ES2880682T3 - Anticuerpos anti PSA (5A10) humanizados - Google Patents

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Kjell Sjöström
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Abstract

Un polipéptido de anticuerpo con especificidad de unión por el antígeno específico de próstata (PSA), en donde el polipéptido de anticuerpo comprende (a) una región variable de cadena pesada que comprende las CDR que tienen las secuencias de aminoácidos del SEQ ID NO: 1 y el SEQ ID NO: 2 y el SEQ ID NO: 3; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende las CDR que tienen las secuencias de aminoácidos del SEQ ID NO: 4 y el SEQ ID NO:5 y el SEQ ID NO: 6 y en donde la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera comprenden secuencias de aminoácidos marco de uno o más anticuerpos humanos.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos anti PSA (5A10) humanizados
Campo de la invención
La presente invención pertenece, en general, al campo de los agentes y métodos terapéuticos y de diagnóstico, en particular en el campo del cáncer de próstata.
Antecedentes
El cáncer de próstata es en la actualidad la forma más común de cáncer entre los hombres. La próstata es una glándula del tamaño de una nuez en los hombres que produce fluido que es un componente del semen. La próstata tiene dos o más lóbulos o secciones, encerradas por una capa externa de tejido. La próstata se localiza frente al recto y justo debajo de la vejiga de la orina y rodea a la uretra.
La aparición del cáncer de próstata es mayor en la parte noroeste de Europa y en los Estados Unidos. El crecimiento del tumor generalmente es un proceso que tiene lugar durante un largo período de tiempo. El cáncer de próstata es normalmente una forma leve de cáncer. De hecho, la mayoría de los hombres diagnosticados con cáncer de próstata sobreviven y se recuperan, con solo una minoría de los hombres enfrentándose a una forma más agresiva de cáncer de próstata, que se metastatiza en una etapa temprana. Esta forma agresiva de cáncer de próstata solo puede ser curable si se diagnostica en una etapa temprana, antes de que el cáncer se haya diseminado al tejido extracapsular.
Hoy en día, el diagnóstico y control del cáncer de próstata se realizan normalmente midiendo la concentración de un antígeno específico de próstata (PSA; del inglés, prostate specific antigen) en la sangre del paciente. Si la concentración de PSA es marcadamente elevada en varias mediciones consecutivas, realizadas en diferentes puntos temporales, la evaluación es que existe una probabilidad de cáncer de próstata. En este punto temporal, se puede realizar una biopsia para verificar el cáncer de próstata.
PSA (también conocida como calicreína III) es una proteína, constituida por una cadena simple de 237 aminoácidos, que se produce en las células secretoras de la próstata. Estas células secretoras pueden encontrarse en toda la glándula prostática. El PSA es un marcador bien establecido e investigado a fondo con respecto al cáncer de próstata. En comparación con las células sanas, la producción de PSA es menor en las células malignas y mayor en las hiperplásicas. Es más bien contradictorio que, de hecho, la concentración de PSA sea más elevada en la sangre de los hombres que padecen cáncer de próstata. Sin embargo, una explicación puede ser que las células malignas tienen una estructura celular deteriorada y por tanto, son más permeables al PSA.
Otra serina proteasa importante adecuada como un objetivo para la terapia del cáncer de próstata es la calicreína 2 glandular humana (hK2; del inglés, human glandular kallikrein 2). El gen que codifica la hK2 está situado en el cromosoma 19, junto con el gen que codifica el PSA. hK2 se expresa principalmente en el tejido prostático, al igual que PSA. En la próstata, PSA está presente como una proforma inactiva y se activa mediante la acción de la peptidasa de hK2. La investigación inmunohistoquímica con respecto a hK2 ha demostrado que hK2 se expresa en relación con el nivel de diferenciación. Esto significa que hK2 se expresa con un mayor rendimiento en tejido de baja diferenciación, tal como el tejido sometido a cáncer de próstata y en un menor rendimiento en tejido de alta diferenciación, tal como el tejido sometido a hiperplasia prostática benigna (HBP; en inglés, BPH) que es otro problema común de próstata.
Las terapias actuales de cáncer de próstata son cirugía (por ejemplo, prostatectomía radical), radioterapia (incluyendo la administración de cloruro de radio-223, braquiterapia y radioterapia de haz externo), ultrasonido focalizado de alta intensidad (HIFU; del inglés, high-intensity focused ultrasound), quimioterapia, fármacos quimioterapéuticos orales, criocirugía (congelación del tumor), terapia hormonal (tal como la terapia antiandrógena), castración o combinaciones de las anteriores.
La mayoría de estas terapias (cirugía y radioterapia externa) son, sin embargo, solo (o principalmente) útiles para el tratamiento de tumores primarios y metástasis grandes. La quimioterapia se usa para la diseminación del cáncer pero para la mayoría de estos pacientes, es un efecto paliativo y/o una supervivencia prolongada. Por tanto, son necesarias otras modalidades de tratamiento o complementarias para lograr mejoras considerables de las enfermedades malignas diseminadas, en concreto, en casos de micrometástasis.
La terapia, tal como inmunoterapia o radioinmunoterapia, que utiliza moléculas de direccionamiento tales como anticuerpos y fragmentos de los mismos podría proporcionar la posibilidad de una terapia de enfermedad diseminada.
Por tanto, existe una necesidad de nuevos agentes y métodos terapéuticos para tratar y diagnosticar el cáncer de próstata.
El documento WO 2013/061083 se refiere a un agente que comprende o que consiste en un resto de unión con especificidad por una proteína calicreína (por ejemplo, PSA o hK2) para usar en el tratamiento del cáncer de próstata y un método para el tratamiento del cáncer de próstata en un paciente, comprendiendo el método la etapa de administrar al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un agente que comprende o que consiste en un resto de unión con especificidad por una proteína calicreína.
El documento WO 2015/148979 se refiere a métodos mejorados para predecir si una biopsia de tejido prostático obtenida de un sujeto contendrá cáncer de próstata detectable.
Sumario de la invención
Por consiguiente, la presente invención busca mitigar, aliviar o eliminar una o más de las deficiencias identificadas anteriormente en la técnica y desventajas, individualmente o en cualquier combinación y resuelve al menos los problemas mencionados anteriormente proporcionando agentes terapéuticos y métodos de acuerdo con las reivindicaciones de patente adjuntas.
Un primer aspecto de la invención proporciona un polipéptido de anticuerpo con especificidad de unión por el antígeno específico de próstata (PSA), en donde el polipéptido de anticuerpo comprende
(a) una región variable de cadena pesada que comprende las secuencias de aminoácidos de los SEQ ID NO: 1 y el SEQ ID NO: 2 y el SEQ ID NO: 3
CDRH1: TTGMGVS SEQ ID NO: 1
CDRH2: HIYWDDDKRYSTSLK SEQ ID NO: 2
CDRH3: KGYYGYFDY SEQ ID NO: 3
y
(b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencias de aminoácidos de los SEQ ID NO: 4 y el SEQ ID NO: 5 y el SEQ ID NO: 6
CDRL1: RASQNVNTDVA SEQ ID NO: 4
CDRL2: STSYLQS SEQ ID NO: 5
CDRL3: QQYSNYPLT SEQ ID NO: 6
y en donde la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera comprenden secuencias de aminoácidos marco de uno o más anticuerpos humanos.
Las seis secuencias de aminoácidos anteriores representan las regiones determinantes de la complementariedad (CDR; del inglés, complementarity-determining regions) de los polipéptidos de anticuerpos de la invención, como se definen de acuerdo con Kabat etal., (1991) Sequences of Immunological Interest, 5a edición, NIH, Bethesda, Maryland.
Por "polipéptido de anticuerpo" los presentes investigadores incluyen moléculas de anticuerpo sustancialmente intactas, anticuerpos monocatenarios, diacuerpos, anticuerpos biespecíficos, cadenas pesadas de anticuerpos, cadenas ligeras de anticuerpos, homodímeros y heterodímeros de cadenas pesadas y/o ligeras de anticuerpos, así como fragmentos de unión a antígenos y derivados de los mismos.
El término "aminoácido" como se utiliza en el presente documento, incluye los veinte aminoácidos codificados genéticamente convencionales y sus estereoisómeros correspondientes en la forma "D" (en comparación con la forma "L" natural), aminoácidos omega y otros aminoácidos de origen natural, aminoácidos no convencionales (por ejemplo, aminoácidos a,a-disustituidos o N-alquil aminoácidos) y aminoácidos químicamente derivatizados (véase más abajo).
Cuando se enumera específicamente un aminoácido, tal como "alanina" o "Ala" o "A", el término se refiere tanto a L-alanina como a D-alanina, salvo que se especifique lo contrario explícitamente. Otros aminoácidos no convencionales también pueden ser componentes adecuados para los polipéptidos de la presente invención, siempre que la propiedad funcional deseada sea conservada por el polipéptido. Para los péptidos mostrados, cada resto de aminoácido codificado, cuando sea adecuado, está representado por una sola letra, que corresponde al nombre trivial del aminoácido convencional.
En una realización, los polipéptidos como se definen en el presente documento comprenden o consisten en L-aminoácidos.
Los polipéptidos de anticuerpos de la invención muestran especificidad por PSA y preferentemente la forma madura activa del PSA humano.
La secuencia de aminoácidos de PSA humano se muestra a continuación
APLILSRIVGGWECEKHSQPWQVLVASRGRAVCGGVLVHPQWVLTAAHCIRNKSV
ILLGRHSLFHPEDTGQVFQVSHSFPHPLYDMSLLKNRFLRPGDDSSHDLMLLRLSE
PAELTDAVKVMDLPTQEPALGTTCYASGWGSIEPEEFLTPKKLQCVDLHVISNDVC
AQVHPQKVTKFMLCAGRWTGGKSTCSGDSGGPLVCNGVLQGITSWGSEPCALPE
RPSLYTKVVHYRKWIKDTIVANP
[SEQ ID NO:7]
(en donde la secuencia de la proteína de PSA madura activa está subrayada; véase también el n.° de registro P07288 de UniProtKB)
La mayor parte del PSA que se encuentra en el plasma seminal está inactivo y forma complejo con el inhibidor de la proteína C (PCI; del inglés, protein C inhibitor). También es posible que PSA forme complejos con otros inhibidores de proteasa extracelular. Los estudios in vitro muestran que PSA puede unirse a a2-antiplasmina (a2-AP), ACT, AMG, antitrombina III (ATIII), inactivador de C1 e inhibidor del activador de plasminógeno-1 (PAI-1).
En una realización, el polipéptido de anticuerpo tiene especificidad por la isoforma libre (es decir, no en forma de complejo) de PSA en comparación con la isoforma en forma de complejo de PSA. Los restos de unión con especificidad por la isoforma libre de PSA pueden tener especificidad de unión para un epítopo que está expuesto en la isoforma libre de PSA, pero que no está expuesto en la isoforma en forma de complejo de PSA y esto puede ser un epítopo lineal o conformacional (es decir, no lineal). Por ejemplo, el polipéptido del anticuerpo puede tener especificidad por un epítopo que incluya uno o más restos de aminoácidos que forman parte de la hendidura catalítica de PSA que se expone en PSA libre y no se expone en una isoforma en forma de complejo, tal como la forma presente en el líquido seminal cuando el PSA forma un complejo con PCI.
Por "especificidad" los presentes investigadores quieren decir que el polipéptido de anticuerpo es capaz de unirse a PSA in vivo, es decir, en las condiciones fisiológicas en que PSA existe dentro del cuerpo humano. Preferentemente, el polipéptido del anticuerpo no se une a ninguna otra proteína in vivo.
Tal especificidad de unión puede determinarse mediante métodos bien conocidos en la técnica, tal como ELISA, inmunohistoquímica, inmunoprecipitación, transferencias Western y citometría de flujo que utiliza células transfectadas que expresan PSA. Ventajosamente, el polipéptido del anticuerpo es capaz de unirse selectivamente al PSA, es decir, se une al menos 10 veces más fuertemente a PSA que a otras proteínas (en particular, otras calicreínas, tales como el antígeno específico de próstata o PSA).
Los polipéptidos de anticuerpos de la presente invención se basan en una versión humanizada seleccionada del anticuerpo 5A10, que muestra propiedades favorables inesperadas.
En particular, los anticuerpos humanizados de la invención muestran una captación mejorada en tumores, en comparación con el anticuerpo 5A10 murino parental (m5A10) del que se derivaron sus secuencias de CDR (véase el Ejemplo 6).
Por "captación mejorada en tumores" los presentes investigadores quieren decir que el polipéptido de anticuerpo de la invención (una forma humanizada del anticuerpo 5A10), cuando se administra a un paciente con un tumor de próstata, puede proporcionar una dosis absorbida por el tumor mayor que el anticuerpo 5A10 murino parental con menos toxicidad orgánica normal.
La acumulación tumoral inesperadamente mejor proporciona un mejor perfil terapéutico de los anticuerpos de la invención. A su vez, permite utilizar de dosis de radiación más altas (dosis absorbidas), conduciendo a una mayor eficacia en el tratamiento del cáncer de próstata sin aumentar los efectos secundarios o el "daño colateral" a los tejidos y órganos sanos.
La humanización (también denominada remodelación o injerto de CDR) es una técnica para reducir la inmunogenicidad de anticuerpos monoclonales de fuentes xenogénicas (comúnmente, de roedores tales como ratones) y para mejorar su activación del sistema inmunitario humano (ver revisión de Almagro y Fransson, 2008, Frontiers in Bioscience 13:1619-1633). Hay varios anticuerpos monoclonales humanizados en ensayos clínicos y unos pocos han recibido aprobación para su uso como fármacos. Aunque la mecánica de producción del anticuerpo monoclonal modificado por ingeniería genética utilizando las técnicas de biología molecular es relativamente sencilla, el simple injerto de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de los roedores en marcos humanos no siempre reconstituye la afinidad de unión y la especificidad del anticuerpo monoclonal original. Con el fin de humanizar un anticuerpo, el diseño del anticuerpo humanizado es una etapa crítica en la reproducción de la función de la molécula original.
