ES2881322T3 - Un método de mejora de la degradación de sustrato en plantas agrícolas de biogás - Google Patents

Abstract

Un método de tratamiento de sustratos para la producción de biogás en digestores anaerobios, que comprende tratar un sustrato con una cantidad eficiente de una o más enzimas proteolíticas solas o en combinación con al menos una carbohidrasa, en donde al menos una de la una o más enzimas proteolíticas se selecciona de polipéptidos que tienen actividad de proteasa y que tienen al menos el 90, o al menos el 95 % de identidad de aminoácidos con SEQ ID NO:1 o con SEQ ID NO:2.

Description

DESCRIPCIÓN

Un método de mejora de la degradación de sustrato en plantas agrícolas de biogás

Campo de la invención

La invención se refiere a la producción de biogás, cuyas ganancias son cada vez más importantes en la economía. El biogás se produce por degradación microbiológica anaerobia de estiércol líquido, plantas de energía (maíz, grano), subproductos agrícolas o residuos orgánicos. Consiste principalmente en CH4 y CO2. El CH4 (participación normalmente superior al 50 %) se usa para la producción de energía térmica y eléctrica. Aproximadamente el 11 % de la energía renovable se produce usando biogás en Alemania (2009).

Las plantas de biogás modernas están equipadas con dispositivos de medición y de control del proceso industrial. Se usan frecuentemente aditivos, tales como preparaciones de oligoelementos o de enzimas, para optimizar el proceso biológico de la digestión anaerobia. Estos aditivos pueden potenciar la acción metabólica de los microorganismos o mejorar la degradación del sustrato. Hace un tiempo, se mostró que la aplicación de preparaciones de enzimas de degradación de los hidratos de carbono (carbohidrasas) es beneficiosa para la descomposición de la celulosa o hemicelulosa en el material vegetal en azúcares simples. Los azúcares resultantes son posteriormente metabolizados por bacterias acidogénicas y acetogénicas en ácido acético, H2 y CO2. Estos compuestos son los sustratos para la producción de metano por arqueas metanogénicas. Por tanto, los efectos beneficiosos sobre la degradación de la pared celular vegetal se reflejan frecuentemente en elevados rendimientos de biogás, consumo reducido de sustrato o viscosidad reducida.

La invención es especialmente interesante para las plantas de biogás, que operan en su totalidad o en gran medida con productos primarios renovables, tales como ensilaje de maíz, ensilaje de hierba u otros ensilajes de planta completa. La utilización de sustratos resistentes con altos contenidos de fibra, que se propaga para la producción de biocombustibles de segunda generación, hace más urgente la necesidad de aditivos enzimáticos. Esto es debido a que la degradación de sustratos ricos en fibra es lenta e incompleta. Además, muchas plantas de biogás, que operan con material vegetal solo, tienen relaciones C:N fuera del intervalo sugerido de 20 a 30. Es decir, el contenido de nitrógeno en muchas plantas agrícolas de biogás es demasiado bajo y, por tanto, el rendimiento de los microorganismos es inferior al óptimo.

Descripción de la técnica relacionada

Hay varias publicaciones referentes a la producción de biogás, véase, por ejemplo, el estudio Biomethanation I and II (Advances in Biochemical Engineering /Biotechnology; volúmenes 81 y 82, Springer-Verlag Berlín Heidelberg GmbH, 2003). Muchas patentes protegen la producción de biogás en plantas de biogás sustentadas por la degradación de sustrato enzimático, a continuación, se dan algunos ejemplos.

En el documento de patente DE 4141832 (S. R. Dauber, fecha de prioridad: 18.12.1991) la novedad es un proceso y aparato de tratamiento de aguas residuales, que trata lodo deshidratado. Consiste en una mezcla de lodo activado de un tanque de sedimentación y lodo primario. Además, se describe que la planta incorpora un reactor de acidificación de funcionamiento anaerobio, seguido por un reactor de biogás de funcionamiento anaerobio con las siguientes características:

(a) se introducen proteasa, amilasa, lipasa, celulasa o mezclas de las mismas en el reactor de acidificación,

(b) el reactor de acidificación funciona en el intervalo de temperatura 20 a 70 °C en un intervalo de pH de 3,5 a 6,5,

(c) la temperatura y el valor de pH se establecen en los intervalos que se expusieron en (b) anteriormente.

Después, se publicó la solicitud alemana DE102004042688 (Biopract GmbH, fecha de prioridad 01.09.2004). Describe la aceleración de la pudrición y el aumento de la producción de gas en las plantas de purificación de aguas residuales y de biogás añadiendo una preparación enzimática mixta al lodo clarificado antes de entrar en el reactor productor de gas. La preparación enzimática consiste en una o más carboxihidrasas junto con otras enzimas de hidrólisis, tales como lipasas y proteasas.

En los años 2010/2011, se publicaron algunas memorias descriptivas de patente WO por la empresa danesa Novozymes A/S.

- El documento de patente WO/2013/083801 (Título: Process for producing biogas from pectin and lignocellulose containing material) contiene un proceso de producción de biogás que comprende las etapas de proporcionar un sustrato que comprende estiércol, y

(a) añadir una o más enzima al sustrato, y luego añadir el sustrato con la una o más enzimas a un digestor de biogás; o

(b) añadir el sustrato a un tanque de digestor y añadir una o más enzimas al tanque. Las enzimas se seleccionan de enzimas amilolíticas, enzimas lipolíticas, enzimas proteolíticas, enzimas celulolíticas, oxidorreductasas y enzimas de degradación de la pared celular vegetal.

- El documento de patente WO 2012093041 A1 (Título: Process forproducing biogas from pectin and lignocellulose containing material) se refiere a procesos de producción de biogás con pretratamiento enzimático, comprendiendo dichos procesos las etapas de proporcionar una suspensión que comprende un material que contiene lignocelulosa y pectina, agua y dos o más tratamientos enzimáticos; permitir que las dos o más etapas de tratamiento enzimático degraden el material que contiene lignocelulosa y pectina, y añadir el material degradado a un tanque digestor de biogás en una tasa y relación adecuadas para convertir eficazmente el material en biogás en el digestor.

- El documento de patente WO 2011092136 (Título: Biogas production process with enzymatic pre-treatment) contiene un proceso de producción de biogás con pretratamiento enzimático, comprendiendo dichos procesos las etapas de proporcionar una suspensión que comprende un material que contiene lignocelulosa, agua y una o más enzimas; permitir que la una o más enzimas degraden el material que contiene lignocelulosa a una temperatura adecuada y pH; y añadir el material degradado por la enzima a un tanque digestor de biogás a una tasa y relación adecuadas para convertir eficazmente el material en biogás en el digestor.

Objetivo de la invención

El objetivo general de la invención es potenciar el rendimiento del biogás en los procesos de descomposición.

Es el objetivo de la presente invención proporcionar una alternativa preferentemente mejorada a las preparaciones de carbohidrasa, que se usan actualmente en las plantas de biogás. Se supone que estos productos mejoran la degradación del material vegetal, para aumentar el rendimiento de gas o la velocidad de formación de gas y/o para reducir la viscosidad en el fermentador.

Sumario de la invención

La invención se refiere a un método de tratamiento de sustratos para la producción de biogás en un digestor anaerobio, que comprende tratar el sustrato con una cantidad eficiente de una o más enzimas proteolíticas solas o en combinación con al menos una carbohidrasa, en donde al menos una de la una o más enzimas proteolíticas se selecciona de polipéptidos que tienen actividad de proteasa y que tienen al menos el 90 % de identidad de aminoácidos con SEQ ID NO:1 o con SEQ ID NO:2. Ahora se ha encontrado sorprendentemente que el uso combinado de una amilasa y/o una mezcla enzimática de degradación de NSP (polisacáridos no amiláceos) con una o más enzima(s) proteolítica(s), en donde al menos una de la una o más enzimas proteolíticas se selecciona de polipéptidos que tienen actividad de proteasa y que tienen al menos el 90 % de identidad de aminoácidos con SEQ ID NO:1 o con SEQ ID NO:2, produce una elevación del rendimiento de biogás total y la velocidad de degradación de sustratos, tales como ensilaje de maíz, ensilaje de hierba, ensilaje de triticale y/u otros ensilajes de planta completa. Las proteasas preferidas según la invención son serina proteasas estables al ácido que tienen al menos el 90 % de identidad de aminoácidos con SEQ ID NO:1 o con SEQ ID NO:2 de Nocardiopsis dassonvillei subsp. dassonvillei DSM 43235 (A1918L1), Nocardiopsis prasina DSM 15649, Nocardiopsis prasina (previamente alba) DSM 14010, Nocardiopsis sp. DSM 16424, Nocardiopsis alkaliphila DSM 44657 y Nocardiopsis lucentensis DSM 44048.

