ES2881683T3

ES2881683T3 - Procedimiento para mejorar las características de las proteínas

Info

Publication number: ES2881683T3
Application number: ES16797078T
Authority: ES
Inventors: Robert Dubridge
Original assignee: Full Spectrum Genetics Inc
Current assignee: Full Spectrum Genetics Inc
Priority date: 2015-05-21
Filing date: 2016-05-16
Publication date: 2021-11-30
Anticipated expiration: 2036-05-16
Also published as: JP2018517899A; US10526597B2; JP7109605B2; US20190078081A1; EP3297661B1; WO2016187101A2; EP3297661A4; US20200123530A1; US11332735B2; JP2021061852A; EP3297661A2; JP6867302B2; WO2016187101A3

Abstract

Un procedimiento para mejorar un sitio de unión a proteínas, comprendiendo el procedimiento los pasos de: sintetizar una biblioteca de sustitución única para cada uno de una pluralidad de dominios de un sitio de unión a proteínas, en el que cada miembro de una biblioteca de sustitución única tiene una secuencia de nucleótidos que codifica cambios de aminoácidos en una única posición de aminoácidos de su dominio asociado y que se solapa con una secuencia de nucleótidos de al menos un miembro de una biblioteca de sustitución única diferente, y en el que los dominios del sitio de unión a proteínas se sustituyen de forma única en entre 1 y 250 posiciones de aminoácidos; expresar por separado cada miembro de cada biblioteca de sustitución única como proteína precandidata; seleccionar las proteínas precandidatas de cada biblioteca de sustitución única que se unen a las moléculas diana para formar una biblioteca seleccionada para cada dominio de la proteína; reestructurar los miembros de las bibliotecas seleccionadas en una PCR para producir una biblioteca combinatoria reestructurada; expresar miembros de la biblioteca reestructurada como proteínas candidatas; incubar en una mezcla de reacción bajo condiciones de unión las proteínas candidatas con las moléculas diana; lavar las moléculas diana hasta que una fracción de las proteínas candidatas permanezca unida; y seleccionar los miembros de la biblioteca reestructurada que codifican las proteínas candidatas que permanecen unidas a las moléculas diana.

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimiento para mejorar las características de las proteínas

Antecedentes

Se están diseñando y desarrollando nuevas generaciones de proteínas y anticuerpos terapéuticos que tienen una serie de mejoras de rendimiento, como afinidades modificadas, mayor estabilidad, reactividad cruzada reducida o aumentada, mayor solubilidad, y similares., por ejemplo Igawa et al, mAbs, 3(3): 243-252 (2011) Bostrom et al, Science, 323: 1610-1614 (2009) Swers, Mol. Biotechnol. 47(1):57-69(2011). Un enfoque importante para realizar estas mejoras es crear una biblioteca de mutantes a partir de una proteína terapéutica existente o de un candidato terapéutico, a continuación cribar los miembros de la biblioteca mediante diversos ensayos hasta encontrar proteínas de mejor rendimiento. Dado que estas bibliotecas suelen ser muy grandes, este tipo de cribado puede ser costoso y llevar mucho tiempo, a menos que se disponga de herramientas de alto rendimiento. En particular, la especificidad de la diana y las propiedades de unión inespecífica de los compuestos candidatos han sido difíciles de evaluar eficazmente debido a la escasez de técnicas de alto rendimiento para este fin.

En vista de lo anterior, los esfuerzos que requieren una comprensión de las reacciones de unión a proteínas, tales como la ingeniería de proteínas y anticuerpos, avanzarían si se dispusiera de técnicas eficientes para crear bibliotecas representativas de baja complejidad a partir de las cuales se pudieran evaluar/seleccionar rápidamente las propiedades de los compuestos de unión candidatos.

Sumario de la invención

En un aspecto, la divulgación está dirigida a procedimientos para mejorar una o más características predeterminadas de una proteína que comprenden los pasos de: a) sintetizar una biblioteca de sustitución única para cada uno de una pluralidad de dominios de una proteína, teniendo cada miembro de una biblioteca de sustitución única una secuencia de nucleótidos que se solapa con una secuencia de nucleótidos de al menos un miembro de una biblioteca de sustitución única diferente; b) expresar por separado cada miembro de cada biblioteca de sustitución única como una proteína precandidata c) seleccionar los miembros de cada biblioteca de sustitución única que codifican proteínas precandidatas que presentan una mejora en una o más características predeterminadas para formar una biblioteca seleccionada para cada dominio de la proteína; d) reestructurar los miembros de las bibliotecas seleccionadas en una PCR para producir una biblioteca combinatoria reestructurada; e) expresar los miembros de la biblioteca reestructurada como proteínas candidatas; y f) seleccionar los miembros de la biblioteca reestructurada que codifican proteínas candidatas que presentan una mejora en al menos una de las características predeterminadas. En algunas realizaciones, la pluralidad de dominios cubre, o abarca, un sitio de unión de la proteína y la una o más características predeterminadas son de, o están relacionadas con, el sitio de unión, que puede ser, por ejemplo, un sitio de unión de anticuerpos, un sitio de unión de sustratos de una enzima, o similares.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 ilustra un flujo de trabajo de una realización ejemplar de la invención.

Las Figs. 2A-2G muestran datos de la aplicación de la invención para generar mutantes del compuesto de unión de cadena única SD1 que tienen una afinidad de unión mejorada con la mesotelina.

Descripción detallada de la invención

La práctica de la presente invención puede emplear, a menos que se indique lo contrario, las técnicas y descripciones convencionales de la química orgánica, la biología molecular (incluidas las técnicas recombinantes), la biología celular y la bioquímica, que están dentro de la habilidad del arte. Tales técnicas convencionales incluyen, pero no se limitan a, la preparación de polinucleótidos sintéticos, anticuerpos monoclonales, sistemas de visualización de anticuerpos, secuenciación y análisis de ácidos nucleicos y similares. Las ilustraciones específicas de las técnicas adecuadas se pueden tener por referencia al ejemplo que se presenta a continuación. No obstante, también pueden utilizarse otros procedimientos convencionales equivalentes, por supuesto. Tales técnicas y descripciones convencionales pueden encontrarse en manuales de laboratorio estándar como Genome Analysis: A Laboratory Manual Series (Vols. I-IV); PCR Primer: A Laboratory Manual; Phage Display:: A Laboratory Manual: and Molecular Cloning: A Laboratory Manual (all from Cold Spring Harbor Laboratory Press); Sidhu, editor, Phage Display in Biotechnology and Drug Discovery (CRC Press, 2005); Lutz and Bornscheuer, Editors, Protein Engineering Handbook (Wiley-VCH, 2009); Hermanson, Bioconjugate Techniques, Second Edition (Academic Press, 2008); y otros similares.

En un aspecto, la divulgación está dirigida a procedimientos para mejorar una o más propiedades, por ejemplo, afinidad, estabilidad, tolerancia al calor, reactividad cruzada, etc., de una proteína, que puede ser un compuesto de unión de referencia. En algunas realizaciones, se proporciona una pluralidad de bibliotecas de sustitución simple, cada una de las cuales corresponde a un dominio diferente, o a un segmento de aminoácidos de la proteína o del compuesto de unión de referencia, de manera que cada miembro de la biblioteca de sustitución simple codifica sólo un cambio de aminoácido en su dominio o segmento de aminoácidos correspondiente. (Esto permite sondear todas las posibles sustituciones en una gran proteína o sitio de unión a proteínas con unas pocas bibliotecas pequeñas) En algunas realizaciones, la pluralidad de dominios forma o cubre una secuencia contigua de aminoácidos de la proteína o del compuesto de unión de referencia. Las secuencias de nucleótidos de diferentes bibliotecas de sustitución simple se solapan con las secuencias de nucleótidos de al menos otra biblioteca de sustitución simple. En algunas realizaciones, una pluralidad de bibliotecas de sustitución simple están diseñadas de manera que cada miembro se superpone a cada miembro de cada biblioteca de sustitución simple que codifica un dominio adyacente.

