ES2881342T3 - Un sistema de ensayo microfluídico y un procedimiento de realización de un ensayo - Google Patents

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Abstract

Un sistema de ensayo microfluídico que comprende un cartucho microfluídico (30) y un sistema operador microfluídico asociado (40), dicho cartucho microfluídico comprende una parte de base (16, 26, 46, 56, 66), que tiene una primera cara (16a) y una segunda cara opuesta (16b) y con un rebaje en la primera cara y una lámina (17, 27, 47, 67) fijada a la parte de base (16, 26, 46, 56, 66) para cubrir el rebaje y formar una cara de lámina de dicho cartucho microfluídico, en el que la parte de base con el rebaje y la lámina forman un canal de flujo (1, 11, 21, 31, 41) y un pozo (3, 13, 23, 33, 43), el canal de flujo tiene una longitud y comprende una sección de reacción (2, 12, 22, 32, 42, 62) y un extremo aguas arriba y otro aguas abajo, en el que el pozo (3, 13, 23, 33, 43) está en comunicación de fluidos con el canal de flujo (1, 11, 21, 31, 41) aguas abajo de la sección de reacción (2, 12, 22, 32, 42, 62) y el cartucho microfluídico comprende una abertura de entrada (4, 14, 24, 34, 44) en dicho canal de flujo aguas arriba de la sección de reacción (2, 12, 22, 32, 42, 62), dicho sistema operador (40) comprende un pistón (29b, 49b), un elemento regulador de la temperatura (28a, 48a) y un actuador (29a, 49a) colocado de tal manera que dicha cara de la lámina de dicho cartucho microfluídico está adaptada para ser colocada en contacto con dicho sistema operador con dicha sección de reacción (2, 12, 22, 32, 42, 62) en proximidad a dicho elemento regulador de temperatura (28a, 48a) mientras que dicho actuador (29a, 49a) está asociado a la sección de pozo para presionar la lámina que cubre dicha sección de pozo (3, 13, 23, 33, 43) y dicho pistón (29b, 49b) está asociado al canal de flujo (1, 11, 21, 31, 41) en una sección de válvula aguas arriba (5, 15, 25, 35) para presionar la lámina y cerrar el canal de flujo (1, 11, 21, 31, 41) aguas arriba de la sección de reacción (2, 12, 22, 32, 42, 62).

Description

DESCRIPCIÓN
Un sistema de ensayo microfluídico y un procedimiento de realización de un ensayo
Campo técnico
La presente invención se refiere a un sistema y un procedimiento de realización de un ensayo, en particular un ensayo sensible a la temperatura, como un ensayo bioquímico.
Técnica antecedente
Se conocen en la técnica anterior una pluralidad de procedimientos y dispositivos para la determinación cuantitativa o cualitativa de un componente objetivo en una muestra líquida. Muchos de estos procedimientos de la técnica anterior comprenden pasos complicados o que requieren mucho tiempo, como los pasos de lavado. Durante muchos años se han desarrollado constantemente procedimientos nuevos y mejorados, y en particular procedimientos que utilizan sistemas ópticos de etiquetado y lectura.
Los procedimientos de detección microfluídica y los ensayos para llevar a cabo dichos procedimientos, incluyendo el etiquetado óptico y los sistemas de lectura, son ampliamente utilizados. Cuando se realizan ensayos bioquímicos, a menudo es necesario controlar la temperatura durante el ensayo y/o controlar el flujo.
El documento US2011272610A divulga una estructura de microválvula y un módulo “lab-on-a-chip” que incluyen un actuador de polímero. La estructura de la microválvula puede incluir una estructura flexible dispuesta sobre una parte base y el actuador de polímero insertado en la estructura flexible. En este momento, la estructura flexible tiene una porción de válvula que define un microcanal y el actuador de polímero está separado del microcanal por la estructura flexible. Además, el actuador de polímero está formado para cambiar un ancho del microcanal controlando un desplazamiento de la porción de la válvula.
El documento US2012298233A divulga un componente microfluídico para manipular un fluido que incluye una primera parte de base, una segunda parte de base, y una tercera parte de base que está configurada a partir de un material resiliente y dispuesta entre la primera parte de base y la segunda parte de base. Al menos un primer rebaje que forma una primera cámara de control está configurado en la cara de la primera parte base que da a la tercera parte base. Al menos un segundo rebaje que forma un canal de fluido está configurado en la cara de la segunda parte base que da a la tercera parte base. En la primera parte base se forma una segunda cámara de control separada espacialmente de la primera cámara de control y un canal de control que conecta la primera cámara de control con la segunda cámara de control. Al menos una pared lateral de la segunda cámara de control está configurada a partir de un material resiliente y es deformable por un actuador de manera que el volumen interior de la segunda cámara de control disminuye.
El documento US2015247845 divulga un dispositivo microfluídico que puede, por ejemplo, utilizarse en un ensayo magnético. El dispositivo microfluídico comprende una parte de base con una ranura para un canal de flujo y una lámina que cubre el canal de flujo, el canal de flujo comprende una ventana transparente y una entrada para la succión de la muestra líquida, el dispositivo microfluídico comprende una sección de pared flexible del canal de flujo o de una sección de pozo en conexión de fluidos con el canal de flujo, la sección de pared flexible se puede mover de tal manera que el aire será presionado fuera del canal de flujo donde después la pared flexible volverá a su posición inicial.
Mientras que la temperatura de la muestra en los cartuchos microfluídicos conocidos puede ajustarse, se ha comprobado que el ajuste de la temperatura es muy lento.
El documento WO 2015/192855 divulga un sistema de detección microfluídico que comprende un cartucho microfluídico y un conjunto detector. El cartucho microfluídico comprende una primera y una segunda cara, al menos un canal de flujo y una entrada al canal o canales de flujo para alimentar una muestra líquida. El canal o los canales de flujo comprenden una pluralidad de primeros sitios de detección óptica. El conjunto detector comprende una ranura para insertar el cartucho microfluídico y una primera fuente de luz fija con una trayectoria de rayos y un lector óptico para leer las señales ópticas de al menos uno de los primeros sitios de detección óptica. El conjunto detector y el cartucho microfluídico están construidos de tal manera que cuando el cartucho microfluídico se inserta en una primera posición predeterminada en la ranura, uno de los primeros sitios de detección óptica del cartucho microfluídico se posiciona en la trayectoria del haz de la primera fuente de luz, y cuando el cartucho se inserta en una segunda posición predeterminada en la ranura, otro de los primeros sitios de detección óptica del cartucho microfluídico se posiciona en la trayectoria del haz de la primera fuente de luz. Se menciona que el conjunto detector puede comprender un elemento de control de la temperatura dispuesto para estar en contacto con el cartucho microfiuídico en la ranura.
El documento WO2015/138343 divulga un termociclador que comprende una primera cámara para mantener un fluido a una primera temperatura media y una segunda cámara para mantener el fluido a una segunda temperatura media. La segunda cámara está en comunicación de fluidos con la primera cámara, en la que el fluido se transfiere entre la primera cámara y la segunda cámara para lograr una transición de la primera temperatura media a sustancialmente la segunda temperatura media o viceversa a una velocidad de 10 uL°C/segundo o más. Los émbolos están dispuestos para transferir alternativamente la muestra entre la primera y la segunda cámara.
Divulgación de la invención
Un objeto de la presente invención es proporcionar un sistema y un procedimiento de realización de un ensayo adecuado para un ajuste rápido y preciso de la temperatura de una muestra contenida en el mismo.
En una realización de la invención es un objeto proporcionar un sistema de ensayo microfluídico que comprende un cartucho microfluídico con una sección de reacción donde una muestra en la sección de reacción puede ser incubada a una temperatura deseada con una alta precisión.
En una realización de la invención es un objeto proporcionar un sistema de ensayo microfluídico que comprende un cartucho microfluídico con una sección de reacción donde una muestra en la sección de reacción puede ser sometida a una regulación de temperatura de acuerdo con un plan de temperatura predeterminado.
En una realización de la invención es un objeto proporcionar un sistema de ensayo microfluídico que permite un ensayo rápido y preciso con una alta precisión.
También se describe un cartucho microfluídico cuya producción es rentable y que puede utilizarse en el ensayo de la invención.
En una realización de la invención es un objeto proporcionar un procedimiento que no requiera pasos de lavado que consuman tiempo y en el que la determinación de un objetivo pueda realizarse con una alta precisión y relativamente rápido, por ejemplo, en unos pocos minutos.
Estos objetos han sido alcanzados por la presente invención y las realizaciones de la misma como se definen en las reivindicaciones y se describen a continuación.
La invención ha demostrado proporcionar un enfoque completamente nuevo para realizar ensayos cuantitativos o cualitativos sensibles al calor, como la determinación de un componente objetivo en un líquido, en particular cuando la determinación incluye un ensayo sensible a la temperatura, como un ensayo bioquímico.
Además, se ha comprobado que se pueden obtener resultados muy buenos y precisos de forma rápida y sencilla. El sistema de ensayo microfluídico de la invención comprende un cartucho microfluídico y un sistema operador microfluídico asociado. En general, se desea que el cartucho microfluídico sea un cartucho microfluídico desechable y que el sistema operador microfluídico pueda ser utilizado una y otra vez junto con cartuchos microfluídicos del mismo diseño y tamaño o con cartuchos microfluídicos de diferentes formas y tamaños. Opcionalmente, el sistema operador microfluídico es ajustable de manera que pueda utilizarse con cartuchos microfluídicos de diferentes tamaños o formas.
El cartucho microfluídico comprende una parte base, que tiene una primera cara y una segunda cara opuesta y con un rebaje en la primera cara y una lámina fijada a la parte base para cubrir el rebaje y proporcionar una cara de la lámina del cartucho microfluídico que es la cara de la lámina orientada hacia fuera de la parte base.
La parte base es ventajosamente rígida.
La lámina puede fijarse a la parte base por cualquier medio, como por ejemplo, soldándola o pegándola. La lámina se fija a la parte base de manera que el rebaje y la lámina forman un canal de flujo y un pozo. El canal de flujo tiene una longitud y comprende una sección de reacción y un extremo aguas arriba y otro aguas abajo. En una realización, el extremo aguas arriba está en un lado de la sección de reacción y el extremo aguas abajo está en un lado opuesto de la sección de reacción. Debe entenderse que el canal de flujo puede tener dos o más secciones de reacción. Además, no se excluye que el canal de flujo esté ramificado.
El pozo está en comunicación de fluidos con el canal de flujo aguas abajo de la sección de reacción. El cartucho microfluídico comprende una abertura de entrada en el canal de flujo aguas arriba de la sección de reacción.
El sistema operador comprende un pistón, un elemento regulador de la temperatura y un actuador colocado de tal manera que la cara de la lámina del cartucho microfluídico puede colocarse en contacto con el sistema operador con la sección de reacción en estrecha proximidad al elemento regulador de la temperatura, mientras que el actuador está asociado a la sección de pozo para presionar la lámina que cubre la sección de pozo y el pistón está asociado al canal de flujo en una sección de válvula aguas arriba para presionar la lámina para cerrar el canal de flujo aguas arriba de la sección de reacción.