Hasta la fecha, no hubo indicación de que la capacidad proteolítica de la microbiota en los fermentadores de biogás pudiera ser un factor limitante. Si se limitó dicha importante actividad, esto es una explicación del efecto sinérgico observado de las carbohidrasas combinadas con una o más proteasas.

Recientemente, se encontró en experimentos de laboratorio que la suplementación de carbohidrasas con enzimas proteolíticas potencia más la tasa de producción de biogás. Esto se refleja ya sea como un aumento en la cantidad total de biogás producida por kg de sustrato, o como una producción de biogás más rápida, por ejemplo, medida como una mayor producción de biogás durante los primeros días de la gasificación. Hay al menos dos posibles explicaciones para esta observación.

La primera es que se escinden complejos de proteína-hidrato de carbono, tales como complejos de prolamina-almidón en granos de maíz. Esta escisión conduce a la liberación de almidón, que de otro modo está protegido por prolamina, y puede entonces ser degradado por bacterias de hidrólisis. Esto conduce a una cantidad más alta de hidratos de carbono digeribles y, posteriormente, a una mayor producción de gas.

La segunda explicación para el efecto enzimático observado es que una escisión enzimática de proteínas en el sustrato da como resultado péptidos y aminoácidos. Estos compuestos se pueden utilizar por microorganismos como fuente de nitrógeno, que es esencial para la síntesis de todas las enzimas necesarias en sus metabolismos. Una mayor actividad metabólica de la microbiota conducirá entonces a una producción más eficiente o más rápida de biogás.

En particular, los inventores de la presente invención han encontrado que la adición de una proteasa que tiene al menos el 90 % de identidad de aminoácidos con SEQ ID NO:1 o con SEQ ID NO:2 en combinación con una carbohidrasa, como, por ejemplo, una amilasa o una enzima de degradación de NSP, produce un refuerzo significativo de la degradación inducida por carbohidrasa y, por tanto, en la velocidad de producción de gas en la fermentación anaerobia de biogás.

En una realización adicional, la invención se refiere a un método de mejora de la degradación de maíz, ensilajes de maíz y otros ensilajes de planta completa como sustrato en digestores anaerobios tratando el sustrato con una cantidad eficiente de una o más enzimas proteolíticas, en donde al menos una de la una o más enzimas proteolíticas se selecciona de polipéptidos que tienen actividad de proteasa y que tienen al menos el 90 % de identidad de aminoácidos con SEQ ID NO:1 o con SEQ ID NO:2, en combinación con al menos una carbohidrasa.

Descripción detallada de la invención

En el presente contexto, una carbohidrasa es una enzima que cataliza la descomposición de hidratos de carbono en azúcares simples.

Los ejemplos de carbohidrasas útiles en el presente contexto son glucanasas, en particular beta-glucanasas y xiloglucanasas, celulasas, xilanasas, amilasas y pectinasas y mezclas de las mismas. En una realización preferida de la invención, las carbohidrasas son amilasa y celulasa.

La carbohidrasa para su uso según la invención es estable en presencia de proteasa. La estabilidad de la proteasa se puede determinar incubando 0,5 mg de proteína de enzima carbohidrasa purificada/ml en un tampón a un pH deseado (por ejemplo, pH 3 ,4 o 5), durante el tiempo deseado (por ejemplo 30, 45, 60, 90 o 120 minutos) en presencia de proteasa (por ejemplo, pepsina, 70 mg/l), y luego aumentando el pH hasta el pH deseado (por ejemplo, pH 4, 5, 6, 7 u 8) y midiendo la actividad residual. La actividad de carbohidrasa residual es preferentemente al menos el 20 %, preferentemente al menos el 30, 40, 50, 60, 70, 80 o al menos el 90 % con respecto al control (una muestra tratada no con proteasa).

En una realización particular, al menos una carbohidrasa es una amilasa, una celulasa o una mezcla enzimática que comprende al menos una enzima seleccionada del grupo que consiste en beta-glucanasas, xiloglucanasas, xilanasas, amilasas y pectinasas.

En el presente contexto, una amilasa es una enzima que cataliza la endohidrólisis de almidón y otros oligo- y poli-alfa-1 -4-D-glucósidos lineales y ramificados. En una realización particular, la amilasa para su uso según la invención tiene actividad de alfa-amilasa, que cataliza la endohidrólisis de enlaces 1,4-alfa-glucoídicos en oligosacáridos y polisacáridos. Las alfa-amilasas actúan, por ejemplo, sobre el almidón, el glucógeno y los polisacáridos y oligosacáridos relacionados en un modo aleatorio, liberando grupos reductores en la configuración alfa.

En una realización preferida, la amilasa de la invención es una alfa-amilasa (denominación sistemática: 1,4-alfa-D-glucano glucanohidrolasa), preferentemente una amilasa bacteriana. En realizaciones adicionales, la amilasa de la invención pertenece al grupo EC 3.2.1.- de amilasas, tales como EC 3.2.1.1 (alfa-amilasa), EC 3.2.1.2 (beta-amilasa), EC 3.2.1.3 (glucano 1,4-alfa-glucosidasa, amiloglucosidasa o glucoamilasa), EC 3.2.1.20 (alfa-glucosidasa), EC 3.2.1.60 (glucano 1,4-alfa-maltotetraohidrolasa), EC 3.2.1.68 (isoamilasa), EC 3.2.1.98 (glucano 1,4-alfamaltohexosidasa) o EC 3.2.1.133 (glucano 1,4-alfa-maltohidrolasa).

En una realización preferida, la amilasa para su uso según la invención se puede clasificar, o se clasifica, que pertenece al grupo EC 3.2.1.1. Los números EC se refieren a Enzyme Nomenclature 1992 de NC-IUBMB, Academic Press, San Diego, California, que incluye los suplementos 1-5 publicados en Eur. J. Biochem. 1994, 223, 1-5; Eur. J. Biochem. 1995, 232, 1-6; Eur. J. Biochem. 1996, 237, 1-5; Eur. J. Biochem. 1997, 250, 1-6; y Eur. J. Biochem. 1999, 264, 610-650; respectivamente. La nomenclatura es regularmente complementada y actualizada; véase, por ejemplo, internet en http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html.

La actividad de amilasa se puede determinar por cualquier ensayo adecuado. En general, el pH del ensayo y la temperatura del ensayo se pueden adaptar a la enzima en cuestión. Los ejemplos de valores de pH del ensayo son pH 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12. Los ejemplos de temperaturas del ensayo son 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 90 o 95 °C. Los valores de pH y las temperaturas preferidas están en el intervalo fisiológico, tales como valores de pH de 3, 4, 5, 6, 7 u 8, y temperaturas de 30, 35, 37 o 40 °C. Se puede usar el siguiente ensayo de amilasa: Sustrato: tabletas Phadebas (Pharmacia Diagnostics; polímero de almidón reticulado, insoluble y de color azul, que se mezcla con albúmina de suero bovino y una sustancia tampón, y se fabrica en comprimidos). Temperatura del ensayo: 37 °C. pH del ensayo: 4,3 (o 7,0, si se desea). Tiempo de reacción: 20 min. Después de la suspensión en agua, el almidón se hidroliza por la alfa-amilasa, dando fragmentos azules solubles. La absorbancia de la disolución azul resultante, medida a 620 nm, es una función de la actividad de alfa-amilasa.

