinato de cobre de grado cGMP. Generalmente, una dosis adecuada es de aproximadamente 250 |jg a aproximadamente 500 |jg de cobre (como histidinato de cobre, cloruro de cobre o sulfato de cobre) por día o en días alternos. Sin embargo, también se podrían usar otras dosificaciones más altas o más bajas (o dosis divididas), tales como de aproximadamente 50 jg a aproximadamente 1000 jg (como aproximadamente 50 jg a 200 jg, de aproximadamente 100 jg a 500 jg, aproximadamente 250 jg a 750 jg, o aproximadamente 500 jg a 1000 jg ) por día o día por medio, por ejemplo, en dependencia de la edad del sujeto (por ejemplo, infante, niño o adulto) y peso corporal, vía de administración u otros factores considerados por un médico. En algunos ejemplos, a los sujetos menores de 12 meses de edad se les administra el cobre en dos dosis diarias, mientras que a los sujetos de 12 meses de edad o mayores se les administra el cobre en una sola dosis diaria. La terapia de cobre se administra por una o más vías parenterales, que incluyen, pero no se limitan a, la administración subcutánea, intramuscular o intravenosa. En un ejemplo específico, la terapia de cobre (como el histidinato de cobre) se administra mediante inyección subcutánea.

El cobre puede administrarse al sujeto antes de, de forma simultánea, sustancialmente de forma simultánea, de forma secuencial o cualquier combinación de los mismos, con los ácidos nucleicos de rsATP7A optimizados con codones, vectores, virus recombinantes o composiciones descritas en la presente descripción. En algunos ejemplos, se administra al menos una dosis de cobre dentro de las 24 horas de administración del ácido nucleico de rsATP7A con codones optimizados, vectores, virus recombinantes o composiciones descritas en la presente descripción. Pueden administrarse dosis adicionales de cobre en momentos posteriores, según lo seleccione un médico. En algunos ejemplos, la terapia de cobre se administra diariamente durante al menos 3 meses, al menos 6 meses, al menos 1 año, al menos 2 años, al menos 3 años o más (como alrededor de 3 meses a 5 años, 6 meses a 3 años, 1 a 2 años, 2 a 6 años o 1 a 5 años). La terapia de cobre (como la administración diaria de cobre) puede comenzar inmediatamente después del diagnóstico de un sujeto con un trastorno del transporte de cobre relacionado con ATP7A y, en algunos ejemplos, puede ocurrir antes de la administración de los ácidos nucleicos de rsATP7A optimizados con codones, vectores, virus recombinantes o composiciones descritas en la presente descripción, y también continúan diariamente después de la administración de rsATP7A. Un experto en la técnica también puede seleccionar tratamientos adicionales para sujetos con un trastorno del transporte de cobre relacionado con ATP7A, tal como L-treo-dihidroxifenilserina (L-DOPS, también conocida como droxidopa).

En algunas modalidades, los métodos también incluyen seleccionar un sujeto para el tratamiento con un ácido nucleico de ATP7A de tamaño reducido con codones optimizados divulgado, un vector o virus que incluye un ácido nucleico de ATP7A de tamaño reducido con codones optimizados, o una composición que incluye tales ácidos nucleicos, virus o vectores. Por ejemplo, los métodos divulgados pueden incluir seleccionar un sujeto con un trastorno del transporte de cobre relacionado con ATP7A, tal como enfermedad de Menkes, enfermedad del cuerno occipital o neuropatía motora distal relacionada con ATP7A. La selección de un sujeto puede basarse en síntomas clínicos, hallazgos bioquímicos, diagnósticos moleculares (como la presencia de una o más mutaciones en ATP7A) o una combinación de dos o más de los mismos. Por lo tanto, en algunos ejemplos, un sujeto con un trastorno del transporte de cobre relacionado con ATP7A se selecciona en base a los síntomas clínicos, tales como cabello grueso, hipotonía, convulsiones, neurodegeneración cerebral y cerebelosa y/o retraso del crecimiento en bebés de aproximadamente 2-3 meses de edad (por ejemplo, enfermedad de Menkes), cutis laxa, articulaciones flojas, depósitos de calcio en forma de cuña del hueso occipital y/o pelo grueso (por ejemplo, OHS), o neuropatía motora distal progresiva, pie cavo, dedos en martillo y/o dedos curvados (por ejemplo, neuropatía motora distal relacionada con ATP7A). En otros ejemplos, el sujeto se selecciona en base a hallazgos bioquímicos, tales como niveles bajos de cobre en suero, niveles bajos de ceruloplasmina en suero y/o niveles neuroquímicos anormales en suero o CSF (como dopamina, norepinefrina o metabolitos de las mismas), ya sea solo o en junto con los síntomas clínicos. En otros ejemplos, el sujeto se selecciona en base a la neuroquímica anormal del plasma o del CSF solo, en ausencia de cualquier otro síntoma bioquímico o clínico. A continuación se describen métodos ilustrativos para determinar niveles de cobre en suero, ceruloplasmina en suero o neuroquímicos en suero o CSF.

