ES2881453T3 - Procedimiento para la selección de moléculas de unión biológicas - Google Patents

Abstract

Procedimiento para la selección de una molécula de unión biológica, la cual se une específicamente a un receptor de célula B activo de forma autónoma o activado de forma autónoma como receptor objetivo, no, sin embargo, a un receptor de célula B no activo o no activado, en el marco de un sistema basado en células mediante el uso de células B no maduras, las cuales se encuentran en el estadio pro/pre, que comprende los siguientes pasos: (a) puesta a disposición de una pluralidad de anticuerpos o fragmentos activos de los mismos como molécula de unión biológica, que se obtuvieron mediante inmunización de un mamífero con formas solubles preparadas de forma recombinante de receptores de célula B, así como posterior inmortalización y purificación; (b) puesta a disposición de células B no maduras en el estadio pro/pre, que no son capaces de expresar los genes nativos para RAG2 y/o RAG1, así como Lambda5, pero que se capacitaron para expresar receptores de células B activos de forma autónoma o activados de forma autónoma como receptores objetivo en su superficie celular; (c) puesta a disposición de células B no maduras en el estadio pro/pre, que no son capaces de expresar los genes nativos para RAG2 y/o RAG1, así como Lambda5, pero que se capacitaron para expresar receptores de células B no activos o no activados como receptores de referencia en su superficie celular; (d) examen comparativo del comportamiento de unión de las moléculas de unión puestas a disposición de acuerdo con el paso (a) con respecto a células, las cuales se ponen a disposición de acuerdo con los pasos (b) y (c); (e) selección de al menos una molécula de unión, la cual se une específicamente a células puestas a disposición de acuerdo con el paso (b), sin embargo, no, a células puestas a disposición de acuerdo con el paso (c).

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimiento para la selección de moléculas de unión biológicas

La presente invención se refiere al ámbito de la preparación, identificación y selección de moléculas de unión biológicas, como en particular de anticuerpos y fragmentos de los mismos, que se unen selectivamente a receptores de células B o complejos de receptores de células B activados.

Como receptor (del latín recipere, alojar o, recibir') se denomina en la bioquímica una proteína o un complejo de proteínas, cuando pueden unirse a él moléculas señalizadoras, las cuales, a través del acontecimiento de unión, pueden dar lugar en el interior de la célula a procesos de señalización. Un receptor puede recibir señales desde el exterior y encontrarse en la superficie de una biomembrana, o ser detectable en el citosol de una célula. Los receptores tienen un punto de unión específico para su agonista o antagonista fisiológico (parte de unión, ligando).

Los receptores de membrana se encuentran en la superficie de biomembranas y consisten en proteínas, las cuales están provistas, a menudo, de modificaciones (por ejemplo, cadenas de hidratos de carbono). Tienen una determinada forma para moléculas pequeñas, llamados ligandos, o para partes de moléculas más grandes, que se unen a la estructura de receptor, en cuanto que complementan ésta como estructura complementaria (denominado a modo de simplificación como 'principio llave-cerradura').

Los receptores pueden servir de este modo para el alojamiento y transmisión de señales (transducción de señales), o participar funcionalmente en la cohesión de células (adhesión celular), o en el transporte de sustancias hacia la célula (transporte de membrana). Pueden ofrecer, además de ello, a viriones la posibilidad de acoplarse a la célula hospedadora correspondiente e infectarla.

Forman parte de los receptores de membrana importantes para contacto celular, tanto moléculas de adhesión de células, que transmiten los contactos célula-célula, como las cadherinas, selectinas e inmunoglobulinas, como también aquellas, que participan en la formación de contactos de célula-matriz y anclan las células a la matriz extracelular, como las integrinas.

Los receptores de membrana no se presentan únicamente en la membrana de plasma, sino también en biomembranas de los organelos del interior de las células. Mientras que los receptores de membrana celular que se encuentran por el exterior relacionan la célula con el espacio exterior como su entorno, en el interior de la célula se relacionan organelos individuales a través de receptores con el citoplasma, citoesqueleto o entre sí.

Los receptores en la membrana celular se dividen en dependencia de su modo de actuación en receptores ionotrópicos y metabotrópicos.

Los receptores ionotrópicos representan canales de iones, los cuales, durante unión de un ligando adecuado, se abren con probabilidad más alta y debido a ello modifican la capacidad de conducción de la membrana.

Los receptores metabotrópicos, por el contrario, no forman canales o poros, sino que activan durante unión de su ligando un "segundo mensajero" postconectado (por ejemplo, una proteína G o una proteína quinasa) y modulan de este modo cascadas de señales intracelulares mediante modificaciones de concentración de sustancias mensajeras secundarias, lo cual puede conducir, no obstante también, indirectamente a una modificación de la permeabilidad de membrana.

Para muchos receptores existen ligandos naturales, los cuales conducen a la activación de estos receptores y dan lugar a una cascada de 'segundos mensajeros'. Además de ligandos naturales existen también sustancias, las cuales se unen al receptor y, o bien, activan el mismo (agonistas) o lo inactivan (antagonistas). Son ejemplos de agonistas de receptor, por ejemplo, antígenos, incluidos alérgenos, opiáceos, nicotina, salbutamol, muscarina, citoquinas y neurotransmisores.

Un receptor especial en este sentido lo representa el receptor de célula B o complejo de receptores de célula B (BCR). Este BCR es expresado por las células B y representa en cierto sentido un anticuerpo ligado a membrana. El BCR se forma en gran variedad en células B en maduración.