Se ha descubierto que el sistema de ensayo microfluídico de la invención proporciona una regulación de temperatura muy eficaz de una muestra dentro de la sección de reacción del cartucho microfluídico. La lámina es relativamente fina, lo que significa que la transferencia de calor a través de ella es relativamente rápida. Además, la disposición del pozo y de la sección de la válvula aguas arriba hace que la presión dentro de la sección de reacción pueda elevarse de forma que la lámina que cubre la sección de reacción no se desvíe hacia el rebaje de la parte base. Se ha comprobado que si no se ejerce la presión dentro de la sección de reacción, la lámina tiende a ser ligeramente absorbida por el rebaje de la parte base, es decir, la lámina que cubre la sección de reacción se desvía hacia el rebaje. Este efecto puede ser aún mayor cuando la sección de reacción está llena de líquido, lo que significa que la cara de la lámina que cubre la sección de reacción no estará en contacto íntimo con el elemento regulador de la temperatura, lo que significa que la regulación del calor se vuelve lenta e inexacta. Mediante la presente invención se asegura un contacto íntimo entre la cara de la lámina y el elemento regulador de la temperatura. De este modo se puede obtener un ajuste de temperatura muy alto y preciso de una muestra contenida en la sección de reacción. Los términos "aguas arriba" y "aguas abajo" deben interpretarse en relación con el canal de flujo y el flujo inicial de una muestra en el canal de flujo.
El término "sustancialmente" debe entenderse aquí en el sentido de que se incluyen las variaciones y tolerancias ordinarias del producto.
El término "aproximadamente" se utiliza generalmente para incluir lo que está dentro de las incertidumbres de medición. Cuando se utiliza en rangos, el término "aproximadamente" debe entenderse como que lo que está dentro de las incertidumbres de medición está incluido en el rango.
El término "muestra líquida" o "muestra" o "líquido de prueba" significa cualquier muestra que contenga líquido, incluyendo la muestra líquida que comprende partes sólidas, como dispersiones y suspensiones. La muestra comprende líquido en el momento de realizar el procedimiento.
A lo largo de la descripción o de las reivindicaciones, el singular abarca el plural a menos que se especifique lo contrario o lo exija el contexto.
El "procedimiento" también se denomina "prueba" o "ensayo".
La sección de reacción forma una cámara de reacción para una reacción deseada. La reacción puede ser, en principio, cualquier reacción, como la formación de un enlace, por ejemplo, entre un objetivo y una sonda de captura, como se describe más adelante.
En una realización se ha encontrado que es ventajoso que al menos la sección de reacción se mantenga en una posición inclinada respecto a un plano horizontal cuando se realiza la regulación de la temperatura. La regulación de la temperatura de la muestra en la sección de reacción puede dar lugar a la formación de pequeñas burbujas de gas que pueden deteriorar la lectura óptica. Se ha descubierto que este problema puede aliviarse total o parcialmente sosteniendo el cartucho microfluídico de manera que al menos la sección de reacción se mantenga en una posición inclinada con respecto a un plano horizontal. Se cree que al mantener la sección de reacción en una posición inclinada se produce una aglomeración de dichas burbujas formadas y/o las burbujas pueden ser transportadas fuera de la sección de reacción, por ejemplo, a la sección de pozo.
En una realización, el sistema operador está adaptado para sostener el cartucho microfluídico de tal manera que al menos la sección de reacción está inclinada cuando se mantiene cerca del elemento regulador de temperatura. En una realización, al menos un eje central de la sección de reacción está inclinado con respecto a un plano horizontal, como con un ángulo de inclinación de al menos aproximadamente 3 grados, como al menos aproximadamente 5 grados, como de aproximadamente 10 a aproximadamente 45 grados, como de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 grados.
El plano horizontal se define como un plano perpendicular a la gravedad.
Generalmente se desea que la parte base del cartucho microfluídico sea sustancialmente plana, es decir, que la primera y la segunda caras opuestas de la parte base sean sustancialmente paralelas y estén en el plano de la parte base.
En una realización, el sistema operador está adaptado para sostener el cartucho microfluídico de manera que la parte base esté inclinada con respecto a un plano horizontal, como con un ángulo de inclinación de al menos aproximadamente 3 grados, como al menos aproximadamente 5 grados, como de aproximadamente 10 a aproximadamente 45 grados, como de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 grados.
La parte de base es preferiblemente de un material que es transparente a por lo menos una longitud de onda seleccionada entre la luz infrarroja (aproximadamente 700 nm a aproximadamente 1000 pm), la luz visible (aproximadamente 400 nm a aproximadamente 700 nm), la luz ultravioleta (aproximadamente 400 nm a aproximadamente 10 nm) y la luz de rayos X (aproximadamente 10 nm a aproximadamente 0,01 nm). La parte base es ventajosamente de un material que es sustancialmente transparente a por lo menos una longitud de onda de alrededor de 200 nm a alrededor de 1600 nm y preferiblemente una longitud de onda dentro del rango visible más amplio de alrededor de 380 nm a alrededor de 750 nm.
Los ejemplos de materiales que pueden utilizarse para la parte de base comprenden materiales seleccionados entre el vidrio y el polímero, preferentemente polímeros seleccionados entre copolímeros cíclicos de oleofina (COC), copolímero de acrilonitrilo-butadieno-estireno, policarbonato, polidimetil-siloxano (PDMS), polietileno (PE), polimetilmetacrilato (PMMA), polimetilpenteno, polipropileno, poliestireno polisulfona, politetrafluoroetileno (PTFE), poliuretano (PU), cloruro de polivinilo (PVC), cloruro de polivinilideno (PVDC), fluoruro de polivinilidina, copolímeros estireno-acrilo, poliisopreno, polibutadieno, policloropreno, poliisobutileno, poli(estireno-butadieno-estireno), siliconas, resinas epoxi, poliéter amida en bloque, poliéster, acrilonitrilo butadieno estireno (ABS), acrílico, celuloide, acetato de celulosa, acetato de etileno-vinilo (EVA), alcohol vinílico de etileno (EVAL), fluoroplásticos, poliacetal (POM), poliacrilatos (acrílicos), poliacrilonitrilo (PAN) poliamida (PA), poliamidaimida (PAI), poliarilcetona (PAEK), polibutadieno (PBD), polibutileno (PB), tereftalato de polibutileno (PBT), tereftalato de polietileno (PET), policiclohexileno dimetileno tereftalato (PCT), policetona (PK), poliéster/politeno/polietileno, polieteretercetona (PEEK), polieterimida (PEI), polietersulfona (PES), polietileclorinatos (PEC), poliimida (PI), ácido poliláctico (PLA), polimetilpenteno (PMP), óxido de polifenileno (PPO), sulfuro de polifenileno (PPS), poliftalamida (PPA) y sus mezclas. Los materiales mencionados anteriormente también pueden utilizarse para la lámina.
La pieza base es ventajosamente rígida a 25° C. Ventajosamente la pieza base se produce por moldeo por inyección o por tallado láser en un sustrato. La parte base está cubierta con la lámina que, ventajosamente, está unida a la parte base para formar el canal de flujo y el pozo.
La lámina es preferiblemente transparente a al menos una longitud de onda, preferiblemente como se ha descrito anteriormente para la parte base.
Ventajosamente, la lámina es relativamente delgada, como por ejemplo con un grosor de menos de aproximadamente 1 mm, preferiblemente de aproximadamente 0,5 mm o menos, como por ejemplo de aproximadamente 100 nm o menos.
Debe entenderse que el cartucho microfluídico puede tener dos o más canales de flujo en conexión de fluidos con un pozo común o con pozos respectivos.
La abertura de entrada puede, en principio, estar dispuesta en cualquier lugar aguas arriba de la sección de reacción y aguas arriba de la sección de la válvula. En una realización, la abertura de entrada en el canal de flujo está dispuesta en el extremo aguas arriba, preferiblemente la abertura de entrada es proporcionada por un orificio a través de la parte base.
En una realización, la abertura de entrada al canal de flujo está dispuesta en un borde del cartucho microfluídico.
Ventajosamente, la abertura de entrada es proporcionada por un orificio a través de la parte base donde el orificio es suficientemente grande para aplicar una gota de un líquido de prueba al cartucho microfluídico. Al proporcionar el orificio suficientemente grande, de manera que el borde de la parte base en la periferia del orificio y la lámina que cubre el orificio proporcionan una cavidad suficientemente grande para una gota de la muestra, se reduce el riesgo de derrame de la muestra.
El canal de flujo del cartucho microfluídico puede, en principio, tener cualquier forma, longitud y tamaño.
En lo que sigue, la anchura del canal y del pozo es la anchura vista en la vista superior desde la cara de la lámina y la altura del canal/pozo es perpendicular a la anchura. La longitud del canal es la longitud central del canal y la anchura se determina perpendicularmente al canal. La anchura del pozo se determina perpendicularmente a una longitud central del canal que se determina como una línea central recta desde la conexión de fluido entre el canal de flujo y el pozo y hasta el punto más alejado del pozo.
En una realización, el canal de flujo inmediatamente adyacente a la entrada tiene una anchura vista desde arriba desde la cara de la lámina, que es menor que la anchura de la abertura de entrada, preferiblemente la anchura es de aproximadamente 10 pm a aproximadamente 500 pm, como por ejemplo de aproximadamente 25 pm a aproximadamente 200 pm.
La anchura del canal de flujo puede ser igual o diferente.
La altura del canal de flujo y, en particular, de la sección de reacción es ventajosamente menor que la anchura. De este modo, se garantiza una lectura óptica eficaz. También se desea que el volumen del canal de flujo sea relativamente bajo, asegurando así que el volumen de muestra requerido para un ensayo sea relativamente pequeño. En una realización, el canal de flujo tiene una altura de aproximadamente 1 pm a aproximadamente 100 pm.
La altura del pozo puede ser igual a la altura del canal de flujo o, ventajosamente, puede ser mayor, por ejemplo, al menos un 25 % mayor, por ejemplo, al menos un 50 % mayor, por ejemplo, al menos un 100 % mayor. En una realización, el pozo tiene una altura de aproximadamente 20 pm a aproximadamente 2 mm, tal como de aproximadamente 200 pm a aproximadamente 1 mm.
En una realización, el pozo tiene una anchura vista desde la cara de la lámina, que es mayor que la anchura máxima de la sección de flujo.
Ventajosamente, el pozo tiene un volumen que es al menos 0,5 veces el volumen total del canal de flujo, tal como al menos alrededor del volumen total del canal de flujo, tal como de aproximadamente 1,5 a aproximadamente 100 veces el volumen del canal de flujo, tal como de aproximadamente 2 a aproximadamente 10 veces el volumen total del canal de flujo. De este modo, el pozo y el actuador asociado pueden regular el flujo de la muestra en el canal de flujo con una precisión muy alta.