En otros ejemplos más, se selecciona un sujeto con un trastorno del transporte de cobre relacionado con ATP7A en base a diagnósticos moleculares, por ejemplo, la presencia de una o más mutaciones en ATP7A, tales como aquellas que dan como resultado una actividad reducida de ATP7A o ausencia de expresión detectable de ATP7A. Los sujetos pueden seleccionarse en base a la secuencia de ADN de ATP7A sola, en ausencia de cualquier otra anomalía bioquímica o clínica, o pueden seleccionarse en base a la presencia de mutación o mutaciones de ATP7A y uno o más de otros síntomas bioquímicos y/o clínicos. Las mutaciones ilustrativas en ATP7A incluyen las descritas en la Publicación PCT International Núm. WO 2010/042102, por ejemplo, Q197X, R201X, A629P, S637L, G666R, G727R, S833G, G1019D, N1304S, A1362D, IVS8,AS,dup5, EVS9,DS+6T>G, IVS21,DS,+3A>T, Del4246-4260 y Del4284-4315. Se describen mutaciones de ATP7A ilustrativas adicionales en Kaler, J. Trace Elem. Med. Biol.

28:427-430, 2014, y Herencia Mendeliana en el Hombre (OMIM) en línea, Núm. de acceso 300011, tal como se presentó en OMIM el 21 de octubre de 2015. Un experto en la técnica puede identificar mutaciones de ATP7A adicionales (incluidas las que aún no se han identificado) que pueden estar presentes en un sujeto con un trastorno del transporte de cobre relacionado con ATP7A. Los métodos ilustrativos para identificar la presencia de una o más mutaciones de ATP7A en un sujeto incluyen secuenciación (por ejemplo, secuenciación genómica o de ADNc), PCR específica de alelo o hibridación de oligonucleótidos específica de alelo, análisis de micromatrices, electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante, HPLC desnaturalizante, escisión por desajuste de enzimas, u otros métodos conocidos por un experto en la técnica.

En algunas modalidades, la eficacia del tratamiento de un sujeto con un ADNc de ATP7A de tamaño reducido con codones optimizados (como rAAV que contiene un ácido nucleico de ATP7A de tamaño reducido con codones optimizados como se divulga en la presente descripción) se evalúa al determinar uno o más marcadores bioquímicos de metabolismo del cobre en una muestra de un sujeto (como nivel de cobre en suero o CSF, nivel de ceruloplasmina en suero, niveles de catecolaminas en plasma o CSF o salida de cobre celular). Los métodos para detectar estos marcadores bioquímicos del metabolismo del cobre son bien conocidos en la técnica.

En algunos ejemplos, el valor de un marcador bioquímico del metabolismo del cobre (como el nivel de cobre, el nivel de ceruloplasmina, el nivel de catecolamina o la salida de cobre celular) en una muestra de un sujeto se compara con un valor para el mismo marcador de un control (como valor de referencia, una población control o un individuo control). En algunos ejemplos, un control es un sujeto con un trastorno del transporte de cobre relacionado con APT7A no tratado (o un valor de referencia o una población control con un trastorno del transporte de cobre relacionado con APT7A no tratado). En otros ejemplos, un control es un sujeto sano (como un sujeto que no tiene un trastorno del transporte de cobre) o un valor de referencia o una población control saludable. En algunos ejemplos, el control puede ser muestras o valores del sujeto con el trastorno del transporte de cobre relacionado con APT7A, por ejemplo, antes de comenzar el tratamiento.

En algunos ejemplos, el marcador bioquímico del metabolismo del cobre en una muestra de un sujeto se compara con un valor obtenido de una muestra control de un solo individuo. En otros ejemplos, el marcador bioquímico del metabolismo del cobre en una muestra de un sujeto se compara con un valor obtenido de una población control, tal como las muestras control de más de un individuo (como dos o más individuos, cinco o más individuos, diez o más individuos, o incluso 100 o más individuos). En el caso de una población control, el valor de la muestra del sujeto puede compararse con la media de los valores de la población control o con el rango de los valores de la población control. En otros ejemplos, el marcador bioquímico del metabolismo del cobre en una muestra de un sujeto se compara con un valor de referencia, tal como un valor estándar obtenido de una población de individuos normales que usan los expertos en la técnica. De manera similar a una población control, el valor de la muestra del sujeto puede compararse con el valor de referencia medio o con un rango de valores de referencia (como los valores altos y bajos en el grupo de referencia o el intervalo de confianza del 95 %).