Una unida de alfa-amilasa fúngica (1 UAF) es la cantidad de enzima que descompone 5,26 g de almidón por hora en las condiciones del ensayo estándar. Un almidón preferido es Merck, Amylum solubile Erg. B. 6, lote 9947275. Para una clasificación taxonómica e identificación de bacterias se hace referencia a Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology (1986), vol 2, ISBN0-683-0783. Alternativamente, se puede usar el bien conocido análisis de secuencias de ARNr 16S (véase, por ejemplo, Johansen et al., Int. J. Syst. Bacteriol, 1999, 49, 1231 -1240, en particular la sección Métodos en la página 1233, 2a columna); o se puede consultar a expertos en taxonomía, por ejemplo, de DSMZ u otros institutos de depósito reconocidos.

Como se emplea en el presente documento, el término bacteriano designa amilasas que derivan de bacterias. El término "derivado de" incluye enzimas obtenibles, u obtenidas, de cepas bacterianas naturales, así como variantes de las mismas. Las variantes pueden tener al menos una sustitución, inserción y/o deleción de al menos un resto de aminoácido en comparación con la enzima original de la que deriva. El término variante también incluye reorganizadores, híbridos, enzimas quiméricas y enzimas consenso. Las variantes se pueden haber producido por cualquier método conocido en la técnica, tal como mutagénesis dirigida al sitio, mutagénesis al azar, procesos de derivación consenso (documento de patente EP 897985) y barajado génico (documentos de patente WO 95/22625, WO 96/00343), etc. Para los presentes fines, una variante de amilasa se considera bacteriana cuando se ha usado al menos una amilasa bacteriana para su diseño, derivación o preparación. El término bacteriano no se refiere a un posible hospedador de producción recombinante, sino solo al origen de la amilasa que codifica el gen que es alojado por ella. La amilasa para su uso según la invención deriva preferentemente de una cepa de Bacillus, tales como las cepas de Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus circulans, Bacillus halmapalus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus sp., Bacillus stearothermophilus y Bacillus subtilis; preferentemente de cepas de Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus halmapalus, Bacillus licheniformis, Bacillus sp., Bacillus subtilis y Bacillus stearothermophilus.

Los ejemplos no limitantes de amilasas naturales para su uso según la invención son las derivadas de Bacillus licheniformis, tal como el nombre de entrada de Swissprot AMY_BACLI, número de acceso principal P06278; Bacillus amyloliquefaciens, tal como el nombre de entrada de Swissprot AMY_BACAM, número de acceso principal P00692; Bacillus megaterium, tal como el nombre de entrada de Swissprot AMY_BACME, número de acceso principal P20845; Bacillus circulans, tal como el nombre de entrada de Swissprot AMY_BACCI, número de acceso principal P08137; Bacillus stearothermophilus, tal como el nombre de entrada de Swissprot AMY_BACST, número de acceso principal P06279. Otro ejemplo es de Bacillus subtilis, tal como el nombre de entrada de Swissprot AMY_BACSU, número de acceso principal P00691.

Para los fines de la presente invención, las amilasas preferidas son las amilasas contenidas en los siguientes productos comerciales: BAN, Stainzyme, Termamyl SC, Natalase y Duramyl (todos de Novozymes), y en los productos Validase BAA y Validase HT (de Valley Research). Los ejemplos particulares adicionales de amilasas para su uso según la invención son las amilasas contenidas en los siguientes productos comerciales: Clarase, DexLo, GC 262 SP, G-Zyme G990, G-Zyme G995, G-Zyme G997, G-Zyme G998, HTAA, Optimax 7525, Purastar OxAm, Purastar ST, Spezyme AA, Spezyme Alpha, Spezyme BBA, Spezyme Delta AA, Spezyme DBA, Spezyme Ethyl, Spezyme Fred (GC521), Spezyme HPA y Ultraphlow (todos de Genencor); Validase HT340L, Valley Thin 340L (todos de Valley Research); Avizyme 1500, Dextro 300 L, Kleistase, Maltazyme, Maxamyl, Thermozyme, Thermatex, Starzyme HT 120 L, Starzyme Super Conc y Ultraphlo.

En una realización particular, la amilasa para su uso según la invención es estable a la sedimentación y/o termoestable. La temperatura de fusión (Tm) de una enzima es una medida de su termoestabilidad. La amilasa de la invención puede tener una Tm de al menos 75 °C, 76 °C, 77 °C, 78 °C, 79 °C, 80 °C, 81 °C, 82 °C, 83 °C, 84 °C, 85 °C, 86 °C, 87 °C, 88 °C, 89 °C, 90 °C, 91 °C, 92 °C, 93 °C, 94 °C o al menos 95 °C, como se ha determinado por calorimetría diferencial de barrido (DSC). La DSC se realiza en un tampón fosfato de sodio 10 mM, cloruro sódico 50 mM, pH 7,0. La velocidad de barrido es constante, por ejemplo 1,5 °C/min. El intervalo barrido puede ser desde 20 hasta 100 °C. Para el barrido se puede seleccionar otro tampón, por ejemplo, un tampón de pH 5,0, 5,5, 6,0 o pH 6,5. En realizaciones alternativas adicionales, se puede usar una velocidad de barrido más alta o más baja, por ejemplo, una más baja de 1,4 °C/min, 1,3 °C/min, 1,2 °C/min, 1,1 °C/min, 1,0 °C/min o 0,9 °C/min.

En otra realización preferida, la amilasa para su uso según la invención tiene una actividad a pH 7,0 y 37 °C de al menos el 35 % con respecto a la actividad en el óptimo de pH y 37 °C. Más preferentemente, la actividad a pH 7,0 y 37 °C es al menos el 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, o al menos el 75 % de la actividad en el óptimo de pH y 37 °C.

En otra realización preferida, la amilasa de la invención tiene una actividad a pH 7,0 y 37 °C y en presencia de sales biliares 5 mM de al menos el 25 % con respecto a la actividad en el óptimo de pH y 37 °C en ausencia de sales biliares. Más preferentemente, la actividad a pH 7,0 y 37 °C y en presencia de sales biliares 5 mM es al menos el 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 o al menos el 65 % de la actividad en el óptimo de pH y 37 °C en ausencia de sales biliares.

Una amilasa bacteriana comercialmente disponible para su uso según la presente invención es RumiStar® (DSM Nutritional Products AG).

Otras carbohidrasas relevantes son enzimas hidrolizadoras de NSP, tales como glucanasas, en particular betaglucanasas y xiloglucanasas, celulasas, xilanasas y pectinasas.

En el presente contexto, una celulasa es una enzima que cataliza la hidrólisis de celulosa. En una realización preferida, la celulasa de la invención es (denominación sistemática: 4-p-D-glucano 4-glucanohidrolasa) preferentemente una celulasa fúngica. En realizaciones adicionales, la celulasa de la invención pertenece al grupo EC 3.2.1.- de glucosidasas, es decir, enzimas que hidrolizan compuestos de O- y S-glucosilo, tales como EC 3.2.1.4 (celulasa), EC 3.2.1.6, EC 3.2.1.14, EC 3.2.1.21, EC 3.2.1.73, EC 3.2.1.74, EC 3.2.1.91, EC 3.2.1.151, EC 3.2.1.165, EC 3.2.1.176. En una realización particular, la celulasa cataliza la endohidrólisis de enlaces (1^4)-p-D-glucosídicos en celulosa y otros oligosacáridos y polisacáridos. Las celulasas actúan, por ejemplo, sobre celulosa y polisacáridos y oligosacáridos relacionados en un modo aleatorio, liberando los grupos reductores en la configuración alfa.

Los números EC se refieren a Enzyme Nomenclature 1992 de NC-IUBMB, Academic Press, San Diego, California, que incluyen los suplementos 1-5 publicados en Eur. J. Biochem. 1994, 223, 1-5; Eur. J. Biochem. 1995, 232, 1-6; Eur. J. Biochem. 1996, 237, 1-5; Eur. J. Biochem. 1997, 250, 1-6; y Eur. J. Biochem. 1999, 264, 610-650; respectivamente. La nomenclatura es regularmente complementada y actualizada; véase, por ejemplo, internet en http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html.

Las preparaciones de celulasa fúngica comercialmente disponibles para su uso según la presente invención son MethaPlus®, Axiase™ (DSM), ZyMaxx y JBS.

