ES2880084T3

ES2880084T3 - Terapias que usan células adiposas y secreciones celulares

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Publication number: ES2880084T3
Application number: ES19153401T
Authority: ES
Inventors: Graham Vesey; Rebecca Anne Webster; Richard Lilischkis
Original assignee: Cell Ideas Pty Ltd
Current assignee: Cell Ideas Pty Ltd
Priority date: 2011-09-23
Filing date: 2012-09-21
Publication date: 2021-11-23
Anticipated expiration: 2032-09-21
Also published as: SG10201606745XA; US20200261510A1; JP6162123B2; JP2022033865A; EP3546569A1; CA2885487A1; EP3546569B1; US20190015455A1; EP2744892B1; JP6839038B2; EP3868871A1; ES2721180T3; JP2019142971A; US10660921B2; JP2017193566A; JP6912512B2; US10111909B2; WO2013040649A1; EP2744892A4; CA2885487C

Abstract

Una composición congelada que comprende células progenie provenientes del cultivo de células con múltiples subcultivos de una suspensión celular derivada de tejido adiposo y secreciones celulares derivadas de tejido adiposo, en donde dichas secreciones comprenden medios clarificados y/o concentrados de cultivo de células derivadas de tejido adiposo que han surgido como células progenie o una línea celular del cultivo previo para su uso en el tratamiento del dolor en un sujeto mamífero, en donde la composición se administra a un sujeto después de descongelar la composición.

Description

DESCRIPCIÓN

Terapias que usan células adiposas y secreciones celulares

Campo técnico

La presente invención se refiere a composiciones que comprenden (i) secreciones celulares derivadas de tejido adiposo o (ii) una suspensión celular derivada de tejido adiposo, que comprende opcionalmente adipocitos o (iii) una combinación de secreciones celulares derivadas de tejido adiposo y una suspensión celular derivada de tejido adiposo, que comprende opcionalmente adipocitos, y su uso en composiciones farmacéuticas y métodos para el tratamiento de diversas afecciones tales como trastornos inflamatorios, lesiones del ligamento, lesiones de tendones o para aliviar el dolor asociado con tales afecciones, un trastorno inflamatorio, una lesión del ligamento o una lesión del tendón, en un sujeto mamífero. Las composiciones se administran en un sitio de un paciente alejado del sitio afectado por el trastorno o afección inflamatoria. La invención también se refiere al uso de tales composiciones en composiciones farmacéuticas para el tratamiento o prevención de enfermedades en un animal de ganadería intensiva, en donde dicha administración es por inyección subcutánea o intramuscular. La invención también se refiere al tratamiento del dolor en un sujeto, siendo el tratamiento mediante inyección subcutánea o inyección intramuscular. La invención también se refiere al tratamiento del dolor neuropático en un sujeto. También se describen métodos, agentes y composiciones mejorados para la crioconservación de células.

Antecedentes de la invención

El tejido adiposo contiene una población celular de grandes adipocitos llenos de lípidos y una población de células no adipocitarias, que comprende células asociadas con diversas fibras conectivas y células asociadas con capilares y vasos sanguíneos más grandes. También se cree que la población de células no adipocitarias comprende una población de células madre adultas derivadas de tejido adiposo y, en consecuencia, ha habido interés en usar tejido adiposo como una fuente de células madre aisladas para diversas aplicaciones terapéuticas.

En general, los métodos para obtener presuntas células madre derivadas de tejido adiposo implican el agotamiento de adipocitos de células no adipocitarias derivadas de tejido adiposo, lo que requiere digerir el tejido adiposo con enzimas tales como la colagenasa y después separar las células liberadas al centrifugar la muestra digerida. Durante la centrifugación, las células no adipocitarias derivadas de tejido adiposo se separan de los adipocitos para formar un sedimento, mientras que los adipocitos que contienen lípidos flotan. La fracción de células no adipocitarias se usa después como fuente de células madre tisulares.

Los presentes inventores han descrito anteriormente el uso de una suspensión celular derivada de tejido adiposo que comprende adipocitos para la preparación de una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de un trastorno inflamatorio o el alivio del dolor asociado con un trastorno inflamatorio en un sujeto, y para el tratamiento y alivio del dolor de afecciones tales como trastornos del cartílago o de los huesos. Esto se describe en la solicitud de patente australiana núm. 2009201915 y en la publicación internacional núm. WO2010/020005. Los presentes inventores también han descrito anteriormente el uso de secreciones celulares derivadas de tejido adiposo para la preparación de composiciones para su uso en el tratamiento de diversas afecciones y enfermedades, incluido el alivio del dolor asociado con tales afecciones.

Las generaciones de reproducción selectiva de animales para ciertos rasgos deseables, tales como el crecimiento rápido, la conversión eficiente del alimento y la acumulación de masa muscular en animales criados para la producción de carne, o la calidad y el volumen de la leche en los animales lecheros, también han dado lugar a que las razas modernas de animales frecuentemente sean propensas a una mayor incidencia de afecciones de salud perjudiciales que los animales reproducidos o seleccionados de forma menos intensiva, tales como las poblaciones silvestres. La incidencia clínica o el efecto de tales rasgos perjudiciales puede verse exacerbado por la forma en que se crían los animales, tal como en las operaciones de ganadería intensiva. Las razas de cerdos modernas, criadas en condiciones intensivas, por ejemplo, son propensas a la debilidad de las patas, tales como la osteocondrosis (OCD), la artritis, un alto riesgo de infección bacteriana clínica y subclínica, todo lo cual tiene el potencial de afectar negativamente al bienestar general del animal y, por tanto, afectar negativamente a la operación de ganadería. El documento WO2010020005 describe un uso de una suspensión celular derivada de tejido adiposo que comprende adipocitos para la preparación de una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de un trastorno inflamatorio, un trastorno del cartílago o del hueso y/o el alivio del dolor asociado con un trastorno inflamatorio en un sujeto mamífero.

El documento WO2005035742 describe composiciones de células madre que tienen ventajas terapéuticas y prácticas significativas, así como también métodos para preparar y usar tales composiciones para el tratamiento y prevención de lesiones y enfermedades en pacientes.

El documento WO03040346 describe células, composiciones y métodos basados en el uso de células estromales para apoyar la proliferación de células madre adultas o embrionarias indiferenciadas in vitro.

El documento WO03053346A2 describe métodos de tratamiento de pacientes que incluyen procesar tejido adiposo para suministrar una cantidad concentrada de células madre obtenidas del tejido adiposo a un paciente.

A. WILSON ET AL, CELL PROLIFERATION, (2010), vol. 44, no. 1, páginas 86 - 98, describe células madre derivadas de tejido adiposo para aplicaciones clínicas.

JAEWOO PAK, JOURNAL OF MEDICAL CASE REPORTS, BIOMED CENTRAL LTD, LO, (2011), vol. 5, núm. 1, página 296, describe la regeneración de huesos humanos en osteonecrosis de cadera y cartílago humano en osteoartritis de rodilla con células madre autólogas derivadas de tejido adiposo. Permanece la necesidad de métodos mejorados para el tratamiento de afecciones inflamatorias, lesiones del ligamento y tendones y composiciones para su uso en los mismos. Permanece la necesidad de métodos mejorados para el tratamiento y la prevención de afecciones perjudiciales asociadas con la ganadería intensiva de animales. Permanece la necesidad de tratar el dolor en un sujeto y de composiciones para el uso en los mismos.

Resumen de la invención

Los métodos descritos previamente para el tratamiento de trastornos inflamatorios con el uso de suspensiones celulares derivadas de tejido adiposo y composiciones libres de células enseñan la administración de la composición o suspensión al área afectada, tal como por inyección intraarticular en el caso de una articulación artrítica. Sorprendentemente, el inventor ha identificado ahora que no se requiere la administración directa de la composición terapéutica al área afectada. El inventor ha identificado sorprendentemente que la administración alejada de una composición que comprende secreciones de una suspensión celular derivada de tejido adiposo o de una composición que comprende una suspensión celular derivada de tejido adiposo, que comprende opcionalmente adipocitos, o de una combinación de los mismos, también puede ser eficaz en el tratamiento de tales afecciones. Los inventores han identificado sorprendentemente que las células madre congeladas, tales como las células madre mesenquimales, tales como las células madre derivadas de tejido adiposo, pueden usarse como agentes terapéuticos en el tratamiento de diversas afecciones. Sorprendentemente, tales células congeladas pueden usarse sin la necesidad de cultivar las células después de su recuperación del almacenamiento congelado. Los inventores también han identificado que el almacenamiento de células en presencia de secreciones derivadas de células mejora la viabilidad y el potencial de proliferación de las células madre crioconservadas, incluidas las células derivadas de tejido adiposo.

La invención se define con referencia a las reivindicaciones adjuntas.

Se describe un método de tratamiento de una afección seleccionada del grupo que consiste en un trastorno inflamatorio, una lesión del ligamento y una lesión del tendón, o para aliviar el dolor asociado con un trastorno inflamatorio, una lesión del ligamento o una lesión del tendón, en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una composición farmacéutica que comprende (i) secreciones celulares derivadas de tejido adiposo, o (ii) una suspensión celular derivada de tejido adiposo, que comprende opcionalmente adipocitos o (iii) una combinación de (i) y (ii), en donde dicha la administración a dicho sujeto se realiza en un sitio alejado del sitio de dicha afección. En un aspecto el sujeto es un sujeto mamífero. En un aspecto la suspensión celular derivada de tejido adiposo, que comprende opcionalmente adipocitos, comprende agregados de células y/o comprende trozos de tejido adiposo. En un aspecto la suspensión celular comprende adipocitos. En un aspecto la suspensión celular está sustancialmente libre de adipocitos. En un aspecto las secreciones celulares derivadas de tejido adiposo comprenden un portador líquido seleccionado de medio de cultivo celular y agua destilada. En un aspecto una suspensión celular derivada de tejido adiposo, que comprende opcionalmente adipocitos, o una combinación de secreciones celulares derivadas de tejido adiposo y una suspensión celular derivada de tejido adiposo, que comprende opcionalmente adipocitos, comprende un portador líquido que es un medio de cultivo celular, tal como DMEM.

En un aspecto el trastorno o afección inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en osteoartritis, enfermedad de la sofocación, temblores, una lesión del tendón y una lesión del ligamento. En un aspecto el trastorno inflamatorio es dermatitis atópica. En un aspecto el trastorno o afección inflamatoria se selecciona del grupo que consiste en artritis reumatoide, dolor de espalda y esclerosis múltiple. En un aspecto el trastorno o afección inflamatoria es una enfermedad impulsada por el sistema inmunitario. En un aspecto el método comprende la administración de secreciones celulares derivadas de tejido adiposo. En un aspecto el método comprende la administración de una suspensión celular derivada de tejido adiposo. En un aspecto la administración es administración subcutánea. En un aspecto la administración es administración intramuscular. En un aspecto la administración es en el anca, el brazo o las nalgas. En un aspecto la administración es en el cuello del sujeto, tal como el cogote del sujeto, tal como el pescuezo cuando el sujeto es un perro o un gato.

En un segundo aspecto se proporciona un método de tratamiento de una enfermedad o afección articular en un sujeto, el método comprende administrar al sujeto una composición farmacéutica que comprende (i) secreciones celulares derivadas de tejido adiposo, o (ii) una suspensión celular derivada de tejido adiposo, que comprende opcionalmente adipocitos, o (iii) una combinación de (i) y (ii), en donde dicha administración a dicho sujeto es en un sitio alejado del sitio de dicha afección. En un aspecto el sujeto es un sujeto mamífero. En un aspecto la suspensión celular derivada de tejido adiposo, que comprende opcionalmente adipocitos, comprende agregados de células y/o comprende trozos de tejido adiposo. En un aspecto las secreciones celulares derivadas de tejido adiposo comprenden un portador líquido seleccionado de medio de cultivo celular y agua destilada. En un aspecto una suspensión celular derivada de tejido adiposo, que comprende opcionalmente adipocitos, o una combinación de secreciones celulares derivadas de tejido adiposo y una suspensión celular derivada de tejido adiposo, que comprende opcionalmente adipocitos, comprende un portador líquido que es un medio de cultivo celular, tal como DMEM. En un aspecto el tratamiento comprende administrar una composición farmacéutica que comprende una suspensión celular derivada de tejido adiposo a dicho mamífero mediante inyección subcutánea. En un aspecto la suspensión celular administrada por vía subcutánea está sustancialmente libre de adipocitos. En un aspecto la suspensión celular administrada por vía subcutánea comprende adipocitos.

El sujeto mamífero puede ser un animal equino, felino, canino, bovino o porcino. El sujeto puede ser un ser humano. El sujeto puede ser aves de corral.

La administración puede ser administración subcutánea. En un aspecto la administración es administración intramuscular. En un aspecto la administración es en el anca, el brazo o las nalgas. En un aspecto la administración es en el cuello del sujeto, tal como el cogote del sujeto, tal como el pescuezo cuando el sujeto es un perro o un gato. Se describe además un método para el tratamiento o prevención de una enfermedad en un animal de ganadería intensiva, el método comprende administrar al animal una composición farmacéutica que comprende (i) secreciones celulares derivadas de tejido adiposo, o (ii) una suspensión celular derivada de tejido adiposo, que comprende opcionalmente adipocitos, o (iii) una combinación de secreciones celulares derivadas de tejido adiposo y una suspensión celular derivada de tejido adiposo, que comprende opcionalmente adipocitos, en donde dicha administración es por inyección subcutánea o inyección intramuscular.

En un aspecto la enfermedad de un animal de ganadería intensiva es una enfermedad del desarrollo ortopédico. En un aspecto la enfermedad de un animal de ganadería intensiva se selecciona del grupo que consiste en debilidad de las patas, cojera, artritis, enfermedades del desarrollo e infección bacteriana. En un aspecto la enfermedad del desarrollo es la osteocondrosis (OCD).

En un aspecto la composición farmacéutica se administra a un animal antes del inicio de los síntomas clínicos de la enfermedad. En un aspecto, el animal de ganadería intensiva es un cerdo y la composición farmacéutica se administra antes del inicio de los síntomas clínicos de la enfermedad del desarrollo ortopédica, tal como la osteocondrosis.

En un aspecto el animal de ganadería intensiva se selecciona del grupo que consiste en cerdos, bovinos, ovinos y aves de corral.

En un aspecto el animal de ganadería intensiva es una hembra reproductora. En un aspecto el animal de ganadería intensiva es una hembra preñada. En un aspecto el animal es una cerda preñada. En un aspecto la cerda preñada tiene síntomas clínicos de osteocondrosis o artritis.

En un aspecto la administración es administración subcutánea. En un aspecto la administración es administración intramuscular. En un aspecto la administración es en el cuello del sujeto, tal como el cogote del sujeto.

Las secreciones celulares derivadas de tejido adiposo pueden prepararse a partir de una suspensión celular derivada de tejido adiposo. En un aspecto la suspensión celular derivada de tejido adiposo está sustancialmente libre de adipocitos. La suspensión celular derivada de tejido adiposo puede comprender además adipocitos. La suspensión celular derivada de tejido adiposo puede comprender adipocitos maduros. Las secreciones celulares derivadas de tejido adiposo pueden prepararse mediante cultivo de suspensión celular derivada de tejido adiposo. La suspensión celular derivada de tejido adiposo puede estar sustancialmente libre de adipocitos. La suspensión celular derivada de tejido adiposo puede comprender además adipocitos. En un aspecto la suspensión celular derivada de tejido adiposo, que comprende opcionalmente adipocitos, comprende agregados de células y/o comprende trozos de tejido adiposo.

La suspensión celular derivada de tejido adiposo puede prepararse mediante un método que comprende la eliminación de (i) parte del contenido de adipocitos o (ii) sustancialmente todo el contenido de adipocitos durante la preparación de la suspensión celular derivada de tejido adiposo.

En un aspecto las secreciones celulares derivadas de tejido adiposo son una preparación concentrada. En un aspecto la preparación concentrada se concentra en comparación con las secreciones celulares cosechadas inicialmente de las suspensiones celulares derivadas de tejido adiposo o el cultivo de las mismas. En un aspecto, las secreciones celulares derivadas de tejido adiposo son una preparación concentrada entre aproximadamente 2 veces y aproximadamente 20 veces. En un aspecto las secreciones celulares derivadas de tejido adiposo son una preparación concentrada en aproximadamente 10 veces.

En un aspecto las secreciones celulares derivadas de tejido adiposo son de origen bovino, canino, porcino o equino. En un aspecto las secreciones celulares derivadas de tejido adiposo son de origen humano.

En un aspecto las secreciones celulares derivadas de tejido adiposo se derivan del tejido adiposo autólogo del sujeto o animal receptor. En un aspecto las secreciones celulares derivadas de tejido adiposo se derivan de tejido adiposo alogénico para el sujeto o animal receptor. En un aspecto las secreciones celulares derivadas de tejido adiposo se derivan de tejido adiposo xenogénico para el sujeto o animal receptor.

En un aspecto la suspensión celular derivada de tejido adiposo, que comprende opcionalmente adipocitos comprende adipocitos maduros.

En un aspecto la suspensión celular derivada de tejido adiposo, que comprende opcionalmente adipocitos es de origen bovino, canino, porcino o equino. En un aspecto la suspensión celular derivada de tejido adiposo, que comprende opcionalmente adipocitos se deriva de tejido adiposo autólogo al sujeto o animal receptor. En un aspecto, la suspensión celular derivada de tejido adiposo, que comprende opcionalmente adipocitos se deriva de tejido adiposo alogénico al sujeto o animal receptor. En un aspecto, la suspensión celular derivada de tejido adiposo, que comprende opcionalmente adipocitos se deriva de tejido adiposo xenogénico al sujeto o animal receptor.

En un aspecto la suspensión celular derivada de tejido adiposo, que comprende opcionalmente adipocitos es una suspensión de células obtenida por expansión celular en cultivo.

En un aspecto las secreciones celulares derivadas de tejido adiposo, o una composición farmacéutica de las mismas se almacenan congeladas antes de la administración.

En un aspecto la suspensión celular derivada de tejido adiposo, que comprende opcionalmente adipocitos, o una composición farmacéutica de los mismos, se almacena congelada antes de la administración.

En un aspecto, las secreciones celulares derivadas de tejido adiposo en combinación con una suspensión celular derivada de tejido adiposo, que comprende opcionalmente adipocitos, o una composición farmacéutica de las mismas se almacenan congeladas antes de la administración. En un aspecto las secreciones celulares en dicha combinación son una preparación concentrada. En un aspecto la preparación se concentra entre 2 y 20 veces en comparación con las secreciones antes de la concentración.

En un aspecto el método comprende además (i) descongelar secreciones celulares derivadas de tejido adiposo congeladas, o (ii) descongelar una suspensión celular derivada de tejido adiposo congelada, que comprende opcionalmente adipocitos, o (iii) descongelar una combinación congelada de secreciones celulares derivadas de tejido adiposo y una suspensión celular derivada de tejido adiposo, que comprende opcionalmente adipocitos, o (iv) descongelar una composición farmacéutica congelada de cualquiera de (i), (ii) o (iii), antes de la administración al sujeto o animal receptor.

En un aspecto las secreciones congeladas, la suspensión celular, la combinación de las mismas o la composición farmacéutica de las mismas, se administra al sujeto o animal receptor poco después de la descongelación, tal como dentro de aproximadamente 10 minutos después de la descongelación, o dentro de aproximadamente 20 minutos después de la descongelación, o dentro de aproximadamente 30 minutos después de la descongelación o dentro de aproximadamente una hora después de la descongelación o dentro de aproximadamente dos horas después de la descongelación.

En un aspecto el método comprende además combinar (i) una composición que comprende secreciones celulares derivadas de tejido adiposo y (ii) una suspensión celular derivada de tejido adiposo, que comprende opcionalmente adipocitos, antes de administrar dicha combinación al sujeto o animal receptor. En un aspecto dicha combinación se produce dentro de las 2 horas antes de dicha administración. En un aspecto una o ambas de dicha composición que comprende secreciones celulares derivadas de tejido adiposo y dicha suspensión celular derivada de tejido adiposo, que comprende opcionalmente adipocitos, se almacena congelada antes de dicha combinación. En un aspecto adicional la composición que comprende secreciones celulares derivadas de tejido adiposo y dicha suspensión celular derivada de tejido adiposo, que comprende opcionalmente adipocitos, se mezclan entre sí antes de congelar la composición.

En un aspecto la composición farmacéutica es una composición veterinaria y el sujeto es un animal no humano. También se describe el uso de (i) secreciones celulares derivadas de tejido adiposo, o (ii) una suspensión celular derivada de tejido adiposo, que comprende opcionalmente adipocitos, o (iii) una combinación de (i) y (ii), para la preparación de una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de una afección seleccionada del grupo que consiste en un trastorno inflamatorio, una lesión del ligamento y una lesión del tendón, o para aliviar el dolor asociado con un trastorno inflamatorio, una lesión del ligamento o una lesión del tendón, en un sujeto mamífero, en donde la composición es adecuada para la administración en un sitio de dicho sujeto alejado del sitio de dicha afección.