Niveles de cobre

Un marcador bioquímico del metabolismo del cobre es el nivel de cobre en una muestra de un sujeto (como suero, plasma o CSF). En algunos ejemplos, el nivel de cobre reducido en comparación con un individuo control normal o una población control normal es un marcador de la enfermedad de Menkes o OHS. Los métodos para determinar los niveles de cobre en una muestra (como suero, plasma o CSF de un sujeto) son bien conocidos por los expertos en la técnica. En algunos ejemplos, los métodos para determinar los niveles de cobre en una muestra incluyen espectrometría de absorción atómica de llama, voltamperometría de redisolución anódica, absorción atómica en horno de grafito, espectrofotometría de absorción atómica electrotérmica, espectroscopía de emisión atómica de plasma acoplado inductivamente y espectrometría de masas de plasma acoplado inductivamente. Véase, por ejemplo, Evenson y Warren, Clin. Chem. 21:619-625, 1975; Weinstock y Uhlemann, Clin. Chem. 27:1438-1440, 1981; WO 93/017321.

Niveles de ceruloplasmina

La ceruloplasmina es la principal proteína portadora de cobre en la sangre. Esta proteína tiene actividad ferroxidasa y amino oxidasa y cataliza la oxidación enzimática de p-fenilendiamina (PPD) y Fe (II). Los niveles de ceruloplasmina en una muestra de un sujeto (como suero, plasma o CSF) son un marcador bioquímico del metabolismo del cobre. En algunos ejemplos, el nivel de ceruloplasmina reducido en comparación con la muestra o población control normal o un valor de referencia es un marcador de la enfermedad de Menkes u OHS.

Los métodos para determinar los niveles de ceruloplasmina en una muestra (como suero, plasma o CSF) son bien conocidos por los expertos en la técnica. En un ejemplo, los niveles de ceruloplasmina en una muestra se determinan al medir la actividad de la ceruloplasmina oxidasa (como la actividad PPD-oxidasa o la actividad ferroxidasa). Véase, por ejemplo, Sunderman y Nomoto, Clin. Chem. 16:903-910, 1970). La tasa de formación del producto de oxidación es proporcional a la concentración de ceruloplasmina en suero (con una corrección por oxidación no enzimática del sustrato). En otro ejemplo, los niveles de ceruloplasmina en una muestra se determinan mediante inmunoensayo, tal como ELISA, fluoroinmunoensayo con resolución temporal de disociación mejorada o inmunoensayo turbidimétrico (véase, por ejemplo, las Patentes de EE. UU. Nos. 6,806,044; 6,010,903; 5,491,066). En un ejemplo adicional, los niveles de ceruloplasmina se determinan al purificar ceruloplasmina y analizar el contenido de cobre mediante el uso de espectroscopía de masas con plasma acoplado inductivamente para proporcionar una señal específica de iones cobre; y la muestra se evalúa para ceruloplasmina en base a la señal específica de iones cobre (véase, por ejemplo, la Publicación de Patente de EE. UU. Núm. 2007/0161120).

Niveles de catecolamina

El cobre es necesario para la actividad de las enzimas metabólicas (como la dopamina p hidroxilasa, lisil oxidasa y citocromo c oxidasa). Por ejemplo, el cobre es necesario para la actividad de la enzima dopamina p hidroxilasa (DBH), que convierte la dopamina en norepinefrina. En algunos ejemplos, los niveles de catecolaminas (como los niveles de catecolaminas en plasma o CSF) se correlacionan con la actividad de DBH. A continuación se muestra una porción de la vía metabólica de la dopamina y la norepinefrina.

Dopamina (B

hidroxilasa

Dopamina (DA) ___________ ^ Norepinefrina (NE)

Ácido dihidroxifenilacético (DOPAC) Dihidroxifenilglicol (DHPG)

Si hay una disminución del cobre disponible (como en la enfermedad de Menkes o el OHS), la actividad de DBH disminuye, lo que resulta en niveles de norepinefrina disminuidos y de dopamina aumentados. También se afectan los sustratos y metabolitos de la dopamina (DA) y la norepinefrina (NE).

Los niveles de catecolaminas pueden ser informativos de los cambios en el metabolismo del cobre. A medida que cambia la actividad de una o más enzimas (como DBH), la proporción de metabolitos del sustrato a metabolitos del producto puede indicar la dirección del cambio. En algunos ejemplos, los aumentos en la actividad enzimática se reflejarán mediante disminuciones en la proporción de uno o más sustratos a sus productos. Asimismo, las disminuciones en la actividad enzimática se reflejarán en aumentos en la proporción de uno o más sustratos a su producto (como la proporción de dopamina a norepinefrina). Estas proporciones pueden ser proporciones de dos metabolitos o proporciones de relaciones complejas entre metabolitos. Además, los metabolitos no necesitan ser metabolitos directos producto-sustrato de enzimas específicas (o una enzima específica), pero pueden ser proporciones de dos o más metabolitos (como la proporción de DOPAC: DHPG o DA:NE).