La sección de la válvula del canal de flujo puede ser una sección ordinaria del canal de flujo, sin embargo, para asegurar una función eficaz de la válvula se desea que la sección de la válvula del canal de flujo esté formada para formar un cierre apretado con la lámina cuando el pistón está presionando la lámina en el canal de flujo en la sección de la válvula del canal de flujo. En una realización, el canal de flujo en la sección de la válvula tiene una pared redondeada, es decir, sin bordes afilados.
En una realización, la sección de la válvula del canal de flujo comprende un asiento de válvula con una forma complementaria a la cabeza del pistón, cuya cabeza del pistón está presionando la lámina en el canal de flujo en la sección de la válvula del canal de flujo al cerrar la válvula.
En una realización, la cabeza del pistón está formada para ser acoplada con el rebaje en la sección de la válvula del canal de flujo para cerrar efectivamente el canal de flujo.
En una realización, la sección de válvula del canal de flujo comprende un asiento de válvula con una estructura de cresta en la primera superficie de la parte base, en la que la estructura de cresta sobresale de la primera superficie de la parte base en el rebaje y cruza al menos una parte del rebaje. De este modo, se puede obtener un cierre muy hermético de la válvula. Ventajosamente, la estructura de cresta se extiende en una dirección sustancialmente perpendicular al canal de flujo para garantizar la estanqueidad a lo largo de toda la anchura del rebaje en la sección de la válvula.
En una realización, el asiento de la válvula comprende una junta para sellar contra el pistón con la lámina intermedia intercalada. Ventajosamente, tanto el asiento de la válvula como la cabeza del pistón comprenden una junta de un material elastomérico para sellar eficazmente contra la lámina intercalada y para asegurar que la cabeza del pistón no dañe la lámina.
La sección de la válvula puede tener la misma anchura que el canal de flujo adyacente.
Para garantizar una función eficaz de la válvula, la sección de la válvula de la sección de flujo puede tener una anchura mayor que la anchura más pequeña del canal de flujo.
Al asegurar que el ancho de la sección de la válvula no es muy estrecho, el pistón y la cabeza del pistón no necesitan ser muy delgados y por lo tanto el pistón y en particular la cabeza del pistón pueden ser más duraderos. Para asegurar que la lámina que cubre la sección de reacción pueda ser presionada para que sea plana o se abulte (desvíe) ligeramente fuera del rebaje, el cartucho microfluídico está ventajosamente formado de tal manera que cuando la sección de la válvula aguas arriba está cerrada, el actuador asociado a la sección de pozo puede aplicar una presión que eleva la presión en la sección de reacción relativamente a lo que habría sido sin este actuador. En una realización, el canal de flujo está libre de cualquier orificio a través de la parte base o de la lámina aguas abajo de la sección de la válvula aguas arriba para asegurar que el fluido no pueda escapar del canal de flujo aguas abajo a la sección de la válvula aguas arriba cuando la sección de la válvula aguas arriba está cerrada y el actuador asociado a la sección del pozo presiona contra la lámina en la sección del pozo.
Ventajosamente, el canal de flujo aguas abajo de la sección de válvula aguas arriba y el pozo constituyen un volumen cerrado cuando la sección de válvula aguas arriba es cerrada por el pistón. De este modo, puede obtenerse un control eficaz de la presión aplicada a la sección de reacción y la lámina que cubre la sección de reacción puede manipularse para que tenga la forma deseada en relación con el rebaje.
En una realización, el canal de flujo comprende una sección de válvula aguas abajo y el sistema operador comprende un pistón asociado para la sección de válvula aguas abajo. La sección de la válvula de aguas abajo y la sección de la válvula de aguas arriba pueden tener ventajosamente la forma descrita anteriormente para la sección de la válvula de aguas arriba. Debe entenderse que la sección de la válvula aguas abajo y la sección de la válvula aguas arriba no necesitan ser idénticas, sino que en una realización pueden ser diferentes entre sí. Para simplificar, la sección de la válvula aguas abajo y la sección de la válvula aguas arriba pueden ser sustancialmente idénticas. La sección de la válvula de aguas abajo y la sección de la válvula de aguas arriba pueden aplicarse para garantizar una presión fija en la sección de reacción, por ejemplo, cerrando la sección de la válvula de aguas abajo y la sección de la válvula de aguas arriba después de que el actuador haya presionado la lámina en el pozo para proporcionar una presión deseada. De este modo, la presión en la sección de reacción puede mantenerse muy estable durante el tiempo deseado.
En una realización la sección de reacción puede ser una sección del canal de flujo que es similar en anchura a las partes adyacentes del canal de flujo. Sin embargo, para garantizar una amplia zona de lectura, se desea que la sección de reacción sea más ancha que el resto del canal de flujo.
En una realización, la sección de reacción tiene una anchura vista en una vista superior desde la cara de la lámina, que es mayor que el canal inmediatamente adyacente a la entrada, preferiblemente la sección de reacción tiene una anchura que es mayor que el canal de flujo inmediato aguas arriba y/o aguas abajo. Preferiblemente, la sección de reacción tiene una anchura media de aproximadamente 2 mm a aproximadamente 5 cm, por ejemplo de aproximadamente 5 mm a aproximadamente 2 cm.
Ventajosamente, la sección de reacción tiene un área de lectura (longitud por anchura media) vista en una vista superior desde la cara de la lámina de al menos aproximadamente 40 mm2, como de al menos aproximadamente 40 mm2, como de al menos aproximadamente 60 mm2, como de al menos aproximadamente 100 mm2.
El ensayo puede implicar ventajosamente lectura óptica.
En una realización, la sección de reacción comprende sondas de captura para un objetivo.
El objetivo puede ser cualquier objetivo que se vaya a determinar cuantitativa o cualitativamente y que puede ser capturada directamente o a través de una molécula de enlace a la sonda de captura. Tales pares de sondas de captura-objetivo son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, anticuerpos-antígenos, etc.
El término "un objetivo" significa una o más moléculas de un tipo o componentes específicos. El término "dos o más o varios objetivos" significa dos o más o varios tipos diferentes de componentes de objetivos.
En lo que sigue, para simplificar, el término "objetivo" se utiliza principalmente en singular, pero también debe incluir la versión plural del término "objetivos", a menos que se especifique lo contrario.
Los términos "objetivo" y "componente objetivo" se utilizan indistintamente.
El objetivo puede ser cualquier tipo de objetivo que pueda determinarse en un ensayo de unión. El experto puede utilizar de forma sencilla los conocimientos de otros tipos de ensayos de unión para seleccionar los componentes objetivo adecuados y las sondas de captura correspondientes.
En una realización, el objetivo es una biomolécula, como una molécula orgánica única o una estructura de moléculas orgánicas, por ejemplo, un organismo orgánico. Dado que en la industria -por ejemplo, la industria de la salud y la industria alimentaria- hay una gran necesidad de un sistema de ensayo que sea rápido, relativamente barato y muy preciso, el sistema de ensayo y el procedimiento de la invención suponen una gran contribución a la técnica. El sistema de ensayo y el procedimiento de la invención son muy adecuados para su uso en determinaciones cuantitativas y/o cualitativas de biomoléculas, en particular porque el procedimiento de la invención es muy rápido y altamente fiable.
En una realización de la invención, el objetivo puede ser, por ejemplo, una variante mutante de una molécula o un organismo orgánico, como un microorganismo.
En una realización, el objetivo es o comprende un microorganismo como al menos uno de los patógenos bacterianos, virales o fúngicos, por ejemplo, E-coli E. coli, Citrobacter spp., Aeromonas spp., Pasteurella spp., Salmonella no serogrupo DI, Camphylobacter Staphylococcus spp y combinaciones de los mismos.
En una realización, el objetivo es o comprende una célula, como una célula sanguínea, una célula madre o una célula tumoral.
En una realización, el objetivo es o comprende proteínas, nucleótidos, carbohidratos o lípidos, en particular una enzima, un antígeno o un anticuerpo.
En una realización el objetivo es o comprende un "hapteno". Un hapteno es una pequeña molécula que puede provocar una respuesta inmunitaria sólo cuando se une a un gran portador, como una proteína; el portador puede ser uno que no provoque una respuesta inmunitaria por sí mismo. El hapteno puede ser, por ejemplo, un esteroide, una hormona, un antibiótico o un componente inorgánico.
El experto se dará cuenta de que el objetivo puede ser cualquier tipo de componente para el que se puede proporcionar una sonda de captura.
Los objetivos y las sondas de captura correspondientes son bien conocidos en la técnica. También es bien conocido el hecho de inmovilizar dichas sondas de captura en una superficie.
En una realización las sondas de captura son específicas para el objetivo.
Si hay dos o más objetivos puede haber varios grupos de sondas de captura o puede haber un tipo de sondas de captura que sean sondas de captura para todos los componentes del objetivo.
En una realización en la que hay dos o más componentes objetivo, las sondas de captura son específicas para los dos o más componentes objetivo, por ejemplo, para un grupo de componentes objetivo similares pero no idénticos. En una realización de la invención, las sondas de captura son específicas para un grupo de componentes que comprende uno o más componentes objetivo.
En una realización, las sondas de captura son, por ejemplo, sitios de unión para proteínas, pudiéndose determinar así el contenido de proteínas. En una realización las sondas de captura son sitios de unión para un tipo o grupo de proteínas preseleccionadas.
En una realización, las sondas de captura son sitios de unión para haptenos como pequeñas moléculas orgánicas, por ejemplo, hormonas esteroides, antibióticos o incluso otras moléculas de hapteno de otro origen.
Las sondas de captura se inmovilizan preferentemente en una superficie dentro de la sección de reacción del canal de flujo.
Las sondas de captura pueden ser inmovilizadas en la lámina y/o en la primera cara de la parte base. En una realización se prefiere que las sondas de captura se inmovilicen en la primera cara de la parte base en la sección de reacción.
La parte base y/o la lámina dentro de la sección de reacción comprenden ventajosamente al menos un elemento óptico. El elemento óptico se construye preferentemente para redirigir y preferentemente colimar la luz emitida por un fluoróforo.
En una realización, el elemento óptico se construye preferentemente para redirigir y preferentemente colimar la luz emitida desde un fluoróforo en la proximidad de la primera cara de la parte base y/o desde un fluoróforo en la proximidad de la lámina dentro de la sección de reacción. La frase "en la vecindad de" significa preferentemente dentro de una distancia de 10 nm o menos, como dentro de una distancia de 2 nm o menos, como dentro de una distancia de 1 nm o menos, como dentro de una distancia de 0,1 nm o menos.