El desarrollo de las células B se produce en el humano y también en algunos otros mamíferos en la médula ósea o en el hígado fetal. Las señales, las cuales son necesarias para el programa de desarrollo, obtienen los linfocitos en desarrollo de llamadas células estromales. Durante el desarrollo de células B es de decisiva importancia la formación de un receptor de célula B que funciona (la forma ligada a membrana del 'anticuerpo'). Solo con este receptor de antígeno las células B maduras serán capaces posteriormente, de reconocer antígenos extraños y de unirlos a través de la formación de correspondientes anticuerpos a estructuras hostiles. La especificidad de antígenos del receptor está determinada por la conexión de determinados segmentos de gen. Los segmentos se llaman segmentos V, D y J, debido a lo cual el proceso se denomina como recombinación V(D)J. A este respecto, estos segmentos, los cuales forman la parte de unión de antígeno del receptor de célula B, se reordenan. La totalidad del receptor consiste en dos cadenas de proteínas ligeras idénticas y en dos cadenas de proteínas pesadas idénticas, estando conectadas entre sí las cadenas pesadas con las ligeras respectivamente a través de puentes disulfuro. En el caso de la recombinación VDJ se conectan en primer lugar los segmentos V, D y J de la cadena pesada del receptor de célula B, tras ello los segmentos V y J de la cadena de receptores ligera. Únicamente cuando los genes se reordenan a este respecto de forma exitosa, lo cual se denomina como reordenación de genes productiva, la célula puede pasar al respectivamente siguiente paso de desarrollo.

Las células B, las cuales reaccionan durante su maduración en la médula ósea a antígenos propios del cuerpo, mueren en la mayoría de los casos debido a apoptosis. En la sangre de personas sanas pueden determinarse pequeñas cantidades de células autorreactivas, entre otros, contra tiroglobulina o también colágeno (Abul K. Abbas: Diseases of Immunity in Vinay Kumar, Abul K. Abbas, Nelson Fausto: Robbins and Cotran - Pathologic Basis of Disease. 7a edición. Filadelfia 2005, página 224 y siguientes).

En caso de generarse anticuerpos contra receptores, entonces, por regla general, se inmunizan animales con el receptor (purificado, clonado o como fragmentos de péptidos) y se generan células hibridoma. Estas células hibridoma producen anticuerpos, los cuales se examinan entonces mediante ELISA o mediante receptores expresados en sistemas celulares. Para ello se usan líneas celulares establecidas convencionalmente, dado que únicamente éstas pueden cultivarse fácilmente. A este respecto pueden generarse anticuerpos, los cuales se unen de modo relativamente específico a un tipo de receptor determinado (por ejemplo, Anti-IgGl, Anti-IgE). En este sentido se producen, no obstante, a menudo reacciones cruzadas con otros receptores u otros epítopos.

Para un uso terapéutico de anticuerpos BCR generalmente no es suficiente usar en general únicamente un único anticuerpo contra el BCR, dado que un uso de banda ancha puede dar lugar a notables efectos secundarios. Sería deseable más bien, poner a disposición un anticuerpo, el cual se una selectivamente a un receptor, el cual presente una activación (patofisiológica) como, en particular, una activación autónoma. Un anticuerpo de este tipo no se conoce en el estado de la técnica y un procedimiento para su preparación u obtención mediante selección no existe.

El objetivo de la invención se encuentra, por lo tanto, en la puesta a disposición de un sistema para la preparación u obtención e identificación o selección de moléculas de unión biológicas, como en particular de anticuerpos o fragmentos funcionales de los mismos, que se unen selectivamente a BCR, que están activadas de forma autónoma o que se encuentran en un estado activado de forma autónoma. En este sentido es importante que los receptores o complejos de receptores, que se usan para la selección, presenten un plegado correcto y de este modo sean funcionales.

El objetivo se resuelve mediante la puesta a disposición de un procedimiento de acuerdo con la reivindicación principal. Formas de realización preferentes son objeto de correspondientes reivindicaciones secundarias.

Antes de que se haga referencia detallada a los aspectos individuales de la presente invención, se realiza una aclaración de conceptos importantes, los cuales se usan en el marco de la presente descripción.

Con "moléculas de unión biológicas" se entienden en el presente caso anticuerpos o sus fragmentos activos. Ventajosamente, y debido a ello preferentemente, un anticuerpo de este tipo está seleccionado del grupo consistente en un anticuerpo IgG, un anticuerpo IgM, un anticuerpo IgG humanizado, y un anticuerpo humano, en el cual está integrada la secuencia de reconocimiento del epítopo. Una molécula de unión de este tipo puede estar también puesta a disposición en forma de un fragmento funcional de la totalidad del anticuerpo, por ejemplo, como fragmento Fab. Para usos diagnósticos la molécula de unión puede comprender marcas detectables, como en particular uno o varios tintes fluorescentes.

El objetivo del complejo de células B (BCR) sobre la superficie de una célula B es detectar patógenos y unirlos. Tal como ya se ha mencionado, esta unión conduce a una modificación de conformación del BCR, debido a lo cual se produce una cascada de señales, que conduce finalmente a una activación de la célula B. Dado que el proceso de la generación de un BCR de este tipo se basa en un ensamblaje aleatorio de segmentos de genes, puede ocurrir que el BCR de nueva formación reconozca de forma indeseada estructuras propias del cuerpo y de este modo se "active de forma permanente". Para evitar la aparición de un BCR "activo o activado permanentemente de este modo", existen diferentes mecanismos de protección propios de cuerpo. En caso de superarse éstos, no obstante, debido a una modificación patológica de la célula B en desarrollo, puede desarrollarse a partir de ello una patología maligna o también de manifestación autoinmune.