El diseño de un anticuerpo humanizado incluye varias elecciones clave, incluyendo las extensiones de las CDR a utilizar y los marcos humanos a utilizar. Sin embargo, con el fin de retener la especificidad del anticuerpo parental, puede ser crítico también sustituir uno o más restos del mAb de roedor en las regiones marco conservadas humanas (las denominadas retromutaciones). Identificar la posición de las retromutaciones necesarias requiere un análisis de secuencia/estructural detallado. Recientemente, las bibliotecas de fagos se han utilizado para variar los aminoácidos en posiciones elegidas. Análogamente, se han utilizado muchos enfoques para elegir los marcos humanos más adecuados en los que injertar las CDR de roedores. Los primeros experimentos utilizaron un subconjunto limitado de anticuerpos monoclonales humanos bien caracterizados (a menudo cuando la estructura estaba disponible), independientemente de la identidad de secuencia con el anticuerpo monoclonal de roedor (el denominado enfoque de marcos fijos). Algunos grupos utilizan regiones variables con una identidad de secuencia de aminoácidos elevada con las regiones variables de roedores (coincidencia de homología o mejor ajuste); otros usan secuencias consenso o de línea germinal, si bien otros seleccionan fragmentos de las secuencias marco dentro de cada región variable de cadena ligera o pesada de varios anticuerpos monoclonales humanos diferentes. También se han desarrollado enfoques hacia la humanización que reemplazan los restos de superficie de roedores por los restos más comunes encontrados en los anticuerpos monoclonales humanos ("acondicionamiento de la superficie" o "recubrimiento"; en inglés, resurfacing o veneering, respectivamente) y los que utilizan diferentes definiciones de las extensiones de las CDR.
Sin embargo, a pesar del extenso estudio de la humanización de anticuerpos, algunos anticuerpos monoclonales de roedores han demostrado ser difíciles de humanizar.
El desarrollo de los polipéptidos de anticuerpos de la invención requirió retromutaciones no solo en las regiones marco sino también en algunas de las CDR (véase el Ejemplo 2 más adelante). Por tanto, las seis secuencias de CDR representadas anteriormente en las SEQ ID NO: 1 a 6 se derivan del anticuerpo anti-PSA murino 5A10, pero contienen mutaciones en CDRH2 (SEQ ID NO: 2) y CDRL1 (SEQ ID NO: 4) relativas al anticuerpo murino parental. Estas mutaciones en las CDR se realizaron con el fin de conferir una especificidad y estabilidad óptimas a la versión humanizada de 5A10.
En una realización, los polipéptidos de anticuerpos de la invención se unen al PSA con una Kd superior a 0,1 x 10-9 M. Los métodos para medir la afinidad global (Kd) y la velocidad de asociación (ka) y la velocidad de disociación (kd) de una interacción (tal como una interacción entre un anticuerpo y un ligando) son bien conocidos en la técnica. Los métodos in vitro ilustrativos se describen en el Ejemplo 3 más adelante. También es concebible utilizar métodos basados en citometría de flujo (Sklar et al., 2002, Annu Rev Biophys Biomol Struct, 31:97-119).
Ventajosamente, el polipéptido de anticuerpo de la invención tiene una afinidad (Kd) por PSA de menos de 1,0 x10'1° M, por ejemplo una Kd menor de 9,0 x10-11 M, 8,0 x10-11 M, 7,0 x10-11 M, 6,0 x10-11 M, 5,0 x10-11 M, 4,0 x10-11 M, 3,0 x10-11 M, 2,0 x10-11 M o menor de 1,0 x10-11M.
Se apreciará por los expertos en la materia que los polipéptidos de anticuerpos de la invención pueden constituir cadenas pesadas de anticuerpos, cadenas ligeras de anticuerpos, homodímeros y heterodímeros de cadenas pesadas y/o ligeras de anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno y derivados de los mismos.
En una realización, el polipéptido de anticuerpo comprende o consiste en un anticuerpo intacto (es decir, completo), tal como una molécula de IgA, IgD, IgE, IgG o IgM.
Ventajosamente, el polipéptido de anticuerpo comprende o consiste en una molécula de IgG intacta o un fragmento de unión a antígeno o derivado de la misma.
La molécula de IgG puede ser de cualquier subtipo conocido, por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4.
Por "fragmentos y derivados de unión a antígeno" de anticuerpos los presentes investigadores incluyen fragmentos Fv (por ejemplo, Fv de cadena sencilla y Fv unido por enlaces disulfuro), fragmentos similares a Fab (por ejemplo, fragmentos Fab, fragmentos Fab' y fragmentos F(ab)2) y anticuerpos de dominio (por ejemplo, dominios variables Vh únicos o dominios variables Vl).
Por ejemplo, el polipéptido de anticuerpo puede comprender o consistir en un fragmento scFv o Fab.
Un rasgo característico adicional de los polipéptidos de anticuerpos de la presente invención es la presencia de secuencias de aminoácidos marco de uno o más anticuerpos humanos en las regiones variables de cadena pesada y ligera.
Por "secuencias marco" los presentes investigadores incluyen las regiones de los dominios variables de las cadenas pesada y ligera diferentes de las CDR. Normalmente, cada dominio variable comprenderá cuatro regiones marco, designadas FR1 a FR4, dentro de las que se sitúan las secuencias de CDR:
FR 1-----CDR1------FR2------CDR2------FR3------CDR3------FR4
Se apreciará que las secuencias de aminoácidos de las regiones marco pueden ser completamente humanas o pueden contener una o más retromutaciones (es decir, la secuencia de aminoácidos presente en el marco humano puede sustituirse por el aminoácido que se encuentra en la posición correspondiente dentro del dominio variable parental de roedor del que se derivan las CDR). En consecuencia, las secuencias de FR1, FR2, FR3 y/o FR4 del (de los) dominio(s) variables de cadena pesada y/o ligera del polipéptido de anticuerpo de la invención pueden no ser de origen natural.
En una realización, las secuencias marco del polipéptido de anticuerpo comparten al menos un 70% de identidad de secuencia con regiones marco de uno o más anticuerpos humanos, por ejemplo al menos un 80%, un 85 %, un 90 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o más. Por tanto, el polipéptido de anticuerpo puede comprender una región FR1 de cadena pesada que comparte al menos un 70% de identidad de secuencia con una región FR1 de un anticuerpo humano. Se apreciará, sin embargo, que las cadenas pesada y ligera del polipéptido de anticuerpo pueden compartir identidad de secuencia con las regiones marco de anticuerpos humanos diferentes.
El porcentaje de identidad puede determinarse mediante, por ejemplo, el programa LALIGN (Huang y Miller, Adv. Appl. Math. (1991) 12:337-357) en la página del centro Expasy (http://www.ch.embnet.org/software/LALIGN_form.html) utilizando como parámetros la opción de alineamiento global, es decir, matriz de puntuación BLOSUM62, penalización de hueco de apertura -14, penalización de hueco de ampliación -4. Como alternativa, el porcentaje de identidad de secuencia entre dos polipéptidos puede determinarse utilizando programas informáticos adecuados, por ejemplo, el programa GAP del Genetic Computing Group de la University of Wisconsin y se apreciará que el porcentaje de identidad se calcula en relación a los polipéptidos, cuya secuencia se ha alineado de manera óptima.
El alineamiento se puede llevar a cabo alternativamente usando el programa Clustal W (como se describe en Thompson et al., 1994, Nucl. Acid Res. 22:4673-4680). Los parámetros utilizados pueden ser como sigue:
- Parámetros de alineamiento por parejas rápido: tamaño de la tupla K (palabra); 1, tamaño de la ventana; 5, penalización de hueco; 3, número de diagonales superiores; 5. Método de puntuación: x por ciento.
- Parámetros de alineación múltiple: penalización por apertura de hueco; 10, penalización por extensión de hueco; 0,05.
- Matriz de puntuación: BLOSUM.
Como alternativa, el programa BESTFIT puede usarse para determinar alineaciones de secuencias locales.
En una realización, las secuencias marco del dominio variable pesado del polipéptido de anticuerpo de la invención están codificadas por la familia de genes VH4 de inmunoglobulina humana.
Por ejemplo, las secuencias marco pueden estar codificadas, al menos en parte, por un gen de la línea germinal VH4-28 (por ejemplo, FR1, FR2 y FR3 pueden estar codificados por VH4-28 y FR4 puede estar codificado por JH1).
Por tanto, en una realización, el polipéptido de anticuerpo puede comprender o consistir en una región variable de cadena pesada que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 8 (en donde las secuencias de CDR están subrayadas en negrita):
Figure imgf000006_0001
En una realización, las secuencias marco del dominio variable ligero del polipéptido de anticuerpo de la invención están codificadas por la familia de genes Kappa V4 de inmunoglobulina humana.
Por ejemplo, las secuencias marco pueden estar codificadas, al menos en parte, por un gen de la línea germinal IgkV4-B3 (por ejemplo, FR1, FR2 y FR3 pueden estar codificados por IgkV4-B3 y FR4 puede estar codificado por JK2).
Por tanto, en una realización, el polipéptido de anticuerpo puede comprender o consistir en una región variable de cadena ligera que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 9 (en donde las secuencias de CDR están subrayadas en negrita):
Figure imgf000007_0001
Por "al menos en parte" los presentes investigadores incluyen que las secuencias marco comprenden al menos diez aminoácidos contiguos codificados por el gen de referencia, por ejemplo, al menos 20 aminoácidos contiguos. También se incluyen que una o más, pero no todas, las regiones FR están codificadas por el gen de referencia (por ejemplo, FR1 y FR2 pueden estar codificadas por el gen de referencia, pero no FR3).
En una realización preferida, el polipéptido de anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 8 y una región variable de cadena ligera que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 9.
Opcionalmente, el polipéptido de anticuerpo de la invención comprende además una región constante de cadena pesada o parte de la misma.
En una realización, el polipéptido de anticuerpo comprende una región CH1, CH2 y/o CH3 de una cadena pesada de IgG (tal como una cadena pesada de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4). Por tanto, el polipéptido de anticuerpo puede comprender parte o todas las regiones constantes de una cadena pesada de IgG1. Por ejemplo, el polipéptido de anticuerpo puede ser un fragmento Fab que comprende regiones constantes CH1 y CL.
En una realización, el polipéptido de anticuerpo puede comprender una región Fc de anticuerpo. Se apreciará por un experto en la materia que la porción Fc puede ser de un anticuerpo IgG o de una clase diferente de anticuerpo (tal como IgM, IgA, IgD o IgE). En una realización, la región Fc es de un anticuerpo IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4.
La región Fc puede ser de origen natural (por ejemplo, parte de un anticuerpo producido de forma endógena) o puede ser artificial (por ejemplo, que comprende una o más mutaciones puntuales relativas a una región Fc de origen natural y/o modificaciones de los restos de carbohidratos dentro del dominio CH2). Las regiones Fc con mutaciones puntuales que mejoran su capacidad para unirse a FcR pueden ser ventajosas, por ejemplo, alterando la vida media en suero o modulando (es decir, potenciando o reduciendo) la unión a los receptores Fcy (FcyR) implicados en ADCC y CDC. Ventajosamente, el polipéptido de anticuerpo puede comprender la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 10 o parte de la misma:
Figure imgf000007_0002
[SEQ ID NO: 10]
Opcionalmente, el polipéptido de anticuerpo de la invención comprende además una región constante de cadena ligera o parte de la misma.
En una realización, el polipéptido de anticuerpo comprende una región CL de una cadena ligera de IgG (tal como una cadena ligera kappa o lambda)
Por ejemplo, el polipéptido de anticuerpo puede comprender la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 11 o parte de la misma:
Figure imgf000008_0001
[SEQ ID NO: 11]
Ventajosamente, el polipéptido de anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos del SEQ Id NO: 10 y una región constante de cadena ligera que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 11.
En una realización preferida, el polipéptido de anticuerpo de la invención comprende:
(a) una cadena pesada que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 12 (en donde la región variable está en negrita y las secuencias de CDR están subrayadas)
Figure imgf000008_0002
[SEQ ID NO: 12]
y
(b) una cadena ligera que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 13 (en donde la región variable está en negrita y las secuencias de CDR están subrayadas)
Figure imgf000009_0001
[SEQID NO: 13]
Por ejemplo, el polipéptido de anticuerpo puede comprender o consistir en dos cadenas pesadas de SEQ ID NO: 12 y dos cadenas ligeras de SEQ ID NO: 13, unidas por puentes disulfuro para formar una estructura de anticuerpo IgG típica.
Los polipéptidos de anticuerpos de la invención pueden comprender o consistir en uno o más aminoácidos que se han modificado o derivatizado.
Pueden conseguirse derivados químicos de uno o más aminoácidos mediante la reacción con un grupo funcional lateral. Tales moléculas derivatizadas incluyen, por ejemplo, las moléculas en las que los grupos amino libres se han derivatizado para formar clorhidratos de amina, grupos p-tolueno-sulfonilo, grupos carboxibenzoxi, grupos tbutiloxicarbonilo, grupos cloroacetilo o grupos formilo. Los grupos carboxilo libres pueden derivatizarse para formar sales, ésteres metílicos y etílicos u otros tipos de ésteres e hidrazidas. Los grupos hidroxilo libres pueden derivatizarse para formar derivados de O-acilo o de O-alquilo. También se incluyen como derivados químicos los péptidos que contienen derivados de aminoácidos de origen natural de los veinte aminoácidos convencionales. Por ejemplo: la 4-hidroxiprolina puede sustituirse por prolina; la 5-hidroxilisina puede sustituirse por lisina; la 3-metilhistidina puede sustituirse por histidina; la homoserina puede sustituirse por serina y la ornitina por lisina. Los derivados también incluyen péptidos que contienen una o más adiciones o deleciones siempre que se mantenga la actividad requerida. Otras modificaciones incluidas son la amidación, la acilación amino terminal (por ejemplo, la acetilación o amidación de ácido tioglicólico) o la carboxilamidación terminal (por ejemplo, con amoniaco o metilamina).
Se apreciará adicionalmente por los expertos en la materia que los compuestos peptidomiméticos también pueden ser útiles. El término "peptidomimético" se refiere a un compuesto que imita la conformación y los rasgos deseables de un péptido particular como agente terapéutico.