Generalmente es más sencillo dotar a la parte base con el elemento óptico que dotar a la lámina con el elemento óptico y, en consecuencia, se prefiere que el elemento óptico forme parte de la parte base. A continuación se describe la realización de la invención con el elemento óptico como parte de la pieza base, pero debe entenderse que el elemento óptico alternativamente podría formar parte de la lámina. Además, debe entenderse que la parte base y/o la lámina dentro de la sección de reacción pueden tener varios elementos ópticos. En una realización, la parte base y/o la lámina dentro de la sección de reacción comprende al menos aproximadamente 4 elementos ópticos, como al menos alrededor de 10 elementos ópticos, como al menos alrededor de 20 elementos ópticos, como al menos alrededor de 50 elementos ópticos.
Preferiblemente, el elemento óptico comprende las sondas de captura para un objetivo inmovilizado en la primera cara de la parte base o en la lámina dentro de la sección de reacción.
El elemento óptico puede producirse ventajosamente durante el moldeo de la parte base y comprende ventajosamente una estructura de lente y/o una estructura de fluorescencia de ángulo supercrítico (estructura SAF), la estructura SAF tiene preferentemente una superficie superior. La estructura de la lente y/o la estructura SAF tiene la función de redirigir la luz emitida por un fluoróforo dentro de la sección de reacción, de manera que la luz emitida pueda leerse de forma sencilla. Ventajosamente, el elemento óptico colima la luz emitida, lo que actúa como una amplificación de la señal que puede leerse.
Preferiblemente el elemento óptico es una estructura SAF.
Las estructuras SAF son bien conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, en los documentos US2016011112, US2013236982A y/o US2007262265.
En una realización la estructura SAF es como el elemento óptico descrito en cualquiera de los documentos de la técnica anterior US2016011112, US2013236982A y/o US2007262265 con la diferencia de que el elemento óptico está incorporado en la sección de reacción del cartucho microfluídico como se describe en el presente documento. Ventajosamente, la estructura SAF es una parte integrada de la parte base y preferiblemente del mismo material que la parte base restante, preferiblemente producida por moldeo por inyección, en la que la estructura SAF se forma en la parte del rebaje que va a formar la sección de reacción.
En una realización alternativa, la estructura SAF está parcialmente incrustada o montada en la parte restante de la parte base. En una realización es más sencillo proporcionar la estructura SAF en un material que difiere del material de la parte restante de la parte base, como un material con un índice de refracción más alto. Sin embargo, generalmente se desea que la estructura SAF sea del mismo material que la parte base restante.
La estructura SAF tiene preferentemente una superficie superior orientada hacia el exterior, es decir, la superficie superior está orientada hacia la lámina si la estructura SAF forma parte de la parte base. Las sondas de captura se inmovilizan ventajosamente en la superficie superior. Cuando hay varias estructuras SAF, las superficies superiores de las respectivas estructuras SAF pueden tener inmovilizadas sondas de captura idénticas o diferentes.
Las sondas de captura pueden ser inmovilizadas ventajosamente antes de fijar la lámina a la parte base.
Ventajosamente, la estructura SAF comprende una forma de tronco de cono que sobresale hacia la lámina, con su superficie superior orientada hacia la lámina. Las sondas de captura se inmovilizan preferentemente en la superficie superior.
La emisión fluorescente de la luz (también llamada emisión de luminiscencia) en o cerca de la interfaz de dos medios de refracción diferentes emite la mayor parte de la luz anisotrópicamente hacia el medio de refracción más alto (n2) dentro de un ángulo por encima de un ángulo supercrítico (0c) (Ver figura 7). La estructura SAF tiene una forma ventajosa para recoger la mayor parte de la fluorescencia emitida en el refractario superior con una alta eficiencia de recogida.
La estructura SAF tiene un índice de refracción más alto que el fluido en la sección de reacción, que puede ser un gas como el aire. Si la muestra se ha retirado de la sección de reacción, puede ser que se introduzca muestra fresca u otro fluido, como el agua, en la sección de reacción después de que las sondas de captura hayan capturado el objetivo.
La emisión de luminiscencia que se propaga en ángulos superiores al ángulo crítico se denomina luz de ángulo supercrítico. Típicamente, la luz de ángulo supercrítico se propaga, por ejemplo, dentro del rango angular de aproximadamente 61,5 grados a aproximadamente 80 grados. Se apreciará que una señal de luminiscencia puede tener muchas formas diferentes dependiendo de la excitación.
Para garantizar una colimación óptima de la luz emitida por los fluoróforos en las proximidades de la superficie superior -por ejemplo, capturada directa o indirectamente (con moléculas enlazadoras u otras moléculas intermedias) por las sondas de captura, el diámetro de la superficie superior y la altura de la estructura SAF saliente se adaptan ventajosamente entre sí. Ventajosamente, la superficie tiene un área de al menos aproximadamente 0,01 mm2, como por ejemplo de aproximadamente 0,02 mm2 a aproximadamente 1 mm2, como por ejemplo de aproximadamente 0,03 mm2 a aproximadamente 0,8 mm2, como por ejemplo de aproximadamente 0,05 mm2 a aproximadamente 0,5 mm2.
La superficie superior tiene preferentemente una periferia redonda, preferentemente circular, con un diámetro de aproximadamente 0,01 mm a aproximadamente 1 mm.
Como se ha mencionado, en una realización alternativa la estructura SAF está montada sobre la lámina y sobresale hacia la primera cara de la estructura.
La estructura SAF tiene ventajosamente una forma de frústula que sobresale de la parte de la base con un diámetro que se estrecha en la dirección que sobresale hacia su superficie superior, de manera que los lados forman un ángulo con respecto a una línea central perpendicular a la superficie superior, ángulo que se denomina ángulo de frústula.
La estructura SAF puede tener, por ejemplo, una forma de tronco piramidal seleccionada entre una forma de tronco piramidal cuadrado, un tronco piramidal pentagonal, un tronco piramidal triangular (una pirámide recortada) o un tronco piramidal cónico.
Ventajosamente, la estructura SAF tiene un tronco piramidal cónico (a veces también denominado forma de tronco piramidal cónico).
Para garantizar una colimación deseada, el ángulo del tronco piramidal es menor que el ángulo supercrítico. Ventajosamente, la estructura SAF tiene un ángulo de frustración de al menos aproximadamente 50 grados, como por ejemplo de aproximadamente 55 grados a aproximadamente 75 grados, como por ejemplo de aproximadamente 58 grados, a aproximadamente 70 grados, como por ejemplo de aproximadamente 59° a aproximadamente 65 grados, como por ejemplo de aproximadamente 60 grados a aproximadamente 61 grados, preferiblemente aproximadamente 60°.
La estructura SAF tiene ventajosamente una altura que sobresale que es suficientemente grande para redirigir la luz emitida por un fluoróforo inmovilizado en la superficie superior de la estructura SAF. Preferiblemente, la luz se colima y se transmite a través de la parte de la base y se emite desde la segunda cara de la parte de la base, donde es leída por un lector óptico.
Preferiblemente, la estructura SAF tiene una altura que sobresale de al menos aproximadamente 0,03 mm, como por ejemplo de al menos aproximadamente 0,1 mm, preferiblemente la estructura SAF tiene una altura que sobresale de unas 1 veces a unas 3 veces el diámetro máximo de la superficie superior de la estructura SAF.
La altura de la estructura SAF se determina la superficie superior hasta su raíz donde se conecta o integra con la parte restante de la parte base (o la lámina donde la estructura SAF forma parte de la lámina).
La estructura SAF (y preferiblemente toda la parte base) tiene un índice de refracción superior a 1,33, que es el índice de refracción del agua. Ventajosamente, la estructura SAF tiene un índice de refracción de al menos aproximadamente 1,4, como por ejemplo un índice de refracción de aproximadamente 1,45 a aproximadamente 1,65. En una realización preferida, la estructura SAF es de poliestireno con un índice de refracción de aproximadamente 1,59.
El regulador de temperatura puede comprender, por ejemplo, un elemento Peltier, un elemento calefactor de lámina delgada y/o otros elementos calefactores resistivos.
Ventajosamente, el elemento regulador de temperatura es un elemento termoeléctrico, tal como un elemento Peltier, preferiblemente el elemento termoeléctrico es operable tanto para enfriar como para calentar en una configuración de tiempo seleccionada.
El sistema operador puede, en una realización, comprender un emisor para transmitir una luz de excitación y un lector para leer las señales ópticas. El lector y el emisor pueden ser, por ejemplo, una unidad común. El emisor/lector se sitúa, por ejemplo, en el lado de la segunda cara del cartucho microfluídico cuando se coloca con su cara de lámina en contacto con el sistema operador para la regulación de la temperatura de una muestra en la sección de reacción.
El lector óptico puede ser, en principio, cualquier tipo de fotodetector capaz de detectar la longitud de onda en cuestión, es decir, los rayos de luz con la longitud de onda que se espera obtener del sitio de detección óptica, por ejemplo, emitidos o reflejados o que pasan por el sitio de detección óptica.
Ventajosamente, el lector óptico es un lector de longitud de onda múltiple.
En una realización, el lector comprende una matriz de fotodiodos y/o un tubo fotomultiplicador. Los detectores adecuados pueden adquirirse, por ejemplo, en Hamamatsu Cooperation, Bridgewater, Estados Unidos, o en Atmel Corporation, San José, Estados Unidos.
En una realización, el lector óptico es un lector de imágenes digitales, preferentemente en forma de un lector de dispositivos de carga acoplada (CCD).
Ventajosamente, el lector CCD es un lector en color, como un lector 3CCD o un lector CCD de mosaico con filtro de color.
Un lector 3CCD es un lector CCD que comprende un prisma divisor de haz dicroico que divide la imagen en componentes rojo, verde y azul.
Un lector CCD de mosaico con filtro de color es un lector CCD que comprende un filtro de color como una máscara Bayer, una máscara RGBW (matriz de filtros rojo, verde, azul y blanco) o una máscara CYGM (matriz de filtros cian, amarillo, verde y magenta).
Ventajosamente el lector óptico es un espectrómetro, el espectrómetro está preferentemente configurado para operar con un ancho de banda que comprende al menos dos haces de luz diferentes.
Un espectrómetro también suele llamarse espectroscopio y se utiliza para medir propiedades, como la intensidad o la polarización de la luz en un ancho de banda específico.
Preferiblemente, el espectrómetro está configurado para determinar las intensidades de la luz en un ancho de banda que comprende la luz visible.
En una realización, el espectrómetro está configurado para determinar las intensidades de la luz en un ancho de banda que comprende al menos dos haces de luz diferentes.
En una realización, el lector óptico es un espectrómetro de fibra óptica que comprende una pluralidad de fibras ópticas dispuestas para recibir los rayos de luz emitidos por los fluoróforos.
El emisor para excitar el fluoróforo puede ser ventajosamente un emisor basado en diodos.