En un quinto aspecto se proporciona el uso de (i) secreciones celulares derivadas de tejido adiposo, o (ii) una suspensión celular derivada de tejido adiposo, que comprende opcionalmente adipocitos, o (iii) una combinación de (i) y (ii), para la preparación de una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de una enfermedad o afección articular en un sujeto mamífero, en donde la composición es adecuada para la administración en un sitio de dicho sujeto alejado del sitio de dicha afección. En un aspecto la suspensión celular derivada de tejido adiposo, que comprende opcionalmente adipocitos, comprende agregados de células y/o comprende trozos de tejido adiposo. En un aspecto la suspensión celular derivada de tejido adiposo está sustancialmente libre de adipocitos. En un aspecto la suspensión celular derivada de tejido adiposo comprende adipocitos.

Se describe además el uso de (i) secreciones celulares derivadas de tejido adiposo, o (ii) una suspensión celular derivada de tejido adiposo, que comprende opcionalmente adipocitos, o (iii) una combinación de (i) y (ii), para la preparación de una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades en un animal de ganadería intensiva, en donde la composición es adecuada para inyección subcutánea o inyección intramuscular.

Además se describe una composición que comprende (i) secreciones celulares derivadas de tejido adiposo, o (ii) una suspensión celular derivada de tejido adiposo, que comprende opcionalmente adipocitos, o (iii) una combinación de (i) y (ii), para el tratamiento de una afección seleccionada del grupo que consiste en un trastorno inflamatorio, una lesión del ligamento y una lesión del tendón, o para aliviar el dolor asociado con un trastorno inflamatorio, una lesión del ligamento o una lesión del tendón, en donde la composición se administra en un sitio de un sujeto alejado del sitio afectado por la afección. En un aspecto la composición es una composición inyectable. En un aspecto la administración es mediante inyección subcutánea o inyección intramuscular.

También se describe una composición que comprende (i) secreciones celulares derivadas de tejido adiposo, o (ii) una suspensión celular derivada de tejido adiposo, que comprende opcionalmente adipocitos, o (iii) una combinación de (i) y (ii), para tratamiento de una enfermedad o afección articular en un sujeto mamífero, en donde dicha composición se administra en un sitio de dicho sujeto alejado del sitio de dicha afección. En un aspecto la suspensión celular derivada de tejido adiposo, que comprende opcionalmente adipocitos, comprende agregados de células y/o comprende trozos de tejido adiposo. En un aspecto la suspensión celular derivada de tejido adiposo está sustancialmente libre de adipocitos. En un aspecto la suspensión celular derivada de tejido adiposo comprende adipocitos.

Se describe además una composición que comprende (i) secreciones celulares derivadas de tejido adiposo, o (ii) una suspensión celular derivada de tejido adiposo, que comprende opcionalmente adipocitos, o (iii) una combinación de (i) y (ii), para tratamiento o prevención de una enfermedad en un animal de ganadería intensiva, en donde en dicho tratamiento o prevención la composición se administra mediante inyección subcutánea o inyección intramuscular.

También se describe una composición farmacéutica que comprende (i) secreciones celulares derivadas de tejido adiposo, o (ii) una suspensión celular derivada de tejido adiposo, que comprende opcionalmente adipocitos, o (iii) una combinación de (i) y (ii), junto con un portador, diluyente, excipiente o adyuvante farmacéuticamente aceptable. En un aspecto la composición que comprende secreciones celulares derivadas de tejido adiposo comprende además adipocitos. En un aspecto la composición es una composición congelada.

Además, se describe un kit que comprende (a) una composición farmacéutica seleccionada del grupo que consiste en (i) una composición que comprende secreciones derivadas de tejido adiposo, (ii) una composición que comprende una suspensión celular derivada de tejido adiposo, que comprende opcionalmente adipocitos, y (iii) una combinación de (i) y (ii); e (b) instrucciones para el uso de dicho kit en el tratamiento de una afección seleccionada del grupo que consiste en un trastorno inflamatorio, una lesión del ligamento y una lesión del tendón, o para aliviar el dolor asociado con un trastorno inflamatorio, una lesión del ligamento o una lesión del tendón, en donde dicho tratamiento comprende la administración de dicha composición farmacéutica a un sitio en un sujeto alejado del sitio afectado por la afección.

Se describe además un kit que comprende (a) una composición farmacéutica seleccionada del grupo que consiste en (i) una composición que comprende secreciones derivadas de tejido adiposo, (ii) una composición que comprende una suspensión celular derivada de tejido adiposo, que comprende opcionalmente adipocitos, y (iii) una combinación de (i) y (ii); e (b) instrucciones para el uso de dicho kit en el tratamiento de una enfermedad o afección articular en un sujeto mamífero, en donde dicho tratamiento comprende la administración de dicha composición farmacéutica a un sitio en un sujeto alejado de la articulación que padece la enfermedad o afección articular. En un aspecto la suspensión celular derivada de tejido adiposo, que comprende opcionalmente adipocitos, comprende agregados de células y/o comprende trozos de tejido adiposo. En un aspecto la suspensión celular derivada de tejido adiposo está sustancialmente libre de adipocitos. En un aspecto la suspensión celular derivada de tejido adiposo comprende adipocitos.

Además, se describe un kit que comprende (a) una composición farmacéutica seleccionada del grupo que consiste en (i) una composición que comprende secreciones derivadas de tejido adiposo, (ii) una composición que comprende una suspensión celular derivada de tejido adiposo, que comprende opcionalmente adipocitos, y (iii) una combinación de (i) y (ii); e (b) instrucciones para el uso de dicho kit en el tratamiento o prevención de enfermedades en un animal de ganadería intensiva, en donde en dicho tratamiento o prevención la composición se administra mediante inyección subcutánea o inyección intramuscular.

El kit puede comprender una o más composiciones congeladas. En un aspecto el kit comprende instrucciones para combinar una composición que comprende secreciones derivadas de tejido adiposo y una composición que comprende una suspensión celular derivada de tejido adiposo, que comprende opcionalmente adipocitos, antes de la administración de una composición combinada. En un aspecto el kit comprende además uno o más dispositivos de inyección, tales como una o más jeringas. En un aspecto el dispositivo de inyección contiene una composición del kit.

Se describe además un método para aliviar el dolor en un sujeto mamífero, el método comprende administrar al sujeto una composición farmacéutica que comprende (i) secreciones celulares derivadas de tejido adiposo, o (ii) una suspensión celular derivada de tejido adiposo, que comprende opcionalmente adipocitos, o (iii) una combinación de (i) y (ii), en donde dicha administración a dicho sujeto es por inyección intramuscular o por inyección subcutánea o por una forma apropiada de administración en o cerca de un sitio del dolor. En un aspecto el dolor está asociado con una afección seleccionada del grupo que consiste en un trastorno inflamatorio, una lesión del ligamento y una lesión del tendón. En un aspecto el dolor está asociado con osteoartritis, enfermedad de la sofocación, bamboleo, una lesión del tendón o una lesión del ligamento. En un aspecto el dolor se asocia con dermatitis atópica. En un aspecto el dolor está asociado con artritis reumatoide, dolor de espalda o esclerosis múltiple. En un aspecto el dolor está asociado con una afección seleccionada del grupo que consiste en debilidad en las piernas, cojera, artritis, enfermedades del desarrollo e infección bacteriana. En un aspecto el dolor se asocia con osteocondrosis (OCD). En un aspecto, el dolor se asocia con una quemadura. En un aspecto, el dolor es dolor de cuello u hombro, trastorno asociado al latigazo cervical o síndrome de dolor regional complejo. En un aspecto el dolor es dolor de espalda. En un aspecto el dolor es dolor lumbalgia. En un aspecto, el dolor es un dolor asociado con un trastorno ciático. En un aspecto, el tratamiento es del dolor para el que no existe una afección clínica causal discernible. En un aspecto el tratamiento es del dolor para el que no existe una afección clínica causal discernible en la parte o región del cuerpo en la que el sujeto experimenta el dolor. En un aspecto el dolor es dolor neuropático. En un aspecto el dolor neuropático es un dolor para el que no existe una afección clínica causal discernible. En un aspecto la forma apropiada de administración es la inyección. En un aspecto la forma apropiada de administración es la aplicación tópica. El dolor neuropático puede localizarse en un área del cuerpo o puede experimentarse en múltiples sitios del cuerpo del sujeto. Cuando se experimenta en varios sitios, la intensidad del dolor puede ser similar en varios sitios o puede ser diferente en varios sitios. En un aspecto el dolor neuropático es un dolor facial neuropático. En un aspecto el dolor es un dolor facial neuropático y la administración a dicho sujeto es mediante inyección en la mandíbula o la encía. En un aspecto la inyección en la mandíbula o la encía se realiza en el sitio original del dolor. En un aspecto, el dolor está asociado con una enfermedad articular o un trastorno articular y la composición se administra en un sitio de dicho sujeto que está alejado de dicha articulación. En un aspecto la suspensión celular derivada de tejido adiposo, que comprende opcionalmente adipocitos, comprende agregados de células y/o comprende trozos de tejido adiposo.

También se describe el uso de (i) secreciones celulares derivadas de tejido adiposo, o (ii) una suspensión celular derivada de tejido adiposo, que comprende opcionalmente adipocitos, o (iii) una combinación de (i) y (ii), para la preparación de una composición farmacéutica para su uso en el alivio del dolor en un sujeto mamífero, en donde la composición farmacéutica es adecuada para la administración a dicho sujeto mediante inyección intramuscular o mediante inyección subcutánea o mediante una forma apropiada de administración, tal como administración tópica, en o cerca de un sitio del dolor.

Se describe además una composición que comprende (i) secreciones celulares derivadas de tejido adiposo, o (ii) una suspensión celular derivada de tejido adiposo, que comprende opcionalmente adipocitos, o (iii) una combinación de (i) y (ii), para aliviar el dolor en un sujeto mamífero, en donde la composición farmacéutica se administra a dicho sujeto mediante inyección intramuscular o mediante inyección subcutánea o mediante una forma apropiada de administración, tal como administración tópica, en o cerca de un sitio del dolor.

Además, se describe un kit que comprende (a) una composición farmacéutica seleccionada del grupo que consiste en (i) una composición que comprende secreciones derivadas de tejido adiposo, (ii) una composición que comprende una suspensión celular derivada de tejido adiposo, que comprende opcionalmente adipocitos, y (iii) una combinación de (i) y (ii); e (b) instrucciones para el uso de dicho kit para aliviar el dolor en un sujeto mamífero, en donde la composición farmacéutica se administra a dicho sujeto mediante inyección intramuscular o mediante inyección subcutánea o mediante una forma apropiada de administración, tal como administración tópica, en o cerca de un sitio del dolor.

También se describe una composición que comprende células derivadas de tejido adiposo y secreciones celulares derivadas de tejido adiposo. Las células pueden ser células adherentes. En un aspecto las células son células madre mesenquimales. En un aspecto la composición es una composición congelada. En un aspecto las secreciones celulares derivadas de tejido adiposo comprenden medios clarificados de cultivo de células derivadas de tejido adiposo. En un aspecto las secreciones celulares derivadas de tejido adiposo son una preparación concentrada de medio de cultivo de células derivadas de tejido adiposo. En un aspecto las secreciones celulares derivadas de tejido adiposo son una preparación concentrada entre 2 y 20 veces. En un aspecto la composición comprende además adipocitos. En un aspecto las células son células progenie provenientes del cultivo de una suspensión celular derivada de tejido adiposo. En un aspecto las células comprenden una línea celular obtenida mediante cultivo de una suspensión celular derivada de tejido adiposo. En un aspecto las células progenie provienen de múltiples subcultivos de células derivadas de una suspensión celular derivada de tejido adiposo. En un aspecto los múltiples subcultivos comprenden cinco o más subcultivos. En un aspecto los múltiples subcultivos comprenden diez o más subcultivos. En un aspecto la composición comprende células de una línea celular derivada de tejido adiposo que se ha congelado varias veces.

Se describe un método para la crioconservación de una célula almacenada, el método comprende combinar dicha célula con una composición que comprende secreciones celulares y almacenar dicha combinación en un estado congelado. En un aspecto el método es para la crioconservación de una línea celular. En un aspecto, antes de dicho almacenamiento, la combinación se mantiene a temperatura ambiente durante hasta una hora. En un aspecto dicha célula almacenada es una célula adherente. En un aspecto la célula almacenada es una célula madre mesenquimatosa. En un aspecto la célula almacenada es una célula derivada de tejido adiposo. En un aspecto la línea celular es una línea celular derivada de tejido adiposo. En un aspecto la composición que comprende secreciones celulares comprende medio clarificado de cultivo de una suspensión celular derivada de tejido adiposo. En un aspecto el cultivo de una suspensión celular derivada de tejido adiposo es el cultivo de células progenie de una suspensión celular derivada de tejido adiposo. En un aspecto la composición que comprende secreciones celulares comprende medio concentrado de cultivo de una suspensión celular derivada de tejido adiposo. En un aspecto la composición que comprende secreciones celulares comprende medio de cultivo de una suspensión celular derivada de tejido adiposo concentrada entre 2 y 20 veces. En un aspecto la línea celular se ha subcultivado varias veces. En un aspecto la línea celular se ha subcultivado más de cinco veces. En un aspecto la línea celular se ha subcultivado más de diez veces. En un aspecto la línea celular se ha subcultivado más de quince veces. En un aspecto la línea celular se ha congelado varias veces.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: Proliferación de células después de la congelación. Las células que no se habían subcultivado y que fueron congeladas sin secreciones (gráfico de la izquierda) y con secreciones (gráfico de la derecha) se tiñeron con el ensayo Click-iT ERD que identifica las células en proliferación. Las células en proliferación aparecen en el cuadrante superior derecho.

Figura 2: Recuperación de células después de la congelación. Las células que se habían cultivado hasta alcanzar una duplicación celular acumulativa de aproximadamente 13 veces se congelaron sin secreciones (imagen superior) y con secreciones (imagen inferior) y después se descongelaron y cultivaron durante 72 horas.

Figura 3: Medidas del volumen de la pata de un modelo de ratón con artritis inducida por anticuerpos contra colágeno (CAIA) tratado intramuscularmente con SVF+secreciones de adipocitos (■) o control de vehículo (•).

Figura 4: Medidas del tamaño del tobillo de un modelo de ratón con artritis inducida por anticuerpos contra colágeno (CAIA) tratado intramuscularmente con SVF+secreciones de adipocitos (■) o control de vehículo (•).

Figura 5: Puntuaciones de artritis clínica de un modelo de ratón con artritis inducida por anticuerpos contra colágeno (CAIA) tratado por vía intramuscular con SVF+secreciones de adipocitos (■) o control de vehículo (•).

Figura 6: Medidas del volumen de la pata de ratones CAIA tratados por vía intravenosa con células o células con secreciones concentradas. Células (■); células más secreciones (•).

Figura 7: Resultados del área de volumen de la pata bajo la curva de ratones CAIA tratados por vía intravenosa con células o células con secreciones concentradas.

Figura 8: Medidas del tamaño del tobillo de ratones CAIA tratados por vía intravenosa con células o células con secreciones concentradas. Células (■); células más secreciones (•).

Figura 9: Resultados del área bajo la curva del tamaño del tobillo de ratones CAIA tratados por vía intravenosa con células o células con secreciones concentradas.

Figura 10: Puntuaciones de artritis clínica de ratones CAIA tratados por vía intravenosa con células o células con secreciones concentradas. Células (■); células más secreciones (•).

Figura 11: Resultados del área bajo la curva de puntuación de artritis clínica de ratones CAIA tratados por vía intravenosa con células o células con secreciones concentradas.

Abreviaturas

DMEM Medio Eagles modificado de Dulbecco.

SVC células vasculares estromales.

SVF fracción vascular estromal.

OCD osteocondrosis.

MSC célula(s) madre mesenquimal(es).

Definiciones

En el contexto de esta divulgación, se entenderá que la referencia a una composición que comprende "secreciones derivadas de tejido adiposo" significa una composición que incluye uno o más factores liberados de las células del tejido adiposo. El material usado en la preparación de la composición que comprende las secreciones puede incluir o no adipocitos.

La expresión "farmacéuticamente aceptable" como se usa en la presente descripción en el contexto de varios componentes, tales como portadores, diluyentes, crioconservantes, pretende abarcar no solo los componentes que son adecuados para la administración a un sujeto humano, sino también aquellos adecuados para la administración a un sujeto mamífero no humano. En aspectos particulares, el componente farmacéuticamente aceptable es adecuado para la administración a un sujeto mamífero no humano. En aspectos particulares, el componente farmacéuticamente aceptable es adecuado para la administración a un sujeto humano. En aspectos particulares, el componente farmacéuticamente aceptable es adecuado para la administración a un sujeto mamífero no humano y a un sujeto humano.

Los términos "tratar", "tratamiento", "terapia" y similares en el contexto de la presente descripción se refieren al alivio de los síntomas y/o la causa subyacente de la afección o enfermedad, tal como trastorno inflamatorio, lesión del ligamento, o lesión o enfermedad del tendón de un animal de ganadería intensiva. En ciertos aspectos, un tratamiento ralentizará, retrasará o detendrá la progresión de un trastorno o los síntomas del trastorno o lesión, o revertirá la progresión del trastorno o lesión, al menos temporalmente. Por lo tanto, la palabra "tratamiento" o sus derivaciones de la misma tales como "tratar" cuando se usa en relación con una aplicación terapéutica, incluye todos los aspectos de una terapia, tal como el alivio del dolor asociado con la afección que se trata, el alivio de la gravedad de la afección que se trata, la mejora en uno o más síntomas de la afección que se trata, etc. Se entenderá que el uso de la palabra "tratamiento" o sus derivados de la misma significa que el sujeto que se "trata" puede experimentar uno o más de los beneficios mencionados anteriormente.

El término "prevenir" y similares, en el contexto de la "prevención" de la enfermedad, se refiere al impedimento de la progresión de los síntomas o la causa subyacente de la enfermedad. Se entenderá que puede producirse la prevención completa de una enfermedad, de modo que la enfermedad no se produzca en un animal o sujeto tratado. Igualmente, se entenderá que el término incluye prevención parcial, tal como la incapacidad de una enfermedad para progresar al estado típico observado en un animal o sujeto que no se trata.

A lo largo de esta descripción, la referencia a "un" elemento no excluye el plural, a menos que el contexto determine lo contrario. De manera similar, la referencia a "un aspecto" no excluye la característica de ese aspecto descrito que se aplica en combinación con uno o más de otros aspectos descritos, a menos que el contexto determine lo contrario.

La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" como se usa en la presente descripción incluye dentro de su significado una cantidad no tóxica pero suficiente de un compuesto o composición para proporcionar el efecto terapéutico deseado. La cantidad exacta requerida variará de un sujeto a otro dependiendo de factores tales como la especie que se trata, la edad y el estado general del sujeto, las comorbilidades, la gravedad de la afección que se trata, el agente particular que se administra y el modo de administración y así sucesivamente. Por lo tanto, para cualquier caso dado, un experto en la técnica puede determinar una "cantidad eficaz" apropiada con el uso sólo de métodos de rutina.

En el contexto de esta descripción, la expresión "que comprende" significa que incluye, pero no necesariamente solo que incluye. Además, las variaciones de la expresión "que comprende", tales como "comprenden" y "comprende", tienen significados correspondientemente variados. Por lo tanto, la expresión "que comprende" y variaciones de la misma se usan en un significado inclusivo en lugar de exclusivo, de modo que los números enteros o características adicionales pueden estar presentes opcionalmente en una composición, método, etc. que se describe como que comprende el número entero A, o que comprende el número entero A y B, etc.

En el contexto de esta descripción se entenderá que el término "aproximadamente" indica las tolerancias habituales que un destinatario experto asociaría con el valor dado.

En el contexto de esta descripción, cuando se establece un intervalo para un parámetro, se entenderá que el parámetro incluye todos los valores dentro del intervalo establecido, incluidos los puntos finales establecidos del intervalo. Por ejemplo, se entenderá que un intervalo de "5 a 10" incluye los valores 5, 6, 7, 8, 9 y 10, así como también cualquier subintervalo dentro del intervalo indicado, como para incluir el subintervalo de 6 a 10, 7 a 10, 6 a 9, 7 a 9, etc., e inclusive cualquier valor e intervalo entre los números enteros que sea razonable en el contexto del intervalo indicado, tal como 5,5, 6,5, 7,5, 5,5 a 8,5 y 6,5 a 9, etc.

En el contexto de esta descripción, el término "pluralidad" significa cualquier número mayor que uno.

Cabe señalar que se entenderá que la referencia en la presente descripción al uso de los métodos y composiciones de la invención en el tratamiento o terapia es aplicable a aplicaciones humanas y no humanas, tales como veterinarias. Por lo tanto, se entenderá que, salvo que se indique lo contrario, la referencia a un paciente, sujeto o individuo significa un ser humano o no humano, tal como un individuo de cualquier especie de importancia social, económica, agrícola o de investigación, incluyendo pero no limitado a miembros de las clasificaciones de ovinos, bovinos, equinos, porcinos, felinos, caninos, primates, roedores, especialmente miembros domesticados o de granja de esas clasificaciones, tales como ovejas, vacas, caballos, cerdos y perros.