En el caso de un BCR "activo de forma autónoma" o "activado de forma autónoma" se trata, por el contrario, de un tipo especial de un BCR activo de forma permanente. Mientras que la activación convencional parte de un antígeno externo (véase arriba), el BCR activo de forma autónoma resulta de su interacción con estructuras de membrana en la superficie de la misma célula. Para el cuadro clínico de la leucemia linfocítica crónica (CLL) pudo mostrarse una interacción entre BCR, que se encontraban adyacentes entre sí sobre la superficie de la misma célula, que da lugar a la activación autónoma (M. Dühren-von Minden et. al; Nature 2012). Otro ejemplo de un BCR activo de forma autónoma lo representa el pre-BCR, que durante el desarrollo de una célula B se expresa como verificación de desarrollo. Además de la interacción de receptores adyacentes (BCR:BCR), también puede conducir, no obstante, una interacción entre receptor y una proteína de membrana (BCR:proteína de membrana) a un BCR activo o activado de forma autónoma.

Procedimientos para la selección de anticuerpos monoclonales, que se unen específicamente al pre-BCR humano, ya son conocidos como tales (Tsuganezawa K. et al., "Flow cytometric diagnosis of the cell lineage and developmental stage of acute lymphoblastic leukemia by novel monoclonal antibodies specific to human pre-B-cell receptor", Blood, American Society of Hematology, US, volumen 92, número 11, páginas 4317-4324 (1998); EP 1001 020 A1 (2000)).

La solución de acuerdo con la invención de los problemas en lo que se refiere a la puesta a disposición de una molécula de unión biológica, como en particular de un anticuerpo o de un fragmento funcional del mismo con, en comparación anticuerpos convencionales, una especificidad selectiva con respecto a receptores de células B u complejos de receptores de células B activos o activados de forma autónoma (BCR) se basa en el sorprendente hallazgo de que sobre células tumorales de pacientes con leucemia linfocítica crónica (CLL) se encuentran receptores de células B, que son activos de forma autónoma, y que estos receptores activos de forma autónoma se caracterizan debido a la presencia de epítopos comunes, los cuales no pueden ser detectados en correspondientes receptores de células sanas del mismo paciente. Estas células pueden de este modo, debido a la presencia de receptores de células B activas de forma autónoma, que se caracterizan por la presencia de los epítopos mencionados arriba, detectarse y tratarse específicamente a través de un anticuerpo, de modo que células B sanas sin esta característica no se ven afectadas debido a ello, debido a lo cual el tratamiento puede llevarse a cabo de forma claramente más específica y con menos efectos no deseados.

En el marco de los numerosos experimentos llevados a cabo para la presente invención pudo verse, no obstante de modo sorprendente, que anticuerpos con particular especificidad para estas zonas de receptor modificadas (epítopos) no pueden prepararse ni seleccionarse con métodos estándar habituales. Solo una vez que las condiciones experimentales se adaptaron de tal modo que en el marco de estudios de unión se usaron células modificadas genéticamente, cuyos receptores de células B modificados se encontraban en un estado nativo y activado, pudieron obtenerse anticuerpos adecuados con la especificidad deseada y requerida. Dicho con otras palabras, es de importancia esencial para las soluciones propuestas de acuerdo con la invención, que las células usadas en estudios de unión para la selección de anticuerpos profilácticos o terapéuticos, así como diagnósticos adecuados, presenten sus zonas modificadas (epítopos) en forma principalmente nativa y activada. En este sentido pudo verse que las llamadas células pro/pre B son particularmente adecuadas debido a su constitución fisiológica. La puesta a disposición de anticuerpos y fragmentos funcionales de los mismos con una especificidad tal, que disponen igualmente de este comportamiento de unión específico, permite de este modo un tratamiento específico de tumor, que se caracteriza por un éxito de tratamiento claramente mejorado y, gracias a la reducción de efectos sistémicos indeseados, un éxito terapéutico claramente aumentado. En el marco de usos diagnósticos, la posibilidad del uso de este tipo de anticuerpos específicos significa un análisis mucho más preciso con una significación mucho mayor en lo que se refiere a la evaluación de un estado a evaluar de un paciente.

Tal como ya se ha mencionado, se pone a disposición mediante la presente invención un procedimiento para la preparación (identificación y selección) de moléculas de unión biológicas en forma de anticuerpos o fragmentos funcionales de los mismos, uniéndose las moléculas de unión selectivamente a determinados epítopos de receptores o complejos de receptores unidos a la membrana activos de forma autónoma de células B.

Se conocen dos variantes (subconjunto 2; subconjunto 4) del BCR activo de forma autónoma, que se diferencian entre sí en lo que se refiere a su respectivo motivo (epítopo) molecular caracterizador (Minici, C. et al., Distinct homotypic B-cell receptor interactions shape the outcome of chronic lymphocytic leukaemia, Nature Comm. (2017)). Ambas variantes presentan diferentes secuencias de aminoácidos, que son respectivamente específicas para estas variantes. Para el experto es conocido que además de los subconjuntos indicados, son activos de forma autónoma también otros receptores de células B. La zona del subconjunto 2 decisiva para la funcionalidad activa de forma autónoma del receptor, se caracteriza en este sentido por las secuencias de aminoácidos KLTVLRQPKA (SEQ ID NO. 1) y VAPGKTAR (SEQ ID NO. 2) de la cadena ligera, mientras que la zona del subconjunto 4 decisiva para la funcionalidad activa de forma autónoma del receptor, se define por las secuencias de aminoácidos PTIRRYYYYG (SEQ ID NO. 3) y NHKPSNTKV (SEQ ID NO. 4) de la parte variable de la cadena pesada. Las secuencias usadas para la generación de los anticuerpos murinos en el marco de la inmunización para los subconjuntos 2 y 4 se indican en las SEQ ID NOS.