En una realización, el sistema operador comprende un sistema informático configurado para controlar el funcionamiento de al menos un elemento operador seleccionado entre el (los) pistón(es), el elemento regulador de la temperatura y el actuador. El sistema informático comprende preferentemente una memoria que almacena un software para controlar el funcionamiento del elemento o elementos operadores. El sistema informático puede estar programado para realizar un procedimiento de ensayo deseado, por ejemplo, según un código cargado en el sistema informático a través de una interfaz y/o un código (por ejemplo, un código de barras) leído en el cartucho de microfluidos.
Ventajosamente, el ordenador está programado para llevar a cabo un procedimiento de ensayo que comprende el llenado de una muestra en la sección de reacción, sometiéndola a calentamiento y/o enfriamiento, transmitiendo una luz de excitación hacia la sección de reacción, leyendo una señal emitida desde un fluoróforo opcional dentro de la sección de reacción. El procedimiento de ensayo puede comprender la retirada de la muestra de la sección de reacción antes de transmitir una luz de excitación hacia la sección de reacción, leyendo una señal emitida por el fluoróforo opcional dentro de la sección de reacción. Opcionalmente se introduce otro fluido, como el agua, en la sección de reacción antes de transmitir una luz de excitación hacia la sección de reacción, leyendo una señal emitida por el fluoróforo opcional dentro de la sección de reacción.
En una realización, el procedimiento de ensayo comprende la activación del activador para presionar la lámina que cubre la sección de pozo, la activación del activador para liberar al menos parcialmente la lámina que cubre la sección de pozo, la activación del pistón para cerrar la sección de válvula aguas arriba y la activación del elemento regulador de la temperatura para regular la temperatura de una muestra en la sección de reacción de acuerdo con un plan de temperatura predeterminado.
El ordenador está programado ventajosamente para operar los elementos operadores para llevar a cabo uno o más de los ensayos descritos a continuación.
En una realización, el sistema de ensayo microfluídico comprende además una fuente de luz (un emisor) configurada para excitar un fluoróforo en la sección de reacción. La fuente de luz está configurada preferentemente para excitar un fluoróforo capturado en una estructura SAF. La captación puede ser directa o indirecta. Por ejemplo, el objetivo puede comprender el fluoróforo o el fluoróforo puede ser capturado por el objetivo opcionalmente a través de una molécula de enlace.
Los fluoróforos son bien conocidos en la técnica y se utilizan ampliamente en la tecnología de los ensayos cuantitativos y cualitativos.
Un fluoróforo (también llamado fluorocromo o cromóforo fluorescente o molécula luminiscente) es una molécula que puede ser excitada mediante la absorción de energía luminosa y reemite energía a una longitud de onda específica. La longitud de onda, la cantidad y el tiempo antes de la emisión de la energía emitida dependen tanto del fluoróforo como de su entorno químico, ya que la molécula en su estado de excitación puede interactuar con las moléculas circundantes.
La energía de excitación puede ser una banda de energía muy estrecha o más amplia, o puede ser todas las energías más allá de un nivel de corte. La energía de emisión y la longitud de onda suelen ser más específicas que la energía de excitación, y suele ser de mayor longitud de onda o menor energía. Las energías de excitación van desde el ultravioleta hasta el espectro visible, y las energías de emisión pueden continuar desde la luz visible hasta la región del infrarrojo cercano.
Generalmente se desea seleccionar fluoróforos con una longitud de onda y energía de emisión relativamente específicas para una determinación cualitativa o cuantitativa más sencilla del componente objetivo. En particular, se desea que la longitud de onda de emisión sea relativamente específica, es decir, que tenga preferentemente una banda de longitud de onda que en el procedimiento de determinación sea lo suficientemente estrecha como para distinguirse de otras emisiones.
El término "longitud de onda específica relativa" significa que la longitud de onda puede distinguirse de otras longitudes de onda emisoras en la prueba.
En particular, en situaciones en las que hay varios fluoróforos diferentes y, opcionalmente, varios componentes objetivo, se prefiere que los fluoróforos tengan longitudes de onda de emisión relativamente específicas, de manera que la emisión de los respectivos fluoróforos pueda distinguirse entre sí.
Los fluoróforos pueden ser de cualquier tipo. En una realización, los fluoróforos son puntos cuánticos o sondas aromáticas y/o sondas conjugadas, como la fluoresceína, derivados del benceno, fluoróforos metal-calcogenuros o combinaciones de los mismos.
Los ejemplos de puntos cuánticos se describen en US 7498177 y los puntos cuánticos disponibles en Life Technologies Europe BV. Estos puntos cuánticos incluyen más de 150 configuraciones de productos diferentes con longitudes de onda de emisión que abarcan una amplia gama de longitudes de onda para los ejemplos de puntos cuánticos con las respectivas longitudes de onda de emisión: 525, 545, 565, 585, 605, 625, 655 e IR 705 y 800 nm. Entre los ejemplos de puntos cuánticos también se incluyen los puntos cuánticos disponibles en Ocean NanoTech, Springdale, Arkansas 72764, que incluyen más de 40 configuraciones de productos diferentes con longitudes de onda de emisión que abarcan en nm y un núcleo exterior funcionalizado de PEG u otro revestimiento compatible con la biología, por ejemplo con las respectivas longitudes de onda de emisión: 530, 550, 580, 590, 600, 610, 620 y 630 nm. Los puntos cuánticos de Ocean NanoTech incluyen puntos cuánticos con diferentes grupos funcionales, por ejemplo, amina, COOH, ácido fenilborónico (PBA), así como puntos cuánticos con recubrimiento de polímero anfifílico y PEG. Otros ejemplos de puntos cuánticos disponibles en Ocean NanoTech son los puntos cuánticos con un único núcleo, por ejemplo, suministrado en tolueno y con sólo una capa de octadecilamina o con un polímero anfifílico y una capa de PEG.
En una realización, el sistema de ensayo microfluídico comprende además un lector óptico para leer la luz emitida, preferentemente de un fluoróforo, más preferentemente el lector está configurado para leer la luz emitida a través de la estructura SAF descrita anteriormente.
La invención también comprende un cartucho microfluídico que comprende una sección de reacción con una o más estructuras SAF como las descritas anteriormente.
También se describe un cartucho microfluídico que comprende una parte de base, que tiene una primera cara y una segunda cara opuesta y con un rebaje en la primera cara y una lámina fijada a la parte de base para cubrir el rebaje y proporcionar una cara de lámina del cartucho microfluídico, en la que la parte de base con el rebaje y la lámina forma un canal de flujo y un pozo. El canal de flujo tiene una longitud y comprende una sección de reacción y un extremo aguas arriba y otro aguas abajo. El pozo está en comunicación de fluidos con el canal de flujo aguas abajo del pozo y el cartucho microfluídico comprende una abertura de entrada en el canal de flujo aguas arriba de la sección de reacción. El canal de flujo comprende una sección de válvula aguas arriba entre la abertura de entrada y la sección de reacción. La sección de la válvula del canal de flujo comprende un asiento de válvula. El asiento de la válvula comprende preferentemente una estructura de cresta en la primera superficie de la parte base. Ventajosamente, la estructura de cresta sobresale de la primera superficie de la parte de la base en el rebaje y atraviesa al menos una parte del rebaje.
El cartucho microfluídico puede ser ventajosamente como se ha descrito anteriormente.
La invención también comprende un procedimiento de realización de un ensayo utilizando un sistema de ensayo microfluídico como el descrito anteriormente. El procedimiento comprende
• aplicar el cartucho microfluídico en el sistema operador de manera que la sección de reacción esté cerca del elemento regulador de la temperatura, mientras que el actuador está asociado a la sección de pozo para presionar la lámina que cubre la sección de pozo y el pistón está asociado al canal de flujo en una sección de válvula aguas arriba para presionar la lámina y cerrar el canal de flujo aguas arriba de la sección de reacción;
• activar el activador para presionar la lámina que cubre la sección del pozo para así presionar el fluido (por ejemplo, el gas) fuera del pozo;
• aplicar una muestra en la entrada del canal de flujo;
• activar el activador para liberar, al menos parcialmente, la lámina que cubre la sección de pozo para aspirar así la muestra, preferiblemente de forma que la muestra llene, al menos parcialmente, la sección de reacción;
• activar el pistón para cerrar la sección de la válvula aguas arriba;
• activar el activador para presionar la lámina que cubre la sección de pozo para aplicar así una presión en la sección de reacción que es más alta de lo que habría sido sin la depresión de la lámina; y
• activar el elemento regulador de la temperatura para regular la temperatura de la muestra en la sección de reacción según un plan de temperatura predeterminado.
El plan de temperatura puede consistir, por ejemplo, en mantener la temperatura constante, por ejemplo, a 37° C durante un tiempo predeterminado, en calentar hasta una temperatura máxima, seguida de un enfriamiento, en enfriar hasta una temperatura baja y, a continuación, en aumentar la temperatura, etc.
Ventajosamente, el sistema operador sostiene dicho cartucho microfluídico de tal manera que al menos la sección de reacción está inclinada cuando se sostiene en proximidad a dicho elemento regulador de temperatura.
Como se ha descrito anteriormente, se ha comprobado que las burbujas formadas opcionalmente pueden eliminarse total o parcialmente de una zona de lectura de la sección de reacción para garantizar así que las burbujas no deterioren la lectura.
En una realización, al menos un eje central de la sección de reacción está inclinado con respecto a un plano horizontal, como con un ángulo de inclinación de al menos aproximadamente 3 grados, como al menos aproximadamente 5 grados, como de aproximadamente 10 a aproximadamente 45 grados, como de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 grados.
En una realización, la parte de la base del cartucho microfluídico es sustancialmente plana y el cartucho microfluídico se aplica sobre el sistema operador de tal manera que el sistema operador sostiene la parte de la base en posición inclinada con respecto a un plano horizontal, tal como con un ángulo de inclinación de al menos aproximadamente 3 grados, tal como al menos aproximadamente 5 grados, tal como de aproximadamente 10 a aproximadamente 45 grados, tal como de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 grados. En una realización, la muestra en la sección de reacción se incuba durante un tiempo predeterminado en el que se somete a la regulación de la temperatura según el plan de temperatura.
Ventajosamente, el tiempo de incubación es relativamente corto, como menos de 30 minutos, por ejemplo de 2 a 10 minutos.
El canal de flujo puede comprender una sección de válvula aguas abajo y el sistema operador puede comprender un pistón asociado para la sección de válvula aguas abajo como se ha descrito anteriormente. En esta realización, el procedimiento comprende ventajosamente la activación del pistón asociado para cerrar la sección de la válvula aguas abajo, donde la sección de la válvula aguas abajo se cierra preferentemente después de la aplicación de la presión en la sección de reacción. De este modo, la presión aplicada a la sección de reacción puede mantenerse muy estable, ya que ningún fluido puede salir de la sección de reacción. Mientras que el actuador puede ser controlado para aplicar una presión específica con una precisión relativamente alta, puede ser más difícil operar el actuador para mantener la presión estable en el tiempo. El cierre por la sección de la válvula aguas abajo y el pistón asociado puede hacer que sea más sencillo mantener la presión deseada con alta precisión.