Por ejemplo, dicho polipéptido incluye no solo moléculas en las que los restos de aminoácidos están unidos por enlaces peptídicos (-CO-NH-), sino también moléculas en las que se invierte el enlace peptídico. Tales peptidomiméticos retroinversos se pueden preparar usando métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, tales como los descritos en Meziere et al. (1997) J. Immunol. 159, 3230-3237. Este enfoque implica preparar pseudopéptidos que contienen cambios que implican la cadena principal y no la orientación de las cadenas laterales. Los péptidos retroinversos, que contienen enlaces NH-CO en lugar de enlaces peptídicos CO-NH, son mucho más resistentes a la proteólisis. Como alternativa, dicho polipéptido puede ser un compuesto peptidomimético en donde uno o más restos de aminoácidos están unidos mediante un enlace -y(CH2 NH)- en lugar del enlace amida convencional.
En una alternativa adicional, se puede prescindir del enlace peptídico por completo siempre que se use un resto conector adecuado que conserve la separación entre los átomos de carbono de los restos de aminoácidos; puede ser ventajoso para el resto conector que tenga sustancialmente la misma distribución de cargas y sustancialmente la misma planitud que un enlace peptídico.
Se apreciará que dicho polipéptido puede estar bloqueado convenientemente en su extremo N o C de modo que ayude a reducir la susceptibilidad a la digestión exoproteolítica.
Se ha utilizado también varios aminoácidos no codificados o modificados, tales como D-aminoácidos y N-metil aminoácidos, para modificar péptidos de mamíferos. Además, una conformación bioactiva supuesta puede estabilizarse mediante una modificación covalente, tal como una ciclación o mediante la incorporación de lactama u otros tipos de puentes, por ejemplo, véase Veber et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:2636 y Thursell et al., 1983, Biochem. Biophys. Res. Comm. 111:166.
Se apreciará por los expertos en la materia que los polipéptidos de anticuerpos de la invención pueden aumentarse con un resto funcional para facilitar su uso previsto, por ejemplo, como un agente de obtención de imágenes in vivo o un agente terapéutico.
Por tanto, en una realización, el polipéptido de anticuerpo está unido, directa o indirectamente, a un resto terapéutico.
Puede usarse cualquier resto terapéutico adecuado. Un resto terapéutico adecuado es uno capaz de reducir o inhibir el crecimiento o en particular de matar, una célula de cáncer de próstata. Por ejemplo, el agente terapéutico puede ser un resto citotóxico. Un resto citotóxico puede comprender o consistir en uno o más radioisótopos. Por ejemplo, dichos uno o más radioisótopos pueden seleccionarse cada uno independientemente del grupo que consiste en emisores beta, emisores Auger, emisores de electrones de conversión, emisores alfa y emisores de baja energía de fotones. Podría desearse que dichos uno o más radioisótopos tengan cada uno independientemente un patrón de emisión de energía absorbida localmente que cree una dosis absorbida elevada en la vecindad del agente. Entre los radioisótopos ilustrativos pueden incluirse los emisores beta de largo alcance, tales como 90Y, 32P, 186Re/188Re; 166Ho, 76As/77As, 89Sr, 153Sm; emisores beta de medio alcance, tales como 131I, 177Lu, 67Cu, 161Tb, 105Rh; emisores beta de baja energía, tales como 45Ca o 35S; emisores de conversión o Auger, tales como 51Cr, 67Ga, 99Tcm, 111In, 114mIn, 123I, 125I, 201Tl; y emisores alfa, tales como 212Bi, 213Bi, 223Ac, 225Ac, 212Pb, 255Fm, 223Ra, 149Tb y 221At. Están disponibles otros radionucleidos y será posible utilizarlos para terapia.
En otra realización, puede desearse que el resto terapéutico o el resto citotóxico no sea un resto como se ha desvelado como un "indicador" en el documento WO 2006/087374 A1, en particular, en la página 11, líneas 7-15 del mismo.
En una realización preferida, el polipéptido de anticuerpo está unido al (o de otra manera marcado con) radioisótopo 177Lu.
Como alternativa, el resto terapéutico puede comprender o consistir en uno o más fármacos terapéuticos (tales como citotóxicos), por ejemplo, un fármaco citostático; un fármaco anti-andrógeno; cortisona y derivados de la misma; un fosfonato; un inhibidor de la testosterona-5-a-reductasa; un añadido de boro; una citocina; tapsigargina y sus metabolitos; una toxina (tal como saporina o caliqueamicina); un agente quimioterapéutico (tal como un antimetabolito); o cualquier otro fármaco terapéutico o citotóxico útil en el tratamiento del carcinoma de próstata.
Entre los fármacos terapéuticos/citotóxicos, por ejemplo, pueden incluirse:
• Citostáticos, en particular, los de efectos secundarios limitantes de la dosis, incluyendo la ciclofosamida, clorambucilo, ifosfamida, busulfano, lomustina, taxanos, fosfato de estramustina y otras mostazas nitrogenadas, antibióticos (incluyendo doxorubicina, caliqueamicinas y esperamicina), alcaloides de la vinca, azaridinas, compuestos que contienen platino, endostatina, alquil sulfonatos, nitrosoureas, triazenos, análogos de ácido fólico, análogos de pirimidina, análogos de purina, enzimas, urea sustituida, derivados de metil hidrazina, daunorrubicina, aminas anfipáticas,
Antiandrógenos, tales como flutamida y bikalutamida y metabolitos de los mismos;
Cortisona y derivados de la misma;
Fosfonatos, tales como difosofonato y bupfosfonato;
Inhibidores de la testosterona-5-a-reductasa;
Añadidos de boro;
Citoquinas;
Tapsigargina y sus metabolitos;
Otros agentes utilizados en el tratamiento del carcinoma de próstata.
Como alternativa, el resto citotóxico puede comprender o consistir en uno o más restos adecuados para usar en terapia de activación, tal como terapia de activación de fotones, terapia de activación de neutrones, terapia de electrones Auger inducida por neutrones, terapia de irradiación con sincrotrón o terapia de activación de fotones de rayos X de baja energía.
Por ejemplo, con los polipéptidos de anticuerpos de la invención, existirá el potencial de utilizar la radiación de sincrotrón (o rayos X de baja energía) para el avance de la radioterapia, centrándose principalmente en la denominada radioterapia de fotoactivación (PAT; del inglés, photo-activation radiotherapy), en la que la deposición de energía local de la irradiación con rayos X externa se ve mejorada en el tejido canceroso por la interacción con un agente de direccionamiento a tumores de Z elevado administrado previamente.
La modalidad de tratamiento PAT utiliza rayos X monocromáticos de una fuente de sincrotrón, tales como los proporcionados por el haz lineal de luz biomédica ID17 en la instalación europea de radiación de sincrotrón (European Synchrotron Radiation Facility, ESRF) en Grenoble y como se prevé, estará disponible en otras instalaciones en el futuro, tales como la nueva instalación de sincrotrón sueca, Max-IV.
Como una modalidad de tratamiento potencial adicional, la investigación sobre la "terapia tumoral de electrones Auger inducida" es la próxima fuente de espalación europea (European Spallation Source, ESS) en Lund y es de esperar, una estación experimental médica. Los neutrones térmicos y semitérmicos producidos por los reactores se han usado durante mucho tiempo para la terapia de captura de neutrones de boro, BNCT (del inglés, boron-neutron-capturetherapy), tanto para experimentos preclínicos como para el tratamiento de tumores cerebrales con las partículas alfa inducidas y el núcleo de retroceso (7L) que proporcionan una alta energía absorbida localmente (dosis absorbida). Un enfoque similar es usar neutrones y moléculas adecuadas de direccionamiento a tumores marcadas con núcleos estables con una sección transversal grande para neutrones. Los anticuerpos o péptidos se pueden marcar, por ejemplo, con gadolinio estable (157Gd) y actúan como la molécula objetivo para los neutrones que son capturados por el núcleo de Gd, lo que se conoce como terapia de captura de neutrones de gadolinio (GdNCT; del inglés, gadolinium neutrón capture therapy). Mediante las técnicas de Monte Carlo, la distribución de la dosis en el tumor y los tejidos circundantes se calcula como resultado de los fotones y, neutrones, retrocesos nucleares, así como rayos X característicos, conversión interna y electrones Auger de gadolinio u otros elementos potenciales.
Como se ha analizado anteriormente, el resto terapéutico (tal como un radioisótopo o resto citotóxico) puede unirse directa o indirectamente, al resto de unión (tal como un anticuerpo o fragmento del mismo). Los enlazadores adecuados son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, grupos prostéticos, enlazadores no fenólicos (derivados de N-succimidilbenzoatos; dodecaborato), restos quelantes tanto de macrocíclicos como quelantes acíclicos, tales como derivados del ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10 tetraacético (DOTA), deferoxamina (DFO), derivados del ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA), derivados del ácido S-2-(4-isotiocianatobencil)-1,4,7-triazaciclononano-1,4,7-triacético (NOTA) y derivados del ácido 1,4,8,11-tetraazaciclodocedan-1,4,8,11-tetraacético (TETA, derivados del ácido 3,6,9,15-tetraazabiciclo [9.3.1]-pentadeca-1 (15),11,13-trieno-4-(S)-(4-isotiocianatobencil)-3,6,9-triacético (PCTA), derivados del ácido 5-S-(4-aminobencil)-1-oxa-4,7,10-triazaciclododecano-4,7,10-tris(acético) (DO3A) y otros restos quelantes. El uso de dichos enlazadores puede ser particularmente adecuado en circunstancias en donde el agente comprende o consiste en un anticuerpo o fragmento del mismo como el resto de unión enlazado, a través de un conector, a un radioisótopo como el resto terapéutico.
Un enlazador preferido es DTPA, por ejemplo, como se usa en 177Lu-DTPA-[polipéptido de anticuerpo de la invención].
Un enlazador preferido adicional es deferoxamina, DFO, por ejemplo, como se usa en 89Zr-DFO-[polipéptido de anticuerpo de la invención], preferentemente para uso diagnóstico.
Opcionalmente, el polipéptido de anticuerpo de la invención puede (o no) comprender además un resto detectable. Por ejemplo, un resto detectable puede comprender o consistir en un radioisótopo, tal como un radioisótopo seleccionado de entre el grupo que consiste en 99mTc, 111In, 67Ga, 68Ga, 72As,89Zr, 123l y 201TI Opcionalmente, el agente puede comprender un par de radionúclidos detectables y citotóxicos, tales como 86y/90y o 124l/211At. Como alternativa, el agente puede comprender un radioisótopo que sea capaz de actuar simultáneamente de manera multimodal como un resto detectable y también como un resto citotóxico para proporcionar los llamados "teragnósticos multimodales". De este modo, los restos de unión pueden acoplarse a nanopartículas que tienen la capacidad de obtención de múltiples imágenes (por ejemplo, SPECT, PET, IRM, óptica o ultrasonido) junto con capacidad terapéutica usando fármacos citotóxicos, tales como radionúclidos o agentes de quimioterapia. También se incluye con la presente invención la posibilidad de tratamiento por hipertermia usando campos magnéticos alternos de alta frecuencia e imágenes de ultrasonido acompañadas.
Como alternativa, el resto detectable puede comprender o consistir en un isótopo paramagnético, tal como un isótopo paramagnético se selecciona del grupo que consiste en 157Gd, 55Mn, 1620y, 52Cr y 56Fe.
En el caso de que el polipéptido de anticuerpo comprenda un resto detectable, a continuación, el resto detectable puede ser detectable mediante una técnica de obtención de imágenes tal como SPECT, PET, SPECT, óptica o ultrasonidos.
Los restos terapéuticos y detectables pueden conjugarse o combinarse de otra manera con el polipéptido de anticuerpo usando métodos bien conocidos en la técnica (por ejemplo, la terapia inmunoconjugada existente, gemtuzumab ozogamicina [nombre comercial: Mylotarg®], comprende un anticuerpo monoclonal unido a la citotoxina caliqueamicina).
En una realización adicional, el polipéptido de anticuerpo de la invención se usa para tratar el cáncer de próstata en forma de una formulación que comprende una población de moléculas de polipéptido de anticuerpo. En una opción, todos (o sustancialmente todos, tales como más de un 90 %, un 95 %, un 99 %, un 99,9 % o más, en peso) de las moléculas de polipéptido de anticuerpo en la población comprenden el mismo resto terapéutico. En otra opción, la población comprende una mezcla de otros agentes con diferentes restos terapéuticos. Esta opción ofrecerá posibilidades para mejorar los efectos de la terapia de radionúclidos dirigida usando diversos agentes, tales como agentes de quimioterapia, agentes de terapia hormonal u otra combinación de terapias en las que el agente de direccionamiento no solo suministre radionúclidos terapéuticamente activos a los antígenos asociados al tumor, sino que también radiosensibilice simultáneamente las células del tumor objetivo mediante la modulación (por ejemplo, activación o bloqueo) de una cascada de señalización intracelular. Esta opción también es útil para tratar el cáncer de próstata con una mezcla de agentes citotóxicos, por ejemplo, usando un cóctel de alfa y diferentes alcances de emisores beta o un cóctel de radionúclidos con diferente alcance, LET (transferencia de energía lineal; del inglés, linear energy transfer) y RBE (efecto biológico relativo; del inglés, relative biological effect), para el tratamiento combinado de tumores grandes, micrometástasis y células tumorales únicas. En una realización, pueden usarse emisores de largo alcance para el tratamiento de tumores grandes y pueden usarse emisores de corto alcance para el tratamiento de tumores más pequeños tales como micrometástasis y células tumorales únicas.
Opcionalmente, el polipéptido de anticuerpo de la presente invención puede (o no) comprender además un resto para aumentar la semivida in vivo del agente. Los restos ilustrativos para aumentar la semivida in vivo del agente pueden incluir polietilenglicol (PEG), albúmina de suero humano, grupos de glucosilación, ácidos grasos y dextrano. Particularmente, puede contemplarse PEG.