Cuando se describen en la presente descripción ejemplos de varios aspectos, generalmente irán precedidos de términos apropiados que incluyen "tal como" o "por ejemplo", o "que incluye". Se entenderá que los ejemplos se describen como posibilidades inclusivas, por ejemplo, con el propósito de ilustración o comprensión y no se proporcionan, a menos que el contexto indique lo contrario, como limitantes.

Descripción detallada de los aspectos preferidos

Los presentes inventores han identificado que sorprendentemente la administración alejada de una composición que comprende secreciones de una suspensión celular derivada de tejido adiposo puede ser eficaz en el tratamiento de diversas afecciones que incluyen enfermedades inflamatorias y trastornos de huesos y articulaciones, incluidas lesiones del ligamento y lesiones del tendón. Los inventores también han identificado sorprendentemente que la administración alejada de una suspensión celular derivada de tejido adiposo, que comprende opcionalmente adipocitos, o de una combinación de secreciones derivadas de tejido adiposo y una suspensión celular derivada de tejido adiposo, que comprende opcionalmente adipocitos, puede ser eficaz en la tratamiento de tales afecciones. Los métodos previamente descritos para el tratamiento de tales afecciones han descrito la administración del agente terapéutico en un sitio de enfermedad o dolor mediante aplicación directa, tal como inyección intraarticular en el caso de una enfermedad articular. Se describen métodos para tratar tales afecciones mediante la administración alejada de (i) una composición que comprende secreciones celulares derivadas de tejido adiposo, o (ii) una composición que comprende una suspensión celular derivada de tejido adiposo, que comprende opcionalmente adipocitos, o (iii) una combinación de (i) y (ii), a un sujeto que lo necesite. También se describe el uso de (i) secreciones celulares derivadas de tejido adiposo, o (ii) una suspensión celular derivada de tejido adiposo, que comprende opcionalmente adipocitos, o (iii) una combinación de (i) y (ii), para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una afección seleccionada del grupo que consiste en un trastorno inflamatorio, una lesión del ligamento y una lesión del tendón, o para aliviar el dolor asociado con un trastorno inflamatorio, una lesión del ligamento, una lesión del tendón, dolor neuropático o una lesión por quemadura, el medicamento adecuado para la administración alejada a un sujeto.

Como se describe en la presente descripción, el inventor ha identificado sorprendentemente que la administración de tal agente terapéutico no necesariamente tiene que ser la administración directa del agente al sitio enfermo o afectado, tal como una articulación. Mediante la administración del agente terapéutico, tal como mediante inyección subcutánea o inyección intramuscular, el inventor ha identificado que pueden tratarse o prevenirse diversas enfermedades. En el caso de una enfermedad que afecte a una articulación, la descripción en la presente descripción de la administración como alejada simplemente significa que no se administra directamente en la articulación, sino que se administra típicamente mediante inyección subcutánea o intramuscular. Por tanto, el sitio de administración mediante inyección subcutánea o intramuscular puede estar o no particularmente distante de la articulación afectada. Se describen métodos para el tratamiento o la prevención de enfermedades en un animal de ganadería intensiva, el método comprende la administración mediante inyección subcutánea o inyección intramuscular de (i) una composición que comprende secreciones celulares derivadas de tejido adiposo, o (ii) una suspensión celular derivada de tejido adiposo, que comprende opcionalmente adipocitos, o (iii) una combinación de (i) y (ii).

El inventor ha identificado que pueden usarse composiciones alogénicas y xenogénicas en el tratamiento y, además, que las composiciones terapéuticas pueden almacenarse congeladas antes de su uso. Se entenderá que, en un aspecto, la divulgación en la presente descripción se refiere a tales composiciones per se, independientemente de la manera en que puedan usarse o pueda pretenderse que se usen. En otros aspectos, la divulgación se refiere al uso de composiciones de la divulgación en los métodos divulgados en la presente descripción. De esta manera, pueden estar disponibles los productos terapéuticos denominados "ya elaborados" o "listos para usar" que ofrecen ventajas, como el suministro, la facilidad de uso, menos molestias para el paciente y un menor requisito de experiencias técnicas, en comparación con un agente terapéutico autólogo derivado del paciente. Se divulga la preparación del agente terapéutico antes del contacto con el paciente, de modo que un producto que comprende secreciones celulares derivadas de tejido adiposo o una suspensión celular derivada de tejido adiposo, que comprende opcionalmente adipocitos, puede estar disponible sin la necesidad de anestesiar a un sujeto o animal para la extracción de tejido adiposo. De manera similar, cuando el agente terapéutico es una combinación de secreciones celulares derivadas de tejido adiposo y una suspensión celular derivada de tejido adiposo, que comprende opcionalmente adipocitos, esa combinación puede ponerse a disposición del usuario, tal como un médico, veterinario o granjero con anticipación o pueden suministrarse las composiciones separadas de secreciones celulares y de suspensión celular, donde el usuario prepara la combinación poco antes de la administración. Como se describe en la presente descripción, las secreciones celulares, la suspensión celular o la combinación pueden almacenarse, por ejemplo, a -20 °C hasta que se requieran para su uso. Alternativamente, las secreciones celulares, la suspensión celular o la combinación pueden almacenarse a una temperatura más baja, tal como en un congelador a -70 °C a -90 °C, o en almacenamiento de nitrógeno líquido, ya sea en la fase de vapor o en la fase líquida, hasta que se requiera para su uso. Las composiciones que comprenden células se almacenarán típicamente en nitrógeno líquido. En un aspecto preferido, la composición que comprende secreciones celulares derivadas de tejido adiposo, o la suspensión celular derivada de tejido adiposo, que comprende opcionalmente adipocitos, o la combinación de secreciones celulares derivadas de tejido adiposo y suspensión celular derivada de tejido adiposo, que comprende opcionalmente adipocitos, se almacena en la fase líquida del almacenamiento de nitrógeno líquido. En un aspecto las secreciones celulares derivadas de tejido adiposo son una preparación concentrada. En un aspecto la preparación concentrada se concentra en comparación con las secreciones celulares cosechadas inicialmente de las suspensiones celulares derivadas de tejido adiposo o el cultivo de las mismas. En un aspecto, las secreciones celulares derivadas de tejido adiposo son una preparación concentrada entre aproximadamente 2 veces y aproximadamente 20 veces. En un aspecto las secreciones celulares derivadas de tejido adiposo son una preparación concentrada en aproximadamente 10 veces.

Sin desear estar unido a ningún mecanismo de acción propuesto, se propone que las secreciones celulares derivadas de tejido adiposo comprendan citocinas, tales como citocinas antiinflamatorias, que pueden migrar a una fuente de lesión o enfermedad y producir una mejora en la afección subyacente, o alivio del dolor asociado con la afección. De manera similar, la suspensión celular derivada de tejido adiposo, que comprende opcionalmente adipocitos, cuando se inyecta por vía subcutánea o intramuscular, entonces opera para secretar varios factores celulares, tales como citocinas, que pueden migrar al sitio de la lesión o enfermedad, ya sea clínica o subclínica, efectuando de ese modo la mejora de la afección subyacente o la prevención de la aparición clínica, por ejemplo, en un animal de ganadería intensiva. Como se describe en los Ejemplos en la presente descripción, el método también es eficaz para mejorar la cojera de un individuo tratado y puede proporcionar beneficios en la mejora del rendimiento, como se demuestra por la agilidad y movilidad mejoradas de los individuos tratados.

Tejido adiposo

Las secreciones celulares pueden ser secreciones celulares derivadas de tejido adiposo. Las suspensiones celulares pueden ser suspensiones celulares derivadas de tejido adiposo. El tejido adiposo puede ser tejido adiposo humano o tejido adiposo de animal mamífero. El ser humano o el animal puede estar vivo o muerto, siempre que todavía haya células viables dentro del tejido adiposo. El tejido adiposo puede comprender tejido adiposo "blanco" o tejido adiposo "marrón".

El tejido adiposo puede tener su origen en cualquier fuente del cuerpo que sea accesible. La grasa subcutánea, por ejemplo, es fácilmente accesible solo con heridas superficiales o mediante técnicas de "cirugía de ojo de cerradura". Por ejemplo, el tejido adiposo puede ser tejido recolectado con el uso de técnicas de liposucción, o tejido adiposo que se extrae con tejido reproductivo cuando se elimina el sexo de un animal macho o hembra. El tejido adiposo puede enjuagarse con un medio de cultivo de tejidos o una solución isotónica tamponada para eliminar las células sanguíneas adherentes, y puede recortarse o procesarse de forma burda para eliminar los vasos sanguíneos grandes o los elementos del tejido conjuntivo antes de generar una suspensión celular derivada de tejido adiposo. El tejido adiposo puede derivarse de un animal maduro o juvenil.

En aspectos particulares, el mamífero es un animal de compañía, tal como un animal doméstico canino o felino, o un animal de trabajo. En otros aspectos particulares, el mamífero es un animal de granja o animal de carreras seleccionado de un caballo, burro, asno, vaca, búfalo, oveja, cabra, camello o cerdo.

Suspensión celular derivada de tejido adiposo

Las secreciones celulares derivadas de tejido adiposo y, por tanto, las composiciones que comprenden tales secreciones, se preparan preferentemente al obtener o preparar en primer lugar una suspensión celular derivada de tejido adiposo. Como se describe en la presente descripción los métodos, kits, usos y composiciones pueden comprender secreciones celulares derivadas de tejido adiposo, una suspensión celular derivada de tejido adiposo o una combinación de las secreciones celulares y la suspensión celular. La suspensión celular derivada de tejido adiposo puede comprender o no adipocitos.

El término "suspensión celular derivada de tejido adiposo" como se usa en la presente descripción abarca células aisladas de tejido adiposo o pequeños agregados o trozos de tejido adiposo, o una mezcla de dos o más de: células aisladas, pequeños agregados y trozos de tejido adiposo. La suspensión celular puede obtenerse al disociar mecánicamente el tejido adiposo con el uso de técnicas que están fácilmente disponibles en la técnica. Puede usarse cualquier método adecuado para la disociación mecánica del tejido adiposo, por ejemplo, al picar el tejido adiposo con cuchillas o tijeras, o al forzar el tejido adiposo a través de tamices o mallas con un tamaño de poro suficiente para romper el tejido en células aisladas o pequeños trozos de tejido adiposo, o una combinación de estas técnicas. Pueden formarse pequeños agregados de tejido adiposo cuando las células derivadas de tejido adiposo disociadas se reasocian en conjuntos más grandes, por ejemplo, al reposar en un medio. Los trozos pequeños o agregados de tejido adiposo pueden tener menos de diez milímetros de diámetro, menos de cinco milímetros de diámetro, menos de un milímetro de diámetro máximo, menos de 500 |jm de diámetro máximo o menos de 250 |jm de diámetro máximo.

La suspensión celular derivada de tejido adiposo puede filtrarse a través de una malla o tamiz para eliminar agregados de células o trozos de tejido que sean mayores que el tamaño de los poros de la malla o tamiz.

Pueden usarse enzimas proteolíticas para promover la disociación del tejido adiposo en una suspensión celular derivada de tejido adiposo. Las enzimas que son adecuadas para tal uso son bien conocidas en la técnica e incluyen, pero no se limitan a, tripsina y colagenasa. Es habitual eliminar y/o inactivar de otro modo las enzimas proteolíticas antes de usar el extracto de células derivadas de tejido adiposo, ya que estas enzimas pueden no ser compatibles con un uso in vivo deseado de las células. Las enzimas proteolíticas pueden usarse en combinación con técnicas para la disociación mecánica del tejido adiposo para generar una suspensión celular derivada de tejido adiposo.

Puede usarse una técnica de disociación mecánica sin usar una o más enzimas proteolíticas. La técnica usada de esta manera puede usarse para generar rápidamente una suspensión celular derivada de tejido adiposo.

La suspensión celular puede suspenderse en un líquido. El líquido puede añadirse al tejido adiposo antes, durante o después de la disociación del tejido adiposo. El líquido puede comprender un medio que sea capaz de mantener la supervivencia de las células del tejido adiposo durante al menos 24 horas en condiciones de cultivo apropiadas. El líquido puede comprender una solución tamponada isotónica, tal como un fosfato o una solución salina tamponada con HEPES, que es capaz de mantener la supervivencia de las células del tejido adiposo durante al menos una hora. El líquido puede comprender un medio de cultivo de tejidos. El líquido puede comprender suero o componentes de suero que apoyan o prolongan la supervivencia celular del tejido adiposo en la suspensión celular. El suero o los componentes del suero pueden ser suero o componentes del suero autólogos.

En algunos aspectos, es posible que la suspensión celular no tenga líquido añadido, sino que las células se suspenden en un líquido que se forma durante la disociación del tejido.

La preparación de una suspensión celular derivada de tejido adiposo puede comprender una etapa de centrifugación. La centrifugación de células aisladas o pequeños agregados o trozos de tejido adiposo suspendidos en un líquido, tal como un medio, se realiza a aproximadamente 500 g durante 10 minutos, o durante un tiempo suficiente y con una fuerza g suficiente para generar un sedimento celular que comprende células no adipocitarias derivadas de tejido adiposo, por encima de la cual hay una capa de medio, sobre la cual flota a su vez una capa que comprende los adipocitos viables, y en la parte superior flota una capa de lípido que se deriva de adipocitos rotos. Después de la centrifugación, en ciertos aspectos, la capa lipídica y la capa media se descartarán y las células retenidas se mezclarán, dejando una suspensión celular derivada de tejido adiposo que comprende adipocitos viables y células no adipocitarias derivadas de tejido adiposo. En otros aspectos, solo se retendrá la capa que comprende los adipocitos viables. En otros aspectos, la capa que comprende adipocitos puede eliminarse y, por tanto, no incluirse en la suspensión celular derivada de tejido adiposo. Esto ocurrirá típicamente cuando se prepara una suspensión celular derivada de tejido adiposo que está sustancialmente libre de adipocitos. Una suspensión celular a la que se hace referencia en la presente descripción como sustancialmente libre de adipocitos significa que en la suspensión celular se han agotado significativamente los adipocitos en comparación con el material de partida, por ejemplo, mediante la eliminación de la fracción de adipocitos después de la centrifugación. Se entenderá que sustancialmente libre de adipocitos cuando se usa en relación con una suspensión celular incluye la ausencia completa de adipocitos y también incluye la situación en la que se ha producido una retención mínima de adipocitos en el material. En otros aspectos, solo una parte del contenido de adipocitos del tejido adiposo puede eliminarse en la preparación de la suspensión celular derivada de tejido adiposo. En este caso, la suspensión celular resultante comprenderá adipocitos, pero en una proporción reducida con respecto a otros componentes retenidos, tales como las células madre, en comparación con la proporción en el material de partida. En un aspecto, la suspensión celular derivada de tejido adiposo comprende al menos un 10 % de adipocitos en volumen. En un aspecto, la suspensión celular derivada de tejido adiposo comprende entre un 10 % y un 30 % de adipocitos en volumen

Puede usarse una etapa de centrifugación o múltiples etapas de centrifugación, por ejemplo, para proporcionar etapas adicionales de separación de células. En otros aspectos, la preparación de una suspensión celular derivada de tejido adiposo no incluye una etapa de centrifugación.

La suspensión celular derivada de tejido adiposo puede comprender o no adipocitos viables. Cuando están presentes, los adipocitos pueden retener cantidades detectables de lípidos en su citoplasma y pueden separarse de las células no adipocitarias derivadas de tejido adiposo sobre la base de la diferente densidad proporcionada por el lípido. Los lípidos pueden detectarse mediante técnicas de microscopía óptica, incluida la microscopía de contraste de fase, o al teñir una muestra de células con un colorante lipófilo tal como Oil Red O. Los adipocitos que retienen lípidos en su citoplasma son considerablemente más frágiles que otras células derivadas de tejido adiposo, y por consiguiente, cuando se deseen adipocitos viables, deben evitarse técnicas para disociar tejido que dañen o destruyan una gran proporción de los adipocitos. Es poco probable que la disociación ultrasónica del tejido adiposo o las técnicas en las que el tejido adiposo se agite vigorosamente, por ejemplo, proporcionen una suspensión celular que contenga un gran número de adipocitos viables. La viabilidad de los adipocitos puede determinarse fácilmente con el uso de técnicas fácilmente disponibles, tales como los ensayos de viabilidad de células VIVAS/MUERTAS (Molecular Probes).

La suspensión celular derivada de tejido adiposo puede comprender tanto adipocitos como células no adipocitarias derivadas de tejido adiposo. Las células no adipocitarias derivadas de tejido adiposo incluyen típicamente células de la fracción vascular estromal, incluidas las células madre mesenquimales. Las células de la fracción vascular estromal se sedimentan típicamente en las condiciones de centrifugación descritas en la presente descripción de una suspensión celular derivada de tejido adiposo.

En aspectos que comprenden tanto adipocitos como células no adipocitarias derivadas de tejido adiposo, la suspensión celular derivada de tejido adiposo puede prepararse convenientemente mediante métodos que comprenden una etapa de centrifugación, como se describe en la presente descripción, en la que se recolectan tanto la capa de células adipocitarias como las células no adipocitarias derivadas de tejido adiposo. Alternativamente, en estos aspectos, la suspensión celular derivada de tejido adiposo puede prepararse al disociar el tejido adiposo como se describe en la presente descripción sin una etapa de centrifugación.

La suspensión celular derivada de tejido adiposo, que comprende opcionalmente adipocitos, puede almacenarse en condiciones apropiadas. Las condiciones de almacenamiento permiten típicamente la retención de la viabilidad celular de algunas o todas las células en la suspensión celular, tal como más del 50 %, más del 60 %, más del 70 %, más del 80 %, más del 90 % o más del 95 %.

Cuando la suspensión celular derivada de tejido adiposo deba almacenarse congelada, puede ser en cualquier portador líquido apropiado para la congelación de células. Como ejemplo ilustrativo pero no limitante, las células pueden suspenderse en medio de cultivo, que puede contener suero o no contener suero, tal como DMEM, RPMI, medio esencial mínimo, o en suero antes de la congelación.

Cuando la suspensión celular derivada de tejido adiposo debe almacenarse congelada, típicamente también comprende un crioconservante, por ejemplo, dimetilsulfóxido (DMSO) o glicerol, a una concentración apropiada, tal como del 5 % al 10 %. Como se describe en la presente descripción, las secreciones celulares tales como las obtenidas o derivadas del cultivo celular de una suspensión celular derivada de tejido adiposo también pueden usarse como crioconservantes para el almacenamiento celular. Tales secreciones, opcionalmente clarificadas u opcionalmente concentradas, pueden combinarse con una población celular destinada al almacenamiento congelado, tal como las células mesenquimales, tal como las células derivadas de tejido adiposo, incluida una línea celular resultante del cultivo de una suspensión celular derivada de tejido adiposo. La combinación puede mantenerse a una temperatura adecuada, tal como la temperatura ambiente, por ejemplo, aproximadamente de 18 °C a 25 °C, antes de congelar durante cualquier tiempo adecuado, tal como hasta aproximadamente una o dos horas, para permitir la interacción entre las secreciones y las células, por ejemplo, aproximadamente 10 minutos, 20 minutos, 30 minutos, 60 minutos, 90 minutos o dos horas. En aspectos preferidos la combinación se mantiene a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos.

Los constituyentes de la suspensión celular, tales como el medio líquido y el crioconservante, son típicamente farmacéuticamente aceptables a las concentraciones usadas. Esto tiene la ventaja de que la suspensión celular derivada de tejido adiposo puede administrarse a un sujeto o animal receptor después de la descongelación con un procesamiento mínimo posterior a la descongelación.

La suspensión celular se congela típicamente en condiciones controladas para minimizar el daño celular, por ejemplo mediante congelación lenta, típicamente a una velocidad de aproximadamente 1 °C/min, tal como colocándola en un dispositivo de congelación programable, o en un recipiente aislado en un congelador de -70 °C a -90 °C. Para el almacenamiento, las células congeladas se transfieren normalmente a un almacenamiento de nitrógeno líquido.

Un método y dispositivo de procesamiento de células que puede usarse para la preparación de suspensiones celulares derivadas de tejido adiposo se describe en la solicitud copendiente WO2012122603.

Suspensiones celulares derivadas de tejido adiposo bovino

Las suspensiones celulares derivadas de tejido adiposo y, por tanto, las secreciones celulares derivadas de tejido adiposo, pueden derivarse de cualquier fuente apropiada. El tejido adiposo bovino es una de tales fuentes. El inventor ha descrito previamente métodos inventivos para la preparación de suspensiones celulares derivadas de tejido adiposo de fuentes bovinas, particularmente de tejido de la base de la cola de bovino, ya que se encontró que ese material era refractario a los métodos estándar apropiados para muchas otras fuentes de tejido adiposo, tal como humano, canino, equino, de ratón y rata. Esto se describe en la solicitud copendiente WO2012122604.