Cuando la sección de reacción comprende sondas de captura para un objetivo que comprende o está asociada a un fluoróforo, el procedimiento comprende ventajosamente determinar cuantitativa o cualitativamente la presencia del objetivo en la muestra, donde el procedimiento comprende emitir luz de excitación hacia la sección de reacción del cartucho microfluídico y leer la señal opcional emitida.
La frase de que el objetivo está asociado a un fluoróforo significa que el fluoróforo está adaptado para unirse al objetivo directa o indirectamente a través de una molécula de enlace.
Como se ha descrito anteriormente, el cartucho microfluídico comprende preferentemente elementos ópticos, más preferentemente estructura(s) SAF.
Cuando las sondas de captura están inmovilizadas en la sección superior de la estructura SAF, la muestra -que opcionalmente comprende fluoróforos que no son capturados por las sondas de captura- no necesita ser retirada antes de la excitación y la lectura, porque sólo los fluoróforos en la vecindad (capturados por las sondas de captura) emitirán luz que se propagará predominantemente en la estructura SAF con un ángulo superior al ángulo crítico. Otros fluoróforos (que fluyen libremente en la muestra) emitirán luz de forma sustancialmente uniforme en todas las direcciones, por lo que se extenderá. De este modo, un usuario o el lector pueden determinar qué es ruido de fondo (por ejemplo, luz emitida dispersa) y qué es una señal real. Sin embargo, para algunos ensayos puede ser deseable retirar la muestra de la sección de reacción antes de emitir la luz de excitación y leerla.
En una realización en la que las sondas de captura están inmovilizadas en una superficie dentro de la sección de reacción del canal de flujo, el procedimiento comprende ventajosamente la activación del pistón o pistones para abrir la sección de la válvula aguas arriba y la sección opcional de la válvula aguas abajo y la activación del activador para aspirar la muestra fuera de la sección de reacción, preferiblemente para aspirar la muestra parcial o totalmente en el pozo. Preferiblemente, la muestra es aspirada fuera de la sección de reacción antes de emitir la luz de excitación hacia la sección de reacción y leerla.
En una realización, otro fluido, como el agua, se introduce en la sección de reacción antes de emitir la luz de excitación hacia la sección de reacción y leerla.
En una realización, las sondas de captura se inmovilizan en un elemento óptico de la parte de base o de la lámina dentro de la sección de reacción y el elemento óptico se construye preferentemente para redirigir y preferentemente colimar la luz emitida por un fluoróforo acoplado a la sonda de captura como se ha descrito anteriormente. La luz de excitación se emite preferentemente hacia los elementos ópticos desde el lado del cartucho microfluídico del que forman parte los elementos ópticos, es decir, cuando los elementos ópticos forman parte de la parte de la base, la luz de excitación se emite hacia el lado de la parte de la base del cartucho microfluídico, es decir, de manera que la luz de excitación incide en la segunda superficie de la parte de la base.
Cuando los elementos ópticos son estructuras SAF, la luz de excitación se emite preferentemente hacia la estructura SAF con una dirección de propagación sustancialmente perpendicular a la superficie superior de las estructuras SAF, preferentemente de manera que la luz de excitación se propague a través de la estructura SAF para excitar los fluoróforos capturados por las sondas de captura.
Breve descripción de los dibujos
Los objetos, características y ventajas anteriores y/o adicionales de la presente invención se dilucidarán aún más mediante la siguiente descripción ilustrativa y no limitativa de las realizaciones de la presente invención, con referencia a los dibujos adjuntos.
La figura 1 es una vista superior esquemática de un cartucho microfluídico.
La figura 2 es una vista superior esquemática de un cartucho microfluídico.
Las figuras 3a, 3b, 3c y 3d son ilustraciones esquemáticas de una realización del sistema de ensayo microfluídico en funcionamiento.
La figura 3e corresponde a la figura 3d en la que al menos la sección de reacción está inclinada con respecto a un plano horizontal.
La figura 4 es una vista en perspectiva de un cartucho microfluídico.
La figura 5 es una vista en perspectiva de un sistema de ensayo microfluídico que comprende un sistema operador microfluídico y una pluralidad de cartuchos microfluídicos.
Las figuras 6a, 6b y 6c son ilustraciones esquemáticas de una realización del sistema de ensayo microfluídico en funcionamiento en el que la sección de reacción comprende sondas objetivo.
La figura 7 es una vista en perspectiva y en sección de una estructura SAF.
La figura 8 es una vista en sección de otra estructura SAF.
La figura 9 es una vista en sección de un cartucho microfluídico, en el que la parte de la base tiene forma de estructura tipo SAF.
La figura 10 es una vista lateral esquemática de una unidad emisora y lectora que forma un conjunto emisor-lector.
La figura 11 ilustra la cara emisora y receptora de una unidad emisora y lectora.
La figura 12 ilustra un sistema operador microfluídico adecuado para un sistema de ensayo microfluídico de una realización de la invención.
Las figuras son esquemáticas y están simplificadas para mayor claridad. A lo largo de este documento, se utilizan los mismos números de referencia para las partes idénticas o correspondientes.
El cartucho microfluídico de la figura 1 comprende 5 canales de flujo 1 formados entre una lámina y una parte de base. El cartucho microfluídico se ve desde el lado de la lámina. Cada cartucho microfluídico comprende un extremo aguas arriba, y un extremo aguas abajo a cada lado de una sección de reacción 2. Se puede observar que la sección de reacción 2 es más ancha que la parte restante del canal de flujo 1. Cada canal está en comunicación de fluidos con un pozo 3. En la realización mostrada, cada canal tiene su propio pozo 3. En una variación, dos o más canales pueden estar en comunicación de fluidos con un pozo común. El cartucho microfluídico tiene una entrada común 4 para los canales de flujo 1. Cada canal de flujo también comprende una sección de válvula aguas arriba 5, que puede ser cerrada por un pistón asociado del sistema operador de microfluidos, como se ha descrito anteriormente. Los canales de flujo pueden comprender fluoróforos 6 aplicados en el canal, donde los fluoróforos 6 están adaptados para reaccionar con un objetivo que puede ser capturado por sondas de captura dispuestas, por ejemplo, inmovilizadas en las secciones de reacción 2. Una zona 2a del cartucho microfluídico que comprende la sección de reacción está ventajosamente asociada a un elemento regulador de la temperatura del sistema operador microfluídi
La lámina es flexible y en su uso, los pozos son deprimidos por los actuadores del sistema operador microfluídico, se aplica una muestra en la entrada y los actuadores liberan la lámina por lo que la muestra es succionada en los canales. Los actuadores pueden, por ejemplo, en un primer paso de liberación, ser liberados sólo parcialmente, de manera que la muestra sea aspirada en la parte del canal de flujo 1 que comprende los fluoróforos, y allí se puede dejar que la muestra tenga un tiempo predeterminado para suspender los fluoróforos 6. A continuación, el actuador puede ser liberado aún más (por ejemplo, completamente) para retirar la muestra en las secciones de reacción 2. La muestra se somete a una regulación de la temperatura, por ejemplo, como se ha descrito anteriormente. A continuación, los objetivos capturados con fluoróforos pueden detectarse ópticamente. Opcionalmente, la muestra se retira de las secciones de reacción y se introduce en los pozos antes de la detección óptica.
El cartucho microfluídico de la figura 2 comprende un único canal de flujo 11 y un pozo 13 formado entre una lámina 17 y una parte base 16. La parte de la base 16 tiene una primera cara 16a y una segunda cara opuesta 16b y comprende un rebaje en la primera cara y la lámina 17 fijada a la parte de la base para cubrir el rebaje. La cara de la lámina es la cara de la lámina 17 que da la espalda a la parte base 16.
El canal de flujo tiene una longitud desde su entrada 14 hasta el pozo 13 y comprende una sección de reacción 12 y un extremo aguas arriba y otro aguas abajo, en el que el pozo 13 está en comunicación de fluidos con el canal de flujo 11 aguas abajo de la sección de reacción.
La parte base 16 es más delgada en la sección de reacción 12 para asegurar una excitación y lectura óptimas del lado de la parte base 12a.
El canal de flujo 15 también comprende una sección de válvula aguas arriba 15, que puede ser cerrada por un pistón asociado del sistema operador microfluídico como se ha descrito anteriormente. La sección de válvula aguas arriba 15 tiene un asiento de válvula que comprende una junta para sellar contra la lámina cuando es presionada por dicha cabeza de pistón de dicho pistón.
Las figuras 3a, 3b, 3c y 3d muestran una realización del sistema de ensayo microfluídico en funcionamiento.
El sistema de ensayo microfluídico comprende un cartucho microfluídico y un sistema operador microfluídico asociado. El cartucho microfluídico comprende una parte de base 26, que tiene una primera cara y una segunda cara opuesta y con un rebaje en la primera cara y una lámina 27 fijada a la parte de base 26 para cubrir el rebaje. La parte base 26 con el rebaje y la lámina 27 forman un canal de flujo 21 y un pozo 23. El cartucho microfluídico comprende una abertura de entrada 24 que está formada por un orificio en la parte base 26 como se ha descrito anteriormente.
Al proporcionar el orificio suficientemente grande, de manera que el borde de la parte base en la periferia del orificio y la lámina 17 que cubre el orificio proporciona una cavidad suficientemente grande para una gota de la muestra, se reduce el riesgo de derrame de la muestra.
El canal de flujo 21 comprende una sección de válvula aguas arriba 25 y una sección de reacción 22.
El sistema operador comprende un marco de soporte 28, un pistón 29b un elemento regulador de temperatura 28a y un actuador 29a colocado de tal manera que la cara de la lámina del cartucho microfluídico puede colocarse en contacto con el sistema operador con la sección de reacción 22 en estrecha proximidad con el elemento regulador de temperatura 28a mientras que el actuador 29a está asociado a la sección de pozo 23 para presionar la lámina 27 que cubre la sección de pozo 23 y el pistón 29b está asociado al canal de flujo 21 en la sección de válvula aguas arriba 25 para presionar la lámina 27 para cerrar el canal de flujo 21 aguas arriba a la sección de reacción 22.
En la figura 3a el cartucho microfluídico está posicionado en contacto con el sistema operador microfluídico. Como se ha visto, la sección de reacción 22 está situada muy cerca del elemento de regulación de la temperatura 28a, el actuador 29a está asociado a la sección de pozo 23 para presionar la lámina 27 que cubre la sección de pozo 23 y el pistón 29b está asociado al canal de flujo 21 en la sección de válvula aguas arriba 25 para presionar la lámina 27 y cerrar el canal de flujo 21 aguas arriba de la sección de reacción 22.
Como se puede observar, la lámina 27a que cubre la sección de reacción tiene una tendencia a desviarse hacia la parte base para disminuir el volumen de la sección de reacción. Se ha demostrado que este efecto se incrementa cuando la sección de reacción comprende fluido, a menos que se aplique una presión como la descrita en el presente documento.