En algunos ejemplos, la cantidad de una o más catecolaminas (expresada en concentración absoluta o relativa, o en una proporción de las mismas) se correlaciona con la actividad de DBH. Por tanto, algunos de los métodos proporcionados implican cuantificar una o más catecolaminas en una muestra biológica de un sujeto. Las catecolaminas incluyen compuestos que incluyen un grupo catecol (como las catecolaminas clásicas, por ejemplo, dopamina, norepinefrina y epinefrina). En ejemplos adicionales, las catecolaminas incluyen metabolitos o sustratos de las catecolaminas clásicas. En algunos ejemplos, las catecolaminas incluyen metabolitos de dopamina (por ejemplo, DOPAC, 3-metoxitiramina y ácido homovanílico) y metabolitos de norepinefrina (por ejemplo, DHP^g , normetanefrina, ácido 3,4-dihidroximandélico, ácido 3-metoxi-4-hidroximandélico y 3-metoxi-4-hidroxifeniletilenglicol). Los expertos en la técnica conocen métodos para determinar los niveles de catecolaminas. Estos métodos incluyen métodos fluorométricos, radioenzimáticos, inmunológicos (como radioinmunoensayo), electroforéticos, electroquímicos (como voltamperometría cíclica de barrido rápido) y cromatográficos (como cromatografía líquida de alta presión (HPLC)), o combinaciones de los mismos. Véase, por ejemplo, Raum, Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 247:E4-E12, 1984; Robinson y otros, Clin. Chem., 49: 1763-1773, 2003; Holmes y otros, J. Chromatogr. B Biomed. Appl. 653:131-138, 1994; Eisenhofer y otros, Clin. Chem. 32:2030-2033, 1986. En un ejemplo particular, los niveles de catecolaminas se determinan mediante cromatografía líquida de alta presión con detección electroquímica.

En algunos ejemplos, los niveles de catecolaminas se correlacionan con la actividad de DBH. En ejemplos particulares, las catecolaminas incluyen dopamina, norepinefrina, ácido dihidroxifenilacético (DOPAC), dihidroxifenilglicol (DHPG) o una combinación de dos o más de los mismos. Por ejemplo, los pacientes con trastornos del transporte de cobre relacionados con ATP7A tienen una actividad de DBH disminuida, que puede reflejarse en un aumento del sustrato de la enzima (como la dopamina) o un aumento de un metabolito del sustrato (como DOPAC, 3-metoxitiramina y ácido homovanílico) en comparación con un sujeto o población sana. En otros ejemplos, la actividad de DBH disminuida puede reflejarse en una disminución en un producto de la enzima (como la norepinefrina) o en una disminución en un metabolito del producto de la enzima (como DHPG, normetanefrina, ácido 3,4-dihidroximandélico, ácido 3-metoxi-4-hidroximandélico y 3-metoxi-4-hidroxifeniletilenglicol).

En ejemplos adicionales, una proporción de niveles de catecolaminas se correlaciona con la actividad de DBH. La actividad de DBH disminuida puede reflejarse en un aumento en la proporción de un sustrato de la enzima (como la dopamina) a un producto de la enzima (como la norepinefrina) en comparación con una muestra o población control normal o un valor de referencia. En otros ejemplos, la actividad de DBH disminuida se correlaciona con un aumento en la proporción de DOPAC a DHPG.

Salida de cobre celular

La ATP7A es responsable para el transporte de cobre a través de la membrana plasmática desde el citoplasma celular al ambiente externo. Como resultado, las células que expresan una ATP7A con actividad de transporte de cobre reducida o ausente acumulan cobre dentro de la célula y exhiben una salida de cobre celular reducida. En algunos ejemplos, la salida de cobre celular reducida puede usarse como un marcador bioquímico del metabolismo anormal del cobre.

Los métodos para determinar la salida de cobre celular son bien conocidos en la técnica. Clásicamente, la salida de cobre radiomarcado se mide en experimentos de persecución de pulsos que utiliza células aisladas (como fibroblastos o linfoblastos aislados), tales como células de un individuo que tiene la enfermedad de Menkes u OHS. Véase, por ejemplo, La Fontaine y otros, J. Biol. Chem. 273:31375-31380, 1998; Goka y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 73:604-606, 1976. En algunos ejemplos, las células (como las células de fibroblasto o linfoblastos) se incuban con cobre radioisotópico (como 64Cu o 67Cu) y se permite que las células absorban el cobre. La absorción de cobre por las células puede determinarse al medir el radioisótopo en las células (como, mediante recuento de centelleo). Una vez que el cobre celular está en equilibrio con el cobre extracelular, puede medirse la salida de cobre (como la pérdida de cobre de las células en un período de tiempo). En otros ejemplos, las células se cultivan en medio estándar y el cobre intracelular total se mide en células aisladas, por ejemplo, mediante espectroscopía de absorción atómica. La salida de cobre celular también puede reflejarse por la retención de cobre de las células. La retención de cobre es la cantidad de cobre que queda en las células (por ejemplo, células marcadas con cobre radioisotópico) después de un período de tiempo en el medio que carece del cobre radioisotópico.