5 y 6 (vHC; LC) o 7 y 8 (vHC; LC). En aras de la exhaustividad se indica en SEQ ID n O. 17 (VSSASTKG) otra secuencia objetivo u otro epítopo con especificidad para la parte variable de la cadena pesada de un BCR del subconjunto 4. Además de las secuencias objetivo (epítopos) responsables de la configuración del estado activo de forma autónoma del BCR (subconjunto 4) de acuerdo con SEQ ID NOS. 3 y 4, la secuencia de acuerdo con SEQ ID NO. 17 representa de este modo otra propiedad característica de este subconjunto.

Cabe señalar que encontrar y caracterizar los subconjuntos 2 y 4, como dos variantes del receptor de células B en el paciente con desarrollo de patología crítico, se basa en el examen de numerosos estudios de caso individual y no significa, por lo tanto, que en otra posible pluralidad de otros subtipos del BCR no se presenten las mismas secuencias objetivo (epítopos) que caracterizan en el presente caso los dos subtipos conocidos y se correlacionen con un desarrollo de patología grave.

A pesar de que anticuerpos contra ambos de estos subconjuntos básicamente pueden generarse con métodos estándar, por ejemplo, en ratones, pudo observarse sorprendentemente que una inmunización mediante el uso de péptidos no condujo a la formación del anticuerpo específico deseado. Tampoco la inmunización mediante el uso de cadenas individuales del receptor, como, por ejemplo, el uso de la cadena ligera, que comprende las zonas de secuencia modificadas, del BCR, dio lugar al éxito deseado, debido a lo cual los ratones finalmente se inmunizaron con la forma soluble de preparación recombinante del BCR (compárese SEQ ID NOS. 5 y 6). De estos ratones pudieron obtenerse a continuación células inmunes con la especificidad deseada y transformarse mediante fusión celular en células hibridoma. En este sentido pudo verse, sin embargo, sorprendentemente que los anticuerpos activos no pudieron identificarse mediante pruebas ELISA u otros procedimientos estándar. Los clones identificados en un primer paso mediante ELISA como potenciales partes de unión resultaron, no obstante, tras la selección, o bien de unión no específica o de no unión al receptor activo de forma autónoma (incluidas las SEQ ID NOS. 1 y 2) y por lo tanto tuvieron que desecharse.

Los procedimientos usados hasta el momento de este descubrimiento comprendían no solo métodos estándar como ELISA y SPR, sino también la expresión intracelular en fibroblastos con una coloración FACS intracelular como control de unión.

Tras laboriosas series de pruebas adicionales pudo mostrarse que una selección exitosa de moléculas de unión adecuadas de acuerdo con la invención no puede llevarse a cabo ni con receptores libres o sus fragmentos ni con fragmentos de receptor unidos a la membrana o intracelulares. En lugar de ello pudo observarse que la selección resultó únicamente mediante el uso de un sistema celular, en cuyo marco se presentó el receptor de células B unido a la membrana completo y funcional. A este respecto es de gran importancia que el BCR se presente o sea presentado con sus zonas modificadas (epítopos) en o sobre las células activo de forma autónoma. Solo con este modo de proceder, cuyas condiciones reproducen un escenario in situ en gran parte fisiológico-nativo, pudo identificarse un anticuerpo, el cual se une de modo altamente específico y de forma selectiva únicamente a las células tumorales, es decir, a las células B, las cuales expresan un BCR con un epítopo sobre su membrana celular, que es característico para el subconjunto-2 o subconjunto-4 de este tipo celular, sin embargo no a otras células B o sus receptores (BCR), las cuales no representan de acuerdo con la invención ningunas células B de los subconjuntos 2 o 4. Dicho con otras palabras, la molécula de unión encontrada de acuerdo con la invención se une selectivamente a receptores de célula B activos de forma autónoma, que se caracterizan por la presencia de dominios estructurales o epítopos (secuencias objetivo) y dan lugar al estado activado de forma autónoma de los receptores de células B. El comportamiento de unión selectivo de la molécula de unión de acuerdo con la invención significa que no se une a receptores u otras estructuras de membrana de células B, que no presentan ningún dominio estructural o ningún epítopo, que dan lugar al estado activo de forma autónoma de las células B. De este modo la molécula de unión propuesta de acuerdo con la invención para el uso no se une selectivamente a secuencias objetivo del receptor de célula B, las cuales no son características del subconjunto 2 o del subconjunto 4, y en particular no con un receptor de célula B, el cual no presenta ninguna de las secuencias SEQ ID NOS. 1, 2, 3 y/o 4.

Pudo mostrarse además de ello que el uso de células pro/pre B detenidas, las cuales se obtuvieron a partir de ratones 'Triple Knockout' (TKO), se adecuan particularmente bien a pesar del difícil manejo y de la laboriosa obtención, para expresar estos receptores y parar usarse en el marco de un sistema de prueba para la identificación de estos receptores. El estado de las células pro/pre B está configurado naturalmente para llevar a cabo la maduración y selección de los BCR, y las células de este estado son particularmente adecuadas debido a su configuración de enzimas (chaperonas, etc.), para plegar correctamente también componentes de BCR "difíciles" y representarlos en su superficie de forma lo suficientemente fisiológica-nativa. Mediante las siguientes deleciones (Knockouts) representadas se evita que mediante una recombinación o el uso de la cadena ligera sustituta ("surrogate light chain") se produzca una modificación del BCR deseado. Mediante el uso de estas células o de este tipo de células de células pro/pre B para la expresión y presentación de BCR en el marco de una selección de anticuerpos con comportamiento de unión específico de selección con respecto a receptores de célula B activos o activados de forma autónoma se pone a disposición una plataforma de selección, la cual, en comparación con los sistemas usados convencionalmente para la selección en el estado de la técnica se caracterizan por una calidad mucho más alta, que justifica el alto esfuerzo del uso de células TKO primarias o su cultivo durante unos pocos pasajes.