Una biblioteca ejemplar de sustitución única que codifica mutantes de un dominio de tres aminoácidos (Glu-Lys-Thr, entre corchetes a continuación) puede tener la siguiente forma:

Proteína de referencia (SEQ ID NO: 1):

... -Gln-Ala-Ala-Phe-[GLu-Lys-Thr]-Ser-Ala-His-Lys-Met-...

Secuencia de ácido nucleico de la proteína de referencia (SEQ ID NO: 2):

... -CAA-GCA-GCA-TTC-[GAG-AAA-ACG]-TCA-GCC-CAC-AAG-ATG- ...

Miembros de una biblioteca de sustitución única para el dominio Glu-Lys-Thr con solapamientos de 12 nucleótidos (SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5):

C A A -G C A -G C A -T TC -[N N N -A A A -A C G ■-TC A-G C C -C Á C -A A G

C A A -G C A -G C A -TTC -fG A G -N N N -A C G ;-TC A -G C C -C A C -A A G

C A A -G C A -G C A -TTC -tG A G -A A A -H N N j -TC A-G C C -C A C -A A G

donde "NNN" es un codón "comodín" como se describe a continuación.

Las proteínas, por ejemplo el compuesto de unión, expresadas a partir de dichas bibliotecas de sustitución única se seleccionan por separado para obtener un subconjunto de variantes en cada biblioteca que tenga propiedades (o una o más características) al menos tan buenas como las de la proteína de referencia o el compuesto de unión de referencia y cuya biblioteca resultante sea de tamaño reducido. (Es decir, el número de ácidos nucleicos que codifican el conjunto seleccionado de compuestos de unión es menor que el número de ácidos nucleicos que codifican los miembros de la biblioteca original de sustitución única). Tales propiedades (o características) incluyen, pero no se limitan a, la afinidad con un compuesto objetivo, la estabilidad con respecto a diversas condiciones como el calor, el pH alto o bajo, la degradación enzimática, la reactividad cruzada con otras proteínas y similares. Los compuestos seleccionados de cada biblioteca de sustitución única se denominan aquí indistintamente "compuestos precandidatos" o "proteínas precandidatas" En lo que respecta a una propiedad o característica de una proteína, "al menos tan buena como" significa que siempre que una propiedad o característica de una proteína pueda ser representada por un valor (por ejemplo, una temperatura o un pH (o similares) a los que una actividad cambia (por ejemplo, disminuye) una cantidad predeterminada, una afinidad a un compuesto objetivo, o similares), el valor de dicha propiedad o característica de una proteína precandidata es mayor o menor que el valor correspondiente de la proteína de referencia. Dependiendo de la propiedad o característica considerada, en algunas realizaciones del procedimiento se seleccionan proteínas precandidatas que tienen valores mayores que los de la proteína de referencia, y en otras realizaciones se seleccionan proteínas precandidatas que tienen valores menores que los de la proteína de referencia. Las secuencias de ácido nucleico que codifican los compuestos precandidatos de las bibliotecas separadas de sustitución simple se reestructuran entonces en una PCR para generar una biblioteca reestructurada, por ejemplo, Stemmer, Patentes estadounidenses 6.444.468 6,132,970 5,830,721 Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci., 91: 10747 10751 (1994) Wu et al, publicación de patente estadounidense 2006/0228350. Es decir, el término "reestructurar" en referencia a las bibliotecas de sustitución simple separadas significa que dichas bibliotecas se combinan en una mezcla de PCR y se lleva a cabo una PCR de manera que los miembros de las bibliotecas de sustitución simple separadas se unen en el producto de PCR resultante. Como se ha señalado anteriormente, es deseable que las secuencias de al menos un par de bibliotecas de sustitución simple se solapen, de modo que las hebras de los miembros de diferentes bibliotecas de sustitución simple puedan hibridarse entre sí y extenderse en la PCR. En otras palabras, es deseable que las secuencias de al menos un par de bibliotecas de una sola sustitución puedan hibridarse entre sí y funcionar como cebadores y plantillas entre sí en la PCR. En algunas realizaciones, es deseable que cada biblioteca de sustitución simple de una pluralidad tenga miembros cuyas secuencias se solapen con las de una biblioteca de sustitución simple adyacente. La cantidad o el grado de solapamiento puede variar mucho. En algunas realizaciones, el grado de solapamiento es el mismo que la longitud de una secuencia típica de cebadores, por ejemplo, como se describe en la sección de definición. En otras realizaciones, el grado de solapamiento puede variar de 6 a 100 nucleótidos o de 6 a 40 nucleótidos.

La Fig. 1 proporciona un esquema de un flujo de trabajo de una realización de la invención. Las bibliotecas de compuestos precandidatos se generan a partir de bibliotecas de sustitución simple y se seleccionan para su unión a la(s) proteína(s) diana (100), tras lo cual las bibliotecas de precandidatos se reestructuran (102) para producir una biblioteca combinatoria de ácidos nucleicos que codifican compuestos candidatos que, a su vez, se clonan (104) en un vector de expresión conveniente, como un sistema de expresión de fagémidos. Los fagos (105) que expresan los compuestos candidatos se someten entonces a una o más rondas de selección (106) para mejorar las propiedades deseadas, como la afinidad de unión a una molécula diana (108). Las moléculas diana pueden adsorberse o adherirse de otro modo a la superficie de un pocillo u otro recipiente de reacción, como se ilustra en la Fig. 1, o las moléculas diana pueden derivarse con una fracción de unión, como la biotina (110), que tras la incubación con los compuestos de unión candidatos puede capturarse con una fracción complementaria, como la estreptavidina, unida a perlas, como las magnéticas, para su lavado. En un régimen de selección particular de interés, los compuestos de unión candidatos se someten a un paso de lavado prolongado (112) para que sólo se seleccionen los compuestos candidatos con tasas de disociación muy bajas de una molécula diana. Tiempos de lavado ejemplares para tales realizaciones son al menos 8 horas; o en otras realizaciones, al menos 24 horas: o en otras realizaciones, al menos 48 horas; o en otras realizaciones, al menos 72 horas. En otras realizaciones, la duración de un paso de lavado puede estar determinado por la fracción de compuestos candidatos a la unión que permanecen unidos a la diana. Es decir, los compuestos undos pueden someterse a las condiciones de lavado durante el tiempo necesario (o tantos, dependiendo de la aplicación) hasta que el 50 por ciento de los compuestos unidos permanezcan unidos, o hasta que el 10 por ciento de los compuestos unidos permanezcan unidos, o hasta que el 1 por ciento de los compuestos undos permanezcan unidos. Alternativamente, las duraciones de los lavados (o el número, dependiendo de la implementación) pueden determinarse en referencia a la fracción del compuesto de unión eluido de la diana. Los clones aislados después de la selección pueden amplificarse y someterse a ciclos adicionales de selección (115) o pueden analizarse (114), por ejemplo, mediante secuenciación (116) y realizando mediciones comparativas de la afinidad de unión, por ejemplo, mediante ELISA, unión por resonancia de plasmón superficial, interferometría de biocapa (por ejemplo, sistema Octet, ForteBio, Menlo Park, CA) o similares (118).