En el presente contexto, una beta-glucanasa es una enzima que cataliza la endohidrólisis de enlaces en beta-D-glucanos (E.C.3.2.1.4, E.C.3.2.1.6, E.C.3.2.1.39, E.C.3.2.1.58, E.C.3.2.1.71, E.C.3.2.1.73, E.C.3.2.1.74, E.C.3.2.1.75, E.C.3.2.1.91, E.C.3.2.1.151, E.C.3.2.1.155 y E.C.3.2.1.176). Los sustratos incluyen laminarina, liquenina, D-glucanos de cereal y otros.

En el presente contexto, una xiloglucanasa es una enzima que cataliza la reacción que implica la endohidrólisis de enlaces 1,4-beta-D-glucosídicos en xiloglucano con retención de la configuración beta de los restos de glucosilo (E.C.3.2.1.151)

En el presente contexto, una xilanasa es una enzima que cataliza el enlace xilosídico en xilanos. Esta actividad enzimática se puede encontrar en las clases de enzima E.C.3.2.1.8, E.C.3.2.1.32, E.C.3.2.1.136 y E.C.3.2.1.156.

En el presente contexto, una pectinasa es una enzima que cataliza la hidrólisis aleatoria de enlaces (1->4)-alfa-D-galactosidurónicos en pectato y otros galacturonanos (E.C.3.2.1.15).

Los números EC se refieren a Enzyme Nomenclature 1992 de NC-IUBMB, Academic Press, San Diego, California, que incluyen los suplementos 1-5 publicados en Eur. J. Biochem. 1994, 223, 1-5; Eur. J. Biochem. 1995, 232, 1-6; Eur. J. Biochem. 1996, 237, 1-5; Eur. J. Biochem. 1997, 250, 1-6; y Eur. J. Biochem. 1999, 264, 610-650; respectivamente. La nomenclatura es regularmente complementada y actualizada; véase, por ejemplo, internet en http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html.

Las proteasas, o peptidasas, catabolizan los enlaces peptídicos en proteínas descomponiéndolas en fragmentos de cadenas de aminoácidos, o péptidos.

Las proteasas se clasifican basándose en su mecanismo catalítico en los siguientes grupos: serina proteasas, EC 3.4.21.-, (S), cisteína proteasas (C), proteasas aspárticas (A), metaloproteasas (M), y desconocidas, o hasta ahora no clasificadas, proteasas (U), véase Handbook of Proteolytic Enzymes, A. J. Barrett, N. D. Rawlings, J. F. Woessner (eds), Academic Press (1998), en particular la parte de introducción general.

Las proteasas para su uso según la invención son proteasas estables al ácido que tienen al menos el 90 % de identidad de aminoácidos con SEQ ID NO:1 o con SEQ ID NO:2.

En una realización particular, la proteasa para su uso según la invención es una proteasa microbiana, indicando el término microbiano que la proteasa deriva de, o se origina a partir de, un microorganismo, o es un análogo, un fragmento, una variante, un mutante, o una proteasa sintética derivada de un microorganismo. Se puede producir o expresar en la cepa microbiana natural original, en otra cepa microbiana, o en una planta; es decir, el término cubre la expresión de proteasas naturales que existen de forma natural, así como la expresión en cualquier hospedador de proteasas recombinantes, genéticamente manipuladas o sintéticas. Los ejemplos de microorganismos son bacterias, por ejemplo, bacterias del filo Actinobacteria phy. nov., por ejemplo, de la clase I: Actinobacteria, por ejemplo, de la subclase V: Actinobacteridae, por ejemplo, del orden I: Actinomycetales, por ejemplo, del suborden XII: Streptosporangineae, por ejemplo, de la familia II: Nocardiopsaceae, por ejemplo, del género I: Nocardiopsis, por ejemplo, Nocardiopsis sp. NRRL 18262, y Nocardiopsis alba; por ejemplo, de las especies Bacillus o mutantes o variantes de las mismas que presentan actividad de proteasa. Esta taxonomía es basándose en Berge’s Manual of Systematic Bacteriology, 2a edición, 2000, Springer (preimpresión: Road Map to Bergey's).

El término serina proteasa se refiere a serina peptidasas y sus grupos como se define en el manual anterior. En la versión de 1998 de este manual, las serina peptidasas y sus grupos se tratan en los capítulos 1-175. Las serina proteasas se pueden definir como peptidasas en las que el mecanismo catalítico depende del grupo hidroxilo de un resto de serina que actúa como el nucleófilo que ataca el enlace peptídico. Los ejemplos de serina proteasas para su uso según la invención son proteasas del clan SA, por ejemplo, la familia S2 (estreptogrisina), por ejemplo, la subfamilia S2A (proteasa alfa-lítica), como se define en el manual anterior, que tienen al menos el 90 % de identidad de aminoácidos con SEQ ID NO:1 o con SEQ ID NO:2.

La actividad de proteasa se puede medir usando cualquier ensayo, en el que se emplea un sustrato, que incluye enlaces peptídicos relevantes para la especificidad de la proteasa en cuestión. No hay limitaciones sobre el origen de la serina proteasa estable al ácido para su uso según la invención. Así, el término proteasa incluye no solo proteasas naturales o no mutantes, sino también cualquier mutante, variante, fragmento, etc., de las mismas que presente actividad de proteasa, así como proteasas sintéticas, tales como proteasas barajadas, y proteasas consenso. Dichas proteasas genéticamente manipuladas se pueden preparar como se conoce, en general, en la técnica, por ejemplo, por mutagénesis dirigida al sitio, por PCR (usando un fragmento de PCR que contiene la mutación deseada como uno de los cebadores en las reacciones de PCR), o por mutagénesis al azar. La preparación de proteínas consenso se describe en, por ejemplo, el documento de patente EP 0897985.

Los ejemplos de proteasas estables al ácido que tienen al menos el 90 % de identidad de aminoácidos con SEQ ID NO:1 o con SEQ ID NO:2 para su uso según la invención son proteasas de Nocardiopsis sp. NRRL 18262, y Nocardiopsis alba y proteasas de al menos el 90 % de identidad de aminoácidos con SEQ ID NO:1 o con SEQ ID NO:2.

Para calcular el porcentaje de identidad, se puede usar cualquier programa informático conocido en la técnica. Los ejemplos de dichos programas informáticos son el algoritmo Clustal V (Higgins, D. G., y Sharp, P. M. (1989), Gene (Ámsterdam), 73, 237-244

Para los fines de la presente invención, la identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos se determina usando el algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como se implementa en el programa de Needle en el paquete EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277), preferentemente la versión 5.0.0 o posterior. Los parámetros usados son la penalización por abertura de hueco de 10, la penalización por extensión de hueco de 0,5 y la matriz de sustitución EBLOSUM62 (versión EMBOSS de BLOSUM62). La salida de Needle marcada con "identidad más larga" (obtenida usando la opción -nobrief) se usa como el porcentaje de identidad y se calcula del siguiente modo:

(Restos idénticos x 100) / (Longitud del alineamiento - Número total de huecos en el alineamiento)

En otra realización particular, la proteasa para su uso según la invención, además de ser estable al ácido, también es termoestable.

El término termoestable significa proteasas de uno o más de lo siguiente: Que el óptimo de temperatura es al menos 50 °C, 52 °C, 54 °C, 56 °C, 58 °C, 60 °C, 62 °C, 64 °C, 66 °C, 68 °C, o al menos 70 °C.

Una serina proteasa comercialmente disponible derivada de Nocardiopsis es Ronozyme®ProAct® (DSM Nutritional Products AG).

En una realización particular, están bien definidas la amilasa y la proteasa, en la forma en la que se añaden al sustrato, o cuando son incluidas en un aditivo de sustrato.

Bien definido significa que la preparación de enzima es al menos el 50 % pura en una base de proteínas. En otras realizaciones particulares, la preparación de enzima es al menos el 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 94 o al menos el 95 % pura. La pureza se puede determinar por cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, por SDS-PAGE, o por cromatografía de exclusión por tamaño (véase el Ejemplo 12 del documento de patente WO 01/58275).

Es ventajosa una preparación de enzima bien definida. Por ejemplo, es mucho más fácil dosificar correctamente al sustrato una enzima que esté esencialmente libre de otras enzimas interferentes o contaminantes. El término dosificar correctamente se refiere en particular al objetivo de obtener resultados coherentes y constantes, y la capacidad de optimizar la administración basándose en el efecto deseado.