Ejemplo 1

ATP7A de tamaño reducido con codones optimizados

Este ejemplo describe la construcción del ADNc de ATP7A de tamaño reducido con codones optimizados.

La secuencia de ATP7A de tamaño reducido con codones optimizados se generó a partir de la secuencia de ATP7A de tamaño reducido nativa (SEQ ID NO: 3) mediante el uso del software Codon Optimization (Integrated DNA Technologies, disponible en idtdna.com/CodonOpt). Los criterios usados para seleccionar la secuencia específica incluyeron baja complejidad, adecuación de codones, patrones de uso de codones y contexto de codones. La secuencia de SEQ ID NO: 1 se seleccionó para construir vectores y experimentos adicionales.

Ejemplo 2

Producción de AAV con ATP7A de tamaño reducido con codones optimizados

Este ejemplo describe la construcción de AAV que contiene el ADNc de ATP7A de tamaño reducido con codones optimizados y la expresión en células HEK293T.

La versión con codones optimizados de rs-ATP7A (co.rsATP7A; SEQ ID NO: 1) se sintetizó y se clonó en un vector de AAV9 que contenía los elementos promotores/potenciadores de CMV/CBA (figura 3). Se usó el método de triple transfección para producir AAV9 de alto título. Este método implicó la transfección transitoria de células HEK293T con tres plásmidos: uno que codifica el transgén más el promotor, flanqueado por repeticiones terminales invertidas (ITR), uno que codifica los genes rep y cap de AAV, y un plásmido auxiliar que proporciona la función de la proteína adenoviral. Antes de los estudios en animales, se evaluó la expresión de co.rsATP7A en células CHO y células HEK293T. Como se muestra en la figura 4, la transfección de células HEK293T con pTR-CAG-rsATP7A dio como resultado cantidades bajas, pero detectables, de proteína rsATP7A (carril 2, 25 |jg de proteína total cargada). Por el contrario, la transfección con la versión con codones optimizados (pTR-CAG-co-rsATP7A) dio como resultado una expresión génica aproximadamente 40 veces mayor (carril 3, 1,25 jg de proteína total cargada, carril 4, 25 jg de proteína total cargada) que la transfección con el constructo de rsATPA nativa (compare los carriles 2 y 4).

Ejemplo 3

co-rsATP7A mejora la supervivencia en un modelo de ratón de la enfermedad de Menkes

Este ejemplo describe la supervivencia en un modelo de ratón de la enfermedad de Menkes cuando se trata con corsATP7A de AAV9 en combinación con histidinato de cobre.

El co-rsATP7A de AAV9 descrito en el ejemplo 2 se administró a ratones C57BL/6-Atp7amo-br (ratones mo-br) mediante inyección intracerebroventricular. Los ratones se inyectaron bilateralmente en el segundo día de vida con 1,6x109 vg en 5 jL de solución de Ringer lactato. Algunos de los ratones también se trataron con histidinato de cobre (15 jg ) mediante inyección subcutánea durante la primera semana de vida (5 jg, d4-6). Aproximadamente el 70 % de los ratones tratados con la combinación de co-rsATP7A de AAV9 e histidinato de cobre sobrevivieron al menos 100 días (figura 5). Por el contrario, los ratones tratados con AAV9 solo y los ratones no tratados no sobrevivieron más de 20 días, y los ratones tratados con histidinato de cobre no sobrevivieron más allá de aproximadamente 28 días (figura 5).

También se ensayó la eficacia de diferentes serotipos de AAV en ratones mo-br. Todos mostraron una mayor supervivencia en comparación con los ratones no tratados, que no sobrevivieron al destete (figura 6). La co-rsATP7A de AAV9 mostró la mayor eficacia, con el 100 % de los ratones tratados que sobrevivieron al destete y el 70 % que mostró supervivencia a largo plazo (figura 6).

Ejemplo 4 Evaluación de ATP7A de tamaño reducido con codones optimizados en un modelo de ratón de la enfermedad de Menkes

Este ejemplo describe la prueba de la eficacia del AAV con ATP7A de tamaño reducido con codones optimizados en un modelo de ratón de la enfermedad de Menkes.