Selección para mejorar las características físicas, químicas y biológicas

En algunas realizaciones, el procedimiento de la invención puede utilizarse para obtener un compuesto de unión con una afinidad equivalente o mejor que la de un compuesto de unión de referencia, pero que tiene una estabilidad superior con respecto a los agentes desestabilizadores seleccionados. En algunas realizaciones, el proceso descrito anteriormente también puede llevarse a cabo con miembros de las bibliotecas de sustitución única que hayan sido tratados primero con un agente desestabilizador (calor, pH bajo, proteasas o similares). En otras palabras, sus miembros forman bibliotecas "estresadas". Los compuestos de unión precandidatos de dichas bibliotecas que pierden afinidad de unión tras ser "estresados" contienen residuos desestabilizadores. El objetivo es identificar mutantes que se unan al antígeno al menos tan bien o mejor que el tipo salvaje en la biblioteca "estresada". Se espera que se puedan combinar varias mutaciones estabilizadoras para aumentar drásticamente la estabilidad de la molécula resultante, por ejemplo, reestructurando la posibilidad de crear una biblioteca combinatoria de segunda etapa a partir de tales mutantes y realizando una segunda ronda de estrés seguida de una selección de unión. En algunas realizaciones, lo anterior puede implementarse de acuerdo con la invención para aumentar la estabilidad de un compuesto de unión codificado por ácido nucleico seleccionado (es decir, compuesto de unión de referencia) sin pérdida de afinidad por un ligando mediante los pasos de: (a) tratar una biblioteca (o bibliotecas) de compuestos de unión precandidatos con un agente desestabilizador para formar una biblioteca o bibliotecas tratadas/estresadas de compuestos de unión precandidatos, estando cada compuesto de unión precandidato comprendido o codificado por una secuencia de nucleótidos; (b) hacer reaccionar en condiciones de unión uno o más ligandos con la biblioteca o bibliotecas tratadas de compuestos de unión precandidatos (c) reestructurar los clones seleccionados de una o más de las bibliotecas (d) someter la biblioteca reestructurada a un estrés similar y (e) seleccionar al menos un compuesto de unión candidato de un subconjunto de compuestos de unión candidatos cuya afinidad sea igual o mayor que la del compuesto de unión codificado por ácido nucleico seleccionado (es decir, el compuesto de unión de referencia), proporcionando así un compuesto de unión codificado por ácido nucleico con mayor estabilidad respecto al compuesto de unión de referencia sin pérdida de afinidad.

En algunas realizaciones, por ejemplo, para compuestos de unión expresados en sistemas de visualización de fagos, las condiciones ejemplares para estresar un subconjunto incluyen (i) exponer los fagos a temperaturas elevadas, por ejemplo, en el intervalo de 40-70°C durante un período de tiempo, por ejemplo, en el intervalo de 5-60 minutos; (ii) exponer los fagos a un pH bajo o alto. por ejemplo, pH en el intervalo de 1-4 o 9-13, durante un período de tiempo, por ejemplo, en el intervalo de 5-60 minutos; (iii) exponer los fagos a diversas proteasas a diversas actividades durante un intervalo de tiempo, por ejemplo, 15-30 minutos, o 1-4 horas, o 1 hora a 24 horas, dependiendo de la proteasa y la actividad específica. Las proteasas ejemplares para las pruebas de estabilidad incluyen, pero no se limitan a, las proteasas del suero; la tripsina; la quimotripsina; las catepsinas, que incluyen, pero no se limitan a la catepsina A y la catepsina B; las endopeptidasas, como las metaloproteinasas de la matriz (m Mp ) que incluyen, pero no se limitan a, la MMP-1, la MMP-2, la MMP-9; o similares.

En algunas realizaciones, el procedimiento de la invención puede utilizarse para obtener un compuesto de unión con una afinidad equivalente o mejor hacia un antígeno o molécula diana que la de un compuesto de unión de referencia, pero que tiene una reactividad cruzada reducida, o en algunas realizaciones, una reactividad cruzada aumentada, con sustancias seleccionadas, como ligandos, proteínas, antígenos o similares, distintas de la sustancia o epítopo para el que un compuesto de unión de referencia es específico, o está diseñado para ser específico. Con respecto a esto último, un anticuerpo terapéutico candidato puede probarse con más éxito en modelos animales si el anticuerpo reacciona tanto con su diana humana como con la diana correspondiente del modelo animal, por ejemplo, el ratón o el mono. Así, en algunas realizaciones, el procedimiento de la invención puede emplearse para aumentar la reactividad cruzada con una o más sustancias o compuestos seleccionados de un primer conjunto, como las correspondientes dianas de modelos animales u otros miembros de la familia de proteínas. En otras realizaciones, el procedimiento de la invención se emplea para reducir la reactividad cruzada de un compuesto de unión, como un anticuerpo terapéutico candidato, por ejemplo, para reducir los posibles efectos secundarios en un paciente. Como en el caso anterior, se identifica un subconjunto de compuestos candidatos en base a la afinidad (es decir, que tienen una afinidad equivalente o superior a la del compuesto de referencia). Los compuestos candidatos del subconjunto pueden entonces combinarse con una o más sustancias o compuestos de un segundo conjunto (distintos del antígeno diana en una o más reacciones de unión (por ejemplo, cada una a diferentes concentraciones de fago)) y seleccionarse para los compuestos de unión candidatos que no se agoten con dichas sustancias. La elección de las sustancias puede ser muy variada, y puede incluir tejidos, líneas celulares, proteínas seleccionadas, matrices de tejidos, micro matrices de proteínas u otros despliegues múltiplex de compuestos potencialmente reactivos cruzados. En las siguientes referencias ejemplares se puede encontrar orientación para la selección de dichos ensayos de reacción cruzada de anticuerpos: Michaud et al, Nature Biotechnology. 21(12): 1509-1512 (2003) Kijanka et al, J. Immunol. Methods, 340(2): 132-137 (2009) Predki et al, Human Antibodies, 14(1-2): 7-15 (2005): Nota de aplicación de Invitrogen sobre Protoarray™ Protein Microarray (2005); y similares. En dichas reacciones de unión, los ácidos nucleicos que codifican los ligantes y los no ligantes del subconjunto se determinan de acuerdo con la invención, proporcionando así un enriquecimiento o un agotamiento significativo de cada compuesto de unión candidato del subconjunto para la una o más sustancias seleccionadas para las que se buscaba la modulación de la reactividad cruzada. Al igual que en el caso anterior, la representación de los mutantes de reacción cruzada puede utilizarse para generar una biblioteca de segunda etapa para identificar compuestos de unión con una reactividad cruzada más reducida con las sustancias seleccionadas.

En algunas realizaciones, lo anterior puede implementarse de acuerdo con la invención para identificar uno o más compuestos de unión con una mayor reactividad cruzada con o hacia un conjunto seleccionado de sustancias o compuestos en comparación con la de un compuesto de unión de referencia sin pérdida de afinidad por el ligando original. Dicho procedimiento puede llevarse a cabo mediante las etapas d e :: (a) sintetizar una biblioteca de sustitución única para cada uno de los dominios de un sitio de unión a una proteína, teniendo cada miembro de una biblioteca de sustitución única una secuencia de nucleótidos que se superpone a la secuencia de nucleótidos de al menos un miembro de una biblioteca de sustitución única diferente; (b) expresar por separado cada miembro de cada biblioteca de sustitución única como una proteína precandidata; (c) seleccionar los miembros de cada biblioteca de sustitución única que codifican proteínas precandidatas que se unen a un socio de unión que difiere del objetivo de unión original [por ejemplo una diana de reacción cruzada deseada]; (d) reestructurar los miembros de las bibliotecas seleccionadas en una PCR para producir una biblioteca combinatoria reestructurada; (e) expresar los miembros de la biblioteca reestructurada como proteínas candidatas y (f) seleccionar los miembros de la biblioteca reestructurada una o más veces para obtener proteínas candidatas que se unan al socio de unión original y (g) seleccionar además las proteínas candidatas para que se unan a la(s) diana(s) de reacción cruzada deseada(s), proporcionando así un compuesto de unión codificado por ácido nucleico con una reactividad cruzada aumentada para la(s) sustancia(s) con respecto al compuesto de unión de referencia sin pérdida de afinidad por el ligando original. Del mismo modo, puede implementarse un procedimiento para obtener un compuesto de unión con reactividad disminuida a una(s) sustancia(s) o compuesto(s) o epítopo(s) de reacción cruzada seleccionado(s) sustituyendo el paso (g) por el siguiente paso: agotar los compuestos de unión candidatos una o más veces del subconjunto de compuestos de unión candidatos que se unen al compuesto de reacción cruzada no deseado.