Como se indica con la flecha en el actuador 28a, el actuador se activa para presionar la lámina 27 que cubre el pozo 23 para así presionar el aire fuera del canal de flujo 21 a través de la entrada 24. A continuación, como se muestra en la figura 3b, se aplica una gota de muestra en la entrada 24 y se libera el actuador, con lo que la muestra es aspirada en el canal de flujo 21 y en la sección de reacción 22. En las figuras 3c y 3d no se muestra la muestra, pero debe interpretarse que la muestra está en el cartucho microfluídico.
En la figura 3c, el pistón 29b se activa para cerrar la sección de la válvula 25 aguas arriba. A continuación, el actuador 29a se activa para presionar la lámina 27 que cubre el pozo 23 y así elevar ligeramente la presión en la sección de reacción, de modo que la lámina 27a' que cubre la sección de reacción 22 ya no se deprime hacia la parte de base 26, sino que se desvía hacia fuera de la parte de base 26, es decir, que se desvía ligeramente.
La figura 3d muestra el actuador 29a mientras presiona la lámina 27 que cubre el pozo 23.
El cartucho microfluídico comprende una depresión de extracción 22a que puede utilizarse para extraer una muestra de la sección de reacción 22. Se puede utilizar una jeringa con una aguja para perforar la pared delgada en la sección de reacción 22 en la depresión de extracción 22a.
La figura 3e corresponde a la figura 3d en la que el sistema operador comprende una base F para asegurar que al menos la sección de reacción esté inclinada con respecto a un plano horizontal. Se puede observar que el eje central RC del centro de reacción está inclinado con respecto a un plano horizonta1H y también el plano PB de la parte base está inclinado con respecto al plano horizontal H. Debido a la posición inclinada, cualquier burbuja que se forme en la cámara de reacción, por ejemplo, causada por la regulación de la temperatura, migrará a la sección del pozo y, por lo tanto, dichas burbujas no deteriorarán la lectura óptica.
El cartucho microfluídico de la figura 4 comprende un canal de flujo 31 y un pozo 43 formado entre una lámina y una parte de base. El cartucho microfluídico comprende una entrada 34 al canal de flujo 31. El canal de flujo 31 tiene una sección de válvula aguas arriba 35, una sección de reacción 32 y una sección de válvula aguas abajo 35a.
En la figura 5, una pluralidad de los cartuchos microfluídicos 30 mostrados en la figura 4 forman un sistema de ensayo microfluídico junto con un sistema operador microfluídico 40. Se puede observar que uno de los cartuchos microfluídicos 30 se inserta en una ranura del sistema operador microfluídico 40.
Las Figuras 6a, 6b y 6c ilustran una realización del sistema de ensayo microfluídico en funcionamiento en el que la sección de reacción comprende sondas objetivo 42b opcionalmente inmovilizadas en una estructura SAF como se ha descrito anteriormente.
El sistema de ensayo microfluídico comprende un cartucho microfluídico y un sistema operador microfluídico asociado. El cartucho microfluídico comprende una parte de base 46, que tiene una primera cara y una segunda cara opuesta y con un rebaje en la primera cara y una lámina 47 fijada a la parte de base 46 para cubrir el rebaje. La parte base 46 con el rebaje y la lámina 47 forman un canal de flujo 41 y un pozo 43. El cartucho microfluídico comprende una abertura de entrada 44 que está formada por un orificio en la parte base 46 como se ha descrito anteriormente.
El canal de flujo 41 comprende una sección de válvula aguas arriba 45 y una sección de reacción 42.
La sección de reacción 42 comprende sondas de captura 42 inmovilizadas en la parte base 46, preferiblemente en la superficie superior de las estructuras SAF.
El sistema operador comprende un marco de soporte 48, un pistón 49b un elemento regulador de temperatura 48a y un actuador 49a colocado de tal manera que la cara de la lámina del cartucho microfluídico puede colocarse en contacto con el sistema operador con la sección de reacción 42 en estrecha proximidad con el elemento regulador de temperatura 48a mientras que el actuador 49a está asociado a la sección de pozo 43 para presionar la lámina 47 que cubre la sección de pozo 43 y el pistón 49b está asociado al canal de flujo 41 en la sección de válvula aguas arriba 45 para presionar la lámina 47 para cerrar el canal de flujo 41 aguas arriba a la sección de reacción 42.
La parte base 46 es más delgada en la sección de reacción 42 para formar así una cavidad 42a en la parte base 46 para asegurar una excitación óptima y una lectura del lado de la parte base en la cavidad 42a.
En la figura 6a el cartucho microfluídico está posicionado en contacto con el sistema operador microfluídico con la sección de reacción 41 posicionada muy cerca del elemento regulador de temperatura 48a.
Como puede observarse, la lámina 47a que cubre la sección de reacción 42 está ligeramente desviada hacia el rebaje de la parte base 46.
Como se indica con la flecha en el actuador 48a, el actuador se activa para presionar la lámina 47 que cubre el pozo 43 para así presionar el aire fuera del canal de flujo 41 a través de la entrada 44. Se aplica una gota de muestra en la entrada 44 y se suelta el actuador, con lo que la muestra es aspirada hacia el canal de flujo 41 y la sección de reacción 42. En la figura 3c no se muestra la muestra, pero debe interpretarse que la muestra está en el cartucho microfluídico.
En la figura 6b, el pistón 49b se activa para cerrar la sección de la válvula aguas arriba 45. A continuación, el actuador 49a se activa para presionar la lámina 47 que cubre el pozo 43 y, de este modo, aumentar ligeramente la presión en la sección de reacción, de modo que la lámina 47a' que cubre la sección de reacción 42 ya no se desvía hacia el rebaje de la parte base 46, sino que se desvía hacia fuera de la parte base 46, es decir, se desvía ligeramente.
La estructura SAF mostrada en la figura 7 tiene una forma de tronco piramidal cónico con una superficie superior 51 y un ángulo de tronco piramidal a. El ángulo del tronco piramidal a es menor que el ángulo supercrítico (0c).
Para los fluoróforos de la superficie superior 51, la mayor parte de la fluorescencia se emite hacia el medio de alta refracción (n2), es decir, hacia la estructura SAF en la dirección del ángulo crítico.
La estructura SAF mostrada en la figura 8 tiene una forma de tronco piramidal cónico con una superficie superior que comprende sondas de captura inmovilizadas que han capturado un objetivo con fluoróforos 52a o conectadas a ellos. La estructura SAF tiene una altura que sobresale h, un diámetro de la superficie superior tD y un diámetro inferior bD. La estructura SAF forma parte de la parte base 56 en la sección de reacción donde la parte base 56 es relativamente delgada, por ejemplo, como se muestra en las figuras 6a, 6b y 6c. Los fluoróforos 52a se excitan mediante la emisión de luz excitante desde el lado de la parte base, como se indica en la figura 8. Los fluoróforos excitados emiten luz de forma anisótropa en la estructura SAF -que tiene un índice de refracción más alto que la muestra, el aire o el agua en la sección de reacción- con un ángulo superior a un ángulo supercrítico (0c). La luz emitida se colima y puede ser leída por un lector como un círculo de luz.
La figura 9 muestra una variación del cartucho microfluídico. El cartucho microfluídico se ve en una sección transversal a través de la sección de reacción 62 del canal de flujo.
En esta realización, la parte base 66 tiene una sección transversal trapezoidal en ángulo recto que forma una estructura SAF. La parte base 66 tiene una superficie superior que comprende sondas de captura inmovilizadas 62a que han capturado un objetivo con fluoróforos 62a o conectadas a ellos. La parte inferior 66 también comprende bridas 66a fijadas a la lámina 67 para formar el canal de flujo que incluye la sección de reacción 62.
La estructura SAF trapezoidal en ángulo recto tiene una altura que sobresale h, un diámetro de superficie superior tD y un diámetro inferior bD.
Debido a la estructura SAF trapezoidal en ángulo recto, los fluoróforos 62a pueden ser excitados mediante la emisión de luz excitante en la parte central de la estructura SAF trapezoidal en ángulo recto, como se indica con E1. Alternativa o simultáneamente, los fluoróforos 62a pueden ser excitados indirectamente mediante la emisión de luz excitante hacia las paredes laterales 66b de la estructura SAF trapezoidal en ángulo recto, como se indica con E2. La luz excitante emitida es entonces reflejada por las paredes laterales 66b hacia los fluoróforos. La señal de los fluoróforos 62a puede leerse como se indica con R como dos líneas paralelas.
El conjunto emisor-lector mostrado en la FIG. 10 comprende una carcasa 70 que comprende una pluralidad de diodos no mostrados con respectivas longitudes de onda centrales para excitar las respectivas longitudes de onda de los fluoróforos. El conjunto emisor-lector comprende además un haz de fibras emisoras 71 que comprende una pluralidad de fibras ópticas en conexión luminosa con los respectivos diodos para guiar la luz hacia los fluoróforos no mostrados capturados por las sondas de captura en una sección de reacción de un cartucho microfluídico. El haz de fibras emisoras 71 tiene una sección de longitud 72 adyacente a los extremos de salida del emisor 73 de las fibras ópticas desde donde se emite la luz 79.
En la sección de longitud 72, el haz de emisores 71 se fusiona con un haz de fibras lectoras 76, de manera que la sección de longitud es una sección de longitud común de emisores y lectores 72. La sección de longitud común emisor-lector 62 se mantiene unida por un manguito 74. El haz de fibras lectoras 76 comprende una pluralidad de fibras ópticas que tienen extremos de entrada al lector 75 dispuestos para recibir la señal luminosa 79 de los fluoróforos. El haz de fibras lectoras 76 se fija a un conector 77 donde se conecta a una unidad de lectura no mostrada -por ejemplo, un espectroscopio- a través de una guía de ondas 78, por ejemplo, en forma de otro haz de fibras.
Los extremos de salida del emisor 73 y los extremos de entrada del lector 75 están ventajosamente dispuestos en un patrón predeterminado. El patrón predeterminado se selecciona ventajosamente para obtener una alta tasa de excitación y una alta tasa de lectura. Los extremos de salida del emisor 73 están ventajosamente rodeados por los extremos de entrada del lector 75 para asegurar una excitación óptima de los fluoróforos y la lectura de la luz emitida por los fluoróforos.
La figura 11 ilustra la cara emisora y receptora de una unidad emisora y lectora, por ejemplo, los extremos de salida del emisor 73 y los extremos de entrada del lector 75 dispuestos en un patrón predeterminado deseado, donde los extremos de salida del emisor 73 están dispuestos en una parte central y los extremos de entrada del lector 75 rodean los extremos de salida del emisor 73.