Por ejemplo, si se utiliza un material derivado de tejido adiposo bovino, puede prepararse una suspensión celular derivada de tejido adiposo bovino para su uso como composición terapéutica o para su uso en la preparación de secreciones celulares derivadas de tejido adiposo de acuerdo con un método que comprende:

- exponer una muestra de tejido adiposo bovino a una solución de enzimas proteolíticas para generar una suspensión celular;

- centrifugar la suspensión de células para formar un sedimento celular, una capa lipídica libre sobre una capa celular flotante que comprende adipocitos y una capa intermedia entre el sedimento celular y la capa celular flotante, donde dicha capa intermedia tiene agotamiento celular con respecto al sedimento celular y la capa de células flotantes; y

- eliminar la capa lipídica libre y la capa intermedia y mezclar el sedimento celular y la capa celular flotante para formar una suspensión celular derivada de tejido adiposo que comprende adipocitos.

En los métodos, usos y composiciones en los que se desea una suspensión celular que no comprenda adipocitos, la capa celular flotante que comprende adipocitos también puede eliminarse y desecharse en la realización del método anterior.

El método puede comprender etapas adicionales en la preparación de suspensiones celulares derivadas de tejido adiposo como se establece en otra parte de esta descripción, en particular la sección anterior titulada "Suspensión celular derivada de tejido adiposo". Estas etapas adicionales incluyen, por ejemplo, la disociación mecánica del tejido y la suspensión mediante un medio o tampón, etc.

La capa intermedia eliminada puede retenerse, ya que normalmente incluye secreciones derivadas de tejido adiposo. Como la concentración de secreciones en la capa intermedia extraída es típicamente baja en comparación con la concentración de secreciones producidas a partir del cultivo celular posterior de suspensiones celulares derivadas de tejido adiposo, como se describe a continuación, las secreciones celulares cosechadas de células cultivadas se usan típicamente en los métodos, usos y composiciones.

En ciertos aspectos, la solución de enzimas proteolíticas comprende colagenasa. La colagenasa se usa típicamente a una concentración final de aproximadamente 0,2 % p/v o aproximadamente 0,25 % p/v o mayor. En ciertos aspectos la exposición del tejido adiposo bovino a la enzima proteolítica se realiza en condiciones que dan como resultado una digestión incompleta del tejido adiposo, tal como las que dan como resultado la presencia de cantidades significativas de tejido adiposo intacto. Típicamente, por ejemplo, puede haber trozos de tejido adiposo presentes que son del mismo tamaño que antes de comenzar la digestión. En aspectos del método, puede que no se digiera entre aproximadamente el 20 % y aproximadamente el 80 % del tejido adiposo.

En ciertos aspectos las células pueden someterse a múltiples etapas de centrifugación o etapas de lavado, por ejemplo, para eliminar el exceso de lípidos libres.

Como se describe adicionalmente en la siguiente sección puede usarse una suspensión celular derivada de tejido adiposo que puede ser de cualquier especie de origen, tal como se menciona en la presente descripción, por ejemplo, bovino, porcino, canino, felino, equino, humano, etc., o una alícuota del mismo, en la preparación de una composición que comprende secreciones de las células derivadas de tejido adiposo.

Composiciones que comprenden secreciones derivadas de tejido adiposo

Puede prepararse una composición que comprende secreciones celulares derivadas de tejido adiposo a partir de una suspensión celular derivada de tejido adiposo de cualquier manera apropiada. Como se indica en la presente descripción, los componentes líquidos formados durante la preparación de una suspensión celular derivada de tejido adiposo incluyen típicamente secreciones derivadas de tejido adiposo, lo que representa un aspecto de una composición que comprende tales secreciones. De esta forma, la composición que comprende las secreciones derivadas de tejido adiposo puede recolectarse en cualquier etapa apropiada en la preparación de una suspensión celular, tal como mediante la recolección de la capa líquida intermedia entre el sedimento celular y la capa celular flotante después de la centrifugación del material derivado de tejido adiposo. En este aspecto, el material recolectado que comprende las secreciones puede incluir o no adipocitos.

Típicamente, la composición se genera mediante la exposición de un medio a la suspensión celular derivada de tejido adiposo que comprende adipocitos. La exposición del medio a la suspensión celular derivada de tejido de adipocitos puede ser durante cualquier tiempo y condiciones apropiados, según lo establezca el operador. La exposición del medio a la suspensión celular derivada de tejido de adipocitos no requiere condiciones que permitan la unión de las células a un sustrato. En estos aspectos, la composición que comprende las secreciones derivadas de tejido adiposo puede generarse al exponer un medio a la suspensión celular derivada de tejido adiposo durante cualquier período de tiempo apropiado, tal como al menos 6 horas, al menos 8 horas, al menos 10 horas, o al menos 12 horas, seguido de la eliminación de la suspensión celular del medio, o viceversa, por ejemplo mediante centrifugación o filtración. En un aspecto, la suspensión celular derivada de tejido adiposo puede exponerse a condiciones de bajo oxígeno, tales como menos del 10 % de oxígeno, menos del 5 % de oxígeno o menos del 1 % de oxígeno. La eliminación de la suspensión celular y el medio entre sí puede dar como resultado una eliminación completa o incompleta de las células. Por tanto, el medio, que comprende las secreciones derivadas de tejido adiposo, puede incluir o no adipocitos después de la eliminación de la suspensión celular. En ciertos aspectos la composición se genera al exponer un medio a la suspensión celular derivada de tejido adiposo durante no más de 12 horas, no más de 18 horas o no más de 24 horas. En ciertos aspectos la composición puede generarse al exponer un medio a la suspensión celular derivada de tejido adiposo durante un período de tiempo más largo, tal como cualquier período de tiempo entre aproximadamente 1 y 15 días, por ejemplo, aproximadamente 1 día, 2 días, 3 días, 4, días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días, 14 días o 15 días. Típicamente, la suspensión se mantiene en una incubadora durante 5 a 10 días y después se recolectan las secreciones. La exposición del medio a las células puede ser o no en condiciones que permitan la unión de las células a un sustrato. Típicamente, cuando la exposición del medio a las células es durante más de aproximadamente 1 día, las condiciones permitirán la unión de las células al sustrato.

La composición puede comprender moléculas derivadas de células que se liberan de las células después de la muerte celular o la ruptura de las células del tejido adiposo. La composición puede comprender secreciones de células de la suspensión celular derivada de tejido adiposo, que comprende opcionalmente adipocitos. La exposición de un medio a una suspensión celular derivada de tejido adiposo puede ser a una temperatura de 4 °C a 50 °C, más típicamente a una temperatura de 10 °C a 40 °C y más típicamente a una temperatura de 20 °C a 37 °C.

Para una suspensión celular derivada de tejido adiposo típica, se disocian 5 g de tejido adiposo y se suspenden en 50 ml de DMEm que contiene suero autólogo al 10 %. La suspensión celular derivada de tejido adiposo comprende típicamente de 100000 a 1000000 de células no adipocitarias por cada gramo de material fuente de tejido adiposo. El número de adipocitos por gramo de material fuente de tejido adiposo es típicamente entre 100000 y 5000000.

El término "medio" como se usa en la presente descripción, pretende abarcar composiciones que apoyan la supervivencia de al menos algunas células en una suspensión celular derivada de tejido adiposo durante al menos una hora. El medio puede ser un medio de cultivo de tejidos, tal como DMEM, r Pm I o medio esencial mínimo, opcionalmente complementado con suero. El medio puede ser una solución isotónica tamponada, tal como una solución salina tamponada con fosfato o una solución salina tamponada de Hank, siempre que el medio sea adecuado para la administración a un sujeto. El medio puede ser líquido que se forma durante la disociación del tejido adiposo. El medio puede complementarse opcionalmente con factores que promueven la supervivencia o unión celular y la división celular, tales como insulina, progesterona y selenio, o suero o componentes de suero. En ciertos aspectos el medio debe ser adecuado para una composición farmacéutica, que sea aceptable para uso in vivo. Tales medios estarán sustancialmente libres de pirógenos u otras impurezas que pueden ser dañinas para los seres humanos o los animales. Los medios farmacéuticamente aceptables están disponibles comercialmente. La frase "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades y composiciones moleculares que no producen reacciones adversas, alérgicas u otras reacciones adversas inaceptables cuando se administran a un animal o un ser humano.

La preparación de una composición que comprende secreciones derivadas de tejido adiposo puede incluir una etapa de lisis de la suspensión celular derivada de tejido adiposo que comprende adipocitos. Puede prepararse un lisado que comprende secreciones celulares mediante cualquier método adecuado. En un aspecto de ejemplo, una suspensión celular derivada de tejido adiposo puede exponerse a un medio, tal como se describe anteriormente. Las células de la suspensión después pueden lisarse por cualquier medio adecuado, tal como por rotura mecánica (por ejemplo, movimiento vigoroso o agitación), rotura ultrasónica, congelación descongelación, liofilización o la adición de uno o más agentes capaces de inducir la lisis celular, típicamente lisis de adipocitos. Tales agentes de lisis son conocidos en la técnica e incluyen urea, dodecilsulfato de sodio y Triton x100. Después de una etapa de lisis, la preparación puede centrifugarse o filtrarse para ayudar en la eliminación de los desechos celulares, o puede usarse sin tal etapa de clarificación, en cuyo caso la composición que comprende secreciones derivadas de tejido adiposo también puede incluir desechos celulares. En algunos casos, el lisado celular puede eliminarse del agente de lisis por precipitación del lisado celular. Cuando la etapa de lisis da como resultado una lisis celular incompleta, la composición que comprende secreciones derivadas de tejido adiposo también puede comprender células derivadas de tejido adiposo, tales como adipocitos.

En ciertos aspectos, la preparación de las secreciones derivadas de tejido adiposo comprende cultivar la suspensión celular que comprende adipocitos en condiciones apropiadas para formar un cultivo celular adherente, tal como un cultivo celular adherente confluente; cosechar el sobrenadante del cultivo celular adherente y eliminar las células de dicho sobrenadante para formar una composición que comprende secreciones derivadas de tejido adiposo. La eliminación de las células del sobrenadante para dejar una composición que comprende secreciones derivadas de tejido adiposo puede ser una eliminación completa o una eliminación parcial. En el último caso, la composición que comprende secreciones derivadas de tejido adiposo puede por tanto incluir también adipocitos.

Antes de comenzar el cultivo de las células, la suspensión celular derivada de tejido adiposo puede resuspenderse en un volumen deseado de un tampón apropiado, tal como DMEM, RPMI o medio esencial mínimo. La suspensión celular, o una alícuota de la misma, puede añadirse a un matraz de cultivo de tejidos estéril e incubarse en condiciones apropiadas, típicamente hasta que las células adherentes hayan alcanzado la confluencia. El cultivo celular se realiza preferentemente en presencia de suero estéril. La concentración del suero en el cultivo puede ser cualquier concentración adecuada que ayude al cultivo de células derivadas de tejido adiposo, tal como por ejemplo en el intervalo de aproximadamente 5 % v/v a aproximadamente 30 % v/v, tal como aproximadamente 10% v/v, o aproximadamente 15 % v/v o aproximadamente 20 % v/v. El suero puede ser cualquier suero apropiado para el cultivo de células derivadas de tejido adiposo, tal como un suero de ternero fetal comercial, o un suero preparado en casa, tal como por métodos conocidos en la técnica. El suero puede ser autólogo, preparado a partir del mismo individuo del que se obtuvo el tejido adiposo, o puede ser alogénico. En otros aspectos, el suero puede ser xenogénico, tal como el uso de suero de ternera en el cultivo de células derivadas de tejido adiposo obtenidas de una fuente canina. Típicamente, las células se cultivaron a 37 °C con 5 % de CO2. En un aspecto adicional, las células se cultivan en condiciones hipóxicas.

Durante el cultivo, las células derivadas de tejido adiposo secretan citocinas que incluyen moléculas antiinflamatorias, moléculas proinflamatorias, quimiocinas, factores de crecimiento y otras moléculas de señalización celular en el medio. El sobrenadante del cultivo comprende, por tanto, secreciones derivadas de tejido adiposo. En ciertos aspectos el cultivo puede congelarse y liofilizarse, lo que da como resultado una preparación liofilizada que incluye células y las secreciones. La rehidratación de la preparación liofilizada lisará la mayoría de las células lo que da como resultado la liberación de citocinas adicionales. La rehidratación se realizará típicamente con el uso de un volumen de líquido que sea menor que el volumen original de las células derivadas de tejido adiposo, tal como un volumen de líquido entre aproximadamente 5 y aproximadamente 20 veces menor que el volumen original, más típicamente aproximadamente 10 veces menor que el volumen original de las células derivadas de tejido adiposo, lo que da como resultado una composición 10 veces más concentrada. A continuación, la composición puede filtrarse para eliminar los restos celulares lo que da como resultado una composición que contiene citoquinas concentradas. Esto proporciona un método preferido para producir grandes volúmenes de secreciones concentradas.

En otros aspectos el sobrenadante puede cosecharse del cultivo en cualquier momento apropiado, aunque típicamente para un cultivo celular adherente se cosechará cuando las células hayan alcanzado la confluencia, tal como después de aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 o 14 días. Las células, los restos celulares y cualquier tejido adiposo restante pueden eliminarse del sobrenadante, tal como mediante filtración. En un aspecto, la filtración puede realizarse a través de una malla de 20 micras. Si se desea, pueden realizarse múltiples etapas de filtración tal como a través de dos o más filtros de tamaño de malla decreciente. La preparación resultante de las secreciones derivadas de tejido adiposo se esteriliza típicamente por filtración, tal como a través de un filtro de 0,22 micras. La composición esterilizada puede usarse inmediatamente o puede dividirse en alícuotas para su uso o para almacenamiento. Típicamente, si se almacena, la composición se almacena congelada a -20 °C. La composición contiene secreciones de las células derivadas de tejido adiposo.

Una composición que comprende secreciones derivadas de tejido adiposo también puede comprender adipocitos. Cuando están presentes, los adipocitos pueden permanecer del tejido adiposo original usado en la preparación de las secreciones o pueden añadirse a la composición que comprende las secreciones.

Como se describió anteriormente, la preparación de secreciones celulares derivadas de tejido adiposo puede realizarse al cultivar una suspensión celular derivada de tejido adiposo y la posterior cosecha y filtración del sobrenadante, con o sin las etapas adicionales descritas anteriormente, tales como esterilización por filtración, secado por congelación y concentración.

Una composición que comprende las secreciones, que puede ser un sobrenadante cosechado que comprende secreciones, puede, por ejemplo, secarse por congelación y posteriormente rehidratarse en un volumen deseado de un líquido apropiado. Típicamente, el líquido apropiado será farmacéuticamente aceptable. El líquido apropiado puede ser agua destilada.

Opcionalmente, los cultivos de células derivadas de tejido adiposo confluentes, después de la cosecha del sobrenadante, pueden subcultivarse en nuevos matraces de cultivo de tejidos y cultivarse de nuevo hasta la confluencia en condiciones apropiadas. Puede realizarse un subcultivo continuo de las células para la preparación de secreciones derivadas de tejido adiposo. Por ejemplo, el sobrenadante puede cosecharse de matraces en cualquier número de subcultivos deseado, por ejemplo, de matraces en el número de subcultivo tres al subcultivo cinco. Los sobrenadantes recolectados pueden combinarse según se desee, por ejemplo, para obtener una mayor cantidad de secreciones. Con etapas adicionales, tales como etapas de concentración, de esta manera puede prepararse una preparación de secreción celular derivada de tejido adiposo de concentración más alta.

Composiciones farmacéuticas y otras composiciones

En ciertos aspectos la composición derivada de tejido adiposo, que contiene secreciones de células de tejido adiposo, o la suspensión celular derivada de tejido adiposo, que comprende opcionalmente adipocitos, se usa para la preparación de una composición farmacéutica. De acuerdo con un aspecto, se proporciona (i) una composición que comprende secreciones derivadas de tejido adiposo o (ii) una suspensión celular derivada de tejido adiposo, que comprende opcionalmente adipocitos o (iii) una combinación de (i) y (ii) para la preparación de una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de una afección seleccionada del grupo que consiste en un trastorno inflamatorio, una lesión del ligamento y una lesión del tendón en un sujeto, o para su uso en el alivio del dolor asociado con un trastorno inflamatorio, una lesión del ligamento, una lesión del tendón, dolor neuropático o lesión por quemadura, en donde el tratamiento comprende la administración alejada de la composición farmacéutica al sujeto.

La composición farmacéutica también puede denominarse medicamento. Típicamente, la administración alejada es la administración subcutánea o la administración intramuscular. Típicamente, la composición farmacéutica también comprende uno o más de un portador, diluyente, excipiente o adyuvante farmacéuticamente aceptable.

En otro aspecto, se proporciona el uso de (i) una composición que comprende secreciones derivadas de tejido adiposo o (ii) una suspensión celular derivada de tejido adiposo, que comprende opcionalmente adipocitos, o (iii) una combinación de (i) y (ii), para la preparación de una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento o prevención de enfermedades en un animal de ganadería intensiva, en donde la composición farmacéutica es adecuada para inyección subcutánea o inyección intramuscular.

En otro aspecto, se proporciona el uso de (i) una composición que comprende secreciones celulares derivadas de tejido adiposo, o (ii) una suspensión celular derivada de tejido adiposo, que comprende opcionalmente adipocitos, o (iii) una combinación de (i) y (ii), para la preparación de una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de una enfermedad o afección articular en un sujeto mamífero, en donde la composición es adecuada para la administración en un sitio de dicho sujeto alejado del sitio de dicha afección.

En otro aspecto, se proporciona el uso de (i) secreciones celulares derivadas de tejido adiposo, o (ii) una suspensión celular derivada de tejido adiposo, que comprende opcionalmente adipocitos, o (iii) una combinación de (i) y (ii), para la preparación de una composición farmacéutica para su uso en el alivio del dolor en un sujeto mamífero, en donde la composición farmacéutica es adecuada para la administración a dicho sujeto por inyección intramuscular o por inyección subcutánea o por una forma apropiada de administración, tal como por administración tópica, en o cerca de un sitio del dolor.

Se proporcionan composiciones farmacéuticas o medicamentos que comprenden (i) secreciones celulares derivadas de tejido adiposo, o (ii) una suspensión celular derivada de tejido adiposo, que comprende opcionalmente adipocitos, o (iii) una combinación de (i) y (ii). La composición farmacéutica puede proporcionarse como parte de un kit, por ejemplo, que incluye componentes adicionales útiles en el tratamiento previsto, tal como por ejemplo instrucciones escritas, o puede proporcionarse como un solo artículo, tal como un solo vial o alícuota de la composición.

De acuerdo con un aspecto adicional se proporciona una composición farmacéutica que comprende secreciones derivadas de tejido adiposo, junto con un portador, diluyente, excipiente o adyuvante farmacéuticamente aceptable. En ciertos aspectos la composición que comprende secreciones derivadas de tejido adiposo comprende además adipocitos. En ciertos aspectos la composición está libre de células. En ciertos aspectos la composición se prepara al exponer un medio u otro líquido a una suspensión celular derivada de tejido adiposo, que puede comprender o no adipocitos maduros. La composición farmacéutica tiene propiedades terapéuticas, tal como para el tratamiento de una afección seleccionada del grupo que consiste en un trastorno inflamatorio, una lesión del ligamento y una lesión del tendón en un sujeto, o para aliviar el dolor asociado con una afección seleccionada del grupo que consiste en un trastorno inflamatorio, una lesión del ligamento, una lesión del tendón, dolor neuropático y una lesión por quemadura. La composición farmacéutica tiene propiedades terapéuticas adecuadas para el tratamiento o la prevención de enfermedades en un animal de ganadería intensiva. Tales enfermedades incluyen debilidad en las piernas, cojera, artritis, enfermedades del desarrollo e infección bacteriana. En un aspecto la enfermedad del desarrollo es la osteocondrosis (OCD). En un aspecto la enfermedad del desarrollo es un quiste óseo. En un aspecto la enfermedad del desarrollo es una enfermedad del desarrollo ortopédica.

En algunos aspectos, el tejido adiposo se toma de un sujeto individual y la composición farmacéutica se administra al mismo individuo y, por lo tanto, las secreciones derivadas de tejido adiposo o la suspensión celular derivada de tejido adiposo, que comprende opcionalmente adipocitos, o una combinación de los mismos, es una preparación puramente autóloga.

En algunos aspectos, el tejido adiposo se toma de uno o más sujetos individuales y la composición farmacéutica se administra a un sujeto diferente de la misma especie y, por lo tanto, las secreciones derivadas de tejido adiposo o la suspensión celular derivada de tejido adiposo, que comprende opcionalmente adipocitos, o combinación de los mismos es una preparación alogénica. En algunos aspectos el tejido adiposo se toma de un individuo de una especie diferente a la que se pretende que sea un receptor de la composición terapéutica. Por ejemplo, una composición que comprende secreciones o células o una combinación de ambas preparadas a partir de tejido bovino puede ser para la administración a un individuo de una especie diferente, tal como un ser humano, felino, porcino o canino. En los aspectos en los que la composición que comprende secreciones derivadas de tejido adiposo o suspensión celular derivada de tejido adiposo, que comprende opcionalmente adipocitos, es para su uso en un individuo diferente de la misma especie que el material de origen o para su uso en un individuo de una especie diferente como el material de origen, la composición puede carecer típicamente de células del sistema inmunitario para minimizar la posibilidad de una respuesta inmunitaria del huésped (receptor) a la composición o enfermedad de injerto contra huésped.