Sistemas de visualización de proteínas

Las características de cualquier sistema de visualización de péptidos o proteínas son: 1.1. Estrecho enlace entre las proteínas expresadas y su ácido nucleico codificador; y 2. Expresión de la proteína en una forma que permita ensayarla y separarla con base en alguna actividad bioquímica (por ejemplo, fuerza de unión, susceptibilidad a la acción enzimática o similares). Para los fines de esta discusión, los sistemas de visualización de proteínas pueden separarse en dos grupos basados en el número de proteínas visualizadas por unidad de visualización, ya sea polivalente o monovalente. Los sistemas de visualización polivalentes, tales como los de visualización de levadura (referencias 1 y 2 más adelante), los sistemas de visualización de mamíferos (referencias 3 y 4 más adelante) y sistemas de visualización de bacterias (referencia 5), expresan el gen o los genes de interés (a menudo diversas bibliotecas de anticuerpos) como proteínas enlazadas a la superficie celular mediante un anclaje de membrana, similar a una inmunoglobulina nativa de superficie que se encuentra en la membrana plasmática de las células B normales. El ADN que codifica los clones de la biblioteca se transforma en el tipo de célula de interés, de manera que cada célula recibe como máximo un clon de la biblioteca. La población resultante de células expresará cada una de ellas de decenas a decenas de miles de copias de un único clon de proteína en su superficie celular. Esta población de células puede ser expuesta a cantidades limitadas de antígeno diana marcado con fluorescencia y los clones de mejor unión se unirán a la mayor parte del antígeno y pueden ser identificados y aislados utilizando un clasificador de células activado por fluorescencia (FACS). Lamentablemente, la cuantificación precisa en los sistemas de visualización polivalente se complica por los efectos de unión cooperativa (avidez) entre las múltiples copias de la molécula visualizada en la misma célula (referencia 6). Este problema es especialmente pronunciado si el antígeno es polivalente (TNF, IgG) o está unido a una superficie celular (por ejemplo, Cd 20, CD3, GPCRs, canales iónicos y similares).

Muchos de los sistemas de visualización de proteínas virales y basados en fagos son también polivalentes por naturaleza, pero las unidades de visualización son demasiado pequeñas para detectarlas en el FACS, por lo que la cuantificación precisa es aún más difícil. Estos sistemas también sufren problemas de avidez si se expresan simultáneamente varios compuestos de unión en la misma partícula fágica/viral. En tales condiciones, es difícil determinar si una fuerza de unión observada se debe al efecto combinado de dos compuestos de unión expresa frente al efecto de un único compuesto de unión de muy alta afinidad. Estos problemas de avidez pueden minimizarse regulando la expresión del compuesto de unión candidato en un huésped mediante técnicas convencionales. En una realización en la que un sistema de visualización de fagos expresa fragmentos Fab, por ejemplo, como se divulga en la Fig. 5, la regulación de la expresión de Fab se ajusta para que la fracción de fagos que expresan un Fab esté en el intervalo de aproximadamente 0,002 a 0,001, o en el intervalo de aproximadamente 0,001 a 0,0005.

Los sistemas de fagos monovalentes (referencia 7) y virales (referencia 8), junto con los sistemas de visualización de ribosomas (referencias 9 y 10) expresan un promedio de <1 molécula de la molécula visualizada por unidad de visualización. Estos sistemas permiten medir con precisión la afinidad real del sitio de unión en cuestión para cada clon de la biblioteca. Por lo general, estos sistemas se utilizan para mostrar grandes y diversas bibliotecas de elementos de unión. A continuación, se seleccionan pequeñas subpoblaciones de clones de estas bibliotecas con base en su mayor capacidad para unirse al antígeno diana en relación con otros miembros de la biblioteca. Después de la selección (a menudo múltiples rondas de selección) los clones resultantes se aíslan y se caracterizan (por ejemplo, como se divulga en la Patente U.S. 7.662.557). Esta es una buena estrategia para aislar los enlaces iniciales a un antígeno diana determinado a partir de una biblioteca muy grande y diversa, pero no es un procedimiento eficiente para cribar exhaustivamente un único sitio de unión de proteínas con fines de ingeniería de proteínas. Para lograr este objetivo, uno quisiera caracterizar el efecto de cada posible cambio de ingeniería y luego diseñar y construir un sitio de unión optimizado en función de: afinidad, estabilidad, reactividad cruzada, rendimiento de fabricación, etc. Por lo tanto, sería deseable analizar la fuerza de unión de cada miembro de una biblioteca/grupo de bibliotecas de sustitución única y saturada del sitio de unión en cuestión. Las técnicas de visualización de proteínas anteriores se divulgan en las siguientes referencias ejemplares: (1) Wittrup, KD; Current Opinion in Biotechnology 12: 395-399 (2001) (Protein engineering by cell-surface display): (2) Lauren R. Pepper, Yong Ku Cho, Eric T. Boder y Eric V. Shusta; Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening 11: 127-134 (2008); (3) Yoshiko Akamatsu, Kanokwan Pakabunto, Zhenghai Xu, Yin Zhang, Naoya Tsurushita; Journal of Immunological Methods 327: 40-52 (2007); (4) Chen Zhou, Frederick W. Jacobsen, Ling Cai, Qing Chen y Weyen David Shen; mAbs 2(5): 1-11 (2010); (5) Patricks Daugherty; Current Opinion in Structural Biology 17:474-480 (2007) (Protein engineering with bacterial display); (6) Clackson and Lowman (editores), Phage Display (2009); (7) Hennie R Hoogenboom, Andrew D Griffiths, Kevin S Johnson, David J Chiswell, Peter Hudson y Greg Winter; Nucleic Acids Research 19(15): 4133-4137 (1991); (8) Francesca Gennari, Luciene Lopes, Els Verhoeyen, Wayne Marasco, Mary K. Collins; Human Gene Therapy 20: 554-562 (2009); (9) Christiane Schaffuzel, Jozef Hanes, Lutz Jermutus, Andreas Pluckthun; Journal of Immunological Methods 231: 119-135 (1999) (ribosome display); (10) Robert A Irving. Gregory Coia, Anthony Roberts. Stewart D Nuttall, Peter J Hudson; Journal of Immunological Methods 248: 31-45 (2001) (ribosome display); (11) Arvind Rajpal, Nurten Beyaz, Lauric Haber, Guido Cappuccilli, Helena Yec, Ramesh R Bhatt, Toshihiko Takeuchi, Richard A Lerner, Roberto Crea; PNAS 102 (24): 8466-71(2005). Algunas de las técnicas anteriores también se divulgan en las siguientes patentes: 7,662,557 7,635,6667,195,8667,063,9436,916,605y similares.

Otros sistemas de visualización de proteínas para su uso con la invención incluyen los sistemas de visualización baculoviral, los sistemas de visualización adenoviral, los sistemas de visualización lentivirus, los sistemas de visualización retroviral, los sistemas de visualización SplitCore, como se divulga en las siguientes referencias: Sakihama et al, PLosOne 3(12): e4024 (2008) Makela et al, Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening, 11: 86-98 (2008) Urano et al, Biochem. Biophys. Res Comm., 308: 191-196 (2003) Gennari et al. Human Gene Therapy, 20: 554-562 (2009) Taube et al, PLosOne, 3(9): e3181 (2008) Lim et al. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening, 11: 111-117 (2008) Urban et al, Chemical Biology, 6(1): 61-74 (2011) Buchholz et al, Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening, 1:99-110 (2008) Walker et al, Scientific Reports. 1(5): (14 de junio de 2011): y similares.