Se apreciará que los polipéptidos de la invención pueden liofilizarse para su almacenamiento y reconstituirse en un portador adecuado antes de su uso, por ejemplo, mediante secado por congelación, secado por pulverización, enfriamiento por pulverización o mediante el uso de formación de partículas (precipitación) a partir de dióxido de carbono supercrítico. Puede emplearse cualquier método de liofilización (por ejemplo, criodesecación, secado por pulverización, secado de torta) y/o técnicas de reconstitución adecuados. Los expertos en la técnica apreciarán que la liofilización y la reconstitución pueden conducir a grados variables de pérdida de actividad y que los niveles de uso deben ajustarse hacia arriba para compensar. Preferentemente, el polipéptido liofilizado (criodesecado) pierde no más de aproximadamente un 1 % de su actividad (antes de la liofilización) cuando se rehidrata o no más de aproximadamente un 5 %, un 10%, un 20%, un 25%, un 30%, un 35%, un 40%, un 45 % o no más de aproximadamente un 50 % de su actividad (antes de la liofilización) cuando se rehidrata.
Los métodos para la producción de polipéptidos de la invención son bien conocidos en la técnica.
De manera práctica, el polipéptido es o comprende un polipéptido recombinante. Los métodos adecuados para la producción de tales polipéptidos recombinantes son bien conocidos en la técnica, tales como la expresión en células huéspedes procariotas o eucariotas (por ejemplo, véase Sambrook y Russell, 2000, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Tercera Edición, Cold Spring Harbor, Nueva York).
Los polipéptidos de anticuerpos de la invención también pueden producirse usando un sistema de traducción in vitro disponible en el mercado, tal como lisado de reticulocitos de conejo o lisado de germen de trigo (disponible en Promega). Preferentemente, el sistema de traducción es lisado de reticulocitos de conejo. De manera práctica, el sistema de traducción se puede acoplar a un sistema de transcripción, tal como el sistema de traducción de transcripción TNT (Promega). Este sistema tiene la ventaja de producir un transcrito de ARNm adecuado a partir de un polinucleótido de ADN codificante en la misma reacción que la traducción.
Los expertos en la técnica apreciarán que los polipéptidos de la invención pueden sintetizarse como alternativa de forma artificial, por ejemplo, usando técnicas bien conocidas de síntesis en fase líquida o en fase sólida (tales como la síntesis de péptidos en fase sólida t-Boc o Fmoc).
Un segundo aspecto de la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido de anticuerpo de la invención o un componente de cadena polipeptídica del mismo. Por "molécula de ácido nucleico" los presentes investigadores incluyen moléculas de ADN (por ejemplo, ADN genómico o ADN complementario) y de ARNm, que pueden ser monocatenarias o bicatenarias.
En una realización, la molécula de ácido nucleico es una molécula de ADNc.
Los expertos en la técnica apreciarán que la molécula de ácido nucleico puede ser optimizada por codones para la expresión del polipéptido de anticuerpo en una célula huésped particular, por ejemplo, para la expresión en células humanas (por ejemplo, véase Angov, 2011, Biotechnol. J. 6(6):650-659).
En una realización preferida, la molécula de ácido nucleico de la invención comprende
(a) la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO:14
CAGGTCACACTGAAGGAATCTGGGCCTGCTTTGGTGAAGCCCACTCAGACTCTGACACTCA
CATGCACCTTCTCCGGGTTTAGCCTGTCAACCACCGGTATGGGCGTGAGTTGGATTCGCCA
ACCACCGGGTAAAGCGCTTGAGTGGCTTGCACACATCTATTGGGACGATGACAAGCGGTAC
AGTACTAGCCTGAAAACGAGACTGACCATAAGCGAGGACTCATCCAAGAATCAGGTGGTAC
TGACGATGACCAACATGGATCCCGTTGATACCGCCACATACTACTGTGCCAGGAAAGGCTA
CTATGGCTATTTCGACTATTGGGGACAGGGAACACTCGTCACTGTGTCCTCT
[SEQ ID NO: 14]
y
(b) la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO:15
GACATCCAGATGACCCAATCTCCCTCTAGCTTGTCCGCTAGTGTCGGTGATAGGGTGACAG
TGACATGCAGAGCTAGCCAGAATGTCAACACAGACGTTGCCTGGTATCAGCAGAAGCCAGG
CAAAGCACCCAAAGCCCTCATCTTCTCCACGTCATATCTGCAAAGCGGAGTACCTTCCCGG
TTTAGTGGGTCTGGGTCAGGCACTGACTTCACCCTGACCATATCCAGCCTTCAACCGGAAG
ATTTCGCGACCTACTACTGTCAGCAGTACAGCAACTATCCTCTGACTTTTGGACAGGGCAC
TAAGGTGGAGATTAAGCGT
[SEQID NO: 15]
Por tanto, la molécula de ácido nucleico de la invención puede comprender
(a) la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO:16
CAGGTCACACTGAAGGAATCTGGGCCTGCTTTGGTGAAGCCCACTCAGACTCTGACACTCA
CATGCACCTTCTCCGGGTTTAGCCTGTCAACCACCGGTATGGGCGTGAGTTGGATTCGCCA
ACCACCGGGTAAAGCGCTTGAGTGGCTTGCACACATCTATTGGGACGATGACAAGCGGTAC
AGTACTAGCCTGAAAACGAGACTGACCATAAGCGAGGACTCATCCAAGAATCAGGTGGTAC
TGACGATGACCAACATGGATCCCGTTGATACCGCCACATACTACTGTGCCAGGAAAGGCTA
CTATGGCTATTTCGACTATTGGGGACAGGGAACACTCGTCACTGTGTCCTCTGCTAGCACC
AAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGG
CCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGG
CGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCC
CTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACG
TGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAA
AACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTC
TTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGG
TGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGA
GGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTC
AGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCT
CCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCG
AGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGC
CTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATG
GGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTT
CCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGC
TCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGG
GTAAATGA
[SEQID NO: 16]
y
(b) la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO:17
GACATCCAGATGACCCAATCTCCCTCTAGCTTGTCCGCTAGTGTCGGTGATAGGGTGACAG
TGACATGCAGAGCTAGCCAGAATGTCAACACAGACGTTGCCTGGTATCAGCAGAAGCCAGG
CAAAGCACCCAAAGCCCTCATCTTCTCCACGTCATATCTGCAAAGCGGAGTACCTTCCCGG
TTTAGTGGGTCTGGGTCAGGCACTGACTTCACCCTGACCATATCCAGCCTTCAACCGGAAG
ATTTCGCGACCTACTACTGTCAGCAGTACAGCAACTATCCTCTGACTTTTGGACAGGGCAC
TAAGGTGGAGATTAAGCGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGAT
GAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAG
AGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGT
CACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAA
GCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGC
CCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
[SEQ ID NO: 17]
También se desvela en el presente documento un vector (tal como un vector de expresión) que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con el segundo aspecto de la invención.
También se desvela en el presente documento una célula huésped (tal como una célula de mamífero, por ejemplo, una célula humana) que comprende una molécula de ácido nucleico de acuerdo con el segundo aspecto de la invención o un vector que comprende dicho ácido nucleico.
También se desvela en el presente documento un método para preparar un polipéptido de anticuerpo de acuerdo con el primer aspecto de la invención que comprende cultivar una población de células huésped que comprenden una molécula de ácido nucleico de acuerdo con el segundo aspecto de la invención o un vector que comprende dicho ácido nucleico, en condiciones en las que dicho polipéptido se expresa y aislar el polipéptido a partir de las mismas.
Un tercer aspecto de la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad farmacéuticamente eficaz de un polipéptido de anticuerpo del primer aspecto de la invención y un diluyente, portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.
También pueden incluirse compuestos adicionales en las composiciones farmacéuticas, que incluyen, agentes quelantes, tales como EDTA, citrato, EGTA o glutatión.
Las composiciones farmacéuticas pueden prepararse de una manera conocida en la técnica que sea suficientemente estable en almacenamiento y adecuada para la administración a seres humanos y animales. Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas pueden liofilizarse, por ejemplo, mediante criodesecación, secado por pulverización, enfriamiento por pulverización o mediante el uso de la formación de partículas a partir de la formación de partículas supercríticas.
Por "farmacéuticamente aceptable" los presentes investigadores quieren decir un material no tóxico que no disminuye la eficacia de la actividad de unión a la proteína de la calicreína del agente de la invención. Tales tampones, portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables son bien conocidos en la técnica (véase Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Edición, A.R Gennaro, Ed., Mack Publishing Company (1990) y Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3a edición, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press (2000)).
El término "tampón" pretende significar una solución acuosa que contiene una mezcla ácido-base con la finalidad de estabilizar el pH. Ejemplos de tampones son Trizma, Bicine, Tricine, MOPS, MOPSO, MOBS, Tris, Hepes, HEPBS, MES, fosfato, carbonato, acetato, citrato, glicolato, lactato, borato, ACES, ADA, tartrato, AMP, AMPD, AMPSO, BES, CABS, cacodilato, CHES, DIPSO, EPPS, etanolamina, glicina, HEPPSO, imidazol, ácido imidazoláctico, PIPES, SSC, SSPE, POPSO, TAPS, TABS, TAPSO y TES.
El término "diluyente" pretende significar una solución acuosa o no acuosa con la finalidad de diluir el agente en la preparación farmacéutica. El diluyente puede ser uno o más de solución salina, agua, polietilenglicol, propilenglicol, etanol o aceites (tales como aceite de cártamo, aceite de maíz, aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón o aceite de sésamo).
El término "adyuvante" pretende significar cualquier compuesto añadido a la formulación para aumentar el efecto biológico del agente de la invención. El adyuvante puede ser uno o más de sales de zinc, cobre o plata con diferentes aniones, por ejemplo, cloruro, bromuro, yoduro, tiocianato, sulfito, hidróxido, fosfato, carbonato, lactato, glicolato, citrato, borato, tartrato y acetatos de diferente composición acílica. El adyuvante también puede ser polímeros catiónicos tales como éteres de celulosa catiónicos, ésteres de celulosa catiónicos, ácido hialurónico desacetilado, quitosano, dendrímeros catiónicos, polímeros sintéticos catiónicos tales como poli(vinil imidazol) y polipéptidos catiónicos tales como polihistidina, polilisina, poliarginina y péptidos que contienes esos aminoácidos.
El excipiente puede ser uno o más de carbohidratos, polímeros, lípidos y minerales. Ejemplos de carbohidratos incluyen lactosa, glucosa, sacarosa, manitol y ciclodextrinas, que se añaden a la composición, por ejemplo, para facilitar la liofilización. Ejemplos de polímeros son almidón, éteres de celulosa, carboximetilcelulosa de celulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, etilhidroxietilcelulosa, alginatos, carragenina, ácido hialurónico y derivados del mismo, ácido poliacrílico, polisulfonato, polietilenglicol/óxido de polietileno, copolímeros polietilenóxido/óxido de propileno, alcohol polivinílico/polivinilacetato de diferente grado de hidrólisis y la polivinilpirrolidona, todos ellos de diferente peso molecular, que se añaden a la composición, por ejemplo, para el control de la viscosidad, para lograr bioadhesión o para proteger el lípido de la degradación química y proteolítica. Ejemplos de lípidos son ácidos grasos, fosfolípidos, mono-, di- y triglicéridos, ceramidas, esfingolípidos y glucolípidos, todos ellos de diferente longitud de cadena de acilo y saturación, lecitina de huevo, lecitina de soja, huevo hidrogenado y lecitina de soja, que se añaden a la composición por razones similares a las de los polímeros. Ejemplos de minerales son el talco, óxido de magnesio, el óxido de zinc y el óxido de titanio, que se añaden a la composición para obtener beneficios tales como la reducción de la acumulación de líquido o las propiedades de pigmento ventajosas.
Los polipéptidos de anticuerpos de la invención pueden formularse en cualquier tipo de composición farmacéutica conocida en la técnica como adecuada para el suministro de los mismos.
En una realización, las composiciones farmacéuticas de la invención pueden estar en forma de un liposoma, en el que se combina el polipéptido de anticuerpo, además de otros portadores farmacéuticamente aceptables, con agentes anfipáticos tales como lípidos, que existen en forma agregada como micelas, monocapas insolubles y cristales líquidos. Los lípidos adecuados para la formulación liposomal incluyen, por ejemplo, monoglicéridos, diglicéridos, sulfátidos, lisolecitina, fosfolípidos, saponina o ácidos biliares. Los lípidos adecuados también incluyen los lípidos modificados anteriormente por el poli(etilenglicol) en el grupo de la cabeza polar para prolongar el tiempo de circulación del torrente sanguíneo. La preparación de dichas formulaciones liposomales se puede encontrar por ejemplo en el documento US 4.235.871.
Las composiciones farmacéuticas de la invención también pueden estar en forma de microesferas biodegradables. Poliésteres alifáticos, tales como poli(ácido láctico) (PLA), poli(ácido glicólico) (PGA), copolímeros de PLA y PGA (PLGA) o poli(carprolactona) (PCL) y polianhídridos se han usado ampliamente como polímeros biodegradables en la producción de microesferas. Las preparaciones de dichas microesferas se pueden encontrar en los documentos US 5.851.451 y EP 0213303.
En una realización adicional, las composiciones farmacéuticas de la invención se proporcionan en forma de geles poliméricos, en los que polímeros tales como almidón, éteres de celulosa, carboximetilcelulosa de celulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, etilhidroxietilcelulosa, alginatos, carragenina, ácido hialurónico y derivados del mismo, ácido poliacrílico, polivinil imidazol, polisulfonato, polietilenglicol/óxido de polietileno, copolímeros polietilenóxido/óxido de propileno, alcohol polivinílico/polivinilacetato de diferente grado de hidrólisis y la polivinilpirrolidona se usan para espesar la solución que contiene el agente. Los polímeros también pueden comprender gelatina o colágeno.
Como alternativa, los polipéptidos de anticuerpos pueden disolverse simplemente en solución salina, agua, polietilenglicol, propilenglicol, etanol o aceites (tales como aceite de cártamo, aceite de maíz, aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón o aceite de sésamo), goma de tragacanto y/o diversos tampones.
Se apreciará que las composiciones farmacéuticas de la invención pueden incluir iones y un pH definido para la potenciación de la acción del polipéptido del anticuerpo activo. Adicionalmente, las composiciones pueden someterse a operaciones farmacéuticas convencionales tales como esterilización y/o pueden contener adyuvantes convencionales tales como conservantes, estabilizantes, agentes humectantes, emulsionantes, tampones o rellenos.
Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención pueden administrarse por cualquier vía adecuada conocida por los expertos en la técnica. Por tanto, las posibles vías de administración incluyen parenteral (intravenosa, subcutánea e intramuscular), tópica, ocular, nasal, pulmonar, bucal, oral, parenteral y rectal. También es posible la administración desde implantes. La infusión puede ser una vía deseada debido a la citotoxicidad potencialmente alta del agente administrado.
En una realización, las composiciones farmacéuticas se administran por vía parenteral, por ejemplo, por vía intravenosa, por vía intracerebroventricular, intraarticular, intraarterial, por vía intraperitoneal, intratecal, vía intraventricular, intraesternal, intracraneal, intramuscular o subcutánea o pueden administrarse mediante técnicas de infusión. Se usan oportunamente en forma de una solución acuosa estéril que puede contener otras sustancias, por ejemplo, suficientes sales o glucosa para hacer que la solución sea isotónica con la sangre. Las soluciones acuosas deben tamponarse adecuadamente (por ejemplo, a un pH de 3 a 9), si es necesario. La preparación de formulaciones parenterales adecuadas en condiciones estériles se realiza fácilmente mediante técnicas farmacéuticas convencionales bien conocidas por los expertos en la técnica.
Las formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen soluciones para inyección estéril acuosas y no acusas que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que hagan que la formulación sea isotónica con la sangre del receptor previsto; y suspensiones acuosas y no acuosas estériles que pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes. Las formulaciones pueden presentarse en recipientes de dosis unitaria 0 de múltiples dosis, por ejemplo, ampollas y viales sellados y pueden almacenarse en un estado criodesecado (liofilizado) que requiera solo la adición del vehículo líquido estéril, por ejemplo, agua para inyecciones, inmediatamente antes de su uso. Se pueden preparar soluciones y suspensiones para inyección extemporáneas a partir de polvos, gránulos y comprimidos del tipo descrito anteriormente.
Por tanto, las composiciones farmacéuticas de la invención son particularmente adecuadas para la administración parenteral, por ejemplo, la administración intravenosa o la administración local a un tumor en un paciente (por ejemplo, intratumoral o peritumoral).
Las composiciones farmacéuticas se administrarán a un paciente en una dosis farmacéuticamente eficaz, es decir, una dosis absorbida terapéuticamente eficaz del radionúclido terapéutico.
En el contexto del uso terapéutico de los polipéptidos de anticuerpos de la invención, una "cantidad farmacéuticamente eficaz" o "cantidad eficaz" o "terapéuticamente eficaz", como se usa en el presente documento, se refiere a esa cantidad que proporciona un efecto terapéutico para una afección dada y régimen de administración. Esta es una cantidad predeterminada de material activo calculada para producir un efecto terapéutico deseado en asociación con el aditivo y diluyente requeridos, es decir, un portador o vehículo de administración. Además, pretende significar una cantidad suficiente para reducir y/o evitar, un déficit clínicamente significativo en la actividad, función y respuesta del huésped. Como alternativa, una cantidad terapéuticamente eficaz es suficiente para causar una mejora en una afección clínicamente significativa en un huésped. Como se aprecia por los expertos en la materia, la cantidad de un compuesto puede variar dependiendo de su actividad específica. Las cantidades de dosificación adecuadas pueden contener una cantidad predeterminada de composición activa calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el diluyente requerido. En los métodos y el uso para la fabricación de composiciones de la invención, se proporciona una cantidad terapéuticamente eficaz del componente activo. El personal médico experto puede determinar una cantidad terapéuticamente eficaz basándose en las características del paciente, tales como edad, peso, sexo, afección, complicaciones y otras enfermedades, como es bien conocido en la técnica (véase el Ejemplo 6 más adelante). La administración de la dosis farmacéuticamente eficaz puede llevarse a cabo tanto por administración única en forma de una unidad de dosis individual como por varias otras unidades de dosis más pequeñas y también por múltiples administraciones de dosis subdivididas a intervalos específicos. Como alternativa, las dosis pueden proporcionarse como una infusión continua durante un período prolongado.
En el contexto del uso diagnóstico de los polipéptidos de anticuerpos de la invención, una "cantidad farmacéuticamente eficaz" o "cantidad eficaz" o "diagnóstico eficaz", como se usa en el presente documento, se refiere a esa cantidad que proporciona una señal detectable para finalidades de obtención de imágenes in vivo.
Los polipéptidos de anticuerpos de la invención pueden formularse en diversas concentraciones, dependiendo de la eficacia/toxicidad del compuesto que se esté usando. La formulación puede comprender el polipéptido en una concentración de entre 0,1 pM y 1 mM, entre 1 pM y 500 pM, entre 500 pM y 1 mM, entre 300 pM y 700 pM, entre 1 pM y 100 pM, entre 100 pM y 200 pM, entre 200 pM y 300 pM, entre 300 pM y 400 pM, entre 400 pM y 500 pM y aproximadamente 500 pM.
Normalmente, la dosis terapéutica del polipéptido de anticuerpo (con o sin un resto terapéutico) en un paciente humano estará en el intervalo de 100 pg a 700 mg por administración (basándose en un peso corporal de 70 kg). Por ejemplo, la dosis terapéutica máxima puede estar en el intervalo de 0,1 a 10 mg/kg por administración, por ejemplo, entre 0,1 y 5 mg/kg o entre 1 y 5 mg/kg o entre 0,1 y 2 mg/kg. Se apreciará que dicha dosis se puede administrar a diferentes intervalos, según lo determine el oncólogo/médico; por ejemplo, una dosis puede administrarse diariamente, dos veces por semana, semanalmente, cada dos semanas o mensualmente.
Los expertos en la técnica apreciarán que las composiciones farmacéuticas de la invención pueden administrarse solas o en combinación con otros agentes terapéuticos usados en el tratamiento de un cáncer de próstata o antes, después o al mismo tiempo que el tratamiento del paciente con otras modalidades terapéuticas para el tratamiento del cáncer de próstata, tales como otros anticuerpos terapéuticos, cirugía (por ejemplo, prostatectomía radical), terapia con radionúclidos, braquiterapia, radioterapia de haz externo, ultrasonido focalizado de alta intensidad (HIFU), quimioterapia, fármacos quimioterapéuticos orales, criocirugía (congelación del tumor), terapia hormonal (tal como la terapia antiandrógena), castración o combinaciones de las anteriores.
También se desvela en el presente documento un kit que comprende un polipéptido de anticuerpo de acuerdo con el primer aspecto de la invención o una composición farmacéutica de acuerdo con el tercer aspecto de la invención, junto con instrucciones para el uso del mismo como se describe en el presente documento.
Un cuarto aspecto de la invención proporciona un polipéptido de anticuerpo de acuerdo con el primer aspecto de la invención para su uso en medicina.
Un quinto aspecto de la invención proporciona un polipéptido de anticuerpo de acuerdo con el primer aspecto de la invención para su uso en el tratamiento y/o diagnóstico de cáncer de próstata.
También se desvela en el presente documento un método de tratamiento del cáncer de próstata en un sujeto, comprendiendo el método administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido de anticuerpo de acuerdo con el primer aspecto de la invención.
Por "tratamiento" los presentes investigadores incluyen tanto el tratamiento terapéutico como el profiláctico del paciente. El término "profiláctico" se usa para abarcar el uso de un agente o una formulación del mismo, como se describe en el presente documento que evita o reduce la probabilidad de cáncer de próstata o la propagación, diseminación o metástasis del cáncer de próstata localizado en un paciente o sujeto. El término "profiláctico" también abarca el uso de un agente o formulación del mismo, como se describe en el presente documento para evitar la reaparición del cáncer de próstata en un paciente que se ha tratado previamente por cáncer de próstata.
También se divulga además en el presente documento un método de diagnóstico del cáncer de próstata en un sujeto, comprendiendo el método administrar al sujeto una cantidad diagnósticamente eficaz de un polipéptido de anticuerpo de acuerdo con el primer aspecto de la invención.
Por "diagnóstico" los presentes investigadores incluyen la detección de células de cáncer de próstata, ya sea in vivo (es decir, dentro del cuerpo de un paciente) o ex vivo (es decir, dentro de una muestra de tejido o célula extraída del cuerpo de un paciente).
El cáncer de próstata que se va a tratar o diagnosticar puede estar localizado en la próstata o puede ser un cáncer de próstata no localizado (es decir, diseminado). El cáncer de próstata localizado en la próstata puede, por ejemplo, clasificarse como cánceres clínicos T1 o T2 de acuerdo con el sistema TNM (abreviado de tumor/nódulos/metástasis), si bien el cáncer de próstata no localizado/diseminado puede, por ejemplo, clasificarse como cánceres clínicos T3 o T4.
El cáncer de próstata que se va a tratar o diagnosticar puede ser un cáncer de próstata metastásico. La metástasis se refiere a la propagación de un cáncer desde su ubicación original a otros sitios en el cuerpo. Por ejemplo, el cáncer de próstata metastásico que se va a tratar o diagnosticar puede ser una metástasis presente en el sistema linfático; en el hueso (incluyendo la columna vertebral, vértebras, pelvis, costillas); metástasis dentro de la pelvis, recto, la vejiga o la uretra. Las metástasis presentes en otras ubicaciones menos comunes también pueden tratarse con la presente invención. Las metástasis pueden ser micrometástasis. La micrometástasis es una forma de metástasis en la cual los tumores recién formados son generalmente demasiado pequeños para detectarse o se detectan con dificultad. Por ejemplo, la presente invención proporciona al experto en la técnica medios para tratar células cancerosas individuales o agrupaciones celulares, incluso si la presencia de dichas células o agrupaciones no pueden diagnosticarse pero existen, por ejemplo, como enfermedad diseminada oculta.
Por consiguiente, se anticipa que una ventaja técnica particularmente importante del tratamiento proporcionado por la presente invención, en comparación con los tratamientos del cáncer de próstata de la técnica anterior, es la eficacia aumentada en el tratamiento del cáncer de próstata diseminado y/o metastásico (incluyendo el micrometastásico).
Por tanto, en una realización, la invención proporciona polipéptidos de anticuerpos y métodos para evitar o tratar la metástasis de un tumor de próstata primario.
El cáncer de próstata tiende a desarrollarse en hombres mayores de cincuenta años, más comúnmente en hombres mayores de 60, 65 o 70 años y aunque es uno de los tipos de cáncer más prevalentes en hombres, muchos nunca presentan síntomas, no se someten a ninguna terapia y finalmente, mueren por otras causas. Esto se debe a que el cáncer de próstata es, en la mayoría de los casos, de crecimiento lento, sin síntomas y dado que los hombres con la afección son mayores, a menudo mueren por causas no relacionadas con el cáncer de próstata, tales como enfermedad cardíaca/circulatoria, neumonía, otros cánceres no relacionados o vejez. Aproximadamente dos tercios de los casos de cáncer de próstata crecen lentamente, el otro tercio es más agresivo y se desarrolla rápido.
Por consiguiente, el desarrollo de métodos eficaces para el tratamiento y diagnóstico del cáncer de próstata es particularmente importante para el tratamiento de formas más agresivas y de rápido desarrollo del cáncer, particularmente en pacientes más jóvenes. Por consiguiente, en una realización, la invención se refiere al tratamiento o diagnóstico del cáncer de próstata en un paciente que tiene menos de 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40 o menos años en el momento del diagnóstico de cáncer de próstata y/o en el momento del tratamiento.
Se piensa que los hombres que tienen un familiar de primer grado (padre o hermano) con cáncer de próstata tienen el doble de riesgo de desarrollar cáncer de próstata y los que tienen dos familiares de primer grado afectados tienen un riesgo cinco veces mayor en comparación con los hombres sin antecedente familiar. Por consiguiente, la invención puede referirse al tratamiento o diagnóstico del cáncer de próstata en un paciente que se caracteriza por que uno, dos o más, miembros de la familia, en particular, miembros de familia de primer grado (tales como un padre o hermano), a los que se ha diagnosticado previamente de cáncer de próstata.
La invención también se refiere al tratamiento o diagnóstico del cáncer de próstata en un paciente, en donde el cáncer de próstata que se va a tratar es cáncer de próstata resistente a la castración (CRPC; del inglés, castration-resistant prostate cancer). El CRPC puede caracterizarse por volverse normalmente refractario al tratamiento hormonal después de uno a tres años y reanudar el crecimiento a pesar de la terapia hormonal.
En los usos médicos y métodos de la invención, normalmente el polipéptido de anticuerpo se inyecta o infunde en el cuerpo del paciente. In vivo, el polipéptido de anticuerpo a continuación se une a los tejidos que producen el antígeno objetivo, p SA; principalmente, células de cáncer de próstata y metástasis de las mismas. Al unirse, el polipéptido de anticuerpo puede ejercer directamente un efecto terapéutico (por ejemplo, inducir la muerte celular a través de ADCC, CDC o en virtud de llevar un radioisótopo u otro resto citotóxico). Como alternativa, el polipéptido de anticuerpo unido puede servir como una herramienta de diagnóstico (obtención de imágenes), que puede guiar la elección de la terapia o ayudar a la extirpación quirúrgica de las células cancerosas.
Los expertos en la técnica apreciarán que los polipéptidos de anticuerpos de la invención se pueden usar en combinación con otros agentes/tratamientos terapéuticos y/o diagnósticos, tales como radioterapia externa, cirugía, citostáticos y tratamientos con andrógenos.
La descripción anterior se centra en las realizaciones de la presente invención aplicables a métodos para el tratamiento y diagnóstico del cáncer de próstata. Sin embargo, se apreciará que los polipéptidos de anticuerpos de la presente invención pueden ser útiles en aplicaciones tales como exámenes posoperatorios y exámenes durante o después de tratamientos de radiación, citostáticos y de andrógenos.