En algunos aspectos la composición farmacéutica se prepara a partir de más de una fuente de tejido adiposo, tal como a partir de diferentes preparaciones tomadas del mismo individuo o de diferentes preparaciones tomadas de diferentes individuos. La combinación puede comprender combinar múltiples suspensiones celulares derivadas de tejido adiposo, tal como en una etapa de cultivo agrupado o la agrupación puede comprender combinar múltiples composiciones de secreciones derivadas de tejido adiposo, tal como las que pueden obtenerse a partir de etapas de cultivo o exposición separadas.

La composición farmacéutica puede administrarse al paciente sujeto en un sitio alejado del área afectada. En este contexto, "alejada" significa que la administración no es la aplicación directa de las secreciones celulares o la suspensión celular o combinación de las mismas al sitio de inflamación u otra lesión o enfermedad que se trata donde tal sitio es identificable. Como ilustración, en el caso del tratamiento de una articulación artrítica, la administración como se describió previamente en la técnica implicó la inyección de suspensiones celulares derivadas de tejido adiposo o secreciones celulares derivadas de tejido adiposo directamente en la articulación afectada. Tal administración requiere un alto grado de experiencia por parte del médico tratante o clínico para asegurar una precisión apropiada. La manipulación de la extremidad o articulación afectada requerida en tal administración también aumenta la angustia experimentada por el paciente, ya sea humano o no humano. Al proporcionar la administración alejada de secreciones celulares derivadas de tejido adiposo, o suspensión celular derivada de tejido adiposo, o una combinación de las mismas, se proporcionan métodos, usos y composiciones mejorados para el tratamiento de tales enfermedades. Por ejemplo, la administración alejada puede ser por inyección subcutánea, tal como en la piel del cuello de un animal (por ejemplo, un gato o un perro) que se trata o por inyección intramuscular. Como un ejemplo adicional, la administración a un perro mediante inyección intramuscular puede ser en el muslo del perro. Como un ejemplo adicional, la administración a un bovino mediante inyección intramuscular puede ser en el pliegue caudal.

Cuando las composiciones terapéuticas se administran para tratar o prevenir una enfermedad de un animal de ganadería intensiva, la administración es por inyección subcutánea o inyección intramuscular. Debido a la naturaleza de la afección que se trata en tal animal, la descripción de que la administración es "alejada" puede no ser apropiada. Por ejemplo, la administración de la composición terapéutica a un animal de ganadería intensiva puede ser para el tratamiento o prevención de la debilidad generalizada o localizada de las piernas, osteocondrosis. Como se describe en la presente descripción la administración de la composición terapéutica a tales animales se realiza mediante inyección subcutánea o inyección intramuscular.

Cuando las composiciones terapéuticas se administran para el tratamiento del dolor para el que no existe una causa clínica discernible, o para el dolor neuropático que puede tener o no una causa clínica discernible, la composición puede administrarse al sujeto por cualquier medio apropiado, tal como por inyección o por aplicación tópica, lo que significa que puede estar en o cerca de un sitio del dolor o puede estar lejos del sitio del dolor. Un sujeto puede experimentar dolor neuropático en varios sitios del cuerpo. El tratamiento de tal dolor puede ser mediante la administración en un sitio, tal como un sitio del dolor original, cuyo sitio también puede estar alejado de otro sitio de dolor experimentado por el sujeto. En un ejemplo, el dolor es un dolor neuropático. El dolor neuropático puede localizarse en un área del cuerpo o puede experimentarse en múltiples sitios del cuerpo del sujeto. Cuando se experimenta en varios sitios, la intensidad del dolor puede ser similar en varios sitios o puede ser diferente en varios sitios. Un ejemplo de dolor neuropático es el dolor facial neuropático. En los métodos, el dolor facial neuropático en un sujeto puede tratarse mediante la administración de una composición al sujeto mediante inyección en la mandíbula o la encía. La inyección en la mandíbula o la encía de dicho paciente puede comprender la administración en el sitio original del dolor o puede ser la administración en un sitio secundario del dolor.

Como se muestra en los ejemplos, las composiciones y métodos también son eficaces para aliviar el dolor y la formación de ampollas asociados con las quemaduras. Cuando las composiciones se administran para el tratamiento de una lesión por quemadura o para aliviar el dolor asociado con una quemadura de la piel, la composición se administra típicamente mediante aplicación tópica, tal como en forma de crema, gel o loción.

Puede suministrarse al usuario una composición farmacéutica como una solución congelada. Como se describe en la presente descripción, por ejemplo, las secreciones celulares, la suspensión celular o la combinación pueden almacenarse a aproximadamente -20 °C hasta que se requieran para su uso. Alternativamente, las secreciones celulares, la suspensión celular o la combinación pueden almacenarse a una temperatura más baja, por ejemplo, en un congelador a -70 °C a -90 °C, o en almacenamiento de nitrógeno líquido, ya sea en la fase de vapor o en la fase líquida, hasta que se requiera para su uso. Las composiciones que comprenden células se almacenarán típicamente en nitrógeno líquido. En un aspecto preferido, la composición que comprende secreciones celulares derivadas de tejido adiposo, o la suspensión celular derivada de tejido adiposo, que comprende opcionalmente adipocitos, o la combinación de secreciones celulares derivadas de tejido adiposo y suspensión celular derivada de tejido adiposo, que comprende opcionalmente adipocitos, se almacena en la fase líquida del almacenamiento de nitrógeno líquido. En un aspecto preferido una composición que comprende células se almacena en combinación con secreciones celulares obtenidas de un cultivo de células derivadas de tejido adiposo. En otro aspecto preferido una composición que comprende células se almacena en una composición que comprende medio clarificado o concentrado de un cultivo de células derivadas de tejido adiposo. Se entenderá que el cultivo de células derivadas de tejido adiposo incluye el cultivo de células recién obtenidas de tejido adiposo, así como también el cultivo de células que han surgido como células progenie o una línea celular de cultivos anteriores. En uso, tal como por parte del médico tratante, clínico, veterinario, técnico, asistente o granjero, la composición se administra típicamente al sujeto o animal tan pronto como sea posible después de la descongelación. Alternativamente, la composición farmacéutica puede almacenarse, por ejemplo, en hielo o en un refrigerador o en una bolsa fría, a aproximadamente 2 °C a 5 °C durante un corto tiempo entre la descongelación y la administración. En este contexto, un breve período de tiempo normalmente no sería superior a varias horas, por ejemplo, no más de aproximadamente media hora, o no más de aproximadamente una hora, o no más de aproximadamente dos horas. Como los crioprotectores son típicamente tóxicos para las células y pueden causar pérdida de viabilidad si se mantienen descongelados, la composición, particularmente cuando comprende células viables, se inyecta típicamente al animal receptor tan pronto como sea posible después de la descongelación.

Se había considerado previamente que una suspensión almacenada (por ejemplo, una congelada) que comprende células madre mesenquimales requiere un período de tiempo en condiciones apropiadas de cultivo celular antes de su uso en un entorno terapéutico, por ejemplo, para ayudar en la recuperación celular. El inventor ha identificado sorprendentemente que el cultivo de una suspensión celular previamente congelada, tal como una suspensión celular derivada de tejido adiposo que comprende opcionalmente adipocitos, no es necesario antes del uso de la suspensión celular en un entorno terapéutico. Como se describe en la presente descripción, los beneficios de la administración de tal suspensión celular son evidentes cuando la suspensión celular se administra después de descongelar y sin intervenir el cultivo celular. Como se demuestra en los Ejemplos en la presente descripción, el almacenamiento de células en presencia de secreciones celulares derivadas de tejido adiposo proporciona beneficios adicionales. Por ejemplo, las células congeladas almacenadas en presencia de secreciones, opcionalmente una preparación clarificada o concentrada de secreciones, demuestran una eficacia terapéutica superior cuando se utilizan después de la recuperación del almacenamiento en comparación con las células congeladas almacenadas en ausencia de secreciones.

Una composición farmacéutica puede suministrarse en forma "lista para su uso". En tales aspectos, el usuario típicamente solo requiere descongelar a una temperatura aceptable para la administración antes de administrar la composición. En tales aspectos, la composición puede suministrarse en dosis premedidas, tales como una dosis premedida o predeterminada adecuada para un sujeto o animal receptor dado, por ejemplo, predeterminada sobre la base de la especie receptora, o sobre la base del individuo receptor, tal como una raza de perro pequeña, en comparación con una raza de perro grande, o un animal juvenil en comparación con un animal adulto. La dosis premedida puede, de forma alternativa o adicional, basarse en la enfermedad o afección que se trata o que se pretenda prevenir. Una forma lista para su uso de la composición puede comprender la composición suministrada con o en un dispositivo inyectable, tal como una jeringa. El dispositivo inyectable puede ser capaz de administrar una sola aplicación a un receptor individual o puede ser capaz de administrar una o múltiples aplicaciones a múltiples receptores. El dispositivo inyectable puede ser ajustable, por ejemplo, para permitir la administración de una variedad de dosis diferentes.

En los aspectos en los que la composición farmacéutica comprende una combinación de secreciones celulares derivadas de tejido adiposo y una suspensión celular derivada de tejido adiposo, que comprende opcionalmente adipocitos, la composición puede suministrarse al usuario como una combinación o como composiciones separadas para que el usuario las combine. Se entenderá que la referencia a un "usuario" en este contexto significa el individuo que realmente administra la composición terapéutica al sujeto o animal receptor y también significa un miembro del equipo o grupo que realiza esa administración. Por ejemplo, el usuario puede ser cualquier individuo que ayude en la aplicación de los métodos tal como un médico, un doctor, un veterinario, un granjero, una enfermera clínica, una enfermera veterinaria, un asistente técnico o un peón.

Trastornos inflamatorios

La composición farmacéutica puede administrarse para el tratamiento de un trastorno inflamatorio y/o para aliviar el dolor asociado con un trastorno inflamatorio en un sujeto.

La inflamación puede surgir como una respuesta a una lesión o estimulación anormal causada por un agente físico, químico o biológico. Una reacción inflamatoria puede incluir reacciones locales y cambios morfológicos resultantes, destrucción o eliminación del material dañino y respuestas que conducen a la reparación y curación. El término "inflamatorio" cuando se usa en referencia a un trastorno se refiere a un proceso patológico que es causado por, que resulta de o que da como resultado una inflamación que es inapropiada o que no se resuelve de la manera normal. Los trastornos inflamatorios pueden ser sistémicos o localizados en tejidos u órganos particulares.

Se sabe que la inflamación se produce en muchos trastornos que incluyen, pero no se limitan a: respuesta inflamatoria sistémica (SIRS); enfermedad de Alzheimer (y afecciones y síntomas asociados que incluyen: neuroinflamación crónica, activación glial; aumento de la microglía; formación de placa neurítica; y respuesta a la terapia); esclerosis lateral amiotrópica (ELA), artritis (y afecciones y síntomas asociados que incluyen, pero no se limitan a: inflamación articular aguda, artritis inducida por antígenos, artritis asociada con tiroiditis linfocítica crónica, artritis inducida por colágeno, artritis juvenil; artritis reumatoide, osteoartritis, pronóstico y artritis inducida por estreptococos, espondiloartropatías, artritis gotosa), asma (y afecciones y síntomas asociados, que incluyen: asma bronquial; enfermedad obstructiva crónica de las vías respiratorias; enfermedad pulmonar obstructiva crónica, asma juvenil y asma ocupacional); enfermedades cardiovasculares (y afecciones y síntomas asociados, que incluyen la aterosclerosis; miocarditis autoinmunitaria, hipoxia cardíaca crónica, insuficiencia cardíaca congestiva, enfermedad de las arterias coronarias, cardiomiopatía y disfunción de las células cardíacas, que incluyen: activación de las células del músculo liso aórtico; apoptosis de las células cardíacas; e inmunomodulación de la función de las células cardíacas, diabetes y afecciones asociadas, que incluyen diabetes autoinmunitaria, diabetes insulinodependiente (Tipo 1), periodontitis diabética, retinopatía diabética y nefropatía diabética); inflamaciones gastrointestinales (y afecciones y síntomas relacionados, que incluyen enfermedad celíaca, osteopenia asociada, colitis crónica, enfermedad de Crohn, enfermedad inflamatoria del intestino y colitis ulcerosa); úlceras gástricas; inflamaciones hepáticas tales como hepatitis viral y otros tipos de hepatitis, cálculos biliares de colesterol y fibrosis hepática, infección por VIH y afecciones asociadas, que incluyen respuestas degenerativas, respuestas neurodegenerativas y enfermedad de Hodgkin asociada al VIH, síndrome de Kawasaki y enfermedades y afecciones asociadas, que incluye el síndrome de los ganglios linfáticos mucocutáneos, linfadenopatía cervical, lesiones de las arterias coronarias, edema, fiebre, aumento de leucocitos, anemia leve, descamación de la piel, erupción, enrojecimiento de la conjuntiva, trombocitosis; trastornos inflamatorios de la piel, que incluyen dermatitis, tales como dermatitis atópica y afecciones asociadas; esclerosis múltiple, nefropatías y enfermedades y afecciones asociadas, que incluyen la nefropatía diabética, enfermedad renal en etapa terminal, glomerulonefritis aguda y crónica, nefritis intersticial aguda y crónica, nefritis lúpica, síndrome de Goodpasture, supervivencia en hemodiálisis y lesión por reperfusión isquémica renal, enfermedades neurodegenerativas y enfermedades y afecciones asociadas, que incluyen neurodegeneración aguda, inducción de IL-I en el envejecimiento y enfermedades neurodegenerativas, plasticidad inducida por IL-I de las neuronas hipotalámicas e hiperreactividad al estrés crónico, oftalmopatías y enfermedades y afecciones asociadas, que incluyen la retinopatía diabética, oftalmopatía de Graves y uveítis, osteoporosis y enfermedades y afecciones asociadas, que incluyen pérdida ósea alveolar, femoral, radial, vertebral o de muñeca o incidencia de fracturas, pérdida ósea posmenopáusica, masa, incidencia de fracturas o tasa de pérdida ósea, otitis media (adulta o pediátrica), pancreatitis o acinitis pancreática, enfermedad periodontal y enfermedades y afecciones asociadas, que incluyen de adultos, de inicio temprano y diabéticos; enfermedades pulmonares, que incluyen enfermedad pulmonar crónica, sinusitis crónica, enfermedad de la membrana hialina, hipoxia y enfermedad pulmonar en SIDS; reestenosis de injertos coronarios u otros injertos vasculares; reumatismo que incluye artritis reumatoide, cuerpos de Aschoff reumáticos, enfermedades reumáticas y miocarditis reumática; tiroiditis que incluye tiroiditis linfocítica crónica; infecciones del tracto urinario que incluyen prostatitis crónica, síndrome de dolor pélvico crónico y urolitiasis, trastornos inmunitarios, que incluyen enfermedades autoinmunitarias, tales como alopecia aerata, miocarditis autoinmunitaria, enfermedad de Graves, oftalmopatía de Graves, liquen escleroso, esclerosis múltiple, psoriasis, lupus eritematoso sistémico, esclerosis sistémica, enfermedades de la tiroides (por ejemplo, bocio y estruma linfomatosa (tiroiditis de Hashimoto, bocio linfadenoide), trastornos del sueño y síndrome de fatiga crónica y obesidad (no diabéticos o asociados con diabetes), resistencia a enfermedades infecciosas, tales como leishmaniasis, lepra, enfermedad de Lyme, carditis de Lyme, malaria, malaria cerebral, meningitis, nefritis tubulointersticial asociada con malaria), que son causadas por bacterias, virus (por ejemplo, citomegalovirus, encefalitis, virus de Epstein-Barr, virus de inmunodeficiencia humana, virus de la influenza) o protozoos (por ejemplo, Plasmodium falciparum, tripanosomas), respuesta al trauma, que incluye trauma cerebral (que incluye los accidentes cerebrovasculares e isquemias, encefalitis, encefalopatías, epilepsia, lesión cerebral perinatal, convulsiones febriles prolongadas, SIDS y hemorragia subaracnoidea), bajo peso al nacer (por ejemplo, parálisis cerebral), lesión pulmonar (lesión pulmonar hemorrágica aguda, síndrome de Goodpasture, reperfusión isquémica aguda), disfunción miocárdica, causada por contaminantes ocupacionales y ambientales (por ejemplo, susceptibilidad a la silicosis del síndrome del aceite tóxico), trauma por radiación y eficacia de las respuestas de curación de heridas (por ejemplo, quemaduras o heridas térmicas, heridas crónicas, heridas quirúrgicas y lesiones de la médula espinal), septicemia, hipotiroidismo, dependencia del oxígeno, anomalía craneal, menopausia de inicio temprano, una respuesta de un sujeto al trasplante (rechazo o aceptación), respuesta de fase aguda (por ejemplo, respuesta febril), respuesta inflamatoria general, respuesta de dificultad respiratoria aguda, respuesta inflamatoria sistémica aguda, cicatrización de heridas, adhesión, respuesta inmunoinflamatoria, respuesta neuroendocrina, desarrollo y resistencia de fiebre, respuesta de fase aguda, respuesta al estrés, susceptibilidad a enfermedades, estrés por movimientos repetitivos, codo de tenista, problemas de ligamentos y tendones y manejo y respuesta al dolor.

En aspectos particulares el trastorno inflamatorio es un trastorno inflamatorio relacionado con las articulaciones, tal como artritis.

Los métodos y composiciones pueden usarse para el tratamiento de lesiones del ligamento y lesiones del tendón o para el alivio del dolor asociado con tales lesiones. Las lesiones del ligamento y tendones, en algunas formas, pueden clasificarse como trastornos inflamatorios. Algunas lesiones del ligamento y tendones pueden no considerarse trastornos inflamatorios. Para evitar dudas, las lesiones del ligamento y las lesiones del tendón contempladas pueden ser aquellas que son trastornos inflamatorios o están asociados con ellos y las que pueden no considerarse trastornos inflamatorios.

Los métodos y composiciones pueden usarse junto con otros tratamientos, tales como los de enfermedades inflamatorias. Como se demuestra en la solicitud de patente australiana núm. 2009201915 y en la publicación internacional núm. WO2010/020005, la administración de una composición que comprende células derivadas de tejido adiposo, cuya composición comprende adipocitos, directamente en una articulación afectada por enfermedades inflamatorias, tal como la osteoartritis, proporciona beneficios terapéuticos para el paciente y está asociada con la mejora de la articulación. Además, se ofrece un tratamiento adjunto, mediante el cual, por ejemplo, puede comenzarse un régimen de tratamiento mediante la administración de la composición que comprende células derivadas de tejido adiposo, cuya composición comprende adipocitos, en la articulación afectada, y que es seguida por el curso de tratamiento menos invasivo utilizando la el suministro alejado.

La presente divulgación también puede ofrecer ventajas como un tratamiento complementario para la artritis y otras enfermedades inflamatorias en combinación con tratamientos establecidos. Por ejemplo, un efecto secundario del tratamiento a largo plazo de afecciones inflamatorias que utilizan AINE es la insuficiencia renal. Esto ofrece una alternativa al uso continuado de AINE en pacientes con signos de insuficiencia renal. Alternativamente, el uso de la presente divulgación en combinación con AINE puede permitir que los AINE se usen en una dosificación reducida, lo que retrasa de este modo la aparición de insuficiencia renal.

La presente divulgación puede usarse en combinación con cualquier terapia conocida para enfermedades inflamatorias, incluido el uso con cualquiera de cartrofeno, metacam, previcox, tramadol. Los métodos y composiciones pueden usarse junto con medicamentos a base de hierbas, tales como valeriana, aceite de romero y hojas de yuca.

Se describe la preparación de las secreciones celulares por adelantado, de manera que un producto que comprende las secreciones celulares derivadas de tejido adiposo puede estar disponible sin la necesidad de anestesiar a un sujeto para la extracción del tejido adiposo. También se describe la preparación de composiciones que comprenden (i) secreciones celulares derivadas de tejido adiposo, o (ii) una suspensión celular derivada de tejido adiposo, que comprende opcionalmente adipocitos, o (iii) una combinación de (i) y (ii), en avance de una necesidad de tratamiento. Como se describe en la presente descripción, las secreciones celulares u otras composiciones pueden almacenarse, por ejemplo, a -20°C °C o menos, hasta que se requieran para su uso.