En algunas realizaciones, la invención emplea sistemas de visualización de fagos convencionales para mejorar una o más propiedades de un compuesto de unión a anticuerpos/proteínas, particularmente un compuesto de unión a anticuerpos/proteínas preexistente. A diferencia de las aplicaciones anteriores de las tecnologías de visualización, que emplean ciclos repetidos de selección, lavado, elución y amplificación, para identificar fagos individuales a partir de una gran biblioteca combinatoria, por ejemplo >108-109 clones, en la presente invención, se seleccionan múltiples bibliotecas pequeñas y concentradas, por ejemplo103i 0 4 clones cada una, o en algunas realizaciones104i 0 5clones cada una, en una o más reacciones de unión en serie, se eliminan los clones con poca unión reduciendo así el tamaño de cada biblioteca. A partir de dicho análisis, se seleccionan y reestructuran subconjuntos, y la biblioteca combinatoria reestructurada resultante se selecciona además en función de otras propiedades de interés, como la afinidad, la estabilidad, la reactividad cruzada y otras similares. Los factores que afectan a estas reacciones de unión son bien conocidos en la técnica e incluyen: el número de fagos que se incluyen en la reacción, la rigurosidad de la mezcla de reacción; el número de moléculas diana que se incluyen en la reacción: la presencia o ausencia de agentes de bloqueo, como la albúmina de suero bovino, la gelatina, la caseína o similares, para reducir la unión inespecífica; la duración y la rigurosidad de una etapa de lavado para eliminar los malos aglutinantes y enriquecer los buenos; la naturaleza de una etapa de elución para eliminar los aglutinantes de las moléculas diana; el formato de las moléculas diana utilizadas en la reacción, que, por ejemplo, pueden estar unidas a un soporte sólido o derivadas con un agente de captura, por ejemplo, la biotina, y que pueden ser de gran valor para la reacción, por ejemplo, biotina, y pueden estar libres en solución; la proteína fágica en la que se insertan los compuestos de unión candidatos; y otros aspectos similares. En algunas realizaciones, las moléculas diana, como las proteínas, se purifican y se inmovilizan directamente en un soporte sólido, como una perla o una placa de microtitulación. Esto permite la separación física de los fagos unidos y no unidos simplemente lavando el soporte. Existen numerosos soportes para este propósito, incluyendo resinas de afinidad modificadas, perlas de vidrio, perlas magnéticas modificadas, soportes de plástico y similares. Los soportes útiles son aquellos que tienen un bajo fondo para la unión inespecífica de fagos y que presentan las moléculas diana en una configuración nativa y en una concentración deseable.

En algunas realizaciones, un compuesto de unión codificado por ácido nucleico es un fragmento de anticuerpo expresado por un fago. En una realización, dicho fago es un bacteriófago filamentoso y el fragmento de anticuerpo se expresa como parte de una proteína de cubierta. En particular, dicho fago puede ser un miembro de la clase Ff de bacteriófagos. En una realización adicional, el huésped de dicho bacteriófago filamentoso es E. coli. En otra realización, se utiliza un sistema de fagos auxiliares fagémidos para visualizar fragmentos de anticuerpos. Los fagémidos pueden mantenerse como plásmidos en una bacteria huésped y la producción de fagos puede ser inducida por una infección posterior con un fago auxiliar. Entre los fagémidos ejemplares se encuentran pComb3 y los miembros de su familia relacionados, por ejemplo, divulgados en Barbas et al, Proc. Natl. Acad. Sci., 88: 7978-7982 (1991), y pHEN1 y los miembros de su familia relacionados, por ejemplo, divulgados en Hoogenboom et al, Nucleic Acids Research, 19: 4133-4137 (1991); y Patente U.S. 5.969.108 6,806,079 7,662,557y patentes relacionadas. En una realización particular, un fragmento de anticuerpo se expresa como una proteína de fusión con la proteína de la cubierta del fago g3p.

Bibliotecas de compuestos de unión a codificados por ácidos nucleicos

Como se ha mencionado anteriormente, una característica de la invención es el uso de bibliotecas de sustitución única enfocadas en las que se pueden cribar grandes dominios de unión hasta su finalización utilizando un pequeño número (3-30) de bibliotecas de subdominios. En algunas realizaciones, esto limita la necesidad de ciclos sucesivos de selección, elución y amplificación y el uso de múltiples y grandes bibliotecas combinatorias, como se requiere en los enfoques convencionales. El tamaño de estas bibliotecas enfocadas de compuestos de unión candidatos está influenciado por al menos dos factores: el tamaño de los subdominios que se eligen para abarcar el dominio de la proteína y la dificultad de sintetizar polinucleótidos que codifiquen los miembros de la biblioteca. Es decir, cuanto más grande sea el dominio de la proteína a cribar, mayor será el número y/o el tamaño de las bibliotecas de subdominios. Del mismo modo, una biblioteca más grande de compuestos candidatos significa que hay que sintetizar un mayor número de polinucleótidos. Así, las aplicaciones particulares pueden implicar opciones de diseño convencionales entre la escala de implementación y el coste. En algunas realizaciones, las bibliotecas enfocadas se obtienen variando los aminoácidos en un número limitado de ubicaciones, una o dos a la vez, dentro de un compuesto de unión preexistente, que puede ser el mismo o equivalente a un compuesto de unión de referencia. Preferentemente, los aminoácidos se varían en diferentes posiciones de uno en uno. Así, por ejemplo, los miembros de una biblioteca de compuestos de unión candidatos pueden tener secuencias de nucleótidos idénticas a la que codifica el compuesto de unión preexistente, excepto por una única posición de codón. En esa posición, la mayoría de los miembros de la biblioteca tendrán un codón diferente al del compuesto de unión preexistente.

Tales bibliotecas pueden incluir miembros que tengan una inserción o deleción de aminoácidos en dicha ubicación y pueden no incluir necesariamente miembros con cada codón posible en dicha ubicación. Las bibliotecas pueden contener miembros correspondientes a tales sustituciones (e inserciones o deleciones) en cada uno de un conjunto de las ubicaciones de aminoácidos dentro del compuesto de unión preexistente. Las ubicaciones pueden ser contiguas o no contiguas. En algunas realizaciones, el número de ubicaciones en las que se varían los codones está en el intervalo de 1 a 500; en algunas realizaciones, el número de dichas ubicaciones está en el intervalo de 1 a 250; en otras realizaciones, el número de dichas ubicaciones está en el intervalo de 10 a 100; y en otras realizaciones, el número de dichas ubicaciones está en el intervalo de 10 a 250. Un compuesto de unión preexistente puede ser cualquier anticuerpo o proteína de unión preexistente cuya información de secuencia esté disponible (o pueda obtenerse). Típicamente, un compuesto de unión preexistente es un compuesto de unión comercialmente importante, como un fármaco anticuerpo o candidato a fármaco, para el que se desea modificar una o más propiedades, como la afinidad, la alteración de la reactividad cruzada, el aumento de la estabilidad, la resistencia a la agregación, o similares, como se ha comentado anteriormente. En una realización, las ubicaciones en las que se varían los codones comprenden las regiones Vh y Vl de un anticuerpo, incluyendo tanto los codones en las regiones marco como en las CDR; en otra realización, las ubicaciones en las que se varían los codones comprenden las CDR de las cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo, o un subconjunto de dichas CDR, como por ejemplo únicamente CDR1, únicamente CDR2, únicamente CDR3, o pares de ellas.

En otra realización, las ubicaciones en las que se varían los codones ocurren únicamente en las regiones marco; por ejemplo, una biblioteca puede comprender cambios de un solo codón únicamente a partir de un compuesto de unión de referencia únicamente en las regiones marco tanto de Vh como de Vl numeradas en el intervalo de 10 a 250. En otra realización, las ubicaciones donde se varían los codones comprenden las CDR3 de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo, o un subconjunto de dichas CDR3. En otra realización, el número de ubicaciones en las que se varían los codones de las regiones de codificación Vh y Vl está en el intervalo de 10 a 250, de tal manera que hasta 100 ubicaciones están en regiones marco. En otra realización, los compuestos de unión codificados con ácido nucleico se derivan de un compuesto de unión preexistente, como un anticuerpo preexistente u otra proteína de unión. Los compuestos de unión preexistentes ejemplares incluyen, pero no se limitan a, fármacos direccionados a anticuerpos o fármacos basados en anticuerpos como adalimumab (Humira), bevacizumab (Avastin), cetuximab (Erbitux), efalizumab (Raptiva), infliximab (Remicade), panitumumab (Vectubix), ranibuzumab (Lucentis), rituximab (Rituxan) trastuzumab (Herceptin) y similares, factores de crecimiento o receptores de factores de crecimiento, ligandos y receptores de señalización, hormonas y receptores hormonales, factores de coagulación y receptores de factores de coagulación, enzimas, proteínas de la matriz y receptores de unión a la matriz, citoquinas y receptores de citoquinas, etc.