Estas células presentan como particularidad las siguientes inactivaciones en su genoma:

- la inactivación de RAG2 evita la recombinación somática de cadenas de inmunoglobulinas pesadas y ligeras propias, debido a lo cual la formación endógena de un BCR queda excluida. Esto conduce a una detención, a un bloqueo o enfriamiento de células B correspondientemente tratadas en este estadio de desarrollo. Es conocido que RAG1 y RAG2 forman un complejo, el cual posibilita el reagrupamiento de VDJ, debido a lo cual una inactivación de RAG1 representa un medio de igual actuación y de este modo una alternativa a la inactivación de RAG2 y queda incluida en la enseñanza de acuerdo con la invención.

- La detección de Lambda5, una parte de la cadena ligera sustituta, evita la formación de un pre-BCR. Dado que el pre-BCR está activo de forma autónoma, esto perturbaría la detección de un receptor activo de forma autónoma. Dado que en este caso se clona un nuevo BCR en la célula, no es deseable un pre-BCR, dado que este aparecería con la cadena pesada (HC) indeseada en unión con la cadena ligera sustituta indeseada en la superficie y perturbaría la selección.

- la inactivación de SLP65, una proteína de adaptación de importancia central en el recorrido de señal de BCR, evita la activación de la célula mediante un BCR dado el caso reconstruido.

La combinación de las inactivaciones de RAG2 o RAG1 y Lambda5 conduce a un bloqueo en el paso del estadio de célula pro-B al estadio de célula pre-B, que se caracteriza clásicamente con el reordenamiento inicial de los segmentos VDJ de la cadena pesada (HC). Por esta razón se trata de células pro/pre-B.

Para la expresión del BCR y selección del anticuerpo adecuado es suficiente la inactivación de RAG2 o RAG1 y Lambda5. Mediante la reconstitución con el SLP65 inducible puede medirse la actividad del BCR. Dado que se seleccionan BCR activos de forma autónoma, este paso es una forma de realización preferente de la invención. El método de la selección en este sentido es la medición del flujo de Ca tras inducción del SLP65 mediante análisis FACS y el uso de un agente colorante dependiente de Ca2+ como Indo-1. Estos métodos son conocidos por el experto (véase ((M. Dühren-von Minden et. al; Nature 2012).

A través de las dos primeras inactivaciones se aseguró que se expresa únicamente el "BCR of Interest" (BCR de interés) en la superficie. Mediante el uso de un SLP65 inducible, con el cual se reconstituyeron las células, puede caracterizarse además de ello la función de los BCR expresados y de este modo verificarse el estado activo de forma autónoma en la superficie antes de la selección.

Tras la selección descrita anteriormente de células hibridoma adecuadas pudieron obtenerse los anticuerpos adecuados para fines diagnósticos, profilácticos y/o terapéuticos, en forma de anticuerpos monoclonales en grandes cantidades. Mediante secuenciación del ADN de estas células pudo determinarse el punto de unión del anticuerpo (compárese SEQ ID NOS. 9 y 10). Dichos procedimientos son conocidos por el experto y están disponibles también comercialmente. En este sentido es ventajoso, cuando se obtiene una gran cantidad de células hibridoma y se seleccionan aquellas con la mejor actividad de unión (especificidad e intensidad/afinidad de unión).

Mediante la información genética obtenida de este modo, sobre el punto de unión, se incorporó la secuencia de codificación para este fin en un plásmido de expresión con el ADN de una secuencia de anticuerpos humana, para generar por la vía habitual de la recombinación un anticuerpo monoclonal humanizado con la especificidad deseada. Estos anticuerpos humanizados mostraron debido a su especificidad única un efecto profiláctico y terapéutico mejor en comparación con sustancias activas convencionales con efectos no deseados comparativamente muy reducidos. Para el experto queda claro que estos anticuerpos humanizados pueden prepararse por vía biotecnológica en grandes cantidades. Para la purificación de los anticuerpos sintéticos pueden usarse procedimientos estandarizados, como, por ejemplo, combinaciones de precipitación, filtración y cromatografía, lo cual es suficientemente conocido por el experto, se debe tener cuidado de no desnaturalizar los anticuerpos y eliminar cuantitativamente posibles sustancias extrañas como, por ejemplo, proteínas, pirógenos y toxinas.

Preferentemente se expresan los anticuerpos deseados en sistemas, en los cuales el anticuerpo experimenta una glicosilación, como en particular una glicosilación humana. Este tipo de sistemas son lo suficientemente conocidos por el experto e incluyen el uso de células de insectos (células S2), células de mamíferos (células CHO) y, de manera particularmente preferente, células humanas, como por ejemplo, células del tipo HEK293T.

El anticuerpo lo suficientemente purificado puede ser en sí ya eficaz terapéuticamente, siempre y cuando presente un isotipo, el cual dé lugar a una respuesta inmune específica, como, por ejemplo, un subtipo IgG, que conduce a través de receptores Fc a una respuesta inmune contra el tumor.