Los AAV descritos en el ejemplo 2 se administran a ratones C57BL/6-Atp7amo-br (ratones mo-br) mediante inyección intracerebroventricular. Los ratones se inyectan bilateralmente el segundo día de vida con dosis específicas de partículas virales (como las de la tabla 1) en 2 jL de solución de Ringer lactato. Algunos ratones también se tratan con histidinato de cobre mediante inyección subcutánea (dosis total de 15 jg ) durante la primera semana de vida. Los ratones de tipo salvaje se usan como controles en la mayoría de los casos, ya que los ratones mo-br no tratados mueren antes del destete.

Tabla 1. Dosis de virus y cobre y tiempo

Las pruebas neuroconductuales (prueba de suspensión de alambre, prueba de varilla giratoria y/o análisis de la marcha) se lleva a cabo en ratones mo-br tratados con AAV, ratones mo-br tratados con AAV más cobre y ratones de tipo salvaje a partir de aproximadamente el día 25 de vida. En la prueba de suspensión de alambre, los ratones se colocan en una rejilla de jaula de alambre a aproximadamente 50 cm por encima de una superficie blanda. El bastidor se invierte y se mide el tiempo que el ratón puede colgar del bastidor (tiempo máximo 60 segundos). La prueba puede repetirse hasta tres veces por sesión (un minuto de descanso entre pruebas) si el mouse no completa los 60 segundos completos.

En la prueba de varilla giratoria, los ratones se colocan sobre una varilla de 3,5 cm de diámetro. La varilla se gira a 4 rpm y se mide el tiempo que el ratón permanece en la varilla (tiempo máximo 60 segundos). La prueba puede repetirse hasta tres veces por sesión (un minuto de descanso entre pruebas) si el mouse no completa los 60 segundos completos. Los ratones se aclimatan a la varilla durante cuatro días consecutivos (de 21 a 24 días de edad) antes de que comience la prueba.

Se usa un análisis estadístico apropiado para determinar si existen diferencias estadísticamente significativas entre los grupos de tipo salvaje, tratados con AAV y tratados de forma simulada para los métodos de resultado clínico bioquímico y/o patológico. Las pruebas pueden incluir análisis de varianza no paramétrico unidireccional de Kruskal-Wallis. También pueden usarse pruebas adicionales, tales como la prueba t de Student o el análisis de rangos con signo de Wilcoxon, para las comparaciones por pares, según corresponda.

Los ratones mo-br no tratados no sobreviven después del destete, por lo que la supervivencia de ratones tratados es un indicador de la eficacia del tratamiento con AAV o AAV más cobre. Se espera que los ratones mo-br tratados supervivientes tengan potencialmente al menos una función motora o neurológica parcialmente reducida (por ejemplo, equilibrio y/o coordinación) en comparación con los ratones de tipo salvaje. Sin embargo, en algunos ejemplos, los ratones mo-br tratados supervivientes tienen poco o ningún déficit neurológico en comparación con los compañeros de camada no afectados.

Ejemplo 5

Neuropatología y bioquímica de ratones tratados con AAV

Este ejemplo describe la neuropatología y bioquímica de ratones tratados con el AAV con ATP7A de tamaño reducido con codones optimizados en un modelo de ratón de la enfermedad de Menkes.

Los ratones se tratan como se describe en los ejemplos 3 y 4. En algunos ejemplos, los ratones mo-br no tratados se usan para la comparación en los primeros momentos. La neuropatología se evalúa en secciones de cerebro mediante tinción con hematoxilina y eosina (H&E), inmunohistoquímica y/o microscopía electrónica. En algunos ejemplos, la muerte de las neuronas del hipocampo y/o el número de células de Purkinje se puntúan en secciones teñidas con H&E. La eficacia del tratamiento (AAV o AAV más cobre) puede estar indicada por la muerte celular reducida y/o un mayor número de células de Purkinje en comparación con los ratones mo-br no tratados (por ejemplo, en el día 12 de vida), y en algunos ejemplos puede ser comparable a la de los ratones tipo salvaje. En otros ejemplos, la mielinización se evalúa, por ejemplo, mediante tinción con azul Luxol rápido. Los niveles de mielinización (por ejemplo, en el cuerpo calloso) en ratones mo-br tratados similares a los observados en ratones de tipo salvaje son un indicador de la eficacia del tratamiento.

La neuroquímica del cerebro también se evalúa en ratones mo-br tratados, ratones mo-br no tratados, y/o ratones de tipo salvaje. Los niveles de cobre en cerebro se miden mediante absorción atómica en horno de grafito y se confirman mediante espectrometría de masas con plasma acoplado inductivamente, por ejemplo, como se describe en Lenn y otros (Mol. Genet. Metab. 91:30-36, 2007). Las concentraciones de ácido dihidroxifenilacético en cerebro (DOPAC) y dihidroxifenilglicol (DHPG) se determinan mediante cromatografía líquida de alta resolución con detección electroquímica en el sobrenadante de muestras de cerebro homogeneizadas en 5-10 volúmenes de ácido perclórico 0,4 N que contiene EDTA al 0,1 %. En algunos ejemplos, cantidades de cobre en el cerebro de al menos aproximadamente 50-75 % de las proporciones de tipo salvaje y/o DOPAC:DHPG que están disminuidas en comparación con los ratones mo-br no tratados son indicadores de la eficacia del tratamiento.