En otra realización, se puede usar la cirugía radioguiada (RGS; del inglés, radio guided surgery) o la cirugía guiada por imágenes (IGS; del inglés, image-guided surgery) para identificar los polipéptidos de anticuerpos marcados con indicador de la invención durante y/o antes de la cirugía. Por tanto, un polipéptido de anticuerpo que comprende un resto detectable como se ha analizado anteriormente puede administrarse durante y/o antes de la cirugía. En esta realización, los polipéptidos de anticuerpos pueden infundirse primero. Posteriormente, se puede usar RGS/IGS para identificar tejido productor de PSA con un instrumento de detección sensible al resto detectable, durante o antes de la cirugía. El resto detectable puede ser, por ejemplo, un resto detectable sensible a la radiación magnética o emisor de radiación; puede, por ejemplo, un emisor de radiación Cerenkov y/o Bremsstrahlung; puede ser un marcador fluorescente y/o un marcador magnético o magnetizable. Por consiguiente, la RGS/IGS de acuerdo con la presente invención puede ser, por ejemplo, un método que se basa en la detección de radiación óptica, Cerenkov, Bremsstrahlung o beta; la detección de un marcador de radionúclido y/o puede implicar magnetometría. La RGS es bien conocida por el experto en la técnica como una técnica quirúrgica que permite al cirujano identificar el tejido "marcado" por el resto detectable.
Las visualizaciones obtenidas de acuerdo con los métodos anteriores pueden combinarse con otros métodos de visualización radiológica, tales como la SPECT/PET, tomografía computarizada (TC; en inglés, CT), los ultrasonidos (US) y la obtención de imágenes mediante resonancia magnética (IRM; en inglés, MRI).
También se desvelan en el presente documento polipéptidos de anticuerpos para su uso en medicina mediante la administración a un paciente con cáncer de próstata antes o durante la cirugía, tal como la cirugía radioguiada o guiada por imágenes.
También se divulga en el presente documento un método in vitro para la detección de células tumorales de próstata en la sangre de un sujeto, comprendiendo el método:
(a) proporcionar una muestra de sangre de un sujeto para analizarla;
(b) opcionalmente, extraer y/o purificar células presentes en la muestra de sangre;
(c) poner en contacto un polipéptido de anticuerpo de acuerdo con el primer aspecto de la invención con células presentes en la muestra de sangre;
(d) determinar (directa o indirectamente) si el polipéptido de anticuerpo se une a PSA libre (es decir, sin formar complejo)
en donde la unión del polipéptido de anticuerpo a PSA libre es indicativa de la presencia de células tumorales de próstata en la sangre de un sujeto.
Por tanto, el método comprende realizar un ensayo para determinar si la muestra de sangre contiene PSA libre; siendo la presencia de PSA libre indicativa de la presencia de células tumorales de próstata en la sangre de un sujeto. Las personas expertas en la técnica apreciarán que hay muchas formas de realizar dicho ensayo. Por ejemplo, el inmunoensayo podría ser homogéneo o más preferentemente, heterogéneo. El ensayo podría realizarse también en un formato competitivo o más preferentemente, en uno no competitivo.
En el caso del ensayo heterogéneo no competitivo, un protocolo ilustrativo podría ser:
(a) proporcionar una muestra de sangre de un sujeto para analizarla;
(b) opcionalmente, extraer y/o purificar células presentes en la muestra de sangre;
(c) poner en contacto un polipéptido de anticuerpo inmovilizado en fase sólida de acuerdo con el primer aspecto de la invención con células presentes en la muestra de sangre;
(d) lavar para eliminar los componentes solubles (no unidos a la superficie sólida);
(e) añadir el indicador, es decir, otro anticuerpo específico anti-PSA marcado con una molécula/partícula indicadora;
(f) lavar para eliminar el anticuerpo indicador no unido; y
(g) detectar la señal del anticuerpo indicador
Entre las etapas b y c o c y d, normalmente debe haber un período de incubación para permitir que la célula produzca PSA soluble, para a continuación se detecte.
También se divulga en el presente documento un método in vitro para la detección de células tumorales de próstata en el tejido de un sujeto, comprendiendo el método
(a) proporcionar una muestra de tejido (tal como una muestra histológica) de un sujeto para ser analizado;
(b) opcionalmente, extraer y/o purificar células presentes en la muestra de tejido;
(c) poner en contacto un polipéptido de anticuerpo de acuerdo con el primer aspecto de la invención con células presentes en la muestra de tejido;
(d) determinar (directa o indirectamente) si el polipéptido de anticuerpo se une a PSA libre (es decir, sin formar complejo)
en donde la unión del polipéptido de anticuerpo a PSA libre es indicativa de la presencia de células tumorales de próstata en el tejido de un sujeto.
En una realización de los métodos in vitro anteriores, la etapa (d) se realiza mediante ELISA. Sin embargo, se puede usar cualquier ensayo adecuado para detectar interacciones anticuerpo-antígeno in vitro.
En una realización adicional, el método comprende además la cuantificación de las células tumorales de próstata en la muestra.
En una realización adicional de los métodos in vitro anteriores, el método es para el diagnóstico de cáncer de próstata en un sujeto.
El uso de la palabra "un" o "uno/a", cuando se usa junto con la expresión "que comprende" en las reivindicaciones y/o en la memoria descriptiva puede significar "uno/a", pero también está en consonancia con el significado de "uno/a o más", "al menos uno/a", y "uno/a o más de uno/a".
Estas y otras realizaciones de la invención se apreciarán y se entenderán mejor cuando se consideren junto con la descripción anterior y los dibujos adjuntos. Debe entenderse, sin embargo, que la descripción anterior, si bien indican diversas realizaciones de la invención y numerosos detalles específicos de la misma, se proporciona a modo de ilustración y no de limitación. Muchas sustituciones, modificaciones, adiciones y/o reordenamientos pueden hacerse dentro del alcance de la invención reivindicada.
Los siguientes dibujos forman parte de la presente memoria descriptiva y se incluyen para demostrar adicionalmente determinados aspectos de la presente invención. La invención puede entenderse mejor haciendo referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de las realizaciones específicas presentadas en el presente documento.
Figura 1: Imágenes representativas de SPECT/TC de xenoinjertos de LNCaP escaneados hasta 7 días tras la inyección de 111In-DTPA-h5A10.
Figura 2: Imágenes representativas de SPECT/TC de xenoinjertos de LNCaP escaneados hasta 7 días tras la inyección de 111In-DTPA-m5A10.
Figura 3: Análisis de las relaciones de tumor respecto a contralateral de m5A10 y h5A10 en el ratón de xenoinjerto de LNCaP.
Figura 4: Análisis de las relaciones de hígado respecto a tumor de m5A10 y h5A10 en el ratón de xenoinjerto de LNCaP.
Figura 5: Análisis de biodistribución de 111In-DTPA-m5A10 y 111In-DTPA-h5A10 en el ratón de xenoinjerto de LNCaP.
Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar realizaciones particulares de la invención. Los expertos en la técnica deberían apreciar que las técnicas divulgadas en los ejemplos que siguen representan técnicas descubiertas por el inventor que funcionan bien en la práctica de la invención y por tanto se puede considerar que constituyen modos específicos para su práctica.
Ejemplos
Ejemplo 1 - Clonación del anticuerpo monoclonal murino 5A10 en formato FAb
Reactivos
Las enzimas de restricción fueron de Fermentas y Promega, la fosfatasa alcalina de Amersham Pharmacia Biotech y los dNTP y ADN ligasa T4 de Fermentas. Los cebadores fueron de la University of Turku, Department of Biotechnology y de Eurogentec. Los kits de Qiagen se utilizaron para las purificaciones de ADN.
Extracción de ARNm y síntesis de ADNc
El ARNm se extrajo de las células de hibridoma que producen Mab 5A10 (células 2E6; Lilja et al, 1991) con perlas magnéticas polydT de Dynal de acuerdo con el procedimiento descrito por el fabricante en "Biomagnetic Techniques in Molecular Biology: Technical handbook"(Dynal A.S, 2a edición, 1995). La síntesis de ADNc se realizó con la enzima Super Script (Gibco BRL): Primero, las partículas magnéticas unidas con ARNm se incubaron a 42 °C durante 2 min en una reacción que contiene 1x tampón de reacción, DTT 0,1 M, dNTP 2 mM e inhibidor de ARNasa (1,5 pl en un volumen de reacción total de 50 pl). A continuación, se añadió 1 pl de Super Script (200 U) y a continuación, la reacción se dejó proceder 1 hora en 42 °C. Después de la síntesis de ADNc, las partículas y la mezcla de reacción se separaron mediante un colector de partículas magnéticas, se eliminó el líquido, las partículas se suspendieron en el tampón TE y se incubaron a 95 °C durante 1 min para liberar el ARNm. Después de la incubación, se recogió el ADNc unido a las partículas, se eliminó el tampón que contenía ARNm, se lavaron las partículas con TE y finalmente, se suspendieron en 50 pl de TE para su almacenamiento.
Amplificación de los genes de anticuerpos del ADNc y clonación
Las secuencias de aminoácidos del extremo N terminal de las cadenas ligera y pesada se determinaron mediante el método de degradación de Edman en la University of Turku, servicio de secuenciación del Center of Biotechnology. Las secuencias obtenidas de la cadena ligera y pesada fueron DIVMTQS [SEQ ID NO: 18] y EVQLVESG [SEQ ID n O: 19], respectivamente. Basándose en la secuencia de aminoácidos del extremo N terminal, se realizó una búsqueda en la base de datos (SwissProt) para identificar las secuencias de nucleótidos correspondientes entre los genes V de la línea germinal de inmunoglobulina de ratón. Las regiones complementarias de los cebadores de PCR directos para clonar las cadenas pesada y ligera se diseñaron basándose en la búsqueda. Se diseñaron cebadores inversos para unir CH1 y CL, respectivamente. Los cebadores también contienen los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción necesarios para la clonación (subrayados más adelante).
Las reacciones de PCR se realizaron en las siguientes condiciones (excepto el cambio de cebadores y moldes): dNTP 125 pM, 0,5 pM de cebadores directos e inversos, 1x tampón de reacción de Pfu y 2,5U Pfu ADN polimerasa (Stratagene). La amplificación se realizó mediante 30 ciclos de 95 °C 30 s, 55 °C 1 min y 72 °C 1 min 30 s.
La cadena ligera se amplificó a partir de ADNc con los siguientes cebadores:
• 5A10-L (5'-CCAGCCATGGCTGACATTGTGATGACCCAGTCTCA-3', Ncol [SEQ ID NO:20]) y
• WO252 (5'-GCGCCGTCTAGAATTAACACTCATTCCTGTTGAA-3', Xbal [SEQ ID NO:21]).
La cadena ligera y el vector pComb3 que contiene los genes de un Fab no relacionado (Barbas et al., 1991) se digirieron con Ncol y Xbal (para el vector, digestión parcial con Ncol), se purificaron a partir de gel de agarosa y se ligaron. El producto de ligación se transformó en E. coli XL1-Blue para obtener el plásmido p5A10-L.
La cadena de Fd (VH+CH1) se amplificó con el siguiente par de cebadores: 5A10-H (5-CCAGCCATGGCTGAGGT-GCAATTGGTGGAGTCTGG-3', NcoI [SEQ ID NO:22]) y WO267 (5-CTAGACTAGTACAATCCCTGGGCACAATTT -TC-3', Spel [SEQ ID NO:23]). La cadena Fd se clonó en el vector pComb3 para reemplazar el gen Fd de otro Fab transportado por el vector. Los productos de PCR y el vector se digirieron con NcoI (digestión parcial con Ncol tanto para el vector como para el inserto) y Spel (New England Biolabs), se purificaron a partir de gel de agarosa y se ligaron. El producto de ligación se transformó en E. coli XL1-Blue para producir el vector p5A10-H.
La cadena ligera de 5A10 se digirió a partir del plásmido p5A10-L con Spel y Xbal y tras la purificación en gel, se ligó con el plásmido p5A10-H purificado en gel y también se digirió con las enzimas correspondientes. El producto de ligación se transformó en E. coli XL1-Blue para obtener el plásmido pComb3- 5A10 que contenía tanto la cadena ligera como la Fd del Fab 5A10. Para eliminar el gen glllp de la proteína de revestimiento del fago fusionado a la cadena Fd, el pComb3-5A10 se digirió adicionalmente con Spel y Nhel, se autoligó y transformó en E. coli XL1-Blue. El plásmido pComb3-5A10DIII permitió la expresión de Fab 5A10 funcional soluble.
Referencias
Barbas CF 3.°, Kang AS, Lerner RA, Benkovic SJ. (1991) Assembly of combinatorial antibody libraries on phage surfaces: The gene III site. Proc. Nat. Acad. Sci., Vol. 88, págs. 7978-7982
Biomagnetic Techniques in Molecular Biology: Technical handbook. Dynal A.S, 2a edición, 1995
Lilja H, Christensson A, Dahlen U, Matikainen MT, Nilsson O, Pettersson K, Lovgren T. (1991) Prostate-specific antigen in serum occurs predominantly in complex with alpha 1-antichymotrypsin. Clin Chem. 37(9):1618-25
Ejemplo 2 - Expresión y purificación de un anticuerpo 5A10 humanizado
Las células HEK293 se expandieron en un cultivo en suspensión de 2 l en medio de expresión FreeStyle 293 (Life Technologies). La densidad celular fue de 1 x 106 células/ml el día de la transfección.
Las secuencias de nucleótidos que codifican las cadenas ligeras o pesadas del componente (por ejemplo, las SEQ ID NO: 16 y 17, respectivamente) se optimizaron por codones para la expresión en células de mamífero, se sintetizaron y clonaron en vectores de expresión de IgG. El ADN plasmídico (vector de expresión) que contiene las secuencias de nucleótidos para las cadenas pesada y ligera se mezcló a continuación, con el agente de transfección y se incubó durante 10 min a TA. La mezcla de agente de transfección de ADN se añadió lentamente al cultivo celular al tiempo que agitó el matraz lentamente. A continuación, el cultivo de células transfectadas se incubó a 37 °C, CO2 al 8% en una plataforma de agitador orbital girando a aproximadamente 135 rpm, durante siete días.
El medio de cultivo se recogió por centrifugación y se filtró a través de sistemas de filtrado de 5 pm, 0,6 pm y 0,22 pm. Los anticuerpos se purificaron mediante cromatografía de proteína G y el tampón se cambió a PBS pH 7,4 mediante diálisis; posteriormente, los anticuerpos se concentraron por ultrafiltración.
La concentración se midió por absorbancia.
ADN:
Cadena ligera: cantidad de p5A10VLhDhk (4300 pb): 0,35 mg
Cadena pesada: cantidad de p5A10VHhDhlgG1 (4900 pb): 0,60 mg
Las cantidades de ADN no se optimizaron.