La figura 12 ilustra un sistema operador microfluídico adecuado para un sistema de ensayo microfluídico de una realización de la invención. El sistema operador microfluídico comprende preferentemente una ranura para insertar el cartucho microfluídico y comprende el sistema de operación descrito anteriormente preferentemente en combinación con un emisor para excitar fluoróforos y un lector para leer las señales emitidas de los fluoróforos. Las figuras son esquemáticas y simplificadas para mayor claridad. A lo largo de este documento, se utilizan los mismos números de referencia para las partes idénticas o correspondientes.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un sistema de ensayo microfluídico que comprende un cartucho microfluídico (30) y un sistema operador microfluídico asociado (40), dicho cartucho microfluídico comprende una parte de base (16, 26, 46, 56, 66), que tiene una primera cara (16a) y una segunda cara opuesta (16b) y con un rebaje en la primera cara y una lámina (17, 27, 47, 67) fijada a la parte de base (16, 26, 46, 56, 66) para cubrir el rebaje y formar una cara de lámina de dicho cartucho microfluídico, en el que la parte de base con el rebaje y la lámina forman un canal de flujo (1, 11, 21, 31, 41) y un pozo (3, 13, 23, 33, 43), el canal de flujo tiene una longitud y comprende una sección de reacción (2, 12, 22, 32, 42, 62) y un extremo aguas arriba y otro aguas abajo, en el que el pozo (3, 13, 23, 33, 43) está en comunicación de fluidos con el canal de flujo (1, 11, 21, 31, 41) aguas abajo de la sección de reacción (2, 12, 22, 32, 42, 62) y el cartucho microfluídico comprende una abertura de entrada (4, 14, 24, 34, 44) en dicho canal de flujo aguas arriba de la sección de reacción (2, 12, 22, 32, 42, 62),
dicho sistema operador (40) comprende un pistón (29b, 49b), un elemento regulador de la temperatura (28a, 48a) y un actuador (29a, 49a) colocado de tal manera que dicha cara de la lámina de dicho cartucho microfluídico está adaptada para ser colocada en contacto con dicho sistema operador con dicha sección de reacción (2, 12, 22, 32, 42, 62) en proximidad a dicho elemento regulador de temperatura (28a, 48a) mientras que dicho actuador (29a, 49a) está asociado a la sección de pozo para presionar la lámina que cubre dicha sección de pozo (3, 13, 23, 33, 43) y dicho pistón (29b, 49b) está asociado al canal de flujo (1, 11, 21, 31, 41) en una sección de válvula aguas arriba (5, 15, 25, 35) para presionar la lámina y cerrar el canal de flujo (1, 11, 21, 31, 41) aguas arriba de la sección de reacción (2, 12, 22, 32, 42, 62).
2. El sistema de ensayo microfluídico de la reivindicación 1, en el que dicho sistema operador está adaptado para sostener dicho cartucho microfluídico de tal manera que al menos la sección de reacción está inclinada cuando se mantiene cerca de dicho elemento regulador de la temperatura, preferiblemente al menos un eje central (RC) de la sección de reacción está inclinado con respecto a un plano horizontal (H), tal como con un ángulo de inclinación de al menos aproximadamente 3 grados, tal como al menos aproximadamente 5 grados, tal como de aproximadamente 10 a aproximadamente 45 grados, tal como de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 grados.
3. El sistema de ensayo microfluídico de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha abertura de entrada (4, 14, 24, 34, 44) en dicho canal de flujo está dispuesta en dicho extremo aguas arriba, preferentemente dicha abertura de entrada se proporciona mediante un orificio a través de dicha parte de base (16, 26, 46, 56, 66).
4. El sistema de ensayo microfluídico de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha sección de válvula (5, 15, 25, 35) de dicho canal de flujo (1, 11, 21, 31, 41) comprende un asiento de válvula, dicho asiento de válvula comprende preferentemente una estructura de cresta en la primera superficie de la parte de base, en el que la estructura de cresta sobresale de la primera superficie de la parte de base en dicho rebaje y cruza al menos una parte de dicho rebaje, preferentemente dicho pistón comprende una cabeza de pistón, dicha cabeza de pistón está conformada para ser acoplada con dicho rebaje en dicha sección de válvula de dicho canal de flujo para cerrar dicho canal de flujo.
5. El sistema de ensayo microfluídico de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el canal de flujo aguas abajo de la sección de válvula aguas arriba (35, 45) y dicho pozo (23, 33, 43) constituyen un volumen cerrado cuando dicha sección de válvula aguas arriba (35, 45) es cerrada por dicho pistón (29b, 49b), preferentemente dicho canal de flujo comprende una sección de válvula aguas abajo (35a) y dicho sistema operador comprende un pistón asociado para la sección de válvula aguas abajo (35a), preferentemente dicha sección de válvula aguas abajo tiene la misma forma que la sección de válvula aguas arriba.
6. El sistema de ensayo microfluídico de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha sección de reacción (42, 62) comprende sondas de captura (42b, 62b) para un objetivo, estando dichas sondas de captura (42b, 62b) preferentemente inmovilizadas en una superficie dentro de la sección de reacción (42, 62) del canal de flujo (41), como por ejemplo en la lámina (47) y/o en la primera cara de dicha parte de base (46, 56).
7. El sistema de ensayo microfluídico de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha parte de base (46, 56) dentro de dicha sección de reacción (42, 62) comprende al menos un elemento óptico, dicho elemento óptico preferentemente está construido para redirigir y preferentemente colimar la luz emitida desde un fluoróforo (42a, 62a) en las proximidades de la primera cara de dicha parte de base (46, 56), preferentemente dicho elemento óptico comprende sondas de captura para un objetivo inmovilizado en dicha primera cara de dicha parte de base (46, 56), o el sistema de ensayo microfluídico de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha lámina (47) dentro de dicha sección de reacción (42, 62) comprende al menos un elemento óptico, dicho elemento óptico preferentemente está construido para redirigir y preferentemente colimar la luz emitida desde el fluoróforo (42a, 62a) en la proximidad de la lámina (47) dentro de dicha sección de reacción (42, 62), preferentemente dicho elemento óptico comprende sondas de captura para un objetivo inmovilizado en dicha lámina dentro de dicha sección de reacción (42, 62).
8. El sistema de ensayo microfluídico de la reivindicación 7, en el que dicho elemento óptico comprende una estructura de lente y/o una estructura de fluorescencia de ángulo supercrítico (estructura SAF), dicha estructura SAF tiene preferentemente una superficie superior, preferentemente dicha estructura SAF es una parte integrada de la parte base y preferentemente del mismo material que la parte base restante.
9. El sistema de ensayo microfluídico de la reivindicación 8, en el que dicha estructura SAF comprende una forma de tronco piramidal que sobresale hacia la lámina con su superficie superior orientada hacia la lámina, dichas sondas de captura preferentemente están inmovilizadas en dicha superficie superior, dicha superficie superior preferentemente tiene un área de al menos aproximadamente 0,01 mm2, tal como de aproximadamente 0,02 mm2 a aproximadamente 1 mm2, tal como de aproximadamente 0,03 mm2 a aproximadamente 0,8 mm2, tal como de aproximadamente 0,05 mm2 a aproximadamente 0,5 mm2.
10. El sistema de ensayo microfluídico de una cualquiera de las reivindicaciones 8-9, en el que dicha estructura SAF tiene un índice de refracción superior a 1,33, tal como un índice de refracción de al menos aproximadamente 1,4, tal como un índice de refracción de aproximadamente 1,45 a aproximadamente 1,65 y en el que dicha sección de reacción comprende una pluralidad de dichos elementos ópticos, tales como estructuras SAF.
11. El sistema de ensayo microfluídico de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho elemento regulador de la temperatura (28a, 48a) es un elemento termoeléctrico, tal como un elemento Peltier, preferentemente dicho elemento termoeléctrico es operable tanto para enfriar como para calentar en una configuración de tiempo seleccionada.
12. El sistema de ensayo microfluídico de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho sistema operador comprende un sistema informático configurado para controlar el funcionamiento de al menos un elemento operador seleccionado entre dicho(s) pistón(es), dicho elemento regulador de temperatura y dicho actuador, dicho sistema informático comprende preferentemente una memoria que almacena software para controlar el funcionamiento de dicho(s) elemento(s) operador(es).
13. El sistema de ensayo microfluídico de la reivindicación 12, en el que dicho ordenador está programado para llevar a cabo un procedimiento de ensayo, dicho procedimiento de ensayo comprende preferentemente la activación de dicho activador para presionar la lámina que cubre dicha sección de pozo, la activación de dicho activador para liberar al menos parcialmente la lámina que cubre dicha sección de pozo, la activación de dicho pistón para cerrar dicha sección de válvula aguas arriba y la activación del elemento regulador de la temperatura para regular la temperatura de una muestra en la sección de reacción de acuerdo con un plan de temperatura predeterminado.
14. Un procedimiento de realización de un ensayo utilizando un sistema de ensayo microfluídico de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, comprendiendo dicho procedimiento
- aplicar dicho cartucho microfluídico en dicho sistema operador de tal manera que dicha sección de reacción (2, 12, 22, 32, 42, 62) esté en proximidad a dicho elemento regulador de temperatura (28a, 48a) mientras que dicho actuador (29a, 49a) esté asociado a la sección de pozo (3, 13, 23, 33, 43) para presionar la lámina que cubre dicha sección de pozo y dicho pistón (29b, 49b) está asociado al canal de flujo (1, 11, 21, 31, 41) en una sección de válvula aguas arriba (5, 15, 25, 35) para presionar la lámina y cerrar el canal de flujo aguas arriba de la sección de reacción (2, 12, 22, 32, 42, 62);
- activar dicho activador para presionar la lámina que cubre dicha sección del pozo (3, 13, 23, 33, 43) para así presionar el fluido (por ejemplo, gas) fuera del pozo;
- aplicar una muestra en la entrada (4, 14, 24, 34, 44) del canal de flujo;
- activar dicho activador para liberar al menos parcialmente la lámina que cubre dicha sección de pozo (3, 13, 23, 33, 43) para aspirar así la muestra, preferiblemente de forma que la muestra llene al menos parcialmente la sección de reacción;
- activar dicho pistón para cerrar dicha sección de válvula aguas arriba;
- activar dicho activador para presionar la lámina que cubre dicha sección de pozo (3, 13, 23, 33, 43) para aplicar así una presión en la sección de reacción (2, 12, 22, 32, 42, 62) que es mayor de la que habría sido sin la depresión de la lámina; y
- activar el elemento regulador de temperatura (28a, 48a) para regular la temperatura de la muestra en la sección de reacción según un plan de temperatura predeterminado.
15. El procedimiento de realización de un ensayo de la reivindicación 14, en el que el canal de flujo comprende una sección de válvula aguas abajo (35a) situada aguas abajo de dicha sección de reacción (32) y dicho sistema operador comprende un pistón asociado para la sección de válvula aguas abajo (35a), y el procedimiento comprende activar dicho pistón asociado para cerrar dicha sección de válvula aguas abajo, estando dicha sección de válvula aguas abajo cerrada preferentemente después de la aplicación de la presión en la sección de reacción.
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