En algunas realizaciones, las sustituciones de codones anteriores se generan sintetizando segmentos de codificación con codones degenerados. A continuación, los segmentos codificantes se ligan aun vector, como una forma replicativa de un fago o fagémido, para formar una biblioteca. Con la presente invención se pueden utilizar muchos codones degenerados diferentes, como los que se muestran en la Tabla I.

Tabla I.

En algunas realizaciones, el tamaño de las bibliotecas de compuestos de unión utilizadas en la invención varía de aproximadamente 1000 miembros a aproximadamente 1 x105 miembros; en algunas realizaciones, el tamaño de las bibliotecas utilizadas en la invención varía de aproximadamente 1000 miembros a aproximadamente 5 x104 miembros; y en otras realizaciones, el tamaño de las bibliotecas utilizadas en la invención varía de aproximadamente 2000 miembros a aproximadamente 2,5 x103 miembros. Así, las bibliotecas de ácidos nucleicos que codifican tales bibliotecas de compuestos de unión tendrían tamaños en intervalos con límites superiores e inferiores de hasta 64 veces los números citados anteriormente.

Ejemplo

Obtención de anticuerpos antimesotelina sdFv optimizados con afinidad de unión mejorada

Se sintetizaron 43 insertos de bibliotecas de fagémidos que contenían secuencias de ADN que codificaban el sdFv mostrado en la Fig. 2A. Cada inserto tenía el codón de uno de los aminoácidos (subrayado) sustituido por el codón degenerado, NNN. Estos insertos se clonaron en el fagémido para producir 43 minibibliotecas que codificaban cada una 19 sdFv variantes y 1 de tipo salvaje. Estas minibibliotecas se transformaron en la cepa E.coli SS320 y las transformantes se mezclaron en tres subbibliotecas que abarcaban la CDR1. CDR2 y CDR3 del sdFv. Estas subbibliotecas se cultivaron e infectaron con el fago auxiliar M13K07 y se produjeron tres bibliotecas de fagos.

Se recubrió una placa maxisorp con 100 ng./pocillo de mesotelina-Fc en tres pocillos y se incubó a 4°C durante la noche. A la mañana siguiente se retiró la solución de antígeno de la capa y se bloquearon los pocillos con 350ul de tampón de bloqueo (PBS 3%BSA) durante 90' a temperatura ambiente. Se eliminó el tampón de bloqueo y se añadieron 5x1010 fagos (diluidos en tampón de lavado - PBS 0,5%BSA 0,05% Tween20) de cada biblioteca a un pocillo de la placa. Estas reacciones de unión se incubaron a temperatura ambiente durante 75'. A continuación, se retiraron las diluciones de fago y se lavaron los pocillos con 350ul de tampón de lavado cinco veces. Se añadieron 200ul de tampón de lavado a los pocillos y se dejaron lavar durante 3 horas adicionales. Después de este lavado prolongado, los fagos de cada uno de los pocillos se eluyeron con glicina 100 mM (pH2,2) a temperatura ambiente durante 15' y luego se recuperaron y se neutralizó el pH con 3ul de Tris Base 2M.

En la Fig. 2B se muestra un mapa del resto del proceso. En resumen, la porción pertinente de cada biblioteca de sustitución única seleccionada se aisló mediante PCR utilizando los cebadores LCF (200) y 135 (202) para la biblioteca CDR1; 136 (204) y 137 (206) para la biblioteca CDR2; y 138 (208) y 121 (210) para la biblioteca CDR3 Fig. 2B. A continuación, los tres productos de la PCR de la biblioteca se purificaron en gel y los fragmentos se mezclaron en una relación molar de 1:1:1 y se unieron a través de sus homologías superpuestas en una reacción de PCR de ensamblaje. A continuación, se amplificaron los productos combinados ensamblados utilizando los cebadores LCF (200) y 121 (210). Este fragmento de la biblioteca combinatoria se utilizó entonces para hacer dos bibliotecas de fagémidos; la primera a través de la clonación directa de la biblioteca amplificada en el vector de fagémidos (biblioteca CDR) y la segunda a través de una reacción adicional de reestructurado con DNasa1 (Stemmer, Nature 370:389-91 1994) y luego la clonación en el vector fagémido (biblioteca de DNasa). Se produjeron fagos a partir de las dos bibliotecas y se realizaron 3 rondas de reacciones de unión cada vez más estrictas. En este caso, la primera ronda de reacción de unión utilizó un paso de lavado de 4 horas. Los fagos unidos se recuperaron mediante una elución ácida del pocillo y luego se infectaron en células SS320 y se amplificaron con el fago auxiliar M13K07. La reacción de unión de la segunda ronda se ejecutó utilizando un paso de lavado de 18 horas con el clon de tipo salvaje incluido como control para supervisar la eficiencia del paso de lavado y los pocillos recubiertos de PBS incluidos para medir la unión no específica del fago a los pocillos Fig. 2C. El número de fagos rescatados de cada muestra se determinó utilizando una reacción de amplificación qPCR SyberGreen para detectar el ADN de fagémidos monocatenarios con los cebadores CmF2 (5' TTTCCGGCAGTTTCTACAC 3') (SEQ ID NO: 6) y CmR1 (5' CAGCACCTTGTCCTTGC 3')(SEQ ID NO: 7) en un sistema de PCR en tiempo real Applied Biosystems StepOnePlus utilizando una curva estándar con fagos diluidos en PBS a 3x108, 3 x107,3 x106, 3 x105, 3 x104 y 0 fagos/pocillo. Los fagos rescatados de las reacciones de 18 horas se amplificaron de nuevo y se llevó a cabo una tercera ronda de reacciones de unión de forma similar utilizando un paso de lavado de 48 horas Fig. 2D. Tras esta ronda final de unión, los fagos rescatados se utilizaron para infectar células SS320 y se seleccionaron transductores individuales para la secuenciación Fig. 2E y 2F.

Se produjeron fagos a partir de 3 clones derivados de cada biblioteca después de la tercera ronda de selección (D08, G07, H07 (SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22. respectivamente) de la biblioteca de CDR reestructurada (Fig. 2E) y B11, F12 y G12 (SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, respectivamente) de la biblioteca reestructurada con DNasa (Fig. 2F)). Estos clones de fagos se probaron en reacciones de unión con un paso de lavado de 48 horas y cada clon mostró una tasa de desactivación más lenta (unión más estrecha) que el clon parental Fig.

2G.

Definiciones

A menos que se defina específicamente en el presente documento, los términos y símbolos de la química de los ácidos nucleicos, la bioquímica, la genética y la biología molecular utilizados en el presente documento siguen los de los tratados y textos estándar en este campo, por ejemplo Kornberg y Baker, DNA Replication, Second Edition (W.H. Freeman, Nueva York, 1992) Lehninger, Biochemistry. Segunda edición (Worth Publishers. Nueva York, 1975) Strachan y Read, Human Molecular Genetics, segunda edición (Wiley-Liss, Nueva York, 1999) Abbas et al, Cellular and Molecular Immuology, 6a edición (Saunders, 2007).