La actividad de enzimas dependientes de cobre tales como la Cu/Zn superóxido dismutasa (SOD1) o la citocromo c oxidasa (CCO) también puede determinarse en ratones tratados y de tipo salvaje, por ejemplo, como se describe en Prohaska (J. Nutr. 121:355-363, 1991). En algunos ejemplos, la actividad de CCO aumenta en los ratones mo-br tratados en comparación con los ratones mo-br no tratados.

Ejemplo 6

Estudios de toxicidad con rango de dosis en roedores

Este ejemplo describe un estudio de toxicidad ilustrativa de co-rsATP7A de AAV9 en un modelo de ratón con enfermedad de Menkes y ratas adultas.

El componente inicial de la evaluación preclínica de seguridad se centra en los ratones mo-br que sobreviven hasta el destete en estudios de prueba de concepto (POC) con rango de dosis. Esos estudios emplean un vector rAAV9 de grado de investigación que contiene co-rsATP7A sin secuencias adicionales (como etiquetas o genes marcadores) incorporadas. El componente de toxicología se centra en evaluaciones histopatológicas en tres ratones por grupo (supervivientes mutantes tratados con rAAV, tipo salvaje tratado con rAAV y tipo salvaje no tratado) por dosis a los 1, 3 y 6 meses de edad. La evaluación de las respuestas inflamatorias en el cerebro mediante inmunohistoquímica implica la tinción con anticuerpos contra la proteína ácida fibrilar glial (GFAP), CD-4, CD-8 e isolectina B4. Las copias del genoma viral se determinan en cerebro, así como en los órganos periféricos, incluidos hígado, riñones, pulmón, corazón y bazo para evaluar el escape viral del CNS.

No se conocen modelos animales grandes de la enfermedad de Menkes con los cuales evaluar la seguridad y eficacia de la terapia génica de rAAV. Por lo tanto, se lleva a cabo un estudio de toxicidad de rango de dosis de 12 meses en ratas adultas macho de tipo salvaje (ya que la enfermedad diana es un rasgo recesivo ligado al cromosoma X). Para este y los componentes posteriores de la evaluación de seguridad, se usa material rAAV de grado clínico. Todos los componentes esenciales del constructo co-rsATP7A usado en rAAV de grado de investigación anterior se retienen y cualquier etiqueta de gen reportero (por ejemplo, hemaglutinina) se escinde. El nuevo constructo está secuenciado en su totalidad. El material comparable al proceso GMP para rAAV9-co-rsATP7A se obtiene del UPenn Clinical Vector Core Laboratory o de la Instalación de Producción de Vectores de AVV de Voyager Therapeutics, al menos inicialmente.

La dosis designada de co-rsATP7A de rAAV9 se administra a los ventrículos laterales izquierdos de ratas Sprague-Dawley adultas macho después de la colocación del catéter ICV. La evaluación de seguridad incluye observación clínica, peso corporal, análisis de sangre de rutina, respuesta inmune, patología de órganos macroscópicos e histopatología. Al inicio del estudio y a los 30, 90, 180 y 360 días después de la administración del vector, se obtienen hemogramas completos (CBC) y químicas en suero. Los anticuerpos neutralizantes en suero y CSF contra la cápside de AAV y el transgén de ATP7A y las respuestas de células T antes y después del tratamiento se cuantifican, mediante el uso de métodos bien establecidos (por ejemplo, Martino y otros, Methods Mol. Biol. 807:259-272, 2011). El CSF se obtiene por muestreo de cisterna magna bajo sedación mediante el uso de un método que minimiza el riesgo de contaminación con sangre (Pegg y otros, J. Neurosci. Methods 187:8-12, 2010). Las ratas se sacrifican en el tiempo de detección del pico del vector esperado (una semana) y en puntos de tiempo posteriores (1, 3, 6 y 12 meses) para evaluar el aclaramiento tisular del vector. El cerebro, hígado, riñones, pulmón, corazón, bazo y gónadas se analizan para histopatología, y se usa PCR cuantitativa para analizar los tejidos en busca de secuencias de vectores (mínimo de tres muestras por tejido). Una muestra de cada tejido incluirá una espiga de ADN control con una cantidad conocida de genomas de vector, como control de calidad para qPCR. Se analizan seis ratas por grupo (tratadas con AAV, tratadas de forma simulada, no tratadas) por punto de tiempo.