Animales de ganadería intensiva

Como resultado de la selección intensiva de animales de granja durante muchas generaciones para características deseables, tales como crecimiento rápido, gran masa muscular y conversión alimenticia eficiente en animales criados para la producción de carne (por ejemplo, cerdos y ganado) y calidad y volumen de leche en animales lecheros, las razas modernas de animales de granja frecuentemente tienen una mayor prevalencia de susceptibilidad a enfermedades y afecciones agudas y crónicas que las poblaciones silvestres o de ganadería menos intensiva. La incidencia y la gravedad de la manifestación de tales enfermedades y afecciones pueden verse agravadas por la forma en que se cría un animal. Los animales criados en condiciones de ganadería intensiva, tal como por ejemplo en porquerizas densamente pobladas o en lotes de alimento, típicamente son susceptibles a una mayor incidencia de enfermedades y afecciones de crecimiento potencialmente perjudiciales que los animales criados en condiciones menos intensivas, tal como un campo libre o una situación de pastoreo abierto. Sin embargo, debido a la selección intensiva, como se describió anteriormente, incluso los animales criados al aire libre o en operaciones de pastoreo abierto pueden tener una mayor susceptibilidad o prevalencia de afecciones de salud perjudiciales. En el contexto de esta divulgación, por lo tanto, se entenderá que la referencia a animales de ganadería intensiva o condiciones de ganadería intensiva incluye animales de reproducción intensiva que pueden criarse en operaciones densamente pobladas, por ejemplo, con disponibilidad limitada para el movimiento individual, y también incluye animales de reproducción intensiva en operaciones menos densamente pobladas, tal como cuando un individuo tiene acceso a pastizales al aire libre o en pastoreo abierto.

La identificación por parte del inventor de que las composiciones terapéuticas son eficaces cuando se administran por vía subcutánea o intramuscular conduce a que los métodos y composiciones tengan efectos beneficiosos en las operaciones de ganadería y en la ganadería de animales particularmente intensiva, tal como la ganadería intensiva de cerdos, vacas, ovejas y aves. Si bien puede administrarse un agente terapéutico para una enfermedad localizada, tal como una articulación artrítica, mediante inyección intraarticular en la articulación afectada, tal administración requiere un alto grado de experiencia por parte del operador, así como también de causar potencialmente dolor al animal al manipular la articulación afectada y, por tanto, se requiere sujeción del animal que se trata. En contraste, la inyección subcutánea o la inyección intramuscular tienen un requisito de experiencia menor por parte del operador, generalmente no requerirá la manipulación de la extremidad afectada y típicamente solo requiere una restricción mínima del animal que se trata. Con la ausencia del requisito de un alto grado de experiencia del operador, en comparación con la inyección intraarticular, por ejemplo, la administración de las composiciones puede emprenderse como parte de un tratamiento rutinario en la granja o un programa preventivo. En tal enfoque, pueden administrarse las composiciones a los animales al mismo tiempo que los animales que se tratan por otras afecciones, o al mismo tiempo que los animales que se someten a procedimientos de rutina asociados con la cría de animales o la empresa de cultivo, tales como vacunación, etiquetado de oídos, tatuaje, corte de cola o castración.

Las generaciones de animales de reproducción selectiva de una especie en particular para un rasgo deseable ha contribuido al aumento de la prevalencia de ciertas características indeseables en la población. Por ejemplo, los cerdos se han seleccionado durante muchos años por su rápido crecimiento, gran masa muscular y una conversión alimenticia eficiente. Sin embargo, esto ha llevado a una prevalencia mucho mayor de problemas esqueléticos, articulares y cartilaginosos que los que se observan en una población silvestre. Estos problemas pueden agravarse en una operación de ganadería en la que el animal tiene un espacio limitado para moverse. Los cambios asociados con las estructuras cartilaginosas pueden denominarse debilidad de las piernas u osteocondrosis (OCD). El término "debilidad de las piernas" también se usa a veces para describir la conformación deficiente de la pierna o para describir una afección clínica asociada con cojera o rigidez. Puede surgir debido a cambios anormales en el cartílago articular y las placas de crecimiento (epifisarias), que son responsables del crecimiento de los huesos tanto en longitud como en diámetro. Los mecanismos exactos que causan estos cambios no se comprenden completamente. Se cree que surgen debido a la presión y las tensiones que se ejercen sobre estos tejidos de rápido crecimiento, lo que reduce el suministro de oxígeno y provoca un crecimiento y una consistencia anormales del cartílago. También se cree que la reducción del suministro de sangre a través de una deficiencia de los vasos sanguíneos contribuye a tales problemas. El daño al cartílago tiende a ser progresivo e irreversible, con reemplazo del cartílago dañado por tejido fibroso.

El acortamiento y la flexión de los huesos cerca de las articulaciones y en las extremidades de los huesos largos pueden seguir al daño del cartílago. Las placas epifisarias débiles también tienen tendencia a fracturarse y el cartílago que cubre las superficies articulares puede partirse y formar fisuras. En los cerdos modernos, estos cambios en el cartílago se producen desde los dos meses de edad. Estos cambios potencialmente perjudiciales generalmente no son clínicamente evidentes en una etapa temprana. En las empresas de cría, no es infrecuente que entre el 20 % y el 30 % de los verracos y las primerizas sean sacrificados debido a la debilidad y deformidades de las patas. Tales condiciones, incluida la OCD, tienen el potencial de tener graves consecuencias económicas y éticas para la empresa ganadera. Actualmente no existe un tratamiento específico para la OCD. En etapas avanzadas, la OCD también puede provocar artritis y cojera permanente.

Las composiciones son beneficiosas para el crecimiento, reparación y maduración de huesos y cartílagos. En consecuencia, se proporcionan métodos para el tratamiento o la prevención de trastornos óseos y cartilaginosos en un animal, incluida la debilidad de las patas o la OCD. Dado que la OCD puede provocar artritis en un animal afectado, los métodos y composiciones también pueden ser eficaces para prevenir la aparición o reducir la gravedad o incidencia de artritis en un animal con riesgo de artritis. En aspectos preferidos el animal es un cerdo. Como se describió anteriormente, tales afecciones comienzan a una edad temprana y, en las primeras etapas del desarrollo, típicamente no están asociadas con ningún síntoma clínico. En los métodos, la composición terapéutica puede administrarse a un animal que presenta síntomas clínicos de una enfermedad articular o a un animal que no presenta síntomas clínicos de una enfermedad articular.

Los síntomas clínicos pueden incluir separación o fractura de los huesos en la placa epifisaria (epifisólisis) asociada con movimientos repentinos, cojera, fracturas repentinas (tal como en las articulaciones de la rodilla y el codo) que pueden ser más comunes en animales jóvenes, conformación anormal de las piernas, marcha anormal, rigidez, dolor. La edad de aparición visible de la OCD puede ser variable, por ejemplo, dentro de los tres meses posteriores a la introducción de las primerizas en una granja, durante el primer embarazo, en la lactancia o en las primeras dos o tres semanas después del destete.

En un aspecto, se proporciona un método para reducir la gravedad de la OCD en un animal, el método comprende administrar a dicho animal una composición farmacéutica que comprende (i) secreciones celulares derivadas de tejido adiposo, o (ii) una suspensión celular derivada de tejido adiposo, que comprende opcionalmente adipocitos, o (iii) una combinación de (i) y (ii), en donde la administración es por inyección subcutánea o inyección intramuscular. En aspectos preferidos el animal es un cerdo.

La administración de la composición farmacéutica al animal receptor puede ocurrir cuando el animal tiene cualquier edad adecuada. Para prevenir la aparición de síntomas clínicos de la OCD o para reducir la gravedad de la OCD en un cerdo, el receptor se trata preferentemente a una edad temprana. Por ejemplo, un cerdo puede tratarse en el destete o poco después, lo que ocurre típicamente en una operación de ganadería de cerdos cuando los lechones tienen entre aproximadamente dos y cinco semanas de edad. Los cerdos jóvenes pueden ser tratados entre aproximadamente un mes y seis meses de edad, o entre aproximadamente tres meses y seis meses de edad. En las porquerizas, los cerdos pasan por una fase de crecimiento rápido entre las 12 y las 16 semanas de edad. Se prevé que, en un aspecto, la administración de las composiciones sería al comienzo de este período de crecimiento, por ejemplo alrededor de las 8 semanas de edad, o 9 semanas de edad, o 10 semanas de edad, u 11 semanas de edad, o 12 semanas de edad o 13 semanas de edad.

El animal puede recibir una sola administración de la composición o puede recibir múltiples administraciones, tales como dos, tres, cuatro o más administraciones. Cuando se realizan múltiples administraciones de la composición, normalmente estarán separadas por aproximadamente uno, dos, tres o cuatro meses en el caso de la administración a cerdos jóvenes.

El método también es beneficioso en el tratamiento de la OCD sintomática. En tales casos, el animal receptor es típicamente un animal mayor, tal como más de seis meses de edad. En animales más viejos, la administración múltiple de las composiciones puede estar separada por aproximadamente dos a seis semanas, o por aproximadamente uno, dos, tres o cuatro meses o más. La elección del momento de la administración múltiple puede ser determinada por el destinatario experto, por ejemplo, puede basarse en la reaparición o el aumento de la gravedad de los síntomas, el embarazo, el destete, etc.

Como se describió anteriormente, las composiciones y métodos encuentran aplicación para prevenir la aparición de la OCD en cerdos y para reducir la gravedad de la OCD y otras afecciones ortopédicas del desarrollo en cerdos. Otros mamíferos, incluidos humanos, perros, ganado y caballos, también pueden padecer afecciones ortopédicas del desarrollo, tal como la OCD, por ejemplo, a través de la predisposición debida al medio ambiente o la genética. Las composiciones también pueden encontrar aplicación para prevenir la aparición, la gravedad o el tratamiento de afecciones ortopédicas del desarrollo, tal como la OCD, en tales animales.

Como se describe en la presente descripción, las composiciones también pueden tratar enfermedades de las articulaciones, artritis y afecciones inflamatorias en mamíferos afectados. Las composiciones también son útiles para aliviar el dolor en sujetos mamíferos. El mamífero puede ser cualquier mamífero tal como un ser humano, un animal doméstico, un animal de granja, tal como un semental, un reproductor o un animal de cría, tal como para la producción de carne o lácteos. En el tratamiento de la artritis clínicamente relevante, por ejemplo, el animal de granja puede ser un cerdo. El cerdo puede ser un cerdo joven o una cerda reproductora. Por ejemplo, una cerda preñada clínicamente afectada puede recibir tratamiento para ayudarla a llegar al parto.

Tratamiento del dolor

El inventor ha identificado que las composiciones son útiles en el tratamiento de sujetos que tienen dolor. En este documento se describen varios tipos específicos de dolor, incluidos los siguientes.

Afecciones musculoesqueléticas dolorosas distintas de la artritis.

Las afecciones musculoesqueléticas dolorosas son comunes, con una prevalencia de aproximadamente el 30 %. Para afecciones musculoesqueléticas distintas de la artritis, el pronóstico es generalmente bueno; la mayoría de las personas se recuperan unas pocas semanas después de la aparición de los síntomas. Sin embargo, una minoría significativa no se recupera y desarrolla dolor crónico o de larga duración, definido como dolor que dura más de 3 meses. Para estos pacientes, el pronóstico es malo y la recuperación es lenta. Un enfoque principal de la investigación contemporánea es la identificación temprana de pacientes que tienen un alto riesgo de tener un resultado desfavorable. Un hallazgo común de esta investigación es que la alta intensidad del dolor temprano es un factor de riesgo para la recuperación tardía y el desarrollo de dolor crónico.

La causa más frecuente de dolor musculoesquelético crónico es la lumbalgia. Más de 1 millón de australianos tienen una discapacidad asociada con sus problemas de espalda y es la razón principal por la que los australianos abandonan la fuerza laboral. Otras afecciones de dolor crónico comunes pero menos prevalentes incluyen: dolor de cuello y hombro, trastorno asociado al latigazo cervical (WAD) y síndrome de dolor regional complejo (CRPS).

El dolor de espalda es una afección de salud extremadamente común, difícil de manejar y costosa. En Australia, el dolor de espalda está asociado con costos de alrededor de $9 mil millones/año. Más del 85 % del dolor lumbar es un dolor lumbar "inespecífico" (NSLBP), ya que no puede identificarse de manera confiable una fuente estructural del dolor. Los objetivos terapéuticos plausibles son los tejidos inervados e incluyen el disco, la articulación facetaria y la articulación sacroilíaca; sin embargo, también pueden estar implicados otros tejidos tales como el músculo y el ligamento. Hasta el 15 % del dolor lumbar es una radiculopatía en la que el pinzamiento de la raíz nerviosa causa síntomas que incluyen dolor de espalda y piernas. Se cree que el dolor asociado con la radiculopatía está asociado con un proceso inflamatorio local. Los tratamientos para el dolor radicular incluyen consejos para mantenerse activo, analgesia que incluya AINE, inyección epidural de corticosteroides e inyecciones perirradiculares transfroaminales de corticosteroides.

Dolor de cuello y hombros

El trastorno asociado al latigazo cervical (WAD) son lesiones en el cuello causadas por la transferencia de energía de aceleración-desaceleración que resultan más comúnmente de un accidente automovilístico. Como ocurre con la mayoría de las afecciones musculoesqueléticas dolorosas, el pronóstico de nuevas lesiones es típicamente bueno en las primeras semanas o meses, pero después de 3 meses, las tasas de recuperación disminuyen notablemente y una proporción significativa de pacientes desarrolla el trastorno crónico asociado al latigazo cervical (WAD). Se sabe que la alta intensidad del dolor es un predictor o un mal resultado. El latigazo cervical es en gran parte resistente a los tratamientos conservadores.

Síndrome de dolor regional complejo

El síndrome de dolor regional complejo (CRPS) es una complicación de un traumatismo menor, generalmente en una extremidad, que se caracteriza por dolor incapacitante, hinchazón, cambios de color y temperatura y desmineralización ósea en la extremidad. En Australia, un promedio de 5000 personas son diagnosticadas con CRPS cada año. El traumatismo menor más común causante es la fractura de muñeca. La incidencia de CRPS después de una fractura de muñeca es del 5-7 %. El pronóstico es malo y las opciones de tratamiento frecuentemente son altamente invasivas, tienen perfiles de efectos secundarios significativos y solo son moderadamente efectivos. Se cree que la principal causa de CRPS es una respuesta inflamatoria aberrante a la lesión tisular y los pacientes con CRPS expresan un equilibrio más proinflamatorio de mediadores inflamatorios en comparación con aquellos sin la afección.

Dolor neuropático

El inventor ha identificado que las composiciones son útiles en el tratamiento de sujetos que tienen dolor para el que no existe una causa clínica discernible, tales como algunas formas de dolor neuropático. El dolor neuropático se refiere a un grupo de trastornos dolorosos caracterizados por dolor debido a una disfunción o enfermedad del sistema nervioso a nivel periférico, a nivel central o ambos. Es una entidad compleja con muchos síntomas y signos que fluctúan en número e intensidad con el tiempo. Los tres componentes comunes del dolor neuropático son dolor constante y neurálgico; ataques espontáneos paroxísticos; e hipersensibilidad.

El dolor neuropático puede ser muy incapacitante, severo e intratable, lo que provoca angustia y sufrimiento a las personas, incluyendo disestesia y parestesia. También se observan con frecuencia déficits sensoriales, tal como pérdida parcial o compleja de la sensibilidad. Además, existen importantes consecuencias psicológicas y sociales vinculadas al dolor neuropático crónico, que contribuyen a una reducción de la calidad de vida.

El dolor neuropático es bastante común en la práctica médica general. En algunas formas, el dolor neuropático no se asocia con ninguna afección clínica causal discernible. Como ejemplo, se demuestra en la presente descripción que las composiciones son eficaces para aliviar el dolor facial neuropático. En algunas formas, el dolor neuropático se asocia con una afección clínica discernible. La prevalencia de la neuralgia del trigémino es de 2,1 a 4,7 personas por cada 100000 habitantes, y la neuropatía diabética dolorosa se produce en el 11 % al 16 % de los diabéticos tipo 1, así como también en los diabéticos tipo II, y la neuralgia postherpética se encuentra en aproximadamente 34 personas por cada 100000 de la población. El tratamiento del dolor neuropático no es sencillo. Los pacientes con dolor neuropático no siempre responden a los analgésicos estándar, tales como los antiinflamatorios no esteroideos (AINE) y, hasta cierto punto, el dolor neuropático es resistente a los opiáceos. Los agentes farmacológicos mejor estudiados y más usados para el tratamiento del dolor neuropático son los antidepresivos y los anticonvulsivos, los cuales pueden tener efectos secundarios graves.

Puede administrarse una composición a un sujeto para el tratamiento de tal dolor en cualquier sitio apropiado. La administración puede ser típicamente con el uso de un tipo apropiado de inyección o puede ser por aplicación tópica. Por ejemplo, una inyección puede ser subcutánea, intramuscular o directamente en un sitio accesible en o cerca de un sitio del dolor. Como este tipo de dolor puede manifestarse en múltiples áreas del cuerpo del sujeto, por ejemplo dolor de mandíbula y dolor de extremidades u hombros, la administración puede ser en o cerca de un sitio del dolor y lejos de otro sitio afectado por el dolor. Típicamente, cuando en un paciente se producen múltiples sitios de dolor, la administración es en o cerca de un sitio identificado como un sitio original o primario del dolor. Como ilustración de este tratamiento, los ejemplos en la presente descripción muestran el tratamiento del dolor facial neuropático mediante inyección en la encía del sujeto. A un sujeto en tratamiento se le puede administrar una sola aplicación de una composición, tal como una sola inyección, o se le pueden administrar múltiples aplicaciones, tal como múltiples inyecciones.

Ejemplos

Ejemplo 1. Preparación de un extracto libre de células

Preparación de tejido adiposo

Se recolectó una muestra de 10 g de tejido adiposo mediante escisión de la almohadilla de grasa inguinal de un perro. El tejido adiposo se enjuagó con solución salina y después se trituró finamente con el uso de tijeras y se mezcló con 20 ml de medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, Sigma). Se añadió colagenasa (Sigma) para producir una concentración final de 0,05 % p/v y la muestra se incubó a 37 °C durante 30 minutos. Al final de los 30 minutos, el tejido adiposo estaba parcialmente digerido y consistía en una mezcla de partículas de grasa parcialmente digeridas, células vasculares estromales liberadas (SVC) y adipocitos liberados. Después, la muestra se centrifugó a 500 g durante 15 minutos. Cuatro capas distintas fueron visibles dentro de la muestra centrifugada: una capa pequeña (2 mm de espesor) de lípido libre en la superficie, debajo de la cual había una capa blanca de 20 mm de espesor de tejido adiposo y adipocitos y después una gran capa transparente de DMEM y después un sedimento de células no adipocitarias derivadas de tejido adiposo. La pequeña capa de lípido se eliminó cuidadosamente con una pipeta pasteur. Después, se insertó cuidadosamente una pipeta pasteur nueva a través de los adipocitos y se eliminó el DMEM transparente sin alterar el tejido adiposo flotante, los adipocitos o las células sedimentadas. Esto dio como resultado una muestra que contenía solo los trozos flotantes de tejido adiposo y adipocitos suspendidos en un pequeño volumen de DMEM y las células sedimentadas. Los trozos de tejido adiposo y adipocitos y las células sedimentadas se mezclaron suavemente con una pipeta pasteur y se transfirieron a un tubo de centrífuga de 15 ml. Los trozos de tejido adiposo y células se lavaron después en DMEM para eliminar la colagenasa de la siguiente manera. Se añadió DMEM a un volumen final de 14 ml y la muestra se centrifugó a 500 g durante 10 minutos. Esto dio como resultado tres capas distintas: trozos flotantes de tejido adiposo y adipocitos, DMEM y células no adipocitarias derivadas de tejido adiposo sedimentadas. El DMEM se eliminó cuidadosamente al insertar una pipeta pasteur a través de los adipocitos teniendo cuidado de no alterar los trozos de tejido adiposo, adipocitos o las células sedimentadas.

Cultivo de tejidos

Los trozos flotantes de tejido adiposo y adipocitos y las células sedimentadas se resuspendieron suavemente en 10 ml de DMEM y se transfirieron a un matraz de cultivo de tejidos de 300 ml. Se añadió un volumen de 30 ml de DMEM y 10 ml de suero estéril autólogo y después el matraz se incubó a 37 °C con 5 % de CO2. El matraz se examinó diariamente mediante microscopía. Las células se adhirieron y tenía apariencia de fibroblastos entre los días 3 y 6. Las células adheridas se volvieron confluentes entre los días 5 y 10.

Cosecha de secreciones celulares libres de células

Una vez que las células confluyeron en la base del matraz, se cosechó el sobrenadante y el tejido adiposo suspendido y las células se eliminaron por filtración a través de una malla de 20 micras. La solución se esterilizó por filtración a través de un filtro de 0,22 micras y después se dispensó asépticamente en viales de 10 ml y se almacenó congelada a -20 °. En los Ejemplos que siguen, este material puede denominarse "CellFree".

Ejemplo 2. Producción de extractos concentrados libres de células caninas

Se secaron por congelación volúmenes (100 ml) de los extractos congelados libres de células del Ejemplo 1 en un secador por congelación Telstar Lyobeta durante 2 días. La torta secada por congelación resultante se rehidrató con 10 ml de agua destilada. Después, la muestra concentrada se sonicó en un baño de agua de sonicación durante 20 min. Los volúmenes de 10 ml contenían una mezcla concentrada de citocinas.