Las preparaciones de enzima con purezas en este orden de magnitud se pueden obtener en particular usando métodos recombinantes de producción, aunque no se obtienen tan fácilmente y también están sujetas a una variación entre lotes mucho mayor cuando se producen por métodos de fermentación tradicionales.

En el método según la invención, las combinaciones de enzima descritas anteriormente se pueden añadir a los fermentadores de biogás antes, después, o simultáneamente con el sustrato. Se prefiere lo último. Esto se aplica tanto a formulaciones líquidas como a sólidas. La dosificación se tiene que adaptar al fermentador de biogás respectivo.

En una realización preferida, al menos una carbohidrasa se añade al digestor y la al menos una carbohidrasa se añade en cantidades correspondientes a 0,1 - 500 mg de proteína de enzima/kg de sustrato; preferentemente 0,2 - 250 mg de proteína de enzima/kg de sustrato, preferentemente 0,2 -100 mg de proteína de enzima/kg de sustrato, preferentemente 0,2 - 50 mg de proteína de enzima/kg de sustrato, preferentemente 0,2 - 10 mg de proteína de enzima/kg de sustrato, preferentemente 0,5 - 5 mg de proteína de enzima/kg de sustrato.

En otra realización preferida, la una o más enzimas proteolíticas se añaden cada una en cantidades correspondientes a 0,1 - 500 mg de proteína de enzima/kg de sustrato, preferentemente 0,2 - 250 mg de proteína de enzima/kg de sustrato, preferentemente 0,2 -100 mg de proteína de enzima/kg de sustrato, preferentemente 0,2 -50 mg de proteína de enzima/kg de sustrato, preferentemente 0,2 - 10 mg de proteína de enzima/kg de sustrato, preferentemente 0,5 -5 mg de proteína de enzima/kg de sustrato.

Se mostró que la aplicación de las preparaciones de enzima, que contienen actividades de enzima proteolítica y carbohidrolítica, reforzaba la producción de biogás en más del 10 %. Los posibles motivos para este significativo efecto potenciador y algunas ventajas del uso de los aditivos de enzima con las principales actividades combinadas descritas en plantas de biogás con respecto a la suplementación con productos comercialmente disponibles son del siguiente modo:

Primero, la adición de preparaciones de carbohidrasa-proteasa cataliza la escisión de complejos de proteína-hidrato de carbono (por ejemplo, complejos de prolamina-almidón en granos de maíz), que da como resultado la liberación de azúcares simples como una fuente de carbono y péptidos como una fuente de nitrógeno. La incorporación de péptidos o aminoácidos cortos durante la síntesis microbiana de proteínas es más favorable que la síntesis de proteínas de otros compuestos de nitrógeno, tales como NH⁴⁺. Se espera que el aumento de la disponibilidad de nitrógeno conduzca a mayores actividades metabólicas de la microbiota. Esto conduciría, en general, a mayores rendimientos de biogás.

Por tanto, debido a que las enzimas son catalizadores, en general, no son consumidas en la reacción que catalizan. Por lo tanto, se espera que sus acciones duren durante un periodo de tiempo más largo sin una acumulación significativa de nitrógeno en el digestato.

La presente invención se describe además por lo siguiente.

Ejemplos

Productos químicos usados como tampones y sustratos fueron productos comerciales de al menos calidad para reactivo.

Ejemplo 1: Ensayo por lotes modificado basado en VDI 4630

Objetivo:

El objetivo de las investigaciones es determinar el volumen de gas normalizado acumulado producido a partir de un sustrato elegido por un cultivo microbiano anaerobio. El gas producido se determina por la medición de la presión del gas debido a la acumulación de volumen de gas en el espacio de cabeza del recipiente de fermentación. Las condiciones de fermentación se describen como un denominado ensayo del espacio de cabeza.

Método:

El ensayo es una fermentación por lotes de 15 ml llevada a cabo en recipientes de 50 ml del siguiente modo:

En dos experimentos independientes, se cultivan 4 duplicados de los lotes durante 21 días a 39 °C. En el momento inicial (t⁰), cada frasco de fermentación, excepto los controles, contiene 15 ml de un cultivo anaerobio descrito, un sustrato y un aditivo. Los controles no contienen el aditivo enzimático activo. Pueden contener aditivos inactivos, tales como la matriz estabilizadora de la preparación enzimática respectiva, o ningún aditivo en absoluto. La presión del gas en el espacio de cabeza, que es el resultado de la formación de gas durante la fermentación, se mide una vez al día en la primera semana, cada dos días en la segunda semana y cada tres días en la última semana. Se calcula la formación de gas normalizada y se compara con controles correspondientes.

Las fermentaciones se llevan a cabo en los denominados frascos de espacio de cabeza (Rollrandflaschen) ND20, 50 ml, N° 1400 118 LA, Burdich Laborbedarf GmbH & Co. KG con cápsulas de aluminio de 20 mm con tabique N° 1 400 711. Es necesario medir el volumen del frasco con mucha exactitud. Entonces es posible calcular con mucha exactitud el volumen del espacio de cabeza. El volumen del recipiente se mide por la determinación de la masa con agua destilada. El peso se tiene que determinar con una exactitud de cuatro dígitos significativos después del punto decimal. El procedimiento experimental es del siguiente modo: Para cada variante experimental individual se tienen que preparar cuatro recipientes (volumen exacto etiquetado conocido) que incluye las cápsulas y los tabiques. Se mide el peso de cada matraz individual que incluye la cápsula y el tabique. La cantidad de sustrato exacto se transfiere a las botellas según el diseño experimental (normalmente 80 a 200 mg de MSO). La preparación de inóculo depende de la fuente y del diseño experimental. Como inóculo se puede usar un cultivo anaerobio según VDI 4630, de plantas de biogás industrial, lodo de plantas de tratamiento de aguas residuales o procesos de fermentación del propio laboratorio con contenidos de materia seca inferiores al 4 % y contenidos de materia seca orgánica del 50 - 80 % (de MS).

Se recoge la cantidad necesaria de inóculo y se almacena en un frasco de Woulff a 39 °C. Para la configuración del experimento por lotes, los recipientes de fermentación se llenan con 15 ml de inoculo y todos los aditivos de volúmenes fijados. La dosificación del inoculo se hace con una bomba dosificadora Watson-Marlow 520 DIL/350. Durante la manipulación, es decir, la recogida y la dosificación, el inóculo es flotado con el biogás recogido de otras fermentaciones. Antes de cerrar los recipientes, se lavan con N² durante 20 segundos. Luego se encapsulan y se cierran con un dispositivo especial (empresa CS-Chromatographie GmbH, Langerwehe). Todos los frascos se mezclan vigorosamente para suspender los sustratos insolubles. Se determina el peso total de cada frasco.

La fermentación empieza por transferencia de los matraces a un baño de agua de 39 °C. Se mide después de una hora la presión del gas en el espacio de cabeza de cada duplicado. Estos valores representan la presión de fermentación inicial y todos los valores de gas adicionales se acumulan a este primer valor. La medición de la presión del gas se lleva a cabo con un manómetro digital Kobold HND-P236.

Para las mediciones de la presión del gas, una aguja (0,45 x 25 mm, 26 G x 1", empresa B. Braun, Melsungen AG), que está conectada con el manómetro por la conexión de Luer, perfora el tabique. Se almacena la presión del gas de cada duplicado y los datos se transfieren a un ordenador para su análisis. Después de la medición y el almacenamiento de datos, se suelta el gas de todos los recipientes introduciendo una aguja en el tabique del recipiente. Después de 5 horas de incubación, se realiza la segunda medición de presión. Entonces, se mide la presión del gas una vez al día, siempre a la misma hora para garantizar intervalos de 24 h. Cada día, se agitan los recipientes al menos una hora antes del comienzo de las mediciones. El intervalo de mediciones de gas se puede prolongar a dos o más días, si el aumento de presión por día es inferior a 100 mbares.