Agente de transfección: patentado (sin embargo, hay agentes de transfección adecuados fácilmente disponibles comercialmente, tales como el reactivo de transfección Xfect™ (Clontech), Lipofectamine (Life Technologies), reactivo de transfección FuGENE® HD (Promega), reactivo FreeStyle™ Max (Invitrogen), DEAE-dextrano, polietilenimina y fosfato cálcico).
Rendimiento global: 15 mg (7,5 mg/l).
Ejemplo 3 - Caracterización de h5A10: Afinidad
Objetivos de estudio
El objetivo del estudio fue investigar la cinética de unión entre ocho variantes del anticuerpo 5A10 y el antígeno PSA utilizando la técnica de resonancia de plasmón superficial (SPR; del inglés, surface plasmon resonance) en un instrumento Biacore.
Con el fin de investigar la calidad de las muestras de proteínas (anticuerpos y antígeno), se ejecutó un gel SDS-PAGE antes de los experimentos de SPR.
En un estudio previo, se investigaron diferentes parámetros con el fin de encontrar las condiciones adecuadas para los experimentos en el Estudio.
En el Estudio, se realizaron múltiples mediciones de unión para los ocho anticuerpos y el antígeno. A partir de los datos recogidos, las constantes de velocidad de asociación y disociación (ka y kd; en inglés, kon y koff respectivamente) y las constantes de disociación (KD) se calcularon y notificaron en el presente documento.
Información de reactivos e instrumentos
Las siguientes soluciones de los ocho anticuerpos y de un antígeno se suministraron por Diaprost AB:
PSA 169 pg/ml
m5A10 (141203) 1 mg/ml
m5A10 (140905) 4 pM
m5A10-DFO (140905) 4 pM
m5A10-DOTA (140905) 4 pM
m5A10-DTPA (140905) 4 pM
h5A10 (141203) 1 mg/ml
h5A10-DFO (141203) 2 mg/ml
h5A10-DTPA (141203) 1 mg/ml
h5A10- DOTA (141211) 2,5 pM
Todas las muestras se dividieron en alícuotas y se mantuvieron en un congelador a -20 °C antes del análisis.
Todos los experimentos de unión se realizaron en una microplaca CM4 en un instrumento Biacore 3000. La microplaca y todos los reactivos necesarios para la activación, inmovilización, desactivación, unión y regeneración se adquirieron de GE Healthcare y se utilizaron de acuerdo con las directrices del fabricante.
SDS-PAGE
(a) Descripción del experimento
Los reactivos proporcionados por Diaprost AB se procesaron en un gel de acrilamida TRIS-Tricine al 10-20% de Novex de acuerdo con las directrices del fabricante.
Se procesaron simultáneamente en el mismo gel dos series de muestras de proteínas, nativas y reducidas, junto con una muestra estándar.
Cada muestra de la serie nativa contenía: 1-1,3 pg de la proteína, tampón TRIS pH 7,4, SDS y tampón de carga. Cada muestra en la serie reducida contenía: 1-1,3 pg de la proteína, tampón TRIS pH 7,4, SDS, tampón de carga y beta2-mercaptoetanol al 0,04% v/v (el agente reductor).
La tinción del gel se realizó en una solución de Coomassie azul brillante de ácido acético, etanol y agua con las proporciones correspondientes de 0,7, 3,0, 6,3.
La decoloración del gel se realizó en la solución de ácido acético, etanol y agua con las proporciones correspondientes de 0,7, 3,0, 6,3.
(b) Resultados y conclusiones
Resulta evidente a partir de estos resultados que las muestras de anticuerpos y antígenos son de alta calidad y pureza (resultados no mostrados).
Estudio de afinidad
(a) Se realizaron dos experimentos con el fin de determinar la afinidad de las interacciones utilizando las condiciones descritas más adelante.
Inmovilización de antígeno en una microplaca CM4.
La activación de la microplaca CM4-1 se realizó de acuerdo con las directrices del fabricante para el acoplamiento de amina utilizando una mezcla de EDC y NHS.
Una solución que contenía 3,00 pg/ml del antígeno PSA (solución madre de PSA diluida en tampón de NaAc 10 mM pH 3,8) se dejó fluir sobre los canales fc2-4 en la microplaca CM4-1 con el fin de inmovilizar el antígeno en la microplaca. Caudal: 5 pl/min, volumen: 200 pl.
UR objetivo < Pm/10 Pm(PSA) = 30000 Da UR objetivo (PSA) < 3000
El canal fc1 se utilizó como blanco.
La siguiente inmovilización se logró en el primer experimento:
fc2 = 1450 UR fc3 = 850 UR fc4 = 900 UR
La siguiente inmovilización se logró en el segundo experimento:
fc2 = 1325 UR fc3 = 890 UR fc4 = 1060 UR
Todos los canales (fc1-4) se bloquearon mediante etanolamina después de la activación e inmovilización.
Estos datos demuestran que se logró una inmovilización adecuada utilizando 3,00 pg/ml del antígeno.
(b) Investigación de la fase de asociación
La fase de asociación de los ocho anticuerpos a la microplaca CM4-1 se siguió durante 5 minutos cuando las soluciones de 4 concentraciones diferentes de cada anticuerpo (soluciones madre diluidas en tampón HSP) se dejaron fluir sobre los canales fc2-4 en la microplaca CM4-1 con una velocidad de 30 pl/min.
Las concentraciones investigadas para cada anticuerpo fueron: 100, 50, 25 y 12,5 nM.
Adicionalmente, se obtuvieron datos de asociación de los experimentos en los que se siguió el proceso de disociación durante 8 horas.
En total, se realizaron 3-9 experimentos de asociación individuales para cada anticuerpo.
La señal del blanco, fc1, se restó para todos los datos.
Los presentes investigadores encontraron que después de 5 minutos, pudieron ajustar los datos para los procesos de asociación.
(c) Investigación de la fase de disociación
La fase de disociación se siguió durante 8 horas para cada uno de los anticuerpos.
La señal del blanco, fc1, se resta en todos los datos utilizados en los cálculos de la constante de disociación.
Los datos indican que los procesos de disociación son muy lentos.
(d) Estimación de la constante de velocidad de disociación (kd)
Los datos de la fase de disociación se ajustaron y se estimaron las constantes de velocidad de disociación (kd) (véase la Tabla 1).
(e) Estimación de la constante de velocidad de asociación (ka)
Con el fin de estimar las constantes de velocidad de asociación, las constantes de velocidad de disociación (Tabla 1) se utilizaron en las ecuaciones ajustadas.
(f) Estimación de la constante de disociación (kD)
La constante de disociación (Kd) para cada uno de los anticuerpos ensayados se muestra en la Tabla 1.
Tabla 1
Figure imgf000023_0001
continuación
Figure imgf000024_0002
Las constantes de disociación (Kd) están en el intervalo de 10-11 M para los ocho anticuerpos.
Aunque no es estadísticamente significativa, la constante de disociación para el anticuerpo humanizado parece ser mayor que la del anticuerpo murino parental.
La conjugación de los anticuerpos humanizados no parece afectar a la afinidad notablemente, dado que la Kd no cambia significativamente.
Sumario
• Los procesos de asociación son muy rápidos para todos los anticuerpos y las constantes de velocidad de asociación (ka) están todas en el intervalo de 105 M-1 s-1 basándose en 3-9 experimentos para cada anticuerpo.
• Los procesos de disociación son muy lentos y casi en el intervalo de las limitaciones técnicas de Biacore. Las constantes de velocidad de disociación (kd) están todas en el intervalo de 10-6 s-1 basándose en 3-9 experimentos para cada anticuerpo.
• Las constantes de disociación (Kd) están en el intervalo de 10-11 M para todos los anticuerpos.
Ejemplo 4 - Caracterización de hSA10: Agregación
Sumario ejecutivo
Se han realizado estudios de dispersión dinámica de luz (DLS; del inglés, dynamic light scattering) en 6 variantes de la IgG para estudiar su propensión a agregarse. Los resultados de DLS muestran que todas las construcciones tienen un tamaño razonable (200 kDa o ligeramente por encima de 200 kDa, asumiendo una proteína esférica) y poca o ninguna agregación.
Objetivo
Caracterizar seis construcciones de IgG con respecto al estado oligomérico usando dispersión de luz dinámica. Resultados
Dispersión de luz dinámica
La dispersión de luz dinámica se midió a 20 °C en muestras por duplicado utilizando el equipamiento Zetasizer APS de Malvern. Cada muestra se midió tres veces. El tampón HBS-EP (del cliente) se utilizó como control para asegurarse de que el tampón estuviera razonablemente libre de polvo y agregados. No se pudieron realizar mediciones de agregados fiables en el tampón HBS-EP, lo cual es bueno, dado que el tampón debe estar libre de agregados. Todas las muestras pudieron medirse de forma fiable utilizando la función de distribución de números. Se calculó el radio promedio de la especie más abundante junto con la polidispersidad de la especie. La distribución de masa promedio de esta especie se calculó también, véase la Tabla 2.
Tabla 2
Figure imgf000024_0001
continuación
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Un radio de 5,7 nm corresponde a un peso molecular de aproximadamente 200 kDa para una proteína que tiene una forma esférica perfecta. Un radio de 6,1 nm corresponde a un peso molecular de aproximadamente 230 kDa para una proteína que tiene una forma esférica perfecta. Esto está razonablemente cerca del peso molecular de 150 kDa para las moléculas de IgG, lo que significa que la mayoría de las muestras consisten principalmente en moléculas de IgG monoméricas y/o diméricas. La razón para no excluir dímeros es que la dispersión de la luz da una estimación aproximada del tamaño basada en la forma molecular y esto hace que sea difícil separar monómeros y dímeros pero fácil separar grandes agregados de monómeros. Se encontraron pequeñas partículas por debajo de 1 kDa en todas las muestras de IgG de ratón. Estas partículas se han ignorado en la Tabla 1, dado que se supone que pertenecen a un componente encontrado en el tampón debido a su pequeño tamaño. Por el contrario, una pequeña fracción de agregados mayores se encuentra en todas las IgG humanas pero no en las IgG de ratón.
Conclusiones
La dispersión de luz dinámica muestra que todas las construcciones tienen un tamaño razonable y poca o ninguna agregación. Las distribuciones de tamaño para las seis construcciones se solapan. Sorprendentemente, se encontraron partículas similares al tampón (<1 kDa) en todas las muestras de IgG de ratón, si bien se encuentran agregados mayores solo en las muestras de IgG humana.
Ejemplo 5 - Caracterización de h5A10: Biodistribución in vivo
Este estudio compara la biodistribución in vivo de 5A10 murino y 5A10 humano cuando se marcan con 111In.
Material y métodos
Se produjo un anticuerpo homólogo humanizado, h5A10, como se describe a continuación.
• Anticuerpos: El anticuerpo monoclonal humanizado ilustrativo 5A10 (IgG1/kappa, expresado de forma transitoria en células HEK 293; véase el Ejemplo 2), que comprende una cadena pesada de acuerdo con el SEQ ID NO: 12 y una cadena ligera de acuerdo con el SEQ ID NO: 13, se suministró por Innovagen AB, Lund (lote n.° 90475.33, conc 1,0 mg/ml en PBS, pH 7,4). Se utilizó un anticuerpo IgG no específico como control de isotipo (anticuerpo IgG de suero de ratón, Sigma I-8765).
Conjugación y radiomarcaje
Conjugación de CHX-A"-DTPA con 5A10: Las soluciones de mAb 5A10 murino y humanizado en PBS o NaCl se ajustaron a pH 9,2 usando tampón borato sódico 0,07 M (Sigma Aldrich). A continuación, la solución de proteína se conjugó con quelante CHX-A"-DTPA (Macrocyclics, Estados Unidos) en una relación molar de quelante respecto a anticuerpo de 3:1 a 40 °C durante 4 h. La reacción se terminó y se separó CHX-A "-DTPA-11B6 (DTPA-11B6) del quelato libre mediante columna de exclusión por tamaño en una columna NAP-5 (GE Healthcare), equilibrada con 20 ml de tampón de acetato de amonio 0,2 M, pH 5,5. Los anticuerpos 5A10 conjugados se eluyeron con 1 ml de tampón acetato de amonio y se almacenaron muestras divididas en alícuotas de 200 ul a -20 °C.
Radiomarcaje de DTPA-5A10: Se mezclaron DTPA-5A10 murino y humanizado, en tampón acetato de amonio pH 5,5 con una cantidad predeterminada de 111 InCl3 (Mallinkrodt Medical, Dublín, Irlanda). Tras la incubación a temperatura ambiente durante 2 h, se terminó el marcaje y se purificó en una columna NAP-5, equilibrada con PBS (Thermo Scientific, Estados Unidos). La eficacia y la cinética del marcaje se controlaron mediante cromatografía instantánea en capa fina (ITLC; del inglés, instant thin-layer chromatography) (Biodex, Shirley, Nueva York, Estados Unidos) eluida con ácido cítrico 0,2 M (Sigma Aldrich). En este sistema, el conjugado radiomarcado permanece en la línea de origen, al tiempo que 111In es libre. La distribución radiactiva se determinó utilizando un Cyclone Storage Phosphor System con el software de cuantificación Optiquant (Perkin Elmer; Waltham, Massachusetts, Estados Unidos).
Estudios en animales
Para los estudios in vivo, se utilizaron las líneas celulares de carcinoma de próstata LNCaP que expresan hK2 (ATCC, Manassas, Virginia, Estados Unidos). Las células se cultivaron en medio RPMI 1640 (Thermo Scientific) complementado con suero bovino fetal al 10% y PEST (100 Ul/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina) de Thermo Scientific. Las células se mantuvieron a 37 °C en una incubadora humidificada con CO2 al 5% y se separaron con una solución de tripsina-EDTA (tripsina al 0,25%, tampón EDTA al 0,02%, Thermo Scientific). Se usó matriz Matrigel (BD-Biosciences, San José, California, Estados Unidos) cuando se realizaron xenoinjertos con células LNCaP.
Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con la legislación nacional sobre protección de animales de laboratorio y con la aprobación del Comité de Ética para la Investigación Animal (Lund University, Suecia). Para este estudio se utilizaron ratones desnudos machos inmunodeficientes, NMRI-Nu, de 6 a 8 semanas de edad (Janvier Labs, Francia). A todos los ratones se les realizaron xenoinjertos s.c. con células LNCaP en su flanco izquierdo, 5-6 millones de células, en 100 pl de medio de crecimiento y 100 pl de Matrigel. Se permitió que los xenoinjertos crecieran durante 6-8 semanas.
Estudios de obtención de imágenes de SPECT/TC
Los estudios de obtención de imágenes de SPECT/TC se realizaron en 111In-DTPA-h5A10 y 111In-DTPA-m5A10. Los animales se anestesiaron con gas isoflurano al 2% a 3% (Baxter; Deerfield, Illinois, Estados Unidos) durante la obtención de imágenes. Los ratones NMRI-nu con xenoinjertos de LNCaP s.c. se inyectaron por vía intravenosa en la vena de la cola con 111In-DTPA-h5A10 (n = 4) o 111In-DTPA-h5A10 (n = 4) con aproximadamente 13-15 MBq, 50 ug de mAb en 100 ul de PBS. Se obtuvieron imágenes de los animales durante 1 h utilizando un escáner SPECT/TC preclínico (NanoSPECT/TC Plus, Bioscan; Washington, DC, Estados Unidos) con el colimador de ratón multiporo NSP-106. La obtención de imágenes se realizó 1, 2, 3 y 7 días después de la inyección. Los datos de SPECT se reconstruyeron utilizando el software HiSPECT (SciVis; Goettingen, Alemania). La obtención de imágenes por TC se realizó antes de cada SPECT de cuerpo entero. Las imágenes de SPECT/TC se analizaron utilizando el software InVivoScope 2.0 (inviCRO; Boston, Massachusetts, Estados Unidos) y las regiones de interés, ROI (del inglés, regionof-interest), se dibujaron utilizando la imagen de TC como referencia anatómica.
Estudios de biodistribución
Los estudios de biodistribución se realizaron tanto en 111In-DTPA-h5A10 como en 111In-DTPA-m5A10. Se inyectó por vía intravenosa a grupos de animales (n=12) de ratones con 111In-DTPA-h5A10 (aproximadamente 3-4 MBq, 50 ug de mAb en 100 ul de PBS) o 111In-DTPA-m5A10 (3-4 MBq, 50 ug de mAb en 100 ul de PBS). Los animales se sacrificaron 7 días p.i. (tras la inyección) y los órganos de interés se recogieron y analizaron con un contador de pocillos automático Nal(TI) con un detector Nal(TI) de 3 pulgadas (1480 WIZARD, Wallac Oy, Turku, Finlandia).
El valor de absorción tisular, expresado como porcentaje de dosis inyectada por gramo de tejido (% IA/g), se calculó como:
% IA/g = (radiactividad tisular/radiactividad inyectada)/peso del órgano x 100 en donde para inyecciones iv:
Radiactividad inyectada = Radiactividad en la jeringa
- radiactividad que queda en la jeringa utilizada
- radiactividad en la cola
Los órganos se pesaron también tras la disección. Se corrigieron respecto al fondo y a la desintegración física. Resultados
Obtención de imágenes de SPECT/TC
En las Figuras 1 y 2 se muestran imágenes de SPECT/TC representativas de xenoinjertos de LNCaP escaneadas hasta 7 días tras la inyección de 111In-DTPA-h5A10 y 111InDTPA-m5A10. La actividad se acumula rápidamente en el tumor de LNCaP en 24 horas y la radiactividad permanece elevada 7 días después de la inyección. También se detectó una alta acumulación de actividad en el hígado. El análisis de ROI mostró que la relación de tumor respecto a tejido blando de la pata contralateral fue de 5,2 ± 0,84 para 111In-DTPA-m5A10 y de 6,4 ± 1,3 para 111In-DTPA-h5A10 a los 7 días p.i.
Biodistribución
Para investigar más a fondo la acumulación de actividad en diferentes órganos, se realizó una biodistribución ex vivo en un mayor número de animales (n = 12 por anticuerpo).
Las relaciones de tumor frente a contralateral de 111In-DTPA-m5A10 y 111In-DTPA-h5A10 a lo largo del tiempo se muestran en la Figura 3. Inesperadamente, se observó que esta relación fue marcadamente mayor para el anticuerpo humanizado que para el anticuerpo murino "parental".
Las relaciones de tumor frente a hígado de 111In-DTPA-m5A10 y 111In-DTPA-h5A10 a lo largo del tiempo se muestran en la Figura 4. De nuevo, inesperadamente, se observó que esta relación fue marcadamente mayor para el anticuerpo humanizado que para el anticuerpo murino "parental".
Los datos de biodistribución de 111In-DTPA-m5A10 y 111In-DTPA-h5A10 se muestran en la Figura 5.
La biodistribución para el 5A10 murino y humanizado en ratones NMRI con xenoinjertos de LNCaP mostró una acumulación tumoral alta a los 7 días, si bien la acumulación en otros órganos, tal como hueso, músculo, fue mucho menor.
La comparación de los datos de biodistribución para 111In-DTPA-h5A10 humanizado con los del anticuerpo murino parental (111In-DTPA-m5A10) reveló una diferencia inesperada y ventajosa. La acumulación tumoral fue significativamente mucho mayor para el humanizado que para el murino, con 7,4 ± 1,4 % IA/g para h5A10 en comparación con 2,7 ± 0,75 % IA/g para m5A10 (p < 0,001) a los 7 días p.i. (Figura 6). La acumulación de radiactividad en otros órganos estuvo aproximadamente al mismo nivel para ambos anticuerpos, haciendo las relaciones de tumor respecto a órgano mucho más altas para el h5A10 humanizado que para el m5A10 murino original (Tabla 3).
Tabla 3
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Conclusiones y discusión
Los resultados de este estudio demostraron lo siguiente:
• el anticuerpo 5A10 humanizado, 111In-h5A10, se dirige eficazmente a tumores de próstata in vivo;
• el anticuerpo h5A10 humanizado inesperadamente muestra una mejor acumulación tumoral que su anticuerpo murino y
• el anticuerpo h5A10 humanizado proporciona un mejor contraste de obtención de imágenes (como se ha mostrado con las relaciones tumor a órgano mayores) que el anticuerpo murino.
Tomados en conjunto, estos hallazgos proporcionan evidencia convincente de las mejores propiedades de direccionamiento de los anticuerpos 5A10 humanizados en el diagnóstico y probablemente una mejor eficacia terapéutica en el tratamiento del cáncer de próstata.
Ejemplo 6 - Planificación de la dosimetría de la terapia con radionúclidos y tratamiento del cáncer de próstata en un paciente
Para la terapia con radionúclidos (RNT; del inglés, radionuclide therapy), la fuente de radiación se distribuye en su totalidad y la radiactividad normalmente se administra por vía sistémica como un radiofármaco. La distribución de la radiactividad depende de la cantidad de radiofármaco que se acumula a lo largo del tiempo en diferentes tejidos, algo que varía entre pacientes (1).
El tratamiento con RNT debe basarse en una dosis prescrita absorbida (2). A continuación, primero se debe realizar un estudio previo a la terapia utilizando una cantidad indicadora del radiofármaco y determinar las dosis absorbidas por el tumor y el órgano. Habitualmente, esta información se expresa como un factor que describe la dosis absorbida por el órgano por unidad de actividad administrada, en unidades de mGy/MBq; DPj(órgano).
Si la administración terapéutica se proporciona a continuación en condiciones similares, este factor puede utilizarse para determinar la actividad que se necesita administrar con el fin de suministrar una dosis prescrita absorbida a un órgano, tejido o tumor dado (4,6).
En el caso del tratamiento del cáncer de próstata con anticuerpos h5A10 radiomarcados, un estudio previo al tratamiento debe basarse en la obtención de imágenes de 111In con 111In-h5A10. 111In es más adecuado para la obtención de imágenes cuantitativas (planar/SPECT) cuando el radionúclido terapéutico debe ser 177Lu. Cuando a continuación se determina el Dpt (órgano), la terapia puede proporcionarse con una actividad de terapia At que da un efecto terapéutico prescrito. Durante la terapia, la distribución de la actividad y la tasa de dosis correspondiente deben calcularse basándose en la obtención de imágenes para conseguir la dosis absorbida real terapéutica dada al tumor y a los órganos normales, necesaria para la evaluación del tratamiento.
En el caso de una terapia donde se alcance el nivel de toxicidad de la médula ósea como resultado de la planificación del tratamiento, a continuación es necesario el apoyo a la médula ósea y basándose en los cálculos de dosimetría para la cavidad de la médula ósea, se debe determinar el tiempo para la reinfusión de células madre.
En síntesis, el siguiente esquema de tratamiento debe planificarse en consecuencia:
Estudio de dosimetría previo al tratamiento
1. Inyección de h5A10 marcado con 111In (200-300 MBq)
2. Muestreo de sangre; concentración de actividad en sangre y plasma determinada la primera semana.
3. Obtención de imágenes (SPECT/planar) durante al menos 1 semana (3-5 veces)
4. Dosimetría de órganos basada en el esquema LundaDose (3) o programa equivalente
5. Actividad de la terapia determinada limitada por la dosis absorbida especificada a los órganos radiosensibles como la médula ósea (2-3 Gy), riñones (20-30 Gy) e hígado (12-36 Gy).
Terapia que incluye la dosimetría intraterapia
1. h5A10 administrado marcado con 177Lu (basado en la dosimetría preterapia)
2. Muestreo de sangre; concentración de actividad en sangre y plasma
3. Obtención de Imágenes durante al menos 1 semana (3-5 veces)
4. Dosimetría de órganos basada en el esquema LundaDose (3) o programa equivalente => Verificación de la dosis absorbida de la terapia prescrita.
Comentarios específicos sobre dosimetría
La actividad acumulada es el número de desintegraciones que se producen en una región dada a lo largo de un período de tiempo. La unidad es Bq s o Bq h. Cuando la radiación ionizante viaja a través de la materia, interactúa y deposita energía. La energía impartida es la suma de todos los depósitos de energía en un volumen dado. La dosis absorbida es la relación entre la energía impartida y la masa del volumen. La unidad de dosis absorbida es el Gray (Gy), 1 Gy equivale a 1 J/kg.
A partir de los valores de la actividad en un tejido en diferentes momentos, la actividad acumulada se determina por integración y la dosis absorbida puede determinarse. Las mediciones de actividad se realizan utilizando la obtención de imágenes planas para la dosimetría de todo el órgano. La SPECT/TC cuantitativa permite la dosimetría en volúmenes más pequeños utilizando métodos basados en vóxeles.
A partir de la distribución 3D de los valores de concentración de actividad, la distribución de la tasa de dosis absorbida puede calcularse utilizando los denominados núcleos de dosis puntuales o valores S vóxel, que describen el patrón de deposición de energía alrededor de una fuente puntual situada en el tejido. Este método asume que la región anatómica es homogénea en términos de densidad, tal como los tejidos blandos dentro del tronco. Para las regiones del cuerpo donde la densidad es heterogénea, como en los pulmones, es preferible un cálculo de Monte Carlo directo. En este punto, la distribución de actividad de SPECT o PET se utiliza como entrada para un código de cálculo de dosis de Monte Carlo.

Claims (14)

REIVINDICACIONES
1. Un polipéptido de anticuerpo con especificidad de unión por el antígeno específico de próstata (PSA), en donde el polipéptido de anticuerpo comprende
(a) una región variable de cadena pesada que comprende las CDR que tienen las secuencias de aminoácidos del SEQ ID NO: 1 y el SEQ ID NO: 2 y el SEQ ID NO: 3; y
(b) una región variable de cadena ligera que comprende las CDR que tienen las secuencias de aminoácidos del SEQ ID NO: 4 y el SEQ ID NO:5 y el SEQ ID NO: 6
y en donde la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera comprenden secuencias de aminoácidos marco de uno o más anticuerpos humanos.
2. Un polipéptido de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende o consiste en un anticuerpo intacto o un fragmento de unión a antígeno seleccionado del grupo que consiste en fragmentos Fv, fragmentos similares a Fab y anticuerpos de dominio.
3. Un polipéptido de anticuerpo de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, que comprende una región variable de cadena pesada que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 8 y/o una región variable de cadena ligera que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 9.
4. Un polipéptido de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende además: (a) una región constante de cadena pesada o parte de la misma, en donde opcionalmente la región constante de cadena pesada es de un subtipo de inmunoglobulina seleccionada del grupo que consiste en IgG1, IgG2, IgG3 y IgG4; y/o (b) una región constante de cadena ligera o parte de la misma, en donde opcionalmente la región constante de cadena ligera es de una cadena ligera kappa o lambda.
5. Un polipéptido de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende una región constante de cadena pesada que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 10 y/o una región constante de cadena ligera que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 11.
6. Un polipéptido de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende una cadena pesada que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 12 y/o una cadena ligera que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 13.
7. Un polipéptido de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde (a) el polipéptido de anticuerpo está unido, directa o indirectamente, a un resto terapéutico y/o (b) el polipéptido de anticuerpo además comprende un resto detectable.
8. Un polipéptido de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el resto terapéutico y/o el resto detectable están unidos al polipéptido de anticuerpo indirectamente, a través de un resto de enlace.
9. Un polipéptido de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el resto de enlace es un quelante seleccionado del grupo que consiste en derivados del ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10,tetraacético (DOTA), deferoxamina (DFO), derivados del ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA), derivados del ácido S-2-(4-isotiocianatobencil)-1,4,7-triazaciclononano-1,4,7-triacético (NOTA) y derivados del ácido 1,4,8,11 -tetraazaciclodocedan-1,4,8,11-tetraacético (TETA).
10. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores o cadena polipeptídica componente del mismo.
11. Una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 10, que comprende la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 14 y/o del SEQ ID NO: 15, en donde opcionalmente la molécula de ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO: 16 y/o del SEQ ID NO: 17.
12. Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y un excipiente, diluyente o portador farmacéuticamente aceptable.
13. Un polipéptido de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para usar como un medicamento.
14. Un polipéptido de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para usar en el tratamiento y/o el diagnóstico del cáncer de próstata.
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