El anticuerpo puede presentarse también, no obstante, como fragmento. A este respecto es importante que el punto de unión de antígeno se presente en el fragmento, es decir, que se trate de un fragmento funcional. Este tipo de fragmentos pueden prepararse, por ejemplo, mediante tratamiento de proteasa como fragmentos F(ab). Dado que estos fragmentos están truncados en la parte constante del anticuerpo, es ventajoso en este caso en el marco de los usos profilácticos o terapéuticos, incorporar una molécula efectora para matar neoplasias.

Aspectos individuales de la presente invención se explican a continuación con mayor detalle mediante ejemplos. Antes de que se presenten explicaciones detalladas relativas al modo de proceder experimental, se remite a las siguientes explicaciones.

La preparación e identificación de anticuerpos, que se unen selectivamente a los receptores de célula B modificados, estaba caracterizada por grandes e imprevisibles problemas. La generación de hibridomas se produjo mediante métodos estándar. El sobrenadante de los grupos de hibridomas se combinó y se examinó en busca de acontecimientos de unión positivos mediante ELISA (receptores de célula B solubles en la placa ELISA). Las mezclas positivas se individualizaron y se examinaron los clones individuales. A este respecto en el ELISA sorprendentemente ya no se identificaron clones positivos. Las señales ELISA positivas de las mezclas resultaron posteriormente como uniones no específicas.

Para lograr mejores epítopos para la detección de los anticuerpos, se expresó ahora la cadena ligera del BCR en fibroblastos. Esto debería garantizar el plegado correcto de la proteína, la cual porta el motivo (epítopo) responsable de la señal autónoma. Con estas células se llevaron a cabo análisis FACS intracelulares. No pudo identificarse ningún clon positivo (anticuerpo).

Por este motivo se modificaron en otro experimento células RAMOS (línea celular de linfoma de Burkitt humano), de modo que éstas presentaron BCR funcionales modificados. De este modo debería garantizarse la biosíntesis completa correcta, plegado y modificación del BCR. Para ello, se eliminó el BCR de la propia célula usando CRISPR y luego se reconstituyó el BCR deseado usando biología molecular (electroporación de vectores CMV). Estas células se usaron para examinar acontecimientos de unión positivos. Tampoco en este caso pudo comprobarse mediante FACS ningún clon positivo.

Sorprendentemente, el uso de células (células pro/pre B detenidas) TKO murinas ('Triple Knock-out'), en las que se introdujo el BCR deseado utilizando un transbordador de genes, trajo, por el contrario, un clon positivo. Y todo esto a pesar de que el sistema celular humano no podía garantizar esto.

La expresión del BCR se determinó mediante anticuerpos anti-IgM y anti-LC en FACS. Para ello se retiraron algunas células y se tiñeron con respectivamente 5pl de anticuerpos en un volumen total de 100|jl en PBS.

Con estas células como "objetivo" se logró ahora mediante FACS, identificar en un anticuerpo, el cual se une específicamente a la zona modificada, por la cual se justifica y caracteriza la activación permanente del BCR. ¡Y esto a pesar de que una unión al mismo tipo de receptor en células RAMOS no tuvo éxito!

Para ello se incubaron las células, las cuales portaban el BCR deseado en la superficie, en primer lugar con los sobrenadantes mezclados, y tras algunos pasos de lavado se detectaron los anticuerpos unidos mediante anticuerpos secundarios. Para una selección específica se usaron células TKO, las cuales expresaron diferentes versiones del BCR deseado. La matriz de selección representada en la figura 1 es un ejemplo de la selección de un subconjunto 2 de CLL de BCR y sirvió para la identificación y selección de clones positivos. Para la identificación más sencilla se mezclaron y midieron los sobrenadantes de los hibridomas. Los grupos, los cuales mostraron una unión, se individualizaron, y se examinaron los sobrenadantes de los respectivos hibridomas en lo que se refiere a unión. La confirmación de que el anticuerpo seleccionado se une específicamente al BCR modificado y no a otras variantes de BCR, se produjo mediante dos pruebas en blanco, es decir, con células sin BCR (véase la figura 1 A), así como con células con Non-CLL-BCR (véase la figura 1 E). Las células B primarias de la sangre de pacientes con leucemia se examinaron mediante FACS en lo que se refiere a unión. El anticuerpo seleccionado fue capaz de identificar específicamente aquellos BCR, los cuales presentaban la estructura objetivo. Esto se confirmó en el plano genómico. Las muestras sin esta estructura objetivo no presentaron unión ninguna.

La invención se explica a continuación con más detalle mediante ejemplos teniéndose en consideración la figura 1. Ejemplo 1

El punto de partida para la preparación de células de Triple-Knockout (TKO) lo forman ratones transgénicos, los cuales presentaron una respectiva inactivación para los genes Lambda5, RAG2 y SLP65 (Dühren von Minden et al., 2012, Nature 489, p309-313). La creación de tales ratones es conocida por el experto y pertenece al estado de la técnica. Para la obtención de las células se extrajo a los ratones una vez muertos la médula ósea de los huesos del muslo. Las células obtenidas de este modo se llevaron a continuación a cultivo en condiciones, las cuales favorecen la supervivencia de células pro/pre B (37 °C, 7,5 % CO2, medio de Iscoves, 10 % FCS, P/S, IL7 murino). Tras varias pasadas se llevó a cabo para el control una clasificación FACS, que clasifica células pro/pre B y a continuación se llevaron de nuevo a cultivo. Los marcadores usados para ello son conocidos por el experto.

Para la reconstitución con un BCR de interés se sintetizaron las correspondientes secuencias de codificación para las cadenas pesadas (HC) y ligeras (LC) y se clonaron entonces respectivamente en un vector de expresión presentando un promotor CMV. Estas se introdujeron en la línea celular de empaquetamiento (línea celular Phoenix) mediante lipofección. Tras una incubación de 36 horas de duración se retiró el sobrenadante de virus y se usó para una infección por espín de las TKO. Tanto los trabajos para la obtención de los sobrenadantes, como también la infección por espín de las TKO son métodos bien conocidos y conocidos por el experto.