La salida de estas pruebas son (a) curvas de formación de gas durante normalmente 21 días (valores medios), (b) velocidad de formación de gas (Nml por día o por hora), (c) formación relativa de gas (en comparación con control correspondiente), (d) análisis estadístico que incluye MV; DE; intervalo de confianza y, si fuera necesario, prueba de la t de dos grupos de valores, (e) rendimientos de gas (valor aceptado hasta que la producción diaria de gas sea inferior al 1 % de gas acumulado)

Ejemplo 2: Degradación anaerobia de maíz y otros ensilajes de planta completa usando aditivos de enzima, que tienen actividades proteolíticas y carbohidrolíticas (Fig. 1)

En el experimento descrito, se aplicó la configuración general del ensayo por lotes modificado descrito en el Ejemplo 1. Se usaron ensilaje de maíz, ensilaje de triticale y ensilaje de hierba seco y molido como los únicos sustratos para la producción de biogás. Las fermentaciones por lotes se inocularon con una población microbiana productora de biogás sacada de un fermentador de laboratorio y se incubaron a 39 °C durante tres semanas. El pH de las muestras se midió al comienzo del experimento después del ajuste de la muestra (pH = 7,3) y al final del experimento después de tres semanas de incubación (pH = 7,1).

Para probar el efecto de las actividades combinadas de amilasa y proteasa, se incubaron las muestras con una preparación de enzima que contenía una proteasa derivada de Nocardiopsis (Ronozyme ProAct) y amilasa (Ronozyme RumiStar). Los controles carecieron de la enzima en sí. Para excluir una influencia por la matriz estabilizadora de la preparación de enzima, se añadió esta matriz estabilizadora sola a los controles. La concentración de la preparación de enzima y del estabilizador usado en este experimento fue 20.000 ppm (20 mg de enzima por g de sustrato seco).

En todos los sustratos probados, se observó un aumento significativo de la producción de biogás. Para el ensilaje de maíz (Fig. 1), el rendimiento del gas aumentó aproximadamente el 20 % en comparación con el control durante los 10 primeros días de fermentación. El rendimiento de gas de ensilaje de grano completo de triticale aumentó en hasta el 15 % y el rendimiento de gas de ensilaje de hierba en aproximadamente el 20 % durante los 7 primeros días de fermentación. El cultivo, que estuvo limitado en nitrógeno, produjo biogás a una velocidad significativamente más rápida de todos los sustratos, si se añadió la preparación de enzima.

Ejemplo 3: Degradación anaerobia de ensilaje de maíz y sorgo usando aditivos de enzima, que tienen actividades proteolíticas y carbohidrolíticas (Fig. 2)

En el experimento descrito, se aplicó la configuración general del ensayo por lotes modificado descrito en el Ejemplo 1. Se usaron ensilaje de maíz y ensilaje de sorgo seco y molido (50/50 % p/p) como sustrato para la producción de biogás. Las fermentaciones por lotes se inocularon con una población microbiana productora de biogás sacada de un fermentador industrial. Todas las muestras se incubaron a 39 °C durante tres semanas. El pH de las muestras se midió al comienzo del experimento después del ajuste de la muestra (pH = 6,7) y al final del experimento después del ajuste de la muestra (pH = 6,9).

Para probar el efecto de las actividades combinadas de celulasa y proteasa, se incubaron las muestras con una preparación de enzima que contenía una proteasa derivada de Nocardiopsis (Ronozyme ProAct) y una preparación de celulasa comercial (Zymaxx). La concentración de la preparación de enzima usada en este experimento fue 20.000 ppm (20 mg de enzima por g de sustrato seco).

Las preparaciones combinadas de celulasa-proteasa condujeron a un aumento de la producción de biogás. El aumento del rendimiento de gas observado osciló entre el 6-8 %.

Los motivos para esta observación podrían ser que el consorcio microbiano no estaba solo limitado en energía (fuente de carbono), sino también limitado en nitrógeno. Solo si ambas limitaciones se tratan, se produce más biogás. Por tanto, la aplicación combinada de preparaciones con actividades de proteasa y de carbohidrasa muestra efectos superiores a la aplicación de preparaciones enzimáticas que incluyen solo una de estas actividades principales.

Ejemplo 4: Degradación anaerobia de ensilaje de maíz usando preparaciones de enzima, que contienen diferentes relaciones entre carbohidrasa y proteasa (Fig. 3)

En el experimento descrito, se aplicó la configuración general del ensayo por lotes modificado descrito en el Ejemplo 1. Se usó ensilaje de maíz seco y molido como sustrato para la producción de biogás. Las fermentaciones por lotes se inocularon con una población microbiana productora de biogás sacada de un fermentador de laboratorio. Todas las muestras se incubaron a 39 °C durante tres semanas. El pH de las muestras se midió al comienzo del experimento después del ajuste de la muestra (pH = 7,5) y al final del experimento después de tres semanas de incubación (pH = 7,1).

Para probar el efecto de las actividades combinadas de amilasa y proteasa, se incubaron las muestras con una preparación de enzima que contenía una proteasa derivada de Nocardiopsis (Ronozyme ProAct) y una preparación de amilasa comercial (MATS L). La concentración de la preparación de enzima usada en este experimento fue 20.000 ppm (20 mg de enzima por g de sustrato seco).

Se observó el efecto beneficioso de la administración combinada de una carbohidrasa y una proteasa durante un amplio intervalo de dosificaciones. Los experimentos mostraron que las mezclas enzimáticas compuestas de una amilasa y una proteasa en relaciones entre 20:1 (20.000 ppm de amilasa y 1.000 ppm de proteasa) y 1:1 (20.000 ppm de amilasa y 20.000 ppm de proteasa) tuvieron efectos significativos sobre la producción de biogás. El aumento de biogás después de una semana de incubación fue del 5 % para la carbohidrasa sola. La preparación con las actividades principales combinadas dio aumentos del 38 % (c:p=1:1), 26 % (c:p=2:1), 17 % (c:p=4:1) y 8 % (c:p=20:1).

Ejemplo 5: Comparación del efecto sobre el rendimiento de biogás causado por diferentes aditivos de proteasa

En el experimento descrito, se realizó el ensayo por lotes modificado descrito en el Ejemplo 1 para mostrar el efecto superior de la serina proteasa de Nocardiopsis en comparación con otras preparaciones de proteasa.

Se usó ensilaje de maíz seco y molido como sustrato para la producción de biogás. Las fermentaciones por lotes se inocularon con una población microbiana productora de biogás sacada de un fermentador de laboratorio. Todas las muestras se incubaron a 39 °C durante tres semanas. Se midió el pH de las muestras al comienzo del experimento después del ajuste de la muestra (pH = 7,3) y al final del experimento después de tres semanas de incubación (pH = 7,1). Se añadieron tres preparaciones diferentes de proteasa comercial, que contuvieron proteína en concentraciones iguales, al sustrato en cantidades iguales (20.000 ppm = 20 mg de enzima por g de sustrato seco). No se añadió preparación que contuviera carbohidrasa. Por lo tanto, los efectos observados podrían ser claramente atribuidos a una clase de enzima solo.

Se mostró que dos de las preparaciones de proteasa condujeron a un aumento del rendimiento de biogás (Fig. 4). La proteasa I condujo al mayor aumento del rendimiento de biogás (20 % en comparación con el control). El efecto de la proteasa II fue más bajo (12 %), pero aún significativo. La proteasa III no tuvo efecto significativo sobre la producción de biogás. Todas las proteasas probadas fueron serina proteasas. La proteasa I y II fueron de origen bacteriano, mientras que la proteasa III fue de origen fúngico (Tabla 1).

Se puede llegar a la conclusión de que la degradación de proteínas en péptidos o aminoácidos puede estimular una población microbiana y, posteriormente, aumentar el rendimiento de biogás.

Sorprendentemente, la proteasa I derivada de Nocardiopsis sp. (Ronozyme ProAct) tuvo el impacto más fuerte sobre la producción de biogás y es, por tanto, superior a otros miembros de esta familia de enzimas.