En el estudio de toxicología en ratas, la evaluación estadística del CBC y los resultados de la química en suero usará ANOVA con el grupo de tratamiento (tratado con AAV, tratado de forma simulada, no tratado) como factores y el tiempo como covariable. Dado que hay >20 variables dependientes, P <0,01 se usará para establecer diferencias estadísticamente significativas entre los grupos de tratamiento y control para minimizar la posibilidad de rechazar incorrectamente la hipótesis nula.

Ejemplo 7

Estudio de toxicidad en primates no humanos

Este ejemplo describe estudios para la evaluación de la toxicidad de co-rsATP7A de AAV9 en primates no humanos.

Se evalúa la seguridad, biodistribución, inmunogenicidad y genotoxicidad potencial de rAAV9-co-rsATP7A en primates no humanos machos (NHP). En esta fase, la dosis más alta previamente determinada que es segura en roedores se escala en base al tamaño estimado del cerebro de NHP y del volumen de CSF. Esta dosis ajustada se administra a los ventrículos laterales izquierdos de macacos rhesus machos jóvenes (<4 años) mediante el uso de un enfoque guiado por MRI para la colocación del catéter intraventricular (Salegio y otros, Adv. Drug Deliv. Rev.

64:598-604, 2012). Las evaluaciones se realizan al inicio del estudio (menos de 2 semanas antes de la cirugía) y 3,

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Una molécula de ácido nucleico con codones optimizados aislada que codifica una proteína ATPasa de tipo P transportadora de cobre ATPasa 1 (ATP7A) de tamaño reducido que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, opcionalmente en donde la molécula de ácido nucleico con codones optimizados codifica una proteína ATP7A que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

2. Un vector que comprende una molécula de ácido nucleico con codones optimizados aislada que codifica una proteína ATPasa de tipo P transportadora de cobre ATPasa 1 (ATP7A) de tamaño reducido que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, opcionalmente en donde la molécula de ácido nucleico con codones optimizados codifica una proteína ATP7A que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

3. El vector de la reivindicación 2, en donde la molécula de ácido nucleico con codones optimizados está operativamente unida a un promotor.

4. El vector de la reivindicación 2 o 3, en donde el vector es un vector de virus adenoasociado (AAV), opcionalmente un vector de AAV serotipo 9 (AAV9) o un vector de AAV serotipo 5 (AAV5).

5. Una célula huésped o un virus aislados que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1 o el vector de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4.

6. Una composición que comprende el vector de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4 o el virus de la reivindicación 5 y un portador farmacéuticamente aceptable, opcionalmente formulado para inyección intracerebral, intratecal o intravenosa.

7. Una composición que comprende un vector o virus que comprende una molécula de ácido nucleico con codones optimizados aislada que codifica una proteína ATPasa de tipo P transportadora de cobre ATPasa 1 (ATP7A) de tamaño reducido que comprende la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 operativamente unida a un promotor; y un portador farmacéuticamente aceptable para el uso en el tratamiento de un sujeto con un trastorno del transporte de cobre relacionado con ATPasa de tipo P transportadora de cobre ATPasa 1 (ATP7A).

8. La composición para uso de la reivindicación 7, en donde el vector o virus es un vector de virus adenoasociado (AAV), opcionalmente un vector de AAV serotipo 9 (AAV9) o un vector de AAV serotipo 5 (AAV5).

9. La composición para el uso de la reivindicación 7 u 8, en donde la composición se administra al sujeto por vía intratecal, intracerebral o intravenosa, opcionalmente en una sola dosis o en múltiples dosis.

10. La composición para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en donde el trastorno del transporte de cobre relacionado con APT7A comprende la enfermedad de Menkes, el síndrome del cuerno occipital o la neuropatía motora distal relacionada con ATP7A.

11. La composición para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, que comprende además administrar cobre al sujeto, en donde opcionalmente el cobre se administra por vía subcutánea, intramuscular o intravenosa.

12. La composición para el uso de la reivindicación 11, en donde el cobre es cloruro de cobre, gluconato de cobre, histidina de cobre, histidinato de cobre o sulfato de cobre.

13. La composición para el uso de la reivindicación 11 o 12, en donde la composición y el cobre se administran al sujeto de forma secuencial, sustancialmente de forma simultánea o de forma simultánea.

14. La composición para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en donde la administración del cobre comprende la administración de múltiples dosis de cobre, opcionalmente en donde las múltiples dosis comprenden la administración diaria durante un período de hasta aproximadamente tres años.

15. La composición para el uso de la reivindicación 14, en donde el cobre se administra dos veces al día si el sujeto tiene menos de 12 meses de edad o el cobre se administra una vez al día si el sujeto tiene más de 12 meses de edad.