Las particularidades estructurales de receptores de célula B de subconjunto-2 se desprenden de la correspondiente bibliografía (véase arriba). Subconjuntos 2 de CLL ejemplares VH y segmentos de ADN LC completos fueron sintetizados por un fabricante contratado usando un método estándar. A continuación, estos se fusionaron con un segmento constante de IgG1 murino mediante PCR y se clonaron en un vector CMV. La secuencia del vector terminado se confirmó mediante secuenciación Sanger.

Subconjunto 2 de CLL VH (SEQ ID NO. 5):

EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFRSYSMNWVRQAPGKGLEWVSSIISSSSYIYYAD

SVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARDQNAMDVWGQGTTVTVSS

Subconjunto 2 de CLL LC (SEQ ID NO. 6):

SYELTQPPSVSVAPGKTARITCAGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVTYYDSDRPSGIPERFS

GSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSGSDHPWVFGGGTKLTVLRQPKAAPSVTLFPPS

SEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPE

QWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS

Para la expresión del subconjunto 2 de CLL IgG1 se utilizó un sistema de expresión celular humano basado en células HEK293T. Para la transfección se utilizó un protocolo basado en polietilenimina (PEI). Tras varias pasadas se mezcló el sobrenadante y se purificó el medio contenido en el sobrenadante de células reunido usando columnas de proteína G. La pureza y la calidad de la IgG1 del subconjunto-2 soluble se determinaron mediante electrotransferencia.

La producción de anticuerpos monoclonales se llevó a cabo según el procedimiento estándar en ratones y la posterior generación de células hibridoma. La selección de clones positivos no se llevó a cabo usando ELISA como es convencional. Dado que se trata en el caso de la estructura objetivo de un receptor unido a la membrana, es de particular importancia, validar la unión de los potenciales anticuerpos también en un sistema celular, es decir, con una extensa conservación de los estados fisiológicos celulares nativos para ese tipo celular. Se examinaron en primer lugar grupos de sobrenadantes mezclados mediante análisis FACS en busca de acontecimientos de unión. Para ello se expresaron diferentes variantes de BCR de subconjunto 2 de CLL en la superficie de una línea celular (TKO), que no puede expresar por sí misma ningún BCR. De este modo pudieron identificarse en primer lugar los sobrenadantes, cuyos anticuerpos mostraron una unión. A continuación se examinaron los sobrenadantes de los clones de hibridoma individuales en lo que se refiere a su unión con mayor detalle, para identificar de este modo clones altamente específicos con alta afinidad.

Para el procedimiento de selección, se utilizaron en el marco de la anterior transformación diferentes vectores para las siguientes combinaciones de cadena pesada (HC) y cadena ligera (LC) de los correspondientes CLL-BCR, usándose estas combinaciones en la superficie del sistema de reconstitución de BCR:

• control (vector de transformación sin BCR) (véase Fig.1 A)

• vector con HC / LC típico para el subconjunto 2 de CLL (véase la Fig. 1 B)

• vector con un no HC para el subconjunto 2 de CLL / con LC típico para el subconjunto 2 de CLL (sin motivo objetivo; epítopo) (véase la Fig. 1 C)

• vector con HC típico para el subconjunto 2 de CLL / un no LC para el subconjunto 2 de CLL (véase la Fig. 1 D)

• vector con un no HC para el subconjunto 2 de CLL / un no LC para el subconjunto 2 de CLL (véase la Fig. 1 E)

• vector con HC / LC típico para el subconjunto 2 de CLL (incluida mutación R110G (motivo objetivo)) (véase la Fig. 1 F).

Este modo de proceder de la selección se ilustra en la figura 1 esquemáticamente en el ejemplo de los BCR de subconjunto 2 de CLL, refiriéndose la denominación 'TKO' a células TKO (véase arriba).

En la ronda 1 de selección, los sobrenadantes de varios clones se combinaron y examinaron con respecto a su perfil de unión a la matriz de selección. Se da un perfil de unión positivo cuando se muestra una unión específica al "BCR-of-Interest" (BCR de interés). Los grupos, los cuales mostraron un perfil de este tipo, se individualizaron, y el perfil de unión de los clones individuales se caracterizó en el marco de una segunda ronda de selección de nuevo en la matriz de selección. La unión de los anticuerpos monoclonales se verificó mediante el uso de un ensayo de unión FACS usando un anticuerpo anti-IgG de ratón marcado con fluorescencia. Indican: A) ningún BCR (control); B) un BCR tópico de subconjunto2 de CLL; C) un BCR con cadena pesada arbitraria y una cadena ligera típica de subconjunto2 de CLL; D) un BCR con una cadena pesada típica de subconjunto2 de CLL y una cadena ligera arbitraria; E) un BCR con cadena pesada arbitraria y una cadena ligera (control; no BCR típico de subconjunto2 de CLL); F) un BCR típico de subconjunto2 de CLL con una mutación en el motivo objetivo (R110G)(control).

Basado en el hallazgo de que el anticuerpo solo se une a las células con las estructuras objetivo (BCR subcojunto2 de CLL; Fig. 1B), se puede concluir que en este caso existe un anticuerpo que se une específicamente a células con receptores autónomos activos.