Ejemplo 3. Administración subcutánea de extractos libres de células de tejido adiposo canino a perros artríticos En este ejemplo, se investigó la seguridad y eficacia de las inyecciones subcutáneas de las secreciones celulares caninas preparadas de acuerdo con el Ejemplo 1 anterior, en el tratamiento de la osteoartritis en perros. Cinco perros recibieron cada uno inyecciones subcutáneas en el pescuezo una vez por semana durante cuatro semanas a la tasa de 0,3 ml/10 kg de peso corporal. Los perros en este ensayo eran predominantemente de edad avanzada (> 10 años) y tenían una variedad de trastornos articulares o óseos, que incluían osteoartritis del codo, displasia crónica de cadera, enfermedad de la rodilla y temblores. Individualmente, los perros de este ensayo recibieron una variedad de medicamentos para el tratamiento de sus afecciones (Tabla 1). La medicación existente se suspendió mientras se realizaba el ensayo. Los perros fueron evaluados por sus veterinarios que los trataban habitualmente, además de ser observados por sus dueños en busca de cambios anecdóticos, tales como cambios en el comportamiento, la movilidad y signos obvios de dolor. El ensayo se resume en la Tabla 1.

Tabla 1: Administración subcutánea de extractos libres de células de tejido adiposo canino a perros artríticos

No se observaron reacciones adversas con inyecciones repetidas. Los cinco perros no se deterioraron a pesar de que se suspendieron sus medicamentos actuales. Tres de los cinco perros mostraron una mejora significativa por encima de lo que se observó con sus medicamentos anteriores.

Ejemplo 4. Administración subcutánea de secreciones concentradas del tejido adiposo canino a perros artríticos Los resultados de los ensayos presentados en el Ejemplo 3 demostraron que no hay efectos adversos asociados con el método y también demostraron que en algunos sujetos tratados la administración alejada de las secreciones celulares derivadas de tejido adiposo se asoció con una mejor actividad del sujeto, una mejor movilidad o un grado de dolor aparentemente menor. El inventor razonó que la administración de una dosis más alta de secreciones celulares derivadas de tejido adiposo puede proporcionar ventajas adicionales.

Se usó un Extracto concentrado libre de células producido como se describe en los Ejemplos 1 y 2 para tratar 9 perros artríticos. Se administró un volumen de 2 ml del extracto concentrado libre de células mediante inyección subcutánea en el pescuezo. Los perros fueron reexaminados después de 10 días por un veterinario. Los resultados se presentan en la Tabla 2.

Tabla 2: Administración subcutánea de secreciones concentradas de tejido adiposo canino a perros artríticos

Ejemplo 5. Administración subcutánea de extractos libres de células de tejido adiposo canino a perros con dermatitis atópica.

Se administró un extracto libre de células preparado como se describe en el Ejemplo 1 mediante inyección subcutánea a tres perros con dermatitis atópica. Se inyectó un volumen de 3 ml en el pescuezo, una vez a la semana durante 3 semanas. Los tres perros mostraron una mejoría cuando se evaluaron mediante un examen veterinario entre 2 y 4 semanas después del tratamiento, su condición mejoró, donde la reducción de la inflamación fue el resultado principal (Tabla 3).

Tabla 3: Administración subcutánea de extractos libres de células de tejido adiposo canino a perros con dermatitis atópica.

Ejemplo 6. Administración subcutánea de extractos concentrados libres de células de tejido adiposo equino en un caballo cojo.

Se preparó un extracto libre de células equinas como se describe en el Ejemplo 1 con el uso de tejido adiposo recolectado de la base de la cola de un caballo. El tejido adiposo se procesó exactamente como se describe en el Ejemplo 1, excepto que se añadió suero equino autólogo al matraz de cultivo de tejidos en lugar de suero canino. El extracto libre de células se concentró mediante secado por congelación como se describe en el Ejemplo 2.

Se administró un volumen de 2 ml del extracto concentrado libre de células mediante inyección subcutánea en el cuello de un caballo de carreras que estaba ligeramente cojo. El caballo había sido tratado previamente con inyecciones intraarticulares de esteroides y ya no respondía a este tratamiento.

El caballo mostró una marcada reducción de la cojera dos días después de la administración del extracto libre de células.

Ejemplo 7: Administración subcutánea de extractos concentrados libres de células de tejido adiposo equino en caballos.

Se trataron cinco caballos con daño del ligamento suspensorio o con osteoartritis de las rodillas en etapa temprana con secreciones equinas concentradas (Ejemplo 6) mediante inyección subcutánea en el cuello dos días antes de la carrera. Todos los caballos demostraron una movilidad mejorada (Tabla 4).

Tabla 4: Administración subcutánea de extractos concentrados libres de células de tejido adiposo equino en caballos

Ejemplo 8. Tratamiento de la osteoartritis en perros mediante inyección subcutánea de células derivadas de tejido adiposo alogénicas crioconservadas, incluidos los adipocitos.

Procesamiento de tejido adiposo

Se recolectó una muestra de 10 g de tejido adiposo falciforme de una perra durante un procedimiento rutinario de desexcitación. El tejido adiposo se enjuagó con solución salina y después se trituró finamente con el uso de tijeras y se mezcló con 20 ml de medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, Sigma). Se añadió colagenasa (Sigma) hasta una concentración final de 0,05 % (p/v) y la muestra se incubó a 37 °C durante 90 minutos. Durante la incubación, la muestra se invirtió suavemente a mano cada 15 minutos.

Después del tratamiento con colagenasa, la muestra se filtró asépticamente a través de una malla de acero inoxidable (tamaño de poro de 700 micras), se transfirió a un tubo de centrífuga de 50 ml y se centrifugó a 500 g durante 15 minutos.

Cuatro capas distintas fueron visibles dentro de la muestra centrifugada: una capa pequeña (2 mm de espesor) de lípido libre en la superficie, debajo de la cual había una capa blanca de adipocitos de 10 mm de espesor y después una gran capa transparente de DMEM y después un sedimento de células SVF. La pequeña capa de aceite se eliminó cuidadosamente con una pipeta pasteur. Después, se insertó cuidadosamente una pipeta pasteur nueva a través de los adipocitos y se eliminó el DMEM transparente sin alterar los adipocitos flotantes o las células SVF sedimentadas. Esto dio como resultado una muestra que contenía solo los adipocitos flotantes y las células SVF sedimentadas. Las células flotantes y sedimentadas se mezclaron suavemente con una pipeta pasteur y se transfirieron a un tubo de centrífuga de 15 ml.

A continuación, las células se lavaron en DMEM para eliminar la colagenasa. Se añadió DMEM hasta un volumen final de 14 ml y la muestra se centrifugó a 500 g durante 10 minutos. Esto dio como resultado tres capas distintas: adipocitos flotantes, DMEM y células SVF sedimentadas. El DMEM se eliminó cuidadosamente al insertar una pipeta pasteur a través de los adipocitos teniendo cuidado de no alterar los adipocitos o las células sedimentadas.

Las células flotantes y sedimentadas se resuspendieron suavemente en 4 ml de DMEM y se mezclaron con una pipeta pasteur.

Expansión y crioconservación de células

Se transfirieron alícuotas (0,5 ml) de la suspensión celular a un matraz de cultivo de tejidos T175 que contenía 50 ml de DMEM más suero canino al 10 % y se incubaron en una incubadora de CO2 a 37 °C hasta que estuvo presente una monocapa de células confluente (6 días). Las células flotantes (adipocitos) todavía tenían una morfología saludable en este momento.

Las células se separaron con 3 ml de TrypLE Express (Invitrogen), se decantaron en tubos de centrífuga de 50 ml y se centrifugaron a 500 x g durante 10 minutos. Las células flotantes y sedimentadas se resuspendieron en 2 ml de suero canino más DMSO al 10 % y se transfirieron a un criovial. Los crioviales se congelaron en un dispositivo de congelación lenta Mr Frosty (Invitrogen) en un congelador a -80 °C durante 24 horas y después se transfirieron a un Dewar de nitrógeno líquido.

Administración de células a perros

A siete perros con osteoartritis se les administró una única inyección subcutánea de células en el pescuezo. El criovial por perro se descongeló a temperatura ambiente y la suspensión celular se extrajo con una jeringa y una aguja hipodérmica. Se inyectaron los 2 ml completos de suspensión celular.

Monitorización de perros

Los perros fueron monitorizados durante un período de 8 semanas por sus dueños y fueron examinados por un veterinario. Seis de los siete perros mostraron una notable mejora en su movilidad y una aparente reducción del dolor. El séptimo perro no mejoró pero no mostró una respuesta negativa.

Ejemplo 9. Tratamiento de la osteoartritis en perros mediante inyección subcutánea de células mezcladas con secreciones celulares.

Se extrajo del nitrógeno líquido un vial de las células crioconservadas como se describe en el Ejemplo 8 y se mezcló con 5 ml de secreciones caninas calientes (37 °C) preparadas como en el Ejemplo 1. Después, se extrajeron las células y las secreciones en una jeringa y se administraron por vía subcutánea en la piel de un perro con artritis. El perro respondió bien al tratamiento y mostró una rápida mejora de la movilidad y una reducción del dolor.

Ejemplo 10. Preparación de células derivadas de tejido adiposo premezcladas con secreciones celulares y después congeladas.

Procesamiento de tejido adiposo

Se recolectó una muestra de 10 g de tejido adiposo falciforme de una perra durante un procedimiento rutinario de desexcitación. El tejido adiposo se enjuagó con solución salina y después se trituró finamente con el uso de tijeras y se mezcló con 20 ml de medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, Sigma). Se añadió colagenasa (Sigma) hasta una concentración final de 0,05 % p/v y la muestra se incubó a 37 °C durante 90 minutos. Durante la incubación, la muestra se invirtió suavemente a mano cada 15 minutos.

Las células flotantes y el sobrenadante se descartaron y las células sedimentadas se mezclaron suavemente con una pipeta pasteur y se transfirieron a un tubo de centrífuga de 15 ml.

A continuación, las células se lavaron en DMEM para eliminar la colagenasa. Se añadió DMEM hasta un volumen final de 14 ml y la muestra se centrifugó a 500 g durante 10 minutos. El sobrenadante se descartó y las células SVF sedimentadas se resuspendieron suavemente en 4 ml de DMEM y se mezclaron con una pipeta pasteur.

Expansión de células

Se transfirieron alícuotas (0,5 ml) de la suspensión celular a matraces de cultivo de tejidos que contenían DMEM más suero canino al 10 % y se incubaron en una incubadora de CO2 a 37 °C hasta que estuvo presente una monocapa de células confluentes (7 a 10 días). Las células se separaron con 3 ml de TrypLE Express (Invitrogen), se decantaron en tubos de centrífuga de 50 ml y se centrifugaron a 500 x g durante 10 minutos. Las células se crioconservaron en este punto, en un dispositivo de congelación lenta Mr Frosty como se describe en el Ejemplo 8, o se colocaron en nuevos matraces de cultivo de tejidos y se subcultivaron más hasta que se duplicaron aproximadamente 8 o 13 veces. Después, las células subcultivadas se separaron y centrifugaron.

Crioconservación de células

Las muestras de células sedimentadas (sin subcultivo, aproximadamente 8 duplicaciones y aproximadamente 13 duplicaciones) se dividieron cada una en dos muestras, una se mezcló con secreciones concentradas y la otra no. Las células se resuspendieron ya sea en suero canino o en una mezcla de suero canino más secreciones caninas concentradas que se produjeron de acuerdo con el Ejemplo 1 pero que se habían concentrado diez veces mediante centrifugación en un tubo de filtro centrífugo Amicon de 3 kDa (Millipore). Las secreciones concentradas se mezclaron con suero canino en una relación de 1 a 1 o en una relación de 1 parte de secreciones concentradas por 10 partes de suero. La suspensión celular se mezcló con el suero y las secreciones y después se mantuvo a temperatura ambiente durante 30 minutos para permitir que las secreciones interactuaran con las células. Las suspensiones celulares se transfirieron después a crioviales en alícuotas de 2 ml.

Se añadió DMSO a cada criovial para producir una concentración final del 10 % y los crioviales se congelaron en un dispositivo de congelación lenta Mr Frosty (Invitrogen) en un congelador a -80 °C durante 24 horas y después se transfirieron a un dewar de nitrógeno líquido durante un período de almacenamiento prolongado.

Descongelación de células crioconservadas y análisis de viabilidad celular

Los viales se retiraron del nitrógeno líquido y se dejaron descongelar a temperatura ambiente. Los viales se mezclaron invirtiéndolos suavemente y después se extrajo un volumen de 0,1 ml para medir la viabilidad. El volumen de 0,1 ml se colocó en un tubo de citometría de flujo y se mezcló con 0,9 ml de Isoflow (Beckman Coulter) que contenía yoduro de propidio (Sigma Chemical Company, Louisville, Estados Unidos.) a una concentración de 10 |jg/ml y Syto11 (Molecular Probes, Eugene, Estados Unidos.) a una concentración de 1 jg/ml. Las muestras se analizaron en un citómetro de flujo FACSCan y se registró el porcentaje de positivas a Syto11 (células vivas) y positivas a yoduro de propidio (células muertas).

Cultivo de células crioconservadas

Se colocó un volumen de 1 ml de las muestras descongeladas en un matraz de cultivo de tejidos T75 con DMEM y suero fetal de ternera al 10 % y se incubó a 37 °C con 5 % en una incubadora de CO2 durante 5 días. Después se examinaron los matraces cada día con el uso de un microscopio invertido y se registró el porcentaje de confluencia. Se extrajeron y analizaron muestras de medios de cultivo de tejidos de los matraces con el uso del ensayo de factor de crecimiento, quimiocinas y citocinas 27-plex de Bio-Plex Pro Human (Biorad, Hercules, Estados Unidos) para ILR1a, G-CSF, VEGF e IL-10. Se incluyeron como controles muestras de control de medios frescos con y sin secreciones.

Evaluación de la viabilidad celular después de la crioconservación

La viabilidad de las células congeladas con las secreciones fue mayor que la de las células congeladas sin secreciones (Tabla 5).

Tabla 5: Viabilidad de células subcultivadas (13 duplicaciones celulares) y células no subcultivadas congeladas con y sin secreciones

Tipo de célula Viabilidad media después de la descongelación Células no subcultivadas sin secreciones 66,83 % Células no subcultivadas con secreciones 75,70 % Células subcultivadas (13 duplicaciones celulares) sin 35,95 % secreciones

Células subcultivadas (13 duplicaciones celulares) con 71,6 % secreciones

Evaluación de la proliferación después de la congelación mediante el ensayo Click-iT EDU

Las tasas de proliferación de las células descongeladas se evaluaron con el uso del ensayo Click-iT EDU (Life Technologies). Se transfirió un volumen de la suspensión celular descongelada que contenía aproximadamente 500 000 células a una placa de 6 pocillos. Se añadió al pocillo un volumen de 2 ml de DMEM más suero canino al 10 %. Se añadió el reactivo EDU al pocillo para crear una concentración final de 10 pM. La placa se incubó a 37 °C con 5 % de CO2 en un incubador de CO2 a 37 °C durante 2 horas. Se recolectó el sobrenadante y las células adherentes se separaron y ambas se combinaron, se lavaron (en PBS más albúmina de suero bovino al 1 %; Sigma) y se resuspendieron en 100 pl de fijador Click-iT y se incubaron durante 15 min a temperatura ambiente para fijar las células. Después, las células se lavaron y se resuspendieron en 100 pl de agente de permeabilización Click-iT para permeabilizar las células. Las células se marcaron para la detección mediante incubación (30 min) en el cóctel de reacción Click-iT (500 pl) que contenía 2,5 pl de tinte fluorescente AlexaFluor 488. Después de la incubación, las células se lavaron en reactivo de lavado y permeabilización Click-iT y se analizaron mediante citometría de flujo. A continuación, las células se analizaron con el uso de un citómetro de flujo FACScan. Las células en proliferación mostraron un aumento de la fluorescencia verde en comparación con las células que no proliferaban.

Los resultados del análisis de las células se muestran en la Figura 1. La muestra que se había almacenado congelada como células más secreciones mostró una población de células en proliferación igual al 16,8 % del total de células. Las muestras que se habían almacenado congeladas como células sin secreciones mostraron una población de células en proliferación igual a solo el 1,8 % del total de células.

Recuperación de células después de la congelación

La adición de secreciones a las células antes de congelarlas mejoró la capacidad de las células para sobrevivir al proceso de congelación y proliferar después de la descongelación. Se observó que las células que habían sido cultivadas hasta alcanzar duplicaciones celulares acumulativas de aproximadamente 8 y que habían sido congeladas con secreciones se unían al matraz de cultivo de tejidos más rápidamente y crecían más rápidamente que las mismas células congeladas sin secreciones. A las 24 horas, las células congeladas con secreciones habían alcanzado el 90 % de confluencia, mientras que las células congeladas sin secreciones habían alcanzado solo el 60 % de confluencia (Tabla 6).

Tabla 6: Evaluación de células cultivadas (aproximadamente 8 duplicaciones celulares acumulativas) congeladas con y sin secreciones

Comparación de citocinas producidas a partir de células congeladas con y sin secreciones

Las células que se habían cultivado a través de aproximadamente 8 duplicaciones celulares acumulativas y que se congelaron con secreciones produjeron una cantidad mayor estadísticamente significativa (prueba t de dos colas) de las citocinas ILrla, IL-6, IL-8, IL-9, IL-12, IL-13, FGF básico, TNF-a y VEGF que las mismas células congeladas sin secreciones (Tabla 7), tras el cultivo posterior a la descongelación durante 5 días.

Tabla 7. Comparación de citocinas producidas por células que se habían congelados con o sin secreciones.

Los números son la media de tres réplicas.

Estos conjuntos de datos demuestran que existe un efecto beneficioso de combinar secreciones con células antes de congelar las células. Las células que se congelan sin secreciones pierden su capacidad de proliferar y producir citocinas. La inclusión de secreciones con las células antes de la congelación conserva la capacidad de las células para proliferar y producir citocinas.

Ejemplo 11. Producción de secreciones a partir de células subcultivadas y uso de secreciones para congelar células. Las células derivadas de tejido adiposo canino se aislaron y cultivaron como se describe en el Ejemplo 10. Las células se subcultivaron hasta que las células alcanzaron una duplicación celular acumulativa de aproximadamente 13 veces. El sobrenadante del cultivo de tejidos de las células se concentró con el uso de un tubo de filtro centrífugo Amicon de 3 kDa (Millipore). Las secreciones concentradas se mezclaron con suero en una relación de 1 a 1. Las células se separaron, se lavaron y el sedimento celular se resuspendió en la mezcla de suero y secreciones y después se mantuvo a temperatura ambiente durante 30 minutos para permitir que las secreciones interactuaran con las células. Después, las suspensiones celulares se transfirieron a crioviales, se mezclaron con DMSO al 10 % y se congelaron como se describe en el Ejemplo 10.

Las suspensiones de células crioconservadas se descongelaron y se cultivaron en matraces de cultivo de tejidos como se describe en el Ejemplo 10. A las 72 horas, las células congeladas con secreciones habían alcanzado el 90 % de confluencia, mientras que las células congeladas sin secreciones habían alcanzado solo el 20 % de confluencia (Figura 2). Es importante destacar que las células sin secreciones se volvieron senescentes y no alcanzaron una confluencia superior al 20 % incluso después de 10 días de incubación.

Este es un hallazgo importante. Existe la necesidad de poder expandir las células madre mesenquimales y otros tipos de células en el cultivo de tejidos para producir un gran número de células. Sin embargo, las células madre mesenquimales y otros tipos de células no pueden cultivarse de forma indefinida. Después de varias duplicaciones celulares, las células se vuelven senescentes y no se multiplicarán más. Esto limita el número de dosis que pueden producirse a partir de un solo cultivo.

Para producir un gran número de células a partir de un único cultivo inicial se requiere la creación de un banco de células de viales crioconservados. Típicamente se crea un banco de células dobles. Se crea un primer juego de viales crioconservados y después uno de estos viales se descongela y se usa para producir un segundo juego de viales crioconservados. Cada vez que se produce un lote de producto, uno de estos segundos conjuntos de viales se descongela y se coloca en cultivo. Este proceso de banco de células normalmente da como resultado células que no son tan terapéuticamente eficaces como las células recién aisladas. Al combinar las secreciones con las células durante las etapas de congelación, se supera este problema y se permite la producción de un producto congelado terapéuticamente eficaz.

Ejemplo 12. Tratamiento del dolor facial neuropático con células autólogas derivadas de tejido adiposo.

Cuatro pacientes humanos que padecían dolor facial neuropático fueron tratados con una suspensión celular derivada de tejido adiposo autólogo compuesta de células de fracción vascular estromal y adipocitos.