Por "anticuerpo" o "inmunoglobulina" se entiende una proteína, natural o producida sintéticamente por medios recombinantes o químicos, que es capaz de unirse específicamente a un antígeno o determinante antigénico particular, que puede ser una molécula diana tal como se utiliza el término en el presente documento. Los anticuerpos, por ejemplo los IgG, suelen ser glicoproteínas heterotetraméricas de unos 150.000 daltons, compuestas por dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera está unida a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, mientras que el número de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de los diferentes isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera también tiene puentes disulfuro intracadena regularmente espaciados. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (V^b) seguido de un número de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (V^l) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de la cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Típicamente, las características de unión, por ejemplo, la especificidad, la afinidad, y similares, de un anticuerpo, o de un compuesto de unión derivado de un anticuerpo, están determinadas por los residuos de aminoácidos en las regiones V^by V^l, y especialmente en las regiones CDR. Los dominios constantes no participan directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas pueden asignarse a diferentes clases. Hay cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de ellas pueden dividirse a su vez en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG-i, IgG², IgG³, IgG⁴, IgA¹e IgA². "Fragmento de anticuerpo", y todas sus variantes gramaticales, tal como se utiliza en el presente documento, se define como una porción de un anticuerpo intacto que comprende el sitio de unión al antígeno o la región variable del anticuerpo intacto, en la que la porción está libre de los dominios constantes de la cadena pesada (es decir, CH2, CH3 y CH4, dependiendo del isotipo del anticuerpo) de la región Fc del anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos son los fragmentos Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab)²y Fv; los diacuerpos: cualquier fragmento de anticuerpo que sea un polipéptido que tenga una estructura primaria consistente en una secuencia ininterrumpida de residuos de aminoácidos contiguos (denominado en el presente documento "fragmento de anticuerpo de cadena única" o "polipéptido de cadena única"), incluyendo sin limitación (1) moléculas Fv de cadena única (scFv) (2) polipéptidos de cadena única que contengan sólo un dominio variable de cadena ligera, o un fragmento del mismo que contenga las tres CDR del dominio variable de cadena ligera, sin una fracción de cadena pesada asociada y (3) polipéptidos de cadena única que contengan sólo una región variable de cadena pesada, o un fragmento del mismo que contenga las tres CDR de la región variable de cadena pesada, sin una fracción de cadena ligera asociada; y estructuras multiespecíficas o multivalentes formadas por fragmentos de anticuerpos. El término "anticuerpo monoclonal" (mAb), tal y como se utiliza en este documento, se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que componen la población son idénticos excepto por posibles mutaciones naturales que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, ya que se dirigen contra un único sitio antigénico. Además, a diferencia de las preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales) que suelen incluir diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada mAb está dirigido contra un único determinante del antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales tienen la ventaja de que pueden ser sintetizados por cultivo de hibridoma o por sistemas de expresión bacteriana, de levadura o de mamíferos, no contaminados por otras inmunoglobulinas.

Por "compuesto de unión" se entiende un compuesto capaz de unirse específicamente a una molécula o grupo de moléculas diana en particular. Entre los ejemplos de compuestos de unión se incluyen anticuerpos, receptores, ligandos, hormonas, factores de coagulación, proteínas de unión, factores de transcripción, moléculas de señalización, proteínas virales, lectinas, ácidos nucleicos, aptámeros y similares, por ejemplo Sharon y Lis, Lectins, 2nd Edition (Springer, 2006) Klussmann. Manual de aptámeros: Functional Oligonucleotides and Their Applications (John Wiley & Sons, Nueva York, 2006). Tal como se utiliza en el presente documento, se entiende por"compuesto de unión basado en anticuerpos" un compuesto de unión derivado de un anticuerpo, como un fragmento de anticuerpo, incluidos, entre otros, los fragmentos Fab, Fab', F(ab')²y Fv, o formas recombinantes de los mismos, como las construcciones biespecíficas. En algunas realizaciones, un compuesto de unión basado en anticuerpos comprende un andamio o región marco de un anticuerpo y regiones CDR de un anticuerpo.

Por "región determinante del complemento" o "CDR" se entiende una secuencia corta (normalmente de hasta 13 a 25 aminoácidos) en los dominios variables de las inmunoglobulinas. Las CDR (seis de las cuales están presentes en las moléculas de IgG) son la parte más variable de las inmunoglobulinas y contribuyen a su diversidad al establecer contactos específicos con un antígeno concreto, lo que permite a las inmunoglobulinas reconocer un amplio repertorio de antígenos con una gran afinidad, por ejemplo Beck et al, Nature Reviews Immunology, 10: 345-352 (2010). Varios esquemas de numeración, tales como el esquema de numeración de Kabat, proporcionan convenciones para describir las ubicaciones de aminoácidos de las CDR dentro de las regiones variables de las inmunoglobulinas.

El término "complejo", tal y como se utiliza aquí, significa un conjunto o agregado de moléculas en contacto directo o indirecto entre sí. En algunas realizaciones, "contacto", o más particularmente, "contacto directo" en referencia a un complejo de moléculas, o en referencia a la especificidad o a la unión específica, significa que dos o más moléculas están lo suficientemente cerca como para que las interacciones atractivas no covalentes, tales como las fuerzas de Van der Waal, los enlaces de hidrógeno, las interacciones iónicas e hidrófobas, y similares, dominen la interacción de las moléculas. En tales realizaciones, un complejo de moléculas es estable en el sentido de que, en condiciones de ensayo, la presencia del complejo es termodinámicamente favorable. Tal como se utiliza aquí, "complejo" puede referirse a un agregado estable de dos o más proteínas, que se denomina de forma equivalente "complejo proteínaproteína". Un complejo también puede referirse a un anticuerpo unido a su correspondiente antígeno. Los complejos de particular interés en la invención son los complejos proteína-proteína y los complejos anticuerpo-antígeno. Como se ha señalado anteriormente, varios tipos de interacciones no covalentes pueden contribuir a la unión de los anticuerpos al antígeno, incluidas las fuerzas electrostáticas, los enlaces de hidrógeno, las fuerzas de Van der Waals y las interacciones hidrófobas. La importancia relativa de cada uno de ellos depende de las estructuras del sitio de unión del anticuerpo individual y del determinante antigénico. La fuerza de la unión entre un único sitio de combinación de un anticuerpo y un epítopo de un antígeno, que puede determinarse experimentalmente mediante diálisis de equilibrio (por ejemplo, Abbas et al (citado anteriormente)), se denomina afinidad del anticuerpo. La afinidad se suele representar mediante una constante de disociación (Kd), que describe la concentración de antígeno que se requiere para ocupar los sitios de combinación de la mitad de las moléculas de anticuerpo presentes en una solución de anticuerpo. Una Kd más pequeño indica una interacción más fuerte o de mayor afinidad, porque se necesita una menor concentración de antígeno para ocupar los sitios. En el caso de los anticuerpos específicos para antígenos naturales, la Kd usualmente varía entre aproximadamente 10'7 M y 10'11 M. El suero de un individuo inmunizado contendrá una mezcla de anticuerpos con diferentes afinidades por el antígeno, dependiendo principalmente de las secuencias de aminoácidos de las CDR.

Por "ligando" se entiende un compuesto que se une específica y reversiblemente a otra entidad química para formar un complejo. Los ligandos incluyen, pero no se limitan a, pequeñas moléculas orgánicas, péptidos, proteínas, ácidos nucleicos y similares. De particular interés son los complejos proteína-ligando, que incluyen complejos proteínaproteína, complejos anticuerpo-antígeno, complejos receptor-ligando, complejos enzima-sustrato y similares.

La "visualización de fagos" es una técnica mediante la cual los polipéptidos variantes se muestran como proteínas de fusión a al menos una porción de una proteína de cubierta en la superficie de partículas de fago, por ejemplo, fago filamentoso. Una de las utilidades de la visualización de fagos reside en el hecho de que se pueden seleccionar rápida y eficazmente grandes bibliotecas de variantes proteicas aleatorias para aquellas secuencias que se unen a una molécula diana con alta afinidad. La visualización de bibliotecas de péptidos y proteínas en fagos se ha utilizado para seleccionar millones de polipéptidos con propiedades de unión específicas. Se han utilizado procedimientos de visualización de fagos polivalentes para visualizar pequeños péptidos aleatorios y pequeñas proteínas mediante fusiones al gen III o al gen VIII de los fagos filamentosos. Wells y Lowman, Curr. Opinen. Construir. Biol., 3:355-362 (1992), y las referencias allí citadas. En el despliegue de fagos monovalentes, una biblioteca de proteínas o péptidos se fusiona con un gen III o una porción del mismo, y se expresa a bajos niveles en presencia de la proteína del gen III de tipo salvaje, de modo que las partículas de fagos muestran una copia o ninguna de las proteínas de fusión. Los efectos de avidez se reducen en relación con los fagos polivalentes, de modo que la selección se basa en la afinidad intrínseca del ligando, y se utilizan vectores fagémidos, que simplifican las manipulaciones del ADN. Lowman y Wells, Methods:: A companion to Methods in Enzymology, 3:205-0216 (1991).