Tabla 1: Aumento de los rendimientos de biogás causados por diferentes proteasas

Ejemplo 6: Digestión anaerobia de ensilaje de maíz en presencia de proteasa - ensayo de operación semicontinua (Fig. 5)

El objetivo del experimento era evaluar el efecto de la adición de enzima proteolítica sobre la digestión anaerobia continua de ensilaje de maíz. Se estudió el efecto de una serina proteasa (originada a partir de Nocardiopsis prasina) con diferentes estrategias de dosificación. Para el experimento, se usaron cuatro reactores continuamente agitados a escala de laboratorio con un volumen activo de cuatro litros. Los reactores se equiparon con una hélice montada en la parte superior para la mezcla y un dispositivo de medición de gas (AnoxKaldnes, Suecia). Se analizó diariamente el contenido de metano del biogás producido. La alimentación de sustrato, ensilaje de maíz fresco, se hizo manualmente una vez al día durante la semana, no se hizo alimentación durante el fin de semana. La temperatura de trabajo de los reactores fue 37 °C. El inóculo usado en el experimento se sacó del digestor de laboratorio alimentado con ensilaje de maíz con adición de oligoelementos. Como resultado de la deficiencia conocida de oligoelementos durante la monofermentación de ensilaje de maíz, se añadieron oligoelementos (AnoxKaldnes, Suecia) una vez a la semana durante el periodo experimental. El tiempo de retención (HRT) fue 60 días durante el experimento con una carga de 2,5 kg de MS/(m³ d) que da 2,4 kg de MSO/(m³ d). El experimento se llevó a cabo durante 107 días. El contenido de MS, materia seca, en el sustrato se diluyó hasta el 15 %. La adición de enzima empezó en el día 15, después de que se alcanzaran las condiciones de estado estacionario en los cuatro reactores. La enzima usada en el experimento fue la serina proteasa de la familia S1 de Nocardiopsis prasina (SEQ ID NO 1), con el siguiente procedimiento de dosificación (Tabla 2): Reactor N1 - sin enzima añadida - Referencia, Reactor N2 - 1 % de SM en el reactor, administración de enzima una vez a la semana, Reactor N3 - 1 % de MS de sustrato entrante, dosificación de enzima cada día, Reactor N4 - 5 % de MS de sustrato entrante, dosificación de enzima cada día.

El rendimiento de metano en los cuatro reactores se puede observar en la Figura 5, donde se representan la producción acumulada de metano y la materia seca orgánica (MSO) acumulada. La pendiente de la regresión lineal es igual al rendimiento medio con respecto al periodo examinado (Tabla 2). El reactor 2 produjo en promedio 9 % más metano que el reactor de referencia (Reactor 1), mientras que el reactor 3 y 4 produjeron 5 y 3 % más, respectivamente. La experiencia previa con los reactores usados ha mostrado un 5 % de margen de error en la producción de gas. Estos resultados, por lo tanto, indican que la adición de enzima ha tenido un efecto positivo sobre la producción de gas en el reactor 2.

En contenido de materia seca (MS) en los reactores fue estable durante el periodo del experimento y no se pudo observar diferencia entre los reactores. La reducción de MS fue aproximadamente del 79 % en todos los reactores cuando se tuvo en cuenta una reducción de volumen por semana y reactor. El pH empezó a 7,3, disminuyó hasta 7,1 pero luego pareció que se estabilizó a aproximadamente 7,2. Los niveles de VFA han sido constantemente bajos durante el experimento. Esto indica que la hidrólisis es la etapa limitante de la velocidad y las posteriores etapas en el proceso de degradación tienen tiempo suficiente para encargarse de los metabolitos. Las concentraciones de amonio (NH⁴-N) variaron entre 300-700 mg/l durante el experimento. La comparación de los valores medios da un aumento en la concentración de amonio del 27, 18 y 24 %, respectivamente, en el reactor 2, 3 y 4. Niveles más altos de NH4-N muestran que se ha degradado más proteína y parece que en este caso la dosificación de proteasa una vez por semana (con 1 % de MS entrante durante la semana) tiene un efecto tan alto como la dosificación diaria con 5 % por MS entrante. Las concentraciones de COD disminuyeron de 7000 mg/l a 4000 - 5000 mg/l en la última parte del experimento. No se pudo observar diferencia entre los reactores.

Tabla 2. Adición de enzima a los cuatro CSTR y rendimiento de metano

Ejemplo 7: Velocidad de producción mejorada de biometano mediante la adición de enzima proteolítica al proceso de biogás de estiércol

El objetivo de este estudio era mostrar que la velocidad de producción de metano aumenta cuando se añade proteasa microbiana adicional al proceso de biogás. Las proteasas investigadas fueron una serina proteasa de la familia S1 de Nocardiopsis prasina (SEQ ID NO 1, Proteasa 1) y una serina proteasa de familia S8A de Bacillus clausii (SEQ ID NO 2, se probaron dos lotes de proteasa 2, proteasa 2A y proteasa 2B). El estudio se hizo en un digestato de biogás que contenía estiércol de cerdo al que se le añadieron diversos residuos industriales sin definir, principalmente residuos de la producción de alimentos. El estudio se hizo en condiciones de laboratorio como el experimento por lotes de biogás, por determinación de la producción de metano. El metano se midió por cromatografía de gases.

Protocolo para los experimentos por lotes de biogás

Equipo/materiales

Frascos de infusión de 500 ml (Apodan Nordic)

Tapones de bromo-butilo para frascos de infusión (Apodan Nordic 050974)

N2 (AGA Art N°)

Jeringa, 50 ml (BD Plastipak 300865)

Aguja para jeringa de 50 ml (BD Microlance 304432)

Jeringa, policarbonato desechable de 1 ml (BD Plastipak 300013)

Aguja para jeringa de 1 ml (BD Microlance 300300)

Válvula, válvula de jeringa Mininert para jeringa de punta de Luer (Mikrolab art PS-654051)

Aguja (aguja para jeringa desechable de 1 ml) (BD medical)

Patrón de metano de 30 %, 60 % y 100 % de metano (30 y 60 %, diluido con N2) (Mikrolab, Árhus, Dinamarca ML42571)

Ventilación/cámara para patrones de biogás con tabique (ML72052)

Supelco, viales de tapa roscada claros de 2 cm3 previamente limpiados (art 27339) (Supelco, Bellafonte, PA, EE. UU.) (las tapas se ajustaron manualmente para garantizar que se cerraron apropiadamente.

Digestato de biogás

El digestato de biogás usado como inóculo en este experimento se obtuvo de una planta de biogás comercial Snertinge Biogas (Snertinge, Dinamarca). Se introdujeron 20 l de estiércol del digestor anaerobio en bidones de plástico de 25 l. El inoculo se tamizó a través de un tamiz de 2 mm, el filtrado se usó para los experimentos.

Experimento en frasco

En frascos de infusión de 500 ml, se añadieron las enzimas (proteasa 1 o proteasa 2) en una dilución de 500 pl, para tener volúmenes finales idénticos en todos los matraces (para mantener volumen del espacio de cabeza similar). Se probaron las enzimas a dos concentraciones, o 1,6 mg o 0,4 mg de enzima por frasco. Para cada concentración se incluyó un control negativo. Para el control negativo se añadió la misma cantidad de enzima, la enzima en el control negativo se inactivó por esterilización en autoclave durante 20 min a 121 °C. A los frascos se añadieron 200 ml de digestato de biogás. El frasco se lavó con N2 durante 30-60 s para retirar el O2 del espacio de cabeza. Se cerraron los frascos con tapones para frascos de infusión. Los frascos se agitaron invirtiéndolos al menos 4 veces para mezclar la enzima con el digestato de biogás. Los frascos se incubaron a 52 °C. Durante el experimento, los frascos se agitaron 2-3 veces/semana (como se ha descrito anteriormente). Se recogieron muestras para la determinación de biometano después de 7, 14, 21 y 28 días. Para corregir el volumen ventilado, se preparan muestras para CG inmediatamente antes y después de la ventilación. Después de 6 días, los frascos se ventilaron para evitar la alta presión. La ventilación se realizó con jeringa de 50 ml, la aguja perforó el tapón del frasco de 500 ml. Se sacaron 50 ml de gas (si la presión en el frasco no permitió que se sacaran 50 ml, no se ventiló el frasco. Si hubo una presión muy alta en el frasco, se sacaron más de 50 ml.

Preparación de muestras de frascos por lotes

Para la determinación de biometano, se prepararon muestras por duplicado, excepto en el día 6 donde se tomó una muestra antes y después de la ventilación de los frascos. Se tomaron muestras con una jeringa de 1 ml con válvula entre la aguja y la jeringa perforando el tapón del frasco por lotes de 500 ml con la válvula abierta. La jeringa se lavó 2-3 veces en el frasco. Se recogieron 250 pl de gas en la jeringa. Se cerró la válvula. La aguja perforó el tapón del vial de CG de 2 ml. Se abrió la válvula. Se inyectaron los 250 pl de gas en el vial de CG de 2 ml.