En este sentido ha podido verse que el uso de células que se encuentran en el estado pro/pre del desarrollo de célula B es necesario para la detección de la expresión exacta del BCR. Estas células están diseñadas desde el punto de vista del desarrollo genético para representar nuevos BCR mediante pliegue preciso y expresión en su superficie. Mediante la inactivación (Knockout) de RAG2 y Lambda5 se evita la expresión de un BCR endógeno o pre BCR. La deleción de SLP65 y la posterior reconstrucción de una SLP65 inducible permiten caracterizar el nivel de actividad del "BCR of Interesf' (BCR de interés).

Para la determinación de la secuencia de aminoácidos de los anticuerpos monoclonales seleccionados mediante selección, se aisló de los clones de hibridoma individuales el ARNm, se generó a partir de ello ADNc y se amplificó el mismo usando PCR de anclaje (Rapid expression cloning of human immunoglobulin Fab fragments for the analysis of antigen specificity of B cell lymphomas and anti-idiotype lymphoma vaccination; Osterroth F, Alkan O, Mackensen A, Lindemann A, Fisch P, Skerra A, Veelken H., J Immunol Methods 1999 Oct 29; 229(1-2):141-53).

Tras identificación y determinación de secuencia de las zonas importantes para la unión (CDR) se transmitieron éstas mediante PCR a una estructura de anticuerpos humana. Para ello se generó la secuencia VH de las regiones FR humanas y las regiones CDR murinas y a continuación se sintetizó como fragmentos de ADN. Estos se fusionaron a continuación mediante PCR con una IgG1 humana y se clonaron en un vector adecuado para la expresión.

Para la generación de los anticuerpos monoclonales se usaron, además de las inmunoglobulinas completas, también péptidos sintéticos, que representan las regiones para la capacidad de una señal autónoma.

El anticuerpo monoclonal específico contra conjunto-2 se secuenció. A este respecto se determinaron las siguientes secuencias de aminoácidos, refiriéndose la SEQ ID NO. 9 a la parte variable de la cadena pesada (HC) y la SEQ ID NO. 10 a la parte variable de la cadena ligera (LC), e indicando las zonas marcadas, en el orden indicado, CDR 1,2 y 3.

SEQ ID NO. 9 (AVA-mAb01 HC)

QVQLQQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTSYG1HWVRQSPGKGLEWLGVIWRGGGTDSNAA

FMSRLSITKDNSKSQVFFKMNSLQADDTAIYYCARSRYDEEESMNYWGQGTSVTVSS

SEQ ID NO. 10 (AVA-mAb01 LC)

QIVLTQSPASLSASVGETVTITCRASGN1HSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLADGVPSRF

SGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGSYYCQHFWNTPPTFGAGTKLELK

Las secuencias parciales que se corresponden con CDR1, CDR2 y CDR3, de la cadena pesada de acuerdo con la SEQ ID NO. 9, se indican en las SEQ ID NOS. 11 a 13, mientras que las secuencias parciales que se corresponden con CDR1, CDR2 y CDR3, de la cadena ligera de acuerdo con la s Eq ID NO. 10, se representan en las SEQ ID NOS.

14 a 16.

SEQ ID NO. 11 (AVA-mAB01 CDR1 HC)

GFSLTSYG SEQ ID NO. 12 (AVA-mAB01 CDR2 HC)

IWRGGGT SEQ ID NO. 13 (AVA-mAB01 CDR3 HC)

ARSRYDEEESMNY SEQ ID NO. 14 (AVA-mAB01 CDR1 LC)

GNIHSY

Claims (4)

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento para la selección de una molécula de unión biológica, la cual se une específicamente a un receptor de célula B activo de forma autónoma o activado de forma autónoma como receptor objetivo, no, sin embargo, a un receptor de célula B no activo o no activado, en el marco de un sistema basado en células mediante el uso de células B no maduras, las cuales se encuentran en el estadio pro/pre, que comprende los siguientes pasos:

(a) puesta a disposición de una pluralidad de anticuerpos o fragmentos activos de los mismos como molécula de unión biológica, que se obtuvieron mediante inmunización de un mamífero con formas solubles preparadas de forma recombinante de receptores de célula B, así como posterior inmortalización y purificación;

(b) puesta a disposición de células B no maduras en el estadio pro/pre, que no son capaces de expresar los genes nativos para RAG2 y/o RAG1, así como Lambda5, pero que se capacitaron para expresar receptores de células B activos de forma autónoma o activados de forma autónoma como receptores objetivo en su superficie celular;

(c) puesta a disposición de células B no maduras en el estadio pro/pre, que no son capaces de expresar los genes nativos para RAG2 y/o RAG1, así como Lambda5, pero que se capacitaron para expresar receptores de células B no activos o no activados como receptores de referencia en su superficie celular;

(d) examen comparativo del comportamiento de unión de las moléculas de unión puestas a disposición de acuerdo con el paso (a) con respecto a células, las cuales se ponen a disposición de acuerdo con los pasos (b) y (c);

(e) selección de al menos una molécula de unión, la cual se une específicamente a células puestas a disposición de acuerdo con el paso (b), sin embargo, no, a células puestas a disposición de acuerdo con el paso (c).

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por que las células puestas a disposición de acuerdo con el paso (b) adicionalmente no están capacitadas para expresar el gen nativo para SLP65.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 o 2, caracterizado por que de acuerdo con el paso (c) se ponen a disposición células, las cuales expresan como receptor de referencia un receptor de célula B no activo de forma autónoma.

4. Procedimiento según la reivindicación 2 o 3, caracterizado por que el paso (e) incluye además de la determinación de una unión específica de la molécula de unión a células puestas a disposición de acuerdo con el paso (b), una confirmación mediante una medición de actividad tras inducción de SLP65.