La liposucción se usó para recolectar aproximadamente 200 gramos de tejido adiposo del abdomen y/o muslos de cada paciente. El lipoaspirado se procesó inmediatamente después de la recolección mediante lavado con solución salina estéril y después mediante digestión al añadir colagenasa estéril hasta una concentración final de 0,05 % p/v. La muestra se incubó a 37 °C durante 20 minutos, se filtró a través de una malla de 800 micras y se transfirió a tubos de centrífuga.

Los tubos de centrífuga se centrifugaron a 400 g durante 10 minutos y se eliminó la capa entre los adipocitos flotantes y las células sedimentadas. El sedimento celular y los adipocitos flotantes se combinaron y se añadió solución salina esterilizada por filtración hasta que los tubos estuvieron llenos. Las muestras se centrifugaron de nuevo a 400 g durante 10 minutos y se eliminó la capa entre las células sedimentadas y los adipocitos flotantes. La preparación celular resultante se diluyó hasta un volumen de 10 ml con solución salina estéril y se dispensó en volúmenes de 2 ml en jeringas estériles.

Los pacientes recibieron cuatro o cinco inyecciones de 2 ml de volumen en las encías en el sitio original del dolor.

Se les dio seguimiento a los pacientes entre 4 y 8 semanas después del tratamiento y su nivel de dolor se evaluó mediante una escala analógica visual (0 = sin dolor, 10 = peor dolor imaginable). Los resultados de estas evaluaciones se describen en la Tabla 8 a continuación.

Tabla 8: Administración de células derivadas de tejido adiposo autólogas para el tratamiento del dolor neuropático

Ejemplo 13. Tratamiento del dolor con aplicación tópica de secreciones celulares derivadas de tejido adiposo bovino. Se recolectó una muestra de 10 g de tejido adiposo por escisión de la base de la cola de un novillo de 1 año. El tejido adiposo se enjuagó con solución salina y después se trituró ásperamente con el uso de tijeras en trozos de aproximadamente 5 mm de diámetro y se mezcló con 20 ml de medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, Sigma). Se añadió colagenasa (Sigma) para producir una concentración final de 0,2 % [p/v] y la muestra se incubó a 37 °C durante 30 minutos. Al final de los 30 minutos, el tejido adiposo estaba parcialmente digerido y consistía en una mezcla de partículas de grasa parcialmente digeridas, células vasculares estromales liberadas (SVC) y adipocitos liberados.

Después, la muestra se lavó para eliminar la colagenasa mediante centrifugación a 500 g durante 15 minutos. Cuatro capas distintas eran visibles dentro de la muestra centrifugada: una capa pequeña (2 mm de espesor) de lípido libre en la superficie, debajo de la cual había una capa blanca de 20 mm de espesor de tejido adiposo y adipocitos y después una gran capa transparente de DMEM/colagenasa y después, un sedimento de células no adipocitarias derivadas de tejido adiposo. La pequeña capa de lípido se eliminó cuidadosamente con una pipeta pasteur. Después, se insertó cuidadosamente una pipeta pasteur nueva a través de los adipocitos y se eliminó el DMEM transparente sin alterar el tejido adiposo flotante, los adipocitos o las células sedimentadas. Esto dio como resultado una muestra que contenía solo los trozos flotantes de tejido adiposo y adipocitos suspendidos en un pequeño volumen de DMEM y las células sedimentadas. Los trozos de tejido adiposo y adipocitos y las células sedimentadas se mezclaron suavemente con una pipeta pasteur y se transfirieron a un tubo de centrífuga de 15 ml. Los trozos de tejido adiposo y células se lavaron después en DMEM para eliminar la colagenasa de la siguiente manera. Se añadió DMEM a un volumen final de 14 ml y la muestra se centrifugó a 500 g durante 10 minutos. Esto dio como resultado tres capas distintas: trozos flotantes de tejido adiposo y adipocitos, DMEM y células no adipocitarias derivadas de tejido adiposo sedimentadas. El DMEM se eliminó cuidadosamente al insertar una pipeta pasteur a través de los adipocitos teniendo cuidado de no alterar los trozos de tejido adiposo, adipocitos o las células sedimentadas.

Cultivo de tejidos

Las células flotantes y sedimentadas se resuspendieron suavemente en 10 ml de DMEM y se transfirieron a un matraz de cultivo de tejidos de 300 ml. Se añadió un volumen de 30 ml de DMEM y 10 ml de suero de ternera fetal estéril y después el matraz se incubó a 37 °C con 5 % de CO2. El matraz se examinó diariamente mediante microscopía. Las células se adhirieron y tenía apariencia de fibroblastos entre los días 3 y 6.

Cosecha de secreciones celulares libres de células

Después de 6 días, se cosechó el sobrenadante y el tejido adiposo suspendido y las células se eliminaron mediante filtración a través de una malla de 20 micras. La solución se esterilizó por filtración a través de un filtro de 0,22 micras y después se dispensó asépticamente en viales de 10 ml y se almacenó congelada a -20 °C.

Preparación de una crema que contiene secreciones bovinas y una crema placebo

Se descongeló un vial de las secreciones bovinas y se mezcló con una cantidad igual de Crema base acuosa BP y se dispensó en tubos de plástico y se almacenó a 4 °C hasta su uso.

Se preparó un segundo lote de crema que no contenía secreciones bovinas como control de placebo. Se mezcló DMEM con una cantidad igual de Aqueous Base Cream BP y se dispensó en tubos de plástico.

Tratamiento del dolor por quemaduras

Un hombre de 46 años que accidentalmente se quemó levemente el pulgar y el dedo medio recibió un tubo de cada crema. Los tubos se marcaron como Crema 1 y Crema 2 y el hombre no sabía qué crema contenía las secreciones o cuál era el placebo. El hombre aplicó la Crema 1 en el dedo medio y la Crema 2 en el pulgar aproximadamente 30 minutos después de que se produjeron las quemaduras. El hombre informó que después de 10 minutos ya no sentía dolor en el pulgar. El dolor en el pulgar no volvió. El dolor en el dedo medio continuó durante aproximadamente 6 horas. Se formó una ampolla en el dedo medio pero no se produjo ninguna ampolla en el pulgar.

La Crema 1 fue el placebo y se aplicó al dedo medio. La Crema 2 contenía las secreciones bovinas y se aplicó al pulgar.

Ejemplo 14. Administración intramuscular de secreciones celulares derivadas de tejido adiposo humano a ratones con artritis inducida por anticuerpos contra colágeno

Preparación de tejido adiposo

La liposucción se usó para recolectar aproximadamente 200 gramos de tejido adiposo de un paciente. El lipoaspirado se digirió al añadir colagenasa estéril hasta una concentración final de 0,05 % p/v. La muestra se incubó a 37 °C durante 30 minutos, se filtró a través de una malla de 800 micras y se transfirió a tubos de centrífuga. Los tubos se centrifugaron a 1500 g durante 5 minutos, para obtener las células sedimentadas (fracción vascular estromal; SVF) y los adipocitos flotantes. Cuatro capas distintas fueron visibles dentro de la muestra centrifugada: una pequeña capa de lípido libre en la superficie, debajo de la cual había una capa gruesa de tejido adiposo y adipocitos y después una gran capa transparente de solución salina y un sedimento de células no adipocitarias derivadas de tejido adiposo (SVF). La capa de lípidos se aspiró y se desechó. Las fracciones de adipocitos y SVF se recolectaron por separado después de la centrifugación. Las fracciones se lavaron por separado con solución salina y se centrifugaron a 1500 x g durante 5 minutos. El sedimento de SVF se resuspendió suavemente en 10 ml de medio de cultivo celular que consistía en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) complementado con suero bovino fetal al 10 % y solución de penicilina-estreptomicina al 1 %.

Se filtró una porción de 300 pl del sedimento de SVF a través de un tubo de 35 pm tapado con malla de nailon. Se enumeró una porción de 200 pl de la muestra filtrada y se determinó la viabilidad en tubos TruCount que contenían isoflujo, yoduro de propidio (10 pg/ml) y Syto11 (1 pM) con el uso de un citómetro de flujo FacsScan. Se determinó el número total de células nucleadas viables en el sedimento de SVF.

Cultivo de tejidos y cosecha de secreciones

Se sembró un matraz de cultivo T175 cm2 con aproximadamente 29 millones de células SVF viables y 30 ml de adipocitos. También se añadió al matraz un volumen de 50 ml de medio de cultivo celular, como se describió anteriormente. El matraz se incubó a 37 °C con 5 % de CO2 durante 72 horas.

Después de la incubación de 72 horas, se recolectó el medio acondicionado del matraz. Esta muestra de medio acondicionado se centrifugó a 4980 g durante 10 minutos y se almacenó a -80 °C. Este medio acondicionado se descongeló, se esterilizó por filtración con el uso de un filtro de jeringa de 0,22 pm, se dividió en alícuotas y se congeló a -80 °C. Un control de vehículo, que contenía DMEM complementado con una solución de penicilinaestreptomicina al 1 %, también se esterilizó por filtración con el uso de un filtro de jeringa de 0,22 micras, se dividió en alícuotas y se congeló a -80 °C. Estas muestras en alícuotas recibieron nombres codificados y se enviaron en hielo seco a TetraQ donde se administraron a ratones que padecían CAIA.

Modelo de ratón con artritis inducida por anticuerpos contra colágeno

El modelo de artritis inducida por anticuerpos contra colágeno (CAIA) es un modelo animal de artritis ampliamente aceptado que se ha informado en la bibliografía para investigar los mecanismos patogénicos implicados en la artritis y para seleccionar posibles candidatos terapéuticos. El modelo apunta al colágeno tipo I, uno de los principales componentes del cartílago articular. En ratones, la CAIA se induce mediante la administración de un cóctel de 5 anticuerpos anti-colágeno tipo II seguido de una inyección de lipopolisacáridos (LPS) tres días después. La administración posterior de LPS después del cóctel de anticuerpos no solo aumenta la gravedad de la artritis mediante la inducción de citocinas proinflamatorias y la activación de los componentes del complemento, sino que también reduce la cantidad de anticuerpo monoclonal requerido para inducir la artritis en este modelo. La artritis que se desarrolla en estos ratones se parece mucho a la artritis reumatoide en las personas, incluida la sinovitis con infiltración de células polimorfonucleares y mononucleares, formación de pannus, degradación del cartílago de fibrosis y erosión ósea. Se observa una hinchazón y enrojecimiento significativos en las patas de los ratones que padecen CAIA. Las manifestaciones clínicas del enrojecimiento y la hinchazón de las patas pueden evaluarse para asignar una puntuación de artritis clínica a los ratones en el modelo CAIA. Las mediciones de resultado del volumen de la pata, el tamaño del tobillo y la puntuación de artritis clínica pueden usarse para determinar la eficacia de un tratamiento para reducir la gravedad de la artritis en este modelo de CAIA.

En el día cero, cada ratón (12 en total) recibió una inyección intravenosa de 1,5 mg (150 jl) de un cóctel de anticuerpos del clon 5 anti-colágeno tipo II. Este cóctel contiene 5 anticuerpos monoclonales: Clon A2-10 (IgG2a), F10-21 (IgG2a), D8-6 (IgG2a), D1-2G (IgG2b) y D2-112 (IgG2b) que reconocen los epítopos conservados en varias especies de colágeno tipo II. El día 3, los ratones recibieron una inyección intraperitoneal de 80 j l (40 jg/ratón) de LPS. El diseño del ensayo consistió en 2 grupos de 6 ratones. Los ratones recibieron dosis de 50 j l administradas por vía intramuscular (IM) los días 6, 8, 10 y 12 de los siguientes: el grupo 1 recibió secreciones humanas de SVF+adipocitos y el grupo 2 recibió el control de vehículo.

Los ratones se monitorizaron durante todo el período de ensayo (2 semanas) y se tomaron las mediciones de resultado primarias del volumen de la pata, el tamaño del tobillo y la puntuación de artritis clínica en los días 0 y 2 13. Las mediciones se tomaron antes de la administración del cóctel de anticuerpos contra colágeno (días 0) y LPS (día 3) y antes de la administración del vehículo y las secreciones SVF+adipocito humano. El volumen de la pata se midió con el uso de un pletismómetro. El tamaño de la pata se midió con el uso de microcalibradores a lo largo del montículo (articulación del tobillo) de cada pata trasera. Los ratones se evaluaron y puntuaron en función de la gravedad de la artritis con el uso de una escala estándar (0 - normal; 1 - enrojecimiento leve, leve hinchazón de tobillo o muñeca, enrojecimiento e hinchazón limitado a articulaciones individuales; 2 - hinchazón moderada de tobillo o muñeca, enrojecimiento en más de una articulación, 3 - hinchazón severa que incluye algunos dedos, tobillo o pie; 4 - hinchazón máxima e inflamación, que implica múltiples articulaciones).

Análisis de los datos

Se calcularon el promedio y la desviación estándar (DE) de cada una de las mediciones de resultado primarias, el volumen de la pata (cm3), el tamaño del tobillo (mm) y la puntuación de artritis clínica para cada punto de tiempo posterior al tratamiento para ambos grupos de ratones. Se realizó una prueba t de dos colas en las mediciones de resultado primarias en cada punto de tiempo posterior al tratamiento para comparar el efecto de las secreciones de SVF+adipocitos frente al control de vehículo. El criterio de significación estadística fue P <0,05.

Resultados

Los resultados del volumen de la pata para ambos grupos se presentan en la Figura 3. Un análisis de los datos en el día 11 reveló una reducción significativa (valor de p = 0,002) en el volumen de la pata de los ratones tratados con SVF+secreciones de adipocitos en comparación con los ratones de control de vehículo.

Las mediciones del tamaño de tobillo para ambos grupos se presentan en la Figura 4. Un análisis de los datos en el día 11 reveló una reducción significativa (valor de p = 0,018) en el tamaño del tobillo de los ratones tratados con SVF+secreciones de adipocitos en comparación con los ratones de control de vehículo.

Las puntuaciones de artritis clínica para ambos grupos de tratamiento se presentan en la Figura 5. Un análisis de los datos en el día 11 reveló una reducción significativa (valor de p = 0,017) en la puntuación de artritis clínica de los ratones tratados por vía intramuscular con SVF+secreciones de adipocitos en comparación con los ratones de control de vehículo.

Los datos muestran claramente que la administración de secreciones por inyección intramuscular tiene un efecto terapéutico en el modelo de ratón CAIA. El lugar de la inyección está alejado del lugar de la enfermedad.

Ejemplo 15. Administración intravenosa de células derivadas de tejido adiposo crioconservadas en crioprotectores estándar frente a células crioconservadas con secreciones concentradas a ratones con artritis inducida por anticuerpos contra colágeno

Preparación de tejido adiposo

El tejido adiposo canino se procesó como se describe en el Ejemplo 1 para producir células adherentes caninas. Además, las secreciones caninas que se concentraron 10x, con el uso de un tubo de filtro centrífugo Amicon de 3 kDa, a partir de células derivadas de tejido adiposo, se produjeron como se describe en el Ejemplo 1. A partir de estas células y secreciones, se prepararon los siguientes productos de prueba en crioviales y se crioconservaron en un dispositivo de congelación lenta Mr Frosty (Invitrogen) en un congelador a -80 °C durante 24 horas y después se transfirieron a un Dewar de nitrógeno líquido:

1. 70000 células crioconservadas en suero canino al 90 % y DMSO al 10 %

2. 70000 células crioconservadas en un secreciones caninas (concentrado 10x) al 45 %, suero canino al 45 % y DMSO al 10 %.

Modelo de ratón con artritis inducida por anticuerpos contra colágeno

El modelo de ratón con artritis inducida por anticuerpos contra colágeno (CAIA) descrito en el Ejemplo 14 también se usó para investigar los efectos de la administración de los productos de prueba descritos anteriormente. Se indujo un total de 12 ratones con CAIA como se describe en el Ejemplo 14. En el día 6 después de la inducción de CAIA, los productos de prueba crioconservados descritos anteriormente se descongelaron a temperatura ambiente inmediatamente antes de la inyección. A 6 ratones que habían sido crioconservadas en crioprotectores estándar se les inyectó por vía intravenosa 140 pl de células (que equivalían a 70000 células), y a los 6 ratones restantes que habían sido crioconservados en una mezcla crioprotectora que incluía secreciones concentradas se les inyectó por vía intravenosa 140 pl de células (que equivalían a 70000 células).

Los ratones se monitorizaron diariamente durante todo el ensayo y se tomaron las mediciones de resultado primarias de volumen de la pata, tamaño del tobillo y puntuación de artritis clínica en los días 0 y 2-12 como se describe en el Ejemplo 14.

Análisis de los datos

El promedio y la desviación estándar (DE) de cada una de las mediciones de resultado primarias, el volumen de la pata (cm3), el tamaño del tobillo (mm) y la puntuación de artritis clínica se calcularon para cada punto de tiempo posterior al tratamiento para ambos grupos de ratones y se graficaron. Se calculó la puntuación del delta (A) volumen de la pata, el tamaño del tobillo y de artritis clínica al restar la puntuación de inducción previa a CAIA de las puntuaciones de inducción posteriores a CAIA y expresándola como un cambio porcentual. Se determinaron para cada grupo el área bajo el A volumen de la pata, el tamaño del tobillo y las curvas de artritis clínica. Se usó una prueba t de dos colas para comparar los valores del A volumen de la pata, tamaño del tobillo y área de artritis clínica bajo la curva (AUC) de ambos grupos.

Resultados

Los resultados del volumen de la pata para ambos grupos de tratamiento se presentan en la Figura 6. Un análisis del área bajo la curva de estos datos reveló una reducción significativa en el volumen de la pata de los ratones tratados con células y secreciones concentradas en comparación con las células solas (Figura 7).

Las mediciones del tamaño del tobillo para ambos grupos de tratamiento se presentan en la Figura 8. Se observó una reducción significativa en el tamaño del tobillo de los ratones tratados con células y secreciones concentradas en comparación con los ratones que recibieron solo células (Figura 9)

Las puntuaciones de artritis clínica para ambos grupos de tratamiento se presentan en la Figura 10. Se observó una reducción significativa en la puntuación de artritis clínica en los ratones tratados con células y secreciones en comparación con los ratones que recibieron células solas (Figura 11).

Los datos muestran un efecto terapéutico aumentado al combinar células con secreciones antes de congelar las células. Los datos muestran claramente que un producto congelado que combina células y secreciones tiene un efecto terapéutico en el modelo de ratón CAIA. Cuando se administraron células solas, no hubo efecto terapéutico. Esto se debe a que las células se dañan durante el proceso de congelación y que las células dañadas no secretan las citocinas necesarias para producir el efecto terapéutico. Al congelar las células con secreciones, las células pueden sobrevivir al proceso de congelación y ser completamente funcionales y capaces de secretar las citocinas necesarias para producir el efecto terapéutico.

Ejemplo 16. Tratamiento del dolor en perros mediante la administración subcutánea de células derivadas de tejido adiposo.

Las células congeladas se prepararon de acuerdo con el Ejemplo 10. La suspensión celular se descongeló y se administró por vía subcutánea en el pescuezo de un perro que padecía dolor del nervio ciático. Una semana después del tratamiento el perro no mostró signos de dolor.

A un segundo perro que padecía la enfermedad del disco intervertebral se le administró una inyección subcutánea de células en el pescuezo. Una semana después del tratamiento el perro no mostró signos de dolor.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición congelada que comprende células progenie provenientes del cultivo de células con múltiples subcultivos de una suspensión celular derivada de tejido adiposo y secreciones celulares derivadas de tejido adiposo, en donde dichas secreciones comprenden medios clarificados y/o concentrados de cultivo de células derivadas de tejido adiposo que han surgido como células progenie o una línea celular del cultivo previo para su uso en el tratamiento del dolor en un sujeto mamífero, en donde la composición se administra a un sujeto después de descongelar la composición.

2. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el dolor está asociado con una lesión por quemadura, dolor de cuello y/u hombro, trastorno asociado con latigazo cervical, síndrome de dolor regional complejo, dolor de espalda, dolor asociado con un trastorno ciático, dolor para el cual no existe causa clínica discernible o dolor neuropático.

3. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el dolor es dolor neuropático.

4. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde las células con múltiples subcultivos son células adherentes.

5. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde las células con múltiples subcultivos son células madre mesenquimales.

6. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dichas células con múltiples subcultivos son (i) de una línea celular que se ha subcultivado más de cinco veces, o (ii) de una línea celular que se ha subcultivado más de diez veces.

7. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dichas células con múltiples subcultivos son de una línea celular que se ha congelado múltiples veces.

8. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde las secreciones celulares derivadas de tejido adiposo comprenden medios clarificados de cultivo de células derivadas de tejido adiposo que han surgido como células progenie o una línea celular de cultivo previo.

9. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde las secreciones celulares derivadas de tejido adiposo comprenden una preparación concentrada de medio de cultivo de células derivadas de tejido adiposo que han surgido como células progenie o una línea celular de cultivo previo.

10. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 9, en donde las secreciones celulares derivadas de tejido adiposo son una preparación concentrada entre 2 y 20 veces.

11. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 10, en donde las secreciones celulares derivadas de tejido adiposo son una preparación concentrada 10 veces.

12. La composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en donde el sujeto es un ser humano.