Preparación de patrones (curva patrón)

Los patrones se prepararon usando el mismo tipo de jeringa que para las muestras. La válvula del patrón se abrió hasta que la se estableció la presión en la cámara (el tabique se tiene que cambiar frecuentemente). La aguja perforó el tabique del patrón con la válvula abierta. La jeringa se lavó 2-3 veces en la cámara. Se tomaron al menos 250 pl de gas en la jeringa. La aguja se sacó del tapón con la válvula abierta. El volumen se ajustó a 250 pl, expulsando el exceso de gas. El gas se inyectó en un vial de CG de 2 ml. La curva patrón se hizo midiendo dos viales independientes preparados como se ha descrito anteriormente que contienen 30, 60 o 100 % de metano.

Método de cromatografía de gases para la determinación del contenido de biometano en el biogás

• Equipo

Varian 3900 GC con inyector automático CP 8400 y detector FID, PoraPLOT Q (10 pm) 25 m x 0,32 mm de sílice fundida (Cat N° 7551)

• Ajustes del equipo

Ajustes del inyector automático, el inyector automático está equipado con una jeringa Hamilton de 10 gl.

Inyector automático "habilitado", profundidad de penetración de muestras "90 %", profundidad de penetración de disolvente "90 %".

Lavado por defecto, vial "I", volumen "5,0 gl", emboladas "1", velocidad de aspiración "5,0 gl/s".

Modo limpieza, lavados con disolvente preinyección "3", lavados de muestra preinyección "0", lavados con disolvente posinyección "1", fuente de disolvente limpio "I".

Columna Pneumatics, "isobárica", presión "7,20 psi".

Detector, calentador "ENCENDIDO" punto de consigna "250 °C",

Ajustes Electrónica "SÍ", constante de tiempo "RÁPIDA"

Tabla de eventos de FID, tiempo; inicial, intervalo;12, autocero; Sí.

Detector EFC: Tipo 11, flujo de helio (constitución) "25 ml/min", flujo de H2 "30 ml/min".

• Método

Las muestras se probaron en un método donde la temperatura de la columna se mantuvo constante a 40 °C, el pico de metano ocurrió a aproximadamente 1 min, y se integró, y el área se usó para el cálculo. Se calcularon los gmoles en patrón para los tres patrones, y la pendiente de la curva patrón se usó para el cálculo de ml de CH⁴. Cantidad de biometano en las muestras usando la fórmula:

p x 250 x % de CH4

gmol de CH4 en el patrón

Trealx 0,0821

Vespacio de cabeza x T x 0,0821 x PromediO(áreai iárea2)

mL de CH4 =

Vmuestrax Pendientepatrón

Definiciones en la fórmula: ml es ml de biometano, Vol^{espacio de cabeza} es el volumen del espacio de cabeza en el frasco en ml, Vol^muestra en ml, T es la temperatura en Kelvin, que es 273, debido a que se quieren determinar los ml de biometano a 0 °C, Promedio^{(área1,área2)} es el promedio del área del pico de metano en las dos determinaciones de CG, Pendiente^patrón es la pendiente de la curva patrón de metano. P es la temperatura ambiente en K cuando se hizo la curva patrón, % de CH4 es la concentración del patrón respectivo.

Resultados y conclusión

Tabla 3 que muestra todos los datos de los ensayos por lotes de biogás. El % de CV se calcula a partir de determinaciones triples.

Tabla 4 que muestra el aumento en la producción biometano con respecto a una muestra a la que se añadió la misma cantidad de enzima inactivada por tratamiento con calor.

Ambas enzimas proteolíticas (la proteasa 1 es una proteasa que pertenece a la familia de S1A, la proteasa 2 (Savinase) pertenece a la familia de S8A en el sistema de clasificación de MEROPS) provocan un aumento de la producción de biometano superior al 10 % en los primeros 3 días después de la adición. La conclusión es que la adición de proteasa al proceso de biogás conduce a una liberación más rápida del metano.

Claims (20)

REIVINDICACIONES

1. Un método de tratamiento de sustratos para la producción de biogás en digestores anaerobios, que comprende tratar un sustrato con una cantidad eficiente de una o más enzimas proteolíticas solas o en combinación con al menos una carbohidrasa,

en donde al menos una de la una o más enzimas proteolíticas se selecciona de polipéptidos que tienen actividad de proteasa y que tienen al menos el 90, o al menos el 95 % de identidad de aminoácidos con SEQ ID NO:1 o con SEQ ID NO:2.

2. El método según la reivindicación 1, en donde el polipéptido que tiene la actividad de proteasa es una serina proteasa S1 de Nocardiopsis.

3. El método según la reivindicación 2, en donde la serina proteasa S1 de Nocardiopsis es de Nocardiopsis dassonvillei subsp. dassonvillei, Nocardiopsis prasina, Nocardiopsis alkaliphila o Nocardiopsis lucentensis.

4. El método según la reivindicación 3, en donde la serina proteasa S1 de Nocardiopsis se selecciona de proteasas de Nocardiopsis dassonvillei subsp. dassonvillei DSM 43235, Nocardiopsis prasina DSM 15649, Nocardiopsis prasina (previamente alba) DSM 14010, Nocardiopsis sp. DSM 16424, Nocardiopsis alkaliphila DSM 44657 o Nocardiopsis lucentensis DSM 44048.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde al menos una de la una o más enzimas proteolíticas es termoestable.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde al menos una de la una o más enzimas proteolíticas es estable al ácido.

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el sustrato comprende material vegetal, tal como maíz, ensilaje de maíz, ensilaje de trigo, ensilaje de hierba, ensilaje de triticale y/u otro ensilaje de planta completa.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el sustrato comprende estiércol líquido, subproductos agrícolas o residuos orgánicos.

9. El método de la reivindicación 1, en donde la enzima proteolítica tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1 o SEQ ID NO:2.

10. El método de la reivindicación 9, en donde la enzima proteolítica es de Nocardiopsis dassonvillei subsp. dassonvillei DSM 43235.

11. El método de la reivindicación 1, en donde al menos una carbohidrasa es una amilasa o una celulasa.

12. El método de la reivindicación 1, en donde al menos una carbohidrasa es una beta-glucanasa o a xilanasa.

13. El método de la reivindicación 1, en donde se añade al menos una carbohidrasa y la al menos una carbohidrasa se selecciona del grupo que consiste en beta-glucanasas, xiloglucanasas, xilanasas, amilasas y pectinasas, o cualquier combinación de las mismas.

14. El método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende tratar un sustrato con una cantidad eficiente de una o más enzimas proteolíticas en combinación con al menos una carbohidrasa.

15. El método de la reivindicación 13, en donde se añade al menos una carbohidrasas en cantidades correspondientes a 0,1 - 500 mg de proteína de enzima/kg de sustrato; preferentemente 1 - 500 mg de proteína de enzima/kg de sustrato, preferentemente 10 - 500 mg de proteína de enzima/kg de sustrato.

16. El método según cualquiera de las reivindicaciones previas, en donde la una o más enzimas proteolíticas se añaden cada una en cantidades correspondientes a 0,1 - 500 mg de proteína de enzima/kg de sustrato, preferentemente 1 - 500 mg de proteína de enzima/kg de sustrato, preferentemente 10 - 500 mg de proteína de enzima/kg de sustrato, preferentemente 50 - 500 mg de proteína de enzima/kg de sustrato.

17. El método de todas las reivindicaciones precedentes, en donde el tratamiento es a una temperatura superior a 20 °C e inferior a 70 °C, preferentemente entre 35 °C y 42 °C.

18. El método de todas las reivindicaciones precedentes, en donde el tratamiento es a un pH superior a 4,5 e inferior a 9,0.

19. El método de todas las reivindicaciones precedentes, en donde el tratamiento es a un pH entre 6,7 y 7,5.

20. El método de todas las reivindicaciones precedentes, en donde una o más enzimas proteolíticas solas o en combinación con al menos una carbohidrasa se añaden antes, después o preferentemente simultáneamente con el sustrato al fermentador.