Por "fagémido" se entiende un vector plasmídico que tiene un origen bacteriano de replicación, por ejemplo, ColE1, y una copia de una región intergénica de un bacteriófago. El fagémido puede utilizarse en cualquier bacteriófago conocido, incluidos los bacteriófagos filamentosos y los bacteriófagos lambdoides. El plásmido también suele contener un marcador seleccionable para la resistencia a los antibióticos. Los segmentos de ADN clonados en estos vectores pueden propagarse como plásmidos. Cuando las células que albergan estos vectores están provistas de todos los genes necesarios para la producción de partículas de fago, el modo de replicación del plásmido cambia a la replicación en círculo rodante para generar copias de una hebra del ADN del plásmido y empaquetar partículas de fago. El fagémido puede formar partículas de fago infecciosas o no infecciosas. Este término incluye a los fagémidos, que contienen un gen de la proteína de la cubierta del fago o un fragmento del mismo unido a un gen del polipéptido heterólogo como una fusión de genes, de manera que el polipéptido heterólogo se muestra en la superficie de la partícula del fago.

Por "fago" o "vector fágico" se entiende una forma replicativa de doble cadena de un bacteriófago que contiene un gen heterólogo y es capaz de replicarse. El vector fágico tiene un origen de replicación fágico que permite la replicación del fago y la formación de partículas fágicas. El fago es preferentemente un bacteriófago filamentoso, como un fago M13, fl, fd, Pf3 o un derivado del mismo, o un fago lambdoide, como lambda, 21, phi80, phi81, 82, 424, 434, etc., o un derivado del mismo.

Por "cebador" se entiende un oligonucleótido, bien sea natural o sintético, que es capaz, al formar un dúplex con una plantilla de polinucleótidos, de actuar como punto de iniciación de la síntesis de ácidos nucleicos y de extenderse desde su extremo 3' a lo largo de la plantilla de modo que se forme un dúplex extendido. La extensión de un cebador usualmente se lleva a cabo con una polimerasa de ácido nucleico, tal como una polimerasa de ADN o ARN. La secuencia de nucleótidos añadidos en el proceso de extensión está determinada por la secuencia del polinucleótido plantilla. Usualmente, los cebadores se extienden mediante una ADN polimerasa. Los cebadores usualmente tienen una longitud en el intervalo de 14 y 40 nucleótidos, o en el intervalo de 18 y 36 nucleótidos. Los cebadores se emplean en una gran variedad de reacciones de amplificación nucleica, por ejemplo, reacciones de amplificación lineal que utilizan un único cebador, o reacciones en cadena de la polimerasa, que emplean dos o más cebadores. La orientación para seleccionar las longitudes y secuencias de los cebadores para aplicaciones particulares es bien conocida por aquellos con conocimientos normales en la técnica, como lo demuestran las siguientes referencias: Dieffenbach, editor, PCR Primer: A Laboratory Manual, 2nd Edition (Cold Spring Harbor Press, Nueva York, 2003).

"Polipéptido" se refiere a una clase de compuestos formados por residuos de aminoácidos unidos químicamente por enlaces amida con eliminación de agua entre el grupo carboxi de un aminoácido y el grupo amino de otro aminoácido. Un polipéptido es un polímero de residuos de aminoácidos, que puede contener un gran número de estos residuos. Los péptidos son similares a los polipéptidos, salvo que, por lo general, están compuestos por un número menor de aminoácidos. Los péptidos se denominan a veces oligopéptidos. No existe una distinción clara entre polipéptidos y péptidos. Por comodidad, en esta divulgación y en las reivindicaciones, el término "polipéptido" se utilizará para referirse en general a péptidos y polipéptidos. Los residuos de aminoácidos pueden ser naturales o sintéticos.

"Proteína" se refiere a un polipéptido, usualmente sintetizado por una célula biológica, plegado en una estructura tridimensional definida. Las proteínas son generalmente de aproximadamente 5.000 y aproximadamente 5.000.000 daltons o más de peso molecular, más usualmente de entre aproximadamente 5.000 y aproximadamente 1.000.000 de peso molecular, y pueden incluir modificaciones postraduccionales, tales como acetilación, acilación, ADP-ribosilación, amidación, formación de enlaces disulfuro, farnesilación, desmetilación, formación de enlaces cruzados covalentes, formación de cistina, glucosilación, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, fosforilación, prenilación, selenoilación, sulfatación y ubiquitinación, por ejemplo Wold, F., Post-transtational Protein Modifications: Perspectivas y perspectivas, pgs. 1-12 en Post-translational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, Nueva York, 1983. Las proteínas incluyen, a título ilustrativo y no limitativo, citoquinas o interleuquinas, enzimas tales como, por ejemplo quinasas, proteasas, galactosidasas, y así sucesivamente., protaminas, histonas, albúminas, inmunoglobulinas, selenoproteínas, fosfoproteínas, mucoproteínas, cromoproteínas, lipoproteínas, nucleoproteínas, glicoproteínas, receptores de células T, receptores de ligandos/hormonas, proteoglicanos y similares.

"Específico" o "especificidad" en referencia a la unión de una molécula a otra molécula, tal como una secuencia diana etiquetada para una sonda, significa el reconocimiento, contacto y formación de un complejo estable entre las dos moléculas, junto con un reconocimiento, contacto o formación de complejo sustancialmente menor de dicha molécula con otras moléculas. En algunas realizaciones, "específico" en referencia a la unión de una primera molécula a una segunda molécula significa que en la medida en que la primera molécula reconoce y forma un complejo con otra

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para mejorar un sitio de unión a proteínas, comprendiendo el procedimiento los pasos de:

sintetizar una biblioteca de sustitución única para cada uno de una pluralidad de dominios de un sitio de unión a proteínas, en el que cada miembro de una biblioteca de sustitución única tiene una secuencia de nucleótidos que codifica cambios de aminoácidos en una única posición de aminoácidos de su dominio asociado y que se solapa con una secuencia de nucleótidos de al menos un miembro de una biblioteca de sustitución única diferente, y en el que los dominios del sitio de unión a proteínas se sustituyen de forma única en entre 1 y 250 posiciones de aminoácidos;

expresar por separado cada miembro de cada biblioteca de sustitución única como proteína precandidata; seleccionar las proteínas precandidatas de cada biblioteca de sustitución única que se unen a las moléculas diana para formar una biblioteca seleccionada para cada dominio de la proteína;

reestructurar los miembros de las bibliotecas seleccionadas en una PCR para producir una biblioteca combinatoria reestructurada;

expresar miembros de la biblioteca reestructurada como proteínas candidatas;

incubar en una mezcla de reacción bajo condiciones de unión las proteínas candidatas con las moléculas diana;

lavar las moléculas diana hasta que una fracción de las proteínas candidatas permanezca unida; y seleccionar los miembros de la biblioteca reestructurada que codifican las proteínas candidatas que permanecen unidas a las moléculas diana.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho sitio de unión es el de un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo expresado por un sistema de visualización de proteínas.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho sistema de visualización de proteínas es un sistema de visualización de levadura, un sistema de visualización de mamíferos, un sistema de visualización de bacterias, un sistema de visualización de células de insectos o un sistema de visualización de fagos.

4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que dicho sistema de visualización de proteínas es un sistema de visualización de fagos.

5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha pluralidad de dominios cubre una secuencia de aminoácidos contigua de dicha proteína.

6. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha fracción de dichas proteínas candidatas que permanecen unidas es del 10 por ciento.

7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha fracción de dichas proteínas candidatas que permanecen unidas es del 50 por ciento.

8. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha fracción de dichas proteínas candidatas que permanecen unidas es del 1 por ciento.